ORGANISATION CELLULAIRE DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE [308227]

CHAPITRE I

ORGANISATION CELLULAIRE DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE

1.1. La cellule

La cellule peut être définie comme l'unité structurale et fonctionnelle des êtres vivants. La cellule est tout d’abord la plus simple organisation de la matière capable de manifester la vie (Tchala).
Le monde des êtres vivants est subdivisé en deux grands groupes qui sont fondamentalement différents dans leur structure interne et leur organisation générale: les procaryotes et les eucaryotes (Tableau 1.1.).

Les procaryotes (du latin "pro", avant et du grec "karyon", noyau) sont des êtres vivants unicellulaires dont le matériel génétique est organisé dans une zone appelée nucléoïde, zone qui n'est pas séparée du reste de la cellule par une enveloppe nucléaire. Le matériel génétique est formé d’une unique molécule d’ADN, double-[anonimizat]. Il est dépourvu d’une membrane qui le séparerait du cytoplasme environnant. Les procaryotes ne possèdent que très rarement des organites (par exemple les ribosomes sont présent chez les procaryotes).

TABLEAU 1.1.

Comparaison entre les cellules procaryotes et eucaryotes (d’après Pierce, 2012).

Les eucaryotes ont une organisation complexe et possèdent des nombreux organites cellulaires. Le matériel génétique chez les eucaryotes est enfermé dans un noyau entouré d’une enveloppe nucléaire. Les eucaryotes constituent un très large groupe d’organismes, uni ou pluricellulaires. [anonimizat]ésent chez les mammifères, sont cellules eucaryotes.

Les composants cellulaires avec un rôle génétique sont les structures cellulaires qui remplissent deux conditions de base:

– capacité d'autoreproduction lors de la division cellulaire;

– continuité physique d'une génération à l'autre (Pusta, 2013).

[anonimizat]éoles, [anonimizat].

1.2. Les composants de la cellule avec un rôle génétique

Le domaine des eucaryotes englobe une vaste variété d’ê[anonimizat] (les amibes) aux organismes complexes ([anonimizat] végétaux, les champignons). [anonimizat]ésent chez les mammifères, sont des cellules eucaryotes.

[anonimizat]ée entre 10 et 100 μm. Les eucaryotes possèdent des caractères qui les distinguent radicalement des procaryotes. Les plus évidents sont: la présence d’un noyau entouré d’une enveloppe nucléaire et la présence de divers organites cellulaires (Figure 1.1.).

La membrane cellulaire est une enveloppe extérieure qui définit la cellule en la limitant. Elle la protège tout en lui servant de moyen d’échanges vitaux avec le milieu extérieur. La membrane cellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation des échanges de matière entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule ou entre deux compartiments cellulaires.

Le cytoplasme cellulaire ou hyaloplasme c’est le corps même de la cellule contenu dans le volume de la membrane plasmique. Il est fait d’eau salée riche en molécules organiques (protéines, glucides, lipides, ARN, etc.) et d’éléments figurés appelés organites cytoplasmiques variables d’une cellule à une autre: ribosomes, ré[anonimizat], appareil (corps) [anonimizat], dictyosomes, lysosomes, peroxysomes, [anonimizat] sécrétion, lamelles chlorophylliennes, etc. Les organites accomplissent des fonctions physiologiques spécialisées et permettent à la cellule de gérer la diversité et la complexité des réactions métaboliques (Callen, 2005).

Fig. 1.1. Schéma de l’ultrastructure d’une cellule animale eucaryote typique.

(http://www.vetopsy.fr)

1.2.1. Le noyau

Le noyau est un organite de 5 à 7 micromètres diamètres, et il contient l’essentiel du matériel génétique de la cellule sous la forme d’un complexe ADN–protéines appelé chromatine. Lors de la division cellulaire, la chromatine se condense pour prendre la forme de chromosomes (Figure 1.2.; Figure 1.3.).

L’enveloppe nucléaire est une double membrane (interne et externe) qui délimite le noyau et sépare deux milieux: le cytosol et le nucléoplasme. La membrane externe est en continuité avec le réticulum endoplasmique granuleux ou rugueux (REG) et peut être, comme ce dernier, parsemée de ribosomes sur sa face cytoplasmique. L'espace entre les deux membranes, appelé l'espace périnucléaire, est en continuité avec la lumière (espace interne) du RE.

Les membranes, internes et externes, de l’enveloppe nucléaire fusionnent à intervalles réguliers, formant des pores nucléaires qui rendent possible des échanges, aussi bien dans le sens noyau → cytoplasme que dans le sens cytoplasme → noyau (par exemple la sortie des ARNm (ARN messagers) vers le cytoplasme et l'entrée de nucléotides dans le noyau nécessaire à la synthèse des ARN).

À l'intérieur du noyau se trouvent un ou plusieurs nucléoles. Les nucléoles produisent d’ARNr qui quitte le noyau et se fixe dans la structure des ribosomes, étant fortement impliqués dans la synthèse des protéines.

Le noyau a pour fonction principale de stocker le génome nucléaire ainsi que la machinerie nécessaire à la réplication des chromosomes et à l'expression de l'information contenue dans les gènes.

Fig. 1.2. La structure du noyau

(http://biofaculte.blogspot.com)

Fig. 1.3. Le noyau et les chromosomes

(www.genome.gov)

1.2.2. Le centrosome et les centrioles

Le centrosome est situé à proximité du noyau et intervient dans la division cellulaire (Figure 1.3.). Il est constitué par deux centrioles, chacun entouré de neuf triplets inclinés de microtubules et par un certain nombre de protéines, collectivement appelé matrice péricentriolaire ou MAP (microtubule associated protein). Les deux centrioles sont disposés perpendiculairement et ils ne se touchent pas.

Fig. 1.3. Le centrosome

(https://antranik.org/the-building-blocks-of-cells/)

Le rôle de centrosome dans la division cellulaire consiste dans la formation de l’appareil mitotique.

Avant la division cellulaire le centrosome se duplique et après chaque paire de centrioles se déplace à un pôle de la cellule, formant un aster. Un réseau de microtubules se forme alors entre ces deux extrémités – le fuseau mitotique. Les chromosomes se déplacent à l’aide de ce réseau lors de la division cellulaire durant la métaphase et l’anaphase, c’est-à-dire lors de la ségrégation des chromosomes entre les deux cellules filles.

1.2.3. Les mitochondries

Les mitochondries sont des organites présents dans la majorité des cellules eucaryotes. Elles sont responsables des réactions métaboliques de la respiration cellulaire qui aboutissent à la fabrication d’énergie sous forme d’ATP. C’est pour cette raison qu’on les compare souvent à des «centrales électriques de la cellule».

L'ensemble des mitochondries d'une cellule constitue ce que l'on appelle le chondriome.

Au cours de l'évolution, les mitochondries ont conservé leur propre génome, qui, bien que très réduit par rapport à celui d'une bactérie, est essentiel au bon fonctionnement de ces organites. Confiné à l'intérieur des mitochondries, le génome mitochondrial (ADNmt) est distinct de l'ADN contenu dans le noyau (Figure 1.4.). La transmission de cet ADN est généralement dite non mendélienne car il est uniquement transmis par la mère.

Fig. 1.4. Organisation d'une mitochondrie.

a. Coupe; b. Représentation schématique en trois dimensions

c. Détail d'une crête montrant les particules pédonculées d'ATPase de la membrane interne.

(http://svt.tice.ac-orleans-tours.fr)

Le génome mitochondrial est particulièrement utilisé en génétique des populations ou en agronomie, comme marqueur génétique pour la biologie évolutive (“marqueur direct et non ambigu de la généalogie maternelle et de la structuration géographique au sein d’une espèce, ainsi que des échanges génétiques entre populations, entre sous-espèces” (Boursot et Bonhomme, 1986). Il se distingue du reste du génome des cellules eucaryotes par son asexualité, qui est à l'origine du phénomène de “stérilité mâle cytoplasmique”.

!!! Les mitochondries ont deux rôles principaux: rôle énergétique et rôle génétique dans l’hérédité extranucléaire.

1.2.4. Les ribosomes

Les ribosomes ont été découverts par le biologiste George Emil Palade, qui a reçu le prix Nobel en 1974 pour sa découverte. Ils sont présents dans le cytoplasme chez tous les deux types de cellules, procaryotes et eucaryotes, à l'exception des globules rouges adultes.

Les ribosomes sont des organismes cellulaires qui peuvent être libres dans le cytoplasme ou peuvent être attachés à toutes les surfaces membranaires dans la cellule. Les différences entre les ribosomes libres et ceux attachés aux organites membranaires ne sont que spatiales. En ce qui concerne la structure et la fonction, ils sont identiques. Les ribosomes ont une forme approximativement sphérique, avec un diamètre d'environ 20 nm et ne sont visibles qu'au microscope électronique. Ils peuvent représenter jusqu'à 25% du poids sec des cellules présentant une synthèse protéique intense, telles que les cellules pancréatiques (Pusta, 2013).

Ce sont des éléments complexes, formés de protéines et d’acide ribonucléique (ARNr) et sont souvent groupés en amas qu’on appelle polyribosomes ou polysomes. Leur rôle est de synthétiser les protéines en assurant la traduction de l’information génétique portée par l’ARN messager. Les ribosomes des procaryotes ont 70S (Svedberg, unité de sédimentation) et des eucaryotes ont 80S.

Les ribosomes sont constitués de deux sous-unités, la petite sous-unité et la grande sous-unité. Ces deux sous-unités s’assemblent et forment, à leur interface, une “tête de lecture” capable de décoder l’ARN messager (pour traduire la chaîne d'ARNm en une chaîne polypeptidique, pendant la synthèse des protéines) (Figure 1.5.).

La petite sous-unité est responsable de la formation du complexe d'initiation de la traduction, accomplit le décodage de l'information génétique et contrôle la fidélité des inter-réactions codon-anticodon.

La grande sous-unité catalyse la formation de liaisons peptidiques et fournit la voie de synthèse de la chaîne polypeptidique naissante.

!!! Les ribosomes sont des organites dans lesquels se produit la synthèse des protéines.

Fig. 1.5. Les ribosomes

(https://ed414-openlab.unistra.fr)

L’ARN messager est lu par série de trois nucléotides, qu’on appelle codon ou triplet, de telle sorte qu’à un codon donné correspond un acide aminé. C’est ce qu’on appelle le code génétique.

Ainsi, lorsque le ribosome lit l’enchaînement GGC (Guanine-Guanine-Cytosine), il sait qu’il devra insérer une glycine dans la protéine. Celle-ci lui sera apportée par l’intermédiaire d’un ARN de transfert (noté ARNt), spécifique pour cet acide aminé et ce codon. A chaque acide aminé peuvent correspondre plusieurs codons et un ou plusieurs ARNt.

La fin de la traduction de l’ARN messager est dictée par la présence d’un codon spécial, appelé codon stop (classiquement il en existe 3, UAA, UAG et UGA), qui correspond simplement à un signal d’arrêt pour le ribosome car il n’existe aucun ARNt pouvant décoder ces codons. La protéine nouvellement formée est alors libérée dans la cellule (Figure 1.6.).

Fig 1.6. Processus de traduction de l'ARN en protéine par le ribosome.

(https://ed414-openlab.unistra.fr)

1.2.5. Le réticulum endoplasmique (RE)

Le réticulum endoplasmique est une structure qu'on ne rencontre que chez les cellules eucaryotes. Le réticulum endoplasmique (RE) est un réseau étendu et complexe d'un assemblage de saccules et tubules aplatis délimités par une seule membrane unitaire. Il constitue un élément essentiel du réseau membranaire interne des cellules (système endomembranaire), en continuité avec la membrane nucléaire externe et en relation avec les autres compartiments, notamment les vésicules de l'appareil de Golgi.

Une partie de la surface du RE est couverte de ribosomes qui assemblent les acides aminés en chaînes protéiques suivant l'information venue du noyau. L'apparence rugueuse de ces parties au microscope électronique leur vaut la qualification de RE granuleux (REG). Les parties sans ribosomes sont appelées RE lisse (REL). Les ribosomes sur le REG synthétisent des polypeptides qui sont dirigés directement dans la lumière (le lumen) du RE, où elles forment les protéines. Les protéines formées sont stockées, transportées et libérées par l'appareil de Golgi.

La quantité de REL et de REG varie selon les cellules. De même la proportion de REG par rapport à celle de REL varie aussi selon l'état d'activité de la cellule, selon les besoins en protéosynthèse de la cellule. Les REG et REL ont des fonctions différentes mais ces deux éléments constituent des compartiments en constante évolution dynamique.

L'information codée dans les séquences d'ADN dans le noyau est transcrite en ARN messager. L'ARNm quitte le noyau à travers ses pores et pénètre/atteint dans le cytoplasme. Au niveau du REG, l'ARNm est traduit en protéines. Ces protéines sont ensuite transférées dans l'appareil de Golgi dans les vésicules de transport, où elles sont ensuite traitées en lysosomes, peroxysomes et vésicules sécrétoires.

Les autres composants cellulaires n'ont aucun rôle génétique mais jouent un rôle important dans la vie cellulaire et seront, donc, présentés ci-dessous.

1.2.6. L’appareil de Golgi

L'appareil de Golgi est un organite cellulaire, constitué par des empilements de saccules, qui se trouve à proximité du noyau et du réticulum endoplasmique. Un des rôles majeurs de l'appareil de Golgi est lié à des phénomènes d'exocytose. Il est le point de passage obligé et régulateur du trafic vésiculaire. L'appareil de Golgi régule le nombre de vésicules allant à la membrane et participe au renouvellement membranaire. Il entraîne des modifications post-traductionnelles des protéines. Les protéines sécrétoires sont très souvent modifiées dans l’appareil de Golgi par addition de groupements spécifiques et sont ensuite dirigées vers leur localisation propre (Prescott et al., 2003, p.80).

1.2.7. Le cytosquelette

Le cytosquelette est un ensemble d’éléments présent dans le nucléoplasme et le cytoplasme des cellules eucaryotes. Il est responsable, entre autres, de la forme interne et externe de la cellule, des mouvements cellulaires et du transport de différents organites ou vésicules à l’intérieur de la cellule.

1.2.8. Les lysosomes

Les lysosomes sont des organites cellulaires présents dans le cytosol de presque toutes les cellules eucaryotes. Ils ont pour fonction d’effectuer la digestion intracellulaire grâce à des enzymes.

1.2.9. Les peroxysomes

Les peroxysomes sont des organites cellulaires entourés par une membrane simple, renfermant des enzymes qui catalysent la production et la décomposition de l’eau oxygénée, c’est-à-dire le peroxyde d’hydrogène H2O2. Leur principale fonction est l’élimination des radicaux libres produits par l’oxygène dans la cellule.

1.3. Le cycle cellulaire

Le cycle cellulaire représente l’histoire de la vie d’une cellule, de la division de sa cellule mère jusqu’à sa propre division (Pierce, 2012). Un nouveau cycle commence quand une cellule s’est divisée et a produit deux nouvelles cellules. La progression dans cycle cellulaire est contrôlée à des points clés appelés points de contrôle.

1.3.1. Phases du cycle cellulaire

Le cycle cellulaire comporte deux phases principales: l’interphase, la période entre les divisions cellulaire, pendant laquelle la cellule croît, se développe, et se prépare à la division et la phase M (phase mitotique/méiotique), la période de la division active. La phase M comprend la mitose/ la méiose, le processus de division du noyau, et la cytodiérèse ou division cytoplasmique.

L’interphase est la plus longue période du cycle cellulaire qui est caractérisée par un accroissement du volume cellulaire, la cellule transcrit ses gènes et les chromosomes sont dupliqués. L'interphase est le moment où la cellule vit et effectue tout ce pourquoi elle est programmée.

Elle peut être subdivisée en plusieurs phases (Figure 1.7.):

1. La phase G1 (de l’anglais GAP = intervalle), au cours de laquelle la cellule effectue son métabolisme normal, elle grossit jusqu’à atteindre une taille critique qui va donner le signal pour passer à la phase S, et effectue les fonctions pour lesquelles elle est programmée génétiquement: production d’ARN, biosynthèse des protéines etc.

C’est aussi la mise en place du processus qui va lui permettre de répliquer son ADN, au cours de la phase suivante. Le point de contrôle G1 détermine si son matériel génétique ne comporte pas d’erreur et donc si la cellule peut ou non passer en phase S.

2. La phase G0 est une issue possible du point de contrôle en fin de G1, alternative à la poursuite de la phase G1 et au passage à la phase S. Elle est une phase de quiescence. La phase G0 peut être temporaire ou permanente. Chez les mammifères, les cellules terminales différenciées, hautement spécialisées, telles que les hématies, les neurones, les pneumocytes de type I, les myocytes des muscles squelettiques, les ostéocytes passent définitivement en phase G0 après s’être différenciés. Les cellules stem, les hépatocytes adulte et les cellules dermiques profondes peuvent passer réversiblement de G0 à G1 et peuvent reprendre la division cellulaire sous l'action de divers facteurs environnementaux externes, nuisibles. Cependant, ils sont de cellules qui n'entrent jamais en phase G0, et continuent de se diviser tout au long de la vie de l'organisme (les cellules épithéliales).

3. La phase S (de l'anglais synthesis, à cause de la synthèse de nouvelles molécules d’ADN), au cours de laquelle le matériel chromosomique est doublé par réplication de l’ADN. Cette étape permet de former deux molécules d’ADN à partir une seule molécule initiale. Pendant les quatre heures, en moyen, que dure cette phase, l’ADN va être entièrement répliqué, grâce à l’ADN polymérase. Au début de la phase le chromosome est fait d'une chromatide et en fin de phase le chromosome sera composé de deux chromatides. Ces deux chromatides sont assemblées au centromère.

4. La phase G2, où la cellule se prépare à se diviser, la croissance de la cellule est terminée. Pendant cette phase, les centrosomes se répliquent, ils permettront le bon déroulement de la division cellulaire. Cette phase se termine en passant le point de contrôle G2, où la division commence.

À l'issue de cette phase, chaque chromosome est parfaitement identique à son homologue sur le plan morphologique et du point de vue des gènes présents, mais chaque gène n'est pas nécessairement identique à son homologue, puisque généralement plusieurs allèles existent.

5. La phase M est la période de la division active pendant laquelle les chromosomes se séparent et la cellule se divise. La phase M comprend la mitose ou la méiose, le processus de division du noyau et la cytodiérèse ou division cytoplasmique.

Fig. 1.7. Le cycle cellulaire – l’interphase et la phase M

(d’après Pierce, 2012)

Légende : 1. Durant G1, la cellule croît

2. Les cellules peuvent entre en G0, une phase de quiescence

3. La cellule est irréversiblement engagée dans la division

4. L’ADN est dupliqué

5. La cellule se prépare à la mitose

6. La cellule peut se diviser

7. La mitose/la méiose et la cytodiérèse ont lieu durant la phase M

Interphase – croissance de la cellule

Phase M – division du noyau et de la cellule

ACTIVITES PRATIQUES

1. Entraînez-vous à représenter graphiquement les composants de la cellule avec rôle génétique.

2. Entraînez-vous à représenter graphiquement les phases du cycle cellulaire.

3. Entraînez-vous à représenter graphiquement la quantité d'ADN en fonction du temps, pendant un cycle cellulaire.

1.4. La division cellulaire

1.4.1. La division des cellules somatiques (la mitose) et conservation de l'information génétique

La phase M (mitotique) est la période du cycle cellulaire pendant laquelle les chromosomes (en fait, les chromatides sœurs) se séparent et la cellule se divise. La séparation des chromatides sœurs est un processus essentiel qui transmet un jeu complet d’information génétique à chacune des cellules filles.

La mitose est un processus continu, sans pauses, et ce n'est que d'un point de vue pédagogique qu'elle est présentée en plusieurs phases et parfois en sous-phases.

Didactique, la phase M est divisée en cinq stades: les quatre stades de la mitose (prophase, métaphase, anaphase, et télophase), et la cytodiérèse (Figure 1.8.).

La prophase. Pendant l’interphase, les chromosomes sont à l’état relâché et se présentent comme de la chromatine diffuse. Les chromosomes se condensent pendant la prophase et deviennent visibles au microscope optique. Chaque chromosome contient deux chromatides, suite à sa duplication pendant la phase S qui a précédé. Le fuseau mitotique se forme; c’est un système organisé de microtubules qui va déplacer les chromosomes à la mitose. Dans les cellules animales, le fuseau se développe à partir d’une paire de centrosomes qui migrent vers les extrémités opposées de la cellule. À l’intérieur de chaque centrosome se trouve un organite spécialisé, le centriole. La membrane nucléaire et les nucléoles se désagrègent.

La métaphase. Au milieu de cette phase, les chromosomes sont attachés par le centromère (kinétochor) aux microtubules du fuseau mitotique et s’alignent dans un plan équatorial (plan central), à équidistance des deux centrosomes qui se trouvent à présent aux extrémités opposées de la cellule, formant la plaque équatoriale ou la plaque métaphasique. Les microtubules s’étendent depuis les pôles du fuseau et se rencontrent dans le plan équatorial. C'est en métaphase que les chromosomes deviennent les mieux visibles. C'est à ce stade qu'on peut réaliser un CARYOTYPE grâce à la grande condensation des chromosomes.

L’anaphase commence quand les chromatides sœurs se séparent et migrent vers les pôles opposés du fuseau. Pendant cette phase se produit le clivage longitudinal des centromères (kinétochore) et la disjonction des chromatides sœurs. Les chromatides séparées sont considérées comme des chromosomes à part entière, qui formeront les noyaux des futures cellules filles.

À la télophase les chromosomes arrivent à proximité des pôles du fuseau. Une membrane nucléaire se reforme autour de chaque jeu de chromosomes, créant deux noyaux distincts dans la cellule. Les chromosomes se décondensent et s’allongent, reprenant un aspect diffus non visible au microscope et les fibres du fuseau disparaissent. Les moments de prophase sont repris, mais en sens inverse: la membrane nucléaire / cellulaire et les nucléoles se réorganisent.

Dans de nombreux types cellulaires, la division du cytoplasme se produit simultanément à la télophase. Un anneau contractile émergeant du milieu de la cellule mère assure la division cytoplasmique, un processus appelé cytodiérèse suivi par cytokinèse.

Fig. 1.8. La mitose

(d’après Pierce, 2012)

1.4.1.1. Conséquences génétiques du cycle cellulaire

La mitose assure, premièrement, le maintien constant du nombre de chromosomes dans toutes les cellules somatiques d’un organisme et, deuxièmement, assure la continuité génétique des cellules de l’organisme, en réalisant la préservation du génotype individuel.

Toutes les cellules de l'organisme, dérivées de zygote (cellule œuf), sont identiques en ce qui concerne l'information génétique.

!!! La mitose, caractéristique des cellules somatiques, consiste en une division nucléaire unique qui est généralement accompagnée d’une seule division cellulaire. Après la mitose, le nombre de chromosomes dans les cellules nouvellement formées est identique à celui de la cellule d’origine. Enfin, la mitose produit des cellules identiques de point de vue génétique (Tableau 1.2).

ACTIVITES PRATIQUES

1. Entraînez-vous à représenter graphiquement la mitose.

1.4.2. La formation des cellules sexuelles (méiose) et la recombinaison de l'information génétique

La méiose est une division particulière impliquée dans la reproduction sexuée des organismes: elle aboutit en effet à la production des cellules sexuelles ou gamètes au cours du processus de gamétogenèse (spermatogenèse chez les mâles, ovogenèse chez les femelles).

La méiose, qui consiste en deux divisions successives sans réplication d'ADN entre elles, permet le passage d'une cellule diploïde à 2n chromosomes (une gonie: spermatogonie ou ovogonie) à quatre cellules haploïdes à n chromosomes (les gamètes: spermatozoïdes ou ovocytes). La production de ces gamètes haploïdes permet lors de la fécondation de restaurer le nombre de chromosomes caractéristique de l'espèce.

Comme la mitose, la méiose est précédée d’une interphase qui comprend des stades G1, S et G2. La méiose comprend deux processus distincts, la méiose I et la méiose II, qui comprennent chacune une division cellulaire (Figure 1.9.).

La première division est appelée division réductionnelle parce qu’elle réduit de moitié le nombre de chromosomes (2n → n).

La seconde division est appelée division équationnelle car le nombre de chromosomes est constamment maintenu tout au long de cette étape (n → n). Les stades de la méiose II sont similaires à ceux de la mitose. Toutefois, la méiose II diffère de la mitose en ce sens que le nombre de chromosomes a déjà été réduit de moitié pendant la méiose I, les chromosomes sont recombinés et que la cellule ne commence pas avec le même nombre de chromosomes qu’à la mitose.

Après une méiose, les cellules ne doivent contenir qu'un seul élément de chaque paire de chromosomes homologues, c'est-à-dire la moitié du nombre initial de chromosomes (cellules haploïdes à n chromosomes).

Entre ces deux divisions (méiose I et méiose II), il n'y a pas de réplication d'ADN supplémentaire. Au final, on obtient 4 cellules haploïdes à n chromosomes, les gamètes.

Fig. 1.9. La méiose comporte deux divisions cellulaires

(d’après Pierce, 2012)

1.4.2.1. La première division méiotique (la division réductionnelle)

Elle comporte les quatre phases de toute division cellulaire mais néanmoins présente des particularités.

La prophase I. L'enveloppe nucléaire est désorganisée. Les chromosomes bichromatidiens (doubles) s’individualisent par condensation de leur ADN à partir de la chromatine du noyau. Ils apparaissent doubles car formés chacun de deux chromatides. Ils s’associent ensuite par paires de chromosomes homologues, aussi appelées bivalents (car 2n chromosomes homologues). Cet appariement donne des tétrades (car 4 chromatides). Cette phase est divisée en cinq étapes qui correspondent à cinq états caractéristiques de la chromatine: leptotène, zygotène, pachytène, diplotène et diacinèse.

Leptotène (du grec lepto-, mince, et -tène, bandelette). Les chromosomes apparaissent très fins, très flexueux et très longs. Au microscope électronique les chromosomes sont bien dupliqués et donc la phase S a déjà eu lieu et les chromatides s'associent par chromatides sœurs. Au microscope optique, les chromosomes apparaissent à partir d'une seule chromatide appelée chromonéma. La seconde chromatide synthétisée n'est pas visible car elle est incolore. Sur la longueur des filaments chromonémiques, il y a une séquence régulière de granules, intensément colorés, appelés chromomères, qui sont des zones plus spiralées.

Zygotène (du grec zygo-, liaison entre deux éléments). Il est un stade long pendant lequel les chromosomes homologues s’apparient et des crossing-over se produisent. D’abord, les chromosomes se condensent, s’apparient et entrent en synapsis, une association latérale très étroite. Chaque paire de chromosomes homologues en synapsis contient quatre chromatides et est appelée un bivalent ou une tétrade. Les chromosomes se raccourcissent et s’épaississent et un complexe synaptonémique se développe entre les homologues apparies. Des crossing-over se produisent, au cours desquels les chromosomes échangent réciproques de l'information génétique. Les centromères des chromosomes appariés s’écartent et les homologues restent associés par des chiasmas qui sont la manifestation visible des crossing-over (Figure 1.10.).

Pachytène (du grec pachy-, épais). La pachytène c’est la phase la plus longue, elle dure environ 2 semaines pour des spermatozoïdes humains. Il s’agit d’un appariement totale, strict des chromosomes homologues et apparition des nodules de recombinaison (intra-chromosomique), qu’ils interviennent dans les échanges chromosomiques. Ces échanges aboutissent à la formation d'enjambements entre les deux chromatides non-sœurs, c'est-à-dire l'une de chacun des deux chromosomes homologues appariés. Bien qu'invisibles au stade pachytène, chacun de ces enjambements apparaîtra plus tard sous la forme d'un chiasma. Cette phase a une importance considérable dans le brassage chromosomique (crossing-over).

Fig. 1.10. Le crossing-over

(d’après Pierce, 2012)

Légende : 1. Un chromosome porte les allèles A et B

2. Le chromosome homologue porte les allèles a et b

3. La réplication de l’ADN pendant la phase S produit des chromatides sœurs identique

4. À la prophase I, des segments des chromatides non sœurs sont échangés lors du crossing-over

5. Après les méioses I et II chacun des cellules de la descendance contient une combinaison unique d’allèles.

Diplotène (du grec diplo-, double). Cette phase est caractérisée par la séparation des chromosomes homologues (désynapsis), mais les chromosomes restent attachés en plusieurs points au niveau desquels deux des quatre chromatides semblent s'entrecroiser (recombinaison intra-chromosomique; chiasma). Pour le bon déroulement de la méiose il en faut au minimum un par chromosome, en moyenne 2-3. Il y a décondensation de la chromatine et formation des grandes boucles permettant un fort taux de transcription. Cette étape de la prophase I peut durer plusieurs années chez l'ovocyte.

Diacinèse (du grec dia-, à travers). Les chiasmas glissent vers les extrémités des chromosomes au fur et à mesure que les composants du complexe se séparent, de sorte que les homologues ne soient plus associés qu’à leurs extrémités. À la fin de la prophase I, la membrane nucléaire disparaît et le fuseau se forme.

Lors de la prophase, une séparation des centrosomes s'effectue. Ainsi, 2 centrosomes génèrent des fuseaux de fibres entre eux et s'éloignent l'un de l'autre.

La métaphase I débute lorsque les paires de chromosomes homologues s’alignent le long du plan équatorial. La condensation des chromosomes est maximale, les bivalents se disposent de façon aléatoire au niveau de la plaque équatoriale de la cellule, on appelle ce phénomène la ségrégation aléatoire. Un microtubule d’un des pôles s’attache à un des chromosomes d’une paire, et un microtubule de l’autre pôle s’attache à l’autre membre de la paire. Les deux chromosomes de chaque paire se font face, car les centromères sont disposés de part et d'autre de cette plaque.

L’anaphase I est marquée par la séparation des chromosomes homologues. Les deux chromosomes d’une paire sont attirés vers les pôles opposés. Bien que les chromosomes homologues se séparent, les chromatides sœurs restent attachées et migrent ensemble. Il se constitue deux lots de n chromosomes à deux chromatides vers chacun des pôles de la cellule. Il n'y a pas de division des centromères. Les chromosomes homologues sont tirés chacun vers un pôle différent, au hasard.

À la télophase I, les chromosomes arrivent aux pôles du fuseau et le cytoplasme se divise. C'est la formation de deux cellules haploïdes à n chromosomes doubles.

!!! Une cellule qui avait au départ 2n chromosomes à 2 chromatides (donc elle était diploïde) a donné naissance à 2 cellules filles qui n'ont plus que n chromosomes toujours à 2 chromatides, donc à 2 cellules haploïdes. C'est la raison pour laquelle la première division de méiose est qualifiée de réductionnelle et c'est cette réduction du nombre des chromosomes qui va permettre la conservation du nombre de l'espèce au moment de la fécondation (Tableau 1.2).

1.4.2.2. La deuxième division méiotique (la division équationnelle)

Elle a toutes les caractéristiques de la mitose, mais n'est pas précédée d'une interphase. Elle produit à partir d’une cellule à n chromosomes doubles, deux cellules à n chromosomes simples. L’intervalle entre la mitose I et la mitose II est appelé l’interkinése. Une membrane nucléaire se reconstitue autour des chromosomes rassemblés à chaque pôle, le fuseau se dégrade et les chromosomes se relâchent (Tableau 1.2.).

La prophase II. Elle est presque identique à la prophase I, mais les chromosomes sont déjà sous forme condensés donc il n'y a pas cette mise en place que l'on avait en prophase I; le fuseau se reforme; l’enveloppe nucléaire se dégrade à nouveau.

La métaphase II. Les chromosomes individuels s’alignent dans le plan équatorial et leurs chromatides sœurs font face aux pôles opposes. La métaphase II est semblable à la métaphase mitotique.

À l’anaphase II, les kinétochores des chromatides sœurs se séparent et les chromatides sont attirées vers les pôles opposés. Chaque chromatide est désormais un chromosome à part entière.

À la télophase II, les chromosomes arrivent aux pôles du fuseau, une enveloppe nucléaire se reforme autour d’eux, et le cytoplasme se divise. Les chromosomes se relâchent et cessent d’être visibles. Les quatre cellules haploïdes issues de la méiose possèdent n chromosomes simples monochromatidiques (Figure 1.11.).

!!! La méiose permet de réduire de moitié le contenu génétique d'une cellule (2n => n); de brasser l'information génétique (recombinaisons et répartition au hasard des chromosomes) et de transmettre l'information génétique à la génération suivante.

Fig. 1.11. La méiose

(d’après Pierce, 2012)

Légende : 1. Le crossing-over se produit

2. Les chromosomes homologues s’alignent par paires dans le plan équatorial

3. Les paires de chromosomes se séparent

4. Les chromosomes s’alignent de façon individuelle

5. Les chromatides se séparent

TABLEAU 1.2.

Comparaison entre la mitose et la méiose (d’apres, Pierce, 2012)

1.4.2.3. Le rôle de la méiose

Le rôle de la méiose est d'assurer la variabilité génétique et de réduire de moitié le nombre de chromosomes nécessaires à la formation de gamètes.

Même si tous les individus d'une même espèce ont en commun le même nombre de chromosomes, chacun est unique dans sa séquence d’ADN. Cette variabilité génétique a pour origine principale les mutations, le hasard de la méiose et de la fécondation, ainsi que le crossing-over.

Le hasard de la méiose et de la fécondation. Le génome contenu dans un gamète est le fruit du hasard de la distribution de chacun des 2 chromosomes des n paires contenues dans les cellules souches. Ce hasard est doublé de celui de la rencontre d’un gamète mâle et d’un gamète femelle lors de la fécondation.

Le crossing-over est représenté par de nombreux échanges de brins de chromatine entre les chromosomes d’une même paire, lors de la méiose. Ces échanges entraînent une forte augmentation de la variabilité des assemblages de gènes transmis par un chromosome.

1.4.2.4. Particularités de la méiose pendant la gamétogenèse chez les mammifères

La gamétogenèse représente le processus de formation des gamètes. La production de gamètes chez un animal mâle, appelée spermatogénèse, a lieu dans les testicules. La production de gamètes chez l’animal femelle, appelée ovogénèse, a lieu dans les ovaires. Par la gamétogenèse deux types de cellule haploïdes à n chromosomes sont produits : les spermatozoïdes (gamète male) par spermatogenèse et les ovules (gamètes femelles) par ovogenèse.

Chez les mâles, la méiose commence par la spermatogenèse, en le même temps avec la maturité sexuelle, puis se poursuit tout au long de la vie. La cellule d'origine est la spermatogonie diploïde (2n), qui produit 8 spermatozoïdes (n) à la fin de la méiose; et chaque spermatocyte primaire produit un total de quatre spermatides haploïdes qui vont se différencier en spermatozoïdes.

Chez les femelles, la méiose commence au cours de la vie fœtale, est interrompue pendant le diplotène et est reprise ensuite dans la vie postnatale, en le même temps avec l'apparition de cycles d'œstrales. Chez les femelles, la méiose est donc cyclique. De l'ovocyte primaire (2n), au début de la méiose, il en résulte un seul ovocyte secondaire (n). Cela est dû au fait qu’à la fin de chaque méiose, une seule cellule fille est fonctionnelle, l’autre dégénère et s’appelle le globe polaire. Donc, l’ovogénèse produit un seul gamète mature au départ de chaque ovocyte primaire (Pierce, 2012).

Fig. 1.12. Formation des gamètes chez les animaux

(Gamétogénèse mâle – spermatogénèse / Gamétogénèse femelle – ovogénèse)

(www.bio.miami.edu)

ACTIVITES PRATIQUES

1. Entraînez-vous à représenter graphiquement le crossing-over.

2. Entraînez-vous à représenter graphiquement la méiose I (réductionnelle) et la méiose II (équationnelle).

PROBLEMES DE GENETIQUE

1. La phase du cycle cellulaire dans laquelle chaque chromosome est composé de deux chromatides afin de la mitose est :

S c) G2

M d) G1

2. Quelle séquence du cycle cellulaire est commune pour toutes les cellules eucaryotes?

G1 – M- G2- S

G1 – S- M- G2

G1 – S – G2 – M

G1 – G2 – S – M

3. La première étape de la mitose quand les chromosomes commencent à devenir visibles au microscope s'appelle:

a) Prophase

b) Télophase

c) Métaphase

d) Anaphase

4. Lequel des énoncés suivants N'EST PAS VRAI pour la mitose?

a) un seul noyau donne naissance à deux noyaux identique

b) les centromères se divisent à anaphase

c) les chromosomes homologues se lient dans la prophase

d) les noyaux fils sont génétiquement identiques aux les noyaux paternels

5. Lequel des énoncés suivants est unique à la mitose et NON une partie de la méiose?

a) les paires de chromosomes homologues forment des bivalents

b) les chromosomes homologues présentent le crossing-over

c) les chromosomes homologues se trouve de manière indépendante

d) la séparation de chromatides en anaphase.

6. Après la mitose, les cellules filles d'une personne adulte auront chacune un total de ……….. chromosomes. Après la méiose I, les deux cellules filles seront avec……….. chromosomes et …….. chromosomes après la méiose II.

23, 23, 23

46, 12, 12

46, 23, 12

46, 23, 23

7. Le processus de la méiose produit quatre cellules filles avec des chromosomes différents. Cette diversification chromosomique se produit dans:

a) la métaphase II

b) la prophase II

c) la prophase I

d) la télophase I

8. Le stade de la méiose quand les cellules deviennent haploïdes est:

a) l’anaphase II

b) l’anaphase I

c) la prophase I

d) la prophase II

9. Une de processus qui est caractéristique pour la méiose et se produite dans la prophase I est:

a) la désintégration de la membrane nucléaire

b) la marche des chromosomes vers la plaque équatoriale

c) l’appariement des chromosomes homologues

d) la condensation de la chromatine

10. Quel est le nombre de chromosomes qui ont les cellules épidermiques et les gamètes du le mêmes animal?

2n; 2n

2n; n

n; 2n

n; n.

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

11. Dans quelle phase du cycle cellulaire, la cellule synthétise l'ARN et des protéines?

a) G2 c) M

b) G1 d) S

12. Dans quelle phase de la méiose les chromosomes homologues s'associent bord à bord parallèle sur toute leur longueur, le processus est appelé conjugaison ou synapsis?

Leptotène

Zygotène

Diplotène

Pachytène

13. Dans quelle phase de la division méiotique les chromosomes homologues forment une unité appelée bivalent (tétrade)

Leptotène

Zygotène

Diplotène

Pachytène

14. Méiose I commence avec ………. chromosomes bichromatidiques et va finir avec ……….. chromosomes bichromatidiques, et la méiose II, commence avec ………… chromosomes bichromatidiques et va finir avec ……………………… chromosomes monochromatidiques.

n; 2n; 2n; n

2n; 2n; n; n

2n; n; n; n

d) 2n; 2n; 2n; n.

15. Dans la division méiotique se produise :

a) une seule division de noyau et deux duplications de l’ADN

b) une division du noyau et une seule duplication de l’ADN

c) deux divisions de noyau et une seule duplication de l’ADN

d) deux divisions du noyau et deux duplications de l’ADN

16. Une cellule a 12 chromosomes en G1 de l’interphase. Combien de chromosomes et de molécules d’ADN par cellule y aura-t-il quand la cellule d’origine passera par les stades suivants?

a) G2 de l’interphase

b) Métaphase I de la méiose

c) Prophase de la mitose

d) Anaphase I de la méiose

e) Anaphase II de la méiose

f) Prophase II de la méiose

g) Apres la cytodiérèse qui suit la mitose

h) Apres la cytodiérèse qui suit la méiose II

17. La quantité d’ADN par cellule d’une espèce particulière est mesurée dans les cellules à différents stades de la méiose, et les quantités suivantes sont obtenues :

Quantité d’ADN par cellule

……3,7 pg …….7,3 pg ……..14,6 pg

Associez les quantités d’ADN ci-dessus aux stades correspondants du cycle cellulaire (da a à f dans la liste ci-dessous). Vous pouvez associer plus d’un stade à chaque quantité d’ADN.

Stades de la méiose:

a) G1

b) Prophase I

c) G2

d) Apres la télophase II et cytodiérèse

e) Anaphase I

f) Metaphase II

18. Complétez le tableau suivant, en remplissant les espaces appropriés

19. Une cellule subit 5 mitoses successives. Quel sera le nombre de cellules formées?

a) 4 cellules

b) 8 cellules

c) 16 cellules

d) 32 cellules

e) 64 cellules

20. Au cours de la division cellulaire, à partir de quelle structure le fuseau s’organise-t-il? A partir:

a) des lysosomes

b) des nucléoles

c) des mitochondries

d) de la membrane cellulaire

e) du centrosome et de ses centrioles

21. Quel/s phénomène/s permet/tent l’obtention de deux cellules-filles possédant chacune le même nombre de chromosomes de la cellule-mère?

a) la duplication de l’ADN nucléaire

b) le dédoublement des chromosomes de la cellule-mère

c) la division du cytoplasme en deux portion

d) les 3 réponses précédent forment un «tout» nécessaire

e) aucune de réponses proposées

22. Les chromosomes sont principalement constitués de:

a) ARN : acide ribonucléique

b) ATP : adénosine triphosphorique (ou triphosphate)

c) ADN : acide désoxyribonucléique

d) STP : le triphosphate de soufre

e) aucune de réponses proposées

23. Après avoir subi une mitose, que formera une cellule en interphase ayant 12 chromosomes ? Elle formera :

a) 1 cellule possédant 12 chromosomes

b) 2 cellules ayant chacune 6 chromosomes

c) 1 cellule ayant 12 paires de chromosomes

d) 2 cellules ayant chacune 24 chromosomes

e) 2 cellules ayant chacune 6 paires de chromosomes

24. Si les enfants reçoivent la moitié de leurs gènes d’un de leurs parents et l’autre moitié de l’autre parent, pourquoi les frères et sœurs ne sont-ils pas identique?

CHAPITRE II

L’ÉTUDE DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE NUCLÉAIRE

2.1. Les chromosomes

Les chromosomes sont des structures tres fins visibles pendant la division cellulaire et ils sont constitué de molécules d'ADN et de protéines. Ils portent les gènes, qui sont transmis des cellules mères aux cellules filles lors des divisions cellulaires. Les chromosomes sont porteurs de l'information génétique. Les gènes représent les principales régions fonctionelles de l’ADN (Griffiths et al., 2013).

L’étude des chromosomes et l’étude de la division cellulaire font l'objet de la cytogénétique.

2.1.1. La formation des chromosomes

Les chromosomes sont des structures visibles pendant une courte période du cycle cellulaire, représenté par la division cellulaire. Ils représentent la forme la plus condensées que peut prendre une molécule d'ADN. Entre chaque division, les molécules d'ADN se décondensent et elles constituent dans leur ensemble la chromatine du noyau interphasique. Au moment d'une division cellulaire (aussi bien mitose que méiose), après s'être dupliquée, chaque molécule d'ADN se condense et devient visible au microscope sous la forme d'un chromosome. La chromatine représente la forme décondensée des chromosomes, tandis que les chromosomes représentent la forme condensée de la chromatine, les deux états étant interchangeables. L'étude des chromosomes se fait en métaphase où les chromosomes sont condensés au maximum.

Les chromosomes monochromatidiques sont formés d’une molécule d’ADN (acide désoxyribonucléique) et des protéines (les histones). L’ADN est une molécule formée de bases puriques double cycle (A – Adénine, G – Guanine) et de bases pyrimidiques mono cycliques (C – Cytosine, T – Thymine).

À l’état non répliqué, un chromosome ne contient qu’une seule molécule d’ADN, les chromosomes sont donc monochromatidiques et après la réplication de l'ADN, les chromosomes deviennent bichromatidiques. La molécule de l’ADN humains mesure 180-200 cm, soit des milliers de fois plus qu’un noyau typique (6 μm diamètre). Pour être emmagasiner l’ADN dans le volume restreint d’un noyau, l’ADN doit présenter un énorme degré de compaction, il faut que la molécule d’ADN soit enroulée de façon serrée autour de molécules d’histones, puis de nombreuses fois sur elle-même, pour former un chromosome bichromatidique (Pierce, 2012).

Différents niveaux de condensation de l’ADN one été décrits. Le plus simple niveau est le brin bicaténaire d’ADN, deux longs brins moléculaires de nucléotides enroulent l’un autour de l’autre en double hélice, avec un diamètre de 2 nm, tandis que le plus complexe niveau est représenté par la chromatide du chromosome métaphasique (700 nm). Entre ces deux niveaux de condensation, trois autres ont été observés au microscope électronique: la fibre nucléosomique, le solénoïde et les boucles d'ADN (Figure 2.1.).

Figure 2.1. Les niveaux de compaction de la chromatine

(http://monde.ccdmd.qc.ca/ressource/?id=55483)

2.1.2. La morphologie des chromosomes

Les chromosomes sont dupliqués dans la phase S du cycle cellulaire et lorsqu’ils s’individualisent en se condensant, ils apparaissent constitués de 2 sous-unités identique appellent les chromatides. Les deux chromatides correspondent aux deux molécules identiques qui résultent de la réplication de l'ADN.

Pendant la métaphase, les chromosomes apparaissent constitués de deux bras séparés (les chromatides) par une zone étranglée appelée centromère. Le centromère est la région sur laquelle s'attachent les microtubules du fuseau de division, au niveau d'une zone particulière appelée kinétochore. Chaque chromatide a son propre kinétochore. Le centromère est la dernière région chromosomique à se scinder en deux au moment de l'anaphase.

Chaque extrémité des chromosomes prend le nom de télomère.

Les bras des chromosomes ont une taille variable, mais on reconnaît toujours un bras court noté avec "p" et un bras long noté avec "q" (Figure 2.2.).

Fig. 2.2. La structure du chromosome métaphasique

(www.bio-top.net)

En fonction de la taille des bras courts et longs, on reconnaît quatre types principaux de chromosomes (Figure 2.3.):

Les chromosomes métacentriques– dont les bras courts et longs sont de taille semblable. L’index centromèrique (r = q / p) est 1-1,7.

Les chromosomes submétacentriques – dont les bras courts sont franchement plus courts que les bras longs. L’index centromèrique est 1,7-3.

Les chromosomes acrocentriques/ télocentriques – dont le bras court est peu ou pas visible. L’index centromèrique est 3-7.

Fig. 2.3. La morphologie des chromosomes

Le nombre, la longueur et l'aspect général des chromosomes sont caractéristiques pour chaque espèce et sont identique chez tous les individus d’une espèce donnée. Par exemple: les poulets ont 78 chromosomes, l’homme en a 46 et la drosophile en a 8 (Tableau 2.1.). Il n’existe pas une relation significative entre la complexité d’un organisme et le nombre de chromosomes dans ses cellules (Pierce, 2012).

Chaque cellule somatique possède 2n chromosomes et les cellules sexuelles possèdent n chromosomes. Chaque cellule somatique possède 2n-2 chromosomes homologues (autosomes) et un pair (2) chromosomes sexuels (gonosomes). Les chromosomes homologues sont des chromosomes qui présentent la même morphologie. Les homologues sont caractérisés par la possession des gènes correspondants dans des régions correspondantes, et responsables de la détermination des mêmes caractères. En ce qui concerne les chromosomes sexuels, les femelles de mammifères possèdent deux chromosomes XX tandis que les mâles possèdent un chromosome X et un chromosome Y. Chez les oiseaux les gonosomes sont ZW pour les femelles et ZZ pour les mâles.

TABLEAU 2.1.

Nombre de chromosomes de différentes espèces (d’après Pusta, 2013)

Légende: T – total, A – autosomes, G – gonosomes

!!! Les chromosomes ont deux rôles principaux, la transmission du patrimoine génétique et l’expression des gènes. La transmission du patrimoine génétique se fait de la cellule mère aux cellules filles par mitose ou d’une génération à l’autre par méiose (formation de gamètes).

2.2. Méthode d’étude des chromosomes – le caryotype

2.2.1. La technique d'obtention de préparations mitotiques

Pour faire le caryotype on doit faire les préparations mitotiques chromosomiques.

Pour le diagnostic cytogénétique, il est nécessaire de mettre en évidence les chromosomes. Ils ont un numéro et une structure caractéristique pour chaque espèce. L'observation des chromosomes n'est possible que lors de la division cellulaire, en métaphase, lorsqu'ils sont le plus facilement identifiables par microscopie. Les chromosomes sont mis en évidence par le blocage des cellules en métaphase de la mitose, raison pour laquelle les préparations contenant de telles cellules sont appelées préparations mitotiques.

Par diffèrent techniques cytogénétiques il est souhaitable d'obtenir un maximum de cellules bloquées à mitose. Le but de ces méthodes est de fournir autant de cellules que possible dans la division.

Les principaux objectifs poursuivis par la réalisation des préparations mitotiques sont les suivants:

indice mitotique accru;

les chromosomes doivent être aussi dispersés que possible;

les chromosomes doivent être aussi moins tordus que possible.

L'étude des chromosomes est effectuée à des fins de diagnostic prénatal (maladies génétiques chromosomiques) ou postnatale (anomalies chromosomiques sans signes cliniques, par exemple translocations).

Les amniocytes sont utilisés pour le diagnostic prénatal chez les mammifères et pour le diagnostic postnatal peuvent être utilises: la moelle osseuse, le sang périphérique, les hémocultures, les cultures de leucocytes, les cultures tissulaires, les tumeurs solides.

Nombreuses techniques pour obtenir des préparations mitotiques ont été développés, mais toutes nécessitent des étapes obligatoires:

1. Prélèvement d’échantillon. L’échantillon pourrait être du sang, cellules amniotiques, cellules tumorales, etc.

2. Culture cellulaire. Pour cela, il est nécessaire d'avoir des cellules en phase de multiplication active, soit spontanément (cas des villosités choriales ou de certaines cellules tumorales) soit par une culture préalable le plus souvent (fibroblastes, tout type cellulaire capable de se diviser) parfois associée à une stimulation (lymphocytes sanguins). La durée de cette culture est variable en fonction du type cellulaire considéré et de la quantité de matériel biologique disponible au départ, à la température corporelle de chaque espèce.

2. Blocage des cellules en mitose – métaphase. L'étape suivante consiste à bloquer les cellules en métaphase afin de pouvoir observer les chromosomes. Pour cela, on utilise un poison du fuseau de division (classiquement c'est la Colchicine qui est utilisée ou son équivalent synthétique la Colcémide) qui empêche la polymérisation de la tubuline et donc la formation du fuseau mitotique. La mitose est bloquée au stade de métaphase, stade dans lequel les chromosomes sont condensés et visibles au maximum.

3. Choc hypotonique. Les cellules sont alors plongées dans une solution hypotonique (sérum dilué) ce qui entraîne leur gonflement. Les membranes cytoplasmique et nucléaire sont fragilisées. Les chromosomes métaphasiques se dispersent dans le milieu. Cette étape est indispensable à l'obtention d'un étalement correct des chromosomes.

4. Fixation – Etalement. La dernière étape consiste en une fixation par un mélange d'alcool et d'acide acétique. La préparation est alors étalée en laissant tomber une goutte de la suspension cellulaire sur une lame.

Cas particulier : certains types cellulaires comme les fibroblastes adhèrent au support lors de la culture. On peut obtenir des métaphases à partir de ces cellules sans les détacher de leur support, toutes les étapes précédentes étant réalisées directement sur la surface de culture (sauf l'étalement qui est bien sûr inutile dans ce cas).

5. Coloration, Giemsa. Lorsque l'on colore des préparations chromosomiques avec du Giemsa, les chromosomes prennent un aspect violacé, typiquement neutrophile, à peu près homogène sur toute leur longueur. On ne peut donc les distinguer les uns des autres que par leur taille et leur forme.

2.2.1.1. La technique d'obtention de préparations mitotiques à partir d’amniocytes

En période prénatale, les amniocytes du liquide amniotique, les cellules trophoblastiques des villosités choriales ou les lymphocytes du sang fœtal sont utilisés. Le temps de culture est variable selon le type de cellule analysé. L’établissement d’un caryotype à partir de liquide amniotique nécessite, en moyenne, un temps de culture de 6 à 10 jours et atmosphère enrichie en CO2. Le temps de culture peut être plus long, parfois de plusieurs semaines, en raison de la faible quantité de cellules initiales en cas d’amniocentèse très précoce ou en raison des nombreuses cellules en apoptose et des débris cellulaires en cas d’amniocentèse tardive.

2.2.1.2. La technique d'obtention de préparations mitotiques de sang périphérique

Un prélèvement de sang veineux périphérique est le plus souvent utilisé pour réaliser un caryotype constitutionnel en période postnatale. Le sang total est incubé 48 à 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (phytohémagglutinine ou PHA) permettant une stimulation de la croissance des lymphocytes T. Les fibroblastes de la peau peut être également couramment utilisés en période postnatale mais demandent une culture cellulaire de une à trois semaines. Le fragment tissulaire est recueilli dans un milieu de culture stérile additionné d'antibiotiques.

2.2.1.3. La technique d'obtention de préparations mitotiques à partir de la moelle hématogène expérimentale chez la souris

Le moyen le plus simple et le plus rapide d’identifier les chromosomes est de la moelle hématogène des souris.

Matériel requis

souris ou rats

seringues de 1-2 ml et aiguilles

verrerie de laboratoire, ciseaux

centrifugeuse, balance, microscope

solution de colchicine à 0,02%

solution de citrate de sodium à 0,8%

mélange d’alcool méthylique absolu et d'acide acétique glacial3: 1

solution Giemsa.

La technique opérationnelle

inoculer 0,5 ml de solution de colchicine chez la souris ou 1,5 ml chez le rat

laisser 1,5-2 heures pour la colchicinisation

l'animal est sacrifié et la moelle hématogène fémorale est récoltée sur une solution de citrate de sodium à 0,8% ; laisser 20 minutes pour hypotonicité (la hypotonisation)

centrifuger pendant 5-10 minutes à 1500rpm et enlever le surnageant

secouer le surnageant cellulaire restant et le fixateur constitué de 3p d’alcool méthylique absolu et d'une partie acide acétique glacial a été ajouté

centrifuger pendant 5-10 minutes à 1500rpm et enlever le surnageant et ajouter 3-5 ml de fixateur frais ; fixer pendant 10 minutes après quoi centrifuger et enlever le surnageant en maintenant quelques gouttes de fixateur

le sédiment restant est homogénéisé par agitation douce; étaler l'échantillon biologique sur les lames sèches et dégraissées, avec des pipettes Pasteur; sécher dans l'air.

colorer les préparations pendant 20 minutes avec une solution de Giemsa, examiner au microscope

Les préparations ainsi obtenues sont examinées au microscope avec l'objectif d'immersion, en suivant la morphologie des chromosomes en métaphase.

ACTIVITES PRATIQUES

1. Regardez-vous chez le microscope des métaphases chromosomiques et des images avec des métaphases normales dans différentes espèces (Figures 2.4.- 2.9.).

Fig. 2.4. Métaphase chez le taureau avec translocation Robertsonienne

(Ciupercescu et Pașca, 1982)

Fig. 2.5. Métaphase chez le taureau avec translocation Robertsonienne 1/29

(Ciupercescu et Pașca, 1982)

Fig. 2.6. Métaphase chez le bélier (2n = 54)

(Ciupercescu et Pașca, 1985)

Fig. 2.7. Idiogramme chez le taureau

(Ciupercescu et Pașca, 1984)

Fig. 2.8. Cariogramme chez la vache, 60, XX

(Ciupercescu et Pașca, 1986)

Fig. 2.9. Métaphases et idiogrammes représentant le mosaïcisme chez les taurins

(Ciupercescu et Pașca, 1986)

2. Entraînez-vous à représenter graphiquement un chromosome de chaque catégorie morphologique.

2.2.2. Le caryotype

Le caryotype représente une technique qui permet l’étude des chromosomes d’un individu. L’étude des chromosomes d’une cellule peut avoir lieu seulement au cours de la métaphase de la mitose, car alors les chromosomes ont une condensation maximale et sont les plus faciles à voir au microscope optique.

Après avoir eu des métaphases, les chromosomes étalés sont photographiés, puis les chromosomes isolés sont découpés de la photographie et les images obtenues sont utilisées pour disposer les chromosomes par paires, et classés par taille et par position du centromère.

La manière la plus courante de créer le caryotype consiste à utiliser différentes techniques de traitement des chromosomes, généralement appelées les bandages chromosomiques.

2.2.2.1. Le marquage chromosomique – les bandes

Pour reconnaître spécifiquement chaque paire des chromosomes, peut être utilisé des techniques de marquage particulières qui permettent d'obtenir une coloration inhomogène des chromosomes. Ces techniques spéciales mettent en évidence l'apparition de bandes. Ainsi, le chromosome n’apparait plus comme un bâtonnet sombre et homogène mais comme une suite de bandes sombres séparées par des zones plus claires.

Si les préparations chromosomiques sont colorées avec du Giemsa, les chromosomes prennent un aspect rose violacé à peu près homogène sur toute leur longueur. On ne peut donc les distinguer les uns des autres que par leur taille et leur forme.

Pour reconnaître spécifiquement chaque paire chromosomique, on utilise donc des techniques de marquage chromosomique, les bandes. Cela signifie l'alternance de bandes claires et sombres sur toute la longueur du chromosome, identique chez tous les individus d’une espèce pour un chromosome donné, qui en permet l'identification précise, selon le même principe qu'un code à barres.

Il existe plusieurs techniques de marquage en bandes des chromosomes (banding) (Figure 2.10.).

Les bandes G, obtenues après traitement des chromosomes par une protéase comme la trypsine. Les bandes traitées sont ensuite fixées par du Giemsa. Ceci conduit à strier les chromosomes en une série de bandes G sombres et d’interbandes claires. Le profil est unique à chaque paire de chromosomes homologues. En général, les bandes G sont riches en bases A et T alors que les interbandes sont riches en G et C.

Les bandes R «reverse bands», la dénaturation thermique ménagée montre qu’il existe des bandes sur les chromosomes (Dutrillaux et Lejeune, 1971). Les bandes R sont révélées par l’acridine orange (fluorescence). Les bandes sombre et claires obtenus ont une distribution invers de celle produite par les technique de bandes G ou de bandes Q.

Dans les cas de bandes G et R, les bandes ne deviennent visibles qu’après une coloration avec le Giemsa. Ces deux techniques donnent un marquage réciproque, c’est-à-dire que là où l’on obtient une bande sombre avec l’une des deux techniques, on observe une bande claire avec l’autre.

Les bandes Q, sont révé1ées par la coloration à la moutarde de quinacrine (Caspersson et al., 1970).Après la coloration et l’examen à la lumière ultraviolette, les chromosomes présentent des bandes fluorescentes transversales (bandes Q) alternant avec des bandes sombres.

Les bandes T, le marquage des extrémités télomériques et des régions centromériques (Dutrillaux, 1973).

D’autres techniques de marquage complémentaires existent qui permettent d’analyser certaines régions particulières du génome :

Les bandes C, cette coloration par le Sulfate de Baryium et le Giemsa permet de mettre en évidence l’hétérochromatine constitutive (centromères et constrictions secondaires).

Les bandes NOR, cette technique consiste en un dépôt de nitrate d’argent qui met en évidence les organisateurs nucléolaires. Ces structures correspondent aux régions du génome contenant les gènes qui codent pour les ribosomes.

Figure 2.10. Les techniques de marquage en bandes G, R et C

(http://monsterddl.free.fr)

2.2.2.2. La technique de marquage en bandes G (d’après Shiraishi et Yosida, 1972)

La technique de marquage des bandes G utilise un colorant chimique, le Giemsa (après dénaturation à la trypsine) qui engendre des bandes sombres sur les chromosomes métaphasiques. Ce colorant à la particularité de se fixer sur les thymines et les adénines, les bandes ainsi révélées indiquent les régions riches en AT. Elle est une technique rapide mais présente aussi des inconvénients, par exemple les télomères apparaissent peu colorés (Fig. 2.11.).

La technique opérationnelle 1

immerger les lames dans un mélange de 3 parties de solution d'urée 8M et de 1 partie tampon Sorensen, pH 6,8 à 37°C, pendant 10 minutes ;

laver très bien avec de l'eau du robinet pour enlever toute les traces d'urée ;

colorer avec du Giemsa dilué 50-70 fois avec du tampon Sorensen, pH 6,8, à température ambiante, pendant 5-20 minutes.

La technique opérationnelle 2

La production de bandes G avec l'acide trichloroacétique, l'acide perchlorique, le désoxychlorate de Na, la laurilarcosine de Na et l'urée :

des préparations chromosomiques obtenues à l'aide de la technique de séchage à l'air sont utilisées ;

incuber dans du sulfate d'ammonium à 0,6 M, pendant 5 minutes ;

laver 3 fois dans du tampon phosphate Sorensen, pH 8,0 ;

incuber dans une solution d'acide trichloroacétique (0,25%) dans un tampon Sorensen, pH 8,0

colorer avec la solution de Giemsa, sécher à l'air et monter

Fig. 2.11. Bandes G (46, XX)

(d’après Ciocca et al., 2013)

2.2.2.3. La technique de marquage en bandes C (d’après Summer, 1971)

les préparations chromosomiques sont introduites dans du HCl 0,2n, à température ambiante, pendant une heure ;

rincer à l'eau distillée ;

les préparations sont introduites dans une solution aqueuse de Ba (OH) 0,5% (fraîchement préparée), à 50 °C, pendant 5-15 minutes ;

nettoyer plusieurs fois dans de l'eau déionisée ;

incuber dans 2 x SSC à 60 °C pendant une heure ;

rincer rapidement à l'eau déionisée ;

colorer dans une solution de Giemsa, pendant 1.5h ;

rincer rapidement à l'eau déionisée et sécher à l'air (Figure 2.12.).

Fig. 2.12. Bandes C (46, XX)

(https://slideplayer.fr/slide/10363775/)

En génétique médicale, le caryotype contribue à la mise en évidence de remaniements chromosomiques équilibrés ou déséquilibrés.

Le caryotype est le classement des chromosomes par paires d’après leur forme et leur taille. (Fig. 2.12.)

Fig. 2.12. Protocole de confection d'un caryotype

(http://www.afblum.be)

L’examen du caryotype permet d’identifier la présence d’anomalies:

de nombre, par exemple la trisomie 21 chez les humaines;

de structure, comme les translocations, c’est les cas de la translocation 1/29 chez les bovins (Figure 2.13.). Quand l’ensemble d’un chromosome se colle sur un chromosome d’une autre paire, c’est une fusion centrique, comme la fusion 1/29 en bovins, qui réduit la fertilité moyenne (par ex. de la race Blonde d’Aquitaine).

Fig. 2.13. Translocation 1/29

(https://scialert.net)

2.3. Les techniques modernes pour la réalisation du caryotype

Actuellement, des systèmes informatiques de reprise et de traitement d'images sont utilisés pour faciliter l'identification et le traitement des chromosomes.

Le caryotype du chien a été réalisé, comme application pratique, à la Clinique d'Obstétrique et de Gynécologie I, Cluj-Napoca. Ce laboratoire dispose d'un microscope Zeiss Axioscope 2 avec une caméra Zeiss pour capturer l'image fournie. La caméra est connectée à un ordinateur qui a installé un programme spécial pour le caryotypage des chromosomes, Meta System Ikaros (Figure 2.14.). Ce programme est utilisé pour le caryotypage des chromosomes humains.

Afin de la réalisation pratique du caryotype, les mitoses ont été luée et interprétée chez les chiens adultes (femelles et mâles). Les résultats ont été obtenus à la fois en lisant les lames de mitose et en lisant les lames en bandes G.

Les fonctions du programme de caryotypage Meta System Ikaros sont les suivantes (Figure 2.15.):

a. Capture – la capture d'une image (une métaphase) au microscope

b. Add capture – la captured’une image plus large d'une métaphase

c. Obj. Threshold – le nettoyage des images des impuretés

d. Mask Meta. – l’élimination des lymphocytes dans l'image, pour une meilleure visualisation des chromosomes

e. Delete – l’élimination des impuretés sur la lame

f. Separate – la séparation des chromosomes entre eux

g. Overlaps – l’élimination des chevauchements entre les chromosomes

h. Check objects – la vérification du nombre de chromosomes

i. Annotate – l’annotation des chromosomes en métaphase

2.14. Système pour capturer et traiter les images (d’après Pusta, 2013)

2.15. Capture de la métaphase sur la lame (Pusta et al., 2013)

Après avoir préparé l'image prise de la lame examinée, le même programme peut traiter et arranger les chromosomes avec les fonctions suivantes (Figure 2.16.):

j. Assign – l'arrangement facultatif des chromosomes par paires

k. Rotate 180ș / 90ș, Rotate X – la rotation des chromosomes

l. Shift – le changement des chromosomes entre eux pour qu'ils soient disposés par paires

m. Clean. – le nettoyage des chromosomes

n. Reduce – la diminution d’image des chromosomes

o. Magnify – l’augmentation d’image des chromosomes

p. Staining – la coloration/ la décoloration des bandes G sur les chromosomes

q. Annotate – l’annotation des chromosomes en métaphase

Fig. 2.16. Carotypage des chromosomes de la métaphase capturée

(Pusta et al., 2007)

Les résultats finaux, obtenus après le caryotypage chez les chiens mâles et femelles, sont présentés dans les figures 2.17. et 2.18.

Fig. 2.17. Le caryotype obtenu chez le chien (78, XY)

(Pusta et al., 2007)

Fig. 2.18. Le caryotype obtenu chez la chienne (78, XX)

(Pusta et al., 2007)

2.3.1. Le FISH (L'hybridation in situ en fluorescence)

Le FISH est une technique de cytogénétique, une technique récente, qui permet de voir des éléments situés à l'intérieur de la cellule. Cette technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilise des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes en microscopie et en imagerie moléculaire.

L'hybridation in situ en fluorescence, ou FISH, est un processus scientifique utilisé pour analyser les chromosomes. L'utilisation appropriée de sondes moléculaires révélées par fluorescence permet de détecter des anomalies chromosomiques de nombre et de structure aussi bien dans les métaphases que dans les noyaux interphasiques. Le FISH sur noyaux interphasiques permet de détecter des clones malins à faible index mitotique et/ou minoritaires. Le FISH sur métaphases permet de préciser un caryotype difficile, de visualiser une microdélétion ou une microtranslocation invisible au caryotype.

Les trois étapes principales du FISH sont: une dénaturation de la sonde d'ADN ainsi que de la cible chromosomique; une hybridation de la sonde, dans des conditions d'environnement précises; d'une étape de détection de la sonde (Sloan-Bena, 1998) (Figure 2.19.).

Le FISH est utilisée pour le diagnostic cytogénétique mais aussi, pour la réalisation de la cartographie physique du génome humain. La technique offre la possibilité d'analyser finement des caryotypes quand l'étude cytogénétique conventionnelle ne détecte pas de remaniements. Le FISH est couramment utilisé pour détecter le syndrome de Down dans un fœtus, par exemple, en vérifiant des anomalies chromosomiques.

La technique opérationnelle du FISH, d’après Pescia et al., 1994

"Les sondes (probes) pour le FISH sont des fragments d'ADN marqués par un fluorochrome, à la suite de l'incorporation dans la double molécule d'ADN de l'uridyl-biotinilé à la place de la thymine. Après marquage, la sonde est dénaturée ce qui permet I'hybridation spécifique avec sa séquence complémentaire sur le matériel d'étude. Celui-ci peut être soit un frottis cellulaire avec des noyaux interphasiques (FISH interphasique), soit une préparation chromosomique obtenue selon lesméthodes cytogénétiques habituelles (FISH métaphasique).

Les sondes spécifiques d'un locus sont surtout utilisées en cartographie physique pour localiser les gènes au niveau des chromosomes.

Les sondes centromériques permettent de colorier électivement les centromères et d'en déduire le nombre de chromosomes correspondant. Des cocktails de sondes spécifiques d'un chromosome sont utilisés pour le chromosome "painting". Celui-ci est très utile en cas d'anomalie structurale (translocation, duplication, délétion), et pour l'identification de microchromosomes surnuméraires." (Pescia et al., 1994) (Figure 2.20.).

Fig. 2.19. La technique de l'hybridation in situ en fluorescence

(https://serc.carleton.edu)

Légende: A – sonde

B – sonde colorée à l’aide d’un fluorochrome

C – hybridation avec l’ADN nucléaire

D – apparence du chromosome métaphasique où la sonde s’est fixée.

2.3.2. Le Multi FISH (FISH en couleurs multiples)

Le Multi FISH est une technique dans laquelle un mélange de 24 sondes spécifiques des 22 autosomes et des chromosomes sexuels sont hybridées simultanément (Figure 2.21.).

Le Fish en 24 couleurs présente deux aspects qui diffèrent au niveau de la méthode d’acquisition des images permettant la classification des chromosomes métaphasiques: la M-Fish (multiplex-FISH) et le caryotype spectral ou le Sky (spectral karyotyping) (Schrock et al., 1997; Eils et al., 1998). Ces deux techniques permettent l’identification et l’analyse simultanées de tous les chromosomes en attribuant à chaque paire d’autosomes, à l’X et à l’Y une couleur propre et distincte (Bouayed Abdelmoula, 2004).

Fig. 2.20. Le FISH en 24 couleurs

(www.haematologica.org)

Fig. 2.21. Le Multi FISH

(researchgate.net)

ACTIVITES PRATIQUES

1. Regardez-vous des images avec des marquages en bandes G et C des chromosomes et avec des translocations chromosomique chez les bovins.

Fig. 2.21. Bandes G chez les taureaux (60, XY)

(Ciupercescu et Pașca, 1986)

Fig. 2.22. Bandes G chez le bélier (54, XY)

(Ciupercescu et Pașca, 1986)

Fig. 2.23. Représentation schématique des bandes G chez le taureau (chromosomes 15-26, X, Y)

(www.nodak.edu)

Fig. 2.24. Métaphase en bandes C chez le taureau

(Ciupercescu et Pașca, 1986)

Fig. 2.25. Translocation Robertsonienne (1/29) en bandes C chez le taureau

(Ciupercescu et Pașca, 1986)

2. Comparez-vous les caryotypes à différentes espèces d'animaux domestiques.

Fig. 2.26. Caryotype d'un chien (78, XY)

Fig. 2.27. Caryotype d'un chat (38, XY)

Fig. 2.28. Caryotype d'un taureau (60, XY)

Fig. 2.29. Caryotype d’une jument (64, XX)

Fig. 2.30. Caryotype d'un bélier (54, XY)

Fig. 2.31. Caryotype d’un porc (38, XY)

Fig. 2.32. Caryotype d'un oiseau (78, ZW) (Tagliarini et col., 2007)

Fig. 2.33. Caryotype d’un souris mâle (40, XY)

3. Analysez-vous les principales anomalies numériques chromosomiques rencontrées chez l'homme.

Fig. 2.31. Le syndrome de Down (47, XX +21)

Fig. 2.34. Le syndrome de Klinefelter (47, XX, Y)

Fig. 2.35. Le syndrome de Turner (45, XO)

Fig. 2.36. Qu'est-ce qui ne va pas ici? (Le syndrome d’Edwards)

4. Entraînez-vous à réaliser le caryotype qui se trouve à la fin du livre.

PROBLEMES DE GENETIQUE

1. Dans quel stade du cycle cellulaire se produit la réplication de l’ADN?

2. Si une cellule somatique contient 15 paires de chromosomes à la fin de télophase, combien de chromatides sont en prophase?

3. Les cellules diploïdes contiennent

a) deux chromosomes

b) deux jeux de chromosomes

c) un jeu de chromosomes

d) deux paires de chromosomes homologues

4. Chez les souris il y a 40 chromosomes dans les cellules somatiques.

Combien des chromosomes sont d’origine maternelle dans une cellule somatique chez le souri?

Combien d’autosomes sont présent dans la cellule somatique d’une souris mâle?

Combien des chromosomes sexuels sont dans l’ovule d’une souris femelle ?

5. Une cellule somatique du lapin a 22 chromosomes. Combien de chromatides sont présents dans la cellule du lapin

a) Dans la métaphase I de la méiose ?

b) Dans la métaphase II de la méiose ?

c) Dans la métaphase de la mitose ?

6. Le cheval (Equus cabalus) a un complément diploïde de 64 chromosomes et l’âne (Equus asinus) a un complément diploïde de 62 chromosomes.

a) Combien de chromosomes l'hybride «cheval x âne» possède-t-il?

b) Comment expliquez-vous que la plupart des mulets soient stériles?

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

7. Les bovins ont un complément diploïde de 60 chromosomes.

a) Combien d'autosomes sont présents dans le sperme de taureau?

b) Combien de chromosomes sexuels se trouvent dans les ovules?

c) Combien de chromosomes reçoit le veau du son père?

d) Combien d’autosomes se trouve dans les cellules diploïdes de la femelle ?

8. Mentionnez la forme d’organisation du matériel génétique pendant la division cellulaire et pendant l’interphase.

9. Répondez par OUI ou par NON aux questions suivantes et JUSTIFIER votre réponses.

a) les cellules sexuelles contiennent des chromosomes autosomes

b) les cellules de peau et de gamètes des mêmes animaux ont un nombre égal de chromosomes

c) les chromosomes sexuels se trouvent seulement dans les cellules sexuelles

d) les chromosomes acrocentriques ont des bras p plus courts que le bras q.

10. Précisez les étapes nécessaires pour la formation des chromosomes :

……..

……..

……..

……..

……..

11. Les cellules somatiques d’un cheval contiennent 64 chromosomes (2n=64). Combien de chromosomes et de molécules d’ADN seront-ils présents dans les types de cellules de cheval suivants?

12. Un spermatocyte secondaire possède 12 chromosomes. Combien de chromosomes possède le spermatocyte primaire dont il est issu?

a) 6

b) 12

c) 18

d) 24

13. Décrivez-vous les principales anomalies chromosomiques (syndromes de Down, Turner et Klinefelter) et les translocations Robertsoniennes.

CHAPITRE III

LA GÉNÉTIQUE MENDÉLIENNE

La génétique mendélienne est la partie de la génétique qui traite de l'étude et de l'application pratique des lois de Gregor Mendel, mais aussi des exceptions à ces lois.

Une méthode couramment utilisée en analyse génétique est la méthode d'hybridation, c'est-à-dire l'accouplement des individus auxquels certains caractères sont pris en compte, puis le mode de transmission et d'expression de ces caractères aux descendants. Les premiers mécanismes logiques de transmission des caractères et des attributs aux descendants ont été découverts par Mendel, et, pour cette raison, les lois héréditaires sont également appelées lois mendéliennes.

Avant de connaître les lois de Mendel, nous devons connaître les termes qui sont constamment utilisés en génétique mendélienne.

3.1. Termes utilisés en génétique

Génétique, la science de l'hérédité et de la variabilité des êtres vivants. La génétique mendélienne étude les caractères héréditaires des individus, leur transmission au fil des générations et leurs variations (mutations), est l’étude qui a permis l'établissement des lois de Mendel et leurs exceptions.

Génome, le patrimoine héréditaire d'un individu. Le terme génome a été introduit en 1920 par le botaniste allemand Hans Winkler et défini par «le jeu haploïde de chromosomes (la totalité des chromosomes) dans la cellule reproductrice – l'ovule ou le spermatozoïde chez les animaux et les humains» (Gavrila L., 2004).

Génotype, ensemble de l'information génétique d'un individu. Le jeu complet des allèles d’une cellule ou d’un individu.

Phénotype, caractéristiques physiques et physiologiques d'un individu, est le résultat de l'interaction entre son génotype et son environnement.

La proportion de différents phénotypes résultant de l'hybridation est exprimée sous la forme d'un rapport de ségrégation phénotypique (RSP). Dans le cas des allèles dominants et récessifs, le phénotype ne reflète pas toujours la structure génétique des organismes. Dans le cas de la monohybridation, le rapport de ségrégation phénotypique dans F2 est constant de 3: 1, c'est-à-dire que 3/4 (75%) montre le caractère dominant (1AA + 1Aa) et 1/4 (25%) montre le caractère récessif (1aa).

Chromosome, une structure constituée à partir d'une macromolécule d'ADN. Dans une cellule somatique, les chromosomes sont toujours appariés et s'appellent chromosomes homologues. Par exemple, il y en a 23 paires chez l'homme et 39 chez le chien.

Gène, l’unité d'hérédité contrôlant un caractère particulier. Cet élément génétique correspond à un segment d'ADN, situé à un endroit bien précis, appelé locus, sur un chromosome.

Allèle, une des différentes formes que peut prendre un même gène sur les chromosomes homologues (il peut y en avoir plus de deux, lorsque plusieurs paires de chromosomes homologues sont impliquées). Les allèles occupent la même position sur les chromosomes homologues. Chaque caractère est lié à au moins une paire de gènes d'allèles différents dans toutes les cellules diploïdes. Il peut y avoir des allèles dominants, désignés par la grande lettre (A, B, C, D) et des allèles récessifs, marqués par la petite lettre correspondant à l'allèle dominant (a, b, c, d).

Lorsque les deux allèles sont identiques, le génotype est homozygote. Selon le type d'allèle, peuvent exister des génotypes dominants homozygotes (AA, BB, CC, DD) ou récessifs homozygotes (aa, bb, cc, dd). Un génotype homozygote ne produit toujours qu'une seule espèce de gamètes.

Homozygote, un organisme ou un individu possédant deux allèles identique à un locus.

Du croisement de deux gamètes contenant des allèles différents, un génotype hétérozygote (Aa) apparaîtra. Les génotypes hétérozygotes d’un même locus produisent toujours deux types de gamètes (A et a).

Hétérozygote, un organisme ou un individu possédant deux allèles différent a un locus.

La proportion de différents génotypes obtenus est exprimée par le rapport de ségrégation génotypique (RSG). Dans le cas de la monohybridation, le rapport de ségrégation génotypique dans F2 est égal à 1 homozygote dominant (AA): 2 hétérozygotes (Aa): 1 homozygote récessif (aa).

3.2. Les lois de Mendel – Applications Pratiques

3.2.1. Le croisement test

Le croisement test ou test-cross est une forme d'hybridation qui permet de différencier les génotypes homozygotes des génotypes hétérozygotes, qui sont phénotypiquement similaires.

Le parent avec lequel le croisement test est effectué est toujours l'homozygote récessif (aa) pour l'allèle considéré. En effet, le génotype homozygote récessif (aa) est d’un part identifié phénotypiquement, et d’autre part ne produit qu’un seul type de gamètes (a). Le croisement test a pour but d’observer à travers la descendance combien de types de gamètes produisent le génotype à analyser.

Si l’individu est homozygote dominant (AA), produira un seul type de gamètes (A) et le croisement test produira une descendance homogène, 100% hétérozygote (Aa).

Si l’individu est hétérozygote (Aa), le croisement produira une descendance dont une moitié seront hétérozygotes (50%, Aa) est l’autre moitié seront homozygotes (50%, aa).

En plus du croisement test (test cross), des rétrocroisements (back cross) peuvent également être effectuées. Ce sont des croisements entre les produits résultants et l'un des parents.

PROBLÈME RÉSOLU ET EXPLICATIONS

1. Déterminez si un cochon d'Inde noir mâle est homozygote ou hétérozygote, sachant que le gène qui détermine la couleur noire est dominant (A) et que celui qui détermine la couleur blanche est récessif (a) (Figure 3.1.).

Solution: Pour cela est pratique un croisement test avec un homozygote récessif, c’est-à-dire avec un cochon d’Inde femelle blanche (aa).

Variants:

a) AA x aa

b) Aa x aa

Fig. 3.1.Le croisement-test

(svtmarcq.over-blog.com)

a) Si le cochon d’Inde mâle est homozygote dominant (AA), il produira un seul type de gamètes (A) et les descendances seront homogène (Aa). Se manifeste la loi de l'uniformité.

P : AA x aa

G (gamètes) : A  ; A a  ; a

F1 : Aa Aa Aa Aa

b) Si le cochon d’Inde mâle est hétérozygote (Aa), il produira deux types de gamètes (Aet a) et alors donnera deux types de descendants dans une proportion égale: 50% Aa et 50% aa.

P : Aa x aa

G (gamètes) : A  ; a a  ; a

F1 : Aa Aa aa aa

Conclusion !!!

Lorsqu'un croisement test aboutit à une uniformité phénotypique, l'individu inconnu est homozygote, et chaque fois qu'une ségrégation phénotypique se produit dans un rapport de 1: 1, l'individu inconnu est hétérozygote.

PROBLÈME D'APPLICATION

1. Deux lignées pures de rats qui diffèrent par un seul caractère : l’une est constituée de rats blancs, l’autre de rats noirs.

a) Le croisement d’un rat blanc avec un rat noir donne en F1 100% de rats noirs. Expliquez ce résultat.

b) Quels seront les résultats statistiques de la F2 résultant du croisement des rats obtenus en F1 ?

c) Doit-on s’assurer de la pureté des rats blancs ?

d) Qu’obtiendrait-on en croisant : 1. Un rat blanc de lignée pure avec un rat obtenu en F1 ? 2. Un rat noir de lignée pure avec un rat obtenu en F1 ?

2. Plusieurs paires des cochons d'Inde du même génotype ont donné naissance à 60 chiots, dont 40 étaient noirs et 20 blancs. Quel est le génotype probable des parents? Écrivez le schéma de croisement et justifiez votre réponse.

3. Des cochons d'Inde noirs, hétérozygotes (Aa) ont été croisés avec des cochons d'Inde blancs, qui sont homozygotes récessif (aa). Spécifiez le rapport de ségrégation phénotypique (RSP) attendu du back-cross des cochons d'Inde noirs résulté en F1 avec:

a) Le parent noir

b) Le parent blanc

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

4. Chez la drosophile, la coloration rouge des yeux est récessive par rapport à la coloration brune. Un généticien a effectué le croisement suivant :

P1 : yeux brunes x yeux rouges

F1 : 358 mouches aux yeux rouges

360 mouches aux yeux bruns

Interprétez les résultats en donnant les génotypes des parents et des individus de la F1.

5. L’absence de pilosité chez le Rat Terrier Américain est récessive par rapport à la présence de poils. Supposez que vous ayez un Rat Terrier avec une pilosité normale. Comment pouvez-vous déterminer si votre chien est homozygote ou hétérozygote pour la présence de poils ?

6. Chez les renards, une fourrure noire argentée est due à l’allèle b, le roux à l’allèle B. Quelle est la proportion des différents génotypes et phénotypes obtenus dans les croisements suivants :

a) roux pur x hétérozygote ?

b) hétérozygote x noir argenté ?

c) roux pur x noir argenté ?

7. Que peut-on dire au sujet de génotype homozygote ou hétérozygote d'un individu élevé pour une caractéristique particulière.

8. a) Si le gène R est dominant comparé au gène r, combien de phénotypes différents sont obtenus en croisant Rr à Rr et dans quelle proportion.

b) Combien de phénotypes sont obtenus et dans quelle proportion s'il n'y a aucune relation dominante entre R et r ?

9. Un animal à longue queue, race pure est croisée avec un animal à queue courte qui n’est pas de race pure. La moitié des descendants résulteront une queue courte. Si cette caractéristique est déterminée par les allèles d'un même gène, quel animal est hétérozygote et quel animal est homozygote ?

3.2.2. Le calcul de probabilité comme outil de l’analyse génétique

La méthode pour prédire le résultat d’un croisement génétique est d’utiliser le calcul de probabilité.

1. La règle de la probabilité simple. La probabilité d’un événement particulier peut être déterminée si on sait comment ou avec quelle fréquence il se produit.

La probabilité simple peut être exprimée par le rapport entre les nombres de cas qui nous intéresse (m) et le nombre de résultats possibles (n). Ou, la probabilité qu’un événement particulier se produise est le nombre de fois que cet événement se produit effectivement (m), divise par le nombre d’occasions qu’il a de se produire (n).

m / n

Par exemple :

– nous savons que la probabilité de jeter un dé et d’obtenir un quatre est 1/6, parce que le dé a six faces et que toutes ont une chance égale de se retrouver au-dessus.

– un jeu de cinquante-deux cartes ne contient qu’un roi de cœur. La probabilité d’obtenir le roi de cœur en tirant une carte au hasard est 1/52, parce qu’il n’y a qu’une seule carte qui est roi de cœur (un événement) et qu’il y a 52 cartes qui peuvent être tirées (52 résultats possibles). La probabilité de tirer un as est 4/52 parce que quatre cartes sont des as. La probabilité peut être exprimée sous forme de fraction (4/52), dans ce cas ou le nombre décimal (0.077).

– en croisant Aa x Aa, 4 génotypes possibles sont obtenus (AA, Aa, Aa, aa). La probabilité d'obtenir un génotype homozygote récessif (aa) est ¼.

2. La règle de la somme. La probabilité que se produise l’un ou l’autre de deux événements qui s’excluent mutuellement est égale à la somme de leurs probabilités individuelles.

Par exemple :

– pour calculer la probabilité de jeter un dé et d’obtenir soit trois soit un quatre, nous appliquons la règle de la somme en additionnant la probabilité d’obtenir un trois (1/6) et celle d’obtenir un quatre (également 1/6), soit 1/6 + 1/6 = 1/3.

– la probabilité d’obtenir un roi, une dame ou un as est 4/52 + 4/52 + 4/52 = 3/13.

– si un carte est tire hors du jeu de cartes (par exemple un as) et n'été pas mis à son place, alors la chance que un as être tire encore un foie sera de 3/51.

– la probabilité d'obtenir un génotype dominant par le croisement de deux hétérozygotes (Aa x Aa), sera 1/4 + 2/4 = 3/4.

Les mots clés qui indiquent qu’il convient d’appliquer la règle de la somme sont « soit… soit ».

3. La règle du produit. La probabilité que deux ou plusieurs évènements indépendants se produisent ensemble est le produit de la probabilité de chacun de ces évènements.

Par exemple :

– pour calculer la probabilité, en jetant deux fois le dé, d’obtenir deux fois de suite un quatre, appliquons la règle du produit. La probabilité d’obtenir un quatre au premier coup est 1/6 et celle d’obtenir un quatre au second coup est aussi 1/6; donc, la probabilité d’obtenir un quatre deux fois de suite est 1/6 x 1/6 = 1/36.

– la probabilité de tirée un as suivi par un autre as est de 4/52 x 4/51 = 1/122.

– la probabilité de tirée les quatre as est de 4/52 x 3/51 x 2/50 x 1/49 = 1/270.725

Le mot clé qui indique qu’il convient d’appliquer la règle du produit est « et ».

3.2.3. L’arbre généalogique

L'analyse de la ségrégation des caractères chez l'homme ne peut pas être effectuée par la méthode d'hybridation, car la reproduction ne peut pas être contrôlée et le nombre de descendants est relativement faible par génération. Pour ça, les généticiens ont dû développer des techniques spéciales. Une de ces techniques est l’analyse d’arbre généalogique (pedigree). Un pedigree représente graphiquement l’analyse généalogique, dans lequel le phénotype de chaque individu est représenté. Le pedigree décrit la transmission d’un ou plusieurs traits/ caractères particuliers.

On peut reconnaître dans les arbres généalogiques les indices permettant d’identifier schémas de transmission génétique.

Les caractères récessifs. Les caractères récessifs apparaissent normalement avec une fréquence égale chez les deux sexes, et seulement quand un individu hérite de deux allèles codant le caractère, un de chaque parent. Si le caractère est peu répandu, la majorité de parents d’enfants affectés sont hétérozygotes et non affectés; par conséquent, le caractère semble « sauter » une génération.

Les caractères dominants. Les caractères dominants apparaissent avec une fréquence égale chez les deux sexes, et les deux sexes peuvent transmettre ces caractères à leur progéniture.

Chaque personne présentant un caractère dominant doit avoir hérité l’allèle d’au moins un de ses parents. Les caractères autosomiques dominants ne sautent pas de générations.

Les symboles couramment utilisés dans les arbres généalogiques sont :

les carrés représentent les homes, les cercles, les femmes et les losanges, les individus avec le sexe inconnu ou non spécifié

les individus affectés ou présentant un caractère sont marquées par le remplissage des symboles

les enfants sont reliés à leurs parents par the caractères verticaux descendant d’entre les parents

chaque génération est identifiée par un chiffre romain et les individus de chaque génération sont identifiés avec des chiffres arabes

chez les humains et chez les animaux qui ont normalement un seul produit de conception, les jumeaux sont indiqués par des lignes diagonales qui vont directement de la ligne horizontale chez les jumeaux non identiques et qui se ramifient sur une verticale commune chez les jumeaux identiques.

PROBLÈME RÉSOLU ET EXPLICATIONS

1. Sachant que chez le cochon d'Inde la couleur noire est dominante par rapport à la couleur blanche, déterminez le génotype des individus représentés dans le pedigree de la figure.

III

1 2

II

1 2 3

I

1 2

Dans le tableau sont indiqué les données phénotypiques connues, la couleur et le sexe, puis les génotypes.

PROBLÈME D'APPLICATION

1. Supposons qu’une maladie dégénérative rare chez les humains est causée par un allèle dominant A, et que cette maladie ne se produit avant l'âge de 45 ans. Un jeune homme a appris que son père présent les signes de la maladie.

a) Quelle est la possibilité que le jeune homme manifeste la maladie à l'âge de 45 ans?

b) Quelle est la probabilité qu'un nouveau-né du jeune homme possède l'allèle dominant A?

2. Une forme d’albinisme chez l’homme est déterminée par l’homozygotie d’un allèle récessive c. Un couple avec une pigmentation normale, chacune d’eux ayant un parent albinos, ont deux enfants. Quelle sont les chances que tous les deux enfants seront albinos ? Quelle est la probabilité qu’un des enfants sera albinos ?

3. Sachant que le ratio entre les sexes à la naissance est de 1:1, examiner deux familles A et B ayant chacun trois enfants. Quelle est la probabilité que tous les enfants de la famille A soient filles et tous les enfants de la famille B sont des garçons ?

4. Chez les animaux l’albinisme (absence de pigment mélanique) est causé par un gène récessif (a) et la pigmentation normale de son allèle dominant (A). Rendre l'analyse de pedigree, avec les characteristique phénotypique et génotypique ci-dessous, où les symboles en noir sont des albinos et les symboles blanc sont la pigmentation normale.

I

1 2

II

1 2 3 4

III

1 2 3

1 2 3

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

5. Le pedigree suivant représente une famille dans la fille indique avec une cercle noir est sourde. Cette forme de surdité est déterminée par un allèle récessif. Quelle est la probabilité que le garçon normal phénotypique, indique avec la carre blanche d’être hétérozygote pour la gêne de surdité ?

1 2

1 2 3

6. Voici le pedigree d’une famille où on trouve un trait héréditaire assez commun (cases ombragées).

a) Croyez-vous que l’allèle déterminant ce trait est dominante ou récessif ? Expliquez votre réponse.

b) Indiques le génotype de chaque individu (ou ses génotypes possibles quand il est impossible d’être plus précis).

I I

1 2 3 4

II

1 2 3 4 5

III

1

7. Vous avez trois dés : un rouge, un vert et un bleu. Lorsque vous lancez les trois des en même temps, calculez la probabilité d’obtenir les résultats suivants :

a) 6 (rouge), 6 (vert), 6 (bleu)

b) 6 (rouge), 5 (vert), 4 (bleu)

c) 6 (rouge), 5 (vert), 6 (bleu)

d) aucun trois

e) un nombre diffèrent sur chaque dés.

8. Dans la lignée Ayshire de bovins, un allèle dominant produit une encoche à l’extrémité des oreilles (gène notch). Dans le pedigree ci-dessous, les cases ombrées représentent les individus de phénotype notch. Quelle est la probabilité d’obtenir de tels individus lors des croisements:

a) III1 x III3

b) III2 x III3

c) III3 x III4

d) III1 x III5

e) III2 x III5

9. Dans l’arbre généalogique suivant, les symboles noirs représentent des individus atteints d’une maladie très rare du sang.

Si vous ne disposiez pas d’autre information, penseriez-vous que la probabilité est plus grande que la maladie soit dominante ou récessive ? Justifiez votre réponse.

10. César et Anne envisagent d’avoir des enfants mais le frère de César et l’arrière-grand-mère d’Anne souffre d’une maladie autosomique récessive. Anne a une sœur qui a trois enfants saines. Quelle est la probabilité que le premier enfant de César et Anne soit atteint de cette maladie ?

11. Les souris porteuses d’un allèle mutant donné ont une queue coudée. Six paires de souris ont été croisées. Leurs phénotypes et ceux de leur descendance sont indiqués dans le tableau suivant. N est le phénotype normal, et C est le phénotype coudé. Déduisez le mode de transmission de ce phénotype.

3.2.4. Les croisements dihybrides

Les croisements dihybrides représente le croisement entre deux individus auxquels ils sont pris en compte deux caractères différents (car ils diffèrent par beaucoup plus de caractères).

Les croisements dihybrides révèlent le principe d’assortiment indépendant des caractères. Ce principe dit que des gènes codant pour des caractères différents se séparent indépendamment quand les gamètes se forment, à cause de la ségrégation indépendante des chromosomes de chaque paire d’homologues pendant la méiose.

L'analyse génétique des résultats de la dihybridation peut être effectuée en utilisant la grille de Punnett.

PROBLÈME RÉSOLU ET EXPLICATIONS

1. Sachant que chez le cochon d'Inde la couleur noire est dominante (A) par rapport à la couleur blanche (a) et que les cheveux courts est dominante (B) par rapport à les cheveux longs (b), analysez les résultats des croisements en F1 et F2 entre des cochons d'Inde homozygotes dominants à poils courts et noirs et des cochons d'Inde homozygotes récessifs avec des poils blancs et longs.

P : AABB x aabb

G (gamètes) : AB ab

F1 : AaBb

F2 : La grille de Punnett

L'analyse de résultats en F2. Il y a 16 variantes possibles, comme suit:

Synthèse des phénotypes :

noire, courts – 9

noire, longs – 3

blanche, courts – 3

blanche, longs – 1

PROBLÈME D'APPLICATION

Quels types de gamètes sont produits par un individu avec le génotype Ff? Un individu avec le génotype BbCc? Un individu avec le génotype RRPp?

2. La fourrure du Labrador retriever peut être de couleur noire (déterminé par le génotype BE-), brune (bbE-) ou dorée (–ee). Deux chiens avec la couleur noire ont été croisés, BbEe x BbEe. Quelle est le phénotype possible des chiots et dans quel rapport ?

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

3. Le motif de la fourrure de chiens est déterminé par l’allèle d’une seule gène, marquée « S » pour la couleur uniforme et « s » pour la couleur tachetée. La couleur noire est déterminée par un second gène, l'allèle dominant « B » détermine la couleur noire, la couleur marronne par l’allèle « b » à l'état homozygote. Une femme avec fourrure de couleur brun et uniforme est croisée avec un mâle avec la couleur noire et d'aspect uniforme. Les phénotypique des chiots en F1 a été: 2 uniforme de couleur marron, 2 noir avec apparence uniforme de la fourrure, un marron tacheté et un noir tacheté. Quel est le génotype possible de leurs parents et des leurs progénitures?

4. Quelle est la relation entre les principes de ségrégation égale et d’assortiment indépendant ? En quoi diffèrent-ils ?

5. On croise les génotypes suivants : Aa Bb Cc Dd X Aa Bb Cc Dd

Quel est, dans la descendance, la proportion des génotypes suivants :

a) Aa Bb Cc Dd

b) aa bb cc dd

c) Aa Bb cc Dd

d) AA BB CC DD

6. Chez le lapin, la robe tachetée (T) domine la robe unicolore (t) et la coloration noire (N) domine la coloration brune (n). Un lapin de couleur brune tacheté est accouplé à un autre dont la robe est unicolore noire et tous les descendants sont noirs tachetés.

a) Quels sont les génotypes des parents?

b) Quelle serait l’apparence des individus en F2 issus de deux lapins noirs tachetés de la F1?

7. Supposons que nous avons une plante dihybride AaBb.

a) Quel rapport phénotypique produira l’autofécondation de cette plante ?

b) Quel rapport génotypique produira l’autofécondation de cette plante ?

c) Quel rapport phénotypique résultera d’un croisement test de cette plante ?

d) Quel rapport génotypique résultera d’un croisement test de cette plante ?

8. La couleur normale de l’œil chez la drosophile est rouge, mais il existe aussi des drosophiles avec les yeux bruns. De même, normalement les ailes des drosophiles sont longues, mais il existe des souches à ailes courtes. Une femelle issue d’une lignée pure à yeux brunes et ailes courtes est croisée avec un male d’une lignée pure normale.

La F1 est constituée de femelles normales et de males à ailes courtes.

Une F2 est ensuite produite en croisant des drosophiles de la F1 entre elles. Les descendants de la F2 de deux sexes présentent les phénotypes suivants :

3/8 yeux rouges, ailes longues

3/8 yeux rouges, ailes courtes

1/8 yeux bruns, ailes longues

1/8 yeux bruns, ailes courtes

Déduisez le mode de transmission de ces phénotypes. Indiquez les génotypes de trois générations et les proportions génotypiques de la F1 et de la F2.

3.3. Les exceptions aux lois de Mendel

Les résultats obtenus par Mendel à partir de croisements entre différents types d'hybrides et matérialisés dans les rapports de ségrégation phénotypique, 3 : 1 dans les croisements monohybrides et 9: 3: 3: 1 dans les croisements dihybrides, ont été testés et démontrés sur de nombreux organismes végétaux et animaux.

Les expériences post-mendéliennes ont démontré l'apparition de différentes catégories de phénotypes dans des proportions différentes de celles qui pourraient être expliquées par les lois de Mendel. Ces changements sont dus à l'interaction entre différents gènes allèle et neallèle.

L'interaction génique est le phénomène par lequel un gène, par son effet, influence à des degrés divers, jusqu'à l'annulation, l'effet d'un autre gène. Certaines de ces interactions se produisent seulement entre les gènes allèles (les interactions alléliques) et d'autres se produisent entre des gènes situés dans des loci différents (les interactions nealléliques).

3.3.1. Les interactions alléliques

Les interactions alléliques se manifestent principalement sous la forme d'une dominance complète, d'une dominance incomplète (semidominance), d’une codominance, d'une surdominance et de gènes létaux. Un aspect particulier de l'interaction allélique est représenté par le phénomène polyallélique.

3.3.1.1. La dominance incomplète (la semidominance)

La dominance incomplète décrit la situation dans laquelle le phénotype d’un hétérozygote (Aa) est intermédiaire entre ceux de deux homozygotes (par ex. AA et aa), sur une échelle de mesure qualitatif. Par conséquent, les hybrides de la génération F1 ont un phénotype intermédiaire (entre les deux phénotypes) par rapport à la génération parentale. Ce phénomène se produit chez les individus hétérozygotes (Ex: Mirabilis jalapa).

En croisant une plante de M. jalapa avec des fleurs rouges (AA) avec une plante à fleurs blanches (aa), Carl Correns a obtenu en F1 des plantes avec des fleurs roses, un couleur intermédiaire aux couleurs des parents.

Par l'autofécondation des hybrides obtenus en F1, Correns a obtenu en F2 trois types de phénotypes dans les proportions suivantes: 25% plantes à fleurs rouges (AA), 50% plantes à fleurs roses (Aa) et 25% plantes à fleurs blanches (aa). Il en résulte que le rapport de ségrégation génotypique est similaire avec le rapport de ségrégation phénotypique de 1: 2: 1.

Le gène A ne se manifeste pas totalement dominant sur son allèle a, et l'allèle a ne se manifestent pas totalement récessifs sur allèle A. Les deux gènes occupant le même locus se manifestent avec une intensité égale.

Des résultats similaires ont également été obtenus chez les animaux. Ex. dans les poulets d'Andalousie, où certains individus sont noirs, d'autres sont blancs et ceux qui ont une dominance incomplète sont gris-bleu; ou bovins Shorthorn, où certains individus ont la couleur rouge, d'autres sont blancs, et ceux qui ont une dominance incomplète sont de couleur pêche.

3.3.1.2. La codominance

La codominance décrit la situation dans laquelle un hétérozygote présente les effets phénotypiques des deux allèles, de manière équivalente. Les deux allèles d’un gène se manifestent complètement et de manière indépendante dans le phénotype chez un individu hétérozygote. On dit que ces deux allèles sont codominants.

Deux allèles qui s'expriment de façon codominant signifient qu'ils ont le même taux d'expression, généralement obtenu à un niveau quantitatif. Le phénotype du génotype codominant hétérozygote ne sera ni dominant ni récessif, mais présentera un mélange d'attributs de formes parentales homozygotes.

Exemple: Groupes sanguins humains ABO. Les allèles (IA ou IB) déterminent le type d’antigène présent à la surface des globules rouges, tandis qu’allèle i indique l’absence de tels antigènes. Le croisement d'un individu dans le groupe sanguin A avec un individu dans le groupe sanguin B, peut conduire à l'apparence des individus avec le groupe sanguin AB, signifiant que les deux types d'antigènes (A et B) sont présents sur la surface des globules rouges. Les allèles IA et IB sont totalement dominants, mais ils sont codominats dans le génotype IAIB.

3.3.1.3. La surdominance

Le terme surdominance a été introduit en biologie par R.A. Fisher (1918). F.H. Hull (1945, 1946) a été celui qui a formulé la théorie de la surdominance. Après Hull, l'effet d'un gène est plus important lorsqu'il agit dans un état hétérozygote que dans un état homozygote parental. Parfois, le phénotype d'un individu hétérozygote est plus extrême que celui de deux individus homozygotes parentaux. Dans cette situation particulière, la valeur du phénotype hétérozygote ne sera pas égale à celle de l'homozygote dominant. La différence de valeur est due à l'interaction établie entre les gènes dominants et leurs allèles récessifs issus du même locus.

Dans un tel exemple, si aa donne une fleur d'un rose léger et AA une fleur d'un rose foncé, Aa donnera de son côté une fleur d'un rouge profond. Ce phénomène est appelé la surdominance. Il concerne, entre autres, le système immunitaire: les individus qui sont hétérozygotes sur les paires d'allèles codant pour le système immunitaire sont souvent en meilleure santé que les individus qui sont homozygotes sur ces gènes (ce quels que soient leurs allèles) et ils ont de meilleures chances de survie.

Pour la plupart des espèces animales, la surdominance est évidente dans le cas de certaines caractéristiques. Le croisement entre des individus homozygotes avec des manifestations relativement faibles de différentes caractéristiques a produit des hybrides hétérozygotes avec des caractéristiques nettes supérieures.

Dans cette interaction allélique, le rapport de ségrégation phénotypique, modifié, de 1: 2: 1, fait référence aux caractères physiologiques: robustesse, vigueur, viabilité, mais aussi morphologique: taille, etc.

3.3.1.4. Les allèles létaux

La présence d’allèles létaux modifie généralement les rapports phénotypiques Mendéliens attendus, en raison du manque de viabilité des gamètes ou des produits qui en résultent. La létalité représente la mort des zygotes ou des certains organismes à différents stades de leur développement, avant qu'ils atteignent la maturité. Le phénomène de létalité est déterminé par l'action de gènes récessifs ou dominants, homozygotes, appelés gènes létaux.

Si un certain caractère est déterminé par des gènes létaux, alors un rapport de ségrégation phénotypique modifié de 2: 1, au lieu de 3: 1, apparaît dans F2. La modification en F2 du rapport de ségrégation phénotypique normal est due au fait que tous les individus récessifs homozygotes (si le gène létal est récessif) ou tous les homozygotes dominants (si le gène est dominant) meurent dans différents stades de développement ontogénique.

En 1905, le zoologiste français L. Cuenot a étudié une variété de souris jaunes par rapport aux souris grises ou agouti (type sauvage). En croisant les souris jaunes entre eux, Cuenot a obtenu des descendants jaunes dans un rapport de 2: 1. Le chercheur a conclu que les souris jaunes sont hétérozygotes. Pour la couleur de la robe, il peut y avoir deux allèles différents: Ay et Avy. Ay est un allèle dominant qui détermine la couleur jaune et dont l'effet secondaire est la létalité en état homozygote. L'allèle Avy a un effet variable sur la couleur, de l'agouti au jaune, mais n'a pas d'effet létal en état homozygote.

F1 : AyAvy x AyAvy

F2 : AyAy AyAvy AyAvy AvyAvy

jaune non viable jaune viable agouti viable

RSP : – : 2 : 1

3.3.1.5. Les allèles multiples

Typiquement, dans le même locus sur les deux chromosomes homologues, il existe deux formes alléliques: l'allèle de type sauvage, sur un chromosome et l'allèle modifié, sur l'autre chromosome. C'est ce qu'on appelle l'allélisme simple. Il y a des gènes qui possèdent plus de deux allèles. On appelle ce phénomène décrit par Morgan en 1914, allèles multiples.

Le gène tête en série, à partir duquel il a commencé le processus de changements répétés, est dominant par rapport aux gènes modifiés qui en dérivent. Le gène suivant est récessif par rapport au gène d'origine, mais il est dominant par rapport au gène suivant, modifié, de la série polyallélique.

Exemple la coloration du pelage chez le lapin. Le gène dominant C détermine la couleur du lapin sauvage (agouti). Son allèle récessif cch produit la couleur chinchilla, caractérisé par un mélange de cheveux blancs et noirs. Cet allèle subit une nouvelle transformation en ch et détermine la couleur de l'himalaya, dans lequel le corps est blanc et les extrémités noires, et qui peut alors passer dans l'allèle récessif c, qui détermine le type albinotique. Les allèles multiples d’un même gène conduisent à une hiérarchie dans la dominance: C > cch> ch> c. Agouti est dominant par rapport au couleur chinchilla; chinchilla est récessif avec agouti, mais dominant avec himalaya; himalaya est récessif avec chinchilla, mais dominant avec albinos.

PROBLÈME D'APPLICATION

1. Si nous croisons un taureau de la race Shorthorn qui a un allèle homozygote codominant pour la couleur rouge avec une vache qui a un allèle homozygote codominant pour la couleur blanche, quelle sera la couleur de veaux produits? Quelle sera la couleur de la génération F2, et en quelle rapport de ségrégation phénotypique? Les gènes sont CR et CB.

2. Un cheval Appaloosa possède des allèles hétérozygotes codominats blancs et gris, ce qui lui donne une apparence tachée. Quelle sorte de croisement nous donne des chevaux Appaloosa? Quelle est la couleur des chevaux obtenus lorsqu'on croise des Appaloosa ensemble?

3. Les poulets hétérozygotes Cp sont appelés creeper et ont des pattes et des ailes courtes, par rapport au génotype normal cp. Le gène dominant Cp est létal à l'état homozygote. Deux allèles d'un second gène déterminent la couleur blanche W_ ou la jaune ww de la peau. En croisant des poulets hétérozygotes pour les deux gènes, quelles classes phénotypiques se produiront chez la progéniture vivante et en quel rapport de ségrégation phénotypique.

4. La coloration du pelage chez le bétail est sous la dépendance de la série allélique S>sh>sc>s (c’est-à-dire que S domine sh, sc et s ; sh domine sc et s ; sc domine s). S conduit à former une bande blanche autour de la taille de l’animal, caractère appelé « ceinture hollandaise » ; sh conduit au tacheté Hereford, sc conduit à une robe unie et s au tacheté Holstein.

Des taureaux à ceinture hollandaise de génotype Ss sont croises avec des vaches Hereford de génotype shsc. Faites l’analyse de la descendance obtenue.

3.3.2. Les interactions nealléliques

Dans certains cas, le développement d'un caractère est contrôlé par plusieurs gènes situés dans des locus différents. Ces locus peuvent être trouvés sur le même chromosome ou sur plusieurs chromosomes nehomologues.

Comme Mendel a établi, lorsque deux paires de gènes ayant des relations de domination complètes entre les allèles situés sur des chromosomes différents, déterminent deux caractères différents, les résultats de la ségrégation phénotypique en F2 suivent le rapport classique 9: 3: 3: 1. Les quatre catégories génotypiques qui déterminent les quatre catégories phénotypiques sont: A_B_, A_bb, aaB_ et aabb. Le phénotype n'est pas influencé par la nature du second allèle représenté par "_".

Lorsqu'un caractère est déterminé par deux paires de gènes allèles entre lesquels il existe diverses interactions nealléliques, une variété de rapports de ségrégation phénotypique peut se produire, selon le type et le degré d'interaction. Les quatre catégories génotypiques de base restent les mêmes, mais en raison des interactions entre les deux paires de gènes, 2 ou 3 catégories génotypiques du 4 peuvent avoir le même phénotype. De cette manière, les proportions de ségrégation phénotypique diffèrent de celles décrites par Mendel (9: 3: 3: 1), entraînant l'apparition d'exceptions aux proportions mendéliennes.

Après l'effet produit et le mécanisme de l'interdépendance, les interactions entre les gènes nealléliques peuvent être: épistatiques, complémentaires, pléiotropes et polymériques.

3.3.2.1. Les interactions épistatiques

L'épistasie désigne l'interaction existant entre deux ou plusieurs gènes. Il y a épistasie lorsqu'un ou plusieurs gènes (dominants ou récessifs) masquent ou empêchent l'expression de facteurs situés à d'autres lieux génétiques (locus). Le gène situé à un locus qui supprime ou masque l’action d’un gène situé à un autre locus est appelé épistasique. Le gène ou locus dont l’expression a été supprimé est appelé hypostasique.

Les effets épistatiques les plus évidents chez les animaux sont associés à l'hérédité des couleurs des robes.

L'épistasie doit être distinguée du phénomène de la dominance, l'épistasie impliquant des gènes neallèliques, alors que la dominance se manifeste entre les gènes allèles.

Le gène épistatique peut faire partie d'une paire de gènes neallèliques dominants ou d'une paire de gènes neallèliques récessifs, et l'épistasie peut être: dominant et récessive.

Il existe trois formes d'épistasie :

L'épistasie dominante où c'est un gène dominant qui influencera l'expression d'un autre gène codant un phénotype différent, le gène épistatique est dominant (RSP = 12 :3 :1).

L'épistasie récessive où c'est un gène récessif qui influencera l'expression d'un autre gène codant un phénotype différent, le gène épistatique est récessif (RSP = 9 :3 :4).

L'épistasie dominante et récessive, lorsqu'un gène épistatique dominant produit le même effet phénotypique que le génotype récessif homozygote du locus hypostatique (RSP = 13 :3).

1. L'épistasie dominante 12 :3 :1

Si l’allèle dominant d’un locus (gène) A est responsable de l’expression d’un certain phénotype quelle que soit l’allèle présent à l’autre locus (B, b), on dit que le locus A est épistasique sur le locus B. Cette épistasie est dominante, car l’allèle A peut s’exprimer en présence de B et b. Les allèles du locus hypostasiques (B, b) ne pourront s’exprimer que chez les individus homozygotes récessifs pour le locus (a). Par conséquent, les génotypes A_B_ et A_bb auront le même phénotype (12:16), le génotype aaB_ aura le phénotype du gène B (3:16) et aabb aura le phénotype du gène b (1:16).

Proportions classiques Gènotypes Proportions modifiés

9/16 A_B_

3/16 A_bb

3/16 aaB_ 3:16 le phénotype du gène B

1/16 aabb 1:16 le phénotype du gène bb

Exemple

Parent:  Violet  x  rouge
F1 :                        Violet

F2 : 12 violets : 3 rouges : 1 blanc.

Interprétation
L’allèle A détermine la coloration violette
L’allèle B détermine la coloration rouge
L’allèle A est épistatique sur B et b

2. L'épistasie récessive 9 :3 :4

Si le génotype récessif d’un locus (aa) empêche l’expression des allèles du locus B, on dit que le génotype aa exerce une épistasie récessive sur le locus B (B ou b). Les allèles du locus hypostasique B (B ou b) ne pourront s’exprimer qu’en présence de l’allèle dominant A. Pour cette raison, le génotype A_B_ représentera le phénotype du gène B (9:16) et A_bb du phénotype du gène b (3:16), et les génotypes aaB_ et aabb produiront le phénotype épistatique aa (4:16).

Ainsi, les proportions phénotypiques classiques 9 :3 :3 :1 deviennent 9 :3 :4.

Proportions classiques Gènotypes Proportions modifiés

9/16 A_B_ 9 :16 le phénotype du gène B

3/16 A_bb 3 :16 le phénotype du gène B

3/16 aaB_

1/16 aabb

Exemple

Le croisement entre une souris grise et une souris albinos donne une F1 constituée par des individus à robe grise, et une F2 formée de : 9 à robe grise : 3 à robe noire et 4 à robe albinos. Interprétez.

Parent : ♀ Souris grise x ♂ Souris albinos

F1 : Souris grises

F2 : 9 souris grises : 3 souris noires : 4 souris albinos.

Interprétation

• La F1 est à 100% homogène, l’Ière loi de Mendel est donc vérifiée.

• Les proportions phénotypiques de la F2 indiquent qu’il s’agit d’un dihybridisme avec épistasie récessive simple : interaction entre deux gènes qui codent pour un même phénotype, la coloration.

• La 3ème loi de Mendel est vérifiée : indépendance génétique.

• Cas de dominance :

L’allèle A, dominant, représente la pigmentation possible.

L’allèle a, récessif, représente l’impossibilité de pigmentation.

L’allèle B, dominant représente la coloration grise.

L’allèle b, récessif, représente la coloration noire.

Phénotypes: 9/16 [AB] grises

3/16 [Ab] noires

4/16 [a -] albinos

Nous pouvons présenter « B » et « b » comme des allèles qui ne peuvent déterminer la production de leurs pigments respectifs qu’avec la collaboration de « A ».

On peut imaginer que « B » et « b » sont chacun responsables de la production du précurseur d’un pigment et que ces précurseurs (enzymes fonctionnels) nécessitent la présence d’une substance ou enzyme qui les activent dont la production est sous contrôle de « A ».

« a » à l’état homozygote ne permet pas la production de cette substance complémentaire ou de cette enzyme. Ce qui suppose que « aa » empêche l’expression de « B » et « b ».

« a » en double dose est donc épistatique sur « B » et « b ». Comme le gène est récessif par rapport à « A » l’épistasie qu’il détermine est dite récessive.

Conclusion: deux enzymes codés par des gènes séparés sont impliqués dans la production de pigments responsables de la coloration.

3. L'épistasie dominante et récessive 13 :3

L'épistasie dominante et récessive se manifeste par le fait que le phénotype du gène épistatique dominant A est équivalent au phénotype récessif homozygote du locus hypostatique bb. Dans ce cas, les individus A_B_, A_bb et aabb ont le même phénotype, le phénotype du gène A (13 :16), et les individus aaB_ présentent le phénotype du gène B (3 :16).

Proportions classiques Gènotypes Proportions modifiés

9/16 A_B_ 12 :16 le phénotype du gène A

3/16 A_bb

3/16 aaB_ 3 :16 le phénotype du gène B

1/16 aabb 1 :16 le phénotype du gène A

Exemple

Chez la poule, un croisement entre un individu de race Leghorn blanche et un individu de race Wyandotte blanche s’exprime par une F1 entièrement blanche et une F2 faite de 13 individus blancs et 3 pigmentés. Formulez une hypothèse qui permet d’interpréter ces résultats.

Interprétation

Le rapport 13:3 semble être une modification du rapport dihybride 9:3:3:1 dans laquelle tous les génotypes contenant au moins un A (au nombre de 12) et le génotype aabb produisent le même phénotype blanc, alors que les autres au nombre de 3 produisent un plumage pigmenté. Ces résultats peuvent-être interprétés en supposant 2 épistasies, l’une dominante et l’autre récessif.

3.3.2.2. Les interactions complémentaires

Les interactions complémentaires consistent en ce qu'au moins deux gènes de différents locus interagissent de manière complémentaire (coopèrent) pour produire plusieurs formes phénotypiques du même caractère.

Il y a trois types d’interactions complémentaires:

1. La complémentarité de dominance donnée par deux gènes neallèles qui déterminent seuls des phénotypes différents (R = 9: 3: 3: 1). Deux gènes neallèles dominants (A ou B) provoquent chacun un phénotype, et lorsqu'ils sont ensemble dans le même génotype, ils interagissent en produisant un nouveau phénotype. Bien que le rapport de ségrégation soit similaire à celui décrit par Mendel, il diffère car, dans le cas de cette interaction complémentaire, il s’agit d’un caractère unique se manifestant dans 4 phénotypes différents.

Proportions classiques Gènotypes Proportions modifiés

9/16 A_B_ 9 :16 le phénotype du gène A+B

3/16 A_bb 3 :16 le phénotype du gène A

3/16 aaB_ 3 :16 le phénotype du gène B

1/16 aabb 1 :16 le phénotype récessif

Exemple

Les gènes qui déterminent la forme de la crête aux poulets (Gallus domesticus).

Chez les poulets d'Andalousie, la crête il y a quatre formes différentes déterminées par l'action de deux gènes (Figure 3.1.). Le gène A détermine la crête en rose, le gène B, la crête battue et le double homozygote récessif détermine la crête simple. Par le croisement entre des oiseaux avec la crête en rose avec des oiseaux avec la crête battue, dans F1 apparaît un oiseau avec un nouveau type de crête, la crête de noyer.

La crête de noyer A_B_ La crête en rose A_bb

La crête simple aabb La crête battue aaB_

Fig. 3.1. Formes de crête chez les poules d'Andalousie

(Hartl et col., 1988)

Bien que le rapport de ségrégation phénotypique obtenu, 9: 3: 3: 1, est caractéristique pour les croisements dihybrides, le résultat obtenu est différent dans deux aspects:

– Les descendants F1 ont un phénotype différent (la crête de noyer) des phénotypes des parents (la crête battue et la crête de rose).

– Deux phénotypes (crête de noyer et crête simple), qui ne sont pas présents chez les parents, apparaissent chez les descendants dans F2.

2. La complémentarité de dominance donnée par deux gènes neallèles qui déterminent seuls des phénotypes similaires (R = 9: 7). Deux gènes neallèles dominants (A ou B) déterminent chacun le même phénotype et le phénotype donné est identique au phénotype produit par l'homozygote récessif. Dans ce cas, il en résultera deux phénotypes différents: A_B_ (9:16) et les trois autres identiques, A_bb, aaB_, aabb (7:16).

Proportions classiques Gènotypes Proportions modifiés

9/16 A_B_ 9 :16 le phénotype du gène A+B

3/16 A_bb

3/16 aaB_

1/16 aabb

3. La complémentarité de récessivite (R = 15: 1). Dans ce cas, les gènes récessifs de différents locus interagissent de manière complémentaire, produisant un nouveau phénotype, différent de celui déterminé par les allèles dominants. Ceci se traduira par: A_B_, A_bb ou aaB_ le phénotype du génotype A, B ou A + B (15:16) et le phénotype récessif aabb (1:16).

Proportions classiques Gènotypes Proportions modifiés

9/16 A_B_

3/16 A_bb

3/16 aaB_

1/16 aabb 1 :16 le phénotype récessif

!!! L'interaction génique complémentaire est le phénomène par lequel certains caractères sont déterminés par l'action concomitante de deux paires de gènes neallèles.

3.3.2.3. La pléiotropie

La pléiotropie, du grec "pleion" (plus), et tropê (changement) qualifie un gène qui détermine plusieurs caractères phénotypiques.

Exemple

Dans le vison (Mustella vison), le gène h, en double dose, détermine la réduction totale des pigments capillaires, ce qui rend la fourrure des porteurs complètement blanche.

Le génotype hh a cependant un effet pléiotrope, agissant également sur la fonction auditive. Les homozygotes récessifs sont complètement sourds, ce qui pose un problème majeur pour la multiplication et la croissance des visons blancs.

3.3.2.4. La polymérie

Hérédité caractérisée par le fait que plusieurs gènes distincts additionnent leurs effets pour réaliser les divers degrés d'un caractère donné. La coloration de la peau, des cheveux sont des exemples de polymérie.

PROBLÈME RÉSOLU ET EXPLICATIONS

Exemple de la couleur du pelage des souris. Les gènes qui déterminent la couleur du pelage sont B, noir (dominant) et b, brun (récessif). Les gènes qui déterminent la synthèse du pigment sont C, synthèse (dominant) et c, pas de synthèse (récessif). En croisant des souris hétérozygotes pour les deux gènes, quelles classes phénotypiques se produiront et en quel rapport de ségrégation phénotypique.

PROBLÈME D'APPLICATION

1. La couleur du pelage chez le chien dépend de l'action d'au moins deux gènes. Un gène épistatique dominant inhibe la synthèse du pigment et ne permet donc pas aux allèles d'un autre locus (B et b) de se manifester, ce qui provoque l'apparition d'une couleur blanche.

Chez les chiens récessifs homozygotes au locus épistatique aa, les allèles du locus hypostatique peuvent se manifester et les génotypes aaB_ seront noirs, et les aabb, bruns.

Si deux hybrides blancs sont accouplés, déterminez le rapport de la ségrégation phénotypique du descendant.

2. Chez les poulets, la crête il y a quatre formes différentes déterminées par l'action de deux gènes neallèles. Le gène A détermine la crête en rose, le gène B, la crête battue et le double homozygote récessif détermine la crête simple. Par le croisement entre des oiseaux avec la crête en rose avec des oiseaux avec la crête battue, dans F1 apparaît un oiseau avec un nouveau type de crête, la crête de noyer.

Déterminez le rapport de ségrégation des formes de crête dans F2 en utilisant le carré de Punnet.

3.4. Linkage et crossing-over

3.4.1. La liaison génétique ou le linkage

La liaison génétique (ou génétique linkage) désigne le fait que deux allèles de deux gènes différents ont tendance à être transmis ensemble d'un individu à sa descendance. Si deux gènes analysés se trouvent sur chromosomes différents, ils se sépareront ensemble avec les chromosomes sur lesquels ils sont placés, en respectant la loi de ségrégation des caractères.

Par conséquent, pour analyser deux gènes d'intérêt, il est obligatoire de savoir s'ils se trouvent sur des chromosomes différents ou sur le même chromosome. La localisation des deux gènes se fait à l'aide d'un croisement test, qui consiste à l'accouplement avec un homozygote récessif ou un back-cross, où l'accouplement est effectué avec le parent homozygote récessif.

1. La transmission indépendante de deux gènes situés sur des chromosomes différents

Si deux gènes analysés se trouvent sur chromosomes différents, le résultat du croisement test, en d'autres termes, le croisement d'un double hétérozygote avec un parent double homozygote récessif se concrétise dans la production de 4 catégories phénotypiques en proportions égales (1: 1: 1: 1). Comme le rapport de la ségrégation phénotypique 1: 1: 1: 1 montre une dissociation indépendante, ces gènes avec une position chromosomique inconnue qui donnent ce résultat par le croisement test sont plus susceptibles d'être situés sur des chromosomes différents.

P : AaBb x aabb

G : AB Ab aB ab ab

F1 : AaBb Aabb aaBb aabb

R : 25% : 25% : 25% : 25%

1 : 1 : 1 : 1

Tout écart significatif du rapport 1: 1: 1: 1 montre autre chose qu'une ségrégation indépendante, et la présence des deux gènes sur le même chromosome constitue l'explication la plus probable.

2. La transmission liée, ensemble, des deux gènes qui se trouvent sur le même chromosome

Lorsqu'un croisement test aboutit à une descendance dans laquelle les individus sont classés en deux catégories phénotypiques dans des proportions égales, reproduisant des phénotypes parentaux, les gènes analysés se trouvent sur la même paire de chromosomes homologues et sont transmis ensemble, enchaînés.

La tendance des gènes placés sur le même chromosome à être transmis à la progéniture par leur distribution associée dans les gamètes s'appelle liaison génétique ou le linkage.

Chez les organismes supérieurs, l'existence d'un plus grand nombre de chromosomes permet de différencier un plus grand nombre de groupes de liaison (de linkage). Chez les organismes diploïdes, le nombre de groupes de liaison (de linkage) correspond au nombre de chromosomes non homologues dans l'ensemble haploïde (n) et non au nombre total de chromosomes (2n).

Les gènes A et B sont liés et sont transmis ensemble, en ce cas les descendants ont la même combinaison de caractères que les parents. Pour suggérer leur placement sur le même chromosome et leur liaison, les génotypes seront écrits sous la forme d’une fraction.

P : AB/ab x ab/ab

G : AB ab ab

F1 : AB/ab ab/ab

R : 25% : 25%

1 : 1

Dans cette situation, les gènes A et B ou a et b sont toujours transmis ensemble, phénomène appelé linkage complète. Un linkage est complet lorsque les gènes liés ne se séparent pas.

3. La transmission de gènes après le crossing-over

Si un crossing-over se produit exactement entre les gènes suivis, en plus des gamètes parentaux se produiront également des gamètes recombinés. C'est le phénomène de linkage incomplet. Le linkage est incomplet lorsque les gènes peuvent se séparer grâce au phénomène de crossing-over mais moins fréquemment que les gènes indépendants.

L'effet du crossing-over simple dans la production de gamètes parentaux recombinants sera étudié.

Les gamètes sont : AB Ab aB ab

On peut observer qu'à partir de la division méiotique d'une cellule double hétérozygote, il peut en résulter 4 gamètes avec des combinaisons des gènes différents dans un rapport de 1/4 AB, 1/4 Ab, 1/4 aB et 1/4 ab. Ce résultat a été obtenu grâce à un seul chiasma entre les locus A et B.

La proportion de cellules entre lesquelles des chiasmes sont produits entre deux locus d’une tétrade chromosomique est appelée la fréquence du chiasma. Cette fréquence est constante dans une espèce, avec une valeur moyenne de cette espèce.

Si la fréquence des chiasmas entre deux gènes est maximale (c.-à-d. 100%, c'est-à-dire des chiasmes se produit entre toutes les cellules qui se divise méiotiquement), au plus 50 gamètes recombinants sont produits ou, en d'autres termes, la recombinaison entre deux gènes liés ne peut dépasser 50%, la fréquence de crossing-over n'est donc toujours que la moitié de la fréquence du chiasma.

Plus la fréquence des chiasmas sont élevée, plus la proportion de gamètes recombinants est élevée et donc plus les types recombinés sont nombreux et vice versa.

3.4.1.1. La liaison des gènes aux positions « cis » et « trans »

Un double hétérozygote pour deux gènes liés peut avoir deux constitutions suivant la position relative des différents allèles. Quand les deux allèles dominants (ou sauvages) sont sur le même chromosome et les deux allèles récessifs (ou mutés) sont sur le chromosome homologue, la liaison est dite Cis (coupling). Si par contre, chaque chromosome porte un allèle dominant à l’un des deux loci et un allèle récessif à l’autre, la liaison est dite en Trans (répulsion) (Figure 3.2.).

Position Cis (coupling) Position Trans (répulsion)

Fig. 3.2. Les positions de genes « cis » et « trans »

3.4.2. L’échange réciproque de gènes ou le crossing-over

La recherche des caractères déterminés de gènes placés sur le même chromosome a mis en évidence l'existence de nombreuses exceptions à la transmission des gènes.

Par conséquent, les gènes placés sur le même chromosome sont divisés en:

– Des gènes complètement liés. On parle des gènes incomplètement liés lorsque les proportions des 4 catégories phénotypiques sont différentes des proportions 1:1:1:1. De plus, les gamètes parentaux sont plus fréquents que les gamètes recombinés.

– Des gènes incomplètement liés. Le linkage complet semble être un phénomène rare jusqu’à maintenant. Il n’est connu que chez le mâle des espèces du genre Drosophile et chez la femelle du ver à soie (Bombyx). Il y’ a donc linkage incomplet chez la drosophile femelle, le mâle du ver à soie et chez les deux sexes de toutes les autres espèces animales et végétales qui ont été étudiées.

Au cours de la prophase réductionnelle, les homologues s’apparient (stade zygotène) puis s’enjambent (stade diplotène) pour former des chiasmas. Il est alors possible qu’en ce point de contact entre les chromosomes d’une même paire, une partie de la chromatide de l’un s’échange avec la partie correspondante de la chromatide de l’autre, phénomène appelé crossing-over (Figure 3.3.). La liaison ou linkage incomplète pourrait être expliquée quand il a été trouvé que entre les chromosomes homologues se produit un échange réciproque de gènes.

Fig. 3.3. Le crossing-over entre deux gènes

(http://passeport.univ-lille1.fr/site/biologie/GenetiqueMendelienne/GenetiqueMendelienne.pdf)

Lorsque le croisement test aboutit à 4 classes phénotypiques dont les proportions ne sont pas égales (les deux classes possédant le phénotype des parents dépasseront 50% du total des descendants, alors que les deux nouvelles classes phénotypiques seront inférieures à 50% du total des descendants), ça va prouver que les deux caractères analysés sont déterminés par deux gènes situés sur le même chromosome, mais ils sont en liaison incomplète, ce qui permet la réalisation d'un crossing-over.

Les nouvelles combinaisons de gènes obtenues par crossing-over portent le nom de recombinaisons et les gènes ainsi associés sont appelés gènes recombinés.

Les porteurs de gènes recombinants sont appelés formes inattendues. Les porteurs de gènes rester dans les combinaisons existantes chez les parents sont appelés formes attendu ou formes parentales.

3.4.2.1. Les types de crossing-over

Le processus de crossing-over assure en brisant et en fusionnant au même niveau des segments chromosomiques, un échange réciproque, équilibrés, des segments égaux, avec un nombre égal de gènes.

En fonction du nombre de points de rupture sur les chromatides bivalentes, il existe plusieurs types de crossing-over.

1. Le crossing-over simple, lorsqu'un seul point de rupture se produit, au même niveau, entre deux chromatides d'une tétrade.

2. Le crossing-over double, lorsque deux crossing-over simples ont lieu entre deux gènes.

3. Le crossing-over multiple, lorsque deux ou plus crossing-over sont produits simultanément, avec plus de 3 gènes impliqués dans le processus.

4. Le crossing-over inégal, Le crossing-over inégal, n'est pas toujours caractérisé par un échange égal de segments chromatidiques. Le crossing-over inégal entraîne la duplication du locus d'un gène sur l'un des chromosomes homologues et la disparition de ce locus sur l'autre chromosome homologue.

3.4.2.2. Les facteurs qui affectent le crossing-over

La création d'un crossing-over reflète la force de liaison des gènes dans un chromosome. Plus la liaison entre les gènes est plus fort, les gènes sont plus distants entre eux, plus la possibilité de la production d’un ou de plusieurs crossing-over augmente.

Ainsi, aux chromosomes très courts, il n'y a qu'un seul chiasma et donc un seul crossing-over, alors qu’aux chromosomes plus long, le nombre de chiasmes augmente proportionnellement à la longueur du chromosome.

3.4.2.3. L’importance du crossing-over

Premièrement, le crossing-over assure la grande variabilité génétique des organismes qui se multiplient par méiose.

Deuxièmement, la fréquence du crossing-over ou de recombinaison dépend de la distance qui sépare les gènes sur un même chromosome. Plus cette distance est grande et plus la probabilité qu’un crossing-over ait lieu entre ces gènes est grande. Cela signifie que plus les gènes sont proches, moins il est probable qu’un crossing-over se produise entre eux.

La distance entre deux gènes se définit par la fréquence d’apparition d’événements de recombinaisons entre ces deux gènes d’une génération à l’autre. Cette fréquence constitue l’unité de mesure des cartes génétiques : 1% de recombinaison = 1 centiMorgan (cM).

PROBLÈME RÉSOLU ET EXPLICATIONS

1. Supposons que deux gènes A et B produisent des chiasmes à une fréquence de 80%. Quelle sera la proportion de types recombinants qui résulte après un croisement test?

Solution

Les génotypes AB / ab sont combinés avec ab / ab.

La fréquence de chiasma signifie que sur 100 cellules qui sont divise par la méiose 80 produit des chiasmes et 20 ne produisent pas de chiasmes et se divisent sans crossing-over dans cette position.

Les gamètes

80 AB

80 cellules AB/ab avec des chiasmes 80 Ab

80 aB

80 ab

Les gamètes

20 cellules AB/ab sans des chiasmes 40 AB

40 ab

Total gamètes : Proportion :

AB : 80+40=120 30% AB – parentaux

Ab : 80 20% Ab – recombiné

aB : 80 20% aB – recombiné

ab : 80+40=120 30% ab – parentaux

La fréquence de crossing-over 20 + 20 = 40%

Les résultats du croisement test :

P : AB/ab x ab/ab

G : 0,3 AB 0,2 Ab 0,2 aB 0,3 ab

R : AB/ab Ab/ab aB/ab ab/ab

30% 20% 20% 30%

40% crossing-over

2. Deux lignées pures de drosophiles, l’une à corps grise et soies normales, l’autre à corps ébène et soies épaisses, sont croisées entre elles. En F1, tous les insectes sont gris et présentent des soies normales. On effectue alors un croisement-test entre ces hybrides de première génération et la souche pure à corps ébène et soies épaisses qui aboutissent aux résultats suivants :

– 50% des insectes possèdent un corps gris et des soies normales,

– 50% des insectes possèdent un corps ébène et des soies épaisses.

a) Identifiez les caractères dominants et les caractères récessifs.

b) Quel est le génotype des hybrides obtenus en F1 ?

c) Pourquoi n’observe-t-on que deux catégories d’insectes lors du croisement-test ? Que pouvez- vous en déduire quant à la position des gènes sur les chromosomes ?

Pour s’assurer des résultats, on recommence exactement la même expérience mais cette fois la population d’insectes obtenue se décompose comme suit :

– 42,5% possèdent un corps gris et des soies normales,

– 7,5% possèdent un corps gris et des soies épaisses,

– 7,5% possèdent un corps ébène et des soies normales,

– 42,5% possèdent un corps ébène et des soies épaisses.

d) Par quel processus a-t-on pu obtenir un résultat différent ?

e) Représentez la garniture chromosomique de chaque type d’insecte obtenu.

Solution

a) Tous les hybrides obtenus en F1 présentant un corps gris et des soies normales, nous pouvons en déduire que les caractères « corps gris » et « soies normales » sont dominants alors que les caractères « corps ébène » et « soies épaisses » sont récessifs.

Nous poserons donc pour la suite :

– G pour « corps gris »,

– éb pour « corps ébène »,

– N pour « soies normales »,

– ép pour « soies épaisses ».

b) Les hybrides résultant du croisement de deux lignées pures, leur génotype comprendra les quatre allèles parentaux, soit G/éb; N/ép.

c) Le croisement-test s’effectuant entre un insecte de souche pure éb/éb; ép/ép et un hybride G/éb ; N/ép, nous devrions obtenir quatre phénotypes distincts.

Or, si seuls les phénotypes G ; N et éb ; ép apparaissent dans la descendance, c’est que l’hybride de F1 n’a produit que deux types de gamètes. Nous pouvons donc en déduire que les caractères « corps gris » et « soies normales » sont liés, de même que les caractères « corps ébène » et « soies épaisses ». Il s’agit d’un cas de linkage.

d) À l’inverse du cas précédent, nous obtenons cette fois quatre phénotypes distincts, les phénotypes G; ép et ép ; N apparaissant dans une plus faible proportion (7,5%) que les phénotypes G ; N et éb; ép (42,5%). Les gènes étant toujours liés, il y a donc eu crossing-over.

e)

PROBLÈME D'APPLICATION

1. Quels types des gamètes produit un individu avec le génotype AB / ab, si un crossing-over entre gènes peut avoir lieu?

2. Quel type de gamètes produit un individu dont le génotype est AaBb

a) si ses gènes sont sur des chromosomes différents

b) si les gènes sont sur le même chromosome sur lequel ne se produit pas crossing-over ?

3. À partir du rétrocroisement (back cross) d'un double hétérozygote Aa/Bb, dans une relation de liaison inconnue, les résultats suivants ont été obtenus.

42% AaBb 8% Aabb

42% aabb 8% aaBb

Déterminez si l'individu dihybride est en position cis ou trans et quelle est la fréquence du chiasma entre les locus A et B.

4. Dans quelle relation de linkage est le double hétérozygote Aa/Bb, sachant que depuis son croisement avec ab/ab, le rapport de ségrégation suivant résulte:

45% Aabb 5% AaBb

45% aaBb 5% aabb

5. Supposons que la longueur et la couleur de la fourrure des animaux soient déterminées par deux gènes liés: la fourrure long est déterminé par le gène A et la fourrure court par l'homozygote aa, la couleur noire est déterminé par le gène dominant B et le brun par l'homozygote bb.

En l'absence de crossing-over, quels sont les génotypes et phénotypes attendus d'un croisement entre les génotypes AB/ab x Ab/aB?

3.5. L’hérédité liée au sexe

3.5.1. L'importance de la reproduction sexuelle

L'existence du sexe et de la reproduction sexuée remplit une fonction biologique fondamentale, celle d'induire la variabilité génétique. La reproduction sexuée est assurée par la fécondation, c'est-à-dire par fusion des gamètes mâle et femelle donnant un œuf (ou zygote). Cette reproduction permet le maintien d'une diversité génétique au sein des populations, car elle assure le brassage génétique.

Une reproduction faisant intervenir la méiose et la fécondation ne reproduit pas à l'identique le patrimoine génétique des parents. La reproduction sexuée permet en effet la transmission des gènes d'une génération à l'autre mais en induisant de la variabilité génétique. C'est le brassage génétique qui permet une évolution de l'information génétique.

3.5.2. Les mécanismes génétiques pour déterminer le sexe

La plupart des mécanismes de détermination du sexe sont génétiques et peuvent s’inscrire dans deux types principaux: par les chromosomes sexuels et géniques.

3.5.2.1. Les mécanismes par les chromosomes sexuels

Dans toutes les cellules diploïdes, avec les paires d'autosomes, il existe également une paire de chromosomes sexuels ou hétérosomes.

Une percée très importante dans la compréhension de la détermination du sexe est la découverte des chromosomes sexuels au début du XXe siècle. Par la suite, il a été découvert que chez la plupart des organismes, bien qu’il y ait le même nombre de chromosomes chez les femelles et les mâles, un ou deux chromosomes additionnels sont représentés de façon inégale chez les deux sexes. Chez les mammifères, la femelle possède deux chromosomes sexuels identiques XX et le mâle un chromosome X et un chromosome Y. Le sexe chez les oiseaux est déterminé par des chromosomes appelés Z et W et les femelles sont le sexe hétérogamétique (ZW) tandis que le mâle possède deux chromosomes sexuels identiques ZZ. Selon la manière dont les chromosomes sexuels s'associent chez les zygotes, il peut y avoir plus de modèles de détermination du sexe:

1. Les mâles hétérogamétiques (Le type Drosophile)

Chez toutes les espèces de mammifères, y compris l'homme, le sexe est déterminé par le chromosome Y. Les mâles ont donc les 2n, XY et les femelles, 2n, XX. Le chromosome Y peut être considéré comme dominant sur X, car en sa présence, le zygote atteindra la masculinité. Ainsi, le mâle est hétérozygote et la femelle homozygote récessive. Toujours, à partir d'un tel croisement, le rapport de ségrégation sera de 1/2: 1/2, c'est-à-dire que la probabilité que des femmes ou des hommes soient nés est égale.

Chez les sauterelles, les criquets, cafards et quelques autres espèces d'insectes, il n'y a qu'un chromosome sexuel, appelé chromosome X. Les mâles ont un chromosome X (X0), 2n-1, les mâles sont hétérogamétique, alors que les femelles en ont deux (XX), 2n, les femelles sont homogamétique.

2. Les femelles hétérogamétiques (Le type Abraxas)

Le type Abraxas est le contraire du précédent, les femelles ayant le caryotype 2n, ZW, étant hétérogamétique et les mâles 2n, ZZ, homogamétique. Ce système de détermination du sexe se rencontre chez les oiseaux, les reptiles, certains amphibiens, certains poissons, certains isopodes, dont le cloporte (Pierce, 2012).

Une variante de la détermination du sexe chez les femelles hétérogamétique est le type papillon, où les femelles sont 2n-1, Z0 (Figure 3.4.).

Fig. 3.4. Déterminisme génétique des sexes

(www.bio.miami.edu)

3.5.3. Le phénomène du sexe-linkage

Les chromosomes X et Y ont différentes formes, tailles, fonctions et propriétés. Cependant, ils se conjuguent au cours de la division méiotique, réalisent des synapses, ce qui indique la présence de segments homologues. Les chromosomes sexuels présentent toujours une petite région homologue, où les gènes sont communs aux deux sexes, et une grande région différentielle (non homologue) où les gènes spécifiques au chromosome X et ceux spécifiques au chromosome Y n’ont pas d’équivalent dans l’autre sexe.

Tous les gènes trouvés sur le chromosome X sont appelés gènes liés au sexe. Les gènes situés dans la région homologue du chromosome X sont appelés gènes partiellement liés au sexe, car ils peuvent être combinés par crossing-over comme tous les gènes allèles autosomiques.

Les gènes authentiques liés au sexe ou complètement liés au sexe sont ceux placés dans la région non homologue ou différentielle du chromosome X. Il peut exister aussi des gènes non homologue sur le chromosome Y. Dans ce cas on parle de gènes holandriques car ils sont transmis exclusivement sur la lignée paternelle, du père à fils (Figure 3.5.).

Fig. 3.5. Représentation schématique des chromosomes sexuels

(www.nature.com)

Chez l’homme, on connait deux gènes holandriques : le gène pour la forme des doigts des pieds et un gène pour les poils sur la partie externe de l’oreille.

Les caractères liés au sexe sont déterminés par des gènes présents sur les chromosomes sexuels. Les gènes du chromosome X déterminent des caractères liés à l’X (les caractères sexuelles primaires et secondaires chez les femelles des mammifères) et les gènes du chromosome Y déterminent des caractères liés à l’Y.

Les gènes liés au sexe sont des gènes présents sur le X, mais qui n'a pas d'allèle sur le Y.

Le mode de transmission des caractères liés au sexe dépend si le gène lié au sexe est dominant ou récessif. La plupart des exemples de gènes liés au sexe sont récessifs et sont impliqués dans la transmission de maladies, par exemple, le gène de l'hémophilie chez l'homme et chez les mammifères.

1. Hérédité récessive liée à l’X. Dans ce cas, les suivantes caractéristiques de transmission des gènes et de manifestation de la maladie peuvent apparaître :

– La maladie se produit de deux en deux générations ;

– La maladie est transmise par les femmes « conductrices » et seuls les mâles sont atteints. Il n’y a jamais de transmission père-fils. Pour ce type des gènes le mâle ne peut être ni homozygote ni hétérozygote, mais hemizygote, car les chromosomes X et Y n’ont pas les mêmes gènes, ils ne sont pas homologues. Les femelles sont homogamétiques tandis que les mâles sont hétérogamétiques ;

– D'un croisement d'une femelle récessive homozygote (qui présente la maladie) avec un mâle sain résulte des femelles saines et des mâles présentant la maladie. Il y a un transfert mutuel des caractères d'un sexe à l'autre, un phénomène appelé héritage croisé ou criss-cross.

Tous les hommes porteurs du gène muté sont malades, tandis que les femmes porteuses du gène muté ne sont pas malades, elles sont porteuses saines, elles peuvent transmettre la mutation à leurs descendance.

Exemples de maladies récessives liées à l’X, l’hémophilie chez les mammifères, le daltonisme chez les hommes.

2. Hérédité dominante liée à l’X, est une forme d’hérédité plutôt rare. Les femmes porteuses du gène muté sont symptomatiques = des hommes et des femmes sont atteints (dans la même proportion).

!!! En raison de la différence de taille (le chromosome Y est nettement plus court que le chromosome X), les chromosomes sexuels s’apparient, lors de la méiose, le long d'une courte région. Les gènes liés au sexe sont soumis aux lois de Mendel, totalement dans la zone homologue. Dans la zone non homologue de X, chez le mâle, les gènes récessives se manifestent dans la dose unique, car ils n’ont pas de correspondant sur Y.

3.5.4. Les applications pratiques de la transmission liée au sexe

L'existence de gènes liés au sexe et la connaissance de leur mécanisme de transmission ont des applications particulières à la fois en pathologie génétique et en zootechnie.

Connaissant le mode de transmission des gènes liés au sexe, en étudiant le pedigree ou par l'analyse de la ségrégation dans une population plus large, il est possible de spécifier la nature génétique d'une maladie. Il est possible de spécifier des critères de diagnostic et la conduite prophylactique. Ainsi, si dans un couple de parents en bonne santé sont nés des mâles affectés, la mère est porteuse et ne sera plus utilisée à la reproduction. Au lieu de cela, les progénitures masculines en bonne santé peuvent être utilisées pour la reproduction sans aucune restriction.

En zootechnie, la détermination du sexe de certains caractères a de larges applications pratiques. Par exemple, chez les poulets sont connus des gènes liés au sexe qui déterminent la couleur et qui sont utilisés pour l’auto-sexage des poussins d'un jour.

PROBLÈME D'APPLICATION

1. Considérant que le type classique de daltonisme est déterminé par les gènes récessifs liés à l'X (Xd) :

a) Quel serait le génotype d'une possible femme daltonienne (c'est rare, mais ça existe)?

b) Que pourriez-vous conclure sur le génotype des parents de cette femme?

2. Une femme normale dont le père est daltonien épouse un homme à vision normale. Quelles sont les probabilités qu'ils aient un enfant daltonien? Représentez ce croisement par un échiquier de Punnett.

3. Un homme avec le daltonisme épouse à une femme avec un phénotype normal. Ils ont huit enfants, quatre garçons en bonne santé et quatre filles qui ont le même défaut de vue que leur père. Qu'est-ce que cela nous apprend sur la base génétique de ce caractère, que ce soit dominant ou récessif, lié à l'X ou à l'Y?

4. Émilien est atteint d’hémophilie, une maladie récessive liée à l’X. Émilien aurait-il pu hériter du gène de cette maladie des personnes suivantes ? Les parents d'Émilien sont tous deux en bonne santé.

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

5. L’hémophilie chez les chiens et les humains est un syndrome caractérisé par l'absence de coagulation du sang dû à une carence de facteur de coagulation VIII, avec un rôle important dans la transformation de la prothrombine en thrombine. La maladie est causée par un gène récessif lié à l’X (Xh). Après un accouplement d’un chien hémophile avec une femelle en bonne santé, venant d'une famille libre d’hémophilie, sont nés sept chiots, dont 3 mâles et 4 femelles.

a) Quel est l'état clinique de la descendance F1 sur l'hémophilie?

b) Quel genre de chiots on obtient en F2 après un accouplement entre les femelles obtenu en F1 avec des mâles en bonne santé?

6. Une femelle hémophilie accouplée avec un chien en bonne santé a donnée naissance à 6 chiots dont 3 mâles et 3 femelles. Quelle sera la situation des descendants en ce qui concerne l'hémophilie?

7. Les allèles récessifs d’un gène X – liée produisent l’hémophilie. Supposons qu’un couple avec un phénotype normal a trois enfants: un garçon hémophile et deux filles en bonne santé. Quelle est la probabilité que les deux filles sont porteuses hétérozygotes?

8. Chez le poulet, le mâle est ZZ et la femelle est ZW. Par ailleurs, le plumage rayé est attribuable à un allèle dominant R, et l’absence de rayures est due à l’allèle r. Ce gène est lié au chromosome Z.

a) Si on croise une femelle et un mâle tous deux au plumage rayé (le mâle est hétérozygote), quels seront les rapports génotypique et phénotypique prévisibles ?

b) D’autre part, si une poule au plumage rayé est accouplée à un coq au plumage non rayé, quelle est l’apparence des poulets issus de ce croisement ?

9. Dans la race Plymouth Rock de poulets existe un gène dominant lie au sexe (ZB) qui provoquant les barres blanches sur le plumage noir. Parmi les poussins nouvellement éclos, on distingue ceux qui donneront des adultes rayés par une tache blanche qu’ils ont sur le haut de la tête. La race Rhode Island, est la variété rouge causée par un gène récessif lié au sexe (Zb).

a) Faites le croisement jusqu’à la F2 d’un croisement entre un coq Plymouth Rock et une poule Rhode Island.

b) Faites le croisement jusqu’à la F2 d’un croisement réciproque entre un coq Rhode Island et une poule Plymouth Rock.

c) Les deux croisements ci-dessus sont-ils nécessaires pour distinguer en F1 les mâles des femelles à l’éclosion ?

10. Chez la mouche Drosophile, un gène R détermine la couleur rouge des yeux. L'allèle récessif r détermine une couleur vermillon.

On a réalisé un croisement entre deux drosophiles aux yeux rouges. On a obtenu à la F1:

103 mâles aux yeux vermillon

99 mâles aux yeux rouges

201 femelles aux yeux rouges

a) Le gène responsable de la couleur des yeux est-il lié au sexe? Expliquez.

b) Quels sont les génotypes des parents? Des mâles et des femelles de la F1?

11. Une femme, dont les parents et les grands parents sont normaux, a un oncle (le frère de sa mère) atteint de daltonisme (anomalie due à un gène récessif lié au sexe). Personne d'autre dans sa famille n'a cette anomalie. Cette femme et son conjoint sont normaux. Elle se demande quand même si c'est possible qu'elle ait un enfant daltonien. Que pouvez-vous lui répondre? Répondez en lui donnant une probabilité.

12. Chez une espèce de chien, un gène mutant qui cause la surdité se trouve sur le chromosome Y. Dresse un échiquier de Punnett afin de montrer l’issue d’un croisement :

a) entre un chien mâle dont le père est sourd et un chien femelle dont le père n’est pas sourd;

b) entre un chien femelle dont le père est sourd et un chien mâle dont le père n’est pas sourd.

13. Chez les souris, le nanisme est cause par un allèle récessif lie à l’X et la couleur rose du pelage est due à un allèle autosomique dominant (le pelage s’une souris est normalement brunâtre). Si une femelle naine de ligne pure est croisée avec un mâle à pelage rose lui aussi de ligne pure, quels seront les rapports phénotypiques de la F1 et de F2 de chaque sexe ?

PROBLÈME D'APPLICATION

La reine Victoria d'Angleterre est à l'origine d'un des cas les plus connus de transmission de l'hémophilie. Elle était porteuse du gène de l'hémophilie (XHXh) et elle l'a transmis à plusieurs familles royales d'Europe.

Vous pouvez suivre la progression du gène de l'hémophilie dans les familles régnantes d'Europe en jetant un coup d'œil sur cet arbre généalogique de la reine Victoria (www.knowledgene.com).

CHAPITRE IV

LE DÉTERMINISME GÉNÉTIQUE DES GROUPES SANGUINS, DANS LES SYSTÈMES ABO, D ET MN

Le terme des groupes sanguins désigne en règle et de façon restrictive les groupes érythrocytaires, sinon, on utilise le terme de groupe plaquettaire, leucocytaire, ou sérique. De nombreux systèmes de détermination des groupes sanguins sont connus chez l'homme. Les principaux groupes sanguins sont ceux qui définissent les systèmes ABO, Rhésus (Rh) ou D, MN mais il en existe beaucoup d'autres.

4.1. Le système des groupes sanguins ABO

Le système de groupes sanguins ABO a été découvert grâce aux travaux de Karl Landsteiner au début du XXe siècle. Ce système est sans aucun doute le plus important du fait de son implication en transfusion sanguine et pour la transplantation d’organe.

Le système ABO est défini par la présence d’antigènes érythrocytaires A ou/et B, et d’anticorps naturels réguliers, anti-A ou/et anti-B, présent de façon constante dans le sérum sans allo-immunisation préalable, correspondant aux antigènes absents du globule rouge.

Dans le système ABO, quatre groupes sanguins sont connus en raison de la présence de 3 allèles dans la population humaine, désignés par IA, IB et i. L'allèle IA code l'antigène A, l'allèle IB code l'antigène B et l'allèle i ne code pas d’antigène. Nous pouvons représenter les relations de dominance entre les allèles ABO comme suite : IA>i, IB>i, IA=IB. Les allèles IA et IB sont dominant sur i et codominant entre eux.

Chaque groupe sanguin est défini par ses agglutinogènes (antigènes), présent à la surface des globules rouges et par ses agglutinines (anticorps), présent dans le plasma sanguin. Les agglutinogènes présents à la surface des globules rouges donnent le nom du groupe sanguin. La présence de l'antigène A détermine donc le groupe sanguin A, la présence de l'antigène B, le groupe sanguin B, la présence des deux antigènes A et B, le groupe sanguin AB et l'absence des deux antigènes détermine le groupe sanguin O (zéro). Les antigènes sont des substances de nature glycoprotéique qui, lorsqu'elles sont étrangères à un organisme, provoquent la synthèse d'anticorps. Dans un organisme, normalement, les anticorps ne seront jamais produits contre leurs propres antigènes. Dans le sang, les agglutinines présentes dans le plasma ne correspondent jamais aux agglutinogènes présents sur les hématies. Les agglutinines sont donc des anticorps naturels contre les antigènes des groupes sanguins.

Les anticorps ont été appelés anti-A et anti-B, donc les individus du groupe A produisent des anticorps anti-B et ceux du groupe B produisent des anticorps anti-A. Les individus du groupe O produisent les deux types d'anticorps, tandis que les individus du groupe AB ne produisent pas aucun type d'anticorps (Tableau 4.1.).

Tableau 4.1.

Le système de groupes sanguins ABO

!!! Le système de groupes sanguins ABO est défini par la présence ou non d’antigènes A au B à la surface des hématies et par la présence ou non d’anticorps anti-A ou anti-B dans le sérum.

4.2. Le système des groupes sanguins Rhésus (Rh)

Le système Rhésus est l’un des systèmes les plus complexes connus chez l’homme. Dans ce cas, les antigènes sont déterminés par 3 paires d’allèles appartenant à trois locus différents situés sur trois chromosomes différents et notés: C, c, D, d, E, e. Parmi ces types de systèmes antigéniques, celui qui présente la plus grande capacité antigénique est le facteur D. D correspond à l'antigène Rh.

Cet antigène n'étant pas présent à la surface des hématies chez tous les individus, donc les individus ayant l'antigène D (ou Rh) ont été appelées Rhésus positif (Rh+), tandis que les individus qui ne possède pas les antigènes D, sont Rhésus négatif (Rh-).

Dans le système de groupes sanguins Rhésus s'agit d'anticorps irréguliers. L'absence de l'antigène n'entraîne pas la présence de l'anticorps correspondant (contrairement au système ABO où l'absence de l'antigène A ou B sur l’hématie doit entraîner systématiquement la présence de l'anticorps dans le plasma).

Les anticorps du système Rhésus sont des anticorps immuns, c’est à dire secondaires à une transfusion ou à une grossesse non-compatible. Les individus Rh- peuvent synthétiser des anticorps anti-Rh (anti-D) lorsque des antigènes D pénètrent dans leur corps.

La règle est qu'on peut transfuser des produits sanguins Rh- (qui ne contiennent pas l'antigène D) à un individu Rh+, mais pas le contraire. L'individu Rh- fabriquerait des anticorps anti-D destructeurs des globules rouges Rh+, ce qui provoquerait un accident transfusionnel lors d'une nouvelle transfusion incompatible.

Il existe un risque d'immunisation au cours de la grossesse d'une femme Rh- par un fœtus Rh+. Dans ce cas, la mère doit recevoir rapidement, dans les 72 heures au plus tard (l’efficacité diminuant rapidement au-delà) des immunoglobulines anti-D qui préviennent sa possible immunisation afin de pouvoir mener sans encombre une grossesse ultérieure et aussi la prévention « de la maladie hémolytique du nouveau-né ». Les immunoglobulines anti-D entraînent d’une part la disparition rapide des globules rouges fœtaux de la circulation maternelle, par hémolyse intra ou extravasculaire, et bloquent d’autre part la réponse immunitaire primaire. Ainsi, l'organisme de la mère ne garde pas la mémoire immunologique de son contact avec l’antigène D après la première transfusion ou après la première grossesse, mais après le deuxième contact, l’organisme conserve la mémoire immunologique, ce qui explique la réaction immunitaire.

!!! Le système de groupes sanguins Rhésus est défini par la présence ou non d’antigènes D à la surface des hématies.

4.3. Le système des groupes sanguins MN

Le système MN est déterminé par la présence d'antigènes M et N à la surface des hématies, comme suit:

Groupe M (IMIM)

Groupe N (ININ)

Groupe MN (IMIN)

Le système MN a une importance médicale mineure dans les transfusions sanguines, car les antigènes M et N ont une faible capacité antigénique, mais le système MN présent un importance médicale pour l'établissement de la paternité et l'identification des personnes.

4.4. Importance pratique des groupes sanguins

La connaissance des groupes sanguins a de nombreuses applications pratiques :

Intérêt clinique: en transfusion clinique; rôle en pathologie, par exemple dans la maladie hémolytique du nouveau-né; rôle dans les greffes de moelle ou d'organes.

Applications médico-légales: pour l’identification des individus; pour l'identification de taches de sang; pour des recherches en exclusion de paternité.

Génétique des populations.

ÉTUDES DE CAS

1. Deux parents ont 4 enfants. Le premier enfant a le groupe sanguin A, le deuxième a le groupe sanguin B, le troisième O et le quatrième AB. C’est quoi le génotype de parents et des enfants? Explique votre réponse.

2. Si la maman a le groupe sanguin O est son enfant le groupe A, c’est quoi le groupe que le père ne peut pas avoir? Explique votre réponse.

3. Une femme a les yeux bleus (aa) et le groupe sanguin AB. Elle a un enfant aux yeux marron (Aa) et le groupe sanguin AB. Quelle couleur d’yeux et quelle groupe sanguin ne peut pas avoir son père? Explique votre réponse.

4. Deux hommes, le premier avec le groupe sanguin A et le deuxième B, disputent la paternité d’un enfant de groupe sanguin O. En sachant que la maman est de groupe B, c’est qui entre les deux hommes est le vrai père? Explique votre réponse.

L'APPRENTISSAGE AUTODIRIGÉ

5. Deux femme, madame Chevalier est madame Fontaine, ont chacun un garçon né dans la même maternité et en même temps. Madame Fontaine pense que son petit bébé a été changé.

Les groupe sanguin des enfants est des parents sont:

a. La famille Fontaine: maman A père B bébé O

b. La famille Chevalier: maman A père A bébé B

Vous croyiez que le bébé en été changer ? Explique votre réponse.

6. Quelle est la probabilité qu’un couple de parents, un avec groupe sanguin A et l’autre avec le groupe sanguin B, tous les deux hétérozygotes, d’avoir une fille avec le groupe sanguin A?

7. Quels sont les génotypes des parents impliqués dans les croisements suivants ?

8. Si un homme appartient au groupe sanguin AB et qu’une femme appartient au groupe A, quels sont les groupes sanguins possibles de leurs enfants?

9. Une femme de groupe sanguin A et de vision normale a cinq enfants, soit:

– un garçon de groupe A, daltonien – un garçon de groupe O, daltonien

– une fille de groupe A, daltonienne – une fille de groupe B, de vision normale

– une fille de groupe A, de vision normale

Deux hommes qui ont eu des relations avec cette femme, un est de groupe AB et daltonien, l’autre de groupe A et de vision normale.

Lequel de ces hommes est le père probable dans chaque cas?

(Rappelons que les gènes qui déterminent les groupes sanguins sont portés sur un autosome et que celui du daltonisme est porté par le chromosome X).

10. Les trois enfants d’une famille appartiennent au groupe sanguin B.

a) À l’aide d’échiquiers de Punnett, montre qu’il existe plusieurs ensembles de génotypes parentaux qui peuvent donner ce résultat.

b) Lequel de ces ensembles de parents possibles que tu as mentionnés en a) est le plus susceptible de représenter les parents de ces trois enfants?

11. Une femme appartenant aux groupes A, M, Rh+ a un fils avec des groupes sanguins O, MN, Rh-. Deux hommes contestent leur paternité, l'un avec A, N, Rh+ et l'autre avec O, MN, Rh-. Lequel des deux hommes peut être le père de l'enfant? Explique votre réponse.

12. Deux hommes, l'un avec le groupe A et l'autre avec le groupe AB, contestent la paternité d'un enfant du groupe sanguin B. Sachant que la mère avait le groupe B, lequel des deux est le père de l'enfant? Explique votre réponse.

13. Les allèles IM et IN au locus des types sanguins MN sont codominants. Donnez les génotypes et les phénotypes attendus et leurs rapports dans la descendance des croisements suivants :

a) IM IM x IM IN d) IM IN x IN IN

b) IN IN x IN IN e) IM IM x IN IN

c) IM IN x IM IN

CHAPITRE V

LES TECHNIQUES DE BASE DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

5.1. Introduction dans PCR

La biologie moléculaire a été révolutionnée par la réaction de polymérisation en chaine (PCR). PCR est une méthode qui permet d’augmente le nombre de molécules d'ADN de manière logarithmique et contrôlée. Kary Mullis a conçu la PCR en 1983 et la première publication de la PCR est parue en 1985. En 1993, Kary Mullis a reçu le prix Nobel de chimie, 40 ans après le déchiffrement de l'ADN en 1953, par J. D. Watson, F. H. Crick et M. Wilkins.

Cette technique offre la possibilité de multiplier in vitro, pratiquement sans limite, tout fragment d’ADN normal ou mutant. L'amplification s'effectue très rapidement, en quelques heures, pour y parvenir, de très petites quantités de matériel biologique (parfois même une seule cellule) sont nécessaires (Andrei, 2005).

La chimie impliquée dans la PCR dépend des complémentarités (correspondance) des bases de nucléotides dans le double brin hélice d'ADN. Quand une molécule d’ADN est suffisamment chauffée, les liaisons hydrogène qui sont responsable de maintenir ensemble la double hélice sont perturbé et la molécule se sépare ou se dénature en simples brins. Si on laisse la solution d'ADN refroidir lentement, les paires de bases complémentaires peuvent se reformer pour rétablir la double hélice d'origine.

Pour réaliser la PCR on a besoin d’ADN, de deux amorces PCR (forward et reverse), d’ADN polymères thermostables, dNTP et d’autres molécules.

Les deux amorces (forward et reverse) sont des séquences exactes des nucléotides qui flanquent la zone d’intérêt (la zone cible) qui doit être amplifiée. Les amorces PCR sont 5’ -3’ oligonucléotides d'environ 20 nucléotides de long.

Pour initier le processus, les amorces s'hybrident de part et d'autre de la séquence d’ADN à amplifier. La température permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN. Les amorces en excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires. Cette configuration permet à l'ADN polymérase (Taq polymérase, par exemple) de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La clé de la réaction de réplication est qu’elle est entraînée par une molécule de polymérase thermostable qui lit un ADN matrice dans le 3’-5’ direction et synthétise un nouveau modèle complémentaire dans le 5’-3’ direction, en utilisant didésoxy nucléoside triphosphates libres (dNTP = bases nucléotidiques) comme élément constitutif des blocs (Pestana et al., 2010).

La PCR est principalement une méthode d’amplification spectaculaire d’un fragment d’ADN désiré afin d’augmenter l’ADN cible à des niveaux détectables. Cela a eu un effet profond sur toutes les études moléculaires, y compris celles dans le domaine du diagnostic. La PCR nous permet également de détecter plus facilement les animaux porteurs de gènes récessifs, porteurs de mutations génétiques et les animaux réservoirs de maladies bactériennes, virales et parasitaires, de détecter des populations mixtes de pathogènes lors d’une infection et de déterminer la charge en agents pathogènes. La méthode a trouvé de nombreuses applications connexes en biologie moléculaire et constitue désormais la base fondamentale de la plupart des études impliquant du matériel génétique (Pestana et al., 2010).

L'extraction et la purification de l'ADN sont nécessaires pour effectuer la réaction PCR.

5.2. L’extraction / purification et quantification de l’ADN

Le plus souvent, l’ADN est extrait de :

– sang total;

– fluides biologiques;

– cellules dans la cavité buccale;

– les tissus;

– cultures bactériennes;

– fèces.

De nombreuses techniques sont utilisées pour purifier les acides nucléiques. Les premières étapes sont toutes identiques, elles consistent à lyser la cellule (détergents, ultrasons, azote liquide, etc.), puis séparer les molécules solubles par centrifugation. Tous les gros débris seront dans le culot tandis qu’on récupéra dans le surnageant les petites molécules (lipides, glucides, etc.), les protéines, et les acides nucléiques. Les étapes suivantes permettront de séparer différents types d’acides nucléiques des autres molécules.

Pour l’extraction d’ADN, une méthode efficace consiste à additionner a la solution un mélange de phénol + chloroforme. Bien qu'il s'agisse d'une technique relativement peu coûteuse et que les acides nucléiques obtenus soient d'une grande pureté, il existe un certain nombre d'inconvénients majeurs: il s'agit d'une technique laborieuse et consommant beaucoup de temps, et les réactifs utilisés sont toxiques et nécessitent une manipulation minutieuse. Pour cette raison, il existe actuellement un certain nombre de kits commerciaux contenant tous les réactifs nécessaires à l'extraction de l'ADN.

Selon le fabricant, les kits d'extraction sont basés sur les principes suivants:

– précipitation, lavage puis réhydratation l'ADN;

– conservation de l'ADN dans une colonne munie d'une membrane "silica", suivie d'une élution d'ADN dans un tube collecteur.

5.2.1. Etapes de l'extraction de l'ADN

Les étapes d'extraction de l'ADN du sang total sont présentées à l'aide de kits basés sur le principe de précipitation de l'ADN :

1. Lyse des membranes cellulaires – cette étape implique la lyse de toutes les membranes cellulaires (y compris celles d'organites cellulaires), à l'exception des membranes nucléaires et mitochondriales, en utilisant une solution détergente, suivie d'une centrifugation au cours de laquelle les noyaux et les mitochondries se déposent;

2. Lyse des membranes nucléaires et la digestion d’ARN – à cette étape, on atteint la lyse des membranes nucléaire et mitochondriale; éventuellement, une RN-ase peut être ajoutée pour éliminer l'ARN;

3. Précipitation des protéines – suivie d'une centrifugation au cours de laquelle les protéines précipitées se sédimentent et l'ADN se retrouve dans le surnageant;

4. Précipitation de l'ADN avec de l'isopropanol – est l'étape à laquelle l'ADN devient visible sous la forme de fines chaînes blanches;

5. Lavage l'ADN avec 70% d'éthanol;

6. Hydratation de l'ADN – après l'ajout de la solution de réhydratation, l'ADN est complètement réhydraté en 12 à 24 heures.

Les étapes d'extraction de l'ADN du tissue sont présentées à l'aide de kits basés sur le principe de conservation de l'ADN dans une membrane "silica", suivie d'une élution d'ADN dans un tube collecteur (ISOLATE II Genomic DNA kit, Bioline, UK) (Figure 5.1.):

1. Préparation des échantillons – découpez 25 mg de tissu et transférez-le dans un tube à centrifuger de 1,5 ml ;

2. Pré-lyse – ajouter 180 µl de tampon de lyse GL et 25 µl de solution de protéinase K; recouvrir complètement les échantillons de solution et vortex; incuber à 56 °C pendant 1 à 3 heures (jusqu'à complète lyse), agiter ou vortexer de temps à autre;

3. Lyse des échantillons – vortexer brièvement l'échantillon et ajouter 200 µl de tampon de lyse G3; vortexer vigoureusement et incuber à 70 °C pendant 10 min.

4. Ajuster les conditions de liaison à l'ADN – vortexer brièvement et ajouter 210 µl d'éthanol (96-100%) à l'échantillon; vortexer vigoureusement;

5. Lier l'ADN – placer la colonne ISOLATE Genomic II Spin dans un tube collecteur de 2 ml; charger l'échantillon dans la colonne et centrifuger 1 minute à 11 000 g; jeter le contenu du tube collecteur et le réutiliser;

6. Laver la membrane de silica – ajouter 500 µl de tampon de lavage GW1, centrifuger 1 minute à 11 000 g, jeter le contenu du tube collecteur et le réutiliser; ajouter 600 µl de tampon de lavage GW2, centrifuger 1 minute à 11 000 g, jeter le contenu du tube collecteur et le réutiliser;

7. Sécher la membrane de silica – centrifuger 1 min à 11 000 g pour éliminer l’éthanol résiduel; placer la colonne ISOLATE II Genomic DNA Spin dans un tube à centrifuger de 1,5 ml;

8. Éluer l'ADN – ajouter le tampon d'élution préchauffé (70 °C) au centre de la membrane de silica; incuber à la température ambiante pendant 1 min; centrifuger 1 min à 11000g.

Fig. 5.1. Protocole d'extraction d'ADN (Isolate II Genomic DNA Kit, Bioline, UK)

5.2.2. Quantification de l’ADN

La concentration et la pureté de l'ADN sont essentielles à son traitement ultérieur. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées.

La plus commune et aussi la plus précise est la méthode spectrophotométrique qui se base sur l’absorbance des acides nucléiques dans l’ultra-violet. Il y a des spectrophotomètres dédiés à la quantification des acides nucléiques, par ex. le NanoDrop (Figure 5.2.).

L’autre méthode consiste à mesurer la densité de fluorescence d’un fragment d’ADN après électrophorèse sur gel d’agarose.

La concentration de l'ADN dépend de plusieurs facteurs, tels que la qualité et l'âge de l'échantillon (plus l'ADN sera vieux, plus la quantité d'ADN sera faible). La pureté de l'ADN peut aussi influencer les résultats ultérieurs.

5.2. NanoDrop utilisé pour la quantification des acides nucléiques

(www.thermofisher.com)

5.3. La réaction de polymérisation en chaine (PCR)

La PCR permet d’amplifier des fragments d’ADN. Pour réaliser la PCR il faut posséder des amorces, c’est-à-dire connaitre la séquence nucléotidique des extrémités du fragment à amplifier.

5.3.1. Eléments nécessaires

– fragment d’ADN à amplifier;

– deux amorces d’ADN en excès: ce sont deux fragments d’ADN simple brin de court taille, ~ 20 nucléotides, complémentaires à chacune des extrémités de l’ADN;

– une ADN polymérase résistant à une température élevée. La polymérase la plus souvent utilisée est la Taq polymérase provenant d’une bactérie (Thermophylus aquaticus) qui vit dans des sources chaude;

– MgCl2, Mg2+ étant le cofacteur de la Taq polymérase;

– des dNTP = dATP, dCTP, dGTP, dTTP;

– d’eaux ultra pures.

5.3.2. Etapes de la réaction PCR

Le volume de la réaction PCR est généralement de 25 µl.

Pour obtenir une quantité important d’ADN, on réalise plusieurs cycles de PCR successifs. La réaction se fait automatiquement dans un appareil appelé thermocycleur (Figure 5.3.). Chaque cycle permet de doubler la quantité d’ADN.

Fig. 5.3. Thermocycleurs

Les éléments nécessaires à la PCR (ci-dessus) sont mélanges et l’ensemble est chauffe pour permettre la dénaturation de l’ADN puis refroidi lentement pour permettre l’hybridation des amorces. Dès que les amorces sont fixées, la Taq polymérase synthétise un brin complémentaires à la matrice d’ADN jusqu’à son extrémité 5’. A la fin de ce premier cycle, la quantité d’ADN a donc doublé. On commence le deuxième cycle en augmentant à nouveau la température pour dénaturer l’ADN. Les amorces étant en excès dans la solution, on a cette fois-ci quatre fragments d’ADN à hybrider. Le thermocycleur sera programmé (T°, durée, nombre de cycle) pour réaliser lui-même ces différents cycles. L’évolution de la quantité d’ADN est du type 2n avec n le nombre de cycles (Figure 5.4.).

Fig. 5.4. Les cycles du PCR

(http://www.fao.org)

La réaction PCR implique trois étapes successives (Figure 5.5.) :

1. Dénaturation initiale – pendant plusieurs minutes (10-15) à 94-96 °C. C'est une étape essentielle car les deux brins de la molécule d'ADN sont maintenant décomposés en rompant les ponts d'hydrogène entre les bases azotées des deux brins (deux ponts d’hydrogène entre chaque couple A-T et trois ponts d’hydrogène entre chaque couple G-C).

2. Les cycles d'amplification – chaque cycle comprenant trois phases : la phase de dénaturation, la phase d’hybridation et la phase d’élongation.

Phase de dénaturation – cette étape (généralement 0 à 1 minute à 94-96°C) permet de déshybrider les ADN, de « décrocher » les polymérases qui seraient encore liées à une matrice et d’homogénéiser le milieu réactionnel.

Phase d’hybridation ou d'appariement des amorces – cette étape (généralement 2 à 60 secondes à 56-65°C) permet aux amorces sens et anti-sens de s’hybrider aux ADN matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. La température d’hybridation est spécifique à chaque paire d’amorces. C'est une étape importante car si les amorces ne s'hybrident pas dans des conditions optimales, l'amplification ne se produira pas.

Phase d’élongation – cette étape (généralement 4 à 120 secondes à 72 °C) permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire de leur ADN matrice à une température qui leur est optimale. Ce brin est fabriqué à partir des sNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend normalement de la longueur de l’amplicon.

En général, 30 à 35 cycles sont suffisants pour obtenir un nombre suffisant de copies du fragment d'ADN cible.

3. Élongation finale – pendant plusieurs minutes (5-10) à 72°C.

Fig. 5.5. PCR – les cycles d'amplification

(http://www.fao.org)

5.4. Electrophorèse

La technique de séparation des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose est extrêmement utilisée en biologie moléculaire. L’ADN étant charge négativement à pH 7, il peut se déplacer dans un gel sous l’action d’un champ électrique. Deux paramètres permettent de séparer des fragments d’ADN: la taille, plus un fragment est grand et plus il est retenu dans les mailles du gel, donc moins il migrera vite ; la structure tridimensionnelle.

5.4.1. Structure du gel

Le gel est constitué d’agarose polymérise formant un réseau régulier dont la taille des mailles varie en fonction du pourcentage d’agarose.

Un faible pourcentage (0,6 – 0,8%) crée des grosses mailles et permet de séparer les gros fragments, tandis qu’un pourcentage élevé (1 – 2%) crée de petites mailles et permet de séparer les petits fragments. Le gel est coule dans un support en U. Le gel d’agarose est épais et permet une migration horizontale.

5.4.2. Marquage de l’ADN

Avant de couler le gel d’agarose dans son support, on ajoute une molécule permettant de visualiser l’ADN. La molécule la plus largement utilisée a été le bromure d’éthidium. Actuellement, des produits moins toxiques sont utilisés pour visualiser l'ADN. Par ex. SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen). Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain est une coloration très sensible pour la visualisation de l'ADN dans des gels d'agarose ou d'acrylamide. La teinture SYBR Safe est spécifiquement formulée pour être une alternative moins dangereuse au bromure d’éthidium qui peut être utilisée avec une excitation à la lumière bleue ou aux UV.

5.4.3. Migration

Le support en U est place dans une cuve d’électrophorèse contenant un tampon spécifique de migration permettant le passage du colorant entre les deux électrodes. L’ADN est préalablement mélangé avec glycérol (pour alourdir l’échantillon) et du bleu de Bromophénol (pour le colorer) puis déposé dans les puits prévus à cet effet. Un courant électrique est applique entre les deux électrodes, ce qui provoque le déplacement de l’ADN vers le pole positif (Figure 5.6., 5.7.).

Fig. 5.6. Électrophorèse sur gel d’agarose

5.7. Équipement nécessaire pour migrer les produits d'amplification

(http://monde.ccdmd.qc.ca/ressource/?id=55516)

5.8. Chargement des échantillons dans les puits du gel

(www.addgene.org/protocols/gel-electrophoresis/)

5.4.4. Révélation

Apres migration, le gel est place sur une table lumineuse émettant des UV. Lorsqu’on observe le gel par transparence, on voit apparaitre les fragments d’ADN. L’intensité de fluorescence dépend de la taille de l’ADN et de sa quantité. Il est donc normal que les fragments de grande taille apparaissent plus fortement marques que ceux de petite taille (Figure 5.8., 5.9.).

Fig. 5.8. Les produits d'amplification résultant de la PCR, et migrant dans un gel d'agarose

5.9. Équipement nécessaire pour amplifier l'ADN et visualiser les produits d'amplification (Laboratoire de Parasitologie, ISV, USAMV-CN)

Légende: 1. Transilluminateur UV; 2. Thermocycleur qPCR; 3. Thermocycleur PCR

Bibliographie sélective

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