pentru studenții de la specializările: CONTROLUL SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE TEHNOLOGIA PRELUCRARII PRODUSELOR AGRICOLE EDITURA UNIVERSITǍȚII… [630077]

PURCǍREA CORNELIA

INDRUMǍTOR DE LABORATOR
BIOCHIMIE

pentru studenții de la specializările:
CONTROLUL SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE
TEHNOLOGIA PRELUCRARII PRODUSELOR AGRICOLE

EDITURA UNIVERSITǍȚII ORADEA
2015

Referen ti stiintifici:
Conf. univ. Dr. Vicaș Simona
Conf. univ. Dr. Alina C araban

Tehnoredactare: Cornelia Purc ărea

EDITURA UNIVERSIT ATII ORADEA
ISBN:978 -606-10-1467 -5 CD

1
CUPRINS
LABORATOR 1. Măsuri de protecția muncii în laboratoarele de biochimie …………………….. 4
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentru produse alimentare ……………………… 6
Soluții de reactivi ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 7
LABORATOR 2. METODE DE ANALIZǍ FOLOSITE ÎN BIOCHIMIE ……………………… 12
LABORATOR 3 – 4.GLUCIDE ………………………….. ………………………….. …………………………. 22
Extragerea glucidelor din produsele alimentare ………………………….. ………………………….. …… 23
3.1. Determinar ea glucidelor totale din miere cu refractometrul ………………………….. ………… 24
3.2.Determinări cantitative ale glucidelor ………………………….. ………………………….. …………… 27
3.2.1.Determinarea glucidelor reducătoare cu ajutorul reacției Fehling ………………………… 27
3.2.2.De terminarea glucidelor prin metoda Schrool ………………………….. ……………………….. 29
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu ………………………… 32
LABORAT OR 5 -6. LIPIDE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 35
5.1.Determinarea principalilor indici la grăsimi ………………………….. ………………………….. ….. 35
5.1.1. Determinarea punctului de topire ………………………….. ………………………….. …………… 35
5.1.2. Determinarea indicelui de iod ………………………….. ………………………….. ………………… 37
5.1.3.Determinarea indicelui de saponificare ………………………….. ………………………….. ……. 38
5.1.4. Determinarea indicelui de aciditate ………………………….. ………………………….. ………… 39
5.1.5. Indice de peroxid ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 39
5.1.6. Reacția Kreis ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 41
6.1. Determinarea grăsimii –metoda Soxhlet –principiul metodei ………………………….. ………. 42
6.2. Determinarea grăsimii din produse le lactate – metoda Gerber – principiul metodei ……. 43
LABORATOR 7 -8-9. DETERMINAREA PROT EINELOR DIN PRODUSEL E
ALIMENTARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 45
7.1. Ob ținerea extractelor proteice ………………………….. ………………………….. …………………….. 46
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire ………………………….. …….. 46
8.1Titrul proteic. Deter minarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen …………………….. 49
8.2. Determinarea conținutului de cazeinӑ din lapte ………………………….. …………………………. 51
9.1.Determinarea pr oteinelor – metoda biuretului ………………………….. ………………………….. … 52
9.2.Determinarea proteinelor – metoda Kjeldhal –principiul metodei ………………………….. …. 54
LABORATOR 10. ENZIME ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 55
10.1. Evidențierea unor enzime ………………………….. ………………………….. …………………………. 56
10.1.1.Evidențierea peroxidazei din hrean ………………………….. ………………………….. ……….. 56

2
10.1.2. Evidențierea activității peroxidazei din lapte ………………………….. ……………………… 56
10.2. Influența factorilor fizico -chimici asupra activității enzimelor ………………………….. …… 57
10.2.1.Influența temperaturii asupra activită ții enzimelor ………………………….. ………………. 57
10.2.2. Influența pH -ului asupra activității enzimatice. ………………………….. ………………….. 58
LABORATOR 11 -12. VITAMINE ………………………….. ………………………….. ……………………. 60
11.1. Metode de identificare ale vitaminelor ………………………….. ………………………….. ……….. 60
11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale ………………………….. ………………………….. ……….. 64
11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans ………………………….. ……………………. 66
LABORATOR 13.PIGMENȚ I ………………………….. ………………………….. ………………………….. 69
13.1.Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subțire …………………………. 69
13.2. Determinarea spectr ofotometricӑ a conținutului de clorofilӑ ………………………….. ……… 71
LABORATOR 14. EVALUA RE LABORATOR. ………………………….. ………………………….. .. 73
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 74

3
Prefațӑ

Alimentele sunt produse naturale, cu o compoziție complexă, de origine vegetală sau
animală. Ele constituie suportul material al vieții, al sănătății omului, asigurând energia și
substanțele de bază necesare desfășurării proc eselor metabolice.
Substanțele componente ale alimentelor se numesc nutrienți. Nutrienții sunt compuși
organici sau anorganici, care pot avea rol structural, energetic și funcțional ca de exemplu :
glucide, lipide, protide, enzime, vitamine, elemente minerale și produși secundari de
metabolism.
Prezenta lucrare este astfel realizată, încât să poată fi utilizată cu succes de studenții
de la secțiile Tehnologia Prelucrării Produselor Alimentare, Controlul și Expertiza Produselor
Alimentare dar și de cei de la Facultățile de Agricultură, Zootehnie și Biotehnologii, care
studiază biochimia.
Indrumӑtorul începe cu protecția muncii, continuӑ cu o prezentare generală a
laboratorului de biochimie, a soluțiilor de reactivi folosiți și a metodelor de an aliză utilizate în
mod curent în biochimia analitică calitativă și cantitativă.
Următoarele lucrӑri cuprind numeroase experiențe privind identificarea și dozarea
constituenților principali ai materiei vii (glucide, lipide, protide), a substanțelor cu rol
funcțional (enzime, vitamine), a produselor de origin e secundară (pigmenți ).
La sfârșitul fiecărui capitol, am întocmit câte un test de verificare, care vine în
sprijinul studenților, pentru a adânci cunoștințele dobândite la orele de laborator și pe cele
predate la orele de curs.

4
LABORATOR 1 . Măsuri de protecția muncii în laboratoarele de biochimie

Laboratoarele de biochimie alimenterӑ sunt destinate activităților didactice, științifice
respectiv aplicative (agricole, alimentare. etc). In astfel de laboratoare se poate executa o
mare diversitate de lucrări necesitând substanțe, sticlărie, ustensile, aparatură și instalații
adaptate scopurilor propuse.
Accidentele de orice natură pot fi evitate dacă se respectă cu strictețe condițiil e de
lucru prescrise la executarea diferitelor lucrări. In acest scop exista prescripții generale, cu
caracter normativ, referitoare la protecția și securitatea muncii (P.S.M.) care trebuie să fie
bine cunoscute de către pesoanele care desfășoară activităț i în laboratoare de profil. Intregul
personal și studenții care lucrează în laborator trebuie să cunoască și să respecte regulile de
protecția muncii și asigurarea securității pentru prevenirea accidentelor de muncă.
Intregul personal și studenț ii care lucrează în laborator trebuie să cunoască și să respecte
regulile de protecția muncii și asigurarea securității pentru prevenirea accidentelor de muncă.
1. Personalul din laborator este obligat să poarte halat.
2. Pentru a evita inhalarea diferit elor substanțe din praful care se ridicӑ odatӑ cu mӑturarea
poelelor, acestea nu se mă tură, ci se spală cu apă sodată, detergenți sau soluții antiseptice.
3. Aparatele electrice trebuie să aibe prizele împământate și izolarea electrică să fie perfectă.
4. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor.
5. Incăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, unde se lucrează cu solvenți
organici trebuie să fie prevazută cu nișă, exhaustor și ventilație electrică.
6. Solvenții și acizii se depozite ază în subsolul clădirii, unde trebuie să existe căi de acces cât
mai largi.
7. In chiuvete nu se vor arunca precipitate sau reactivi tari care atacă conducta, dacă totuși se
întâmplă, se lasă să curgă o cantitate mare de apă pentru a evita deteriorarea ch iuvetei.
8. La destuparea sticlelor trebuie să se acorde o atenție deosebită manipulării dopurilor.
Acestea se așază cu partea plată pe masă și partea cilindrică în sus.

5
9. Pentru a evita impurificarea reactivilor surplusul de reactivi ce rămâne în vase nu se toarnă
din nou în sticlă.
10. Evaporarea solvenților inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă
electrice, sub nișe cu tiraj convenabil.
11. Sticlele cu reactivi se etichetează clar și durabil, iar turnarea reactivilor din sticle nu se
face în dreptul etichetelor, pentru a evita distrugerea lor.
12. După terminarea lucrărilor se verifică dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize și
dacă robinetele au fost închise.
13. In laborator se păstrează curățenie perfectă. Pe masa de lu cru se vor afla numai vasele și
reactivii cu care se lucrează.
14. Este interzisă gustarea soluțiilor și substanțelor de laborator.
15. Miros irea substanțelor gazoase se face cu prudență printr -o mișcare de vânturare deasupra
vasului spre nas.
16. Eprubete le în care se fac experiențele nu trebuie îndreptate nici spre cel care face
experimentul, nici spre vecin.
17. Substanțele volatile, foarte inflamabile se vor feri de căldura mare și de lumina solară. Cu
ele se lucrează numai în camere bine aerisite și la o depărtare de 5 metri de orice sursă de
flacără.
18. Subsțantele sensibile la lumină sunt păstrate în sticle colorate.
19. Măsurarea soluțiilor toxice nu se face prin pipetare, ci numai cu ajutorul biuretelor sau
pipetelor automate.
20. Substanțele peric uloase ca: fosforul, metalele alcaline, benzina, sulfura de carbon,
carbidul, acetona, iodul, etc. nu se aruncă în chiuvetă, ci se adună în borcane sau se
transformă în substanțe inofensive. Fosforul alb se păstrează sub apă, iar metalele alcaline sub
petrol.
21. La diluarea acizilor se va turna acidul în apă și nu invers, lăsând să se prelingă foarte încet
acidul pe pereții vasului.
22. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon și azot lichid se depozitează în afara laboratoarelor.
23. Cromatografia și electro foreza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului și
prevăzute cu ventilație.
24. Substanțele toxice se țin sub cheie.
25. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu trusă de prim ajutor.

6
Organizarea laboratorului de analize biochimice pentr u produse
alimentare

Analiza biochimică trebuie efectuată imediat ce mostrele recoltate sunt aduse la laborator
pentru că acestea se depreciază foarte repede fie datorită activității microorganismelor ce se
găsesc în sau pe produse, fie activității enzimelor tisulare, ambii factori fiind favorizați de
temperatura camerei, de prezența oxigenului din aer și de lumină.
Laboratorul trebuie astfel dimensionat încât să se poată efectua cu promptitudine analizele
solic itate pentru a putea stabili operativ starea produsului.
Orice laborator de control biochimic al alimentelor trebuie să se compună din următoarele
încăperi:
1. Sala de primire a probelor ;
2. Sala de pregatire a materialului.
3. Laboratorul de lucru propriu -zis prevăzut cu mese faianțate sau acoperite cu
materiale termorezistente și rezistente la acizi și baze, chiuvete, etajere metalice
pentru reactivi uzuali, becuri de gaz și prize;

4. Camera frigiderelor pentru pӑstrarea probelor si contraprobelor
5. Camera de balanțe si aparatura performanta – amplasatӑ în acea parte a clădirii în
care trepidațiile sunt minime .Balanța trebuie sӑ fie instalatӑ pe o consolӑ fixatӑ în
perete sau mese fixe ;
6. Depozit de reactivi , cu minimul de reactivi pe timp de un an. Aici e interzisă instalarea
de prize, surse de apă si gaz. Reactivii toxici vor fi amplasați într -un dulap metalic cu
cheie, iar cheile vor fi pӑsrate de cӑtre șeful de laborator;
7.Sala pentru spӑlarea sticlӑriei.

7
Soluții de reactivi
Concentrația este o caracteristică esențială a unei soluții și reprezintă raportul dintre
cantitatea de substanță dizolvată și cantitatea dizolvantului utilizat.
Există mai multe moduri de exprimare a concentrației unei soluții.
a. Concentrația procen tuală : reprezintă cantitatea de substanță dizolvată în 100g soluție,în
acest caz exprimarea fiind "g/g".
Dacă soluția se prepară prin cântărirea solvatului și aducerea acestuia la
volum constant cu solventul, este exprimare "g/V".
Dacă soluția se prepară volumetric, ambele componente ale soluției fiind
lichide, avem exprimare "V/V".
b. Concentrația molală se referă la numărul de moli de substanță dizolvată în 1000ml
solvent.
c. Concentrația molară reprezintă numărul de moli de substan ță dizolvată în 1000ml
soluție.
d. Concentrația normală se referă la numărul de echivalenți (vali) în 1000ml soluție.
Normalitatea unei soluții se notează fie cu "n", fie cu "N". Soluția
care conține un val substanță în 1000ml soluție, se numeste sol uție 1N.
Echivalentul gram (val ) reprezintă cantitatea dintr -o substanță în grame, egală cu
echivalentul său chimic. Echivalentul se calculează diferit pentru acizi, baze și săruri,
conform următoarelor relații:
 Pentru acizi
Se calculează împă rțind masa moleculară a acidului la numărul atomilor de hidrogen ai
acidului.

Exemplu :

 Pentru baze
Se calculează împărțind masa moleculară a bazei la numărul de grupări hidroxilice

8
Exemplu

 Pent ru sare
Se calculează împărțind masa moleculară a sării la numărul atomilor de metal înlocuiți de
hidrogen :

Exemplu
EMgCO3 =84,3/2=42,15g

Utilizarea soluțiilor normale în volumetrie prezintă avantajul că soluțiile de aceeași
normalitate reacțione ază între ele în volume egale, deoarece conțin dizolvate substanțe în
cantități echivalente.
Titrul (T) unei soluții reprezintă cantitatea de substanță exprimată în grame, care se
găsește dizolvată într -un ml de soluție. Soluția al cărei titru se cun oaște se numește soluție
titrată.
De exemplu, dacă în 1000ml soluție se găsesc 40,0005g NaOH, într -un ml de soluție se
află T g NaOH, adică :
T=40,0005/1000=0,040005g NaOH
Pentru obținerea unei soluții cu un anumit titru se procedează după urmă toarele metode:
a). fie prin cântărirea unei anumite cantități de substanță etalon sau titrimetrică.
Substanțele etalon sunt acele substanțe din care prin simplă cântărire și dizolvare în balon
cotat, la volum cunoscut, se pot obține soluții cu co ncentrația cunoscută.
b). fie prin titrare cu ajutorul unei substanțe etalon. Se cântărește o anumită cantitate din
substanța etalon (0,15 -0,20g), se dizolvă în apă și se titrează cu soluția al cărei titru dorim să
îl determinăm.
Pentru stabilirea ti trului sunt necesare cel puțin două titrări în scopul verificării
concordanței dintre rezultate.
Factorul soluției (F) este un factor de corecție al concentrației unei soluții, este numărul
care arată corespondența dintre un ml soluție aproximativ no rmală și o soluție exact normală.

9
De exemplu, pentru o soluție exact 0,1N de NaOH titrul teoretic este de 0.004. Pentru o
soluție aproximativ 0,1 N să presupunem că titrul real este 0.004328. F actorul acestei soluții
va fi:
F=
== 0,004328/ 0,004 = 1,0820

Aceasta înseamnă că la 1ml din soluția noastră corespund 1.082ml din soluția exact 0.1N.
In general, dacă se titrează o soluție a substanței A cu greutate moleculară M A, cu
reactivul B având norma litatea n și factorul F, folosind V ml din reactivul B, cantitatea de
substanță A din proba analizată va fi:

TEST

1. Laboratoarele de chimie trebuie să fie dotate oblig atoriu cu:
a.Nisă
b.Ventilatie
c.Extinctor
d.Aer conditionat
e. Trusă de prim ajutor
2. Solventii organici se evaporă pe:
a. flacără
b. plită electric
c. baie de apă
d. baie de nisip
3. Cu solventii organici se lucrează la o distantă de minim…. de orice sursă de
flacără
a. 1m
b. 3m
c. 5m
d. 10m

10
4. Balanta analitică se instalează in:
a. camera de p rimire probe
b. camera frigorifică
c. laboratorul propriu -zis
d. cameră specială in care trepidatiile sunt minime
5. Solutiile de reactivi se prepară in:
a. cilindru gradat
b. pahar Berzelius cotat
c. balon cotat
6. Concentratia normală reprezintă :
a. număr de moli de substantă in 1000 ml solutie
b. cantitatea de substantă dizolvată in 100 g de soluti e
c. număr de echivalenti dizolvati in 1000 ml de solutie
7. Cât hidroxid de sodiu trebuie cântărit pentru a obtine 250 ml solutie 10% NaOH?
a.5 g
b. 30g
c. 25g
d. 60g
8. Pentru a prepara 500 ml solutie NaOH 0,3N avem nevoie de:
a. 120 gNaOH
b. 6 g NaOH
c. 40g NaOH
d. 12 g NaOH
9. Pentru a prepara 300 ml NaCl 2M trebuie să cântărim:
a. 58,5g NaCl
b. 117 g NaCl
c. 11,7 g NaCl
d. 35,1 g NaCl
10. Câti ml de HCl sunt necesari pentru a prepara 250 ml HCl de concentratie 1M,
folosind HCl 36% cu dens itatea 1,183g/cm3?
a. 18,56 ml
b. 21,43 ml
c. 56,71 ml
d. 33,11 ml

11

12
LABORATOR 2 . Metode de analizǎ folosite în biochimie

După caracteristicile lor, metodele de analiză pot fi :
 calitative, atunci când se execută numai identificări de substanță sau se evidențiază
însușiri fizico -chimice ale acestora și
 cantitative , atunci când se execută determinări evalua te prin măsurare și exprimate în
unități de masură.
Metodele cantitative se împart în trei mari grupe: metode gravimetrice, volumetrice si
fizico -chimice.
2.1. Metodele gravimetrice al căror principiu se bazează pe cântăriri analitice.
2.2. Metodele volumetrice se bazează pe măsurări de volume, de exemplu reacțiile de
titrare.
2.3. Metodele fizico -chimice la care determinările se bazează pe evidențierea unor
însusiri fizico -chimice specifice substanței care se analizează, care permi t evaluarea
cantitativă. Aceste metode se împart în:
2.3.1. Metode optice:
– Colorimetrice
– Fotometrice
– Spectrofotometrice
– Flamfotometrice
– Refractometrice
– Polarografice
2.3.2. Metode de separare – metode cromtografice
2.3.3. Metode e lectrochimice
– Electroforetice

13
– Potențiometrice
– Conductometrice
2.3.1. Metode optice
a. Metodele colorimetrice reprezintă metodele de analiză care se bazează pe compar area
vizuală a intensității colorației soluțiilor de concentrații diferite cu cea a unei soluții standard.
Acest e analize prezintă avantajul că necesită cantități mici de substanță și un timp relativ
redus în comparație cu analizele chimice.
b. Metod a fotocolorimetrică se bazează pe fenomenul efectului fotoelectric (fotoefect),
adică fenomenul de desprindere a electronilor din atomii substanței sub influența fluxului
luminos.
Celulele fotoelect rice transformă energia luminoasă în energie electric ă. Fotocurentul care
ia naștere este proporțional cu intensitatea I a radiației și se măsoară cu un galvanometru de
sensibilitate mare.
Inlocuirea ochiului observatorului cu celule fotoelectrice elimină erorile subiective.
c.Metoda spectrofotome trică se bazează pe determinarea coeficientului de extinție a
soluției la diferite lungimi de undă.

Fig. Spectrofotometru
Pe baza raportului dintre lungimea de undă și capacitatea de percepere a ochiului omenesc
radiațiile luminoase se împart în tr ei categorii:
 radiații vizibile, a căror lungime de undă se situează în domeniul 400 -760nm;
 radiații ultraviolete, cu lungimea de undă mai mică de 400nm;
 radiații infraroșii, cu lungimea de undă mai mare de 760nm.
Lungimile de undă corespunzătoare spectru lui vizibil sunt redate în următorul tabel.

14

Culoarea Domeniul lungimilor de undă
Violet 400-450 nm
Albastru 450-500 nm
Verde 500-570 nm
Galben 570-590 nm
Portocaliu 590-620 nm
Roșu 620-760 nm

d.Metoda flamfotometrică (fotometria cu flacără ) este una din metodele de analiză
cantitativă de interes deosebit pentru laboratoarele de biochimie. Este o metodă de analiză
rapidă, precisă și necesită o aparatură relativ simplă. Are o aplicabilitate practică limitată
îndeosebi la metalele alcaline și alcalino -pământoase.

Fig. Flamfotometru principiu de functionare si aparat
http://www.multilab.ro/spectrometre/flamfotometru_fotometru_flacara.html

Fotom etria cu flacără se bazează pe înregistrarea spectrelor de emisie ale diferitelor
elementelor excitate în flacără cu ajutorul unei celule fotoelectrice. Fiecare element are o
radiație specifică numită bandă spectrală de emisie. Majoritatea atomilor posedă o bandă de
emisie principală și mai multe benzi secundare. Benzile individuale ale diferitelor elemente se
pot suprapune cum este cazul sodiului și calciului, la aproximativ 590nm.

15
e.Refractometria se bazează pe fenomenele de refracție sau de reflecție to tală a unui fascicol
de radiații luminoase la limita de separație dintre două medii cu indici de refracție diferiți.

f.Polarimetria constituie o metodă analitică cu ajutorul căreia se masoară deviația luminii
polarizate produse de substanțele optic active și pe această bază se determină concentrația lor.
Lumina polarizată se obține trecând lumina naturală prin prisme speciale, numite nicoli, care
au proprietăți birefringente.
Caracteristica substanțelor optic active o constituie disimetria molecular ă datorată
carbonului asimetric. Rotația luminii polarizate se poate face spre dreapta, caz în care unghiul
de rotație se notează cu (+), sau spre stânga ( -).

Polarimetre

Pentru o anumită lu ngime de undă, unghiul de rotație specifică a unei substanțe aflate sub
formă de soluție, este proporțional cu grosimea stratului traversat și cu concentrația ei.
Constanta de proporționalitate specifică fiecărei substanțe se numește ―unghi de rotație
specifică‖ și se notează cu ( α)D20, unde 20 reprezintă temperatura la care se face citirea, iar D,
linia sodiului (ca sursă de lumină, aparatele sunt echipate cu lămpi de sodiu).
In practica, polarimetria se folosește pentru determinarea concentrației un or glucide cu
ajutorul aparatelor numite polarimetre.
Fiecare substanță optic activă are un unghi specific de rotație, în condiții determinate de
lucru. In tabelul următor sunt trecute valorile unghiului de rotație specifică a unor glucide de
import anță biologică.
Substanța ( α)D20 Substanța (α)D20
Glucoză +52.74
Fructoză -93.78
Galactoză +80.70
Maltoză +136.90
Zaharoză +66.50 Lactoză +55.30
Manoză +14.50
Arabinoză +105.0
Xiloză +19.00
Celobioză +35.00

16
2.3.2. Metode de separare – Metode cromatografice
Permit separarea substanțelor dintr -un amestec pe baza capacității de distribuție între o fază
staționară și una mobilă având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a componentelor
purtate de faza mobilă de -a lungul fazei staționare.
Metodele cromatografice se pot clasifica după starea de agregare a fazei staționare și
mobile și după fenomenul d e absorbție sau de repartiție între două faze nemiscibile în:
 cromatografie pe hârtie
 cromatografie în strat subțire
 cromatografie pe coloană de sephadex
 cromatografie în fază gazoasă
 lichid cromatografia
a.cromatografia pe hârtie are loc o repartiți e a substanțelor ce se separă între stratul de
lichid polar (apă) aderent de hârtie și faza mobilă (organică), nemiscibilă cu apa. Deci, este o
cromatografie de repartiție de tip lichid -lichid.
Ca suport se utilizează hârtia cromatografică Whatman, Schleicher -Schűll, etc.
-Pentru aplicare se pot folosi siringi, micropipete, pipete Pasteur.
-Developarea se face în aparate speciale de sticlă, care să asigure o atmosferă închisă.
-Soluțiile developante sunt specifice substanțelor ce se cercetează.
După developare și uscare la aer a cromatogramelor, acestea se pulverizează uniform cu o
soluție revelatoare cu compoziție specifică substanțelor ce se cercetează. Se usucă din nou la
aer, apoi se expun la etuvă, la temperatura de 90 -100șC pentru evidențierea spoturilor.

Fig. Cromatografia pe hartie
http://lumea -cunoasterii.blogspot.ro/

Pentru identificare se pot folosi două procedee:
 prin comparare cu standardele de referi nță preparate din substanțe cunoscute
 cu ajutorul factorului de retenție numit Rf

17
Rf-ul se definește ca fiind raportul dintre distanța parcursă de substanța separată prin
cromatografie și distanța parcursă de sol vent. Deci, pentru calcularea Rf -ului se măs oară
pe de o parte distanța de la punctul de start până la linia de migrare a solventului (L), iar
pe de de altă parte distanța de la punctul de start până la centrul geometric al spotului
substanței respective (l).
Rf=l / L
Valoarea Rf -ului este totdeauna subunitară și în aceleași condiții de lucru fiecare
substanță are un Rf cu valoare absolut specifică.
Pentru evaluarea cantitativă, fiecare spot identificat se decupează, eluează și se supune
determinării fotometrice față de un standard de referință cu concentrație cunoscută.
In biochimie, cromatografia pe hârtie are multiple domenii de aplicare, dar se folosește în
special pentru separarea, identificarea și determinarea aminoacizilor și a substanțelor
glucidice.
b. Cromatografia în strat subți re este asemănătoare cromatografiei pe hârtie cu deosebirea
că în locul hârtiei se folosesc plăci de sticlă acoperite cu un strat adsor bant, uniform distribuit,
de gr osime prestabilită, din silicagel sau alt material asemănător. Prezintă avantajul unei mai
bune separări a compușilor din amestec și a unei foarte bune reproductibilități. Metoda poate
fi utilizată și în cazul unor substanțe developante care ar ataca hârtia cromatografică.

http://ima ges.1233.tw/tlc -developing -tanks/

Fig. Cromatografia in strat subtire
http://www.bio -rad.com/en -za/applications -technologies/chromatography

18
c. Cromatografia pe coloană de sephadex . Principiul este asemănător cu al cromatografiei
pe hârtie sau în strat subțire cu deosebirea că suportul și faza staționară sunt introduse într -o
coloană cilindrică de sticlă. Substanțele din amestec sunt purtate de fa za mobilă de -a lungul
fazei staționare, distribuindu -se în mod specific, în funcție de capacitatea lor de migrare, în
acest fel realizându -se separarea lor.

Cromatografia pe coloane
http://www.drgpdreamdot.com/chromatography/

Sephadex -ul este o substanță hidrofilă de tipul dextran -ului, care are proprietatea de a se
îmbiba foarte repede cu apă, formând geluri poroase. Aceste geluri sunt formate din
macromolecule filiforme, legate între ele încrucișat, formând o rețea tridimensională care se
comportă ca o adevărată ―sită moleculară‖. Efectul acestei site este acela că m odelează viteza
de parcurgere a ei de către substanțe în funcție de masa lor moleculară.
Metoda se folosește pentru separarea diferitelor fracțiuni proteice, inclusiv pentru
separarea și purificarea enzimelor, acizilor nucleici, polipeptidelor, amin oacizilor, precum și
a unor polizaharide.
c.Cromatografia în fază gazoasă reprezintă una din cele mai perfecționate tehnici
cromatografice cunoscute până în prezent, cu ajutorul căreia se determină substanțele dintr -un
amestec, în domeniu nanogramelor. Fa za mobilă este alcătuită dintr -un ―gaz purtător‖, iar
faza staționară este formată din substanțe specifice care sunt lichide la temperatură înaltă și
care sunt fixate de un suport inert pulverulent. Complexul de substanțe care alcătuiesc faza
staționară su nt introduse într -o coloană lungă și îngustă, din sticlă, alcătuind așa -numita
―umplutură de coloană‖. Extractul din proba de cercetat purificat printr -o tehnică specială se
injectează în partea superioară a coloanei de unde este preluat de gazul purtător și vehiculat
de-a lungul fazei staționare. In funcție de structura lor chimică componentele amestecului

19
străbat coloana cu viteze diferite, deci, se separă unele de altele. La extremitatea opusă a
coloanei există un sistem de detecție care semnalizează ieș irea din coloană a fiecărui element.
Intensitatea semnalelor emise este proporțională cu concentrația fiecărei substanțe, ceea ce
permite evaluarea cantitativă. Semnalele transmise de detector sunt amplificate, apoi se
înregistrează grafic sub forma de ―pi curi‖ a căror înalțime sau arie e proporțională cu
concentrația. Identificarea și evaluarea cantitativă se fac cu ajutorul standardelor de referință
cu concentrație cunoscută.
d. Cromatografie de lichide de înaltă performanță – Metoda se bazează pe acelaș i
principiu ca și celelalte metode cromatografice și anume repartizare a diferită a componentelor
unui a mestec de substanțe între o fază staționară și o fază mobilă. Deosebirea majoră între
această metodă și cromatografia de gaz este aceea că faza mobilă es te lichidă și nu gazoasă.
În plus, faza mobilă nu are un simplu rol de cărăuș ci participă activ la procesul de separare
datorită unor interacțiuni complexe.
2.3.3 . Metode electrochimice
a.Electroforeza este tehnica analitică ce are la bază capacitatea particolelor încărcate
electric dintr -o soluție coloidală de a migra spre polul (+) sau ( -) atunci când prin mediul
respectiv trece un curent electric. Mai exact, dacă într -un mediu se găsesc particole încărcate
electric, pozitiv sau negativ, ș i dacă în mediul respectiv se creează un câmp electric între doi
electrozi sub tensiune, atunci particolele migrează către electrodul de semn contrar.
Viteza de migrare e condiționată de mai mulți factori, dar în primul rând de mărimea
încărcăturii electrice a fiecărei particole. In aceleași condiții de lucru (pH, temperatură,
intensitatea câmpului electric, natura suportului) viteza de migrare a substanțelor dintr -un
amestec e diferită în funcție de natura fiecărei substanțe.
In practica de la borator, electroforeza se utilizează în special pentru separarea fracțiunilor
proteice din lichidele biologice sau din extractele de țesuturi, ulterior fiind posibilă
identificarea și evaluarea lor cantitativă.
b.Metodele poten țiometrice se bazează pe determinarea concentrației ionilor din soluție
măsurând valoarea sau variația potențialului unui electrod indicator.
Aceste metode pot fi:
 directe (pH -metria)
 indirecte (titrări potențiometrice)

20
pH-ul se definește ca fiind logaritmul cu semn schi mbat al concentrației ionilor de
hidrogen dintr -o soluție. Se exprimă prin valori cuprinse între 1 -14.
 Valoarea 7 corespunde mediului neutru
 Valorile mai mici decât 7 corespund mediului acid
 Valorile mai mari decât 7 corespund mediului bazic (alcalin)
pH-ul are o importanta deosebita in desfasurarea reactiilor biochimice din organism.
In mediul biologic, valoarea constantă a pH este 7.2 -7.4.
Determinarea pH -ului se poate face prin metoda cu hârtie indicator, metoda cu soluție
indicatoare, dar pentru d eterminarea exactă a pH -ului se folosește metoda potențiometrică –
pH-metria.

hârtie de pH pH -metru

Principiul metodei constă în măsurarea diferenței de potențial electric între un electrod de
referință și un electrod de măsurare introduși în soluția de cercetat și exprimarea acesteia sub
formă de unități de pH.
Aparatele folosite se numesc pH -metre. Pentru etalonarea lor se folosesc soluții tampon.
Acetea s unt formate din soluții în care solvatul este alcătuit din două sau mai multe substanțe
chimice, care prin particularitătile lor se opun la schimbarea pH -ului atunci când variază
concentrația ionilor de hidrogen.
Exemple de sisteme tampon:
 Sistemul tampon constituit dintr -un acid slab și sarea lui cu o bază tare – acid acetic,
acetat de sodiu
 Sistem tampon constituit dintr -o bază slabă și sarea ei cu un acid tare – hidroxid de
amoniu, clorură de amoniu
Sistemele tampon îndeplinesc un rol biochimic e sențial în organism pentru că ele asigură
menținerea pH -ului în limite fiziologice specifice vieții.

21
c. Conductometria cuprinde metode de analiză bazate pe determinarea conductibilității
soluțiilor. Conductibilitatea soluțiilor de electroliți se datorea ză deplasării sarcinilor electrice
(ionilor) sub influența unui gradient de potențial realizat cu ajutorul a doi electrozi.
Există o dependență lineară între concentrația unui ion din soluție și contribuția acestui
ion la conductibilitatea totală a s oluției.

TEST

1. Ce este cromatografia ? Dați exemple de diferite tipuri de cromatografie.
2. Precizați care este me toda cea mai des utilzată în biochimia analitică cantitativă
3. Care sunt cele 3 categorii în care se împart radiațiile luminoase, pe baza raportului
între lungimea de undă și capacitatea de percepere a ochiului omenesc ?
4. Ce este pH -ul ? Indicați două metode de determinare a pH -ului.
5. Ce determinări se realizează cu ajutorul metodelor refractometrice ?
6. Ce sunt soluțiile tam pon ?

22
Laborator 3 – 4.Glucide

Glucidele sunt substanțe naturale universal răspândite în organismele vegetale și animale.
Au rol structural și energetic, reprezentând combustibilul principal al tuturor organismelor.
De exemplu, pentru un adult furnizează 60% din energia necesară.
Glucidele sunt substanțe cu funcțiuni mixte, care conțin în molecula lor grupări
carbonilice și hidroxilice, ele fiind polihidroxialdehide sau polihid roxicetone.
In funcție de complexitatea structurală glucidele se clasifică în două categorii:
 Oze – denumite și monozaharide – sunt compuși la care hidroliza acidă sau enzimatică nu
conduce la compuși mai simpli care să păstreze totuși proprietățile grupului.
 Ozide – sunt glucide care prin hidroliza acidă sau enzimatică pun în libertate una sau mai
multe molecule de monozaharide. In funcție de moleculele care rezultă în urma hidrolizei,
ozidele se împart în:
– Holozide – care conțin în structura lor monozaharide
– Heterozide – care sunt constituite din monozaharide și o componentă neglucidică
numită aglicon.
Reacțiile chimice folosite pentru identificarea și dozarea glucidelor, sunt reacții de
culoare, condensare, deshidratare, oxido -reducere, hid roliză, etc.

23
Extragerea glucidelor din produsele alimentare
Extragerea monoglucidelor și a oligoglucidelor din produsele alimentare se poate realiza
prin presare sau prin extracția produsului respectiv cu anumiți solvenți.
Extracția prin presare
Se aplică produselor alimentare cu conținul mare de apă și glucide solubile. In urma
presării se obține un suc care conține glucide solubile. Acest suc se utilizează la dozarea
glucidelor prin metode refractometrice și densitometrice. Rezultatele ace stor măsuratori sunt
orientative deoarece în sucul obținut pot exista și alte substanțe solubile în apă.
Extracția cu solvenți specifici
Această metodă este folosită frecvent în scopuri analitice și industriale. Solvenții utilizați
sunt: apa la 75 -80șC sau etanolul la temperatura de fierbere.
a). Extracția apoasă la cald cu defecare
Extractul primar obținut prin această metodă are un grad de puritate mai mare decât prin
presare, deoarece prin procesul de defecare se îndepărtează substanțele neg lucidice cu
ajutorul unor reactivi numiți defecanți. (In latină, termenul de ―defecare‖ înseamnă desfacere,
purificare).
b). Extracția alcoolică
Metoda se folosește pentru produsele cu conținut ridicat de amidon sau în scopuri
microanalitice. Amidonu l este insolubil în etanol și în felul acesta se înlătură posibilita tea
antrenării sale în extract. In cazul microanalizei glucidelor se aplică extracția alcoolică,
deoarece etanolul are un rol dublu: de extractant și de defecant. Extractul alcoolic poate fi
tratat cu schimbător de ioni pentru a scoate eventualii anioni și cationi existenți în extract sau
poate fi tratat cu cărbune activ pentru înlăturarea pigmentilor solubili în etanol.

24
3.1. Determinarea glucidelor totale din miere cu refractomet rul

Refractometrie este metoda pentru determinarea indicelui de refractie " n", sau a
refractiei molare Rm.Analiza refractometrica este utilizata pentru a determina concentratiei
unuei substante dintr -o solutie in functie de indicele de refractie.
Metoda refractometrica se aplica pentru determinarea concentratiilor solutiilor în
industria zaharului, conserve vegetale, produse zaharoase, glucoza, etc.; determina substanta
uscata solubila si concentratia de zahar daca în extractul solubil al unui produs alim entar
predomina zaharurile iar nezaharul este constant.
Refractometria se utilizeaza si pentru determinarea indicelui de refractie al grasimilor,
respectiv pentru determinarea continutului de grasime al unui produs alimentar.
Se numește indice de refracție raportul dintre sinusul unghiului razei luminoase față de
verticala ( α) și sinusul unghiului de refracție ( β).
Indicele de refracție=sin α/sin β

Indicele de refracție este o constantă specifică fiecărei substanțe. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mărimea și structura fizică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentrația unei soluții și astfel se poate stabili procentul de substanță
uscată sau de apă.
Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai utilizat fiind
refractometrul Abbé.
Indicele de refracție este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca determinările
să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometre le sunt cuplate de
obicei cu baie ultratermostatată.

Indicele de refracție

25

Tipuri de refractometre :

Se numește indice de refracție raportul dintre sinusul unghiului razei lumi noase față de
verticala ( α) și sinusul unghiului de refracție ( β).
Indicele de refracție=sin α/sin β

Indicele de refracție este o constantă specifică fiecărei substanțe. Valoarea lui depinde de
cantitatea, mărimea și structura f izică a particolelor dizolvate. Cu ajutorul acestei metode se
poate determina concentrația unei soluții și astfel se poate stabili procentul de substanță
uscată sau de apă.
Determinările se fac cu ajutorul aparatelor numite refractometre, cel mai uti lizat fiind
refractometrul Abbé.
Indicele de refracție este puternic influentat de temperatură, deci este necesar ca
determinările să se facă la temperatură bine reglată, constantă. In acest scop, refractometrele
sunt cuplate de obicei cu baie ultratermo statată.
Modul de lucru pentru refractometrul Abbe -Zeiss
1. Se depărtează prismele una de alta, se spală suprafața cu alcool și se lasă să se usuce.

Indicele de refracție

26
2. Cu o pipetă se pun câteva picături din lichidul de studiat pe suprafața prismelor, după
care se închide bloc ul prismelor.
3. Cu ajutorul oglinzii se îndreaptă fasciculul luminos către prisme.
4. Privind prin luneta din dreapta se pune la punct imaginea firelor reticulare prin învârtirea
ocularului. Apoi se caută domeniul de separație dintre câmpul luminos și întunecat
învârtind butonul din stânga. Dacă în câmpul lunetei se observă o figură neregulată,
înseamnă că lichidul nu a acoperit într eaga suprafață a prisme i. În acest caz se mai pun
câteva picături de lichid, până când domeniul luminos și cel întunecat sunt separ ate
printr -o linie dreaptă.
5. Cu butonul din stânga se aduce încrucișarea firelor reticulare în suparapunere cu nlinia de
separație. Cu lupa din stânga se citește pe scala gradată direct indicele de refracție IR al
lichidului
6. Se repetă măsurătorile de cel pu țin 3 ori.
Date experimentale:
Nr
probei. Repetitii/medie IR Conc SU
solubila in apa
1 R1
R2
R3
M
2 R1
R2
R3
M
3 R1
R2
R3
M

27
3.2.Determinări cantitative ale glucidelor
3.2.1. Determinarea glucidelor reducăto are cu ajutorul reacției Fehling
Reacția Fehling poate servi și pentru determinarea cantitativă a glucidelor
reducătoare. Pentru aceasta trebuie să determinăm ―titrul soluției Fehling‖, adică
corespondența în glucoză sau alt glucid reducător al reactiv ului Fehling, cu care se lucrează.
Prin titrul soluției Fehling se înțelege cantitatea de glucoză exprimată în miligrame,
care reduce amestecul format din 10ml soluție Fehling I+ 10ml soluție Fehling II.
Determinarea titrului soluției Fehling .
Se cântarește 1g glucoză pură, uscată în prealabil la 100șC și se dizolvă într -un balon
cotat de 100ml, completându -se la semn cu apă distilată.
Intr-un flacon Erlenmeyer se pun exact 10ml reactiv Fehling I și 10ml reactiv Fehling
II și se adaugă 10 -20ml apă distilată.Flaconul se încălzește până la fierbere pe o sită de azbest
și se adaugă din biuretă soluție de glucoză picătură cu picătură, până când soluția va deveni
incoloră și se observă depunerea unui precipitat roșu -cărămiziu, care se depune pe fund ul
vasului. Dacă se depășește punctul de viraj soluția va deveni galbenă din cauza caramelizării
glucozei și reacția trebuie repetată.
Este bine ca reactivul Fehling să fiarbă tot timpul, glucoza să se adauge numai în
picături și titrarea să se facă câ t mai repede.
Titrul soluției Fehling =N·10 mg
N= nr.ml de glucoză utilizați
In cazul determinării glucidelor din soluții necunoscute se procedează la fel ca și în cazul
stabilirii titrului, cu deosebire că în biuretă se pune soluția de cercetat.
Gluc oză mg =Titrul solutiei Fehling·1000/ N1
unde:
N1= numarul de ml utilizați din soluția de glucidă necunoscută

Calcule si observatii

28

29
3.2.2 .Determinarea glucidelor prin metoda Schrool
Determinarea zahărului r educător dupa această metodă este mult mai rapidă, nu
necesită aparatura specială (filtru G 4) însă este mai puțin exactă decât metoda Bertrand.
Prin această metodă, cantitatea de oxid cupros formată se determină indirect, prin
dozarea iodometrică a sulf atului de cupru existent în soluția Fehling, înainte și după reducere.
Diferența obținută reprezintă cantitatea de cupru redusă de către zahăr .
Reacțiile chimice care au loc sunt următoarele:
2 CuSO 4 + 4 KI = 2 CuI + 2 K 2SO 4 + I2
I2 + Na 2S2O3 = 2 NaI + Na 2S4O6
Reactivi necesari: – soluție Fehling I
– soluție Fehling II
– tiosulfat de sodiu 0,1N
– iodură de potasiu 10%
– acid s ulfuric, d=1,11
– amidon solubil 1%
Mod de lucru: Intr-un balon Erlenmeyer de 300ml se introduc 10ml soluție Fehling I, 10ml
soluție Fehling II și 20ml din soluția de analizat. Balonul se încălzește pe sită de azbest,
reglând u-se astfel flacăra becului încât soluția să fiarbă după trei minute. Se fierbe două
minute, se răcește apoi soluția în curent de apă după care se adaugă 20ml soluție de iodură de
potasiu și 15ml acid sulfuric.
 Se titrează iodul pus în libertate, prin redu cerea cuprului în iodură cuproasă, cu Na2S2O3
0,1N în prezența amidonului ca indicator. Titrarea se continuă până la dispariția culorii
albastre.
 Se face o probă martor pentru stabilirea titrului cantității de cupru din cei 10ml soluție
Fehling.
Proba martor se lucrează în aceleași condiții ca și proba de analizat, cu diferența că în
locul soluției de zahăr se adaugă 20ml apă distilată.
Cantitatea de cupru redusă de către zahăr se află în funcție de cantitatea de tiosulfat de
sodiu 0,1N folosită la titrare, pe baza relației :
V =V1 – V2 în care
V = ml Na2S2O3 0,1N corespunzător zahărului care se găsește în proba de analizat, in ml
V1 = ml tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei martor, în ml
V2 = ml de tiosulfat de sodiu 0,1N fo losit la titrarea probei de analizat în ml

30

Determinarea zahărului invertit și glucozei după Schoorl
Soluția de
Na2S2O3 0,1N ml Cupru mg Glucoză mg Zahăr Invertit
mg
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25 6,4
12,7
19,1
25,4
31,8
38,2
44,5
50,9
57,3
63,6
70,0
76,3
82,7
89,1
95,4
101,8
108,1
114,4
120,8
127,2
133,5
139,8
146,2
152,6
159,0 3,2
6,3
9,4
12,6
15,9
19,2
22,4
25,6
28,9
32,3
35,7
39,0
42,4
45,8
49,3
52,8
56,3
59,8
63,3
66,9
70,7
74,5
78,5
82,6
86,6 3,2
6,4
9,7
13,0
16,4
19,8
23,2
26,5
29,9
33,4
36,8
40,3
43,8
47,3
50,8
54,3
58,0
61,8
65,5
69,4
73,3
77,2
81,2
85,2
89,2

Cantitatea de zahăr analizată, corespunzătoare volumului V de tiosulfat de sodiu se află cu
ajutorul unui tabel, exprimarea fiind în zahăr invertit sau glucoză.

Calcul și observații

31

32
4. Determinarea lactozei din lapte prin metoda cu fericianură de potasiu
Lactoza din lapte este unul din componentele extractului uscat total reprezentând
aproximativ 35%. Lactoza este un co mpus instabil suferind fermentaț ii sub infuen ța
microorganismelor prezente în lapte.
Pentru determinarea lactozei din lapte se folosesc mai multe metode chimice
(metoda Bertrand, varianta Elser, metoda cu fericianur ӑ de potasiu), sau se folosesc metode
instrumentale (metoda polarimetricӑ ).
Lactoza, reduce în mediu alcalin și la cald, fericianura de potasiu K3[Fe(CN)6] în
ferocianură de potasiu, K4[Fe(CN)6], ceea ce va duce la decolorarea soluției galbene de
fericianură.
Reactivi necesari : – sulfat de cupru, soluție saturată
– soluție alc alină de fericianură de potasiu : se dizolvă 23g fericianură de
potasiu în cca.400ml apă, iar în alt pahar 23g hidroxid de potasiu tot în cca. 400ml apă.
Cele două soluții se trec în balon cotat de 1000ml, se completează cu apă la semn și se
omogenizează.
– soluție standard de lactoză: 5g lactoză se aduc cu apă în balon cotat de
1000ml, se completează la semn și se omogenizează.1ml din această soluție conține
5mg lactoză.
Mod de lucru
Stabilirea titrului soluției de fericianură de potasiu : Intr-un vas Erl enmeyer se introduc
10ml soluție alcalină de fericianură de potasiu, peste care se adaugă 30ml apă distilată și se
așează pe sita de azbest, iar deasupra lui se potrivește biureta cu soluție standard de lactoză.
Se pornește flacăra și când începe fierberea se picură soluție de lactoză din biuretă agitând
flaconul după fiecare picătură, până în momentul în care culoarea galbenă dispare brusc.
Ritmul de picurare trebuie să fie rar,iar soluția din vas în continuă fierbere moderată.
Titrul soluției de feric ianură de potasiu exprimat în numărul de mg lactoză necesar pentru a
reduce 1ml soluție de fericianură , se stabilește cu ajutorul formulei :
T = V x5 / 10
în care : V = volumul soluției de lactoză folosit, în ml
5 = conțin utul de lactoză, în mg , corespunzător la 1ml soluție
10 = volumul soluției de fericianură folosit,în ml

33
Determinarea : Intr-un balon cotat de 100 ml se introduc 10 ml lapte peste care se adaugă cca.
40ml apă și se omogenizează. Adӑugӑm 1 ml so luție saturat ӑ de CuSO 4, (0,5 ml solutie
saturata de fericianura de potasiu ). Amestecul se agitӑ de 3-4 ori și se completeazӑ cu apa
pâna la semn , dupa care se lasӑ 5 mi nute în repaus. După un repaos de 5 minute se filtrează
prin filtru cutat și se obține un lichid clar de culoare slab albăstruie. Pentru a îndepărta
excesul de sulfat de cupru adăugăm 0,5 -1,0g pulbere de zinc, se omogenizează și se filtrează
din nou. Astfel se obține un lichid incolor și perfect limpede.
Filtratul se introd uce în biuretă și se procedează în continuare ca la stabilirea titrului
soluției de fericianură.
Calculul rezultatelor
a. Calcul Titru

b. Calcul continut lactoza
Conținutul de lactoză din lapte, exprimat în g la 100ml, se calculează astfel :
Lactoză, g l a 100ml = (Tx10x10 /V x1000) x 100
în care :
T = titrul soluției de fericianură de potasiu
10 = volumul soluției de fericianură de potasiu luat în lucru,în ml
10 = raportul între volumul balonului cotat (50 ml) și laptele l uat în lucru (5 ml)
V = volumul de filtrat folosit, în ml
1000 = factor de transformare mg în g
100 = factor de exprimare pentru 100ml lapte

34
Interpretarea rezultatului
Continutul în lactoza al laptelui de vaca este în medie 4,55%.
Cantit atea de lactoza din lapte scade în cazul falsific ӑrii laptelui cu apa precum si în cazul
modificarilor inflamatorii ale glandei mamare. Laptele cu aciditate de peste 21șT nu se
preteazӑ pentru determinarea lactozei. În acest caz se vor obtine valori mai mici decât
cele pentru laptele proasp ӑt deoarece p rocesele fermentative se desfӑșoarӑ în primul rând
pe seama lactozei.

Test

1. Care este rolul glucidelor în organism ?
2. Cum se pot extrage glucidele din produsele alimentare ?
3. Dați exemplu de reacție de reducere, care p ermite identificarea și determinarea
cantitativă a glucidelor reducătoare.
4. Ce monoglucide rezultă în urma hidrolizei lactozei ?
5. Care este substanța de baza din reactivul Fehling?

35

Laborator 5 -6. Lipide

5.1.Determinarea principalilor indici la grăsimi
5.1.1. Determinarea punctului de topire

Valoarea punctului de topire al grăsimilor este în strânsă corelație cu natura și proporția
acizilor grași din structura lor chimică. Astfel, grăsimile care conțin și acizi grași saturați
inferiori de tipul acizilor butiric, caproic, caprilic, care la temperatura camerei sunt lichizi sau
semilichizi, vo r avea consistenta mai moale decât alte grăsimi, cum este cazul grăsimii
laptelui. Invers, grăsimile în structura cărora predomină acizii grași saturați superiori de tipul
acidului stearic vor avea consistența mult mai fermă, cum este cazul seului de rumeg ătoare.
Toți acizii grași nesaturați sun t lichizi la temperatura de 20˚ C. Exemplul cel mai evident
îl constituie uleiurile vegetale, la care proporția de acizi grași nesaturați este de 60%.
Pentru că grăsimea fiecărei specii are o structu ră chimică specifică și valoarea punctului
de topire va fi relativ specifică.
Punctul de topire poate fi socotit ca indicator util pentru stabilirea speciei de la care
provine grăsimea supusă analizei.
Valoarea punctului de topire este da tă de temperatura corespunzătoare momentului în
care grăsimea introdusă într -un tub capilar și încălzită lent, se clarifică brusc.
Materiale necesare:
– tuburi capilare din sticlă, uniform calibrate, bine degresate și uscate, cu diametrul interior
de 1mm și lungimea de 15 mm.
– termometru cu mercur de 0…100˚C, gradat din 0,1 în 0,1˚C
– pahar Berzelius de 100ml
– stativ cu clemă pentru suspendarea termometrului

36
– glicerină
– plită electrică sau bec de gaz
Mod de lucru : Intr -un creuzet mic de porțelan se int roduc câteva grame de grăsime și se
încălzește ușor până la topire completă. In acest moment, cu ajutorul unei pense, se introduc
în creuzet două tuburi capilare care se vor umple complet cu grăsime topită.Se lasă apoi
creuzetul în repaos pentru răcire și închegarea grăsimii. Se scot cele două tuburi capilare și se
curăță de grăsimea aderentă la suprafața lor externă. Coloana de grăsime din interiorul
capilarelor trebuie să fie compactă și să ocupe tot lumenul acestora. Cu ajutorul unui inel
subțire de cauc iuc se fixează cele două capilare de o parte și alta a rezervorului cu mercur al
termometrului și termometrul astfel pregătit se introduce la congelatorul frigiderului unde se
ține 24 de ore
Paharul Berzelius umplut cu glicerină se trece pe plita el ectrică sau pe sita de azbest și în
el se suspendă termometrul cu cele două tuburi capilare. Termometrul se fixează cu ajutorul
unei cleme în poziție perfect verticală, în așa fel încât să se ocupe centrul geometric al masei
de glicerină din pahar, iar tu burile capilare la rândul lor să fie în poziție perfect verticală.

Fig. Instalație pentru determinarea punctului de topire a grăsimii

Se acționează căldura și se urmărește temperatura pe scala gradată a termometrului și
aspectul grăsimii din cele două tuburi capilare. Incălzirea trebuie să fie lentă, încât viteza de
creștere a temperaturii să înregistreze un ritm de 2 -3˚C/ minut.
In preajma punctului de topire coloana de grăsime din capilare începe să se clarifice de
la exterior spre interior. In momentul în care s -a realizat clarificarea completă se citește
valoarea temperaturii. In acest moment o bulă de grăsime se va profila brusc la capătul
superior al tubului capilar, ca urmare a alunecării coloanei de grăsime topită împinsă de

37
presiunea de jos în sus a glicerinei din pahar. Aproape instantaneu picătura de grăsime se
desprinde de capătul tubului capilar și se ridică la suprafața stratului de glicerină.
5.1.2. Determinarea indicelui de iod
Dublele legături ale a cizilor grași nesaturați din compoziția grăsimilor conferă acestora
caracter de instabilitate chimică, ce se traduce și prin capacitatea lor de a adiționa ușor
halogeni la nivelul acestor duble legături.
Indicele de iod este cantitatea de iod, în grame, ad iționată de 100g grăsime.Valorea
acestui indice este condiționată de natura și proprția acizilor gra6si nesaturați (adică de
numărul dublelor legături) din compoziția grăsimilor. Grăsimile care au un conținut mic de
acizi grași neasturați vor avea indicele de iod cu valoare mai mică (grăsimile animale în
general), iar cele care au un conținut mare de acizi grași nesaturați, vor avea un indice de iod
cu valoare mare (uleiurile)
De exemplu, untul de vacă are un indice de iod cuprins între 21 – 36 ; untura d e porc
între 43 – 70 ; uleiul de floarea soarelui intre 119 – 135.
Indicele de iod constituie un criteriu pentru aprecierea purității grăsimii.
In condiții specifice de lucru, se tratează o cantitate dată de grăsime cu o soluție de iod de
concentrație cun oscută, apoi se titrează excesul de iod cu o soluție echivalentă de tiosulfat de
sodiu. Cantitatea de iod adiționată se calculează din diferență.
Reactivi necesari : – cloroform sau tetraclorură de carbon
– reactiv Ha nus (monobromură de iod)
– iodură de potasiu, soluție 15% proaspăt preparatӑ
– tiosulfat de sodiu, soluție 0,1N
– amidon, soluție 1%, proaspăt preparată
Mod de lucru: Cantitatea de grăsime care se ia în lucru, se va corela cu indicele de iod
probabil al acesteia după cum urmează:
– 1,0g , pentru indicele de iod cuprins între 10 -50
– 0,6g, pentru indicele de iod cuprins între 50 -70
– 0,25g, pentru indicele de iod cuprins între 70 -120
– 0,15g, pentru indicele de iod mai mare de 120
Intr-un flacon Erlenmeyer de 300ml cu dop rodat, se cântărește la balanța analitică
grăsimea în prealabil topită. Se adaugă apoi 10ml cloroform, 25ml reactiv Hanus și se lasă la
întuneric 30 -60 minute, funcție de valoarea indicelui de iod. Se adaugă apoi 20ml iodură de

38
potasiu, și 100ml apă distilată, apoi se titrează repede cu tiosulfat de sodiu. Spre sfârșitul
titrării, când culoarea soluției se deschide la galben, se adaugă 3 -5 picături soluție de amidon;
soluția se colorează în albastru . Se continuă titrarea agitând mereu, foarte energic, până la
dispariția culorii albastre.
In aceleași condiții se face si o probă martor, dar fără grăsime.
Calculul rezultatelor :
Indicele de iod = 0,01269 • (V – V1) • 100 / m în care:
0,01269 = cantitatea de iod, în g, corespunzătoare la 1ml tiosulfat de sodiu soluție 0,1N
V = volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martor
V1 = volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei ce se analizează.
m = cantitatea de grăsime, în g, luată în lucru.
5.1.3.Determina rea indicelui de saponificare
Indicele de saponificare exprimă numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar
pentru a saponifica total un gram de grăsime.
Cu cât este mai mare masa moleculară a gliceridei, respectiv a acizilor grași, cu atât
cantitatea de hidroxid de potasiu necesară saponificării este mai mică.Valoarea indicelui de
saponificare dă indicații a supra constituției chimice a grăsimii cercetate.
Reactivi necesari: – soluție alcoolică de hidroxid de potasiu aproximativ 0,5N – se preparӑ
dizolvând 32g hidroxid de potasiu în puțină apă și completând la
1000ml cu alcool de 95șC
– fenolftaleină 1% în alcool 95șC
– acid clorhidric 0,5N
Mod de lucru: Intr-un balon de 150 -200ml se cântăresc 1 -2g grăsime la care se adaugă apoi
25ml hidroxid de potasiu alcoolic.
Balonul se astupă cu un dop, prin care trece un refrigerent ascendent răcit cu apă, apoi se
încălzește pe o baie de apă fierbinte 30 -40 minute. După acest timp soluția din flacon se
titrează cu HCl 0,5N. Dacă soluția este puternic colorată, se diluează cu alcool pentru ca să se
poată observa cât mai bine culoarea roșie a fenolftaleinei.
Intr-un balon se face o titrare martor cu 25ml de hidroxid de potasiu alcoolic.
Difere nța dintre numărul de ml folosiți la titrarea soluției martor N 1 și a celor folosiți la
titrarea soluției cu grăsime N 2, dă numărul de ml de hidroxid de potasiu întrebuințați la
saponificarea grăsimii luată în lucru.

39
Din aceștia se calculeaz ă apoi numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru
saponificarea unui gram de grăsime și care reprezintă indicele de saponificare.
Indicele de saponificare = (N 1 – N2)• F HCl • 28 / G în care:
N1 = volumul de acid clorhidric, în ml, fo losit la titrarea probei martor
N2 = volumul de acid clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei de grăsime
28 = cantitatea de hidroxid de potasiu, în mg, corespunzătoare la 1ml hidroxid de potasiu,
G = masa de grăsime
5.1.4. Determinarea indicelu i de aciditate

Indicele de aciditate reprezintă numărul de miligrame de hidroxid de sodiu necesar pentru
neutralizarea acizilor grași liberi dintr -un gram de grăsime.
Reactivi necesari : – hidroxid de sodiu 0,1N
– fenolftaleină, soluție alcoolică 2%
– amestec alcool -eter 1:1 (un volum alcool etilic 95°C se amestecă cu un
volum eter etilic) înainte de folo sire se neutralizează cu NaOH 0,1N în
prezență de fenolftaleină .
Mod de lucru : Intr-un pahar Berzelius se cântăresc 5g de grăsime și se încălz ește până la
topire. Se adaugă 20ml amestec alcool -eter neutralizat față de fenolft aleină și se titre ază cu
NaOH 0,1N sub agitare continuă, până la apariția culorii roz care trebuie să persiste 30 de
secunde.
Calcul :
Aciditate, în acid oleic % = 0,0282 • V • 100 / m în care :
0,0282 = cantitatea de acid oleic, în g, corespunzătoare la 1ml hidroxid de sodiu 0,1N
V = volumul soluției de hidroxid de sodiu 0,1N, în ml, folosit la titrare
m = masa probei luată pentru determinare.
5.1.5. Indice de peroxid
Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de peroxid și alte substanțe oxidante dintr -o
cantitate dată de grăsime, care oxidează iodura de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o
soluție de tiosulfat de sodiu iar exprimarea rezultatelor se face în miliechivalenți de peroxid la
1 kg produs.
Reacti vi necesari : – cloroform + acid acetic glacial
– iodură de potasiu, soluție apoasă saturată, proaspăt preparată

40
– tiosulfat de sodiu, soluție 0,1N și 0,01N
– amidon, soluție 1%, proaspăt preparată
Mod de lucru : Probele de grăsime pentru această determi nare se recoltează în borcane brune
de sticlă cu dop rodat. Recipientul se umple complet cu grăsime fără a se forma goluri de aer,
se închide etanș și se păstrează la rece și întuneric pe tot parcursul, până în momentul
analizei.
Proba se încălzește mod erat pe baia de apă cu 5 -10°C peste punctul de topire a l
grăsimii, apoi se omogenizează ușor fără a se îngloba aer. Dacă grăsimea topită are un
conținut mare de apă (este pronunța tulbure) se adaugă cca. 20% sulfat de sodiu anhidru, se
omogenizează și se l asă în repaus pentru decantare.
Din stratul clar de la suprafață se cântărește foarte exact într -un flacon cu dop rodat o
cantitate corelată cu indicele probabil de peroxid și anume.

Indicele de peroxid probabil (miliechivalenți/kg) Cantitate a de grăsime (g)
Până la 19
între 19…31
între 31…50
între 50…88 5 ± 0,05
2,0 -1,2
1,5 -0,8
0,8 -0,5

In flaconul cu grăsime se introduc 10ml cloroform si se omogenizează până la
dizolvare. Se adaugă 15ml acid acetic, 1m l soluție de iodură de potasiu , se închide cu dopul,
se agită 1 minut si se lasă în repaus la întuneric exact 5 minute.
Se adaugă 75ml apă distilată și se titreză repede cu soluție de tiosulfat de sodiu, 0,01N
dacă indicele de peroxid este până la 19, sau 0,1N dacă indicele de peroxid este mai mare.
Către sfârșitul titrării se folosește soluția de amidon (până la dispariția culorii albastre) .
In paralel se efectuează o determinare martor în aceleași condiții dar fără grăsime.
Calculul rezultatelor:
Indice de peroxid, miliechivalenți/kg = (V – V1) ·n ·1000 / m
în care :
V = volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrare a probei
V1= volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea martorului
n = normalitatea soluției de tiosulfat de sodiu folosită la titrare
m= masa probei de grăsime, în g, luată în lucru

41
5.1.6. Reacția Kreis
Aldehida epihidrinică se formează în mod constant în procesul de oxidare avansată a
grăsimilor. Ea reacționează cu fluoroglucina în mediu acid, formând un compus colorat.
Intensitatea culorii este proporțională cu cantitatea de aldehidă epihidrinică, deci și cu
procesul de oxidar e.
Reactivi necesari : – fluoroglucină, soluție eterică 0,1 %. Se păstrează max 1 sӑpt. î n sticle
brune
– acid clorhidric concentrat(d=1,19)
Mod de lucru : Intr-o eprubetă curată se introduce o anume cantitate din proba de grăsime,
după topire a prealabilă la temperatură moderată (cca.50°C). Se adaugă același volum de acid
clorhidric concentrat și se omogenizează bine. Se adaugă în continuare același volum de
soluție de fluoroglucină și se omogenizează din nou.
Dacă untura este proaspătă soluția din eprubetă rămâne incoloră sau capătă o tentă gălbuie.
Dacă sunt instalate procese de oxidare, apare o culoare roșie de diferite intensități, funcție
de gradul râncezirii. Culoarea se dezvoltă imediat și este stabilă o oră.
Calcule si observatii

42

6.1. Determinarea grăsimii –metoda Soxhlet –principiul metodei

În produsele naturale, substanțele grase sunt înglobate de obicei în celule grăsoas e, a
căror membrană este de natură proteică. Extragerea cantitativă din proba care se analizează,
presupune eliberarea grăsimii din corsetul proteic.
Distrugerea membranei sau peliculei proteice se poate realiza pe două căi: pe cale
fizică (cu ajutorul căl durii), sau pe cale chimică (prin hidroliza acidă sau alcalină). Separarea
grăsimii de celelalte componente organice și minerale se poate realiza prin extracție selectivă
cu ajutorul solvenților organici, sau prin centrifugare.
Determinarea grăsimii din pr odusele alimentare de origine animală se poate realiza
prin mai multe metode: prin extracție cu solvenți organici, cum ar fi metoda Soxhlet,
Goldfish, Mojonnier sau folosind hidroliza acidă sau alcalină – metoda Gerber, Babcock.
Metoda de referință utiliz ată în laboratoarele de stat este metoda Soxhlet.
Principiul metodei
Grăsimea din proba de cercetat este extrasă până la epuizare cu solvenți organici și
după îndepărtarea solventului de extracție se cântărește și se exprimă procentual. Pentru
asigurarea extracției complete, proba este supusă în prealabil unui tratament termic la
temperatură moderată prin care se realizează deshidratarea și distrugerea membranei sau
peliculei proteice a microstructurii în care este înglobată.

Extractoare Soxhlet

43
6.2. Determinarea grăsimii din produsele lactate – metoda Gerber –
principiul metodei
Componentele majore din țesurile și umorile animale au greutate specifică 1,00 (apa) sau mai
mare de 1,00 (protidele, glucidele și substanțele minerale). Lipidele au greutate s pecifică mai
mică decât unu. Există deci posibilitatea separării și determinării lipidelor prin centrifugare.
Pentru aceasta este necesar ca toate componentele să se găsească sub formă de soluție,
emulsie sau suspensie coloidală, situație ce se poate reali za în condiții optime prin hidroliză
acidă.
Metoda se folosește în special pentru determinarea grăsimii din lapte și din produsele
lactate. Prin adaptări corespunzătoare însă, se poate utiliza pentru determinarea grăsimii din
orice produs de origine animală.
Produsul de cercetat este introdus într -un recipient de sticlă special numit butirometru
unde este supus unei hidrolize rapide cu ajutorul acidului sulfuric. Grăsimea eliberată din
structura în care este încorporată, se separă prin centrifug are. Pentru ușurarea separării se
folosește alcoolul amilic. Cantitatea de grăsime, exprimată procentual, se citește direct pe tija
gradată a butirometrului.

Butirometre

Centrifugă Gerber

44
Test

1. Care este rolul lipidelor în organism ?
2. Ce fel de acizi grași conțin ul eiurile ? Precizați care este reacția folosită pentru
determinarea gradului de nesaturare a grăsimilor.
3. Enumerați constantele caracteristice lipidelor.
4. Care este metoda folosită pentru a pune în evidență degradarea oxidativă avansată a
grăsimilor ?
5. Care est e principiul metodei de determinare a grăsimilor din lapte și alte produse
lactate ?
6. Indicați solventul folosit pentru extragerea grăsimilor prin metoda Soxhlet.

45
Laborator 7 -8-9. Determinarea proteinelor din produsele alimentare

Protidele sunt substanțe chimice esențiale ale materie vii. Ele sunt formate în special din
aminoacizi. Sunt substanțe complexe care conțin C, H, O, N și uneori sulf, fosfor, fier sau
cupru.
Rolul fundamental este cel plastic și funcțional și mai puțin e nergetic. Ele sunt
considerate cele mai importante substanțe prezente în regnul animal și vegetal.
Aminoacizii sunt acizi carboxilici în care un atom de hidrogen a fost înlocuit cu o
grupare amino, -NH 2; ei rezultă prin hidroliza acidă, bazică sau enzima tică a proteinelor.
Din punct de vedre al comportării față de diferiți solvenți protidele se clasifică în
proteine simple și proteine conjugate. Prin hidroliză proteinele simple eliberează numai
aminoacizi, iar proteinele conjugate eliberează pe lângă am inoacizi și o componentă
neproteică numită grupare prostetică.
In constituția corpului omenesc se găsesc câteva mii de proteine diferite, cu structuri
speciale care corespund anumitor funcții specifice.
Analiza calitativă și cantitativă a aminoacizil or se bazează pe reacțiile specifice date
de gruparea amino, carboxil, de radicalul moleculei fiecărui aminoacid, de legăturile
peptidice, pe valoarea punctului izoelectric și pe masa moleculară.
Reacțiile chimice prin care pot fi identificate protidele s e împart în:
– Reacții de culoare specifice sau generale
– Reacții de precipitare

46
7.1. Obținerea extractelor proteice

a.Albumina vegetală: 25g făină de grâu se amestecă cu 100ml apă distilată și se lasă să
stea 30 minute, agitând din când în când. S e filtreză pe filtru cutat. Dacă primele porțiuni sunt
tulburi se filtrează din nou.
b.Albumină de origine animală : La 50ml lapte se adaugă un volum egal de apă distilată
și apoi, în picături amestecând, 0,2 -0,3ml acid acetic concentrat, până la obțin erea unui
precipitat floconos.
După 5 -10 minute amestecul se filtrează printr -o pânză umezită în prealabil. Primele
cantități se refiltrează. Soluția limpede, puțin gălbuie conține albumină și o parte din
globulina din lapte. Reziduul de pe filtru est e constituit din cazeină și grăsime.
c.Obținerea proteinelor din albușul de ou
O soluție concentrată de proteine se formează dintr -un albuș de ou la care se adugă 5 -6g
NaCl. Se agită puțin, se pune într -un vas de 500ml . Când trebuie preparată o solu ție diluată,
se ia un anumit volum din soluția concentrată și se diluează de două sau de trei ori cu apă
distilată.
7.2. Identificarea aminoacizilor prin cromatografie in strat subtire
Proteinele sunt alcătuite dintr -un amestec de aminoacizi în diferi te proporții și din această
cauză este important să cunoaștem aminoacizii constituenți.
Separarea și identificarea aminoacizilor constituenți este posibilă prin cromatografie pe
hârtie sau în strat subțire.
In cromatografia pe hârtie se folosește h ârtie de filtru îmbibată și străbătută de diferite
amestecuri de solvenți, de exemplu fenol -apă sau butanol –apă. Aceleași amestecuri de
solvenți sunt folosiți și în cromatografia în strat subțire cu deosebirea că în acest caz faza fixă
este dispusă pe o pl acă de sticlă, și este constituită dintr -un material poros solid –silicagel sau
oxid de aluminiu.
Aminoacizii se deplasează cu viteze diferite de -a lungul hârtiei sau a plăcii cromatografice.
Deoarece aminoacizii sunt incolori, trebuie să se realizeze o reacție de culoare cu ninhidrină.
Aminoacizii se prezintă sub formă de pete de dimensiuni diferite, cu intensități diferite de
culoare.
Pentru a identifica în parte se face o cromatogramă de comparație, folosind câte un
aminoacid cunoscut, astfel se p oate cunoaște poziția fiecărui aminoacid în cromatogramă.
Aparaturӑ necesara : – amestec de 2 -3 aminoacizi (1mg/ml apă, 0,1%)

47
– soluții de control de aminoacizi (1mg/ml)
– amestec de develop are butanol -acid acetic – apă 4:1:5
– ninhidrină 0,1 -0,2% în butanol
– Hârtie cromatografică Whatman nr.1 sau plăci croma tografice
Mod de lucru: Pe o placă cromatografică se trag linii pa ralele la distanțe de 1cm. La 2cm de
marginea inferioară se așează cu micropipeta câte o picătură din soluția de cercetat și din
soluțiile de control. Diametrul fiecărei picături trebuie să fie cca. 2 -3mm, iar cantitatea
maximă de aminoacizi într -o pată în jur d e 0,03mg/. Placa cromatografică se introduce în
tancul de cromatografiere care conține amestecul de developare, astfel încât capătul pe care
au fost puși aminoacizii să ajungă în soluție. Petele de aminoacizi nu trebuie să intre în
amestecul de devel opare. Se lasă un timp, până când frontul solventului ajunge la 2cm de la
marginea superioară a plăcii. Se scoate placa, se usucă în etuvă la 100°C și se pulverizează
cu ninhidrină. Se introduce 10 minute în etuvă la 90°C, apoi se observă poziția și inten sitatea
culorii petelor apărute și se calculează Rf -ul.
Distanța de la linia de start la pată
Rf = ——————————————————————
Distanța de la linia de start până la front ul solventului

Acidul aminat Rf Culoarea ninhidrină
Alanină 0.38 Violetă
Arginină 0.20 Violetă
Cisteină 0.07 Brună
Cistină 0.08 Brună
Acid glutamic 0.30 Violetă
Glicină 0.26 Violetă
Histidină 0.20 Violetă -brun
Izoleucină 0.72 Violetă
Leucină 0.73 Violetă
Lizină 0.14 Violetă
Metionină 0.55 Violetă
Ornitină 0.15 Violetă
Fenilalanină 0.68 Violetă
Prolină 0.43 Galbenă
Serină 0.27 Violetă
Treonină 0.35 Violetă
Triptofan 0.50 Violetă -brun
Tirozină 0.45 Albastră
Valină 0.60 Violetă

48

http://www.reachdevices.com/TLC_aminoacids.html

49

8.1Titrul proteic . Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Sorensen

Laptele de vacӑ contine în medie 3,4% proteine r eprezentate de:
• cazeina (2,7%);
• lactalbumina (0,4% -0,5%);
• lactoglobulina (0,1 -0,2%).
In structura prote inelor aminoacizii sunt legați între ei prin legături peptidice între
gruparea amino a unui aminoacid și gruparea carboxilică a altui aminoacid. In lanțurile
polipeptidelor există și grupări amino și carboxilice libere. Pentru determinarea cantitativă
este necesară punerea în libertate a aminoacizilor din macromolecula protidică. In acest scop
soluția este supusă hidrolizei alcaline.
Principiul metodei
Grupele amin ice libere ale proteinelor ( -NH 2 ) reactioneaza cu formaldehida formând grup ӑri
(N=CH 2) caract eristice bazelor Schiff. În acest fel aciditatea datorata gruparilor carboxilice
(-COOH) se poate mӑsura prin titrare cu soluț ie de hidroxid de sodiu si se poate corela cu
continutul de proteine prin înmultirea cu un factor empiric. Reactiile chimice sunt
urmӑ toarele:

Reactivi: – NaOH 0,143N. 1ml din această soluție corespunde la 1% proteina
– aldehidă formică soluție 40% , neutralizată față de fenolftaleina inainte de folosire
– oxalat de po tasiu soluție 28% , neutralizată față de fenolftaleina inainte de folosire
– sulfat de cobalt heptahidrat, soluție 5%
– fenolftaleină soluție alcoolică 2%

50
Mod de lucru:
Prepararea probei martor
– într-un vas Erlenmeyer de 100ml se introduc 25ml lapte, 1ml soluție de oxalat de potasiu și
0,5ml soluție de sulfat de cobalt, după care se omogenizează. Se dezvoltă imediat o culoare
roză care este stabilă. Fenolftaleina s -a adăugat la neutralizarea celor două soluții.
Determinar ea titrului proteic : Intr -un vas Erlenmeyer asemănător cu al probei martor se
introduc 25ml lapte, 1ml soluție de oxalat de potasiu și eventual 2 -3 picături de fenolftaleină.
Se omogenizează bine și după 1 minut se neutralizează cu hidroxid de sodiu până l a o
colorație identică cu a probei martor. Prin această operație s -au neutralizat toți acizii liberi din
probă. Pentru ca determinarea să fie precisă este necesar ca la această neutrali zare să nu se
întrebuințeze un volum de hidroxid de sodiu 0,143N, mai mare de 1,75 ml. Laptele cu
aciditate proprie mai mare nu este apt pentru determinarea proteinelor prin această metodă.
In proba astfel neutralizată se adaugă 5ml aldehidă formică ș i se omogenizează. Culoarea
roz dispare brusc și laptele își reia culoa rea albă sp ecifică. După 1 minut se titrează din nou
cu soluția de hidroxid de sodiu până la culoare identică cu a probei martor, notându -se
volumul de hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare.
In condițiile în care s -a respectat întocmai metoda de lucru descrisă, volumul soluției de
hidroxid de sodiu folosit la a doua titrare reprezintă conținutul de proteine, în procente al
probei de lapte supusă analizei.
Rezultatul se exprimă ca media aritmetică a două determinări efectuate în aceleași condi ții.
Metoda are caracter orientativ.
Titrul proteic =V ,
unde V este volumul de solutie NaOH 0,143N (în ml) folosit la a doua titrare.
Rezultatul se exprima prin media a doua determinari efectuate pe aceeasi proba.
Calcul si observatii:

51
8.2. Dete rminarea conținutului de cazeinӑ din lapte

Principiul metodei
Metoda are la bazӑ determinarea titrului proteic prin metoda Sorensen. Formal dehida adӑugatӑ
în lapte blocheazӑ grupӑrile amino , din proteine si determinӑ creșterea aciditӑții libere.
Mӑsurarea nivelului aciditӑții libere dupӑ blocarea grupӑrilor aminice stӑ la baza determinӑrii
proteinelor din lapte.
Mod de lucru
Intr-un balon Erlenmeyer de 100 ml se adaugӑ 10 ml lapte; 0,5 ml soluție alcoolicӑ de
fenolftaleinӑ și se titreazӑ cu NaOH 0,1 M pânӑ la culoarea roz. Adӑugӑm 2 ml formaldehidӑ
20% și se titreazӑ din nou cu NaOH 0,1M pânӑ la apariția colorației roz care persist 30
secunde.
Conținutul de casein se calculeazӑ cu ajutorul formulei urmӑtoare
Caseinӑ g% = V x 1,47
Unde, V = – volumul NaO H folosit la a doua titrare
1,47 – factor de conversie pentru cseiӑ
Conținut mediu de cazeinӑ în diferite tipuri de lapte:
vacӑ – 2,60%,
caprӑ – 2,90%,
oaie – 4,50%,

52
9.1.Determinarea proteinelor – metoda biuretului
Principiul metodei
Sulfat ul de cupru în mediu bazic reacționeazӑ cu substanțele care conțin 2 sau mai
multe legӑturi peptidice formând un complex colorat în albastru – violet. Intensitatea culorii
este direct proporționalӑ cu numӑrul legӑturilor peptidice din proteinӑ. Numele metod ei
provine de la compusul biuret H 2N-CO-NH-CO-NH 2 care dӑ reacție pozitivӑ tipicӑ. Metoda
este folositӑ pentru determinarea unor cantitӑți relativ mari de proteinӑ (1 -20 mg).
Reactivi
– Soluție standard de albuminӑ sericӑ bovinӑ 5mg/ml preparatӑ extempor aneu
– Reactiv biuret (3g CuSO 4 x 5 H 2) si 9 g tartrat de sodiu si potasiu in 500 ml solutie NaOH
0,2M, se adaugӑ 5g KI și se aduce la 1 l cu NaOH 0,2 M.
– extract proteic total obținut prin centrifugarea unui omogenat (1g tesut hepatic /10 ml apӑ
distilat ӑ)
Mod de lucru
In 6 eprubete se pipeteazӑ:
Nr.
crt ml solutie
standard ml apa
distilatӑ Proteinӑ
mg/2ml Absorbanta
DO
1 0 2,0 0
2 0,1 1,9 ,5
3 0,5 1,5 2,5
4 1,0 1,0 5
5 1,5 0,5 7,5
6 2,0 0 10

In fiecare eprubeta adӑugӑm 3 ml de reactiv biur et. Probele se agitӑ energic, se
incubeazӑ timp de 10 minute la 37 °C si dupӑ rӑcire se colorimetreazӑ la 540 nm fațӑ de apӑ.
Se construiește o curbӑ de etalonare trasând pe abscisӑ mg/2ml proteinӑ – iar pe ordonatӑ DO
la 540nm. Se determinӑ concentrația pr oteicӑ în extractul proteic total, incubând 2ml preparat
cu 3ml reactiv biuret la 37°C timp de 10 minute. Dupӑ rӑcire, proba se colorimetreazӑ la 540
nm fațӑ de apӑ – iar DO mӑsuratӑ este transformatӑ in concentratie proteicӑ mg/2ml cu
ajutorul curbei de e talonare. Dacӑ intensitatea cu lorii este prea puternicӑ se dilueazӑ
preparatul proteic pânӑ când DO se încadreazӑ în curba de etalonare. Valorile obținute trebuie
multiplicate prin factorul de diluție.

53
Calcule și observații

54

9.2.Determinarea proteinelor – metoda Kjeldhal –principiul metodei
Componenta de bază, cu valoare nutritivă, din majoritatea produselor alimentare de
origine animală dar si vegetalӑ este proteina. Calitatea acestor produse se apreciază, în primul
rând, după conținutul lor în proteine.
Proteinele dintr -un anumit tipde aliment au un conținut de azot cu valoare relativ
constantă, la 100g proteine. Cunoscând conținutul de azot se poate calcula cantitatea de
proteine cu ajutorul unui factor de convertire
Exemplu pentru carne -Continutul de azot este 16 g la 100 g protein. Factorul de
convertire este 6,25 (rezultat din raportul 100/16).
Principiul metodei
Proba de analizat se mineralizează prin încălzire cu acid sulfuric concentrat în
prezența unui catalizator. în urma degradării proteinelor și a celorlalți compuși cu azot, se pun
în libertate ionii de amoniu care se combină cu acidul sulfuric formând bisulfatul de amoniu.
Amoniacul pus în libertate prin alcalinizare puternică este distilat și titrat.

TEST

1. Care sunt metodele de obținere a extractelor proteice ?
2. Care este rolul proteinelor în organism ?
3. De câte feluri pot fi reacțiile de precipitare ?
4. Ce este punctul izoelectric ?
5. Care sunt cele trei etape ale metodei Kjeldahl ?

55
Laborator 10 . Enzime
Enzimele sunt substanțe de naturӑ proteicӑ , fiind constituite fie numai din resturi de
aminoacizi, legați prin legături peptidice, fie din catene polipeptidice și alte componente
organice sau anorganice. Acestea prezintă struct uri spațiale complicate.
Enzimele, numite și biocatalizatori, accelerează viteza reacțiilor biochimice de 108 –
1011 ori prezentând o capacitate catalitică superioară catalizatorilor chimici.Reacțiile care în
laboratoarele de chimie decurg în condiții speciale de temperatură, presiune, pH, în prezența
enzimelor decurg în condiții moderate.
Activitatea catalizatorilor, i ndiferent de natura lor chimică , se caracterizează prin
faptul că poate fi decelată când aceștia se găsesc în cantități foarte mic i. La sfârșitul reacției
atât catalizatorul chimic cât și enzima se regăsesc, într -o stare neschimbată, putând participa
la un nou atac catalitic .
Enzimele au un grad deosebit de complexitate, motiv pentru care sunt ușor
denaturabile prin modificarea temperaturii, pH-ului, prin acțiunea razelor UV, a
ultrasunetelor, prin congelări și decongelări repetate etc.
Deosebirea esențială dintre enzime și catalizatorii chimici constă în înalta specificitate
de acțiune a enzimelor, având capacitatea de a c ataliza un singur tip de reacție biochimică,
uneori a unei singure substanțe chimice (specificitate absolută de substrat).

Determinarea activității enzimatice
Prezența unei enzime într -un amestec de reacție poate fi pusă în evidență și urmărită
fie p rin dispariția substratului, fie prin apariția unui produs de reacție. Enzima este incubată
cu substratul, în condiții de concentrații, pH și temperatură strict controlate și din amestecul
de reacție se scot la anumite intervale de timp probe, care sunt an alizate.
Fiecare probă este însoțită de un martor, în scopul depistării reacțiilor chimice
nespecifice și spontane care au loc independent de enzimă.
Dacă urmărim variația în timp a vitezei enzimatice vom constata că la început acest
parametru c rește linear, după care scade. Abaterea de la linearitate a vitezei de reacție în
funcție de timp poate fi datorată fie inversării sensului reacției (echilibrul este atins și reacția
inversă devine mai importantă), fie scăderii în timp a concentrației subs tratului când enzima
nu mai este saturată în acesta, fie inhibiției printr -un produs al reacției. Pentru a minimaliza
aceste efecte, în cercetările enzimologice se determină viteza inițială de reacție v o cand v
crește linear în timp.

56
Activitatea enzima tică este frecvent exprimată în unități (U), astfel că o unitate reprezintă
cantitatea de enzimă ce catalizeză transformarea a 1 micromol de substrat într -un minut, în
condiții definite. Unitatea internațională sistematică a activității enzimatice este kat al-ul (kat)
care reprezintă transformarea unui mol de substrat pe secundă .
Puritatea unei enzime se exprimă prin activitatea specifică, care este numărul de unități
enzimatice (U) pe mg proteină sau numărul de catali pe kg proteină.

10.1. Evidențier ea unor enzime
10.1.1.Evidențierea peroxidazei din hrean
Peroxidaza catalizează oxidările cu oxigen peroxidic, deci activează și următoarea reacție
în care donorul de electroni este pirogalolul.
Trecerea culorii în portocaliu -brun indică apariția c onfigurației chinonice în purpurogalină.
Reactivi necesari : – peroxidază (extract apos de hrean)
– pirogalol 2%
– apă oxigenată 0,5%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml extract apos de hrean, la care se adaugă 0,5ml
pirogalol și două picături de apă oxigenată. Imediat apare o culoare portocalie –brună.
10.1.2. Evidențierea activității peroxidazei din lapte
Peroxidaza existentă în laptele care nu a fost supus unui tratament termic de scompune apa
oxigenată cu eliberare de oxigen. Evidențierea acestui fenomen se poate face prin reacții de
culoare specifice ale oxigenului cu unele substanțe ușor oxidabile, cum ar fi ; parafenilen
diamina, tinctura de guaiac sau benzidina.
Evidențiere a activității peroxidazei este utilă pentru identificarea laptelui nepasteurizat.
Reactivi necesari : – apă oxigenată 3%
– parafenilendiamină
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 5ml lapte, 5 picături apă oxigenată și cca. 1g
amestec de parafenilendiamină cu nisip, după care se omogenizează, se lasă în repaos 2
minute, apoi se citește reacția.
In cazul prezenței peroxidazei (lapte nepasteurizat) lichidul din eprubetă capătă culoare
albastră cenușie
In cazul abs enței peroxidazei (lapte corect pasteurizat) lichidul nu -și modifică culoarea sau
capătă o tentă cenușie slab perceptibilă.

57

10.2. Influența factorilor fizico -chimici asupra activității enzimelor
10.2.1.Influența temperaturii asupra activității enzimelor
Acțiunea temperaturii asupra reacțiilor enzimatice este dublă:
– modifică viteza reacției enzimatice
– denaturează enzima, respectiv apoenzima care este de natură proteică
Majoritatea enzimelor au o temperatură optimă, între 20 -40°C. La temperaturi sub 0°C,
activitatea enzimelor scade foarte mult, fără să fie distruse. Sub formă uscată, enzimele își
păstrează activitatea și unele pot rezista scurt timp la o temperatură de 100°C. Se preferă ca
temperatură de lucru +37°C, deoarece distruge rea enzimei este practic nulă, iar viteza reacției
este suficient de mare.
Reactivi necesari : – salivă diluată
– soluție de amidon 1% în clorură de sodiu 0,3%
– reactiv Fehling
Mod de lucru: In două eprubete se măsoară câte 4ml soluție amidon 1% în cl orură de sodiu
0,3%. Intr -o eprubetă se adaugă 1ml salivă proaspătă, nefiartă, iar în a doua 1ml salivă fiartă.
Se agită și se introduc în termostat la + 37°C timp de 15 minute. Se adaugă în fiecare
eprubetă 1ml reactiv Fehling și se fierbe pe baie de apă 5 minute. In eprubeta cu salivă
nefiartă, reactivul Fehling este redus la suboxid de cupru de culoare roșie cărămizie. In
eprubeta cu salivă fiartă, unde amila za este distrusă prin fierbere, amidonul; nefiind
hidrolizat, reactivul Fehling nu este redus, d eci culoarea nu se schimbă.

58
10.2.2. Influența pH -ului asupra activității enzimatice.

Fiecare enzimă dezvoltă o activitate maximă la o anumită valoare a pH -ului= pH optim.
Extractu l enzimatic s -a obținut din car tofi 10 g cartofi se moja rează cu 5 g carbonat de
calciu. Amestecul se trece cantitativ in cilindru de 100 ml si după o oră se filtrează prin vată.
Modul de lucru
Reactiv Balon 1 Balon 2 Balon 3 Balon 4
Extract enzimatic 5 ml 5 ml 5 ml –
HCl 1 N (pH=2) 2 ml – – –
NaOH 1 N (pH=14 ) – – 2 ml –
Apă distilată (pH=7 ) – 2 ml – 5 ml
Se agită
H2O2 1% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Se lasă în repaos 15 minute
H2SO 4 15% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
KI 10% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Molibdat de amoniu 1% 2-3 picături. Agitare energică 2 -3 minut e

Probele se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N în prezența amidonului ca indicator până
la decolorare.
Calcul
Datele experimentale exprimate în ml tiosulfat de so diu se scad din ml tiosulfat folosit
la titrarea probei martor. VM – VP
Folosind aceste date si pH -ul la care a acționat enzima se trasează curba care indică
influența pH -ului asupra activității enzimei.
Calcule și observații laborator 10.

59
TEST

1. Ce sunt enzimele și ce rol au în organism ?
2. Care este dife rența între cataliza enzimatică și cea chimică ?
3. Care sunt factorii care influențează activitatea enzimatică ?
4. Care este enzima care catalizează hidroliza amidonului ?
5. Ce importanță prezintă determinarea activității peroxidazei în industria alimentară
6. Care este enzima determinată din mierea de albine, ce constituie un criteriu de
autenticitate al mierii de albine ? Descrieți principiul metodei de lucru folosite.

60
Laborator 11 -12. Vitamine
Celulele conțin pe lângă componentele lor d e bază, anumite substanțe organice, act ive la
concentrații foarte mici, numite vitamine , care sunt vitale pentru organism. Unele organisme
nu pot sintetiza vitamine și trebuie să le obțină din surse exogene.
Lipsa vitaminelor din organism (avitaminoză) , insufi ciența (hipovitaminoză) sau
concentrația crescută (hipervitaminoză) dau naștere la tulburări metabolice mai mult sau mai
puțin grave.
Vitaminele au structură chimică heterogenă și din această cauză clasificarea lor este foarte
dificilă.Cel mai des folosit criteriu este în funcție de solubilitate și după acest criteriu există
vitamine liposolubile (A, D, E, K) și vitamine hidrosolubile (vitaminele B, C, PP).
Fiecare vitamină prezintă reacții caracteristice majoritatea lor fiind reacții de cu loare.

11.1. Metode de identificare ale vitaminelor

Identificarea vitaminei A
a. Vitamina A dă cu acidul tricloracetic o colorație galbenă care virează în albastru.
Reactivi necesari : – soluție uleioasă de vitamina A 0,1mg%
– soluție cloroformică de acid tricloracetic 30%
Mod de lucru: Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluție uleioasă de vitamina A și 1ml soluție
acid tricloracetic 30%. Apare o colorație galbenă care virează în albastru.

b. Vitamina A tratată cu fenol în prezența guaiacolului dau o colorație roșie purpurie.
Reactivi necesari : – soluție uleioasă de vitamină A 0,1mg%
– guaiacol cristale
– fenol p.a.
– acid clor hidric concentrat
– cloroform
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se măsoară 0,5ml soluție vitamină A la care se adaugă un
cristal de guaiacol, 2 picături fenol, 1ml acid clorhidric concentrat și 5ml cloroform. După
agitare apare o coloratie roșie -purpurie.
c. Reacția dintre vitamina A și clorura de stibiu în soluție cloroformică, cu formarea unei
colorații albastre, poartă denumirea de reacția Carr -Price. Reacția poate fi folosită și pentru
dozarea vitaminei A.

61
Reactivi necesari : – concentrate de vitamina A
– cloroform purificat
– soluție cloroformică de clorură de stibiu
Mod de lucru : la 4-5 picături de soluție de vitamina A se adaugă 1ml cloroform și 1 -2 ml
soluție cloroformică de clorură de stibiu. Se agită conținutul eprubetei. Apare o colorație
albastră proporțională cu conținutul de vitamina A.
In cazul determinărilor cantitative se compară culoarea obținută cu o scară etalon sau
colorimetric.
Identifica rea vitaminei D
a. Reacția cu aldehide: Vitaminele D reacționează cu aldehidele aromatice (vanilină,
furfural), în prezența acidului percloric, cu formarea de produși colorați.
Reactivi necesari : – soluție benzenică de vitamina D
– soluție 0,1% de aldehidă aromatică în benzen
– acid acetic glacial
– amestec de acid percloric ; 2ml aldehidă acetică se tratează
2,5ml acid aceti c glacial și se încălzește la 95 -100°C, timp
de 30 minute .
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se iau 1ml soluție benzenică de vitamina D și 1ml de aldehidă
aromatică în benzen și se încălzesc la fierbere. Se adaugă apoi dou ă picături de reactiv
percloric și se fierb încă un minut, apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Soluția
devine tulbure, colorată în verde. Se adaugă 1,5ml acid acetic și se urmărește culoarea
formată.
a. Reacția cu clorura de stibiu : soluția b enzenică de vitamina D se tratează cu cloroform
în raport de 1:10 și apoi cu o soluție cloroformică de clorură de stibiu.și se obține o colorație
galben -portocalie.
b. Reactia cu anilină
Reactivi necesari: – untură de pește
– amest ec anilină : HCl, în raport 15:1
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 3ml untură de pește sau soluție uleioasă de
vitamina D, și 1ml amestec de anilină :HCl. Se agită ușor si se încălzește la fierbere. Emulsia
galbenă devine la început verde șters apo i trece în roșu. După 2 -3 minute emulsia se separă în
două straturi dintre care cel inferior are o culoare roșie intensă.

62
Identificarea vitaminei E
a. Reacția cu acidul azotic
α- tocoferolul se oxidează în prezența clorurii ferice sau a acidului azo tic la α –
tocoferilchinonă, de culoare roșie
Reactivi necesari : – soluție uleioasă de vitamina E
– etanol
– acid azotic concentrat
Mod de lucru : Se iau într -o eprubetă câteva picături dint r-o soluție uleioasă de vitamina E,
se tratează cu câteva picături de acid azotic concentrat. Conținutul se încălzește de la sine și
apare o colorație brună roșie (se lucrează cu atenție și la nevoie se răcește).
c.Reacția cu clorura ferică
Datorită grupării hidroxil tocoferolii dau reacție pozitivă cu clorura ferică. Reacția este
specifică fenolilor, care sunt oxidați la compuși chinonici.
Reactivi necesari : – soluție alcoolică de vitamină E 0,1mg %
– soluție clorură ferică 10%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se introduc 0,5ml solutie alcoolică de vitamină E și 2 -3
picături soluție clorură ferică 10%. După agitare apare o coloratie galben -roșiatică
Identificarea vitaminelor B
a.Vitamina B 1: In mediu alcalin este oxid ată de fericianura de potasiu la tiocrom de culoare
roșie, care prezintă o fluorescență albastră în UV.
Reactivi necesari : – soluție vitamina B 1 1g ‰
– solutie de fericianură de potasiu 2%
– metanol
– NaOH 30%
– izobutanol
– etanol 96°
Mod de lucru : Intr-o pâlnie de separare se pipetează 1ml din soluția de vitamină, 4 picături
metanol și 1 -2 picăt uri de fericianură de potasiu 2%. Se agită și se adaugă 1ml sol. NaOH
30%. Se lasă în repaus 2 minute și se introduc 10ml izobutanol, după care se agită energic. Se
lasă în repaus câteva minute, după care timp se separă cele două straturi. Stratul inferior apos
se îndepărtează și se reține stratul cu izobutanol care conține tiocromul . Se spală cu 3ml apă
distilată . Se separă apa, iar stratul de izobutanol se tranvazează într -o eprubetă și se adaugă

63
2ml etanol. Eprubeta se așează în fața unei surse de lumină UV, când se observă apariția unei
fluorescente albastre .
b. Vitamina B 2: prezintă fluorescență galben -verzuie și sub acțiunea reducătorilor trece în
leucoderivat, care nu mai prezintă fluorescență. Reacția este reversibilă și își recapătă
fluorescenta în prezența oxigenului.
Reactivi necesari : – soluție vitamina B 2 50mg %
– zinc metalic granule
– soluție acid clorhidric 10%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se măsoară 1ml soluție vitamină B 2, care prezintă o
fluorescență galben -verzuie. Se adaugă 20 -30 mg zinc metalic și 2ml acid clorhidric 10%. Se
agită de câteva ori și se observă dispariția fluorescenței. Se astupă eprubeta cu degetul și se
agită. Se observă apariția fluorescenței, datorită oxi dării vitaminei sub acțiunea oxigenului
atmosferic.
Identificarea Vitaminei C
a. Vitamina C datorită proprietății de a se oxida ușor, reduce sărurile de argint la argint
metalic.
Reactivi necesari : – soluție vitamină C 3g%
– soluție azotat de argint 5g%
– soluție hidroxid de amoniu 20%
Mod de lucru : Intr-o eprubetă se măsoară 1ml azotat de argint și se adaugă hidroxid de
amoniu picătură cu picătură până la dizolvarea precipitatului format inițial. Se adaugă 2ml
soluție de vitamină C și se încălzește pe baie de apă 5 -10 minute. Va apărea argintul metalic
depus pe pereții eprubetei.
b. Vitamina C se extrage din țesuturi cu soluții slab acide pentru a fi evitată alterarea ei, apoi
se identific ă cu ajutorul fericianurii de potasiu. In preze nța clorurii ferice, vitamina C , reduce
fericianura de potasiu , formând albastrul de Berlin.
Reactivi necesari : – soluție de HCl 2%
– fericianură de potasiu 1%
– clorură ferică soluție 1%
Mod de lucru : Se cântăresc 4 -5g din materialul vegetal și se introduc într -un mojar unde se
mojarează cu nisip și HCl 2%. Se aduce apoi volumul la 100ml cu acid clorhidric și se
filtrează . Din acest lichid se in troduc 5ml într -o eprubetă și se tratează cu o picătură de sol.
fericianură de potasiu și o picătură de sol. de clorură ferică. Rezultă o colorație albastră.

64
11.2.Determinarea vitaminei C din vegetale
Se bazează pe proprietatea reducătoare a acidului asco rbic. Acidul ascorbic prin
oxidare se transformă în acid dehidroascorbic. Dozările se fac prin volumetrie iar solutia de
titrare este – iodat de potasiu,
Extracția din produse vegetale
15 g produs vegetal se mojarează timp de 10 minute cu 2,5 g de nisip si 10 ml de acid
metafosforic. Se complectează la 50 ml cu acid metafosforic, se filtrează sau se
centrifughează. Din filtrat se iau 10 ml si se dozează vitamina C la fel ca din suc.
Dozarea vitamine C
Reactivi: – soluție standard vitamina C 1 mg/ml
– amidon 1%
– HCl 1M
– Iodat de K 0,004N (1,2g KI + 0,478g I 2, se aduce la 1000 ml cu apă distilată).
– acid metafosforic 5%
10 ml de soluție standard de vitamina C se amestecă cu 20 ml apă d istilată, 2 picături
de HCl 1 M și 15 picături de amidon 1%, se titrează cu iodat de K până la culoarea albastră
care persistă 15 secunde. Se notează cu V volumul de iodat folosit la titrare.
Se repetă aceleași operații pentru suc sau pentru supernatant, î n loc de 10 ml soluție
standard se vor folosi 10 ml suc sau filtrat.
Se notează cu V1 volumul de iodat folosit la titrare.
Calcul
Pentru suc
10 x V 1
vitamina C mg /10 ml suc = ––––-
V
Pentru vegetale
10 x V 1 x 5
vitamina C mg /10 0 g produs = –––––– x 100
V x m
V = vol. de iodat folosit la titrarea soluției standard
V1 = vol. de iodat folosit la titrarea probei
5 = dilutia
10 = ml solutie standard luata in lucru
m = masa probei (15g)
100 = raportarea la 100 g produs

65
Calcul si observatii

66
11.3.Dozarea vitaminei C din lapte cu reactiv Tillmans
In mediu acid vitamina C este oxidată la acid dehi droascorbic de către reactivul Tillmans
(2,6-diclorfenolindofenol) de culoare roșie, care se reduce consecutiv transformându -se în
leucoderivatul corespunzător incolor.

Reactivi necesari : – soluție Tillmans -10mg 2,6 -diclorfenolindofenol în 100ml apă distilată –
se păstrează câteva zile la frigider.
– soluție de acid metafosforic 5%în apă distilată
– acid acetic glacia l
– carbonat de calciu pulbere
– soluție de acetat de plumb 5%
– material de analizat
Mod de lucru :
Stabilirea titrului în acid ascorbic al soluției de react iv Tillmans
Se pipetează într -un balon Erlenmeyer 10 ml soluție de vitamina C și se titrează din biureta
cu soluție Tillmans cu picătura, până în momentul în care culoarea virează în roz și persistă
30 secunde.
T= 0,088 · 10 / V
în care:
0,088 = cantit atea de acid ascorbic, în mg existentă în 1ml
10 = volumul soluție de acid ascorbic luat în lucru
V= volumul soluției de indicator folosit la titrare

Intr-un flacon Erlenmeyer se pun 20ml lapte, peste care se adaugă sub agitare, 8ml soluți e
de acid metafosforic . Se omogenizează și apoi se filtrează. Inr -un alt flacon Erlenmeyer se
pipetează 14ml filtrat (echivalentul a 10ml de lapte) și se titrează cu reactiv Tillmans, până la
apariția culorii roz persistente 30 de secunde.

67
Calcul : Conți nutul în vitamină C, exprimat în mg la 100ml lapte, se calculează cu ajutorul
formulei:
Vitamină C, mg la 100ml = V·T·100 / V 1
în care:
V = volumul soluției de indicator, în ml, folosit la titrare
T = titrul soluției de indicator
V1= volumul de lapte co respunzător celor 14ml filtrat luat în lucru (10ml)
Conținutul vitaminei C din lapte este cuprins între 10 și 80 mg/l cu variații în funcție de
specie , tipul de alimentație și sezon, fiind mai ridicat vara când animalele se hrănesc cu iarbă
și cu di ferite nutrețuri verzi.
Calcule și observații laborator 12

68
TEST

1. Ce este acidul ascorbic, ce rol are în organism ? Dati exemple de surse naturale de acid
ascorbic.
2. Mentionați pentru fiecare vitamină din grupul B, numele și rolul în organism
3. Ce rol are vitamina A în organism, și care sunt produsele alimentare bogate în vitamina
A? Ce sunt provitaminele A?
4. Indicați o metodă de identificare a vitaminei A care poate fi utilizată si pentru
determinarea cantitativă a vitaminei A.
5. Care sunt factorii care influențează stabilitatea vitaminelor ? Dați exemplu pentru
vitamina A, B 1 și C.

69
Laborator 1 3.Pigmenți
Culoarea diferitelor o rgane ale plantelor se datoreazӑ unor substanțe colorate, numite
pigmen ți.
Pigmenții naturali au rol biochimic și fiziologic foarte important. Iau parte la
numeroase procese metabolice, formează sisteme de oxidoreducere, dau gustul, aroma și
coloritul unor produse alimentare. Pigmenții clorofilieni au rol esențial în proc esul de
fotosinteză
Sub aspect chimic, pigmenții naturali sunt substanțe foarte heterogene. Ei se găsesc
în celule și țesuturi în stare liberă sau sub formă de cromoproteide, glicozide etc.In general se
găsesc în cantități mici și se determină prin met ode cromatografice, colorimetrice și
spectrofotometrice.

13.1. Izolarea pigmentilor clorofilieni prin cromatografie in strat subțire
Amestecul de pigmenți este extra s cu un solvent potrivit si se separӑ prin
cromatografie in strat subtire pe placi acoper itecu silicagel -material adsorbant, fiecare
pigment situându -se într -o anumită zonă, de -a lungul plӑcii.
Reactivi necesari :
– acetonă
– hexan
– sulfat de sodiu anhidru
– mojar cu pistil
– nisip sau sticlӑ pisatӑ
– tuburi capilare
– hârtie de f iltru
Obținerea extractului : pentru prepararea extractului de pigmenți se mojarează 2g frunze de
spanac cu puțin nisip și 3 ml acetonă. Se decanteazӑ soluția si se trece pe o pâlnie cu vatӑ, se
stoarce vata pentru a recupera extractul. Porțiunile de extract se reunesc într -un tub cu capac.
Reziduul din mojar se reia cu 3 ml de acetonӑ, se repetӑ operația anterioarӑ. La fina l se
adaugӑ 3ml de acetonӑ și 5 ml de hexan în mojar și se mojareazӑ pânӑ reziduul se decoloreazӑ.
Soluția obținutӑ se trece intr-o eprubeta cu d op.
Se adaugӑ 3 ml de saramurӑ se agita si se lasӑ sӑ se separe. Startul de sus va fi verde inchis
iar cel de jos verde deschis.
Extractul spălat se usucă adăugând sulfat de sodiu anhidru până la limpezirea soluției.

70
Cromatografie -Mod de lucru:
Soluția cu amestecul se aplică în picături la baza plăcii, cu ajutorul unei micropipete. Se usucă
picăturile prin suflare și se introduce placa în amestecul de eluare cu capătul cu picături în jos
astfel ca picăturile să nu ajungă în eluent.
Linia de st art trebuie sӑ fie la 1,5 -2 cm.
Developarea durează aproximativ 30 de minute.Identificarea componentelor se face prin
compararea poziției lor cu cea a componentelor din soluții etalon sau prin stabilirea valorilor
Rf.
La terminarea separării, pe pl acă ordinea pigmenților de sus în jos va fi :
– β caroten
– diceto -carotenoide
– cetohidroxi -carotenoide
– hidroxi -carotenoide
Spoturile obținute se pot determina și cantitativ folosind metode colorimetrice.

http://www.uni –
regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D -TLC -e.htm

Calcule și observații laborator 13. 1.

71
13.2. Determinarea spectr ofotometricӑ a conținutului de clorofilӑ

Mod de lucru
– Se cântӑresc 100 mg frunzӑ /probӑ.
– Se mojareazӑ cu 10 ml acetonӑ 80% cu ajutorul nisipului sau a sticlei pisate
– Se filtreazӑ si filtratul se colecteazӑ intr – eprubetӑ.
Determinarea concentratiei de clorofilӑ.
Blanckul folosit este acetona . Se umple cuva spectrofotometrului cu extractul obtinut
si se citesc absorbantele la urmӑtoarele lungimi de undӑ : 663 nm; 645 nm; 470 nm.
Calcule:
Folosind ecuația Arnon se calculeazӑ continutul de clorofila
Chl a ( mg/g ) = [(12.7 × A663) – (2.6 × A645 )] × ml acetona / mg frunze
Chl b (mg/g ) = [(22.9 × A645) – (4.68 × A663)] × ml aceton a / mg frunze
Total Chl = Chl a + Chl b.
C x+c = 1000 A470 – 1.90Chla – 63.14 Chlb/214, (x = xantofila si caroten)

72
TEST

1. Care este rolul pigmenților naturali?
2. Care este rolul clorofilei în organismele vegetale ?
3. Indicați metodele cel mai des utilizate pentru identificarea si dozarea pigmenților.

73
Laborator 14. Evaluar e laborator.

Determinarea unor parametrii, efectuarea unor calcule

74

BIBLIOGRAFIE

1. Dumitru IF., – Biochimie – Editura Didactică și Pedagogică, București 1980.
2. Dumitru IF., D.Iordăchescu – Introducere în enzimologie – Ed. Medicală, B ucurești ,
1981.
3. Iordăchescu D., I.F.Dumitru -Biochimie practică – Tipografia Universități, București,
1980.
4. Neamțu G.,- Biochimie alimentară – Ed.Ceres, București, 1997
5. Neamțu G.,- Lucrări Practice de biochimie alimentară – Tipo Agronomia, Cluj -Napoca,
1997
6. Popescu N., Meica S., – Noțiuni și elemente practice de chimie analitică sanitar
veterinară, Ed.Diacon Coresi, București, 1993.
7. Purcărea C.,- Biochimie alimentară practică, Ed.Univ.Oradea,2003.
8. Purcărea C.,– Biochimie agroalimentară. Edit.Univ. Oradea, 2005.
9. Socaciu C.,- Chimie alimentelor – Ed.Academic.Press, Cluj -Napoca, 2003.
10. Socaciu C., O.Bobiș – Caiet de lucrări practice, Chimia alimentelor, Ed. Academic
Press, Cluj -Napoca, 2003.

75