Polimorfisme Genetice Si Mecanisme Implicate In Aparitia Distrofiei Mumusculare Duchenne

Cuprins

REZUMAT

Distrofia musculară Duchenne și Becker ( DMD, respectiv BMD ), sunt boli musculare progresive, cu transmitere ereditară, datorate unor mutații la nivelul genei DMD, care codifică proteina distrofinei, exprimată în principal la nivelul musculaturii scheletice, netede și cardiace; Distrofia musculara Duchenne, fiind forma cea mai severă și frecventă a distrofiilor musculare.

Distrofina este proteina responsabilă de stabilitatea fibrelor musculare, astfel, absența distrofinei va avea ca rezultat pierderea progresivă a țesutului muscular și implicit a funcției musculare.

De-a lungul timpului s-a încercat dezvoltarea unor terapii noi și îmbunătățirea celor existente, pentru a stopa avansarea bolii și pentru îmbunătățirea simptomatologiei acesteia. Unele terapii sunt, și la ora actuală, încă în faza de studiu. Dintre terapiile studiate cea mai eficientă pare a fi: mecanismul de prelucrare alternativă a transcriptelor – ignorarea exonului ( exon skipping ).

Datorită dezvoltării bionformaticii, ramură a geneticii, este posibil accesul la informațiile și studiile efectuate asupra unei gene, proteine și mutații, care sunt structurate în baze de date.

CUVINTE CHEIE: distrofia musculara Duchenne, distrofina, gena DMD, țesut muscular, terapii, mutații.

Polimorfisme genetice și mecanisme implicate în aparitia  distrofiei musculare Duchenne

GENERALITĂȚI BOALĂ

Distrofia musculară Duchenne a fost descrisă pentru prima oară de catre Edward Meryon in 1851 și este cea mai frecventă și mai severă boală musculară cu transmitere ereditară, cu o incidență de ~1 la 4000 de nou născuți de gen masculin. Femeile nu sunt afectate de boală fiind doar purtatoare datorită localizării mutației care cauzeaza DMD pe cromozomul X. Prin urmare numai masculii (un singur cromozom X pot fi afectați de diferite forme de DMD în timp ce la femei, prezența a 2 cromozomi X, permite compensarea defectului) (Fig. 1.1.1)

Distrofia musculară Duchenne este, de obicei recunoscută în al treilea an de viață dar jumatăte din pacienți prezintă semne de boală înainte de a începe să umble. Primele semne care atrag atenția sunt: incapacitatea de a merge sau alerga când copiii în mod normal ar fi deprins aceste aptitudini sau copiii apar mai puțini activi decât normal și cad cu usurința, dificultatea de a se ridica de jos (maniera Gowers – prin care copilul își sprijină mainile pe podea, apoi pe coapse, pentru a-și ridica in sus partea superioara a corpului). [Allsop et Ziter, 1981].

Fig. 1.1.1 Transmiterea distrofiei musculare Duchenne prin intermediul unei mame purtătoare a mutației

Distrofia musculară Duchenne este o boală musculară progresivă, severă, provocată de mutații ale genei DMD care codifică distrofina. Distrofina conferă stabilitate fibrelor musculare în timpul exercițiului fizic iar absența distrofinei duce la o pierdere progresivă de țesut muscular și a funcției musculare. Pentru rezolvarea problemelor apărute de disfuncțiile genei, în prezent există mai multe abordări terapeutice, aflate în diferite stadii de dezvoltare.

Formele de distrofii musculare, Duchenne, Becker (DMD și respectiv DMB) sunt provocate de mutații ale genei DMD care codifică distrofina.

TABLOUL CLINIC AL DISTROFIEI MUSCULARE DUCHENNE

Cu trecerea timpului crește dificultatea de a merge pe jos, alergatul, urcatul scărilor. Primii mușchi afectați sunt: cvadriceps, iliopsoas și fesieri. Mușchii abdominali, ai umărului și cei ai membrelor superioare sunt afectați mai târziu. In final, mușchii ajung să își reducă volumul, membrele sunt de obicei hipotone și moi, dar odată cu progresia bolii apar contracții datorită menținerii membrelor în aceeași poziție și lipsei de echilibru între mușchii antagoniști și agoniști. Reflexele tendoanelor la început scad iar apoi dispar odată cu pierderea fibrelor musculare; ultimele refelexe care dispar sunt reflexele lui Ahile (Fig. 2.2.2). Se observă o stare de hipertrofie cauzată de îngroșarea fibrelor sănătoase, comparativ cu fibrele adiacente neutilizate. Ulterior, adevărata hipotrofie va fi înlocuită de o pseudohipotrofie ca urmare a înlocuirii fibrelor degenerate cu țesut adipos. La capete fibrele degenerează și dispar, ramânând astfel doar câteva fibre musculare împrăștiate, aproape pierdute într-o mare de adipocite (Fig. 2.2.3). Oasele devin subțiri și demineralizate. Până la vârsta de 10-12 ani ajunge ca motricitatea autonomă să fie pierdută în totalitate. Un alt aspcet al bolii care afectează circa 30% din pacienți, se referă la deficitul cognitiv, exprimat prin dificultăți de învațare și probleme de vorbire.

Fig. 2.2.2 Fazele bolii: A – la naștere și primii ani normali; B – pierderea progresivă a forței musculare; C – Pierderea motricității;

Fig. 2.2.3 Secțiune transversală a mușchiului scheletic colorată cu hematoxilină/eozină. Stânga: Secțiune prin mușchi sănătos; Dreapta: Secțiune de la pacient cu DMD stadiu avansat.

În tabloul clinic al acestei boli apare și deprecierea mușchilor respiratori, agravându-se starea sănătății, fiind nevoie de ventilație mecanică. În jurul varstei de 6 ani se manifestă de asemenea și o implicare a miocardului, ce poate conduce la diagnosticul de cardiomiopatie dilatativă. [Nigro et colab, 1983].

Moartea are loc în a doua sau a treia decadă a vieții datorită complicațiilor de la nivel respirator și/sau de la nivelul inimii. [Dubowitz 1995, Engel și colab.,, 1994].

CAUZELE APARIȚIEI BOLII

Deficiența în celulele musculare este datorată unor mutații la nivelul genei care codifică sinteza distrofinei. Defectele genetice includ modificări atât în gena care codifică distrofina cât și în glicoproteinele asociate – sarcoglicanii (distroglicanul și laminina) care mențin stabilitatea membranelor. Distrofina, împreuna cu distroglicanul și laminina, constituie legătura mecanică dintre citoscheletul actinic al fibrei musculare și matricea extracelulară.  În urma producerii deficienței proteinei distrofinei, în celulele musculare apare o scădere a nivelului de ditrofină-glyproteine (DGC), rezultând fenotipuri severe a bolii DMD.

Datorită absenței distrofinei funcționale, fibrele musculare sunt deteriorate continuu în timpul contracțiilor. Această deteriorare și/sau activare mărită a canalelor calciului prin întindere are drept rezultat nivele mărite ale ionului de calciu, Ca2+ în fibre. [Deconinck et colab., 2007]

Această situație activează în continuare calpainele (proteaze) și duce, de asemenea, la deteriorarea mitocondriilor care produc stresul oxidativ în fibrele musculare. Ambele procese cresc gradul de deteriorare a fibrei musculare. Datorită naturii persistente a deteriorării, mușchii sunt inflamați cronic. Celulele inflamatorii produc citokine și alte toxine care deteriorează și mai mult celulele musculare și, de asemenea, împiedică regenerarea mușchilor și măresc formarea fibrozei. În consecință, fibrele musculare se pierd continuu, procesul de regenerare musculară este deteriorat și, în cele din urmă mușchiul este înlocuit cu țesut fibros și adipos iar funcția musculară se pierde progresiv (Fig. 3.3.4). Datorită deteriorării fibrei musculare, enzima specifică mușchilor, creatininkinaza, pătrunde în fluxul sanguin și nivelul ei este mult mai ridicat la pacienții mai tineri. [Grounds et colab., 2008].

Fig. 3.3.4 Secțiune transversală a unui mușchi sănătos, unde distrofina este funcțională(stânga); Secțiune prin mușchi afectat de DMD, distrofina este absentă(dreapta)

Procesul de diagnosticare poate fi făcut prin urmărirea creșterii creatin-kinazei (CK) în sânge, enzima care fosforilează creatina și este un compus care marchează nespecific daunele musculare. [Davis et colab, 1982]

Din punct de vedere genetic DMD este cauzată de mutații în gena care codifică proteina distrofina. Analiza polimorfismelor ADN permite identificarea mutațiilor în gena ce codifică această proteină, distrofina. Experimental s-a demonstrat că la aproximativ 65% dintre pacienți se regăsesc deleții în afara cadrului de citire a genei; în 30% din cazuri boala este datorată mutațiilor punctiforme, iar în restul cazurilor, boala este determinată de duplicații intragenice. Cele mai importante deleții sunt localizate în intervalul dintre exonii 45 și 53 și între exonii 2 și 20. Aceste modificări duc la lipsa producției distrofinei în mușchii pacienților cu DMD. [Kunkel et colab. 1985].

GENA CARE CODIFICĂ DISTROFINA

Gena DMD a fost identificată cu ajutorul tehnicii de clonare pozitională ce viza izolarea genei responsabile de distrofia musculară Duchenne și Becker, în timp ce produsul genei, proteina distrofina, a fost descrisă de Hoffman, în anul 1987 ().

Gena distrofinei este cea mai mare gena umană, având o lungime de aproximativ 2,4 Mb, fiind poziționată pe cromozomul X ( Xp21.2) (Fig4.5)

Fig4.5 Poziția pe cromozomul X al genei distrofinei (DMD)

(sursa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&chr=X&query=uid(-1918149403,-2121844771,-2121807748,-2121807747,-2121807745,-2121807744,-2121807743,-2121807742,-2121807741,-2121807740,-2121807739,-2121807738,-2121807737,-2121807736,-2121807734,-2121807733,-2121807732,-1071455769,-1071455768,-1071455767)&QSTR=1756%5Bgene_id%5D&maps=gene_set&cmd=focus )

Gena distrofinei are simbolul oficial DMD și ID de identificare pe NCBI 1756, referința NC_000023.11 iar în baza OMIM maladia poate fi identificată după numărul 310200. Conține 79 de exoni și produce un transcript primar cu o lungime de 14,3 kb.

Gena DMD are 7 transcripte diferite, generate prin 3 tipuri de procese:

utilizarea a cel putin 7 promotori situați în amonte față de gena structurală, care majoritatea prezintă specificitate de țesut;

mecanismul de “splicing” alternativ;

utilizarea de diferite semnale de poli-adenilare.

BMD este o formă alelică mai mică. În general, pacienții cu DMD poartă mutații care cauzează terminarea prematură a traducerii informației genetice (mutații nonsens sau cu schimbarea cadrului de citire), în timp ce la pacienții cu BMD proteina distrofina este fie redusă în greutatea moleculară (derivată din deleții în cadru de citire) fie în nivelul de expresie. Mutația nonsens este o mutație în care o pereche de baze azotate se schimbă la nivel ADN și în urma căreia în locul unui codon sens din mesajul genetic apare unul nonsens sau STOP. Mutația prin decalarea cadrului de citire a mesajului genetic apare ca urmare a inserției sau deleției unei perechi de nucleotide din genă, prin urmare citirea mesajului genetic se schimbă cu o nucleotidă în plus sau în minus. În general acest tip de mutație duce la sinteza unei proteine nefuncționale, mai scurte, deoarece de foarte multe ori se produc codoni stop care întrerup mesajul genetic (Cosier, 2014).

Gena distrofina este extrem de complexă, conține cel puțin opt promotori independenți, specifici țesutului și două situsuri de poli-adenilare. În plus, ARN distrofinei este prelucart diferențiat, ceea ce determină producerea unei game largi de transcripte care codifică un set de izoforme ale proteinei. Distrofina (varianta codificată de transcriptul Dp427) este o proteină mare sub formă de tijă citoscheletală care se găsește la suprafața interioară a fibrelor musculare. Distrofina face parte din complexul-glicoproteinei distrofinei (DGC), care face legătura cu citoscheletul interior (F-actina) și matricea extracelulară. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756).

[Mandel, 1989; Manole, 1995]

Fig. 4.6

4.1. Mutații în gena distrofinei asociate bolii DMD

Gena DMD ce codifică distrofina, o proteină de mari dimensiuni regăsită în mușchi, care este mutantă în distrofia musculară Duchenne și Becker, boli definite de deteriorarea progresivă a țesutului muscular, având ca rezultat slabiciunea musculară.

Tennyson si colab (1995) a descoperit că gena DMD dispune de 79 exoni si acopera cel putin 2300 kb ( 2,3 Mb ). In urma analizei cantitative RT-PCR realizate, privind transcrierea celor 4 regiuni ale genei, cercetătorii au măsurat timpul necesar pentru transcrierea a aprox 1770 kb din genă ca fiind 12 ore, iar pentru trascrierea genei complete – 16 ore.

Oshima si colab (2009) au evaluat 624 de cazuri privind mutatiile in gena DMD si au descoperit in 238 de cazuri mutatii genomice (38,1%).

4.1.1. Delețiile

Au fost identificate in 188 cazuri (79.0%), din care in 31 cazuri deletiile au avut loc la nivelul unui singur exon, iar in 157 cazuri deletiile au interesat mai multi exoni. Majoritatea deletiilor se regasesc intre exonii 45- 52 si intre exonii 8-13 ai genei.

Se apreciaza ca principala mutatie a genei DMD, care va conduce la aparitia distrofiei musculare, este deletia, la nivelui unuia sau a mai multor exoni. Luand in considerare studiul lui Oshima (2009), aceasta mutatie se regaseste la 60-65% dintre pacienti.

Deletia partiala a genei sau duplicatia la nivelul genei DMD reprezinta in proportie de 65% cauza principala de aparitie a distrofiei musculare Duchenne. Aceste mutatii au fost grupate in 2 hotspot-uri: 30% dintre hotspoturi regasindu-se la nivel proximal al genei, iar 70% la nivel mai distal fata de gena. In urma studiului realizat pe 473 de pacienti din Brazilia si Olanda, Passos-Bueno si colab (1992), au considerat ca deletiile proximale pot aparea la inceputul dezvoltarii embrionale, crescand astfel riscul transmiterii ereditare a distrofiei musculare Duchenne, in timp ce deletiile distale pot aparea mai tarziu, ducand la cazuri izolate de DMD.

Conform cercetărilor întreprinse de Baumach si colab (1989) portiunea centrala a locusului genei pentru distrofina este un site preferential deletiilor cauzatoare de DMD.

4.1.2. Duplicațiile

Au fost și ele identificate in 44 din cazuri (18,5%), din care in 12 cazuri a fost implicat un singur exon, iar în 32 cazuri mai mulți exoni. În celalalte cazuri rezultatele au fost normale.

Hu și colab ( 1988 ) într-un studiu efectuat la 2 pacienți, unul afectat de DMD și unul de BMD a regăsit cu ajutorul analizei Southern blot o porțiune duplicată la nivelul locusului genei distrofina. În aceste doua cazuri apare un nou fragment de restrictie, care apare la nivelul unei jonctiunii dublate și care evidentiat, indica faptul ca duplicatiile au fost aranjate in tandem.

Prin urmarirea segregarii fragmentelor duplicate s-a constatat că acestea se transmit conform legilor lui Mendel, acestea fiind evidentiate in cele 2 familii; astfel fragmentele duplicate se regasesc in interiorul genei, si pot duce la aparitia bolii genetice prin perturbarea organizarii exonice.

Hu si colab (1989) in urma studiilor cu ajutorul tehnicii RFLP, efectuate în familii cu barbati afectati de DMD si BMD, rezultatele au aratat posibilitatea apariției crossing-overului inegal între cromatidele surori, în celulele germinale ale bunicului unui membru al familiei ca fiind cauza aparitiei duplicatiei, mutatie intracromozomiala comună de altfel in gena pentru distrofina.

White si colab (2006) intr-un studiu pe 230 pacienti cu DMD si BMD a considerat ca duplicatia cea mai frecventa este in apropiere de capatul 5’ al genei, la nivelul exonului 2.

4.1.3. Mutațiile punctiforme SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Lenk și colab (1993) a aplicat analiza PCR – SSCP pentru exonii 60-79 a genei DMD la 26 de pacienți cu DMD / BMD, fără deleții evidențiate. În urma studiului s-au evidențiat 7 mutații punctiforme și 1 polimorfism intronic. Terminarea prematura a translației a fost considerată cauza a 6 mutații punctiforme regăsite la pacienții cu DMD. La un pacient cu BMD a fost identificată o mutație punctiformă care a dus la schimbarea unui aminoacid. Retardul mental a fost regăsit la 5 dintre pacienții cu DMD, care purtau o mutație punctiformă, și este asociat cu o defecțiune translatională în regiunea C-terminala a genei. Autorii au susținut ca dp 71 si/sau dp116, produsii de translatie a regiunii C-terminala a genei DMD, pot fi implicati in aparitia retardului mintal la pacientii cu distrofie musculara Duchenne.

În bazele de date există descrise mutațiile de la nivelul genei DMD. Conform bazei de date 1000 Genomes acestea sunt:

http://browser.1000genomes.org/Homo_sapiens/Gene/Variation_Gene/Table?db=core;g=ENSG00000198947;r=X:31115794-33357558;v=rs104894790;vdb=variation;vf=23710071

Una dintre cele mai importante mutații, de tip SNP, asociate distrofiei musculare Duchenne este cea cu numărul de acces: rs104894790 în baza de date 1000 Genomes.

http://browser.1000genomes.org/Homo_sapiens/Variation/Phenotype?db=core;g=ENSG00000198947;r=X:31115794-33357558;v=rs104894790;vdb=variation;vf=23710071

Numărul de acces al mutației în baza de date OMIM al aceleiași mutații este 300377.0067 iar în baza de date a SNP-urilor, de pe NCBI 104894790.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/11273/

Este o mutație de stop-gaine sau nonsens; aceasta fiind definită ca variantă cu o secvență în care cel puțin o bază a unui codon este schimbată, transormându-l într-un codon stop prematur, ceea ce va duce la obținerea unui transcript mai scurt.

http://www.sequenceontology.org/browser/release_2.5.1/term/SO:0001587

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=104894790

La nivel proteic mutatia nonsens va determina sinteza unuei proteine mai mici decât cea originală.

http://www.justmed.eu/fisiere/L19sCURS%2520MUTATIILE.pdf

Lenk și colab ( 1993 ) au identificat, la un pacient cu DMD o substituție de tip C – T în poziția nucleotidică 10349, care codifică un codon stop corespunzător poziției 3381 în proteină, și a concluzionat că această substituție ar fi cauza deficienței determinată de distrofia musculară la acel pacient.

http://www.omim.org/entry/300377#0067

În baza de date a SNP-uri de pe NCBI sunt precizate informații referitoare la poziționarea mutației, structura nucleotidică, precum și alte informații de interes pentru mutația rs104894790.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=104894790#locus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ss.cgi?subsnp_id=289224699

Un exemplu de variantă de transcript este cea cu numărul de referință de pe site-ul de specialitate NCBI: NM_004006 – varianta de transcript a genei DMD Dp427.

Gena distrofinei este cea mai mare genă, măsurând 2,4 Mb și a fost identificată cu scopul de a izola gena responsabilă de distrofia musculară Duchenne și Becker.

DMD este o boală recesivă, letală, X-linkată, iar BMD este o formă alelică mai ușoară. În general pacienții cu DMD prezintă mutații care cauzează stoparea prematura a translației ( mutații nonsens, și mutații la nivelul cadrului de citire – frameshift ).

http://www.justmed.eu/fisiere/L19sCURS%2520MUTATIILE.pdf

La nivel de ARN al genei distrofinei se vor produce diferite transcripte, care codifică un număr mare de proteine izoforme.

Gena pentru distrofină este extrem de complexă, pe lăngă multiplii promotori independenți, conține și doua situri poli A.

Distrofina codificată de transcriptul Dp427 este o proteină mare, sub formă de tijă citoscheletică care se găsește la suprafața interioară a fibrelor musculare.

Varianta de transcript Dp427m codifică principala proteină distrofina, care se găsește în mușchi, iar ca urmare a utilizării alternative a promotorilor, exonul 1 codifică o secvență unică N-terminală de aminoacizi: MLWWEEVEDCY.

Transcriptul Dp427m este reprezentat de ARNm liniar format din 13993 pb, cu situsul de reglaj între 13971-13976, și situsul poli A în poziția 13993

………………………………………………………………………………………………

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004006.2

Această variantă de transcript codifică proteina distrofinei cu izoforma cea mai întâlnită Dp427m cu numărul de referință pentru NCBI: NP_003997.1 formată din 3685 AA

…………………………………………………………………………………

…

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_003997

4.1.3. Baza de date franceză a mutațiilor genei DMD: UMD-DMD

Tuffery- Giraud si colab. ( 2009 ) au descris baza de date franceză pentru mutațiile genei DMD care include 2411 de mutații, din care 1404 deletii, 215 duplicatii, si 465 reanjari.

Această bază de date a fost înființată pentru a susține efortul laboratoarelor de diagnostic prin furnizarea informațiilor privitoare la mutațiile genei DMD, identificate la pacienții cu distrofinopatii din Franța. Datele moleculare sunt adunate din cele 14 laboratoare de diagnostic din Franța iar scopul principal al acestei baze de date este de a face informațiile accesibile oricui interesat de variațiile genetice ale genei DMD (geneticieni, medici cercetători, clinici de distrofinopatii ) și dezvoltarea unor noi abordări terapeutice.

4.1.3.1. Mutațiile înregistrate în baza de date

În baza de date sunt introduse doar mutațiile complet caracterizate, în expresia genei la pacienții de sex masculin sau la purtătorii asimptomatici. Dacă într-o familie sunt identificate mai multe persoane afectate, pentru fiecare persoană în parte se vor introduce date, care vor permite ulterior studiul clinic asupra variabilității genotipice intra-familiale.

Pentru fiecare mutație în bază sunt oferite următoarele informații:

la nivel de genă: numărul exonilor și codonilor, tipul codonului mutant, tipul de mutație ( deleție, duplicație, punctiformă ), numele mutației.

la nivel de proteină codificată: tipul aminoacizilor mutanți, efectul presupus asupra cadrului de citire.

Alte informații:

grupul fenotipic

rezultatele analizei de imunofluorescență, și Western Blot cu 3 anticorpi Dys1, Dys2, Dys3

modul de transmitere a mutației.

4.1.3.2. Chei de căutare în baza de date:

Căutarea după: “numărul și tipul mutației“ oferă posibilitatea accesării tuturor mutațiilor raportate în baza de date potrivit tipului de mutație: “mutație de exon“ – permite accesul la lista tuturor mutațiilor raportate în exonul specificat.

Pentru leziuni mari există 6 tipuri de analize diferite a căror rezultate vor fi afișate grafic sau sub formă de liste.

Pentru leziuni mici există 15 analize diferite.

4.2. Diferența între fenotipurile normale, Duchenne și Becker

Hoffman si colab (1988) au diferențiat distrofia musculara Duchenne de cea Becker. Hoffman a prcizat ca in cazul distrofiei musculare Duchenne este vorba de o anomalie cantitativa de distrofina, reprezentată printr-o cantitate redusa sau chiar absentă, in cazurile severe de DMD. In cazul distrofiei musculare Becker însă este vorba de o anomalie calitativa a distrofinei, care își îndeplinește parțial funcția de a proteja membrana ce învelește fibrele musculare.

Davies si colab (1988) in urma studiului a peste 300 de pacienti cu DMD si BMD au constatat ca serveritatea fenotipului poate sa nu fie influentata de dimensiunea fragmentului de deletie ci, dacă este sau nu este afectat cadrul de citire a mesajului genetic. În cazul distrofiei Becker acesta nu este afectat, motiv pentru care la pacientii cu BMD distrofina este regasita la nivelul tesutului muscular, insa intr-o varianta mai scurta, in timp ce la pacientii cu DMD distrofina este absenta in majoritatea cazurilor.

http://omim.org/entry/300377

Fig. 4.7 Diferența între fenotipurile normale, Duchenne și Becker

La adulții neafectați, cadrul de citire al distrofinei (ARNm) este intact și se va sintetitza proteina distrofină completă, funcțională. Proteina sintetizată va forma o legătură între actina citoscheletică și matricea extracelulară. Prin aceasta ea conferă stabilitate fibrelor musculare în timpul contracțiilor și previne deteriorarea mușchilor.

În DMD, mutațiile perturbă cadrul deschis de citire a distrofinei la nivelul ARNm. Acest lucru face ca translația să se oprească prematur. Proteina care rezultă nu este funcțională, deoarece legătura dintre actină și matricea extracelulară este pierdută și fibrele musculare sunt expuse deteriorării.

În DBM, o parte a genei DMD este ștearsă, dar cadrul deschis de citire al distrofinei- ARNm rămâne intact. De aceea, se va obține o proteină puțin mai scurtă. Această proteină este încă funcțională în mare parte și poate furniza o legătură funcțională între actina citoscheletică și matricea extracelulară.

[Verhaart Ingrid EC et colab,2011]

4.3. Transcriptele alternative ale genei distrofinei umane

Gena distrofinei are 30 transcripte, 68 ortologi, 5 paralogi, si face parte din familia de proteine 5, având asociate 8 fenotipuri diferite.

Cele 30 transcripte diferite ale genei :

Tabel 4.1 Transcriptele genei DMD umane

De exemplu, pentru transcriptul DMD-001 ( CCDS14233 ) secventa în nucleotide de 11057, iar marimea proteinei codificate este de 3685 aa.

68 ortologi:

Tabel 4.2 Ortologi

……………………………………………………………………………

5 paralogi:

Tabel 4.3 Paralogi

Expresia transcriptului de lungime totală este controlată de 3 promotori reglementați în mod independent: în creier ( B), în mușchi ( M) și în celulele Purkinje (P) a căror nume reflectă situsurile de expresie a distrofinei. Promotorul B produce expresia în principal la nivelul neuronilor corticali; promotorul M a condus la un nivel ridicat de exprimare în mușchii scheletici, în cardiomiocite și la un nivel scăzut în celulele gliale din creier; promorul P face posibilă exprimarea în celulele cerebeloase Purkinje și în mușchii scheleltici.

Gena DMD, are de asemenea 4 promotori interni care conduc la producerea unui transcript mai scurt care codifică alte câteva izoforme de distrofină. Acești promotori interni sunt denumiți: retina (R), creier-3 (B3), celule Schwann (S) și general (G). [Barnea și colab., 1990; Chelly și colab.,1990; Gorecki și colab., 1992].

http://www.omim.org/entry/310200

Informații detaliate despre genă,mutații și fenotipuri asociate pot fi găsite în baza de date OMIM (Online Mendelian Inheritance in Human) unde gena DMD este identificată cu numărul 300377 iar fenotipul distrofic Duchenne cu numărul 310200.

4.3.1. Analiza Blast

Pentru varianta de transcript DMD-001 de la om, cu numărul de referință NM_000109.3 din NCBI s-a efectuat analiza Blast, care este un instrument de comparare a secvențelor nucleotidice sau proteice cu toate secvențele din baza de date în vederea găsiri de similitudini între secvențe. Instrumentul este util atunci când am secvențiat o genă nouă și dorim să găsim orice similitudine cu alte secvențe incluse în bazele de date.

În urma analizei Blast, am obținut o similaritate în proporție de 100% cu variantele de transcript cu numerele de referință: NM_004010.3; NM_004009.3; NM_004006.2; NM_004012.3; M_004011.3; NM_004013.2;NM_004014.2.

……………………………………………………………………………….

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi

4.3.2. Design primeri pentru transcriptul de genă DMD-001

Pe varianta 1 de transcript a genei cu numărul de referință NM_000109.3 din NCBI s-a efectuat design de primeri, în vederea amplificării secvenței prin tehnica PCR; o astfel de modelare de primeri este prezentată în continuare:

Fig. Analiza de design de primeri pentru amplificarea regiunii de control a transcriptului DMD-001

4.3.3. Digestia enzimatică asupra variantei ARNm a transcriptului

Asupra ARNm a variantei de transcript DMD-001 s-a reazlizat digestia enzimatică cu ajutorul enzimei de restricție AluI, care produce digestia în situsul AG-CT (fig).

http://nc2.neb.com/NEBcutter2/showdig.php?name=f2356534-

PROTEINA DISTROFINA

Gena DMD codifică sinteza proteinei distrofina. Izoforma cel mai des întâlnită este o proteina de 427 kDa, formata din 3685 aminoacizi și este predominant hidrofilă pe toată lungimea sa (izoforma 4). Această izoformă are urmatoarea secvență de aminoacizi:

>nxp|NX_P11532-1|DMD|Dystrophin|Iso 4

MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQV

……………………………………………………………………………………………………

QDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM

Fig. 5.8 Structura proteinei este diferită pentru toate variantele ei, un exemplu de structură 3D este cea pentru 1DXX

Fig. 5.9 Structura tridimensională a proteinei 1DXX

http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P11532/structures

Proteina se regăsește în proporție ridicată în țesutul muscular (scheletic, cardiac și neted) la nivelul neuronilor și celulelor gliale ale SNC și SNP. [Mehler, 2000].

Distrofina este o proteină a citoscheletului sub forma de tijă, localizată pe partea citoplasmatică a membranei plasmatice, avand funcția de a media fixarea citoscheletului actinei fibrei musculare striate ale membranei bazale, datorită complexului proteic al membranei asociată distrofinei ( DAPC: dystrophin associated protein complex ) (fig). Unul din rolurile principale ale acestui complex de proteine este de a stabiliza sarcolema și de a proteja fibrele musculare de daune pe termen lung cauzate prin contracție.

Distrofina reprezinta 3% din totalul proteinelor de membrană și 0,002% din totalul proteinelor musculare (sursa).

[Michalak și colab.,., 1997].

La nivelul proteinei se pot distinge 4 domenii principale:

domeniul de legare a actinei, un domeniu N-terminal de 240 aminoacizi, care contine situsuri diferite de legare pentru actina, responsabila de interactiunile dintre distrofina și citoschelet; [Kunkel e Hoffman, 1989];

domeniul central, o mare regiune triplu-helicoidala în forma de tija formata din 24 repetitii, dispuse în tandem, fiecare de aproximativ 109 aminoacizi, care permit asocieri homo-/hetero- oligomerice. In aceasta structura sunt regasite 4 regiuni de articulatie bogate în prolina, numite “regiuni-balama”, care confera flexibilitate pentru proteine și cel putin un alt situs de legare cu afinitate mai redusa pentru actina; [Rybakova și colab.,., 1996; Kunkel și Hoffman, 1989];

domeniul bogat în cisteină; un domeniu bogat în cisteina de 280 aminoacizi, continand un posibil situs de legare pentru Ca + + și situsuri de legare pentru diferite componente ale complexului de proteine asociate distrofinei; [Blake și colab.,., 2002]

domeniul carboxi-terminal, contine 420 aminoacizi, a caror structura secundara este un alfa helix spiralat, pentru aceasta este denumita regiunea CC

(spiralat bobina), responsabilă pentru legarea distrofinei cu sintrofin. [Blake și colab.,., 1995].

5.1. Variațiile la nivelul proteinei distrofinei umane

Baza de date proteice Uniprot prezinta 7 variante aminoacidice ce sunt produse de mutatii punctiforme în gena DMD ( distrofina ), care determină înlocuirea aminoacidului normal cu un codon schimbat. Acestea sunt redate în figura următoare:

Fig. Variantele proteinei distrofina prezente în baza de date UNIPROT http://www.uniprot.org/uniprot/P11532#subcellular_location

1. Varianta Leu54Arg ( L R)

KQHIENLFSDLQDGRRLLDL  L EGLTGQKLPKEKGSTRVHAL

În pozitia 54 a structurii proteice a distrofinei, are loc înlocuirea aminoacidul leucina ( L ) cu arginina ( R ). Schimbarile ce au loc in urma mutatiei: leucina: dimensiune medie, hidrofoba arginina: dimensiune mare, bazică. http://web.expasy.org/variant_pages/VAR_005147.html

2. Varianta Asp645Gly ( D G)

QDLLSTLKNKSVTQKTEAWL  D NFARCWDNLVQKLEKSTAQI

In pozitia 645 din structura aminoacidică a distrofinei, are loc înlocuirea aminoacidul aspartat ( D ) cu glicina ( G ). Schimbarile ce au loc in urma mutatiei sunt dimensiune medie, și stare acidă glicina: dimensiune mare, bazică. http://web.expasy.org/variant_pages/VAR_023541.html

3. Varianta Lys773Glu. K E

EGNFSDLKEKVNAIEREKAE  K FRKLQDASRSAQALVEQMVN

În pozitia 773 din structura proteică a distrofinei are loc substituirea aminoacidul lizina ( K ), care este de dimensiuni mari și bazic cu glutamat ( E), care are dimensiune medie, și stare acidă. http://web.expasy.org/variant_pages/VAR_005154.html

4. Varianta 2305- 2366.

>sp |P11532|2305-2366

VSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFD

VK

Acesta secventa de aminoacizi lipseste în distrofia musculara Duchenne. http://www.uniprot.org/blast/?about=P11532[2305-2366]&key=Natural%20variant&id=VAR_005166

5. Varianta Cys3313Phe. CF

VWLPVLHRVAAAETAKHQAK  C NICKECPIIGFRYRSLKHFN

In cazul acestei variante, in pozitia 3313 are loc în structura proteica a distrofinei substituirea aminoacidului cisteina ( C ) cu fenilalanina ( F ). Schimbarea ce va aparea in urma mutatiei în proteină schimbă aminoacidul, de dimensiune medie cisteina, care este polara, cu fenilalanina de dimenisuni mari și structură aromatică. Aceasta are ca rezultat nivelul redus de proteine si exprimare redusa in sarcolema. http://web.expasy.org/variant_pages/VAR_023545.html

6. Varianta Asp3335His. DH

ICKECPIIGFRYRSLKHFNY  D ICQSCFFSGRVAKGHKMHYP

Această variantă apare în poziția 3335 din structura proteică a distrofinei prin înlocuirea aminoacidului aspartat ( D ) cu histidina ( H ). Aspartatul are o dimensiune medie și este acid, iar histidina are dimensiune medie si este polară.

Ca rezultat al mutației din genă, modificarea nu afecteaza stabilitatea si expresia proteinei in sarcolema. http://web.expasy.org/variant_pages/VAR_023546.html

7. Varianta Cys3340Tyr. CY

PIIGFRYRSLKHFNYDICQS  C FFSGRVAKGHKMHYPMVEYC

Această variantă este caracterizată de substituirea aminoacidului cisteina ( C ) cu tirozina ( Y), in pozitia 3340 a proteinei, distrofina. Cisteina este de dimensiune medie și polară, în timp ce tirozina are o dimensiune mare si este aromatică.

In DMD această mutație va produce un nivel redus de proteine in sarcolemă corespunzător unui nivel redus de exprimare a genei. http://web.expasy.org/variant_pages/VAR_023547.html

ABORDĂRI TERAPEUTICE

Din dorința îmbunătățirii terapiilor cunoscute, și dezvoltării de noi terapii pentru stoparea și dezvoltarea bolii distrofiei musculare Duchenne, s-au efectuat cercetări în acest domeniu, majoritatea terapiilor fiind încă în faza de studiu clinic: terapia genică, creșterea răspunsului celular la utrofină și cele care au ca scop îmbunătățirea calității mușchilor.

6.1. Terapia genică

Distrofia musuclara Duchenne, fiind o boală recesivă mono-alelică, s-a încercat terapia genică, prin adăugarea unei gene funcțioane DMD, care să codifice o proteină funcțională – distrofină.

Cei mai utilizați în terapia genică sunt virusurile, pentru transmiterea informatiei genetice în țesuturile gazdă țintă și vectorii virali, cand gena dorită va înlocui genele virale, astfel vectorul va transporta gene cu scop terapeutic.

[Genetics Home Reference]

Distrofia musculară Ducehenne are specificitate pentru mușchii scheletici și cei de la nivelul inimii, motiv pentru care s-au realizat cercetări în scopul utilizării vectorului viral cu capacitate de infectare acestor tipuri de țesuturi musculare; astfel, s-a descoperit ( AAV) – vectorul viral adeno-asociat, un virus mic ( aprox 4,9 kb ) în comparație cu gena DMD care are o dimensiune de 2,4 Mb, aproximativ 0,1% din genomul uman. Secvența codificatoare a genei, deși fiind de numai 11 kb este totuși prea mare pentru a se putea utiliza vectorii AAV. [England et colab., 1990]

S-a observat că la anumiți pacienți cu DMB, din domeniul central de la nivelul genei ce codifică distrofina, lipsesc părți mari, însă când sunt prezente domeniile de legătură pentru actină și pentru matricea extracelulară și porțiuni din domeniile de ancorare, proteina distrofina, ce se va sintetiza va fi parțial funcțională. Astfel, s-a încercat obținerea, pe cale sintetică, a microdistrofinei, care să conțină doar acele domenii importante pentru funcționalitatea proteică. S-au obținut numeroase microdistrofine, cu ajutorul unei gene suficient de mici pentru a putea fi fixată în interiorul unui vector AAV, și s-a observat că aceste microdistrofine pot îmbunătății calitatea și funcția mușchilor, dacă se exprimă ca transgene la nivelul țesuturilor musculare lipsite de distrofină. Un exemplu de microdistrofină, des utilizată, conține domeniul N-terminal de legătură al actinei, responsabilă de interacțiunea cu citoscheletul; 4 din cele 24 de repetiții din domeniul central și 3 din cele 4 domenii de ancorare bogate în prolină. [Liu M et colab., 2005]

Zaiss și colab ( 2005 ) au demonstrat că în urma tratamentului cu vectori AAV ce conțin microdistrofină asociat cu factori de permeabilizare vasculară se va obține o expresie a distrofinei, mai mare la nivelul mușchilor scheletici, și mai redusă la nivelul mușchilor inimii; diferența de expresie a fost explicată prin faptul că există stereotipuri AAV, cu aplicabilitate în terapia genică, cu tropism puternic pentru musculatura scheletică ( ex AAV5, AAV8 și AAV9 ) și pentru musculatura de la nivelul inimii ( AAV8 ).[Zaiss AK et colab, 2005]

Există două mari bariere în aplicarea terapiei genice în cazul distrofiei musculare Duchenne. Prima barieră este datorată dificultății cu care se poate ajunge la fiecare fibră musculară în parte, dată fiind abundența țesutului muscular și a celui conjunctiv care înconjoară fibrele musculare și filtrează particulele virale mai mari. A doua barieră este datorată imunogenicității vectorului AAV sau a microdistrofinei, fapt dovedit din testele efectuate pe șoarecele model mdx, la care s-a observat o reacție imună în urma tratamentului cu AAV. [Mendell JR et colab., 2010]

Van PM și colab ( 2011 ) au efectuat un studiu a 6 pacienți care consta în injectarea intramusculară a AAV fără administrarea imunosupresoarelor. În urma biopsiei musculare s-a constatat că toți cei 6 pacienți au dezvoltat un răspuns imun la capsida virală, iar la 4 dintre pacienți s-a descoperit un răspuns imun chiar la proteina microdistrofină nou sintetizată; la 2 pacienți s-a exprimat microdistrofina la nivelul câtorva fibre musculare. [van PM et colab., 2011]

La ora actuală tratamentul cu AAV nu poate fi aplicat la om, datorită reacției imune la AAV care ar face nefolositoare injecțiile repetate cu AAV. Studiile actuale în această direcție vizează utilizarea temporară a imunosupresoarelor pentru încercarea tratamentului.

6.2. Terapia celulară

O formă a terapiei genică este și terapia celulară, care constă în transferul unor celule, de la un organism sănătos, care poartă gena funcțională a distrofinei, având efect regenerant asupra musculaturii afectate de lipsa distrofinei la pacienții cu DMD. S-a studiat aplicarea terapiei pentru mioblaste, care sunt celule satelit provenite de la donator sănătos, cu rol în repararea mușchiului deteriorat. Primele studii clinice au dovedit că nici una din mioblaste nu au trecut de bariera sanguină înspre țesutul muscular. S-a reușit, totuși, aplicarea acestei terapii pentru restaurarea distrofinei în mușchii mici, superficiali, prin injecții multiple locale, circa 25-250 pe centimetru cub. Abundența și inaccesibilitatea țesutului muscular sunt motivele pentru care această terapie nu poate fi aplicată cu succes pentru mușchii mai mari sau dacă tratamentul este necesar pentru întreg organismul. [Skuk D et colab., 2004]

6.3. Terapia cu celule stem

Există celule stem: de la nivelul vaselor de sânge – mesangioblaste; asociate sistemului imunitar; celule stem grase – pericite și celule osoase, care spre deosebire de mioblaste, au capacitatea de a străbate membrana sanguină și de a migra în țesutul muscular unde vor contribui la regenerarea fibrei musculare. Dintre aceste celule stem, mesangioblastele s-au dovedit a fi eficiente; acestea au fost studiate în distrofia musculară la rasa de câini Labrador, unde transferul mesangioblastelor prin injecție intra-arterială a dus la o îmbunătățire a musculaturii. [Sampaolesi M et colab., 2006 ]

6.4. Creșterea răspunsului la utrofină

Utrofina este un omolog autosomal al distrofinei care din punct de vedere structural este foarte similar distrofinei și poate compensa funcțional absența distrofinei. Asemănările structurale dintre distrofină și utrofină sunt în proporție de aproximativ 80% pentru domeniul N-terminal, domeniul C-terminal și domeniul bogat în cisteină. Astfel, una din strategiile de terapie, este aceea prin care se urmărește mărirea expresiei utrofinei, la nivel muscular; utrofina, similar distrofinei, va forma o legătură între citoscheletul celular și matricea extracelulară. Utrofina se găsește prezentă în țesutul muscular a întregii muscuclaturi, în stadiile fetale timpurii, nivelul utrofinei scăzând pe masura dezvoltării, ajungând ca la adulți să fie regăsită doar la nivelul joncțiunii neuromusculare, cu rol in integritatea structurală. Când se dorește utilizarea utrofinei pentru procesul de regenerare a fibrelor musculare, aceasta se regăsește de-a lungul întregii sarcoleme, unde mai apoi va fi înlocuită de distrofină; iar dacă utrofina va compensa funcțional absența distrofinei, se va regăsi de-a lungul întregii membrane musculare, unde va forma complexe proteice, cu acele proteine cu care se asocia distrofina. [Mizuno Y et colab., 1993]

În urma studiului efectuat pe șoarecele model mdx, s-a observat creșterea expresiei la nivel celular al utrofinei; absența distrofinei, sau a omologului sau, utrofinei, va produce moartea șoarecelui model mdx la vârsta de 2-3 luni. [Deconinck AE et colab., 1997]

Datorită faptului că utrofina poate preveni dezvoltarea distrofiei musculare Duchenne, s-au efectuat cercetări pentru crearea medicamentelor care pot induce creșterea expresiei utrofinei; medicamentul SMTC1100 s-a dovedit clinic a fi eficient în studiul efectuat pe șoarecele model mdx, la care, în urma aplicării tratamentului oral s-a observat îmbunătățirea funcției mușchilor. În urma studiului clinic la om, pe indivizi sănătoși s-a dovedit ca în urma tratamentului nu se poate obține efectul dorit, datorită nivelului scăzut din plasmă al medicamentului, sub pragul minim pentru mărirea expresiei utrofinei. [Bowe MA et colab., 2000]

6.5. Terapii specifice mutației – citirea codonilor stop

Pacienții afectați de distrofia musculară Duchenne poartă mutații care cauzează terminarea prematură a traducerii informației genetice ( mutații nonsens sau cu schimbarea cadrului de citire ); mutația nonsens este definită ca o mutație în care o pereche de baze azotate se schimbă la nivel de ADN, ceea ce va produce transformarea unui codon sens, din mesajul genetic, într-un codon nonsens, sau STOP. ( Coșier, 2014 ).

S-a demonstrat că unele dintre antibioticele aminoglicozide au potențialul de a forța mecanismul de translație să ignore codonii stop și să introducă în locul lor un aminoacid. Acest fapt ar avea un potențial terapeutic pentru un procent estimat de 14% dintre pacienții purtători de mutații nonsens undeva în gena DMD, în timp ce restul transcripției rămâne neafectata. În urma studiilor efectuate in vitro pe celule a pacienților afectați de DMD/DMB s-au observat ca rezultatele obținute în urma acestei terapii sunt dependente de tipul de mutație a codonului stop ( UAA; UAG; UGA ) și de nucleotidele care flanchează codonul stop. [Howard MT et colab., 2004]

Un astfel de antibiotic aminoglicozid, gentamicina, a fost utilizat în studiul asupra șoarecelui model mdx pentru o mutație nonsens în exonul 23 din gena DMD la șoareci, obținându-se bune rezultate, cu o prezență a nivelului distronei de până la 20%. [Barton ER et colab., 2003]

Studiile clinice au fost extinse la om, unde în urma tratamentului cu gentamicină s-au obținut rezultate slabe, datorate diferiților izomeri ai gentamicinei. S-a decoperit, însă, că un singur izomer a prezentat o activitate ridicată la citire, însă neajunsul în utilizarea acestuia, a fost atribuit amestecului de izomeri diferiți, cu proporții diferite între loturi. [Malik V et colab., 2010]

Utilizându-se izomerul de gentamicină care are activitate ridicată de citire într-un studiu clinic recent, timp de o lună la pacienții cu mutații ale codonului stop s-a obținut un nivel scăzut de creatinkinază la nivel plasmatic; iar pentru pacienții cu mutații de la nivelul cadrului de citire a mesajului genetic, nu s-au observat efecte ale tratamentului. În urma aplicării tratamentului pe o perioadă de șase luni, la pacienții cu mutații nonsens s-a observat o creștere a nivelului de distrofină până la 15% pentru 3 din cei 16 pacienți participanți la studiu. Marele dezavantaj a terapiei este nefrotoxicitatea și ototoxicitatea ireversibilă a gentamicinei pe termen lung. [Hirawat S et colab., 2007]

Ca alternativă de tratament a fost descoperit compusul PTC 124 ( ataluren ), cu un risc scăzut asupra sănătății față de gentamicină; acest compus are o selectivitate pentru codonii stop prematuri, fără a intervenii în citirea codonilor stop normali. Primele studii efectuate asupra șoarecelui model mdx au evidențiat niveluri scăzute ale creatinkinazei în sânge, creșterea forței musculare, datorate creșterii nivelului de distrofină până la 25%. În urma tratamentului cu ataluren, într-un studiu pe voluntari umani, s-a observat o creștere modestă a nivelului de distrofină. [Finkel RS et colab. 2010]

6.6. Ignorarea ( “skipping-ul” ) exonului – mecanism de prelucrare alternativă a transcriptelor.

Transcripția unei gene eucariote este un proces complex datorită asocierii dintre ADN cu proteinele histonice în nucleozomi. Spre deosebire de procariote, complexarea ADN cu proteinele histonice determină intervenția mai multor factori de remodelare a cromatinei și a altora care vor facilita accesul enzimelor la matrița ADN. În timp ce replicarea este un proces care se realizează simultan pentru tot genomul nuclear, transcripția este un proces care are loc numai în anumite perioade, nu implică toate genele simultan și are loc diferit în funcție de necesitățile celulei.

Procesul final de prelucrare a ARNm constă, în fapt, în excizia intronilor din transcript și asamblarea exonilor. Modalitatea prin care sunt prelucrate moleculele de ARNm pentru excizia intronilor constă în procese moleculare prin care anumite secvențe conservate la nivel intronic sunt recunoscute de enzime și atacate prin clivaj, după care intronii sunt excizați și se asamblează exonii învecinați. În mod curent, capătul 5’ al intronilor începe cu secvențele nuclelotidice GU și se termină cu secvențele AG, iar înspre capătul 3’, înaintea situsului de clivaj cu 16-40 nucleotide, se găsește așa-numitul punct de legătură marcat de nucleotida A, recunoscut specific de subunități ale complexului. Procesul de clivaj are loc la joncțiunea exonilor cu intronii și este urmat de asamblarea exonilor.

În mod curent, în celulele eucariote funcționează mecanisme de reglaj prin care se asigură excizia corectă a intronilor din transcript și asamblarea exonilor pentru obținerea unui mesaj genetic corect și fidel informației din ADN. Această recunoaștere corectă a secvențelor intronice de către componentele ARNsn se face prin mecanisme care unele au loc chiar în timpul transcripției, iar altele în timpul prelucrării ARNm.

Mecanismele care au loc în timpul transcripției se referă la legarea proteinelor implicate în procesul de prelucrare, imediat după transcrierea secvențelor intronice. Astfel, polimeraza transcrie secvența responsabilă de legarea proteinelor, iar coada acesteia (domeniul CTD) leagă proteinele de prelucrare. În acest fel, încă din timpul transcrierii informației genetice din ARNm, procesul de excizie este practic inițiat în aceste regiuni țintite de subunitățile U1 și U2 ale complexului ribonucleoproteic. Cu toate că proteinele sunt legate la ARNm, ordinea de excizare a intronilor nu este definitivă, prin urmare transcriptele pot fi încă prelucrate alternativ, rezultând diferite variante finale de ARNm.

Dintre terapiile studiate, cea mai apropiată de a fi aplicată, este exon-skipping-ul, care presupune utilizarea oligonucleotidelor antisens, pentru refacerea cadrului de citire și obținerea unei distrofine parțial funcțională. Principiul acestei metode de prelucrare alternativă ( exon-skipping-ul ) este ignorarea exonului la nivelul căruia există mutația, în timpul manipulării procesului de asamblare a ARNm, cu ajutorul oligonucleotidelor antisens, secvențe de ADN sau ARN care vor hibrida cu exonul dorit. Majoritatea pacienților afectați de DMD prezintă deleții în domeniul central al proteinei, între exonul 45 și 55; pentru 13% din pacienți mutația fiind localizată la nivelul exonului 51. Inițial s-au realizat studii clinice, în testarea abordării, în ceea ce privește ignorarea exonului 51, pe șoarecele model mdx, la care s-a reușit refacerea distrofinei și îmbunătățirea funcțională a muschilor. [Aartsma-Rus A et colab., 2009]

La ora actuală se cunosc doi compuși: 2'-O-methyl phosphorothioate (2OMePS) și morpholino phosphorodiamidate (PMO), de mare interes deoarece cu ajutorul acestor oligonucleotide antisens s-a obținut pentru prima dată o refacere semnificativă a distrofinei la pacienții cu DMD, în urma tratamentului injectabil aplicat intregului organism, fără efecte secundare notabile. În urma studiului oligonucleotidei PMO s-a constatat că datorită dimensiunii foarte mici a acestei oligonucleotide va fi cu ușurință filtrată de rinichi, ajungând astfel la o rată de înjumătățire rapidă în plasmă; pentru oligonucleotida antisens 2OMePS atomul de sulf din forforotioat va contribui la prevenirea eliminării din rinichi, datorită afinității scăzute pentru proteinele plasmatice; astfel se va îmbunătății rata de înjumătățire în plasmă. [van Deutekom JC et colab., 2007; Heemskerk H et colab., 2010]

Studiile efectuate pe șoarecii model mdx și pe cei sălbatici, tratați cu oligonucleotida 2OMePS au arătat o absorbție la nivelul mușchiului afectat de DMD de aproximativ 10 ori mai mare față de absorbția de la nivelul mușchiului sănătos; s-a constatat, astfel, că locurile prin care este eliminată creatinkinaza sunt locurile de acces în fibrele musculare pentru oligonucleotidele antisens. În urma aplicării cu succes a tratamentului cu cele doua nucleotide antisens: PMO și 2OMePS la șoarecele model mdx s-au continuat studiile pe pacienți afectați de distrofia musculară Duchenne, unde s-a reușit ignorarea exonului 51 și refacerea distrofinei în aproape toate fibrele musculare, în proporție de 60-100%, în funcție de dozele utilizate; rezultate notabile s-au obținut, la majoritatea pacienților, în ceea ce privește îmbunătățirea calității mușchilor, la testul de mersul, în urma aplicării tratamentului pe o durată de trei luni. [Denti MA et colab., 2006]

Pentru îmbunătățirea absorbției oligonucleotidelor la nivelul țesuturilor de interes: mușchi și inimă, s-a încercat, la șoarecele model mdx, asocierea oligomerului PMO cu o peptidă capabilă să pătrundă în celulă, cu rezultate foarte bune în ceea ce privește eficiența ignorării exonului dorit. [Yin H et colab., 2008]

În timpul transcripției ARN-ul se găsește asociat cu proteine implicate în procesul de prelucrare a ARNm, care pot fi înlocuite de secvența antisens dorită. Prin studiul realizat pe șoarecele model mdx, utilizând particulele ribonucleotidice mici din subunitățile U1 și U7, care pot fi inserate cu ușurință într-un vector AAV, s-a evidențiat ignorarea exonului 23 și refacerea distrofinei. Neajunsul în aplicarea acestei strategii de terapie este similar cu cel al strategiei care implică furnizarea microdistrofinei prin intermediul unui vector AAV. [Goyenvalle A et colab., 2004]

ALTE GENE RESPONSABILE DE PRODUCEREA BOLII DMD

În încercarea de a identifca factorii responsabili de fenotipul clinic al bolii s-au efectuat studii clinice pe pacienți diagnosticați cu distrofie musculară Duchenne; acești pacienti au fost tratati cu o doza standard de steroizi pana la momentul pierderii motricitatii; pacientii au fost ulterior clasificati în functie de raspuns astfel: R- raspuns pozitiv – în cazul în care pierderea motricitatii se instala dupa varsta de 13 ani și NR- non raspuns – cand pierderea motricitatii survenea inainte de varsta de 10 ani.

Pentru identificarea grupurilor de trascripte genetice diferential exprimate în cele doua categorii de pacienți, a fost realizata o analiza a profilurilor de expresie ( microarray ) utilizand o platforma de oligonucleotide, urmata de prelucrarea statistica a datelor.

Odata identificate genele responsabile, studiul a continuat cu identificarea unui subgrup de gene exprimate diferentiat la pacientii R și NR, regasindu-se la pacientii R, 47 de gene cu mutatii specifice , în timp ce la pacientii NR s-au regasit 37 de gene supraexprimate, multe din ele codificand factori de transcriptie și 10 gene subexprimate, dintre care gene structurale exprimate normal pe durata dezvoltarii, gene implicate în raspunsul imun și gene care codifica proteinele prezente în matricea extracelulara.

Genele exprimate diferentiat, ce au fost identificate, au fost ulterior supuse analizei functionale cu scopul de a identifica procesele biochimice în care au fost implicate. Evaluand interactiunea dintre genele identificate, s-au obtinut rezultate deosebit de importante în semnalizarea interferonului ( IFN ) și factorului de transcriere a semnalui nuclear kappa B ( NF-kB ), un factor de transcriere ubiquitar care reglementeaza expresia genelor implicate în procesele inflamatorii și în procesul de raspuns la stres. Datele experimentale obtinute în urma analizelor pe animalele model ( soareci MDX ) au sustinut ca factorul de transcriere a semnalului nuclear kappa B poate reglementa favorabil progresia bolii, a distrofiei musculare Duchenne (autor)

Cel putin 4 dintre genele studiate ( IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3 ) au rol în procesul de activare a factorului de transcriptie a semnaluilui nuclear kappaB. In scopul de a valida excesul de expresie a acestor transcripte la pacientii R, cu raspuns pozitiv la tratamentul de steroizi, au fost efectuate analize cu ajutorul tehnicii Real Time-PCR. Analiza a scos în evidenta faptul ca în interiorul fiecarui grup pe pacienti, ( R și NR ) s-a identificat o mare variabilitate. S-a efectuat o a doua analiza comparandu-se analizele fiecarui pacient cu un “martor” selectat în functie de varsta la care apare pierderea motricitătii.

Genele exprimate diferentiat au fost evaluate în functie de caracteristicile functionale, de expresie fiziologica și de interactiuni. In urma celei de a doua analize s-a evidentiat implicarea unor membrii din familia TNF (TNF, TNFS10, LTA, LTB) și o gena ce codifica un inhibior al factorului de transcriptie a semnalului nuclear kappaB (NFKBIL1).

Au fost luate în considerare și alte 5 gene (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2) selectionate datorita expresiei uniforme din interiorul celor 2 grupuri de pacienti, putandu-se, astfel, elimina variabilitatea inter-grup. Chiar și în acest caz datele au fost validate cu ajutorul tehnicii Real Time-PCR. Gena care a trecut de controlul de validare este USMG5 (stimularea în timpul creșterii muschiului scheletic 5 – upregulated during the skeletal muscle growth 5), studiat ulterior în scopul identificarii polimorfismelor unice de nucleotide (SNP). S-a evaluat existenta SNP-urilor cunoscute prin consultatea bazei de date a SNP pentru gena USMG5 și pentru alte 2 gene alese de literatura de specialitate: ACTN3 – care codifica proteina alfa-actinina3, exprimata exclusiv în discul Z de la nivelul fibrelor II din muschiul scheletic, și AKT1 – care codifica serin-treonina-protein-kinaza, implicata în transductia semnalului factorului de crestere IGF1, pe langa rolul avut în dezvoltarea și supravietuirea celulara și în activarea NF-kB. http://paduaresearch.cab.unipd.it/1835/1/Tesi_di_Dottorato_Bruno_Gavassini.pdf

Pegoraro colab. (2011) au evaluat 106 pacienti cu DMD pentru variații in 29 de gene, selectate ca și candidate ale modificării din severitatea bolii. ARNm a genei distrofinei din musculatura scheletică a dus la identficarea alelei G, a polimorfismului cu numărul de identificare rs28357094, situat în promotorul genei SPP1 (166490), care codifică osteopontina, ca având un efect semnificativ atât asupra progresiei bolii cât si raspunsului la glucocorticoizi. Intr-un model de transmitere prin dominanta autosomală, purtători ai alelei G (35% din subiecți) au înregistrat o progresie mai rapidă a bolii și o scădere a forței de prindere chiar cu 12-19% mai scăzută. Asocierea polimorfismului cu scăderea progresivă a forței și cu progresia mai rapidă a bolii a fost ulterior validată într-o a doua cohortă de 156 de pacienți.

7.1. Gena USMG5

Aceasta gena este codificatoare de proteine implicate în stimularea din timpul cresterii muschiului scheletic 5 – upregulated during the skeletal muscle growth 5; prezinta o structura de 58 aminoacizi, cu secvența următoare:

MAGPESDAQYQFTGIKKYFNSYTLTGRMNCVLATYGSIALIVLYFKLRSKKTPAVKAT

Gena joaca un rol esential în mentinerea sintezei de ATP la nivel de mitocondrii.

Punctul izoelectric este de 9,78;

Masa moleculara este de 6458 Da.

Tipul genei: codificatoare de proteina;

Simbol oficial: USMG5;

Alte denumiri: DAPIT HCVFTP2 bA792D24.4

(sursa: http://www.nextprot.org/db/entry/NX_Q96IX5/structures)

Structura tridimensionala a proteinei codificata de gena USMG5

Fig.http://www.proteinmodelportal.org/?pid=modelDetail&provider=MODBASE&template=2g7zA&pmpuid=1000005066849&range_from=1&range_to=58&ref_ac=Q96IX5&zid=async

Pozitionarea genei USMG5 pe cromozomul 10 uman

Gena USMG5 este pozitionata pe cromozomul 10 ( din 46 ) la om gasindu-se în intervalul 105,147,900-105,157,200 pb

Fig: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=USMG5

Fig. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&chr=10&query=uid(-1699937970,-1699937969,-1699937968,-2146542365)&QSTR=84833%5Bgene%5Fid%5D&maps=gene_set&cmd=focus

Expresia genei USMG5

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=USMG5

Structura exonica  Entrez Gene

http://genecards.weizmann.ac.il/geneloc-bin/exon_struct.pl?disp_name=USMG5&chr_nr=10

7.1.1. Variantele transcriptelor genei USMG5 la om

Gena USMG5 la om prezinta 3 variante de transcript, insa varianta 1 este cea principală (Homo sapiens up-regulated during skeletal muscle growth 5 homolog (mouse) (USMG5), transcript variant 1, mRNA), varianta 2 și 3 codificand aceiași proteină

Varianta 1 de transcript este regasită în baza de date NCBI cu numărul de referinta: NM_001206426.1. Aceasta varianta de transcript este formata din ARNm liniar de lungime 427 pb, la om, iar gena care produce acest transcript se gaseste localizata pe cromozomul 10 (fig??).

Comment

Features

Sequence

>gi|330340386|ref|NM_001206426.1| Homo sapiens up-regulated during skeletal muscle growth 5 homolog (mouse) (USMG5), transcript variant 1, mRNA

GGGGGCCGGCTAAACGCGTGCGGGGGAGGTGGCTTCTTCCGGCCGGGCCGAGAGGTGGTTACATTCGTTG

AAGGACACCAGCTGCGGAATTTGCGGCTTTGGCAGATTGAAATCATGGCAGGTCCAGAAAGTGATGCGCA

ATACCAGTTCACTGGTATTAAAAAATATTTCAACTCTTATACTCTCACAGGTAGAATGAACTGTGTACTG

GCCACATATGGAAGCATTGCATTGATTGTCTTATATTTCAAGTTAAGGTCCAAAAAAACTCCAGCTGTGA

AAGCAACATAAATGGATTTTAAACTGTCTACGGTTCTTAACCTCATCTGTTAAGTTCCCATGCCTGGAGA

AGCTAATGCCAACTCATCATGTGATAATTCAATTTGTACAATAAATTATGAACCTGGAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA

Această genă este formată din unitați informationale, ce alternează cu unități noninformaționale, respectiv din exoni și introni, cei din urmă urmând a fi eliminați din ARNm în procesul de maturare al acestuia ( la eucariote ). Gena USMG5 conține exoni în pozițiile: 1-105; 106-201; 202-294; 295-411 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001206426.1).

7.3. Analiza BLAST pentru gena USMG5 la om

Pentru varianta de transcript ARNm 1 a genei USMG5 de la om, s-a efectuat analiza Blast care este un instrument de comparare a secvențelor nucleotidice sau proteice cu toate secvențele din baza de date în vederea găsiri de similitudini între secvențe. Instrumentul este util atunci când am secvențiat o genă nouă și dorim să găsim orice similitudine cu alte secvențe incluse în bazele de date.

In urma analizei Blast, am obtinut o similaritate în proportie de 100% cu toate cele 3 variante de transcript ARNm pentru gena USMG5 de la om, cu numarul de referinta:

NM_001206426.1; NM_032747.3; NM_001206427.1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi

7.3. Designul de primeri pentru gena USMG5

Pe varianta 1de transcript s-a efectuat design de primeri, în vederea amplificarii secventei prin tehnica PCR; o astfel de modelare de primeri este prezentată în continuare:

Fig. Analiza de design de primeri pentru amplificarea regiunii de control a genei USMG5 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1392138546&job_key=YHuKQsxIZWxaXl5SP3xsLCRRXj03TkM4

Asupra variantei de transcript 1 a ARNm a genei USMG5 s-a reazlizat digestia enzimatică cu ajutorul enzimei de restricție AluI, care produce digestia în situsul AG-CT (fig).

http://tools.neb.com/NEBcutter2/showdig.php?name=81a000d1-

7.5. Polimorfismele SNP la nivelul genei USMG5

SNPs ( Single Nucleotid Polymorphism ) este o variație în secventa ADN-ului ce intereseaza un singur nucleotid: A, T, C sau G.

Un astfel de SNP la nivelul genei de interes este și polimorfismul cu numarul de acces din baza de data NCBI: rs375465659, a cărui variație este determinată de înlocuirea C cu T la om. Cate astfel de polimorfisme au fost identificate? Care sunt mai importante?

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=375465659

Cu ajutorul bioinformaticii bazele de date moleculare (GeneBank) ce contin gene, secvente de nucleotide pot fi accesate și se pot stabili la ora actuală functiile unor gene nou secventiate, prin comparare cu cele existente deja, se pot face predictii pentru diferite boli cu carater ereditar, se poate disemina informatia, aceasta fiind publica și accesibila, iar în final cunoasterea în detaliu a anumitor gene și secvente de nucleotide permite adaptarea tratamentelor în functie de necesitate prin tehnici avansate, cu ajutorul terapiei genice, tratamente cu celule stem, terapia prin citirea codonului stop; aceste tratamente fiind valabile în cazul nostru, pentru combaterea distrofiei musuculare Duchenne..

15. Bibliografie

1. [Allsop et Ziter, 1981]

2. [Nigro et colab, 1983]

3. [Dubowitz 1995, Engel și colab.,, 1994]

4. [Davis et colab, 1982]

5. [Kunkel et colab. 1985]

6. [Deconinck et colab., 2007]

7. [Mandel, 1989; Manole, 1995]

8. [Barnea și colab.,., 1990; Chelly și colab.,., 1990; Gorecki și colab.,., 1992]

9. http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P11532/structures

10. [Mehler, 2000]

11. Kunkel e Hoffman, 1989];

12. [Rybakova și colab.,., 1996; Kunkel e Hoffman, 1989];

13. [Blake și colab.,., 2002]

14. [Blake și colab.,., 1995]

15.http://paduaresearch.cab.unipd.it/1835/1/Tesi_di_Dottorato_Bruno_Gavassini.pdf
16. http://www.nextprot.org/db/entry/NX_Q96IX5/structures

17.http://www.proteinmodelportal.org/?pid=modelDetail&provider=MODBASE&template=2g7zA&pmpuid=1000005066849&range_from=1&range_to=58&ref_ac=Q96IX5&zid=async

18. http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=USMG5

19.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&chr=10&query=uid(-1699937970,-1699937969,-1699937968,-2146542365)&QSTR=84833%5Bgene%5Fid%5D&maps=gene_set&cmd=focus

20. http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=USMG5

21. http://genecards.weizmann.ac.il/geneloc-bin/exon_struct.pl?disp_name=USMG5&chr_nr=10

22. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001206426.1

23. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi

24. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/treeview/treeView.cgi

25. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1392138546&job_key=YHuKQsxIZWxaXl5SP3xsLCRRXj03TkM4

26. http://tools.neb.com/NEBcutter2/showdig.php?name=81a000d1-

27. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=375465659

Pegoraro, E., Schimke, R. N., Arahata, K., Hayashi, Y., Stern, H., Marks, H., Glasberg, M. R., Carroll, J. E., Taber, J. W., Wessel, H. B., Bauserman, S. C., Marks, W. A., Toriello, H. V., Higgins, J. V., Appleton, S., Schwartz, L., Garcia, C. A., Hoffman, E. P. Detection of new paternal dystrophin gene mutations in isolated cases of dystrophinopathy in females. Am. J. Hum. Genet. 54: 989-1003, 1994.