Obținerea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale derivate din țesut adipos [308730]
UNIVERSITATEA BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
MASTER BIOCHIMIE ȘI BIOLOGIE MOLECULARĂ
LUCRARE DE DIZERTAȚIE
COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Prof. Dr. Dinischiotu Anca
ÎNDRUMĂTOR ȘTIINȚIFIC:
Dr. Titorencu Irina
ABSOLVENT: [anonimizat], 2020
UNIVERSITATEA BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
MASTER BIOCHIMIE ȘI BIOLOGIE MOLECULARĂ
LUCRARE DE DIZERTAȚIE
Obținerea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale derivate din țesut adipos
COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Prof. Dr. Dinischiotu Anca
ÎNDRUMĂTOR ȘTIINȚIFIC:
Dr. Titorencu Irina
ABSOLVENT: [anonimizat], 2020
CUPRINS
Introducere 3
PARTEA TEORETICĂ 4
Capitolul I. [anonimizat] 5
I.1. [anonimizat] 5
I.2. Clasificare celulelor stem și surse potențiale de celule stem 5
Capitolul II. Celulele stem mezenchimale 6
II.1. Criterii de definiție pentru celulelele stem mezenchimale multipotente 6
II.2. Proprietăți ale celulelor stem mezenchimale 7
II.3. Celulele stem mezenchimale derivate din țesut adipos 8
II.3.1. Nomenclatura celulelor stem derivate din țesut adipos 8
II.3.2. Surse și metode de obținere a ADSC 8
II.3.3. Condiții de cultivare a ADSC 12
II.3.4. Caracterizarea ADSC 13
II.3.5. Secretomul ADSC 18
II.3.6. Aplicații ale ADSC 22
PARTEA PRACTICĂ 23
Scop și obiective 24
Capitolul III. Materiale și metode 25
III.1. Celulele stem derivate din țesut adipos 25
III.2. Izolarea ADSC din țesutul adipos 25
III. 2.1. Obținerea ADSC prin digestie enzimatică 26
III.2.2. Obținerea ADSC prin tehnica explantului din țesut adipos 27
III.2.3. Decongelarea celulelor 29
III.2.4. Subcultivarea celulelor 30
III.4. Evaluarea potențialului de diferențiere multiliniară 31
III.4.1. Protocolul de diferențierea către linia adipogenă 31
III.5.1. Colorația cu Oil Red 34
III.5.3. Colorația cu Alcian Blue 36
III.6. Analiza markerilor de suprafață prin citometrie în flux 37
III.7. Analiza statistică a datelor 39
Capitolul IV. Rezultate și discuții 40
IV.1. Izolarea ADSC din țesutul adipos și analiza morfologiei celulare 40
IV.2. Evaluarea capacității proliferative 43
IV.3. Evaluarea potențialului de diferențiere multiliniară 44
IV.4. Analiza markerilor de suprafață prin citometrie în flux 45
Capitolul V. Concluzii 47
Bibliografie 48
Introducere
În ultimii ani, a [anonimizat] a [anonimizat] a se diferenția în mai multe linii celulare atunci când sunt cultivate în condiții specifice de creștere precum si efectului paracrin. [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat]. Celulele stem reprezintă pionii principali în procesul de regenerare întrucât posedă proprietățile necesare: [anonimizat], prezintă plasticitate și în final pot da naștere unor celule diferențiate terminal. Progresele tehnologiilor din ingineria tisulară și medicina regenerativă permit accesarea celulelor stem și ulterior integrarea în tehnologii regenerative care vizează reconstrucția de organe și terapiile celulare.
[anonimizat], reprezintă o sursă abundentă, accesibilă și bogată de celule stem adulte, cu proprietăți multipotente, adecvate pentru inginerie tisulară și aplicații ale medicinei regenerative.
Scopul principal al acestei lucrări a fost evidențierea unor metode alternative de izolare a celulelor stem derivate din țesut adipos subcutan.
PARTEA TEORETICĂ
Capitolul I. Celulele stem -Generalități
I.1. Celulele stem – Scurtă introducere
Domeniul celulelor stem a cunoscut succesul abia în epoca modernă, deși descoperirea celulelor stem s-a realizat cu mai bine de 50 de ani în urmă. Primele informații care vizează celulele stem se referă la studiile lui Ernest McCulloch și James Till (1963), care, împreună cu Andy Becker și Lou Siminovitch, au raportat prezența unor celule cu capacitate de autoreînnoire la nivelul măduvei spinării de șoarece și au postulat că acestea erau celule stem regenerative (Becker și colab., 1963; Zhang și colab., 1999).
Pe baza experimentelor istorice din diferite modele animale, prima dată a fost definită o celulă stem „adultă” din sistemul hematopoietic. Principalele sale caracteristici biologice la acea vreme erau radioprotecția, generarea de celule progenitoare angajate pe diferite linii de diferențiere și capacitatea de autoînnoire (Conrad și Huss, 2005).
Prin definiție, o celulă stem este caracterizată de capacitatea de a realiza un proces de auto- reînnoire, capacitatea sa de diferențiere multiniară și formarea de celule diferențiate terminal. În mod ideal, celulele stem cu aplicații în medicina regenerativă ar trebui să îndeplinească următorul set de criterii:
(i) să fie găsite în cantități abundente (milioane la miliarde de celule);
(ii) să poată fi colectate și recoltate printr-o procedură minim invazivă;
(iii) să poată fi diferențiate către mai multe linii celulare într-o manieră reproductibilă;
(iv) să poată fi transplantate în siguranță și eficient fie autolog, fie la o gazdă alogenă (Gimble, 2003).
I.2. Clasificare celulelor stem și surse potențiale de celule stem
Celulele stem pot fi împărțite în două mari categorii: celule stem embrionare și celule stem adulte. Celulele stem embrionare își au originea în embrion, mai exact în masa celulară internă a blastocistului, pe când celulele stem adulte derivă din țesuturi postnatale și pot include și celulele stem de origine fetală și celule stem provenite din cordonul ombilical (Zuk, 2010). Celulele stem adulte sunt derivate din organe specifice, cum ar fi creierul, intestinul, plămânul, ficat, țesut adipos și măduvă osoasă (Bunnell și colab., 2008). Se folosește termenul „adult” pentru a distinge orice celulă multipotentă de origine embrionară (ES) sau de celule germinale primordiale (PGC) (Conrad și Huss, 2005). Datorită disponibilității limitate de celule stem tisulare, există un interes științific și comercial în creștere pentru potențialul celulelor stem adulte derivate din alte surse, cum ar fi măduva osoasă, cordonul ombilical sau sângele periferic. Există dovezi susținute de o varietate și un număr tot mai mare de studii diferite că celulele progenitoare dintr-un anumit țesut se pot diferenția în celule angajate ale altor țesuturi, caracteristică definită sub denumirea de plasticitate.
Capitolul II. Celulele stem mezenchimale
II.1. Criterii de definiție pentru celulelele stem mezenchimale multipotente
Celulele stem mezenchimale (MSC) sunt celule stem adulte care au fost identificate inițial în măduva osoasă ca celule multipotente (Friedenstein și colab., 1968; Pittenger și colab., 1999). Încă de la descoperirea lor în anii 1960 (Friedenstein și colab., 1968), celulele stem derivate din măduva osoasă sunt studiate în mare măsură pentru potențialul terapeutic. După descoperirea MSC-urilor obținute din măduva osoasă, MSC-urile au fost izolate din aproape toate țesuturile din organism (da Silva și colab.., 2006), de exemplu, din țesutul adipos (Zuk și colab., 2001), din sângele cordonului ombilical (Erices și colab., 2000), sângele periferic (Roufosse și colab., 2004), pulpa dentară (Gronthos și colab.., 2000), derm (Haniffa și colab., 2007) și lichid amniotic (Sessarego și colab., 2008) și chiar de la nivelul tumorilor (Yan și colab., 2012).
În ceea ce privește caracteristicile definitorii ale MSC există o serie de controverse, lumea științifică neajungând la un consens unanim acceptat în ceea ce privește markerii moleculari. Din acest motiv, Comitetul pentru Celule Stem din cadrul Societății Internaționale pentru Terapie Celulară a propus un set de standarde pentru a defini MSC umane folosite pentru investigații științifice de laborator și pentru studii preclinice. Astfel, au fost definite trei criterii pentru identificarea celulelor stromale mezenchimale multipotente: aderența la plastic, expresia unor antigene de suprafață specifice și capacitatea de diferențiere multipotentă. Ca și primă caracteristică, MSC trebuie să fie aderente la plastic atunci când sunt păstrate în condiții standard de cultură și cultivate în flaskuri sau plăci de cultură. În al doilea rând, profilul de markeri specifici pentru MSC, analizați prin citometrie în flux, cuprinde molecule CD105, CD73 și CD90, care trebuie să fie exprimate de către populația MSC analizată într-un procent de peste 95%. În plus, ca și criteriu adițional celulele stem mezenchimale multipotente nu exprimă antigene de suprafață specifice celulelor hematopoietice. În acest scop, Societatea Internațională pentru Terapie Celulară recomandă utilizarea unui set de antigene pentru a se realiza distincția între celulele mezenchimale și cele hematopoietice, setul cuprinde molecule precum CD45, CD34, CD14 sau CD11b, CD79a sau CD19 și HLA clasa II. CD45 reprezintă un marker pan-leucocitar; CD34 este caracteristic progenitorilor hematopoietici primitivi și celulelor endoteliale; CD14 și CD11b sunt frecvent exprimate pe monocite și macrofage, cel mai frecvent întâlnite tipuri celulare hematopoietice care se găsesc într-o cultură MSC; CD79a și CD19 sunt markeri ai limfocitelor B; iar moleculele HLA-DR nu sunt exprimate pe MSC în mod normal, ci doar dacă acestea sunt stimulate, spre exemplu cu IFN-γ. Antigenele de suprafață CD45, CD34, CD14 sau CD11b, CD79a sau CD19 și HLA clasa II este recomandat să fie prezente la mai puțin de 2% din populația MSC. Un al treilea aspect definitoriu pentru MSC este reprezentat de potențialul de diferențiere mesenchimală triliniară. Așadar, celulele stem mesenchimale multipotente au capacitatea de a se diferenția în osteoblaste, adipocite și condroblaste în condiții standard de diferențiere in vitro. Diferențierea către linia osteoblastică poate fi demonstrată prin colorarea cu Alizarin Red sau von Kossa. Diferențierea către adipocite este confirmată prin colorarea cu Oil Red O. Diferențarea condroblastică este evidențiată prin colorarea cu Albastru Alcian sau prin colorarea imunohistochimică a colagenului de tip II (Dominici și colab., 2006).
II.2. Proprietăți ale celulelor stem mezenchimale
O caracteristică importantă și utilă pentru aplicațiile în medicina regenerativă o reprezintă profilul non-imunogen al celulelor stem mezenchimale. Studii realizate pe scară largă au arătat că acestea prezintă molecule ale Complexul Major de Histocompatibilitate (CMH) de clasă I, dar nu molecule CMH de clasă II. Acest lucru conduce la inactivarea celulelor T și determină proprietățile imunosupresoare ale MSC (Jacobs și colab., 2013). În plus, unele cercetări au raportat și existența unui efect imunomodulator suplimentar, manifestat prin afectarea profilului de expresie a CD80 și CD86 la nivelul celulelor dendritice și prin proliferarea și diferențierea celulelor B umane (Spaggiari și colab., 2009; Jiang și colab., 2005).
Mai mult decât atât, MSC-urile contribuie la modularea unor procese biologice prin intermediul moleculelor secretate în mediul extracelular. MSC-urile secretă diferite chemokine, citokine și proteine ale matricei extracelulare în care sunt implicate procese biologice precum hematopoieză, angiogeneză, trafic de leucocite, răspunsuri imune și inflamatorii (Jiang și colab., 2011; Bernardo și colab., 2009). Aceste dovezi permit utilizarea MSC atât în transplantul autolog, cât și alogenic, fără a fi nevoie de imunosupresie (Bartholomew și colab., 2002; Brooke și colab., 2007).
II.3. Celulele stem mezenchimale derivate din țesut adipos
Celulele stem derivate din țesut adipos (ADSC) au fost identificate pentru prima dată ca MSC-uri în țesutul adipos în 2001 (Zuk și colab., 2002), iar de atunci țesutul adipos a început să fie studiat ca sursă potențială de celule pentru ingineria tisulară și medicina regenerativă (Tsuji și colab., 2014).
II.3.1. Nomenclatura celulelor stem derivate din țesut adipos
O varietate de denumiri au fost folosite pentru a descrie populația de celule aderente la plastic și izolată din țesut adipos prin digestie cu colagenază. Au fost folosiți următorii termeni cu referire la aceeași populație de celule provenite din țesut adipos: celule stem/ stromale derivate din țesut adipos (ASC), celule stem adulte derivate din țesut adipos (ADAS), celule stromale adulte derivate din țesut adipos, celule stromale derivate din țesut adipos (ADSC), celule stromale adipoase (ASC), celule stem mezenchimale adipoase (AdMSC), lipoblaste, pericite, pre-adipocite, celule din lipoaspirat prelucrat (PLA). Însă utilizarea acestei nomenclaturi diverse a produs confuzie în literatura de specialitate și s-a impus găsirea unui termen comun, general acceptat. Cu acest scop, International Fat Applied Technology Society a ajuns la un consens de a adopta termenul „celule stem derivate din țesut adipos” (ASC) pentru identificarea populației de celule multipotente, izolate din țesut adipos, aderentă la plastic (Bunnell și colab., 2008).
II.3.2. Surse și metode de obținere a ADSC
Țesutul adipos reprezintă o sursă ideală de celule stem mezenchimale autologe datorită metodelor simple de obținere a celulelor, procedurile de recoltare care presupun un disconfort minim al pacientului și a randamentului mare de obținere, acesta permitând izolarea unui număr suficient de mare de celule pentru propagarea în cultură. Țesutul adipos, la fel ca și măduva osoasă, este derivat din mezodermul embrionar și conține o populație heterogenă de celule stromale (Zuk și colab., 2001).
Viabilitatea, randamentul, indicele proliferativ și calitatea de celule stem ale ADSC pot fi influențate de procedura de recoltare. ADSC pot fi izolate din țesutul adipos prin metode ca rezecție chirugicală sau liposucție. Liposucția este cel mai des utilizată și preferată în principal, fiind o procedură sigură, bine tolerată, ușor invazivă, capabilă să furnizeze cu un randament ridicat celule stem stromale (Palumbo și colab., 2018).
Într-un studiu recent realizat de Bajek și colaboratorii (Bajek și colab., 2017) au fost evaluate comparativ proprietățile biologice ale ADSC din punct de vedere al clonogenității, ratei de proliferare, timpului de dublare populațională, diferențierii multiliare și al potențialului de senescență după recoltare, utilizând trei metode de recoltare: rezecție chirurgicală, liposucție asistată de putere (PAL) și liposucție asistată de laser (LAL). Acești autori au concluzionat că metoda de colectare a ADSC poate afecta numărul de celule izolate, clonogenitatea și timpul de dublare populațională, ajungând la concluzia că, la momentul actual, cea mai bună metodă de colectare a ADSC în scopuri clinice este liposucția asistată de putere datorită potențialului mare de proliferare și lentă senescență a celulelor izolate.
Literatura de specialitate prezintă numeroase modalități pentru izolarea ADSC, însă din lipsa rapoartelor care să compare eficiența acestora nu există o procedură standardizată de izolare a ADSC. Cu toate acestea, cea mai des utilizată metodă pentru izolarea ADSC este protocolul descris de Zuk și colaboratorii în 2001. În cadrul metodei elaborate de Zuk și colab., probele de lipoaspirat sunt spălate intens cu volume egale de soluție tampon fosfat salin (PBS) și apoi digerate la 37 ° C timp de 30 min cu 0,075% colagenază, capabilă să degradeze joncțiunile strânse și componentele matricei extracelulare. Digestia enzimatică a lipoaspiratului duce la obținerea unei populații heterogene ce conține mai multe tipuri celulare (preadipocite, fibroblaste, celule musculare netede vasculare, celule endoteliale, monocite / macrofage rezidente, limfocite și ADSC), cunoscute sub numele de fracție vasculară stromală (SVF). Activitatea enzimatică a colagenazei este apoi neutralizată prin adăugarea mediului Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) îmbogățit cu 10% ser fetal bovin (FBS) și suspensia celulară este centrifugată la 1200g timp de 10 min pentru a obține un sediment de înaltă densitate din SVF. Sedimentul este apoi suspendat în și incubat la temperatura camerei timp de 10 minute, cu scopul de a liza globulele roșii contaminante. SVF este colectată prin centrifugare, filtrată printr-un filtru nailon cu diametrul porilor de 100 µm, pentru a îndepărta fragmentele de țesut nedigerate și incubată peste noapte la 37 ° C și 5% în mediu de control (DMEM, 10% FBS, 1% soluție de antibiotic/ antimicotic). Celulele aderente sunt păstrate în condiții de cultură standard până când au ajuns la sub-confluență (80–90%).
În ceea ce privește etapa de îndepărtare a eritrocitelor, aceasta a fost analizată de Li și colab. (Li și colab., 2017), care au comparat două metode pentru liza globulelor roșii, una cu soluție hipotonică și cea de-a două cu soluție hipotonică de . În urma evaluării efectele acestor soluții asupra funcționalității ADSC derivate din lipoaspirate, autorii au ajuns la concluzia că soluția hipotonică de este mai eficientă în purificarea ADSC și îndeplinește standarde clinice de siguranță pentru bune practici de fabricație / recomandări de bune practici clinice.
Fracția stromală vasculară poate să fie extrasă din lipoaspirate prin mai multe metode: centrifugare în gradient de densitate, stratificare spontană sau filtrarea și spălarea celulelor. Obținerea SVF, prin centrifugare în gradient de densitate la diferite viteze de rotație și prin stratificare spontană a lipoaspiratului, a fost analizată de Palumbo și colab. (Palumbo și colab., 2015) într-un raport anterior în care erau vizate influența diferitelor metode de manipulare în producția și viabilitatea celulelor din fracția stromală vasculară, cât și a adipocitelor. Astfel, cele două metode de procesare a țesutul adipos au fost investigate având în vedere numărul de adipocite și de celule ale fracției stromale vasculare; numărul de ADSC-uri izolate; capacitatea de aderență la plastic și potențialul de diferențiere a ADSC-urilor izolate. Procedura de stratificare spontană după 10, 20 sau 30 minute a fost comparată cu centrifugarea la diferite viteze (90, 400 sau 1500 × g). Rezultatele au arătat că stratificarea spontană, la 20 sau 30 minute, conduce la un randament de obținere a ADSC comparabil cu cel obținut după centrifugare la 90 sau 400 × g timp de 3 minute. În ceea ce privește capacitatea de diferențiere a ADSC, acestea se diferențiază cu succes către linia adipogenă, osteogenă și condrogenică indiferent de metoda de manipulare folosită, ceea ce sugerează că metodele de manipulare nu influențează direct capacitatea de diferențiere. Coroborând rezultatele studiul realizat de Palumbo și colab. (Palumbo și colab., 2015) se poate trage concluzia că stratul mijlociu obținut din eșantioanele lipoaspirate, fie după stratificare spontană la 20 min sau centrifugare la 400 × g, este suficient pentru a oferi o cantitate convenabil de mare de ASC și pentru a păstra integritatea adipocitelor, ambele abordări fiind eficiente în acest sens, însă pentru economia de timp este preferată tehnica centrifugării în gradient de densitate.
Metodele de obținere a ADSC bazate pe digestia enzimatică sunt folosite în special în scopuri experimentale, pe când în scopuri clinice sunt preferate metodele non-enzimatice. Utilizarea enzimelor proteolitice de tipul soluție tripsină-EDTA, dispază sau colagenază poate afecta în mod negativ viabilitatea celulară și integritatea antigenelor de suprafață, lucru ce este considerat critic pentru domeniul clinic (Hendijani, 2017). Metoda explantului este o metodă non-enzimatică, în care țesutul de origine este fragmentat în bucăți mai mici, plasate în vasele de cultură și cultivate în condiții standard de cultură. În cadrul metodei, celulele încep apoi să migreze din țesut și aderă la suprafața vasului de cultură. Ghorbani și colab. au realizat izolarea celulelor stem mezenchimale derivate din țesut adipos prin tehnica explantului (Ghorbani și colab., 2014), evidențiind posibilitatea obținerii ADSC printr-o metoda non-enzimativă eficientă comparativă cu cea clasică, enzimatică. În acest sens, câte patru bucăți mici (± 5 mg) din fiecare probă au fost spălate complet cu FBS (ser fetal bovin) și fragmentele de țesut au fost explantate în colțurile flaskului de cultură. În flaskuri a fost adăugat FBS preîncălzit cu grijă pentru a evita plutirea fragmentelor de țesut și acestea au fost incubate timp de 24 de ore în condiții standard; 37 ° C și 5% . La sfârșitul perioadei de incubație, FBS a fost înlocuit cu DMEM cu 20% FBS și antibiotic, culturile fiind monitorizate zilnic prin examen microscopic până când celule cu morfologie fibroblastică au început să migreze jurul fragmentelor de țesut; de obicei 3–5 zile de la însămânțare. După migrarea celulelor, în flask au fost adăugați 5 ml DMEM cu antibiotic și 20% FBS și celulele au fost incubate în continuare conform condițiilor standard până când a ajuns la confluență. Celulele subconfluente au fost recoltate și extinse 3 pasaje.
Busser și colaboratorii săi (Busser și colab., 2014) au propus o nouă metodă într-un singur pas pentru izolarea ADSC-urilor din lipoaspirat fără a utiliza colagenaza cu scopul de a compara metodele enzimatice de obținere a ADSC cu tehnica explantului. Aceste experimente au demonstrat că tratamentul cu colagenază afectează cantitatea și calitatea celulelor izolate, în plus, celulele obținute fără tratare enzimatică manifestau un potențial mai mare de a susține procesul de hematopoieză și nu prezentau un procent mai mic de celule CD34+, toate acestea susținând calitatea și eficacitatea tehnicii culturii explantului.
În ceea ce privește utilizarea grefelor de țesut adipos în practica clinică, Administrația Statelor Unite ale Americii pentru produse alimentare și medicamente (FDA) a stabilit o serie de reglementări conform cărora grefa trebuie să fie minimum manipulată, fără ajutorul enzimelor și utilizată în aceeași procedură chirurgicală.
Având în vedere utilizările numeroase ale ADSC în medicina regenerativă este de o deosebită importanță obținerea de celule stabile din punct de vedere genetic, care să nu se transforme în urma expandării in vitro și care să nu determine celule descendente aberante după transplantul alogenic. Astfel, metodele de expansiune a celulelor în cultură, pe lângă testele de sterilitate, trebuie să conserve și să garanteze caracteristicile fenotipice și funcționale ale celulelor, precum și stabilitatea genomică a acestora în perioada de cultură in vitro (Palumbo și colab., 2018). Cele mai utilizate tehnici de verificare a stabilității genomice sunt reprezentate de tehnica cariotipării, care este cea mai frecvent folosită, analiza instabilității microsateliților (MSI), lungimea telomerelor și activitatea telomerazei. Li și colab. (Li și colab.,2017) au demonstrat stabilitatea genomică a ADSC izolate prin tehnica explantului și propagate în cultură într-un mediu standard fără ser. Aceștia au analizat morfologia celulelor, cariotipul, ciclul celular, imunofenotipul și factorii de creștere la diferite pasaje (n. 1, 3, 5, 10, 15, 20) și au concluzionat că rata de proliferare ADSC începe să încetinească semnificativ după 15 pasaje și nu se observă aberații cromozomiale evidente până la pasajul #20. De asemenea, nivelul de expresie genică al p53 (genă supresor tumorală), CCNE (care codifică pentru un factor de transcripție implicat în reglajul trecerii din faza G1 în faza S a ciclului cellular), Nanog (genă care codifică pentru un factor transcripțional cu rol în menținerea pluripotenței celulelor embrionare prin blocarea factorilor determinării celulare) și TERT (genă care codifică pentru subunitatea catalitică a telomerazei, enzimă cheie în menținerea lungimii temolerilor cromozomilor) rămâne stabil la toate pasajele, susținând astfel că ADSC-urile obținute prin acest protocol sunt sigure și potrivite pentru transplantul clinic.
În concluzie, metodele de izolare a celulelor stem mezenchimale derivate din țesut adipos sunt adaptate la scopul experimentelor de izolare. Metodele non-enzimatice necesită cantități mari de lipoaspirat și au o eficiență mai mică în recuperarea celulelor în comparație cu metodele enzimatice utilizate în general într-un context de cercetare (Bellei și colab., 2017).
II.3.3. Condiții de cultivare a ADSC
Protocoalele de cultivare a ADSC sunt numeroase și variază de la un laborator la altul, însă, cu toate acestea, cel mai des utilizat protocol este cel de obținere a unei culturi monostrat în mediu standard suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Palumbo și colab., 2015). Indiferent de metodele de izolare (enzimatice sau non-enzimatice), celulele fracției stromale vasculare sunt însămânțate în flaskuri sau plăci de cultură și păstrate în condiții sterile la 37 ° C, 5% în mediu standard (adică DMEM sau α-MEM) conținând 10% FBS și 1% antibiotice pentru a selecta celulele aderente (Palumbo și colab., 2015; Agostini și colab., 2018). Celulele care plutesc în mediu și nu au aderat sunt îndepărtate 24-48 ore mai târziu, iar flaskul este spălat cu mediu pentru a îndepărta resturile celulare. ADSC aderate sunt menținute în mediu suplimentat cu 10% FBS, în condiții de umiditate 95%, la 5% , 37 ◦C până la subconfluența de 80–90%, schimbând mediul o dată la 2-3 zile. Când se ajunge la subfluență, celulele aderente sunt recoltate după desprinderea enzimatică, spălate în PBS, numărate și analizate din punct de vedere al creșterii lor, clonogenității și expresiei antigenelor de suprafață. Celulele sunt expandate până la pasajul 3 (P3) prin reînsămânțare la densitate mică (~ 1000–4000 celule / ) (Busser și colab., 2014; Agostini și colab., 2018). La fel ca toate tipurile de celule adulte, potențialul de creștere al ADSC-urilor scade scade semnificativ după un număr limitat de pasaje in vitro din cauza unui proces celular denumit senescență replicativă.
II.3.4. Caracterizarea ADSC
Potențialul de diferențiere al ADSC
Pentru identificarea ADSC, potrivit criteriilor formulate și definite de Federația Internațională pentru Terapiile și Știința Țesutului Adipos (IFATS) și Societatea Internațională pentru Terapie Celulară (ISCT) este necesară evaluarea multipotenței și a capacității de diferențiere către linia osteoblastică, condrocitică și adipocitară folosind condiții standard de diferențiere a culturii țesuturilor in vitro (Almalki și Agrawal, 2016 ).
În ceea ce privește diferențierea osteogenică, factorii inductori care determină virarea ADSC către un fenotip osteoblastic și care se regăsesc în mediul de diferențiere osteogenă sunt reprezentați de către β-glicerofosfat, dexametazonă, acidul ascorbic-2-fosfat și combinații ale factorului de creștere transformant-beta (TGF-β), proteine osoase morfogenetice (BMP) și vitamina D3 (Bourin și colab., 2013; Almalki și Agrawal, 2016). Studii recente au raportat utilizarea melatoninei sau a unui amestec de hialuronic, acizii butirici și retinoici pentru a promova eficient o modelare osteogenă în celule stem din pulpă dentară umană prin inducerea transcrierii unui program genic specific de osteogeneză (Manoli și colab., 2016; Basoli și colab., 2017). ADSC sunt incubate cu medii de diferențiere osteogenă timp de 14–21 zile și apoi la 14 și 21 de zile de cultură, procesul de diferențiere este evaluat în primul rând prin colorarea cu Alizarin Red sau von Kossa. Control diferențierii ADSC în osteocite este realizat de diverși factori de transcripție spre exemplu factorul de transcripție legat de Runt2 (Runx2), osterix și β-catenină. În plus, pentru confirmarea fenotipul osteoblastic, sunt efectuate analize histochimice sau RT-PCR pentru a evalua profilul de expresie a genelor și proteinelor implicate în diferențiere, precum factorul cheie de transcripție osteogenă Runx2, fosfatază alcalină, sialoproteina osoasă, osteocalcina, osterix (Bourin și colab., 2013).
Diferențierea adipogenă a ADSC este indusă prin incubarea celulelor cu medii de diferențiere care conțin factori inductori de tipul IBMX (3-izobutil-1-metil-xantina), insulină, indometacină, triiodotionină, ascorbat-2-P, factorului basic de creștere fibroblastic (b-FGF) și a dexametazonei (Almalki și Agrawal, 2016). Fenotipul ADSC în urma diferențierii adipogene este caracterizat morfologic de forma sferică a celulelor și acumularea de picături lipidice în citoplasmă (Palumbo și colab., 2015). În ceea ce privește controlul diferențierii adipogene, factorul de transcriere implicat în cea mai mare parte în diferențierea adipogenă este receptorul activat de proliferare peroxisomală γ (PPARγ), care este capabil să regleze expresia genelor care promovează procesul adipogen (Bourin și colab., 2013; Almalki și Agrawal, 2016). Diferențierea adipogenă a celulelor stem derivate din țesut adipos este rezultatul cultivării ADSC timp de 7–21 zile cu mediu de diferențiere specific. Evidențierea fenotipului adipogenic este realizată prin colorarea cu Oil Red sau Nile Red, cât și prin analiza mai multor markeri biochimici, cum ar fi adiponectina, proteina de legare a acizilor grași 4, leptina, PPARγ, glicero-3-fosfat dehidrogenază, prin tehnici histochimice sau qRT-PCR.
Pentru diferențiere condrogenă, mediul de diferențiere conține drept inductori ascorbat 2 fosfat, dexametazonă, albumină serică bovină, acid linoleic, piruvat de sodiu, transferină, acid selenic și TGF-β1 (Almalki și Agrawal, 2016; Johnstone și colab., 1998). Factorul de trancripție SOX-9 (SRY-Box Transcription Factor 9) este unul dintre factorii majori de transcriere care modulează diferențierea către linia condrogenică. În urma diferențierii condrogenice, celulele ADSC își schimbă morfologia dintr-una asemănătoare fibroblastului într-o formă rotundă. Pentru inducerea diferențierii către condrocite, celulele stem sunt incubate timp de 14–21 zile în prezența mediului de diferențiere. Fenotipul condrogenic este verificat prin colorația Alcian Blue (Albastru Alcian) sau colorația cu Safranina O, evaluându-se și profilul de markeri: agrecan, colagen de tip II, Sox9 (Bourin și colab., 2013).
Celulele stem derivate din țesut adipos prezintă, de asemenea, și potențialul de a se diferenția în celule de origine atât mezodermală, cât si non-mezodermală, precum cardiomiocite (Choi și colab., 2010; Fraser și colab., 2006), celule musculare netede (Kuk și colab., 2002; Fraser și colab, 2006), celule endoteliale (Fraser și colab., 2006) și neuroni Jang și colab., 2010). MSC derivate din țesutul adipos pot fi diferențiate în hepatocite prin utilizarea unui cocktail de factori de inducție a hepatocitelor care cuprinde FGF1, FGF4 și HGF. Acest angajament este indus de factori precum oncostatina M și dexametazona (Banas și colab., 2007). În plus, Bellei și colab. (Bellei și colab., 2017) au extins sfera de plasticitate și la melanocite, aceștia raportând că ADSC se pot diferenția în melanocite în prezența unor factori de creștere selectați.
Prin urmare, ADSC sunt celule mezenchimale multipotente care prezintă o plasticitate mare, potențialul lor de diferențiere extinzându-se atât către liniile celulale mezodermale, cât și non-mezodermale.
Profilul markerilor de suprafață specifici ADSC
Analiza ADSC în cultură arată prezența unui profil de markeri de suprafață comun cu alte celule stem stromale mezenchimale. Astfel, ADSC sunt pozitive pentru markeri precum CD90, CD73, CD105 și CD44 și negative pentru CD45 și CD31. ADSC se pot distinge de MSC derivate din măduva osoasă prin pozitivitatea lor pentru CD36 și negativitatea pentru CD106 (Palumbo și colab., 2018)
Expresia antigenelor de suprafață poate fi influențată de cultura in vitro și de numărul de pasaje (Varma și colab., 2007). Puține studii evaluează influență metodei de recoltare a țesuturilor asupra profilului imunofenotipic al celulelor izolate. Bajek și colab. (Bajek și colab., 2015) au realizat un astfel de studiu prin care au comparat markerii de suprafață în ADSC-uri obținute prin liposucție asistată mecanic (MAL) și prin lipoaspirație cu ultrasunete (UAL), selectând celulele obținute la al doilea pasaj. În urma analizei a 242 de markeri diferiți folosind Panoul de screening al markerilor umani celulari de suprafață BD LyoplateTM au constatat că expresia markerilor selectați pentru fenotipul MSC, CD13, CD29, CD73, CD90, CD105 este similară în ambele populații ASC, cu deosebirea că nivelul CD166 este mai ridicat în ADSC recoltate prin liposucție cu ultrasunete. Deși expresia markerilor necaracteristici MSC, CD31, CD45 și HLA-DR, este mai mare în ADSC obținute prin UAL comparativ cu cele obținute prin MAL, autorii concluzionează că diferențele dintre cei mai importanți markeri sunt destul de mici ceea ce conduce la concluzia finală că metoda de colectare nu afectează în mod semnificativ profilul fenotipic al ADSC. În plus, tot Bajek și colaboratorii au confirmat recent că nici alte metode de colectare precum rezecția chirurgicală, PAL și LAL nu modifică expresia markerilor mezenchimali majori, CD90 și CD44 în populația ADSC în culturile in vitro pe termen lung (Bajek și colab., 2017).
Tabelul 1: Profilul de expresie al markerilor de suprafață ai celulelor stem mezenchimale derivate din țesut adipos (adaptat după Zuk și colab., 2013)
II.3.5. Secretomul ADSC
O nouă teorie în ceea ce privește potențialul terapeutic al celulelor stem extinde sfera efectelor benefice potențiale ale celulelor stem și atrage atenția asupra acțiunilor paracrine tranzitorii. Capacitatea lor de a secreta o gamă largă de factori bioactivi, precum și vezicule extracelulare, capabile să moduleze atât procesele fiziologice locale, cât și sistemice fac din ADSC- un instrument promițator pentru medicina regenerativă (Vizoso și colab., 2017), interesul științific și clinic. In ultimii ani o atentie deosebita a fost acordata efectului terapeutic al secretomului precum si a exosomilor purificați din acesta ca mediatori ai acestuia.
Secretomul reprezintă un ansamblu complex de exosomi și microvezicule secretate de celulele vii și poate fi izolat de la toate fluidele corporale, acesta purtând o încărcătură complexă constituită în principal din proteine biologice active, lipide, acizi nucleici (Makridakis și Vlahou, 2010; Valadi și colab., 2007). Pana in prezent, nu a fost încă standardizata o metodă optima de obtinere a unui volum suficient de secretom derivat din ADSC pentru a fi folosit in abordări terapeutice. În comparație cu celulele, exosomii sunt mai stabili și mai ușor de stocat, existând și posibilitatea mai mică de respingere a imunității în urma transplantului in vivo, iar moleculele conținute în exosomi sunt mai bine protejate de degradare (Vizoso și colab., 2017).
Celulele stem pot secreta combinații de factori de creștere care modulează răspunsurile celulelor rezidente inducand efectele vizate de terapia aplicată (regenerare, reparare, proliferare, etc..). În baza acestei noi perspective au fost realizate o serie de studii științifice care demonstrează efectul paracrin al celulelor stem. Date recente au arătat că biomoleculele sintetizate de celulele stem joacă, de asemenea, un rol important în repararea funcțională a țesuturilor. Nișa celulelor stem, definită ca și micromediul local în care celulele stem sunt localizate, determină destinul unei celule stem. Astfel, nu doar celulele înconjurătoare, cât și produșii secretați de celulele stem contribuie activ la mediul celulelor stem. Acestea secretă citokine, factori de creștere și molecule ale matricei extracelulare care manifestă efecte asupra lor însele (acțiune autocrină), cât și asupra celulelor vecine (acțiune paracrină) (Baraniak și McDevitt, 2010).
Figura 1. Efectele imunomodulatorii ale celulelor stem derivate din țesut adipos (ADSC). ADSC stimulează macrofagele și inhibă celulele T și dendritice, inducând angiogeneza, o scădere a apoptozei și a fibrozei, cu o scădere a procesului antiinflamator. Interleukina-1 α, -6, -10 (IL-1 α, -6, -10, -13), TNF-α (Factor de necroză tumorală-α), TGF-β (Factor de creștere tumorală-β), TLR2, TLR4 ( Toll Like Receptor 2, 4), VEGF (Factorul de creștere endotelial vascular), b-FGF (Factorul bazic de creștere fibroblastic) (adaptat după Mazini și colab., 2019)
Figura 2. Secretomul celulelor stem derivate din țesut adipos și mecanismele implicate în repararea tisulară și regenerare. ADSC secretă diferiți factori de creștere și proteine cunoscute pentru inducerea diferențierii celulare specifice. Interleukina-1, -6, -10 (IL-1, -6, -10), TNF-α (Factorul de necroză tumorală-α), TGF-β (Factorul de creștere tumorală-β), TR2, TLR4 (Toll Like Receptor 2, 4), GDF11 (Factorul de creștere a diferențierii 11), GDF15 (Factorul de creștere a diferențierii 15), G-CSF (Factorul de stimulare a coloniilor de granulocyte), GM-CSF (Factorul de stimulare a coloniilor de granulocite- monocite), EGF (Factorul de creștere endotelial), VEGF (Factorul de creștere endothelial vascular), IGF (Factorul de creștere al insulinei), b-FGF (Factorul bazic de creștere fibroblastic), PDGF ( Factorul de creștere derivate al plachetelor), NGF (Factorul de creștere nervos), CCL-2 (Chemokine C-C Motif Ligand 2), PEDF (Factorul derivate al epiteliului pigmentar), KGF (Factorul de creștere al keratinocitelor) (adaptată după Mazini și colab., 2019)
II.3.6. Aplicații ale ADSC
Celulele stem derivate din țesut adipos prezintă aplicabilitate în medicina regenerativă și în tratamentul numeroaselor boli cronice, reprezentând o soluție pentru vindecarea rănilor și regenerarea pielii, repararea osoasă și a cartilajului, tratamentul bolilor cardiovasculare și musculare, cât și a bolilor neurodegenerative etc.
Aplicații ale ADSC în vindecarea rănilor și regenerarea pielii
Primii substituenți de piele utilizati în terapiile folosite în vindecarea rănilor au fost epiteliile de cultură autologe (CEA) folosite drept substituenți epidermici. Treptat proprietățile acestor substituenți de piele au fost îmbunătățite prin adăugarea de celule stem mezenchimale. ADSC s-au dovedit cele mai potrivite celule mezenchimale pentru astfel de aplicații datorită accesibilității, recoltării non-invazive și a proprietăților secretorii. Proteinele matricei extracelulare produse de ADSC au îmbunătățit calitatea epiteliilor de cultură prin creșterea contracțiilor cicatriciale și promovarea fazelor de proliferare și remodelare tisulară, etape ale procesului de vindecare (Trottier și colab., 2008).
ADSC, datorită faptului că promovează supraviețuirea țesutului adipos, au devenit o alternativă reală la operațiile de mărire a țesuturilor moi, cum este cazul augmentării mamare și a operațiilor de corectare a defectelor faciale (Koh și colab., 2012; Wang și colab., 2012). ADSC- au contribuit la reconstituirea țesuturilor, corectând defectele tisulare și determinând regenerarea pielii, au ajutat la cicatrizare și au modulat inflamația, promovând astfel vindecarea pielii (Rigotti și colab., 2016; Charles-de-Sá și colab., 2015 ). Multe grupuri de cercetători au utilizat ADSC- autologe sau alogene în tratamentul arsurilor, utilizarea lor singure sau în combinație cu grefa epidermică au îmbunătățit grefarea pielii.
ADSC au fost utile și în tratarea ischemiei critice a membrului inferior, factorii de creștere și citokinele antiinflamatorii pe care le secretă acestea au împiedicat apoptoza celulară și neo-angiogeneza indusă, procese favorizante pentru vindecare (Liang și colab., 2018).
PARTEA PRACTICĂ
Scop și obiective
Potențialul enorm pe care îl au celulele stem în tratarea bolilor cronice fac din acestea o unealtă promițătoare pentru domenii ca medicina regenerativă și inginerie tisulară. Studii actuale prezintă țesutul adipos drept o sursă convenabilă de celule stem grație randamentului sporit de obținere, cât si din perspectiva faptului că un deșeu chirurgical, cum era considerat până acum, poate fi valorificat cu succes.
Scopul principal al acestei lucrări a fost evidențierea unor metode alternative de izolare a celulelor stem derivate din țesut adipos subcutan.
În realizarea acestei lucrări am avut în vedere următoarele obiective:
obținerea celulelor stem derivate din țesut adipos (ADSC) prin intermediul a 2 metode diferite de izolare;
caracterizarea comparativă din punct de vedere imunofenotipic a ADSC izolate prin tehnici diferite;
evaluarea comparativă a potențialului proliferativ precum si a capacitatii de diferentiere a ADSC izolate prin tehnici diferite;
Capitolul III. Materiale și metode
III.1. Celulele stem derivate din țesut adipos
Celulele folosite în experimente de caracterizare au fost prelevate de la 3 pacienți de sex feminin în urma unor intervenții chirurgicale de îndepărtare a țesutului adipos. Celulele primului pacient (denumit de-a lungul lucrării pacientul 1) au fost obținute în urma unei abdominoplastii, țesutul adipos obținut fiind ulterior prelucrat prin tehnica explantului. Celulele celui de-al doilea pacient (pacientul 2) au fost izolate prin digestie enzimatică cu colagenază. În cazul celui de-al treilea pacient (pacientul 3) celulele au fost izolate din țesut adipos, rezultat în urma unei mamoplastii prin tehnica explantului.
III.2. Izolarea ADSC din țesutul adipos
Izolarea celulelor stem derivate din țesut adipos a fost realizată prin parcurgerea a 2 metode distincte:(1) digestie enzimatică din țesut adipos, (2) tehnica explantării din țesut adipos.
Figura 3. Țesut adipos obținut în urma abdominoplastiei t înainte de prelucrare
III. 2.1. Obținerea ADSC prin digestie enzimatică
Mod de lucru:
Prin această metoda s-a realizat izolarea ADSC din tesut adipos prin digestie enzimatica. În cadrul acestei etape, proba de țesut adipos rezultata în urma mamoplastiei au fost recoltate imediat după intervenție și transportate în soluții de tampon fosfat salin, în care a fost adăugat antibiotic 3% penicilină, streptomicină și neomicină. Fragmentele de țesut adipos au fost curățate de țesutul conjunctiv și mărunțite, ulterior fiind supuse procesului de digestie enzimatică cu colagenază 0.075 mg/ml dizolvată în mediu DMEM 4.5‰, în raport de volum 1:1 cu cantitatea de țesut adipos. Digestia s-a realizat la temperatura de 37⁰C, pe baie de apă, cu agitare, timp de 30 de minute. După agitare s-a adaugat mediu DMEM 1‰ cu 15% ser fetal pentru neutralizarea activității colagenazei și probele au fost centrifugate la 3700g, 4 ⁰C, pentru 10 minute. După centrifugare, supernatantul a fost îndepărtat, sedimentul fiind reluat într-un volum de 5 ml mediu. Suspensia obținută a fost filtrată printr-un filtru cu dimensiunea porilor de 70 µm si centrifugata la 3700g, 4 ⁰C, pentru 10 minute. In continuare supernatantul a fost îndepărtat, iar sedimentul resuspendat. Celulele s-au însămânțat în mediu DMEM 4.5‰, îmbogățit cu 15 % ser fetal bovin. După aderarea celulelor, la intervalul de 48 de ore s-a schimbat mediul cu scopul atât de a îndepărta restul celulelor care nu au aderat, cât și de a resuplimenta mediul cu nutrienți necesari proliferării. Mediul celulelor a fost schimbat odată la 2-3 zile până în momentul în care acestea au atins pre-confluența, punct în care celulele au fost pasate și congelate.
Figura 4. Etape intermediare ale procesării țesutului adipos în vederea obținerii de ADSC prin digestia cu colagenază: stânga – prelucrarea țesutului adipos subcutan prin îndepărtarea tegumentului, a țesutului conjunctiv și a vaselor de sânge adiacente; mijloc – Tub Falcon cu țesut adipos după digestia cu colagenază (30 minute, 37⁰C); dreapta – Tub Falcon obtinerea fractiei stromale vasculare dupa centrifugare
Figura 5. Design experimental al obținerii celulelor ADSC din țesut adipos prin digestie enzimatică cu colagenază
III.2.2. Obținerea ADSC prin tehnica explantului din țesut adipos
Materiale necesare:
Instrumentar de laborator: foarfece, pense sterile;
Vas Petri din sticlă;
plăcuțe Petri pentru însămânțare;
pipete serologice sterile;
pipetor;
mediu de cultură DMEM 1‰ cu 15% ser fetal bovin;
Mod de lucru:
Fragmentele de țesut adipos rezultate în urma unor rezecții au fost curățate de țesutul conjunctiv și de vasele de sânge. Bucățile de țesut au fost mărunțite cu ajutorul foarfecei și a pensei sterile într-un vas Petri și au fost etalate pe suprafața unor plăcuțe Petri cu diametrul de 6 cm. Fragmentele de tesut au fost lăsate la uscat (în fluxul de aer din nișă) pentru a adera la suprafață plăcuțelor. După fixare, s-au adăugat câte 2 ml de mediu cald (37 ⁰C) DMEM 1‰ cu 15% ser fetal bovin în fiecare plăcuță Petri. Plăcuțele Petri au fost plasate în incubator, la 37 ⁰C. După ce celulele au început să migreze din fragmentele de țesut, mediul de cultură a fost schimbat la fiecare 48 de ore și la pre-confluenta celulele au fost tripsinizate și congelate.
Figura 6. Explant obținut din țesut adipos. Fragmente de țesut adipos etalate în plăcuța Petri, înainte de aderarea la placa Petri (stânga) și după aderarea la placa Petri și adăugarea mediului de cultură (dreapta)
Figura 7. Design experimental al obținerii celulelor ADSC din țesut adipos prin tehnica explantului
III.2.3. Decongelarea celulelor
În vederea caracterizării celulelor, acestea au fost decongelate. Celulele corespunzătoare pacienților 2 și 3au fost decongelate astfel: criula a fost dezghețată pe baie de apă (37⁰C) prin agitare. Conținutul criulei a fost transferat într-un tub Falcon de 15 ml cu un volum dublu (2 ml) de mediu DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin și 1% antibiotic penicilină, streptomicină, neominică și centrifugat la 1050 rpm, 4⁰C, 5 minute pentru îndepărtarea urmelor de DMSO ( dimetilsulfoxid). După centrifugare, supernatantul a fost îndepărtat și sedimentul a fost resuspendat în 4 ml de mediu de cultură și centrifugat din nou la 1050 rpm, 4⁰C, 5 minute. Sedimentul obținut a fost resuspendat în 20 ml mediu de cultură, celulele au fost însămânțate în plăci de cultură cu diamentrul de 6 cm la o densitate celulară de 200.000 celule/ plăcuță în mediu DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin și 1% antibiotic penicilină, streptomicină, neominică și introduse în incubator, la temperatura de 37 ⁰C.
III.2.4. Subcultivarea celulelor
În momentul în care celulele au atins pre-confluența de ~80% au fost tripsinizate și numărate prin parcurgerea următorului set de pași. Mediul de cultură a fost înlăturat din placa de cultură și placa a fost spălată prin adăugarea cu grijă a 4 ml de PBS, pe un perete al plăcii, pentru a nu despinde stratul de celule atașate, și apoi distribuirea pe toată suprafața prin înclinarea plăcii de câteva ori. Această etapă are ca scop înlăturarea urmelor de ser, calciu sau magneziu care ar putea interfera cu acțiunea agentului de disociere și ar putea scădea eficiența acestuia. Pentru desprinderea celulelor de placuța în care au fost cultivate și pentru ruperea legăturilor formate între celule s-a realizat tripsinizarea celulelor cu o soluție de tripsină de concentrație 2,5‰ si EDTA 0,5 mM. În placa Petri cu celule s-a adăugat 1 ml tripsină caldă și apoi a fost introdusă placa în incubator, la 37 ⁰C, pentru 5 minute. S-a verificat gradul de detașare al celulelor la microscopul optic și s-a pipetat suspensia celulară până în momentul în care s-au obținut celule individuale (suspensie celulară bob de bob). Pentru inactivarea tripsinei, celulele au fost transferate într-un tub Falcon cu 5 ml de mediu DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin, rece. Ulterior tubul a fost centrifugat la 1050 rpm, 4⁰C, 5 minute. După centrifugare, supernatantul a fost îndepărtat și sedimentul a fost resuspendat într-un volum cunoscut de mediu de cultură DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin. După omogenizare, din suspensia celulară au fost preluați 10 μL pentru numărarea celulelor cu ajutorul unei camere de numărare.
S-a utilizat un microscop în contrast de fază cu un obiectiv 10X și s-a focalizat pe liniile grilei camerei de numărare. S-au numărat celulele din cele patru cadrane (fiecare cu câte 16 pătrate), apoi a fost făcuta media celulelor ținandu-set cont că numărul rezultat a fost obținut într-un volum de 0.1 și s-a multiplicat apoi cu pentru a exprima valoare obținută în celule/mL suspensie.
Tubul cu celule a fost centrifugat 1050 rpm, 4⁰C, 5 minute. Supernatantul a fost aruncat iar peletul a fost resuspendat în mediu de cultură astfel încât să ajungă la densitatea celulară de 1. 000 000 celule/ mL. S-a realizat reînsămânțarea celulelor la o densitate celulară de 200 000 celule per placă în 4 ml de mediu DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin cald. Placa a fost introdusă în incubator, la temperatura de 37 ⁰C.
III.3. Evaluarea capacității proliferative
Pentru evidențierea potențialulul proliferativ al celulelor provenite de la cei trei pacienți a fost realizata curba de creștere pentru fiecare dintre aceștia. Celulele au fost menținute în cultură până în momentul în care s-a observat că acestea nu mai proliferează, deci ating senescență replicativă.
Pentru fiecare pacient, celulele au fost însămânțate de fiecare dată la aceeași densitate celulară: 200 000 celule/ placă cu diametrul de 6 cm, mediul de cultură fiind schimbat la intervale de 48 de ore. La fiecare 72 de ore de la însămânțare, celulele au fost pasate și numărate conform protocolului descris la punctul 2.4. Subcultivarea celulelor, urmând ca apoi din suspensia obținută celulele să fie însămânțate la aceeași densitate celulară.
A fost calculat numărul de dublări populaționale realizate de celulele menținute în cultură și pasate la intervale aproximativ egale de timp, de 72 de ore. Dublările populaționale au fost calculate după formula:
DP = 3.32*(Log (NF)-Log(NI)), unde NF= numărul de celule obținut după 72 de ore în cultură și NI= numărul de celule însămânțate.
În realizarea curbei de creștere s-au folosit dublări populaționale cumulate.
III.4. Evaluarea potențialului de diferențiere multiliniară
III.4.1. Protocolul de diferențierea către linia adipogenă
Pentru inducerea diferențierii celulelor stem izolare din țesut adipos s-a utilizat un mediu de diferențiere care conținea factori inductori capabili să dirijeze schimbarea fenotipului celulelor de la un fenotip fibroblast-like la unul specific adipocitelor.
Mediul de diferențiere adipogenă a fost preparat după următoarea rețetă: mediu de cultură DMEM 1‰, îmbogățit cu 10% ser fetal bovin, ITS (insulina, selenit, transferina) 1 µg/ml , dexametazonă M, IBMX (3-izobutil-1-metilxantină) 0,5 mM, rosiglitazonă 1 µM.
Celulele au fost însămânțate în plăci de cultură cu 4 godeuri la o densitate celulară de 10.000 celule/ (20000 celule/godeu), dintre care 2 godeuri corespuzand condiției control, celule fără mediu de diferențiere și 2 godeuri conținand celule supuse diferențierii adipogene. Experimentul a fost realizat în duplicat, pentru fiecare experiment de diferențiere am însămânțat câte 2 astfel de plăci. Mediul de cultură în care au fost însămânțate celulele a fost mediu DMEM 1‰, îmbogățit cu 15% ser fetal bovin și 1% antibiotic: penicilină, streptomicină și neomicină. Celulele au fost menținute în cultură până când au ajuns la 80% confluență. Mediul de cultură a fost schimbat cu unul proaspăt la fiecare două zile. În momentul în care celulele au atins confluența de 80%, s-a schimbat mediul de cultură astfel: în godeurile destinate diferențierii adipogene am adăugat câte 500 µl de diferențiere adipogenă suplimentat cu 1% antibiotic penicilină, streptomicină și neomicină, iar în godeurile corespunzătoare condiției control au fost adăugați 500 µl de mediu DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin și 1% antibiotic penicilină, streptomicină și neomicină.
Celulele au fost menținute în cultură pentru aproximativ 21 de zile, reîmprospătarea mediilor (control și de diferențiere) fiind realizată la două zile. După acest interval, celulele au început să își schimbe morfologia și să producă picături lipidice distribuite în formă de șirag, ulterior ciorchine, în citoplasma celulară. La finalul acestui interval, celulele au fost fixate cu paraformaldehidă 4%, 15 minute la temperatura camerei, spălând godeurile înainte și după fixare cu PBS. Celulele au fost păstrate în PBS până în momentul realizării colorației cu Oil Red O.
III.4.2. Protocolul de diferențierea către linia osteogenă
Mediul de diferențiere osteogenă a fost preparat după următoarea rețetă: β-glicerofosfat 10 mM, acid ascorbic 0,2 mM, dexametazonă M, rosiglitazonă 1 µM, dizolvate în mediu DMEM 1‰ îmbogățit cu 10% ser fetal bovin.
Celulele au fost însămânțate în plăci de cultură cu 4 godeuri la o densitate celulară de 10.000 celule/ (20000 celule/godeu) utilizând ca mediu de cultură DMEM 1‰, îmbogățit cu 15% ser fetal bovin și 1% antibiotic: penicilină, streptomicină și neomicină. Două dintre godeuri au fost corespunzătoare condiției control și conțineau celule care nu sunt supuse procesului de diferențiere, iar celelalte două godeuri au fost induse diferențierii osteogene.
Celulele s-au menținut în cultură până au ajuns la 100% confluență, schimbându-se mediul de cultură cu unul proaspăt la două zile. În momentul în care celulele au atins confluența de 100%, se schimbă mediul de cultură din godeurile destinate diferențierii cu mediul de diferențiere osteogenă, suplimentat cu 1% antibiotic penicilină, streptomicină și neomicină și mediul corespunzător condiției control (DMEM 1‰ cu 10% ser fetal bovin și 1% antibiotic penicilină, streptomicină și neomicină).
Celulele au fost menținute în cultură pentru 21 de zile, mediile de cultură fiind reîmprospătate la două zile. După aproximativ 14 zile, celulele au început să își schimbe morfologia și să formeze noduli de .
Fixarea celulelor. După 21 de zile, celulele au fost fixate cu metanol absolut rece, 15 minute. Godeurile cu celule au fost spălate apoi cu PBS și menținute în PBS până în momentul realizării unei colorații specifice, menite să evidențiere procesul de diferențiere osteogenă.
III.4.3. Protocolul de diferențierea către linia condrogenă
Mediul de diferențiere condrogenă a fost preparat după rețeta: dexametazonă M, ascorbat 2-fosfat 50 µg/ml, prolină 40 µg/ml, ITS+1 (diluat 1:100 din soluția stoc), diluate în mediu DMEM 4,5‰ fără ser fetal bovin. Înainte de a adăuga mediul peste celule supuse tratamentului s-a adăugat factorul TGF β3 în concentrație de 10 ng/ml.
Diferențierea condrogenă s-a realizat pe culturi în sediment. Celulele ADSC au fost distribuite câte 250 000 celule/ tub Falcon de 15 ml. Probele au fost centrifugate pentru 5 minute, la 300g. S-a indepartat supernatantul și sedimentul a fost resuspendat în 500 µl mediu de diferențiere condrogenă, mediu în care s-a adăugat factorul TGF β3 (10 ng/ml). Tuburile au fost centrifugate pentru 5 minute, la 300g, apoi capacele tuburilor au fost ușor desfăcute și probele au fost introduse în incubator (37 ⁰C) pentru 21 de zile. Mediul de cultură a fost schimbat de 2 ori pe săptămână, după 21 de zile obținându-se un sediment globulos.
Fixarea sedimentului. După 21 de zile, sedimentul a fost fixat cu PFA 4%, 24h, la temperatura camerei, spălând cu PBS godeurile înainte și după fixare.
Deshidratarea sedimentului. Sedimentul a fost apoi prelucrat în vederea realizării de secțiuni histologice. Inițial a fost deshidratat prin trecerea succesivă prin băi de etanol de concentrații descrescătoare: etanol 70%, etanol 96%, etanol 100%, câte 2 băi a câte o oră.
Clarificarea sedimentului a fost realizată utilizând xilen – sedimentul a fost trecut prin 3 băi de xilen a câte o oră fiecare. După clarificare, sedimentul s-a transparentizat, apoi s-a realizat colorarea acestuia cu Alcian Blue (pentru a deveni vizibil).
Includerea sedimentului în blocul de parafină. Înainte de includerea propriu-zisă în blocul de parafină, sedimentul a fost menținut într-o baie de parafină pentru 2 ore și apoi inclus în blocul de parafină.
Realizarea de microsecțiuni. Secționarea blocului de parafină a fost realizată utilizănd microtomul. Au fost realizate secțiuni cu o grosime de 5µm, care au fost etalate pe baia de apă și preluate pe lame. Lamele au fost introduse în etuvă pentru aderarea si etalarea secțiunilor și lăsate peste noapte în etuvă la temperatura de 60 ⁰C. Lamele au fost păstrate la temperatura camerei până în momentul colorării.
III.5. Metode citochimice folosite pentru evidențierea procesului de diferențiere către adipocite, osteoblaste și condroblaste
III.5.1. Colorația cu Oil Red
Colorația cu Oil Red evidențiază gradul de diferențiere al celulelor către adipocite. Oil Red O () reprezintă un colorant diazoic lizocrom utilizat pentru colorarea trigliceridelor și lipidelor neutre pe criosecțiuni și a unor lipoproteine pe secțiuni de parafină. Colorantul are o absorbție maximă la 518 nm (Kraus și colab., 2016).
Figura 8. Structura moleculară a colorantului Oil Red
Pregătirea soluției Oil Red: Soluția stoc s-a obținut prin dizolvarea a 0,5 g de pulbere Oil Red în 100 ml izopropanol 100%, pe plita magnetică cu agitare. Soluția de lucru Oil Red a fost preparată din 30 ml de soluție stoc Oil Red și 20 ml apă distilată. Soluția a fost filtrată prin hârtie de filtru și stocată într-un vas opac, pentru a evita degradarea colorantului la lumină.
Protocolul de realizare a colorației. Celulele, anterior fixate cu paraformaldehidă 4% și menținute în PBS, au fost colorate cu 500 µl soluție Oil Red filtrată, 15 minute, la temperatura camerei, la întuneric. Colorantul a fost îndepărtat, godeurile cu celule au fost spălate cu PBS si fotografiate la microscopul optic inversat în contrast de fază ZEISS, la magnificație 10x, 20x, 40x.
III.5.2. Colorația cu Alizarin Red
Colorația cu Alizarin Red a fost utilizată pentru a evidenția diferențierea celulelor stem derivate din țesut adipos către osteoblaste. Alizarin Red S este un derivat al antrachinonei utilizat pentru a identifica depozitelor de calciu din secțiunile de țesut. Reacția colorantului Alizarin Red nu este strict specifică pentru calciu, deoarece și alte elemente bivalente precum magneziu, mangan, bariu, stronțiu și fier pot interfera, însă aceste elemente nu apar de obicei în concentrație suficient de mare pentru a interfera cu colorarea. Prin interacția cu colorantul Alizarin Red, se formează un complex calciu – Alizarin Red printr-un proces de chelare.
Figura 9. Structura moleculară a colorantului Alizarin Red
Prepararea soluției de Alizarin Red: 2g de pulbere Alizarin Red au fost dizolvate în 100 ml apă distilată, pe plită, cu agitare. Soluția a fost adusă la un pH= 4,1- 4,3 cu hidroxid de amoniu 10%.
Protocolul de realizare a colorației. Celulele fixate anterior au fost colorate cu soluția Alizarin Red, 5 minute, la temperature camerei. Godeurile cu celulele diferențiate s-au spalat de 4-5 ori cu apă distilată și au fost apoi fotografiate la microscopul optic inversat cu contract de fază ZEISS, la magnificație 10X, 20X și 40X.
III.5.3. Colorația cu Alcian Blue
Diferențierea celulelor stem derivate din țesut adipos către condroblaste a fost evaluată prin colorația cu Alcian Blue. Alcian Blue este un colorant bazic polivalent, solubil în apă, care prezintă în moleculă. Alcian Blue (la pH de 2,5 și preparat în soluție de acid acetic 3%) colorează glicozaminoglicanii din structura cartilajului, atât mucopolizaharidele acide sulfatate și carboxilate, cât glicoproteine de tipul sialomucinelor sulfatate și carboxilate. Astfel, principiul reacției de colorare are la bază formarea de legături între grupările bazice ale colorantului și grupările acide ale mucopolizaharidelor acide din structurile diferențiate.
Figura 10. Structura moleculară a Alcian Blue
Prepararea soluțiilor.
Soluția Alcian Blue: 0,5 g Alcian Blue au fost dizolvate în 50 ml acid acetic 3%. Soluția obținută a fost adusă la pH=2,5 și filtrată prin hârtie de filtru. S-a adăugat un cristal de timol pentru a preveni infectarea solutiei.
Soluția Nuclear fast red: 25 g de sulfat de aluminiu au fost dizolvate în 500 ml apă distilată. S-a adăugat 0,5 g Nuclear fast red și s-a dizolvat soluția pe plita încălzită. Apoi soluția a fost filtrata cu ajutorul hârtiei de filtru și s-a adăugat un cristal de timol.
Pregătirea secțiunilor pentru colorare. Înainte de colorare, lamele au fost deparafinate în xilen, realizându-se două băi succesive a câte 15 minute, prima baie cu incubare la 60ᵒC, iar a doua la temperatura camerei. Ulterior lamele au fost hidratatate prin trecerea acestora prin băi de etanol de concentrații crescătoare: o baie de alcool etilic absolut de 5 minute, o baie de alcool etilic 96% 5 minute, alcool etilic 70% 5 minute și la final o baie de apă distilată pentru 10 minute.
Protocolul de realizare a colorației cu Alcian Blue: Lamele au fost plasate într-un pahar Coplin cu acid acetic 3% pentru 3 minute, după care au fost introduse în soluție de Alcian Blue, 30 minute și menținute la temperatura camerei. Lamele au fost apoi spălate cu apă de robinet, clătite în apă distilată și colorate cu Nuclear fast red pentru 5 minute. Lamele au fost din nou spălate în apă de robinet și deshidratate în băi de etanol de concentrații crescătoare: o baie de etanol de concentrație 70% pentru 3 minute, o baie de etanol de concentrație 96% pentru 3 minute, o baie de etanol absolut. Înainte de montare, secțiunile au fost clarificate în toluen, montarea realizându-se cu Balsam de Canada.
Secțiunile astfel colorate au fost vizualizate la microscop la obiectivele 5X, 10X și 20X. S-au putut observa nucleii celulelor colorați în roșu (Nuclear fast red) și prezența polizaharidelor colorate în albastru.
III.6. Analiza markerilor de suprafață prin citometrie în flux
Protocolul de pregătire a celulelor pentru citometria în flux:
Pentru a examina prezența markerilor de suprafață specifici celulelor mezenchimale multipotente celulele (provenite de la fiecare dintre cei 3 pacienți) a fost folosită tehnica de citometrie de flux.
Celulele au fost însămânțate în plăcuța Petri cu diametrul de 6 cm la densitatea celulară de 200.000 celule/ placă Petri. După 4 zile, moment în care celulele au ajuns la pre-confluență, celulele au fost desprinse de pe placă și pregătite pentru citometria în flux. Pentru desprinderea celulelor s-a folosit acutază deoarece această enzimă are o acțiune mai blândă asupra celulelor, având efect de conservare a epitopilor moleculelor de interes. După îndepărtarea mediului de cultură din placa Petri, celulele au fost spălate placa cu 1 ml PBS, urmând ca placa cu celule sa fie lăsată la incubator 5-10 minute, la 37 ⁰C, cu 1 ml de acutază. După acest interval de timp, celulele s-au vizualizat la microscop și s-a verificat dacă s-au desprins de placă, lucru evidențiat prin rotunjirea celulelor și mișcarea lor în câmpul microscopului. Suspensia obținută a fost trecută într-un tub cu 5 ml de mediu DMEM 1% cu 10% ser fetal bovin, rece, pus anterior pe gheață. Tubul a fost centrifugat 5 minute, la 1050 rpm, la 4 ⁰C. După centrifugare, s-a aruncat supernatantul și celulele au fost resuspendate într-un volum de mediu cunoscut pentru a fi numărate. Au fost din nou centrifugate 5 minute, la 1050 rpm, la 4 ⁰C, iar sedimentul a fost reluat într-un volum de PBS cu 10% ser care să permită obținerea unei densități de 100.000 celule/ 100 µl. Tubul cu suspensia de celule a fost lăsat 15 minute la temperatura camerei. Au fost transferați câte 100 µl din suspensia de celule în tuburi pentru citometria în flux.
S-au utilizat anticorpi din kitul Human Mesenchymal Stem Cell Multi-Color Flow Citometry Kit produs de R&D Systems. Au fost pregătite 3 tuburi pentru fiecare experiment astfel: tubul 1- conținea numai celule, tubul 2-izotip- s-a adăugat câte 10 µl din fiecare anticorp specific din kit: Mouse IgG1-PE Isotype Control, Mouse IgG2A-APC Isotype Control, Mouse IgG1-CFS Isotype Control, IgG1-PerCP Isotype Control, tubul 3 – markeri – s-a adăugat câte 10 µl din fiecare anticorp: CD105/Endoglin-PerCP Mouse IgG1; CD73/5` nucleotidaza Mouse IgG1; CD90/Thy1-APC Mouse IgG2A; CD45-PE Mouse IgG1. Celulele au fost incubate cu anticorpi pentru 30 minute, la temperature camerei, la întuneric. Tuburile cu celule au fost supuse unei centrifugări la 400g, pentru 5 minute, la 4 ⁰C. Ulterior au fost realizate 3 spălări ale celulelor cu soluție de PBS steril cu 2% ser fetal bovin și 2 mM EDTA astfel: după centrifugare supernatantul a fost aspirat, a fost adăugată soluția de PBS steril cu 2% ser fetal bovin și 2 mM EDTA, celulele au fost resuspendate și centrifugate la 400 g, pentru 5 minute, la 4 ⁰C. Procedeul s-a repetat de 3 ori, la ultima aspirare a supernatantului s-au păstreat aproximativ 400 µl în fiecare tub. Citirea probelor a fost efectuata la citometrul GALLIOS Flow Cytometer, utilizând softul atașat acestuia.
III.7. Analiza statistică a datelor
Prelucrarea datelor obținute s-a realizat cu ajutorul aplicației Excel a programului Microsoft Office 2010.
Pentru reprezentarea grafică a datelor necesare pentru realizarea curbelor de creștere s-a utilizat aplicația GraphPad Prism.
Capitolul IV. Rezultate și discuții
IV.1. Izolarea ADSC din țesutul adipos și analiza morfologiei celulare
Ambele metode utilizate pentru izolarea celulelor stem mezenchimale stromale din țesutul adipos s-au dovedit eficiente, având în vedere că s-a reușit obținerea de ADSC atât prin digestie enzimatică, cât și prin tehnica explantului.
Figura 11. Morfologia ADSC, provenite de la pacientul 1, după 2 săptămâni în cultură. Cu negru sunt indicate fragmentele de țesut adipos din lipoaspirat, iar cu albastru ADSC, la magnificație 5X, 10X și 20X.
Figura 12. Morfologia ADSC obținute prin digestie enzimatică din țesut adipos, magnificație 5X, scala = 200µm
În cadrul izolării celulelor ADSC prin tehnica explantului, pentru evaluarea gradului de migrare a celulelor din fragmentele de țesut adipos celulele au fost examinate la microscopul optic în contract de fază ZEISS. După 2-3 săptămâni în cultură, celulele au migrat din fragmentele de țesut adipos și au proliferat în plăcile în care au fost cultivate. Figura 11 ilustrează gradul de migrare al celulelor stem derivate din explantul de țesut adipos după 2 săptămâni în cultură. Celulele au prezentat morfologie alungită de tip fibroblastic. Figura 12 evidențiază morfologia celulelor ADSC după izolarea prin digestie enzimatică si propagarea lor în cultură in vitro la pasajul #2 (pacientul 2).
IV.2. Evaluarea capacității proliferative
Figura 13. Curbele de creștere ale celulelor ADSC provenite de la cei 3 subiecți.
Celulele stem derivate din țesut adipos izolate de la pacientul 1 prin tehnica explantului și-au păstrat potențialul proliferativ până la pasajul #31 (125 de zile în cultură), comparativ cu celulele izolate de la pacientul 2 prin digestie enzimatică, care și-au păstrat potențialul proliferativ până la pasajul #24 (93 de zile în cultură). Celulele stem derivate din țesut adipos provenite de la pacientul 3 prin tehnica explantului au fost menținute în cultură până la pasajul #17, acestea conservându-și potențialul proliferativ până în momentul încetării cuantificării duplărilor de populație.
După cum se poate observa și în Figura 11, capacitatea proliferativă a celulelor a scăzut după un anumit număr de pasaje și a atins o fază de platou. În cazul pacientului 1 , potențialul proliferativ a început să scadă după 22 de pasaje, comparativ cu pacientul 2 la care faza de platou a fost atinsă după parcurgerea a 17 pasaje. Acest lucru indică faptul că celulele au atins punctul de senescență replicativă după parcurgerea a aproximativ 15-20 pasaje, celulele analizate demonstrând datele din literatura de specialitate.
IV.3. Evaluarea potențialului de diferențiere multiliniară
Experimentele de diferențiere către linia adipogenică, osteogenică și condrogenică au arătat că toate cele 3 populații de celule stem, indiferent de metoda de izolare, au prezentat potențial de diferențiere triliniară. Prin colorația cu Oil Red O a fost pusă în evidență acumularea lipidelor neutre în citoplasma celulelor (Figura 12, stanga), depozitele lipidice colorându-se în roșu. Diferențierea osteogenică a fost evidențiată prin colorația cu Alizarin Red, în urma căreia depozitele de calciu formate în urma diferențierii au fost colorate cu roșu (Figura R, mijloc). Pentru evaluarea potențialului condrogenic s-a folosit colorația cu Alcian Blue și Nuclear fast red în urma căreia matricea celulară bogată în glicozaminoglicani a fost colorată în albastru, iar nucleii celulelor în roz.
Figura 14. Diferențierea triliniară a ADSC provenite de la 3 pacienți: 1 – prin tehnica explantului, 2 – prin digestie enzimatică cu colagenază -și 3 – prin tehnica explantului – stânga – diferențiere adipogenică (Colorație cu Oil Red O), mijloc- diferențiere osteogenică (Colorație cu Alizarin Red), dreapta – diferențiere condrogenică (Colorație cu Alcian Blue și Nuclear fast red), magnificație 20X (stânga și mijloc); și 4X, (dreapta)
IV.4. Analiza markerilor de suprafață prin citometrie în flux
În urma analizei imunofenotipului celulelor stem derivate din țesut adipos prin citometrie în flux s-a observat că toate cele 3 linii celulare obținute de la pacienții analizați prezentau în procente de peste 60% în populație markerii specifici celulelor stromale mezenchimale: CD 73, CD 105 și CD 90. Astfel, în cazul pacientului 1 un procent de 71,87% dintre celule sunt CD 73+, 63,66% CD105 + și 98,61% CD90+, comparativ cu pacientul 3 care prezintă un procent mai scăzut de celule CD73+ (65,73%) și celule CD105+ (61,34%), procentul de celule CD90 + fiind asemănător (98,49%). Pacientul 2 prezintă un procent mai mare de celule CD73+ (72,81%), CD105+ (71,88%) și CD90+ (99,71%) comparativ cu ceilalți 2 pacienți, lucru ce ar putea sugera faptul că metoda de izolare ar putea interfera cu conservarea antigenelor de suprafață.
Având în vedere faptul că analiza imunofenotipului celor 3 linii celulare a fost realizată la același pasaj, pasajul #3, diferențele de expresie a markerilor de suprafață nu a constituit o consecință a propagării celulelor in vitro.
Figura 15. Analiza profilul imunofenotipic al celulelor ADSC provenite de la 1 – prin tehnica explantului, 2 – prin digestie enzimatică cu colagenază -și 3 – prin tehnica explantului, evidențiat prin citometrie în flux
Capitolul V. Concluzii
În urma analizei eficienței metodelor de izolarea a celulor stem mezenchimale derivate din țesut adipos s-a constatat că atât tehnica explantului, cât și cea a digestiei enzimatice cu colagenază permite izolarea ADSC din țesut adipos. În ceea ce privește timpul de execuție digestia cu colagenază este mai convenabilă, pe când tehnica explantului este preferabilă pentru faptul că utilizează un minimum de resurse și interfere mai puțin cu analiza profilului imunofenotipic al celulelor isolate.
ADSC izolate de la pacientul 1 prin tehnica explantului și-au păstrat potențialul proliferativ timp de 22 de pasaje, în timp la ADSC izolate de la pacientul 2 o scădere a potențialul proliferativ s-a înregistrat începând cu pasajul #17.
În ceea ce privește profilul imunofenotipic al ADSC isolate de la cei trei pacienți, toți pacienții au prezentat markeri specifici celulelor stem mezenchimale (CD 73, CD105, CD90) în peste 61% din celulelele din populațiile liniile celulare analizate.
ADSC izolate de la cei trei pacienți au prezentat capacitatea de diferențiere triliniară, către linia adipogenică, osteogenică și condrogenică, procese evidențiate prin tehnici citochimice.
Așadar, celulele stem mezenchimale derivate din țesut adipos izolate de la cei trei pacienți prin tehnica explantului și a digestiei enzimatice demonstrează caracteristicile specifice celulelor stem mezenchimale (potențial proliferativ, capacitate de diferențiere multiliniară și profil imunofenotipic specific).
Experimentele din cadrul acestei lucrări au fost realizate în cadrul proiectului de cercetare proiectului TE cod PN-III-P1-1.1- TE-2016-1592 PROSKIN – “Mesenchymal stromal cells contribution to the reepithelialization process of the biomimetic skin cultures by differentiation and paracrine factors “Project coordinator: Irina Titorencu – IBPC “N. Simionescu”.
Bibliografie
Agostini, F., Rossi, F.M., Aldinucci, D., Battiston, M., Lombardi, E., Zanolin, S., Massarut, S., Parodi, P.C., Da Ponte, A., Tessitori, G. and Pivetta, B., 2018. Improved GMP compliant approach to manipulate lipoaspirates, to cryopreserve stromal vascular fraction, and to expand adipose stem cells in xeno-free media. Stem cell research & therapy, 9(1), pp.1-16.
Almalki, S.G. and Agrawal, D.K., 2016. Key transcription factors in the differentiation of mesenchymal stem cells. Differentiation, 92(1-2), pp.41-51.
Bajek, A., Gurtowska, N., Gackowska, L., Kubiszewska, I., Bodnar, M., Marszałek, A., Januszewski, R., Michalkiewicz, J. and Drewa, T., 2015. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells?. Bioscience reports, 35(3).
Bajek, A., Gurtowska, N., Olkowska, J., Maj, M., Kaźmierski, Ł., Bodnar, M., Marszałek, A., Dębski, R. and Drewa, T., 2017. Does the harvesting technique affect the properties of adipose‐derived stem cells?—the comparative biological characterization. Journal of cellular biochemistry, 118(5), pp.1097-1107.
Banas, A., Teratani, T., Yamamoto, Y., Tokuhara, M., Takeshita, F., Quinn, G., Okochi, H. and Ochiya, T., 2007. Adipose tissue‐derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology, 46(1), pp.219-228.
Baraniak, P. R., și McDevitt, T. C., 2010. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regenerative medicine, 5(1), pag 121-143
Bartholomew, A., Sturgeon, C., Siatskas, M., Ferrer, K., McIntosh, K., Patil, S., Hardy, W., Devine, S., Ucker, D., Deans, R. and Moseley, A., 2002. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Experimental hematology, 30(1), pp.42-48.
Basoli, V., Santaniello, S., Cruciani, S., Ginesu, G.C., Cossu, M.L., Delitala, A.P., Serra, P.A., Ventura, C. and Maioli, M., 2017. Melatonin and vitamin D interfere with the adipogenic fate of adipose-derived stem cells. International journal of molecular sciences, 18(5), p.981.
Becker A.J., McCulloch E.A. și Till J.E., 1963. Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature, 197(4866), pp.452-454.
Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S. and Picardo, M., 2017. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports, 7(1), pp.1-15.
Bernardo, M.E., Avanzini, M.A., Ciccocioppo, R., Perotti, C., Cometa, A.M., Moretta, A., Marconi, M., Valli, M., Novara, F., Bonetti, F. and Zuffardi, O., 2009. Phenotypical/functional characterization of in vitro-expanded mesenchymal stromal cells from patients with Crohn's disease. Cytotherapy, 11(7), pp.825-836.
Bourin, P., Bunnell, B.A., Casteilla, L., Dominici, M., Katz, A.J., March, K.L., Redl, H., Rubin, J.P., Yoshimura, K. and Gimble, J.M., 2013. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy, 15(6), pp.641-648.
Brooke, G., Cook, M., Blair, C., Han, R., Heazlewood, C., Jones, B., Kambouris, M., Kollar, K., McTaggart, S., Pelekanos, R. and Rice, A., 2007, December. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. In Seminars in cell & developmental biology (Vol. 18, No. 6, pp. 846-858). Academic Press.
Bunnell B. A., Flaat M., Gagliardi C., Patel B., Ripoll C., 2008. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods, 45(2), pp. 115-120.
Charles-de-Sá, L., Gontijo-de-Amorim, N.F., Takiya, C.M., Borojevic, R., Benati, D., Bernardi, P., Sbarbati, A. and Rigotti, G., 2015. Antiaging treatment of the facial skin by fat graft and adipose-derived stem cells. Plastic and reconstructive surgery, 135(4), pp.999-1009.
Choi, Y.S., Dusting, G.J., Stubbs, S., Arunothayaraj, S., Han, X.L., Collas, P., Morrison, W.A. and Dilley, R.J., 2010. Differentiation of human adipose‐derived stem cells into beating cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine, 14(4), pp.878-889.
Conrad, C. and Huss, R., 2005. Adult stem cell lines in regenerative medicine and reconstructive surgery. Journal of Surgical Research, 124(2), pp.201-208.
da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P.C. and Nardi, N.B., 2006. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of cell science, 119(11), pp.2204-2213.
Dominici, M.L.B.K., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F.C., Krause, D.S., Deans, R.J., Keating, A., Prockop, D.J. and Horwitz, E.M., 2006. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4), pp.315-317.
Erices, A., Conget, P. and Minguell, J.J., 2000. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. British journal of haematology, 109(1), pp.235-242.
Fraser, J.K., Schreiber, R., Strem, B., Zhu, M., Alfonso, Z., Wulur, I. and Hedrick, M.H., 2006. Plasticity of human adipose stem cells toward endothelial cells and cardiomyocytes. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine, 3(1), pp.S33-S37.
Fraser, J.K., Wulur, I., Alfonso, Z. and Hedrick, M.H., 2006. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in biotechnology, 24(4), pp.150-154.
Freshney, R.I., 2015. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. John Wiley & Sons. Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th ed. Hoboken, NJ: Wiley‐Blackwell; 2010. xxxi, 732 p., 28 p. of plates p.
Friedenstein, A.J., Petrakova, K.V., Kurolesova, A.I. and Frolova, G.P., 1968. Heterotopic transplants of bone marrow. Transplantation, 6(2), pp.230-247.
Ghorbani, A., Jalali, S.A. and Varedi, M., 2014. Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method. Tissue and Cell, 46(1), pp.54-58.
Gimble, J.M., 2003. Adipose tissue-derived therapeutics. Expert opinion on biological therapy, 3(5), pp.705-713.
Haniffa, M.A., Wang, X.N., Holtick, U., Rae, M., Isaacs, J.D., Dickinson, A.M., Hilkens, C.M. and Collin, M.P., 2007. Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells. The Journal of Immunology, 179(3), pp.1595-1604.
Hendijani, F., 2017. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell proliferation, 50(2), p.e12334.
Jacobs, S.A., Pinxteren, J., Roobrouck, V.D., Luyckx, A., Van't Hof, W., Deans, R., Verfaillie, C.M., Waer, M., Billiau, A.D. and Van Gool, S.W., 2013. Human multipotent adult progenitor cells are nonimmunogenic and exert potent immunomodulatory effects on alloreactive T-cell responses. Cell transplantation, 22(10), pp.1915-1928.
Jiang, R., Han, Z., Zhuo, G., Qu, X., Li, X., Wang, X., Shao, Y., Yang, S. and Han, Z.C., 2011. Transplantation of placenta-derived mesenchymal stem cells in type 2 diabetes: a pilot study. Frontiers of medicine, 5(1), pp.94-100.
Jiang, X.X., Zhang, Y.I., Liu, B., Zhang, S.X., Wu, Y., Yu, X.D. and Mao, N., 2005. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood, 105(10), pp.4120-4126.
Johnstone, B., Hering, T.M., Caplan, A.I., Goldberg, V.M. and Yoo, J.U., 1998. In vitrochondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Experimental cell research, 238(1), pp.265-272.
Koh, K.S., Oh, T.S., Kim, H., Chung, I.W., Lee, K.W., Lee, H.B., Park, E.J., Jung, J.S., Shin, I.S., Ra, J.C. and Choi, J.W., 2012. Clinical application of human adipose tissue–derived mesenchymal stem cells in progressive hemifacial atrophy (Parry-Romberg disease) with microfat grafting techniques using 3-dimensional computed tomography and 3-dimensional camera. Annals of plastic surgery, 69(3), pp.331-337.
Kraus, N.A., Ehebauer, F., Zapp, B., Rudolphi, B., Kraus, B.J. and Kraus, D., 2016. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte, 5(4), pp.351-358.
Li, J., Huang, H. and Xu, X., 2017. Biological characteristics and karyotiping of a new isolation method for human adipose mesenchymal stem cells in vitro. Tissue and Cell, 49(3), pp.376-382.
Li, S.H., Liao, X., Zhou, T.E., Xiao, L.L., Chen, Y.W., Wu, F., Wang, J.R., Cheng, B., Song, J.X. and Liu, H.W., 2017. Evaluation of 2 Purification Methods for Isolation of Human Adipose-Derived Stem Cells Based on Red Blood Cell Lysis With Ammonium Chloride and Hypotonic Sodium Chloride Solution. Annals of plastic surgery, 78(1), pp.83-90.
Liang, J., Zhang, H., Kong, W., Deng, W., Wang, D., Feng, X., Zhao, C., Hua, B., Wang, H. and Sun, L., 2018. Safety analysis in patients with autoimmune disease receiving allogeneic mesenchymal stem cells infusion: a long-term retrospective study. Stem cell research & therapy, 9(1), pp.1-10.
Maioli, M., Basoli, V., Santaniello, S., Cruciani, S., Delitala, A.P., Pinna, R., Milia, E., Grillari-Voglauer, R., Fontani, V., Rinaldi, S. and Muggironi, R., 2016. Osteogenesis from dental pulp derived stem cells: a novel conditioned medium including melatonin within a mixture of hyaluronic, butyric, and retinoic acids. Stem cells international, 2016.
Makridakis, M. and Vlahou, A., 2010. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of proteomics, 73(12), pp.2291-2305..
Mazini, L., Rochette, L., Amine, M. and Malka, G., 2019. Regenerative capacity of adipose derived stem cells (ADSCs), comparison with mesenchymal stem cells (MSCs). International journal of molecular sciences, 20(10), p.2523.
Palumbo, P., Lombardi, F., Siragusa, G., Cifone, M.G., Cinque, B. and Giuliani, M., 2018. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences, 19(7), p.1897.
Palumbo, P., Miconi, G., Cinque, B., la Torre, C., Lombardi, F., Zoccali, G., Orsini, G., Leocata, P., Giuliani, M. and Cifone, M.G., 2015. In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells. Journal of cellular physiology, 230(8), pp.1974-1981.
Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S. and Marshak, D.R., 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. science, 284(5411), pp.143-147.
Rigotti, G., Charles-de-Sá, L., Gontijo-de-Amorim, N.F., Takiya, C.M., Amable, P.R., Borojevic, R., Benati, D., Bernardi, P. and Sbarbati, A., 2016. Expanded stem cells, stromal-vascular fraction, and platelet-rich plasma enriched fat: comparing results of different facial rejuvenation approaches in a clinical trial. Aesthetic surgery journal, 36(3), pp.261-270.
Roufosse, C.A., Direkze, N.C., Otto, W.R. and Wright, N.A., 2004. Circulating mesenchymal stem cells. The international journal of biochemistry & cell biology, 36(4), pp.585-597.
Sessarego, N., Parodi, A., Podestà, M., Benvenuto, F., Mogni, M., Raviolo, V., Lituania, M., Kunkl, A., Ferlazzo, G., Bricarelli, F.D. and Uccelli, A., 2008. Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for clinical application. haematologica, 93(3), pp.339-346.
Spaggiari, G.M., Abdelrazik, H., Becchetti, F. and Moretta, L., 2009. MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function by selectively interfering with the generation of immature DCs: central role of MSC-derived prostaglandin E2. Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 113(26), pp.6576-6583.
Trottier, V., Marceau‐Fortier, G., Germain, L., Vincent, C. and Fradette, J., 2008. IFATS collection: Using human adipose‐derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem cells, 26(10), pp.2713-2723.
Tsuji, W., Rubin, J.P. and Marra, K.G., 2014. Adipose-derived stem cells: Implications in tissue regeneration. World journal of stem cells, 6(3), p.312.
Valadi, H., Ekström, K., Bossios, A., Sjöstrand, M., Lee, J.J. and Lötvall, J.O., 2007. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology, 9(6), pp.654-659.
Varma, M.J.O., Breuls, R.G., Schouten, T.E., Jurgens, W.J., Bontkes, H.J., Schuurhuis, G.J., Ham, S.M.V. and Milligen, F.J.V., 2007. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem cells and development, 16(1), pp.91-104.
Vizoso, F.J., Eiro, N., Cid, S., Schneider, J. and Perez-Fernandez, R., 2017. Mesenchymal stem cell secretome: toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine. International journal of molecular sciences, 18(9), p.1852.
Wang, L., Lu, Y., Luo, X., Fu, M.G., Hu, X., Dong, H. and Fan, Z.H., 2012. Cell-assisted lipotransfer for breast augmentation: a report of 18 patients. Zhonghua zheng xing wai ke za zhi= Zhonghua zhengxing waike zazhi= Chinese journal of plastic surgery, 28(1), pp.1-6.
Yan, X.L., Fu, C.J., Chen, L., Qin, J.H., Zeng, Q., Yuan, H.F., Nan, X., Chen, H.X., Zhou, J.N., Lin, Y.L. and Zhang, X.M., 2012. Mesenchymal stem cells from primary breast cancer tissue promote cancer proliferation and enhance mammosphere formation partially via EGF/EGFR/Akt pathway. Breast cancer research and treatment, 132(1), pp.153-164.
Zhang J., Shehabeldin A., Da Cruz L.A., Butler J., Somani A.K., McGavin M., Kozieradzki I., Dos Santos A.O., Nagy A., Grinstein S. și Penninger J.M., 1999. Antigen receptor–induced activation and cytoskeletal rearrangement are impaired in Wiskott-Aldrich syndrome protein–deficient lymphocytes. The Journal of experimental medicine, 190(9), pp.1329-1342.
Zuk P. A., 2010. The adipose-derived stem cell: looking back and looking ahead. Molecular biology of the cell, 21(11), pp.1783-1787.
Zuk, P.A., Zhu, M., Ashjian, P., De Ugarte, D.A., Huang, J.I., Mizuno, H., Alfonso, Z.C., Fraser, J.K., Benhaim, P. and Hedrick, M.H., 2002. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell, 13(12), pp.4279-4295.
Zuk, P.A., Zhu, M.I.N., Mizuno, H., Huang, J., Futrell, J.W., Katz, A.J., Benhaim, P., Lorenz, H.P. and Hedrick, M.H., 2001. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering, 7(2), pp.211-228.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Obținerea și caracterizarea celulelor stem mezenchimale derivate din țesut adipos [308730] (ID: 308730)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.