Partea Teoretica (2) [626821]

I.PARTEA TEORETICA
CAPITOLUL I
Caracterizarea genului Pseudomonas
Primele bacterii au fost evidențiate de către Leeuwenhoek în anul 1674 iar
recunoașterea lor ca grup distinct a fost realizata în perioada 1850 – 1875 de către Cohn pe baza
proprietăților grupului omogen al eubacteriilor (Jelea și colab., 2000).
Denumirea provine din grecescul ,,bacteria,,= baston (termen introdus de Ehrenberg,
1838). Bacteriile au o morfologie caracteristică, destul de limitată, dimensiuni mici și caractere
de colorabili tate ușor de stabilit prin observații microscopice (Lazar si colab., 2016).
Descoperirea diferitelor grupuri de bacterii a scos în evidență mai multe caractere care nu
sunt unitare. Au fost descrise bacterii imobile sau mobile prin unul sau mai mulți flage li, prin
alunecare /glisare pe o suprafață (micoplasme) sau prin contracția unui filament axial
(spirochete) (Lazar si colab., 2016). A fost evidențiat faptul că mutiplicarea se poate face prin
diviziune, înmugurire sau formare de spori de propagare sau pr in segmentare. De asemenea,
unele bacterii prezintă, datorită structurii lor miceliene o asemănare mare cu grupul
microfungilor în care au fost încadrate multă vreme (numite initial actinomicete, în prezent
actinobacterii) (Jelea și colab., 2000).
Stanier (1970) a demonstrat că desi diversitatea lumii bacterieneeste foarte mare, are la
bază un set de caracterecomune ce sunt specifice celulei procarioate.Conceptul de bacterie/celula
procariota, în forma sa actuală poate fi definit în funcție de organizarea celulara de tip procariot,
analizata prin antiteză cu tipul de organizare eucariot (Lazăr si colab., 2016).
Celula procariotă este mai puțin complexă fiind unitatea de structură a eubacteriilor si
cianobacteriilor (bacterii albastre -verzi).
Celula eucari otă este mai complexă și reprezinta unitatea structurală a tuturor celulelor
animale, a plantelor superioare si inferioare, a fungilor și a tuturor protistelor (Lazăr si colab.,
2016).
Bacteriile sunt organisme procariote cu structura celulară simplă, înc adrate întrei grupe:
arhebacterii, eubacterii si cianobacterii (Lazăr si colab., 2016).

Arhebacteriile sunt un grup restrâns de bacterii care trăiesc în medii lipsite deoxigen
(anaerobe), iar cele mai cunoscute sunt bacteriile metanogene (producătoare dem etan), bacteriile
halofile (care trăiesc în medii bogate în săruri) și bacterile dinapele termale (Jelea și colab.,
2000).
Eubacteriile trăiesc în toate mediile de viață: apă, aer, sol și pot avea formăsferică
(coci), forma de bastonaș (bacili), de virgule (vibrioni), spiralata (spirili),pot trăi izolat sau pot
forma de colonii (Jelea si colab., 2000).
Cianobacteriile , numite înainte alge albastre -verzi, sunt organismemicroscopice
procariote, unicelulare, izolate sau reunite in colonii. Acestea sunt autotrofe,pigmentul asimilator
caracteristic este ficocianina, care predominăfață de clorofilă. În citoplasma celulelor se disting
două zone: una central (nucleoplasma) și una periferică (cromatoplasma), cu pigmenti. Sunt
raspândite înapele dulci și marin e (Jelea și colab., 2000).
Forma bacteriilor este controlată genetic. Deși variază destul de mult în funcție de
condițiile de mediu, polimofismul lor este relativ limitat și caracterizat prin predominanța formei
tipice pentru specia dată. După formă, celu lele bacteriene pot fi încadrate în 5 tipuri morfologice
de baza (Lazăr si colab., 2016).
 sferice sau coci;
 cilindrice sau bacili;
 spiralate sau helicoidale (vibrioni, spirili, spirochete);
 filamentoase;
 pătrate; primele 3 tipuri sunt cele mai frecvente (fig. 1).

Fig. 1 Reprezentarea schematică a tipurilor morfologice de bază la bacterii (Lazăr si colab., 2016).

În afara acestor tipuri de bază, există și bacterii cu forme particulare, rare (bacterii c are
înmuguresc, bacterii pedunculate, cu apendici – unele sunt forme adaptative, induse de anumite
condiții de mediu) (Lazar si colab., 2016).

Bacteriile sferice au formă sferică, ovoidală, uneori neregulată, diametrele celulei fiind
aproximativ egale. D in cauză că forma este adesea modificată de diferiți factori de mediu este
discutabil dacă forma celulei este realmente sferică (Jelea și colab., 2000).
Bacteriile cilinidrice cunoascute sub denumirea comună de bacilli, care pot fi drepți sau
ușor incurba ți la mijloc sau la una din extremități. Capetele pot fi tăiate drept sau rotunjite ca la
majoritatea celorlalți (Jelea și colab., 2000).
Bacteriile spiralate se împart în trei subtipuri morfologice și anume vibronul, spirilul
care are formă de spirală cu mai multe ture de spirală rigide și spirochete în formă de spirală
(Jelea și colab., 2000).
Bacteriile filamentoase au aspecte morfologice asemănătoare microfungilor, formeaza
hife ramificate ce au aspect de miceliu (Jelea și colab., 2000).
Bacteriile p ătrate sunt prezente în soluție hipersalină în unele bălți din Peninsula Sinai.
Au forma unor pătrate și au grosime inegală (Jelea și colab., 2000).

Bacteriile au dimensiuni foarte mici (în medie 0,5 – 1 µm – 3 – 6 µm). Cele mai mici
aparțin genului Mycopl asma si au diametrul de 125 – 250 nm, cele mai mari pot avea 10 – 20 µm
lungime, iar cele filamentoase pot ajunge la 500 µm. Sub raportul dimensiunilor, cele mai mici
bacterii se suprapun virusurilor mari, iar cele mai mari depășesc mărimea microorganismel or
eucariote. Dimensiunile nu pot fi utilizate drept caracter diferențial, regula generală fiind că
bacteriile sunt mult mai mici comparativ cu celulele eucariote. Dimensiunile mici determină
raportul mare dintre suprafața și volumul celular (S/V >) și cum , la toate nivelurile de
complexitate biologică, rata metabolismului este invers proporțională cu mărimea organismului,
ratele de creștere și multiplicare (determinate de rata metabolismului) vor fi foarte intense la
bacterii/ microorganisme în general (Lazar si colab., 2016).
Datorită dimensiunilor mici ale structurilor componente, organizarea internă a bacteriilor
a fost mult timp ignorată sau contestată. Descrierea constituenților structurali ai celulei
bacteriene a fost posibilă datorită perfecționării tehnicilor de citochimie (colorații selective
pentru diferite componente) și de microscopie electronică de transmisie (MET), pe secțiuni
ultrafine. Prin aceste tehnici s -a demonstrat că celulele bacteriene nu sunt simpli saci cu enzime,
lipsite de structur i interne, cu conținut omogen, lipsite de nucleu. Aspectul lor aparent omogen la
microscopul optic, după colorarea cu coloranți bazici, se datorează conținutului bogat în ARN al
citoplasmei care determină bazofilia intensă a acesteia.
În prezent, sunt defi nite și descrise o serie de structuri bacteriene, care, după localizare, luând ca
reper peretele celular , pot fi clasificate în structuri intraparietale și extraparietale (fig.2), dup ă
cum urmeaz ă (Lazăr si colab., 2016).
Structuri – intraparietale: – extraparietale:
 membrana plasmatică – capsula și glicocalixul
 citoplasma – pilii
 nucleoidul și plasmidele – fimbriile
 ribosomii – flagelii
 endosporul – curli
 vacuolele și incluziunile
 aparatul fotosintetic

Această simplă enumerare conduce la ideea că structura bacteriilor nu este deloc simplă,
ci chiar complexă; unele dintre aceste structuri sunt esențiale pentru supraviețuire, vitale; la
acestea se adaugă și unele accesorii, prezente în anumite stadii de d ezvoltare sau în
anumitecondiții de mediu, având rol adaptativ (Lazar si colab., 2016).

Fig. 2 Organizarea unei celule bacteriene: structuri intra – și extraparietale (schemă) (Lazăr si colab., 2016).

Peretele celular (P.C.) bacterian reprezint ăo structură definitorie, prin compoziția chimică,
structura primară, secundară și terțiară și în general, un marker biochimic pentru procariote; este
o structură bine definită, rigidă, cu o grosime medie de 15 – 35 nm, care înconjoară celula
bacteriană, ac operă membrana plasmatică și poate fi străbătută de flageli, la bacteriile mobile
(Lazăr si colab., 2016).
Evidențiere – la microscopul optic:
 pe preparate proaspete, datorită refringenței;
 pe frotiuri – colorate cu metode selective pentru perete celular;
 la microscopul electronic cu transmisie (MET), pe secțiuni ultrafine;
 prin lezarea peretelui celular prin metode fizice (agitare, US), chimice (șoc osmotic),
are loc eliminarea conținutului celular și evidențierea peretelui celular ca un sac golit
de conț inut.

Deși sistemul actual de clasificare filogenetic ă a bacteriilor se bazeaz ă pe criterii oferite
de biologia molecular ă, o schem ă generală de clasificare fenotipic ă a bacteriilor, înc ă foarte util ă
din punct de vedere practic, utilizează drept criteriu structura peretelui celular; mai exact, în
funcție de prezența, structura și gradul de dezvoltare a peretelui celular, bacteriile se împart în 4
diviziuni (Lazăr si colab., 2016).

1. Diviz. FIRMICUTES (lat. firmus = tare, cutes = înveliș) = bacteriile Gram pozitive;
Cls. 1. Firmibacteria – bacterii cu perete celular gros, rigid, prin conținutul mare în mureină
Cls. 2. Thallobacteria – bacterii filamentoase = Actinobacteria (den. veche Actinomycetes ).

2. Diviz. GRACILICUTES (lat. gracilis = fragil) = bacteriile G ram negative;
Cls. 1. Scotobacteria (gr. scotos = întuneric)= bacterii care se pot dezvolta în absența luminii;
Cls. 2. Photobacteria :
– Subcls. Oxyphotobacteria , respectiv Cyanobacteria ;
– Subcls. Anoxyphotobacteria – bacteriile sulfuroase roșii ( Chromati aceae );
– bacteriile sulfuroase verzi (Chlorobacteriaceae );
– bacteriilenesulfuroase roșii (Rhodospirillaceae ).

3. Diviz. TENERICUTES(lat. teneri = moale) = bacteriile fără perete celular – micoplasmele;
Cls. Mollicutes (lat. molli = moale, pliabil) , genul reprezentativ fiind Mycoplasma .
Micoplasmele sunt cele mai mici bacterii cunoscute capabile de creștere pe
medii acelulare; membrana lor plasmatică are un caracter unic printre bacterii, în sensul c ă
aceasta conțin e steroli, ce protejează celula de șocul osmotic și îi conferă un polimorfism
accentuat; datorită dimensiunilor mici și lipsei peretelui celular celulele traversează majoritatea

filtrelor bacteriologice. Deși nu au perete celular, se colorează prin metoda Gram ca și bacteriile
Gram negative (Lazăr si colab., 2016).
Există specii de micoplasme saprotrofe, comensale și parazite (implicit patogene) de o
manier ă unică, respectiv micoplasmele sunt „paraziți de suprafaț ă” ai celulelor umane/animale,
fiind tolera te la acest nivel din cauza asem ănării structurale a membranelor celulelor animale și
micoplasmelor.

4. Diviz. MENDOSICUTES (lat. mendosus = fals, greșit) = microorganismele încadrate în
Domeniul Archaea , respectiv microorganisme cu organizare celulară de t ip procariot, dar
care la nivel molecular sunt mai asemănătoare cu eucariotele decât cu procariotele,
reprezentând o direcție de evoluție aparte. Archaeele prezintă un perete celular „fals”, în
compoziția căruia intră pseudomureina sau o mureină neconvenți onală (lipsită de acidul
N-acetilmuramic = NAM), lipidele membranare sunt diferite, glicerolul fiind înlocuit cu
acidul N –acetil -talosaminuronic sensibilitatea diferită la antibiotice.
Archaeele sunt răspândite în natură, nu doar în medii cu condiții ex treme, ci și în
sol, peșteri, mediul marin și oceanic; au fost identificate și specii comensale, prezente în
microbiota intestinală normală a omului si animalelor, participând la procesul de digestie
(specii metanogene); nu se cunosc cazuri de specii paraz ite/patogene.
Diferențele cele mai nete sunt îns ă între bacteriile Gram pozitive și Gram negative,
fiind nu doar de afinitate tinctorială, ci și de ordin biochimic, comportamental, antigenic și de
patogenitate. Aceast ă colorație diferențială a fost invent ată în 1884 de danezul H. Ch. Gram,
fiind o metodă ce permitea și permite în continuare diferențierea celor două grupe mari de
bacterii, pe baza afinitații lor pentru coloranți (fig. 7); după elucidarea structurii peretelui celular
bacterian a fost înțeles și mecanismul acestei colorații diferențiale, ca și toate implicațiile privind
biologia bacteriilor (Lazăr si colab., 2016).
Bacteriile se înmulțesc prin diviziune directă .Procariotele se consideră a fi primele
organisme apărute pe Pământ. Sunt microorgan isme unicelulare, cu structură simplă (procariotă);
citoplasmă și unperete rigid care care le permite să -și mențină forma constantă. Matrialul genetic
– un singur cromozom, deține caracterelor genetice ale speciei, pe care letransmite la descendenți
și în componența bacteriilor pe lângă alți constituienti esențialiintra cei doi acizi nucleici cu

importantă deosebită în viața celulei: ADN (aciddezoxiribonucleic), prezent mai ales în
cromozomul bacterian și ARN(acid ribonucleic), prezent în mare masură în cit oplasmă (Toma și
colab., 2005).

1.1 Familia Pseudomonadaceae . Genul Pseudomonas
Genul Pseudomonas reunește bacilli gram -negativi, nesporulați, cu unul sau mai mulți
flageli polari, nepretențioși nutritiv, strict aerobi, oxidează pozitiv, incapabilili să fermenteze
glucoza, producători de pigment, au fost descoperiți in secolul 19 de către Walter Migul a
(Cornelis și colab., 2014).

Încadrarea taxonomică
Domeniu: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clasa: Gammaproteobacteria
Ordin: Pseudomonadales
Familie: Pseudomondaceae
Genul: Pseudomonas

Genul Pseudomonas cuprinde in prezent peste 60 de specii. Multe specii ale genului au
fost reclasificate în alte 11 genuri (Palleroni și colab., 2010).
Speciile de Pseudomonas se clasifică în cinci grupe pe baza omologiei ARN -ului ribosomal
(Palleroni și colab., 2010).
Speciile de Pseudomonas se clasifică în două grupe și anume (dupa Săcărea și colab., 2006):
 Specii fluorescente și anume: Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas fluorescens ,
Pseudomonas syringae , Pseudomonas cichorii , ultimele două fiind patogeni ai plantelor;
 Specii nefluorescente, și anume: Pseudomonas stu tzeri, Pseudomonas mendocina .

Genul Pseudomonas are o distribuție cosmopolită, în special în medii umede, în apă,
sol, plante, în special fructe și legume. Este prezent în spitale, în soluții apoase, dezinfenctante,
unguente, săpun, fluide de irigare, pi cături oculare, lichide și echipament de dializă.Pe suprafața
fructelor și legumelor, care la pacienții imunosupresași duce la colonizare gastrointestinală.

Alte surse de infecție sunt reprezentate de pisicina, cada de baie, soluția lentilelor de
contact, cosmetice, unghii artificiale, droguri injectabile, talpa internă a tenișilor (Cornelis și
colab., 2014).
Pseudomonas aeruginosa este rar prezent în microbita indigenă a indivizilor sănătoși,
cel mai frecvent fiind cel gastrointestinal, iar rata de colon izare crește la pacienții spitalizați,
chimioterapie, terapie cu antibiotice de spectru larg precum și la pacienții intubați (Săcărea și
colab., 2006).
Familia Pseudomonadaceae cuprinde genul Pseudomonas care are 256 de specii
împărțite în 4 grupe metabolice și grupul Xanthomonas , Acinetobacter sp., Stenotrophomonas
maltophilia , Alcaligenes sp.,Sphingobacterium sp. Flavimonas oryzihabitans sunt doar câteva
exemple de agenți patogeni. Migula, în anul 1894 descrie pentru prima dată proprietățile
morfologice ale pseudomonelor (Biello și colab., 2012). Speciile componente ale familiei
Pseudomonadaceae se diferențiază prin faptul că au o rezistență crescută la antibiotice dar și că
duc la apariția de infecții n osocomiale ((Biello și colab., 2012). De -a lungul timpului, infecțiile
cu specii ce apartin familiei Pseudomonadaceae au fost raportate cu o frecvență ridicata
(Gheorghe, 2014).
Genul Pseudomonas a devenit o sursă importantă de infecție, în special al gaz delor
imunocompromise. Este cel mai comun patogen izolat, în special la pacienți care au fost
spitalizați mai mult de o săptămâna, fiind și o cauză frecventă a infecțiilor nosocomiale. Infecțiile
cu tulpini de Pseudomonas sunt complicate și pot pune viața în pericol a pacientului (Cornelis și
colab., 2012).
Infectiile cu Pseudomonas implică mai multe părți ale corpului și pot avea următoarele
semne și simptome:
 ale sistemului respirator (ex. pneumonie);
 alesistemului nervos central (ex. meningită);
 ale ure chii (ex. otită externă);
 ale sistemului osos (ex. osteomielită);
 ale tractului urinar;
 ale tegumentului (Cornelis și colab., 2012).

 1.1.2 Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa sau bacilul piocianic face parte din familia Pseudomonadaceae,
genul Pseudomonas (Murray și colab., 2003).
Bacteriile cuprinse în acest grup sunt bacili Gra m-negativi, mobili, care se cultivă in
laborator pe medii uzuale, elaborând pigmenți difuzibili în medii, de diferite culori: albastru –
verde, galben -verde fluorescent, roșu sau brun. Specia tip este P. aeruginosa , specie descoperita
de către Gessard în anul 1882 în „puroiul albastru” a unor plăgi infectate (Murray și colab.,
2003).
Bacilul piocianic este foarte răspândit în mediul extern: ape de râu sau canal, aer, sol; se
găsește deasemenea în intestinul și cavitățile naturale ale omului și animalelor precu m și pe
tegumente (Murray și colab., 2003).
P. aeruginosa are dimensiunile între 0.5 to 0.8 μm și 1.5 to 3.0 μm. Nu prezinta exigente
nutritionale deosebite asfel incat a fost observată creșterea sa în apă distilată, ceea ce ne arată
nevoia minimală de su bstanțe nutritive. În laborator, cel mai simpu se cultivă într -un mediu ce
are ca bază acetatul sub forma de carbon și NH4+ sulfat ca sursă de N2 (Murray și colab., 2003).
Izolatele de P. aeruginosa produc trei tipuri de colonii.Cele naturale, izolate din sol sau
ape formeaza colonii simple.Izolatele clinice, în general, produc două tipuri de colonii, unulcu
aspect ridicat, de ou, cu marginile drepte. Un alt tip, frecvent obținut, este cel din urocultura sau
din cele ale secrețiilor din tractul respirator și au un aspect mucoid ce este atribuit prezenței
alginatului (Anderson și colab., 2005).
P. aeruginosa este comensal al tubului digestiv, este un organism ubicuitar, prezent în
apă, sol, pe plante. A fost izolată din apa de râu, de canal, de piscine, de m are, din apă potabilă,
minerală, termală. Se găsește pe produsele vegetale, legume, fructe, flori.Contaminează
produsele alimentare și farmaceutice, chiar dacă sunt păstrate la frigider. Este din ce în ce mai
frecvent izolat din mediul de spital, de pe dif erite suprafețe sau chiar de pe instrumente și
dispositive medicale (Săcărea și colab., 2006).
Este un microorganismcnefastidios care poate crește și în apă distilată. Poate crește pe
medii simple in conditii de aerobioza.Temperatura de creștere variază între 5 -42°C.După 24 de
ore formeaza colonii în formă de “S (smoth)”, transparente.Atât colonia cât și mediul de cultura
sunt pigmentate în verde -albastrui, colonia având reflexe metalice. Cultura elibereazaun miros

aromat de flori tei, salcâm sau iasomie. Pe mediu de cultura geloză -sange coloniile sunt
înconjurate de o zonă extinsa de β -hemoliză. Pe medii lactozate coloniile sunt lactoză negative
(Yordanov și colab., 2014).
Tulpinile de P. aeruginosa produc pigment alcătuit din două componente și anume,
piocianina de culoare verde -albăstruie, solubilă în cloroform și pioverdină, galben -verzuie ,
fluorescent, solubilă în apă (Yordanov și colab., 2014).
Este o bacterie rezistentă în mediul extern supraviețuind luni de zile și chiar
multiplicându -se în apă la temperatura mediului ambiant, este rezistenta și față de unele
antiseptice și dezinfectante, dar este sensibil la pH acid și sărurile de Ag (Murray și colab.,
2003).
Este rezistent de asemenea la antibiotice. Rezistența naturală la antibiotice este dator ată
impermeabilității membranei externe și producerii unei beta -lactamaze inductibile. Rezistența
dobândita apare prin două mecanisme care au uneori o actiune sinergica ( Mesaros și colab.,
2010 ).
Bacilul piocianic este un bacil Gram -negativ, mobil. Se cult ivă in laborator pe medii
uzualesimple cum este de exemplu pe mediul nutrient agar,bacilul piocianic formeaza colonii
translucide cu pigmentare consecutivă a mediului în verde -albăstrui (fig 1), cultura prezentând
un miros caracteristic de „acaccia” (trime tilamină).Pe medii de cultura lichide determina
turbiditate cu formare de peliculă la suprafață, cu colorarea ulterioară a mediului în raport de
pigmentul elaborat (mai frecvent albastru sau verde). Bacilul piocianic nu fermentează lactoza,
nu produce indo l, lichefiază gelatina și are proprietăți hemolitice (Murray și colab., 2003).

Fig. 1 Pseudomonas aeruginosa pe mediu de agar
(httpswww.google.comsearchq=pseudomonas+aeruginosa+culture&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKE
wj0pqqp67zbAhVoyKYKHTEAA4MQ_AUI CigB&biw=1366&bih=631#imgrc=wN0gX9927b7TSM)

1.1.3 Pseudomonas koreensis
P. koreensis este o bacterie Gram -negativa cu dimensiune cuprinsa intre 1.6 -2µm.
Formează colonii circulare alb -galbene pe mediu LB (lysogeny broth) (mediul bogat nutrițional
folosit primordial pentru creșterea bacteriilor (Bertani și colab., 2014)) agar, iar pe mediu l T.S.A
(triptic soy agar, triptic soia agar) devine mucoid după două zile. A fost izolată pentru prima
dată, din solul unei ferme în Coreea, în anul 2003 (Kwon și colab. , 2003).
1.1.4 Pseudomonas alcaligenes
P. alcaligenes face parte din familia Pseudomo nadaceae , este o bacterie aerobă, folosită în
actiunile de remedierea poluării cu combustibili, pesticide și alte substanțe chimice, deoarece are
proprietatea de a degrada hidrocarburile aromatice. Deși cazurile sunt rare, specia poate fi un
patogen uman f iind raportata în Japonia in hemocultura (Suyuki și colab., 2013).

1.1.5 Pseudomonas stutzeri
P. stutyeri este o bacterie nefluorescentă, distribuită în mediul înconjurător, fiind un
patogen oportunistic.Specia a primit o atenție sporită datorită propr ietăților sale metabolice
particulare, a fost propusă ca model de organism pentru studiile de denitrificare. Se poate cultiva
in laboratorde exemplu pe mediul geloză sânge (fig 2). Multe tulpini au proprietăți de
transformare naturale, făcându -le relevante pentru studiul transferului genelor de rezistenta la
antibiotice în mediul înconjurător. S -au raportat tulpini ce au capacitatea de pot fixa N2, iar alții
participă la degradarea poluanților sau interacționează cu metalele toxice (Ginard și colab.,
1997).
Acest microorganism poate fi ușor de indentificat față de alte specii ale
genului Pseudomonas din cauza abilității acesteia de a folosi maltoza și amidonul ca sursă de
energie și producția de dinitrogen din nitriți (Ginard și colab., 1997).

Fig. 2 Pseudomonas stutzeri pe mediu geloză sânge
(httpswww.google.comsearchbiw=1366&bih=631&tbm=isch&sa=1&ei=mLQWW4ijIYH76ATi1bDQDg&q=pseud
omonas+stutzeri+culture&oq=pseudomonas+stutzeri+culture&gs_l=img.3…10902.14857.0.15167.8.8.0.0.0.0)

1.1.6 Pseudomonas ch lororaphis
P. chlororaphis sunt bacterii Gram -negative în formă de bară, cu unul sau mai multi
flageli polari (Todar și colab, 2006). Organismul este în mod tipic un heterotrof aerob, dar s -a
demonstrat, de asemenea, că realizeaza denitrificarea în rizosf era cu Glyceria maxima (Bodelier
et al și colab., 1997). Creșterea speciei este stimulată de rădăcinile plantei, nu numai în rizosfera,
ci și în sedimentele din jur (Bodelier și Laanbroek și colab., 1997). De asemenea, s -a arătat că

specia se afla in compe titie cu Nitrosomonas europaea pentru oxigenul din rizosfera, dar
procesul este controlat de cinetica procesului de oxidare a donorului de electroni. Este o bacterie
heterotrofaraspandita în rizosferă, filosferă și sedimente înconjurătoare (Bodelier și Laa nbroek și
colab., 1997). Este mezofil cu o temperatură ideală de dezvoltare între 20°C și 28°C (Selin et al
și colab., 2010).
1.1.7 Pseudomonas putida
P. putida este o bacterie Gram -negativă în formă de tijă, care se găsește în sol și apă
unde există surs e de O 2. Se dezvoltă optim la 25 -30°C și poate fi ușor izolat (fig. 3) (Cornelis și
colab., 2014).
Tulpinile de P. putida induc creșterea plantelor și protejează plantele de agenții
patogeni; cercetătorii folosesc specia în studiile de bioinginerie, dezv oltarea de biopesticide și
îmbunătățirea sănătatii plantelor.
Pseudomonas putida are un metabolism aerob foarte divers, tulpinile avand capacitatea
de a degrada solvenții organici cum ar fi toluenul (Soeng și colab., 2012).

Fig. 3 Pseudomonas putida stadii de creștere
(httpswww.google.comsearchq=pseudomonas+putida+culture&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjtof
TO8rzbAhWBAJoKHVxOBGQQ_AUICigB&biw=1366&bih=631#imgrc=qtTNop6fH8vnIM)

1.1.8 Pseudomonas oleovorans este o bacterie Gram -negativă, metilo trofa (produce
biomasă bacteriană, folosid ca sursă de energie metanul metanolul și metilamina), crește pe
mediul LB (Lysogeny broth) agar, flourescentă, temperatura ideală de creștere este de 35 de
grade Celsius, (Huertans și colab., 2014).
A fost izola tă din apă, sol și probe clinice cum ar fi urină, spută și este un patogen
oportunist ce poate cauza meningită sau pneumonie (Huertans și colab., 2014).

CAPITOLUL II
Clase de antibiotice și mecanisme de acțiune

Antibioticele sunt substante chimioterapeutice cu efect bacteriostatic sau bactericid.
Încă din anul 1910, o serie de antibiotice,cu diferite mecanisme de acțiune, cum ar fi inhibarea
sintezei peretului celular al bacteriilor( în această clasă de antibiotice fiind incluse p enicilinele,
cefalosporinele); inhibarea proteosintezei (tetraciclinele, aminoglicozidele, macrolide) și
inhibarea sintezei AND -ului bacterian (fluorochinolone și sulfamidele) (Karaman și colab.,
2015).
Antibioticele sunt considerate una din descoperirile revolutionareale secolului al XX -lea.
Succesul oricărui agent terapeutic este compromis de dezvoltarea toleranței sau rezistenței
acestuia. Cel mai bun exemplu este rata de mortalitate cauzată de bacterii. Descoperirea
agențiilor infecțioși in secolul al X IX-lea a stimulat cercetarea și descoperirea masurilor de
prevenție și tratament. Succesul a venit o dată cu descoperirea și introducerea antibioticelor o
jumătate de secol mai târziu. Antibioticele au revolutionat medicina și au salvat nenumărate
vieți, a ceastă descoperire a schimbat soarta omenirii. Dar, odata cu descoperirea și introducerea
acestora în mediul spitalicesc, agricultură, zootehnie a aparutsi o creștere rapidă a rezistenței
agenților infecțioși. Descoperirile recente au aratat că există mai mult de 20.000 de potențiale
gene de rezistenta la antibiotice (ARG) (Davies si Davies, 2010).
Antibioticele (AB) sunt substanțe antimicrobiene produse de diferite specii de
microorganisme (bacterii,fungi, actinomicete) care posedă proprietatea de a inhiba cresterea si
multiplicarea microorganismelor sau efect letal (Davies si Davies, 2010).
Astfel penicilinele și cefalosporinele sunt produse de ascomicete (ascomicete conidiale
din genul Penicillium ). Aminoglicozidele, macrolidele, tetraciclinele, cloramfe nicolul,
lincomicinele sunt produsemai ales din actinomicete (genul Streptomyces ), iar unele bacterii din
genul Bacillus produc polimixinele și bacitracina (Davies si Davies, 2010).

Chimioterapicele antimicrobiene sunt substanțe chimice produse prin sinteză și sunt
alăturate grupului antibioticelor datorită efectelor similare. În momentul de față, delimitareanetă
a acestor două catogorii de substanțe antimicrobiene utilizate în terapie nu mai este nici posibilă
și nici justificată . Datorită progreselo r științifice și tehnologice multe dintre aceste substanțe sunt
obținute industrial prin sinteză sau semisinteză. Obținerea unui produs terapeutic antimicrobian
pe cale biologică, prin extracție sau prin sinteză industrială este dictată doar de rentabilita tea
metodei (Ordeanu și colab., 2012).

Antibioticele sunt folosite pentru tratarea unor boli infecțioase, iar cu timpul
microorganismele și -au dezvoltat mecanisme de rezistentă la antibiotice, de aceea ele trebuie
administrate cu prudența. Capacitatea lor de rezistență a fost descoperită în mom entul
introducerii antibioticelor în clinică și s -a observat că mecanismele de rezistentă diferă de la
individ la individ, în funcție de agentul colonizator, imunitate dar și factorii de mediu extern și
rezistența se referă la capacitatea unei celule bacte riene de a rezista efectelor unui antibiotic.
Descoperirea unor noi antibiotice atrage după sine metode de rezistentă la acestea (Chifiriuc și
colab., 2007).
Una din cauzele rezistenței bacteriilor la antibiotice este reprezentat de utilizarea abuziva,
datorat în cea mai mare parte unui diagnostic eronat. Folosirea antibioticelor în exces în creșterea
animalelor a creat de asemenea mecanisme de rezistență a bacteriilor care se pot transmite la om.
Creșterea numerica a populației la nivel global este de ase menea o cauză (Zhang și colab.,2011).
Odată cu creșterea și înmulțirea mecanismelor de rezistentă la antibiotice s -a pus
problema elucidaii mecanismelor moleculare și genetice ale acestui proces.

Rezistența la antibiotice poate fi de două tipuri(Chifiriuc și colab., 2007) :
• naturală;
• dobandită.
2.1Rezistența naturală
Prin rezistența naturală numită și rezistență intrinsecă se face trimitere la bacteriile
insensibile la anumite antibiotice în mod natural, fără să își formeze factori de rezistență. Astfel,
prin lipsa exactă a unei ținte celulare de acțiune a antibioticului, acesta nu pot pătrunde în celulă

datorită structurilor de înveliș ale celulei care prezintă bariere greu de trecut și se produce
rezistență na turală (Zhang și colab.,2011).
La bacteriile Gram negative, membrana externă a peretului funcționează că o barieră care
protejează față de acțiunea antibioticului. Prin difuzia pasivă traversează doar apa, O2, CO2 sau
molecule liposolubile (Zhang și colab. ,2011).
De exemplu Streptomyces are anumite gene care îi conferă rezistență la aminoglicolize,
macrolide, tetracicline, cloramfenicol și lincomicine, propriile sale antibiotice. Alte exemple
includ organisme care nu dispun de un sistem de transport sau de o țintă pentru antibiotice. În
alte cazuri rezistența poate fi determinată de creșterea activității pompelor de eflux bacteriene
cauză (Zhang, 2011).
2.2 Rezistența dobândită
Rezistența dobândită se referă la puterea agentului patogen de a -și transfera car acterul rezistent
la alte celule bacteriene, fie din aceeași specie, fie din genuri diferite. Toleranța – primul stadiu al
rezistenței dobândite – reprezintă procesul prin care o bacterie poate supraviețui în prezența unui
antibiotic (Chifiriuc și colab., 20 07).
Rezistența dobândită se referă la antibiotice care sunt de obicei sensibile la antiobiotice,
dar care sunt supuse să dezvolte rezistență. Rezistența dobandită este de asemenea cauzată de
mutații la nivelul genelor cromozomiale, sau prin achiziționare a de elemenete genetice mobile,
cum ar fi plasmidele care transportă genele de rezistență la antibiotice (Zhang și colab.,2011).
Acest tip de rezistență are rezultate eficace în prezența unor fenomene genetice cum ar fi
mutații ale genelor cromozomale. De cele mai multe ori, tulpinile devin rezistente atunci când
conțin numeroase mutații spontane ale unor gene rezultate în timpul multiplicării bacteriilor
(Zhang și colab.,2011).

Mecanisme biochimice ale rezistenței la antibiotice
Impermeabilitatea membra nei celulare
Membrana celulară are rolul de a menține la un loc conținutul celular și îi oferă
individualitate. Prin intermediul acesteia se realizează transportul molecular și ionic,

semnalizarea celulară și este sediul reacțiilor enzimatice asociate u nor structuri membranare. Din
punct de vedere structural este formată din bistrat fosfolipidic de 6 -10 nm grosime care este
traversat de molecule proteice. Când antibioticul reușește să ajungă la nivelul țintei, ceea ce
implică depășirea anumitor bariere i mpuse de celula bacteriană în funcție de locul acțiunii
antibioticului, de tipul de bacterie – fie bacterii Gram pozitive, fie bacterii Gram negative, atunci
poate fi considerat activ (Zhang și colab.,2011).
Bacteriile Gram negative prezintă un perete celular mai complex față de celelalte bacterii,
prin prezența unor structuri specifice, cum ar fi membrana externă – similară cu membrana
plasmatică fiind și ea alcătuită dintr -un dublu strat fosfolipidic cu per meabilitate redusă pentru
moleculele hidorfile. În stratul lipidic se află porinele prin intermediul cărora se elimină
produsele de catabolism , dar mai cu seamă se dobândește o rezistență mare (Chifiriuc și colab.,
2007).
Așadar, pentru a ajunge la locu l țintă, antibioticul este nevoit să parcurgă mai multe
obstacole: capsulă, membrana externă, spațiul periplasmic care este mereu în formă lichidă și la
nivelul căruia se pot găsi enzime ce degradează antibioticul dar are și un rol foarte important
pentru Gram negative acestea trăiesc în medii oligotrofe, peptidoglicanul (mureina) care cofera
protecție în funcție de tipul celular iar bacteriile Gram -negative au un strat mai subțire
comparativ cu bacteriile Gram pozitive unde peptidoglicanul este mai gros și astfel mai greu de
traversat și membrana citoplasmatică (Chifiriuc și colab., 2007).
Datorită prezenței dublului strat fosfolipidic, membrana externă este mai puțin
permeabilă la traversarea anumitor molecule ceea ce îngreunează traversarea antibioticelo r.
Substanțele antimicrobiene trec de bariera membranei cu ajutorul porinelor care intervin în
reglarea permeabilității, astfel încât, cu cât există mai multe proteine ale membranei externe cu
atât difuzia antibioticul se realizează cu mai multă ușurință. Antibioticele cu diametru mai mic
(beta -lactamice, tetracicline) vor ajunge cu ușurință în interiorul celulei, pe când antibioticele cu
structură moleculară mare (acidul fusidic, rifamicinele) vor întâmpina dificultăți în traversarea
porinelor (Mărculescu și colab., 2007)
Impermeabilitatea membranei citoplasmice
Membrana citoplasmatică este formată din 3 straturi intercalate și are rol în
permeabilitatea selectivă și în reglarea schimburilor cu mediul exterior. Polipeptidele ciclice sunt
țintă de acțiune a membranei citoplasmatice, de exemplu colistin și polimixină B.

Alterarea țintei bacteriene
Țintele de acțiune ale antibioticului sunt diverse, în funcție de prezența tipului de bacterie.
Modificarea țintei bacteriene – substanțele antimicrobiene care activează asupra peretelui
celular: beta lactaminele în faza de polimerizare inhibă sinteza peptidoglicanului. Cele care
au ca țintă de acțiune PBP inhibă funcția enzimatică: carboxipeptidare, transpeptidare
(Benea și colab., 2016).

 Alterări structur ale ale învelișurilor bacteriene au ca rezultat scăderea permeabilitataii
pereților celulari deoarece structura porinelor este afectată;
 Unele bacterii Gram negative au dobândit impermeabilitate pentru quinolone și beta
lactamine prin încapacitatea de a sintetiza noi porine funcționale;
 Rezistența la cloramfenicol se datorează unei acetiltransferaze care duce la diminuarea
permeabilității peretelui celular și este mediată plasmidic;
 Celulele bacteriene prezintă o rezistență destul de mare la tetracicl ină, rezistență
dobândită prin producerea de proteine suplimentare.
 Alterarea tintei – modificări ale proteinei de la nivelul ribozomilor: aminoglicozide,
tetracicline;
 Modificarea PBP (penicllin Binding Protein) care au ca țintă de acțiune beta -lactamine le;
 Defecte în modul de acțiune al enzimelor: nitroreductaza în cazul nitroimidazolilor dar
există și situații în care bacteriile dispun de enzime care pot modifica macrolidele (Benea
și colab., 2016).
Inactivarea enzimatică a antibioticelor
Există f oarte multe clase de enzime care inactivează antibioticele: antibioticele beta –
lactamice, antibioticele aminoglicozide sau cloramfenicolul.

Beta-lactamazele sunt enzime produse de bacterii care hidrolizează antibioticele beta –
lactamice, au capacitatea d e a se lega covalent la penicilinaze și cefalosporinaze și au un
randament antibacterian scăzut. Indicele de rezistență al beta lactamazelor ține cont de mai multe
criterii: cantitatea de beta -lactamaze sintetizată, capacitatea de hidrolizare a substanței
antimicrobiene și de afinitatea unor enzime față de antibiotice (Benea și colab., 2016).

Beta-lactamazele sunt cele mai întâlnite enzime și acționează prin hidroliză la nivelul
inelului beta lactamic. Din perspectiva caracteristicilor moleculare, enzimele pot fi clasificate în:
• beta-lactamaza prezentă la Staphylococcus aureus – activitat e mediată plasmidic și
cromozomial care se diferențiază cu o activitate intensă în momentul interacțiunii cu penicilinele;
• cefalosporinazele cromozomale ale bacteriilor Gram -negative – care pot hidroliza în
special cefalosporinele, dar și aztrenamul, cefuroximul, imipenemul (Benea și colab., 2016).

Mecanisme genetice
Rezistența la antibiotice mediată de gene cromozomale
Acest tip de rezistență se referă la prezența unei mutații la nivelul unei gene care codifică
modul de transport în membrană/perm eabilitatea membranei sau ținta antibioticului, astfel încât
prin mutație se obține rezistența dobândită față de un anumit antibiotic.Aceste modificări se
realizează în nucleotidele unui cromozom prin inserții, duplicatii, deletii sau inversii care au ca
rezultat diferite proteine sau macromolecule astfel încât acțiunea antibioticului este inhibată
(Lazăr, 2001).
Modificările genetice microevolutive numite și mutații punctiforme au o rată de apariție
de 10-7- 10-9, dar probabilitatea de apariție a mutații lor spontane este mai scăzută deoarece
trebuie să se producă mutații multiple. Modificările cromosomiale au transmitere pe verticală sau
pot să apară brusc. Prin intermediul transpozonilor care sunt structuri mobile în cromosomul
bacterian, au loc modifică rile genetice macroevolutive care modifică poziția unor segmente mari
de ADN (Lazăr, 2001).
Mutațiile punctiforme intervin în rezistența față de peniciline, cefalosporine, quionolone
sau rifamicină. Rezistența mutațională este defapt rezistența primară care inițial s -a crezut că se
formează prim mutații spontane, ulterior dovedindu -se că pot apărea mutații și în timpul terapiei.
Totuși, mutațiile apărute în vivo sunt mult mai puține față de cele produse în vitro pentru că
acestea atrag după ele și modica ri în constituția celulei care pot fi dăunătoare patogenului
(Mărculescu și colab., 2007).
Organismele care se dezvoltă în medii cu materie organică în descompunere dar și
speciile patogene de microorganisme, în situații critice de stres își dublează in formația de

supraviețuire, respectiv își dublează cantitatea de gene de rezistență față de acțiunea
medicamenelor.
Rezistența mediată de plasmide
Plasmidele sunt molecule de ADN prezente la bacterii, mai rar în celulele
eucariote, care se replică ind ependent de genomul gazdei. Într -o celula bacteriană se găsesc mii
de copii ale unei plasmide, multiplicate în citoplasma celulei gazdă iar din punct de vedere
structural, plasmidele sunt formate din ADN dublu catenar cu formă circulară și conțin gene care
codifică structuri esențiale gazdei. Acestea se pot muta de la o celulă la alta, chiar și de la unele
specii diferite la altele (Mărculescu și colab, 2007).
Genele care codifică pentru rezistența multiplă la antibiotice este asociată cu
prezența plasm idelor R, dar și cu integronii. Atunci când plasmidele sunt eliminate din celulă,
aceasta va obține sensibilitate la același antibiotic. Plasmidele R sunt structuri extracromosomale
cu caracter infecțios descrise prima dată de Watanable în 1961. Au o impo rtanță clinică foarte
mare doarece sunt prezente la numeroase specii de bacili Gram -negativi, au rezistență multiplă la
antibiotice dar și o rată mare de transfer prin conjugare (Mărculescu și colab, 2007).
Plasmidele R sunt formate din două regiuni funcț ionale: genele care conferă rezistență la
antibiotice (notate cu " -R") și gene care asigură funcția de transferon formând factorul de transfer
la rezistenței (FTR) prin care plasimda prezintă replicare autonomă și transfer prin conjugare.
Deoarece famiile de antibiotice sunt apropiate din punct de vedere chimic, o plasmidă poate oferi
rezistență la mai multe antibiotice, în același timp și astfel s -a dedus caracterul lor multirezistent,
celula bacteriană devenind suprarezistenta din punct de vedere cantitat iv și calitativ (Chifiriuc și
colab., 2007).
Rezistența simultană la diferite antibiotice a fost demonstrată pe culturi de bacili Gram
negativi, respectiv pe celule de Shigella . Ulterior, plasmidele R au fost găsite la mai multe
familii: Escherichia coli , Salmonella sp.,Shigella sp., Pseudomonas sp.,Proteus sp.,Klebsiella sp.,
etc.
Rezistența bacteriilor prin intermediul plasmidelor se face prin diverse mecanisme
biochimice: inhibarea antibioticului, modifcarea țintei antibioticului, pentru unele bacteri i Gram
negative de interes clinic (Mihăescu și colab, 2008).
Din punct de vedere genetic, plasmidele R prezintă gene tra care codifică sinteza unor
proteine care au rol în transferul plasmidei. Dacă aceste gene lipsesc, transferul se face prin

transducț ie sau prin conjugare realizată de alte plasmide.
Genele r sunt componente ale unor transpozoni și au proprietatea de a se deplasa de la nivelul
unui situs în altul, sau chiar de o plasmidă la un cromozom (Mihăescu și colab, 2008).
Rezistența mediată de integroni
Integronii sunt elemente ale exprimării genelor, secvențe de ADN care au determinanți
genetici cu specificitate de situs și mediază deplasările secvențelor de ADN numite casete genice.
Aceștia sunt formați din două structu ri conservate și o regiune variabilă la nivelul căreia se află
casetele genice – au o genă de rezistență la antibiotice (fig. 4) (Mărculescu și colab, 2007).
Într-una din cele două regiuni conservate ale integronilor se află o secvență ce codifică
integra za care răspunde de inserția specifică din casete.
Livermore, în anul 1995 a prezentat patru grupe de integroni. Aceștia se găsesc în
exclusivitate la bacteriile Gram negative, iar din punct de vedere al numărului de casete genice se
remarcă gena de rezi stență la sulfoamida ( sul I), având 60 de casete genice ce oferă rezistență la
antibiotice. Regiunea 5' a casetei are gena int ce codifică integraza iar captul 3' conține gena de
rezistență la un antibiotic (Mihăescu si colab., 2007).

Fig. 4 Structura integronilor sul1 -gena ce codifică rezistența la sulfonamide; orf5 – genă cu funcție necunoscută; qac –
gena ce codifică rezistența la săruri cuaternare de amoniu( Vakulenko si Mobashery, 2003 )

Rezistența mediată de transpozoni
Transpozonii sunt elemente g enetice mai mari decât secvențele de inserție(SI), având o

lungime de peste 2000 perechi de nucleotide cu capete identice dispuse palindromic și au fost
descoperiți de către Barbara McClintock, chiar înaintea deslușirii structurii ADN -ului (Vassu și
colab. , 1982).
Elementul genetic mobil determină o ruptură cromozomială într -un situs de inserție ceea
ce duce la deplasarea genei săritoare, deci transpozonii au caracter mobil, mutându -se între
plasmidă și cromozom. Transpozonii, prin transpoziție, produc m odificări la nivelul unui
segment ADN ce conduc la formarea de secvențe noi și implicit cu o funcție nouă sau modificată.
Aceste aranjamente pot avea ca rezultat și mutații (Mărculescu și colab., 2011).
Transpozonii realizează transpoziția cu ajutorul pr opriilor enzime, astfel încât aceștia se
pot integra în locuri noi și în lipsa enzimelor recombinării folosite în mod normal. Spre deosebire
de SI, aceștia au gene care conferă proprietăți noi în regiunea centrală, cum ar fi gene de
rezistență la kanamicin ă etc (Mihăescu și colab., 2007).
În genomul uman, elementele transpozabile sunt de tip transpozoni și retrotranspozoni
iar la procariote există și elementele de inserat și transpozonii realizează două tipuri de
transpoziție, replicativă unde doar copia t ranspozonului este inserată în alt fragment (mecanism
copy -paste) și non -replicativă în care chiar transpozonul se mută la nivelul unui alt situs
(mecanism cut -paste) – intervine transpozaza care se leagă la capetele transpozonului original,
ADN polimeraza care umple golurile rămase și ADN ligaza care sudează scheletul glicofosforic
(Mihăescu și colab., 2007).
În urma cercetărilor amănunțite asupra acestor elemente genice mobile s -a descoperit că
genele de rezistență pot trece de la un replicon la altul – cum ar fi rezistența celulelor bacteriene
la antibioticele beta -lactamice care se explică prin deplasarea genei ce codifică pentru sinteza
beta lactamazei, de pe o plasmidă pe alta (Mihăescu și colab., 2007).