PARTEA A-II-A ACTIVITATEA EXPERIMENTALĂ CAPITOLUL II MATERIALE, METODE ȘI TEHNICI DE LUCRU 2.1 Infrastructura de cercetare Întreaga activitate de… [301487]

PARTEA A-II-A [anonimizat]

2.1 [anonimizat] s-a derulat pe parcursul celor trei ani de studiu din cadrul programului de doctorat, a fost posibilă datorită Sistemelor Recirculante Pilot și a [anonimizat], [anonimizat] – Universitatea „Dunărea de Jos” din Galați.

[anonimizat] a [anonimizat] a unor specii de pești de cultură în spații limitate.

Obiectivul esențial în proiectarea unui sistem acvacol recirculant este dimensionarea corespunzătoare a tuturor componentelor sistemului.

[anonimizat], acesta nu va fi capabil să mențină un mediu adecvat pentru populația de pești [76].

A. Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot I (RAS I)

Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot I (RAS I) a constituit baza experimentală pentru cercetările prezentate în capitolele V, VI, respectiv VII.

Configurația acestui sistem recirculant a necesitat înglobarea unor echipamente de tratare a apei tehnologice și a unităților de creștere dimensionate corespunzător în raport cu tehnologia dezbătută.

[anonimizat] (figura 2.1) este format din:

[anonimizat] a calității apei ([anonimizat], [anonimizat] a apei, unitate de sterilizare a apei, [anonimizat]),

instalație de distribuție a [anonimizat], comandă și control.

[anonimizat], confecționate din poliester armat cu fibră de sticlă (PAS) și au un volum individual de aproximativ 1 m3 (nr. 1 din fig. 2.1). [anonimizat] a regimului hidraulic din cadrul acestora este satisfăcută exigența tehnologică în ce privește randamentul crescut al eliminării rapide a solidelor.

Dimensionarea componentelor unui sistem recirculant se realizează în funcție de debitul de recirculare care poate fi de 6 m3/h [anonimizat] 30 de minute [77].

Figura 2.1 Configurația sistemul recirculant pilot I (RAS I)/ Foto original [78]

1 – hrănitor automatizat, 2 – senzori de control privind parametri de calitate a apei tehnologice, 3 – senzori de nivel, 4- regulator nivel, 5 – filtru mecanic cu tambur rotativ, 6 – bazin decantor, 7 – sistem pompe, 8 – filtru cu nisip, 9 – filtru cu cărbune activ, 10 – filtru trickiling, 11 – sistem de pompe sub presiune spre unitatea UV, 12 – con oxigenare, 13 – rețea de alimentare cu apă potabilă, 14 – [anonimizat], prevăzută fiind pe toată suprafața imersă cu orificii, 15 – sistem de evacuare poziționat central.

Instalație de alimentare cu apă a [anonimizat] a apei din unitățile de creștere.

Fiecare unitate de creștere din sistemul recirculant este prevăzută cu un sistem de evacuare poziționat central (nr. 15 din fig. 2.1, fig. 2.2), cu senzori de nivel minim și maxim (nr. 3 din fig. 2.1), respectiv cu senzori de control al unor parametri de calitate a apei tehnologice (nr. 2 din fig. 2.1).

Figura 2.2 Unitate de creștere (foto original)

La alimentarea cu apă a unităților de creștere ce se realizează individual, se folosește o coloană verticală, obturată, prevăzută fiind pe toată suprafața imersă cu orificii (nr. 14 din fig. 2.1).

În cadrul acestui sistem recirculant, există un sistem mecanizat de distribuire a hranei (fig. 2.3), precum și un regulator nivel (nr. 4 din fig. 2.1, fig. 2.4) care are rolul de a regla nivelul apei tehnologice din unitățile de creștere.

Figura 2.3 Sistem automatizat de distribuire a hranei (foto original)

Figura 2.4 Regulator nivel (foto original)

Apa tehnologică odată evacuată din unitățile de creștere este colectată într-o conductă ce este confecționată din polipropilenă, de unde este dirijată spre unitatea de control a solidelor.

Filtrul mecanic cu tambur rotativ (nr. 5 din fig. 2.1, fig. 2.5) are rolul de a controla solidele grosiere fiind prevăzut cu un sistem de autospălare a solidelor reținute.

Figura 2.5 Filtrul mecanic cu tambur rotativ (foto. original)

Apa reziduală (AR) rezultată în urma procesului de autospălare este evacuată din cadrul sistemului recirculant integrat (fig. 2.1), ajungând într-o unitate de decantare ce este prevăzută cu senzori de nivel (nr. 3 din fig. 2.1, fig. 2.5) și senzori de control al unor parametri de calitate a apei tehnologice (nr. 2 din fig. 2.1, fig. 2.5). Această unitate de decantare are o formă rectangulară și este confecționată din aluminiu.

Completarea volumului de apă ce a fost îndepărtat ca apă reziduală sau în urma procesului de evaporare se poate realiza foarte ușor la nivelul unității de decantare cu ajutorul unei conducte de alimentare (nr. 13 din fig. 2.1).

Prin intermediul unui sistem de pompe de recirculare (nr. 7 din fig. 2.1), apa tehnologică din unitatea de decantare este dirijată spre un modul format din două filtre (unul cu nisip – nr. 8 din fig. 2.1 și unul cu cărbune activ – 9 din fig. 2.1) tip ACLM 05 – Romet, Buzău. Rolul filtrului cu nisip este de a reține particulele solide ce au un diametru de peste un micron și prezintă următoarele caracteristici tehnice: presiune de lucru 2 – 6 bari, temperatura optimă de lucru 5 – 40ș C, tensiune de alimentare 220 V – 50 Hz, tensiune de lucru 12 V – 50 Hz și viteza maximă de filtrare 10 m3/m2/h. Filtrul cu pat de cărbune activ are rolul de a reține solidele cu un diametru minim de 0.5 microni, este dimensionat pentru un timp de contact de două minute, la o înălțime a patului filtrant de un metru și prezintă aceleași caracteristici tehnice, precum filtrul cu nisip.

Spălarea patului filtrant se realizează de jos în sus, apoi se face o pauză pentru decantare, timp în care permite acestuia să se așeze în poziția corectă pe cale gravitațională [79].

Filtrarea biologică este următorul pas privind tratarea apei care se realizează cu ajutorul filtrului trickiling (nr. 10 din fig. 2.1), unde circulația apei se desfășoară gravitațional.

Apa tratată din punct de vedere biologic este dirijată apoi cu ajutorul unui sistem de pompe sub presiune spre unitatea UV (nr. 11 din fig. 2.1), respectiv spre unitatea de oxigenare (nr. 12 din fig. 2.1).

Unitatea UV este alcătuită din trei lămpi UV (55 W), o cameră de reacție din oțel inox, un panou de control și leduri de avarie [79].

Apa evacuată din unitatea de oxigenare este dirijată către alimentarea unităților de creștere.

B. Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot II (RAS II)

Din punct de vedere constructiv, sistemul recirculant (figura 2.6) este alcătuit din următoarele părți componente:

4 unități de creștere;

unități de condiționare a calității apei, formate din:

unitatea de filtrare mecanică a apei;

unitatea de filtrare biologică a apei;

unitatea de sterilizare a apei;

unitatea de aerare-oxigenare a apei;

instalație de distribuție a apei la modulul de creștere.

a) Unitățile de creștere – sunt reprezentate de 4 bazine din sticlă cu grosimea de 10 mm și un volum de 0,336 m3 fiecare (40×80×100 cm). Adâncimea apei, dimensiunile în plan, respectiv volumul de apă corespunzătoare unei unități de creștere au în vedere să asigure, în condiții de fiabilitate și eficiență cât mai crescută, exigențele tehnologice specifice sistemelor intensive de creștere.

Figura 2.6 Schema sistemului recirculant experimental (după Dediu L.,2009) [80]

B1-B4 -unitățile de creștere a peștilor, D–decantor, P1,P2,P3-pompe, UV- lampa de sterilizare, FM- filtrul mecanic, FB-filtrul biologic

1-burete, 2-nisip, 3-pietriș 4-bactobolți, 5- duză aerare

Instalație de alimentare cu apă a unităților de creștere

Instalație de evacuare a apei din unitățile de creștere

b) Unitatea de condiționare a calității apei are drept scop controlul și menținerea în domeniul optim a principalilor parametri fizico-chimici ai apei, cum ar fi: conținutul în oxigen, concentrația în azot amoniacal, concentrația în particule solide, pH-ul și dioxidul de carbon. Astfel, pentru controlul particulelor solide a fost instalat un filtru cu nisip sub presiune, pentru controlul concentrației de azot amoniacal, sistemul fiind prevăzut cu o unitate de filtrare biologică – filtrul de tip trickling (foto 1.) alcătuit dintr-o succesiune de materiale filtrante (bactoballs cu o suprafață specifică de 300 mm2/m3), în care se realizează nitrificarea apei, iar pentru sterilizarea și dezinfectarea apei pe circuitul principal de alimentare cu apă condiționată a unităților de creștere, a fost montată o instalație cu lampă UV (Sfetcu L.,2009; Vasilean I.,2010).

Caracteristica funcțională de bază a instalației este puterea nominală (3000 W), putere care asigură cantitatea de radiații în gama de lungimi de undă optime pentru procesul tehnologic. Pentru asigurarea concentrației de oxigen dizolvat (DO) la nivelul impus de gradul de intensivitate al populării s-a prevăzut o unitate de aerare-oxigenare. Aceasta este formată dintr-un compresor Hagen cu debitul de 1,5 m3/h. Sistemul recirculant asigură un debit de 12 L/min/unitate de creștere.

Foto 1. Filtrul biologic (foto original)

c) Instalația de distribuție a apei și aerului la unitățile de creștere este alcătuită dintr-un sistem de pompe, tuburi și armături ce asigură debitul tehnologic necesar pentru fiecare din unitățile de creștere. Traseele instalației de distribuție, respectiv modul de pozare a acesteia au fost condiționate de modul de amplasare a unităților de creștere. Modul de distribuție a apei la fiecare compartiment al sistemului de creștere, precum și evacuarea apei din acestea asigură o optimă circulație a apei în fiecare unitate de creștere, aspect deosebit de important în condiții de intensivitate când este necesar să fie valorificat integral volumul (mediul) de creștere (Sfetcu L.,2009; Vasilean I.,2010).

După realizarea sistemului recirculant descris anterior, s-a inițiat operația de formare a peliculei biologice la nivelul filtrului trickling. Inițierea și activarea biofiltrului s-au realizat utilizând metoda biologică, prin inoculare cu o serie de culturi bacteriene pure din genurile Nitrosomonas și Nitrobacter.

C. Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot III (RAS III)

Unitatea de condiționare a apei din cadrul acestui sistem este dispusă pe orizontală și are încorporate trei trepte de filtrare diferite (fig. 2.7).

Figura 2.7 Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot III (RAS III)/ Unitatea de condiționare a apei (foto original)

Modulul de creștere al acestui tip de sistem recirculant este compus din două unități tip Ewos, confecționate din fibră de sticlă ce au următoarele dimensiuni: 1.40×1.40×0.60 m.

Cele trei trepte de filtrare sunt:

filtrare mecanică cu ajutorul forței centrifuge – instalație tip hidrociclon,

filtrare mecanică cu ajutorul unui burete,

filtrare biologică.

D. Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot IV (RAS IV)

Acest tip de sistem este format din:

12 unități de creștere,

unități de condiționare a calității apei (o unitate de filtrare mecanică a apei, o unitate de filtrare biologică a apei, o unitate de sterilizare a apei, o unitate de aerare – oxigenare a apei),

instalație de distribuție a apei către modulul de creștere.

Unitățile de creștere sunt confecționate din sticlă având o grosime de 10 mm și un volum individual de 0.132 m3 (36×37.5×98 cm) (fig. 2.8).

Figura 2.8 Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot IV (RAS IV) (foto original)

Parametrii fizico-chimici de calitate a apei au fost controlați și menținuți în limitele optime, datorită unităților de condiționare a apei. Aceștia sunt: conținutul de oxigen dizolvat, concentrația în azot amoniacal, concentrația în particule solide, pH-ul și dioxidul de carbon.

Controlul particulelor solide s-a realizat cu ajutorul unui filtru cu nisip sub presiune, iar în ce privește controlul concentrației de TAN s-a folosit o unitate de filtrare biologică – filtrul de tip trickling.

Filtrul de tip trickling este alcătuit dintr-o succesiune de materiale filtrante – bactoballs ce au o suprafață specifică de 300 mm2/m3, la nivelul căruia se realizează procesul de nitrificare a apei [81, 82].

Instalația de sterilizare Tetra Quiet UV-C 35000 având o putere de 36 W a fost folosită la sterilizarea și dezinfectarea apei tehnologice rezultată din filtrul biologic.

Sistemul recirculant poate asigura un debit de 12 L/min/unitate de creștere, iar compresorul tip Fiap Air Active 10000, ce are o putere de 100 W și o presiune 0.042 Mpa, reprezentând unitatea de aerare-oxigenare, introduce un debit de aer de 8400 L/h.

Echipamentul de distribuire a apei spre unitățile de creștere este compus dintr-un grup de pompe, tubulatură și de fitinguri ce au rolul de a asigura debitul tehnologic necesar pentru fiecare unitate de creștere.

Trei pompe tip DAB A 80 180 XM (Debitul: Q=0.6-8.7 m3/h) au asigurat pomparea apei.

E. Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot V (RAS V)

Modulul de creștere este reprezentat de două unități de creștere octogonale tip Ewos, confecționate din fibră de sticlă cu următoarele dimensiuni: 1,40 X 1,40 X 0,60 m, fiecare având un volum de 600 l și un sistem de climatizare privind calitatea apei. Forma unităților de creștere ajută la circulația uniformă a apei cât și la distribuția omogenă a oxigenului în masa apei (figura 2.9). Rolul unității de condiționare a calității apei este acela de control și menținere în domeniul optim a principalilor parametri fizico-chimici ai apei: conținutul în oxigen dizolvat, concentrația în azot amoniacal, concentrația în particule solide, pH-ul și dioxidul de carbon.

Figura 2.9 Sistemul Recirculant de Acvacultură Pilot V (RAS V) (foto original)

2.2 Materialul biologic

Sturionii sunt specii de pești ce aparțin ordinului Acipenseriformes, clasei Actinopterygei ce cuprinde două familii:

familia Acipenseridae

familia Polyodontidae.

Familia Acipenseridae este compusă din 30 de specii împărțite în patru genuri diferite (22 Acipenser, 2 Huso, 3 Scaphirhyncus, 3 Pseudoscaphihryncus), iar familia Polyodontidae cuprinde doar două genuri (Polyodon, Psephurus).

În România, primul studiu pe creșterea sturionilor în sisteme intensive recirculante (RAS) a fost efectuat în 2002 [83].

La nivel mondial, producția de sturioni a crescut încet în ultimele decenii, speciile cele mai des întâlnite și crescute în sisteme de acvacultură [84] fiind Siberian sturioni (Acipenser baerii), Acipenser gueldenstaldtii, Acipenser ruthenus și bester [85].

În bazinul inferior al Dunării, a avut loc o scădere drastică a stocurilor de sturioni urmare a impactului antropic negativ în zonele de reproducere naturală și a pescuitului abuziv, fapt ce a impus un efort de cercetare dirijat în special pentru protecția și redresarea acestor stocuri [86]. Astfel, restabilirea stocului de sturioni se urmărește a se realiza prin reproducere artificială și creștere în conditii de mediu favorabile.

Densitatea de populare reprezintă factorul cheie în creșterea sturionilor [87]. S-a demonstrat astfel că o densitate mare de material piscicol poate suprima creșterea acestuia din cauza apariției stării de stres ceea ce duce la neconsumarea cantității de hrană administrată și implicit la deteriorarea calității apei tehnologice [88, 89, 90, 91].

Specia Acipenser stellatus (Pallas, 1771) face parte din speciile genului Acipenser și este un candidat bun pentru acvacultura din România, având în vedere rezultatele cercetărilor efectuate până în prezent [92, 93, 94].

În România, capturile de Acipenser stellatus (Pallas, 1771), în conformitate cu CITES, au scăzut pe parcursul anilor 2002-2006 de la 12.427 tone la 3.43 tone (72,5% în patru ani). Astfel s-a recurs la creșterea sturionilor în acvacultură, urmărindu-se repopularea Dunării.

Denumirea populară, a specie Acipenser stellatus (Pallas, 1771) este păstruga. Aceasta este răspândită în Marea Caspică, Marea de Azov, Marea Neagră, Marea Egee și în afluenții acestora. Este o specie migratoare. Păstruga migrează din Marea Neagră în Dunăre.

Păstruga a primit numele de “stellatus” datorită faptului că scurturile prezente pe tegumente au forma de stele. “Stellatus” în latina înseamnă acoperit cu stele.

Corpul acestei specii este alungit, fusiform și este acoperit cu cinci rânduri de scuturi osoase longitudinale (un rând dorsal, două laterale, două ventrale). Gura este transversală, având o mărime medie.

Botul este alungit, îngust și turtit dorso-ventral cu o lungime 63,92-66,31% din lungimea capului [95, 96] – este un caracter distinctiv prin care specia poate fi ușor identificată între celelalte specii ale genului Acipenser.

Tegumentul este acoperit de scutele pectinate și stelate. Mustățile sunt scurte și nefranjurate. Buza inferioară este întreruptă la mijloc.

Pe partea dorsală, corpul are culoarea cafeniu-închis sau cenușiu, abdomenul este alb, iar scuturile ventrale au o colorație alb-murdar.

Exemplarele din fluviu au o culoare mai deschisă comparativ cu cele din mare care au o culoare mai închisă.

În Dunăre există două forme de păstrugă în funcție de perioada de migrație și anume, o formă de primăvară și una de iarnă. Păstruga poate atinge o lungime maximă de circa 210 cm și o greutate de maximum 68 kg.

Păstruga este o specie bentonică caracteristică apelor costiere din mare și a cursurilor inferioare ale fluviilor, dar spre deosebire de celelalte specii de sturioni, poate fi găsită și în straturile superioare ale apei [97].

Păstruga migrează în mare pentru hrănire și iernare și în fluvii pentru reproducere. În Dunăre pătrunde imediat după morun și nisetru. Există două perioade de migrație. Prima perioadă începe în luna martie când temperatura apei este de 8 – 110 C, atinge un maxim în aprilie și continuă până în luna mai. A doua perioadă care este mult mai intensă, începe în luna august și durează până în luna octombrie.

Conform unui studiu recent [98] maximum de captură pentru păstruga din Dunăre s-a înregistrat în luna mai.

Puii de păstrugă din Dunăre, în primele stadii de viață, se hrănesc cu larve de chironomide, trichoptere, efemeroptere, crustacei, iar cei din Marea Neagră consumă viermi, moluste si crustacei. Adulții se hrănesc cu pește și crustacei [99].

Maturitatea este atinsă la 7 – 10 ani de masculi și la 10 – 14 ani de către femele în Dunăre [97]. Păstruga nu se reproduce în fiecare an.

Exemplarul cel mai vârstnic de Acipenser stellatus (Pallas, 1771) capturat în partea nord-vestică a Mării Negre avea 23 ani.

După Manea (1980) fecunditatea absolută variază între 30.000 și 180.000 icre.

În perioada aprilie – mai are loc reproducerea la temperaturi ale apei cuprinse între 8 – 15șC. Păstruga se reproduce în râuri pe substratul stâncos, cu prundiș, pietriș amestecat cu fragmente de scoici și nisip grosier [97].

Exemplarele de Acipenser stellatus (Pallas, 1771), ce au constituit materialul biologic pentru experimentele de la capitolul III, respectiv, capitolul IV, s-au obținut prin reproducere artificială, în mai 2012, la stația de reproducere artificială de la Isaccea.

Puietul de păstrugă folosit drept material biologic în cadrul experimentelor de la capitolul V, respectiv capitolul VI, a fost obținut prin reproducere artificială în aprilie 2013, în urma realizării unor experimente de încrucișare dirijată a unor genitori de păstrugă, cu proveniență și grad de înrudire diferit (Dunăre-migrație 2013 și Acvacultură).

În ceea ce privește materialul biologic utilizat în cadrul experimentului prezentat la capitolul VII, s-au folosit 4 loturi experimentale, reprezentate de diferite specii de sturioni ce au dat naștere unor hibrizi (Sterbe, respectiv Bestbeluga).

Sterbe (♂morun Dunăre+ ♀cegă acvacultură) este o specie obținută din încrucișarea masculului de morun (Huso huso Linnaeus, 1758) cu femela de cegă (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758). Face parte din grupul hibrizilor interspecifici, adică sunt obținuți din specii diferite și sunt frecvenți în cadrul genului Acipenser.

Hibrizii interspecifici ajung maturi, masculii au lapți, femelele însă sunt sterile. Hibrizii nu dau descendență.

Hibridizarea artificială a început să fie folosită frecvent în piscicultură datorită faptului că hibrizii obținuți au o creștere mai bună sau alte caractere avantajoase față de formele parentale.

Sterbe are corpul alungit, fusiform, delicat și subțire, acoperit cu cinci rânduri de scuturi osoase longitudinale (un rând dorsal, două laterale și două ventrale) (fig. 2.10).

Figura 2.10 Puiet de Sterber – 8 luni și 4 zile (foto original)

Numărul de scuturi dorsale variază între 9-13 (în medie 11), cel al scuturilor laterale 41-47 (în medie 42-43), iar în ce privește numărul de scuturi ventrale acesta este de 9-11 (în medie 9-9).

Coloritul corpului este cenușiu-închis pe spate și alb pe abdomen.

Rostrul este triunghiular, ascuțit la vârf, puțin ridicat la extremitate și prevăzut la jumătatea lungimii sale cu patru mustăți dispuse transversal. Gura este mare, largă, în formă de semilună transversală dispusă pe partea ventrală a capului. Coada este heterocercă.

Sterberul moștenește ritmul de creștere lent al cegăi și crescut într-un mediu controlat poate atinge următoarea lungime medie [100]:

Bestbeluga (♂morun Dunăre+ ♀ bester acvacultură) este un hibrid obținut prin încrucișarea masculului de morun (Huso huso Linnaeus, 1758) cu femela de bester.

Femela de bester este un hibrid obținut prin încrucișarea masculului de cegă (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758) cu femela de morun (Huso huso Linnaeus, 1758), moștenește ritmul de creștere intens al morunului și maturitatea sexuală rapidă a cegăi (♂ (4-5 ani), ♀ (7-9 ani) ), motiv pentru care este considerat cel mai economic sturion pentru creșterea intensivă.

Bestbeluga are corpul alungit fusiform, masiv, gros, acoperit cu cinci rânduri longitudinale de scuturi osoase (un rând dorsal, două rânduri laterale și două rânduri ventrale) (fig. 2.11).

Figura 2.11 Puiet de Bestbeluga – 8 luni și 4 zile (foto original)

Numărul de scuturi dorsale variază între 10-13 (în medie 11), cel al scuturilor laterale 40-43 (în medie 42-43), iar în ce privește numărul de scuturi ventrale acesta este de 9-10 (în medie 10-9).

Corpul hibridului Bestbeluga are un colorit cenușiu-deschis pe spate și alb pe abdomen (partea ventrală a corpului) (fig. 2.11).

Rostrul este triunghiular, ascuțit la vârf, mai scurt față de sterber, puțin ridicat la extremitate și este prevăzut cam la jumătate din lungimea lui cu patru mustăți dispuse paralel cu gura. Gura este mai mare și mai largă comparative cu sterberul, în formă de semilună transversal dispusă pe partea ventrală a capului. Coada este heterocercă.

În ceea ce privește ritmul de creștere, s-a constatat că hibridul bestbeluga a moștenit ritmul de creștere intens al morunului față de hibridul sterbe care a moștenit ritmul de creștere mai puțin intens al cegăi.

Ritmul de creștere al bestbelugăi crescut într-un mediu controlat atinge următoarea lungime medie [100] :

Dacă comparăm ritmul de creștere a celor doi hibrizi prezentați mai sus, având aceeași vârstă și care au fost crescuți în condiții identice, putem trage concluzia că hibridul bestbeluga a avut un ritm de creștere mai bun față de hibridul sterbe, lucru datorat zestrei genetice [100].

2.3 Metode de înglobare a diferitelor vitamine și fitobiotice în hrană

Fitobioticele folosite pe durata cercetărilor experimentale au fost: cimbru (Thymus vulgaris) (foto 2.), cătina (Hippophae rhamnoides) (foto 3.), respectiv spirulina (Spirulina Platensis ) (foto 4.), iar dintre vitamine s-au utilizat vitamina C (acidul ascorbic) (foto 5.) și vitamina E (tocoferolului) (foto 6.).

Foto 2. Thymus vulgaris Foto 3. Hippophae rhamnoides Foto 4. Spirulina platensis

Foto 5. Acidul ascorbic Foto 6. Tocoferolul

Fitobioticele utilizate în experimentele acestei teze au fost achiziționate de la un magazin local de tip Plafar, sub formă de fructe cătina (Hippophae rhamnoides), sub formă de pulbere spirulina (Spirulina platensis) și sub formă de frunze cimbrul (Thymus vulgaris). Frunzele și fructele au fost transformate în pulbere cu ajutorul unei râșnițe electrice.

Protocolul de înglobare a vitaminei E (tocoferolul) în furaj a urmărit păstrarea proprietăților fizico-chimice ale vitaminei E și s-a realizat după cum urmează:

omogenizarea vitaminei E cu 3-4 picături metanol plus 5 ml etanol;

încorporarea soluției obținute în furajul granulat;

uscarea peletelor la etuvă la T0= 250C timp de 1h÷1,5h.

Protocolul de înglobare a fitobioticului și a vitaminei C (acid ascorbic) în furaj a fost următorul:

omogenizarea cimbrului în soluție de gelatină 2%;

încorporarea soluției obținute în furajul granulat;

uscarea peletelor la etuvă la T0= 250C timp de 1h÷1,5h.

Pe parcursul celor cinci experimente unele fitobiotice au fost introduse în hrana peștilor atât în concentrație de 1%, cât și 2%. Hrana peștilor s-a preparat cu o zi înainte de a fi administrată.

În experimentele în care s-a utilizat vitaminei E (tocoferolul) s-a folosit concentrația de 500 mg/kg furaj, iar în cazul vitaminei C (acid ascorbic) s-au folosit 250 mg/kg furaj.

2.4 Metode de lucru privind determinarea parametrilor de calitate ai apei și echipamentele utilizate

În vederea asigurării condițiilor optime pentru creșterea sturionilor, s-a acordat o atenție sporită controlului și măsurării parametrilor fizico-chimici ai apei.

Zilnic, mai precis dimineața, înainte de primenirea apei și administrarea hranei, s-a măsurat oxigenul dizolvat (DO), temperatura și pH-ul, iar de două ori pe săptămână s-a determinat concentrația de nitriți (N-NO2ˉ), nitrați (N-NO3ˉ) și concentrația ionului de amoniu (N-NH4+).

Parametrii fizico-chimici ai apei au fost determinați prin metoda potențiometrică și colorimetrică.

Principalii parametri fizico-chimici ai apei (temperatura și oxigenul dizolvat) au fost măsurați zilnic cu ajutorul echipamentului WTW Multi 3410 (foto 7.), iar pH-ul cu ajutorul echipamentului WTW model 340 (foto 8.). Compușii azotului au fost determinați săptămânal cu ajutorul spectofotometrului Spectroquant Nova 400 (foto 9.), folosind kituri compatibile Merk.

Foto 7. Oximetrul WTW Multi 3410 Foto 8. pH-metrul WTW, model 340

(foto original) (foto original)

Foto 9. Spectrofotometru Spectroquant Nova 400 (foto original)

Respectarea standardelor privind calitatea apelor de suprafață, precum și cele folosite la creșterea speciilor de pești (Ordinul Ministerului Mediului și Gospodării Apelor nr. 161/2006 pentru aprobarea Normativului privind clasificarea calității apelor de suprafață în vederea stabilirii stării ecologice a corpurilor de apă) a constituit reperul de plecare privind evaluarea regimului hidrochimic al apei tehnologice. Apa tehnologică trebuie să se încadreze cel puțin în limitele corespunzătoare clasei a doua de calitate, în ceea ce privește practicarea pisciculturii.

Privitor la definirea efluentului descărcat în rețeaua urbană, ne-am raportat la standardele de calitate conforme normativelor europene ce au fost adoptate în legislația națională prin H.G. nr. 188 din 28 februarie 2002 cu privire la aprobarea unor norme privind condițiile de descărcare în mediul acvatic a apelor uzate, modificată și completată prin H.G. nr. 352 din 21 aprilie 2005 [101].

2.5 Parametri de performanță ai creșterii

La sfârșitul experimentelor, după ce peștii au fost evaluați din punct de vedere biometric, s-au calculat următorii parametri tehnologici: sporul real de creștere [Sr], ritmul zilnic de creștere [GR], factorul de conversie al hranei [FCR], rata specifică de creștere [SGR], respectiv factorul de conversie al proteinei [PER], factorul alometric de condiție, pe baza următoarelor ecuații:

Sporul real de creștere [Sr] se calculează ca diferență între biomasa finală și biomasa inițială.

[Sr] = (Bf) – (Bi) [g], (1)

unde,

Bf – Biomasa finală (g);

Bi – Biomasa inițială (g).

Ritmul zilnic de creștere [GR] – se determină prin raportarea diferenței dintre biomasa finală (Bf) și biomasa inițială (Bi) la timpul de creștere (t) exprimat în număr de zile.

[GR] = (Bf – Bi)/t [g/zi], (2)

unde,

t – număr de zile.

Factorul de conversie a hranei [FCR] – se calculează prin raportarea cantității de furaje distribuite la sporul de creștere a peștelui.

[FCR] = Q/Sr [g furaj/g spor biomasa], (3)

unde,

FCR – coeficient de conversie;

Q – cantitate de furaje administrate;

Sr – sporul real de creștere.

Rata specifică de creștere [SGR] – se determină conform relației:

[SGR] = 100 x (ln Bf – ln Bi)/t [%/zi] (4)

Factorul de conversie a proteinei [PER] – se calculează cu ajutorul relației:

[PER] = Sr/F* Pb [g/g], (5)

unde,

Sr – spor de creștere (g);

F – cantitatea de furaje ingerate (g);

Pb – proteina brută a furajului (%).

Factorul de condiție Fulton – reprezintă un indicator cu grad mare de semnificație privind starea de întreținere a peștilor. Relația de calcul este:

[K] = M * 100 / L3 (6)

unde,

K – factorul de condiție Fulton;

M – masa corporală individuală (g);

L – lungimea totală individuală (cm).

Determinarea corelației dintre masa corporală și lungimea totală s-a realizat cu ajutorul regresiei liniare simple. Este cert faptul că în limitele de toleranță ale factorilor de mediu masa corporală crește odată cu dimensiunile corpului. Din punct de vedere analitic, această certitudine se descrie prin ecuația:

[M] = a * Lb (7)

unde,

M – masa corporală individuală (g);

a – indicele de corelație;

b – puterea lui L;

L – lungimea totală individuală (cm).

Valoarea lui ”b” exprimă caracterul creșterii, astfel:

dacă b=3, creșterea este izometrică (creșterea în masă este direct proporțională cu creșterea în lungime),

dacă b<3, creșterea este alometrică (creșterea în masă este mai rapidă decât creșterea în lungime),

dacă b>3, creșterea este alometrică (creșterea în lungime a fost mai rapidă decât creșterea în masa).

În determinarea acestor indici este nevoie și de forma logaritmică a ecuației, prin intermediul căreia putem estima valorile lui ”a” și ”b” (q=ln a) prin analiza regresiei liniare.

Forma ecuației liniare este:

[lnM] = ln a + bln L [8]

unde,

b – reprezintă coeficientul de regresie și este egal cu unghiul făcut de curba cu orizontala,

ln a – reprezintă locul de intersectare cu orizontala.

2.6 Metode de lucru și echipamente necesare pentru evaluarea profilului hematologic

La pești, analizele hematologice se realizează după metode curente aplicate în hematologia veterinară, ce reflectă starea de sănătate a acestora, determinând, astfel, potențialele schimbări fiziologice ce pot apărea sub acțiunea factorilor de stres [102, 103].

Metoda de prelevare a sângelui

Examinarea seriei eritrocitare și leucocitare a fost posibilă prin recoltarea probelor biologice de sânge (cca. 0,5 – 2 ml, în funcție de talia peștelui). La pești există mai multe metode de recoltare a sângelui: puncție cardiacă – la pești de dimensiuni mari, puncție din vena caudală – la pești de diferite dimensiuni, tăierea pedunculului caudal – la pești de dimensiuni mici.

Recoltarea sângelui s-a realizat prin metoda puncției din vena caudală, (foto 10.).

Foto 10. Recoltare sânge (foto original)

Înainte de recoltarea probelor de sânge, peștii au fost anesteziați cu soluție 2 – fenoxietanol (1 mL la 10 L de apă).

Metoda realizării și colorării frotiurilor sangvine

Sângele recoltat a fost distribuit, în prealabil, în tuburi Ependorf heparinate (foto 11.) pentru stabilirea indicatorilor hematologici și tuburi Ependorf neheparinate în scopul determinării glucozei și proteinelor serice. Probele neheparinate sunt așezate într-un stativ special și lăsate la temperatura camerei, timp de o oră, pentru a se produce coagularea sângelui.

Foto 11. Heparinarea tuburilor Ependorf (foto original)

Înainte de distribuirea sângelui în tuburile Ependorf, s-au realizat câte două frotiuri pentru fiecare exemplar de pește studiat, în vederea stabilirii ulterioare a formulei leucocitare.

Frotiul de sânge s-a realizat pe lame bine spălate și degresate în soluție de alcool (foto 12).

Foto 12. Pregătirea lamelor (foto original)

Pe lamă s-a aplicat o picătură de sânge (fără anticoagulant), s-a întins rapid și cât mai subțire cu ajutorul unei lame șlefuite, așezată înclinat sub un unghi de 45° cu o mișcare de translație în lungimea lamei (figura 2.12).

Figura 2.12 Tehnica realizării corecte a frotiurilor de sânge* [104]

După realizarea frotiurilor, imediat, acestea au fost fixate cu metanol timp de 3-5 minute, și apoi au fost colorate folosind metoda panoptică May-Grunwald Giemsa.

Folosindu-se un suport de colorare, frotiurile de sânge au fost așezate orizontal pe acesta și fiecare frotiu în parte s-a acoperit cu un număr egal de picături de soluție May-Grünwald. După 3 minute, s-a adăugat același număr de picături de apă distilată cu pH=6,81 (realizată cu tampon fosfat) și după 2 minute acest amestec s-a eliminat, scufundându-se lamele în vasele Laveran cu soluție Giemsa, proaspăt preparată. Colorarea cu soluția Giemsa a durat circa 30 minute, apoi lamele s-au spălat sub jet moderat de apă.

După obținerea preparatelor permanente s-a realizat examinarea acestora la microscopul Zeizz Axio Imager (foto 13), folosindu-se obiectivul de imersie (10 oc. X 100 ob.) atât pentru caracterizarea morfologiei elementelor celulare, cât și pentru numărarea leucocitelor în vederea stabilirii numărului total și a formulei leucocitare.

Foto 13. Microscopul Zeizz Axio Imager (foto original)

La microscopul Zeizz Axio Imager au fost observate eritrocitele, trombocitele și leucocitele.

Prin colorarea panoptică, leucocitele s-au evidențiat din masa eritrocitelor [103] astfel:

limfocitele au între 7-9 μm, nucleu rotund sau reniform cu multă cromatină, citoplasmă bazofilă, perinucleară, lipsită de granulații.

monocitele au între 15-18 μm, sunt cele mai voluminoase leucocite, citoplasmă bazofilă mult mai bine reprezentată, cu nucleu ovoid și reniform.

granulocitele neutrofile au între 5-10 μ, prezintă în citoplasmă granulații fine cu afinitate pentru coloranți acizi și bazici, iar nucleul poate avea formă de bastonaș la cele tinere sau poate avea 2-6 lobi legați prin punți fine.

granulocitele eozinofile (acidofile) mai puțin numeroase, de 8-12 μm, au nucleu bilobat și granulații citoplasmatice sferice mai voluminoase, gălbui-roșcate.

granulocitele bazofile de 10 μm sunt în număr foarte mic, caracterizându-se prin prezența unui nucleu neregulat cu ștrangulații mai mult sau mai puțin accentuate, citoplasma este bazofilă cu granulații puternic bazofile care uneori acoperă chiar și nucleul.

Formula leucocitară reprezintă exprimarea procentuală a diferitelor tipuri de leucocite în urma examinării pe frotiul de sânge colorat a cel puțin 200 leucocite, după care se face calculul procentual pentru fiecare categorie.

S-a folosit obiectivul cu imersie pentru o identificare morfologică corectă.

Frotiul a fost parcurs deplasând preparatul într-un singur sens și în zig-zag pentru a surprinde atât elementele marginale, cât și cele din mijlocul lamei (întrucât limfocitele au tendința de a se grupa spre centru, iar polimorfonuclearele și monocitele spre marginea și franjurile frotiului).

Astfel, pe frotiurile de sânge colorate au fost numărate diferite tipuri de celule albe și exprimate procentual la un total de 200 leucocite.

Formula de calcul este următoarea:

[X] = (A*100)/200 [9]

unde,

X – procentul grupei de celule albe determinat în formula leucocitară.

A – numărul de celule albe corespunzătoare grupei, găsit la un total de 200 leucocite.

Pentru o imagine cât mai precisă a complexului leucocitar, pe lângă determinarea numărului relativ de leucocite, respectiv stabilirea formulei leucocitare, s-a determinat și numărul absolut de leucocite, ce exprimă numărul unui anumit tip de leucocit conținut într-un mm3 sânge. Acesta se calculează printr-o regulă de trei simplă ce ține cont de numărul de eritrocite numărate pe hemocitometru. Altfel spus, s-au numărat 200 diferite categorii de leucocite și 1000 de eritrocite; dacă s-a ajuns cu numărătoarea la 1000 eritrocite și nu s-au găsit 200 leucocite, s-a continuat numărătoarea până la găsirea a 200 leucocite.

Microfotografiile au fost efectuate cu camera Axio Cam Icc 1 Zeiss.

Determinarea numărului de eritrocite

Determinarea numărului de eritrocite (globule roșii) s-a efectuat după metoda clasică utilizând ca lichid de diluție – soluția Vulpian, camera de numărat Neubauer și pipeta Potain pentru eritrocite (foto 14).

Cu pipeta Potain s-a aspirat sânge până la diviziunea 0,5, apoi lichid de diluție Vulpian (nu produce hemoliza eritrocitelor) până la diviziunea 1,01, realizându-se o diluție de 1:200. După omogenizare, s-au îndepărtat primele 2-3 picături, iar următoarea picătură s-a introdus în camera de numărat, pe care în prealabil s-a montat lamela perfect, adică până s-au observat inelelor lui Newton. După circa un minut, s-au numărat eritrocitele din 5 pătrate situate între liniile triple din mijlocul crucii.

Foto 14. Cameră de numărat (hemocitometru) Newbauer, pipeta Potain și soluția Vulpian (foto original)

Pentru numărarea eritrocitelor pe hemocitometru s-a folosit microscopul ZEISS-AXIO IMAGER la o magnitudine de 10 oc. x 40 ob.

Formula de calcul utilizată a fost următoarea:

[N] = 400*200*n/80 = 10000*N [10]

unde,

n – număr eritrocite numărate în 80 (16 x 5) de pătrățele;

400 – volumul pătrățelelor cu latura de 1/20 mm;

200 – diluția realizată la nivelul pipetei Potain.

Determinarea concentrației de hemoglobină

Pentru determinarea concentrației de hemoglobină s-a folosit metoda colorimetrică cu reactiv Drabkin. Pregătirea probelor (foto 15) s-a realizat conform următorului protocol (tab. 2):

Tabel 2. Protocolul de lucru pentru determinarea hemoglobinei

* – se omogenizează foarte bine și se lasă în repaus 3 minute la temperatura camerei

Foto 15. Pregătirea probelor pentru determinarea hemoglobinei (foto original)

După prelucrarea probelor de sânge, se măsoară extincția la spectrofotometrul SPECORD 210 Analytikjena (foto 16) la lungimea de undă de 540 nm față de reactivul Drabkin ca martor.

Foto 16. Spectofotometrul SPECORD 210 Analytikjena (foto original)

Formula de calcul este următoarea:

[Hb] = Ap/As x Cst (g/dL) (11)

unde,

Ap – absorbanța probei de analizat,

As – absorbanța probei standard,

Cst – concentrația standardului.

Determinarea hematocritului (Ht)

Determinarea hematocritului s-a realizat prin metoda microhematocritului, ce presupune centrifugarea sângelui în tuburi capilare de microhematocrit heparinate (foto 17).

Foto 17. Tuburi capilare de microhematocrit (foto original)

Centrifugarea s-a realizat cu ajutorul centrifugei HETTICH HEMATOKRIT 210 (foto 18), la o turație 12000 rot/min timp de 5 minute.

Foto 18. Centrifuga HETTICH HEMATOKRIT 210 (foto original)

După cinci minute de centrifugare, s-a citit pe nomogramă raportul dintre elementele figurate și plasma sanguină. Valoarea hematocritului reprezintă exprimarea procentuală a raportului dintre volumul eritrocitar (coloana roșie) și volumul total sanguin (coloana totală).

Determinarea constantelor eritrocitare

Constantele eritrocitare reflectă gradul de funcționare a eritrocitelor, conținutul de hemoglobină al fiecărui eritrocit și raportul dintre acest conținut și valoarea lui. Cele mai importante constante eritrocitare ce s-au determinat în cadrul experimentelor efectuate au fost: volumul eritrocitar mediu (VEM), hemoglobina eritrocitară medie (HEM) și concentrația de hemoglobină eritrocitară medie (CHEM).

Volumul eritrocitar mediu (VEM) reprezintă volumul mediu al eritrocitului. Valorile obținute variază în funcție de vârstă și sex. Acesta se exprimă în μm3 și se calculează după formula:

[VEM] = (Ht*10)/E (μm3) (12)

unde,

Ht – hematocritul (%);

E – numărul de eritrocite, mil/mm3 sânge.

Hemoglobina eritrocitară medie (HEM) reprezintă încărcarea fiecărui eritrocit cu hemoglobină. Se exprimă în picograme (1pg = 10-12g) și se calculează după formula:

[HEM] = (Hb*10)/E (pg) (13)

unde,

Hb – hemoglobina în grame/100 ml sânge,

E – număr de eritrocite exprimate în mil/mm3 sânge.

Concentrația de hemoglobină eritrocitară medie (CHEM) reprezintă raportul dintre hemoglobina eritrocitului și volumul său. Se exprimă în grame/100 ml masă eritrocitară și se calculează după formula:

[CHEM] = (Hb*100)/Ht (g Hb/100 ml ) (14)

unde,

Hb – hemoglobina în grame/100 ml sânge,

Ht – hematocritul (%).

2.7 Metode de lucru și echipamente utilizate la determinarea și evaluarea parametrilor biochimici ai plasmei sangvine

Determinarea glucozei serice (GLU)

La determinarea concentrației de glucoză s-a folosit metoda colorimetrică bazată pe reacția dintre glucoză cu o substanță cromogenă (o-toluidină), care în prezența aldohexozelor formează un compus intens colorat în verde.

Reactivi necesari: Soluție de acid tricloracetic 20%, soluție de acid tricloracetic 5%, soluție de o-toluidină.

Tehnica de lucru:

se pregătesc 2 eprubete de centrifugare, una pentru proba de analizat, una pentru proba standard.

Proba standard: 0,2 ml soluție standard de glucoză, 1,5 ml apă distilată și 0,5 ml acid tricloracetic 20%.

Proba de analizat: 0,2 ml ser, 1,5 ml apă distilată și 0,5 ml acid tricloracetic 20%.

Serul se obține prin centrifugarea probelor de sânge, centrifugarea realizându-se cu ajutorul centrifugei HETTICH MIKRO 120 (foto 19), timp de 10 minute la 3000 de rotații/min.

Foto 19. Centrifuga HETTICH MIKRO 120 Foto 20. Centrifuga Universal 320R

(foto original) (foto original)

după omogenizare probele, se lasă în repaus timp de 5 minute,

urmează o centrifugare (centrifuga Universal 320R – foto 20) timp de 10 minute la 3500 turații pe minut,

din supernatantul rezultat, în fiecare eprubetă se pregătesc:

proba de analizat: 2 ml supernatant de la proba de analizat se amestecă cu 2 ml soluție de o-toluidină.

proba standard: se amestecă 0,5 ml de supernatant de la proba standard cu 2,5 ml soluție de o-toluidină.

proba în alb: se amestecă 0,5 ml soluție de acid tricloracetic 5% cu 2,5 ml soluție de o-toluidină.

probele omogenizate sunt supuse fierberii timp de 8 minute, apoi sunt răcite sub jet de apă rece.

după răcire se măsoară absorbanța acestora și a probei standard în raport cu proba în alb.

Citirile s-au făcut la spectrofotometrul SPECORD 210 Analytikjena (foto 16) la o lungime de undă de 635 nm.

Formula de calcul este următoarea:

[GLU] = Ap/As*100 (mg/dL) (15)

unde,

GLU – concentrația de glucoză (mg/dL),

Ap- absorbanța probei de analizat,

As- absorbanța probei standard.

Pentru a reduce influența dietei asupra valorilor parametrilor biochimici, peștii nu au fost hrăniți cu o zi înainte de recoltarea probelor.

Determinarea proteinelor totale (TP)

La dozarea proteinelor serice s-a folosit metoda biuretului.

Reactivi:

– soluția de lucru care se obține prin diluarea a unui volum de soluție A cu 4 volume de soluție B. (Soluția A se obține prin dizolvarea a 4,5 g tartrat de sodiu și potasiu în 40 ml de NaOH 0,2 N. Se adaugă apoi sub agitare 1,5 g CuSO4.5 H2O dizolvat în 10 ml H2O, apoi 0,5 g KI și se completează cu NaOH 0,2 N până la 100 ml. Soluția B se obține prin dizolvarea a 5 g de KI în 1000 ml de NaOH 0,2 N.)

– NaCl 0,9%.

Tehnica de lucru: Proba de analizat se obține prin amestecarea a 5 ml de soluție de lucru cu 0,1 ml ser. Se omogenizează și după 30 de minute se realizează citirea probelor față de proba blanc, la spectrofotometrul SPECORD 210 Analytikjena 250 la lungime de undă 546 nm. Blancul se obține prin amestecarea a 5 ml soluție de lucru cu 0,1 ml NaCl 0,9%.

Formula de calcul este următoarea:

[TP] = Ap*18.4 (g/100ml) (16)

unde,

TP – proteinele totale serice,

Ap – absorbanța probei de analizat.

2.8 Metode de lucru și echipamente folosite pentru determinarea compoziției biochimice a țesutului muscular

Prin determinarea compoziției biochimice a cărnii materialului biologic în cadrul perioadei experimentale se poate aprecia starea generală de întreținere și impactului condițiilor de mediu asupra organismului. De asemenea, în urma acestei determinări se poate trage o concluzie în ceea ce privește valorificarea hranei.

La sfârșitul experimentului s-au prelevat probe de țesut muscular, ținându-se cont de uniformitatea exemplarelor, eliminându-se astfel erorile ce pot apărea datorită diferențelor de masă corporală. Înainte de a fi prelucrate, probele de țesut muscular au fost supuse unei operațiuni de mixare și omogenizare, operațiune ce s-a realizat cu ajutorul unui mixer vertical.

Analiza compoziției biochimice a țesutului muscular a constat în determinarea conținutului procentual de umiditate, proteine, lipide, cenușă și substanță uscată.

Determinarea proteinelor (%)

Conform standardului de stat STAS 6514-75 (Ordin nr. 191 din 13 iunie 2001), s-a realizat determinarea conținutului procentual de proteine a țesutului muscular, prin metoda Kjeldahl.

Tehnica de lucru:

– se cântăresc 1-2 g de probă omogenizată ce se introduc în balonul Kjeldahl, împreună cu 25 ml H2SO4 98% și un gram de catalizator alcătuit din K2SO4 cu CuSO4. Sub acțiunea catalitică a sulfatului de cupru în mediu de acid sulfuric și sulfat de potasiu (mineralizarea probelor), azotul total din proba de analizat este transformat în ioni de amoniu.

– amoniacul eliberat se distilează în aparatul Parnas-Wagner (foto 21) și se captează într-o soluție de acid sulfuric care este dozat prin titrare cu hidroxid de sodiu, în prezența indicatorului de culoare (roșu de metil).

– conținutul în substanțe proteice totale se determină prin înmulțirea azotului total determinat prin metoda Kjeldahl cu un coeficient caracteristic cărnii de pește (6,25).

Foto 21. Sistemul de digestie de tip C. Gerhardt (foto original)

În vederea evaluării calității proteinelor se cunosc mai mulți indicatori, dintre care cei mai importanți sunt valoarea productivă a proteinei (PPV) sau eficiența utilizării proteinei (PUE) și proteinele reținute (PR).

Eficiența utilizării proteinelor [PUE] nu ia în considerare creșterea masei corporale, ci adaosul de proteine din carnea de pește:

[PUE] = 100 x (Bf x Pf – Bi x Pi) /F x PB (%) (17)

unde:

Bf – Biomasa finală (kg);

Bi – Biomasa inițială (kg);

Pf – proteina corporală finală (%);

Pi – proteina corporală inițială (%);

F – cantitatea de furaje ingerată (kg);

PB – proteina brută a furajului (%).

Proteinele reținute [PR]:

[PR]=masa ex. finală x Pf – masa ex.inițială x Pi (g/ex) (18)

Pf – proteina corporală finală (%)’;

Pi – proteina corporală inițială (%).

Determinarea lipidelor (%)

Determinarea lipidelor s-a realizat prin metoda Soxlet, conform standardului de stat STAS 3104-80, cu ajutorul echipamentului de extracție tip Raypa (foto 22).

Foto 22. Echipament de extracție a lipidelor tip Raypa (foto original)

Tehnica de lucru:

– se ia tara paharelor goale,

– se introduc 7-10 g de țesut muscular în cartușul de extracție,

– se realizează extracția grăsimilor cu eter de petrol până la epuizare,

– urmează apoi îndepărtarea solventului, uscarea și cântărirea paharelor.

Formula de calcul folosită este:

[%lipide] = (Pf – Pi)/mp*100 (19)

unde,

Pf – masa finală a paharului cu produs, după extragerea lipidelor (g);

Pi – masa inițială a paharului cu produs, înaintea extragerii lipidelor (g);

mp – masa de probă luată în lucru (g).

Aprecierea calității cărnii de pește se mai poate realiza și prin calcularea lipidelor reținute (LR).

Formula de calcul folosită este:

[LR]=masa ex.finală x Lf -masa ex.inițială x Li (g/ex) (20)

unde:

Lf = lipidele corporale finale (%);

Li = lipidele corporale inițiale (%).

Determinarea cenușii (%)

Determinarea cenușii (%) din țesutul muscular s-a realizat conform standardului de stat STAS 6511-87.

Substanțele minerale totale (cenușa) se determină prin calcinarea probei de carne de pește la 525±25oC, până se obține o masă constantă. S-a folosit cuptorul de calcinare tip Nabertherm (foto 23).

Foto 23. Cuptor de calcinare Nabertherm (foto original)

Tehnica de lucru:

– într-un creuzet de porțelan (a cărui masă a fost notată), s-a cântărit o cantitate de probă (aproximativ 1-2g),

– după care, creuzetele s-au introdus la cuptorul de calcinare, la temperatura de 525±25oC, unde au fost ținute aproximativ 4-5 ore,

– după ce probele au fost scoase din cuptor și răcite în exicator, acestea au fost cântărite și s-a notat masa creuzetului cu proba calcinată,

– creuzetul cu probă a fost apoi introdus în cuptor pentru încă o oră, operațiunea fiind repetată până când proba a ajuns la masă constantă.

Formula de calcul folosită a fost:

[%cenușă] = (m2 – m1)/mpx100 (%) (21)

unde,

m2 – masa creuzetului după calcinare (g);

m1 – masa creuzetului gol (g);

mp – masa de probă luată pentru analiză (g).

Determinarea substanței uscate (%)

Determinarea substanței uscate (%) a țesutului muscular se poate realiza, prin uscarea la etuvă, la temperatura de 105oC, până la obținerea unei mase constante. Aplicarea acestei metode la pește și produse din pește este considerată ca metodă de referință, fiind standardizată în toate țările, deoarece se caracterizează printr-o mare precizie [105]. Pentru determinarea acestei analize, s-a folosit etuva tip Sterilizator Esac (foto 24).

Foto 24. Etuva tip Sterilizator Esac (foto original)

Tehnica de lucru:

– într-un creuzet de porțelan, tarat în prealabil, s-au introdus aproximativ 5-7 g probă de carne de pește,

– după care s-a realizat uscarea probei până la masă constantă la 1050C.

Formula de calcul folosită a fost:

SU = (Cf – Ci)/mp x 100 (%) (22)

unde:

SU – substanța uscată (%),

Ci – masa creuzetului cu probă, înainte de uscare (g),

Cf – masa creuzetului cu probă, după uscare (g),

mp – masa probei luate pentru determinare (g).

Determinarea conținutului cărnii în substanțe extractive fără azot (SEN)

În categoria substanțelor extractive fără azot sunt incluse glicogenul, glucidele simple și fosforilate, acizii organici și inozitolul [106]. Determinarea conținutului cărnii în substanțe extractive fără azot s-a realizat matematic, prin diferența rămasă după ce din substanța uscată (SU %) s-au scăzut proporțiile celorlalte componente chimice de natură minerală sau organică, respectiv:

[SEN]=SU%- Cenușă% – (Grăsimi%+Proteine %) (23)

După determinarea conținutului procentual de proteine, azot total și de lipide din țesutul muscular, se poate obține și conținutul de umiditate (%) folosind următoarea formulă de calcul:

[Apă]=100 – (Azot total% + Proteine% + Lipide%) (%) (24)

Determinarea indicelui hepatosomatic [IHS]

Pentru determinarea indicelui hepatosomatic [IHS], ficatul peștilor a fost cântărit după disecție, putându-se calcula valoarea lui după următoarea formulă [107, 108]:

[IHS]=masăficat/masăpește*100 (25)

Determinarea indicelui viscerosomatic [IVS]

Pentru determinarea indicelui visceromatic [IVS], viscerele au fost cântărite (fără grăsime), pentru calcul folosindu-se următoarea formulă:

[IVS]=masăviscere/masăpește*100 (26)

2.9 Metode de prelucrare statistică a datelor

Datele obținute s-au prelucrat statistic cu ajutorul programelor: Microsoft Excel (Office) 2010 pentru Windows și SPSS Statistics 20.0 pentru Windows.

Normalitatea distribuției a fost verificată cu ajutorul testului Kolmogorov-Smirnov.

Omogenitatea variantei a fost testată cu ajutorul testului Levene. Testarea post-hoc pentru stabilirea subseturilor s-a realizat cu ajutorul testului Tukey’s-B și Duncan. Diferențele statistice între variabile au fost testate prin folosirea testului t (comparații între medii, semnificație p < 0.05) și a testului ANOVA.

Boxploturile au fost realizate cu ajutorul programului SPSS 20.0, iar graficele ce reprezintă regresia liniară simplă, lungime totală – masa corporală, au fost realizate în Microsoft Excel (Office 2010). Regresia liniară simplă se utilizează în analiza dintre variabile, pentru a previziona o variabilă dependentă (endogenă) notată cu y, utilizând o singură variabilă independentă (exogenă) x. Se consideră că o modificare a variabilei independente se va reflecta într-o modificare proporțională a variabilei dependente.

Coeficientul de determinare R2 s-a calculat și el pe baza regresiei liniare simple. Acesta reprezintă proporția de variație a dependenței explicate de modelul de regresie. Este întotdeauna mai mare sau egal cu zero (toate valorile sunt pozitive prin ridicarea la pătrat) și întotdeauna mai mic sau cel mult egal cu 1 atunci când variația explicată este egală cu variația totală (modelul explică perfect, în proporție de 100%, variația dependenței).

Formula de calcul:

[R2]=Ʃni=1(ŷi – ȳ)2/ Ʃni=1(yi – ȳ)2 0 ≤ r2 ≤ 1 (27)

Cu cât valoarea lui R2 este mai aproape de 1, cu atât modelul teoretic va fi mai bun; cu cât este mai aproape de zero, înseamnă că modelul nu reușește să surprindă ceea ce se întâmplă în realitate.

Atunci când se calculează într-o ecuație de regresie simplă, coeficientul se numește de determinație simplă și se notează cu r2; în regresia multiplă el se numește coeficient de determinație multiplă și se notează cu R2.

Coeficientul de corelație liniară Pearson (r)

Corelația Pearson (r) măsoară gradul de asociere dintre variabile. Aceasta se referă la gradul și sensul de variație concomitentă a valorilor unei variabile (x) în raport cu cealaltă (y), după un model de tip liniar. Domeniul de variație a coeficientului de corelație Pearson (r) este între r=-1 (corelație perfectă negativă) și r=+1 (corelație perfectă pozitivă). Absența oricărei legături (corelații) dintre variabile se traduce prin r=0. Un coeficient de corelație egal cu –1 arată o legătură inversă perfectă. In general, r > 0,4 → corelație bună.

rxy = n Ʃxiyi – Ʃxi Ʃyi / (n Ʃxi – Ʃxi) * (n Ʃyi – Ʃyi) (28)