Prezența și diseminarea genelor de rezistență la antibiotice câteva bacterii Gram Negative izolate din mediul clinic și natural în Sud-Estul României [307783]

[anonimizat]:

Prof. Univ. Dr. Veronica Lăzar

Îndrumător științific:

Asist. Univ. Dr. Irina Gheorghe

Student: [anonimizat]:

Mirela Popescu

București

2017

[anonimizat]. Nucleotida este unitatea de bază a ADN-[anonimizat] – acid ribonucleic. Este un polinucleotid format prin copolimerizarea ribonucleotidelor. Un ribonucleotid este format dintr-o bază azotată, o pentoză și o [anonimizat] (organite celulare la nivelul cărora se realizează sinteza proteinelor). Prin transcripție sunt sintetizați precursori de talie mare ce vor fi ulterior scindați în patru tipuri de ARNr: ARNr 28S, ARNr 5.8 S, ARNr 5S (ce intră în compoziția subunității mari a ribozomului) și ARNr 18S (ce intră în compoziția subunității mici)

CMA – concentrația minimă activă. Este concentrația la care antibioticul poate induce anumite perturbări în activitatea metabolică a microorganismelor, fară a [anonimizat] a [anonimizat] a unui antibiotic este concentrația minimă care omoară tulpina

GTP (Guanozin trifosfat). Este o nucleozidă purinică. [anonimizat] a ADN-[anonimizat]. Este un proces prin care porțiuni mici din materialul genetic pot fi transferate între bacterii ale aceleiași specii sau chiar între diferite specii.

LUCA (Last Universal Common Ancestor). Este considerat strămoșul comun al tuturor formelor de viață de pe Pământ cu o vechime de 3,8 [anonimizat]. Sunt proteine citoplasmatice solubile (~72 kDa) care mediază rezistența la tetraciclină. [anonimizat]. [anonimizat] H3O+

Reacția PCR ([anonimizat]). este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a [anonimizat]. [anonimizat]. Acest tip de reglare a expresiei genice a fost denumit mecanism de quorum sensing (QS) . [anonimizat]. Sunt compuși naturali extrași din alge (furanone halogenate), licheni, [anonimizat] a rezistenței

Cuprins

Partea generală

Introducere……………………………………………………………………………………………..

I. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul rezistenței la antibiotice în mediul clinic și natural al tulpinilor patogene………………………………………………………………………………………..

Originea și evoluția speciilor de bacterii rezistente ………………………………………………………………………..

Cauzele apariției și răspândirii rezistenței…………………………………………………………………………………….

Evoluția filogenetică a genelor de rezistență la antibiotice………………………………………………………………..

Factorii care contribuie la diseminarea și întreținerea rezistenței la antibiotice…………………………………………

Mecanismele rezistenței bacteriene la antibiotice…………………………………………………………………………………..

Tipuri de rezistență……………………………………………………………………………………………………………………..

Rezistența naturală…………………………………………………………………………………………………………………….

Rezistența dobandită………………………………………………………………………………………………………………….

Pseudorezistența……………………………………………………………………………………………………………………….

Mecanismele rezistenței la antibiotice…………………………………………………………………………………………

Mecanisme genetice……………………………………………………………………………………………………………..

1. Mutații spontane la nivelul ADN-ului bacterian……………………………………………………………..

2. Integrarea de material genetic exogen…………………………………………………………………………..

Mutații…………………………………………………………………………………………………………………

Recombinări cromozomiale……………………………………………………………………………………

Elemente mobile: plasmide, transpozoni și integroni………………………………………………..

3. Transferul de gene pe verticală………………………………………………………………………………….

4. Transferul de gene pe orizontală………………………………………………………………………………..

4.1. Transformare…………………………………………………………………………………….

4.2. Transducție……………………………………………………………………………………….

4.3. Conjugare. ……………………………………………………………………………………..

Genele care codifică pentru proteinele RPP…………………………………………………………………………….

Genele Tet și Erm………………………………………………………………………………………………………………………

Mecanisme biochimice…………………………………………………………………………………………………………

Inactivare enzimatică………………………………………………………………………………………………………….

Clasificarea β-lactamazelor…………………………………………………………………………………………………

β-lactamazele clasei A…………………………………………………………………………………………………

β-lactamazele clasei B…………………………………………………………………………………………………

β-lactamazele clasei C…………………………………………………………………………………………………

β-lactamazele clasei D………………………………………………………………………………………………..

Mecanisme celulare…………………………………………………………………………………………………………

Alte ipoteze referitoare la dobândirea rezistenței la antibiotice………………………………………………

Biofilmul………………………………………………………………………………………………………………………..

Insulele de patogenitate……………………………………………………………………………………………………..

Factori favorizanți……………………………………………………………………………………………………………..

Istoricul bolilor infecțioase……………………………………………………………………………………………………….

Metode de diagnostic……………………………………………………………………………………………………………….

Prevenția…………………………………………………………………………………………………………………………………

Abordări terapeutice…………………………………………………………………………………………………………………

Partea experimentală

Introducere……………………………………………………………………………………………………………………………….

Scop………………………………………………………………………………………………………………………………………….

Obiective……………………………………………………………………………………………………………………………………

Materiale și metode…………………………………………………………………………………………………………………….

Rezultate și discuții……………………………………………………………………………………………………………………..

Concluzii și perspective……………………………………………………………………………………………………………….

Bibliografie………………………………………………………………………………………………………………………………..

Introducere

Tema tezei de diserație abordează un subiect de mare actualitate, întrucât prezența bacteriilor rezistente și multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică la nivel mondial.

Subiectul este de interes întrucât datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru țara noastră, în special pentru zona sudică și estică.
Antibioticele sunt utilizate pentru tratarea boliilor atât la oameni cât și la animale. Potrivit unor studii (Levy, 1997; Oppegaard și colab. 2001 ), există mecanisme comune de rezistență la antibiotice în populațiile bacteriene proporțional cu utilizarea de antibiotice, în special în agricultură (Levy, 1997; Oppegaard și colab. 2001).

Utilizarea antibioticelor în scopuri profilactice sau terapeutice la om și în scopuri veterinare și agricole a furnizat o presiune selectivă care favorizează supraviețuirea și răspândirea microorganismelor rezistente sau multirezistente (Hooper, 2002; Mascaretti, 2003; Taber, 2002).

Bacteriile Gram negative s-au dovedit a fi cele mai des întâlnite, atât în mediul natural, cât și în spitale.

Pseudomonas aeruginosa și Acinetobacter baumannii sunt patogeni nosocomiali frecvenți, fiind implicați în apariția mai multor infecții, dificil de controlat.

Având în vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenței la antibiotice, lucrarea își propune sa evidențieze markerii genetici de rezistență la antibiotice a unor tulpini de bacili, izolați din câteva surse naturale de apă din Sud-Estul României, în scopul realizării pattern-urilor genetice comparative și a genelor care le conferă rezistență la antibiotice.

Profilul genetic al bacteriilor depistate va fi comparat cu cel al unor bacterii din mediul clinic.

Având în vedere necesitatea utilizării unor metode specifice de diagnostic a bacteriilor implicate în patologii, vom compara diferite metode de detectare a bacteriilor rezistente la antibiotice, cu scopul de a evidenția eficacitatea, rapiditatea și specificitatea fiecăreia dintre acestea.

Utilizarea metodelor moleculare va completa evaluarea fenotipică a izolatelor și astfel vom putea avea caracterizarea tulpinilor rezistente la terapie.

În partea a doua a lucrării, am izolat tulpini de bacterii din mediul natural și clinic pentru a identifica genele implicate în rezistența la antibiotice, iar rezultatele experimentului vor fi prelucrate și analizate prin mai multe tehnici și metode.

Rezultatele acestui studiu ar putea completa bazele de date de la nivel european sau mondial cu profilul genetic al tulpinilor bacteriene care au exprimate gene de rezistență la antibiotice.

Obiective

1. Determinarea prezenței unor bacterii Gram negative purtătoare de gene de rezistență la antibiotice la culturile izolate din mediul acvatic și spitalicesc.

2. Ilustrarea profilului genetic al tulpinilor izolate a unor tulpini de bacterii izolate într-un spital și în câteva ape din Sudul României.

3. Optimizarea unor metode de detecție a tulpinilor patogene.

4. Evidențierea prin comparație a profilului genetic la bacteriile pe care le-am izolat din mediul înconjurător și intraspitalicesc.

5. Investigarea mecanismelor de răspândire a genelor de rezistență (mutație spontană versus transfer orizontal).

6. Compararea rezultatelor obținute cu cele existente în literatura de specialitate

I. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul rezistenței la antibiotice în mediul clinic și natural al tulpinilor patogene

Originea și evoluția speciilor de bacterii rezistente la antibiotice

Bacteriile au apărut pe Pământ acum câteva miliarde de ani, timp în care și-au perfecționat mecanismele de adaptare la mediul extern, în special prin plasticitate și flexibilitate genetică. (Cupșa, 2007).La ora actuală se crede că toate celulele au ca strămoș o celulă ancestrală comună, ultimul strămoș comun universal (LUCA).

Evoluția omului a avut loc într-o relație simbiotică cu flora bacteriană endogenă (numărul celulelor bacteriene depășește numărul de celule umane). Diversitatea microorganismelor, variatele genotipuri și fenotipuri de rezistență la antibiotice, sunt studiate pe baza metodelor moleculare de secvențiere a genelor.

O mare parte a antibioticelor își au originea în bacteriile existente (spre exemplu eritromicină, streptomicină, vancomicină, daptomicină). (Baltz, 2005)

Aceste bacterii prezintă mecanisme de protejare împotriva propriilor produși, mecanisme care odată ce sunt transferate patogenilor sau oportuniștilor anulează acțiunea antibioticelor.

Cauzele apariției și răspândirii rezistenței la antibiotice

Rezistența la antibiotice reprezintă capacitatea naturală sau dobândită a unui microorganism de a supraviețui în prezența unuia sau mai multor antibiotice. (Depardieu și colab., 2007)

Rezistența la antibiotice poate să apară prin mai multe mecanisme: selecție naturală, mutații spontane (ca rezultat al acțiunii factorilor de mediu) sau prin erori necorectate în procesul de replicare al ADN-ului. (Curtis și colab., 2007)

Acest proces biologic natural duce la supraviețuirea celor mai rezistente tulpini (Fedesa, 2000).

Odată apărută rezistența la antibiotice, gena care codifică acest caracter se poate răspândi la alte celule prin transfer de plasmide, transpozoni sau integroni.

O bacterie poate avea mai multe gene de rezistență la antibiotice exprimate, fiind numită multirezistentă.

Rezistența la antibiotice poate fi indusă unui microorganism și pe cale artificială, prin tehnici de transformare.

Rezistența se manifestă atât la nivel individual cât și populațional (comunitar sau nosocomial).

Un studiu filogenetic recent pe tema rezistenței la antibiotice arată că unele gene de rezistență la antibiotice au o lungă istoria evoluționistă de diversificare, care a început cu mult înainte de „epoca antibiotic“. (Ventola, 2015).

Problema rezistenței la antibiotice este actuală și face obiectul mai multor studii deorece există o creștere semnificativă a numărului bacteriilor patogene rezistente la antibiotice.

De cele mai multe ori rezistența la antibiotice este asociată cu utilizarea și abuzul de antibiotice, atât la oameni cât și la animale.
Cu toate acestea, rezistența dobândită prin transferul lateral de gene de rezistență la antibiotice este cea mai fecvent întâlnită la bacterii taxonomic îndepărtate. (Penesyan și colab., 2015)

Evoluția filogenetică a genelor de rezistență la antibiotice

Transferul de gene pe orizontală între taxoni îndepărtați filogenetic este dificil de reprodus in vitro deoarece la ora actuală nu se cunosc bacteriile și mecanismele genetice care au fost implicate, condițiile de mediu la momentul transferului și rata de transfer (poate fi prea mică pentru a o reproduce într-un experiment). Totuși, datorită programelor și bazelor de date disponibile, este posibil să se efectueze o analiză filogenetică a ascendenților unor specii de bacterii pentru a se confirma ipoteza transferului de gene pe orizontală. În urma experimentelor de cartare a genelor implicate în rezistența la antibiotice, s-a evidențiat faptul că acestea sunt grupate în zone denumite "clusteri". Localizarea acestor gene este de obicei cromozomală, dar există și cazuri când acestea sunt localizate în plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi și colab.,1987).

Factorii care contribuie la diseminarea și întreținerea rezistenței la antibiotice

Conform studiului lui Chastre, factorii de risc care contribuie la apariția și răspândirea infecțiilor cu bacterii rezistente sau multirezistente sunt:

a. tratamentul cu antibiotice cu cel puțin 90 zile anterior apariției simptomelor

b. internare în ultimele 3 luni

c. studii care indică frecvența crescută a tulpinilor curezistență în comunitate sau în spital

d. imunosupresia rezultată în urma tratamentului cu imunosupresoare sau a unei boli care influențează răspunsul imun

e. terapia intravenoasă (cu sau fără antibiotice)

f. dializă

g. existența unor membri de familie purtători de tulpini patogene rezistente sau multirezistente (Chastre, 2008)

Antibioticele se folosesc în numeroase contexte: de la tratamentul boliilor la hrănirea animalelor de producție alimentară pentru stimularea creșterii. Factorul evolutiv este foarte important, mai ales în contextul creșterii accentuate a producției și consumului de antibiotice. Presiunea impusă de mediu selectează tulpinile patogene cele mai rezistente, dar problema nu va înceta să existe atunci când presiunea este îndepărtată. (Salyers și Amabile-Cuevas, 1997).

Deși unele studii sugerează faptul că dobândirea și transferul genelor de rezistență presupune consum energetic ridicat pentru celula bacteriană și că genele de rezistență la antibiotice se vor inactiva odată ce presiunea selectivă este eliminată, în natură există multe exemple care demonstrează plasticitatea bacteriilor, în scopul reducerii metabolismului. (Lenski, 1997; Enne și colab., 2005; Ramadhan și Hegedus, 2005).

Reducerea consumului energetic necesar transferului genelor poate fi unul dintre motivele pentru care genele de rezistență la antibiotice supraviețuiesc procesului de selecție impus de prezența antibioticelor. (Gilliver și colab.,1999).

Prin urmare, răspândirea de gene de rezistență la antibiotice în mediul înconjurător devine o problemă; studiile arată că în zonele cu un nivel redus al utilizării antibioticelor în agricultură frecvența genelor de rezistență este foarte scăzută (Osterblad și colab., 2001).

Tipuri de rezistență: naturală și dobândită

Rezistența la antibiotice a bacteriilor poate fi datorată unei trăsături specifice a unui microorganism care o face în mod natural rezistentă (naturală), sau poate fi dobândită.

Rezistența naturală

Rezistența naturală reprezintă rezistența unei specii bacteriene la acțiunea unuia sau mai multor antibiotice administrate în doze care pot inhiba creșterea sau distruge alte microorganisme.

Rezistența naturală este proprietatea intrinsecă a speciei, fiind determinată genetic. (Burton și Engelkirk, 2002)

Rezistența dobândită

Rezistența dobândită poate fi definită ca acea rezistență necaracteristică unei specii bacteriene, dar prezentă în anumite subpopulații din acea specie în circumstanțe date.

De exemplu, antibioticul acționează ca un presor selectiv (pacientul are o infecție în care majoritatea populației bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar există și tulpini rezistente). În aceste condiții, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor supraviețui.

În practică, bacteria este considerată rezistentă când se înregistrează un raport subunitar între nivelul seric mediu suportat de pacient și concentrațiile minime inhibitorii sau bactericide ale antibioticului. (Todar, 2002).

În scopul de a dobândi rezistență la antibiotice, bacteriile dezvoltă mai multe mecanisme de apărare.

Toate mecanismele presupun fie modificarea materialului genetic existent, fie integrarea unui nou material genetic.

Rezistența dobândită prezintă importanță clinică și epidemiologică din cauza transmiterii în cadrul aceleiași specii dar și între specii îndepărtate taxonomic.

Clasificare

Potrivit lui Swartz (Swartz, 2000), există mai multe tipuri de rezistență dobândită, în funcție de diferite criterii :

a. După momentul în care se instalează infecția, rezistența este:

– primară → starea de rezistență a bacteriei în momentul inițierii infecției

– secundară → dobândită de tulpina infectantă în urma terapiei

b. După numărul de antibiotice față de care se instalează rezistența:

– Monorezistență → rezistența microbiană față de un singur antibiotic

– Plurirezistența (multirezistența) → rezistența microbiană față de mai multe antibiotice

c. După viteza de instalare a rezistenței față de antibiotice:

– Rezistență rapidă de tip streptomicinic → apărută într-o singură treaptă (mutație unică, pe o singură genă)

– Rezistență progresivă de tip penicilinic → apărută în mai multe trepte (mutații succesive)

d. După prezența sau absența antibioticului:

– rezistență inductibilă → rezistența apare numai în prezența antibioticului)

– rezistența constitutivă → rezistența este independentă de prezența sau absența antibioticului)

Pseudorezistența

Prin pseudorezistență se definește ineficiența unui tratament cu antibiotice cauzat de caracteristicile organismului gazdă sau de utilizarea incorectă a antibioticelor.

Pseudorezistența este un fenomen temporar, reversibil, care apare numai in vivo.

Dezvoltarea rezistenței este favorizată de caracteristicile farmacocinetice ale antibioticelor și de o terapie incorectă (doză insuficientă, durată prea scurtă sau lungă a tratamentului), dar și de concentrația activă ineficientă a antibioticului la locul infecției (din cauza barierei seroase, țesuturilor nevascularizate, inactivarea antibioticelor sau a pH-ului nefavorabil).

O altă cauză a eșecului terapeutic este rezistența relativă a bacteriilor, care sunt sensibile in vitro, dar insensibile in vivo (datorită reducerii metabolismului) și statusul imun al pacientului.

O forță selectivă importantă o reprezintă cantitatea mare de antibiotice utilizate în agricultură, precum și în terapia și profilaxia din medicina umană și veterinară (Hardy, 2002).

Mecanismele de dobândire a rezistenței bacteriene la antibiotice

La ora actuală, sunt cunoscute mai multe mecanisme care le conferă bacteriilor rezistență la antibiotice. Cele mai studiate mecanisme sunt cele genetice, biochimice și celulare.

Aceste mecanisme pot să inactiveze antibioticul prin modificarea chimică a structurii compusului activ, prin eliminarea din celulă, sau prin modificarea situsului țintă care nu mai este recunoscut de antibiotic.

Inactivarea enzimatică a antibioticului reprezintă mecanismul cel mai des întâlnit în natură. O strategie alternativă utilizată de multe bacterii este modificarea situsului țintă al antibioticului.

Mecanismele genetice

Rezistența la antibiotice poate fi indusă la bacterii prin mecanisme de variație genetică, atât de natură endogenă (mutații și translocări), cât și exogenă (recombinări cromozomiale, transfer de plasmide rezistente, transpozoni sau integroni).

Mutații spontane la nivelul ADN-ului bacterian

Mutațiile apar fie în genele structurale, determinând modificări ale moleculelor țintă sau a sintezei enzimelor ce inactivează antibioticul, fie în genele reglatorii cu rol în activarea pompelor de eflux pentru antibiotic și/sau modificarea porilor membranei celulare.

Genele de rezistență sau represorii lor pot fi activați sau inactivați prin migrarea secvențelor de inserție.

Acest tip de rezistență se întâlnește la tulpinile de Streptococcus pneumoniae rezistente la peniciline și/sau cefalosporine, tulpinile de Streptococcus aureus cu rezistență la oxacilină, mutațiile determinând modificări ale moleculelor țintă.

Rata mutațiilor spontane in vivo este de aproximativ (variază între ), dar poate crește de 200 de ori în condiții de stres oxidativ, în prezența antibioticelor. (Livermore, 2003)

Acest fenomen se întâlnește la tulpinile de E.coli rezistente sau, în cazul fibrozei chistice, la tulpinile de Pseudomonas aeruginosa cu multirezistență la cefalosporine, aminoglicozide și cloramfenicol.

Din cauza mutațiilor apare multirezistența prin activarea pompelor de eflux în asociere cu alterarea porinelor, sau modificări ale moleculelor țintă. (Livermore, 2003)

Integrarea de material genetic exogen

Integrarea de material genetic exogen se realizează prin recombinări cromozomiale, prin elemente mobile sau prin transferul genelor de rezistență între specii diferite sau intraspecie.

a. Recombinări cromozomiale

Acest tip de rezistență apare ca urmare a unor mutații în secvențele nucleotidelor cromozomului bacterian, ceea ce determină sinteza de proteine sau alte macromolecule care interferă cu activitatea antibioticelor.

Mutațiile cromozomiale pot fi spontane sau induse de agenți mutageni (în special de antibiotice), se transmit și pe verticală (fără contact cu antibioticul) și sunt definitive. .

Totuși, se presupune că numărul de mutanți rezistenți va scădea după încetarea expunerii la antibiotic. (Kuhn și col., 2003)

Într-o populație expusă la un antibiotic, dezvoltarea rezistenței cromozomale este, de obicei, un proces gradual, realizat prin mutații succesive. Rar însă, pentru unele antibiotice o singură mutație poate determina rezistență (care se reflectă într-o creștere a CMI).

Apariția mutanților rezistenți este mult mai puțin frecventă in vivo decât in vitro, probabil datorită faptului că mutațiile care duc la rezistență sunt, de obicei, asociate cu alte modificări celulare, care pot fi dezavantajoase bacteriei. (Kuhn și col., 2003).

Din acest motiv, unii oameni de știință privesc dezvoltarea rezistenței determinată de mutații cromozomale ca pe o mică problemă, comparativ cu rezistența transferabilă. În practică, aceste mutații au importanță redusă, datorită faptului că apar rar (~10% din totalul mutațiilor). (Jackson și col., 2004).

b. Rezistența transferabilă prin elemente mobile

Bacteriile au sisteme de transfer genetic deosebit de eficiente, capabile de a interschimba și acumula genele rezistenței.

Unele gene, inclusiv cele care induc rezistența, se pot transfera între elementele ADN-ului cromozomal și extracromozomal ale bacteriilor. Mutațiile extracromozomiale sunt mult mai frecvente (~90%), deci au mare importanță clinică.

Genele se pot transmite între bacterii care aparțin aceleiași specii sau unor specii și genuri diferite (transfer orizontal), care împart același ecosistem. Odată ce s-au activat gene ale rezistenței în elemente mobile transferabile, bacteriile care poartă aceste gene vor rămâne donori potențiali pentru alte bacterii. (Agerso și col., 2005).

În ultimii ani, un număr important de gene ale rezistenței au fost asociate cu transferul de ADN extracromozomal prin plasmide, transpozonii sau integroni. S-a demonstrat că aceste elemente mobile transmit determinanți genetici ai unor mecanisme ale rezistenței antimicrobiene și au importanță în diseminarea genelor rezistenței între bacterii diferite. (McDermott ,2002)

Plasmide

Plasmidele sunt molecule de ADN extracromozomal, replicabil, care conțin genele rezistenței. (Marble, 1999)

Replicarea plasmidială are loc independent de ADN-ul cromozomal. Plasmidele sunt importante în evoluția bacteriană, deoarece ele au rol în replicare, reglarea metabolismului, rezistența la toxinele bacteriene (bacteriocine), antibiotice și bacteriofagi, astfel asigurând o șansă mai bună de supraviețuire și propagare.

Cu toate acestea, plasmidele nu sunt necesare pentru supraviețuirea bacteriei. Au fost identificate la majoritatea speciilor bacteriene, având capacitatea de a fi transferate (conjugative) sau co-transferate (non-conjugative) de la o bacterie la alta.

Genele codificate de plasmide sunt mai mobile decât genele cromozomale deoarece plasmidele pot fi transferate în interiorul unei specii sau între diferite specii bacteriene.

Printre cele mai răspândite și bine studiate plasmide sunt plasmidele de rezistență (R-plasmide), care conferă rezistență la antibiotice sau la alți inhibitori de creștere. În general, genele de rezistență codifică pentru proteine care inactivează antibioticul. (Diaz și col., 2006).

Achiziția de noi determinanți ai rezistenței poate apărea mult mai rapid prin R-plasmide decât prin mutație genetică.

Mai multe gene de rezistență la antibiotice pot fie codificate pe o singură plasmidă R, iar o bacterie multirezistentă poate conține mai multe plasmide R diferite.

O singură R-plasmidă poate codifica simultan pentru rezistență la peste 10 antibiotice diferite. Spre exemplu, plasmida R100 determină rezistența la sulfonamide, streptomicină, cloramfenicol și tetraciclină. (Diaz și col., 2006)

Plasmidele din izolate umane și veterinare par a fi foarte asemănătoare, sugerându-se chiar transmiterea lor de la animale la om.

Diseminarea plasmidelor poate apărea prin distribuire clonală și prin transfer intra- și inter-special, ceea ce duce la o înmulțire graduală a microorganismelor transportoare a uneia sau mai multor gene codificate pe plamida R. (Diaz și col., 2006)

Rezistența plasmidică față de unul sau mai multe antibiotice (multirezistență) este dependentă de genotipul speciei, având transmitere atât pe orizontală, cât și pe verticală. (Johnson și col., 1994).

Transpozonii

Transpozonii sunt secvențe scurte de ADN care pot transfera material genetic între plasmide, între plasmide și cromozomul bacterian sau între o plasmidă și un bacteriofag (Henderson, 2000).

Spre deosebire de plasmide, transpozonii nu sunt capabili să se replice independent, ei trebuie să fie menținuți într-un replicon funcțional (cromozom sau plasmidă).

Transpozonii la bacteriile Gram-negative sunt non-conjugativi, în timp ce la bacteriile Gram-pozitive pot fi atât conjugativi cât și non-conjugativi. (Kehrenberg și col., 1998)

Totuși, dacă un transpozon al bacteriilor Gram-negative este parte a ADN-ului unei plasmide conjugative, transferul orizontal este posibil. Transpozonii, inclusiv aceia care transportă genele rezistenței, sunt preluați de către plasmide și apoi încorporați în ADN-ul bacterian. (Ribera și col., 2003)

De cele mai multe ori, pe aceeași plasmidă se găsesc mai mulți transpozoni, determinând transferul mai multor determinanți ai rezistenței în cursul unei singure conjugări.

Transferul intracelular al transpozonilor între plasmide, între cromozomul bacterian și plasmide poate duce la o rapidă dezvoltare a rezistenței în interiorul unor populații bacteriene.

Exprimarea genelor rezistenței localizate pe tranpozoni (spre exemplu, producția de enzime specifice) poate să necesite prezența antibioticului.

Mai mult de atât, prezența antibioticului va stimula transferul rezistenței. Antibioticele crează un mediu în care achiziția de determinanți ai rezistenței este avantajoasă, iar rata transferului genelor rezistenței crește. (Kehrenberg și col., 1998)

Integronii

Integronii au fost inițial descoperiți pe plasmidele conjugative.

Integronii sunt elemente cromozomiale naturale ale exprimării genelor. Sunt compuși din două regiuni conservate și o regiune variabilă interpusă, care conține casete ale genelor de rezistență la antibiotice (Hall și Collis, 1995).

Casetele genelor sunt elemente care includ o singură genă și un situs de recombinare. Au fost identificate mai mult de 40 de casete, dintre care majoritatea conțin gene ale rezistenței (Agerso și col., 2005).

De exemplu, modelul rezistenței caracteristice la cromozomul de Salmonella typhimurium DT104 este asociat cu prezența integronilor (Swartz, 2000).

Una dintre regiunile conservate ale integronului conține gena integrazei, care este responsabilă pentru inserția specifică la situsul din casete (Swartz, 2000).

Integronii pot fi localizați în ADN-ul cromozomal, dar mai des sunt localizați în plasmide (Diaz și col., 2006) sau transpozoni și sunt, prin urmare, elemente mobile.

Transferul de gene pe verticală

Frecvența mutațiilor spontane care conferă rezistență la antibiotice este de aproximativ

Acest lucru înseamnă că una din fiecare bacterii are potențialul de a dezvolta rezistență la antibiotice prin procesul de mutație.

În cazul E. coli se estimează că rezistența la streptomicină este dobândită la o rată de aproximativ când este expus la concentrații mari de streptomicină. (Livermore, 2003)

Deși mutația spontană este foarte rară, rata de creștere foarte rapidă și numărul mare contribuie la dezvoltarea într-un timp scurt a mecanismelor de rezistență.

Odata ce genele de rezistență s-au dezvoltat, ele sunt transferate direct la toate bacteriile în timpul replicării ADN-ului. Acest proces este cunoscut sub numele de transfer de gene pe verticală sau evoluție verticală.

Acest proces se desfășoară după principiile darwiniste de selecție naturală: o mutație spontană în cromozomul bacterian conferă rezistență unei singure bacterii dintr-o populație de bacterii.

În mediu selectiv al antibioticului, tipul sălbatic (non mutant) este ucis și mutantul rezistent crește.

Transferul genelor pe orizontală

Transferul lateral sau pe orizontală al genei (HGT) este un proces prin care porțiuni mici din materialul genetic pot fi transferate între bacterii ale aceleiași specii sau chiar între diferite specii.

Efectele combinate ale creșterii rapide la populații mari de celule, procesul epigenetic de mutație și selecție, precum și capacitatea de a transfera gene, pot explica frecvența mare de apariție a rezistenței care apare la unele bacterii.

Așa cum am precizat mai sus, elementele genetice mobile extracromozomiale implicate în trasnferul genelor de rezistență sunt plasmidele, transpozonii și integronii.

Există cel puțin trei mecanisme posibile de transfer pe orizontală (HGT), echivalente cu cele trei procese generice de schimb de material genetic între bacterii.

Acestea sunt transformarea, transducția (mediat de bacteriofag) sau conjugarea (prin pili de conjugare).

Integrarea genei de rezistență este urmată de recombinări între specii înrudite sau între specii îndepărtate taxonomic.

Figura 2. Transfer vertical și orizontal (După Brock biology of microorganisms, 2014). Transferul pe verticală apare atunci când celula se divide. Transferul pe orizontală apare atunci când o celulă schimbă material genetic cu o alta celulă. La procariote, transferul pe orizontală apare prin unul din cele trei mecanisme : conjugare, transformare și transducție.

1. Conjugarea se produce atunci când există contact direct celulă-celulă între două bacterii (care nu trebuie să fie înrudite filogenetic) și se transferă ADN plasmidial. Acest proces este considerat a fi mecanismul principal al transferului genelor pe orizontală și se realizează prin intermediul plasmidelor, transpozonilor și integronilor.

2. Transformarea apare atunci când materialul genetic este preluat direct de un alt microorganism, în urma distrugerii unei bacterii (Kehrenberg, 2000; Furushita, 2003).

3. Transducerea apare atunci cand bacteriofagii transferă ADN între două bacterii strâns înrudite filogenetic.

Genele care codifică pentru proteinele RPP

Analiza filogenetică a fost folosită pentru analiza istoriei evoluției genelor de rezistență la antibiotice, care codifică pentru proteinele ribozomale cu rol de protecție (RPP).

Aceste proteine conferă rezistență la tetraciclină (Connell și colab., 2002, 2003).

Analiza filogenetică a evidențiat evoluția timpurie și independentă la opt grupuri de RPP cu mult înainte de „era antibiotic“ (Aminov și colab., 2001).

Nu există dovezi care să susțină ipoteza transferului de gene de rezistență de la tulpinile bacteriene care produc antibiotic la alte bacterii comensale. (Aminov și colab., 2001)

Recent, această analiză a fost refăcută cu un set de date actualizat. Această analiză a confirmat, încă o dată, originea monofiletică a genelor Tet (gena care codifică pentru proteina RPP).

Analiza secvențelor de ADN de la bacteriile Streptomyces rimosus și Agrobacterium nu arată transferul de gene orizontal. (Aminov și colab., 2007)

Deși încă nu a fost confirmat prin experimentele de clonare a genei și secvențiere, există indicii că unele gene tet din specii de Streptomyces, în special cele care codifică RPP, pot fi detectate la Mycobacterium (Pang și colab.,1994).

Genele de rezistență la antibiotice ale bacteriilor din sol codifică pentru proteine cu rol funcțional (protecție împotriva antibioticelor sintetizate de către producători). Este greu de explicat prezența acestora și modul de funcționare în bacteriile producătoare de antibiotice din alte nișe ecologice, cu sau fără expunere limitată la microbioza din sol.

O posibilă explicație pentru acest fenomen ar putea fi faptul că aceste gene ar fi avut inițial alte funcții metabolice în epoca preantibiotic. (Lafontaine și colab., 1998)

Antibioticele țintesc moleculele implicate în mecanisme importante din celulă, folosite pentru susținerea și protejarea nevoilor celulare de bază, cum ar fi: procesele celulare vitale, păstrarea integrității peretelui celular și biosinteza compușilor vitali pentru celulă. (Alekshun și Levy, 2007)

Rezistența la antibiotice a fost observată la multe tulpini bacteriene de colecție, izolate înainte de folosirea acestor antibiotice în practica clinică, ceea ce întărește ideea că populațiile bacteriene vin în contact cu asemenea compuși în mediul lor natural de viață.

De asemenea, unii metaboliți toxici chiar dacă nu sunt antibiotice puternice, pot spori activitatea altor antibiotice față de care s-a instalat rezistența la numeroase tulpini bacteriene.

Genele Tet și Erm

Pe de altă parte, analiza filogenetică sugerează că răspândirea rapidă a genelor rezistente la antibiotice între specii de bacterii patogene îndepărtate filogenetic este un eveniment evolutiv recent și este cel mai probabil cauzat de tranferul pe orizontală între bacterii din „epoca de antibiotice“.

Figura 1. În figura de mai sus este ilustrat transferul de gene de rezistență între bacterii Gram-pozitive și bacterii Gram-negative. Dovada transferului constă în analiza secvențelor genei de interes. Spre exemplu, gena Tet (M) se găsește atât la bacteriile Gram-pozitive cât și la bacteriile Gram negative. Această genă este transferată de transpozonul Tn916. (După Brock biology of microorganisms, 2014)

Gena Tet (W) este prezentă la specii precum : Megaspaera elsdenii, Bifidobacterium longum, Roseburia hominis, Mitsuokella multacida și Butyrivibrio fibrisolvens, fapt care confirmă ipoteza transferului recent pe orizontală al genei între bacterii din intestinul uman, de la porcine și o bacterie probiotic (Barbosa și colab., 1999; Kazimierczak și colab., 2006).

Marea majoritate a bacteriilor care poartă genele tet sunt orale, intestinale sau genitale. De aceea, riscul transferului pe orizontală este mare (Salyers și colab., 2004).

În cazul genelor erm situația este asemănătoare, în special pentru variantele erm (B), erm (C), și erm (G), demonstrând penetranța înaltă, fiind întâlnite la bacterii Gram negative și pozitive.

Analiza evoluției și răspândirii genelor tet în specii de bacterii care colonizează intestinul a evidențiat faptul că aceste gene au fost răspândite rapid în rândul populației, atât în spitale cât și în comunitate, în ultimii 30 de ani (Shoemaker și colab., 2001).

Această perioadă de timp coincide cu ¨epoca antibioticelor¨.

Rezultatele analizei moleculare a genelor erm (B) izolate de la om, porcine, păsări de curte și Enterococcus faecium sugerează faptul că transferul orizontal al genelor de rezistență la antibiotice este mai des decât transmiterea directă a tulpinilor rezistente (De Leener și colab., 2005).

Din punct de vedere clinic, este de interes analiza penetranței genelor de rezistență la antibiotice la bacteriile patogene.

Analiza moleculară a genelor care codifică pentru tetraciclină din izolatele clinice arhivate sugerează că acest proces ar fi putut apărea cu câțiva ani înainte de începutul utilizării antibioticelor (Atkinson și colab., 1997; Cousin și colab., 2003).

Mecanismele biochimice de rezistență

Principalele mecanisme biochimice sunt : inactivarea enzimatică a antibioticelor, impermeabilitatea membranei celulare față de antibiotice, efluxul de antibiotic, modificări ale moleculelor țintă (subunități ribozomale, modificări ale enzimelor țintă sau modificarea precursorilor peretelui celular)

Inactivarea enzimatică a antibioticelor este un mecanism de rezistență întâlnit la betalactamine, aminoglicozide, cloramfenicol și macrolide.

Plasmidele rezistente și, mai rar, cromozomii, codifică enzimele de inactivare a antibioticelor. Se cunosc mai multe categorii de enzime de inactivare: a antibioticelor betalactamice, a antibioticelor aminoglicozide, a cloramfenicolului.

Betalactamazele

Sunt enzime descoperite la majoritatea speciilor bacteriene, care au capacitatea de a hidroliza inelul betalactam al antibioticelor betalactamice, ceea ce duce la inactivarea completă a antibioticului.

Nivelul de rezistență mediat de betalactamaze este determinat de mai mulți factori, cum ar fi: rata de hidrolizare a antibioticului, afinitatea enzimelor față de antibiotic, cantitatea de betalactamaze produse în celulă, rata de difuzie a antibioticului prin membrana externă.

Rezistența enzimatică este constitutivă sau inductibilă, genele fiind localizate plasmidic sau cromozomial. (Slavcovici, 2009)

Genele de rezistență sunt localizate la nivelul transpozonilor sau plasmidial și sunt transferate prin conjugare.

La bacilii Gram-negativ betalactamazele sunt extrem de variate, acesta fiind mecanismul major al rezistenței lor.

Rezistența prin betalactamaze se asociază frecvent și cu alte mecanisme de rezistență, determinând apariția tulpinilor multirezistente, în special în cazul infecțiilor nosocomiale.

Inactivarea enzimatică a aminoglicozidelor (prin foforilare, acetilare, nucleotidare) are loc în timpul transportului transmembranar.

Producerea de β-lactamaze constituie principalul factor de rezistență al bacteriilor Gram negative la antibioticele β-lactamice. β-lactamazele sunt enzime care clivează ciclul β-lactamic și inactivează antibioticul. (Mihăescu și colab., 2007)

Potrivit lui Ambler (1980), în funcție de secvența de aminoacizi și de tipul de molecule hidrolizate, β-lactamazele se clasifică în patru clase: A, B, C și D.

În clasele A, C și D sunt incluse enzimele cu resturi de serină la situsul activ, iar în clasa B sunt enzimele zinc-dependente. Enzimele grupate în clasa A sunt cele mai frecvente, urmate de cele din clasa C. (Nordmann și colab., 2011)

Enzimele clasei A

Enzimele grupate în clasa A sunt cele mai frecvente, urmate de cele din clasa C.

Enzimele clasei A produse de bacterii Gram pozitive și Gram negative hidrolizează preferențial penicilinele, iar cele ale clasei C cefalosporinele. Multe dintre genele care le codifică se găsesc pe plasmide, astfel încât au suferit numeroase mutații responsabile de apariția unor noi fenotipuri de rezistență la antibiotice. (Kotra și colab., 2002; Walther-Rasmussen și colab. 2007)

În literatura de specialitate s-a evidențiat apariția unor variante de β-lactamaze ale clasei A rezistente la inhibitori, inițial la enzimele de tip TEM, fenotip denumit IRT (Inhibitor Resistant TEM), iar ulterior și la enzimele SHV. (Lin S și colab., 1998)

Enzimele de tip β-lactamaze cu spectru extins (ESBL) sunt variante moleculare sensibile la inhibitorii β-lactamazelor, care și-au extins profilul substraturilor hidrolizate, incluzând alte β-lactamine (spre exemplu oxiimino-cefalosporine, cefamicine și monobactami). (Jacoby și colab., 2005)

Majoritatea β-lactamazelor de tip ESBL aparțin familiilor SHV, TEM și CTX-M. (Naas și colab., 2008)

Enzimele din clasa B

Enzimele din clasa B sunt metalo β-lactamaze (MBL) care conțin ioni de Zn2+ la situsul activ. Acestea pot hidroliza o gamă largă de substraturi, inclusiv carbapenemele, care sunt rezistente la acțiunea majorității celorlalte clase de enzime. ( Queenan și colab., 2007)

Genele de tip blaMBL sunt localizate cromozomal, plasmidial, sau se pot regăsi în integroni, ceea ce permite diseminarea rapidă între diferite specii și chiar genuri bacteriene.

Prima MBL, codificată cromozomal, a fost detectată la bacterii comensale sau oportuniste (Bacillus cereus, Aeromonas sp. și Stenotrophomonas maltophilia). ( Queenan și colab., 2007)

Cele mai comune MBL codificate de elemente genetice mobile sunt cele din familiile VIM și IMP, ale căror gene codificatoare sunt localizate pe integroni.

Carbapenemaza NDM-1 (New Delhi Metallo-β-lactamase) a fost izolată în 2008 de la o tulpină de K. pneumoniae în Suedia, de la un pacient din India. Gena blaNDM-1 nu este situată în structura unui integron, dar adiacent genei blaNDM-1 sunt localizate diferite fragmente de inserție (IS) care contribuie la mobilizarea acesteia. (Yong și colab., 2009)

Secvența ISAba125 sau fragmente ale acesteia (ΔISAba125) au fost identificate totdeauna în aval de gena blaNDM-1 și se consideră că acest fragment de inserție a fost mobilizat împreună cu blaNDM-1 de la o tulpina bacteriană de origine necunoscută. (Poirel și colab., 2011)

Enzimele grupate în clasa C

Enzimele grupate în clasa C sunt cefalosporinaze de tip AmpC (genă de rezistență la ampicilină, localizată cromozomal).

Aceste enzime sunt codificate de gene cromozomale, dar și plasmidial (spre exemplu DHA-1, CMY-2, ACT-1). (Philippon și colab., 2002)

Bacteriile au fenotip de tip AmpC sunt rezistente la peniciline, la asocierea unui antibiotic β-lactamic cu un inhibitor de β-lactamază și la cefalosporine (cefoxitin, cefotetan, ceftriaxonă și cefotaxim).

Producerea enzimelor de tip AmpC poate fi derepresată prin inducție de către anumite β-lactamine, ca de exemplu cefoxitinul. (Vanwynsberghe și colab., 2009)

Enzimele din clasa D

Enzimele din clasa D sunt rezistente la inhibitorii serin-β-lactamazelor din clasa A și pot determina fenotipuri de rezistență la peniciline, cefalosporine, cefalosporine de spectru extins (BLSE de tip OXA) și carbapeneme. Clorura de sodiu poate inhiba anumite oxacilinaze care hidrolizează carbapenemele. (Naas și colab., 1999)

β-lactamazele clasei D care hidrolizează carbapenemele (CHDL – Carbapenem Hydrolysing class D β-Lactamases) se găsesc în special la specii de Acinetobacter (de exemplu OXA-23, OXA-24.), dar și la enterobacterii (OXA-48, rezultată în urma transferului genei OXA-54 de la o tulpină de Shewanella oneidensis). Deoarece hidrolizează carbapenemele cu o rată mai mică decât carbapenemazele din clasele A și B, enzimele de tip OXA-48 sunt dificil de identificat în screening-ul de rutină din spitale. (Poirel și colab., 2012)

Enzimele de modificare a aminoglicozidelor

Aminoglicozidele sunt modificate la nivelul grupărilor amino și hidroxil prin mecanisme de fosforilare, acetilare sau adenilare, in final aceste modificări duc la inactivarea antibioticelor.

Nucleotidiltransferaza, acetiltransferaza, fosfotransferaza sunt codificate de gene plasmidice sau transpozoni.

Enzimele de inactivare a cloramfenicolului

Rezistența este de natură plasmidială și este cauzată de producerea de către bacterie a unei enzime, acetiltransferaza, care provoacă acetilarea antibioticului, determinând inactivarea lui.

Rezistența enzimatică se întâlnește în infecțiile cauzate de stafilococi, streptococi și enterobacteriacee.

Mecanisme celulare de dobândire a rezistenței la antibiotice

Reducerea permeabilității membranei externe

Lipopolizaharidele membranei externe, la tulpinile Gram-negativ, opresc pasajul antibioticelor hidrofobe.

Pasajul antibioticelor hidrofile este facilitat de existența porilor membranari.

Permeabilitatea membranei externe față de antibiotice este în strânsă legatură cu numărul porinelor, mărimea și proprietățile fizico-chimice ale antibioticelor.

Reducerea permeabilității membranei prin mutații care afectează porinele determină rezistența la betalactamine și aminoglicozide.

Acest mecanism de rezistență se întâlnește la Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp. și Bacteroides sp.

Reducerea permeabilității membranei citoplasmatice

Pasajul antibioticelor prin membrana citoplasmatică are loc prin transport activ (cu consum de energie), bazat pe diferența de potențial electric de la nivelul membranei celulare.

Acest tip de rezistență apare frecvent la aminoglicozide și este cauzat de mutațiile cromozomiale care afectează permeabilitatea membranei.

Acest mecanism de dobândire a rezistenței la antibiotice a fost identificat la stafilococi, E.Coli, și Salmonella sp.

Rezistența prin eflux de antibiotic

Efluxul de antibiotic se realizează la nivel membranar prin sisteme de transport cu consum de energie și este o cauză importantă a rezistenței sau multirezistenței la Enterobacteriaceae (apare la E. coli, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae, streptococi și stafilococi). (Issam Raad, Hend Hanna și colab., 2007)

Rezistența prin eflux de antibiotic determină rezistența tulpinilor de Str. pyogenes, Str. pneumoniae, S. aureus (prin gena mef și msr) la macrolidele clasice, azalide și streptogramine B.

Mecanismele de eflux în asociere cu prezența betalactamazelor, contribuie la rezistența tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa la toate betalactaminele.

Alte ipoteze referitoare la dobândirea rezistenței la antibiotice

Insulele de patogenitate și evoluția virulenței

Insulele de patogenitate se găsesc atât la bacterii Gram pozitive cât și Gram negative. Acestea sunt
regiuni ADN de până la 200 kb care conțin mai multe gene de rezistență.

Compararea genomurilor bacteriilor patogene cu cele ale rudele lor inofensive dezvăluie adesea insule cromozomiale care codifică pentru factori de virulență. (Van der Poll și Opal, 2008).

Secvența lor diferă mult de a altor gene cromozomale, ceea ce denotă ca sunt achiziții relativ recente în evoluție.

Ar putea să apară prin integrarea unui element genetic exogen – fagul. Insulele de patogenitate sunt prezente în anumite tulpini ale bacteriei Gram pozitive Staphylococcus aureus. (Van der Poll și Opal, 2008)

Rolul jucat de aceste insule în transferul lateral al genelor este încă neelucidat, dar este posibil să fie cauzat de procentul ridicat de guanină și citozină.

Endosporii bacterieni

Endosporul este considerat în prezent o forma primitiva de citodiferentiere la procariote. (V.Lazăr, 2015)

Starea de latență metabolică sau criptobioză determină rezistența sporilor la temperaturi de peste 100 (pâna la 180 șC), uscăciune și radiații UV, la substanțe antimicrobiene (antiseptice, antibiotice). De aceea au rol important în diseminarea bacteriilor în natură.

Importanța medicală a endosporilor este determinată de faptul că unele bacterii patogene sunt sporogene (Clostridium botulinum, C. tetani sau C. perfringens). (V.Lazăr, 2015)

Printre speciile care colonizează omul, numai Clostridium sp. și Bacillus sp. produc endospori. Aceste bacterii anaerobe se multiplică în intestin, sunt apoi eliminate și ajung în apele uzate și sol, unde supraviețuiesc sub formă de spori.

Printre factorii care contribuie la rezistența la căldură se numără peretele gros și nivelul ridicat de deshidratare. Atunci când un spor găsește condiții prielnice de dezvoltare (nutrienți, temperatură, presiune osmotică, etc.) se întoarce la starea vegetativă și se pot reproduce.

Biofilmul

Biofilmul reprezintă o comunitate de microorganisme înglobate într-o matrice proprie secretată de bacterii (matrice polizaharidică) sau la nivelul suprafețelor biotice sau abiotice. (Issam Raad, Hend Hanna și colab., 2007)

Aderența este un factor determinant al colonizării unor situsuri specifice la plante și animale, o etapa timpurie importantă în procesul infecțios, fiind o condiție sine qua non a colonizării organismelor parazitate.

Recent s-a descoperit că aderența determină modificarea expresiei genice (activare/represie), așa încât celulele biofilmului sunt diferite din punct de vedere fenotipic, de celulele libere din suspensie.

Biofilmul influențează nivelul de expresie fenotipică a tulpinilor rezistente.

Una din consecințele formării biofilmelor cu implicații medicale, este aceea că microorganismele componente sunt mult mai rezistente la antibiotice și la mecanismele imunitare ale gazdei. (V. Lazăr, 2010)

Bacteriile aderă în general la epiteliile mucoaselor, a celule epiteliale cheratinizate, endoteliilor, oase, dinți, dar și la suprafețele diverselor dispozitive implantate (catetere, proteze).

Formarea biofilmului are loc în mai multe etape:

a. aderarea microorganismelor la nivelul suprafeței

b. formarea matricei polizaharidice

c. creșterea și dezvoltarea biofilmului

Semnalizarea intercelulara este implicată în reglarea exprimării genelor și dezvoltarea de biofilme, astfel că cercetările actuale au ca scop depistarea si testarea unor produși (de origine microbiană, vegetală sau animală) care interferă cu semnalizarea intercelulară dintre microorganismele biofilmelor. Acești compuși poartă numele de inhibitori de QS (QSI). (Lazăr, 2011)

Bacteriile care formează frecvent biofilm sunt: stafilococii, streptococii, enterococii, Ps.aeruginosa, Klebsiella sp. și E.coli.

Din cauza stresului metabolic indus de radicalii de oxigen, a unui potențial redox scăzut și a insuficienței substanțelor nutritive, apar tulpini patogene cu diverse fenotipuri de rezistență (rezistența prin eflux, prin modificări ale moleculelor „țintă“ ).

Mai mult, biofilmul prezintă o structură care împiedică adsorbția antibioticelor și a componentelor răspunsului imun în profunzimea biofilmului.

Un procent considerabil dintre infecțiile umane implică formarea de biofilme, de aceea terapia trebuie sa se bazeze pe doze de antibiotice necesare omorârii bacteriilor din biofilme si nu pe cele care pot ucide celulele libere. (V. Lazăr, 2011)

Prevenția dobândirii rezistenței la antibiotice

Se realizează în mai multe feluri :

a. Prin vaccinare

b. Diagnostic bacteriologic rapid, asociat cu un tratament antibiotic corect. Diagnosticul rapid se poate realiza prin introducerea testelor de diagnostic microbiologic cu acuratețe mare (PCR) și utilizarea markerilor genetici.

c. Utilizarea rațională a antibioticelor

d. Utilizarea restrictivă a unor antibiotice care se adresează țintit bacteriilor rezistente pentru a limita presiunea de selecție exercitată de antibiotic

e. Dozele și durata corectă a terapiei cu antibiotice

f. Implicare comunității medicale și a organizațiilor guvernamentale în supravegherea, prevenirea și controlul rezistenței.

g. Colaborarea cu sectorul veterinar și industrial, în scopul reduceri iutilizării nejustificate de antibiotice.

h. Educarea populației și promovarea mijloacelor simple, dar eficiente de igienă individuală.

Istoricul bolilor infecțioase

Bolile infecțioase au fost descrise de mii de ani, dar etiologia lor a fost elucidată abia acum un secol.

Medicul grec Hipocrate credea că infecțiile sunt cauzate de „modificări“ în aer. Teoria miasmatică privind bolile infecțioase a rămas populară în lumea medicală până la începutul secolului XIX, în ciuda faptului că A. Van Leeuwenhoek, folosind un microscop a descris bacterii încă din secolul al XVII-lea.

Louis Pasteur a pus bazele microbiologiei moderne odată cu infirmarea teoria generației spontane și acceptarea teoriei celulare (sau teoria germenilor). Deși această teorie mai fusese propusă anterior, Pasteur are meritul de a fi dovedit printr-o serie de teste că infecțiile nu apar spontan, ci sunt produse de microorganisme.

Pasteur a arătat că fermentația poate fi prevenită dacă aerul care ajunge la mediul de cultură este trecut printr-un filtru sau printr-un tub lung ținut în flacără. Prin aceste experimente, Pasteur nu numai că a infirmat definitiv teoria generației spontane, dar a și pus bazele tehnicilor moderne de sterilizare.

În 1884, medicul german Robert Koch a publicat Postulatele lui Koch. Scopul acestor postulate era de a stabili o relație cauzală între un microb și boala pe care o cauzează.

În anul 1929 Alexander Fleming a descoperit penicilina. Acesta a observat o zonă de inhibare a creșterii bacteriene în jurul unei colonii de Penicillium notatum.

Datorită acestei descoperiri, în următoarea perioadă numeroase alte antibiotice au fost descoperite, numarul estimat la ora actuală fiind între 5 000 si 10 000 de antibiotice.

Diagnostic

Bacteriile sunt componenta predominantă a florei, proliferează pe mucoase, îndeosebi, în
tractul gastrointestinal, unde se găsesc peste 400 de specii diferite. Peste 99% dintre bacteriile din flora normală sunt anaerobe, îndeosebi Gram negative.

O infecție are două tipuri de surse: o sursă primară și secundară. Prin sursă primară de infecție înțelegem locul în care agentul patogen este prezent și se reproduce.
Sursele secundare de infecție sunt obiecte, materiale sau persoane care contribuie la transmiterea agenților patogeni de la sursa primară la alte persoane.

Identificarea agenților patogeni se bazează pe caracteristicile morfologice, fiziologice și chimice ale acestora. (Tabel 1)

Infecțiile pot fi diagnosticate, fie direct, prin detectarea agentului patogen sau indirect, prin detectarea anticorpilor produși. Printre metodele directe clasice se numără examinarea microscopică, cultura. Pentru detecția directă se pot folosi și anticorpi monoclonali sau policlonali.

În diagnosticul de laborator este o necesitate ca prelevarea de probe și transportul acestora să se efectueze în condiții optime, pentru a nu fi contaminate.

Transportul trebuie să fie efectuat în containere speciale, pe medii care conțin substanțe nutritive pentru bacterii, pentru a favoriza o creștere selectivă a bacteriilor de interes, sau pe medii simple.

Tabel 1. Principiul esențial al identificării bacteriene constă în încadrarea taxonomică a bacteriilor din cultură pe baza analizei morfologice (spre exemplu colorare), fiziologice (determinate cu medii indicatoare) sau a caracteristicile chimice. Metodele moleculare genetice de diagnostic vor juca un rol important în viitor.

Tehnici moleculare de diagnostic

Obiectivul principal al tehnicilor moleculare de identificare bacteriană îl reprezintă detecția directă a secvențelor de nucleotide în materialul testat.

Aceste metode sunt folosite, în special, pentru detecția bacteriilor care sunt foarte dificil de cultivat sau au o rată mică de proliferare.

În principiu, se poate utiliza orice secvență de ADN a unei specii pentru genotipare, dar de cele mai multe ori se analizează regiunile specifice ale genelor care codifică pentru ARNr 16S și ARNr 23S.

O anumită regiune a ARNr 16S se întâlnește în toate bacteriile. Între aceste secvențe extrem de bine conservate sunt și altele, care sunt specifice pentru o specie sau gen.

Folosind primeri care pot recunoaște regiunile conservate ale ADNr 16S, secvența de interes poate fi amplificată, iar mai apoi secvențiată. Secvența astfel obținută este apoi identificată prin compararea cu secvențele înregistrate în baze de date.

Detecția directă a antigenelor specifice pentru anumite specii sau genuri se poate realiza cu ajutorul anticorpilor mono sau policlonali prezenți în probă, ceea ce permite un diagnostic rapid (spre exemplu, în meningita acută se pot evidenția antigene bacteriene în lichidul cerebrospinal).

Cu toate acestea, această tehnică nu este la fel de sensibilă ca metodele clasice.

Abordări terapeutice

Microorganismele patogene posedă o serie de caracteristici care le permit să inducă boli infecțioase.

Aparitia patogenilor rezistenți la antibiotice (spre exemplu enterococii care sunt rezistenți la toate antibioticele cunoscute) întărește ideea că am intrat în era ¨postantibiotice¨.

De obicei, bolile infecțioase apar ca urmare a două capacități majore a microorgansimelor, determinate de genele exprimate în plasmida R:

(1) capacitatea agentului patogen să se atașeze și să colonizeze un țesut specific al gazdei

(2) producția de toxine, enzime și alte molecule care scad imunitatea gazdei. Multe bacterii produc, de asemenea, proteine care inhibă sau distrug specii înrudite sau chiar diferite tulpini ale aceleiași specii. Acești agenți, numite bacteriocine, sunt analoage cu antibioticele, dar au un spectru mai restrâns de
activitate decât antibioticele. Genele care codifică pentru bacteriocine și proteinele necesare pentru prelucrarea și transportul acestora sunt, de obicei, găsite în plasmide.

Alte plasmide conferă proprietăți metabolice speciale celulelor bacteriene, cum ar fi capacitatea de a degrada poluanți toxici.

Substanțele chimice sunt folosite în mod curent pentru a controla creșterea microbiană. Un agent antimicrobian este un produs chimic natural sau sintetic, care ucide sau inhibă creșterea microorganismelor.

Compușii care au capacitatea să ucidă microorganismele sunt numiți agenți bactericizi, fungicizi sau viricizi, în funcție de tipul de microorganism. Există și agenți are nu ucid, ci doar inhibă creșterea microorgansimelor. Aceștia poartă numele de compuși bacteriostatici, fungistatici și viristatici.

Activitatea antimicrobiană a unui antibiotic se realizează prin măsurarea a 3 parametri, care variază în funcție de concentrația antibioticului și de timpul său de acțiune:

a. CMA – concentrația minimă activă. Este concentrația la care antibioticul poate induce anumite perturbări în activitatea metabolică a microorganismelor, fară a afecta capacitatea de multiplicare și viabilitatea lor

b. CMI – concentrația minimă inhibitorie a unui antibiotic este cea mai mică concentrație care inhibă complet multiplicarea unei tulpini patogene

c. CMB – concentrația minimă bactericidă a unui antibiotic este concentrația minimă care omoară tulpina

Din punct de vedere microbiologic, organismele rezistente sunt acelea care posedă orice tip de mecanism al rezistenței sau gene ale rezistenței. Concentrația minimă inhibitorie (CMI) a unui antibiotic dă informații cantitative despre susceptibilitatea bacteriană.

De obicei, un organism este considerat susceptibil atunci când CMI este mai mic decât limita indicată de diversele laboratoare abilitate pentru astfel de standarde (Sockett. și col., 2006).

Înainte de a administra un antibiotic trebuie să cunoaștem CMI determinată in vitro, dar și calitățile farmacocinetice (de exemplu, posibilitatea realizării concentrației active la nivelul locului de infecție).

Tehnica de evidențiere a sensibilității la antibiotice a unei tulpini microbiene se numeste antibiogramă.

Dupa determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (tulpina microbiană de testat este pusă în contact cu diferite antibiotice într-o anumită concentrație), se pot folosi teste cantitative pentru determinarea valorii CMI (tulpina microbiană este pusă în contact cu concentrații crescătoare ale aceluiași antibiotic).

Clasificarea antibioticelor

Figură. Adaptată după În figura de mai sus se poate observa mecanismul de acțiune al antibioticelor, în funcție de situsul la nivelul căruia acționează. 1. Sulfonamidele sunt antibiotice care inhibă sinteza enzimei PABA (acidului para-aminobenzoic) , esențial pentru sinteza acidului folic și a derivatului acestuia THFA (acid tetrahidrofolat); 2. Beta-lactamazele sunt principala clasă de antibiotice care inhibă sinteza peptidoglicanului din componența peretelui celular; 3. Aminoglicozidele se fixează la nivelul peretelui celular bacterian, traversează celula și se fixează ireversibil de ribozomi astfel încât inhibă sinteza proteinelor. 4. Quinolonele inhibarea sintezei ADN-ului prin blocarea replicării ADN. 5. Inhibitorii funcției membranei plasmatice se leagă de fosfolipidele membranei bacteriene, alterând funcționarea pompelor de K+ si Na+ și duc la liza celulei.

În funcție de ținta de acțiune, antibioticele sunt:

1. Antibiotice care acționează asupra peretelui bacterian

Principalele clase de antibiotice cu țintă de acțiune asupra peretelui celular al bacteriilor Gram negative sunt antibioticele β–lactamice.

Familia acestor antibiotice se împarte în patru clase: penicilne, cefalosporine, carbapeneme, monobactami. Așa cum se poate observa în figura de mai sus, antibioticele β – lactamice inhibă sinteza peretelui celular, respectiv a peptidoglicanului (mureinei).

Rezistența la antibioticele β–lactamice este cauzată de: mutațiile PBP (penicilin binding protein, enzima tinta a antibioticelor), impermeabilitatea membranei externe și de efluxul pompelor ionice.

Penicilinele sunt antibiotice inhibitoare ale sintezei peretelui bacterian. Acestea sunt derivate din acidul 6-aminopenicilanic și, în funcție de modul de obținere sunt peniciline de biosinteză (penicilina G, penicilina V, penicilina N), peniciline de semisinteză (oxacilină, ampicilină) și peniciline de sinteză chimică (peneme, monobacteme). Penicilinele sunt produse de anumite bacterii Gram pozitive, dar și de unii fungi. (Angelescu, 1998)

Penicilinele de semisinteză sunt clasificate la rândul lor în peniciline cu spectru îngust (peniciline antistafilococice) și peniciline cu spectru larg (aminopeniciline, carboxipeniciline, ureidopeniciline, amidinopeniciline). (Oniga, 2003)

Spectrul de activitate al penicilinelor naturale asupra bacteriilor Gram-negative este mic, acționând asupra speciilor Neisseria meningitidis și N. gonorrhoeae.

De aceea au fost realizate peniciline de semisinteză care cuprind un spectru mult mai mare de activitate, inclusiv în cazul rezistenței la sucul gastric (spre exemplu cefalosporinele).

Cefalosporinele sunt un grup de antibiotice cu spectru larg de acțiune, fiind antibiotice β–lactamice semisintetice. Au fost descoperite într-o cultură cu Cephalosporium acremonium. Acestea sunt derivate alea acidului 7-aminocefalosporanic și diferă de peniciline prin prezența unui ciclu hexagonal de dihidrotiazină. Mecanismul de acțiune este asemănător cu cel al penicilinelor dar sunt mai puțin sensibile la acțiunea β–lactamazelor.

Cefalosporinele reprezintă cel mai folosit grup de antibiotice și, în funcție de spectrul antimicrobian, sunt împărțite în patru generații:

Generația I – Cefalotină, Cefazolină, Cefalexin, Cefadroxil, Cefradin

Generația II – Cefamandolă, Cefuroxim, Cefoxitim, Cefotiam, Cefaclor

Generația III – Cefotaxim, Ceftriaxon, Ceftazidim, Latamoxef, Cefixim

Generația IV – Cefepime, Cefpirome

2. Antibiotice care acționează asupra membranei plasmatice

Antibioticele din aceasta clasă sunt produse de diferite specii de Bacillus, având același spectru antibacterian și sunt împărțite în polimixină, bacitracină și gramicidină.

Polimixinele acționează asupra bacteriilor Gram negative: Aerobacter sp., Bordetella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp.. Fac parte dintr-o familie de peptide cationice nonribozomice eficiente împotriva bacteriilor Gram negative. Acestea acționează la nivelul membranei lipidice, ducând la liza celulei. Ca și mod de acțiune, polimixinele se leagă de fosfolipidele membranei bacteriene, alterând funcționarea pompelor de K+ si Na+.

3. Antibiotice cu țintă de acțiune asupra replicării ADN

Printre antibioticele care intervin în inhibarea sintezei ADN-ului se afla quionolonele. Acestea blochează replicarea ADN prin inhibarea ADN topoizomerazei (alterarea topoizomerazei are efect negativ asupra exprimării cantitative și calitative a genelor).

Cea mai importantă enzimă în ciclul de viață al unei bacterii este subunitatea A a ADN-topoizomerazei care este dealtfel și ținta de acțiune a quinolonelor. (De Jong și Mörner, 1999).

Pentru a acționa, quinolonele traversează peretele bacterian prin transport pasiv, prin intermediul porinelor sau lipoplizaharidului.

Exista trei grupe de quinolone (Oniga, 2003):

Quinolone din prima generație: acid nalidixic, acid oxolinic, acid pipemidic, cinoxacină, flumechină, rosoxavină;

Quinolone din a doua generație: ciprofloxacină, enoxacină, fleroxacină, lomefloxacină, norfloxacină, nadifloxacină, pefloxacină, ofloxacină;

Flurochinolone antipneumococice: levofloxacină, sparfloxacină, gatifloxacină, moxifloxacină, balofloxacină, grepafloxacină;

4. Antibiotice care blochează transcrierea

Rifamicinele se mai numesc și false macrolide (ansamicine) deoarece prezintă o structură fals lactonică. Sunt obținute prin semisinteaza de la un antibiotic natural, rifamicina B, având o acțiune bactericidă asupra cocilor și bacililor Gram negativi și pozitivi.

Rifamicinele inhibă transcripția ADN-ului bacterian prin legarea de ARN-polimerază.

Dupa modul de obținere, sunt grupate în:

Rifamicine de biosinteză: A, B, C, D, E (descoperite in culturi de Streptomyces mediterranei)

Rifamicine de semisinteză: S, SV, Rifampicină, Rifabutină (Oniga, 2003).

Rifamicina are ca țintă de acțiune faza de multiplicare activă a bacililor și se administrează în cazuri de tuberculoză, lepră, infecții biliare și urinare.

Nitrofuranii reprezintă antibiotice de sinteză folosite pentru tratamentul unor infecții urinare sau digestive. Aceștia au un spectru de acțiune larg: bacterii Gram negative (enterobacterii), dar și coci Gram pozitivi (stafilococi sau streptococi). Nitrofuranii acționează la nivelul ADN-ului, dar pot avea și efect mutagen. Rezistența bacteriilor la nitrofurani se face în funcție de specie (Matinca, 2002).

5. Antibiotice care blochează sinteza proteică

Aminoglicozidele au o structură heterozidică, fiind zaharuri complexe. Moleculele lor pot fi policationice sau polare.

Streptomicina reprezintă primul antibiotic aminoglicozidic descoperit. Este produs de Streptomyces griseus și are trei subunități (streptidină, streptoză și N-metil-glucozamină) unite prin legături glicozidice (Mihăescu și colab., 2007).

Au un spectru larg de activitate: bacili Gram negativi, bacterii aerobe Gram pozitive și Mycobacterii.

În funcție de natura agliconului, antibioticele aminoglicozidice sunt clasificate astfel:

Aminoglicozide cu aglicon streptidinic: streptomicină si dihidrostreptomicină

Aminoglicozide cu aglicon 2- dezoxistreptaminic:

a. Diozide in 4,5: neomicine si paromicine;

b. Diozide in 4,6: kanamicine, gentamicine (Oniga, 2003).

Aminoglicozidele se fixează la nivelul peretelui celular bacterian, traversează celula și se fixează ireversibil de ribozomi astfel încât inhibă sinteza proteinelor. Rezistența la acțiunea acestor antibiotice poate fi naturală (prin sinteză de enzime) sau poate fi dobândită (prin inactivare enzimatică, prin degradarea țintei ribozomale sau a sistemului de transport).

PARTEA EXPERIMENTALĂ

Introducere

Studiile recente pun în evidență multitudinea de căi prin care genele de rezistență se pot răspândi în ecosisteme acvatice (prin consumul alimentelor purtătoare de gene de rezistență insuficient preparate sau prin consumul de apă potabilă provintă din ape de suprafață poluate).

Apariția genelor de rezistență la antibiotice în mediul acvatic devine o preocupare crescândă la nivel mondial. Sute de gene care conferă rezistență la antibiotice au fost evidențiate la bacteriile izolate din apele de suprafață și în stațiile de epurare a apelor reziduale provenite din spitale.

Dunărea este al II-lea mare fluviu al Europei dupa Volga, atât ca lungime (2857 km), cât și ca debit (aprox 5600 m/sec la intrare în țară și 6470m/sec la Pătlăgeanca). Pe teritoriul țării noastre, se varsă în Marea Neagră. În acest fluviu se varsă aproape toate râurile de pe teritoriul țării noastre (cu excepția unor mici râuri dobrogene), făcând ca rețeaua hidrografică să fie unitară.

Impactul unor posibile contaminări cu bacterii purtătoare a unor gene de rezistență la antibiotice este cu atât mai mare cu cât unele localități de-a lungul Dunării își asigură apa potabilă din fluviu. De asemenea, numeroase specii de pești sunt pescuite pentru consum (spre exemplu crapul sălbatic, scrumbii, caras). În acest context, peștii ar fi potențiali purtători al genelor de rezistență la antibiotice, iar acestea ar putea ajunge direct la consumatori prin lanțul alimentar.

Situl ROSCI0005 Balta Albă-Amara-Lacul Sărat Câineni-Jirlău se întinde pe o suprafață de aproximativ 6500 ha și este poluat în special de acțiunile și activitățile riveranilor precum: deversarea în lacuri a reziduurilor menajere, modificări naturale și artificiale ale compoziției apei, schimbarea metodelor de cultivare a terenurilor din cele tradiționale în agricultură intensivă și folosirea excesivă a îngrășămintelor. Lacurile din acest situ sunt populate cu pești din specii diferite (crap, caras, lin, biban, salau și somn), care sunt pescuiți și consumați, putând fi purtători ai unor gene de rezistență la antibiotice.

Rezistența la antibiotice a principalelor Enterobacteriaceae implicate în infecții comunitare și nosocomiale (Escherichia coli și Klebsiella pneumoniae) și a Pseudomonadaceelor reprezintă pentru țara noastră o altă problemă importantă. Ca incidență, infecțiile cu Klebsiella pneumoniae reprezintă a doua etiologie Gram-negativă a infecțiilor sistemice (cele mai frecvente sunt cele pulmonare și urinare).

Klebsiella pneumoniae colonizează frecvent intestinul uman, dar la pacienții spitalizați poate fi izolat și de pe tegumente, orofaringe sau din arborele respirator superior (unde ajunge adesea de pe mâinile personalului medical). Klebsiella pneumoniae determină infecții la pacienți imunodeprimați (diabetici, alcoolici) sau la purtători de proteze. Această bacterie reprezintă o problemă majoră legată de transmiterea rezistenței bacteriane la antibiotice, deoarece produce noi carbapenemaze, ulterior transmițându-le și altor Enterobateriaceae genele care le codifică.

Scopul lucrării

Având în vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenței la antibiotice, lucrarea își propune să evidențieze markerii genetici de rezistență la antibiotice a unor tulpini de bacili, izolați din câteva surse naturale de apă din Sud-Estul României și compararea acestora cu un lot de 10 tulpini nosocomiale, în scopul realizării pattern-urilor genetice comparative și a genelor care le conferă rezistență la antibiotice.

Obiectivele studiului

1. Determinarea prezenței unor bacterii Gram negative purtătoare de gene de rezistență la antibiotice la culturile izolate din mediul acvatic și spitalicesc.

2. Ilustrarea profilului genetic al tulpinilor izolate a unor tulpini de bacterii izolate într-un spital și în câteva ape din Sudul României.

3. Optimizarea unor metode de detecție a tulpinilor patogene.

4. Evidențierea prin comparație a profilului genetic la bacteriile pe care le-am izolat din mediul înconjurător și intraspitalicesc.

5. Investigarea mecanismelor de răspândire a genelor de rezistență (mutație spontană versus transfer orizontal).

6. Compararea rezultatelor obținute cu cele existente în literatura de specialitate

Materiale și metode:

În prezenta lucrare au fost analizate un număr de 54 de tulpini de bacterii Gram negative din familia Enterobacteriaceae – Escherichia coli, Enterobacter cloacae; fam. Psedomonadaceae – Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas mosselii, Pseudomonas putida, Aeromonas salmonicida, Aeromonas eucrenophila, tulpini izolate din lacuri sărate din județul Buzău și din fluviul Dunăre (județul Giurgiu), în perioada septembrie 2016-mai 2017. Tulpinile izolate au fost comparate cu un lot de 10 tulpini nosocomiale.

Din Dunăre (județul Giurgiu) am colectat 6 probe de la o adâncime de aproximativ 50 cm, în amonte și aval, din locuri diferite. Probele au fost depozitate la o temperatură de aprox. 5°C și au fost transportate în laborator pentru a fi analizate.

Probele din cele 4 lacuri sărate din județul Buzău au fost prelevate din lacurile salamastre din bazinul hidrografic al râului Buzău (Amara,Jirlău,Balta Albă), precul și lacul sărat Câineni.

Tulpinile bacteriene s-au cultivat în medii de cultură de cultura specifice ( EMB, McConkey, Cetrimid), și au fost incubate la temperatura 37 oC timp de 48h, până la atingerea fazei staționare de creștere.

În scopul izolării de tulpini pure, din probele mixte au fost realizate pasaje sucesive prin tehnica epuizării ansei din fiecare probă, după care am făcut însămânțarea (prin tehnica epuzării ansei) pe mediile solide proaspete selective (EMB, McConkey,) și neselective (Geloza îmbogățita cu 5% sânge de berbec).

Coloniile izolate obținute au fost identificate cu ajutorul sistemul automat Bruker DaltoniK MALDI Biotyper. Sistemul Bruker DaltoniK MALDI Biotyper asigură identificarea rapidă, de înaltă încredere și clasificarea taxonomică a bacteriilor, drojdiilor și fungiilor. Clasificarea și identificarea se bazează pe amprentele proteomice, utilizând spectrometria de masă MALDI-TOF de mare viteză. MALDI Biotyper permite, de asemenea, teste de rezistență antimicrobiană. Tulpinile pe care nu le-am putut identifica la acest nivel au fost eliminate din studiu.

Figură. Imagine adaptată după site-ul: http://www.romtech.ro/en/cbrn/cbrn-detection/biological-detection.html

Tabel

Rezultatele obținute au fost analizate comparativ cu un lot de 10 tulpini nosocomiale aparținând fam. Enterobacteriaceae izolate de la pacienți internați în secțiile de terapie intensivă a Institutului de Boli Cardiovasculare prof. C.C.Iliescu din București în anul 2017

Tabel. Lotul de tulpini nosocomiale aparținând Fam. Enterobacteriaceae izolate din secția de terapie intensivă a Institutului de Boli Cardiovasculare prof. C.C.Iliescu din București în anul 2017

Obținerea ADN-ului bacterian s-a realizat folosind protocolul de extracție alcalină a ADN (protocol derivat din tehnica Johnson):

Medii și soluții:

20 µl NaOH 0.05M

SDS 0.25%

1-5 colonii tulpină bacteriană pură

Mod de obținere:

Din fiecare tulpină am obținut o suspensie celulară care a fost denaturată 15 min, la 95oC

Am adaugat 180 µl TE

Am centrifugat probele timp de 3 min, la 13.000 rpm

Am recuperat supernatantul și l-am utilizat în reacția de amplificare

Evidențierea genelor de virulență a fost făcută prin intermediul reacției PCR Multiplex (Polymerase Chain Reaction= Reacția de polimerizare în lanț)

Reacția PCR (Polymerase Chain Reaction= Reacția de polimerizare în lanț) este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN.

Pentru realizarea probelor în PCR am folosit PCR Thermal Corbett.

Am făcut o reacție de PCR multiplex folosind primerii din tabelul de mai jos.

Tabel . Secvența nucleotidică, condițiile de amplificare și dimensiunea anticipată a ampliconilor obținuți pentru genele de virulență investigate la tulpinile testate.

Electroforeza ADN

Pentru pregatirea gelului de electroforeză am folosit următoarele componente:

Agaroză (1g);

Tampon TAE 0,5X;

Bromură de etilium care are rolul de a colora benzile ADN pentru a fi vizibile în domeniul UV.

În prima etapă am dizolvat agaroza în TAE 0,5X pe baie de apă. După ce agaroza s-a dizolvat, am lasat-o câteva minute să se răcească, apoi am turnat gelul încălzit la aproximativ 60șC în cuva electroforezei peste care am adaugat pieptenele și l-am lăsat să se solidifice. Ulterior am scos pieptenele, iar peste gel am turnat tampon de migrare TBE 0,5X.

În godeuri am adăugat probele care conțineau loading buffer (tampon de încărcare) și 5µl proba de ADN. În godeurile martor am încarcat doar tamponul și markerul de greutate moleculară.

Am setat timpul de migrare la 50 de minute și tensiunea curentului electric de 100V, probele de ADN migrând în funcție de greutatea moleculară.

După migrare, am scos gelul din cuva electroforezei și l-am pus în transiluminator pentru a-l vizualiza în UV.

Analiza biocomputațională

Gradul de înrudire genetică dintre organisme aparținând aceleiași specii poate fi stabilit pe baza polimorfismelor genetice. Aceste polimorfisme explică evoluția divergentă a organismelor.

În această lucrare au fost analizate un lot 44 de bacterii Gram negative, care provin din medii diferite, și sunt purtătoare ale unor gene de rezistență la antibiotice.

Pe baza polimorfismelor genetice evidențiate prin analiza PCR am putut determina evoluția divergentă și gradul de înrudire genetică a tulpinilor analizate. Această analiză este importantă deoarece putem determina modul de răspândire la bacteriile comensale, în cadrul aceleași specii sau între specii (prin transfer vertical sau pe orizontală), a genelor de rezistență la antibiotice.

Imaginile obținute au fost prelucrate cu ajutorul programului open-source PyElph.

Rezultate și discuții

Tabel 1. Distribuția genelor de rezistență la antibiotice la tulpinile de bacterii Gram negative izolate din Dunăre și situl ROSCI0005

Figura. În figura de mai sus este ilustrată distribuția genelor de rezistență la antibiotice la bacteriile izolate din mediul acvatic.

În studiul nostru comparativ au fost incluse de asemenea 10 tulpini nosocomiale aparținând speciei K. pneumoniae.

Tabel. Distribuția genelor de rezistență la antibiotice la tulpinile nosocomiale de K. pneumoniae

Figura. În figura de mai sus este ilustrată distribuția genelor care conferă rezistență la antibiotice la tulpinile nosocomiale de K.pneumoniae

Rezultatele obținute în urma amplificării prin PCR a genelor care determină rezistența la antibioticepentru tulpinilor izolate din Dunăre sunt ilustrate în figurile de mai jos:

Fig…… Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele teA si tetB. Godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2-22- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive- pentru tetA: 3.4. si 1.4.

Fig…… Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele blaVIM si blaIMP. Godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2-22- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive- pentru blaVIM-2: 1.2; 4.1 si 4.3 iar pentr blaIMP: 2.3; 2.4 si 3.3

Fig…… Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genA Int1. Godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2-22- ampliconii tulpinilor analizate. Toate tulpinile analizate au fost pozitive pentruintegraza.

Fig…… Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele QnrA, QnrB si QnrS. Godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2-22- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive- pentru gena QnrS: 1.4

Rezultatele obținute în urma amplificării prin PCR a genelor care determină rezistența la antibiotice pentru tulpinilor izolate din lacurile sărate sunt ilustrate în figurile de mai jos:

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru gena blaOXA-48like si pentru gena blaNDM: godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range DNA); godeu nr2-27- ampliconii tulpinilor 4.7-3.8. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru blaNDMlike: 3.9; 2.11 (E.coli).

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru gena blaCTX-Mlike si pentru gena blaTEMkike: godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 27 ampliconii tulpinilor 1.5-1.1. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru blaCTX-Mike : 1.4; 4.5 3.2; 4.2; 1.8; 1.6; 2.10; 2.6; 2.8; 4.6; 4.11; 3.6.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru gena blaCTX-Mlike si pentru gena blaTEMkike: godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 19 ampliconii tulpinilor 4.8-3.11. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru blaCTX-Mike : 2.1; 2.5; 2.9; 3.1; 1.2; 3.4; 2.4; 3.5.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele QnrA, QnrB si QnrS: godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 27 ampliconii tulpinilor 4.2-3.4. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru QnrS :2.8 (Enterobacter cloacae).

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele SulI si SulII: godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 27 ampliconii tulpinilor 2.7 1.9. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru gena SulI: 2.7; 2.4; 4.7; 4.3; 4.10; 2.5; 3.5; 1.4; 4.5; 2.12; 3.11; 3.7; 3.4; 4.11; 1.3; 2.8; 1.6; 3.10; 4.2; 4.4; 1.2; 1.9 iar pentru gena SulII: 3.9.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele SulI si SulII: godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 19 ampliconii tulpinilor 2.13- ctrl negativ. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru gena SulI: 2.1; 3.9; 4.6; 2.9; 2.2; 1.1; 2.11; 3.2; 4.8; 2.6; 3.1; 2.3; 1.8; 4.1.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele tetA si tet B godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 19 ampliconii tulpinilor 4.11-3.10. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru gena tetA: 4.7; 3.10; 4.8 si 2.10.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele tetA si tet B godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 19 ampliconii tulpinilor 4.11-3.10. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru gena tetA: 3.8.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele Int1 si drfA1-aadA1godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 26 ampliconii tulpinilor 4.1-1.1. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru gena Int1: 4.1; 2.12; 2.6; 2.9; 4.4; 3.5; 3.2; 3.8; 4.2; 3.3; 2.3; 2.8 ;1.3 ;3.4 ;4.9 ;3.1; 3.11 ;2.5; 1.9; 1.7; 4.11; 1.1.

Fig. Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele Int1 si drfA1-aadA1godeu 1 – Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Mid Range); godeu 2- 19 ampliconii tulpinilor 2.4-3.10. Tulpini pozitive- enterobacterii- pentru gena Int1: 2.4; 2.10; 3.9; 1.2; 4.3; 2.2; 2.1; 4.5; 1.6; 4.6; 1.4; 2.11; 3.7; 4.10; 2.13; 3.6; 3.10.

Rezultatele obținute în urma amplificării prin PCR a genelor care determină rezistența la antibiotice pentru tulpinilor nosocomiale de K.pneumoniae sunt ilustrate în figurile de mai jos:

Fig…… Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele blaCTX-M si blaTEM. Godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2-11- ampliconii tulpinilor analizate. Toate tulpinile analizate au fost pozitive pentru BLSE blaCTX-M.

Fig…… Electroforegrama ampliconilor obtinuți prin PCR pentru genele tetA si tetB. Godeu 1- L- Marker de greutate moleculară GeneRuler 3000 bp (Termo Scientific); godeu nr2-11- ampliconii tulpinilor analizate. Tulpini pozitive- pentru tetA:1; 2; 5; 7; 8; 9; 10

Rezultate obținute în urma analizei electroforegramelor cu softul PyElph.

Concluzii

Bibliografie

Agerso Y., D. Sandvang (2005) – Class 1 integrons and tetracycline resistance genes în alcaligenes, arthrobacter, and Pseudomonas spp. isolated from pigsties and manured soil, Appl. Envirom. Microbiol., 71(12): 7941-7;

Aminov, R. I., & Mackie, R. I. (2007). Evolution and ecology of antibiotic resistance genes. FEMS microbiology letters, 271(2), 147-161.

Aminov, R. I., Garrigues-Jeanjean, N., & Mackie, R. I. (2001). Molecular ecology of tetracycline resistance: development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins. Applied and environmental microbiology, 67(1), 22-32.

Angelescu Mircea (1998) – Terapia cu antibiotice, Ed. Medicală, București.

Atkinson BA, Abu-Al-Jaibat A & LeBlanc DJ (1997) Antibiotic resistance among enterococci isolated from clinical specimens between 1953 and 1954. Antimicrob Agents Chemother 41: 1598–1600.

Barbosa TM, Scott KP & Flint HJ (1999) Evidence for recent intergeneric transfer of a new tetracycline resistance gene, tet(W), isolated from Butyrivibrio fibrisolvens, and the occurrence of tet(O) in ruminal bacteria. Environ Microbiol 1: 53–64.

Burton R.W. Gwendolyn and Engelkirk G. Paul (2002) – Microbiology for the Health Sciences, 7th Edition, Chapter 9, Using antimicrobial agents to control microbial growth in vivo, 226-248.

Collis H., (1995) – Integrons and Mobile Gene Cassettes, Molecular Microbiolg, .15:593-600;

Connell SR, Trieber CA, Stelzl U, Einfeldt E, Taylor DE &Nierhaus KH (2002) The tetracycline resistance protein Tet(O) perturbs the conformation of the ribosomal decoding centre. Mol Microbiol 45: 1463–1472.

Cousin S, Whittington WL & Roberts MC (2003) Acquired macrolide resistance genes in pathogenic Neisseria spp. isolated between 1940 and 1987. Antimicrob Agents Chemother 47: 3877–3880.

De Leener E, Martel A, De Graef EM, Top J, Butaye P, Haesebrouck F, Willems R & Decostere A (2005) Molecular analysis of human, porcine, and poultry Enterococcus faecium isolates and their erm(B) genes. Appl Environ Microbiol 71:2766–2770.

Diaz M.A., Cooper R.K., Cloeckaert A., Siebeling R.J. (2006) – Plasmid-mediated high level gentamicin resistance among enteric bacteria isolated from pet turtles in Louisiana, Appl. Envirom.Microbiol, 72 (1): 306-12;

Enne VI, Bennett PM, Livermore DM & Hall LM (2004) Enhancement of host fitness by the sul2-coding plasmid p9123 in the absence of selective pressure. J Antimicrob Chemother 53:958–963.

FEDESA (2000) – Antibiotics for animals. A FEDESA perspective on antibiotics, Animal Health and the Resistance Debate, vol. February: 6;

Furushita M., Shiba T., Maeda T., Yahata M., Kaneoka A., Takahashi Y., Torii K., Hasegawa T., Ohta M. (2003) – Similarity of tetracycline resistance genes isolated from fish farm bacteria tothose from clinical isolates, Appl Envir. Microbiol, 69 (9): 5336-42;

Gilliver MA, Bennett M, Begon M, Hazel SM & Hart CA (1999) Antibiotic resistance found in wild rodents. Nature 401: 233–234.

Han, J. W., Koh, H. B., & Kim, T. J. (2016). Molecular characterization of β-Lactamase-producing Escherichia coli collected from 2001 to 2011 from pigs in Korea. Foodborne pathogens and disease, 13(2), 68-76.

Hanson, N. D., & Sanders, C. C. (1999). Regulation of inducible AmpC beta-lactamase expression among Enterobacteriaceae. Current pharmaceutical design, 5(11), 881-894.

Hardy, B. (2002). The issue of antibiotic use in the livestock industry: what have we learned?. Animal biotechnology, 13(1), 129-147.

Heinemann J.A. (1999) – How antibiotics cause antibiotic resistance, Drug Discov Today, 4 (2): 72-79;

Issam Raad, Hend Hanna et al – Comparative Activities of Daptomycin, Linezolid, and Tigecycline against Catheter-Related Methicillin-Resistant Staphylococcus Bacteremic Isolates Embedded in Biofilm Antimicrobial Agents and Chemotherapy, May 2007, p.1656-1660, Vol. 51, No. 5

Jackson C.R., Fedorka C.P.J., Barrett J.B., Ladely S.R. (2004) – Effects of tylosin use on erythromycin resistance in enterococci isolated from swine, Appl. Envirom. Microbiol, 70 (7): 4205-10.

Johnson A.P., Burns L., Woodford N., Threlfall E.J., Naidoo J., Cooke E.M., George R.C. (1994) – Gentamicin resistance in clinical isolates of Echerichia coli encoded by genes of veterinary origin, J. Med. Microbiol., 40 (3): 221-6.

Kazimierczak KA, Flint HJ & Scott KP (2006) Comparative analysis of sequences flanking tet(W) resistance genes in multiple species of gut bacteria. Antimicrob Agents Chemother 50: 2632–2639.

Kehrenberg C., Weckenthin C., Schwarz S. (1998) – Tn570, a transposon-like element fromPasteurella multocida mediating tetracycline resistance, Antimicrob. Agents Chemother., 42 (8): 2116-8;

Kuhn F., Cottagnound M., Acosta F., Flatz L., Enteza J., Cottagnound P. (2003) – Cefotaxine acts synergistically with levofloxacin in experimental meningitis due to penicillin-resistant pneumococci and prevents selection of levofloxacin resistant mutants in vivo, Antimicrob Agents Chemother., 47 (8): 2487-91;

Lafontaine DL, Preiss T & Tollervey D (1998) Yeast 18S rRNA dimethylase Dim1p: a quality control mechanism in ribosome synthesis? Mol Cell Biol 18: 2360–2370.

Lau SK, Woo PC, To AP, Lau AT & Yuen KY (2004) Lack of evidence that DNA in antibiotic preparations is a source of antibiotic resistance genes in bacteria from animal or human sources. Antimicrob Agents Chemother 48: 3141–3146.

Lazar, V. (2011). Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe, 17(6), 280-285.

Lazãr, V., & Chifiriuc, M. C. (2010). Architecture and physiology of microbial biofilms. Roum Arch Microbiol Immunol, 69(2), 95-107.

Lazãr, V., & Chifiriuc, M. C. (2010). Medical significance and new therapeutical strategies for biofilm associated infections. Roum Arch Microbiol Immunol, 69(3), 125-138.

Lenski RE (1997) The cost of antibiotic resistance – from the perspective of a bacterium. Ciba Found Symp 207: 131–140.

Levy MS, Balbinder E & Nagel R (1993) Effect of mutations in SOS genes on UV-induced precise excision of Tn10 in Escherichia coli. Mutat Res 293: 241–247.

Livermore DM (1996) Are all beta-lactams created equal? Scand JInfect Dis Suppl 101: 33–43.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (2014). Brock biology of microorganisms (Vol. 14). Upper Saddle River, NJ: prentice hall

Marble Michelle (1999) – Plasmid DNA associated with specific bands in PFGE patterns of antibiotic –resistant Salmonella serotype enteritidis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy Record 107, 5-7;

McDermott P.F., Zhao S., Wagner D.D., Simjee S., Walker R.D., White D.G. (2002) –The food safety perspective of antibiotic resistance, Anim.Biotehnol., 13(1):71-84;

merie Queenan, A., & Bush, K. (2007). carbapenemases: the versatile B-lactamases. Clin Microbiol Rev, 20(3), 440-458.

Mihăescu, G., Chifiriuc, C., & Dițu, L. M. (2007). Antibiotoce și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene. Editura Academiei Române.

Naas, T., Poirel, L., & Nordmann, P. (2008). Minor extended‐spectrum β‐lactamases. Clinical microbiology and infection, 14(s1), 42-52.

Nordmann, P., Poirel, L., Carrër, A., Toleman, M. A., & Walsh, T. R. (2011). How to detect NDM-1 producers. Journal of clinical microbiology, 49(2), 718-721.

Nordmann, P., Poirel, L., Carrër, A., Toleman, M. A., & Walsh, T. R. (2011). How to detect NDM-1 producers. Journal of clinical microbiology, 49(2), 718-721.

Osterblad M, Leistevuo J, Leistevuo T, Jarvinen H, Pyy L,Tenovuo J & Huovinen P (1995) Antimicrobial and mercury resistance in aerobic gram-negative bacilli in fecal flora among persons with and without dental amalgam fillings. Antimicrob Agents Chemother 39: 2499–2502.

Osterblad M, Norrdahl K, Korpimaki E & Huovinen P (2001) Antibiotic resistance. How wild are wild mammals? Nature 409: 37–38.

Pang Y, Brown BA, Steingrube VA, Wallace RJ Jr & Roberts MC (1994) Tetracycline resistance determinants in Mycobacterium and Streptomyces species. Antimicrob Agents Chemother 38:1408–1412.

Paterson, D. L., & Bonomo, R. A. (2005). Extended-spectrum β-lactamases: a clinical update. Clinical microbiology reviews, 18(4), 657-686.

Philippon, A., Arlet, G., & Jacoby, G. A. (2002). Plasmid-determined AmpC-type β-lactamases. Antimicrobial agents and chemotherapy, 46(1), 1-11.

Poirel, L., Dortet, L., Bernabeu, S., & Nordmann, P. (2011). Genetic features of blaNDM-1-positive Enterobacteriaceae. Antimicrobial agents and chemotherapy, 55(11), 5403-5407.

Ramadhan AA & Hegedus E (2005) Survivability of vancomycin resistant enterococci and fitness cost of vancomycin resistance acquisition. J Clin Pathol 58: 744–746.

Ribera A., Roca I., Ruiz J., Gibert I., Vila J. (2003) – Partial characterization of a transposon containing the tet (A) determinant in a clinical isolate of Acinetobacter baumannii, J. Antimicrob. Chemother. 52 (3): 477-80;

Salyers AA & Amabile-Cuevas CF (1997) Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination? Antimicrob Agents Chemother 41: 2321–2325.

Salyers AA, Gupta A & Wang Y (2004) Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance genes. Trends Microbiol 12: 412–416.

Shan, L. I. N., Thomas, M., Shlaes, D. M., Rudin, S. D., ANDERSON, V., & BONOMO, R. A. (1998). Kinetic analysis of an inhibitor-resistant variant of the OHIO-1 β-lactamase, an SHV-family class A enzyme. Biochemical Journal, 333(2), 395-400.

Shoemaker NB, Vlamakis H, Hayes K & Salyers AA (2001) Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl Environ Microbiol 67: 561–568.

Slavcovici Adriana (2008). Antibiotic resistance of bacteria involved in severe infections Romanian Journal of Infectious Disease. Revista Română de Boli Infecțioase 4, 65-72.

Sockett D.C., Valley Ann (2006) – Antimicrobial susceptibility testing, Wisconsin Veterinary Diagnostic Laboratory, April 14;

Swartz N. Morton (2000) – Minireview: Impact of antimicrobial agents and chemotherapy, from 1972 to 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000- 2016;

Todar K. (2002) – Antimicrobial agents used in treatment of infectious disease, Textbook of Bacteriology, Wisconsin-Madison,

Van der Poll, T., & Opal, S. M. (2008). Host–pathogen interactions in sepsis. The Lancet infectious diseases, 8(1), 32-43.

Walsh, T. R., Toleman, M. A., Poirel, L., & Nordmann, P. (2005). Metallo-β-lactamases: the quiet before the storm?. Clinical microbiology reviews, 18(2), 306-325.

Yong, D., Toleman, M. A., Giske, C. G., Cho, H. S., Sundman, K., Lee, K., & Walsh, T. R. (2009). Characterization of a new metallo-β-lactamase gene, blaNDM-1, and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(12), 5046-5054.