Prezenta Bacteriilor DIN Genul Campylobacter LA Puii Broiler Si Rezistenta Acestora LA Refrigerare Si Congelare

Diverse2

Prezenta Bacteriilor DIN Genul Campylobacter LA Puii Broiler Si Rezistenta Acestora LA Refrigerare Si Congelare

Byadmin ianuarie 1, 2024

PREZENȚA BACTERIILOR DIN GENUL CAMPYLOBACTER LA PUII BROILER ȘI REZISTENȚA ACESTORA LA REFRIGERARE ȘI CONGELARE

CUPRINS

Partea I Considerații generale

Capitolul 1

LISTA TABELELOR

INTRODUCERE

Datorită rolului important al Campylobacter jejuni în producerea gastroenteritei acute la om, cu caracter epidemiologic de toxiinfecție alimentară, Comitetul de experți FAO/OMS asupra securității alimentelor a inclus această bacterie pe lista agenților care produc boli de origine alimentară.

Experții Organizației Mondiale a Sănătății reunite la Moscova în 1984 au subliniat faptul că “nu va fi posibil să se înțeleagă pe deplin relația dintre infecțiile umane și animale cu Campylobacter fără intensificarea cercetărilor în acest domeniu și că specialiștii care lucrează în sectorul sănătății publice veterinare trebuie să contribuie mai mult la prevenirea și combaterea acestor infecții la om.”(O.M.S., 1984).

În ultimile două decenii s-a cunoscut adevăratul rol al Campylobacter jejuni în infecțiile omului, care este îngrijorător. Pe baza studiilor clinice, epidemiologice și de laborator, Campylobacter jejuni este considerat acum a fi una din cele mai frecvente cauze a infecțiilor gastro-intestinale în multe țări ale lumii.

În SUA această bacterie depășește speciile de Salmonella în producerea bolilor gastro-intestinale, în anumite state și perioade, numărul anual de îmbolnăviri produse de Campylobacter jejuni depășind 2 milioane. Infecțiile cu Campylobacter nu sunt rare. O serie de studii indică faptul că în Statele Unite, boala diareică produsă de Campylobacteri este mai frecventă decât cea produsă de Salmonella și Shigella împreună. Infecțiile apar pe toata durata anului, însă există un vârf de incidență în timpul verii și la începutul toamnei. Sunt afectate persoane de toate vârstele, totuși, ratele de atac pentru C. jejuni sunt cele mai ridicate în rândul copiilor mici și al adulților tineri, iar cele pentru C. fetus sunt mai ridicate pentru vârstele extreme.

De câțiva ani s-a stabilit că infecțiile umane produse de Campylobacter jejuni sunt deseori asociate cu sindromul Guillain-Barre, ceea ce a sporit și mai mult interesul cercetătorilor

pentru studierea lor și pentru găsirea unor mijloace profilactice eficiente. Acest interes explică apariția în ultimii ani a unui număr enorm de publicații de specialitate cu acest subiect, probabil neegalat de alte boli.

În România autoritățile sanitar-veterinare monitorizează bacteria Campylobacter de câțiva ani și în prezent fac verificări în crescătoriile de pui și în supermarketuri.

Se realizează frecvent controale pentru a vedea incidența bacteriei Campylobacter în carnea de pui. Astfel de controale sunt realizate la nivelul Uniunii Europene, ca recomandare a

celor de la EFSA (Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară), care a constatat că incidența bacteriei Campylobacter a depășit-o pe cea a bacteriei E.coli.

În anul 2009, în statele membre ale Uniunii Europene, inclusiv în România, s-a desfășurat un program de monitorizare pentru bacteriile din genul Campylobacter , în abatoarele pentru păsări, conform Deciziei 516/2007/CE.

Din anul 2009 până în prezent, în România s-a monitorizat prezența Campylobacter spp. în carcasele de pui broileri și în carnea de pasăre (broileri și curcani), în cadrul programelor naționale anuale de monitorizare ale A.N.S.V.S.A.

Ca urmare a măsurilor aplicate de către ANSVSA, în fermele și abatoarele de pasări, procentul de probe pozitive depistate în carnea de pasăre analizată a scăzut de la 63% în anul 2009, la 41% în anul 2010, la 38% în anul 2011, ajungând la 23% la sfârșitul anului 2014.

În acest context, în lucrarea de față ne-am propus monitorizarea bacteriilor din genul Campylobacter cu implicații în toxiinfecțiile alimentare, prezente pe suprafața carcaselor și în conținutul cecal la puii broiler sacrificați în abatorul S.C. Agricola Internațional S.A. din județul Bacău.

PARTEA I

Date bibliografice privind Genul Campylobacter

CAPITOLUL I

ELEMENTE DE TAXONOMIE ȘI PARTICULARITĂȚILE MORFOFIZIOLOGICE ALE BACTERIILOR DIN GENUL CAMPYLOBACTER

Taxonomia

Taxonomia genului Campylobacter a fost mult discutată și revizuită în ultima decadă. La început în acest gen erau incluse numai două specii: Campylobacter fetus și Campylobacter bubulus. Denumirea genului provine din limba greacă (campylo=încurbat) și se referă la forma bacteriilor. Genul Campylobacter face parte din familia Campylobacteriaceae și cuprinde speciile prezentate in Tabel 1.1. .

Tabel 1.1.

Clasificarea taxonomică a genului Campylobacter (după Vandamme și De Ley, 1991)

Prezența sau absența catalazei permite separarea genului în specii catalază pozitive și specii catalază negative.

Specii catalază pozitive

Campylobacter jejuni este semnificativă pentru om, fiind responsabilă de 85-90% din cazurile de gastroenterită acută campilobacteriană la om, cu caracter epidemiologic de toxiinfecție alimentară, iar uneori implicată și în infecțiile urinare. Este larg răspândită la păsări și mamifere, cele mai multe cu rol de purtător intestinal.

Campylobacter coli a fost separată ca specie distinctă pe baza hibridizării ADN, fiind implicată în 5-15% din cazurile de enterită campilobacteriană la om.

Se dezvoltă mai ușor pe mediile de cultură decât alte specii și trece mai lent în forme cocoide. Se deosebește de Campylobacter jejuni pe baza incapacității sale de a hidroliza hipuratul (Apostu S. 2006).

Campylobacter lari apare frecvent pe carcasele, pipotele și ficații de pasăre, producând enterite la om și păsări.

Campilobacteriile catalază pozitive se împart în două grupe în funcție de comportarea lor față de temperatură:

Specii care se dezvoltă la 250C, dar nu și la 420C (C. Fetus);

Specii care se dezvoltă la 420C, dar nu și la 250C, numite campilobacterii termotolerante și care sunt principalii agenți ai gastroenteritelor umane.

Acestea din urmă cuprind mai multe specii dintre care cele mai importante sunt: C. jejuni, C coli, C. lari, C. upsaliensis, Ca hyoilei, C. hyointestinalis și C. showae.

Dintre speciile genului Campylobacter, C. jejuni este cea mai des izolată în patologia umană; C. coli și C. fetus sunt izolate în proporții asemănătoare.

Specii catalază negative

Campylobacter sputorum cu trei subspecii (sputorum, bubulus și mucosalis) cu toleranță mai mare față de oxigen, capabile să reducă nitrații și să producă H2S.

Campylobacter concisus peoduce produce gingivite și peritonite la om.

Morfologia

Campylobacter jejuni se caracterizează morfologic prin forme caracteristice de virgulă sau forma literei “S”. Se pot întâlni și forme mai lungi, multispiralate, cât și scurte, cocoide. În condiții neprielnice adoptă forma cocoidală, care păstreaza intacte peretele celular și flagelii.

Genul Campylobacter cuprinde bacterii Gram negative, groase de 0,2-0,5 µm, microaerofile, mobile datorită prezenței unui flagel polar care determină o mobilitate specifică „în zbor de musculiță” (Bărzoi D., 1990).

Proprietăți biochimice

Campylobacter jejuni este un microaerofil și se dezvoltă mai bine într-o atmosferă care conține 5% oxigen. Microaerofilia se datorează incapacității lui de a sintetiza compuși care leagă Fe+++ la nivele suficiente care să-i permită dezvoltarea în condiții aerobe. Unii cercetători au constatat o creștere a toleranței față de aerul atmosferic în mediile agarizate la care se adaugă câte 0,025 % sulfat feros, metasulfit de sodiu și piruvat de sodiu.

Adăugarea acestor substanțe la mediile de cultură mărește capacitatea de supraviețuire a C. jejuni și îi păstrează morfologia caracteristică, mobilitatea și viabilitatea la 4 C (30 zile) sau la temperature camerei (20 zile) în condiții atmosferice normale. Pentru dezvoltare, în afară de o concentrație optimă de 5% oxigen, bacteria are nevoie, de asemenea, de o concentrație optimă de dioxid de carbon (10%) și de una de azot 85% (Salloway S. și col., 1996).

Absența uneia sau a două componente din atmosfera de incubare inhibă dezvoltarea acestei bacterii (Crețu Carmen, 2009).

Sulfatul feros și clorura de cadmiu au efect antagonic asupra dezvoltării bacteriei, iar factorii prezenți în mediul cu sânge și cu tioglicolat neutralizează activitatea inhibitoare a sărurilor de cadmiu.

Pe mediile lichide campilobacteriile produc turbiditate discrete observabilă la câțiva milimetri sub fața superioară a coloanei de mediu. Coloniile dezvoltate pe suprafața mediilor solide pot avea două aspect principale:

Colonii foarte mici, aplatizate, gri+cenușii, fin granulate și translucide, cu margini neregulate, asemănătoare picăturilor mici de miere;

Colonii rotunde cu margini translucide.

Uneori formează colonii de tip R, cu suprafața uscată, marginile neregulate cu colonii cu aspect mucos. Mediile cu sânge sunt favorabile dezvoltării campilobacteriilor, acestea producând doar o ușoară hemoliză de tip alfa.

Campilobacteriile au metabolism de tip respirator și proprietăți metabolice limitate. Reduc nitrații, cu excepția speciilor aerotolerante (Păun L. și col.,1983). Speciile catalază negative pot reduce nitrații. Sunt incapabile să fermenteze sau să oxideze hidrații de carbon, deoarece nu pot fosforila și transporta glucoza. Nu produc acizi sau substanțe finale neuter din metabolizarea diferitelor substraturi. Nu hidrolizează gelatin, cazeina, esculina, AND+UL, ARN+UL și sunt indol, RM și VP negative.(Stern N.J. și col., 1992). Nu elaborează lipase și cu excepția C. mucosalis care produce pigmenți galbeni, sunt apigmentogene.

În tabelul 1.2. sunt prezentate criteriile prin care se diferențiază specii sau subspecii cu semnificație patogenă pentru om.

Tabelul 1.2.

Diferențiere speciilor de Campylobacter

+ = >99% positive; – = > 99% negative; ± = > 50% pozitive; – + = > 50% negative; R = rezistent; S = sensibil; (R) = de regula rezistent; R/S = 50% R si 50% S.

Proprietățile antigenice

Structura chimică a peretelui celular la campilobacterii este asemănătoare cu cea a celorlalte bacterii Gram negative, peptidoglicanul fiind format din acid N-acetilmuramic și N-acetilglucozamină. Membrana externă conține doi compuși majori, bine studiați, cu rol în antigenitatea bacteriilor și care stau la baza unor teste biochimice sau serologice de diferențiere: lipopolizaharidele (LPS) și polipeptidele majore (OMP= outer membrane protein)

La C. jejuni s-a identificat o fracțiune de suprafață care nu face parte din OMP, care joacă rolul unei microcapsule și care este responsabilă de inaglutinabilitate.

În general, hidrații de carbon din structura LPS sunt glucoza, galactoza și manoza la C. jejuni și C. coli și galactoza și manoza la C. fetus s. venerealis. Studiile serologice au arătat că tulpinile de C. jejuni sunt diferite din punct de vedere antigenic și că astăzi se disting cel puțin 42 de serotipuri printr-un sistem de serotipizare bazat pe antigenele termostabile

Componentele polipeptidice din membrane exterioară (OMP) sunt de natură flagelară. Proteina flagelară este principalul component antigenic din schema de serotipare a lui Lior și este un imunogen dominant, evidențiat în infecțiile cu C. jejuni. Această polipeptidă unică deosebește C. jejuni și C. coli de E. coli și S. typhmimurium, ca și de C. fetus care are două sau mai multe benzi de OMP majore.

Schema Lior este o alternative de serotipare prin aglutinare pe lama pentru diferențierea serotipurilor de C. jejuni. Pentru aceasta s+au folosit factorii antigenici termolabili pentru producerea antiserurilor, care apoi s+au aplicat pentru serotiparea tulpinilor isolate prin reacția de seroaglutinare rapidă pe lama (Bărzoi D.,1985).

Viabilitatea bacteriilor din genul Campylobacter

Viabilitatea bacteriilor din genul Campylobacter în apă

Campylobacter spp., este frecvent izolat din apele de suprafață . Supraviețuirea este mai importantă la temperatură joasă (4-10°C) și este redusă prin procesul de aerare-oxigenare a apei. Între speciile de Campylobacter spp există variații mari (Bărzoi D., 1985).

Astfel, populațiile de C.jejuni și C.lari par a fi mai rezistente, în apele fluviilor la 5°C iar timpul de supraviețuire este variabil în funcție de tulpină. Aplicarea radiațiilor UV/24 ore asupra apelor de suprafață demonstrează faptul că populațiile de Campylobacter devin necultivabile după 30-90 minute (Handan A. Dincer and Taner Baysal, 2004).

Viabilitatea bacteriilor din genul Campylobacter în produsele alimentare

Multe experimente s-au concentrat asupra evoluției numărului de campilobacterii în produsele alimentare. În condiții normale de prelucrare, transport și distribuție, numărul lor este scăzut și nu este influențat de temperatură, atmosferă, pH sau de natura substratului alimentar. Supraviețuirea și dezvoltarea în produse alimentare a fost demonstrată prima data în carnea depozitată la 370C/420C, (10).

Supraviețuirea în produse alimentare se află sub influența unui număr de factori descriși mai jos:

Temperaturile negative

În perioada 1980-1996, în Islanda au fost vândute carcase de pui congelate, rata de infecție cu Campylobacter scăzând. După aprobarea vânzării carcaselor de pui în stare proaspătă, rata de infecție cu Campylobacter a crescut la valori semnificative. Studiile au arătat că procesul de congelarea a redus încărcătura bacteriană prezentă pe carcase de 1-2 log10. Astfel se consideră că, cu cât numărul de celule bacteriene este mai mare pe carcasă cu atât riscul de infecție este mai mare. Prin urmare temperaturile negative stopează creșterea lui C. jejuni și reduce încărcătura bacteriană de pe suprafața carcaselor.

Diferiți factori influențează această evoluție:

condițiile de mediu: C. jejuni pare a fi mai sensibil la îngheț în medii lichide decât în cele solide;

utilizarea de ventilare forțată în timpul congelării reduce semnificativ contaminarea carcaselor de pui la suprafață comparativ cu congelarea fără ventilație.

tulpinile izolate de la om sunt mai puțin sensibile la congelare față de tulpinile de origine animală.

Temperaturile pozitive

În general, indiferent de produsul alimentar temperaturile de refrigerare (0-100C) sunt mai favorabile pentru supraviețuirea campilobacteriilor decât temperaturile mai ridicate, (21). Mai mult, supraviețuirea depinde foarte mult de condițiile de mediu (mediu solid este mai puțin sensibil). Prezența aditivilor permite diminuarea numărului de bacterii cultivabile, chiar și la temperaturi de refrigerare. Campylobacter este sensibil la deshidratare în timpul refrigerării (raportul rece umed/ rece uscat).

Inactivarea termică

Campilobacteriile sunt foarte sensibile la căldură, iar tratamentele termice mai mari de 600C le distrug indiferent de mediu (lichid sau solid).

pH-ul

Intervalul de pH optim pentru creșterea lui C.jejuni este de 6,5-7,5 dar poate crește și la pH = 5,5-8,5. Este omorât în substraturile cu pH mai m ic de 3,5-4,5, în funcție de temperatură. La aceleași valori de pH, moare mai repede la 420C decât la 40C. La 370C, C. jejuni se poate multiplica în cărnurile cu pH ridicat (≥ 6,4), dar nu și în cele cu pH normal. Campylobacter este mai sensibil la acțiunea acizilor organici decât la acțiunea celor minerali.(Baqar S. Și col.).

NaCl

Campylobacter spp., nu este halofil (concentrația optimă de 0,5% NaCl). Limita concentrației de NaCl pentru multiplicarea speciilor termotolerante este de 2%. Concentrațiile de peste 6,5% au efect letal.

Acidul ascorbic

Acidul ascorbic care se adaugă în mediul nutritiv, are un efect bactericid asupra C. jejuni la 420C. Acest efect este confirmat în carne.

Atmosfera modificată

Supraviețuirea bacteriei este în funcție de concentrația de O2 (scade o dată cu creșterea concentrației) și de cantitatea de CO2 (crește odată cu creșterea cantității).

Dezinfectanții și iradierea

C. jejuni este foarte sensibilă la o serie de dezinfectanți ca hipocloritul de sodiu (soluțiile de 5 ppm, concentrațiile de 107 celule/ml sunt distruse în 15 minute), compușii fenolici 0,15% compușii de amoniu cuaternar, etanol 70%, glutaraldehidă 0,125%, monocloramină (1ppm omoară 99% din celulele bacteriene din apă după un contact de 15 minute). Din aceste dezinfectante, cloramina apei din bazinele de prerăcire și-a găsit aplicarea practică în unele abatoare din țările dezvoltate pentru distrugerea campilobacteriilor de pe suprafața carcaselor de pasăre.

În același timp este la fel de sensibilă sau mai sensibilă decât salmonelele la acțiunea razelor gama care au o valoare de reducere zecimală egală cu 32 Krad, ceea ce este de zece ori mai puțin decât doza care se aplică în mod obișnuit în unele țări, în procedeele de iradiere a produselor de carne. (Atanassova Viktoria and Christian Ring, 1999).

CAPITOLUL II

PATOGENITATEA

Caracteristicile care conferă caracterul de patogenitate au fost studiate în principal pentru C. jejuni. In vitro pe culturi de celule epiteliale C. jejuni aderă și se implantează. Procesul de adeziune este reversibil și depinde de mobilitate (Timofte Dorina, 1998).

Factorii de virulență și toxicitate

Capacitatea patogenă a C. jejuni variază de la tulpină la tulpină și este determinată de mai mulți factori legați de bacterie sau de gazdă. Unii cercetători au demonstrat că, în cazul unor tulpini, doza minimă infectantă pentru om este de 500 celule, iar în alte cazuri această doză este mult mai mare, în funcție de o serie de factori de virulență (Atanassova Viktoria and Christian Ring, 1999).

Producerea de toxine

Simptomele clinice produse de diferite tulpini de C.jejuni depind de toxinele pe care le produc. În prezent se cunoaște că această specie bacteriană produce o enterotoxină asemănătoare cu enterotoxina holerică.

Aproximativ 75% din tulpinile izolate din materiale clinice produc această toxină, în timp ce tulpinile izolate de la purtătorii asimptomatici nu o produc sau o produc într-o proporție redusă. S-a demonstrat de asemenea, că tulpinile izolate din probe de la pacienți cu diaree de tip secretor provoacă acumulare de lichid în ansa ligaturată de șobolan, iar cele izolate din cazuri de diaree hemoragică produc citotoxină pentru celulele Vero și HeLa, dar nu și acumulare de lichid în ansa ligaturată de șobolan.

Enterotoxina C.jejuni este o proteină mare cu o greutate moleculară de 60.000-70.000, termolabilă, care se inactivează într-o oră la 560C, ca și la pH 2 și 8 și numai parțial la pH 4. Activitatea ei se pierde în timp de o lună la 40C.

C. jejuni este capabilă să invadeze direct mucoasa intestinală la pacienții cu enterită hemoragică, ca și celulele HeLa în care, după pătrundere, se multiplică. Puterea invazivă pentru celulele HeLa este mai accentuată la tulpinile izolate de la bolnavi, decât la cele izolate din apă.

Citotoxina este o altă toxină produsă de C. jejuni și ea provoacă efecte citopatice pentru celulele renale de bovine, ovariene de hamster chinezesc, Vero și HeLa. Ea se găsește în preparatele de culturi sonicate, fără celule, și eliberarea ei crește când celulele bacteriene se tratează cu polimixină B, înainte de centrifugare și filtrare. Citotoxina este sensibilă la tripsină și este mai tolerantă față de căldură decât enterotoxina. Ea nu poate fi neutralizată de serul de iepure antitoxină Shiga sau anti-LT.

Endotoxina reprezentată de lipopolizaharidele (LPS) din peretele celular este un factor endotoxic important care contribuie la virulența bacteriei. LPS C. jejuni conțin glucoză, galactoză, L-glicero-D-manoză-heptoză, glucozamină, galactozamină, acid gras 3-hidroxi-tetradecanoic și acid 2-cheto-3-deoxioctonic. LPS unor tulpini de C. jejuni au aceeași lipidă A ca determinanți antigenici, ca regiunea corului LPS ale numeroaselor bacterii Gram-negative. Regiunea cu lipida A este partea toxică a endotoxinei (Bărzoi D., Meica I., Marian Negruț, 1999).

Factorii de virulență

C. jejuni depinde, cel puțin în parte, de structura suprafeței celulare formată, în principal, de LPS și OMP (outer membrane protein). Aceste două componente celulare servesc ca interfață între bacterie și celula gazdă și ajută bacteria să învingă mecanismele de apărare a gazdei. LPS și OMP sunt implicate în aderența și invazia bacteriei în celula gazdă, fenomene în care microcapsula bacteriană, ca factor antifagocitar, ar juca un rol important în infecția cu alte specii sau subspecii de Campylobacter, cum este C. fetus (Bondoc I., Șindlar E. V., 2002).

Folosirea fierului de către C.jejuni este socotită în prezent, ca și în cazul altor bacterii Gram-negative, un factor important de virulență. Compușii proteici produși de bacteriile care leagă fierul sunt numiți, în general, siderofori. Proteinele bacteriene au capacități mai mari de a lega fierul decât cele produse de gazde. Producerea toxinei de către C. jejuni este sporită când fierul este în exces. Tulpinile care nu produc nivele detectabile de toxină, devin producătoare de toxină dacă se cultivă pe medii suplimentate cu fier. Această constatare a determinat pe unii cercetători să considere că fierul este un element cheie în patogeneza acestei specii bacteriene.

Factorii de virulență, menționați mai sus, pot fi codificați prin informația genetică prezentă în plasmide. Din C. jejuni s-au izolat mai multe plasmide, dar numai două caracteristici ale acestei bacterii sunt mediate de plasmide: rezistență față de tetraciclină și în anumite condiții producerea enterotoxinei. Nu s-a constatat nici o omologie ADN între plasmidele C. jejuni și sondele genice ale subunităților A și B ale CT sau gena care codifică LT la E. coli. În același timp s-a constatat că numai 61% din tulpinile de C. jejuni enterotoxigene posedau ADN plasmidic specific, ceea ce arată că producerea enterotoxinei la multe tulpini poate fi codificată de gene cromozomice. La tulpini de C. fetus netoxigene s-a reușit să se transfere proprietatea de a produce enterotoxina, odată cu transferul rezistenței la tetraciclină, iar transconjugatele de C. fetus au fost capabile să transfere plasmidele PGK 103 și PGK 104 la o tulpină netoxigenă de C. jejuni făcându-o rezistentă la tetraciclină și producătoare de enterotoxină.

Mecanismele patogenității

Deși mecanismele de patogenitate a C. jejuni nu sunt pe deplin cunoscute, totuși în ultima decadă s-au făcut progrese importante pentru înțelegerea corectă a factorilor de virulență, așa cum s-a arătat mai sus. Mecanismele prin care C. jejuni poate provoca infecția au fost presupuse pe baza datelor studiilor făcute asupra diferitelor sindroame clinice, asemănătoare cu cele produse de alte bacterii enteropatogene. Izolarea C. jejuni din sânge și din alte țesuturi extraintestinale, ca și din fecale, arată că această bacterie nu este un patogen oportunist. Ca și alte bacterii enteropatogene, C. jejuni produce boala prin diferite mecanisme. Unul din mecanismele enterotoxigene constă din colonizarea bacteriei în intestinul subțire, multiplicarea pe suprafața mucoasei intestinale și elaborarea enterotoxinei.Această toxină determină un aflux de lichid și de electroliți, urmat de apariția diareei apoase.

O altă cale de producere a bolii este procesul invaziv prin care bacteria pătrunde în peretele intestinului subțite și al colonului. După această pătrundere, bacteria se multiplică intracelular și diseminează în și în afara mucoasei, dar leziunea ramâne superficială. Porțiunea terminală a ileonului și colonul sunt cel mai des afectate, iar scaunele, în aceste cazuri, sunt adesea hemoragice și conțin leucocite.

Leziunile constau din infiltrate inflamatorii în lamina propria și din abcese în criptele mucoasei, asemănătoare cu cele din shigeloză și salmoneloză. După infecția cu C. jejuni apar în serul sangvin titruri mari de anticorpi Ig G și Ig M, ceea ce arată contactul intim componenților celulari ai bacteriei cu sistemul imun extraintestinal.

Variația simptomelor în enterita campilobacteriană se datorează diferitelor mecanisme prin care diferite tulpini de C. jejuni produc boala. Instalarea unei infecții enterice depinde deseori de capacitatea bacteriei de a coloniza mucoasa intestinală. C. jejuni este capabilă să colonizeze masiv și să se multiplice în intestinul omului, după cum arată numărul mare de asemenea bacterii în fecalele diareice.

Mucusul intestinal care acoperă ca un gel mucoasa, reprezintă o barieră de pătrundere a majorității patogenilor enterici, dar campilobacteriile fiind foarte mobile, subțiri și spiralate, sunt capabile să penetreze această matrice foarte vâscoasă și să colonizeze mucoasa intestinală. Colonizarea este ușurată și de stimuli chemotactici, prin mărirea mobilității bacteriilor selectate. Se pare că C. jejuni se atașează de țesutul intestinal prin colonizarea mucusului și nu prin aderență. Capacitatea acestei specii de a coloniza mucoasa intestinală pe calea mucusului este considerată ca un factor de patogenitate important.

De asemenea , se consideră că adezinele flagelare ajută atașarea C. jejuni de liniile celulare epiteliale, atașare care este inhibată prin diferite tratamente și substanțe: L-fucoza, glucoza, N-acetilglucozamina, N-acetil, galactozamina și sorbitolul, enzimele proteolitice, glutaraldehida (2,5%), D-manoza.

CAPITOLUL III

TOXIINFECȚIILE ALIMENTARE PRODUSE DE CAMPYLOBACTER JEJUNI

3.1. Modul de transmitere și sursele de infecție

C. jejuni poate face parte din microflora intestinală obișnuită a multor specii de animale domestice și sălbatice, ca și a animalelor de apartament sau agrement. Din cauza acestor rezervoare extinse, C. jejuni poate contamina apele de suprafață și solul.

Transmiterea la om are loc prin ingestia alimentelor de origine animală contaminate și a apei contaminate, netratate, sau prin contactul direct cu animalele infectate, în special cu cele de apartament. Foarte rar infecția se poate transmite de la om la om.

Episoadele extinse de enterită cu C. jejuni se datorează, în mod obișnuit, ingerării de lapte nepasteurizat sau apei contaminate și numai rareori ingerarea cărnii de pasăre sau de alte alimente. Din contra, cazurile endemice izolate, au ca sursă de infecție ingerarea de carne de pasăre în proporție de 50-70% din toate cazurile endemice, care reprezintă 95% din toate cazurile de enterită campilobacteriană.

Deși laptele crud este raportat ca vehicolul cel mai frecvent al episoadelor de enterită cu Campylobacter, rezultatele numeroaselor acțiuni de supraveghere au scos în evidență că primul vehicul de transmitere a enteritei cu C. jejuni de origine alimentară este carnea de pasăre. Episoadele asociate cu carnea de pasăre, foarte rar cuprind un număr mare de îmbolnăviri, asemănător cu cele produse prin consumul laptelui. Din această cauză, numărul infecțiilor atribuite consumului cărnii de pasăre contaminate este mic. Aproape toate carcasele de pasăre proaspete, refrigerate sau congelate sunt contaminate cu C. jejuni la nivele de circa 105 celule/g de carcasă.

Frecvența si nivelul contaminării explică de ce carnea de pasăre constituie sursa cea mai importantă pentru infecția de origine alimentară la om. C. jejuni nu se multiplică pe carne, din contra, datorită unor factori nefavorabili, numărul ei scade.

De asemenea, numărul acestei bacterii scade mult în timpul refrigerării și congelării, dar celulele care supraviețuiesc procesului de congelare rămân viabile și infectante mai multe luni.

C. jejuni trăiește ca un comensal în tractul intestinal al multor animale cu sânge cald, domestice și sălbatice, care trebuie considerate surse de infecție pentru om și rezervoare ale bacteriei prin care se contaminează alimentele și apa de suprafață.(19)

Păsările de fermă sunt purtătoare și excretoare de C. jejuni în proporție de 91-100%, bovinele de 43%, câinii de curte – 49%. Multe mamifere și păsări sălbatice sunt, de asemenea, purtătoare de C. jejuni reprezentând un rezervor natural important.

Un procent foarte mare de purtători s-a găsit la pescăruși și ciori, în special la cele care au acces la deșeurile din zonele urbane și la păsările acvatice migratoare. Frecvența mare a acestei bacterii în intestinul păsărilor este legată de caracterul ei termotolerant și de temperatura corporală a păsărilor mai mare decât aceea a mamiferelor. Se poate spune că pentru numeroase specii de păsări, C. jejuni face parte din microflora intestinală normală, densitatea ei fiind deseori de 104-107 celule/g fecale.

Muștele din fermele de păsări și porci sunt frecvent purtători de C. jejuni putând juca un rol important în transmiterea indirectă a bolii prin contaminarea alimentelor.

Carnea de pasăre este contaminată cu C. jejuni intr-o proporție mult mai mare, datorită procentului foarte mare de purtători intestinali și procesului de tăiere și de obținere a carcaselor, care determină contaminarea acestora prin fecale. Numărul de celule bacteriene vii de pe suprafața carcaselor se reduce, dar nu dispare, în timpul stocării în condiții de refrigerare sau congelare.

Campilobacteriile termotolerante s-au găsit și pe legumele proaspete din piețe și magazine.

3.2. Manifestări clinice

Toxiinfecția alimentară produsă de C. jejuni se manifestă din punct de vedere clinic și anatomopatologic ca o enterită, enterocolită sau gastroenterită acută.

Perioada de incubație obișnuită este de 1-3 zile, dar poate fi și de o săptămănă sau mai lungă. Durata perioadei de incubație este, de regulă, direct proporțională cu numărul de bacterii ingerate și invers proporțională cu scăderea rezistenței organismului infectat. Acești doi factori explică faptul că la unele persoane doza minimă infectantă este de 500 celule bacteriene, iar la altele de 106.

Semnele prodromale sunt, în mod obișnuit, nespecifice și constau din dureri de cap, mialgii, frisoane și febră, uneori mai mare de 40oC. După 24 de ore de la apariția semnelor prodromale se instalează manifestarea clinică majoră care constă dintr-o boală diareică acută, însoțită, deseori, de crampe abdominale acute și de febră.

Fecalele devin repede lichide, urât mirositoare și apoi apoase, iar numărul de scaune pe zi în perioada de vârf a bolii, este de 8 sau chiar 20. În a doua sau a treia zi de boală poate să apară sânge proaspăt în fecale, numeroase leucocite polimorfonucleare și mucus. Scaunele pot căpăta o tentă biliară sau uneori, devin sanguinolente. În unele cazuri durerile abdominale sunt așa de pronunțate încât boala se poate confunda cu apendicita acută. Apogeul bolii este atins la 24-48 ore de la apariția semnelor care pot dispare în decurs de o săptămână, iar disconfortul abdominal poate persista mai multe zile. La pacienții netratați pot apare recidive la 20% din cazuri.

Boala diareică ce însoțește infecția cu C. jejuni este considerată un proces inflamator din cauza exprimării predominante a febrei și a simptomelor specifice, ca și din cauza scaunelor care conțin leucocite polimorfonucleare și sânge. Colonoscopia și biopsia pun în evidență o colită inflamatorie difuză și o enterită. Aceste semne clinice și modificările anatomice însoțite de creșterea titrurilor de anticorpi față de

C. jejuni în serul bolnavilor demonstrează natura invazivă a agentului cauzal. Fecalele conțin un număr foarte mare de celule de C. jejuni, ceea ce face posibil ca laboratoarele clinice să pună diagnosticul foarte precoce pe baza examenului microscopic în contrast de fază direct al probelor proaspete de fecale.

Infecția tipică cu C. jejuni se manifestă prin enterocolită acută cu dureri abdominale, diaree hemoragică, inflamarea stratului lamina propria și abcese criptice. În cele mai multe cazuri boala se remite fără tratament,alteori este nevoie de o terapie cu eritromicină. Rareori enterocolita cu campilobacterii se complică cu hemoragii gastroimtestinale masive în segmentele inferioare ale tractusului intestinal, ulcere ale mucoasei ileonului sau valvulei ileocecale sau printr-o infecție a apendicelui.

C. jejuni poate provoca și infecții extraintestinale care se pot manifesta ca pancreatită, colecistică, cistită, avort. S-au descris, de asemenea, cazuri de bacteriemii, în special la persoanele imunosupresate, cu diseminări la distanță. Infecția se poate complica după câteva zile de evoluție. Complicațiile au caracter nesupurativ și alergic: artrită reactivă la persoanele cu antigen de histocompatibilitate HLA-B 27 (human leukocyte antigen), sindrom Reiter, miocardită, meningoencefalită.

Gastroenterita campilobacteriană la om, în afară de C. jejuni, poate fi produsă și de speciile înrudite: C.coli, C.laridis, C.upsaliensis, C.butzleri.

C. coli se izolează de la aproximativ 3,2% din bolnavii cu enterită, iar C. lari provoacă diaree sau crampe abdominale severe.

Transmiterea bacteriei la om se face pe cale alimentară.

3.3. Tabloul anatomopatologic

Leziunile sunt destul de variate și inconstant întâlnite. În mod deosebit atrag atenția leziunile hepatice a căror gravitate este dependentă de tipul evolutiv al bolii. În forma acută ficatul este de dimensiuni normale sau ușor mărit în volum și cu prezență de focare necrotice solitare sau confluente, cu marginile neregulate și de culoare alb-gălbuie sau gri gălbuie. La pui se întâlnesc frecvent hemoragii hepatice, localizate subcapsular pe marginea lobilor și pe parenchim. În pereții vezicii biliare, care poate fi dilatată, se pot găsi focare necrotice miliare.

Mai rar sunt semnalate o ușoară splenomegalie însoțită sau nu de leziuni punctiforme, miocardoză, epicardită hemoragică, peritonită seroasă. La unele păsări se găsesc leziuni de enterită catarală, cataral-hemoragică sau fibrino-necrotică, obișnuit difuză. În forma cronică se întâlnește degenerescența foliculilor ovarieni, splenomegalie, hipertrofie.

Examenul histopatologic al ileonului și al sacilor cecali relevă edemul mucoasei și prezența lui C. jejuni la suprafața eritrocitelor, uneori și atrofia vilozităților, cu acumularea de mucus, eritrocite și celule inflamatorii în lumenul intestinal. Microscopic, în ficat se evidențiază infiltrație periportală, distrofie grasă, focare necrotice, hiperplazia mezenchimală.(14)

3.4. Diagnostic clinic și de laborator

Diagnosticul clinic nu este posibil, tabloul de enterită, enterocolită sau gastroenterocolită bacteriană neavând nimic caracteristic. Manifestările clinice coroborate cu datele epidemiologice pot contribui la fixarea unui diagnostic prezumtiv, care orientează pe clinician către examenul de laborator.(Guguianu E., 2002)

Diagnosticul diferențial se face față de celelalte enterocolite acute, dizenteria, colita ulceroasă, boala Crohn. O problemă de diagnostic apărută în ultimii ani este aceea a sindromului Guillain-Barre, care după diagnosticarea pe baza semnelor clinice neurologice, trebuie investigat asupra legăturii lui cu enterita produsă de C. jejuni.

Diagnosticul de laborator el enterocolitei acute campilobacteriene se bazează pe examenul microbiologic prin culturi al probelor de fecale de la bolnavi sau, în cazul formelor sistemice, cu bacteriemii, și al probelor de sânge. Acest examen este relativ simplu și constă în strierea pe suprafața agarelor selective de izolare a materialelor clinice, care, de regulă, conțin în exclusivitate (cazul sângelui) sau în număr dominant (cazul fecalelor) celule de campilobacterii.(Ieniștea C., 1982)

Un diagnostic prezumtiv rapid se poate pune prin vizualizarea bacteriei din fecale prin examinarea microscopică a frotiurilor făcute din fecale și colorate prin metoda Gram sau prin examinarea microscopică în contrast de fază a preparatelor native.

Infecția cu C. jejuni determină apariția anticorpilor specifici în serul bolnavilor, dar aceștia ating titruri de diagnostic, după ce semnele clinice au dispărut.

C. jejuni persistă în fecale un timp limitat, de obicei mai scurt de 3 săptămâni. În general examenul bacteriologic al fecalelor, în vederea stabilirii precise a diagnosticului, este eficient numai în prima săptămână de boală. Întrucât în această fază acută a bolii, C. jejuni se găsește în număr foarte mare sau reprezintă microflora dominantă din fecale, izolarea bacteriei se face relativ ușor prin strierea diluțiilor de fecale pe suprafața mediilor selective. Din contra, alimentele conțin un număr mic de celule campilobacteriene și mult mai multe celule de bacterii concurente. Din această cauză, izolarea din alimente necesită totdeauna o fază de îmbogățire selectivă.

Marea majoritate a speciilor de Campylobacter, printre care si C. jejuni, pentru a fi cultivate au nevoie de o atmosferă de incubare microaerobă, formată din 5%O2 , 10%CO2, și 85%N2 . Această atmosferă se poate obține pe diferite căi. Multe firme livrează în prezent aparate speciale cu atmosferă controlată cum ar fi –incubatorul Cytocell în mediu cu CO2, model 500 Anaerostat, producător MMM Medcenter Germania.

PARTEA a II a

CERCETĂRI PROPRII

CAPITOLUL 4

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII

În ciuda măsurilor luate pentru siguranța alimentelor, amenințarea bolilor cauzate de bacteriile din genul Campylobacter, din carne, din produsele lactate sau din fructe și legume este din ce în ce mai mare.

Cu toate acestea sunt menționate suficiente episoade care să justifice încercarea noastră de a evidenția prezența acestor microorganisme în alimente. Sursele primare de infecție sunt reprezentate de animale bolnave, cadavre, fecale, urina precum și laptele și carnea în care se găsesc tulpini patogene de Campylobacter jejuni.

Se cunoaște faptul că specia Campylobacter jejuni se găsește frecvent în intestinul animalelor și al păsărilor domestice (Bărzoi D.,1985).

Toate acestea devin argumente pentru sesizarea factorului de risc prin contaminarea cu Campylobacter jejuni. Toxinele și enterotoxinele pe care acesta le elaborează sunt elementele principale de patogenitate prin care se declanșează mecanismul toxiinfecțiilor alimentare la om.

Scopul acestor cercetări a constat în punerea în evidență a bacteriilor din genul Campylobacter (Campylobacter jejuni), pe carcasele proaspete și în conținutul cecal la puii broiler și rezistența acestora la procesele de refrigerare și congelare.

Cercetările au avut la bază, următoarele obiective:

Izolarea și identificarea speciei Campylobacter jejuni pe suprafața carcaselor și în conținutul cecal al puilor broiler;

Observarea caracterelor morfologice specific specie Campylobacter jejuni;

Testarea rezistenței specie Campylobacter jejuni la temperature de refrigerare și congelare.

CAPITOLUL 5

CERCETĂRI BACTERIOLOGICE PRIVIND IZOLAREA ȘI IDENTIFICAREA SPECIEI CAMPYLOBACTER JEJUNI

5.1. Material și metodă

În perioada 2014-2015 au fost investigate bacteriologic 200 carcase pui broiler și 75 probe de conținut cecal în scopul izolării speciei Campylobacter jejuni și a testării rezistenței acesteia la temperaturi scăzute.

Efectuarea examenelor a urmărit depistarea prezenței Campylobacter jejuni în probele de piele din regiunea gâtului și în cecumul de pui broiler.

5.2. Aparatura și sticlăria necesară

Aparatura, sticlăria, mediile de cultură și alte materiale utilizate pe parcursul lucrării, au fost cele recomandate de STAS SR EN ISO 10272/2/2007.

Anaerostat reglabil Cytocell (Fig. 5.1.);

Fig. 5.1. Anaerostat Cytocell

Incubator, reglabil între 250C – 370C;

Baie de apă, reglabilă între 440C și 470C;

Balanță electronică;

pH-metru, cu exactitate de 0,1 unități pH la 250C;

Recipiente, de exemplu sticle, eprubete, flacoane, corespunzătoare pentru sterilizare și depozitare diluanți și medii de cultură;

Cutii Petri, de preferat cu rugozități, de sticlă sau plastic, cu diametrul de 90 mm până la 100 mm;

Pipete gradate cu scurgere totală, cu vârf lărgit și capacitate nominală de 1 ml și 10 ml, gradate cu diviziuni de 0,1 ml;

Pară de cauciuc, sau orice alt sistem de siguranță capabil să fie adaptat la pipete gradate;

Anse sterile, de platină/iridiu, nichel/crom sau plastic, de aproximativ 3 mm diametru și sub formă de sârmă din același material sau baghetă de sticlă sau plastic;

Instrument de întindere, de sticlă sau plastic;

Microscop cu contrast de fază (pentru a se observa caracteristica de mobilitate a Campylobacter).

5.3. Medii de cultură

5.3.1. Bulion Bolton-mediu de bază

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, în apă, prin aducere la fierbere.

Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,4±0,2 la 250C. Se repartizează mediul de bază în flacoane de capacitate corespunzătoare. Se sterilizează în autoclavă fixată la 1210C timp de 15 min (Fig. 5.2. )

Fig . 5.2. Bulion Bolton – forma comercială

5.3.2. Agar modificat cu cărbune cefoperazonă deoxicolat (agar mCCD)-mediu de bază

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, în apă, prin aducere la fierbere.

Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,4±0,2 la 250C. Se repartizează mediul de bază în flacoane de capacitate corespunzătoare. Se sterilizează în autoclavă fixată la 1210C timp de 15 min (Fig. 5.3.)

Fig. 5.3. Mediu bază mCCD – forma comercială

5.3.3. Soluția de antibiotic

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentele în apă. Se sterilizează prin filtrare.

5.3.4. Mediu complet

Compoziție

Preparare

Se adaugă soluția de antibiotic la mediul de bază, răcit la 470C ± 20C, apoi se omogenizează cu atenție. Se toarnă circa 15 ml mediu complet în cutii Petri sterile.

Se lasă să se solidifice. Chiar înainte de folosire, se usucă cu atenție plăcile de agar, de preferat fără capace și cu suprafața agarului orientat în jos, într-o etuvă de uscare timp de 30 min sau până când suprafața agarului este lipsită de umiditate vizibilă. Dacă au fost preparate înainte, plăcile de agar neuscate nu se păstrează mai mult de 4 h la temperatura ambiantă, sau la întuneric la 50C ± 30C mai mult de 7 zile.

5.3.5. Agar Karmali- mediu de bază

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, în apă, prin aducere la fierbere.

Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,4±0,2 la 250C. Se repartizează mediul de bază în flacoane de capacitate corespunzătoare. Se sterilizează în autoclavă fixată la 1210C timp de 15 min (Fig. 5.4.)

Fig. 5.4. Mediu bază Karmali forma comercială

5.3.6. Campylobacter Selective Supplement (Karmali)

Compoziție/ flacon pentru 500 ml mediu bază(Karmali)

Preparare

Se dizolvă componentele de bază în 2 ml – ethanol: apă distilată (în proporție de 1:1) apoi se adaugă in mediul de bază topit și răcit la 470C±20C, apoi se omogenizează cu atenție. Se toarnă circa 15 ml mediu complet în cutii Petri sterile. Se lasă să se solidifice. Chiar înainte de folosire, se usucă cu atenție plăcile de agar, de preferat fără capace și cu suprafața agarului orientat în jos, într-o etuvă de uscare timp de 30 min sau până când suprafața agarului este lipsită de umiditate vizibilă. Dacă au fost preparate înainte, plăcile de agar neuscate nu se păstrează mai mult de 4 h la temperatura ambiantă, sau la întuneric la 50C ± 30C mai mult de 7 zile.

5.3.7. Agar cu sânge Columbia-mediu de bază

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, în apă, prin aducere la fierbere.

Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,3±0,2 la 250C. Se repartizează mediul de bază în flacoane de capacitate corespunzătoare. Se sterilizează în autoclavă fixată la 1210C timp de 15 min (Fig. 5.5.).

Fig. 5.5. Mediu bază agar Columbia – forma comercială

5.3.8. Sânge de oaie defibrinat steril-mediu complet

Compoziție

Preparare

Se adaugă aseptic sângele la mediul de bază, răcit la 470C±20C, apoi se omogenizează cu atenție. Se toarnă circa 15 ml mediu complet în cutii Petri sterile. Se lasă să se solidifice. Chiar înainte de folosire, se usucă cu atenție plăcile de agar, de preferat fără capace și cu suprafața agarului orientat în jos, într-o etuvă de uscare timp de 30 min sau până când suprafața agarului este lipsită de umiditate vizibilă.

Dacă au fost preparate înainte, plăcile de agar neuscate nu se păstrează mai mult de 4 h la temperatura ambiantă, sau la întuneric la 50C±30C mai mult de 7 zile la 50C ± 30C.

5.3.9. Bulion Brucella

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentele de bază sau mediul de bază complet, deshidratat, în apă, prin încălzire dacă este necesar.

Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, așa încât după sterilizare să fie 7,0±0,2 la 250C.Se repartizează mediul în cantități de 10 ml în eprubete de capacitate corespunzătoare. Se sterilizează în autoclavă fixată la 1210C timp de 15 min.

5.4. Reactivi

Reactivii utilizați pentru confirmarea biochimică a tulpinilor izolate, au fost: reactiv pentru detecția oxidazei, reactiv pentru detectarea hidroliza hippurate, ninhydrin soluție de 3,5%, și discuri cu Indoxyl acetat. (Fig. 5.6.)

Reactiv pentru detecția oxidazei

Compoziție

Preparare

Se dizolvă componentul în apă chiar înainte de folosire.

Reactiv pentru detectare hidroliză hipurat-soluție de hipurat de sodiu

Compoziție

Preparare

Se dizolvă Hippurat de sodiu în soluție PBS. Se sterilizează prin filtrare. Se distribuie reactiv aseptic, în cantități de 0,4 ml în tuburi mici, de capacitate corespunzătoare. Se păstrează la aproximativ -200C.

Ninhydrin soluție de 3,5% (masă/volum)

Compoziție

Preparare

Se dizolvă Ninhydrin într-un amestec de acetonă/butanol. Se păstrează soluția la frigider pentru o perioadă de maxim 1 săptămână, la întuneric.

Discuri cu Indoxyl acetat

Compoziție

Preparare

Se dizolvă Indoxyl acetatul în acetonă. Se adaugă 25µl din această soluție, pe discurile de hârtie goală. După uscare la temperatura camerei, discurile se păstrează la 4oC într-un tub de sticla maro sau în prezența silicagelului.(Fig. nr. 6)

Fig. 5.6. Reactivii utilizați pentru testarea tulpinilor de Campylobacter spp.

Modul de utilizarea a reactivilor este următorul: intr-o placa Petri în care s-a turnat agar nutritiv, se pune la uscat în etuvă, apoi se face o suspensie într-o soluție de NaCl 2% cu colonii izolate de Campylobacter, luate de pe mediul selectiv mCCD. Apoi se inundă suprafața mediului cu 0,1-0,2 ml din suspensia obținută. Se lasă 2-3 min. pentru a pătrunde inoculul, după care se aplică dischetele cu reactivii mai sus menționați. Placa astfel inoculată se termostatează la 41,50C timp de 24 h, (Fig. 5.6.)

Fig. 5.6. Culturi de Campylobacter spp și reactivi utilizați pentru identificare

5.5. Protocolul de lucru

Pentru identificarea speciei Campylobacter jejuni a fost utilizat standardul

SR EN ISO 10272/2/2007 (Fig. 5.7).

5.6. Izolarea și identificarea bacteriilor din Genul Campylobacter din carcasele de pui broiller

Pregătirea probei pentru analiză

Se pregătește proba pentru analiză conform cu standardul internațional specific, care se referă la produsul respectiv. Dacă nu există un standard internațional specific, se recomandă ca părțile implicate să ajungă la un acord referitor la acest subiect.

Mod de lucru

Din proba de analizat se iau 25g probă (din pielea gâtului) cu 225 ml bulion Bolton, într-un balon Elermayer. Se incubează la 370C 4-6 h apoi la 41,50C 44h.

Inoculare și incubare

Se transferă cu o pipetă strilă 0,1ml din bulionul Bolton în două plăci Petri cu mediu agar mCCD, Se etalează cu atenție inoculul, uniform și cât se poate mai repede, pe suprafața plăcii de agar, fără să atingă marginile plăcii, folosind un instrument de intindere până când nu mai există nici un pic de lichid vizibil pe suprafața agarului. Se incubează plăcile la 41,50C timp de 40-48 h în atmosferă microaerobă.

Enumerarea și selectarea coloniilor pentru confirmare

Pe Agar mCCD coloniile tipice sunt cenușii, adesea cu un luciu metalic, plate și umede, cu o tendință de împrăștiere. Coloniile se împrăștie mai puțin pe suprafețe de agar uscate. Pot să apară și alte forme de colonii. Se selectează plăcile care conțin mai puțin de 150 colonii tipice sau suspecte, se numără aceste colonii. Apoi se aleg la întâmplare 5 astfel de colonii pentru subcultivare în scopul analizelor de confirmare. Se însămânțează în linie dreaptă coloniile selectate pe o placă de agar cu sânge Columbia pentru a permite dezvoltarea de colonii bine izolate. Se incubează plăcile în atmosferă microaerofilă la 41,50C timp de 24-48 h .

Culturile pure se folosesc pentru examen morfologic, mobilitate, creștere microaerobă la 250C, creștere microaerobă la 41,50C 0C și prezența oxidazei.

Confirmarea speciilor de Campylobacter

Deoarece bacteriile se deteriorează rapid la aer se efectuează modul de lucru descris mai jos fără întârziere.

Examinarea morfologiei și a mobilității

Se suspendă o colonie de pe placa de agar cu sânge Columbia în 1 ml bulion Brucella și se examinează pentru morfologie și mobilitate folosind un microscop.

Se rețin pentru examinare ulterioară toate culturile în care s-au găsit bacili curbați cu mobilitate de tirbușon spiralat.

Studiu de creștere la 250C (microaerob) și la 41,50C (aerob)

Folosind colonii izolate, se inoculează, cu ajutorul unei anse suprafața unei plăci de agar cu sânge Columbia. Se incubează o placă la 250C în atmosferă microaerobă timp de 40 h până la 48 h. Se incubează cealaltă placă la 41,50C în atmosferă aerobă timp de 40 h până la 48 h. Se examinează plăcile pentru creșteri vizibile de colonii de Campylobacter.

Detecția oxidazei

Folosind o ansă de platină/iridiu sau o baghetă de sticlă, se ia câte o porțiune dintr-o colonie bine izolată de pe fiecare placă individuală și se transferă pe o hârtie de filtru umectată cu reactiv pentru detecția oxidazei. Apariția culorii mov, violet sau albastru intens în 10 s indică reacția pozitivă.

Interpretare

În urma examenul microbiologic efectuat pe probelor prelevate de pe carcasele de pui broiler s-au obținut rezultatele sistematizate în Tabelul 5.1. și Tabelul 5.2.

Tabelul 5.1.

Caracteristici ale Campylobacter spp.

Confirmarea rezultatelor a fost posibilă prin controale pozitive și negative cu tulpini de Campylobacter.

Tulpinile de control corespunzătoare sunt Campylobacter jejuni NCTC 11351 (probă de control pozitivă) și Campylobacter lari NCTC 11352 (probă de control negativă).

Tabelul 5.2.

Criterii de diferențiere a speciilor genului Campylobacter

5.7. Izolarea și identificarea bacteriilor din Genul Campylobacter din cecumul de pui broiller

Pregătirea probei pentru analiză

Cecumul de pasăre a fost dezinfectat cu alcool etilic absolut timp de 2-3 minute, apoi a fost uscat într-o placă Petri. (Fig. 5.8.). S-a tăiat vârful cecumului și s-a recoltat din conținut, utilizând o pipetă Pasteur, (Fig. 5.9. și Fig. 5.10.). Însămânțarea s-a efectuat pe mediul solid mCCD pentru izolare (Fig. 5.11.).

Fig. 5.8. Cecumuri de pasăre

Fig. 5.9. Secționarea apexului cecal

Fig.10. Recoltare conținutului cecal

Fig. 5.11 Însămânțare pe Agar mCCD

Incubare

Incubarea s-a realizat în mediu cu 10%CO2, la 41,50C pentru 48h.

Confirmarea biochimică

Departajarea speciilor în cadrul genului Campylobacter se bazează pe testele biochimice și sensibilitatea față de unele antibiotice (Tabelul 5.3.)

Tabelul 5.3.

Rezultatele testelor biochimice pentru diferite specii din genul Campylobacter

5.7.1. Testele biochimice de identificare a speciilor de Campylobacter

Hidroliza hipuratului de Na

în două tubulețe mici cu soluție de hipurat de Na 1% se introduce cultură din placă (se prelevează cu tampoane mici) ;

a doua zi se adaugă sol. de ninhidrină 3,5% iar tuburile se introduc la termostat la 370C 10 min.

Interpretare

În cazul probei pozitive apare culoarea albăstrui-violet, la cele negative – culoare galben –pal.

Hidroliza indoxil acetat

Se prelevează cu ansa, cultură din placa cu agar Columbia se dispune pe suprafața benzii impregnată cu endoxil acetat și apoi se umectează cu apă distilată – o picătură.

Interpretare – apare în timp la locul de descărcare al ansei o culoare violet-negru

Catalaza- se dispune pe lamă o picătură apă oxigenată 3 %, apoi se prelevează cultura și se dispune picătura, se omogenizează și apare reacția de efervescență în cazul reacției pozitive.

Oxidaza- se dispune pe lamă hârtie de filtru + reagent pentru oxidază + cultura și apoi se pune reagentul de oxidază

Interpretare- reacția pozitivă apare culoarea negru – violet.

Aspecte culturale pe agar Columbia – colonii mici,mijlocii în gazon, semitransparente sau semiopace, lucioase (tip S) nehemolitice. Nu este o regulă dar de obicei – colonii mici, să fie de C. jejuni și colonii mai mari de C. coli.

Antibiograma – metoda difuzimetrică – se testează sensibilitatea la eritromicina, tetraciclină, streptomicină, ciprofloxacină, gentamicină.

Aprecierea concentrației minime inhibitorii (CMI) se face în funcție de diametrul zonei de inhibiție.

CAPITOLUL 8

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Menționăm faptul că cercetările noastre au avut drept scop izolarea și identificarea speciei Campylobacter jejuni deoarece este o bacterie cu potențial patogen crescut, capabilă să producă toxiinfecții alimentare la om.

S-a urmărit apoi testarea rezistenței acestei specii bacteriene la temperatura de refrigerare și congelare.

Primele 100 probe de piele din regiunea gâtului, din cele 200 recoltate în abator imediat după sacrificarea puilor, au fost examinate microbiologic în stare proaspătă (după 1-2 ore de la prelevare) și după refrigerare timp de 72 ore la temperatura de 40C.

Celelalte 100 probe au fost examinate în stare proaspătă și după congelate timp de 1 lună la temperatura de -180C.

Culturile s-au dezvoltat după 2-4 zile de incubație în anaerostat la temperatura de 41,50C.

Identificarea culturilor obținute pe mediile speciale de izolare pentru campilobacterii s-a efectuat pe baza caracterele culturale, morfologice, biochimice și a sensibilității la acid nalidixic și cephalotin, în conformitate cu cerințele STAS SR EN ISO 10272/2/2007.

Caracterele culturale

Pe agar mCCD coloniile considerate tipice pentru Campylobacter spp. au fost cele de culoare cenușie, uneori cu luciu metalic, plate și umede, cu tendința de a se întinde de-a lungul striurilor (Fig. nr.12).

Fig .12. Mediul mCCD izolare Campylobacter jejuni.

Pe agarul sânge Columbia, coloniile transplantate de pe mediul mCCD au format culturi nehemolitice după 24-48 ore de incubare.

În culturile de 24 ore coloniile au avut un diametru de 1-2 mm și uneori au putut fi observate numai la o examinare atentă a suprafeței mediului (Fig.nr. 13A).

În culturile de 48 ore creșterea a fost mai abundentă, coloniile ajungând la un diametru de 4-6 mm.(Fig.13B).

A

B

Fig .13. Culturi de Campylobacter jejuni pe agar sânge Columbia:

A – cultură de 24 ore; B – cultură de 48 ore.

Caracterele morfologice

La examenul bacteriilor în stare vie s-au observat bacili curbați, foarte mobili, cu mișcări de rotație sau mișcări anarhice în câmpul microscopic.

În frotiurile colorate Gram, efectuate din coloniile caracteristice, de 24 ore, s-au observat celule bacteriene tipice: bacili Gram negativi de 1-2µm lungime, în forma literelor „S” și „C” (Fig. nr.14).

Fig.14 Campylobacter spp. – frotiu din cultură de 24 ore.

Colorație Gram(x1000)

În frotiurile efectuate din culturi de 48 ore, pe lângă formele caracteristice au fost prezente numeroase forme cocoide, slab colorate, atipice, care reprezintă celulele degenerate prin procesul de îmbătrânire (Fig. nr.15).

Fig.15 Campylobacter spp. – frotiu din cultură de 48 ore.

Colorație Gram(x1000)

Procesul de degenerescență a celulelor bacteriene de Campylobacter spp., determinat de învechirea culturilor, menționat și în literatură (22), prezintă importanță practică deoarece în acest stadiu apar nu numai modificări morfologice ci și fiziologice, care ar putea genera erori de identificare.

Caracterele biochimice

Primul test biochimic care s-a efectuat pe coloniile caracteristice pentru confirmarea genului a fost testul oxidazei. Campilobacteriile sunt oxidază pozitive, adică în prezența reactivului culturile se colorează în mov (Fig.nr. 16).

Fig.16. Testul oxidazei

Testul care a servit la departajarea speciei Campylobacter jejuni de celelalte specii ale genului a fost testul de hidroliză a hipuratului de Na pozitiv (Tabelul nr.6).

Tabelul nr. 6

Rezultatele privind contaminarea carcaselor proaspete de pui broiller cu specia Campylobacter jejuni și efectele procesului de refrigerare asupra acestui contaminant sunt redate sintetic în tabelul nr. 7.

Analiza datelor din tabel relevă faptul că din cele 100 carcase investigate, 14 carcase (14%) au fost contaminate cu specia Campylobacter jejuni . În urma procesului de refrigerare a carcaselor timp de 72 ore la temperatura de 40C, bacteria a mai fost izolată doar de pe 3 carcase (3%), ceea ce înseamnă că la temperatura frigiderului are loc o reducere cu 21 % a acestor germeni.

Tabelul nr. 7

Prezența speciei Campylobacter jejuni / 25g. piele din regiunea gâtului la carcasele proaspete și refrigerate

Rezultatul congelării asupra bacteriilor din specia Campylobacter jejuni sunt sistematizate în tabelul nr. 8.

Tabelul nr. 8

Prezența speciei Campylobacter jejuni / 25g. piele din regiunea gâtului la carcasele proaspete și congelate

Datele din tabel arată că incidența contaminării cu Campylobacter jejuni la cele 100 probe investigate în stare proaspătă, a fost mai mare comparativ cu primele 100 probe (20% față de 14 %), dar prin procesul de congelare incidența s-a redus cu 35% (față de numai 21 % prin refrigerare).

Per ansamblu, rezultatele cercetărilor efectuate demonstrază că specia Campylobacter jejuni este sensibilă la temperaturile scăzute, congelarea fiind mai eficientă decât refrigerarea (Fig.nr.17).

Fig.17. Reprezentarea grafică

Examenele bacteriologice pentru depistarea speciei Campylobacter jejuni în conținutul cecumurilor s-au soldat cu rezultate pozitive la 11 (14,6 %) din cele 75 probe investigate (tabelul nr. 9).

Tabelul nr.9

Incidența speciei Campylobacter spp. în cecumuri

Rezultatele obținute confirmă datele din literatură potrivit cărora păsările sunt purtătoare de Campylobacter spp. și constituie sursa de contaminare a carcaselor în timpul procesului de eviscerare (9).

Concluzii

În perioada 2008-2010 au fost investigate bacteriologic 200 carcase pui broiller și 75 probe de conținut cecal în scopul izolării speciei Campylobacter jejuni și a testării rezistenței acesteia la temperaturi scăzute.

Investigațiile s-au desfășurat în conformitate cu prevederile STAS SR EN ISO 10272/2/2010.

Incidența speciei Campylobacter jejuni a fost de 34% pe carcase și 14,6 % în conținutul ceccumurilor.

Procesul de refrigerare a redus incidența speciei Campylobacter jejuni pe carcase cu 21%, iar procesul de congelare cu 35%.

BIBLIOGRAFIE

1. Apostu S., 2006 – Microbiologia produselor alimentare. Vol. I.,Editura Risoprint, Cluj Napoca.

2. Atanassova Viktoria and Christian Ring , 1999– Prevalence of Campylobacter spp., in poultry and poultry meat in Germania, Mirobiology. Vol.51, pag. 187-190.

3. Baqar S. și col., – Immunogenicity and protective efficacy of a prototype Campylobacter killed whole-cell vaccine in mice.

4. Bărzoi D., 1985 – Microbiologia produselor alimentare de origine animală, Ed. Ceres, București.

5. Bărzoi D., Meica I., Marian Neguț, 1999 – Toxiinfecții alimentare, Ed. Diacon Coresi, București.

6. Bărzoi D., 1985 – Toxiinfecție alimentară frecventă dar puțin cunoscută, produsă de Campylobacter fetus subsp. Jejuni. Rev. De creșterea animalelor, 8,55.

7. Bărzoi D., Natalia Maier, Lidia Tuluș, 1985, – Incidența bacteriei C. jejuni în unele produse de origine animală. Lucrare prezentată la L.C.C.P.O.A.F. București.

8. Bondoc I.,Șindilar E.V.,2002- Controlul sanitar veterinar al calității și salubrității alementelor. Vol. I Editura „Ion Ionescu de la Brad” Iași.

9. Crețu Carmen, 2009 – Cercetări privind dinamica microflorei din carnea de pasăre proaspătă refrigerată și congelată în funcție de pH și temperatură. Teză de Doctorat, F.M.V. Iași.

10. Guguianu E., 2002 – Bacteriologie generală, Casa de Editură Venus, Iași

11. Handan A. Dincer and Taner Baysal, 2004 – Decontamination Technizues of Pathogen Bacteria in Meat and Poutry, Critical Reviews in Microbiology, 30: 197-204.

12. Ieniștea C., 1982 – Procedeu simplu de izolare și studiere a bacteriilor anaerobe, Bact. Virus. Parazit. Epidemiol.,Vol.27, Nr. 1, p. 29.

13. O.M.S., 1984 – Raportul Organizației Mondiale a Sănătății asupra sănătății publive veterinare privind prevenirea ți combaterea infecțiilor produse de Campylobacter.Reuniunea de la Moscova, 20-22 febr.

14. Perianu T., 2003 – Boli infecțioase ale animalelor. Bacterioze. Vol. I, Editura Venus, Iași.

15. Păun L. și col., 1983 – Infecția cu Campylobacter v. jejuni. Studiu clinic pe 60 cazuri. Viața Medicală, 30,125.

16. Rusu V., C. Nițulescu, M. Kovaci, 1986 –Incidența C. jejuni/coli la porcine și păsări. Bacteriol., 31,303, București.

17. Rusu V., și col., 1988 – Infecții sistemice cu Campylobacter jejuni. Viața Medicală, 34, 87..

18. Salloway S. și col., 1996 – Miller-Fisher syndrome associated with Campylobacter jejuni bearing lipopolysaccharide molecules that mimic human ganglioside GD -3.Inf.Immun.,, 64,2945.

19. STAS SR EN ISO 10272/2/2007 – Microbiologia alimentelor și nutrețurilor. Metode orizontale pentru detectarea și enumerarea Campylobacter spp.Partea 1: Metodă de detectare.

20. Stern N.J. și col, 1992- A differential selective medium and dry ice-generated atmosphere for recovery of Campylobacter jejuni, 55,514.

21. Șindilar E., 1996 – Expertiza sanitară veterinară a produselor de origine animală vol. I Editura „CENTRALĂ” Chișinău, Republica Moldova.

22. Timofte Dorina,1998 – Cercetări bacteriologice asupra Genului Campylobacter izolat de la animale și implicații epidemiologice. Teză de Doctorat, F.M.V Iași.