Obiectivul principal se bazează pe îndeplinirea următoarelor obiective specifice: [303839]

[anonimizat]. [anonimizat] o poartă. Complexele multiproteice sunt în mare parte responsabile de buna coordonare a [anonimizat] a acestor complexe constituie un factor determinant al specificității (Bach, 2000).

Printre acestea se numără și proteinele LIM care au fost identificate în organismele eucariote nevertebrate și vertebrate. Punctul de start în descoperirea acestei familii de proteine a fost reprezentat de anul 1988, [anonimizat]-3. Aceasta din urmă a prezentat un real interes pentru studiu prin prisma faptului că structura acesteia conținea un homeodomeniu. Plecând de la secvența proteinei MEC-3, a fost clonată ulterior gena care codifică pentru linia celulară proteina LIN-11 de la C.elegans. Celor două li s-a [anonimizat]1. Noul motiv proteic a [anonimizat]-11, Isl1 și MEC-3 (Kadrmas și Beckerle, 2004). [anonimizat] (LIM-HD). [anonimizat], [anonimizat]. Una dintre cele mai semnificative subclase de proteine LIM homeodomeniu este cea a [anonimizat]1a si Lmx1b.

Lmx1a și Lmx1b [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat]-o regiune N-[anonimizat] o regiune C-terminală fără o structură bine definită. [anonimizat] „degete de zinc” specializate localizate N-terminal față de homeodomeniu și cunoscute drept domeniile LIM (Hobert și Westphal, 2000). [anonimizat], în timp ce homeodomeniul se leagă la regiuni conservate de ADN. Astfel, domeniile LIM împreună cu homeodomeniul determină comportamentul ca factori de transcripție a proteinelor Lmx1a și Lmx1b. Acestea se leagă și controlează activitatea altor gene având rol de activare sau chiar de represie. [anonimizat]1a și Lmx1b sunt extrem de similari. Cei doi factori de transcripție au homeodomeniul conservat în procent de 100% și o identitate a celor două domenii LIM de 67% și respectiv 83% (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

[anonimizat]1a se exprimă încă din ziua embrionară E8.5 în placa dorsală a [anonimizat]. [anonimizat], proteina Lmx1a a [anonimizat]ltării mezencefalului ventral. Astfel, Lmx1a reglează neurogeneza și soarta neuronală la nivelul sistemului nervos central și în urechea internă, fiind exprimat în numeroase structuri din cadrul acestora.

La fel ca Lmx1a, Lmx1b este exprimat în embrionii vertebratelor, însă începând cu E7.5. În această zi embrionară se regăsește la nivelul plăcii neurale a embrionului și ajunge să fie exprimat în istm în jurul zilei E9.5. Lmx1b este esențial pentru dezvoltarea organizatorului istmic (IsO) (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Lmx1b se exprimă la nivelul structurilor rinichiului, iar studiile realizate pe Xenopus indică implicarea lui Lmx1b în menținerea în parametrii normali a proceselor realizate de podocite. De asemenea, studiile care au avut ca subiecți puii de găină au sugerat că Lmx1b este exprimat și implicat în dezvoltarea corectă a membrelor, iar studiile pe peștele zebră au arătat o implicare a factorului de transcripție Lmx1b în dezvoltarea ochilor. Este important de menționat că Lmx1b se regăsește printre factorii de transcripție implicați în dezvoltarea neuronilor serotonergici și glutaminergici. Împreună cu factorul de transcripție Pet1 cooperează pentru a determina diferențierea terminală a neuronilor serotonergici din nucleii rafeului, susținând supraviețuirea acestora.

Deși au numeroase roluri specifice, Lmx1a și Lmx1b au și funcții cooperative. Atât Lmx1a cât și Lmx1b sunt considerați esențiali în stabilirea fenotipului neuronal dopaminergic, fiind implicați în procesele de proliferare, specificare și diferențiere a progenitorilor dopaminergici din mezencefal (mDA) în neuroni dopaminergici maturi.

În etapa de specificare a neuronilor dopaminergici Lmx1a și Lmx1b sunt coexprimate în progenitorii neuronali din placa ventrală a mezencefalului și funcționează cooperativ. Cu toate acestea, experimente realizate la șoarece au indicat faptul că Lmx1b doar completează funcția proteinei Lmx1a. Pe de altă parte, în etapa de specificare regională, embrionii mutanți cărora le lipsește Lmx1b întâmpină o scădere drastică a numărului de neuroni mDA chiar din timpul stadiilor embrionare timpurii. Această pierdere este corelată cu o funcționare defectuoasă a organizatorului istmic în absența proteinei Lmx1b. Totuși, la șoarecii mutanți doar jumătate din neuronii mDA sunt pierduți, ceea ce sugerează că exista o activitate reziduală a proteinei Lmx1a sau o potențială compensare a funcțiilor lui Lmx1b de către Lmx1a (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Ulterior, expresia factorilor Lmx1a și Lmx1b persistă în precursorii postmitotici și în neuronii mDA diferențiați, sugerând implicarea acestora și în aceste etape ale neurogenezei dopaminergice. Alături de funcțiile cheie în etapele de diferențiere embrionară a neuronilor dopaminergici, acești factori de transcripție mențin homeostaza în creierul adult și determină supraviețuierea pe termen lung a neuronilor dopaminergici. O altă funcție cheie a factorului de transcripție Lmx1a este în formarea plăcii dorsale a tubului neural. Coexpresia acestui factor cu Lmx1b sugerează că acesta din urmă ar putea completa și compensa parțial funcția proteinei Lmx1a în acest proces.

În strânsă legătură cu funcțiile exercitate de factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b în specificarea unor tipuri celulare neuronale și gliale și împărțirea corectă a structurilor creierului, formele patologice ale paralogilor Lmx1a și Lmx1b au fost corelate cu diferite maladii umane. Studii recente dezvăluie un rol cheie al genelor LIM homeodomeniu în cancerele umane. Gena lmx1a de la om este implicată în cancerele de tip glioma și meningioma, dar și în boala Alzheimer și tulburarea obsesiv-compulsivă. Disfuncțiile de la nivelul genelor lmx1a/lmx1b au fost corelate cu boala Parkinson și schizofrenie.

Astfel, deși cei doi paralogi au domenii și secvențe genomice și proteice similare, doar unele functii au caracter compensatoriu, în timp ce altele sunt în mod surpinzător atribuite doar unuia dintre cei doi factori de transcripție. Datorită prezenței homeodomeniului, cei doi paralogi prezintă aceeași specificitate de legare la ADN. Cu toate acestea, funcțiile biologice distincte derivă cel mai probabil din posibilitatea domeniilor LIM de a interacționa într-un anumit moment și context biologic cu diferite proteine partenere pentru a îndeplini funcții specifice. În mod specific, coexpresia acestor proteine în mezencefalul ventral a indicat faptul că proteinele pot avea aceeași funcție, dar pot îndeplini și funcții distincte. În încercarea de a delimita rolurile proteinelor Lmx1a și Lmx1b în timpul dezvoltării mezencefalului ventral, câteva experimente au sugerat că deficiența în Lmx1a afectează în mod diferit subpopulatiile progenitorilor dopaminergici față de cea în Lmx1b.

În acest context, obiectivul principal al acestei lucrări este reprezentat de înțelegerea aprofundata a functiilor specifice și cooperative ale factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b la nivelul sistemului nervos central.

Obiectivul principal se bazează pe îndeplinirea următoarelor obiective specifice:

Descrierea caracteristicilor generale ale factorilor de transcripție paralogi Lmx1a și Lmx1b. Este prezentată prin comparație, acolo unde este cazul, organizarea structurală, clasificarea și expresia acestor proteine.

Prezentarea funcțiilor factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b în sistemul nervos central, punându-se accent pe evidențierea acțiunii independente, cooperative sau compensatorii a unui factor în raport cu celălalt.

În concluzie, prezenta lucrare își propune prezentarea ipotezelor și conceptelor actuale referitoare la funcțiile paralogilor Lmx1a și Lmx1b, în scopul distingerii clare a modului lor de acțiune independent sau sinergic în diferite procese care au loc la nivelul sistemului nervos central. Înțelegerea aprofundată a rolurilor Lmx1a/b este necesară în scopul dezvoltării unor terapii eficace pentru tratarea diferitelor maladii ale sistemului nervos central asociate cu acești factori de transcripție.

CLASIFICAREA FACTORILOR DE TRANSCRIPȚIE LMX1A ȘI LMX1B

Proteinele LIM

Există mai multe clase de proteine cu unul sau mai multe domenii LIM. În genomul uman sunt identificate în momentul de față 135 de secvențe codificatoare pentru proteinele LIM localizate pe 58 de gene. Proteinele LIM de la om pot conține între 1 și 5 domenii LIM, iar acestea împreună cu alte categorii de proteine LIM sunt prezentate în următoarea figură (Figura 1).

Figura 1. Structurile de domeniu ale membrilor familiei LIM și/sau cele mai bine caracterizate exemple ale principalelor familii de proteine LIM. Numărul membrilor cunoscuți pentru fiecare familie în parte este scris între paranteze. Casetele colorate reprezintă anumite scheme de clasificare utilizate frecvent. Domeniile LIM individuale sunt indicate prin sferele de diverse culori care au fost grupate în funcție de similaritatea secvenței LIM. Domeniile heterologe, ca de exemplu LD, domeniul monooxigenazei și domeniile de legare ale actinei sunt indicate prin benzile bej. Domeniile cu linii întrerupte sunt afișate ca și casete. Liniile întrerupte indică faptul că scala nu este păstrată. Adaptat după Kadrmas și Beckerle, 2004.

Proteinele LIM pot fi clasificate în urma comparării secvențelor de aminoacizi. Astfel, domeniile LIM sunt structurate în patru categorii (indicate în Figura 3), care reflectă similaritatea acestora. Este important de menționat faptul că analiza secvențelor oferă informații despre relațiile dintre proteinele LIM în timpul evoluției.

Proteinele LIM only (LMO) și LIM homeodomeniu (exemplu LHX) conțin secvențe diferite de cele ale proteinelor LIM implicate în rolul citoscheletului. Domeniile N-terminale ale proteinelor LMO și LHX fac parte dintr-un grup restrâns cu secvențe înrudite (reprezentate prin culoarea roșie, Figura 2). Totuși, cele mai înrudite cu proteinele LMO și LHX, sunt proteinele LIM kinaze și proteinele LIM de legare a actinei (ABLIM). De cele mai multe ori, membrii familiei de proteine LIM împart același aranjament al secvențelor domeniului LIM. Această similaritate de secvență indică existența unui strămoș comun care a dus la extinderea familiei (Kadrmas și Beckerle, 2004).

În funcție de localizare, proteinele LIM pot fi separate în două mari categorii: proteinele LIM localizate la nivel citoplasmatic și proteinele LIM nucleare. Însă, nu există o distincție bine definită a acestora. De exemplu, proteina CRP este o proteină atât nucleară cât și citoplasmatică. Un alt exemplu îl reprezintă proteinele LHX, îndeosebi LHX1 care este o proteină preponderent nucleară, dar în diferențierea celulelor carcinomatoase embrionare este localizată la nivel citoplasmatic (Dawid și colab.., 1998).

Există însă și proteine care sunt excluxiv nucleare, printre acestea se numără proteinele LIM only (LMO) și proteinele LIM heomeodomeniu.

LIM only

Proteinele LIM au o structură formată din două domenii LIM în tandem (Figura 2). Acestea sunt cunoscute ca fiind cofactori transcripționali localizați la nivel nuclear. Reglementează transcripția genică funcționând ca proteine de legătură („linker”) (Sang și colab., 2014). Clasa proteinelor LIM only este implicată în oncogeneză. De asemenea, au rol în formarea complexelor multiproteice ale factorilor de legare la ADN (Rabbitts, 1998).

Domeniile LIM din structura proteinelor LIM only (cunoscute și sub numele de proteine LMO) prezintă o secvență de aminoacizi diferită față de domeniile LIM cu rol în organizarea citoscheletului (Kadrmas și Beckerle, 2004).

Până în prezent au fost identificate 4 proteine aparținând clasei LMO (Gill, 2003): LMO-1, LMO-2, LMO-3 și LMO-4.

Domeniile LIM din componența proteinelor LIM nucleare nu interacționează doar cu factorii transcripționali, ci și cu structurile de tip cofactor precum: CLIM1/Ibd2 și CLIM2/Ibd1/NLI/Chip. În urma acestor interacții și pe baza testelor experimentale, a putut fi constatat faptul că proteinele LIM nucleare au rol în formarea complexelor multiproteice de la nivelul moleculei de ADN. Acest lucru arată importanța acestora în realizarea procesului de transcripție (Agulnick et al., 1996; Bach, 2000; Jurata și colab., 1996; Morcillo și colab., 1997)

Figura 2. Reprezentarea schematică a proteinelor LMO de la om. Casetele de culoare gri desemnează cele două domenii LIM din structura proteinelor LMO (LIM1 și LIM2). Adaptat după Sang și colab., 2013.

Genele lmo-1 și lmo-2 au fost pentru prima dată descoperite la pacienții cu leucemie asociată limfocitelor T. În urma unor translocări, a fost observată o expresie anormală a proteinelor LMO-1 sau LMO-2 în timus și în celulele T. Aceste țesuturi exprimă în mod normal un nivel scăzut pentru ambele proteine (Bach, 2000). Astfel, LMO-1 și LMO-2 au un rol decisiv în tumorigeneza celulară, ca urmare a unor translocări cromozomale (Grutz și colab., 1998).

De asemenea, LMO-2 este implicată în eritropoieză (Figura 3) și în hematopoieză la animalele adulte. Aceste funcții au fost demonstrate cu ajutorul unui experiment în care gena LMO-2 a fost deletată. Astfel, în lipsa proteinei LMO-2, șoarecii sunt incapabili de a forma etritrocite mature și astfel nu pot supraviețui în timpul embriogenezei. Prin supraexpresia proteinei LMO-1 sau LMO-2 în timusul animalelor transgenice s-a putut dovedi faptul că poate fi provocată apariția unor modificări la nivelul limfocitelor T (Larson și colab., 1996).

Familia proteinelor LIM a fost extinsă în urma izolării proteinei LMO-3 și mai recent a proteinei LMO-4. Proteina LMO-3 prezintă o exprimare cantitativă destul de crescută în creier și măduva spinării în timpul celei de a 19-a zi embrionară (E19) (Sang și colab al., 2014). LMO-4 are în structura sa două domenii LIM, unite între ele printr-o legătură scurtă. Aceasta se exprimă în principal la nivelul timusului, dar și în alte țesuturi precum creier, piele și glanda pituitară (Bach, 2000). In vivo, LMO-4 poate interacționa cu mDEAF (factorul autoreglator epidermic deformat) și DEAF1 (Bach, 2000).

Figura 3. Rolul LMO2 în dezvoltarea organismului embrionar murin. LMO-2 la șoareci prezintă roluri importante atât în procesul de hematopoieză, cât și în formarea vaselor de sange. LMO-2 are un rol esențial în hematopoieza primitivă (a) (Warren și colab., 1994) și în cea definitivă (b) (Yamada și colab., 1998). De asemenea, este importantă pentru remodelarea rețelelor vasculare ca parte a angiogenezei (c) (Yamada și colab., 2000). În plus, LMO-2 este exprimată în sistemul nervos în timpul dezvoltării (Foroni și colab., 1992; imagine preluată după Chambers și Rabbitts, 2015).

LIM kinaze

Proteinele LIM kinaze sunt serin/treonin kinaze și funcționează ca structuri reglatoare ale dinamicii citoscheletului. Prima LIM kinază studiată a fost cofinila, factorul de dezasamblare al actinei, unde fosforilarea acesteia modulează reorganizarea scheletului de actină (Yang și colab., 1998).

Proteinele Lmk1(Kiz) și Lmk2 sunt cei mai studiați membri și au în componența structurii două domenii LIM localizate N-terminal legate de un domeniu kinazic C-terminal (Bernard, 1994). În interiorul acestor LIM kinaze există secvențe țintă menite să le direcționeze în citoplasmă sau în nucleu, sau pot fi transferate în ambele compartimente, cum este în cazul lui Lmk1 (Yang și Mizuno, 1999).

Lmk1 prezintă un rol central în procesul de organizare al scheletului de actină. Această kinază este fosforilată de factorul Rho GTP-azic asociat cu kinaze (ROCK), implicat în reorganizarea indusă de Rho a citoscheletului de actină (Maekawa și colab., 2013) (Figura 4).

Figura 4. Căile de semnalizare intracelulară în care sunt implicate LIM kinazele. Membrii subfamiliei Rho din clasa GTP-azelor, care includ Rac, Rho și Cdc42, mediază răspunsurile chemotropice prin rolul lor la nivelul dinamicii citoscheletului (Hall și Lalli, 2010). Rac și Rho activează LIM kinaza (LIMK) prin intermediul PAK și ROCK, care la rândul ei reglează depolimerizarea actinei indusă de cofilină (imagine preluată după Shigeoka și colab., 2013).

În plus, Lmk1 are și capacitatea de a activa factorul de răspuns seric (SRF); acest factor este implicat în procesul de transcripție și în reglarea mai multor gene inductibile seric și specific-muscular (Bach, 2000). Activarea factorului de răspuns seric, de către LMK1, este dependentă de modificarea dinamicii actinice (Sotiropoulos și colab., 1999). Astfel rolul pe care Lmk1 îl exercită în morfogeneza și motilitatea celulară este evidențiat (Bach, 2000). Autoinhibiția este un fenomen în care deleția unui singur domeniu LIM poate duce la o activitate îmbunătățită a celuilalt domeniu LIM rămas (Kadrmas și Beckerle, 2004). De exemplu, deleția domeniilor LIM sau mutațiile la nivelul resturilor de zinc coordinate din cadrul proteinei Lmk1, determină creșterea activității kinazice. În afară de fosforilarea mediată de ROCK, Lmk1 poate fi fosforilată și de către PAK1, un alt efector, localizat în aval, al proteinelor Rho și Rac (Edwards și colab., 1999; Ohashi și colab., 2000). În concluzie, fosforilarea afectează în mod direct autoinhibarea LIM-dependentă (Kadrmas și Beckerle, 2004).

LIM homeodomeniu

Una dintre clasele de proteine LIM este reprezentată de proteinele LIM homeodomeniu (LIM-HD). Membrii clasei LIM homeodomeniu au rol de factori transcripționali. Din punct de vedere al structurii, LIM-HD sunt alcătuite din două domenii LIM localizate în regiunea N-terminală și un homeodomeniu dispus central (Figura 5) (Hunter și Rhodes, 2005).

Figura 5. Structura proteinelor LIM homeodomeniu. Reprodus după Hobert și Westphal, 2000.

Proteinele LIM, care au în componență homeodomeniul, sunt codificate de o serie de gene homeobox. Homeodomeniile proteinelor LIM-HD sunt semnificativ mai similare între ele decât cele ale altor proteine. Acest aspect sugerează că toate proteinele LIM-HD provin de la un strămoș comun și că proteinele LIM homeodomeniu au dobândit o specificitate distinctivă de legare a ADN-ului. Ca și în cazul altor gene homeobox, această subfamilie a factorilor de transcripție a fost conservată în evoluție. Până în prezent au fost caracterizate 12 gene pentru mamifere și respectiv 5 gene pentru Drosophila melanogaster, gene implicate în codificarea proteinelor LIM-HD (Tabel 1) (Hobert și Westphal, 2000).

Din categoria proteinelor LIM-homeodomeniu, face parte grupul LMX. La nevertebrate a fost descrisă o singură proteină din grupul LMX. Proteina lim-6 a fost descrisă la C. elegans (Hobert și Westphal, 2000). Lim-6 este întâlnită la nivelul neuronilor postmitotici, în celulele endoteliale din structura uterului precum și în anumite zone ale sistemului excretor. Lim-6 are un rol important în morfogeneza uterină. De asemena, aceasta afectează diferențierea neuronilor GABAergici.

Tabel 1. Genele LIM-HD la om și șoarece-denumire și localizare cromozomală (adaptat după Hunter și Rhodes, 2005)

Cel mai remarcabil grup al familiei LIM-HD este reprezentat de grupul LHX. Printre membrii grupului LHX se regăsesc factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b, identificați la vertebrate. Este important de menționat faptul că grupul LHX are rol în dezvoltarea neuronală și sunt exprimați în momentul formării structurilor din creier. De asemenea, au rol în modelarea structurilor embrionare, dar și în specificarea neuronală (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Cercetările efectuate asupra factorilor Lmx1a și Lmx1b au dovedit faptul că polimorfismele din genele care codifică pentru aceștia sunt asociate cu boala Parkinson și schizofrenia (Bergman și colab., 2010).

Lmx1a și Lmx1b sunt cei mai importanți membri ai grupului LHX. Expresia și activitatea normală a acestor factori transcripționali asigură formarea corespunzătoare a centrelor de semnalizare critică, inclusiv placa ventrală embrionară menzecefalică și delimitările dintre celulele liniare specifice. Expresia Lmx1a și Lmx1b persistă în neuronii dopaminergici maturi ai substanței nigra partea compactă și în aria tegmentală ventrală (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

La fel ca și în cazul Lmx1a, Lmx1b este exprimat în timpul dezvoltării embrionare și este identic cu Lmx1a din punct de vedere al homeodomeniului. La puii de găină, Lmx1b este responsabil pentru modelarea dorso-ventrală a membrelor, unde specifică identitatea dorsală sub controlul proteinei Wnt7a (Riddle et al., 1995; Vogel și colab., 1995). De asemenea, factorul de transcripție Lmx1b este implicat în modelarea oaselor calvariene (Chen și colab., 1998) și în modelarea precoce a veziculei otice (Giraldez, 1998). Identic ca în cazul proteinei Lim-6 de la C. elegans, Lmx1b este exprimat în sistemul excretor. Acest aspect sugerează faptul că există o conservare a funcționalității în timpul evoluției. Pierderea unei singure copii a genei Lmx1b umane cauzează Sindromul unghiilor rotulă (Nail Patella Syndrome), o tulburare caracterizată prin defecte de modelare a membrelor și afecțiuni la nivelul rinichilor (Chen și colab., 1998; Dreyer și colab., 1998). Asemenea altor proteinele LIM-HD, gena Lmx1b de la șoarece este un marker pentru subtipurile specifice ale interneuronilor din măduva spinării (Hobert și Westphal, 2000). În plus, Lmx1b este implicat în dezvoltarea epiteliului visceral al gromerulului vascular de la nivelul rinichilor și în formarea segmentului anterior al ochiului. Este important de menționat faptul că expresia lui Lmx1b este mai scăzută în țesutul creierului afectat de boala Parkinson (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Alte proteine LIM

La vertebrate au fost descoperite și alte proteine care conțin unul sau mai multe domenii LIM în structura lor. Proteinele bogate în cisteină (CRP) localizate la nivel citoplasmatic constituie o altă subfamilie a proteinelor LIM, CRP1, CRP2, CRP3/MLP și CRIP fiind membrii acesteia. Structura proteică este formată în primul rând din domeniile LIM caracteristice care sunt legate de o secvență adițională scurtă și conservată. CRIP are în componență un singur domeniu LIM în timp ce fiecare din ceilalți trei membri conțin câte două domenii LIM caracteristice (Dawid și colab., 1998; Pérez-Alvarado și colab., 1996). În cazul proteinelor CRP1 și CRP2 cele două domenii LIM se împachetează independent, neexistând o orientare preferențială sau legături stabile între cele două domenii, ceea ce susține ideea de modularitate a domeniului LIM (Schmeichel și Beckerle, 1994). La om au fost identificate trei proteine CRP, CRP1, CRP2 și CRP3. CRP1 și CRP2 sunt localizate cu precădere în mușchiul neted, iar CRP3 este specifică pentru mușchiul striat de aceea este cunoscută și sub numele de proteine LIM musculară (MLP). Prin prisma rolului pe care proteinele CRP îl desfășoară în cazul contracției musculare și în reglarea transcripțională, membrii familiei CRP contribuie la homeostazia sistemului muscular. Datorită acestei contribuții, aceștia pot fi folosiți ca markeri pentru evidențierea stării fiziologice a acestui sistem (Kadrmas și Beckerle, 2004).

În cazul șoarecilor cu lipsa expresiei genei CRP3/MLP a fost observată o modificare în ceea ce privește citoarhitectura mușchilor cardiaci și scheletici (Arber și colab., 1998). Toate cele trei proteine CRP (CRP1-CRP3) sunt asociate cu filamente de actină și cu liniile Z ale miofibrilelor, ceea ce face ca acestea să dețină funcții similare, dar care sunt exercitate în locații diferite (Arber și colab., 1997; Louis și colab., 1997).

Un alt grup de proteine LIM este denumit grupul divergent 3 și este împărțit în alte două subgrupuri. Unul dintre aceste subgrupuri este constituit din membri precum Ril, Enigma, Zixina, Prickle, și Paxilina. Proteina Ril are în compoziția sa un singur domeniu LIM, în timp ce celelate proteine dețin câte trei domenii LIM, mai puțin Paxilin, la care sunt identificate patru domenii de acest tip. Toate proteinele incluse în acest grup conțin în structura lor și alte tipuri de domenii, numite domenii adiționale. Domeniile adiționale sunt localizate la capătul N-terminal. Cea mai mare parte din aceste proteine sunt asociate citoscheletului. În plus, Enigma este implicată în traficul proteic (Bach, 2000).

NRAP (nebulin-related actin-binding protein) este un alt exemplu de membru al familiei proteinelor LIM, aceasta fiind asociată cu domeniul SH3. Din punct de vedere al structurii, NRAP este constituită dintr-o regiune N-terminală la nivelul căreia este identificat un domeniu LIM și o regiune C-terminală. Capătul N-terminal are rol în legarea la proteina Talin cu funcție reglatoare a activității integrinei (Tadokoro și colab., 2003). Regiunea C-terminală este implicată în reglarea actinei. Proteina NRAP poate fi localizată în țesutul muscular, cu precădere în cadrul joncțiunilor miotendinoase ale mușchiului scheletic și în discurile intercalare de la nivelul mușchiului cardiac (Kadrmas și Beckerle, 2004). Funcția NRAP este bine corelată cu structura. Aceasta realizează transmiterea tensiunii în mușchi prin ancorarea filamentelor de actină terminală din miofibrile (Kadrmas și Beckerle, 2004; Luo și colab., 1999).

Proteinele LIM de adeziune focală au atât funcții de legare și reglare a citoscheletului de actină cât și funcții importante în capacitate de semnalare a integrinei. De exemplu, proteina Paxilina are o structură formată din 5 motive LD în regiunea N-terminală și 4 domenii LIM în regiunea C-terminală. Paxilina se leagă de proteinele citoscheletice și de semnalizare, controlând motilitatea (Kadrmas și Beckerle, 2004).

Subgrupurile SLIM1/KyoT/ACT și PINCH sunt alcătuite din patru și cinci domenii LIM. Proteina LIM Unc-98 reprezintă un membru al subclasei PINCH. Unc-98 a fost identificată la C. elegans și afectează integritatea structurală a joncțiunilor musculare care conțin integrină. De asemenea, este importantă pentru funcțiile mecanosenzoriale ale receptorilor tactili (Hobert și colab., 1999). Proteina SLIM1/KyoT1 este o proteină citoplasmatică spre deosebire de KyoT2 care este localizată nuclear. KyoT2 conține doar regiunea N-terminală și două domenii LIM, fiind o formă alternativă a aceleași gene (Taniguchi și colab., 1998).

În ceea ce privește proteinele LIM, este remarcabil faptul că există o varietate de grupuri și membri ai acestora care duc la structurarea unei familii. Ca urmare a clasificării și caracterizării principalelor tipuri de proteine, funcțiile acestora pot fi rezumate astfel:

Figura 6. Reglarea proceselor celulare mediate de proteinele care conțin domenii LIM. Reprodus după Bach, 2000.

ORGANIZAREA STRUCTURALĂ A GENELOR ȘI PROTEINELOR LMX1A și LMX1B

Lmx1a, membrul fondator al grupului LHX, a fost pentru prima dată clonat la hamster. Clonarea a fost realizată asemenea uneia dintre numeroasele proteine care se pot lega la promotorul genei codificatoare pentru insulină. Lmx1a interacționează cu alte proteine de legare la promotor, de exemplu cu helix-loop-helix (bHLH) (Hobert și Westphal, 2000). A fost demonstrat faptul că proteina Lmx1a acționează sinergic cu factorul bHLH de transcripție E47 și activează enhancer-ul/promotorul insulinei (Hunter și Rhodes, 2005). De asemenea, lmx-1 împreună cu cd3 exprimate la nivelul unei linii de celule fibroblastice care nu produc insulină, pot activa transcripția genelor Far/LAT (Far și FLAT fiind cele două tipuri de elemente componente ale promotorului I insulinic de la șobolan) (German și colab., 1992). După izolarea Lmx1a, au mai fost identificate două forme distincte ale genei, numite Lmx1.1 și Lmx 2.1 (Haldin și colab., 2003).

Lmx1b face parte de asemenea din grupul LHX și a fost izolat la șoarece ca un ortolog al Lmx1 de la puii de găină. (Chen și colab., 1998; Riddle și colab., 1995; Vogel și colab., 1995). Deleția genei Lmx1b la șoareci cauzează anormalitatea membrelor și rinichilor (Chen și colab., 1998). La nivelul sistemului nervos central (SNC), Lmx1b realizează diferite funcții precum: formarea neuronilor dopaminergici, serotonergici, dar și a ochiului (Cheng și colab., 2003; Ding și colab., 2003; Kania și colab., 2000; Kania și Jessell, 2003; Smidt și colabl., 2000).

Lmx1a la șoarece și om

ADN-ul genomic al genei lmx1a la șoarece conține opt (Lmx1a-001; 3347 pb) (Figura 7) sau nouă (Lmx1a-002; 3200 pb) exoni. Cele două tipuri de ADN diferă în ceea ce privește cei 50 de exoni inițiali. Ambele variante ale genei lmx1a codifică pentru aceeași proteină formată din 382 de aminoacizi. Genele lmx1a-001 și lmx1a-002 conțin domenii identice la nivelul structurii. Pentru gena lmx1a umană au fost identificate patru variante. lmx1a-001 (3545pb) și lmx1a-002 (3350 pb) conțin nouă exoni, în timp ce lmx1a-003 (1342 pb) are doar opt exoni. Cele trei variante pentru gena lmx1a de la om codifică, la fel ca la șoarece, o proteină care conține 382 de aminoacizi. Ultima formă, lmx1a-004 (1255pb) conține șapte exoni și este un trasncript al procesului de codificare non-proteică (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Figura 7. Structura ADN genomic pentru lmx1a-001. Cei opt exoni sunt reprezentați de casetele notate de la 1 la 8. În plus, cele două domenii LIM (LIM1 și LIM2) precum și homeodomeniul (HOMEO) din structura Lmx1a sunt reprezentate. Reprodus după Doucet-Beaupré și colab., 2015.

Lmx1b la șoarece și om

Gena lmx1b de la șoarece conține 3 transcripți. Gena lmx1b-001 (4790 pb) deține opt exoni și codifică pentru o proteină cu 372 de aminoacizi (Figura 8). Transcriptul lmx1b-003 are o lungime de 1420 pb și este translatat într-o proteină formată din 368 de aminoacizi. Varianta lmx1b-002 este un transcript care nu codifică pentru proteine. La nivelul genomului uman, au fost identificate patru variante ale genei lmx1b, toate cele patru forme conținând opt exoni și codifică pentru proteine. Gena lmx1b-001 are o lungime de 1195 pb și codifică pentru o proteină care are un conținut de 395 de aminoacizi. Celelalte trei variante ale genei umane sunt următoarele: lmx1b-002 (5797 pb), lmx1b-201 (5809 pb) și lm1b-003 (1300 pb), și codifică pentru proteine cu o lungime de aproximativ 400 de aminoacizi (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Figura 8. Structura transcriptului lmx1b-001.Exonii sunt reprezentați de cele opt casete. De asemenea, sunt reprezentate domeniile LIM (LIM1 și LIM2) și homeodomeniul (HOMEO) din structura acestuia. Reprodus după Doucet-Beaupré și colab., 2015.

Organizarea structurală a factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b

Lmx1a și Lmx1b sunt paralogi și fac parte din categoria proteinelor LIM-homeodomeniu, subgrupul LHX. Aceștia formează o pereche de gene care derivă din aceeași genă ancestrală. Structural, proteinele Lmxa și Lmx1b sunt alcătuite dintr-o regiune N-terminală care le conferă specificitate. Capătul N-terminal este urmat de două domenii LIM dispuse în tandem, domenii foarte bine conservate din punct de vedere evolutiv, un homeodomeniu și o regiune C-terminală. Homeodomeniul este de asemenea conservat în evoluție. Capătul carboxi-terminal are la nivelul său regiuni cu rol în activare, inhibare și posibil alte elemente funcționale (Dawid IB, 2001) (Figura 9).

Figura 9. Reprezentarea schematică a structurii proteinelor LIM-HD. Reprodus după Doucet-Beaupré și colab., 2015.

Domeniile LIM

Denumirea de „LIM” provine de la numele celor trei factori de transcripție la nivelul cărora a fost identificat pentru prima oară domeniul LIM: Lin11, Isl-1 și Mec-3 (Bach, 2000), iar în prezent acesta este regăsit la o varietate de organisme eucariote. De exemplu se întâlnește la nevertebratele C.elegans și D. melanogaster, cât și în anumite drojdii și mucegaiuri unde se găsesc proteine care conțin domenii LIM. La om, domeniul LIM poate avea aceeași distribuție ca domeniile SH3 și SH2 și pot conține proteine care au în structură până la 5 domenii LIM. În schimb, la organismele procariote, domeniul LIM este absent deoarece acestea nu prezintă structură nucleară individualizată (Kadrmas și Beckerle, 2004).

La nivelul domeniului LIM au loc interacții de tip proteină-proteină și este localizat atât N-terminal cât și C-terminal în cadrul unei proteine (Kadrmas și Beckerle, 2004). Proteinele LIM pot fi alcătuite doar din domenii LIM sau din domenii LIM care se pot lega la alte domenii cum ar fi homeodomeniile, domeniile catalitice sau domeniile de legare a citoscheletului.

Structura și secvența domeniului LIM

Conținutul în aminoacizi al acestei structuri este bogat în cisteină și histidină. Fiecare domeniu LIM legând câte doi ioni de zinc pentru a forma o structură de tip „degete de zinc”, ceea ce face ca domeniul LIM sa fie un domeniu de coordonare a zincului (Hunter și Rhodes, 2005). Un domeniu LIM este format din două subdomenii ce conțin câte un atom de Zn, unite printr-o legătură hidrofobă între două resturi de aminoacizi. Atomul de Zn este asociat cu trei resturi de Cys și un rest de His în primul subdomeniu, și trei resturi de Cys și un rest de Asn în al doilea (Kadrmas și Beckerle, 2004).

Analizate individual, domeniile LIM sunt constituite din aproximativ 55 de aminoacizi dintre care 8 resturi sunt conservate și localizate la intervale bine definite. Cele 8 resturi de aminoacizi reprezintă situsurile de legare a zincului. Resturile 1-4 coordonează un singur ion de zinc, iar resturile 5-8 coordonează cel de al doilea ion de zinc formându-se o structură de tip „degete de zinc” în tandem (Figura 10). La nivelul acestei topologii este întâlnit un situs de spațiere invariant ca lungime, format din două resturi de aminoacizi și localizat între cele două structuri de tip „deget”. Acesta are un rol esențial în funcția domeniului LIM. Resturile voluminoase sau/și alifatice conservate moderat ocupă de asemenea poziții bine definite (Kadrmas și Beckerle, 2004).

Secvența consensus a domeniului LIM la om a fost definită astfel: CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16-21CX2(C/H/D), unde X poate fi orice aminoacid (Figura 11). Această secvență variază de la o specie la alta (Schmeichel și Beckerle, 1994).

Figura 10. Structura domeniului LIM. Cercurile violet indică resturile de legare a zincului. Resturile alifatice/voluminoase semi-conservate sunt reprezentate de sferele de culoare verde. Resturile neconservate cu distanțiere invariabilă sunt ilustrate de sferele purpuriu închis. Cercurile galbene indică un număr variabil de resturi (X) care sunt posibile în secvență. Reprodus după Kadrmas și Beckerle, 2004.

Figura 11. Secvența consensus a domeniului LIM. Pe baza unei analize a 135 de secvențe LIM de la om a fost descoperită distanțierea și identitatea celor 8 resturi de legare a zincului (1-8). Secvențele rar observate (identificate la mai puțin de 10% din cazuri) sunt notate cu ajutorul textului care nu este îngroșat. X desemnează orice aminoacid. Reprodus după Kadrmas și Beckerle, 2004.

Rolul domeniului LIM

Funcția principală a domeniului LIM este de a realiza interacții cu alte proteine. Fiind un domeniu de interacțiune de tip proteină-proteină, acesta prezintă un rol important în buna desfășurare a funcțiilor biologice, cu formare de complexe multiproteice. Proteinele care au în structura lor domeniul LIM, mediază procesele biologice prin intermediul legării acestora de proteinele țintă. Domeniul LIM se poate lega de domeniile PDZ, kinazice sau se poate lega de motive tirozinice care nu necesită a fi fosforilate. O astfel de interacție a fost indetificată la proteina LIM Enigma (Tabel 3). Proteina Enigma conțiune un domeniu PDZ la nivel N-terminal și trei domenii LIM în regiunea C-terminală (Bach, 2000). Principalii parteneri de legare ai domeniilor LIM cunoscuți în momentul de față sunt prezentați în tabelul de mai jos (Tabelul 2).

Tabel 2. Interacțiile domeniilor LIM cu alte proteine (adaptat după Dawid și colab., 1998).

Se formează anumite domenii LIM dimere cu alte domenii LIM, și se pare că toate aceste domenii pot lega diverse structuri proteice distincte. De exemplu, domeniul LIM amino-proximal al Zixinei se poate lega de CRP1, iar proteina CRP3 sau proteina LIM din mușchi (MLP) au fost identificate ca formând homodimeri. În timp ce formarea homodimerului și heterodimerului domeniilor LIM este intrigantă, dar are o semnificație generală incertă, interacțiunile de la nivelul domeniului LIM cu alte proteine ​​sunt clar funcționale. Cel puțin o proteină LHX (LIM homeobox), LMX1 (LIM homeobox1), LMO ( LIM only) și CRP3/MLP interacționează fizic și funcțional cu factorii de transcripție helix–buclă-helix (Tabelul 3). Zixina, este componentă importantă a plăcilor de adeziune. Paxilina este de asemenea găsită în plăcile de aderență, unde este localizată prin acțiunea celui de al treilea domeniu LIM31. Enigma se leagă de tirozină și s-a arătat că se leagă de asemenea de receptorul tirozin kinazei RET într-o manieră dependentă de domeniul LIM. În plus, domeniile LIM ale enigmei și ale omologului relativ ENH leagă unele izoforme de proteine, dar nu toate izoformele proteinkinazei C (PKC). Anumite izoforme PKC interacționează cu LIMK1, necesitând domeniul LIM C-terminal entru legare (Dawid și colab., 1998).

În plus, domeniul LIM poate îndeplini și funcții implicate în patogeneză. Un exemplu important este constituit de implicarea acestuia în oncogeneză, unde delețiile sau mutațiile apărute la nivelul domeniului LIM pot duce la diferite afecțiuni. Totodată, domeniul LIM poate media proprietățile proteinelor care se leagă la ADN și poate conferi funcții de transactivare (Hunter și Rhodes, 2005).

Homeodomeniul

Homeodomeniul, domeniu globular, este una dintre componentele proteinelor LIM-HD. Localizat în regiunea centrală a acestora, între pozițiile 195 și 254, este solicitat pentru a facilita legarea proteinelor la secvențele țintă din structura moleculelor de ADN. Cele mai multe dintre proteinele care au în structura lor homedomeniu (proteinele LIM-HD) acționează ca factori de transcripție, astfel că acestea se leagă și controlează activitatea altor gene (Hunter și Rhodes, 2005).

Homeodomeniul are în compoziția sa 60 de aminoacizi care formează o structură de tip helix-turn-helix. Miezul homeodomeniului prezintă patru regiuni helicale. Primul helix este unit printr-o regiune buclă de helixul 2. Helixul 2 este separat printr-o singură spiră de cel de al treilea helix care este foarte bine definit și care este alungit de un helix (helixul 4) mai flexibil (Gehring, 1993). Cele două helixuri localizate în regiunea N-terminală sunt antiparalele. Helixul situat C-terminal este aproximativ perpendicular pe axele formate de celelalte două helixuri. Interacțiunea directă cu moleculele de ADN este realizată de helixul dispus la capătul carboxi și este facilitată de punțile de hidrogem și de interacțiile de natură hidrofobă. În plus, acesta poate interacționa și indirect cu ADN-ul prin intermediul moleculelor de apă formate de lanțurile laterale. Moleculele de apă sunt situate spre fosa majoră a ADN-ului (Schofield, 1987).

Structura motivului helix-turn-helix este formată cu ajutorul helixului 2, a spirei de legătură și a spiralelor 3 și 4. Structura tridimensională a acestui motiv este similară cu cea a represorilor de la organismele procariote, deși este greu de identificat o anumită similaritate a secvențelor de aminoacizi (Gehring, 1993). Proteinele care conțin homeodomeniu în structură pot acționa cu ajutorul domeniilor LIM care se leagă la cofactori. Acestea formează complexe transcripționale ce reglează procesul de transcripție într-o manieră specifică și funcționează sinergic pentru a determina fenotipul neuronal (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Astfel, Lmx1a/b funcționează ca factor de transcripție cu rol de activare, posibil și de represie, a expresiei genice (Figura 12). Lmx1a poate dimeriza cu proteinele LIM sau cu alte proteine, de exemplu proteine adaptor (ex. NLI).

Figura 12. Interacțiile proteinelor LIM-HD. În această figură sunt ilustrate diferitele tipuri de complexe de cofactori în care sunt implicate proteinele LIM-HD. Complexele ilustrate de la (a) la (c) conudc la activarea transcripției, în timp ce complexul prezentat în (d) realizează probabil represia transcripțională. Reprodus după Hobert și Westphal, 2000.

Printre cei mai importanți cofactori care mediază funcția de legare la ADN, se regăsește cofactorul CLIM. Acesta este implicat în inhibarea genelor țintă sau în activarea sinergică, în funcție de natura promotorului (Bach și colab., 1997; Jurata și Gill, 1997).

Adaptorul de interacție nucleară, prescurtat NLI sau LDB1 (LIM domain binding protein 1) este important în recunoașterea domeniilor LIM care se leagă cu o afinitate crescută. Legarea este realizată cu ajutorul promotorilor sau activatorilor din cadrul moleculelor de ADN și astfel activitatea transcripțională devine maximă. NLI conține din punct de vedere structural regiuni hidrofobe poziționate în regiunea N-terminală care este formată din 200 de aminoacizi. Pe lângă regiunile hidrofobe, sunt prezente în structura acestuia și regiuni helicale situate la capătul C-terminal. Regiunile helicale sunt implicate în interacțiunea proteică. La nivelul capătului N-terminal are loc formarea complexelor homodimerice și tetramerice de tipul 2LHX-2LDB1. Pentru a putea face posibilă legarea la ADN, proteinele LIM cu homeodomeniu necesită NLI drept punte de interacțiune, singura interacțiune directă având loc doar între Lhx3 și Isl (Gill, 2003).

De asemenea, NLI formează complexe cu Lmx1 la nivelul promotorului I al insulinei de la șobolan și inhibă activarea transcripțională sinergică dependentă de domeniul LIM al Lmx1 și proteinei E47 de tip helix-loop-helix (Jurata și Gill, 1997).

Comparație între Lmx1a și Lmx1b

Conform bazelor de date UniProt și PDB (Protein Data Bank), există două izoforme ale proteinei Lmx1a identificate la om. Cele două izoforme pot fi identificate cu ajutorul codurilor Q8TE12-1 pentru Lmx1a și respectiv Q8TE12-2 pentru izoforma Lmx1a-4AB. Pentru șoarece, există o singură izoformă identificată prin codul Q9JKU8-1. Pe de altă parte, pentru Lmx1b există trei izoforme la om cu următoarele coduri UniProt: O60663-1, O60663-2, O60663-3. Asemenea Lmx1a, Lmx1b are o singură izoformă la șoarece, corespunzătoare codului Uniprot O88609-1 (Berman și colab., 2000; Consortium, 2018).

În ceea ce privește similaritatea organizării structurale, Lmx1a și Lmx1b au o secvență a domeniilor LIM similară în proporție de 67% și respectiv 83% și o conservare a homeodomeniului de 100% (Figura 13). Deși homeodomeniile lor sunt 100% identice, funcția acestora este diferită.

La fel ca alți factori de transcripție, Lmx1a și Lmx1b au o specificitate de legare la moleculele de ADN identică (Doucet-Beaupré și colab., 2015; Hobert și Westphal, 2000).

Figura 13. Identitatea secvențelor de aminoacizi între domeniile Lmx1a și Lmx1b. Reprodus după Doucet-Beaupré et al., 2015.

Proteina Lmx1a de la om are o identitate per total de 66% față de Lmx1b la nivelul secvenței de aminoacizi. Totodată, este identică în proporție de 58% și 59% cu Lmx1a și Lmx1a-like de la peștele zebră (Zebrafish). Lmx1ba este 72% identic și Lmx1bb 82% identic cu secvența proteinei umane Lmx1b (Burzynski și colab., 2013).

În scopul identificării proteinelor care interacționează cu Lmx1a în etapele neurogenezei dopaminergice din mezencefalul murin, s-a dorit realizarea unui experiment denumit Yeast Two Hybrid Screen (Clontech), cu intenția de a utiliza Lmx1a drept „proteină momeală”. În urma examinării proteinei Lmx1a de la Mus musculus (mLmx1a) cu numărul de acces GenBank NP_387501.1, a fost observată structura acesteia: regiunea N-terminală, urmată de două domenii LIM, homeodomeniul si o regiune C-terminală, precum și secvența de aminoacizi a acestora (Figura 14).

Analiza comparativă a proteinei mLmx1a (NP_387501.1) cu mLmx1b (NP_034855.2) a evidențiat că cele două proteine prezintă 66% identitate de secvență și respectiv 78% similaritate de secvență.

Figura 14. Secvența de aminoacizi a proteinei mLmx1a cu numărul de accesare GenBanK NP_387501.1. Domeniile LIM sunt colorate în galben, homeodomeniul în mov, iar regiunea corespunzătoare proteinei mLmx1a-LIM este subliniată cu roșu. Secvența proteică este analizată și cu programul FoldIndex© (http://bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex), care oferă informații despre gradul de organizare sau dezorganizare structurală. Regiunile alcătuite din aminoacizii colorați în verde sunt prezise a avea structuri secundare si terțiare organizate, în timp ce regiunile prezise a avea structuri neorganizate, de tip random coil, sunt formate din aminoacizi colorați în roșu. Adaptat după https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_387501.1?report=fasta.

O comparație între primii 155 de aminoacizi de la proteinele mLmx1a (mLmx1a-LIM) și mLmx1b (mLmx1b-LIM) a evidențiat 66% identitate de secvență și 80% similaritate de secvență (Figura15).

Figura 15. Comparație între secvențele de aminoacizi 1-155 ale proteinelor mLmx1a (mLmx1a-LIM) și mLmx1b. Domeniile LIM1 și LIM2 sunt marcate cu galben pentru fiecare secvență proteică. (*) este simbolul pentru aminoacizii identici, (:)-aminoacizii cu similaritate mare, (.)-aminoacizii similari, (fără adnotare)-aminoacizii diferiți, iar aminoacizii lipsă sunt adnotați (-).

Astfel, este posibil ca unii dintre potențialii parteneri de interacție pentru Lmx1a identificați în urma acestui studiu, să fie parteneri de interactțe și pentru proteina Lmx1b. Cu toate acestea, diferența de 34% în secvențele de aminoacizi ale celor două proteine poate conduce și la descoperirea unor parteneri de interacție specifici pentru Lmx1a.

EXPRESIA LMX1A ȘI LMX1B ÎN ORGANISM

Lmx1a este implicată în formarea plăcii dorsale și a structurilor care iau naștere din aceasta: cerebel, cortex, interneuronii dorsali ai măduvei spinării. În plus, Lmx1a are rol și în formarea neuronilor dopaminergici din mezencefalul ventral (Zou și colab., 2009). Expresia Lmx1a, la nivel de transcript, este detectată începând cu ziua de dezvoltare embrionară 8.5 (E8.5) în celulele din placa neurală dorsală (Millen și colab., 2004).

Embrion

Expresia embrionară a Lmx1a la șoarece

Momentul în care ia naștere expresia Lmx1a a fost identificat cu ajutorul unei hibridizări in situ realizată prin tehnica RT-PCR (reverse transcriptse-polymerase chain reaction). În stadiul E8.5, Lmx1a este exprimată în cea mai mare parte în linia mediană dorsală a tubului neural și în veziculele otice (Figura 16 A și B). Expresia la niveulul plăcii dorsale devine proeminentă și acaparează aproape întreaga axă antero-posterioară, mai puțin regiunea vârfului caudal al stadiului embrionar E8.5-E10.5 (Figura 16-A, B, F-H). În cazul șoarecilor dreher (cu mutații autozomale recesive punctiforme ale genei Lmx1a ce duc la diverse manifestări fenotipice), a fost detectată o expresie a Lmx1a doar în cazul derivatelor crestelor neurale din cadrul stadiilor tardive ale neurulei. La nivelul membrelor sau gonadelor aflate în dezvoltare nu a fost înregistrată o expresie a Lmx1a (Figura 16-A, B, F) (Failli și colab., 2002).

La nivelul diencefalului, Lmx1a se exprimă într-o arie restrânsă a plăcii dorsale și în hipotalamusul bazal, regiuni denumite tubelară și mamilară (Figura 16-J, K, N), începând cu ziua E12.5. La nivelul creierului anterior (prozoencefal), Lmx1a are o expresie crescută în placa dorsală a veziculelor telencefalice, în girusul cingular și la nivelul plexurilor croroide (Figura 16-I, J, K). Expresia localizată în cadrul plăcii dorsale telencefalice ia sfârșit în jurul zilei embrionare E15.5 și este absentă în E16.5 (Figura 16N). Proteina Lmx1a este prezentă în mezencefal la nivelul foselor romboidale anterioare din ziua E12.5 (Figura 16L) și la nivelul plăcii bazale din ziua E16.5 (Figura16N). A fost identificată expresia Lmx1a și în structura care intervine în formarea cerebelului din stadiul E14.5 (Failli și colab., 2002).

Figura 16. Experimente de hibridizare in situ înfățișând expresia Lmx1a la embrionii de șoarece din E8.5 până în E16.5. (A)-expresia Lmx1a în stadiul E8.5; (B-D)-expresia pentru ziua embrionară E9.5. (C) și (D) constituie o vizualizare mai bună a embrionului ilustrat în imaginea (B). (C) permite vizualizarea expresiei Lmx1a în veziculele otice, iar (D) ilustrează expresia de la nivelul plăcii dorsale a tubului neural. (E-H) expresie pentru stadiul E10.5. (E) și (F) reprezintă vederea dorsală și laterală a aceluiași embrion. (G) și (H) constituie o vizualizare mai bună a regiunii dorsale și respectiv a celei laterale. (I-K)-expresie la nivelul creierului în stadiul E12.5: vedere laterală (I), dorsală (J) și medială (K), precum și cazul veziculelor otice deschise. (L-M) ilustrează o vedere dorsală a expresiei la nivelul joncțiunii mez-metencefalice din E14.5 și E16.5. (N)- expresia din stadiul E16.5, vedere medială a creierului hemi-sectat. Reprodus după Failli și colab., 2002.

Tabel 3. Lista abrevierilor anatomice întâlnite la nivelul embrionului (adaptat după Failli și colab., 2002).

Expresia Lmx1a în embrionul uman

Tubul neural, inclusiv mezencefalul, poate fi împărțit în patru domenii longitudinale poziționate pe lungimea axei dorso-ventrale. Cele patru domenii sunt: placa ventrală, placa bazală, placa alară și placa dorsală. Placa ventrală este o structură bogată în celule gliale și funcționează ca un centru de semnal pentru diverse regiuni ale sistemului nervos central aflat în dezvoltare. Astfel, expresia proteinei Lmx1a în embrionul uman a fost identificată la nivelul celulelor din placa ventrală. Lmx1a marchează această componentă în momentul dezvoltării mezencefalului ventral la om (Figura 17). În același domeniu ventral, pe lângă Lmx1a, se exprimă și proteina BLBP (proteină de legare a lipidelor de la nivelul creierului). Cele două proteine identificate au fost utilizate pentru a defini linia de separare laterală dintre placa ventrală și cea bazală din mezencefalul uman (Figura 18) (Nelander și colab., 2009).

Figura 17. Mezencefal uman, postconcepție săptămâna 5.0 și 7.5. (A) și (G) ilustrează embrionul uman în timpul săptămânilor indicate. Imaginile au fost folosite pentru a se putea realiza o schematizare a embrionului și implicit pentru a se putea identifica mai ușor tubul neural, localizarea mezencefalului și a regiunii mezencefalice din cadrul tubului neural (secțiunile indicate în imaginile B și H). Secțiunile obținute au fost colorate cu Nissl pentru o mai bună vizualizare a mezencefalului în stadiile analizate. Colorarea imunohistochimică a zonelor marcate de Lmx1a poate fi observată în imaginile (E) și (K). Este important de menționat că în săptămâna 5.0 după concenpție embrionul a fost secționat în întregime fără o altă subdisecție anterioară. Reprodus după Nelander și colab., 2009.

Figura 18. Expresia proteinelor BLP și Lmx1a la nivelul plăcii ventrale a mezencefalului ventral uman. Adaptat după Nelander și colab., 2009.

Expresia Lmx1b la nivelul SNC

Lmx1b este exprimat și funcționează în cadrul unei regiuni de la niveul IsO (organizatorul istmic). Expresia acestuia este menținută cu ajutorul glicoproteinei Fgf8 (factorul de creștere fibroblastică 8). În același timp, Lmx1b menține la rândul său expresia factorului Wnt1. Localizarea sub formă de transcript (ARNm) în istm a Lmx1b este vizibilă imediat după activarea proteinei Fgf8. Lmx1b provenit de la puiul de găină (denumită și lmx-1) face parte din clasa proteinelor LIM-homeodomeniu și este exprimată în sistemul nervos central (SNC). Pe lângă SNC, Lmx1b își poziționează expresia în mugurii membrelor în curs de dezvoltare și în mezonefros (corpul lui Wolff) (Adams și colab., 2000).

Spre deosebire de funcția bine determinată în cazul formării unui model dorsal al membrelor, în cazul rolului exercitat la nivelul SNC există încă numeroase neclarități (Chen și colab., 1998; Riddle și colab., 1995; Vogel și colab., 1995).

Lmx1b are o expresie dinamică în sistemul nervos central rostral. La acest nivel, factorul de transcripție Lmx1b își exercită funcțiile. Expresia acestuia își are punctul de pornire în placa neurală anterioară, în timpul stadiului 6 (Figura 19A) și atinge un nivel mai crescut în zonele laterale ale liniei mediane (Figura 19A și B). În stadiul 8, Lmx1b este puternic exprimat în crestele neurale rostrale, pe măsură ce acestea încep să se închidă. Expresia Lmx1b începe să fie dispersată spre prozoencefal, mezencefal și rombencefal odată cu eziua 9 de dezvoltare embrionară (Figura 19C), cel mai înalt nivel de expresie fiind localizat dorsal (Figura 19D). Ulterior, Lmx1b își menține expresia la nivelul a trei arii majore din creier: linia mediană dorsală, ventrală și caudal spre vârful tubului neural. Ziua 10 a dezvoltării embrionare furnizează o expresie pentru Lmx1b doar în jumătatea caudală a prozoencefalului (Figura 19E). Începând cu stadiul 15, domeniile de expresie pentru Lmx1b își micșorează dimensiunile (Figura 19F) și în ziua 20 embrionară expresia Lmx1b este absentă în telencefalul rostral, diencefalul rostral și diencefalul mijlociu (Figura 19G) (Adams și colab., 2000)

În plus, în jurul zilelor 10-20 de dezvoltare embrionară, Lmx1b este menținut într-un inel care este centrat spre cea mai îngustată regiune a istmului (vârfurile săgeților negre și roșii din Figura 19E). În a 10-a zi, inelul are o dimensiune crescută, iar în etapele următoare, limita rostrală a acestei regiuni de expresie nu este menținută. Inelul de expresie Lmx1b este îngustat în ziua 15 și are cele mai înalte niveluri centrate doar rostral la constricția istmică (Figura 19H). Expresia Lmx1b este identificată la nivelul mezenchimului care stă la baza istmului rostral odată cu terminarea zilei 10 de dezvoltare embrionară (Figura 19I) (Adams și colab., 2000).

Figura 19. Expresia Lmx1b în timpul dezvoltării creierului la puiul de găină. În toate imaginile de mai sus embrionii sunt poziționați astfel încât rostrarul să fie orientat în sus. (A)-vedere dorsală a zilei 6 embrionare. Lmx1b își inițiază expresia în acestă zi la nivelul plăcii neurale. Săgeata din imaginea (B) marchează nivelul la care a fost făcută secțiunea respectivă. În stadiul 6 transcripții Lmx1b sunt limitați la neuroepiteliu și sunt reduși la linia mediană. (C)-vedere dorsală a stadiului 9 embrionar. Lmx1b este localizat în aproape toată structura care va deveni mai apoi creierul propriu-zis cu excepția regiunilor cele mai rostrale. În aceeași zi, expresia Lmx1b este identificată în tubul neural (D). Un nivel înalt al expresiei este localizat în porțiunea dorsala a SNC. (E)-vederea laterală a embrionului în ziua 10. (F)-secțiune transversală a mezencefalului rostral, stadiul 15. (G)-vedere laterală a capului, ziua 20. (H)-vedere dorsală a zilei embrionare 15. (I)-secțiune longitudinală prin ariile care înconjoară istmul, ziua 15. Reprodus după Adams și colab., 2000.

Expresia Lmx1b în rinichi

Expresia factorului de transcripție Lmx1b este prezentă în principal la nivelul glomerulilor din rinichii de la șoarece (Isojima și colab., 2014) și își are începutul în ziua 27 a dezvoltării embrionare (Figura 20). Astfel, la șoarecii care nu prezintă Lmx1b, procesele realizate de podocite sunt defective. Pentru localizarea acestei expresii este necesară înțelegerea dezvoltării podocitelor la Xenopus. În cadrul acestui organism sunt identificați șase factori de transcripție ai podocitelor care își exercită expresia: wt1,foxc2, hey1, tcf21, mafb și lmx1b. Au fost analizați embrioni în stadiul 35 de dezvoltare deoarece podocitele de la Xenopus sunt complet funcționale în ziua 38 de dezvoltare embrionară, iar vascularizația glomerulară își are începutul în jurul zilei 32 de dezvoltare embrionară. Hibridizarea in situ denotă o expresie a genei lmx1b la nivelul glomerulilor renali, ochilor, placodelor otice, ectodermul dorsal și neuronii dopaminergici din tubul neural (Figura 21A și A”) (White și colab., 2010). Lmx1b are un rol decisiv în morfogeneza rinichilor, iar în cazul indivizilor care prezintă NPS (Nail Patella Syndrome) aproximativ 40% dintre aceștia suferă de nefropatie.

Figura 20. Expresia temporală a genei lmx1b. Reprodus după White și colab., 2010.

Figura 21. Expresia spațială a genei podocitare lmx1b. (F’) și (F”) reprezintă hibridizarea in situ a factorului de transcripție lmx1b. Reprodus după White și colab., 2010.

Expresia Lmx1b la nivelul membrelor

Factorul de transcripție Lmx1b își are regiunea de exprimare la nivelul mezenchimului dorsal al membrelor aflate în curs de dezvoltare (Cygan și colab., 1997; Riddle și colab., 1995; Vogel și colab., 1995). Expresia lui Lmx1b este în strânsă legătură cu expresia Wnt-7a. Experimentele realizate pe puii de găină (Riddle și colab., 1995; Vogel și colab., 1995), au arătat că Lmx1b joacă un rol important în procesul de dorsalizare a membrelor. Expresia lui Lmx1b sub formă de ARNm a fost pentru prima dată localizată în mezodermul plăcii laterale a membrelor anterioare din stadiul de 10 somite (la 8.5 zile după concepție) (Figura 22A). Trascripții Lmx1b sunt blocați la mezenchimul dorsal în momentul în care apar mugurii membrelor (ziua 11.5) (Figura 22 B și C). În timpul stadiului embrionar 13.5, Lmx1b are o expresie mai scăzută la nivelul regiunilor interdigitale și destul de crescută la nivelul degetelor (Figura 22D). La 14.5 zile după concepție degetele devin distincte din punct de vedere morfologic, iar expresia Lmx1b crește substanțial în antebraț și continuă să persiste la același nivel în mezenchimul dorsal (Figura 22E). Ulterior, asemenea etapelor anterioare, transcriptul Lmx1b este restricționat la mezenchimul dorsal (Figura 22F) (Cygan și colab., 1997)

Figura 22. Expresia lui Lmx1b la nivelul membrelor aflate în dezvoltare-hibridizare in situ totală. (A)-vedere dorsală în ziua de dezvoltare embrionară 8.5 (10 somite). (B)-Imagine mărită a membelor anterioare din perioada 10.5. (C)-Secțiune pe toată lungimea axei P-D a membrului anterior din ziua 11.5 realizată la vibratom. (D)- membrul anterior în stadiul 13.5. (E)- vedere dorsală a membrului anterior, stadiul 14.5. (F)-vedere posterioara a membrului anterior, stadiul 14.5. Unde D-dorsal, V-ventral. Reprodus după Cygan și colab., 1997.

Exprexia Lmx1b la nivelul ochilor

Expresia factorului de transcripție Lmx1b la nivelul ochilor a fost analizată în urma unor experimente realizate pe peștele zebră (McMahon și colab., 2009). În cazul acestui organism au fost definiți doi transcripți pentru Lmx1b: lmx1b.1 și lmx1b.2. Expresia transcripților lmx1b.1 și lmx1b.2 este crescută și prezintă un dinamism în numeroase structuri regăsite în dezvoltarea embrionară (Figura 23). Expresia lmx1b.2 este localizată asemănător cu cea a lmx1b.1 dar este mai scăzută. Aceasta este exprimată la 24 de ore după concepție la nivelul mezenchimului periocular și la 36 de ore postconcepție în celulele care căptușesc fisura optică (Figura 23 E și F) (McMahon și colab., 2009).

Totuși, la 24 de ore după concepție au fost detectate transcrieri pentru ambele gene la nivelul celulelor perioculare (Figura 23 A și B) și la nivelul mezenchimului periocular (Figura 23 C și D). După 36 de ore, lmx1b.1 persistă încă la acest nivel și crește în expresie în segmentul anterior al celulelor și implicit al structurilor ce aparțin vascularizației optice (McMahon și colab., 2009).

Figura 23. Expresia lmx1b.1 și lmx1b.2 la nivelul țesuturilor oculare-hibridizare in situ. Pentru ambele gene este ilustrată expresia perioculară în celulele asociate cu tuplina optică (săgețile albe din figurile A și B) și la nivelul globului ocular (săgețile negre din figurile A și B). (D) și (J)-expresie vizualizată în toate secțiunile histologice (săgețile negre). (E) și (K)- expresia lmx1b.1 și lmx1b.2 în fisura ventrală. Unde hdc-ore după concepție. Adaptat după McMahon și colab., 2009.

Expresia Lmx1b în neuronii serotonergici și glutaminergici

Lmx1b are expresia localizată în neuronii serotonergici aflați în plină dezvoltare. Pentru a determina regiunile în care Lmx1b se exprimă, a fost realizată o comparație cu expresia Pet-1, un marker al neuronilor 5-HT (neuroni 5-hidroxiriptaminici/serotonergici). Datorită faptului că nici Lmx1b și nici Pet-1 nu se exprimă la nivelul creierului posterior în timpul etapei embrionare E10.5 evidențiază faptul că neuronii 5-HT se dezvoltă abia după E10.75. În stadiul embrionar E11.5, Lmx1b și Pet-1 se exprimă la nivelul creierului posterior rostral în două zone celulare adiacente plăcii dorsale (Figura 24 A și B). La nivelul acestei regiuni, în mod normal iau naștere neuronii 5-HT. Odată cu E12.5, procesul de formare a neuronilor 5-HT se deplasează spre creierul posterior caudal. În acest moment, Lmx1b și Pet-1 au aceleași expresii atât în zonele rostrale (Figura 24 C și D) cât și caudale (Figura E și F) de la nivelul liniei medii a rombencefalului. În plus, imunocolorarea dublă a 5-HT și Lmx1b scoate în evidență ideea că Lmx1b se exprimă în toți neuronii 5-HT (Figura 24 G-I) (Cheng și colab., 2003). Figura 24I ilustrează o serie de neuroni aflați în perioada embrionară E14.5 care sunt pozitivi pentru Lmx1b și negativi pentru 5-HT. Acest lucru relevă posibila expresie pentru Lmx1b și în alți neuroni decât cei serotonergici din nucleii rafeului.

Figura 24. Expresia Lmx1b în neuronii serotonergici. Secțiuni transversale prin punte în E11.5 (A și B), prin regiunea caudală din punte în ziua de dezvoltare embrionara E12.5 (C și D), prin bulb în ziua E12.5 (E și F) și prin regiunea caudală a punții din ziua E14.5 (G-I). (A-F)-Lmx1b și Pet-1 se exprimă în neuronii derivați din linia mediană ventrală care corespunde nucleilor primordiali ai rafeului (indicare prin săgeți). Expresia Lmx1b este vizibilă în placa dorsală (A) și la nivelul altor regiuni din bulb (* din Figura A, săgețile din Figura E). (G-H)-secțiuni coronaleprin puntea din stadiul E14.5. Dubla imunocolorare realizată cu anticorpul anti Lmx1b (roșu, Figura G) și cu anticorupul anti 5-HT (verde, Figura H). (I)-expresia Lmx1b în toate celulele 5-HT (cu galben sunt reprezentați nucleii, săgeata indică expresia Lmx1b, iar capul de săgeată indică celulele care sunt pozitive pentru Lmx1b și negative pentru 5-HT). Reprodus după Cheng și colab., 2003.

Modalitatea expresiei lui Lmx1b la nivelul rombencefalului în curs de dezvoltare a fost determinată într-un alt studiu prin colorare imunocitochimică. În urma acestui proces, s-a observat o expresie bilaterală pentru Lmx1b în regiunea ventrală a rombencefalului, inclusiv la nivelul plăcii dorsale (E10.57). Expresia factorului de transcripție Lmx1b este prezentă în nucleii rafeului și formațiunea reticulară adiacentă, în timpul E13.5 (Ding și colab., 2003).

Pe lângă expresia în neuronii serotonergici, factorul de transcripție Lmx1b marchează și celulele glutaminergice împreună cu Pax2, care se exprimă în celulele GABAergice din nucleii trigeminali principali (PrV). Lmx1b se exprimă și împreună cu VGLUT2 (transportor vezicular pentru glutamat), care este considerat că marchează toți neuronii glutaminergici. Lmx1b este exprimat din abundență în PrV în timpul dezvoltării (Figura 25A). De asemenea, acesta se exprimă și în nucleii supratrigeminali (Figura 25B). Cu ajutorul imunocitochimiei a fost identificată o dublă marcare pentru Lmx1b și VGLUT2 în care 95% din celulele pozitive pentru factorul de transcripție Lmx1b coexprimă VGLUT2 în nucleii trigeminali principali (Figura 25 C) (Xiang și colab., 2012). Același proces de imunocitochimie a fost utilizat și pentru identificarea colocalizării Lmx1b și Pax2, un factori de transcripție care marchează neuronii GABA în regiunea dorsală a măduvei spinării. A fost dovedit faptul că acestea nu sunt colocalizate. Celulele pozitive pentru Pax2 se regăsesc în număr ridicat în stadiul E14.5 la nivelul regiunilor laterale din nucleii trigeminali principali (Figura 25D) (Xiang și colab., 2012).

Figura 25. Expresia markerilor moleculari în secțiunile transversale ale nucleilor trigeminali principali (PrV). (A-C)-expresia crescută pentru Lmx1a (A) și VGLUT2(B) în ziua P0. (C)-dubla colorație a VGLUT2 (albastru) și Lmx1b (galben). (E)-Lmx1b (celulele colorate în roșu și indicate prin capul de săgeată) nu sunt colocalizate cu Pax2 (celulele verzi) în PrV din ziua E14.5 de dezvoltare embrionară. Mo-nucleii motori. Adaptat după Xiang și colab., 2012.

Expresia Lmx1a și Lmx1b în neuronii dopaminergici din mezencefal

Pentru a se identifica proteinele LIM-HD exprimate la nivelul celulelor progenitoare dopaminergice din mezencefalul ventral au fost realizate hibridizări in situ însoțite de reacții PCR. În urma acestor tehnici a fost identificată expresia Lmx1a, dar și a Msx1 în regiunea cea mai caudală a diencefalului a embrionului de șoarece din perioada de dezvoltare embrionară E10.5 (Figura 26 A și B). Pentru o analiză mai amănunțită a expresiei în raport cu markerii specifici neuronilor DA postmitotici (Nurr1, Lmx1b, Pitx3 și tirozin hidroxilaza) a fost utilizată imunohistochimia. Tirozin hidroxilaza (TH) este o enzimă care limitează rata de sinteză a neuronilor dopaminergici. Stadiul E12.5 este stadiul în care neuronii dopaminergici sunt generați în mod activ, iar Lmx1a și Msx1 sunt exprimați în celulele progenitoare dopaminergice (Figura 26 C și F). Factorul de trascripție Lmx1a își păstrează expresia în neuronii Nurr1+/TH+ DA dopaminergici postmitotici (Figura 26 C și D). Important este faptul că Lmx1a se exprimă înaintea proteinei Msx1 și inițial a fost identificată în stadiul de E9 în celulele liniei medii ventrale (Figura 26G) (Andersson și colab., 2006).

În ceea ce privește proteina Lmx1b, aceasta este similară din punct de vedere structural cu Lmx1a și participa la maturarea neuronilor dopaminergici (Smidt și colab., 2000). Expresia Lmx1b este localizată la nivelul celulelor progenitoare din mezencefalul ventral, însă în stadiile timpurii nu este limitată la celulele progenitoare dopaminergice (Figura 26 K-N). În stadiul E11.5, expresia factorului de transcripție Lmx1b este limitată la nivelul celulelor dopaminergice progenitoare cu aproximativ două zile înainte ca generarea de neuroni dopaminergici să înceteze. Totuși, în această perioadă expresia lui Lmx1a este încă menținută. Expresia lui Lmx1a, dar nu și a paralogului Lmx1b este corelată cu specificarea neuronului dopaminergic (Andersson și colab., 2006).

Figura 26. Expresia lui Lmx1a și Lmx1b la nivelul mezencefalului ventral (vMB) la embrionii de șoarece. (A) și (B)- hibridizarea in situ pentru Lmx1a, respectiv Msx1 în stadiul E11.5 (mezencefalul este încadrat în chenarul de culoare galbenă). (C-F)-secțiuni transversale ale mezencefalului. Este ilustrată expresia lui Lmx1a și Msx1 relativă la tirozin hidroxilaza (figurile D și F) și la Nurr1 (Figura E) în stadiul E12.5. (G-N)-profilul expresiilor la nivelul mezencefalului ventral, expresii identificate în etapele desfășurate de la E9 la E11.5. Adaptat după Andersson și colab., 2006.

Expresia Lmx1a și Lmxb în placa dorsală și cerebel

Gena lmx1a se exprimă în placa dorsală și în celulele progenitoare ale acesteia la toate nivelurile sistemului nervos central, având rol în formarea în formarea plăcii dorsale din măduva spinării. În absența genei lmx1a, la nivelul regiunii anterioare a SNC se formează o placă dorsală reziduală. În ceea ce privește gena înrudită Lmx1b, aceasta este coexprimată împreună cu Lmx1a în rombomerul dorsal 1 (rh1), cea mai anterioară regiune a creierului posterior. Atunci când genele lmx1a sau lmx1b sunt deletate, organismele mutante nu pot forma placa dorsală rombencefalică. Pe lângă implicarea celor două gene în formarea și dezvoltarea acestei structuri, au fost evidențiate funcții și în cadrul reglării morfogenezei cerebelare (Mishima și colab., 2012).

Hibridizarea in situ cu genele lmx1a și lmx1b a ilustrat expresia acestora în diferite etape embrionare. Expresia genei lmx1b în stadiul E8.0 de dezvoltare embrionara, a fost localizată de-a lungul marginilor laterale ale plăcii neuronale (Figura 27B) și la nivelul regiunii din care ia naștere placa dorsală rh1.

Gena lmx1b are un nivel mai ridicat de exprimare în placa dorsală rh1 și derivatul ulterior al acesteia (epiteliul plexului coroidal) în momentul închiderii tubului neural (Figura 27 D, G și J). Lmx1b este exprimat și la nivelul IsO (Figura 27D). Factorul de transcripție Lmx1a se exprimă asemenea lui Lmx1b la nivelul marginilor laterale ale plăcii neurale de la nivelul mezencefalului/rombencefalului. Totuși, gena lmx1a își inițiază expresia mai târziu decât lmx1b, fiind observată abia în stadiul E8.5 (Failli și colab., 2002; Millen și colabl., 2004) (Figura 27A). În timpul dezvoltării embrionare și postnatale, gena lmx1a se exprimă în placa dorsală rh1 și in epiteliul plexului coroidal (Figura 27 C și F) (Mishima și colab., 2012).

Figura 27. Expresia factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b la nivelul plăcii dorsale rh1 și în epiteliul plexului coroidal. (A-D)-Hibridizare in situ utilizând probe ce conțin genele lmx1a și lmx1b. (A) și (B)-vedere dorsală a embrionilor în stadiul E8.5. Genele lmx1a și lmx1b sunt exprimate în celulele progenitoare ale plăcii dorsale de-a lungul marginilor laterale de la nivelul tubului neural (expresia este indicată cu ajutorul săgeților). De asemenea, lmx1b se exprimă și la nivelul IsO în cadrul joncțiunii mez/rombencefalice (săgeata din figura B). Imaginile (C) și (D)-vedere laterală a perioadei embrionare E10. Parantezele indică structura rh1. În figura C, lmx1a se exprimă în placa dorsală de-a lungul axei antero-posterioare a embrionului, inclusiv în rh1. (D)-expresia lui lmx1b în placa dorsală anterioară și IsO. (E)-reprezentare schematică pentru rh1 și secțiunea paramedială a acestuia, perioada de dezvoltare embrionară E12.5. (F)-Imunohistochimie în E12.5 utilizată pentru vizualizarea expresiei genei lmx1a în plexul coroidal (CP) și buza rombică (RL). Capetele săgeților din (G) și (H) indică limita dintre CP și RL. (G)-expresia lmx1b este restricționată în plexul coroidal. (H)-fuzionarea imaginilor (F) și (G). (I)-reprezentare schematică a secțiunii sagitale în P6 a cerebelului. (J)-lmx1b se exprimă în plexul coroidal, dar nu și în cerebel. EGL-stratul granular exterior. Reprodus după Mishima și colab., 2012.

Începând cu stadiul E12.5, este inițiată expresia pentru proteina Lmx1a la nivelul buzei rombice adiacente (Figura 27F). Lmx1b rămâne restricționată, din punct de vedere al expresiei, în plexul coroidal atât în etapa embrionară cât și postnatală (Figura 27 G, H și J) (Mishima și colab., 2012).

Adult

Expresiile factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b au fost analizate în creierul postnatal prin aceeași tehnică de hibridizare și imunohistochimie la nivelul secțiunilor de mezencefal ale șoarecilor. Profilul expresiilor pentru cele două transcripte a fost descris pe toată durata perioadei postnatale (Figura 28). Semnalul rezultat în urma hibridizării Lmx1a a fost mai crescut în prima zi postnatală (P1). Ulterior, acesta suferă o diminuare odată cu înaintarea perioadei, dar continuă să persiste chiar și la 6 luni (P200) (Figura 28A). Transcriptul Lmx1b a înregistrat o expresie mai crescută în estadiul P7 decât în timpul perioadei embrionare. Acesta rămâne exprimat totuși moderat pe toată perioada P1-P200. Stadiul de dezvoltare 200 ilustrează o imunofluorescență triplă la nivelul secțiunilor mezencefalice. Imunofluorescența identificată denotă pozitivitate a neuronilor dopaminergici din mezencefal (mDA) față de factorii de transcripție Lmx1a, Lmx1b și tirozin hidroxilază (Figura 28B). Expresiile acestora sunt totuși mai scăzute în creierul adult față de expresiile analizate în stadiile postnatale timpurii, unde nivelurile crescute ale ambelor proteine Lmx1a și Lmx1b (Figura 29) sunt detectabile chiar și la șoarecele în vârstă de 13 luni (Doucet-Beaupré și colab., 2016).

Figura 28. Expresia factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b la nivelul neuronilor dopaminergici din mezencefal este menținută la vârsta adultă. (A)-Nivelul de expresie a transcripților Lmx1a și Lmx1b; comparație între etapele P1, P7, P60 și P200 (a fost utilizată hibridizarea in situ non-reactivă; scală 250 μm). (B)-Imagini ale plăcilor care prezinta o colorare imunofluorescentă cu anti-Lmx1a (verde), anti-Lmx1b (roșu) și anti-TH (albastru). Reprezentările au fost realizate în cadrul criosecțiunilor ventrale ale mezencefalului din creierul de șoarece aflat în stadiul P1 și P200. Reprodus după Doucet-Beaupré și colab., 2016.

Figura 29. Western blot și cuantificarea expresiei Lmx1a și Lmx1b în etapele E15, P1, P7, P20, adult (3 luni) și în vârstă (9 luni) la nivelul mezencefalului de șoarece. Sunt ilustrate în figură masa moleculară a marker-ului proteic. Reprodus după Doucet-Beaupré și colab., 2016.

Într-un alt experiment de hibridizare in situ pentru proteina Lmx1a (Zou și colabl., 2009) a fost identificată o restricție a transcriptului la nivelul câtorva regiuni din sistemul nervos central postnatal. Regiunile în care Lmx1a își menține expresia de la naștere și până la maturitate sunt: hipotalamus, mezencefal și rombencefal. În stadiul P0-P7, semnalizarea in situ a înregistrat un nivel ridicat.

La nivelul hipotalamusului au fost observati o serie de neuroni puternic marcati în zona hipotalamică posterioară, în nucleul subtalamic (Figura 30 A-F), nucleul supramamilar și nucleul premamilar ventral (Figura 30 A și C). În plus, a fost evidențiată o dublă marcare a proteinei Lmx1b și transcriptului Lmx1a ceea ce poate conduce la ideea că că expresiile pentru Lmx1a și Lmx1b s-au suprapus în aceste regiuni, iar majoritatea neuronilor marcați exprimă ambii factori (Figura 30 I și I”). Până a ajunge la stadiul P180, expresia lui Lmx1a rămâne stabilă în regiunile hipotalamice posterioare și în nucleul subtalamic (Figura 30 G și H). Este important de menționat faptul că ARNm pentru Lmx1a nu a fost identificat în bulbul olfactiv, cortexul cerebral, hipocamp sau corpii striați. Factorul de transcripție Lmx1a a fost exprimat, de asemenea, în celulele ependimale și plexul coroidian sistemul ventricular, incluzând ventriculii laterali, al treilea și al patrulea la P0 (Figura 30 A și B, A – E) (Zou și colab., 2009).

Figura 30. (A-C)-Transcriptul Lmx1a observat în hipotalamusul posterior (PH), nucleul subtalamic (STh) și celulele epindemale de la nivelul ventricului trei (3V), stadiul P0. (B) și (C) ilustrează o imagine mărită pentru (A). (D-H)-Neuroni care exprimă Lmx1a localizați la nivelul nucleilor hipotalamici dorsomediali (DM) și la nivelul fornixului (f). (I-I”)-Dubla marcare a transcriptului Lmx1a (I” violet) și a proteinei Lmx1b (I” verde) în nucleul subtalamic, estadiul P7. Un singur cap de săgeată indică neuronii care exprimă doar transcriptul Lmx1a, întreaga săgeată indică neuronii care exprimă doar Lmx1b, iar săgețile duble sunt orientate spre neuronii care exprimă atât Lmx1a cât și Lmx1b. Abrevieri întâlnite în această figură: cp- peduncul cerebral, Hi-hipocamp, Th-talamus, LV-ventricul lateral. Reprodusă după Zou și colab., 2009.

FUNCȚII SPECIFICE ȘI COOPERATIVE ALE FACTORILOR DE TRANSCRIPȚIE LMX1A ȘI LMX1B

Implicarea Lmx1a/b în calea neuronilor dopaminergici din mezencefal

Rolul Lmx1a/b în dezvoltarea neuronilor dopaminergici

Dopamina este un neurotransmițător catecolaminergic identificat în sistemului nervos central și utilizat de neuronii dopaminergici. La acest nivel, biosinteza dopaminei decurge asemenea unui precursor al adrenalinei și noradrenalinei. Drept marker pentru sinteza neuronilor dopaminergici, a fost utilizată tirozin hidroxilaza (TH) (Prakash și Wurst, 2006).

În acest context, neuronii dopaminergici de la nivelul creierului mamalian au fost analizați în detaliu, astfel dovedindu-se că sunt distribuiți la nivelul unor regiuni precum creierul anterior și cel mijlociu. Totuși, cei mai studiați neuroni dopaminergici sunt cei de la nivelul mezencefalului ventral. Neuronii dopaminergici din mezencefal (mDA) reprezintă un procent de 75% din totalitatea neuronilor de acest tip de la nivelul creierului adult (Ang, 2006). Corpul celular al acestora ocupă poziții stereotipice la nivelul creierului. Așadar, realizând o analiză care pornește de la zonele caudale spre cele rostrale, au fost identificate trei mari populații de neuroni dopaminergici (Figura 31).

Prima populație este formată din neuronii dopaminergici din mezencefalul ventral. Aceast tip de neuroni este divizat în două grupuri importante, localizate în aria tegmentala ventrală (ATV) și respectiv în substanța neagră parte compactă (SNpc). Este important de menționat faptul că grupurile de neuroni mezencefalici care alcătuiesc aria tegmentală ventrală și substanța neagră parte compactă produc majoritatea dopaminei de la nivelul sistemului nervos central (Chabrat și colab., 2017). Un alt grup de la nivelul mezencefalului ventral este constituit din neuronii dopaminergici dispuși în câmpul retrorubral (CR). Cele trei grupuri ale primei populații de neuroni au fost notate astfel: A8 (CR), A9 (SNpc) și A10 (ATV), “A” provevind de la grupările amino pe care aceste grupuri le conțin.

Referitor la grupul de celule dopaminergice din mezencefalul de șobolan, acesta este format din aproximativ 45000 neuroni. Privind comparativ, la nivelul creierului uman în primele patru decenii de viață există în jur de 590000 de neuroni (Prakash și Wurst, 2006).

O altă populatie de neuroni dopaminergici este formată din grupurile A11-A15, localizate în diencefal. Grupul neuronilor dopaminergici din hipotalamusul posterior (A11) este cel mai mare grup al acestei populatii.

A treia populație de neuroni dopaminergici, care este totodată și cea mai mică ca număr, a fost identificată în telecenfal și cuprinde grupurile A16 și A17 (Prakash și Wurst, 2006). A1-A7 delimitează grupurile de neuroni care utilizează ca neurotransmițător norepinefrina, urmând grupurile A8-A17.

Figura 31. Poziția și proiecția axonală a diferitelor grupuri celulare de neuroni dopaminergici. Vedere sagitală a creierului adult de la rozătoare. Sunt ilustrate grupurile mezencefalice A9 (SNpc-roșu) și A10 (ATV-verde). În figură este identificată poziția aproximativă a grupurilor diencefalice A11-A15 de la nivelul hipotalamusului/talamusului ventral (zonele de culoare gri). Sub forma unei linii întrerupte de culoare galbenă sunt reprezentați neuronii din grupul A16. Acest grup este format din interneuronii periglomerularidin bulbul olfactiv. Adaptat după Prakash și Wurst, 2006.

În ciuda faptului că acești neuroni utilizează același neurotransmițător, ei inervează regiuni diferite ale creierului, exercită funcții diferite și sunt susceptibili degenerării în mod diferit. În cazul bolii Parkinson, neuronii dopaminergici de la nivelul mezencefalului din SNpc reprezintă cel mai afectat grup, în timp ce neuronii ATV degenerează în stadii mult mai târzii ale bolii. Axonii neuronilor dopaminergici SNpc inervează dorsal corpii striați și globul palid formând calea nigrostriatală care controlează comportamentul motor. Grupul A10 inervează numeroase structuri ale creierului precum: corpii striați din regiunea dorsală, nucleul accumbens, amigdala, tuberculul olfactiv și cortexul prefrontal, formând sistemul mezolimbic și mezocortical. De asemenea, există legături suplimentare stabilite de grupul A10 cu regiunile talamice și zonele de la nivelul hipocampului. Acești neuroni sunt implicați în diferite tipuri comportamentale (de exemplu în motivatie și răsplată) (Chabrat și colab., 2017).

Dezvoltarea neuronilor dopaminergici cuprinde 5 etape și se desfășoară sub controlul factorilor intracelulari și a condițiilor extracelulare în timpul etapei de dezvoltare embrionară. Etapele generării neuronilor dopaminergici și principalele proteine implicate în acest proces sunt prezentate în figura de mai jos.

Figura 32. Generarea neuronilor dopaminergici din mezencefal (imagine adaptată după Ang, 2006; Prakash și Wurst, 2006). Shh (Albastru) este secretat la nivelul plăcii dorsale a măduvei spinării și rombencefalului și la nivelul plăcii bazale/dorsale a creierului mijlociu și prozencefalul caudal, stabilind un gradient ventro-dorsal, care conferă informații asupra axului dorso-ventral. Bariera dintre mezencefal și rombencefal (săgeata neagră) sau organizatorul istmic este evidențiată de expresia lui Otx2 (Galben) în prozencefal și mezencefal și a lui Gbx2 (portocaliu) în rombencefal și măduva spinării. Expresia lui Fgf8 (verde) și Wnt (roșu) este limitată la nivelul zonei caudale a barierei mezencefalo-rombencefalică (BMR) din rombencefalul rostral, telencefalul ventral și creasta neurală anterioară (Fgf8) și la nivelul barierei rostrale a BMR în mezencefalul caudal, linia mediană dorsală a mezencefalului și diencefalul caudal, linia mediană ventrală a mezencefalului (flexura cefalică) și linia mediană dorsală a rombencefalului și măduvei spinării (Wnt1). Semnalele din zona BMR conferă informații despre axul anteroposterior. Precursorii mDA (violet) sunt induși la nivelul flexurii cefalice (mezencefalul ventral) de către semnalele provenite de la Fgf8, Wnt1 și Shh (Prakash și Wurst, 2006).

Specificare regională

Neuronii mDA își au originea în celulele progenitoare multipotente de la nivelul plăcii ventrale, localizate în regiunea liniei mediane a mezencefalului (Placzek și Briscoe, 2005). Specificarea regională timpurie reprezintă momentul în care celulele neuroepiteliale ale plăcii dorsale neangajate recepționează semnale inductive. Semnalele sunt primite de la două molecule de semnalizare: morfogenul Sonic Hedgehog (Shh) secretat de notocord și factorul de creștere fibroblastică 8 (Fgf8) secretat de organizatorul istmic (Prakash și Wurst, 2006). Cele două molecule vor fi utilizate ulterior și în procesul de inducție.

În timpul dezvoltarii sistemului nervos central, factoruld e transcripție Lmx1b este exprimat începând cu ziua de dezvoltare embrionară E7.5 și este esențial pentru dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal. Expresia acestuia apare în perioada E8.5 la nivelul regiunii mezencefal-metencefal, având un rol definitoriu în stabilirea corectă a graniției dintre cele două structuri. Totodată, în ziua E9.5 Lmx1b este implicat în formarea istmului. Celulele istmice secretă moleculele Fgf8 și Wnt1, iar dinamica în spațiu și timp a acestora trasează anumite linii în ceea ce privește soarta celulelor progenitoare (Doucet-Beaupré și colabl., 2015). În același timp, Lmx1b controlează expresia acestor factori, idee susținută de studiul realizat pe peștele zebră în care deleția genei pentru Lmx1b a dus la pierderea organizatorului istmic, a structurilor cerebeloase și implicit pierderea expresiei pentru Fgf8 și Wnt1 (O’Hara și colab., 2005). Morfogenul Fgf8 este principala moleculă secretată de IsO. Studiile realizate asupra embrionilor de pui de găină au evidențiat faptul că Lmx1b este localizat într-o poziție mai înaltă ierarhic decât Wnt1 în cadrul cascadei de expresie genică de la nivelul istmului. Prin urmare, Wnt1 nu poate genera o expresie a Lmx1b, dar Lmx1b poate induce expresia lui Wnt (Adams și colab., 2000). Wnt1 la rândul lui poate genera expresia factorului Fgf8. În plus, domeniul de expresie al Lmx1b și Wnt1 împreună cu cel al Fgf8 se suprapune pe o zonă largă în jurul regiunii istmice în stadiile incipiente ale dezvoltării, în timp ce domeniile lor de expresie devin segregate și situate unul lângă celălalt începând cu E2.5 (Matsunaga și colabl., 2002).

Embrionii mutanți cărora le lipsește gena pentru factorul de transcripție Lmx1b întâmpină o scădere severă a numărului de neuroni mDA chiar din timpul stadiilor embrionare timpurii. Această pierdere este cauzată în principal de o funcționare defectivă a IsO în absența proteinei Lmx1b. Totuși, la șoarecii mutanți doar jumătate din neuronii mDA sunt pierduți, sugerând că exista o activitate reziduală a proteinei Lmx1a sau o potențială compensare a funcțiilor lui Lmx1b de către Lmx1a (Doucet-Beaupré și colabl., 2015).

Inducție

Etapa de inducție din dezvoltarea neuronilor dopaminergici presupune procesul prin care are loc specializarea celulele multipotente din ectoderm în celule gliale și neuronale (sau ale epidermului). Acest proces este determinat de celulele mezodermale, care migrează de-a lungul liniei mijlocii, formând notocordul. La acest nivel, acestea difuzează semnale către ectoderm, anumite gene se activează în timp ce altele sunt inactivate. În cazul neuronilor mDA, este evidențiată o caracteristică unică: sunt generați din linia mijlocie mezencefalică, reprezentată de placa bazală. Celulele de la nivelul acestei regiuni sunt celule gliale ceea ce conduce la ideea că dezvoltarea neuronilor mDA este urmata de o conversie a celulelor plăcii bazale în progenitori neurali, fapt ce a fost dovedit în 2007 de Ono și echipa sa (Andersson și colab., 2006; Ono și colab., 2007).

Dezvoltarea neuronilor mDA se produce în apropierea celor două centre de semnalizare importante localizate în embrionul de șoarece. Printre moleculele implicate în inducția neuronilor se află Shh (Figura 32) care este secretat la nivelul plăcii dorsale a măduvei spinării și rombencefalului și la nivelul plăcii bazale/dorsale a creierului mijlociu și prozencefalul caudal, stabilind un gradient ventro-dorsal, care conferă informații asupra axului dorso-ventral. Există o dependență față de Shh a tuturor celulelor din axa neurală ventrală (neuroni motori spinali, neuroni mDA, neuroni colinergici ai prozoencefalului bazal), dependență corelată cu dezvoltarea și diferențierea acestora (Miao și colab., 1997).

Totuși, doar expresia Shh nu este suficientă pentru generarea neuronilor mDA (Andersson și colab., 2006). O altă proteină importantă în această etapă este Fgf8 care funcționează cooperativ cu Shh. Morfogenul Fgf8 induce caracteristicile neuronale mezencefalice dopaminergice cu ajutorul unui mecanism ce determină două efecte: primul-suprimarea altor căi de inducere, iar al doilea-activarea sau menținerea moleculelor implicate în specificare. Blochează astfel inducția prozencefalică, în timp ce activează anumiți factori de transcripție, ca de exemplu Otx2 (Jaeger și colab., 2011).

Un alt factor important, este reprezentat de Wnt1. Acesta este situat upstream și constituie un reglator cu funcție importantă în dezvoltarea mDA. Wnt1 formează o cale de semnalizare cu Lmx1a, antagonistă față de calea Shh-Foxa2. Cele două căi sunt indispensabile diferențierii neuronale. Echilibrarea acestora este realizată de proteinele morfogenetice osoase (bone morphogenetic proteins; BMP) și de factorul de creștere și transformare β (transforming growth factor, TGF β) (Cai și colab., 2013). La nivelul mezencefalului ventral de la embrion, a fost observată o buclă de feedback negativ între Lmx1b și miR135a2, un microARN care modulează extinderea semnalului provenit de la Wnt1 și mărimea domeniului progenitorului de dopamină. De asemenea, a fost evidențiat faptul ca Lmx1b potențează semnalizarea indusă de Wnt1 ceea ce duce la o creștere în dimensiune a mezencefalului (Anderegg și colab., 2013). Astfel, se realizează inducția corectă a teritoriului pe care se dezvoltă neuronii dopaminergici din mezencefal fiind și o consecință a funcționării corecte a Lmx1b, care controlează expresia Fgf8 și Wnt1, molecule esențiale în inducția corectă a neuronilor dopaminergici.

Este important de menționat faptul că, Shh și Fgf8 determină identitatea dorsoventrală, în timp ce Wnt1 are impact asupra identității antero-posterioară. Localizarea tuturor acestor factori este prezentată în figura 32.

Specificarea celulelor neuroepiteliale din placa ventrală a mezencefalului

Imediat după faza de inducție, are loc etapa de specificare a progenitorilor în subtipuri neuronale. În urma specificării celulelor plăcii ventrale iau naștere progenitorii neuronali mDA, care sunt angajați mai departe pe linia dopaminergică. În vederea realizării acestei etape, este vizibilă implicarea unui număr mare de factori de transcripție. Factorii de transcripție lucrează cooperativ, atât prin inhibarea diverselor căi de semnalizare care pot provoca generarea unor identități alternative, precum și prin inducerea unor proteine care au rol în potențarea diferențiereii dopaminergice.

Referitor la originea neuronilor mDA, este bine cunoscut faptul că aceștia provin din domeniul progenitor situat la nivelul mezencefalului ventral. Recent, pe baza studiilor de expresie genică a fost expusă ideea care susține că neuronii mDA anteriori sunt localizați în diencefalul ventral și totodată își au originea la acest nivel (Blaess și Ang, 2015). Însă, în timp ce identitatea antero-posterioră a progenitorilor mDA nu este încă bine elucidată, neuronii mDA de la nivelul axei antero-posterioare își au originea în placa ventrală, o structură a liniei mediane ventrale care este definită din punct de vedere operațional de expresia factorului Shh (Joksimovic și colab., 2009). Placa ventrală este compusă dintr-un număr mare de diferite grupuri celulare și i-au fost atribuite două duncții principale de organizare: celulele de la nivelul acesteia guvernează specificarea identităților neuronale și gliale în timpul secreției glicoproteinei Shh (Placzek și Briscoe, 2005). Bazat pe acestea se poate concluziona că neuronii dopaminergici din sistemul nervos central își au originea în celulele neuroepiteliale din placa ventrală a mezencefalului ventral. Placa ventrală mezencefalică embrionară este o regiune neurogenică (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Primul indiciu care a condus la ideea că placa ventrală este o zonă neurogenă, a apărut în urma unui studiu descris de Blaess și Ang în 2015. Studiul a arătat că markerii pentru progenitorii mDA (familia aldehid dehidrogenazei 1, subfamilia A1 și factorul de transcripție LIM homeobox 1𝛼, cunoscut drept LMX1A) sunt exprimați în placa ventrală mezencefalică.

Celulele care se desprind de la nivelul plăcii ventrale mezencefalice devin neuronii dopaminergici ai subsanței negre parte compactă (SNc) și a ariei tegmentale ventrale (ATV) (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Celulele neuroepiteliale din placa ventrală a mezencefalului primesc semnale de la molecule precum Lmx1a/b, Otx2, Foxa1/2. Cu ajutorul acestor semnale acestea se vor orienta spre calea nuronilor dopaminergici.

Otx2 este un factor de transcripție biocid ce aparținei clasei de proteine homeodomeniu și este exprimat înainte de a se forma gastrula. Expresia acestuia este restricționată progresiv în treima anterioară a embrionului de șoarece după ziua embrionară E7.75. Otx2 este necesar pentru poziționarea expresiei factorilor Wnt1 și Fgf8 la nivelul limitei mezencefalului și pentru a limita extinderea dorsală a expresiei lui Shh în mezencefalul ventral. De asemenea, Otx2 are roluri adiționale în specificarea progenitorilor mDA și diferențierea acestora (Ang, 2006). Are activitate inhibitorie, reprimând expresia factoului Gbx2 pentru a menține sistemul mezencefal-rombencefal. Suprimează factorul Nkx2.2 și are ca consecință o delimitare a progenitorilor dopaminergici de cei serotonergici (Xi și colab., 2012). Pierderea progenitorilor mDA este strâns legată de expresia anormală a factorului Nkx2.2 în progenitorii mDA (Prakash și Wurst, 2006).

Factorul Wnt1 induce expresia Lmx1a cu care creează un sistem autoreglator. Expresia Lmx1a este reglată și de proteina Shh. Celulele neuroepiteliale devin neuroni progenitori care vor urma calea neuronilor dopaminergici localizați în regiunea ventriculară, de unde vor migra ulterior. Publicație de referință care a descoperit acest lucru este cea a lui Andersson și colab din 2006. Aceștia au realizat un studiu care a dus la identificarea rolului pe care Lmx1a îl are în această etapă de dezvoltare a neuronilor mDA. La nivelul mezencefalului vetral de la șoarece, Lmx1a deține o expresie evidentă începând cu ziua embrionară 9.0 (E9.0). Expresia acestuia marchează specific progenitorii mDA în zona ventriculară. Ulterior, are loc o pronunțare a expresiei lui Lmx1a care se menține pe durata întregului proces de generare a neuronilor mDA (E9.0-E14.5) (Andersson și colab., 2006). În timpul neurogenezei dopaminergice, Lmx1a se exprimă atât la nivelul neuronilor mDA cât și în neuronii mDA postmitotici. Acțiunea factorului Lmx1a în progenitorii mDA este descrisă amănunțit, însă rolul acestuia în neuronii dopaminergici postmitotici rămâne încă neclar. Studiile asupra a două zone germinale embrionare la nivelul cărora Lmx1a se exprimă în placa ventrală cerebeloasă și la nivelul hemului cortical din telencefal, au arătat că Lmx1a reglează în mod critic deciziile cu privire la soarta celulară. În măduva spinării aflată în dezvoltare, Lmx1a are o acțiune dublă: conduce progenitorii spre a forma placa ventrală în timp ce împiedică transformarea lor în interneuroni dorsali (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Expresia Lmx1a este indusă de Shh și menținută de Foxa1/2 (Ferri și colab., 2007), fiind necesară și suficientă pentru procesul de specificare. Lmx1a alături de Lmx1b funcționează cooperativ, dar și suprapus. Totuși, Lmx1b doar completează funcția Lmx1a și nu este absolut necesar. Lmx1a controlează gena proneuronală Ngn2 care contribuie la transformarea celulelor neuroepiteliale în neuroni. O altă genă cu rol esențial în formarea neuronilor este și Mash1. Ngn2 activează Msx1 care controlează momentul în care neuronii dopaminergici progenitori încep să se dezvolte. Totodată, Msx1 represează Nkx6.1 și implicit formarea altor tipuri neuronale în acest teritoriu. Una dintre genele reglate atât de Lmx1a cât și de Lmx1b (precum și de Wnt1) este gena codificată de factorul de transcripție Pitx3, care activează tirozin hidroxilaza (Simon și colab., 2003). Pitx3 constituie un factor de transcripție necesar pentru a face vizibilă expresia tirozin hidroxilazei la nivelul neuronilor mDA din SNpc dar și ATV (Ang, 2006). Deleția atât a Lmx1a cât și Lmx1b conduce la o pierdere aproape completă a neuronilor mDA (Yan și colab., 2011). Este important de menționat faptul că în cazul șoarecilor, Lmx1a este necesară pentru specificarea neuronilor mDA și doar Lmx1a este esențială pentru dezvoltarea plăcii dorsale, în timp ce Lmx1b joacă un rol important la puii de găină. Această discrepanță indică o diferență la nivel de specii a necesităților întâlnite în acest proces de generare a neuronilor dopaminergici (Chizhikov și Millen, 2004; Ono și colab., 2007).

Diferențiere

A patra etapă din procesul de generare a neuronilor debutează cu o diferențiere timpurie. Aceasta este definită ca fiind etapa în care progenitorii mDA ies din ciclul celular și dau naștere neuronilor mDA imaturi (Ang, 2006). Studiile care au avut ca scop identificarea momentului exact al generării neuronilor imaturi, au evidențiat prezența acestora la șoareci în perioada de dezvoltare E9.5 și E13.5 (Bayer și colab, 1995). Apariția neuronilor mDA imaturi declanșează o cascadă de semnalizare prin care se activează și alți markeri specifici precum Nurr1 și En1/2. Principalul activator al etapei de diferențiere a neuronilor mDA este factorul de transcripție Lmx1a. Lmx1a și Msx1 (activat de către acesta) cooperează pentru a activa Ngn2. Ngn2 joacă un rol important în reglarea neurogenezei, activând la rândul său progenitorii care sunt pozitivi pentru Sox2. Aceștia vor deveni ulterior neuroni postmitotici pozitivi pentru markerul Nurr1 și mai departe se vor diferenția în neuroni mDA pozitivi pentru tirozin hidroxilază (Kele și colab., 2006). Ngn2 împreună cu Mash1 (cunoscut și sub numele de Ascl1) sunt gene proneurale exprimate împreună cu Lmx1a în progenitorii mDA. Totuși, Lmx1a nu este exprimată doar în progenitorii proliferativi ci și în neuronii mDA postmitotici (Ono și colab., 2007). Mash 1 poate realiza reglarea proliferarea precursorilor neuronali timpurii în neurogeneză (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Pe de altă parte, Ngn2 acționează spre finalul diferențierii și în cadrul maturării neuronilor postmitotici (Yi și colab., 2008). Mash1 și Lmx1a sunt utilizați împreună în vederea generării neuronilor dopaminergici (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Nurr1 va determina exprimarea genei TH (enzima fundamentală în sinteza dopaminei) o activează și rămâne în acest stadiu pe tot parcursul vieții celulare (Bergman și colab., 2009). De asemenea, Nurr1 este important în transportul monoaminic vezicular 2 (VMAT2) și în transportul dopaminei (DAT) (Ang, 2006). Alături de Nurr1, sunt implicați și factorii Engrailed 1 și 2 (En1/2). Cei doi fac parte din familia factorilor de transcripție cu domeniu homeobox. Proteinele En1/2 sunt necesare pentru supraviețuirea neuronilo mDA, fiind implicate în reglarea apoptozei (Ang, 2006).

Factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b reglează proliferarea progenitorilor mDA în mare parte prin reglementarea Wnt1 care este implicată în promovarea proliferării progenitorilor mDA. În concordanță cu această idee, a fost arătat faptul că expresia ciclinei D2, o țintă a lui Wnt1 localizată în aval și un factor de reglare a ciclului celular, este de asemenea grav afectată la șoarecii mutanți care nu au ambele gene lmx1a/b (Yan și colab., 2011). Aceste rezultate sunt corelate cu observația că Wnt1 și Lmx1a reglementează reciproc exprimarea amândurora în timpul diferențierii celulelor stem embrionare de șoarece în neuronii mDA (Chung și colab., 2009). Lmx1a și Lmx1b reglează, de asemenea, numărul de celule neuronale mDA prin controlul întinderii neurogenezei cu ajutorul reglării expresiei Ngn2. Această concluzie este fondată pe baza observării unei scăderi suplimentare a expresiei Ngn2 în progenitorii mDA prin reducerea numărului de copii ale genei lmx1b în prezența unei mutații pentru gena lmx1a. Bazat pe aceste rezultate se poate concluziona că, Lmx1a/b reglează numărul de celule neuronale mDA reglând proliferarea, ieșirea din ciclul celular și diferențierea progenitorilor mDA (Yan și colab., 2011).

În plus, studiile actuale sugerează că Lmx1a funcționează împreună cu Foxa2 pentru a promova și induce fenotipul neuronal dopaminergic (Lin și colab., 2009; Nakatani și colab., 2010). Lmx1a acționează în aval față de factorii de transcripție Foxa1/2 și Otx2 pentru a reglementa proliferarea și diferențierea progenitorilor mDA (Andersson și colab., 2006; Ono și colab., 2007). Foxa1 și Foxa2 sunt exprimați la nivelul progenitorilor din mezencefalul ventral în jurul perioadei E8.5. Aceștia reglează în mod pozitiv expresia factorilor Lmx1a și Lmx1b în progenitorii mDA. Mai mult decât atât, Foxa1 și Foxa2 funcționează cooperativ cu Lmx1a și Lmx1b pentru a regla diferențierea neuronilor mDA (Lin și colab., 2009). În acest context, a fost demonstrat faptul că electroporarea lui Lmx1a în progenitorii bazali aparținând embrionilor de pui, duce la generarea de neuroni mDA ectopici (Andersson și colab., 2006). Astfel, dacă Foxa2 și Lmx1a acționează sinergic pentru a induce neuroni mDA ectopici, atunci expresia ectopică pentru ambele gene poate conduce la generarea neuronilor dopaminergici proveniți din progenitorii localizați în placa alară și placa bazală a mezencefalului. Pentru a fi demonstrată această idee, Lin și colab au realizat în anul 2009 o coelectroporare a factorilor Foxa2 și Lmx1a în mezencefal. Acest experiment a condus la generarea în cantitate mare la nivelul celor două regiuni a neuronilor mDA ectopici pozitivi pentru markerii Lmx1b, Nurr1, Pitx3 și TH.

La rozătoare, neuronii imaturi sunt formați în jurul zilei E10.5, în timp ce la oameni, această etapă începe între săptămânile embrionare 5-6 și se finalizează în săptămânile 10-11 (Arenas și colab., 2015).

Maturare

Maturarea definește etapa în care neuronii postmitotici devin neuroni mDA maturi și totodată este etapa în care factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b rămân exprimați. Exprimarea acestora conduce la un posibil rol protector atribuit celor doi factori. Cunoscută și ca o etapă de diferențiere târzie, aceasta începe odată cu perioada E11.0 și presupune o continuare a migrării neuronilor mDA imaturi. Aceștia migrează radial înspre zona de manta și devin neuroni mDA maturi. Un număr dintre factorii prezentați anterior, printre care și Nurr1 își continuă activitatea. În acest stadiu, neuronii maturi exprimă în plus factori precum Pitx3, dar și enzime și cofactori necesari pentru fenotipul dopaminergic: TH, VMA2, DAT, Aadc (aromatic amino acid decarboxylase) (Maxwell și colab., 2005). Toate aceste proteine sunt necesare pentru realizarea sintezei, depozitării și transportării dopaminei. Totuși, este remarcat faptul că Ngn2 nu se exprimă în neuronii maturi (Ang, 2006).

Lmx1b este prezent în etapa de specificare, absent în diferențiere, dar în perioada de maturare este din nou activ, fiind necesar pentru menținerea neuronilor mDA maturi (Smidt și colab., 2000). Lmx1b este colocalizat cu Pitx3 și este posibil ca acesta să realizeze reglarea unei căi necesare exprimării Pitx3. Pitx3 reglează expresia BDNF (factor neurotrofic derivat din creier) care aparține familiei NGF- factori de creștere nervoși. Absența acestui factor, ilustrată în experimentele pe șoareci de laborator, a determinat lipsa dezvoltării neuronilor dopaminergici (Bergman și colab., 2009).

În ceea ce privește menținerea expresiei factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b, Doucet-Beaupré și colaboratorii au sugerat în 2015 că această exprimare a celor doi factori are rol în creșterea axonilor și în stabilirea corectă a direcției acestora către țesuturile țintă. La nivelul regiunii dorsale a măduvei spinării, în mod normal interneuronii își au proiecțiile la nivelul plăcii ventrale și dorsale. Analizele realizate pe șoarecii dreher au evidențiat axoni localizați greșit, care traversau linia mediană dorsală. De asemenea, Lmx1a/b sunt necesari pentru organizarea topografică a rețelei de axoni care proiectează în striat. Această afirmație a apărut în urma studiului realizat de Chabrat și colab în 2017, care au arătat că o cuantificare a inervației axonale pozitivă pentru TH la nivelul striatului șoarecilor mutanți pentru genele lmx1a/b arată o scădere a densității axonilor mDA în regiunea dorso-posterioară a striatului. Tot în cadrul acestui studiu a fost descoperit și un reglaj al Plxnc1, realizat de către Lmx1a/b. Pentru că Lmx1a/b reglează expresia a sute de gene, pentru a se descoperi gena de interes a fost utilizată o hibridizare in situ în secțiunile mezencefalice a genei Plxnc1. Expresia genei Plxnc1 a fost observată ca fiind restricționată în aria tegmentală ventrală. Lipsită de expresia acestei gene, este însă SNpc. O altă situațiea fost însă întâlnite la șoarecii mutanți pentru Lmx1a/b, a căror neuroni mDA de la nivelul ambelor regiuni, ATV și SNpc, exprimau un nivel ridicat al genei Plxnc1 (Chabrat și colab., 2017).

Rolul Lmx1a/b în menținerea și protejarea neuronilor dopaminergici din mezencefal

Procesul de dezvoltare a neuronilor dopaminergici presupune parcurgerea unor etape complexe în care rolul definitiv îl joacă un număr de factori și molecule de semnalizare interconectate. Prezența acestor factori este resimțită doar fie în anumite etape ale dezvoltării, fie pe tot parcursul vieții neuronilor, contribuiând astfel la menținerea unui echilibru în ceea ce privește activitatea funcțională a acestora. Cât timp exsită o bună menținere și protejare a celulelor neuronale mature, funcția cheie va rămâne nealterată și va fi exercitată în mod corect.

În acest context, pentru a fi stabilit rolul factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b în maturarea neuronilor mDA adulți, un studiu recent a analizat consecința extirpării acestor factori specifici pentru neuronii dopaminergici din mezencefal. Studiul a avut ca subiecți șoarecii knockout, adică șoarecii la nivelul cărora se inactivează o genă de interes, fie prin înlocuire sau prin întreruperea acesteia. Șoarecii knockout vor exprima modificări fenotipice ce vor oferi informații importante referitoare la funcția în organism a genei asupra căreia s-a intervenit. Doucet-Beaupré și colaboratorii, au descris acest studiu în anul 2015. Aceștia au menționat că funcțiile lui Lmx1a și Lmx1b au fost urmărite la șoarecii cu knockout condiționat (dublu homozigot pentru alele loxP-flancate ale lui Lmx1a și Lmx1b cu șoareci heterozigoți care exprimă recombinaza Cre sub controlul de reglementare al locusul genei transportoare de dopamină cLmx1a/b DatCre). Testele care aveau ca țintă comportamentul șoarecilor knockout Lmx1a/b adulți și înaintați în vârstă au arătat deficiențe în coordonarea motorie și în memorie (Laguna și colab., 2015). De asemenea, a fost observată o pierdere progresivă a neuronilor pozitivi pentru tirozin hidroxilază, pierdere însoțită de patologie axonală dopaminergică la nivelul striatului. Toate acestea explică manifestarea disfuncțiilor în cadrul circuitelor dopaminergice. Important este faptul că îndepărtarea în particular a genei lmx1b, la fel ca îndepărtarea simultană a ambelor (Lmx1a și Lmx1b), duce la generarea unor schimbări morfologicale în axonii terminali TH pozitivi din striat. Totuși, nu există patologii la nivelul striatului atunci când este deletată doar Lmx1a (Yan și colab., 2011). Rezultatele acestui studiu pot fi explicate prin existența unei compensări eficiente realizată de către Lmx1b pentru Lmx1a, în timp ce Lmx1a nu compensează pierderea factorului Lmx1b (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Extirparea genelor lmx1a/b în timpul dezvoltării embrionare la neuronii mDA maturi (E12.5) conduce la o pierdere neuronală, în timp ce extirparea acestora la patru săptămâni după naștere nu a provocat un asemenea efect (Laguna și colab., 2015). Absența pierderii neuronale poate fi corelată cu diferența în activitatea reziduală a genelor lmx1a/b, sau poate fi explicată prin dobândirea unui mecanism compensatoriu în timpul dezvoltării postnatale. De aceea, este importantă examinarea funcțiilor ambelor gene, lmx1a și lmx1b, funcții cu importanță în menținerea circuitului mDA în creierul adult (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

În acest scop, a fost realizată o aprofundare a subiectului de către Doucet-Beaupré și colaboratorii în anul 2016. Studiul acestora a evidențiat și a indicat rolurile cheie ale genelor lmx1a/b în creierul adult și importanța acestora în mecanismele de menținere și degenerare a neuronilor dopaminergici. Șoarecii knockout Lmx1a/b au exprimat primele semnale de degenreare în jurul perioadei P20, la nivelul SNpc. Concomitent cu aceste semnale, a fost observată apariția unor terminatii anormale umflate (structuri asemănătoare unor sferoide) care însoțeau moartea neuronală. Această degenerare neuronală, în special localizată la nivelul SNpc, este corelată cu boala Parkinson. În acest context a fost observat faptul că, o inactivare la nivelul neuronilor mDA a genelor lmx1a și lmx1b conduce la o deteriorare progresivă a funcției motorii, asemănătoare cu cea întâlnită în boala Parkinson. Inițial, la 12 săptămâni de la inactivarea genelor, a fost vizibilă o reducere a posibilității realizării mișcărilor verticale, urmând un declin continuu în următoarele luni. Însă, este de menționat faptul că acest deficit la nivel locomotor, rezultat al inactivării genelor lmx1a/b în șoarecii adulți, nu a fost detectat la șoarecii tineri (Doucet-Beaupré și colab., 2016).

Tot în acest studiu autorii afirmă faptul că genele lmx1a/b pot modula metabolismul mitocondrial și propun un rol deosebit pentru lmx1a/b și anume controlul unor părți cheie din programul care realizează generarea și menținerea neuronilor dopaminergici. Programul nu include doar componente esențiale care îi aparțin căii dopaminergice ci și caracteristici mitocondriale unice aparținând neuronilor mDA, în special protecția constitutivă atât de necesară pentru supraviețuirea acestora. Astfel, lmx1a/b pot reprezenta un factor cheie în comunicarea încrucișată dintre semnalizarea genetică și cea metabolică care apare în timpul dezvoltării și care persistă în neuronii mDA maturi (Doucet-Beaupré și colab., 2016).

Dincolo de rolul de reglare a markerilor mDA clasici, pe care factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b îl îndeplinesc, prezența lui Lmx1b este critică pentru menținerea în parametri normali a funcțiilor de transport autofag-lizozomal și intercelular și pentru prevenirea dezvoltării unor posibile patologii la nivelul neuronilor mDA. Funcțiile ulterioare ale lui Lmx1b împreună cu Nurr1 nu sunt o simplă reflectare a importanței cheie pe care o au în stabilirea unui profil de expresie genică caracteristic identității neuronilor mDA în timpul dezvoltării ci acționează ulterior și pentru controlul homeostaziei celulare centrale care trebuie să fie sub control strâns pentru a preveni aparița patologiei celulare. Deleția genelor lmx1a/b în neuronii mDA aflați în etapa de diferențiere și în neuronii mDA adulți provoacă o notabilă acumulare a autofagozomilor și lizozomilor la nivelul terminalelor axonale. Se remarcă faptul că, acumularea agregatelor de proteine dens electronice în soma neuronilor mDA provoacă descreșterea expresiei genelor lizozomale, care constituie o primă deficiență cauzată de extirparea genelor lmx1a/b. Această deficiență poate conduce ulterior la o supraviețuire slabă a neuronilor mDA. Toate acestea subliniază importanța cunoașterii rolului lui lmx1a/b în neuronii mDA postmitotici și relevanța acestor factori în ceea ce privește boala Parkinson. Pentru aceasta, deleția genelor lmx1a/b poate reprezenta foarte bine un model util pentru investigarea mecanismelor moleculare care stau la baza patologiei (Laguna și colab., 2015).

Evidențierea schematică a funcțiilor și expresiei factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b poate fi urmărită în figura 33.

Figura 33. Funcția factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b în timpul dezvoltării neuronilor mDA și în neuronii mDA adulți. Partea superioară a figurii ilustrează cronologia expresiei genice pentru Lmx1a/b. Sub aceasta sunt reprezentate schematic diferite etape ale creierului rozătoarelor în timpul dezvoltării embrionare. Regiunile de la nivelul creierului colorate în roșu indică localizarea neuronilor dopaminergici și proiecțiile axonale ale acestora. Prescurtarea MHO este utilizată pentru indicarea “organizatorului istmic”. Toate reprezentările schematice sunt vederi sagitale ale creierului cu excepția secțiunii din ziua E11.5 de dezvoltare a embrionului care este o secțiune coronală. Adaptat după Doucet-Beaupré și colab., 2015.

Rolul Lmx1a în producerea de neuroni dopaminergici mezencefalici in vitro

Rolul factorului de transcripție Lmx1a a fost bine conturat în etapele de generare a neuronilor dopaminergici și totodată a fost dovedit faptul că activitatea lui Lmx1a este necesară și suficientă pentru generarea neuronilor dopaminergici cu identitate mezencefalică pornind de la celule stem embrionare (Andersson și colab., 2006). Prin urmare, Lmx1a poate fi considerat un punct central și de pornire în conceperea terapiilor ce utilizează celule stem, terapii utilizate în boala Parkinson. Totuși, Lmx1a realizează producerea neuronilor mDA in vitro, doar cu condiția ca în mediu să fie prezenți factorii Shh și Fgf8.

Un prim protocol de obținere in vitro a neuronilor dopaminergici mezencefalici a fost realizat și descris de Andersson și colaboratorii, în 2006. Ideea centrală a acestui studiu, dar în același timp și obiectivul principal a fost de a studia posibilitatea ca identificarea factorilor determinanți în procesul de specificare a neuronilor mDA din perioada de dezvoltare poate fi utilizată într-o strategie bine gândită de generare in vitro a neuronilor mDA din celule stem. Ulterior, obiectivul central a fost concluzionat de identificarea importanței utilizării factorului Lmx1a. Producerea eficientă a neuronilor cu identitate corectă de mDA de catre Lmx1a se realizează numai în urma ventralizării celulelor stem embrionare. Ventralizarea este indusă intrinsec de Shh și presupune transformarea celulelor stem în progenitori ventrali, care vor intra în etapa de specificare neuronală. Generarea de neuroni cu identitate corectă este vitală în influențarea potențialului terapeutic exercitat de neuronii derivați din celulele stem (Andersson și colab., 2006; Arenas și colab., 2015).

Un alt studiu interesant este cel realizat de Caiazzo și echipa sa în 2011. Aceștia și-au propus să obțină neuroni dopaminergici complet funcționali pornind de la fibroblaste de șoarece și om. Subiectul experimentului a fost corelat cu posibilitatea îmbunătățirii rezultatului clinic în boala Parkinson prin realizarea unui transplant de neuroni dopaminergici, care anterior a fost dovedit a fi eficient în vindecarea simptomelor motorii provocate de un eventual deficit de dopamină. Rezultatele protocolului au condus la identificarea a unei combinații de trei factori-Mash1 (Ascl1), Nurr1 (Nr4a2) și Lmx1a. Împreună, aceștia reușesc să determine generarea directă a neuronilor dopaminergici funcționali pornind de la celula fibroblastică, fără posibilitatea de a se întoarce la stadiul celular de progenitor. Celulele dopaminergice induse (iDA) se comportă asemenea celor nativ dopaminergice, secretă dopamină și au activitate electrică. Pentru obținerea unor astfel de celule, au fost utilizați șoareci TH-GFP transgenici de la care s-a realizat procesul de transducție a fibroblastelor embrionare de șoarece cu ajutorul unui amestesc de lentivirusuri inductibile de doxiciclină care exprimă toți factorii selectați inițial (11 dopaminergici și alți 3 pentru celulele neuronale) (Caiazzo și colab., 2011). Șoarecii TH-GFP transgenici au fost creați pentru a exprima o proteină ce emite fluorescență de culoare verde (GFP-green fluorescent protein) în majoritatea neuronilor dopaminergici mezencefalici sub controlul promotorului genei TH de șobolan (Matsushita și colab., 2002). Tranducția tuturor factorilor selectați inițial a avut ca rezultat generarea unui număr mic de celule GFP+ (1.8 ± 0.8%). De asemenea, pentru a se determina setul minimal de gene necesare inducerii neuronilor dopaminergice si pentru a crește procentul de neuroni generați, Mash1 a fost introdusă în fibroblastele embrionare de șoarece împreună cu fiecare dintre ceilalți factori dopaminergici, respectiv Nurr1 și Lmx1a. Activarea combinată a factorilor Mash1/Nurr1 a dus la obținerea unei creșteri ușoare a celulelor GFP+ (8 ± 2%). În urma adăugării celei de a treia molecule și a studiului ratei de generare a celulelor GFP+ din fiecare combinație, s-a dovedit că doar Lmx1a și parțial Lmx1b (18 ± 3% și respectiv 13 ± 3% din celulele GFP+) sunt factorii capabili să acționeze sinergic cu Mash/Nurr1 și să determine o creștere impresionantă a celulelor GFP+ generate. Utilizarea mixului dintre Mash1, Nurr1 și Lmx1a a evidențiat faptul că celulele duble GFP+/ TH+ reprezentau cel mai mare procent din totalul celulelor neuronale induse, mai precis 85 ± 4%. Mai mult decât atât, analiza expresiei globale a arătat că celulele dopaminergice induse erau mai apropiate de grupurile A9 și A10 de neuroni dopaminergici mezencefalici decât de originea lor fibroblastică (Caiazzo și colab., 2011).

Bazat pe aceste date se poate concluziona că, Lmx1a este un factor cheie și are un rol decisiv în producerea neuronilor mDA in vitro. Prezența lui Lmx1a este necesară pentru obținerea celulelor dopaminergice, iar în anumite combinații cu alți factori relevanți rezultatele devin mult îmbunătățite. Odată cu procesul de generare a celulelor neuronale dopaminergice apar noi posibilități în obținerea terapiilor regenerative pentru boala Parkinson și alte tulburări corelate cu aceasta. Totuși, este extrem de important ca întreg procesul să aibă o eficiență ridicată pentru a putea fi confirmată 100% relevanța clinică a acestuia. Tocmai de aceea, va fi util să se descopere și alți factori care pot fi adăugați pentru ca eficiența procesului să crească.

Genetica factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b în sistemul nervos central

Gena pentru factorul de trasncripție Lmx1a de la om a fost identificată pe cromozomul distal 1q22-q23 (German și colab., 1994), iar cea pentru Lmx1b pe brațul lung a cromozomului 9, în poziția 33.3 (9q33.3) (Iannotti și colab., 1997). Stiudiul polimorfismelor genetice pentru Lmx1a și Lmx1b a condus la asocierea acestora cu diferite boli (Tabel 4) care afectează calea serotonergică și dopaminergică din sistemul nervos central.

Tabel 4. Boli umane asociate cu genele lmx1a și/sau lmx1b (adaptat după Doucet-Beaupré și colab., 2015)

Studiile realizate până în prezent indică o legătură între polimorfismele acestor gene, boala Parkinson și schizofrenia.

Polimorfismele genetice corelate cu boala Parkinson au fost studiate și descrise de Bergman și echipa sa în anul 2009. Obiectivul principal al studiului urmărea investigarea unei diferențe de variație genetică în Lmx1a și Lmx1b între pacienții cu boala Parkninson și subiecții folosiți drept control. Pentru început, a fost selectat un total de 46 de polimorfisme uninucleotidice (SNPs-single nucleotide polymorphisms) care alcătuiau o regiune genomică cu o lungime de 186.2 kb ce cuprindea gena lmx1a și un total de 22 de SNPs cu o lungime totală de 71.5 corespunzătoare genei lmx1b. În urma unei selecții, au fost genotipate 33 de polimorfisme uninucleotidice ale genei lmx1a si 11 ale genei lmx1b. Trei din cele 33 de SNPs pentru gena lmx1a și unul pentru gena lmx1b au fost asociate cu boala Parkinson. După separarea acestora în funcție de gen, s-a obținut un total de 6 SNPs asociate cu boala Parkinson la femei și 4 SNPs la bărbati (Bergman și colab., 2009).

Un alt studiu a urmărit nivelul proteic al genei lmx1b în țesuturile postmortem de la nivelul creierului pacienților cu boala Parkinson și a celor folosiți drept control (Laguna și colab., 2015) A fost constatat un nivel scăzut pentru gena lmx1b în neuronii mDA a pacienților cu parkinsonism comparativ cu nivelul înregistrat la pacienții control care aveau aceeași vârstă. Identificarea unei expresii scăzute pentru lmx1b a pus sub semnul întrebării rolul pe care acesta îl joacă în patogeneza moleculară a bolii Parkinson, dincolo de funcțiile exercitate în integritatea și supraviețuirea pe termen lung a neuronilor mDA, care sunt deja bine cunoscute (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Schizofrenia este una dintre cele mai severe tulburări mentale, având un spectru simptomatic variat care pornește de la modul în care o persoană crede, simte și se comportă. Un studiu care a urmărit o posibilă asociere între schizofrenie și polimorfismele uninucleotidice a fost cel a lui Bergman și colaboratorii, din anul 2010. Pentru polimorfismele uninucleotidice în genele pitx3, lmx1a și lmx1b a fost demonstrată anterior legătura cu boala Parkinson (Bergman și colab., 2009; Bergman și colab., 2010). În urma rezultatelor obținute în studiile anterioare, a luat naștere ideea conform căreia există o posibilitate ca polimorfismele acestor gene să influențeze dezvoltarea și/sau menținerea neuronilor dopaminergici. Principala întrebare a cercetătorilor a fost dacă aceleași polimorfisme corelate cu boala Parkinson pot fi asociate și cu schizofrenia. Astfel, prin genotiparea lor au fost identificate 4 din 5 polimorfisme uninucleotidice comune la pacienții care sufereau de schizofrenie și care erau aceleași cu cele care au fost demonstrate anterior pentru boala Parkinson. Ipoteza conform căreia dopamina joacă un rol cheie în patofiziologia schizofreniei își are rădăcinile în mare parte din evidențele farmacologice, fiind confirmată și de datele obținute prin tomografie cu emisie de pozitroni, date ce ilustrau eliberări crescute de dopamină în striatul pacienților schizofrenici (Bergman și colab., 2010).

În cazul autismului, gena lmx1b își face simțită prezența, iar rolul său în patofiziologia acestei boli a fost determinat cu ajutorul polimorfismului genetic și în urma unei analize a creierului postmortem (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Autismul împreună cu alte dizabilități de dezvoltare sunt cunoscute în diagnosticul clinic sub numele de tulburare a spectrului de autism (ASDs) și au o simptomatologie legată de deficiențe ale abilităților de comunicare și interacțiune socială. Factorul de transcripție LMX1B a fost inițial considerat un factor cheie în reglarea dezvoltării dorsoventrale a membrelor. Mai târziu, au apărut diferite idei despre rolul acestuia în dezvoltarea și menținerea neuronilor serotonergici (neuroni 5HTergici) din SNC, dar și despre rolul sistemului serotonergic în patofiziologia autismului. Această ipoteză, în care sistemul serotonergic ar putea fi corelat cu autismul, a plecat de la patru certitudini: a) hiperserotonemie detectată în toate celulele sângelui și trombocite la 25-50% din pacienții cu autism; b) epuizarea triptofanului, precursorul al 5-hidroxitriptaminei (5-HT), la pacienții cu autism a condus la creșterea unor stereotipuri comportamentale asociate cu această boală; c) administrarea unui tratament care conține inhibitori selectivi ai recaptării serotoninei a reușit să aibă un efect de ameliorare a comportamentelor repetitive și/sau compulsive; d) studiile recente de neuroimagistică au detectat un nivel scăzut de sinteză a 5-hidroxitriptaminei la nivelul creierului copiilor autiști (Thanseem și colab., 2011). În acest sens, a fost studiată existența unei asocieri între gena lmx1b și autism la populația caucaziană, obținându-se asocieri nominale între două polimorfisme uninucleotidice și un haplotip cu autism. Thanseem și colaboratorii au fost primii care au raportat această asociere a factorului Lmx1b cu autismul, până atunci fiind demonstrată doar legătura dintre Lmx1b și schizofrenie. De asemenea, în timpul studiului a fost remarcată o expresie extrem de scăzută a transcriptului primar pentru Lmx1b în girusul cingular anterior al creierului autist (Thanseem și colab., 2011).

Gena lmx1a a fost corelată în particular cu două boli neurodegenerative: Alzheimer și tulburarea obsesiv-compulsivă. În cazul bolii Azheimer vorbim despre o pierdere graduală și progresivă a neuronilor ce conduce la generarea unor disfuncții cognitive la vârstnici. Într-un studiu realizat în 2014, Talwar și colaboratorii săi au dorit să descopere principalele gene implicate în procesele biologice ce au legătură cu boala Alzheimer. În urma studiului genelor provenite de la 108 candidați au putut fi evidențiate genele în funcție de procesul biologic în care sunt implicate, funcțiile moleculare sau localizarea celulară. Genele de risc cu însemnătatea cea mare pentru Alzheimer au fost ACTB și EGFR. Cu toate acestea, nu trebuie neglijată nici gena lmx1a a cărei rol în neurogeneză, în reglarea acesteia și în dezvoltarea neuronală a fost dovedit. Cât despre legătura dintre lmx1a și tulburarea obsesiv-compulsivă, aceasta intră în categoria genelor susceptibile. Împreună cu genele dlgap1, ryr3, pbx1-meis2, bdnf și grin28 constituie componenta principală a creșterii neuronale și a căii BDNF(factor neurotrofic derivat din creier)-mTOR( ținta mamiferică a rapamicinei) de diferențiere și neurogeneză. Calea BDNF-mTOR are numeroase implicații la nivelul creierului (Grados și colab., 2014).

Totuși, în ultimii ani numeroase studii au arătat că genele care fac parte din familia LIM homeodomeniu sunt molecule cheie implicate în dezvoltarea a diverselor cancere umane. Din această clasă, gene cu importanță majoră pentru cancer este lmx1a. Analizele imunohistologice a unor tumori de la nivelul creierului au evidențiat legături directe între nivelul proteic al genei lmx1a și cancerele de tip meningioma și glioma, cu mențiunea că lmx1a este mai puternic implicată în stadiile II și III ale bolii. Cea mai comună tumoră întâlnită la nivelul sistemului nervos central este glioma, a doua ca popularitate fiind meningioma. Împreună cu osteopontina (opn), lmx1a are rol în principalele etape ale formării cancerului la om, de la progresia tumorală și până la metastazare. În anul 2012 a fost testată impoteza conform căreia expresia factorilor Genele opn și lmx1a ar avea legătură cu principalele tumori ale creierului. Analizele imunohistochimice au relevat o prezență a expresiei acestora în 139 de cazuri de tumoră a creierului, dintre care 65 erau cancere de tip meningioma și 71 de tip glioma. Așa cum se cunoaște deja, cancere sunt clasificate în functie de evoluție în cancere în stadiul I, II, III sau IV. Pentru cancerul de tip meningioma în stadiul I a fost demonstrată absența expresiei lui opn și lmx1a la peste 90% dintre cazuri, în timp ce în stadiile II și III un procent cuprins între 66.7-100% din cazuri evidențiau o expresie moderată și respectiv puternică a genelor opn și lmx1a. Rezultate similare au fost descoperite și pentru cancerul de tip glioma, în acest caz intesnitatea expresiei pentru factorul de transcripție Lxm1a a fost mai crescută în stadiile I-III spre deosebire de stadiul IV al tumorii (Tsai și colab., 2012).

Rolul Lmx1a/b în formarea plăcii dorsale

Placa dorsală este considerată a fi centrul organizatoric din cadrul regiunii dorsale a sistemului nervos central, prin secreția moleculelor semnal BMP și WNT controlând specificarea și diferențierea neuronilor adiacenți (Mishima și colab., 2009).

Lmx1a este principalul factor implicat direct în formarea tubului neural, iar la închiderea acestuia expresia lui Lmx1a este restricționată în placa dorsală și progenitorii acesteia de la toate nivelele axiale ale SNC. Studiile inițiale ce aveau ca subiect placa dorsală erau axate în principal pe măduva spinării și pe legătura dintre calea de semnalizare Bmp-Lmx1a și progenitorii plăcii dorsale, aceștia fiind induși de aceasta (Doucet-Beaupré și colab., 2015). Ulterior, studiile au avut ca subiect rolul lui Lmx1a și implicit al factorului Lmx1b, în formarea plăcii dorsale. Toate au condus la o singură concluzie conform căreia gena lmx1a este necesară și în același timp suficientă pentru a determina formarea acestei structuri la nivelul măduvei spinării. Totuși, aceleași studii au evidențiat faptul că, în porțiunea anterioară a sistemului nervos central se dezvolta o placă dorsală reziduală, apariția acesteia fiind posibilă în absența lui Lmx1a. La acest nivel intervine Lmx1b, factor cheie pentru dezvoltarea organizatorului istmic (IsO). Gena lmx1b este coexprimată cu lmx1a în rombomerul dorsal 1 (rh1) al plăcii dorsale (Mishima și colab., 2009).

Deși există această coexprimare a lui lmx1b cu gena lmx1a, lmx1b nu este absolut necesară pentru ca placa dorsală să se formeze. La șoarecii cărora le-a fost extirpată doar gena lmx1b (lmx1b−/− ) nu a fost întâlnită o imposibilitate a formării plăcii dorsale de la nivelul rombomerului. Dacă genele lmx1a și lmx1b sunt analizate separat, pot fi considerate gene facultative pentru inducerea plăcii dorsale a creierului posterior (Mishima și colab., 2009). Rezultatele nu sunt similare atunci când vorbim despre o deleție dublă (lmx1a−/−; lmx1b−/−), atât pentru lmx1a cât și pentru lmx1b, șoarecii aflați în această situație nu reușesc să dezvolte placa dorsală. În urma analizelor fenotipice ale șoarecilor cu mutații simple sau duble, în anul 2009 Mishima și echipa sa au confirmat existența unei suprapuneri între rolurile genelor lmx1. Datele descrise de acești cercetători au fost considerate o primă evidență a acestei suprapuneri încă din timpul dezvoltării embrionare a sistemului nervos central.

Până să ajungă la aceste rezultate, punctul de plecare a fost reprezentat de ideea că proteina Lmx1b funcționează redundant cu Lmx1a. În ciuda faptului că factorul de transcripție Lmx1b se exprimă în IsO, expresia acestuia este vizibilă și în placa dorsală anterioară a rombencefalului. Placa dorsală anterioară a rombencefalului este strâns corelată cu acea placă reziduală formată la embrionii care au gena lmx1a deletată, argument ce vine în susținerea ideii de la care s-a plecat. Pentru a putea fi separată funcția factorului Lmx1b la nivel anterior/posterior (la nivelul IsO) de tipul funcțiilor exercitatea la nivel dorsal/ventral, au fost utilizate strategii pentru deleția specifică a lui lmx1b în linia mediană dorsală fără a fi perturbată expresia acestuia. Șoarecii mutanți lmx1b−/− au fost crescuți împreună cu șoarecii mutanți lmx1a−/− pentru ca doza genelor lmx1 să fie redusă pe o perioadă îndelungată. Această modalitate de studiu a condus la identificarea unei reduceri semnificative din punct de vedere al dimensiunilor pentru ventriculul IV al plăcii dorsale. Modificarea sesizată confirmă rolurile suprapuse pentru genele lmx1a și lmx1b exprimate în regiunea dorsală în momentul formării plăcii dorsale. Tot pentru a se demonstra rolurile suprapuse ale acestora au fost atent analizați embrionii lipsiți de gena lmx1b. În stadiul E10.5 de dezvoltare embrionară, rh1 din placa dorsală este relativ normal ca mărime și formă, având o expresie neschimbată a markerilor pentru placa dorsală (Gdf7, Wnt1 și Msx1). Caracteristicile în limite normale ale lui rh1 de la șoarecii lmx1b−/− indică faptul că, deși rolul lui lmx1b este semnificativ pentru menținerea organizatorului istmic, acesta poate lipsi fără a crea schimbări atunci când rh1 din placa dorsală se dezvoltă (Figura 34 C și D). Pe de altă parte, pierderea genei lmx1a este concluzionată printr-o reducere semnificativă a rombomerului 1 din placa dorsală (Figura 34 E și F) (Mishima și colab., 2009).

Pentru a se testa dacă factorul de transcripție Lmx1b cooperează cu Lmx1a pe durata procesului de dezvoltare a plăcii dorsale a fost studiat fenotipul lui rh1 la embrionii cu mutații pentru ambele gene. Dacă în etapa de dezvoltare 10.5 expresia markerilor specifici pentru placa dorsală era normală la șoarecii care aveau doar gena lmx1b deletată, la șoarecii cu deleție dublă, în aceeași etapă, markerul molecular Gdf7 este complet absent sau extrem redus. De asemenea, a fost detectată o expresie anormală a factorului Wnt1 în rh1 dorsal al embrionilor mutanți din aceeași perioadă de dezvoltare (E10.5). La șoarecii de tip sălbatic, Wnt1 este exprimat în buza rombică adiacentă plăcii dorsale din creierul posterior, în timp ce la șoarecii dublu mutanți a fost observată o fuziune medială a expresiei acestuia (Mishima și colab., 2009).

Figura 34. Vedere dorsală a hibridizării in situ pentru Gdf7 și Wnt1 la embrionii din perioada de dezvoltare E10.5. (A) și (B) ilustrează poziția lui rh1 și viitorul cerebel. Cele două figuri sunt reprezentative pentru șoarecii de tip sălbatic. Embrionii lmx1b−/− sunt ilustrati în figurile (C) și (D), unde ventriculul IV al plăcii dorsale este aproape normal în ciuda pierderii organizatorului istmic. Figurile (E) și (F) arată o reducere a ventriculului IV la embrionii lmx1a−/−. Reprodus după Mishima și colab., 2009.

Este important de menționat faptul că înaintea studiilor pe șoareci, Lmx1a a fost demonstrat ca fiind factorul suficient pentru formarea unei plăci dorsale ectopice atunci când este supraexprimat în măduva spinării din cadrul studiilor pe puii de găină. Din punct de vedere funcțional, placa dorsală ectopică poate induce non-autonom formarea în poziții ectopice a interneuronilor dorsali dI1 și dI3. În plus, aceasta are rol supresor în procesul de specificare al interneuronilor dorsali dI2 din măduva spinării aflată în dezvoltare. Studiile pe puii de găină au demonstrat că Lmx1a induce expresia membrilor familiilor de proteine Bmp și Wnt care sunt componente importante ale semnalizării plăcii dorsale în timpul dezvoltării măduvei spinării. Pierderea lui Lmx1a conduce la lipsa expresiei factorului Bmp în măduva spinării la embrion, în timp ce expresia lui Wnt rămâne neschimbată. Astfel, membri familiei Bmp sunt considerați componente importante ale semnalizării Lmx1a dependentă din placa dorsală. Activarea lui Lmx1a și dezvoltarea timpuri a plăcii dorsale sunt dependente de semnalizarea Bmp și nu sunt inhibate atunci când semnalizarea Wnt este scăzută. Activarea ectopică a semnalizării Bmp determină extinderea inducerii plăcii dorsale. Cu ajutorul Bmp este inclusă aproape întreaga axă dorsoventrală a măduvei spinării, în timp ce Lmx1a poate induce placa dorsală doar în cea mai dorsală regiune a tubului neural (Chizhikov și Millen, 2004).

Rolul lui Lmx1b în calea neuronilor serotonergici și glutaminergici

Neuronii serotonergici, cunoscuți și sub denumirea de neuroni 5-hidroxitriotaminici (5-HT), modulează diverse procese de dezvoltare și comportamentale. Dereglarea nivelului de 5-hidroxitriptamină în sistemul nervos central poate conduce la instalarea unor tulburări psihiatrice. Obținerea informațiilor valoroase legate de mecanismele moleculare ce stau la baza etapelor de specificare, diferențiere, supraviețuire și menținere a neuronilor 5-HT centrali, a fost susținută de identificarea factorilor de transcripție specifici pentru 5-HT și manipularea genetică a acestora în diverse experimente.

Principalele descoperiri în ceea ce priveste controlul transcripțional al dezvoltării neuronilor 5-HT au fost sumarizate de Chen și Ding în 2006. Focusul studiului a fost menținut pe rezultatul obținut în urma experimentelor de direcționare a genelor la șoareci. În studiul publicatd e aceștia, discuția se concentrează pe două clase de factori transcripționali corelați cu 5-HT: Nkx2.2 și Mash1 (prima clasă) împreună cu Lmx1b și Pet 1 (a doua clasă). Membrii primei clase se exprimă în celulele 5-HT progenitor, fixându-se în zona ventriculară. În contrast, Lmx1b și Pet 1 se exprimă doar în neuronii 5-HT postmitotici. Utilizând acesti factori, autorii au construit o comparație a unor linii de mutație diferite cărora le lipsea un factor transcripțional individual. Această comparație le-a permis să anticipeze relatiile dintre factorii de interes în timpul dezvoltării neuronilor serotonergici.

Lmx1b este unul dintre factorii exprimați timpuriu în neuronii 5-HT postmitotici. Acesta cooperează cu factorul Pet1 în vederea organizării diferențierii terminale și promovează supravietuirea neuronilor în nucleii rafeului (Cheng și colab., 2003; Ding și colab., 2003). Deleția lui Lmx1b în neuronii care exprimă Pet1 conduce la eliminarea completă a neuronilor serotonergici de la nivelul creierului șoarecilor. Această tehnică a fost folosită ca model pentru studiul căii dopaminergice (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Totuși, expresia lui Lmx1b nu rămâne persistentă doar în neuronii 5-HT postmitotici din timpul dezvoltării embrionare. Acesta rămâne exprimat în neuronii 5-HT postnatali și implicit în creierul adult, ceea ce evidențiază faptul că Lmx1b poate avea roluri multiple în funcție de stadiul de dezvoltare al neuronilor serotonergici. Pentru realziarea etapei de specificare a neuronilor 5-HT, Lmx1b este necesar, dar nu și suficient. Specificarea se realizează doar atunci când Lmx1b este co-exprimat cu alți factori precum Pet1 și Nkx2.2. Însă, rolul definitoriu pentru Lmx1b în neuronii serotonergici este legat de implicarea acestuia în supraviețuirea lor (Chen și Ding, 2006). Primul argument care a susținut că Lmx1b este un factor esențial pentru supraviețuirea neuronilor 5-HT a fost furnizat de faptul că pierderea markerilor specifici pentru neuronii serotonergici și implicit inactivarea lui Lmx1b este urmata de pierderea aproape totală a somei neuronilor 5-HT în creierul neonatal (Zhao și colab., 2006).

Un alt studiu, a folosit deleția selectivă a lui Lmx1b în nucleii rafeului pentru a arăta că Lmx1b este necesar pentru biosinteza receptorilor 5-HT. Acest experiment a condus la concluzia conform căreia Lmx1b poate fi implicat în menținerea funcției normale a neuronilor 5-HT centrali, prin reglarea expresiei factorilor Tph2, Sert și Vmat2 (Whitaker și colab., 2014). Este important de menționat că deleția lui Lmx1b în neuronii 5-HT adulți nu conduce la pierderea neurnilor 5-HT în nucleii rafeului. Ideea a fost susținută de evidențierea neschimbării expresiei lui Pet 1 și Aadc, markeri adiționali ai neuronilor 5-HT, în urma extirpării lui Lmx1b (Deneris și Hobert, 2014).

În cazul neuronilor glutaminergici, Lmx1b are diferite zone de exprimare în cadrul sistemului nervos central postnatal. Expresia acestuia este localizată în principal la nivelul nucleului principal al trigemenului senzorial și coarnelor dorsale spinale (Dai și colab., 2008). De asemenea, Lmx1b este exprimat și în timpul dezvoltării embrionare, având o expresie abundentă în nucleul principal al trigemenului (PrV). În timpul dezvoltării acestei structuri, Lmx1b împreună cu VGLUT2, un marker glutaminergic, marchează celulele glutaminergice și nu cele GABAergice (Xiang și colab., 2012). Studiile pe acest subiect au adus evidențe asupra faptului că Lmx1b nu este unul dintre factorii implicați în specificarea inițială a celulelor glutaminergice, dar are un rol cheie în menținerea fenotipului glutaminergic. Lmx1b acționează pentru a suprima factorul Pax2, un promoter al căii GABAergice. Această acțiune asupra lui Pax2 conduce la o potențială menținere a echilibrului funcțional al tipurilor de celule glutaminergice și GABAergice în timpul dezvoltării. În absența lui Lmx1b, specificarea inițială este normală până în stadiul de dezvoltare E14.5. După această perioadă, celulele glutaminergice încep să scadă ca număr la nivelul PrV de la embrionii mutanți pentru factorul de transcripție Lmx1b (Lmx1b −/−). Pe de altă parte, numărul celulelor GABAergice de la acest nivel a început să crească. Astfel, în absența lui Lmx1b foarte multe dintre celulele care erau inițial specificate pentru a deveni glutaminergice, devin GABAergice. Rezultate suplimentare ale diferitelor studii sugerează că Lmx1b este atât necesar cât și suficient pentru a inhiba expresia fenotipului GABAergic. Totuși, studiul lui Xiang din anul 2012 a evidențiat că nu toate celulele glutaminergice de la nivelul PrV adoptă o soartă GABAergică în absența lui Lmx1b. Acest lucru este datorat faptului că expresia lui Gad1 este inhibată doar într-o mică parte din celulele Lmx1b −/−. Autorii aceluiași studiu au evidențiat că în nucleul principal al trigemenului de la șoarecii Lmx1b −/− există o reducere semnificativă a expresiei lui VGLUT2 spre finalul ultimei săptămâni de dezvoltare embrionară. O ulterioară introducere a factorului Lmx1b în cortexul cerebral prenatal tardiv, conduce la o creștere a expresiei lui VGLUT2. Aceste rezultate au demonstrat că factorul de transcripție Lmx1b dirijează menținerea și amplificarea fenotipului glutaminergic în timpul dezvoltării. Totuși, o inducție a expresiei lui Lmx1b în cortex nu este corelată cu o inducere a expresiei glutaminergice, ci mai degrabă o îmbunătățeste în anumite regiuni. De aceea, Lmx1b trebuie să coopereze cu alți factori glutaminergici specifici deja existenți pentru a construi și modela traseele excitatorii din cortexul aflat în dezvoltare. Cu toate acestea, modul în care Lmx1b reglează ,în mod direct sau indirect, expresia lui VGLUT2 rămâne încă neclar (Xiang și colab., 2012).

CONCLUZII

Tema acestei lucrări a avut ca scop expunerea și înțelegerea funcțiilor și mecanismelor de acțiune pe care factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b le îndeplinesc la nivelul sistemului nervos central. Au fost urmărite pe parcursul întregului studiu atât funcțiile specifice cât și cele cooperative sau compensatorii, cele două proteine fiind privite în comparație una față de cealaltă. Încadrate în familia genelor homeobox și implicit în subfamilia genelor LIM homeobox, Lmx1a și Lmx1b conferă acestora o importanță deosebită în definirea trăsăturilor neuronale, fiind implicate direct în acest proces. Funcția de bază a genelor lmx1a și lmx1b este corelată cu dezvoltarea neuronilor dopaminergici de la nivelul mezencefalului. Până la această dată, există numeroase studii care au ca subiect expresia celor doi factori de transcripție la nivelul sistemului nervos central, și nu numai. Toate aceste studii au ca punct comun de plecare originea celor două proteine, aspect cu o semnificație deosebită în ceea ce privește rolurile pe care Lmx1a și Lmx1b le dețin.

Plecând de la clasificare și implicit structura lui Lmx1a și Lmx1b, un alt obiectiv al acestei lucrări a fost localizarea expresiei celor doi factori de transcripție. Asemenea unui fir epic logic, expresia acestora este descrisă de la stadiile incipiente ale dezvoltării organismului și până la stadiul de adult. În stadiile timpurii de dezvoltare embrionară, Lmx1a și Lmx1b dirijează formarea centrelor de semnalizare critică care conduc la stabilirea teritoriilor adiacente. Pentru ca funcțiile specifice și reduntante pe care aceste două proteine le exercită la nivelul mezencefalului din timpul dezvoltării embrionare, au fost folosiți pentru diverse analize embrioni ai șoarecilor dreher și knock-out.

Momentul în care ia naștere expresia Lmx1a a fost identificat cu ajutorul unei hibridizări in situ realizată prin tehnica RT-PCR, iar expresia acesteia pleacă din stadiul E8.5 de la nivelul plăcii dorsale a tubului neural. Expresia paralogului său Lmx1b, se stabilizează în jurul zilei embrionare E9.5 la nivelul istmului și a celulelor progenitoare ale neuronilor mDA. Lmx1a și Lmx1b funcționează împreună pentru a realiza controlul etapelor de proliferare, specificare și diferențiere a progenitorilor mDA din timpul procesului de dezvoltare a neuronilor dopaminergici. Expresia factorilor de transcripție Lmx1a și Lmx1b persistă și în neuronii mDA postmitotici (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Prin studiile efectuate de Andersson și colaboratorii în anul 2006 pe șoarecii knock-out pentru Lmx1b și Lmx1a, s-a arătat că există o pierdere progresivă mai mare a celulelor progenitoare ale neuronilor mDA în comparație cu soarecii knock-out pentru Lmx1a. Embrionii mutanți cărora le lipsește Lmx1b întâmpină o scădere severă a numărului de neuroni mDA chiar din timpul stadiilor embrionare timpurii. Această pierdere este cauzată în principal de o funcționare defectivă a IsO în absența proteinei Lmx1b. Totuși, la șoarecii mutanți doar jumătate din neuronii mDA sunt pierduți, sugerând că exista o activitate reziduală a proteinei Lmx1a sau o potențială compensare a funcțiilor lui Lmx1b de către Lmx1a (Doucet-Beaupré și colab, 2015).

Expresia lui Lmx1b în cadrului sistemului nervos central este menținută cu ajutorul glicoproteinei Fgf8 (factorul de creștere fibroblastică 8). În același timp, Lmx1b menține la rândul său expresia factorului Wnt1, iar prin intermediul lui Wnt1 Lmx1b împreună cu Lmx1a controlează proliferarea celulară. Spre deosebire de funcția bine determinată în cazul formării unui model dorsal al membrelor, în cazul rolului exercitat la nivelul SNC există încă numeroase neclarități, ceea ce face ca în viitor să fie utilă descoperirea și înțelegerea mecanismelor îndeplinite de Lmx1b la acest nivel. Este important de menționat că totuși, Lmx1b, controlează expresia lui Fgf8 și Wnt1, molecule esențiale în inducția corectă a neuronilor dopaminergici. În timpul procesului de generare a neuronilor dopaminergici factorul Wnt1 induce expresia Lmx1a cu care creează un sistem autoreglator. Expresia Lmx1a este reglată și de proteina Shh. Celulele neuroepiteliale devin neuroni progenitori care vor urma calea neuronilor dopaminergic În măduva spinării aflată în dezvoltare, Lmx1a are o acțiune dublă: conduce progenitorii spre a forma placa ventrală în timp ce împiedică transformarea lor în interneuroni dorsali (Doucet-Beaupré și colab., 2015).

Un concept interesant este reprezentat de utilizarea lui Lmx1a în obținerea de neuroni dopaminergici mezencefalici prin metode in vitro. Simpla exprimare a Lmx1a în celulele progenitoare neuronale este suficientă pentru a produce neuroni dopaminergici din celule stem (de origine embrionară sau pluripotentă indusă. Această idee a fost corelată cu posibilitatea îmbunătățirii rezultatului clinic în boala Parkinson prin realizarea unui transplant de neuroni dopaminergici. Cu toate acestea, Lmx1a este capabil să genereze neuroni mdDA cu o identitate mezencefalică corectă numai dacă celulele stem au fost în prealabil “ventralizate” prin adăugarea Shh și Fgf8 în mediul de cultură. Acest lucru conduce la ipoteza că alte molecule încă necunoscute contribuie împreună cu Lmx1a la specificarea progenitorilor neuronali către linia celulara dopaminergică. În plus, Lmx1a este exprimată și în etapele următoare de diferențiere și maturare a mdDA, inclusiv în timpul vieții adulte. Din acest motiv, ar fi important de înțeles în viitor rolul pe care il joacă această proteină împreună cu alte molecule în aceste procese și eventuala sa implicare în menținerea și protejarea mdDA pentru a se descoperi pe deplin relevanța clinică pe care Lmx1a o îndeplinește.

În concluzie, lucrarea de față a avut drept obiectiv evidențierea complexității funcțiilor și mecanismelor în care factorii de transcripție Lmx1a și Lmx1b sunt implicați. Aceștia nu doar că participă într-o diversitate de evenimente legate de dezvoltare, ci sunt implicați cu diferite roluri în mecanismele de menținere și protejare prostmitotică a neuronilor dopaminergici. Astfel că, o funcționalitate defectivă pentru Lmx1b conduce la neurodegenerări asemănătoare cu cele întâlnite în boala Parkinson. În același timp, genele lmx1a și lmx1b de la om se află în strânsă legătură cu o serie de boli asociate defectelor dopaminergice. Prin prisma faptului că LMX1A se comportă asemenea unui supresor tumoral sau a unei oncogene și alături de Lmx1b participă în nenumărate căi de semnalizare, este important să se cunoască cu exactitate contribuția acestora pentru îmbunătățirea tratamentelor actuale și dezvoltarea de noi medicamente.