Prezența și diseminarea genelor de rezistență la antibiotice la câteva [622871]

0

Universitatea din Bucure ști
Facultatea de Biologie
Master Genetică aplicată și biotehnologii

Lucrare de disertați e

Prezența și diseminarea genelor de rezistență la antibiotice la câteva
bacterii Gram Negative izolate din mediul clinic și natural în Sud -Estul
României

Coordonator:
Prof. Univ. Dr. Veronica Lăzar
Masterand: [anonimizat]:
Asist. Univ. Dr. Irina Gheorghe

București
2017

1
Abrevieri

ADN – acid deoxiribonucleic. Nucleotida este unitatea de bază a ADN -ului și este compusă prin policondensarea
unui glucid, baze azotate hete rociclice și unui rest de acid fosforic

ARN – acid ribonucleic. Este un polinucleotid format prin copolimerizarea ribonucleotidelor. Un ribonucleotid
este format dintr -o bază azotată, o pentoză și o grupare fosfat

ARNr – este un constituent principal al ribozomilor (organite celulare la nivelul cărora se realizează sinteza
proteinelor). Prin transcripție sunt sintetizați precursori de talie mare ce vor fi ulterior scindați în patru tipuri de
ARNr: ARNr 28S, ARNr 5.8 S, ARNr 5S (ce intră în compoziția subu nității mari a ribozomului) și ARNr 18S
(ce intră în compoziția subunității mici)

CMA – concentrația minimă activă. Este concentrația la care antibioticul poate induce anumite perturbări în
activitatea metabolică a microorganismelor, fară a afecta capacitatea de multiplicare și viabilitatea
microorganismelor

CMI – concentrația minimă inhibitorie a unui antibiotic este cea mai mică concentrație care inhibă complet
multiplicarea unei tulpini patogene

CMB – concentrația minimă bactericidă a unui ant ibiotic este concentrația minimă care omoară tulpina

GTP (Guanozin trifosfat). Este o nucleozidă purinică. Acesta poate acționa ca un substrat atât în sinteza ARN –
ului în timpul procesului de transcriere cât și a ADN -ului în timpul replicării

HGT – trans fer pe orizontală al genelor. Este un proces prin care porțiuni mici din materialul genetic pot fi
transferate între bacterii ale aceleiași specii sau chiar între diferite specii.

LUCA (Last Universal Common Ancestor). Este considerat strămoșul comun al tuturor formelor de viață de pe
Pământ cu o vechime de 3,8 miliarde de ani

RPP – proteine ribozomale cu rol de protecție. Sunt proteine citoplasmatice solubile (~72 kDa) care mediază
rezistența la tetraciclină. Majoritatea genelor care codifică pentru RP P sunt localizate pe plasmide și se transmit
între specii diferite prin transfer lateral

2

pH- reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației ionilor din soluție. Prin noțiunea de pH se
exprimă cantitativ aciditatea sau bazicitatea unei sol uții, pe baza concentrației de hidroniu H3O+
Reacția PCR (Polymerase Chain Reaction – Reacția de polimerizare în lanț). este o metodă de amplificare
enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN
QS – Sunt molecule de semnalizare celulară cu greutate moleculară mică. Atunci când moleculele semnal ating
un prag critic de concentrație, inhibă sau activează expresia genică. Acest tip de reglare a expresiei genice a fost
denumit mecanism de quorum sensing (QS) . Se întâlnește atât la bacteriile Gram negat ive cât și la cele Gram
pozitive
QSI – inhibitori naturali sau sintetici de QS. Sunt compuși naturali extrași din alge (furanone halogenate),
licheni, plante sau sintetici, care nu constituie un factor de presiune selectivă și de inducere a rezistenței

3

Cuprins

Partea generală

Introducere…………………………… ……………………………………………………………………………… ………………..6

I. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul rezistenței la antibiotice în mediul clinic și natural al tulpinilor
patogene …………………………… …………………………………………………… …………………………… ………….. 8

Originea și evoluția speciilor de bacterii rezistente …….. ……….. ……………. …………………………… …………… ….8
Cauzele apariției și răspândirii rezistenței… …………………………………………. …………… …………………….. ……8
Evoluția filogenetică a genelor de rezistență la antibiotice ………………………….. ……….. …………….. ……… ………9
Factorii care contribuie la diseminarea și întreținerea rezistenței la antibiotice ……………… ………………….. ………….9
Tipuri de rezistență ……………………………………………….. ……………………………….. …………….. ……… …………………. …10
Rezistența naturală …………………………………………………. ………………………………….. ……………….. ………….. …………10
Rezistența dobandită ………………………………………………………………………… ………….. …………………… ……10
Pseudorezistența ……………………………………………………………………………… …………… ………………….. ………………. …11
Mecanismele rezistenței la antibiotice ……………………………………………………… ………………………………….. 12
Mecanisme genetice ………………………………………………………………………….. ……………………………………. 12
Mutații spontane la nivelul ADN -ului bacterian ………………………. …………………….. …………………. …………. ………..13
Integrarea de material genetic exogen ……………………………………….. ………. …………………………………. ……… ……….14
Recombinări cromozomiale …………………………………. …………………………………………. …………………… …………14
Elemente mobile: plasmide, transpozoni și integroni ………………….. …………… …………………… ……… ……………….15
Transferul de gene pe verticală ……………. …………………………………………….. …………………………………. ……………17
Transferul de gene pe orizontală ……….. ……………………………………………………………………………. ……………1 7
Conjugare. ……………………….. …………………. …………………………………………………………… ……………….18
Transformare ………………………. ………………. …………………………………………………………… ……………….18
Transducție …….. …………………… …………………………………………………….. …………………………. ………………18
Genele care codifică pentru proteinele RPP ………. ……… ………………………………. ……………………………………. ….19
Genele Tet și Erm ……………………………………………. ………………………………………. …………………………… …………..20
Mecanisme biochimice ……………………………………….. ………………………….. ………………………. ………………..21
Inactivare enzimatică ……………………………………………………………………… ………………………………………. 22
Clasificarea β-lactamazelor ………………. ……………………………………………. ………………………………………. 22

4
β-lactamazele clasei A ……………………………. ………… …………….. ………………………………………………………… .23
β-lactamazele clasei B ………………………… ……………………….. ………………………………………………………. .23
β-lactamazele clasei C …………………………… ………….. ……………… ………………… ……………………………………. .24
β-lactamazele clasei D …………………………… ……………. …………….. ……………………………………………………….. ..25
Mecanisme celulare …………………………… ………. ………………………………………………. ……………………………2 5
Reducerea permeabilit ății membranei externe …………………… …………. …………………………………………………..2 5
Reducerea permeabilit ății membranei citoplasmatice …….. ………….. …………………………………………………………2 5
Rezisten ța prin eflux de antibiotic ……………………………………. ………….. …………………………… …………………..2 6
Alte ipoteze referitoare la dobândirea rezistenței la antibiotice.. ……………………………….. ………….. ………….. ……….2 6
Insulele de patogenitate …………… ………. …………………………………………………………….. ……………………………… 26
Endosporii bacterieni …………… ………………………………………………… …………………… …… …………………..27
Biofilmul ………………………… ……………………………….. …………………………… ……………………………..2 7
Preven ția……… …………………………………………… …………………………………………………………………2 8
Istoricul bolilor infecțioase ……………………………. …………………………………………………. ……………………. 29
Metode de diagnostic ……………………………… ……………………………………………………… …………………….30
Tehnici moleculare de diagnostic ………………… …………………………………………….. ………………………31
Abordări terapeutice ……………………………………….. …………………………………………… …………. ……………………..32
Clasificarea antibioticelor…… ………… …………… ……………………………………………………. …………………3 4
Antibiotice care ac ționeaz ă asupra peretelui bacterian ………… ………………………………………………. ……………35
Antibiotice care ac ționeaz ă asupra membranei plasmatice ………………………………………………………. ……….. …36
Antibiotice cu țintă de ac țiune replicarea ADN -ului………… ……………………………………………………. ………3 6
Antibiotice care blocheaz ă transcrierea ………… ……………………………………………………………………… …..3 7
Antibiotice care blocheaz ă sinteza proteic ă………… ………………………………………………………………. …….37

II. Partea experimentală

Introducere …………………………………………………………………………………………….. ……………………………. 38
Scop ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………. 39
Obiective ………………………………………………………………………………… ………………… …………………………… 39
Materiale și metode ………………………………………………………………………………………. ………………………..39
Rezultate și discuții ………………………………………………………………………………………… ……………………..48
Concluzii și perspective ………………………………………………………………………………….. ……………………..6 5

5

Bibliografie …………………………………………………………………………………………………… …………………..6 7

6
Introducere

Tema tezei de diserație abordează un subiect de mare actualitate, întrucât prezența bacteriilor rezistente și
multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică la nivel mondial. Subiectul este de interes
întrucât datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru țara noastră, în special pentru zona sudică și
estică.

Antibioticele sunt utilizate pentru tratarea boliilor atât la oameni cât și la animale. Potrivit unor studii (Levy,
1997; Oppegaard și colab. 2001 ), există mecanisme comune de rezistență la antibiotice în populațiile bacteriene
proporțional cu utilizarea de antibiotice, în special în agricultură (Levy, 1997; Oppegaard și colab. 2001).

Utilizarea antibioticelor în scopuri profilactice sau terapeutice la om și în scopuri veterinare și agricole a furnizat
o presiune selectivă care favorizează supraviețuirea și răspândirea microorganismelor rezistente sau
multirezistente (Hooper, 2002; Mascaretti, 2003; Taber, 2002).

Bacteriile Gram negative s -au dovedit a fi cele mai des întâlnite, atât în mediul natural, cât și în spitale.
Pseudomonas aeruginosa și Acinet obacter baumannii sunt patogeni nosocomiali frecvenți, fiind implicați în
apariția mai multor infecții, dificil de controlat.

Având în vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenței la antibiotice, lucrarea își
propune sa eviden țieze markerii genetici de rezistență la antibiotice a unor tulpini de bacili, izolați din câteva
surse naturale de apă din Sud -Estul României, în scopul realizării pattern -urilor genetice comparative și a
genelor care le conferă rezistență la antibiotice.

Profilul genetic al bacteriilor depistate va fi comparat cu cel al unor bacterii din mediul clinic.
Având în vedere necesitatea utilizării unor metode specifice de diagnostic a bacteriilor implicate în patologii,
vom compara diferite metode de detectare a bacteriilor rezistente la antibiotice, cu scopul de a evidenția
eficacitatea, rapiditatea și specificitatea fiecăreia dintre acestea.
Utilizarea metodelor moleculare va completa evaluarea fenotipică a izolatelor și astfel vom putea avea
caracterizarea tulpinilor rezistente la terapie.

În partea a doua a lucrării, am izolat tulpini de bacterii din mediul natural și clinic pentru a identifica genele
implicate în rezistența la antibiotice, iar rezultatele experimentului vor fi prelucrate și analizate prin mai multe
tehnici și metode.

7
Rezultatele acestui studiu ar putea completa bazele de date de la nivel european sau mondial cu profilul genetic
al tulpinilor bacteriene care au exprimate gene de rezistență la antibiotice.

Obiective

1. Determinarea prezenței unor bacterii Gram negative purtătoare de gene de rezistență la antibiotice la culturile
izolate din mediul acvatic și spitalicesc.
2. Ilustrarea profilului genetic al tulpinilor izolate a unor tulpini de bacterii izolate într -un spital și în cât eva ape
din Sudul României.
3. Optimizarea unor metode de detecție a tulpinilor patogene.
4. Evidențierea prin comparație a profilului genetic la bacteriile pe care le -am izolat din mediul înconjurător și
intraspitalicesc.
5. Investigarea mecanismelor de răspândire a genelor de rezistență (mutație spontană versus transfer orizontal).
6. Compararea rezultatelor obținute cu cele existente în literatura de specialitate

8
I. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul rezistenței la antibiotice în mediul clinic și natural al tulpinilor
patogene

Originea și evoluția speciilor de bacterii rezistente la antibiotice

Bacteriile au apărut pe Pământ acum câteva miliarde de ani, timp în care și -au perfecționat mecanismele de
adaptare la mediul extern, în special prin plasticitate și flexibilitate genetică. (Cupșa, 2007). La ora actuală se
crede că toate celulele au ca strămoș o celulă ancestrală comună, ultimul strămoș comun universal (LUCA).

Evoluția omului a avut loc într -o relație simbiotică cu flo ra bacteriană endogenă (numărul celulelor bacteriene
depășește numărul de celule umane). Diversitatea microorganismelor, variatele genotipuri și fenotipuri de
rezistență la antibiotice, sunt studiate pe baza metodelor moleculare de secvențiere a genelor.

O mare parte a antibioticelor își au originea în bacteriile existente (spre exemplu eritromicină, streptomicină,
vancomicină, daptomicină). (Baltz, 2005)

Aceste bacterii prezintă mecanisme de protejare împotriva propriilor produși, mecanisme care odată c e sunt
transferate patogenilor sau oportuniștilor anulează acțiunea antibioticelor.

Cauzele apariției și răspândirii rezistenței la antibiotice

Rezistența la antibiotice reprezintă capacitatea naturală sau dobândită a unui microorganism de a supraviețu i în
prezența unuia sau mai multor antibiotice. (Depardieu și colab., 2007)
Rezistența la antibiotice poate să apară prin mai multe mecanisme: selecție naturală, mutații spontane (ca rezultat
al acțiunii factorilor de mediu) sau prin erori necorectate în p rocesul de replicare al ADN -ului. (Curtis și colab.,
2007)
Acest proces biologic natural duce la supraviețuirea celor mai rezistente tulpini (Fedesa, 2000).

Odată apărută rezistența la antibiotice, gena care codifică acest caracter se poate răspândi la al te celule prin
transfer de plasmide, transpozoni sau integroni.
O bacterie poate avea mai multe gene de rezistență la antibiotice exprimate, fiind numită multirezistentă.

Rezistența la antibiotice poate fi indusă unui microorganism și pe cale artificială, prin tehnici de transformare.
Rezistența se manifestă atât la nivel individual cât și populațional (comunitar sau nosocomial).

9
Un studiu filogenetic recent pe tema rezist enței la antibiotice arată că unele gene de rezistență la antibiotice au o
lungă istoria evoluționistă de diversificare, care a început cu mult înainte de „epoca antibiotic“. (Ventola, 2015).

Problema rezistenței la antibiotice este actuală și face obiec tul mai multor studii deorece există o creștere
semnificativă a numărului bacteriilor patogene rezistente la antibiotice. De cele mai multe ori rezistența la
antibiotice este asociată cu utilizarea și abuzul de antibiotice, atât la oameni cât și la animale .
Cu toate acestea, rezistența dobândită prin transferul lateral de gene de rezistență la antibiotice este cea mai
fecvent întâlnită la bacterii taxonomic îndepărtate. (Penesyan și colab., 2015)

Evoluția filogenetică a genelor de rezistență la antibiotic e

Transferul de gene pe orizontală între taxoni îndepărtați filogenetic este dificil de reprodus in vitro deoarece la
ora actuală nu se cunosc bacteriile și mecanismele genetice care au fost implicate, condițiile de mediu la
momentul transferului și rata de transfer (poate fi prea mică pentru a o reproduce într -un experiment).

Totuși, datorită programelor și bazelor de date disponibile, este posibil să se efectueze o analiză filogenetică a
ascendenților unor specii de bacterii pentru a se confirma ipoteza transferului de gene pe orizontală. Î n urma
experimentelor de cartare a genelor implicate în rezistența la antibiotice, s -a evidențiat faptul că acestea sunt grupate
în zone denumite "clusteri". Localizarea acestor gene este de obicei cromozomală, dar există și cazuri când acestea
sunt localizate în plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi și colab.,1987).

Factorii care contribuie la diseminarea și întreținerea rezistenței la antibiotice

Conform studiului lui Chastre, factorii de risc care contribuie la apariția și răspândirea infecțiilor cu bacterii
rezistente sau multirezistente sunt:
a. tratamentul cu a ntibiotice cu cel puțin 90 zile anterior apariției simptomelor
b. internare în ultimele 3 luni
c. studii care indică frecvența crescută a tulpinilor curezistență în comunitate sau în spital
d. imunosupresia rezultată în urma tratamentului cu imunosupres oare sau a unei boli care influențează răspunsul
imun
e. terapia intravenoasă (cu sau fără antibiotice)
f. dializă
g. existența unor membri de familie purtători de tulpini patogene rezistente sau multirezistente (Chastre, 2008)

10
Antibioticele se folos esc în numeroase contexte: de la tratamentul boliilor la hrănirea animalelor de producție
alimentară pentru stimularea creșterii. Factorul evolutiv este foarte important, mai ales în contextul creșterii
accentuate a producției și consumului de antibiotice. Presiunea impusă de mediu selectează tulpinile patogene
cele mai rezistente, dar problema nu va înceta să existe atunci când presiunea este îndepărtată. (Salyers și
Amabile -Cuevas, 1997).

Deși unele studii sugerează faptul că dobândirea și transferul gen elor de rezistență presupune consum energetic
ridicat pentru celula bacteriană și că genele de rezistență la antibiotice se vor inactiva odată ce presiunea
selectivă este eliminată, în natură există multe exemple care demonstrează plasticitatea bacteriilo r, în scopul
reducerii metabolismului. (Lenski, 1997; Enne și colab., 2005; Ramadhan și Hegedus, 2005).

Reducerea consumului energetic necesar transferului genelor poate fi unul dintre motivele pentru care genele de
rezistență la antibiotice supraviețuie sc procesului de selecție impus de prezența antibioticelor. (Gilliver și
colab.,1999).

Prin urmare, răspândirea de gene de rezistență la antibiotice în mediul înconjurător devine o problemă; studiile
arată că în zonele cu un nivel redus al utilizării ant ibioticelor în agricultură frecvența genelor de rezistență este
foarte scăzută (Osterblad și colab., 2001).

Tipuri de rezistență: naturală și dobândită
Rezistența la antibiotice a bacteriilor poate fi datorată unei trăsături specifice a unui microorganism care o face
în mod natural rezistentă (naturală), sau poate fi dobândită.
Rezistența naturală

Rezistența naturală reprezintă rezistența unei specii bacteriene la acțiunea unuia sau mai multor antibiotice
administrate în doze care pot inhiba creșterea sau distruge alte microorganisme.
Rezistența naturală este proprietatea intrinsecă a speciei, fiind determinată genetic. (Burton și Engelkirk, 2002)

Rezistența dobândită

Rezistența dobândită poate fi definită ca acea rezistență necaracteristică unei specii bacteriene, dar prezentă în
anumite subpopulații din acea specie în circumstanțe date.
De exemplu, antibioticul acționează ca un presor selectiv (pacientul are o infecție în care majoritatea populației

11
bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, da r există și tulpini rezistente). În aceste condiții, tulpinile
sensibile vor fi inhibate sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor supraviețui.

În practică, bacteria este considerată rezistentă când se înregistrează un raport subunitar între nivelu l seric mediu
suportat de pacient și concentrațiile minime inhibitorii sau bactericide ale antibioticului. (Todar, 2002).

În scopul de a dobândi rezistență la antibiotice, bacteriile dezvoltă mai multe mecanisme de apărare.
Toate mecanismele presupun fie modificarea materialului genetic existent, fie integrarea unui nou material
genetic.

Rezistența dobândită prezintă importanță clinică și epidemiologică din cauza transmiterii în cadrul aceleiași
specii dar și între specii îndepărtate taxonomic.

Clasifica re
Potrivit lui Swartz (Swartz, 2000), există mai multe tipuri de rezistență dobândită, în funcție de diferite criterii :
a. După momentul în care se instalează infecția, rezistența este:
– primară → starea de rezistență a bacteriei în momentul inițierii i nfecției
– secundară → dobândită de tulpina infectantă în urma terapiei
b. După numărul de antibiotice față de care se instalează rezistența:
– Monorezistență → rezistența microbiană față de un singur antibiotic
– Plurirezistența (multirezistența) → rezistența microbiană față de mai multe antibiotice
c. După viteza de instalare a rezistenței față de antibiotice:
– Rezistență rapidă de tip streptomicinic → apărută într -o singură treaptă (mutație unică, pe o singură genă)
– Rezistență progresivă de tip penicilinic → apărută în mai multe trepte (mutații succesive)
d. După prezența sau absența antibioticului:
– rezistență inductibilă → rezistența apare numai în prezența antibioticului)
– rezistența constitutivă → rezistența este independentă de prezența sau absența antibioticului)

Pseudorezistența

Prin pseudorezistență se definește ineficiența unui tratament cu antibiotice cauzat de caracteristicile organismului
gazdă sau de utilizarea incorectă a antibioticelor.

12
Pseudorezistența este un fenomen tempo rar, reversibil, care apare numai in vivo.
Dezvoltarea rezistenței este favorizată de caracteristicile farmacocinetice ale antibioticelor și de o terapie
incorectă (doză insuficientă, durată prea scurtă sau lungă a tratamentului), dar și de concentrația ac tivă
ineficientă a antibioticului la locul infecției (din cauza barierei seroase, țesuturilor nevascularizate, inactivarea
antibioticelor sau a pH -ului nefavorabil).

O altă cauză a eșecului terapeutic este rezistența relativă a bacteriilor, care sunt sen sibile in vitro, dar insensibile
in vivo (datorită reducerii metabolismului) și statusul imun al pacientului.

O forță selectivă importantă o reprezintă cantitatea mare de antibiotice utilizate în agricultură, precum și în
terapia și profilaxia din medicin a umană și veterinară (Hardy, 2002).

Mecanismele de dobândire a rezistenței bacteriene la antibiotice

La ora actuală, sunt cunoscute mai multe mecanisme care le conferă bacteriilor rezistență la antibiotice. Cele mai
studiate mecanisme sunt cele genetice , biochimice și celulare.
Aceste mecanisme pot să inactiveze antibioticul prin modificarea chimică a structurii compusului activ, prin
eliminarea din celulă, sau prin modificarea situsului țintă care nu mai este recunoscut de antibiotic.
Inactivarea enzimatică a antibioticului reprezintă mecanismul cel mai des întâlnit în natură. O strategie
alternativă utilizată de multe bacterii este modificarea situsului țintă al antibioticului.

Mecanismele genetice
Rezistența la antibiotice poate fi indusă la bacterii prin mecanisme de variație genetică, atât de natură endogenă
(mutații și translocări), cât și exogenă (recombinări cromozomiale, transfer de plasmide rezistente, transpozoni
sau integroni).
Mutații spontane la nivelul ADN -ului bacterian

Mutațiile apar fie în genele structurale, determinând modificări ale moleculelor țintă sau a sintezei enzimelor ce
inactivează antibioticul, fie în genele reglatorii cu rol în activarea pompelor de eflux pentru antibiotic și/sau
modificarea porilor membr anei celulare.

Genele de rezistență sau represorii lor pot fi activați sau inactivați prin migrarea secvențelor de inserție.
Acest tip de rezistență se întâlnește la tulpinile de Streptococcus pneumoniae rezistente la peniciline și/sau

13
cefalosporine, tul pinile de Streptococcus aureus cu rezistență la oxacilină, mutațiile determinând modificări ale
moleculelor țintă.

Rata mutațiilor spontane in vivo este de aproximativ 10−8(variază între 10−5−1011 ), dar poate crește de 200
de ori în condiții de stres oxi dativ, în prezența antibioticelor. (Livermore, 2003)

Acest fenomen se întâlnește la tulpinile de E.coli rezistente sau, în cazul fibrozei chistice, la tulpinile de
Pseudomonas aeruginosa cu multirezistență la cefalosporine, aminoglicozide și cloramfenicol.

Din cauza mutațiilor apare multirezistența prin activarea pompelor de eflux în asociere cu alterarea porinelor,
sau modificări ale moleculelor țintă. (Livermore, 2003)

Integrarea de material genetic exogen
Integrarea de material genetic exogen se realizează prin recombinări cromozomiale, prin elemente mobile
sau prin transferul genelor de rezistență între specii diferite sau intraspecie.

a. Recombinări cromozomiale

Acest tip de rezistență apare ca urmare a unor mutații în secvențele nucleotidelor cromozomului bacterian, ceea
ce determină sinteza de proteine sau alte macromolecule care interferă cu activitatea antibioticelor.
Mutațiile cromozomiale pot fi spontane sa u induse de agenți mutageni (în special de antibiotice), se transmit și
pe verticală (fără contact cu ant ibioticul) și sunt definitive. Totuși, se presupune că numărul de mutanți rezistenți
va scădea după încetarea expunerii la antibiotic. (Kuhn și col., 2 003)

Într-o populație expusă la un antibiotic, dezvoltarea rezistenței cromozomale este, de obicei, un proces gradual,
realizat prin mutații succesive. Rar însă, pentru unele antibiotice o singură mutație poate determina rezistență
(care se reflectă într -o creștere a CMI).

Apariția mutanților rezistenți este mult mai puțin frecventă in vivo decât in vitro, probabil datorită faptului că
mutațiile care duc la rezistență sunt, de obicei, asociate cu alte modificări celulare, care pot fi dezavantajoase
bacte riei. (Kuhn și col., 2003).

Din acest motiv, unii oameni de știință privesc dezvoltarea rezistenței determinată de mutații cromozomale ca pe

14
o mică problemă, comparativ cu rezistența transferabilă. În practică, aceste mutații au importanță redusă, datorită
faptului că apar rar (~10% din totalul mutațiilor). (Jackson și col., 2004).

b. Rezistența transferabilă prin elemente mobile

Bacteriile au sisteme de transfer genetic deosebit de eficiente, capabile de a interschimba și acumula genele
rezistenț ei.

Unele gene, inclusiv cele care induc rezistența, se pot transfera între elementele ADN -ului cromozomal și
extracromozomal ale bacteriilor. Mutațiile extracromozomiale sunt mult mai frecvente (~90%), deci au mare
importanță clinică.

Genele se pot tr ansmite între bacterii care aparțin aceleiași specii sau unor specii și genuri diferite (transfer
orizontal), care împart același ecosistem. Odată ce s -au activat gene ale rezistenței în elemente mobile
transferabile, bacteriile care poartă aceste gene vor rămâne donori potențiali pentru alte bacterii. (Agerso și col.,
2005).
În ultimii ani, un număr important de gene ale rezistenței au fost asociate cu transferul de ADN extracromozomal
prin plasmide, transpozonii sau integroni. S -a demonstrat că aceste el emente mobile transmit determinanți
genetici ai unor mecanisme ale rezistenței antimicrobiene și au importanță în diseminarea genelor rezistenței
între bacterii diferite. (McDermott ,2002)
Plasmide
Plasmidele sunt molecule de ADN extracromozomal, r eplicabil, care conțin genele rezistenței. (Marble, 1999)
Replicarea plasmidială are loc independent de ADN -ul cromozomal. Plasmidele sunt importante în evoluția
bacteriană, deoarece ele au rol în replicare, reglarea metabolismului, rezistența la toxinele bacteriene
(bacteriocine), antibiotice și bacteriofagi, astfel asigurând o șansă mai bună de supraviețuire și propagare.
Cu toate acestea, plasmidele nu sunt necesare pentru supraviețuirea bacteriei. Au fost identificate la majoritatea
speciilor bacterie ne, având capacitatea de a fi transferate (conjugative) sau co -transferate (non -conjugative) de la
o bacterie la alta.
Genele codificate de plasmide sunt mai mobile decât genele cromozomale deoarece plasmidele pot fi transferate
în interiorul unei specii sau între diferite specii bacteriene.

15
Printre cele mai răspândite și bine studiate plasmide sunt plasmidele de rezistență (R -plasmide), care conferă
rezistență la antibiotice sau la alți inhibitori de creștere. În general, genele de rezistență codifică pe ntru proteine
care inactivează antibioticul. (Diaz și col., 2006).
Achiziția de noi determinanți ai rezistenței poate apărea mult mai rapid prin R -plasmide decât prin mutație
genetică.
Mai multe gene de rezistență la antibiotice pot fie codificate pe o si ngură plasmidă R, iar o bacterie
multirezistentă poate conține mai multe plasmide R diferite.
O singură R -plasmidă poate codifica simultan pentru rezistență la peste 10 antibiotice diferite. Spre exemplu,
plasmida R100 determină rezistența la sulfonamide, streptomicină, cloramfenicol și tetraciclină. (Diaz și col.,
2006)
Plasmidele din izolate umane și veterinare par a fi foarte asemănătoare, sugerându -se chiar transmiterea lor de la
animale la om.
Diseminarea plasmidelor poate apărea prin distribuire clonală și prin transfer intra – și inter -special, ceea ce duce
la o înmulțire graduală a microorganismelor transportoare a uneia sau mai multor gene codificate pe plamida R.
(Diaz și col., 2006)
Rezistența plasmidică față de unul sau mai multe antibiotice (multirezistență) este dependentă de genotipul
speciei, având transmitere atât pe orizontală, cât și pe verticală. (Johnson și col., 1994).
Transpozonii
Transpozonii sunt secvențe scurte de ADN care pot transfera material genetic între plasmide, între pl asmide și
cromozomul bacterian sau între o plasmidă și un bacteriofag (Henderson, 2000).
Spre deosebire de plasmide, transpozonii nu sunt capabili să se replice independent, ei trebuie să fie menținuți
într-un replicon funcțional (cromozom sau plasmidă).
Transpozonii la bacteriile Gram -negative sunt non -conjugativi, în timp ce la bacteriile Gram -pozitive pot fi atât
conjugativi cât și non -conjugativi. (Kehrenberg și col., 1998)
Totuși, dacă un transpozon al bacteriilor Gram -negative este parte a ADN -ului u nei plasmide conjugative,
transferul orizontal este posibil. Transpozonii, inclusiv aceia care transportă genele rezistenței, sunt preluați de

16
către plasmide și apoi încorporați în ADN -ul bacterian. (Ribera și col., 2003)
De cele mai multe ori, pe aceeași plasmidă se găsesc mai mulți transpozoni, determinând transferul mai multor
determinanți ai rezistenței în cursul unei singure conjugări.
Transferul intracelular al transpozonilor între plasmide, între cromozomul bacterian și plasmide poate duce la o
rapidă dezvoltare a rezistenței în interiorul unor populații bacteriene.
Exprimarea genelor rezistenței localizate pe tranpozoni (spre exemplu, producția de enzime specifice) poate să
necesite prezența antibioticului.
Mai mult de atât, prezența antibioticulu i va stimula transferul rezistenței. Antibioticele crează un mediu în care
achiziția de determinanți ai rezistenței este avantajoasă, iar rata transferului genelor rezistenței crește.
(Kehrenberg și col., 1998)
Integronii
Integronii au fost inițial des coperiți pe plasmidele conjugative.
Integronii sunt elemente cromozomiale naturale ale exprimării genelor. Sunt compuși din două regiuni
conservate și o regiune variabilă interpusă, care conține casete ale genelor de rezistență la antibiotice (Hall și
Collis, 1995).
Casetele genelor sunt elemente care includ o singură genă și un situs de recombinare. Au fost identificate mai
mult de 40 de casete, dintre care majoritatea conțin gene ale rezistenței (Agerso și col., 2005).
De exemplu, modelul rezistenței caracteristice la cromozomul de Salmonella typhimurium DT104 este asociat cu
prezența integronilor (Swartz, 2000).
Una dintre regiunile conservate ale integronului conține gena integrazei, care este responsabilă pentru inserția
specifică la situsul din cas ete (Swartz, 2000).
Integronii pot fi localizați în ADN -ul cromozomal, dar mai des sunt localizați în plasmide (Diaz și col., 2006)
sau transpozoni și sunt, prin urmare, elemente mobile.

17
Transferul de gene pe verticală
Frecvența mutațiilor spontane care conferă rezistență la antibiotice este de aproximativ 10−8−10−9
Acest lucru înseamnă că una din fiecare 10−8−10−9bacterii are potențialul de a dezvolta rezistență la
antibiotice prin procesul de mutație.
În cazul E. coli se estimează că rezistența la streptomicină este dobândită la o rată de aproximativ 10−9când este
expus la concentrații mari de streptomicină. (Livermore, 2003)
Deși mutația spontană este foarte rară, rata de creștere foarte rapidă și num ărul mare contribuie la dezvoltarea
într-un timp scurt a mecanismelor de rezistență.
Odata ce genele de rezistență s -au dezvoltat, ele sunt transferate direct la toate bacteriile în timpul replicării
ADN -ului. Acest proces este cunoscut sub numele de trans fer de gene pe verticală sau evoluție verticală.
Acest proces se desfășoară după principiile darwiniste de selecție naturală: o mutație spontană în cromozomul
bacterian conferă rezistență unei singure bacterii dintr -o populație de bacterii.
În mediu selectiv al antibioticului, tipul sălbatic (non mutant) este ucis și mutantul rezistent crește.
Transferul genelor pe orizontală
Transferul lateral sau pe orizontală al genei (HGT) este un proces prin care porțiuni mici din materialul genetic
pot fi transferate între bacterii ale aceleiași specii sau chiar între diferite specii.
Efectele combinate ale creșterii rapide la populații mari de celule, procesul epigenetic de mutație și selecție,
precum și capacitatea de a transfera gene, pot explica fre cvența mare de apariție a rezistenței care apare la unele
bacterii.
Așa cum am precizat mai sus, elementele genetice mobile extracromozomiale implicate în trasnferul genelor de
rezistență sunt plasmidele, transpozonii și integronii.
Există cel puțin trei mecanisme posibile de transfer pe orizontală (HGT), echivalente cu cele trei procese
generice de schimb de material genetic între bacterii.
Acestea sunt transformarea, transducția (mediat de bacteriofag) sau conjugarea (prin pili de conjugare).

18
Integra rea genei de rezistență este urmată de recombinări între specii înrudite sau între specii îndepărtate
taxonomic.

Figura 1 . Transfer vertical și orizontal (După Brock biology of microorganisms, 2014). Transferul pe verticală
apare atunci când celula se divide. Transferul pe orizontală apare atunci când o celulă schimbă material genetic
cu o alta celulă. La procariote, transfe rul pe orizontală apare prin unul din cele trei mecanisme : conjugare,
transformare și transducție.
1. Conjugarea se produce atunci când există contact direct celulă -celulă între două bacterii (care nu trebuie să fie
înrudite filogenetic) și se transferă ADN plasmidial. Acest proces este considerat a fi mecanismul principal al
transferului genelor pe orizontală și se realizează prin intermediul plasmidelor, transpozonilor și integronilor.
2. Transformarea apare atunci când materialul genetic este preluat d irect de un alt microorganism, în urma
distrugerii unei bacterii (Kehrenberg, 2000; Furushita, 2003).
3. Transducerea apare atunci cand bacteriofagii transferă ADN între două bacterii strâns înrudite filogenetic.

19
Genele care codifică pentru proteinele R PP

Analiza filogenetică a fost folosită pentru analiza istoriei evoluției genelor de rezistență la antibiotice, care
codifică pentru proteinele ribozomale cu rol de protecție (RPP).
Aceste proteine conferă rezistență la tetraciclină (Connell și colab., 2 002, 2003).

Analiza filogenetică a evidențiat evoluția timpurie și independentă la opt grupuri de RPP cu mult înainte de „era
antibiotic“ (Aminov și colab., 2001).

Nu există dovezi care să susțină ipoteza transferului de gene de rezistență de la tulpini le bacteriene care produc
antibiotic la alte bacterii comensale. (Aminov și colab., 2001)

Recent, această analiză a fost refăcută cu un set de date actualizat. Această analiză a confirmat, încă o dată,
originea monofiletică a genelor Tet (gena care codifi că pentru proteina RPP).

Analiza secvențelor de ADN de la bacteriile Streptomyces rimosus și Agrobacterium nu arată transferul de gene
orizontal. (Aminov și colab., 2007)

Deși încă nu a fost confirmat prin experimentele de clonare a genei și secvențiere, există indicii că unele gene tet
din specii de Streptomyces , în special cele care codifică RPP, pot fi detectate la Mycobacterium (Pang și
colab.,1994).

Genele de rezistență la antibiotice ale bacteriilor din sol codifică pentru proteine cu rol funcțional (protecție
împotriva antibioticelor sintetizate de către producători). Este greu de explicat prezența acestora și modul de
funcționare în bacteriile pro ducătoare de antibiotice din alte nișe ecologice, cu sau fără expunere limitată la
microbioza din sol.

O posibilă explicație pentru acest fenomen ar putea fi faptul că aceste gene ar fi avut inițial alte funcții
metabolice în epoca preantibiotic. (Lafont aine și colab., 1998)

Antibioticele țintesc moleculele implicate în mecanisme importante din celulă, folosite pentru susținerea și
protejarea nevoilor celulare de bază, cum ar fi: procesele celulare vitale, păstrarea integrității peretelui celular și
biosinteza compușilor vitali pentru celulă. (Alekshun și Levy, 2007)

20
Rezistența la antibiotice a fost observată la multe tulpini bacteriene de colecție, izolate înainte de folosirea acestor
antibiotice în practica clinică, ceea ce întărește ideea că populații le bacteriene vin în contact cu asemenea compuși în
mediul lor natural de viață.

De asemenea, unii metaboliți toxici chiar dacă nu sunt antibiotice puternice, pot spori activitatea altor antibiotice față
de care s -a instalat rezistența la numeroase tulpi ni bacteriene.

Genele Tet și Erm

Pe de altă parte, analiza filogenetică sugerează că răspândirea rapidă a genelor rezistente la antibiotice între
specii de bacterii patogene îndepărtate filogenetic este un eveniment evolutiv recent și este cel mai proba bil
cauzat de tranferul pe orizontală între bacterii din „epoca de antibiotice“.

Figura 2 . În figura de mai sus este ilustrat transferul de gene de rezistență între bacterii Gram -pozitive și bacterii
Gram -negative. Dovada transferului constă în analiza secvențelor genei de interes. Spre exemplu, gena Tet (M)
se găsește atât la bacteriile Gram -pozitive cât și la bacteriile Gram negative. Această genă este transferată de
transpozonul Tn916. (După Brock biology of micro organisms, 2014)

Gena Tet (W) este prezentă la specii precum : Megaspaera elsdenii, Bifidobacterium longum, Roseburia

21
hominis, Mitsuokella multacida și Butyrivibrio fibrisolvens, fapt care confirmă ipoteza transferului recent pe
orizontală al genei între bacterii din intestinul uman, de la porcine și o bacterie probiotic (Barbosa și colab.,
1999; Kazimierczak și colab., 2006).

Marea majoritate a bacteriilor care poartă genele tet sunt orale, intestinale sau genitale. De aceea, riscul
transferului pe oriz ontală este mare (Salyers și colab., 2004).

În cazul genelor erm situația este asemănătoare, în special pentru variantele erm (B), erm (C), și erm (G),
demonstrând penetranța înaltă, fiind întâlnite la bacterii Gram negative și pozitive.

Analiza evoluț iei și răspândirii genelor tet în specii de bacterii care colonizează intestinul a evidențiat faptul că
aceste gene au fost răspândite rapid în rândul populației, atât în spitale cât și în comunitate, în ultimii 30 de ani
(Shoemaker și colab., 2001).
Aceas tă perioadă de timp coincide cu ¨epoca antibioticelor¨.

Rezultatele analizei moleculare a genelor erm (B) izolate de la om, porcine, păsări de curte și Enterococcus
faecium sugerează faptul că transferul orizontal al genelor de rezistență la antibiotice este mai des decât
transmiterea directă a tulpinilor rezistente (De Leener și colab., 2005).

Din punct de vedere clinic, este de interes analiza penetranței genelor de rezistență la antibiotice la bacteriile
patogene.

Analiza moleculară a genelor care c odifică pentru tetraciclină din izolatele clinice arhivate sugerează că acest
proces ar fi putut apărea cu câțiva ani înainte de începutul utilizării antibioticelor (Atkinson și colab., 1997;
Cousin și colab., 2003).
Mecanismele biochimice de rezistență
Principalele mecanisme biochimice sunt : inactivarea enzimatică a antibioticelor, impermeabilitatea membranei
celulare față de antibiotice, efluxul de antibiotic, modificări ale moleculelor țintă (subunități ribozomale,
modificări ale enzimelor țintă sau mo dificarea precursorilor peretelui celular)
Inactivarea enzimatică a antibioticelor este un mecanism de rezistență întâlnit la betalactamine,
aminoglicozide, cloramfenicol și macrolide.

22
Plasmidele rezistente și, mai rar, cromozomii, codifică enzimele de in activare a antibioticelor. Se cunosc mai
multe categorii de enzime de inactivare: a antibioticelor betalactamice, a antibioticelor aminoglicozide, a
cloramfenicolului.
Betalactamazele
Sunt enzime descoperite la majoritatea speciilor bacteriene, care au cap acitatea de a hidroliza inelul betalactam
al antibioticelor betalactamice, ceea ce duce la inactivarea completă a antibioticului.
Nivelul de rezistență mediat de betalactamaze este determinat de mai mulți factori, cum ar fi: rata de hidrolizare
a antibioti cului, afinitatea enzimelor față de antibiotic, cantitatea de betalactamaze produse în celulă, rata de
difuzie a antibioticului prin membrana externă.
Rezistența enzimatică este constitutivă sau inductibilă, genele fiind localizate plasmidic sau cromozomial.
(Slavcovici, 2009)
Genele de rezistență sunt localizate la nivelul transpozonilor sau plasmidial și sunt transferate prin conjugare.
La bacilii Gram -negativ betalactamazele sunt extrem de variate, acesta fiind mecanismul major al rezistenței l or.
Rezistența prin betalactamaze se asociază frecvent și cu alte mecanisme de rezistență, determinând apariția
tulpinilor multirezistente, în special în cazul infecțiilor nosocomiale.
Inactivarea enzimatică a aminoglicozidelor (prin foforilare, acetilar e, nucleotidare) are loc în timpul transportului
transmembranar.
Producerea de β -lactamaze constituie principalul factor de rezistență al bacteriilor Gram negative la antibioticele
β-lactamice. β -lactamazele sunt enzime care clivează ciclul β -lactamic și i nactivează antibioticul. (Mihăescu și
colab., 2007)

Potrivit lui Ambler (1980), în funcție de secvența de aminoacizi și de tipul de molecule hidrolizate, β –
lactamazele se clasifică în patru clase: A, B, C și D.

În clasele A, C și D sunt incluse enzimele cu resturi de serină la situsul activ, iar în clasa B sunt enzimele zinc –
dependente. Enzimele grupate în clasa A sunt cele mai frecvente, urmate de cele din clasa C. (Nordmann și
colab., 2011)

23
Enzimele clasei A
Enzimele grupate în clasa A sunt cele mai f recvente, urmate de cele din clasa C.

Enzimele clasei A produse de bacterii Gram pozitive și Gram negative hidrolizează preferențial penicilinele, iar
cele ale clasei C cefalosporinele. Multe dintre genele care le codifică se găsesc pe plasmide, astfel în cât au
suferit numeroase mutații responsabile de apariția unor noi fenotipuri de rezistență la antibiotice. (Kotra și
colab., 2002; Walther -Rasmussen și colab. 2007)

În literatura de specialitate s -a evidențiat apariția unor variante de β -lactamaze ale c lasei A rezistente la
inhibitori, inițial la enzimele de tip TEM, fenotip denumit IRT ( Inhibitor Resistant TEM), iar ulterior și la
enzimele SHV. (Lin S și colab., 1998)

Enzimele de tip β -lactamaze cu spectru extins (ESBL) sunt variante moleculare sensibi le la inhibitorii β –
lactamazelor, care și -au extins profilul substraturilor hidrolizate, incluzând alte β -lactamine (spre exemplu
oxiimino -cefalosporine, cefamicine și monobactami). (Jacoby și colab., 2005)

Majoritatea β -lactamazelor de tip ESBL aparțin f amiliilor SHV, TEM și CTX -M. (Naas și colab., 2008)

Enzimele din clasa B

Enzimele din clasa B sunt metalo β -lactamaze (MBL) care conțin ioni de Zn2+ la situsul activ. Acestea pot
hidroliza o gamă largă de substraturi, inclusiv carbapenemele, care sunt rezistente la acțiunea majorității
celorlalte clase de enzime. ( Queenan și colab., 2007)

Genele de tip bla MBL sunt localizate cromozomal, plasmidial, sau se pot regăsi în integ roni, ceea ce permite
diseminarea rapidă între diferite specii și chiar genuri bacteriene.

Prima MBL, codificată cromozomal, a fost detectată la bacterii comensale sau oportuniste ( Bacillus cereus ,
Aeromonas sp. și Stenotrophomonas maltophilia ). ( Queenan și colab., 2007)

Cele mai comune MBL codificate de elemente genetice mobile sunt cele din familiile VIM și IMP, ale căror
gene codificatoare sunt localizate pe integroni.

Carbapenemaza NDM -1 (New Delhi Metallo -β-lactamase) a fost izolată în 2008 de la o tulpină de K.

24
pneumoniae în Suedia, de la un pacient din India. Gena bla NDM -1 nu este situată în structura unui integron, dar
adiacent genei bla NDM -1 sunt localizate diferite fragmente de inserție (IS) care contribuie la mobilizarea acesteia.
(Yong și co lab., 2009)

Secvența IS Aba125 sau fragmente ale acesteia ( ΔISAba125 ) au fost identificate totdeauna în aval de gena
bla NDM -1 și se consideră că acest fragment de inserție a fost mobilizat împreună cu bla NDM -1 de la o tulpina
bacteriană de origine necunoscută. (Poirel și colab., 2011)

Enzimele grupate în clasa C

Enzimele grupate în clasa C sunt cefalosporinaze de tip AmpC (genă de rezistență la ampicilină, localizată
cromozomal).

Aceste enzime sunt codificate de gene cromozomale, dar și plasmidia l (spre exemplu DHA -1, CMY -2, ACT -1).
(Philippon și colab., 2002)

Bacteriile au fenotip de tip AmpC sunt rezistente la peniciline, la asocierea unui antibiotic β-lactamic cu un
inhibitor de β-lactamază și la cefalosporine (cefoxitin, cefotetan, ceftriaxonă și cefotaxim).

Producerea enzimelor de tip AmpC poate fi derepresată prin inducție de către anumite β-lactamine, ca de
exemplu cefoxitinul. (Vanwynsberghe și colab., 2009)

Enzimele din c lasa D

Enzimele din clasa D sunt rezistente la inhibitorii serin -β-lactamazelor din clasa A și pot determina fenotipuri de
rezistență la peniciline, cefalosporine, cefalosporine de spectru extins (BLSE de tip OXA) și carbapeneme.
Clorura de sodiu poate in hiba anumite oxacilinaze care hidrolizează carbapenemele. (Naas și colab., 1999)

β-lactamazele clasei D care hidrolizează carbapenemele (CHDL – Carbapenem Hydrolysing class D β-
Lactamases) se găsesc în special la specii de Acinetobacter (de exemplu OXA -23, OXA -24.), dar și la
enterobacterii (OXA -48, rezultată în urma transferului genei OXA -54 de la o tulpină de Shewanella oneidensis ).
Deoarece hidrolizează carbapenemele cu o rată mai mică decât carbapenemazele din clasele A și B, enzimele de
tip OXA -48 sun t dificil de identificat în screening -ul de rutină din spitale. (Poirel și colab., 2012)

25
Enzimele de modificare a aminoglicozidelor
Aminoglicozidele sunt modificate la nivelul grupărilor amino și hidroxil prin mecanisme de fosforilare, acetilare
sau adenilare, in final aceste modificări duc la inactivarea antibioticelor.
Nucleotidiltransferaza, acetiltransferaza, fosfotransferaza sunt codificate de gene plasmidice sau transpozoni.
Enzimele de inactivare a cloramfenicolului
Rezistența este de natură plasmidială și este cauzată de producerea de către bacterie a unei enzime,
acetiltransferaza, care provoacă acetilarea antibioticului, det erminând inactivarea lui.
Rezistența enzimatică se întâlnește în infecțiile cauzate de stafilococi, streptococi și enterobacteriacee.
Mecanisme celulare de dobândire a rezistenței la antibiotice
Reducerea permeabilității membranei externe
Lipopolizaha ridele membranei externe, la tulpinile Gram -negativ, opresc pasajul antibioticelor hidrofobe.
Pasajul antibioticelor hidrofile este facilitat de existența porilor membranari.
Permeabilitatea membranei externe față de antibiotice este în strânsă legatură c u numărul porinelor, mărimea și
proprietățile fizico -chimice ale antibioticelor.
Reducerea permeabilității membranei prin mutații care afectează porinele determină rezistența la betalactamine
și aminoglicozide.
Acest mecanism de rezistență se întâlnește l a Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp. și
Bacteroides sp.
Reducerea permeabilității membranei citoplasmatice
Pasajul antibioticelor prin membrana citoplasmatică are loc prin transport activ (cu consum de energie), bazat pe
diferenț a de potențial electric de la nivelul membranei celulare.
Acest tip de rezistență apare frecvent la aminoglicozide și este cauzat de mutațiile cromozomiale care afectează
permeabilitatea membranei.

26
Acest mecanism de dobândire a rezistenței la antibiotice a fost identificat la stafilococi, E.Coli, și Salmonella sp .
Rezistența prin eflux de antibiotic
Efluxul de antibiotic se realizează la nivel membranar prin sisteme de transport cu consum de energie și este o
cauză importantă a rezistenței sau multirez istenței la Enterobacteriaceae (apare la E. coli,Pseudomonas
aeruginosa, S. pneumoniae , streptococi și stafilococi). (Issam Raad, Hend Hanna și colab., 2007)
Rezistența prin eflux de antibioticdetermină rezistența tulpinilor de Str. pyogenes, Str. pneumoni ae, S. aureus
(prin gena mef și msr) la macrolidele clasice, azalide și streptogramine B.
Mecanismele de eflux în asociere cu prezența betalactamazelor, contribuie la rezistența tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa la toate betalactaminele.
Alte ipoteze r eferitoare la dobândirea rezistenței la antibiotice
Insulele de patogenitate și evoluția virulenței

Insulele de patogenitate se găsesc atât la bacterii Gram pozitive cât și Gram negative. Acestea sunt
regiuni ADN de până la 200 kb care conțin mai multe gene de rezistență.

Compararea genomurilor bacteriilor patogene cu cele ale rudele lor inofensive dezvăluie adesea insule
cromozomiale care codifică pentru factori de virulență. (Van der Poll și Opal, 2008).

Secvența lor diferă mult de a altor gene cromozomale, ceea ce deno tă ca sunt achiziții relativ recente în evoluție.

Ar putea să apară prin integrarea unui element genetic exogen – fagul. Insulele de patogenitate sunt prezente în
anumite tulpini ale bacteriei Gram pozitive Staphylococcus aureus . (Van der Poll și Opal, 2008)
Rolul jucat de aceste insule în transferul lateral al genelor este încă neelucidat, dar este posibil să fie cauzat de
procentul ridicat de guanină și citozină.
Endosporii bacterieni
Endosporul este considerat în prezent o forma primitiva de citodifer entiere la procariote. (V.Lazăr, 2015)
Starea de latență metabolică sau criptobioză determină rezistența sporilor la temperaturi de peste 100 (pâna la

27
180 șC), uscăciune și radiații UV, la substanțe antimicrobiene (antiseptice, antibiotice). De aceea au ro l
important în diseminarea bacteriilor în natură.
Importanța medicală a endosporilor este determinată de faptul că unele bacterii patogene sunt sporogene
(Clostridium botulinum, C. tetani sau C. perfringens ). (V.Lazăr, 2015)

Printre speciile care colon izează omul, numai Clostridium sp . și Bacillus sp . produc endospori. Aceste bacterii
anaerobe se multiplică în intestin, sunt apoi eliminate și ajung în apele uzate și sol, unde supraviețuiesc sub
formă de spori.

Printre factorii care contribuie la rezis tența la căldură se numără peretele gros și nivelul ridicat de deshidratare.
Atunci când un spor găsește condiții prielnice de dezvoltare (nutrienți, temperatură, presiune osmotică, etc.) se
întoarce la starea vegetativă și se pot reproduce.
Biofilmul
Biofilmul reprezintă o comunitate de microorganisme înglobate într -o matrice proprie secretată de bacterii
(matrice polizaharidică) sau la nivelul suprafețelor biotice sau abiotice. (Issam Raad, Hend Hanna și colab.,
2007)
Aderența este un factor determinant al colonizării unor situsuri specifice la plante și animale, o etapa timpurie
importantă în procesul infecțios, fiind o condiție sine qua non a colonizării organismelor parazitate.
Recent s -a descoperit că aderența determină modificarea expresiei genice ( activare/represie), așa încât celulele
biofilmului sunt diferite din punct de vedere fenotipic, de celulele libere din suspensie.
Biofilmul influențează nivelul de expresie fenotipică a tulpinilor rezistente.
Una din consecințele formării biofilmelor cu i mplicații medicale, este aceea că microorganismele componente
sunt mult mai rezistente la antibiotice și la mecanismele imunitare ale gazdei. (V. Lazăr, 2010)
Bacteriile aderă în general la epiteliile mucoaselor, a celule epiteliale cheratinizate, endoteli ilor, oase, dinți, dar
și la suprafețele diverselor dispozitive implantate (catetere, proteze).
Formarea biofilmului are loc în mai multe etape:
a. aderarea microorganismelor la nivelul suprafeței

28
b. formarea matricei polizaharidice
c. creșterea și dezvoltarea biofilmului
Semnalizarea intercelulara este implicată în reglarea exprimării genelor și dezvoltarea de biofilme, astfel că
cercetările actuale au ca scop depistarea si testarea unor produși (de origine microbiană, vegetală sau animală)
care int erferă cu semnalizarea intercelulară dintre microorganismele biofilmelor. Acești compuși poartă numele
de inhibitori de QS (QSI). (Lazăr, 2011)
Bacteriile care formează frecvent biofilm sunt: stafilococii, streptococii, enterococii, Ps.aeruginosa , Klebsiel la
sp. și E.coli .
Din cauza stresului metabolic indus de radicalii de oxigen, a unui potențial redox scăzut și a insuficienței
substanțelor nutritive, apar tulpini patogene cu diverse fenotipuri de rezistență (rezistența prin eflux, prin
modificări ale mol eculelor „țintă“ ).
Mai mult, biofilmul prezintă o structură care împiedică adsorbția antibioticelor și a componentelor răspunsului
imun în profunzimea biofilmului.
Un procent considerabil dintre infecțiile umane implică formarea de biofilme, de aceea te rapia trebuie sa se
bazeze pe doze de antibiotice necesare omorârii bacteriilor din biofilme si nu pe cele care pot ucide celulele
libere. (V. Lazăr, 2011)
Prevenția dobândirii rezistenței la antibiotice
Se realizează în mai multe feluri :
a. Prin vaccina re
b. Diagnostic bacteriologic rapid, asociat cu un tratament antibiotic corect. Diagnosticul rapid se poate realiza
prin introducerea testelor de diagnostic microbiologic cu acuratețe mare (PCR) și utilizarea markerilor genetici.
c. Utilizarea rațională a antibioticelor
d. Utilizarea restrictivă a unor antibiotice care se adresează țintit bacteriilor rezistente pentru a limita presiunea
de selecție exercitată de antibiotic
e. Dozele și durata corectă a terapiei cu antibiotice

29
f. Implicare comunității med icale și a organizațiilor guvernamentale în supravegherea, prevenirea și controlul
rezistenței.
g. Colaborarea cu sectorul veterinar și industrial, în scopul reduceri iutilizării nejustificate de antibiotice.
h. Educarea populației și promovarea mijloacelo r simple, dar eficiente de igienă individuală.
Istoricul bolilor infecțioase
Bolile infecțioase au fost descrise de mii de ani, dar etiologia lor a fost elucidată abia acum un secol.
Medicul grec Hipocrate credea că infecțiile sunt cauzate de „modificări“ în aer. Teoria miasmatică privind bolile
infecțioase a rămas populară în lumea medicală până la începutul secolului XIX, în ciuda faptului că A. Van
Leeuwenhoek, folosind un microsco p a descris bacterii încă din secolul al XVII -lea.
Louis Pasteur a pus bazele microbiologiei moderne odată cu infirmarea teoria generației spontane și acceptarea
teoriei celulare (sau teoria germenilor). Deși această teorie mai fusese propusă anterior, Pa steur are meritul de a
fi dovedit printr -o serie de teste că infecțiile nu apar spontan, ci sunt produse de microorganisme.
Pasteur a arătat că fermentația poate fi prevenită dacă aerul care ajunge la mediul de cultură este trecut printr -un
filtru sau pri ntr-un tub lung ținut în flacără. Prin aceste experimente, Pasteur nu numai că a infirmat definitiv
teoria generației spontane, dar a și pus bazele tehnicilor moderne de sterilizare.
În 1884, medicul german Robert Koch a publicat Postulatele lui Koch. Scop ul acestor postulate era de a stabili o
relație cauzală între un microb și boala pe care o cauzează.
În anul 1929 Alexander Fleming a descoperit penicilina. Acesta a observat o zonă de inhibare a creșterii
bacteriene în jurul unei colonii de Penicillium notatum .
Datorită acestei descoperiri, în următoarea perioadă numeroase alte antibiotice au fost descoperite, numarul
estimat la ora actuală fiind între 5 000 si 10 000 de antibiotice.

Diagnostic
Bacteriile sunt componenta predominantă a florei, proliferează pe mucoase, îndeosebi, în
tractul gastrointestinal, unde se găsesc peste 400 de specii diferite. Peste 99% dintre bacteriile din flora normală
sunt anaerobe, îndeosebi Gram negative. O infecție are două tipuri de surse: o sursă primară și secu ndară. Prin

30
sursă primară de infecție înțelegem locul în care agentul patogen este prezent și se reproduce.
Sursele secundare de infecție sunt obiecte, materiale sau persoane care contribuie la transmiterea agenților
patogeni de la sursa primară la alte pe rsoane.
Identificarea agenților patogeni se bazează pe caracteristicile morfologice, fiziologice și chimice ale acestora.
(Tabel 1)
Infecțiile pot fi diagnosticate, fie direct, prin detectarea agentului patogen sau indirect, prin detectarea
anticorpilor pr oduși. Printre metodele directe clasice se numără examinarea microscopică, cultura. Pentru
detecția directă se pot folosi și anticorpi monoclonali sau policlonali.
În diagnosticul de laborator este o necesitate ca prelevarea de probe și transportul acestor a să se efectueze în
condiții optime, pentru a nu fi contaminate.
Transportul trebuie să fie efectuat în containere speciale, pe medii care conțin substanțe nutritive pentru bacterii,
pentru a favoriza o creștere selectivă a bacteriilor de interes, sau pe medii simple.

Tabel 1. Principiul esențial al identificării bacteriene constă în încadrarea taxonomică a bacteriilor din cultură pe

31
baza analizei morfologice (spre exemplu colorare), fiziologice (determinate cu medii indicatoare) sau a
caracteristicile chimice. Metodele moleculare genetice de diagnostic vor juca un rol important în viitor.

Tehnici moleculare de diagnostic
Obiectivul principal al tehnicilor moleculare de identificare bacteriană îl reprezintă detecția directă a secvențelor
de nucleotide în materialul testat.
Aceste metode sunt folosite, în special, pentru detecția bacteriilor care sunt foarte dificil de cultivat sau au o rată
mică de proliferare.
În principiu, se poate utiliza o rice secvență de ADN a unei specii pentru genotipare, dar de cele mai multe ori se
analizează regiunile specifice ale genelor care codifică pentru ARNr 16S și ARNr 23S.
O anumită regiune a ARNr 16S se întâlnește în toate bacteriile. Între aceste secvențe extrem de bine conservate
sunt și altele, care sunt specifice pentru o specie sau gen.
Folosind primeri care pot recunoaște regiunile conservate ale ADNr 16S, secvența de interes poate fi amplificată,
iar mai apoi secvențiată. Secvența astfel obținută est e apoi identificată prin compararea cu secvențele înregistrate
în baze de date.
Detecția directă a antigenelor specifice pentru anumite specii sau genuri se poate realiza cu ajutorul anticorpilor
mono sau policlonali prezenți în probă, ceea ce permite un d iagnostic rapid (spre exemplu, în meningita acută se
pot evidenția antigene bacteriene în lichidul cerebrospinal).
Cu toate acestea, această tehnică nu este la fel de sensibilă ca metodele clasice.
Abordări terapeutice
Microorganismele patogene posedă o se rie de caracteristici care le permit să inducă boli infecțioase.
Aparitia patogenilor rezistenți la antibiotice (spre exemplu enterococii care sunt rezistenți la toate antibioticele
cunoscute) întărește ideea că am intrat în era ¨postantibiotice¨.
De obice i, bolile infecțioase apar ca urmare a două capacități majore a microorgansimelor, determinate de genele
exprimate în plasmida R:

(1) capacitatea agentului patogen să se atașeze și să colonizeze un țesut specific al gazdei

32
(2) producția de toxine, enzime și alte molecule care scad imunitatea gazdei. Multe bacterii produc, de asemenea,
proteine care inhibă sau distrug specii înrudite sau chiar diferite tulpini ale aceleiași specii. Acești agenți, numite
bacteriocine, sunt analoage cu antibioticele, dar au u n spectru mai restrâns de
activitate decât antibioticele. Genele care codifică pentru bacteriocine și proteinele necesare pentru prelucrarea și
transportul acestora sunt, de obicei, găsite în plasmide.
Alte plasmide conferă proprietăți metabolice speciale celulelor bacteriene, cum ar fi capacitatea de a degrada
poluanți toxici.
Substanțele chimice sunt folosite în mod curent pentru a controla creșterea microbiană. Un agent antimicrobian
este un produs chimic natural sau sintetic, care ucide sau inhibă creșt erea microorganismelor.
Compușii care au capacitatea să ucidă microorganismele sunt numiți agenți bactericizi, fungicizi sau viricizi, în
funcție de tipul de microorganism. Există și agenți are nu ucid, ci doar inhibă creșterea microorgansimelor.
Aceștia poartă numele de compuși bacteriostatici, fungistatici și viristatici.
Activitatea antimicrobiană a unui antibiotic se realizează prin măsurarea a 3 parametri, care variază în funcție de
concentrația antibioticului și de timpul său de acțiune:
a. CMA – concentrația minimă activă. Este concentrația la care antibioticul poate induce anumite perturbări în
activitatea metabolică a microorganismelor, fară a afecta capacitatea de multiplicare și viabilitatea lor
b. CMI – concentrația minimă inhibitorie a unui antibiotic este cea mai mică concentrație care inhibă complet
multiplicarea unei tulpini patogene
c. CMB – concentrația minimă bactericidă a unui antibiotic este concentrația minimă care omoară tulpina
Din punct de vedere microbiologic, organismele reziste nte sunt acelea care posedă orice tip de mecanism al
rezistenței sau gene ale rezistenței. Concentrația minimă inhibitorie (CMI) a unui antibiotic dă informații
cantitative despre susceptibilitatea bacteriană.
De obicei, un organism este considerat suscept ibil atunci când CMI este mai mic decât limita indicată de
diversele laboratoare abilitate pentru astfel de standarde (Sockett. și col., 2006).
Înainte de a administra un antibiotic trebuie să cunoaștem CMI determinată in vitro, dar și calitățile
farmacoci netice (de exemplu, posibilitatea realizării concentrației active la nivelul locului de infecție).
Tehnica de evidențiere a sensibilității la antibiotice a unei tulpini microbiene se numeste antibiogramă.

33
Dupa determinarea spectrului de sensibilitate la a ntibiotice prin tehnici calitative (tulpina microbiană de testat
este pusă în contact cu diferite antibiotice într -o anumită concentrație), se pot folosi teste cantitative pentru
determinarea valorii CMI (tulpina microbiană este pusă în contact cu concentr ații crescătoare ale aceluiași
antibiotic).

Clasificarea antibioticelor
Figură 3. Adaptată după Brock biology of microorganisms, 2014. În figura de mai sus se poate observa
mecanismul de acțiune al antibioticelor, în funcție de situsul la nivelul căruia acționează. 1. Sulfonamidele sunt
antibiotice care inhibă sinteza enzimei PABA (acidului para -aminobenzoic) , esențial pentru sinteza a cidului
folic și a derivatului acestuia THFA (acid tetrahidrofolat); 2. Beta -lactamazele sunt principala clasă de
antibiotice care inhibă sinteza peptidoglicanului din componența peretelui celular; 3. Aminoglicozidele se

34
fixează la nivelul peretelui celul ar bacterian, traversează celula și se fixează ireversibil de ribozomi astfel încât
inhibă sinteza proteinelor. 4. Quinolonele inhibarea sintezei ADN -ului prin blocarea replicării ADN. 5.
Inhibitorii funcției membranei plasmatice se leagă de fosfolipidele membranei bacteriene, alterând funcționarea
pompelor de K+ si Na+ și duc la liza celulei.
În funcț ie de ținta de acțiune, antibioticele sunt:
1. Antibiotice care a cționează asupra peretelui bacterian
Principalele clase de antibiotice cu țintă de acțiune asupra peretelui celular al bacteriilor Gram negative sunt
antibioticele β–lactamice.

Familia acestor antibiotice se împarte în patru clase: penicilne, cefalosporine, carbapeneme, monobactami. Așa
cum se poate observa în figura de mai sus, antibioticele β – lactamice inhibă sinteza peretelui celular, respectiv a
peptidoglicanului (mureinei).

Rezistența la antibioticele β–lactamice este cauzată de: mutațiile PBP (penicilin binding protein, enzim a tinta a
antibioticelor), impermeabilitatea membranei externe și de efluxul pompelor ionice.

Penicilinele sunt antibiotice inhibitoare ale sintezei peretelui bacterian. Acestea sunt derivate din acidul 6 –
aminopenicilanic și, în funcție de modul de obține re sunt peniciline de biosinteză (penicilina G, penicilina V,
penicilina N), peniciline de semisinteză (oxacilină, ampicilină) și peniciline de sinteză chimică (peneme,
monobacteme). Penicilinele sunt produse de anumite bacterii Gram pozitive, dar și de un ii fungi. (Angelescu,
1998)

Penicilinele de semisinteză sunt clasificate la rândul lor în peniciline cu spectru îngust (peniciline
antistafilococice) și peniciline cu spectru larg (aminopeniciline, carboxipeniciline, ureidopeniciline,
amidinopeniciline). (Oniga, 2003)

Spectrul de ac tivitate al penicilinelor naturale asupra bacteriilor Gram -negative este mic, acționând asupra
speciilor Neisseria meningitidis și N. gonorrhoeae .

De aceea , au fost realizate peniciline de semisinteză care cuprind un spectru mult mai mare de activitate, i nclusiv
în cazul rezistenței la sucul gastric (spre exemplu cefalosporinele).

Cefalosporinele sunt un grup de antibiotice cu spectru larg de acțiune, fiind antibiotice β–lactamice

35
semisintetice. Au fost descoperite într -o cultură cu Cephalosporium acremon ium. Acestea sunt derivate alea
acidului 7 -aminocefalosporanic și diferă de peniciline prin prezența unui ciclu hexagonal de dihidrotiazină.
Mecanismul de acțiune este asemănător cu cel al penicilinelor dar sunt mai puțin sensibile la acțiunea β–
lactamazelo r.

Cefalosporinele reprezintă cel mai folosit grup de antibiotice și, în funcție de spectrul antimicrobian, sunt
împărțite în patru generații:
1. Generația I – Cefalotină, Cefazolină, Cefalexin, Cefadroxil, Cefradin
2. Generația II – Cefamandolă, Cefuroxim, Cefoxitim, Cefotiam, Cefaclor
3. Generația III – Cefotaxim, Ceftriaxon, Ceftazidim, Latamoxef, Cefixim
4. Generația IV – Cefepime, Cefpirome
2. Antibiotice care acționează asupra membranei plasmatice

Antibioticele din aceasta clasă sunt produse de diferite specii de Bacillus , având același spectru
antibacterian și sunt împărțite în polimixină, bacitracină și gramicidină.
Polimixinele acționează asupra bacteriilor Gram negative: Aerobacter sp., Bordete lla sp., Enterobacter sp.,
Salmonella sp.. Fac parte dintr -o familie de peptide cationice nonribozomice eficiente împotriva bacteriilor
Gram negative. Acestea acționează la nivelul membranei lipidice, ducând la liza celulei. Ca și mod de acțiune,
polimixine le se leagă de fosfolipidele membranei bacteriene, alterând funcționarea pompelor de K+ si Na+.

3. Antibiotice cu țintă de acțiune replicarea ADN

Printre antibioticele care intervin în inhibarea sintezei ADN -ului se afla quionolonele. Acestea
blochează replicarea ADN prin inhibarea ADN topoizomerazei (alterarea topoizomerazei are efect negativ
asupra exprimării cantitative și calitative a genelor) .

Cea mai importantă enzimă în ciclul de viață al unei bacterii este subunitatea A a ADN -topoizomerazei
care este dealtfel și ținta de acțiune a quinolonelor. (De Jong și Mörner, 1999).

Pentru a acționa, quinolonele traversează peretele bacterian pri n transport pasiv, prin intermediul porinelor
sau lipoplizaharidului.

36
Exista trei grupe de quinolone (Oniga, 2003):

1. Quinolone din prima generație: acid nalidixic, acid oxolinic, acid pipemidic, cinoxacină, flumechină,
rosoxavină;
2. Quinolone din a doua g enerație: ciprofloxacină, enoxacină, fleroxacină, lomefloxacină, norfloxacină,
nadifloxacină, pefloxacină, ofloxacină;
3. Flurochinolone antipneumococice: levofloxacină, sparfloxacină, gatifloxacină, moxifloxacină,
balofloxacină, grepafloxacină;

4. Antibioti ce care blochează transcrierea

Rifamicinele se mai numesc și false macrolide (ansamicine) deoarece prezintă o structură fals lactonică.
Sunt obținute prin semisinteaza de la un antibiotic natural, rifamicina B, având o acțiune bactericidă asupra
cocilor și bacililor Gram negativi și pozitivi.

Rifamicinele inhibă transcripția ADN -ului bacterian prin legarea de ARN -polimerază.

Dupa modul de obținere, sunt grupate în:
 Rifamicine de biosinteză: A, B, C, D, E (descoperite in culturi de Streptomyces mediterranei)
 Rifamicine de semisinteză: S, SV, Rifampicină, Rifabutină (Oniga, 2003).

Rifamicina are ca țintă de acțiune faza de multiplicare activă a bacililor și se administrează în cazuri de
tuberculoză, lepră, infecții biliare și urinare.

Nitrofuranii reprezintă antibiotice de sinteză folosite pentru tratamentul unor infecții urinare sau digestive.
Aceștia au un spectru de acțiune larg: bacterii Gram negative (enterobacterii), dar și coci Gram pozitivi
(stafilococi sau streptococi). Nitrofuranii acționează la nivelul ADN -ului, dar pot avea și ef ect mutagen.
Rezistența bacteriilor la nitrofurani se face în funcție de specie (Matinca, 2002).

5. Antibiotice care blochează sinteza proteică
Aminoglicozidele au o structură heterozidică, fiind zaharuri complexe. Moleculele lor pot fi policationice
sau polare.
Streptomicina reprezintă primul antibiotic aminoglicozidic descoperit. Este produs de Streptomyces griseus
și are trei subunități (streptidină, streptoz ă și N -metil -glucozamină) unite prin legături glicozidice (Mihăescu și

37
colab., 2007).

Au un spectru larg de activitate: bacili Gram negativi, bacterii aerobe Gram pozitive și Mycobacterii.
În funcție de natura agliconului, antibioticele aminoglicozidic e sunt clasificate astfel:
1. Aminoglicozide cu aglicon streptidinic: streptomicină si dihidrostreptomicină
2. Aminoglicozide cu aglicon 2 – dezoxistreptaminic:
a. Diozide in 4,5: neomicine si paromicine;
b. Diozide in 4,6: kanamicine, genta micine (Oniga, 2003).

Aminoglicozidele se fixează la nivelul peretelui celular bacterian, traversează celula și se fixează
ireversibil de ribozomi astfel încât inhibă sinteza proteinelor. Rezistența la acțiunea acestor antibiotice poate fi
naturală (prin sinteză de enzime) sau poate fi dobândită (prin inactivare enzimatică, prin degradarea țintei
ribozomale sau a sistemului de transport).

38
II. PARTEA EXPERIMENTALĂ

Introducere

Studiile recente evidențiaza multitudinea de căi prin care genele de rezistență se pot răspândi în ecosisteme
acvatice (prin consumul alimentelor purtătoare de gene de rezistență insuficient preparate sau prin consumul de
apă potabilă provintă din ape de suprafață poluate).

Apariția genelor de rezistență l a antibiotice în mediul acvatic devine o preocupare crescândă la nivel mondial.
Sute de gene care conferă rezistență la antibiotice au fost evidențiate la bacteriile izolate din apele de suprafață și
în stațiile de epurare a apelor reziduale provenite din spitale.

Dunărea este al II -lea mare fluviu al Europei dupa Volga, atât ca lungime (2857 km), cât și ca debit (aprox 5600
m/sec la intrare în țară și 6470m/sec la Pătlăgeanca). Pe teritoriul țării noastre, se varsă în Marea Neagră. În acest
fluviu se varsă aproape toate râurile de pe teritoriul țăr ii noastre (cu excepția unor mici râuri dobrogene), făcând
ca rețeaua hidrografică să fie unitară.

Impactul unor posibile contaminări cu bacterii purtătoare a unor gene de rezistență la antibiotice este cu atât mai
mare cu cât unele localități de -a lungu l Dunării își asigură apa potabilă din fluviu. De asemenea, numeroase
specii de pești sunt pescuite pentru consum (spre exemplu crapul sălbatic, scrumbii, caras). În acest context,
peștii ar fi potențiali purtători al genelor de rezistență la antibiotice, iar acestea ar putea ajunge direct la
consumatori prin lanțul alimentar.
Situl ROSCI0005 Balta Albă -Amara -Lacul Sărat Câineni -Jirlău se întinde pe o suprafață de aproximativ 6500 ha
și este poluat în special de acțiunile și activitățile riveranilor precu m: deversarea în lacuri a reziduurilor
menajere, modificări naturale și artificiale ale compoziției apei, schimbarea metodelor de cultivare a terenurilor
din cele tradiționale în agricultură intensivă și folosirea excesivă a îngrășămintelor. Lacurile din a cest situ sunt
populate cu pești din specii diferite (crap, caras, lin, biban, salau și somn), care sunt pescuiți și consumați, putând
fi purtători ai unor gene de rezistență la antibiotice.
Rezistența la antibiotice a principalelor Enterobacteriaceae implicate în infecții comunitare și nosocomiale
(Escherichia coli și Klebsiella pneumoniae ) și a Pseudomonadaceelor reprezintă pentru țara noastră o altă
problemă importantă. Ca incidență, infecțiile cu Klebsiella pneumoniae reprezintă a doua etiologie Gram –
negativă a infecțiilor sistemice (cele mai frecvente sunt cele pulmonare și urinare).

39
K.pneumoniae colonizează frecvent intestinul uman, dar la pacienții spitalizați poate fi izolat și de pe tegumente,
orofaringe sau din arborele respirator superior (unde ajunge adesea de pe mâinile personalului medical). K.
pneumoniae determină infecții la pacienți imunodeprimați (diabetici, alcoolici) sau la purtători de proteze.
Această bacterie reprezintă o problemă majoră legată de t ransmiterea rezistenței bacte riane la antibiotice,
deoarece produce noi carbapenemaze, ulterior transmițându -le și altor Enterobateriaceae genele care le
codifică.

Scopul lucrării

Având în vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenței la antibiotice, lucrarea își
propune să evidențieze markerii genetici de rezistență la antibiotice a unor tulpini de bacili, izolați din câteva
surse naturale de apă din Sud -Estul României și compararea acestora cu un lot de 10 tulpini nosocomiale, în
scopul realizării pattern -urilor genetice comparative și a genelor care le conferă rezistență la antibiotice.

Obiectivele studiului
1. Determinarea prezenței unor bacterii Gra m negative purtătoare de gene de rezistență la antibiotice la culturile
izolate din mediul acvatic și spitalicesc.
2. Ilustrarea profilului genetic al tulpinilor izolate a unor tulpini de bacterii izolate într -un spital și în câteva ape
din Sudul României.
3. Optimizarea unor metode de detecție a tulpinilor patogene.
4. Evidențierea prin comparație a profilului genetic la bacteriile din habitate acvatice și nosocomiale.
5. Investigarea mecanismelor de răspândire a genelor de rezistență (mutație spontană versus transfer orizontal).
6. Compararea rezultatelor obținute cu cele existente în literatura de specialitate .

Materiale și metode:

În prezenta lucrare au fost analizate un număr de 33 de tulpini de bacterii Gram negative din familia
Enterobacteriaceae – Escherichia coli, Enterobacter cloacae , K.pneumoniae , K.oxytoca , Enterobacte r kobei,
Acinetobacter calcaoceticus, Enterobacter ludwig, Escherichia hermannii, Raoultella ornithinolytica, Serratia
rubidaea, Serratia marcescen s, Pantoea a nanatis, Hafnia alvei, ; fam. Psedomonadaceae – Pseudomonas
chlororaphis, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas mosselii, Pseudomonas putida, Aeromonas salmonicida,
Aeromonas eucrenophila , tulpini izolate din lacuri sărate din județul Buzău și din fluviul Dună re (județul
Giurgiu), în perioada septembrie 2016 -mai 2017. Tulpinile izolate au fost comparate cu un lot de 10 tulpini
nosocomiale.

40

Din Dunăre (județul Giurgiu) am colectat 6 probe de la o adâncime de aproximativ 50 cm, în amonte și aval, din
locuri diferite. Probele au fost depozitate la o temperatură de aprox. 5°C și au fost transportate în laborator
pentru a fi analizate.

Probele din județul Buzău au fost prelevate din lacurile salamastre din bazinul hidrografic al râului Buzău
(Amara,Jirlău,Balta Albă), precul și lacul sărat Câineni.
Tulpinile bacteriene au fost cultivate pe medii de cultură de cultura specifice (EMB, McConkey, Cetrimid), și au
fost incubate la temperatura 37oC timp de 48h, până la atingerea fazei staționare de creștere.
În scopul izolării de tulpini pure, din probele mixte au fost realizate pasaje sucesive prin tehnica epuizării ansei
din fiecare probă, după car e am făcut însămânțarea (prin tehnica epuzării ansei) pe mediile solide proaspete
selective (EMB, McConkey,) și neselective (Geloza îmbogățita cu 5% sânge de berbec).

Coloniile izolate obținute au fost identificate cu ajutorul sistemul automat Bruker Dalt oniK MALDI Biotyper.
Sistemul Bruker DaltoniK MALDI Biotyper asigură identificarea rapidă, de înaltă încredere și clasificarea
taxonomică a bacteriilor, drojdiilor și fungiilor.

Clasificarea și identificarea se bazează pe amprentele proteomice, utilizând spectrometria de masă MALDI -TOF
de mare viteză. MALDI Biotyper permite, de asemenea, teste de rezistență antimicrobiană.

Tulpinile pe care nu le -am putut identifica la acest nivel au fost eliminate din studiu.

Fig.. 4 Identificarea tulpinilor bacteri ene cu ajutorul sistemului automat Bruker Dalton iK MALDI Biotyper
(adaptat dup ă http://www.romtech.ro/en/cbrn/cbrn -detection/biological -detection.html

41
Tabel 2. Speciile i zolate din Dun ăre și lacurile din jude țul Buz ău.
Nr. Cod tulpină Specia identificată Sursă de izolare
1.

3.4 iT Pseudomonas chlororaphis Dunăre
2. 3.3 iT Aeromonas salmonicida Dunăre
3. 1.2 iT Pseudomonas koreensis Dunăre
4. 1.1 iC Pseudomonas mosselii Dunăre
5. 2.4 iC Pseudomonas putida Dunăre
6. 2.3 iC Pseudomonas putida Dunăre
7. 4.1 iC Enterobacter cloacae Dunăre
8. 3.2 iT Aeromonas eucrenophila Dunăre
9. 3.1 iT Pseudomonas chlororaphis Dunăre
10. P1 1.6
Serratia marcescens
Balta Albă

11. P1 1.7
Klebsiella pneumoniae
Balta Albă

12. P1 1.8
Klebsiella oxytoca
Balta Albă

13. P1 1.9
Enterobacter kobei
Balta Albă

14. P2 2.6
Acinetobacter calcaoceticus
Amara

15. P2 2.7 Enterobacter ludwigii Amara

42

16. P2 2.8
Enterobacter cloacae
Amara

17. P2 2.9
Escherichia coli
Amara

18. P2 2.10
Escherichia coli

Amara

19. P2 2.11
Escherichia coli
Amara

20. P3 3.6
Escherichia coli
Jirlău

21. P3 3.7
Raoultella ornithinolytica
Jirlău
22. P3 3.8
Escherichia coli
Jirlău
23. P3 3.9
Escherichia coli
Jirlău
24. P3 3.10
Escherichia coli
Jirlău
25. P3 3.11
Escherichia hermannii
Jirlău

43
26. P4 4.6
Klebsiella oxytoca
Câineni
27. P4 4.7
Enterobacter cowanii
Câineni
28. P4 4.8
Serratia rubidaea
Câineni
29. P4 4.9
Escherichia coli
Câineni
30. P4 4.10
Pantoea ananatis
Câineni
31. P4 4.11
Hafnia alvei
Câineni
32. P 2.12
Enterobacter cloacae
Amara
33. P.2.13
Escherichia coli
Amara

Rezultatele obținute au fost analizate comparativ cu un lot de 10 tulpini nosocomiale aparținând fam.
Enterobacteriaceae izolate de la pacienți internați în secțiile de terapie intensivă a Institutului de Boli
Cardiovasculare prof. C.C.Iliescu din București în anul 2017 .

44

Tabel 3. Lotul de tulpini nosocomiale aparținând Fam. Enterobacteriaceae izolate din secția de ter apie intensivă
a Institutului de Boli Cardiovasculare prof. C.C.Iliescu din București în anul 2017
Cod spital Sursa izolare Specia si codul de laborator Fenotipul de rezistență
151 Secretie traheala 1 Klebsiella pneumoniae BLSE
143 Secretie traheala 2 Klebsiella pneumoniae BLSE
5 Plaga femurala 3 Klebsiella pneumoniae BLSE
8 Secretie plaga 4 Klebsiella pneumoniae BLSE
7 Cateter 5 Klebsiella pneumonia e BLSE
4 Sputa 6 Klebsiella pneumoniae BLSE
1 Hemocultura venoasa 7 Klebsiella pneumoniae BLSE
2 Cateter 8 Klebsiella pneumoniae BLSE
3 Secretie traheala 9 Klebsiella pneumoniae BLSE
6 Hemocultura venoasa 10 Klebsiella pneumoni eae BLSE

Obținerea ADN -ului bacterian s-a realizat folosind protocolul de extracție alcalină a ADN (protocol
derivat din tehnica Johnson):
Medii și soluții:
 20 µl NaOH 0.05M
 SDS 0.25%
 1-5 colonii tulpină bacteriană pură
Mod de obținere:
1. Din fiecare tulpină am obținut o suspensie celulară care a fost denaturată 15 min, la 95oC
2. Am adaugat 180 µl TE
3. Am centrifugat probele timp de 3 min, la 13.000 rpm
4. Am recuperat supernatantul și l -am utilizat în reacția de amplificare

Evidențierea genelor de virulență a fost făcută prin intermediul reacției PCR Multiplex
(Polymerase Chain Reaction = Reacția de polimerizare în lanț)
Reacția PCR ( Polymerase Chain Reaction = Reacția de polimerizare în lanț) este o metodă de
amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN.

Pentru analizarea probelor în PCR am folosit aparatului PCR Thermal Corbett.

45

Au fost realizate reacții PCR simplex și multiplex folosind primerii din tabelul de mai jos.

Tabel.4 . Secvența nucleotidică, condițiile de amplificare și dimensiunea anticipată a ampliconilor obținuți
pentru genele de virulență investigate la tulpinile testate.
Gena de
rezistență Secvența de primer (5´ – 3´) Nr. perechi
de baze
anticipate Temp. de
hidridare Reacția PCR
(denaturare/amplificare/extensie)
blaTEM
ATAAAATTCTTGAAGACGAAA
GTCAGTTACCAATGCTTAATC

1080 59 °C 1 ciclu – 95 °C pt. 2 min./35
cicluri (95 °C pt. 30 sec., 72 °C
pt. 1 min). 1 ciclu – 72°C/7 min.
blaCTX -M
CGCTGTTGTTAGGAAGTGTG
GGCTGGGTGAAGTAAGTGAC
730 60 °C 1 ciclu – 95 °C pt. 2 min./35
cicluri (95 °C pt. 30 sec., 60 °C
pt. 30 sec, 72 °C pt. 1 min.). 1
ciclu – 72°C/7 min.
blaNDM
GGTTTGGCGATCTGGTTTTC
CGGAATGGCTCATCACGATC
621 52 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 10 min./36
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 52 °C
pt. 40 sec, 72 °C pt. 72 sec.). 1
ciclu – 72°C/5 min.
blaVIM -2
GATGGTGTTTGGTCGCATA
CGAATGCGCAGCACCAG
390 52 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 10 min./36
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 52 °C
pt. 40 sec, 72 °C pt. 72 sec.). 1
ciclu – 72°C/5 min.
blaIMP
GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC
GGTTTAAYAAAACAACCACC
232 52 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 10 min./36
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 52 °C
pt. 40 sec, 72 °C pt. 72 sec.). 1
ciclu – 72°C/5 min.
tet A
GCGCGATCTGGTTCACTCG
AGTCGACAGYRGCGCCGGC
164 61 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./25
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 61 °C
pt. 30 sec., 61 °C pt. 30 sec.). 1
ciclu – 61°C/7 min.

46
tet B
TACGTGAATTTATTGCTTCGG
ATACAGCATCCAAAGCGCAC
206 61 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./25
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 61 °C
pt. 30 sec., 61 °C pt. 30 sec.). 1
ciclu – 61°C/7 min.
tet C
GCGGGATATCGTCCATTCCG
GCGTAGAGGATCCACAGGACG
207 68 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./25
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 68 °C
pt. 10 sec., 68 °C pt. 10 sec.). 1
ciclu – 68°C/7 min.
tet D
GGAATATCTCCCGGAAGCGG
CACATTGGACAGTGCCAGCAG
187 68 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./25
cicluri (94 °C pt. 5 sec., 68 °C
pt. 10 sec., 68 °C pt. 10 sec.). 1
ciclu – 68°C/7 min.
sulI
CGGCGTGGGCTACCTGAACG
GCCGATCGCGTGAAGTTCCG
432 69 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./30
cicluri (94 °C pt. 15 sec., 69 °C
pt. 30 sec., 72 °C pt. 60 sec.). 1
ciclu – 72°C/7 min.
sulII GCGCTCAAG GCAGATGGCATT
GCGTTTGATACCGGCACCCGT 293 69 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./30
cicluri (94 °C pt. 15 sec., 69 °C
pt. 30 sec., 72 °C pt. 60 sec.). 1
ciclu – 72°C/7 min.
int1 ATGGCCGAGCAGATCCTGCACG
GCCACTGCGCCGTTACCACCGC 899 60 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./35
cicluri (94 °C pt. 30 sec., 60 °C
pt. 40 sec., 72 °C pt. 40 sec.). 1
ciclu – 61°C/7 min.
dfrA1 –
aadA1 AGCATTACCCAACCGAAAGT
TGTCAGCAAGATAGCCAGAT 818 60 °C 1 ciclu – 94 °C pt. 5 min./35
cicluri (94 °C pt. 30 sec., 60 °C
pt. 40 sec., 72 °C pt. 40 sec.). 1
ciclu – 61°C/7 min.

47
qnrA AGAGGATTTCTCACGCCAGG
TGCCAGGCACAGATCTTGAC 580 54 °C 1 ciclu – 95 °C pt. 10 min./35
cicluri (94 °C pt. 30 sec., 60 °C
pt. 40 sec., 72 °C pt. 60 sec.). 1
ciclu – 72°C/10 min.
qnrB GGMATHGAAATTCGCCACTG
TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA 264 54 °C 1 ciclu – 95 °C pt. 10 min./35
cicluri (94 °C pt. 30 sec., 60 °C
pt. 40 sec., 72 °C pt. 60 sec.). 1
ciclu – 72°C/10 min.
qnrS GCAAGTTCATTGAACAGGGT
TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG 428 54 °C 1 ciclu – 95 °C pt. 10 min./35
cicluri (94 °C pt. 30 sec., 60 °C
pt. 40 sec., 72 °C pt. 60 sec.). 1
ciclu – 72°C/10 min.
Protocoale adaptat e după : Eftekhar și colab, 2005; Pan, J și colab., 2010; Bali, E. B și colab., 2010; Poirel, L și
colab., 2011; Aminov, R. I și colab., 2002; Frank, T., Gautier și colab., 2007; Cattoir, V și colab., 2007.

Electroforeza ADN
Pentru pregă tirea gelului de electroforeză am folosit următoarele componente:
 Agaroză (1g);
 Tampon TAE 0,5X;
 Bromură de etilium care are rolul de a colora benzile ADN pentru a fi vizibile în domeniul UV.
În prima etapă am dizolvat agaroza în TAE 0,5X pe baie de apă. După ce agaroza s -a dizolvat, am lasat -o câteva
minute să se răceas că, apoi am turnat gelul încălzit la aproximativ 60șC în cuva electroforezei peste care am
adaugat pieptenele și l -am lăsat să se solidifice. Ulterior am scos pieptenele, iar peste gel am turnat tampon de
migrare TBE 0,5X. După migrare a probelor, gelul a f ost vizualizat in domeniul UV (transiluminator).

48
Rezultate și discuții

Tabel 5 . Distribuția genelor de rezistență la antibiotice la tulpinile de bacterii Gram negative izolate din Dunăre
și situl ROSCI0005.
Nr. Probă Microorganism blaNDM
blaCTXM
QnrS
Sul1
Sul2
TetB
TetA
Int1
blaIMP
blaVIM –
2

3.4 iT Pseudomonas
chlororaphis X X
3.3 iT Aeromonas
salmonicida X X X
1.2 iT Pseudomonas
koreensis X X
1.1 iC Pseudomonas
mosselii X
2.4 iC Pseudomonas
putida X X X
2.3 iC Pseudomonas
putida X X
4.1 iC Enterobacter
cloacae X X
3.2 iT Aeromonas
eucrenophila X
3.1 iT Pseudomonas
chlororaphis X

49
P1 1.6
Serratia
marcescens
X X X
P1 1.7
Klebsiella
pneumoniae
X
P1 1.8
Klebsiella
oxytoca
X X
P1 1.9
Enterobacter
kobei
X X
P2 2.6
Acinetobacter
calcaoceticus
X X X
P2 2.7
Enterobacter
ludwigii
X
P2 2.8
Enterobacter
cloacae
X X X X
P2 2.9
Escherichia coli
X X X

50
P2
2.10
Escherichia coli

X X X
P2
2.11
Escherichia coli
X X X
P3 3.6
Escherichia coli
X X X
P3 3.7
Raoultella
ornithinolytica
X X
P3 3.8
Escherichia coli
X X
P3 3.9
Escherichia coli
X X X X X
P3
3.10
Escherichia coli
X X X
P3
3.11
Escherichia
hermannii
X X
P4
4.6
Klebsiella
oxytoca
X X X X

51
P4
4.7
Enterobacter
cowanii
X X
P4
4.8
Serratia
rubidaea
X X
P4
4.9
Escherichia coli
X
P4
4.10
Pantoea
ananatis
X X
P4
4.11
Hafnia alvei
X X X X
P 2.12
Enterobacter
cloacae
X
P.2.13
Escherichia coli
X

În figura 5 este ilustrată distribuția genelor de rezistență la antibiotice la bacteriile izolate din mediul
acvatic. La tulpinile bacteriene izolate din mediul acvatic au fost identificate gene care conferă rezistență la
antibiotice β ‐lactamine cu următoarea distribuție: blaNDM (6,06% dintre tulpinile analizate), blaCTXM
(27,27% din tulpini ), blaIMP (12,12%), blaVIM2 (9,09%); la tetracicline: TetA 21,21% din tulpini și TetB la

52
9,09% din tulpini, quinolone: QnrS (6,06%) ; precum si la sulfonamide: sulI (51,51 %) și SulII (3,03% din
tulpini) și Int1 (87,87%) .

Figura 5. Distribu ția numeric ă a genelor de rezisten ță la antibiotice la tulpinile izolate din mediul acvatic.

În studiul nostru comparativ au fost incluse de asemenea 10 tulpini nosocomiale aparținând speciei K.
pneumoniae.

Tabel 6. Distribuția genelor de rezistență la antibiotice la tulpinile nosocomiale de K. pneumoniae
Nr. Specia Bla
NDM BlaCTX -M QnrS
Sul1
tetA tetB
1 K. pneumoniae
X
X

2 K. pneumoniae
X
X

3 K. pneumoniae
X

4 K. pneumoniae X X

5 K. pneumoniae
X
X

6 K. pneumoniae
X X

53
7 K. pneumoniae
X
X

8 K. pneumoniae
X
X

9 K. pneumoniae
X
X

10 K. pneumonia
X
X

În figura 6 este ilustrată distribuția genelor de rezistență la antibiotice la tulpinile nosocomiale de
K.pneumoniae. La tulpinile de K.pneumoniae izolate din mediul nosocomial s -au identificat genele BlaNDM
(10%), Bla CTX -M (100%), Qnrs (10%) și tetA (70%).

Fig 6. Distribu ția genelor de rezisten ță la antibiotice la tulpini nosocomiale de K. pneumoniae .

Rezultatele obținute în urma amplificării prin PCR a genelor care determină rezistența la antibiotice pentru
tulpinilor izolate din Dunăre sunt ilustrate în figurile 7, 8, 9, 10.

54

Fig.7 Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele teA si tetB. Godeu 1 – L- Marker de greutate
moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2 -22- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive – pentru
tetA:3.4. si 1.4.

Fig. 8 Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele blaVIM si blaIMP. Godeu 1 – L- Marker de greutate
moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2 -22- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive – pentru
blaVIM -2: 1.2; 4.1 si 4.3 iar pentr blaIMP: 2.3; 2.4 si 3.3

Fig.9 Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genA Int1. Godeu 1 – L- Marker de greutate moleculară
GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2 -22- ampliconii tulpinilor analizate. Toate tulpinile analizate au fost
tetA=
164bp
L 3.41 2.32 3.1 6.2 3.4 2.3 1.1 2.4 6. 1.1 3.3 5 1.2 6.1 4.2 4 12 1.43.1 1.1
blaVIM2=
751bp
blaIMP=
232 bp=
164bp
L 3.41 2.32 3.1 6.2 3.4 2.3 1.1 2.4 6. 1.1 3.3 5 1.2 6.1 4.2 4 12 1.43.1 1.1
Int= 899bp L 3.41 2.32 3.1 6.2 3.4 2.3 1.1 2.4 6. 1.1 3.3 5 1.2 6.1 4.2 4 12 1.43.1 1.1

55
pozitive pentru integraza.

Fig.10 Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele QnrA, QnrB si QnrS. Godeu 1 – L- Marker de
greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2 -22- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive –
pentru gena QnrS: 1.4

Rezultatele obținute în urma amplificării prin PCR a genelor care determină rezistența la antibio tice pentru
tulpinilor de K.pneumoniae izolate din mediul nosocomial sunt ilustrate in figurile 11 si 12.

Fig. 11 Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele blaCTX -M si blaTEM. Godeu 1 – L-
Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2 -11- ampliconii tulpinilor
analizate. Toate tulpinile analizate au fost pozitive pentru BLSE blaCTX -M.

CTX -M-
754bp L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L 3.41 2.32 3.1 6.2 3.4 2.3 1.1 2.4 6. 1.1 3.3 5 1.2 6.1 4.2 4 12 1.43.1 1.1
QnrS= 428bp

56

Fig. 12 . Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele tetA si tetB. Godeu 1 – L- Marker de
greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2 -11- ampliconii tulpinilor analizate.
Tulpini pozitive – pentru tetA:1; 2; 5; 7; 8; 9; 10

Rezultatele obținute în urma amplificării prin PCR a genelor care determină rezistența la antibiotice pent ru
tulpinilor izolate din Buz ău sunt ilustrate în figurile 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22.

Fig.1 3 Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru gena bla OXA -48like si pentru gena bla NDM: godeu 1 –
L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range DNA); godeu nr2 -27- ampliconii tulpinilor
4.7-3.8. Tulpini pozitive – enterobacterii – pentru bla NDMlike : 3.9; 2.11 ( E.coli )

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L
tetA- 164bp
NDM=621
bp L 4.7 4.9 2.8 1.8 1.7 1.6 2.10 3.6 3.11 2.6 2.7 1.9 4.10 3.7 3.9 4.8 2.11 2.12 3.10 4.6 2.9 4.11 2.13 3.8

57

Fig.14 .Electroforegram a aampliconilor obtinu ți prin PCR pentru gena bla CTX -Mlike si pentru gena bla TEMkike : godeu
1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 27 ampliconii tulpinilor 1.5 -1.1.
Tulpini pozitive – enterobacterii -pentru bla CTX -Mike : 1.4; 4.5 3.2; 4.2; 1.8; 1.6; 2.10; 2.6; 2.8; 4.6; 4.11; 3.6.

Fig.15 .Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru gena bla CTX -Mlike si pentru gena bla TEMkike : godeu 1
– Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 19 ampliconii tulpinilor 4.8 -3.11.
Tulpini pozitive – enterobacterii – pentru bla CTX -Mike : 2.1; 2.5; 2.9; 3.1; 1.2; 3.4; 2.4; 3.5.

L 1.5 1.4 4.7 4.5 4.3 1.9 3.2 4.2 2.11 1.8 1.3 3.3 4.4 4.9 2.12 1.6 2.10 2.6 3.10 2.8 4.6 2.2 4.11 4.1 3.6 1.1
L 4.8 2.3 2.1 3.7 2.7 1.7 2.5 2.9 3.1 1.2 3.9 3.8 4.10 2.13 3.4 2.4 3.5 3.11 CTX -M=544
bp
CTX -M=544
bp

58

Fig.16 .Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele QnrA, QnrB si QnrS: godeu 1 – Marker
de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 27 ampliconii tulpinilor 4.2 -3.4. Tul pini
pozitive – enterobacterii -pentru QnrS :2.8 (Enterobacter cloacae ).

Fig.17 .Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele SulI si SulII: godeu 1 – Marker de
greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 27 ampliconii tulpinilor 2.7 1.9. Tulpini
pozitive – enterobacterii – pentru gena SulI: 2.7; 2.4; 4.7; 4.3; 4.10; 2.5; 3.5; 1.4; 4.5; 2.12; 3.11 ; 3.7; 3.4;
4.11; 1.3; 2.8; 1.6; 3.10; 4.2; 4.4; 1.2; 1.9 iar pentru gena SulII : 3.9.

L 4.2 2.2 3.2 3.11 1.7 4.8 1.2 3.1 2.11 4.6 3.3 2.8 4.1 1.6 4.3 3.5 1.4 2.3 4.5 3.10 2.5 2.13 1.5 1.3 2.10 3.4
QnrS=428 bp
SulI=432
bp SulII=293
bp L 2.7 2.4 4.7 4.3 4.10 2.5 3.5 1.7 1.4 4.5 2.12 3.8 3.11 3.7 3.4 4.11 1.3 2.8 1.6 3.10 3.6 4.2 4.4 3.9 1.2 1.9

59

Fig.18 . Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele SulI si SulII: godeu 1 – Marker de
greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 19 ampliconii tulpinilor 2.13 – ctrl negativ.
Tulpini pozitive – enterobacterii – pentru gena SulI: 2.1; 3.9; 4.6; 2.9; 2.2; 1.1; 2.11; 3.2; 4.8; 2.6; 3.1;
2.3; 1.8; 4.1 .

Fig.19 .Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele tetA sitet B godeu 1 – Marker de greutate
moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 19 ampliconii tulpinilor 4.11 -3.10. Tulpini pozitive –
enterobacterii – pentru gena tetA: 4.7; 3.10; 4.8 si 2.10.

L 2.13 2.1 3.9 2.10 4.6 2.9 4.9 2.2 1.1 2.11 3.2 4.8 2.6 3.1 2.3 1.5 1.8 4.1 – L
SulI=432
bp
L 4.11 4.8 1.6 2.2 4.10 1.8 2.3 2.11 2.10 1.1 2.5 2.7 2.8 3.6 4.7 2.8 3.6 4.7 3.3 2.6 1.7 4.4 3.5 2.1 1.3 3.10 3.9 1.2
3.1
tetA= 164
bp

60

Fig.20 . Electroforegram aampliconilor obtinu ți prin PCR pentrugenele tetA si tet B godeu 1 – Marker de greutate
moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 19 ampliconii tulpinilor 4.11 -3.10. Tulpini pozitive –
enterobacterii – pentru gena tetA: 3.8.

Fig.21 . Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele Int1 si drfA1 -aadA1 godeu 1 – Marker de
greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 26 ampliconii tulpinilor 4.1 -1.1. Tulpini
pozitive – enterobacterii – pentru gena Int1: 4.1; 2.12; 2.6; 2.9; 4. 4; 3.5; 3.2; 3.8; 4.2; 3.3; 2.3; 2.8 ;1.3 ;3.4 ;4.9
;3.1; 3.11 ;2.5; 1.9; 1.7; 4.11; 1.1.

L 2.4 1.5 3.4 2.9 2.13 1.4 3.11 4.6 3.8 4.2 3.2 4.5 4.9 2.12 1.9 3.7 4.3 4.1 – L
tetA= 164
bp
L 4.1 2.12 2.6 2.7 4.2 2.9 4.4 4.9 3.5 3.2 3.8 4.2 3.3 2.3 2.8 1.3 3.4 4.9 3.1 3.11 2.5 1.9 1.7 4.11 1.1
Int1`= 899
bp

61

Fig.22 . Electroforegrama ampliconilor obtinu ți prin PCR pentru genele Int1 si drfA1 -aadA1 godeu 1 – Marker de
greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2 – 19 ampliconii tulpinilor 2.4 -3.10. Tulpini
pozitive – enterobacterii – pentru gena Int1:2.4; 2.10; 3.9; 1.2; 4.3; 2.2; 2.1; 4.5; 1.6; 4.6; 1.4; 2.11; 3.7; 4.10;
2.13; 3.6; 3.10.
În cadrul studiului nostru , au fost izolat e și identificat e un număr de 4 3 de tulpini de Enterobacteriaceae și
Pseudomonadaceae din mediul acvatic si spital .

Toate tulpinile identificate au fost investigate prin metoda PCR, în vederea identificării unor gene de rezistență.
La tulpinile de bacterii izolate din mediul acvatic au fost identificate gene care conferă rezistență la antibiotice
β‐lactamine cu următoarea distribuție: blaNDM (6,06%), blaC TXM (27,27%), blaIMP (12,12%), blaVIM2
(9,09%); la tetracicline: TetA 21,21% și TetB 9,09%, quinolone: QnrS (6,06%) și sulfonamide: sulI (51,51%) și
SulII (3,03%) și gena codificatoare pentru integraz ă Int1 (87,87%).

La tulpinile de Klebsiella pneumoniae izolate din mediul nosocomial s -au identificat genele BlaNDM (10%), Bla
CTX -M (100%), Qnrs (10%) și tetA (70%).

L 2.4 2.10 3.9 1.2 4.3 1.9 2.2 2.1 4.5 1.5 1.6 4.6 1.4 2.11 3.7 4.10 2.13 3.6 3.10 –
Int1`= 899
bp

62

Figura 23 . În figura de mai sus este reprezentat ă, prin compara ție, distribu ția genelor de rezisten ță la antibiotice
la tulpinile izolate din mediul acvatic (albastru) și spital (ro șu).

Prezența genei blaCTX -M, codificatoare a rezistenței la β ‐lactamine a fost identificată în cazul a 9 izolate,
izolate din mediul acvatic, reprezentând 27.27% din to talitatea tulpinilor analizate .

Gene responsabile pentru rezistența la su lfamide și trimetoprim au fost de asemenea identificate , cu o
prevalență de 51,51% (sulI) și 3,03% (sulII) din total ul tulpinilor analizate .

Gena codificatoare pentru integraz ă Int1 a fost identificat ă la 87,87% din tulpinile izolate din mediul acvatic (29
de tulpini).

Gena tetA, codificatoare a rezistenței la tetracicline, a fos t identificată la 21.21% din totalitatea tulpinilor
acvatice supuse studiul ui genoti pic și la 70% din tulpinile nosocomiale (7 tulpini) . Gena tetB, a fost identificată
în 9.09% din tulpinile din apele de suprafa ță investigate .

Atât tulpinile izolate din câteva ape reziduale din Sudul României în cadrul unui studiu recent ( Marinescu și
colab ., 2014), cât și tulpinile izolate în cadrul studiului nostru, conțin gene care conferă rezistență la tetracicline,
tetA fiind cea mai întâlnită.

Rezultate asemănătoare cu cele obținute în studiul nostru au arătat că genele de rezistență la antibiotice izolate 05101520253035
blaNDM blaCTXM QnrS Sul1 Sul2 TetB TetA Int1 blaIMP blaVIM2Numărul de gene identificateGenele de rezistență identificate la tulpinile Gram -negative
izolate din habitatele acvatice și spital

63
din mediul nosocomial sunt prezente într -un număr mai mare decât în apele reziduale sau de suprafață. (Wiethan
si colab., 2001; Kümmerer, 200 4).

Se presupune că numărul mare de antibiotice folosite în spital exercită o presiune selectivă asupra bacteriilor,
care devin multirezistente, iar apoi sunt eliberate în mediul natural, unde transferă genele la alte bacterii
comensale (din apă sau sol). (Wiethan si colab., 2001)

Peak și colab., 2007 au arătat ca prezența a șase gene care conferă rezistență la tetraciclină variaza in functie de
sezon, fiind mai numeroase toamna. Genele analizate au fost tet(O), tet(Q), tet(W), tet(M), tet(B) and tet (L) în
ape reziduale și de suprafață din Marea Britanie. Aceste rezultate sugerează că antibioticele folosite de populație
ajung în habitatele acvatice. Același studiu a arătat că genele de rezistență la antibiotice pot ajunge în apele de
suprafață prin co ntaminarea cu deșeuri porcine, aceasta ducând la dispersia bacteiilor rezistente în apă.

Aceleași variatii au fost observate si la genele care conferă rezistență la sulfonamidă (sulI si sulII). (Pruden și
colab, 2006)

Integronii transport ă gene care confer ă rezisten ță la antibiotice, cel mai adesea la sulfonamide (sulI). În studiu l
nostru , 13 dintre tulpinile izolate din mediul acvatic au prezentat gena Int1 și gena sulI, ceea ce demonstreaz ă
coexisten ța acestora într-o mare propor ție (39,3 9% din tulpinile izolate din habitatele acvatice ). Aceste rezultate
sugereaz ă că gena sulI este transportat ă și prin alte elemente mobile. Rezultate asem ănătoare studiului nostru au
fost ob ținute într-un studiu din Portugalia. (Antunes și colab., 2005).

Prezența genelor tetB poate fi explicată prin utilizarea tetraciclinelor pe scară largă pentru tratamentul infecțiilor
bacteriene la om, dar și pentru creșterea animalelor. Studiile anterioare au demonstrat diseminarea genelor tet în
mediul acvatic, de la lagunele porcine în apele subterane. (Koike și colab., 2007).

În studiu l nostru, 9,09% dintre tulpini au prezentat gena blaVIM2, urmată de gena blaNDM (6,06%). Am
observat prezen ța blaVIM2 și a genei int1 la 3 tulpini izolate din apele de suprafață . Studi ile recente din Europa
au eviden țiat prezen ța clasei 1 de integroni la tulpinile pozitive pentru genele care confer ă rezisten ță la
β‐lactamine . (Lepšanovic și colab., 2012 ).
Prezența acestor gene în apele de suprafață poate fi cauzată de contaminarea cu apele reziduale deversate din
spitale. (Lupo și colab., 2012)

Potrivit unui alt studiu (Marinescu și colab., 2014), în tulpinile izolate din câteva ape reziduale și de suprafață

64
din Sudul Românei, au fost identificate gene de rezistență la antibiotice descrise recent în izolatele clinice (QnrS,
CTX -M), ceea ce ar putea indica faptul că bacteriile purtătoare ale acestor gene sunt eliberate în apele de
suprafață.

Prezența genei QnrS și a genei CTX -M în apele de suprafață incluse în studiul nostru sublini ază necesitatea
monitorizării calității apei, cu atât mai mult cu cât bazinul hidrografic din România este unitar, iar Dunărea este
o sursă din care se asigură necesarul de apă potabilă pentru multe orașe din țară.

În cadrul studiului nostru au fost identificate și gene care conferă rezistență la sulfonamide, sulI fiind cea mai des
întâlnită (51,51%), urmată de sulII (3,03%). O distribuție asemănătoare a acestor gene a fost observată și în alte
studii recente din țara noastră (Marinescu și colab., 201 4).

Studiile anterioare sugerează, de asemenea, că presiunea selectivă generată de prezența antibioticelor poate
contribui la integrarea genei QnrS în plasmide și diseminarea în apele de suprafață. (Cattoir și colab., 2008).

65
Concluzii

1. Studiul realizat pe tulpinile de bacterii Gram -negative, izolate din habitatele acvatice și din mediul spitalicesc,
a condus la stabilirea prezenței genelor de rezistență la antibiotice la specii de importanță medicală.

2. Prezența genele de rezistență descrise anterior în izolatele clinice și în tulpini izolate din apele de suprafață,
dovedește existența transferului de gene.

3. Prezența genelor care conferă rezistență la antibiotice la tulpinile Gram -negative analizate a fost
variabilă, în funcție de sursa de izolare și de specia testată. Rezultatele prezentate au demonstrat prezența un or
gene de rezistență în rândul tulpinilor izolate din ape le de suprafață și din spital, aceasta având un rol
important în răspândirea determinanților de rezistență și, implicit a mecanismelor de rezistență asociate.
De asemenea, studiul nostru subliniază rolul important al apelor de suprafață ca și rezervor al unor gene de
rezistență.

4. Prezență genelor de rezistență la ant ibiotice la tu lpinilor asociate cu infecțiile comunitare pune în discuție
mecanismele de transmitere pe verticală sau orizontală, intra și inter -specială a elementelor genetice responsabile
de transfer. Apele de suprafață reprezintă un mediu propice pentru diseminarea și transferul genelor de rezistență
la antibiotice. În apă conviețuiesc bacterii de origine diferită (om, animal, sol), astfel mecanismele de rezistență
evoluează ca o consecință a transferului de gene. În același timp, antibiotice, dezinfecta nți și metale grele sunt
deversate în apă și pot exercita o presiune selectivă asupra bacteriilor, contribuind la apariția genelor de
rezistență.

5. Luând în considerare problematica reprezentată de transferul genelor de rezistență la antibiotice din mediul
natural la om, prin intermediul consumului de alimente sau apă, este necesară o monitorizare atentă a calității
apei. Mai mult, carnea de pește care provine din aceste ape poate transmite genele de rezistență la om, așa cum
se sugerează în studiul r ealizat de Hatha și colab., 2005.

6. În cadrul studiului nostru au fost identificate gene de rezistență la antibiotice descoperite recent în izolatele
clinice (QnrS, CTX -M), ceea ce ar putea indica faptul că bacteriile purtătoare ale acestor gene sunt eliberate în
apele de suprafață din apele reziduale.

7. Prezentul studiu demonstrează necesitatea monitorizării fenomenului de antibi orezistență . Apele de suprafață
contaminate cu bacter ii rezistente pot reprezenta o reală amenințare la adresa sănătății publice, dat fiind faptul

66
că există posibilitatea ca genele codificatoa re ale unor determinanți de rezistență, transportate cu ajutorul
elementelor genetice mobile, să fie transferate la nivelul altor bacterii comensale sau patogene.

67
Bibliografie

1. Agerso Y., D. Sandvang (2005) – Class 1 integrons and tetracycline resistance genes în alcaligenes,
arthrobacter, and Pseudomonas spp. isolated from pigsties and manured soil, Appl. Envirom. Microbiol .,
71(12): 7941 -7.
2. Aminov, R. I., & Mackie, R. I. (2007) . Evolution and ecology of antibiotic resistance genes. FEMS
microbiology letters , 271(2), 147 -161.
3. Aminov, R. I., Chee -Sanford, J. C., Garrigues, N., Teferedegne, B., Krapac, I. J., White, B. A., & Mackie, R.
I. (2002). Development, validation, and applic ation of PCR primers for detection of tetracycline efflux genes
of gram -negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology , 68(4), 1786 -1793.
4. Aminov, R. I., Garrigues -Jeanjean, N., & Mackie, R. I. (2001). Molecular ecology of tetracycline resistance :
development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal
protection proteins. Applied and environmental microbiology , 67(1), 22 -32.
5. Angelescu Mircea (1998) – Terapia cu antibiotice, Ed. Medicală, București.
6. Antunes, P., Machado, J., Sousa, J. C., & Peixe, L. (2005). Dissemination of sulfonamide resistance genes
(sul1, sul2, and sul3) in Portuguese Salmonella enterica strains and relation with integrons. Antimicrobial
agents and chemotherapy, 49(2), 836 -839.
7. Atkinson BA, Abu -Al-Jaibat A & LeBlanc DJ (1997) Antibiotic resistance among enterococci isolated from
clinical specimens between 1953 and 1954. Antimicrob Agents Chemother 41: 1598 –1600.
8. Bali, E. B., Accedil, L., & Sultan, N. (2010). Phenotypic and molecular characterization of SHV, TEM,
CTX -M and extended -spectrum -lactamase produced by Escherichia coli, Acinobacter baumannii and
Klebsiella isolates in a Turkish hospital. African Journal of Microbiology Research , 4(8), 650 -654.
9. Barbosa TM, Scott KP & Flint HJ (1999) Evidence for recent intergeneric transfer of a new tetracycline
resistance gene, tet(W), isolated from Butyrivibrio fibrisolvens, and the occurrence of tet(O) in ruminal
bacteria. Environ Microbiol 1 : 53–64.
10. Burton R.W. Gwendolyn and Engelkirk G. Paul (2002) – Using antimicrobial agents to control microbial
growth in vivo, in Microbiology for the Health Sciences, 7th Edition Gwendolyn Burton & Paul Engelkirk
(eds), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelph ia, 226 -248.

68
11. Cattoir, V., Poirel, L., Rotimi, V., Soussy, C. J., & Nordmann, P. (2007). Multiplex PCR for detection of
plasmid -mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL -producing enterobacterial isolates. Journal of
antimicrobial chemotherapy , 60(2), 394-397.
12. Collis H., (1995) – Integrons and Mobile Gene Cassettes, Molecular Microbiolg , 15:593 -600.
13. Connell SR, Trieber CA, Stelzl U, Einfeldt E, Taylor DE &Nierhaus KH (2002) The tetracycline resistance
protein Tet(O) perturbs the conformation of the ribosomal decoding centre. Mol Microbiol 45: 1463 –1472.
14. Cousin S, Whittington WL & Roberts MC (2003) Acquired macrolide resistance genes in pathogenic
Neisseria spp. isolated between 1940 and 1987. Antimicrob Agents Chemother 47: 3877 –3880.
15. De Leener E, Ma rtel A, De Graef EM, Top J, Butaye P, Haesebrouck F, Willems R & Decostere A (2005)
Molecular analysis of human, porcine, and poultry Enterococcus faecium isolates and their erm(B) genes .
Appl Environ Microbiol 71 :2766 –2770.
16. Diaz M.A., Cooper R.K., Cloecka ert A., Siebeling R.J. (2006) – Plasmid -mediated high level gentamicin
resistance among enteric bacteria isolated from pet turtles in Louisiana, Appl. Envirom.Microbiol, 72 (1):
306-12.
17. Eftekhar, F., Hosseini -Mazinani, S. M., Ghandili, S., Hamraz, M., & Za mani, S. (2005). PCR detection of
plasmid mediated TEM, SHV and AmpC β -lactamases in community and nosocomial urinary isolates of
Escherichia coli. Iranian J Biotech , 3(1), 48 -54.
18. Engemann, C.A., Adams, L., Knapp, C.W., Graham, D.W., 2006. Disappearance of oxytetracycline
resistance genes in aquatic systems. FEMS Microbiol. Lett. 263 , 176 –182.
19. Enne VI, Bennett PM, Livermore DM & Hall LM (2004) Enhancement of host fitness by the sul2 -coding
plasmid p9123 in the absence of selective pressure . J Antimicrob Chem other 53 :958–963.
20. Fedesa (2000) – Antibiotics for animals. A FEDESA perspective on antibiotics, Animal Health and the
Resistance Debate, vol. February: 6.
21. Frank, T., Gautier, V., Talarmin, A., Bercion, R., & Arlet, G. (2007). Characterization of sulphonami de
resistance genes and class 1 integron gene cassettes in Enterobacteriaceae, Central African Republic (CAR).
Journal of Antimicrobial Chemotherapy , 59(4), 742 -745.
22. Furushita M., Shiba T., Maeda T., Yahata M., Kaneoka A., Takahashi Y., Torii K., Hasegawa T., Ohta M.
(2003) – Similarity of tetracycline resistance genes isolated from fish farm bacteria tothose from clinical

69
isolates, Appl Envir. Microbiol, 69 (9): 5336 -42;
23. Gilliver MA, Bennett M, Begon M, Hazel SM & Hart CA (1999) Antibiotic resistance found in wild rodents.
Nature 401 : 233 –234.
24. Han, J. W., Koh, H. B., & Kim, T. J. (2016). Molecular characterization of β -Lactamase -producing
Escherichia coli collected from 2001 to 2011 from pigs in Korea. Foodborne pathogens and disease , 13(2),
68-76.
25. Hanson, N. D., & Sanders, C. C. (1999). Regulation of inducible AmpC beta -lactamase expression among
Enterobacteriaceae. Current pharmaceutical design , 5(11), 881-894.
26. Hardy, B. (2002). The issue of antibiotic use in the livestock industry: what have we learned?. Animal
biotechnology , 13(1), 129 -147.
27. Hatha, M., Vivekanandhan, A. A., & Joice, G. J. (2005). Antibiotic resistance pattern of motile aeromonads
from farm raised fresh water fish. International Journal of Food Microbiology , 98(2), 131 -134.
28. Heinemann J.A. (1999) – How antibiotics cause antibiotic resistance, Drug Discov Today, 4 (2): 72 -79.
29. Issam Raad, Hend Hanna (2007) – Comparative Activities of Daptomycin, Linezolid, and Tigecycline
against Catheter -Related Methicillin -Resistant Staphyloco ccus Bacteremic Isolates Embedded in: Biofilm
Antimicrobial Agents and Chemotherapy , Vol. 51, No. 5, p.1656 -1660
30. Jackson C.R., Fedorka C.P.J., Barrett J.B., Ladely S.R. (2004) – Effects of tylosin use on erythromycin
resistance in enterococci isolated from swine, Appl. Envirom. Microbiol, 70 (7) : 4205 -10.
31. Johnson A.P., Burns L., Woodford N., Threlfall E.J., Naidoo J., Cooke E.M., George R.C. (1994) –
Gentamicin resistance in clinical isolates of Echerichia coli encoded by genes of veterinary origin, J. Med.
Microbiol., 40 (3): 221 -6.
32. Kazimierczak KA, Flint HJ & Scott KP (2006) Comparative analysis of sequences flanking tet(W) resistance
genes in multiple species of gut bacteria. Antimicrob Agents Chemother 50 : 2632 –2639.
33. Kehrenberg C., Weckenthin C., Schwarz S. (1998) – Tn570, a transposon -like element fromPasteurella
multocida mediating tetracycline resistance, Antimicrob. Agents Chemother., 42 (8): 2116 -8.
34. Kuhn F., Cottagnound M., Acosta F., Flatz L., Enteza J., Cottagnound P. (2003) – Cefotaxine acts

70
syner gistically with levofloxacin in experimental meningitis due to penicillin -resistant pneumococci and
prevents selection of levofloxacin resistant mutants in vivo, Antimicrob Agents Chemother., 47 (8): 2487 -91.
35. Kümmerer, K. (2004). Resistance in the environm ent., Journal of Antimicrobial Chemotherapy , 54(2), 311 –
320.
36. Lafontaine DL, Preiss T & Tollervey D (1998) Yeast 18S rRNA dimethylase Dim1p: a quality control
mechanism in ribosome synthesis ? Mol Cell Biol 18 : 2360 –2370.
37. Lau SK, Woo PC, To AP, Lau AT & Yuen KY (2004) Lack of evidence that DNA in antibiotic preparations
is a source of antibiotic resistance genes in bacteria from animal or human sources. Antimicrob Agents
Chemother 48 : 3141 –3146.
38. Lazãr, V. (2011). Quorum sensing in biofilms –how to destroy the bacterial citadels or their
cohesion/power?. Anaerobe , 17(6), 280 -285.
39. Lazãr, V., & Chifiriuc, M. C. (2010). Architecture and physiology of microbial biofilms. Roum Arch
Microbiol Immunol , 69(2), 95 -107.
40. Lazãr, V., & Chifiriuc, M. C. (2010). Medical significance and new therapeutical strategies for biofilm
associated infections. Roum Arch Microbiol Immunol , 69(3), 125 -138.
41. Lenski RE (1997) The cost of antibiotic resistance – from the perspective of a bacterium. Ciba F ound Symp
207: 131 –140.
42. Lepšanovic Z, Tomanovic B, Rakonjac B, Ðuric M,Perovanovic J, Rackov G, et al. Molecular
characterization of metallo -β-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa strains. Med Data. 2012;
4(3):249 -52.
43. Levy MS, Balbinder E & Nagel R ( 1993) Effect of mutations in SOS genes on UV -induced precise excision
of Tn10 in Escherichia coli. Mutat Res 293 : 241 –247.
44. Livermore DM (1996) Are all beta -lactams created equal? Scand J Infect Dis Suppl 101: 33 –43.
45. Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parke r, J. (2014). Brock biology of microorganisms (Vol. 14). Upper
Saddle River, NJ: prentice hall, ISBN -13: 978 -0321897398.
46. Marble Michelle (1999) – Plasmid DNA associated with specific bands in PFGE patterns of antibiotic –
resistant Salmonella serotype enter itidis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy Record 107 , 5-7.

71
47. Marinescu, F., Marutescu, L., Savin, I., Lazăr, V. (2015). Antibiotic resistance markers among Gram –
negative isolates from wastewater and receiving rivers in South Romania. Romanian Biotechnolo gical
Letters, 20(1), 10055 -10069.
48. Matinca, D. (2002). Antibiotice. Editura Medicală Universitară" Iuliu Hatieganu".
49. McDermott P.F., Zhao S., Wagner D.D., Simjee S., Walker R.D., White D.G. (2002) –The food safety
perspective of antibiotic resistance, Anim.Biotehnol., 13(1):71 -84;
50. Merie Queenan, A., & Bush, K. (2007). carbapenemases: the versatile B -lactamases. Clin Microbiol Rev ,
20(3), 440 -458.
51. Mihăescu, G., Chifiriuc, C., & Dițu, L. M. (2007). Antibiotoce și substanțe chimioterapeutice
antimicrobiene . Editura Academiei Române.
52. Naas, T., Poirel, L., & Nordmann, P. (2008). Minor extended ‐spectrum β ‐lactamases. Clinical microbiology
and infection , 14(s1), 42 -52.
53. Nordmann, P., Poirel, L., Carrër, A., Toleman, M. A., & Walsh, T. R. (2011). How to detect NDM -1
producers. Journal of clinical microbiology , 49(2), 718 -721.
54. Nordmann, P., Poirel, L., Carrër, A., Toleman, M. A., & Walsh, T. R. (2011). How to detect NDM -1
producers . Journal of clinical microbiology , 49(2), 718 -721.
55. Oniga, O., Tiperciuc B., (2003) . Antibiotice antibacteriene. Editura Medicală Universitară "Iuliu Hațieganu".
56. Osterblad M, Leistevuo J, Leistevuo T, Jarvinen H, Pyy L,Tenovuo J & Huovinen P (1995) Antimicrobial
and mercury resistance in aerobic gram -negative bacilli in fecal flora among persons with and without dental
amalgam fillings. Antimicrob Agents Chemother 39 : 2499 –2502.
57. Osterblad M, Norrdahl K, Korpimaki E & Huovinen P (2001) Antibiotic resistance. How wild are wild
mammals? Nature 409 : 37–38.
58. Pan, J., Hu, L., Yu, F., Chen, C., & Zhang, X. (2010). Coexistence of multiple antimicrobial -resistance genes
in a carbapenem -resistant Citrobacter freundii clinical isolate from China. Journal of medical microbiology,
59(5), 622-623.
59. Pang Y, Brown BA, Steingrube VA, Wallace RJ Jr & Roberts MC (1994) Tetracycline resistance
determinants in Mycobacterium and Streptomyces species. Antimicrob Agents Chemother 38:1408 –1412.
60. Paterson, D. L., & Bonomo, R. A. (2005). Extended -spectrum β -lactamases: a clinical update. Clinical
microbiology reviews , 18(4), 657 -686.
61. Peak, N., Knapp, C.W., Yang, R.K., Hanfelt, M.M., Smith, M.S., Aga, D.S., Graham, D.W.,2007.
Abundance of six tetracycline resistance genes in wastewater lagoons atcattle feedlots with different
antibiotic use strategies . Environ. Microbiol. 9, 143 –151.
62. Philippon, A., Arlet, G., & Jacoby, G. A. (2002). Plasmid -determined AmpC -type β -lactamases.

72
Antimicrobial agents and chemotherapy , 46(1), 1 -11.
63. Poirel, L., Dortet, L., Bernabeu, S., & Nordmann, P. (2011). Genetic features of blaNDM -1-positive
Enterobacteriaceae. Antimicrobial agents and chemotherapy , 55(11), 5403 -5407.
64. Poirel, L., Walsh, T. R., Cuvillier, V., & Nordmann, P. (2011). Multiplex PCR for detection of acquired
carbapenemase genes. Diagnostic microbiology and infectious disease , 70(1 ), 119 -123.
65. Pruden, A., Pei, R., Storteboom, H., Carlson, K.H., 2006. Antibiotic resistance genes asemerging
contaminants: studies in northern Colorado. Environ . Sci. Technol. 40 ,7445 –7450
66. Ramadhan AA & Hegedus E ( 2005) Survivability of vancomycin resistan t enterococci and fitness cost of
vancomycin resistance acquisition. J Clin Pathol 58 : 744 –746.
67. Ribera A., Roca I., Ruiz J., Gibert I., Vila J. (2003) – Partial characterization of a transposon containing the
tet (A) determinant in a clinical isolate of Ac inetobacter baumannii, J. Antimicrob. Chemother. 52 (3): 477 –
80;
68. Salyers AA & Amabile -Cuevas CF (1997) Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination?
Antimicrob Agents Chemother 41 : 2321 –2325.
69. Salyers AA, Gupta A & Wang Y (2004) Human int estinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance
genes. Trends Microbiol 12 : 412 –416.
70. Schlüter, A., Szczepanowski, R., Pühler, A., Top, E.M., 2007. Genomics of IncP -1 antibiotic resistance
plasmids isolated from wastewater treatment plants provides evidence for a widely accessible drug resistance
gene pool. Microbiol. Rev. 31 , 449 –477
71. Schwartz, T., Volkmann, H., Kirchen, S., Kohnen, W., Schön -Hölz, K., Jansen, B., Obst,U., 2006. Real -time
PCR detection of Pseudomonas aeruginosa in clinical andmunici pal wastewater and genotyping of the
ciprofloxacin -resistant isolates. FEMS Microbiol. Ecol . 57, 158 –167
72. Shan, L. I . N., Thomas, M., Shlaes, D. M., Rudin, S. D., ANDERSON, V., & BONOMO, R. A. (1998).
Kinetic analysis of an inhibitor -resistant variant of the OHIO -1 β-lactamase, an SHV -family class A enzyme.
Biochemical Journal, 333(2), 395-400.
73. Shoemaker NB, Vlamakis H, Hayes K & Salyers AA (2001) Evidence for extensive resistance gene transfer
among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl Environ
Microbiol 67 : 561 –568.
74. Slavcovici Adriana (2008). Antibiotic resistance of bacteria involved in severe infections Romanian Journal
of Infectious D isease. Revista Română de Boli Infecțioase 4 , 65-72.

73
75. Sockett D.C., Valley Ann (2006) – Antimicrobial susceptibility testing, Wisconsin Veterinary Diagnostic
Laboratory , April 14.
76. Swartz N. Morton (2000) – Minireview: Impact of antimicrobial agents and chem otherapy, from 1972 to
1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy , 2000 – 2016.
77. Todar, K. (2002). Antimicrobial Agents used in the treatment of infectious disease. Department of
Bacteriology University of Wisconsin -Madison.
78. Van der Poll, T., & Opal, S. M. (2008). Host –pathogen interactions in sepsis. The Lancet infectious diseases,
8(1), 32-43.
79. Walsh, T. R., Toleman, M. A., Poirel, L., & Nordmann, P. (2005). Metallo -β-lactamases: the quiet before the
storm?. Clinical microbiology reviews, 18(2), 306-325.
80. Wiethan, J., Unger, J., Brunswik -Titze, A., & Kümmerer, K. (2001). Occurrence and reduction of antibiotic
resistant (pathogenic) bacteria in municipal sewage treatment plants. In Proc. International Water
Association 2nd World Water Congress, Berlin (p. 227).
81. Yong, D., Toleman, M. A., Giske, C. G., Cho, H. S., Sundman, K., Lee, K., & Walsh, T. R. (2009).
Characterization of a new metallo -β-lactamase gene, blaNDM -1, and a novel erythromycin esterase gene
carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneum oniae sequence type 14 from India. Antimicrobial
agents and chemotherapy , 53(12), 5046 -5054.
82. http://www.romtech.ro/en/cbrn/cbrn -detection/biological -detection.html