PANSAMENTE NANOMODIFICATE BIOACTIV Student/ă:Corina CROITORESCU CUPRINS 1. PARTEA I 7 1.1. Introducere 7 1.2. PANSAMENTE 8 1.2.1. Condiții pentru un… [305743]

PROIECT DE DIPLOMĂ

Student/ă:Corina CROITORESCU

PANSAMENTE NANOMODIFICATE BIOACTIV

Student/ă:Corina CROITORESCU

CUPRINS

1. PARTEA I 7

1.1. Introducere 7

1.2. PANSAMENTE 8

1.2.1. Condiții pentru un pansament ideal 9

1.2.2. Clasificarea pansamentelor 11

1.2.2.1. Pansamentul protector 11

1.2.2.2. Pansamentul absorbant 11

1.2.2.3. Pansamentul ocluziv 12

1.2.2.4. Pansamentul umed 13

1.2.2.5. Pansamente tradiționale 14

1.2.2.6. Pansamentele pe bază de biomateriale 15

1.2.3. Formulări farmaceutice utilizate ca pansamente pentru răni și arsuri 15

1.2.3.1. Pansamentele tip film 15

1.2.3.2. Pansament cu hidrogel 16

1.2.3.3. Pansament cu hidrocoloid 17

1.2.3.4. Pansament din alginat de calciu 17

1.2.3.5. Pansament cu hidrofibre 18

1.2.3.6. Pansament din spumã 19

1.2.3.7. Pansament cu ioni de argint 19

1.3. Leziuni cutanate 21

1.3.1. Leziuni prin modificari de coloratie a pielii 21

1.3.2. Leziuni elementare cu continut solid 23

1.3.3. Leziuni elementare cutanate cu continut lichid 24

1.3.4. Deseuri cutanate 25

1.3.5. Leziuni elementare cutanate prin solutii de continuitate 25

1.3.6. Sechele cutanate 26

1.4. Plăgi 28

1.4.1. Vindecarea plăgii 29

1.5. Colagenul 34

1.5.1. Proprietăți colagen 34

1.5.2. Aplicatii biomedicale ale colagenului 35

1.5.3. Obtinerea colagenului de tip 1 folosit pentru obtinerea de hidrogeluri 36

1.5.4. Formulări de colagen pentru vindecarea rănii 38

1.6. Nanoparticule de Ag (AgNPs) 40

1.6.1. Metode de sinteză ale nanoparticulelor de argint 41

1.6.1.1. Sinteza fizica a nanoparticulelor de argint 43

1.6.1.2. Sinteza fotochimica a nanoparticulelor de argint 43

1.6.1.3. Sinteza biologica a Nanoparticulelor de argint 44

1.6.1.4. Sinteza bacteriană a nanoparticulelor de argint 44

1.6.1.5. Sinteza fungică a nanoparticulelor de argint 46

1.7. Core Shell SiO2-Ag II 47

1.7.1. Metode de sinteza a Core-Shell 48

2. PARTEA a II-a 51

2.1.1. Obtinerea nanoparticulelor de argint 51

2.1.2. Obtinerea SiO2 51

2.1.3. Obtinerea SiO2@Ag 52

2.1.4. Obtinerea hidrogelurilor composite pe baza de collagen si SiO2/SiO2@Ag 52

2.2. METODE DE CARACTERIZARE 53

2.2.1. Difracția de Raze X 53

2.2.2. Microscopia Electronică prin Transmisie 55

2.2.3. Spectroscopia de Infraroșu cu Transformata Fourier 56

2.2.4. Microscopia Electronică de Baleiaj 57

2.2.5. Capacitatea de gonflare (absorbție) 58

2.2.6. Degradarea enzimatică 59

2.2.7. Protocoale efect antimicrobian 59

2.2.7.1. Analiza calitativa a efectului antimicrobian 59

2.2.7.2. [anonimizat] (antibiograma adaptata) 59

2.2.7.3. Biofilm – material solid functionalizat 60

2.2. Rezultate și discuții 61

2.2.1. Difracția de raze X 61

2.2.2. Microscopia Electronică prin Transmisie 62

2.2.3. Difracție de electroni pe arie selectată (SAED) 63

2.2.4. Caracterizarea materialelor composite 68

2.2.4.1. Microscopie electronică de baleiaj 68

2.2.4.2. Spectroscopia de Infraroșu cu Transformata Fourier 73

2.2.4.3. Capacitatea de gonflare (absorbție) 75

2.2.4.4. Degradarea enzimatică 77

2.2.4.5. Analize biologice 78

3. Concluzii 80

4. Surse bibliografice 81

[anonimizat]. [anonimizat] a [anonimizat]-a doua este partea reprezentată de metodele de sinteză și caracterizare pentru a obține pansamentul bioactiv.

Proiectul de cercetare s-a bazat pe o serie de studii bibliografice privind performanțele, metodele de sinteză și metodele de caracterizare a pansamentului bioactiv. Pe tot parcursul analizei practice, am încercat într-un mod cât mai realist și corelat să ating obiectivele și strategiile stabilite la începutul lucrării.

În final, consider că succesul unei astfel de lucrări constă, pe de o parte în totalitatea cunoștintelor pe care le-am dobândit, iar pe de altă parte, cât de bine am înțeles aplicabilitatea pansamentului bioactiv in vindecarea rănilor, în urma testărilor făcute.

Abstract

The structure of the diploma paper is divided into several chapters, divided into two parts. The first part is theoretical and includes the role of dressings in the healing of acute and chronic wounds, but also of tissue lesions, and the second is the part of the synthesis and characterization methods to obtain the bioactive dressing.

The research project was based on a series of bibliographic studies on performance, synthesis methods and bioactive dressing characterization methods. Throughout the practical analysis, I tried in a realistic and correlated way to achieve the goals and strategies set at the beginning of the paper.

Finally, I believe that the success of such a work consists, on the one hand, of all the knowledge we have gained, and on the other hand, how well I understand the applicability of the bioactive dressing in wound healing, following tests.

PARTEA I

Introducere

Pansamentele bioactive sunt pansamente care livrează substanțe active în vindecarea rănilor, prin furnizarea de compuși bioactivi sau fabricate din materiale cu endogen activitate.Aceste materiale includ hidrocoloide, alginate, colagene, chitosan, chitină,derivați de chitosan sau chitină și biotextile. Aceste pansamente bioactive fac parte în mod obișnuit, la categoria de îmbrăcăminte de rană interactivă și arsură a Administrației SUA pentru Alimente și Medicamente (FDA).Vindecarea este interacțiunea unei cascade complexe de evenimente celulare care generează resurfacarea, reconstituirea și restaurarea rezistenței la tracțiune a pielii rănite. Vindecarea rănilor este rezultatul interacțiunilor dintre citokine, factori de creștere, sânge și extracelulare matrice (ECM)[1].

Citokinele promovează vindecarea prin diferite căi cum ar fi stimularea producerii de componente ale membranei bazale, prevenirea deshidratării, creșterea inflamației și formarea țesutului de granulare. Vindecarea este un proces sistematic, explicat în mod tradițional în termenii a trei faze clasice: inflamația, proliferarea, maturarea sau remodelarea. Într-o altă schemă, procesul de vindecare a rănilor poate fi împărțit în patru faze continue, și anume hemostază, inflamație, proliferarea și remodelarea. Formele de cheag și celule inflamatorii debridează răniți țesut în timpul fazei inflamatorii. Epitelizarea, fibroplasia și angiogeneza apar în timpul fazei proliferative. Între timp, forme de țesut de granulație și rana începe să se contracteze. În cele din urmă, în timpul fazei de maturare, colagenul se strânge legături încrucișate cu colagen și cu molecule de proteine, crescând rezistența la tracțiune din cicatrice. [1].

PANSAMENTE

Din 1946, după cel de-al doilea război mondial, au fost efectuate experimente cu un număr de pansamente bazate pe produse derivate din poliamidă sau polietilenă și mai târziu pansamente din poliuretan. Mai târziu, au fost studiate și alte pansamente interactive și bioactive cum ar fi pansamente impregnate, pansamente de spumă, hidrogeluri, alginate, hidrocoloide, hidrofibre, pansamente de absorbție a mirosurilor și, mai recent, pansamente bioactive pe bază de chitină sau chitosan și derivații acestora. Cel mai important progres în îngrijirea rănilor a venit din studiul lui Winter anii 1960, care au arătat că rănile ocluizate la animale porcine s-au vindecat mult mai repede decât rănile uscate și mediul de vindecare a rănilor umede au optimizat ratele de vindecare. El a demonstrat asta atunci când rănile sunt ținute umede, epitelializarea este de două ori mai rapidă decât la răni lasate să se usuce prin expunere la aer. Ulterior Hinman și Maibach și-au confirmat lucrarea pe ființe umane în 1963. O rană deschisă, care este direct expusă aerului, se deshidratează și se formează o cicatrice. Aceasta constituie o barieră mecanică pentru migrarea celulelor epidermice, care sunt apoi obligate să se mute într-un nivel mai profund de țesut, ceea ce prelungește procesul de vindecare.

Vindecarea umedă împiedică formarea cicatricilor, deoarece pansamentul absoarbe exsudatul la nivelul plăgii secretate de ulcer. Capacitatea pansamentelor bioactive de a absorbi exudatele și de a le furniza un mediu umed este o caracteristică foarte importantă a acestor pansamente. În sens larg, pansamentul reprezintă totalitatea mijloacelor și metodelor care realizează protecția unui țesut sau organ față de acțiunea agresivă a diverșilor agenți. În sens restrâns, pansamentul chirurgical este actul prin care se realizează și se mențineasepsia unei plăgi, în scopul cicatrizării ei[1].

Pansamentele sunt concepute pentru crearea și menținerea unui mediu care este cel mai potrivit pentru vindecarea rănilor prin asigurarea schimbului ușor de gaze,absorbția exsudaților de la locul plăgii și asigurarea unui mediu steril care nu susține creșterea microbiană. Plăcile pentru plăgi sunt folosite în principal pentru a preveni pierderea în vrac a țesuturilor și sunt eficiente împotriva traumelor, a rănilor cronice, cum ar fi răni cronice de arsură, diabet, decubit și ulcere venoase. În caz de infecție, pansamentele fără medicament nu pot fi eficiente din cauza organismelor infecțioase la nivelul plăgilor și provoacă infecții grave necesitând îndepărtarea pansamentului pentru tratament și vindecare ulterioara. Tratarea acestor răni necesită suprimarea și controlul creșterii bacteriene. Astfel de răni necesită un tratament antimicrobian local cu un pansament, pentru un management adecvat și ulterior vindecare[1].

Condiții pentru un pansament ideal

Pansamentele moderne pentru răni sunt concepute pentru a facilita funcționarea plăgii mai degrabă decât să o acopere. Vindecarea rănilor este un proces celular biologic legat la procesul de reparare. Procesul fiziologic al vindecării rănilor este un proces dinamic, un model complex de patru faze continue, și anume hemostaza, inflamația, proliferarea și maturarea sau remodelarea. Cel mai bun dressing este pielea proprie a pacientului, care este permeabilă la vapori și protejează straturile profunde ale țesutului împotriva leziunilor mecanice și a infecțiilor. Dezavantajul acestor pansamente sunt proprietățile lor antigenice, care limitează durata aplicării. Un pansament pentru răni creează un microclimat potrivit pentru vindecarea rapidă și eficientă[2].

Pansamentul trebuie să indeplineasca anumite conditii[2]:

Pansamentul trebuie să acopere complet plaga (conferind izolare față de mediul extern);

Materialul din care se realizează pansamentul să aibă o bună putere absorbantă (pentru plăgile secretorii),

Să fie confecționat din materiale sterile, să nu conțină particule sau componente toxice;

Să fie atraumatic (executarea pansamentului să nu provoace durere);

Materialul de fixare al pansamentului să fie suficient de elastic, dar suficient de bine strâns, încât să mențină pansamentul fix, fără să producă constricție.

Pansamentul ideal “ trebuie sa asigure[2]:

înlăturarea excesului de exudat și a toxinelor – previne macerarea

umiditate crescută la interfața plagă-pansament – mediul uscat întarzie vindecarea plăgii

permisivitatea schimburilor gazoase dintre plagă și exterior

izolație termică – reduce temperatura la nivelul patului plăgii

protective împotriva infecțiilor secundare- previne pătrunderea microorganismelor în plagă

schimbarea atraumatică a pansamentului – nu afectează procesul de vindecare și reduce durerea.

Tehnica pansamentului se efectuează în funcție de stadiul de vindecare al plăgii, respectându-se următoarele reguli:

îngrijirea plăgii să se facă în condiții de asepsie perfectă

să se asigure prin pansament, o bună absorbție a secrețiilor

plaga să fie protejată de factorii nocivi, termici, infecțioși, mecanici, din mediul înconjurător

să se asigure repausul sau imobilizarea regiunii lezate pentru a grăbi cicatrizarea

să se aseptizeze plaga cu antiseptice corespunzătoare.

Clasificarea pansamentelor

Pielea are o tendință remarcabilă de a se repara, dar când daunele sunt grave sau apare într-o zonă mai mare, o acoperire adecvată și imediată a zonei ranii cu un dispozitiv optim sau pansament adecvat este esențial pentru a proteja rana și pentru a accelera procesul de vindecare. Materialele folosite pentru a acoperi rănile și arsurile sunt de asemenea, cunoscute sub numele de piele artificiale, deoarece acestea îndeplinesc funcțiile de piele normală în zonele distruse ale pielii[3].

Pansamentul protector

Acesta are ca obiectiv acoperirea unei plăgi care nu secretă, nu prezintă tub de dren (plaga operatorie, locul unei injecții sau puncții, locul unde este montat un cateter venos) pentru a realiza protecția față de mediul înconjurător[3].

Figura1. Tip de pansament protector[3]

Pansamentul absorbant

Acesta are ca obiectiv acoperirea plăgilor drenate sau secretante cu un strat de comprese și un strat de vată.

Figura2. Tip de pansament absorbant[3]

Pansamentul ocluziv

Acesta are ca obiectiv acoperirea cu comprese și vată a plăgilor însoțite de leziuni osoase peste care se aplică aparatul gipsat pentru imobilizare.

Figur3. Tip de pansament ocluziv[3]

Pansamentul compresiv are ca obiectiv acoperirea unei plăgi sangerande în scop hemostatic, pentru imobilizarea unei articulații în caz de entorsă sau pentru reducerea unei cavități superficiale după puncționare[3].

Figura 4. Pansamentul compresiv[3]

Pansamentul umed

Acesta are ca obiectiv diminuarea edemului inflamator si este de 2 tipuri:

alcoolizat: realizat din comprese îmbibate în alcool și îmbrăcate într-un strat consistent de vată și, ulterior, acoperite cu un bandaj. Grație acțiunii antiinflamatorii și calmante, acesta își găsește întrebuințarea în special în tratarea panaritiilor și a plăgilor infectate[3].

decongestionant și antiseptic, fiind utilizat cu precădere în caz de dermatoză acută, dermite zemuinde.

Figura5. Pansament umed[3]

Diferitele pansamente utilizate pentru vindecarea rănilor sunt clasificate după cum urmează:

În funcție de natura acțiunii, pe baza naturii acțiunii, materialele de îmbrăcare a rănilor pot fi clasificate după cum urmează:

1. Produse pasive – compozite din tifon și tifon-bumbac

2. Produse interactive – tamburi polimerice și spume care oferă transparență, permeabilitate la vapori de apă, permeabilitate la oxigen și uneori biodegradabilitate

3. Produse bioactive – pansamente avansate care au capacitatea de a transporta substanțe active la locul rănii prin eliberarea de substanțe active în vindecarea rănilor, de exemplu, colagen, chitosan și alginate[3].

În funcție de natura materialelor, materialele de îmbrăcare a rănilor pot fi clasificate dupa cum urmează:

Pansamente tradiționale

Acestea sunt cele mai comune pansamente tradiționale sunt tifonul, bumbacul și tifon compozit. Principalele funcții realizate de aceste pansamente sunt absorbția exsudațiilor, pansamentelor de specialitate pentru gestionarea rănilor permit un loc uscat, ascund rana din vedere, asigură protecție fizică și ăl protejază de contaminare. Exudatul ce se scurge prin materialele tradiționale, de cele mai multe ori crește posibilitatea de infecție și este una dintre cele mai mari probleme ale acestui tip de pansament. Agenții antibacterieni sunt adăugați în pansamente pentru a elimina infecția. În plus, una dintre cele mai importante probleme întâlnite în aceste pansamente este reacția de corp strain provocată de fibrele de bumbac asupra rănii. Prin urmare tifonul compozit cu o suprafață non-adezivă este destinat pentru a reduce durerea și trauma care pot să apară atunci când se elimină pansamentele traditionale de pe suprafața plăgilor[4].

Figura6. Tifon[4]

Aceste pansamente tradiționale au mai multe dezavantaje dupa cum urmează:

Nu se poate preveni invazia microbiană; absorbția redusă a exudațiilor ranilor care conduc la acumularea de exudate la suprafața plăgii, care este predispusă la atac microbian.

Exudarea scurgerii de pe suprafața saturată crește riscul de infectare.

Duce la traumatism la pacienți în momentul îndepărtării, deoarece aderă la patul plăgii, în afară de eventuala sângerare și deteriorarea epiteliului nou format .

Nu asigură permeabilitatea gazelor.

Se folosește pentru răni minore și nu pentru răni cronice

Pansamentele pe bază de biomateriale

Pansamentele pe bază de biomateriale sunt clasificate în următoarele:

Alogrefe- Cele mai frecvente surse sunt fragmentele de piele proaspete sau liofilizate preluate din rudele sau cadavrele pacienților . Cu toate acestea, există un mare risc de reacție imună și organismul poate respinge țesutul. Suprimarea sistemului imunitar efectuată pentru a preveni respingerea organismului de țesut transplantat conduce și la creșterea riscului de infecție. Dezavantajul acestor pansamente este difluzia în pregătire, lipsa donatorilor, costuri ridicate și durata de depozitare limitată[5].

Derivații de țesuturi – Aceste materiale derivate din diferite forme de colagen, au un conținut redus de risc de contaminare, caracteristici antigenice slabe și ușor de pregătit. Cu toate acestea, un risc mai mare de infecția, în special în utilizarea pe termen lung este principalul dezavantaj[5].

Xenogrefe – Sunt materiale disponibile comercial, cum ar fi cele derivate din piele porcină , contrar autografelor și alogrefelor. Ele pot fi ușor sterilizate și au o lungă durată de termen de valabilitate. Cu toate acestea, riscul declanșării unui răspuns imun din cauza unui țesut străin este principalul dezavantaj[5].

Formulări farmaceutice utilizate ca pansamente pentru răni și arsuri

Multe formulări farmaceutice au fost recent dezvoltate ca materiale pentru pansamente în tratamentul rănilor și arsurilor [6].

Figura7. Arsuri la nivelul pielii[6]

Pansamentele tip film

Acestea sunt transparente și semipermeabile (impermeabile pentru fluide și bacterii și permeabile pentru oxigen și vapori de apa). Deoarece acestea se schimbă mai rar, provoacă mai puțină durere. Aceste pansamente pot fi adezive sau nonadezive și sunt confecționate fie din poliuretan, fie din straturi de polimer sintetic[7-10].

Figura8. Pansament sub forma de film

Pansamentele permit trecerea vaporilor de apă, O2 și CO2 dinspre plagă, sunt impermeabile pentru bacterii și favorizează debridarea autolitică. Deoarece sunt semipermeabile, pansamenele film mențin un mediu umed în plagă. Există diferite tipuri de filme cu diferite grade de permeabilitate pentru vapori, dar pansamentele film sunt recomandate doar pentru plãgi cu exudat foarte puțin sau absent deoarece fluidul se poate acumula sub pansament provocând macerare. Aceste pansamente sunt recomandate doar pentru plăgile superficiale cu exudat minim (spre exemplu, plăgile aflate în stadiul de epitelizare)[7-10].

Filmele se pot utiliza ca pansamente secundare. Deoarece se comportă ca niște pansamente ocluzive, nu se folosesc pe ulcerele infectate cu bacterii anaerobe (de obicei recunoscute dupã mirosul neplăcut). Se pot schimba în maxim șapte zile. Acestea prezinta dezavantajul de a nu putea fi folosite pe tegumente fragile și adezivul poate cauza dermatitã de contact[7-10].

Pansament cu hidrogel

Deoarece hidrogelurile sunt confecționate din polimeri cu un conținut mare de apă, ele mențin umiditatea la nivelul ulcerului și diminueazã durerea. Nu se utilizeazã în tratarea ulcerelor infectate și prezintã risc de a determina o dermatitã de contact datoritã propilen glicolului sau altor componente. Pansamentele cu hidrogel au proprietãți semiocluzive și sunt folosite pentru a hidrata plăgile neinfectate uscate, dar pot fi folosite și pentru a absorbi exudatul moderat unde este cazul. Ele favorizează debridarea autolitică. Nu sunt indicate în ulcerele cu exudat abundent deoarece favorizeazã macerarea, și nici înaintea terapiei cu larve deoarece acestea nu tolereazã hidrogelurile. Hidrogelurile se utilizeazã în fazele de granulație și epitelizare ale ulcerului. Sunt transparente și permit monitorizarea plãgii fãrã a îndepãrta pansamentul. Se schimbã la fiecare 1- 3zile. Se utilizeazã împreunã cu un pansament secundar[7-10].

Pansament cu hidrocoloid

Aceste pansamente adezive conțin carboximetilceluloza sodică combinată cu pectinã și sunt utilizate în toate fazele ulcerului de gamba (debridare, granulare, epitelizare). Absorb exudatul și formează un gel, mențin mediul umed. Atunci când sunt îndepărtate pot lăsa un miros neplăcut care se poate confunda cu infecția [2]. pH-ul mic pe care îl creează este eficient în tratarea ulcerelor suprainfectate cu Pseudomonas. Ele favorizează debridarea autolitică a plăgilor deoarece rehidratează, sunt imper-meabile pentru fluide și bacterii, se schimbă rar, la 2-7zile.

Figura 9. Pansament cu hidrogel

Prezintã dezavantajele de a nu absorbi, produc traumatism când sunt îndepărtate, pot determina dermatite de contact, pot macera țesutul din jur și au miros neplăcut[7-10].

Pansament din alginat de calciu

Aceste pansamente semipermeabile, cu putere mare de absorbție au multiple avantaje: rețin secrețiile moderate-abundente din ulcerele exsudative sau infectate, sunt hemostatice datoritã ionilor de calciu pe care îi elibereazã și intervin în coagulare, debrideazã autolitic plagile, însã prezintã dezavantajul de a necesita pansament secundar. Pansamentele pe baza de alginat de calciu absorb pânã la de 20 de ori greutatea lor făcândule foarte eficiente în tratatrea exudatului moderat-sever. În contact cu secrețiile se transformã într-un gel absorbant care permite îndepărtarea fãrã durere a pansamentului și protejeazã țesutul nou de granulație. Se schimbă la 3–7 zile[7-10].

Figura10. Pansament din alginat de calciu

Pansamentele din alginat de calciu nu se aplică pe ulcere uscate (sau cu necrozã) deoarece aderă la suprafața plăgii. Daca acest lucru se întâmplă, fie se pot îndepărta cu soluție de clorură de sodiu 9% încãlzită, fie se lasă pe loc deoarece sunt biodegradabile. Un dezavantaj pe care îl produc este macerarea tegumentului perilezional intact deoarece aceste pansamente permit fluidului sa colecteze intre pansament și tegumentul perilezional intact[7-10].

Pansament cu hidrofibre

Pansamentele cu hidrofibre conțin fibre de carboximetilcelulozã sodicã și sunt utilizate pentru debridarea ulcerelor cu exudat moderat abundent, având putere mare de absorbție. Sunt netraumatizante la îndepãrtare și pentru cã sunt neaderente, necesită pansament secundar. Dacă exudatul nu este moderat-abundent, pansamentul va adera la plagã. Se schimba la maxim 7 zile.

Figura11. Pansament cu hidrofibre

Comparativ cu alginații, în contact cu exudatul ulcerului formeazã un gel care poate avea o putere de absorbție de trei ori mai mare decât cea a alginaților [14], iar hidrofibrele produc mai puținã macerație perilezionalã. Ambele tipuri de pansamente pot lãsa un rezidu fibrinos și pot fi utilizate în ulcerele cu exudat ușor dar necesitã soluție salinã pentru a fi îndepãrtate[7-10].

Pansament din spumã

In general, pansamentele din spumã sunt groase și prezintã o structurã bilaminarã cu suprafața hidrofilicã. Acest tip de pansament este utilizat în fazele de granulatie și epitelizare ale ulcerului cu exudat ușor pânã la abundent. Doarece este permeabil pentru apa și vapori și impermeabil pentru lichide și germeni, absoarbe exsudatul în exces și protejeaza de contaminarea din exterior. Poate fi aderent sau non-aderent. Poate fi schimbat cel mult la 7 zile.

Figura12. Pansament din spumã

Prezintã dezavantajele de a macera pielea înconjurãtoare și este opac. De obicei sunt pansamente neaderente, mai bine tolerat de pielea fragilã, ce necesitã pansament secundar. Poate fi utilizat și cu un pansament secundar care sã absoarbã exudatul în exces. Se îndeparteaza nontraumatic și deoarece se schimã rar, reduce costurile. Aceste pansamente, asemãnãtor cu hidrocoloizii, pot lãsa un miros neplãcut. Pânã în prezent, nu sunt raportate cazuri de dermatita de contact la alginați sau pansamente pe bazã de spumã, exceptând spumele aderente[7-10].

Pansament cu ioni de argint

Pansamentele cu ioni de argint controleazã colonizara și infectarea. Infecția este una dintre cele mai frecvente complicații ale ulcerului venos, ulcerele infectate generând tratamente costisitoare perioade lungi de timp.

Figura 13. Pansament cu ioni de argint

Se utilizeazã pe termen scurt deoarece sunt iritante. Nu trebuie utilizate mai mult de 4 sãptãmâni fãrã o justificare clinicã puternicã. Pansamentele nu se schimbã mai devreme de 24 de ore sau mai târziu de 7 zile[7-10].

Pansamentele compuse

Acestea sunt alcãtuite din mai multe straturi (straturi absorbante, hidrocoloizi, spume, bariere antibacteriene, alginați, hidrogeluri) având scopul de a crește absorbția, blocarea fluidului și debridarea autoliticã. Nu sunt indicate în tratarea ulcerelor infectate. Sunt opace si au o margine adezivã care se fixeazã de tegument.

Figura14. Pansament compus din doua straturi un strat antibacterin si unul de hidrogel

Pansamentele compozite au grade variate de absorbție, fiind utilizate în controlul exudatului și ca pansamente secundare pentru alginați, spume, hidrofibre. Pot fi schimbate la maxim 7 zile[7-10].

Leziuni cutanate

Leziunile elementare se impart in mod obisnuit in primare si secundare. Leziunile elementare cutanate primare sunt leziuni care apar pe pielea sanatoasa fara a fi precedate de existenta unui stadiu intermediar. Se disting urmatoarele leziuni primare: macula, papula, nodulul, vezicula, bula si pustula. Leziunile elementare cutanate secundare sunt precedate de existenta altor leziuni. Ele sunt reprezentate de: scuama, crusta, lichenificarea, eroziunea, ulceratia, cicatricea si pustula.

Leziunile elementare se clasifica morfofiziopatologic in sase categorii.

Leziuni prin modificari de coloratie a pielii

Leziunile elementare prin modificari de coloratie a pielii pe o zonǎ restransǎ (circumscrisǎ) se numesc pete sau macule si se caracterizeaza prin aceea ca nu modifica relieful sau consistenta pielii, ci numai culoarea. In functie de modificarile histopatologice care stau la baza acestor leziuni, petele pot apǎrea prin tulburǎri ale pigmentatiei sau prin tulburǎri ale vascularizatiei.

Rănile acute se pot vindeca într – o perioadă limitată de timp, de obicei nu prezintă complicații și se caracterizează prin pierderea integrității pielii (vătămării) care apare brusc. Țesutul rănit vindecă într-o manieră previzibilă în care trombocitele, keratinocitele, celulele de supraveghere imună, celulele microvasculare și fibroblastele joacă roluri majore în restaurarea integrității țesuturilor [11].Aceste răni sunt fie chirurgicale, fie traumatice [12].

Rănile cronice sunt răni care nu se vindecă în perioada normală și sunt asociate cu acestea factori predispozanți care slăbesc integritatea țesuturilor dermice și epidermice. Acești factori fie să perturbe echilibrul între bioburdenul ranit și sistemul imunitar al pacientului sau afecta ciclul de vindecare a rănilor. În ceea ce privește durata, în cazul în care rana nu reușește să se vindece sau arată nu semn de recuperare în termen de 12 săptămâni, este considerată o rană cronică. Factorii predispozanți pot afectează perfuzia tisulară care cauzează răni cronice, cum ar fi ulcerele vasculare asociate cu tulburările metabolice, cum ar fi diabetul, care cauzează ulcerele piciorului diabetic . Ele pot fi identificate prin criterii precum vindecarea întârziată și țesutul de granulație friabilă, faza inflamatorie prelungită, infecție persistentă și prezența microorganismelor rezistente [13-15].

Petele pigmentare  sunt modificari de coloratie ale pielii cauzate de acumularea de pigment in epiderm si derm, fiind reprezentate de leziuni circumscrise, difuze sau generalizate care nu dispar la presiune. Se produc prin acumularea de melanina sau prin depunerea la nivel cutanat a altor pigmenti endogeni sau exogeni (pete nemelanice)[15].

a)  Pete cauzate de tulburari ale melanogenezei apar prin:

– acumularea anormala de melanina (pete hipercrome) care poate fi congenitala (ex: nevi pigmentari) sau dobandita (ex: cloasma, efelide, pata cafea cu lapte), primara (ex: nevi nevocelulari, efelide) sau secundara altor leziuni (ex: pemfigus, lichen plan).

– pierderea partiala (hipocromie) sau totala (acromie) a melaninei poate fi congenitala (ex: albinism) sau dobandita (ex: vitiligo), primara (ex: vitiligo) sau secundara altor leziuni (ex: pitiriazis versicolor, eczematide, psoriazis vulgar)[15].

b)  Pete produse prin acumularea altui pigment decat melanina – apar de obicei in dermatita cronica de staza a membrelor inferioare fiind produse prin depunerea hemosiderinei (pigment derivat din hemoglobina) care va conduce la pigmentarea bruna a tegumentului[15].

2.  Petele vasculo-sanguine sunt datorate alterarii vaselor si sangelui circulant sau extravazarii hematiilor.

a) Eritemul este o roseata a pielii de durata in general scurta, mai rar persistenta, cu nuante variabile de la rosu aprins la roz palid, care dispare la presiune, avand temperatura locala crescuta. Histopatologic se constata largirea lumenului arteriolelor dermice. Eritemul poate fi asociat cu alte leziuni precum vezicule, bule, pustule[15].

b) Eritrodermia se caracterizeaza printr-un eritem al intregului tegument, caracterizat prin culoarea rosie vie si asocierea cu alte semne cutanate: edem cutanat profund, descuamatie mai mult sau mai putin intensa, si cu semne generale (febra, alterarea starii generale), adenopatii superficiale. Eritrodermia este un sindrom grav care poate aparea in mai multe afectiuni precum psoriazis, limfom cutanat, eczema, toxidermie.

c) Cianoza este o pata vasculara persistenta, de nuanta rosie-violacee, fara caracter inflamator si care dispare la presiune. Pielea este rece la palpare. Este cauzata de staza a sangelui in capilare si vene datorata unui spasm arterial. Cianoza este localizata mai ales la extremitati (ex: acrocianoza, boala Raynaud, degeraturi).

d) Purpura este o modificare de culoare a pielii, de obicei circumscrisa, datorata extravazarii hematiilor in derm cauzata fie de o lezare a peretelui vascular, fie de o anomalie a coagularii[13-15].

Clinic, purpura se manifesta initial ca o pata de coloratie rosu inchis care nu dispare la presiune, schimbandu-si apoi aspectul datorita modificarilor hemoglobinei, trecand prin diverse nuante: albastru, galben, pentru ca in final sa ramana o pata bruna, trecatoare sau durabila (ex: purpurele cronice din hemosideroze). Localizarea de electie este la nivelul membrelor inferioare.

e) Petele vasculare propriu-zise sunt pete circumscrise aparute datorita unei dilatatii vasculare anormale sau unui proces de neoformatie a capilarelor dermice. Ele dispar la presiune dar sunt permanente. Acestea pot fi congenitale (ex: angiomul plan) sau dobandite (telangiectazii, stelute vasculare)[13-15].

Leziuni elementare cu continut solid

1. Papula este o proeminenta a pielii solida, neindurata, bine circumscrisa, de mici dimensiuni cu diametrul de obicei sub 1 cm. Dupa aspect papula poate fi rotunda, ovala, poligonala, ombilicata sau conica. Culoarea papulelor poate fi rosie (ex: eritemul polimorf), rosie-violacee (ex: lichen plan), rosie-bruna (ex: sifilis)[14].

Din punct de vedere histopatologic papula se poate forma prin ingrosarea epidermului (ex: verucile plane juvenile), prin edematierea dermului (ex: urticarie) sau prin infiltrat inflamator (ex: sifilis, lichen plan).

2. Nodulii sunt leziuni solide, circumscrise, rotunde, mai mult sau mai putin proeminente, cu dimensiuni de peste 1 cm, ferme la palpare. Substratul anatomic al nodulilor este un infiltrat situat in derm sau hipoderm. Uneori sunt folosite sinonime precum: nodozitatile care sunt induratii subcutanate avand dimensiuni mari de cativa centimetri (ex: eritemul nodos) sau gomele care sunt noduli cu evolutie progresiva trecand prin patru stadii: cruditate, ramolire, ulcerare si reparatie (ex: sifilis, tuberculoza cutanata, lepra)[14].

3. Vegetatiile se prezinta ca si excrescente moi, filiforme sau globuloase, cu suprafata neregulata, avand uneori aspect conopidiform (ex: vegetatiile veneriene).

4. Lichenificarea consta in ingrosarea pielii cu adancirea santurilor normale care prin intretaierea lor determina suprafete poligonale. Lichenificarea este o leziune cutanata secundara produsa prin scarpinat repetat si intalnita in neurodermite, eczeme, prurigo cronic.

5. Hiperkeratoza consta in ingrosarea marcatǎ a stratului cornos. Hiperkeratoza poate fi circumscrisa (durioame, veruci) sau difuza (ihtioza).

6. Leucokeratoza reprezintǎ o tulburare a procesului de keratinizare ce consta in aparitia straturilor granulos si cornos la nivelul mucoaselor, formand plǎci albicioase (lichen plan al mucoaselor, leucoplazie, lupus eritematos cronic al mucoaselor).

7. Tumora este o formatiune circumscrisa a pielii, neinflamatorie, de obicei solida, de dimensiuni si consistenta variabile, reliefata sau inclavata in piele, cu tendinta sa persiste sau sa creasca. Tumorile cutanate pot avea ca punct de plecare: epidermul (ex: carcinoamele, melanoamele), elementele constitutive ale dermului (ex: fibroblaste, vase, nervi, anexe) sau din celulele prezente in piele (ex: metastaze, limfoame). Pe plan evolutiv tumorile benigne sunt fie stationare, fie prezinta o crestere rapida spre deosebire de cele maligne care cel mai ades se extind lent[16].

Leziuni elementare cutanate cu continut lichid

1. Veziculele sunt mici ridicaturi circumscrise, translucide, de mici dimensiuni (diametrul de 1-3 mm), continand un lichid limpede, clar. In evolutie veziculele se pot rezorbi lasand la suprafata o scuama fina sau sa se rupa spontan sau prin scarpinat situatie in care serozitatea se usuca dand nastere unei cruste sub care se gaseste o mica eroziune, sa conflueze formand bule sau sa se infecteze cu formarea de pustule[17].

2. Bulele sau flictenele sunt ridicaturi ale epidermului de forma rotunda sau ovalara, cu dimensiuni cuprinse intre 5 mm si mai multi centimetri, avand un continut lichid care poate fi clar, tulbure sau hemoragic. In raport cu cantitatea de lichid colectat in interiorul lor bulele pot fi bombate, hemisferice sau din contra turtite, flasce cand serozitatea este mai putin abundenta (ex: pemfigus, erizipelul bulos, arsurile de gradul II).Evolutia lor este diferita astfel incat cele rezistente se pot rezorbi, pe cand cele fragile se rup spontan sau sub actiunea unui mic traumatism, serozitatea eliberata uscandu-se si dand nastere unei cruste. Dupa vindecare se poate observa o mica pata pigmentata reziduala. In alte situatii continutul bulelor se poate tulbura devenind purulent si dand nastere unei pustule.

3. Pustulele sunt leziuni primare care se prezinta ca ridicaturi circumscrise, de culoare alba sau galbena si avand un continut purulent. In evolutie prin uscarea continutului sau dupa ruperea lor se formeaza cruste galben-brune. Pustulele pot fi primitive sau secundare suprainfectarii veziculelor. Pustulele primitive le intalnim in infectiile stafilococice (ex: foliculita stafilococica), in acnee sau psoriazis pustulos.

Deseuri cutanate

Acestea sunt leziuni cutanate rezultate din cornoase hipeplaziate, a secretiilor patologice si a tesuturilor necrozate.

1. Scuamele iau nastere prin acumularea la suprafata pielii a celulelor, indepartandu-se mai mult sau mai putin usor. De cele mai multe ori sunt primare fiind adesea asociate cu alte leziuni primare indeosebi cu eritemul realizand leziuni eritemato-scuamoase[17].

2. Crustele sunt leziuni secundare rezultate din uscarea la suprafata pielii a secretiilor patologice din eroziuni, ulceratii,escoriatii. Forma si dimensiunea crustelor sunt cele ale leziunilor din care provin. Culoarea crustelor poate fi galbuie (ex: eczema), galbena ca mierea (ex: impetigo streptococic) sau hematica (ex: ectima, epitelioame)[17].

Leziuni elementare cutanate prin solutii de continuitate

Dupa profunzimea lor se disting:

1. Eroziunea sau exulceratia este o pierdere de substanta superficiala cu interesarea numai a epidermului, fǎrǎ a depasi membrana bazala, si care se vindeca fara cicatrice lasand doar o macula pigmentata reziduala. Apare secundar in evolutia veziculelor, pustulelor, bulelor, dar poate fi si primitiva in sifilisul primar (sifilomul primar).

2. Ulceratia este o pierdere de substanta mai profunda decat eroziunea interesand dermul si chiar hipodermul si care se vindeca printr-o cicatrice sechelara. Ulceratia poate fi superficiala (ex: ectima) sau intinsa si profunda (ex: carcinoame, TBC cutanat, lepra). Forma ulceratiei poate fi rotunda, ovala sau neregulata, fundul poate fi neted, anfractuos sau proeminent, marginile pot fi taiate drept (ex: goma sifilitica), alteori decolate (ex: goma TBC) sau ridicate in burelet (ex: carcinoame). Baza ulceratiei poate fi moale, infiltrata sau dura[18].

3. Escoriatia este o pierdere de substanta superficiala sau profunda produsa de un traumatism. Poate fi accidentala consecutiva unei zgarieturi printr-un corp strain sau simptomatica in urma scarpinatului (ex: eczema, prurigo, pediculoza).

4. Fisura este o eroziune sau o ulceratie de forma liniara, dureroasa, localizata in regiuni inflamate si supuse miscarilor de extensie (ex: pliuri, palme, plante). Ragada este o fisura liniara situata in jurul orificiului bucal.

5. Gangrena este o necroza tisulara de coloratie neagra avand origine vasculara sau infectioasa si care se ulcereaza secundar prin eliminarea tesutului necrotic.

6. Escara este o necroza ulcerata secundar si localizata in zone de presiune. Ea se poate extinde la muschi, tendoane, oase si articulatii.

Sechele cutanate

1. Cicatricea este o leziune circumscrisa sau mai intinsa aparuta in urma unui proces de reparare cu formarea de tesut de neoformatie implicand mai ales dermul, aparut dupa pierderea de substanta sau dupa o inflamatie cutanata.

Cicatricea propriu-zisa ia nastere prin inlocuirea cu tesut de neoformatie a oricarei pierderi de substanta mai profunda. Culoarea cicatricei poate fi alba-sidefie, hiperpigmentata in totalitate sau depigmentata in centru si hiperpigmentata la periferie.

Cicatricele patologice sunt leziuni secundare proeminente, vizibile si palpabile. Se disting doua tipuri:

– cicatricea hipertrofica este bombata deasupra tegumentului, bine delimitata, regulata, de culoarea pielii normale si cu evolutie in general spontan regresiva in 12-18 luni;

– cicatricea cheloidiana are un aspect asemanator, dar cu prelungiri in forma clestilor de rac si mai ales cu o evolutie extensiva pe o perioada de mai multi ani. Ea este mai frecventa pe anumite zone (partea superioara a trunchiului).

2. Atrofia este o alterare care consta intr-o subtiere a pielii prin diminuarea sau disparitia tuturor sau numai a unei parti a componentelor constitutive. Pielea atrofica are o coloratie ceroasa sau alba, este subtire prin ea putandu-se vedea uneori vasele si tendoanele. La palpare se evidentiaza o depresiune corespunzand zonei atrofice.

3. Scleroza este o leziune caracterizata printr-o ingrosare si pierdere a elasticitatii cutanate. Pielea este dura, pierzandu-si supletea si fiind putin mobila pe planurile profunde. Astfel de modificari se intalnesc in sclerodermie sau dermo-hipodermitele sclerodermiforme din insuficienta venoasa a membrelor inferioare.

Plăgi

Plaga este leziunea traumatică caracterizată prin întreruperea continuității tegumentului (soluție de continuitate cutanată). În functie de mecanismul de producere plagile pot fi: plăgi prin taiere, plăgi prin contuzie (lovire), plagi prin înțepare plăgi prin mușcatură, plăgi prin agresiune termică (arsuri, degerături) plăgi prin agresiune chimică (arsuri chimice) plăgi prin electrocutare. Alți factori ce au contribuit la o gamă largă de pansamente sunt diferitele tipuri de plăgi (de exemplu acute, cronice, exudate și răni uscate) precum și faptul că nici un pansament individual nu este potrivit pentru gestionarea tuturor rănilor. În plus, procesul de vindecare al plăgilor are mai multe faze diferite, care nu pot fi vizate de nici un pansament special [19]

Figura15. Tipuri de plăgi: exudate, cronice, uscate [19].

Majoritatea plagilor sunt accidentale. Unele plagi sunt intentionale (consecutiv unor agresiuni sau, mai rar, a unor autoagresiuni); tot plagi intentionale sunt si plagile chirurgicale. În functie de intervalul de timp scurs de la producerea plagii si momentul examinarii de catre medic plagile se clasifica în plagi recente (pana la 6 ore) si plagi vechi (peste 6 ore). Aceasta clasificare are importanta atunci cand – prin mecanismul de producere – plaga este aseptica la momentul accidentului; plaga poate fi considerata aseptica cca 6 ore de la momentul producerii, dupa care este considerata contaminata. Pentru plagile care afecteaza cavitatile naturale ale corpului (abdomen, torace, cutia craniana) se foloseste o clasificare care are ca si criteriu definitor afectarea seroasei endocavitare (peritoneul, pleura, pericardul, dura mater). Astfel plagile în care seroasa este deschisa se numesc plagi penetrante, iar plagile în care seroasa nu este afectata se numesc plagi nepenetrante. Evident plagile penetrante au o gravitate mai mare, întrucat pot fi însotite de lezarea unor viscere intracavitare[2].

Examenul obiectiv al pacientului evidentiaza semne generale si semne locale: semnele generale: agitatia, anxietatea, paloarea, tahicardia, hipotensiunea, febra Agitatia si anxietatea sunt manifestari comportamentale aparute în contextul starii psihice particulare postraumatice. Paloarea traduce – atunci cand apare – anemia secundara consecutiva unei hemoragii importante[2].

Vindecarea plăgii

Vindecarea unei plagi se face prin cicatrizare . Cicatrizatrea este procesul biologic prin care între marginile plagii se formeaza o “plomba” de tesut conjunctiv care uneste (solidarizeaza) marginile plagii. Imediat dupa agresiune (producerea plagii) se produce o hemoragie din vasele dermice lezate, care face ca elementele figurate sanguine sa se acumuleze În plaga si ulterior sa fie înglobate în coagulul format în cursul hemostazei, eliberând amine vasoactive. Vasoaminele determina o vasodilatatie locala temporara, care permite trecerea polimorfonuclearelor neutrofile (PMN), plachetelor sanguine si proteinelor plasmatice sa infiltreze plaga. Factorii biochimici eliberati de aceste celule opresc vasodilatatia si determina o faza de vasoconstrictie. Agregarea plachetara initiaza coagularea care (alaturi de vasoconstrictie) duce la oprirea hemoragiei si la depozitarea de fibrina între marginile plagii. Din trombocitele lizate se elibereaza câteva substante chemotactice (cum sunt factorul de crestere plachetar – platelet-derived growth factor (PDGF) – si factorul á de crestere –transformare – transforming growth factor á (TGF- á )) care atrag celulele polimorfonucleare la nivelul plagii si initiaza inflamatia. Dupa cca 48 de ore macrofagele înclocuiesc PMN ca principale celule inflamatorii. Cele 2 tipuri de celule inflamatorii (PMN si macrofagele) produc debridarea plagii (eliminarea detritusurilor celulare si tisulare), elibereaza factori de crestere si initiaza reorganizarea matricii extracelulare. Faza urmatoare (proliferativa) începe la cca 72 de ore de la agresiune[2].

Factorii chemotactici eliberati de celulele inflamatorii determina popularea plagii cu fibroblasti care încep sinteza de colagen. Fibrele de colagen umplu spatiul plagii si solidarizeaza marginile acesteia. Treptat sinteza de colagen scade, dar reorganizarea (rearanjarea fibrelor de colagen pe directia liniilor de forta care actioneaza asupra regiunii anatomice lezate) continua saptamÉni sau chiar luni dupa vindecarea aparenta[2].

Figura16. Proces de vindecare a plăgii[2]

Procesul descris mai sus este sistematizat în trei faze :

faza inflamatorie si hemostatica

inflamatia imediata(2-5 zile)

hemostaza (vasoconstrictia, agregarea plachetara, coagularea)

inflamatia tardiva (fagocitoza, debridarea)[20].

faza proliferativa (2 zile – 3 saptamâni)

granularea (fibroblastii umplu defectul cu fibre de colagen; se formeaza noi vase sanguine). Prin granulare se formeaza un tesut rosu, ferm, care nu sângereaza la desprinderea pansamentului. Granularea patologica (care se produce în conditii de hipoxie, ischemie, diabet) duce la formarea unui tesut de granulatie (denumit tesut de granulatie aton) care este albicios sau închis la uloare, moale, edematos, friabil si usor hemoragic; acest tesut împiedica epitelizarea si plaga nu are tendinta spre vindecare[20].

contractia (prin reorganizarea fibrelor de colagen marginile plagii se apropie una de alta, reducând marimea defectului)

epitelizarea: celulele epiteliale prolifereaza acoperind defectul cu un strat epitelial; epitelizarea se face dinspre marginile plagii (în plagile profunde) si din profunzime în plagile superficiale (în care exista resure epiteliale la nivelul fundului plagii)

faza de remodelare (restructurare functionala) (3 saptamâni – 2 ani)

producerea de colagen scade, dar noile fibre formate sunt mai groase

fibrele de colagen se orienteaza pe directia liniilor de forta

cu toate acestea tesutul cicatriceal este întotdeauna mai putin rezistent decât tesutul “original” care a fost lezat. În plus interpozitia acestui tesut conjunctiv cicatriceal între capetele sectionate ale unui nerv sau tendon compromite functionarea acestuia (motiv pentru care se încearca dirijarea procesului de cicatrizare prin sutura tendinoasa sau nervoasa)[20].

Vindecarea primara (per primam sau per primam intentionem): caracterizeaza plagile superficiale si plagile suturate. Vindecarea se face fara complicatii, iar cicatricea este subtire, supla, rezistenta si estetica[20].

Figura17. Plagă suturată- vindecare primară[20]

Vindecarea secundara (per secundam sau per secundam intentionem) este tipul de vindecare al plagilor supurate sau cu devitalizari tisulare importante (la care sutura chirurgicala nu se poate face). La acestea fazele de debridare, granulare si contractie a plagii sunt prelungite, iar cicatricea rezultata este inestetica si groasa, dar cu rezistenta slabă[20].

Figura18. Plagă nesuturată- vindecare secundară[20]

Vindecarea terțiară (per tertio intentionem) este vindecarea care survine la plagile infectate, la care (prin tratament local antiseptic si tratament general) se obtine aseptizarea si se practica (intr-un al doilea timp terapeutic) sutura plagii.

Figura19. Etape vindecare terțiară[20]

Tratamentul local al plagii cuprinde toaleta plagii, hemostaza, debridarea, sutura, drenajul si pansamentul. Pentru a se putea face aceste masuri terapeutice este necesara adesea anestezia locala[20].

Prin toaleta plagii se întelege ansamblul de masuri care vizeaza aseptizarea plagii. Se face cu solutii antiseptice uzuale. Pentru aseptizarea tegumentului din jurul plagii se folosesc alcoolul, tinctura de iod sau betadina. Pentru toaleta plagii propriu-zise se folosesc apa oxigenata, betadina, solutia de cloramina, rivanol, acid boric; de asemenea se pot folosi antiseptice sub forma solida (pulbere) precum acidul boric sau iodoformul[20].

Hemostaza cuprinde ansamblul de masuri care vizeaza oprirea hemoragiei. Cele mai importante metode de hemostaza folosite în cursul tratamentului plagilor sunt ligatura vasculara, compresiunea mecanica si electrocoagularea[20].

Debridarea plagii consta în excizia tesuturilor devitalizate; aceasta trebuie facuta “cu economie”, fara a se extirpa tesuturile vitale. Managementul mediului plãgii se bazeazã pe conceptul de pregãtire a patului prin debridare, menținerea echilibrului bacterian, îndepãrtarea exudatului în exces și îngrijirea țesutului local[20].

Sutura se practica pentru a grabi vindecarea plagii (vindecare primara). Manevra este indicata însa numai în cazul plagilor necontaminate sau cu contaminare redusa. Sutura plagilor contaminate ar crea conditii de dezvoltare a bacteriilor si ar conduce la aparitia unui abces; acesta ar determina dehiscenta plagii sau desfacerea terapeutica a suturii pentru evacuarea puroiului[20].

Drenajul consta în plasarea unui tub, a unei lame de cauciuc sau a unei mese sub sutura pentru a permite evacuarea lichidelor. Este indicat în cazul plagilor cu contaminare redusa la care s-a facut totusi sutura sau când persista riscul unei hemoragii sau limforagii dupa efectuarea suturii. Volumul si aspectul drenajului constituie ulterior un indicator important al evolutiei plagii[20].

Aceste manevre terapeutice necesita deseori efectuarea anesteziei locale. De obicei se foloseste anestezia prin infiltratie (infiltrarea cu un anestezic local – lidocaina, bupivacaina etc. – a buzelor plagii), dar se poate folosi si anestezia tronculara (de exemplu anestezia prin infiltrarea nervilor colaterali ai unui deget). Anestezia locala se face dupa aseptizarea tegumentului din jurul plagii[20].

Pansamentul constă în izolarea plagii cu materiale sterile (de obicei fașa de tifon) pentru a reduce contaminarea exogena cu germeni microbieni.

Colagenul

Colagenul este principala proteină structurală din cele mai multe țesuturi conjunctive moi, laxe, semirigide și rigide (piele, oase, tendon, membrane bazale etc.), care asigură în principal integritate structurală țesuturilor [21].

Colagenul este prezent în toate animalele pluricelulare și reprezintă cea mai abundentă proteină din vertebrate. Are localizare extracelulară și este organizat în fibre cu mare rezistență la întindere. Este component al țesuturilor conjunctive fiind prezent în oase, dinți, cartilaje, tendoane, ligamente, tegument și vase de sânge. În cantitate mică, se găsește practic în orice țesut.

Polimer natural, colagenul este constituit din 20 de aminoacizi, aranjați în secvențe caracteristice, ce formează o structură conformațională foarte complexă, organizată pe patru nivele, numite structuri primară, secundară, terțiară și cuaternară [22].

Figura20. Colagen[22]

Colagenul tip I, pe lângă rolul de componentă principală a țesutului cicatriceal, are rol cheie în: controlul răspunsului inflamator la injuriu și reparare, influențând mitogeneza celulară, diferențierea și migrarea; sinteza proteinelor în matricea extracelulară; sinteza și eliberarea citochinelor și factorilor de creștere; interacțiunea dintre enzimele care remodelează MEC, inclusiv metaloproteinaza matriceală [23].

Proprietăți colagen

Folosit ca material biomedical, colagenul îndeplinește criterii esențiale ca:

Rată controlată de degradare

Rezistență mecanică corespunzătoare

Biocompatibilitate excelentă, din punct de vedere imunologic,

Nu este respins de organism

Datorită efectului său rapid de vindecare a rănilor, acesta este folosit in chirurgia de reconstrucție, făcandu-se astfel uz de abilitatea sa de regenerare.

Induce proliferarea celulelor sănătoase din jurul rănii, determinănd astfel regenerarea țesutului afectat. Colagenul este utilizat pe scară largă în chirurgia estetică, în tratarea rănilor  provocate de arsuri, în reconstrucția oaselor, în domeniul ortopedic și stomatologic[24].

Datorită biocompatibilității și biodegradabilității excelente, structurii bine definite, caracteristicilor biologice și modului în care interacționează cu organismul, colagenul reprezintă unul dintre cele mai utilizate biomateriale.

Extras sub formă de soluție apoasă sau gel, colagenul fibrilar tip I poate fi modelat în diferite forme: dispozitive medicale, implanturi artificiale, suporturi pentru cedarea medicamentelor și schele (scaffold) pentru regenerare tisulară, cu rol important în prezent în medicină [24]. .

Colagenul, având stuctură proteică, este biodegradabil. În țesuturi este degradat prin procese catabolice ce includ degradarea cu colagenaze specifice și fagocitoza. Colagenazele au capacitatea unică de a rupe lanțurile α într-un singur loc. Clivând numai lanturile principale, biodegradarea cu colagenaze permite evaluarea gradului de reticulare. Cantitatea de tripsină măsoară extinderea denaturării. Fibrilele sunt degradate de la exterior, iar moleculele din interior devin accesibile proteazelor progresiv [24].

Biodegradarea colagenului in vivo este un proces complex, cu particularități dependente de tipul de colagen. Cea in vitro este stimulată de incubarea cu colagenază bacteriană, catepsină, pepsină ori tripsină, teste ce permit compararea materialelor similare, dar corelarea cu degradarea in vivo este dificilă [25].

Aplicatii biomedicale ale colagenului

Biomaterialele pe bază de colagen se utilizează ca: dispozitive medicale, schelete pentru regenerare tisulară, implanturi artificiale, suporturi pentru eliberarea medicamentelor, factorilor de creștere și celulelor, precum și în terapia genetică, însă colagenul este și principiu activ – hemostatic și pansament în vindecarea rănilor. Fiind proteină, este substrat și pentru bacterii, deci trebuie asociat cu antibiotice și/sau antiseptice [26].

Obtinerea colagenului de tip 1 folosit pentru obtinerea de hidrogeluri

In cadrul Sanimed International Impex s-a optimizat protocolul de obtinere a colagenului necesar pentru obtinerea de hidrogeluri multifunctionale colagenul s-a obtinut prin prelucrarea de tendoane de vacă sau de cal, de origine controlată sanitar-veterinar. Înaintea curățării tendoanelor, acestea s-au spalat cu soluție de acid acetic proaspăt preparată, de 10 ori. Cu ajutorul bisturiului de unică folosință, s-au îndepărtat cheagurile de sânge, pielea cu păr, oasele, mușchii și urmele de grăsime, lăsându-se tendoanele curate. Acestea s-au spalat cu apă distilată (4 – 5 volume de apă, raportate la materia primă) de două ori pe mesele de lucru din inox cu scurgere[27].

Tendoanele curate au fost transferate în recipienți de inox apoi în tocătorul industrial cu sită Sirman. Loturile curățate s-au introdus în baza de date privind trasabilitatea extinsă a produsului. Tendoanele au fost mărunțite cu ajutorul unei mașini electrice de tocat carne, prevăzută cu o sită având diametrul ochiurilor de 3-5 mm, apoi cântărite (doze a câte 540 g fiecare)[27].

Extractia colagenului s-a realizat într-un malaxor industrial din oțel inoxidabil (agitator din inox cu două cuve interschimbabile de 50 L Conti), care asigură o viteză de rotație de min 40 rotații/minut. Peste cantitatea cântărită de țesuturi mărunțite s-au adaugat 20 de litri de soluție de pepsină în acid acetic 0,5 M, raportul între pepsină și substanța uscată a țesutului luat în lucru fiind de 1:9. Soluția s-a agitat intermitent timp de 48 ore, la temperatura de 20 – 25 C. pH-ul mediului de extracție este 2,5-3,5, valoare la care pepsina are activitate enzimatică optimă[27].

Indepărtarea țesutului nedigerat s-a realizat prin centrifugare (4 C, 9000 rpm, timp de 15 min). Indepărtarea acidului acetic din compoziția soluției de colagen s-a facut prin dializa/diafiltrarea acestuia față de apa distilată.Operația s-a realizat pe doua cai:

a) Prin dializă, cu ajutorul sacilor din membrana colagenică, proces în care apa distilată din bazinul de dializă se schimbă zilnic până ce valoarea pH-ului gelului de colagen ajunge la o valoare cuprinsă între 5 și 6.

b) Prin diafiltrare pe filtre ceramice de 20 nm, proces în care înlăturarea acidului acetic se face alimentând circuitul de filtrare al instalației cu apă purificată (pH 6,5 – 7,0), în contracurent față de circuitul gelului de colagen. Gelul de colagen neutralizat a fost repartizat în tăvițe din inox pe loturi și pe categorii de sursă de gel în vederea liofilizării. Prima fază a procesului de liofilizare – congelarea, se efectuează lent, pentru a forma cristale mari de gheață, sau rapid pentru a forma cristale mici. Intrucât în timpul criolizei are loc creșterea volumui specific al apei, fenomen ce poate conduce la modificări ale structurii colagenului nativ, se procedează la o congelare rapidă la temperatura de – 40 C, timp de 4 ore[27].

A doua fază a liofilizării – uscarea sub vid inalt, determină trecerea apei din f de vid ce intră în componența liofilizatorului și timp de 20 de ore s-a trecut aparatul pe uscare sub vid. Uscarea finală s-a facut treptat, timp de 10 ore, la temperatura de + 32 C iar liofilizarea s-a realizat cu liofilizatorul Zirbus.

Produsul liofilizat a fost ulterior supus controlului microbiologic. S-au prelevat sub hota cu flux laminar, cu pipeta se sticlă sterilă (de unică folosință), 2 ml de gel de colagen neutralizat care s-au însămânțat soluția d pe mediu Plate count agar care ulterior a fost incubat 24 de ore la 37 C[27].

După 24 de ore s-au numărat coloniile și s-a calculat numărul UFC (unități formatoare de colonii) raportat la unitatea de masă/ volum. Gelul de colagen obtinut a fost de asemenea caracterizat din punct de vedere al continutului de azot. Continutul de azot din gelul de colagen trebuie sa se incadreze in parametri urmatori: azot total (raportat la substanța uscată) trebuie sa fie minim 12% iar substanța proteică (raportat la substanța uscată) min. 68%[27].

Azotul din probă a fost transformat în sulfat de amoniu prin dezagregarea cu acid sulfuric concentrat în prezența unui catalizator (metoda Kjeldahl-descrisa mai jos): Se cântăresc cca. 6 g din proba de analizat, prelevată din flaconul steril cu gel de colagen neutralizat și se introduc în balonul Kjeldahl. Se adaugă 2 pastile catalizator, o pastilă antispumant și 20 ml acid sulfuric conc. Balonul Kjeldahl se poziționează în lăcașul sistemului de mineralizare și se supune operației de digestie rapidă. După răcire, balonul cu probă se plasează în sistemul automat de distilare rapidă prin antrenare cu vapori Vapodest unde are loc eliberarea amoniacului rezultat în prima etapă. Acesta este captat de soluția de acid boric, care astfel se colorează în verde. Amoniacul colectat în soluția de acid boric se titrează automat cu acid sulfuric 0,1N[27].

Procentul de azot total si substanta proteica se calculeaza cu ajutorul formulelor de mai jos: Azot total % = 0,0014 x Vx100/G În care: 0,0014 = cantitatea de de azot corespunzatoare la 1ml soluție de acid sulfuric 0,1N; V = volumul de acid sulfuric 0,1N folosit la titrare, ml; G = cantitatea de proba luata in lucru, g. Substanța proteică % = azot total % x 6,25 Colagenul obtinut s-a caracterizat si din punct de vedere al continutului de substanța grasă (care, raportat la substanța uscată trebuie sa fie de max 3%). Proba supusă analizei (6–7 g gel de colagen prelevat steril din masa de gel de colagen neutralizat) cântărită cu precizie de 0,0001 g, s-a introdus în cartușul din dotarea analizorului de grăsimi GERHARDT serie 8445140025/ 8500140028, cartuș care a fost in prealabil cântărit)[27].

După introducerea cartușului în paharul de extracție (adus la greutate constantă, la 105 C, cu 3-4 granule din cuarț), se adaugă 60 ml solvent și se amplasează în locașul echipamentului. Se derulează programul de extracție prestabilit. Paharul de extracție cu substanțele grase se usucă în etuvă la 100 – 110 0C până la greutate constantă. Procentul de substanta grasa s-a calcualt astfel: Substanța grasă % = G1/G2 x100 În care: G1= cantitatea de substanță grasă extrasă, g; G2= cantitatea de probă luată în lucru.

Totodata, s-a realizat determinarea conținutului de substanță uscată din gelul de colagen neutralizat (care trebuie sa se incadreze in limita de 0,4 – 0,6%) conform protocolului descris mai jos: Într-o fiolă de cântărire adusă la greutate constantă s-a cântărit cca. 1 g produs cu balanța tehnică și s-a menținut la 100-105°C în etuva timp de 3 ore, după care s-a răcit în exicator și s-a cântărit. S-a continuat uscarea câte 60 minute, răcirea în exicator și cântărirea până la greutate constantă. Diferența dintre cântărirea înainte și după uscare, raportată la 100 g produs, va da conținutul procentual în substanța uscată al probei de analizat: Substanța uscată % (% S.U.) = [(m2 – m0 / m1 – m0)]*100 m0= masa fiolei goală (g) m1= masa fiolei cu produs înainte de uscare (g) m2= masa fiolei și a reziduului după uscare (g)[27].

Formulări de colagen pentru vindecarea rănii

Vindecarea rănilor reprezinta o serie de procese complexe, dar bine coordonate, care implică interacțiuni coordonate între diferite sisteme biologice și componente celulare,cum ar fi citokinele și factorii de creștere și constă în inflamație, proliferarea celulelor, matricea și fazele de remodelare a țesutului. Dacă oricare dintre faze nu este suficient de finalizată, vindecarea rănilor poate să fie afectată, ducând la o rană cronică.

Vindecarea implică curățarea, debridarea și asigurarea unui mediu umed pentru a promova procesul imunologic de vindecare naturală, realizarea fiziologică de închidere într-un timp scurt. Prin urmare, un film ideal sau material de acoperire ar trebui să mențină o proprietate umedă, servind ca un mediu umed pentru trecerea gazelor, în timp ce acționează ca o barieră împotriva factorilor toxici, inclusiv a bacteriilor.

Plăcile sau pansamentele de colagen aplicate în chirurgia cutanată sunt eficiente pentru inițierea tratamentului, acoperirea temporară, prevenirea edemelor și a pierderii de umiditate de la locul rănii și oferirea unei reconstrucții definitive a plagii. Dimensiunea porilor și suprafața bazată pe colagen sunt factori integrați pentru atragerea celulelor, cum ar fi fibroblastele și keratinocitele, la rană, care declanșează debridement, angiogeneză și reepitelizarea. Acest proces îmbunătățește ulterior activitatea metabolică a țesutului de granulare și a mecanismelor de reparare a corpului.

Formulările de colagen pentru vindecarea rănilor au avantaje generale față de pansamentele convenționale în ceea ce privește ușurința aplicării și fiind naturale, neimunogene, non-pirogenice, hipoalergenice și fără durere. Colagenul facilitează vindecarea rănilor prin organizarea și acumularea fibrelor proaspăt formate și a țesutului de granulare în patul plăgii, creând astfel interfața fiziologică optimă între suprafața plăgii și mediul înconjurător Ele sunt impermeabile la viruși și bacterii.Cele mai frecvente bacterii implicate în procesele de răni sunt Pseudomonas aeruginosa (Gram negativ) și Staphylococcus aureus (Gram pozitiv). Bacteriile sunt, de asemenea, cunoscute pentru a forma biofilme. O eliberare incompletă a bacteriilor din site-urile rănii poate deteriora faza inflamatorie, ducand la rani cronice. Mai mult, formulările de colagen au avantajul suplimentar de a opri sângerarea.

Filmele de colagen sau pansamentele destinate vindecării rănilor au fost explorate pentru a se realiza eliberarea susținută și controlată a diferitelor produse farmaceutice, inclusiv a compușilor endogeni, cum ar fi oxidul nitric, hormonul de creștere uman, hormonul de creștere recombinant, factorul de creștere derivat din plachete și factorul de creștere a nervului exogen.

Nanoparticule de Ag (AgNPs)

Nanoparticulele au multiple aplicații în domeniul biomedicinei, cum ar fi administrarea controlată de medicamente și alți agenți cu rol terapeutic, aplicații privitoare la diagnosticare, precum și aplicații în scop pur terapeutic, aceasta deoarece, având dimensiuni foarte mici, nanoparticulele pot fi utilizate pentru administrarea țintită precis a medicamentelor și, dat fiind faptul că nanoparticulele răspund prin rezonanță la câmpul magnetic variabil, în calitate de agenți hipertermici ele pot transfera suficientă energie termică cu caracter distructiv pentru celulele canceroase[28].

Figura21. Nanoparticule de argint[28]

Proprietățile specifice ale nanoparticulelor de argint sunt dictate de raportul specific suprafață/volum și presupun manifestarea unor comportamente inedite, dependente de dimensionalitatea acestor structuri. Proprietățile optice, conductivitatea electrică, stabilitatea chimică și activitatea catalitică, activitățile anti-microbiene și anti-inflamatorii specifice AgNPs sunt aspecte care indică aplicabilitatea versatilă a acestora. În domeniul biomedical, utilizarea particulelor nanodimensionate de argint s-a bucurat de rezultate promițătoare într-o serie vastă de potențiale aplicații: sisteme pentru eliberare țintită și controlată a substanțelor active [28], terapie anti-tumorală inginerie tisulară și tratamentul plăgilor tegumentare.

Tabel1. Proprietățile AgNPs[28]

Metode de sinteză ale nanoparticulelor de argint

Datorită versatilității caracteristice, abordările tehnologice de producere a nanoparticulelor de argint vizează atât strategii de tip top-down (sinteză pornind de la metalul masiv), cât și strategii de tip bottom-up (sinteză pornind de la structuri atomice și moleculare). Diversitatea metodelor de sinteză aplicată argintului permite producerea de nanostructuri caracterizate de valori ridicate ale raportului specific suprafață/volum, aspect ce influențează drastic caracteristicile structurale, morfologice și funcționale [29, 30].

Metodele avansate de sinteză a AgNPs consideră principii fundamentale fizice și chimice, ce favorizează sinteza de structuri de înaltă puritate, cu dimensiuni nanometrice (sub 100 nm) și morfologii controlabile. Sinteza nanoparticulelor de argint prin metode fizice presupune fenomene simultane de evaporare și condensare a metalului masiv, prin implicarea de diferite surse externe de energie care să favorizeze formarea speciilor metalice în diverse medii gazoase inerte și depunerea ulterioară pe substratul de interes.

Numeroase strategii fizice au fost implicate în producerea de AgNPs de înaltă puritate, caracterizate de distribuție dimensională uniformă și morfologie preferențial sferică, precum descărcare în arc electric, implantare ionică, ablație laser, piroliză, pulverizare în radiofrecvență și pulverizare termică [31-33].

Strategiile chimice de sinteză a nanoparticulelor de argint implică procese electrochimice controlate de degradare a sărurilor metalice în prezența agenților reducători de origine anorganică sau organică și a stabilizatorilor. Rezultate promițătoare privind obținerea de suspensii stabile de AgNPs au fost raportate utilizând diferiți agenți de stabilizare: aminoacizi și acizi carboxilici, dendrimeri, polimeri și surfactanți[31-33].

De asemenea, combinarea principiilor fizice și chimice de obținere a nanoparticulelor metalice a favorizat utilizarea cu succes a metodelor de sinteză fizico-chimică în producerea AgNPs. În cazul acestor strategii, energia externă utilizată favorizează producerea fenomenelor electrochimice implicate în procesul de sinteză.

Rezultate promițătoare au fost obținute experimental prin utilizarea de ultrasunete, radiație ultraviolet, radiație electromagnetică vizibilă, radiație γ și microunde [34-36]. În scopul diminuării sau eliminării inconvenientelor specifice metodelor de sinteză fizică și chimică (costuri ridicate pentru achiziționarea și întreținerea instalațiilor, risc de contaminare biologică), numeroase studii de specialitate au vizat aplicarea de strategii inspirate din natură pentru obținerea AgNPs. Astfel, au fost raportate rezultate favorabile privind sinteza și funcționalitatea nanoparticulelor de argint prin considrarea proprietăților reducătoare și antioxidante caracteristice substanțelor fitochimice[37, 38] și prin implicarea mecanismelor de bioreducere specifice microorganismelor, majoritar specii bacteriene. Fără doar și poate, studiul asupra proprietăților anti-microbiene ale nanoparticulelor de argint reprezintă direcția cea mai studiată și versatilă, din punct de vedere al aplicațiilor biomedicale.

Mecanismul anti-microbian al acestor structuri asupra organismelor patogene nu a fost încă pe deplin elucidat, însă datele de literatură menționează trei posibile mecanisme: (i) AgNPs interacționează puternic cu structurile bogate în sulf și fosfor ale membranei microbiene (datorită afinității ridicate pentru structuri încărcate electric negativ); (ii) AgNPs cauzează dislocarea ionilor vitali din structura membranei microbiene (datorită mecanismelor concurente caracteristice proteinelor intra-/trans-membranare); (iii) prezența AgNPs favorizează apariția stresului oxidativ, datorită formării speciilor reactive de oxigen [39, 40].

De asemenea, considerând versatilitatea proceselor de sinteză ce pot fi aplicate acestui metal nobil, AgNPs pot fi înglobate sau depuse pe suprafața unei game largi de materiale (anorganice sau organice, unitare sau compozite, hibride) – utilizând în acest sens mecanisme in situ sau ex situ de formare a particulelor metalice – în scopul inducerii de proprietăți anti-microbiene (efect biostatic sau biocid, potențial anti-aderent sau inhibitor al biofilmului microbian)[39, 40].

Sinteza fizica a nanoparticulelor de argint

Sinteza fizică a nanoparticulelor de argint utilizează de obicei energiile fizice (termică, puterea curentului electric alternativ, descărcarea în arc) pentru a produce nanoparticule de argint cu o distribuție îngustă a dimensiunilor. Metoda fizică permite producerea unor cantități mari de nanoperticule de argint într-un singur proces. Aceasta este, de asemenea, metoda cea mai folosită pentru a produce pulbere de nanoparticule de argint. Totuși, trebuie luate în considerare costurile pentru investiția în echipament[41].

Sinteza fotochimica a nanoparticulelor de argint

Metodele de sinteză foto pot fi împărțite în două abordări distincte: fotofizică și fotochimică. Prin metoda fotofizică se pot prepara nanoparticule prin subdiviziunea metalului grosier, în vreme ce prin metoda fotochimică se prepară nanoparticule din precursori ionici. Nanoparticulele sunt formate prin fotoreducerea directă a unei surse de metal sau prin reducerea ionilor metalici utilizând intermediari generați fotochimic, cum ar fi molecule excitate și radicali, aspect care este adesea numit fotosensibilizare în sinteza nanoparticulelor[41].

Procesul de fotoreducere corectă a AgNO3 în prezența citratului de esodiu a fost realizată cu diferite surse de lumină (UV, albă, albastră, cian, verde și portocalie) la temperatura camerei. S-a arătat că variația sursei de lumină conduce la obținerea unui coloid cu proprietăți optice distincte care pot fi corelate cu dimensiunea și forma particulelor. Principalele avantaje ale sintezei fotochimice sunt: (1) oferă avantajele procesării prin foto-inducție, adică un proces curat, rezoluție spațială ridicată și comoditatea utilizării, (2) generarea controlabilă in situ a agenților reducători; formarea nanoparticulelor poate fi inițiată  prin foto-iradiere și (3) are o mare versatilitate; sinteza fotochimică permite fabricarea de nanoparticule în diferite medii, incluzând emulsii, micelii sufactante, filme polimer, sticlă, celule etc[41].

Sinteza biologica a Nanoparticulelor de argint

După cum s-a menționat mai sus, atunci când nanoparticulele de argint sunt produse prin sinteză chimică, sunt necesare trei componente principale: o sare de argint (de obicei AgNO3), un agent reducător (de ex. etilenglicol) și un stabilizator sau agent de acoperire (de ex. PVP) pentru a controla creșterea nanoparticulelor și pentru a preveni agregarea lor prin coliziune. În cazul sintezei biologice a nanoparticulelor de argint, agentul reducător și stabilizator sunt înlocuiți cu molecule produse de organismele vii. Acești compuși reducători și/sau stabilizatori pot fi procurați din bacterii, fungi, drojdii, alge sau plante[41].

Metoda biologică oferă multe resurse pentru sinteza nanoparticulelor de argint și această metodă poate fi considerată drept o abordare prietenoasă în ceea ce privește mediul și, de asemenea, o metodă cu costuri scăzute. Rata reducerii ionilor metalici prin folosirea agenților biologici este mai mare și, de asemenea, are loc la temperatura și presiunea mediului ambiant. În sinteza biologică, pereții celulari ai microorganismelor joacă un rol major în sinteza intracelulară de nanoparticule. Peretele celular încărcat cu sarcină negativă interacționează electrostatic cu ionii metalici încărcați pozitiv și reduce ionii metalici pe cale biologică la nanoparticule. Atunci când microorganismele sunt incubate cu ioni de argint, pot fi generate nanoparticule de argint extracelular, ca un mecanism de apărare intrinsec împotriva toxicității metalului. De asemenea, s-au realizat sinteze ecologice de nanoparticule de argint utilizând extracte din plante, ca agenți reducători[41].

Sinteza bacteriană a nanoparticulelor de argint

S-a demonstrat că nanoparticulele de argint sunt un biocid eficient împotriva unui spectru larg de bacterii, incluzând atât bacterii gram-negative, cât și bacterii gram-pozitive, printre care sunt multe tulpini cu un grad de virulență foarte ridicat. Morones și echipa au utilizat diferite tipuri de bacterii gram-negative pentru a testa activitățile antibacteriene a nanoparticulelor de argint în domeniul 1-100nm. S-a raportat că activitatea antibacteriană a nanoparticulelor de argint împotriva bacteriilor gram-negative s-a împărțit în trei pași: (1) nanoparticulele cu dimensiuni de 1-10nm se atașează de suprafața membranei celulare și perturbă drastic funcțiile normale ale acesteia, cum ar fi permeabilitatea și respirația; (2) aceste nanoparticule sunt capabile să penetreze în interiorul bacteriei și să provoace deteriorări ulterioare prin posibila interacțiune cu compușii conținând sulf și fosfor, cum ar fi AND-ul; (3) nanoparticulele eliberează ioni de argint, care vor contribui în plus la efectul bactericid al nanoparticulelor de argint[41, 42].

Într-un alt studiu, Shrivastava și echipa au descris eficiența antibacteriană a nanoparticulelor de argint cu dimensiuni de 10-15nm, având o stabilitate crescută, împotriva unor tulpini bacteriene non-rezistente și rezistente la medicamente. S-a concluzionat că efectul antibacterian este dependent de doză și este mai pronunțat împotriva bacteriilor gram-negative, decât în cazul bacteriilor gram-pozitive; de asemenea, acest efect antibacterian este independent de dobândirea rezistenței la antibiotice. S-a sugerat, de asemenea, că mecanismul principal prin care nanoparticulele de argint și-au manifestat proprietățile antibacteriene a fost prin ancorarea de și penetrarea peretelui celular al bacteriei și prin modularea semnalizării celulare[41, 42].

Într-un studiu comparativ asupra efectului nanoparticulelor de argint de diferite forme, Pal și echipa au demonstrat că nanoparticulele de argint interacționează diferit, în funcție de formă, cu E. coli. Astfel, nanoparticulele de argint triunghiulare trunchiate au prezentat activitatea biocidă cea mi ridicată, comparativ cu nanoparticulele de formă sferică și bastonaș și cu argintul ionic[41, 42].

Într-un studiu recent, Jones și Hoek au rezumat cele mai cunoscute trei mecanisme antibacteriene: (1) preluarea de ioni de argint, urmată de perturbarea producției de ATP și a replicării AND-ului, (2) generarea de către nanoparticulele și ionii de argint a speciilor reactive de oxigen (ROS) și (3) deteriorarea directă a membranelor celulare de către nanoparticulele de argint. Totuși, sunt necesare investigații ulterioare, pentru a desluși mai clar acest mecanism, în special problema afinității nanoparticulelor de argint pentru proteinele bacteriene conținând sulf și fosfor și efectele acestei afinități asupra funcțiilor proteinelor bacteriene[41, 42].

În ceea ce privește tulpinile bacteriene utilizate cu succes în biosinteza nanoparticulelor de argint, acestea sunt: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia[43, 44].

Escherichia coli Klebsiella pneumonia Staphylococcus aureus

Figura22. Tulpini bacteriene [43, 44].

Sinteza fungică a nanoparticulelor de argint

Fungii sunt din ce în ce mai recunoscuți ca fiind agenții patogeni majoritari în cazul pacienților aflați în stare critică, în special în cazul infecțiilor fungice nosocomiale. Deși activitatea antibacteriană a nanoparticulelor de argint este bine cunoscută, activitatea antifungică nu a fost încă studiată în mod adecvat. Totuși, nanoparticulele de argint s-au dovedit a fi un potențial biocid și față de tulpinile de fungi și astfel ar putea fi de ajutor pentru a preveni infecțiile fungice.

Aceasta metodă de sinteză a nanoparticulelor de argint face posibilă interacțiunea culturilor fungice cu o cantitate mai mare de precursor metalic (AgNO3), comparativ cu culturile bacteriene, datorită morfologiei specifice, ceea ce asigură producerea mai numeroasă a nanoparticulelor de argint prin metodele de sinteză ce implică mecanisme fungale [45].

Procesul presupune imobilizarea la suprafața celulelor fungice a ionilor de Ag+ din soluția precursoare, apoi bioreducerea acestora de către substanțe active specifice culturilor fungale (mult mai numeroase, comparativ cu enzimele identificate în culturile bacteriene). Nitrat-reductaza și chinonele sunt responsabile pentru biosinteza nanoparticulelor de argint, această sinteză fungică înregistrând rezultate promițătoare, din punct de vedere dimensional și al morfologiei prin antrenarea mecanismului de bioreducere al fungilor. Sunt utilizate numeroase tulpini fungice, dintre care: Aspergillus spp., Candida spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Cladosporium spp., Fusarium spp. [46, 47].

Fusarium spp Cladosporium spp. Aspergillus spp.

Figura23. Tulpini fungice [43, 44].

Core Shell SiO2-Ag II

În ultimele decenii, proiectarea și pregătirea controlată a compozitelor core-shell a atras atenție considerabilă și a devenit un domeniu de cercetare important în știința materialelor, chimie, medicină și inginerie. Printre numeroasele tipuri de materiale structurate de tip core-shell, structurile silice-argint formate din miezuri de siliciu și cochilii de argint au avut un interes semnificativ din cauza proprietăților lor unice și a aplicațiilor potențiale, variind de la dispozitive optice la cataliză și medicamente. Nanoparticule core shell au devenit o zona de interes, inclusiv în activitatea de cercetare, pentru tratamentul cancerului, boala neurodegenerativă, precum și pentru aplicațiile biomedicale[48].

Figura24. Nanoparticule Core-shell[48]

Nanoparticulele de coajă nucleară pot fi de diferite clase, pe baza tipului de bază și materialul de coajă, care poate fi organic sau anorganic. În funcție de material proprietățile miezului și a cochiliei, nanoparticulele de coajă de bază pot fi împărțite pe larg în patru clase: (1) coajă organică / coajă organică; (2) coajă organică / anorganică;

(3) coajă anorganică / coajă organică; (4) coajă anorganică / anorganică[48].

Metode de sinteza a Core-Shell

Sinteza particulelor la scala nanometrica se poate face folosind două metode. Metoda Bottomup: în această metodă moleculele sunt auto-asamblate, din cauza proprietăților lor chimice, într-o formă definită și conformație semnificativă. Cele mai comune metode includ sinteza chimică, nanoprecipitarea, depunerea chimică a vaporilor, autoasamblare, depunerea filmului și agregarea coloidală[48].

Metoda Top- down constituie a doua metodă pentru sinteza nanoparticulelor .

Metodele cele mai explorate includ tehnici mecanice (măcinare, omogenizator de înaltă presiune, sonicator de sonde, prelucrare, lustruire), tehnici litografice (sonda de scanare, fascicul ultraviolet, electron sau ion).[48]

Până în prezent s-au făcut eforturi considerabile pentru sinteza compozitelor SiO2 / Ag core-shell, inclusiv metodele de reducere chimică, șablon, metoda microemulsie, strat cu strat (LBL), metoda solgel, depunere termică și așa mai departe . Cu toate acestea, compozitele de SiO2 / Ag cu strat de argint dens, complet, uniform, nanoscalat și puritate ridicată sunt încă dificil de obținut. Mai mult decât atât, procesul de fabricare a sferelor core shell de SiO2 / Ag implică, în general, o procedură complexă, în mai multe etape, consumatoare de timp. De aceea, este foarte important să se dezvolte o procedură simplă și ușor de manevrat pentru fabricarea compozitelor SiO2 / Ag core-shell cu un strat de argint complet, uniform, nanoscalat[49-51].

Metoda sol-gel consta in prepararea unor geluri oxidice prin hidroliza si policondensarea anumitor precursori. Gelul obtinut prezinta proprietati mecanice intermediare intre cele ale fluidelor si solidelor, datorita dezvoltarii unei structuri spatiale organizate intr-o retea rigida, interconectata, cu pori de dimensiuni submicronice si lanturi polimerice ale caror lungime medie este mai marc de l μm. Dupa un proces de densificare a gelului prin uscare in conditii bine stabilite, produsul final mono sau polioxidic se obtine printr-un tratament termic in cadrul caruia se ard substantele organice, au loc descompuneri si formari de noi compusi oxidic[52-55] .

În decursul ultimelor decenii, proiectarea și pregătirea controlată a compozitelor core-shell a atras atenție considerabilă și a devenit un domeniu de cercetare important în știința materialelor, chimie, medicină și inginerie [52-55]. Printre numeroasele tipuri de materiale structurate de tip core-shell, structurile de siliciu-argint formate din miezuri de siliciu și cochilii de argint au avut un interes semnificativ datorită proprietăților lor unice și aplicațiilor potențiale, variind de la dispozitive optice și de la dispersia Raman la cataliză și medicament[56, 57].

Până în prezent s-au făcut eforturi considerabile pentru sinteza compozitelor SiO2 / Ag core-shell, inclusiv metoda de reducere chimică, șablon, metoda microemulsie, strat cu strat (LBL), metoda solgel, depunere termică și așa mai departe . Cu toate acestea, compozitele de SiO2 / Ag cu un strat dens de argint nanoscărat, cu densitate mare și puritate ridicată, sunt încă dificil de obținut[58-60].

Mai mult decât atât, procesul de fabricare a sferelor coreshell de SiO2 / Ag implică, în general, o procedură complexă, în mai multe etape, consumatoare de timp. De aceea, este foarte important să se dezvolte o procedură simplă și ușor de manevrat pentru fabricarea compozitelor SiO2 / Ag core-shell cu un strat de argint complet, uniform[60].

Prepararea compozitului mono-dispersat SiO2 / Ag cu carcase de argint uniforme și complete. Particulele de silice au fost preparate în primul rând prin procesul Stöber [61]. Apoi, amestecul de nuclei Ag stabilizați de polivinilpirolidonă și ionii de surplus [Ag (NH3) 2] + au fost adsorbiți pe suprafața microsferelor de silice. În final, particulele compozite de SiO2 / Ag s-au format printr-un proces simplu de reducere în prezența borohidrură de sodiu (NaBH4). Toate reacțiile au fost efectuate la temperatura ambiantă. Din punct de vedere al aplicațiilor ulterioare, activitatea fotocatalitică a compozitelor SiO2 / Ag a fost evaluată în degradarea portocaliei metil (MO) sub iradiere cu lumină vizibilă[61].

Microsferele de silice s-au preparat prin hidroliză și policondensare a TEOS după metoda Stöber. Într-un experiment tipic, s-a adăugat o soluție de etanol de 50,0 ml conținând 4,5 ml TEOS într-o soluție de etanol de 16 ml conținând 9 ml amoniac și 24 ml H20. Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 3 ore cu o viteză de agitare de 300 rpm.

Microsferele de silice rezultate au fost separate din suspensie centrifugă și apoi spălate cu ultrasunete cu apă și etanol de trei ori separat. În cele din urmă, au fost uscate într-un cuptor la 60 ° C timp de 12 ore [61].

Pe scurt, aproximativ 0,3 ml de soluție apoasă de NaBH4 proaspăt preparată, 0,14 M, a fost adăugată într-o soluție apoasă de 140 ml conținând 0,12 g PVP și [Ag (NH3) 2] + (0,1 M) care a fost produs prin adăugarea de amoniac în soluție AgN03. Într-un pahar separat, 0,025 g de microsfere de silice preparate ca atare s-au dispersat în 10 ml de apă deionizată prin sonicare și s-au adăugat rapid în amestecul anterior preparat cu agitare magnetică viguroasă [61]. Ulterior, 50 ml de soluție NaBH4 0,14 M, ca agent de reducere, a fost picurată la o viteză de 0,5 ml / min în suspensii sub agitare. După aceea, soluția a fost lăsată să reacționeze timp de 24 de ore la temperatura camerei. Soluția treptat sa schimbat la culoare închisă, ceea ce indică formarea nanoparticulelor Ag. În final, compozitele rezultate au fost colectate prin centrifugare, spălate cu etanol și uscate la 60 ° C într-un cuptor cu vid timp de 12 ore [61].

O alta metoda pentru prepararea nanoparticulelor de bază / coajă de SiO2 / Ag :

În primul rând, suprafața particulelor de Si02 a fost modificată prin utilizarea (3-mercaptopropil) trimetoxisilanului. În acest scop, 1,5 g de particule de Si02 s-au dispersat în 30 ml de toluen uscat, apoi s-au adăugat 1,5 ml (3- mercaptopropil) trimetoxisilan a fost adăugat în suspensie și refluxat timp de 24 de ore atmosferă de azot. Structura rezultată a fost separată din toluen prin centrifugare și spălate cu acetonă uscată, alcool etilic și, respectiv, dietileter pentru a îndepărta (3-mercaptopropil) trimetoxisilan nereacționat. Au fost 0,5 g de particule de Si02 modificate dispersate în 30 ml de amestec de etanol și apă (5/1: v / v). S-a adăugat 0,01 g de AgN03 suspensie și s-a agitat timp de 30 de minute. Apoi s-a răcit cu gheață 10 ml de soluție de NaBH4 (0,132 g in 10 ml apă) în suspensie. Amestecul rezultat a fost agitat pentru 16 ore. Particulele rezultate au fost separate prin centrifugare, spălate de mai multe ori cu apă, uscate la 110 ° C și calcinate la 550 ° C [62].

PARTEA a II-a

2.1 Materiale și metode

Obtinerea nanoparticulelor de argint

Pentru obținerea a 500 ml argint coloidal de concentrație 100 ppm ( părți per milion ) s-a utilizat drept precursor o soluție apoasă de AgNO3 (azotat de argint), peste care s-au adăugat 30 ml citrat de sodiu (C6H5O7Na) 0,3 M omogenizând foarte bine soluția. După 12 minute s-au adăugat peste soluție, 30 ml de polivinilpirolidonă (PVP) 0,007 M și 5 ml borohidrură de sodiu (NaBH4) 1 M, în vederea reducerii Ag+ la nanoparticule de AgO. În final s-au adăugat 5 ml de apă oxigenată 30% și a fost menținută agitarea pentru aproximativ 10 minute până când s-a obținut culoarea albastru ușor închis (culoare datorată dimensiunii nanoparticulelor), conform imaginii I.3.1 de mai jos. (Ag NP)

Obtinerea SiO2

Metoda utilizată pentru prepararea nanoparticulelor de silice se bazează pe sinteza Stöber modificată. Într-un singur proces, am adăugat următorii reactivi: 15 ml apă deionizată, 50 ml etanol absolut, 2 ml tetraetilortosilicat (TEOS) și 10 ml soluție de amoniac. Toți reactanții au fost amestecați prin agitare la 300 rpm cu agitator magnetic. (SiO2)

Figura 25. Pulbere de SiO2

Obtinerea SiO2@Ag

Metoda utilizată pentru a prepara nanosferele de coajă de argint-silice se bazează pe aceeași sinteză Stöber modificată cu adăugarea nanoparticulelor de argint coloidal. Într-un singur vas de reacție s-au adăugat următorii reactivi: 15 ml apă deionizată, 50 ml etanol absolut, 2 ml tetraetilortosilicat (TEOS), 10 ml soluție de amoniac și 3 ml suspensie de nanoparticule de argint, toate reactanții au fost amestecați prin agitare la 300 rpm cu agitator magnetic la temperatura camerei (22°C). După 15 minute de pornire a reacției, s-au adăugat 7 ml de nanoparticule de argint și s-au menținut sub agitare peste noapte. (SiO2 @ Ag).

Obtinerea hidrogelurilor composite pe baza de collagen si SiO2/SiO2@Ag

Hidrogelurile composite pe bază de collagen și particule de SiO2/SiO2@Ag au fost obținute printr-o metodă în doi pași, primul pas reprezentând obținerea particulelor(detaliat anterior),iar pasul doi fiind reprezentat de omogenizarea acestora în colagen. Pentru reticularea la rece timp de minim 24 h a colagenului s-a utilizat o soluție diluată de glutaraldehidă (1%). Amestecurile de collagen și particule oxidice au fost supuse omogenizării mecanice viguroase, în vederea obținerii unei distribuții cât mai uniforme a particulelor în masa polimerică, dat fiind faptul ca acestea s-au adăugat în proporție de2.5, respectiv 5% față de masa de colagen uscat din probă. Probele rezultate au fost catalogate Col+SiO2 2.5%, Col+SiO2 5%,Col+SiO2@Ag 2.5%,Col+SiO2@Ag 5%. Pentru evaluarea efectului particulelor asupra materialelor finale, s-a obtinut si o proba etalon, caracterizata de colagen reticulat, fara adaos de particule, denumit in continuare Col.

METODE DE CARACTERIZARE

Conceptul de caracterizare a materialelor se poate referi la acestea atât la nivel atomic, dar și în ceea ce privește proprietățile lor sau chiar distribuțiile de tensiuni sau transferul de căldură. Proprietățile unice și performanțele materialelor nanostructurate sunt determinate de dimensiunile lor, de structura suprafețelor și de interacțiile dintre particule. În cele mai multe cazuri pentru un bun control asupra proprietăților nanomaterialelor trebuie luat în calcul rolul dimensiunii particulei, parametru a cărui importanță poate fi comparabilă cu compoziția chimică.

Difracția de Raze X

Prin difractometria de raze X s-a putut identifica faza componentă și s-a determinat gradul de cristalinitate al pulberii de silice.

Figura 26. Pregatirea probei pentru analiza XDR

Spectrele de difracție a razelor X pot fi utilizate atât în scopul analizei calitative și cantitative, cât și pentru stabilirea parametrilor de rețea caracteristici constituenților materialului studiat. Analizele calitative de faze cu ajutorul spectrelor de difracție presupun calcularea distanțelor dintre planele reticulare (ce îndeplinesc condiția de difracție Bragg 2dsinθ=nλ) pentru toate liniile de difracție apărute în spectrul amestecului policristalin și compararea lor cu valorile d date în literatură pentru faze cunoscute. Analize cantitative de faze se bazează pe relația dintre intensitatea unei anumite linii din spectrul unui amestec de faze și concentrația componentei căreia îi aparține această linie.

Metoda se bazează pe emisia de către un tub catodic a unei radiații X ce este filtrată (pentru obținerea unui fascicul monocromatic), colimată (pentru formarea unui fascicul convergent) și ulterior direcționată către proba analizată ce se găsește fixată pe un suport rotativ, radiația X incidentă fiind proiectată cu ajutorul fantelor pe suprafața probei[63, 64].

Interacția dintre radiația X și probă constă în difuzarea undelor incidente de raze X, sub formă de unde secundare sferice, propagarea radiațiilor difractate fiind influențată de distanța dintre atomii celulei elementare[65]. Efectul de difracție rezultă în urma interferării pozitive a tuturor difracțiilor individuale ale atomilor rețelei cristalografice, fenomen realizat în conformitate cu legea lui Bragg – prin intermediul condiției nλ = 2dsinθ stabilindu-se o relație de proporționalitate între lungimea de undă asociată radiației electromagnetice șidistanța dintre planele reticulare, respectiv valoarea unghiului sub care radiația X interacționează cu planele probei[63].

Radiația difractată este înregistrată de un contor Geiger – Müller care se află pe același ax rotativ cu suportul probei și se rotește cu o viteză unghiulară dublă față de cea a suportului pe care este poziționată proba. Impulsurile contorului Geiger – Müller sunt amplificate și se înregistrează de către un software specializat sub forma difractogramelor, unde maximele ascuțite sunt asociate unghiurilor de difracție ale radiației X[64].

Astfel, spectrele de difracție a razelor X (difractogramele) caracteristice fazei cristaline respective se obțin prin reprezentarea intensității radiației difractate și a unghiului de incidență la care apare efectul de difracție[66].

Investigarea cristalinității a fost realizată prin intermediul tehnicii de difracție a razelor X, utilizând în acest sens un difractometru model Shimadzu XRD 6000. Determinările experimentale au fost făcute la temperatura camerei, pentru valori ale unghiului Bragg de 2θ cuprinse între 100 și 800, utilizând radiația Cu Kαcu λ = 1,056 Å (15 mA și 30 kV).

Microscopia Electronică prin Transmisie

O altă analiză structurală a nanoparticulelor s-a realizat folosind microscopia electronică prin transmisie care a facilitat observarea dimensiunii, distribuției si compoziției fazelor prezente.

Într-un microscop TEM, electronii sunt îndreptați, trecând printr-o serie de lentile electromagnetice, spre o probă subțire (sub 200 nm grosime). Electronii transmiși trec apoi prin lentile adiționale pentru a fi proiectați pe un ecran de vizualizare sau înregistrați cu o camera digitală[63]. Contrastul imaginii este realizat prin capacitatea diferitelor zone ale obiectului (probei) de a dispersa diferențiat electronii. Cu cât grosimea probei este mai mare și cu cât numărul atomic (Z) al elementelor dintr-o zonă este mai mare, cu atât dispersia electronilor este mai mare[67].

TEM poate furniza detalii microstructurale până la nivel atomic și poate fi utilizat pentru examinarea structurilor cristaline si defectelor dintr-o rețea cristalină[63].

Modurile principale de formare a imaginii în cazul TEM-ului sunt: diferența de luminozitate (se bazează pe diferența de număr atomic si densitate între diferintele porțiunii ale probei care va duce la un comportament modelat de legea lui Beer, adică unele porțiuni vor permite o transmisie mai ridicată decât altele și vor aparea mai luminoase), contrast dat de difracție (cristalinitatea probei poate fi investigată prin difracția electronilor pe planele cristaline), pierdere de energie a electronilor care dă o informație referitoare la compoziția chimică deoarece fasciculul transmis trece printr-un spetrometru de energie și astfel se pot observa tranzițiile inter-atomice care apar in urma interactiilor electron-electron și contrast de fază (informația este extrasă din imaginea de interferență a fasciculului produsă de trecerea prin rețeaua cristalină a materialelor analizate și imaginea finală poate fi produsă doar după o prelucrare a datelor obținute- în cazul HRTEM-ului (High Resolution TEM)[68].

În scopul obținerii imaginilor de microscopie electronică prin transmisie, o cantitate redusă de probă pulverulentă a fost dispersată în etanol pur și supusă unui tratatment cu ultrasunete, timp de 15 minute. Ulterior, proba a fost amplasată pe o grilă de cupru acoperită cu carbon și lasată să se usuce, la temperatura camerei. Obținerea imaginilor TEM a fost posibilă prin analizarea probei cu ajutorul unui microscop electronic prin transmisie de înaltă rezoluție de tip TecnaiTM G2 F30 S-TWIN echipat cu SAED, achiziționat de la compania FEI (Oregon, Statele Unite ale Americii).

Spectroscopia de Infraroșu cu Transformata Fourier

Analiza spectroscopică în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) a fost folosită pentru a determina picurile caracteristice colagenului si silicei și interacțiunile ce au loc între compușii existenți în structura acestuia.

Spectrometrele cu transformată Fourier sunt aplicate în multe domenii în care spectroscopia în infraroșu nu poate fi aplicată. Oferă atât informații calitative, metoda fiind utilizată în principal în determinări structurale (multe grupări funcționale dau absorbții IR caracteristice la frecvențe specifice pe intervale înguste, indiferent de relația lor cu restul moleculei) și determinări de identificare a componentelor (identificare a componentelor organice prin găsirea unui spectru de comparație care să se potrivească cu spectrul componentei necunoscute), cât și informații cantitative prin asocierea intensității maximelor spectrale cu cantitatea de compus[63].

În urma interacției radiațiilor infraroșii cu un compus are loc absorbția acestora de către moleculele substanței iradiate și apariția unor vibrații caracteristice grupărilor funcționale din moleculele compusului chimic: de alungire sau de deformare. Vibrațiile de alungire implică o variație a distanței interatomice, iar vibrații de deformare constau într-o modificare în plan sau în afara acestuia a unghiul de valență dintre legăturile covalente ce au un atom comun[68, 69].

Radiația electromagnetică poate fi absorbită de către grupările funcționale ale moleculelor iradiate cu unde infraroșii doar la anumite valori ale lungimii de undă, astfel permițând înregistrarea de către interferometru a unor maxime de absorbție în infraroșu caracteristice. Maximele de absorbție rezultate sunt ulterior analizate la nivelul interferometrului care, prin aplicarea transformatei Fourier semnalului primit, permite prezentarea și înregistrarea informației sub forma spectrală cunoscută, obținându-se astfel o amprentă moleculară unică pentru fiecare compus chimic analizat[70].

Microscopia Electronică de Baleiaj

Morfologia suprafețelor pe bază de silice a fost analizată prin microscopie electronică de baleaj.

Metoda implică emiterea unor electronii secundari dintr-o probă de analizat la bombardarea în vid a acesteia cu un fascicul primar de electroni. Aceștia sunt caracterizați de o energie joasă ( în general mai mică de 50 eV), de aceea sunt emiși de o porțiune foarte apropiată de suprafața probei. Ca urmare, acești electroni oferă o bună rezoluție imaginii[71].

Prin înregistrarea intensităților la care sunt împrăștiați electronii secundari rezultați în urma scanării suprafeței materialului cu un fascicul de electroni, este posibilă obținerea unor imagini virtuale asociate texturii probei iradiate. Contrastul imaginii este dat de topografia probei. În zonele mai înalte au loc interacții mai puternice cu fasciculului incident de electroni și emiterea unui număr mai mare de electroni secundari, asigurând astfel o imagine mai luminoasă în ” vârfurile” suprafeței probei[72]. Imaginea obținută este influențată de: intensitatea, diametrul și energia fasciculului de electroni, de volumul și de compoziția probei.

În scopul investigării morfologiei și dimensiunii nanoparticulelor și materialelor compozite obținute, probele au fost secționate cu ajutorul unui disc cu diamant, fixate pe un suport port-obiect și introduse în incinta de analiză a unui microscop electronic de baleiaj achiziționat de la compania FEI (Oregon, Statele Unite ale Americii, imaginile obținute fiind realizate prin înregistrarea fasciculului de electroni secundari rezultat, cu energie de 30 keV.

A fost efectuată analiza EDX utilizând un spectrometru EDS-EDX cu o rezoluție de 128 Ev. Această analiză permite detecția razelor X emise de un element, ca rezultat a de-excitării nucleului de electroni creată de o undă electronică cu energie inaltă. Datorită cuantificării nivelurilor de energie electronică, energiile razelor X emise caracteristic pentru fiecare element in parte.

Capacitatea de gonflare (absorbție)

Afinitatea față de mediile apoase reprezintă un parametru important în caracterizarea hidrogelurilor și se determină cantitativ prin măsurarea gradului de gonflare (GG, %) al substratului într-un mediu apos. Alegerea mediului de testare și stabilirea condițiilor de lucru se face în concordanță cu aplicația pentru care biomaterialul a fost conceput.Dat fiind faptul că sistemele sintetizate în această lucrare sunt destinate utilizării pentru tratarea rănilor, mediul de testare a comportamentului lor a fost serul fiziologic simulat (SBF). Determinarea gradului de gonflare se poate realiza prin diverse metode, cea mai des întâlnită fiind metoda gravimetrică. Această metodă constă în determinarea masei de lichid reținută în material după diverse intervale de timp (mti) si raportarea acestei la masa inițiala a eșantionului supus testului, înainte de începerea experimentului (mo).Gradul de gonflare se calculează cu ajutorul formulei (1):

GG,% = (1)

În cadrul activității experimentale s-a aplicat metoda gravimetrică după cum urmează: cele 8 eșantioane au fost cântărite în prealabil, după care au fost imersate, pe rând, în SBF (ser fiziologic simulat) într-un interval total de 24 h. Măsurătorile au fost realizate pentru fiecare probă în parte dupa 15, 30, 60, 120, 240, 300 respectiv, 1440 minute de când proba a fost imersată în SBF. După trecerea timpul alocat imerisiei probei în SBF, acesta a fost scoasă, tamponată ușor pe o hârtie de filtru în vederea îndepărtării excesului de apă de pe suprafață și cântărită, după care imersată din nou în SBF pentru următorul timp de imersie propus. Astfel s-a procedat pentru fiecare eșantion în parte. După realizarea acestor măsurători s-a calculat gradul de gonflare în vederea obținerii procentului de gonflare al fiecărei probe.

Degradarea enzimatică

Degradarea enzimatică a fost realizată prin imersarea unor bucăți din probele liofilizate într-o soluție de colagenază și monitorizarea degradării în timp. Pentru a monitoriza pierderea de masă, probele au fost cântărite la intervale diferite de timp și au fost calculate utilizând următoarea ecuație:

Pierdere în greutate = Wi-Wt / Wt × 100 (1), unde W1 reprezintă masa inițială și Wt reprezintă greutatea probei după intervalul de timp t.

Protocoale efect antimicrobian

Tulpinile utilizate pentru acest studio Staphylococcus aureus și Escherichia coli (gram negativ)au fost obtinute din colectia de tulpini a laboratorului de Microbiologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucuresti.

Analiza calitativa a efectului antimicrobian

Tulpinile de Staphylococcus aureus și Escherichia coli (gram negativ)au fost mentinute pe bulion nutritiv cu 20% glicerol la -80oC. Pentru testele antimicrobiene microorganismele au fost insamantate pe geloza nutritiva. Coloniile obtinute au fost utilizate pentru obtinerea de suspensii in AFS (apa fiziologica sterile) de densitate optica 0,5 Mc Farland (1-3×108 UFC/mL).

Evaluarea antimicrobiana – metoda calitativa (antibiograma adaptata)

Materialul obtinut impregnat cu agentul therapeutic/compusul antimicrobian selectat a fost sterilizat prin expunere la radiatii UV timp de 20 min pe fiecare parte. Materialele au fost plasate cu ajutorul unei pense sterile pe o placa Petri ce contine mediu Mueller Hinton însămânțată în panza cu tamponul, utilizand ca inocul o suspensie microbiană de densitate 1-3×108 UFC/mL (UFC – unități formatoare de colonii) (corespunzătoare standardului 0.5 MacFarland), urmand procedura descrisa de standardul CLSI 2018 pentru tehnica antibiogramei. Plăcile însămânțate au fost incubate timp de 24 de ore, la 37oC, interval în care microorganismele insamantate cresc si se multiplica, iar dupa expirarea perioadei de incubare se citesc rezultatele prin masurarea zonei de inhibitie a cresterii cu ajutorul unei rigle gradate. Se observa de asemenea si daca agentul antimicrobian inglobat in material difuzeaza sau nu in mediu de cultivare.

Biofilm – material solid functionalizat

Pentru testarea efectului suprafetelor obtinute asupra producerii de biofilme, materialele obtinute au fost taiate la dimensiunile de 1cm/1cm si sterilizate prin expunere la radiatii UV timp de 20 min pe fiecare parte. Cate un fragment de material steril a fost depus individual intr-un godeu al unei placi cu 6 godeuri sterile. Peste materialele depuse, in godeuri s-au adaugat 2 mL mediu lichid (bullion simplu) si ulterior 50 μL suspensie microbiana de densitate 0.5 McFarland. Placile cu 6 godeuri astfel pregatite, au fost incubate le 37oC timp de 24h. Dupa incubare materialele au fost spalate cu AFS si mediul a fost schimbat, pentru dezvoltarea biofilmelor dezvoltate pe acestea. Placutele au fost incubate pentru diferite perioade de timp (24, 48 si respective 72h). Dupa expirarea fiecarei perioade de incubare luate in calcul, esantionul pe care s-a dezvoltat biofilmul a fost spalat cu AFS si depus intr-un tub steril intr-un mL AFS. Tubul a fost vortexat energic timp de 30 sec pentru desprinderea celulelor din biofilm. Suspensia celulara obtinuta a fost diluata si diferite dilutii au fost insamantate pe placi cu mediu de cultura solidificat in vederea obtinerii si cuantificarii numarului de unitati formatoare de cololonii.

Rezultate și discuții

Difracția de raze X

Investigarea cristalinității nanoparticulelor de SiO2 sintetizate a fost posibilă prin analiza de difracție a radiației X, aceasta fiind metoda de investigație cel mai des utilizată pentru a pune în evidență compoziția fazală și caracterul nanocristalin al unei probei de analizat. Spectrul de difracție de raze X pe nanopulberea de SiO2 sintetizată este prezentat în figura 27.

Figura 27. Difractograma de raze X înregistrată pentru SiO2

Din figura 27 poate fi observat spectrul de difracție de raze X specific nanoparticulelor de SiO2, conform datelor de literatura. Aceasta prezintă picuri caracteristice pentru planele definite de indicii Miller în corcondanță cu fișa ASTM (American Society for Testing and Materials) pentru nanoparticulele de SiO2.

Gradul de cristalinitate al probei este pus în evidență prin intensitatea liniilor de difracție, astfel se pot observa picuri largi, neconturate, fapt ce sugerează că proba analizată prezintă un grad scăzut de cristalinitate.

Microscopia Electronică prin Transmisie

O altă analiză structurală a nanoparticulelor de argint s-a realizat folosind microscopia electronică prin transmisie care a facilitat observarea distribuției si compoziției fazelor prezente.

Imaginile de înaltă rezoluție furnizează aspecte legate de densitatea și tipul defectelor rețelei cristaline. În figura 28 sunt prezentate imaginile de microscopie electronica prin transmisie ale probei de SiO2.

Imaginea într-un microscop electronic prin transmisie se formează când electronii produși de un tun de electroni pătrund în probă, sunt difractați, focalizatți cu ajutorul unei lentile obiectiv, radiația astfel obținută este amplificată prin lentile proiector.

Analiza TEM pentru nanoparticulele de argint s-a realizat la dimensiuni nanometrice, sub 50nm. Din punct de vedere structural, se poate observa ca nu sunt evidențiate formele sferice ale nanoparticulelor de argint, ci o morfologie neregulata, poliedrala si cvasi-sferica, cu un grad mare de aglomerare.

Difracție de electroni pe arie selectată (SAED)

SAED este similară cu difracția de raze X, cu diferența că pot fi examinate zone de sute de nanometri în timp ce la difracția de raze X zonele examinate sunt de ordinul centimetrilor.

Imaginea de difracție de electroni pe arie selectată prezentată în figura 28 prezintă o singură fază mineralogică, și anume AgNPs. Analiza SAED arată caracterul cristalin al probei obținute prin spectrul rezultat sub forma unui set de cercuri de difracție concentrice, se poate observa caracteristica complexă a tipului de inel, ce demonstrează faptul ca proba este cristalină, susținând astfel rezultatele obținute în difracția de raze X. Inelele din pattern-ul SAED pot fi indexate pentru planele definite de indicii Muller (111), (200), (220), (311), care sunt conforme cu datele de specialitate ceea ce confirmă cristalinitatea nanoparticulelor de argint.

Imaginile de înaltă rezoluție furnizează aspecte legate de densitatea și tipul defectelor rețelei cristaline. În figura 29 sunt prezentate imaginile TEM ale probei pe bază de pulbere de SiO2

Imaginile în câmp luminos pentru SiO2 nanostructurată evidențiază particule sub forma unor sfere (figura 29). De asemenea, privind morfologia probei obținute, se observă forma regulata a particulelor și tendința redusa a acestora de a forma aglomerate.

O altă analiză structurală a pulberii de SiO2@Ag s-a realizat folosind microscopia electronică prin transmisie care a facilitat observarea distribuției si compoziției fazelor prezente.

Analizând cu ajutorul microscopiei electronice prin transmisie SiO2@Ag, a fost evidențiată depunerea de nanoparticule de argint pe suprafață formand un strat cvasi-uniform (stanga), insa o parte au migrat in interiorul structurii poroase de SiO2 (dreapta).

Caracteristicile morfologice și dimensionale ale pulberii de SiO2 au fost investigate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM).

Se poate observa in figura 31 ca sunt distribuite uniform din punct de vedere dimensional si morfologic sub forma de sfere, cu un grad redus de aglomerare, dimeniuni 200-300 nm.

A fost efectuată analiza EDX utilizând un spectrometru EDS-EDX cu o rezoluție de 128 Ev. Această analiză permite detecția razelor X emise de un element, ca rezultat a de-excitării nucleului de electroni creată de o undă electronică cu energie inaltă. Datorită cuantificării nivelurilor de energie electronică, energiile razelor X emise caracteristic pentru fiecare element in parte.

Din EDS se observa elementele componente specifice silicei (Si, O), lipsa altor elemente, ceea ce denota un grad mare de puritate. C provine din modul de pregatire a pulberilor pentru analiza, si anume aderarea la o banda dublu adeziva de C.

Caracteristicile morfologice și dimensionale ale pulberii de SiO2@Ag au fost investigate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM).

Se poate observa in figura 32 ca sunt uniforme dpdv dimensional si morfologic (sfere), uniform distribuite, cu un grad redus de aglomerare, dimeniuni 200-300 nm.

A fost efectuată analiza EDX utilizând un spectrometru EDS-EDX cu o rezoluție de 128 Ev. Această analiză permite detecția razelor X emise de un element, ca rezultat a de-excitării nucleului de electroni creată de o undă electronică cu energie inaltă. Datorită cuantificării nivelurilor de energie electronică, energiile razelor X emise caracteristic pentru fiecare element in parte.

Din EDS-ul prezent in figura 32 se pot observa elementele componente specifice silicei (Si, O), dar și argintul, lipsa altor elemente, ceea ce denota un grad mare de puritate. C provine din modul de pregatire a pulberilor pentru analiza, si anume aderarea la o banda dublu adeziva de C. Dat fiind că argintul are dimensiune reduse, este greu de clarificat din SEM modul de dispunere a acestuia. Se observă, insa local aglomerari de argint, prezentate in coltul dreapta sus.

Caracterizarea materialelor composite

Microscopie electronică de baleiaj

Micrografiile SEM ale compusului obținut, liofilizat indică prezența unei rețele fibroase, tridimensionale în structura colagenica. Se poate observa că microfibilele colagenului prezintă o aranjare aleatorie ceea ce conduce la formarea porilor de diferite mărimi, atât la suprafață, cât și în întreaga matrice colagenica.

Micrografiile SEM ale compusului obținut, liofilizat indică prezența unei rețele fibroase, tridimensionale în structura colagenica. Se poate observa că microfibilele colagenului prezintă o aranjare aleatorie ceea ce conduce la formarea porilor de diferite mărimi, atât la suprafață, cât și în întreaga matrice colagenica.

In figura 32 se observa particule de SiO2 pe suprafata foilor de colagen, uniform distribuite. Nanoparticulele pot pătrunde în interiorul matricei colagenice prin intermediul acestor pori. Micrografiile oferă o imagine de ansamblu asupra nanoparticulelor de SiO2 aderate la suprafața matricei colagenice.

A fost efectuată analiza EDX utilizând un spectrometru EDS-EDX cu o rezoluție de 128 Ev. Această analiză permite detecția razelor X emise de un element, ca rezultat a de-excitării nucleului de electroni creată de o undă electronică cu energie inaltă. Datorită cuantificării nivelurilor de energie electronică, energiile razelor X emise caracteristic pentru fiecare element in parte.

Din analiza EDX Si, O, au provenit din faptul ca probele au fost metalizate- acoperite cu un strat de 4-5 nm de Au in vederea realizarii de suprafete conductoare electric.

Micrografiile SEM ale compusului obținut, liofilizat indică prezența unei rețele fibroase, tridimensionale în structura colagenica. Se poate observa că microfibilele colagenului prezintă o aranjare aleatorie ceea ce conduce la formarea porilor de diferite mărimi, atât la suprafață, cât și în întreaga matrice colagenica.

Nanoparticulele pot pătrunde în interiorul matricei colagenice prin intermediul acestor pori.Micrografiile oferă o imagine de ansamblu asupra nanoparticulelor de SiO2 aderate la suprafața matricei colagenice. Din punct de vedere morfologic, nanoparticulele prezintă formă de foi. Aglomerarea nanoparticulelor poate fi evitată prin funcționalizarea acestora, precum și prin utilizarea rețelei tridimensionale formată din nanofibrele de colagen. În momentul în care, există o concentrație ridicată a nanoparticulelor, factori precum energia de suprafața mare și densitatea nanoparticulelor creează mediul necesar pentru ca particulele să formeze aglomerate locale. Acest aspect se evidențiază ușor la nivelul compozitului obținut.

Micrografiile din figura 35 oferă o imagine de ansamblu asupra nanoparticulelor de SiO2 aderate la suprafața matricei colagenice. Din punct de vedere morfologic, nanoparticulele prezintă formă de foițe. La măriri mai mari se poate observa mult mai bine cum nanoparticulele de argint s-au întrepătruns printre fibrele de pansament.

De asemenea, cantitatea de argint din aceste probe este sub limita de detectie a aparatului, motiv pentru care spectrele EDS sunt irelevante.

Micrografiile din figura 36 oferă o imagine de ansamblu asupra nanoparticulelor de SiO2 aderate la suprafața matricei colagenice. Din punct de vedere morfologic, nanoparticulele prezintă formă de foițe.

De asemenea, cantitatea de argint din aceste probe este sub limita de detectie a aparatului, motiv pentru care spectrele EDS sunt irelevante.

Spectroscopia de Infraroșu cu Transformata Fourier

Figura 37. Col-etalon/ Col- SiO2_2,5%/ Col- SiO2_5%

Analiza spectroscopică în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) a fost folosită pentru a determina picurile caracteristice compusului SiO2-Col și interacțiunile ce au loc între compușii existenți în structura acestuia.

Pe baza datelor din literatură, banda de absorbție largă din intervalul 3000-3307 este asociată grupărilor hidroxil din colagen. În zonele de vibrație 2855-2931 cm-1 pot fi observate benzi minime de absorbție atribuite grupărilor CH2 ce aparțin colagenului. Prezența colagenului poate fi identificată prin benzile amidice tipice, și anume, zona 1634 cm-1 atribuită vibrației de alungire C=O din amida I, 1544 cm-1 pentru vibrațiile N-H de deformare la amida II și la 1452 cm-1 vibrația de deformare a grupărilor CH3.

Figura 38. Col-etalon/ Col- SiO2-Ag_2,5%/ Col- SiO2-Ag_5%

Pe baza datelor din literatură, banda de absorbție largă din intervalul 3000-3307 este asociată grupărilor hidroxil din colagen. În zonele de vibrație 2855-2931 cm-1 pot fi observate benzi minime de absorbție atribuite grupărilor CH2 ce aparțin colagenului. Prezența colagenului poate fi identificată prin benzile amidice tipice, și anume, zona 1634 cm-1 atribuită vibrației de alungire C=O din amida I, 1544 cm-1 pentru vibrațiile N-H de deformare la amida II și la 1452 cm-1 vibrația de deformare a grupărilor CH3.

De asemenea spectrele FT-IR ne arata zonele de vibrație 1635, 1544, 1398, 1030 cm-1 specifice nanoparticulelor de argint (AgNPs). In plus, poate fi observată o bandă slabă la 527 cm−1 atribuită vibratiei de intindere simetrice pentru legăturile Si-O.

Capacitatea de gonflare (absorbție)

Figura 39. S1(Col-etanol), S2(Col+SiO2-Ag_5%),S3(Col+SiO2-Ag_2,5%), S4(Col+SiO2_2,5%), S5(Col+SiO2_5%)

Figura 40. Diametrul zonei de inhibiție

Figura 41. Diametrul zonei de inhibiție

În cadrul activității experimentale s-a aplicat metoda gravimetrică pentru a obține procentul de gonflare pentru fiecare proba, astfel putem observa ca in cazul probei S1, gradul de gonflare crește o data cu creșterea perioadei de timp in care a fost imersata în SBF proba. In cazul probei S2 putem observa faptul ca gradul de gonflare scade o data cu creșterea timpului de imersare in SBF din cauza argintului. In cazul probei S3 putem observa faptul ca gradul de gonflare oscileaza o data cu creșterea timpului de imersare in SBF, din cauza introducerii în proba a argintului. In cazul probei S4 putem observa faptul ca gradul de gonflare nu este foarte influențat de creșterea timpului de imersare in SBF. In cazul probei S5 putem observa faptul ca gradul de gonflare a crescut fața de S4 deoarece am avut o concentrație mai mare de silicie. Putem spune si faptul că gradul de gonflare scade o data cu introducerea siliciei și argintului.

Degradarea enzimatică

Figura 42. Degradarea enzimatică la diferite intervale de timp

Degradarea enzimatică a fost realizată prin imersarea unor bucăți din probele liofilizate într-o soluție de colagenază și monitorizarea degradării în timp. Dupa cum se poate observa in figura 42, pentru S1 gradul de degradare enzimatica oscileaza in funcție de timp, astfel putem spune ca pana la 120 minute a fost in creștere,insa apoi a intrat in descreștere o data cu trecerea timpului. Pentru S2 puntem vedea ca a ramas constant in primele 30 de minute dupa care a crescut in urmatoarele 30 de minute și apoi a fost in descreștere o data cu trecerea timpului, La fel s-au comportat și celelalte doua probe, respectiv S4 și S5, oscilând in funcție de timp așa cum se observă in figura 40, insă cel mai mare grad de degradare l-a avut proba S1, iar cel mai mic grad de degradare enzimatica l-a avut proba S2 dupa cum se poate observa in figura 42.

Analize biologice

Figura 43.Planctonice- 1(etalon), 2(Col+SiO2_2,5%), 3(Col+SiO2-Ag_2,5%), 4( Col+SiO2-Ag_5%),5(control_tulpină)

În vederea stabilirii activității antimicrobiene a pansamentelor, acestea au fost testate utilizând doua tulpini bacteriene și anume Staphylococcus aureus și Escherichia coli (gram negativ).

Figura 42. Biofilme- 1(etalon), 2(Col+SiO2_2,5%), 3(Col+SiO2-Ag_2,5%), 4( Col+SiO2-Ag_5%),5(control_tulpină)

În vederea stabilirii activității antimicrobiene a pansamentelor, acestea au fost testate utilizând doua tulpini bacteriene și anume Staphylococcus aureus și Escherichia coli (gram negativ).Analiza rezultatelor a avut loc dupa 24h în scopul obținerii și cuantificării numărului de unități formatoare de cololonii (UFC/mL).În figura 42 este prezentată activitatea antimicrobiană a probelor pentru a evalua unitățile formatoare de colonii, în cazul testării pentru tulpina de S. aureus a pansamentelor acoperite cu nanoparticule de argint, analizând graficul obținut se poate observa faptul că dupa 24h activitatea argintului în scopul anti-infecțios are un efect de reducere al unităților formatoare de colonii substanțial,fapt ce dovedește proprietatea anti-bacteriană a nanoparticulelor de argint depuse pe pansament.

Din graficul obținut în urma testării pentru tulpina de Escherichia coli , în vederea evaluării unităților formatoare de colonii, este observată o diferență substantială, pentru probe față de control, în urma a 24h asupra biofilmului microbian.

Concluzii

Surse bibliografice

1. Dhivya, S., V.V. Padma, and E. Santhini, Wound dressings–a review. BioMedicine, 2015. 5(4).

2. Boateng, J.S., et al., Wound healing dressings and drug delivery systems: a review. Journal of pharmaceutical sciences, 2008. 97(8): p. 2892-2923.

3. Gottrup, F., Trends in surgical wound healing. Scandinavian Journal of Surgery, 2008. 97(3): p. 220-225.

4. Paul, W. and C.P. Sharma, Chitosan and alginate wound dressings: a short review. Trends Biomater Artif Organs, 2004. 18(1): p. 18-23.

5. Gil, E.S., et al., Functionalized silk biomaterials for wound healing. Advanced healthcare materials, 2013. 2(1): p. 206-217.

6. Sezer, A.D. and E. Cevher, Biopolymers as wound healing materials: challenges and new strategies. 2011: INTECH Open Access Publisher.

7. Gist, S., et al., Wound care in the geriatric client. Clinical interventions in aging, 2009. 4: p. 269.

8. Purser, K., Wound dressing guidelines. Royal United Hospital Bath NHS Trust, 2010. 747: p. 1-25.

9. Dabiri, G., E. Damstetter, and T. Phillips, Choosing a wound dressing based on common wound characteristics. Advances in wound care, 2016. 5(1): p. 32-41.

10. Kannon, G.A. and A.B. Garrett, Moist wound healing with occlusive dressings: a clinical review. Dermatologic surgery, 1995. 21(7): p. 583-590.

11. Singer, A.J. and R.A. Clark, Cutaneous wound healing. New England journal of medicine, 1999. 341(10): p. 738-746.

12. Moffatt, C., Identifying criteria for wound infection. European Wound Management Association (EWMA). Position document: Identifying criteria for wound infection. MEP Ltd, London, 2005.

13. Wolcott, R.D., D.D. Rhoads, and S.E. Dowd, Biofilms and chronic wound inflammation. Journal of wound care, 2008. 17(8): p. 333-341.

14. Eming, S.A., T. Krieg, and J.M. Davidson, Inflammation in wound repair: molecular and cellular mechanisms. Journal of Investigative Dermatology, 2007. 127(3): p. 514-525.

15. Harding, K. and R. Edwards, Bacteria and wound healing vol. 17. 2004, United States: Lippincott Williams & Wilkins.

16. Celebi, M.E., et al., Lesion border detection in dermoscopy images. Computerized medical imaging and graphics, 2009. 33(2): p. 148-153.

17. Gutman, D., et al., Skin lesion analysis toward melanoma detection: A challenge at the international symposium on biomedical imaging (ISBI) 2016, hosted by the international skin imaging collaboration (ISIC). arXiv preprint arXiv:1605.01397, 2016.

18. Weston, S.D. and M. Wiener, Familial polyposis associated with a new type of soft-tissue lesion (skin pigmentation). Diseases of the Colon & Rectum, 1967. 10(4): p. 311-321.

19. Boateng, J.S., et al., Wound healing dressings and drug delivery systems: A review. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008. 97(8): p. 2892-2923.

20. Schoukens, G., Bioactive dressings to promote wound healing, in Advanced textiles for wound care. 2019, Elsevier. p. 135-167.

21. Ferreira, A.M., et al., Collagen for bone tissue regeneration. Acta Biomaterialia, 2012. 8(9): p. 3191-3200.

22. An, B., Y.-S. Lin, and B. Brodsky, Collagen interactions: Drug design and delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2016. 97: p. 69-84.

23. Rangaraj, A., K. Harding, and D. Leaper, Role of collagen in wound management. Wounds uk, 2011. 7(2): p. 54-63.

24. Welgus, H., et al., Characteristics of the action of human skin fibroblast collagenase on fibrillar collagen. Journal of Biological Chemistry, 1980. 255(14): p. 6806-6813.

25. Megerman, J., et al., A laboratory model to quantitate the resistance of collagen vascular grafts to biodegradation. Journal of biomedical materials research, 1991. 25(3): p. 295-313.

26. Lee, C.H., A. Singla, and Y. Lee, Biomedical applications of collagen. International journal of pharmaceutics, 2001. 221(1): p. 1-22.

27. Hoffman, A.S., Hydrogels for biomedical applications. Advanced drug delivery reviews, 2012. 64: p. 18-23.

28. Yadollahi, M., S. Farhoudian, and H. Namazi, One-pot synthesis of antibacterial chitosan/silver bio-nanocomposite hydrogel beads as drug delivery systems. International journal of biological macromolecules, 2015. 79: p. 37-43.

29. Maier, S.A., et al., Plasmonics—a route to nanoscale optical devices. Advanced materials, 2001. 13(19): p. 1501-1505.

30. Reti, A. and S. Mridha, Silver: Alloying, Properties, and Applications. 2014.

31. Koo, H.Y., et al., Size-controlled silver-glass composite powders with nanometer size prepared by flame spray pyrolysis. Powder technology, 2011. 207(1-3): p. 362-369.

32. Bai, L., et al., Nanostructured titanium–silver coatings with good antibacterial activity and cytocompatibility fabricated by one-step magnetron sputtering. Applied Surface Science, 2015. 355: p. 32-44.

33. Vytykacova, S., et al., The formation of silver metal nanoparticles by ion implantation in silicate glasses. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms, 2016. 371: p. 245-250.

34. Oluwafemi, O.S., et al., Microwave irradiation synthesis of silver nanoparticles using cellulose from Eichhornia crassipes plant shoot. Materials Letters, 2016. 185: p. 576-579.

35. Ahmad, T., et al., Low temperature chemical synthesis and comparative studies of silver oxide nanoparticles. Journal of Molecular Structure, 2015. 1084: p. 9-15.

36. Banach, M. and J. Pulit-Prociak, Synthesis, characteristics, and biocidal activity of silver nanoparticles, in Fabrication and Self-Assembly of Nanobiomaterials. 2016, Elsevier. p. 367-399.

37. Ren, Y.-y., et al., Green synthesis and antimicrobial activity of monodisperse silver nanoparticles synthesized using Ginkgo Biloba leaf extract. Physics Letters A, 2016. 380(45): p. 3773-3777.

38. Sánchez, G.R., et al., Leaf extract from the endemic plant Peumus boldus as an effective bioproduct for the green synthesis of silver nanoparticles. Materials Letters, 2016. 183: p. 255-260.

39. Jung, W.K., et al., Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Applied and environmental microbiology, 2008. 74(7): p. 2171-2178.

40. Prabhu, S. and E.K. Poulose, Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications, and toxicity effects. International nano letters, 2012. 2(1): p. 32.

41. Iravani, S., et al., Synthesis of silver nanoparticles: chemical, physical and biological methods. Research in pharmaceutical sciences, 2014. 9(6): p. 385.

42. Guzman, M., J. Dille, and S. Godet, Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles against gram-positive and gram-negative bacteria. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2012. 8(1): p. 37-45.

43. Shahverdi, A.R., et al., Rapid synthesis of silver nanoparticles using culture supernatants of Enterobacteria: a novel biological approach. Process Biochemistry, 2007. 42(5): p. 919-923.

44. Kumar, C.G. and S.K. Mamidyala, Extracellular synthesis of silver nanoparticles using culture supernatant of Pseudomonas aeruginosa. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2011. 84(2): p. 462-466.

45. Roy, N., et al., Green synthesis of silver nanoparticles: an approach to overcome toxicity. Environmental toxicology and pharmacology, 2013. 36(3): p. 807-812.

46. Ahmad, T., et al., Biosynthesis, structural characterization and antimicrobial activity of gold and silver nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013. 107: p. 227-234.

47. Korbekandi, H., et al., Optimization of biological synthesis of silver nanoparticles using Fusarium oxysporum. Iranian journal of pharmaceutical research, 2013. 12(3): p. 289-298.

48. Son, S., et al., Designed synthesis of SiO2/TiO2 core/shell structure as light scattering material for highly efficient dye-sensitized solar cells. ACS applied materials & interfaces, 2013. 5(11): p. 4815-4820.

49. Chen, K.-H., et al., Ag-nanoparticle-decorated SiO2 nanospheres exhibiting remarkable plasmon-mediated photocatalytic properties. The Journal of Physical Chemistry C, 2012. 116(35): p. 19039-19045.

50. Wei, S., et al., Multifunctional composite core–shell nanoparticles. Nanoscale, 2011. 3(11): p. 4474-4502.

51. Zhang, Q., et al., Ag/TiO 2 and Ag/SiO 2 composite spheres: synthesis, characterization and antibacterial properties. RSC Advances, 2013. 3(25): p. 9739-9744.

52. J. Phys. Chem. C. 2012. p. 19039.

53. Nat. Mater. 2010. p. 205.

54. Adv. Colloid Interfac. 2012. p. 28.

55. Chem. Mater. 2003. p. 1944.

56. Nanoscale. 2011. p. 4474.

57. Appl Surf. Sci. 2014. p. 399.

58. J. Phys. Chem. C. 2008. p. 11205.

59. Colloid. Surface. A. 2011. p. 17.

60. J. Nanosci. Nanotechno. 2009. p. 3177.

61. J. ColloidInterf. Sci. 1968. p. 62.

62. Deveci, İ. and B. Mercimek, Performance of SiO2/Ag Core/Shell particles in sonocatalalytic degradation of Rhodamine B. Ultrasonics sonochemistry, 2019. 51: p. 197-205.

63. Andronescu, E., et al., Nanopulberi și materiale ceramice: Obținere și caracterizare. 2008, Bucuresti: Politehnica Press.

64. Chrystallography and Diffraction Techniques.

65. Dutrow, B.L. and C.M. Clark, X-ray Powder Diffraction (XRD).

66. Birkholz, M., Principles of X-ray Diffraction, Thin Film Analysis by X-Ray Scattering. 2006, Weinheim: Wiley-VCH.

67. X-ray crystallography.

68. Vasile, E., Metode de caracterizare structurala in stiinta nanomaterialelor. 2013.

69. Reimer, L., Scanning Electron Microscopy. Spriger Series in Optical Sciences, 1998. 45.

70. Todoraș, A. and Ș. Antohe, Aplicații ale spectroscopiei IR și RAMAN în studiul materialelor. 2011: Bucuresti. p. 63-68.

71. FTIR Spectroscopy.

72. Generalități despre Spectroscopia IR.