Prezența și diseminarea genelor de rezistență la antibiotice la câteva bacterii Gram Negative izolate din mediul clinic și [622870]

Universitatea din București
Facultatea de Biologie
Prezența și diseminarea genelor de rezistență la antibiotice la câteva bacterii Gram Negative izolate din mediul clinic și
natural în Sud-Estul României
Coordonator:
Prof. Univ. Dr. Veronica Lăzar
Îndrumător științific:
Asist. Univ. Dr. Irina Gheorghe
Absolvent: [anonimizat]
27 iunie 2017

Introducere
Studiile recente evidențiaza multitudinea de căi prin care genele de
rezistență se pot răspândi în ecosisteme acvatice (prin consumul alimentelor
purtătoare de gene de rezistență insuficient preparate sau prin consumul de
apă potabilă provintă din ape de suprafață poluate).
Apariția genelor de rezistență la antibiotice în mediul acvatic devine o
preocupare crescândă la nivel mondial. Sute de gene care conferă rezistență
la antibiotice au fost evidențiate la bacteriile izolate din apele de suprafață
și în stațiile de epurare a apelor reziduale provenite din spitale .
Rezistența la antibiotice a principalelor Enterobacteriaceae implicate
în infecții comunitare și nosocomiale ( Escherichia coli și Klebsiella
pneumoniae ) și a Pseudomonadaceelor reprezintă pentru țara noastră o altă
problemă importantă.

Scopul lucrării
Având în vedere că pe plan european există programe
de supraveghere a rezistenței la antibiotice, lucrarea își
propune să evidențieze markerii genetici de rezistență
la antibiotice a unor tulpini de bacili, izolați din câteva
surse naturale de apă din Sud-Estul României și
compararea acestora cu un lot de 10 tulpini
nosocomiale, în scopul realizării pattern-urilor
genetice comparative și a genelor care le conferă
rezistență la antibiotice.

Obiectivele studiului
1. Determinarea prezenței unor bacterii Gram negative purtătoare de gene de rezistență la antibiotice
la culturile izolate din mediul acvatic și spitalicesc.
2. Ilustrarea profilului genetic al tulpinilor izolate a unor tulpini de bacterii izolate într-un spital și în
câteva ape din Sudul României.
3. Optimizarea unor metode de detecție a tulpinilor patogene.
4. Evidențierea prin comparație a profilului genetic la bacteriile din habitate acvatice și nosocomiale.
5. Investigarea mecanismelor de răspândire a genelor de rezistență (mutație spontană versus transfer
orizontal).
6. Compararea rezultatelor obținute cu cele existente în literatura de specialitate.

Materiale și metode:
Au fost analizate un număr de 33 de tulpini de bacterii Gram negative
din familia Enterobacteriaceae și Psedomonadaceae izolate din lacurile
salamastre din bazinul hidrografic al râului Buzău (Amara, Jirlău, Balta
Albă) și lacul sărat Câineni, și din fluviul Dunăre (județul Giurgiu), în
perioada septembrie 2016-mai 2017.
Rezultatele obținute au fost analizate comparativ cu un lot de 10 tulpini
nosocomiale aparținând fam. Enterobacteriaceae izolate de la pacienți
internați în secțiile de terapie intensivă a Institutului de Boli Cardiovasculare
prof. C.C.Iliescu din București în anul 2017

Metode și metode
Tulpinile bacteriene au fost cultivate pe medii de cultură de
cultura specifice (EMB, McConkey, Cetrimid), și au fost incubate
la temperatura 37oC timp de 48h, până la atingerea fazei
staționare de creștere.
În scopul izolării de tulpini pure, din probele mixte au fost realizate
pasaje sucesive prin tehnica epuizării ansei din fiecare probă,
după care am făcut însămânțarea (prin tehnica epuzării ansei) pe
mediile solide proaspete selective (EMB, McConkey,) și
neselective (Geloza îmbogățita cu 5% sânge de berbec).
Coloniile izolate obținute au fost identificate cu ajutorul sistemul
automat Bruker DaltoniK MALDI Biotyper.

Materiale și metode

Rezultate și discuții
Extracția ADN din tulpinile izolate
Am folosit protocolul de lucru de extracție alcalină a ADN
Amplificarea ADN
 Am realizat amplificarea prin reacții PCR simplex și multiplex
pentru reacție am folosit un amestec alcătuit din apă pură, nucleotide, primeri, enzima T aq-
polimeraza, clorură de magneziu și buffer, la care am adaugat proba de ADN
Electroforeza ADN
După prepararea gelului de electroforeză, l-am turnat în cuva de electroforeză,
am adaugat pieptenele și l-am lăsat la solidificare pentru formarea godeurilor
Am încărcat probele în godeuri și am conectat aparatul (PCR Thermal Corbett) la
sursa de curent electric
 Timpul de migrare este de 30 minute, iar tensiunea curentului electric între 90 și
120 V
 Benzile de ADN au migrat în funcție de greutatea moleculară
 Am vizualizat gelul în UV la transiluminator

Rezultate și discuții

Rezultate și discuții
Prezența genei blaCTX-M, codificatoare a rezistenței la β‐lactamine a fost identificată în
cazul a 9 izolate, izolate din mediul acvatic, reprezentând 27.27% din totalitatea tulpinilor
analizate
Gene responsabile pentru rezistența la sulfamide și trimetoprim au fost de asemenea
identificate , cu o prevalență de 51,51% (sulI) și 3,03% (sulII) din totalul tulpinilor analizate
Gena tetA, codificatoare a rezistenței la tetracicline, a fost identificată la 21.21% din
totalitatea tulpinilor supuse studiul genotipic. Gena tetB, a fost identificată în 9.09% din
tulpinile investigate
În studiu nostru, 9,09% dintre tulpini au prezentat gena blaVIM2, urmată de gena blaNDM
(6,06%)

Concluzii
Apele de suprafață reprezintă un mediu propice pentru diseminarea și transferul genelor de rezistență la antibiotice.
Rezultatele prezentate în această lucrare au demonstrat prezența unor gene de rezistență în rândul tulpinilor izolate din
apele de suprafață și din spital, acestea având un rol important în răspândirea determinanților de rezistență și, implicit a
mecanismelor de rezistență asociate
Studiul nostru subliniază rolul important al apelor de suprafață ca rezervor al unor gene de rezistență
În tulpinile izolate din apele de suprafață au fost identificate gene de rezistență la antibiotice descrise recent în izolatele clinice
(QnrS, CTX-M), ceea ce ar putea indica faptul că bacteriile purtătoare ale acestor gene sunt eliberate în apele de suprafață
Prezența genei QnrS și a genei CTX-M în apele de suprafață incluse în studiul nostru subliniază necesitatea monitorizării
calității apei, cu atât mai mult cu cât bazinul hidrografic din România este unitar, iar Dunărea este o sursă din care se asigură
necesarul de apă potabilă pentru multe orașe din țară
În studiu nostru, 9,09% dintre tulpini au prezentat gena blaVIM2, urmată de gena blaNDM (6,06%). Studiile recente (Lupo și
colab., 2012) sugerează că prezența acestor gene în apele de suprafață poate fi cauzată de contaminarea cu apele reziduale
deversate din spitale.

Bibliografie selectivă
Lazăr V., 2001, ” Microbiologie generală-Note de
curs și principii de diagnostic microbiologic ”,
Editura Universității din București

Vă mulțumesc pentru atenție!