P2: Colectivul de cercetare nr. 31008 [308656]

UNIVERSITATEA TEHNICĂ „GHEORGHE ASACHI” [anonimizat]

P2: Colectivul de cercetare nr. 31008

Chimia și ingineria procesării resurselor proteice

CONTRACT DE CERCETARE ȘTIINȚIFICĂ

Nr. 216 / 2014

– [anonimizat]-EFICIENTEI INDUSTRIEI DE PIELĂRIE (PROECOPEL)

COORDONATOR (CO):

[anonimizat]

2015

Cuprins

Pagina

Preambul

Prelucrarea neconvențională a [anonimizat], și redefinirea unora dintre criteriile de evaluare a caracteristicilor semifabricatelor tăbăcite. [anonimizat], [anonimizat]-mecanice acceptă abateri și variații semnificative comparativ cu sortimentele clasice ([anonimizat]). [anonimizat]-termic, definit prin temperatura de contracție a dermei tăbăcite și prin variația cu temperatura a [anonimizat] (în general de scăderi) ale valorilor așteptate și acceptate ca fiind atinse în urma aplicării tratamentelor neconvenționale de prelucrare. A [anonimizat], [anonimizat]-mecanice. Motivația rezidă în faptul că durata de exploatare a produselor moderne din piele și gama de agresiuni fizice și mecanice la care acestea sunt supuse s-[anonimizat] „produse de folosință îndelungată” la cel de „bunuri de larg consum”, ori de „produse cu purtare restrânsă”. [anonimizat] a [anonimizat] (mai ales costurile legate de prevenirea poluării și de protecția mediului) nu se mai justifică. Consecința imediată a acestei atitudini a [anonimizat]-[anonimizat].

[anonimizat], încep să se afirme procedeele de „bio-tăbăcire” și cele de „tăbăcire mediată enzimatic”. Deocamdată, acestea se află în etapa de elaborare a [anonimizat] [1, 2], dar neaplicate la scară industrială. [anonimizat] a [anonimizat] a [anonimizat], acest tip de tehnologii „eco-eficiente” se vor impune decisiv. [anonimizat] o competiție legată de transpunerea industrială a principiilor procedeelor de „bio-tăbăcire” și de „tăbăcire mediată enzimatic”.

Principalul avantaj demn de remarcat al procedeelor mai sus citate derivă din reducerea semnificativă a eco-[anonimizat] a stratului dermic tăbăcit. De asemenea, respectivele procedee concură la închiderea ciclurilor de recuperare – reutilizare a unor subproduse, fapt care poate reduce costurile legate de auxiliarii chimici implicați.

Una dintre deficiențele procedeelor neconvenționale de tăbăcire, pentru care nu s-au găsit încă soluții, constă în imposibilitatea ca acestea să asigure „formarea volumului pielii tăbăcite”. Derma supusă acestor variante de tăbăcire neconvențională scade în grosime, comparativ cu grosimea atinsă după tăbăcirea organică, realizată, spre exemplu, cu dialdehide. În cazul „bio-tăbăcirii” cu hidrolizate proteice, motivația rezidă în difuzia dificilă în intimitatea microstructurii dermice, iar în cazul „tăbăcirii mediate enzimatic”, drept cauză se adaugă și „colarea” avansată a elementelor fibroase ale dermei, deoarece în volumul pielii nu se introduce un agent tanant propriu-zis, reticulările covalente inducându-se direct între grupările aminoacidice laterale ale scleroproteinelor.

Pentru a compensa această deficiență, tehnologiile cadru de tăbăcire neconvențională trebuie să includă operații suplimentare, de regulă de factură mecanică. În plus, timpii tehnologici (duratele proceselor chimice și fizico-chimice, intervalele de timp la care diversele operații se repetă, numărul repetărilor, duratele operațiilor de maturare / „odihnă”) cresc în bună măsură. Din aceste motive, tehnologiile cadru de tăbăcire neconvențională trebuie încă optimizate. Este evident însă faptul că optimalitatea lor se va atinge abia după ce principiile și fizico-chimismul celor două tipuri de tăbăcire aflate în discuție vor fi complet elucidate.

Prezenta lucrare abordează studiile preliminare privind posibilitatea de utilizare a hidrolizatelor de colagen și / sau a transglutaminazei drept agenți capabili a induce efecte asimilate tăbăcirii, prin prisma creșterii temperaturii de contracție a dermei pieilor de bovine cu mai mult decât 6,5 șC. Respectiva creștere reprezintă valoarea minim acceptată pentru sporul temperaturii de contracție ce poate fi asociat cu efectul tanant al unui compus chimic apt a interacționa fizic cu scleroproteinele. În acest sens, compusul de referință în evaluarea capacității tanante este 2,2’,4,4’-tetrahidroxi-difenil-metanul (denumirea IUPAC: 4-[(2’,4’-dihydroxyphenyl)methyl]benzene-1,3-diol), care este capabil, ca preponderent prin interacții de tipul legăturilor de hidrogen, să inducă un spor de 6,5 șC al temperaturii de contracție a dermei pieilor gelatină tratate [3].

In mod particular, lucrarea vizează evaluarea validității principiilor tenologice aplicabile tratării pieilor gelatină de bovine tinere cu hidrolizate de colagen și / sau cu transglutaminază, în vederea sporirii stabilității hidrotermice a acesteia. Astfel, experimentele descrise în lucrare testează modalități de efectuare a operațiilor tehnologice (secvența, recepturile și procedurile respectivelor operații) apte a asigura instalarea unui efect tanant cuantificabil.

Bibliografie

[1] Subramani S., Palaninsamy T., Rao J.R., Nair B.U., Thirumalachari R. – Bio-tanning process for leather making, US Pat. App. 2006/0137102/29.06.2006.

[2] Feigel T., Palissa M., Pasternack R., Fuchsbauer H.-L., Germann H.-P., Meyer M. – Agent and method for enzymatically tanning skins, US Pat. 6849095/1.02.2005.

[3] Heidemann E. – Fundamentals of Leather Manufacturing, Eduard Roether KG Drukerei und Verlag, Darmstadt, 1993 (Chapter 13, p. 403 și următoarele).

Capitolul I

Caracterizarea hidrolizatelor colagenice utilizate în studiile preliminare

privind „bio-tăbăcirea” pieilor

Hidrolizatele de colagen sunt amestecuri de polipeptide rezultate în urma hidrolizei unor materii prime cu conținut ridicat de colagen (derma pieilor recoltată de la diverse animale, piele procesată tăbăcărește, furdale de piele, oase etc.). De regulă, în primă fază, hidrolizatele se prezintă sub forma unor soluții coloidale puternic polidisperse și relativ diluate, obținute după ce dispersiilor brute rezultate la finalul operațiilor de hidroliză li s-au aplicat operații de separare a speciilor solubile de suspensiile (grosiere și medii) însoțitoare. În respectivele soluții, fracțiile solubile sunt preponderent polipeptidice, cu mase moleculare mai mici decât cele ale gelatinelor (de 2 ÷ 16 kDa, comparativ valorile specifice gelatinelor, situate peste 50 kDa, de regulă în jurul valorii de circa 150 kDa) [1 – 4] și dependente de modul de realizare și de durata proceselor hidrolitice. Principala diferență între hidrolizatele colagenice și gelatine este faptul că, în cazul hidrolizatelor, scindarea macromoleculelor colagenului se realizează preponderent și masiv intracatenar, conducînd la o fragmentare avansată, pe când, în cazul gelatinelor, se înregistrează preponderent o denaturare intensă a colagenului, urmată de fragmentarea hidrolitică parțială și limitată a catenelor polipeptidice ale acestuia. Drept urmare, odată aduse sub formă uscată (prin liofilizare sau prin atomizare), hidrolizatele colagenice sunt solubile în apă la orice temperatură, în timp ce gelatinele se resolubilizează doar la cald (peste 40, sau chiar numai peste 60 șC) și doar după o etapă de îmbibare statică („umflare”) în apă.

În majoritatea aplicațiilor industriale (și în unele dintre cele agrotehnice, zootehnice și biomedicale), hidrolizatele colagenice se utilizează după modificarea lor chimică. Respectiva modificare vizează ajustarea hidrofiliei [5], a semnului și valorii încărcării electrice globale în mediu apos [6], a naturii și numărului grupărilor chimice reactive [7, 8], precum și a dispersității masei moleculare medii. Atât utilizarea ca atare, cât și orice modificare chimică sunt posibile însă doar după caracterizarea fizico-chimică a hidrolizatelor colagenice.

Dată fiind natura lor polipeptidică, hidrolizatele de colagen se caracterizează prin:

– domeniul izoelectric;

– conținutul de grupări ionizabile al catenelor aminoacidice laterale;

– caracterul amfoter;

– capacitatea de tamponare pe scala de pH.

Aceste caracteristici permit estimarea comportamentului și reactivității hidrolizatelor în soluție apoasă, inclusiv în raport cu proteinele dermei, precum și estimarea abilităților de difuzie din soluție (ori din flotele tehnologice) în dermă. De asemenea, permit stabilirea modalităților de modificare chimică și calcularea recepturilor, în acest sens.

Caracterizarea minimal necesară a hidrolizatelor colagenice se realizează prin tehnica titrimetrică și permite determinarea cantitativă a conținutului de grupări acide și bazice ale catenelor aminoacidice. În cele ce urmează, se prezintă rezultatele acestor caracterizări aplicate, comparativ, pudrei de piele necromată, gelatinelor de tip A și B, precum și hidrolizatelor de colagen obținute pornind de la piele gelatină (două variante de hidroliză).

I. 1. Pregătirea probelor în vederea caracterizării titrimetrice

Pentru ca determinările titrimetrice să fie reproductibile (și rezultatele lor să fie corect interpretabile), probele supuse analizei trebuie anterior caracterizate minimal pentru a se stabili:

– conținutul de suspensii insolubile (și respectiv de specii solubile totale).

– conținutul de substanță uscată al soluției libere de suspensii;

– conținutul de compuși minerali (reziduul de calcinare);

– conținutul de materii grase.

Aceste caracteristici permit stabilirea bilanțurilor masice ale probelor de hidrolizate de colagen supuse analizei.

Pentru asigurarea reproductibilității determinărilor cantitative (inclusiv titrimetrice) asupra hidrolizatelor colagenice s-a elaborat o variantă optimală pentru pregătirea probelor. Aceasta include etapele și operațiile descrise în Tabelul I.1.

Hidrolizatul brut se omogenizează și apoi se caracterizează preliminar, determinând: densitatea, substanța uscată, conținutul de minerale și pH-ul. Cantitatea de hidrolizat brut luată în lucru se cântărește cu precizie (împărțind-o în porții de câte 100 mL și sumând masele determinate), pentru stabilirea masei la care se vor raporta apoi determinările. De asemenea, după fiecare operație menționată în Tabelul I.1. hidrolizatul în curs de procesare se cântărește în vederea întocmirii bilanțurilor masice.

O șarjă distinctă se procesează în paralel, în condiții identice, iar după fiecare operație, asupra sa se efectuează determinările necesare calculării bilanțurilor (densitate, substanță uscată, substanțe minerale).

În vederea titrării, se prepară soluții de hidrolizat cu tărie ionică ajustată la minimum 0,2 M, pentru a asigura o ecranare reciprocă suficientă a sarcinilor electrice ale grupărilor aminoacidice laterale [9] și deci o conformație extinsă a catenelor polipeptidice. Concentrația standard a hidrolizatului în respectiva soluție este de 0,05 g/L. Este util ca, imediat înaintea titrării, în soluția standard să se barboteze azot liber de CO2, pentru a stabiliza pH-ul acesteia ca urmare a eliminării bioxidului de carbon absorbit.

Figurile I.1. ÷ I.5. și Sinopticele asociate lor (I.1. ÷ I.5.) prezintă rezultatele investigațiilor titrimetrice aplicate celor două tipuri de hidrolizat de colagen testate (HC-1 și HC-2), comparativ cu rezultatele obținute pentru Gelatina A și Gelatin B (Sigma-Aldrich, cod G2500-100G și respectiv G9382-100G), precum si pentru pudra de piele necromata (Sigma-Aldrich, cod H0162-25G). Figurile mai sus citate includ:

dependența pH-ului măsurat de volumul de reactiv de titrare adăugat (curba de titrare „brută”, asamblată din cele două curbe trasate pentru adaosul de acid și respectiv de bază);

cantitatea echivalentă (mMol/g, sau mEq/g) de protoni legați sau cedați de către grupările ionizabile ale polipeptidelor în cursul titrării cu reactivi monoprotici („curba de legare”, calculată conform unui algoritm adaptat după referințele [9] și [10]);

capacitatea de tamponare a formelor proteice în raport cu reactivi monoacizi sau monobazici (calculată conform unui algoritm adaptat după referințele [11-13]); maximele locale ale curbei capacității de tamponare oferă valorile constantelor de ionizare (exprimate drept constante de aciditate, pKa) ale grupărilor aminoacidice laterale și a celor terminale.

Analizând Figurile I.1. ÷ I.5. (și Sinopticele asociate) se constată faptul că hidrolizatul HC-1 are un nivel de reactivitate mai ridicat decât hidrolizatul HC-2, urmare a unui grad de hidroliză sporit (o fragmentare mai avansată a catenelor polipeptidice ale colagenului). Ambele hidrolizate au un caracter proponderent acid în soluție apoasă, cu valori ale primei constante de aciditate globală (pKa1) plasată în intervalul 4,5 ÷ 5,0. Așadar, la valori ale pH-ului mediului apos de peste 5,0 unități logaritmice, grupările carboxil se găsesc în stare (complet) disociată, iar grupările aminice se găsesc în stare (complet) protonată până la pH 10,5, deși în cazul hidrolizatului HC-2, se înregistrează o primă treaptă de deprotonare la pH 8,2.

Utilizând informațiile furnizate de investigarea titrimetrică se poate estima comportamentul hidrolizatelor în flote, comparativ cu cel al fibrelor dermice (respectiv al pudrei de piele necromată; Figura I.5. și Sinopticul I.5.). Ambele hidrolizate sunt relativ mai acide, ceea ce indică o posibilă (dar slabă) legare ionică a lor în secțiunea dermei pielii gelatină. În vederea creșterii potențialului lor tanant, hidrolizatele trebuie însă supuse modificării chimice.

Tabelul I.1. Protocolul pentru pregătirea probelor de hidrolizat de colagen în vederea caracterizării titrimetrice

Tabelul I.1. (Continuare)

Tabelul I.1. (Continuare)

Tabelul I.1. (Continuare)

Tabelul I.1. (Continuare)

Bibliografie

[1] Zhang Z., Li G., Shi B. – Physicochemical properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate derived from bovine limed split wastes, Journal of the Society of Leather Technologists and Chemists, 90, 2006, p.23-28.

[2] Elharfaoui N., Djabourov M., Babel W. – Molecular weight influence on gelatin gels. Structure, enthalpy, and rheology, Macromolecular Symposia, 256 (1), 2007, p. 149-157.

[3] Wang Q., Ma P., Ma X., Fan D. – Enzymatic hydrolysis of human-like collagen and molecular weight distribution of hydrolysates, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 6 (1), 2014, p. 278-282.

[4] Wang W., Li Z., Liu J., Wang Y., Liu S., Sun M. – Comparison between thermal hydrolysis and enzymatic proteolysis processes for the preparation of Tilapia skin collagen hydrolysates, Czech Journal of Food Sciences, 31 (1), 2013, p. 1-4.

[5] Šemrl-Kosmač V., Gantar A., Anžur I. – Modification of collagen hydrolysates, Resources, Conservation and Recycling, 13, 1995, p. 97-104.

[6] Su D., Wang K., Chen X. – Preparation of protein retanning agent by grafting modification of collagen hydrolyste extracted from chrome shavings, Conference Paper, 30th, International Union of Leather Technologists & Chemists Societies; 2009; Beijing, China.

[7] Langmaier F., Mokrejš P., Karnas R., Mládek M., Kolomazník K. – Modification of chrome-tanned leather waste hydrolysate with epichlorhydrin, Journal of the Society of Leather Technologists and Chemists, 90, 2006, p.29-34.

[8] Tang K., Cao J., Lv Y., Chang G. – Glutaraldehyde Modification of Collagen Hydrolysate Obtained from Chrome Shavings, Journal of the American Leather Chemists' Association, 100 (7), 2005, p. 265-272.

[9] Kenchington A. W. – Analytical information from titration curves, în A Laboratory Manual of Protein Chemistry (Including Polypeptides), Volme 2, The Composition, Structure and Reactivity of Proteins, Editors: Alexander P, Block R. J., Pergamon Press, Oxford, 1960, p. 353-388.

[10] Kenchington A. W., Ward A. G. – The titration curve of gelatin, Biochemical Journal, 58 (2), 1954, p. 202-207.

[11] Burgot J.-L. – Ionic Equilibria in Analytical Chemistry, Springer Science+Business Media, LLC, New York, 2012.

[12] Urbansky E. T., Schock M. R. – Understanding, Deriving, and Computing Buffer Capacity, Journal of Chemical Education, 77 (12), 2000, p. 1640-1644.

[13] Clark R. W., White G. D., Bonicamp J. M., Watts E. D. – From Titration Data to Buffer Capacities: A Computer Experiment for the Chemistry Lab or Lecture, Journal of Chemical Education, 72 (8), 1995, p. 746-750.

Capitolul II

Testarea preliminară a potențialului tanant al hidrolizatelor colagenice,

individual și în tandem cu tratamentul cu transglutaminază

Deși au caracteristicile unui amestec de polipeptide, caracteristici întru totul similare celor ale fibrelor colagenice, hidrolizatele de colagen pot interacționa electrostatic cu colagenul dermic în intervale limitate de pH, în care există mici diferențe între sarcinile globale ale celor doi parteneri. Prezenta lucrare include o serie de teste preliminare, efectuate în acest sens.

II.1. Prelucrarea pieilor în vederea tăbăcirii lor neconvenționale

S-a realizat conform tehnologiei cadru descrise în Tabelul II.1.

Tabelul II.1.: Tehnologia cadru pentru prelucrarea pieilor de bovine

până la stadiul de piele piclată

Tabelul II.1. (Continuare)

Tabelul II.1. (Continuare)

Tabelul II.1. (Continuare)

II.2. Pregătirea pielii în vederea tratării lor cu hidrolizatele colagenice

S-a realizat conform tehnologiei cadru descrise în Tabelul II.2.

Tabelul II.2.: Tehnologia cadru pentru depiclarea pieilor de bovine mici,

conservate prin piclare

Tabelul II.2. (Continuare)

II.3. Caracterizarea hidrolizatelor colagenice

În vederea utilizării lor în cadrul testelor preliminare de determinare a potențialului de legare în dermă, hidrolizatele de colagen (HC-1 și HC-2) s-au procesat conform metodologiei cadru descrise în Tabelul II.3.

Tabelul II.3.: Metodologia cadru pentru procesarea hidrolizatelor de colagen

în vederea testării capacității de legare în derma pieilor.

Tabelul II.3.: (Continuare)

Tabelul II.3.: (Continuare)

Caracteristicile determinate asupra hidrolizatelor colagenice care au parcurs primele 17 operații din protocolul descris în Tabelul II.3 (până la concentrarea lor în stare lichidă) sunt reunite în Tabelul II.4.

Tabelul II.4. Caracteristicile fizico-chimice ale hidrolizatelor de colagen procesate.

II.4. Tăbăcirea organică efectuată cu agentul tanant de referință

Pentru evaluarea comparativă a rezultatelor tăbăcirilor neconvenționale, obținute asupra probelor de piele prelucrată conform tehnologiei cadru descrisă în Tabelul II.2, s-a recurs la aplicarea unei tăbăciri cu aldehidă glutarică, în calitate de agent tanant de referință. Valorile temperaturilor de contracție atinse în urma tăbăcirilor neconvenționale se raportează la valoarea rezultată după tăbăcirea cu aldehidă glutarică.

Tehnologia cadru de tăbăcire cu agentul tanant de referință este descrisă în Tabelul II.5.

Tabelul II.5.: Tehnologia cadru pentru tăbăcirea pieilor cu aldehidă glutarică.

II.5. Tratamentul neconvențional cu transglutaminază

Tratamentul cu transglutaminază nu reprezintă o tăbăcire în sensul clasic al definiției, ci doar o creștere a numărului punților de reticulare covalentă la nivelul intim al fibrelor colagenice, între macromoleculele de colagen imediat învecinate. Respectivul tratament nu introduce punți de reticulare ce includ catenele unor compuși chimici, ci doar așa-numite „punți de reticulare de lungime zero”, stabilite direct între catenele aminoacidice laterale. Consecința tratamentului este o sporire a temperaturii de contracție, dar volumul secțiunii dermei scade, iar țesutul dermic devine mai compact și mai „sec”. Din acest motiv, pielea tratată cu transglutaminază trebuie intens retanată și unsă, pentru a-i reface „volumul”.

Obiectivul investigării efectului asimilabil tăbăcirii, efect indus de transglutaminază, nu este de a stabili o tehnologie de prelucrare a pielii, ci doar acela de a evalua sporul de temperatură de contracție ce poate fi indus pe calea acestui tratament neconvențional. Tabelul II.6. prezintă protocolul de tratare a probelor de piele cu transglutaminază.

Tabelul II.6.: Protocolul cadru pentru tratarea pieilor cu transglutaminază.

Tabelul II.6.: (Continuare)

II.6. Tăbăcirea neconvențională efectuată cu hidrolizat de colagen

Tratamentul probelor de piele cu hidrolizat de colagen reprezintă o pseudotăbăcire organică, realizată prin interacția electrostatică între macromoleculele colagenice ale fibrelor dermei și polipeptidele scurte conținute în hidrolizatul proteic, popipeptide ce au reușit să difuzeze în secțiunea dermei. Tabelul II.7 prezintă protocolul cadru testat.

Tabelul II.7.: Protocolul cadru pentru tratarea pieilor cu soluție de hidrolizat de colagen.

Tabelul II.7.: (Continuare)

II.7. Tăbăcirea neconvențională efectuată cu hidrolizat de colagen, urmată de

tratament cu transglutaminază

În cadrul lucrării s-a testat posibilitatea de a spori temperatura de contracție a dermei pielii printr-un tratament cu transglutaminază, succesiv celui cu hidrolizat de colagen. Protocolul acestui tratament se prezintă în tabelul II.8.

Tabelul II.8.: Protocolul cadru pentru tratarea cu transglutaminază a pieilor anterior tratate

cu hidrolizat de colagen.

Tabelul II.8.: (Continuare)

II.8. Concluzii

Lucrarea a investigat posibilitatea de a induce efecte de tăbăcire (sau asociate tăbăcirii) utilizând agenți tananți neconvenționali, respectiv hidrolizate de colagen și transglutaminază. Criteriul principal avut în vedere a fost sporul temperaturii de contracție în raport cu valoarea determinată pentru pielea inițial prelucrată până la stadiul de piele gelatină picală și apoi depiclată și neutralizată.

Tratamentul cu hidrolizate de colagen nemodificate chimic prezintă un potențial tanant modest, dar exploatabil, în raport cu pieile de bovine tinere, prelucrate prin piclare și uscare în stare piclată, în vederea afânării țesutului dermic.

Tratamentul cu transglutaminază asigură un spor al temperaturii de contracție (deci un efect pseudotanant), dar „volumul” pielii scade semnificativ, ceea ce restrânge posibilitățile de retanare și finisare ulterioare.

Aplicarea unui tratament cu transglutaminază după cel cu hidrolizate de colagen nu conduce la efecte sporite de (pseudo)tăbăcire, probabil din cauza blocării posibilității de difuzie a enzimei în secțiunea dermei pielii în care s-au introdus deja polipeptide.