ȊNDRUMĂTOR ABSOLVENT PROF. DR. ING. – DR. SC. NAT. CĂTĂLIN BUIU IVANOV NEONILA BUCUREȘTI, 2017 Listă de figuri Figura 2.1 Structura pielii umane [4]… [308091]

UNIVERSITATEA POLITEHNICA din BUCUREȘTI

FACULTATEA DE AUTOMATICĂ ȘI CALCULATOARE

DEPARTAMENTUL DE AUTOMATICĂ ȘI INGINERIA SISTEMELOR

PROIECT DE DIPLOMĂ

CONSTRUIREA ȘI COMANDA UNEI

BIOIMPRIMANTE 3D

ȊNDRUMĂTOR ABSOLVENT: [anonimizat]. – DR. SC. NAT. CĂTĂLIN BUIU IVANOV NEONILA

BUCUREȘTI, 2017

Listă de figuri

Figura 2.1 Structura pielii umane [4] 6

Figura 2.2 Colagenul și elastina din dermă [5] 8

Figura 2.3 Colagen, fibroblat, elastină [7] 9

Figura 2.4 Țesut de piele: (A, B) imprimat, (C, D) însămânțat [18] 15

Figura 2.5 Tipuri de imprimare în funcție de proprietățile materialului [9] 18

Figura 3.1 Prusa i3 MK2 [21] 20

Figura 3.2 Sistemul construit 21

Figura 3.3 Sistemul de coordonate carteziene xOy 21

Figura 3.4 Detalii 22

Figura 3.5 Componente printate 3D. a, c – suporți tije orizontale; b – suport seringă 22

Figura 3.6 Componente printate 3D. a – [anonimizat]; b – [anonimizat] 23

Figura 3.7 Cutia în faza de proiectare 3D 24

Figura 3.8 Fixare xOy 24

Figura 3.9 Axa Oz: a – partea inferioară; b – partea superioară 25

Figura 3.10 Cutia rezultată 26

Figura 3.11 Arduino Mega 2560 27

Figura 3.12 Ramps 1.4 29

Figura 3.13 Ramps 1.4 – soclu pentru driver 29

Figura 3.14 Ramps 1.4 conectat cu restul sistemului 30

Figura 3.15 Modul Bluetooth HC-O5 30

Figura 3.16 Modul Bluetooth HC-O5 – configurația pinilor 31

Figura 3.17 [anonimizat]-pas bipolar 31

Figura 3.18 [anonimizat]-pas – Nema17 32

Figura 3.19 Driver A4988 32

Figura 3.20 Ansamblu seringă 33

Figura 3.21 Driverul motorului de curent continuu 34

Figura 3.22 Releu 34

Figura 3.23 Conectarea releului 35

Figura 3.24 Sursă de alimentare 35

Figura 4.1 Arduino Uno și drivere A4988 39

Figura 4.2 Sistem printare 2D 39

Introducere

Scopul proiectului

Originea dezvoltării proiectului Construirea și comanda unei bioimprimante 3D este reprezentată de necesitatea actuală a [anonimizat].

[anonimizat], s-a studiat intens cultura celulelor în formă bidimensională. Incapacitatea acestora de a reproduce anatomia sau fiziologia unui țesut pe care să se poată efectua studii relevante, a dus către abordarea și expertiza multidisciplinară în folosirea și celei de-a treia dimensiuni. Investigarea celei de-a [anonimizat], și a [anonimizat], absorbția nutrienților și eliminarea resturilor nefolositare. O data cu îmbunătățirea sistemelor de culturi 3D (tridimensionale), [anonimizat]-culturi și integrarea celulelor stem. Obiectivele dezvoltării sistemelor 3D [anonimizat]-ul medicamentelor .[1]

[anonimizat]-[anonimizat]. [anonimizat], în sensul că aceasta nu își mai poate îndeplini funcțiile specifice, se numără arsurile, cicatricile apărute în urma unor accidente sau operații chirurgicale și diversele boli dermatologice, printre care și cancerul de piele. O altă situație reprezentativă este dorința permanentă de a îmbunătăți produsele din industria cosmetică și cea farmaceutică, caz în care se impune cercetarea interacțiunii dintre un tip specific de piele și diverse substanțe chimice.

În speranța că se va găsi un echivalent al pielii funcționale, cât mai apropiat de varianta ideală, de-a lungul timpului, au fost explorate diverse biomateriale și tehnici de obținere. Biologi, chirurgi și ingineri în știința materialelor, lucrând împreună, reușesc să obțină îmbunătățiri permanente în procesele de reparare și regenerare a pielii, dar nu s-a ajuns încă la un substitut care să se încadreze în criterii precum biocompatibilitea, imunocompatibilitatea, buna vascularizare în vederea prelungirii perioadei de viață a celulelor, proprietăți mecanice asemănătoare pielii reale sau evitarea apariției cicatricilor.[2] În paralel cu cercetarea și dezvoltarea unui echivalent al pielii, au avansat și ingineria țesuturilor și medicina regenerativă.

Pielea umană poate să asigure transportul, din exterior, de substanțe, precum medicamentele și reactivii, către nivelul local, cât și către întregul organism, transport transdermal. Din dorința de a studia proprietăți ale pielii ca: permeabilitatea, corozivitatea, iritarea, toxicitatea, biochimia, metabolismul și farmacologia celulară, în cadrul laboratoarelor academice s-a reușit obținerea propriilor modele ale echivalentului pielii.[3]

O combinație promițătoare, în ceea ce privește regenerarea pielii, pare a fi cea dintre celulele stem, materialele inteligente, vascularizare și bioimprimare.[2]

Scopul principal al acestui proiect îl reprezintă realizarea unui prototip de bioimprimantă 3D, idee ce a luat naștere în cadrul Institutului Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Științe Biologice. Întrucât pot apărea confuzii, e de precizat că termenul de bioimprimare face referire la produsul rezultat în urma imprimării și nu la faptul că sistemul dezvoltat este construit din componente biologice.

Procesul de bioimprimare 3D a celulelor are ca obiectiv construirea unor structuri tridimensionale (3D) de celule, din blocuri de construcție, numite biocerneală, capabile, ulterior, să genereze țesuturi sau organe. Aceste structuri se pot obține prin plasarea blocurilor de construcții, de către bioimprimantă, în locații ce urmăresc cu strictețe o arhitectură precisă.

Cerința principală a INCDSB este ca, uilizând celule de piele aflate în colagen, aplicația dezvoltată să permită modelarea unei forme date, de dimensiuni cunoscute, cu o viteză precizată și să le ofere celulelor condițiile necesare supraviețuirii pe parcursul procesului de imprimare.

Imprimarea celulelor se face într-un vas Petri, cu diametrul de 3 cm, printr-un proces aditiv. Cantitatea maximă de substanță a unui ciclu complet de imprimare s-a ceut a fi de 5 ml. În vederea protejării și evitării stresării celulelor, seringa utilizată trebuie încărcată înaintea introducerii în imprimantă.

Condițiile minime pe care mediul din interiorul imprimantei trebuie să le îndeplinească sunt: menținerea unei temperaturi de 37°C și sterilizarea incintei. Pentru asigurarea unei performanțe ridicate a imprimantei, e recomandat și controlul umidității aerului și al cantităților de dioxid de carbon și oxigen.

Putem observa ușor asemănarea funcțiilor cerute cu cele îndeplinite de imprimantele 3D existente. O imprimantă 3D este un tip limitat de robot industrial, fiind un sistem alcătuit din elemente de mecanică, senzori, actuatori și un mecanism de direcționare.[4] Partea mecanică determină structura și posibilitățile de mișcare. Senzorii și actuatorii permit interacțiunea cu mediul, informațiile acestora fiind maipulate de mecanismul de direcționare, care comandă motoarele.

Partea de hardware, tipul de cerneală, biocerneală, și materialul pe care se printează, biomaterial, sunt cele trei componente majore ale bioimprimantelor, similare cu cele ale imprimantelor 3D obișnuite. În capitolul următor sunt descrise amănunțit conceptele de bioimprimantă, biocerneală, biomaterial.

1.2 Rezumatul lucrării

În cadrul lucrării Construirea și comanda unei bioimprimante 3D , în partea teoretică, sunt dezvoltate noțiunile de bioimprimare, biocerneală, biomaterial cu referire, în special, la piele. Partea teoretică cuprinde și caracterizări ale componentelor utilizate în construirea părții practice, relevante pentru acest proiect, deoarece e nevoie de înțelegerea funcționării lor independente, pentru a se putea ajunge la înțelegerea funcționării întregului sistem.

Plecând de la necesitate găsirii unui echivalent al țesuturilor și organelor funcționale, s-a ajuns la explorarea bioimprimantelor 3D. Crearea unui prototip de bioimprimantă 3D este chiar scopul principal al proiectului. Capitolul 1. Introducere prezintă, pe lângă acest rezumat al lucrării, obiectivele principale pe care sistemul construit trebuie să le îndeplinească.

Capitolul 2. Stadiul actual în domeniu este compus din patru subcapitole ample.

Primul subcapitol, 2.1 Pielea, oferă o imagine clară asupra componenței și strcturii pielii umane.

Următorul subcapitol, 2.2 Biomaterialul și biocerneala, oferă descrie biomaterialul, colagenul și biocerneala, materialul pe care această aplicație îl va folosi în procesul de bioimprimare.

În 2.3 Evoluția bioimprimantelor 3D sunt prezentate: istoricul bioimprimantelor, tipuri și caracteristici ale acestora și descrierea unei bioimprimante 3D care printează deja piele. Deși este o tehnologie apărută recent, se poate observa că bioimprimarea s-a dezvoltat foarte rapid.

Subcapitolul 2.4 Vedere asupra apariției tehnologiei bioimprimării 3D enumeră câteva idei în legătură cu dezvoltarea acestei tehnologii, văzute din punctul actual al dezvoltării bioimprimării 3D.

Capitolul 3. Prezentarea aplicației dezvoltate, pe lângă informațiile tehnice ale componentelor utilizate, explică utilitatea lor în cadrul sistemului. Așa cum am precizat în 1.1 Scopul proiectului, partea hardware a bioimprimantei 3D este similară unei imprimante 3D obișnuite.

Subcapitolul 3.1 Sursa principală de inspirație prezintă cateva informații legate de imprimanta 3D, Prusa i3, al cărei ghid de asamblare e gratuit și disponibil pe internet, fiind ușor accesibil oricui.

Sucapitolul 3.2 Construirea bioimprimantei 3D descrie pașii parcurși pentru constuirea unei bioimprimante. În cadrul acestui subcapitol sunt detaliate Grade de libertate, din punct de vedere mecanic ale acestui sistem. Tot aici, sunt enumerate Componentele din structura bioimprimantei, obținute prin tehnologia de printare 3D. Secțiunea Cutia și pașii de asamblare descrie asemenea unui kit, pașii construirii întregului sistem.

Subcapitolul 3.3 Comanda bioimprimantei 3D, în vederea evidențierii comenzilor existente în acest proiect, prezintă informații relevante ale componentelor electronice și electromecanice care intră în alcătuirea bioimprimantei 3D. Acestea sunt: Arduino Mega 2560 și Arduino IDE, Ramps 1.4, Modulul Bluetooth HC-05, Driverul A4988 și motoarele pas cu pas, Driverul TB6612FNG și motorulul de curent continuu, Releu SSR 12VDC, Termistorii și patul încălzit și Sursa de alimentare.

Subcapitolul 3.4 Modul de funcționare al bioimprimantei 3D dezvoltă cele două mari matode de comunicare între programul scris în Arduino IDE și utilizatorul bioimprimanei 3D. O metodă se bazează pe Interacțiunea prin Bluetooth și cealaltă pe Interacțiunea prin Arduino IDE.

Capitolul 4.Experimente, rezultate și discuții scoate în evidență provocările apărute în decursul realizării bioimprimantei 3D. Prima parte a capitolului, 4.1 Experimentele și rezultatele utilizării altor componente expune pașii auxiliari care au contribuit la obținerea bioimprimantei 3D în forma actuală. A doua parte a capitolului, 4.2 Atenționări, este o însumare a unor piedici apărute, puse sub formă de atenționări sau recomandări.

În încheierea lucrării, capitolul 5.Concluzii, înșiruie caracteristicile rezultatului final obținut. Subcapitolul 5.1 Avantajele și dezavantajele aplicției dezvoltate cuprinde prezentarea detaliată a rezultatelor, iar subcapitolul 5.3 Posibilități de îmbunătățire, alături de secțiunea Realizarea unui algoritm pentru imprimarea unei imagini 3D, descrie pași care ar putea fi urmați, pentru ca sistemul construit să ajungă să performeze.

Stadiul actual în domeniu

2.1 Pielea

Figura . Structura pielii umane [4]

Pielea este învelișul neîntrerupt și neuniform al corpului uman. Caracterul neuniform al pielii se datorează cutelor, proeminențelor și orificiilor.

Pielea are în compoziția sa un număr mare de receptori care îi determină un rol multiplu. Astfel, pe lângă depozitarea de rezerve energetice ale organismului și rolul de barieră anatomică între mediul intern și mediul extern, îl protejează de leziuni mecanice, patogeni, microorganisme și substanțe toxice, ia parte la secretarea unor produse finale ale metabolismului și la procesele fiziologice de termoreglare, respirație, vindecare.[3]

Pielea reprezintă o cale de introducere a substanțelor în organism. Sunt sugerate două căi principale de acces. Una dintre căi este cea prin stratul cornos, la nivelul căruia substanțele urmează ruta intercelulară și/sau intracelulară, apoi prin epiderma viabilă și dermă, unde are loc difuziune/divizare substanțelor. O altă cale de penetrare a substanțelor este cea a difuziei prin spațiul dintre foliculii de păr sau glandele sudoripare, și epidermă, respectiv dermă.[3]

Absorbția percutanată a apei, a electroliților, a medicamentelor (ex.: unguente, creme) și a altor substanțe este maximă prin orificiile foliculare. Orificiile foliculare fac parte din categoria orificiilor mici, alături de orificiile glandelor sudoripare ecrine.[4]

Structura pielii

Pielea este alcătuită în straturi, așa cum se poate observa și în Figura 2.1 Structura pielii umane [4], grupate în două categorii principale, de la exterior spre interior: epiderma și derma.

Epiderma este stratul cu celule aflate într-o continuă proliferare. Aceasta este compusă mojoritar din keratinocite, celule provenite din cel mai profund strat al epidermei, stratul bazal, generator. O dată cu divizarea keratinocitelor, celulele fiice se deplasează spre exterior. Ajunse în stratul spinos, format din 6-15 rânduri de celule spinoase, celulele încep să se încarce, treptat, cu keratină și să se turtească. În stratul granulos, celulele înglobează granule de keratohialină. Urmează stratul lucid, subțire și translucid, compus din celule moarte.

Ultimul strat, stratul cornos e compus din celule moarte, fără nuclee și organele, denumite corneocite. Oferă cea mai semnificativă contribuție în ceea ce privește funcția de permeabilitate a pielii.[4]

Celule importante, cu rol funcțional, care intră în alcătuirea epidermei, sunt și celulele Langerhans, din stratul spinos, și corpusculii senzoriali Merkel-Ranvier, din stratul bazal. Corpusculii Merkel-Ranvier sunt celule receptor ovale. Celulele Langerhans contribuie la răspunsul imunologic al pielii.[3]

Melanocitele sunt celule care se găsesc în stratul bazal și produc melanină. Melanina secretată contribuie la nivelul de pigmentare al pieii și la protejarea celulelor împotriva razelor ultraviolete.[4]

Membrana bazală are în alcătuirea sa un strat, mojoritar compus din colagen de tip IV. Funcția de filtru selectiv pe care o deține, presupune identificarea substanțelor din dermă care sunt necesare nutriției epidermei.[4]

Derma e compusă din stratul superficial subepidermic și stratul profund. Stratul subepidermic e alcătuit, la rândul său, din papilele dermice și stratul subpapilar. Stratul profund, dermă sau corion, are o grosime mai mare și rezistență, elasticitate și flexibilitate crescute, în cosistența sa dominând fibrele colagenice, elastice și reticulare (a se vedea Figura 2.2 Colagenul și elastina din dermă [5]).[4]

Figura . Colagenul și elastina din dermă [5]

Fibrobrastul, macrofagele și adipocitul sunt cele trei tipuri principale de celule prezente în dermă. Fibroblastul produce colagen, fibre elastice, glicoproteine și glicozaminoglicani.[3]

În structura pielii intră și componente cu diferite funcții, anexe epidermei și dermei. Glandele sudoripare reglează temperatura corpului prin secreția transpirației. Glandele sebacee secretă sebum pentru a asigura hidratarea pielii și a părului. Foliculii de păr joacă un rol important în vindecarea rănilor, prin faptul că reprezintă o sursă de proliferare a keratinocitelor în timpul reepitalizării. Mușchii arectori pilli au capacitatea de a ridica firul de păr. Unghiile protejează falangele distale.[3]

Provocări în reproducerea pielii

Există farte mulți pacienți, victime ale arsurilor sau ale accidentele auto, a căror viață depinde de regenerarea pielii. Pulverizarea de celulele, fie keratinocite, fie celule stem, a dus, în multe cazuri, la rezultate nefavorabile. Deși s-a reușit reproducerea configurației histologice a pielii, acceptarea unui astfel de model, de către rană, este îndoielnică datorită vascularizării întârziate.[6]

Conform articoului lui Z. Zhang și B. B. Michniak-Kohn, “Tissue Engineered Human Skin Equivalents”, din 2012, utilizându-se tehnici de inginerie a țesuturilor, s-a reprodus pielea, ca organ, dar nu îndeplinește suficient de bine rolul de barieră. O provocare în obținerea pielii funcționale o reprezintă regenerarea foliculilor de păr, a glandelor sebacee, a nervilor și a vaselor de sânge.[3]

2.2 Biomaterialul și biocerneala

Biomaterialul

Pentru evitarea confuziilor, trebuie precizat, mai întâi, faptul că biomaterialul nu este același cu materialul biologic, care e produs de un sistem biologic (ex.: Pielea, sângele).[4]

Știința biomaterialelor sau ingineria materialelor, este într-o creștere puternică și continuă. Este o ramură multidisciplinară a știintei, care implică medicina, biologia, chimia, ingineria țesuturilor și știința materialelor.[4]

Un biomaterial este o substanță proiectată să interacționeze cu sistemele biologice și poate fi găsit în natură sau sintetizat în laborator. Proprietatea principală a unui biomaterial este biocompatibilitatea cu aplicația obiectiv, acesta fiind special conceput pentru un caz anume. Biocompatibilitatea unui material nu se poate generaliza.[4]

Autograftul, alogrefa sau xenografa sunt biomateriale de transplant. Biomaterialul poate servi și eliberării prelungite a unui medicament, prin introducerea, în corp, a unuei strcturi impregnate cu substanțe.[4]

Colagenul

Figura . Colagen, fibroblat, elastină [7]

Colagenul este cel mai întâlnit polimer din organismul uman și cea mai abundentă proteină din matricele extracelulare ale multor țesuturi. Este util datorită proprietăților mecanice. Matricea organică a osului și a dentinei, dar și o mare parte din tendoane și ligamente sunt alcătuite din colagen. Pielea, corneea, vasele de sânge și cartilajele au în structura lor o cantitate semnificativă de colagen.[4]

O matrice extracelulară, ECM, este formată din molecule secretate de celule care oferă suport structural și biochimic celulelor mediului în care se află. Datorită divesității celulare, compoziția matricei diferă. Funcțiile principale ale acesteia sunt aderența celulară, comunicarea dintre celule și diferențierea celulară. Conținutul său este compus din apă și fibre, de colagen sau elastină (Figura 2.3 Colagen, fibroblat, elastină [7]).[4]

Supus unor anumite condiții fiziologice, colagenul formează hidrogelul. Degradarea prin hidroliză acidă sau bazică a triplu-helixului colagenului are ca rezultat formarea gelatinii. Gelatina este o proteină care își modifică consistența o dată cu temperatura. În urma răcirii gelatinei, sub 30°C, se obține hidrogelul.

Colagenul este potrivit încapsulării celulelor datorită proprietății acestuia de a stimula adeziunea celulară. Într-un experiment, a fost ultilizat amestecul de neuroni embrionari de șobolan cu colagen neutralizat și în urma incubării la 37°C s-a format hidrogel.

Colagenul este folosit des în ingineria țesuturilor și medicina regenerativă. Întrebuințarea în aceste domenii este potrivită deoarece e posibilă prevenția lichefierii gelatinii la temperatură fiziologică, iar prezența secvențelor RGD (acid Arginyl-Glycyl-Aspartic) îi oferă gelatinii caracter bio-interactiv.[8]

Biocerneala

Biocerneala este un material cu caracter lichid, obținută din celule vii în suspensie, care trebuie să poată fi încărcată într-un cartuș personalizat, împreună cu un gel denumit bio-hârtie (bio-paper). Biocerneala intervine în asigurarea caracteristicilor mecanice și în menținerea vitalității celulelor din produsul bioimprimat 3D.[9]

Alături de celule, în compoziția biocernelii se află hidrogelurile. Hidrogelurile sunt un foarte bun imitator al matricii extracelulare, fiind compuse preponderent din apă și având toxicitatea redusă.[9]

Proprietatea importantă a biocernelii, care variază în funcție de temperatură, concentrația și greutatea moleculară a polimerului, este viscuozitatea. Cu cât crește viscozitatea, cu atât crește și riscul leziunilor celulare în timpul bioimprimării.[9]

2.3 Evoluția bioimprimantelor 3D

Bioimprimarea 3D este văzută ca o tehnică aditivă de producție prin care celule și biomateriale sunt depozitate simultan. Prin această tehnică se poate înlocui procedura manuală de însămânțare a celulelor, dovedită ca fiind o provocare pentru ingineria de țesuturi bazată pe schelete clasică. Un alt beneficiu rezultat din bioimprimarea 3D este posibilitatea plasării, diferitelor tipuri de celule, într-o locație precisă și obținerea unor densități ridicate ale celulelor inițiale.[9]

Pentru a reuși bioimprimarea 3D unui țesut, este nevoie de cunoașterea proprietăților matricei bioimprimate de hidrogel și de identificarea paramerilor, cum ar fi: geometria și densitatea celulară, care pot influența dezvoltarea țesutului sau maturizarea lui.[9]

Istoricul bioimprimării

Conform site-ului 3D SYSYEMS, în 1983, Chuck (Charles) Hull creează prima componentă imprimată 3D, inventând Stereolitografia, tehnologie care poate transforma datele dintr-un computer, într-un obiect tangibil.[10]

În 1996, Dr. Gabor Forgacs, fondatorul companiei Organovo, a observat cum celulele se lipesc între ele în timpul dezvoltării embrionare și se mișcă împreună, în grămezi, părând să aibe proprietăți asemănătoare lichidelor.

În 2003, a fost modificată imprimanta cu jet de cerneală astfel încât să poată imprima proteine și celule.[11]

În 2004, Dr. Gabor Forgacs, dezvoltă un țesut tridimensional compus numai din celule, fără ajutorul vreounui schelet.

În 2009 – 2010, Organovo a lansat prima bioimprimantă, denumită NovoGen MMX Bioprinter. Aceasta printează vase de sânge utilizând o cultură de celule care aparțin unei singure persoane.

În 2010, Centrul Laser din Hannover, Germania, a imprimat cu succes celule de piele, prin tehnologie laser, în speranța că acestea se vor putea utiliza, în viitor, în înlocuirea țesuturilor.[12]

Tot Centrul Laser din Hannover, Germania, în 2011, a creat grefe de piele din celule stem și a obținut celule specifice țesuturilor osos și cartilaginos.[13]

Din 2011, Organovo începe să încheie parteneriate cu corporații din domeniul descoperirii de medicamente [14], oferindu-le acestora modele ale unor boli, imprimare 3D, din celule umane.

În 2013, cercetătorii scoțieni au imprimat celule stem embrionare umane.[15]

În 2015, Organovo s-a angajat în dezvoltarea pielii bioimprimate 3D.[14]

În 2016, în Spitalul St Vincent din Melbourne, au fost bioimprimate 3D schelete din biomateriale, în scopul facilitării dezvoltării de cartilaje din celule stem adipoase.[16]

În 2017, tot în Melbourne, a fost implementată și testată, pe o oaie, prima versiune mobilă a bioimprimantelor 3D, Biopen. Această bioimprimantă coaxială, face posibilă aplicarea, in situ, pe cartilagii, a unui material format din celule stem, de consistența unui gel. Celulele implantate astfel, permit o reparare naturală a țesutului.[17]

Bioimprimarea 3D

Bioimprimarea 3D reprezintă procesul de creare a unui model din celule vii, utilizând tehnologii de imprimare 3D, în urma căruia calitatea celulelor nu este alterată. Cea mai des întâlnită metodă de depozitare a metrialului, cunoscut sub denumirea de biocerneală, este cea strat-cu-strat. Structura astfel creată, similară unui țesut real, este utilizată în domeniul medical și în cel al ingineriei țesuturilor.[4]

Bioimprimarea de țesuturi și organe este acum însoțită și de imprimarea scheletelor. Acestea au rolul de a interveni în procesul de regenerare a ligamentelor și articulațiilor.[4]

Utilizarea celulelor umane autologe (care provin de la acelși individ) în construcția țesuturilor și a organelor, din punct de vedere teoretic, asigură un micromediu similar țesuturilor și organelor reale, din interiorul organismului, iar individual, celulele dintr-o construcție 3D, au parte de un micromediu similar celui din țesutul real din corp.[18]

Oportunitatea evidentă ce reiese din cele de mai sus, este posibilitatea experimentării efectelor medicamentelor in vitro, în țesuturi sau organe vii, eliminându-se varianta testării acestora direct pe oameni sau pe animale.[18]

Abordări ale bioimprimării

Există trei categorii de abordare a bioimprimării. Prima poartă denumirea de biomimicry. Aceasta se bazează pe crearea unor structuri identice celor naturale, prin duplicarea formei și a micromediului organelor și țesuturilor. Țesuturile sunt replicate la o scară micro pentru a putea fi îndeplinite criteriile de asemănare, atât la nivel celular, cât și extracelular. Biomimicry implică necesitatea înțelegerii micromediului și natura forțelor biologice care acționeză în cadrul lui, a organizării precise a celulelor de tip funcțional și a celor de tip suport, a factorilor de solubilitate, și a compoziției matricei extracelulare.[4]

Auto-asamblarea este o altă caregorie de abordare a bioimprimării, care consideră celula ca fiind factorul fundamental al histogenezei. Această abordarare copiază procesul fizic al dezvoltării embrionare a țesuturilor. Fiind într-o fază inițială de dezvoltare, celulele dețin capacitatea de a-și crea propriul bloc de matrice extracelulară, sistemul de semnalizare celulară, și de a se poziționa în spațiu în așa fel încât să fie asigurate funcțiile biologice și microarhitectura țesutului. Pentru acestă abordare a bioimprimării unui țesut, este necesară înțelegerea modului dezvoltării mecanismelor țesuturilor embrionare, dar și a micromediului înconjurător.[4]

Mini țesut este abordarea bioimprimării care le combină pe celelalte două, biomimicry și auto-asamblarea. Componentele funcționale foarte mici, care alcătuiesc țesuturile, sunt prelucrate și aranjate într-o formă dorită. Abordarea este desompusă în două stategii. Una dintre ele este cea prin care sferele celulare auto-asamblate sunt aranjate în țesuturi mari, printr-un design natural, folosit pe post de ghid, iar cealaltă permite auto-asamblarea după ce a fost realizată o reprodcere a țesutului, conform unui design calitativ și precis.[4]

Etapele bioimprimării

Prima etapă a procesului complet de bioimprimare, din cele trei existente, este pre-bioimprimarea. Aceasta include pregătirea modelului și a materialului ce urmează a fi imprimat. În cadrul acestei etape este realizată biopsia țesutului țintă, urmată de aplicarea uneia dintre tehnicile de rezonanță magnetică nucleară sau tomografie computerizată, prin care să se obțină imagini relevante în stabilirea modelului structurii pe care o va avea obiectul imprimat. Metoda de bioimprimare strat-cu-strat se folosește de o suprapunere de imagini 2D. După imprimare unei astfel de imagini 2D, unele celule sunt izolate, multiplicate și amestecate cu un material aflat în stare lichidă, special conceput să poată furniza oxigen și alți nutrienț, asigurând supraviețuirea celulelor. În unele procese, celulele sunt încapsulate în sferoizi celulari.[4]

Următoarea etapă este bioimprimarea. Ea implică plasarea unor anumite cantități de amestec lichid de celule și nutrienți, care se află în cartușul imprimantei, în puncte bine precizate, conform modelului elaborat în etapa precedentă. Rezultatul imprimării este un pre-țesut. Acesta este pus într-un incubator pentru a se maturiza.

Una dintre problemele cu care se confruntă bioimprimarea 3D a organelor este necesitatea creșterii a miliarde de celule. O altă problemă apărută, în cazul ficatului și a rinichilor bioimprimați 3D, o reprezintă lipsa unor vase de sânge funcționale, a tubulilor pentru colectarea urinii, elemente ce conduc la imposibilitatea asigurării corespunzătoare de substanțe nutritive și oxigen, în miezul organelor. Pentru că țesuturile din organismul uman sunt compuse din diferite tipuri de celule, au fost abordate diverse tehnologii de imprimare a fiecărui tip de celulă. Fiecare tehnologie dorește să asigure stabilitatea și viabilitatea celulelor pe parcursul întregului proces de imprimare. Metode de bioimprimare 3D sunt: fotolitografia, bioimprimarea magnetică, stereolitografia și extrudarea directă a celulelor.[4]

Ultima etapă a procesului de bioimprimare 3D, post-bioimprimarea, e menită să asigure stabilitatea structurii create, pentru a înlătura riscurile alterării obiectului imprimat 3D. Este astfel aplicată stimularea mecanică și chimică, stimulări care controlează remodelarea și creșterea țesutului.[4]

Recenta apariție a bioreactoarelor a dus la maturizarea mai rapidă a țesuturilor, vascularizarea lor și la abilitatea de a supraviețui transplanturilor. Funcțiile pe care le poate îndeplini un bioreactor sunt: transportul convectiv de nutrienți, crearea unui mediu de microgravitație, schimbarea presiunii sau adăugarea compresiei, pentru încărcarea dinamică sau statică.[4]

Rezultate ale bioimprimării

Figura . Țesut de piele: (A, B) imprimat, (C, D) însămânțat [18]

Analizând Figura 2.4 Țesut de piele: (A, B) imprimat, (C, D) însămânțat [18], se observă că, după șapte zile, țesutul de piele bioimprimat 3D, (A, B), își păstrează forma, atât din punct de vedere geometric, cât și dimensional. Țesutul însămânțat, (C, D), structurat manual, se micșorează semnificativ și își pierde foma inițială.[18]

O construcție a pielii, in vitro, a fost obținută de Lee. Acesta a utilizat celule de tipul keratinocitelor, care au format epiderma, fibroblast, care a alcăit derma, și colagen, care a compus matricea extracelulară a pielii (Figura 2.4 Țesut de piele: (A, B) imprimat, (C, D) însămânțat [18]). În urma examinărilor: histologice, biochimice, microscopice optice și de fluorescență, ale pielii imprimate 3D, s-a constatat similaritatea morfologică și biologică cu pielea reală.[18]

Tehnologia LIFT (laser-induced forward transfer), a transferului laser indus înainte, a fost folosită de Koch pentru depozitarea celulelor vii, aflate în biocerneală. Tot celule de tipul keratinocitelor și a fibroblastului au compus straturile pielii. Koch a introdus și celule stem mezenchimale cu scopul diferențierii acestora în alte celule utile.[18]

Organovo bioimprimă structuri alcătuite din celule umane. Ele imită, in vitro, diverse aspecte biologice, cum ar fi micromediul, interacțiunea reciprocă dintre celule și factorii micromediului și stimularea matricei extracelulare a țesutului original, incluzând electroliții extracelulari. Țesutul uman rezultat din bioimprimanta exVive3DTM, lansată în 2014, de Organovo, poate reduce riscul eșecurilor și costurile din domeniul dezvoltării terapeuticii sau a medicamentelor. Experimentarea efectelor medicamentelor, in vitro, pe țesuturi umane 3D imprimate, face posibilă asigurarea datelor specifice țesutului uman, înaintea inițierii studiilor clinice pe oameni.[18]

Ficatul este locul inițial în care are loc metabolizarea multor substanțe endogene, cum ar fi hormonii, și exogene, cum sunt xenobioticele. Ficatul rezultat din exVive3DTM (Organovo, 2014) și compus din heparocite, celule hepatice stelate și celule endoteliale este capabil să secrete o cantitate de proteine importante ca: fibrinogenul, albumina și transferina, proporțională cu nivelurile din ficat. Într-un interval noamal, relativ la întregul ficat, se încadrează și nivelurile secretate de ATP și lactat dehidrogenază. Astfel, acest model de ficat poate reprezenta un bun obiect de studiu în cercetarea căii metabolice a diverse substanțe endogene și exogene.[18]

Bioimprimarea 3D în România

Symme3D, în colaborare cu OncoGen (Centrul de Terapii Genice și Celulare în Tratamentul Cancerului), a lansat la târgul MedTec Europa, Stuttgart, Symme3D Biotech One, o bioimprimantă 3D menită să printeze nenumărate tumori canceroase pentru domeniul cercetărilor medicale. Tehnologia utilizată elimină riscurile de contaminare sau necrozare a culturilor vii de celule.[19]

Cea mai recentă bioimprimantă 3D pentru piele

În 2016, un grup de oameni de știință spanioli, au construit prototipul unei bioimprimante 3D care tipărește piele umană total funcțională. Aceștia au publicat și un articol, în care oferă prima demonstrație a capacității tehnologiei de imprimare 3D a pielii umane.[20]

Pielea rezultată este compusă din epidermă și dermă, asemenea pielii reale. În producerea ei, s-au folosit numai de celule și componente umane. Sunt în așteptare aprobările, de la diverse instituții abilitate, în vederea efectuării primul implant. Acestă piele este printre primele organe umane, create prin tehnologia bioimprimării, care va fi pusă pe piață.[20]

Conform lui Juan Francisco del Cañizo, de la Spitalu Universitar General Gregorio Marañón și a cercetătorilor de la Universitatea Complutense de Madrid: "Știind cum să amesteci componentele biologice, în ce condiții să lucrezi cu ele în așa fel încât celulele să nu se deterioreze, și cum să depozitezi produsul, corect, este critic pentru sistem." [20]

Tehnici de bioimprimare 3D

Cele patru tehnici principale de bioimprimare 3D sunt: cu jet de cerneală, orificiu liber, prin extrudare și gel-în-gel. Fiecare funcționeză conform propriului set de cerințe ideale. Aceste cerințe iau în cacul proprietățile biocernelii, în vederea obținerii obiectului 3D proiectat, la rezoluția dorită, și compus din celule viabile.

Figura . Tipuri de imprimare în funcție de proprietățile materialului [9]

Figura 2.5 Tipuri de imprimare în funcție de proprietățile materialului [9] este o reprezentare schematică a celor mai întâlnite tehnici și subtehnici de bioimprimare, și a proprietăților biocernelii potrivite.[9]

2.4 Vedere asupra apariției tehnologiei bioimprimării 3D

Opiniile din această secțiune sunt dezvoltate pe baza stadiului actual din domeniul tehnologiei de bioimprimare 3D.

Ideea de la baza dezvoltării tehnologiei bioimprimării 3D este de a recrea o parte dint-un om. Conform tuturor religiilor, omul este creația lui Dumnezeu. Posibilitate aceasta, nou apărută, de a recrea ce a creat Dumnezeu, este identificată, de către credincioși, cu încercarea omului de a-l înlocui pe Dumnezeu, lucru inacceptabil. Pentru că toate lucrurile descoperite până în acest moment, duc către convingerea că, peste o perioadă, nu foarte mare, de timp, o parte semnificativă a corpului uman va avea un echivalent artificial, conflictele dintre știință și religii se vor intensifica. Soluția pe care o găsesc, privind încetarea acestor conflicte, este reinterpretarea textelor religioase și actualizarea lor.

Cantitatea de informații strânse, de-a lungul a mii de ani, pare a nu fi suficientă înțelegerii tuturor proceselor din natură. Producerea țesuturilor prin bioimprimare 3D nu este un proces natural. Deși, în primă instanță, un astfel de țesut implantat va părea că funcționează perfect, în timp, datorită acelor informații nedescoperite încă, este posibilă ivirea unor urmări grave.

Răspândirea masivă a bioimprimantelor 3D și posibilitatea tot mai extinsă a realizării, cu succes, a transplanturilor, ar putea da naștere unei piețe negre de organe, organe care ar fi mult inferioare calitativ celor din centrele avizate.

O dată cu avansarea în domeniul medicinei, va crește și durata medie de viață a oamenilor. În cazul dat, se va mări și numărul populației, de pe glob, dacă nu se vor aplica măsuri pentru controlul acestui număr. Cum resursele Pamântului sunt limitate, se poate lua în calcul șansa epuizării lor.

Mai devreme sau mai târziu, vor apărea oamenii bionici. În construirea lor vor trebui aplicate cât mai multe măsuri de protecție, pentru a excude posibilitatea scăpării acestora de sub control.

O ipoteză privitoare la viitorul îndepărtat, este prelungirea vieții oamenilor cu posibilități financiare, cu foarte mulți ani, prin înlocuirea succesivă a organelor și a țesuturilor.

Prezentarea aplicației dezvoltate

3.1 Sursa principală de inspirație

Se observă ușor că structura hardware a unei bioimprimante 3D este, în mare parte, asemănătoare cu cea a unei imprimante 3D. În prezent, o multitudine de proiecte hardware sunt disponibile în regim Open Source, gratuite, puse la dispoziția tuturor utilizatorilor internetului. Folosirea unui astfel de proiect este avantajoasă datorită bunei documentări.

Figura . Prusa i3 MK2 [21]

Dezvoltarea acestui proiect a pornit de la adaptarea sistemului hardware al imprimantei 3D, Prusa i3 MK2 (Figura 3.1 Prusa i3 MK2 [21]), la cerințele impuse de Institutului Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Științe Biologice.

3.2 Construirea bioimprimantei 3D

Construirea bioimprimantei 3D din cadrul prezentului proiect, constă într-un șir de operații de asamblare a unor elemente mecanice și electromecanice, componente electronice și auxiliare, acestea din urmă având rol de suport pentru primele categorii.

Pentru construirea sistemului, pe lângă componentele care intră în alcătuirea lui, sunt necesare și câteva unelte: o șurubelniță de 3mm, cu vârf drept, mecanică și/sau electrică, o cheie imbus de 3mm, o ruletă, un letcon (de preferabil să permită o temperatură cât mai mare de topire), un multimetru, o aplicție pentru măsurarea înclinărilor unghiulare, în vederea calibrării manuale a sistemului. Pe lângă acestea este nevoie de fire mamă-mamă și mamă-tată, de lungimi variabile (între 10 și 40 cm), și de fludor.

Figura . Sistemul construit

Grade de libertate, din punct de vedere mecanic

Tehnica de bioimprimare 3D, dezvoltată în cadrul acestui proiect, este extrudarea, iar metoda de bioimprimare 3D este cea strat-cu-strat. Astfel, pentru a face posibilă bioimprimarea 3D, sistemul, din punct de vedere mecanic, are patru grade de libertate. Trei grade de libertate sunt rezervate obiectului bioimprimat, văzut ca un obiect tridimensional. Un grad de libertate corespunde axei pe care se deplasează pistonul seringii.

Figura . Sistemul de coordonate carteziene xOy

În Figura 3.3 Sistemul de coordonate carteziene xOy apar două dintre axele ce caracterizează modelul bioimprimat: Ox și Oy. Acestea sunt suficiente în cazul bioimprimării unui singur strat, deci a unui model bidimensional. Deoarece scopul proiectului e obținerea unui prototip, structura din figură este o soluție ieftină și destul de utilă.

Axa Oz se poate vedea în Figura 3.2 Sistemul construit. În alcătuirea ei intră cele două axe de ghidaj (Figura 3.4 Detalii – B) și două tije filetate (Figura 3.4 Detalii – A), dispuse în paralel, la distanțe egale față de axa imaginară de simetrie. Sunt folosiți rulmenți liniari (Figura 3.4 Detalii – C), în vederea micșorării gradului de frecare dintre axa de ghidaj și componenta de susținere (Figura 3.4 Detalii – D). Legătura între tija filetată și motor se face printr-un cuplaj elastic (Figura 3.18 Motor pas-cu-pas – Nema17 ). Acesta din urmă are și capacitatea de a minimiza uzura motorului, în momentul în care tija are tendința de a opune rezistență.

Figura . Detalii

Componente printate 3D

Figura . Componente printate 3D. a, c – suporți tije orizontale; b – suport seringă

Figura . Componente printate 3D. a – capăt inferior, axă Oz; b – capăt superior, axă Oz

Pentru a crea un sistem personalizat, este nevoie și de componente personalizate. Actualmente, acestea se pot produce ușor, ieftin și rapid prin tehnologia printării 3D. Pașii de obținere a unor astfel de obiecte, presupun modelarea tridimensională, exportarea într-un format de fișier standard (.stl), și felierea acestui fișier.

Replicarea harware a Prusa i3, include utilizarea obiectelor printate 3D, pentru care, în kitul de asamblare, sunt puse la dispoziție fișierele corespunzătoare, în format STL.

În construirea bioimprimantei 3D, sunt necesare numai o parte din componentele Prusa i3 și de o componentă cu rol de suport pentru seringă (a se vedea Figura 3.5 Componente printate 3D. a, c – suporți tije orizontale; b – suport seringă și Figura 3.6 Componente printate 3D. a – capăt inferior, axă Oz; b – capăt superior, axă Oz). Pentru confecționarea lor, e de preferat materialul PET-G, deoarece este un material rezistent și ieftin, care poate fi sterilizat.

Fișierele tuturor componentelor utilizate în construcția acestui sistem, se găsesc atașate în Anexă. Modificarea lor se poate face cu software-ul OpenSCAD. Acest program este open-source și permite realizarea modelelor prin comenzi scrise, asemenea AutoCAD-ului.

Cutia și pașii de asamblare

Figura . Cutia în faza de proiectare 3D

Construirea cutiei este ca un puzzle simplu, ca urmare a bunei proiectări (Figura 3.7 Cutia în faza de proiectare 3D) și poate începe imediat după tăierea laser a plăcilor utilizate.

Primul pas constă în lipirea piesele cu rol de suport a structurii din plexiglass, componentele roz din Figura 3.7 Cutia în faza de proiectare 3D.

Al doilea pas este asamblarea cutiei din placajul de 8mm, partea maro din model. În această cutie, la final, se depozitează componentele electronice ca sursa de alimentare și ansamblul Arduino-Ramps-Drivere-Modul Bluetooth.

Al treilea pas implică fixarea părții suport a cutiei, aplicarea unei benzi înguste de cauciuc, pe marginile libere, pentru asigurarea etanșeității incintei, și închiderea cutiei, prin placarea părților laterale. Tot la etanșeitate contribuie și utilizarea șaibelor cauciucate.

Figura . Fixare xOy

Pasul patru e reprezentat de fixarea patului încălzit, succedat de fixarea sistemului cartezian, xOy. E necesară introducerea distanțierelor dintre fundul cutiei, patul încălzit și placa suport din plexiglass pentru protejarea plexiglass-ului, deoarece la temperaturi înalte se poate deforma (Figura 3.8 Fixare xOy).

Figura . Axa Oz: a – partea inferioară; b – partea superioară

La pasul cinci se execută următoarele acțiuni:

se fixează motoarele Nema, conform Figura 3.9 Axa Oz: a – partea inferioară; b – partea superioară.;

se introduc rulmenții în spațiul din componenta printată 3D, laterală, și se fixează pe aceasta, piulița trapezoidală (Figura 3.4 Detalii – E);

se unește o axă de ghidaj, din cele două mai lungi, cu o tijă filetată, prin componenta laterală de mai sus;

se cuplează tija filetată cu motorul și se fixează axa de ghidaj în spațiul destinat;

se repetă procedeul și pentru cealaltă pereche;

se unesc axele de ghidaj, mai scurte, prin suportul pentru seringă și se cuplează cu partea verticală;

se fixează partea superioară a axei Oz, conform Figura 3.9 Axa Oz: a – partea inferioară; b – partea superioară.;

se adaugă sistemul de acționare al pistonului seringii.

În cadrul ultimului pas, se monteză balamalele și se pune ușița (Figura 3.10 Cutia rezultată). Tot aici, se reconstruiește rețeua electronică. Incinta comunică cu cutia de depozitare printr-o gaură destinată trecerii firelor.

Figura . Cutia rezultată

3.3 Comanda bioimprimantei 3D

Bioimprimanta 3D construită în cadrul acestui proiect, poate printa un model tridimensional prin executarea unei serii de comenzi. Aceste comenzi, sunt transmise elementelor electromecanice și electronice din componența sistemului, de la nivel software, prin intermediul platformei electronice Arduino.

Arduino Mega 2560 și Arduino IDE

Figura . Arduino Mega 2560

Arduino Mega 2560 (Figura 3.11 Arduino Mega 2560), cu microcontrollerul Atmega2560, poate fi considerat creierul bioimprimantei 3D dezvoltate, datorită capacității sale de a interacționa cu mediul. Deși oferta de microcontrollere și de platforme microcontroller e variată, Arduino este cel mai potrivit datorită costului mai mic de 50 de dolari, raportat la gama largă de întrebuințare, la diversitatea funcțiilor pe care le poate îndeplini. [22]

Schemele plăcuțelor Arduino sunt publicate sub licența Creative Commons, astfel, oricine poate modifica circuitele acestuia pentru a obține funcții noi sau pentru a le îmbunătăți pe cele existente.

Plăcuța Arduino Mega 2560 dispune de o conexiune USB cu un rol dublu: alimentare și comunicare. Comunicarea include încărcarea programelor dedicate și interacțiunea cu ele în timpul rulării. Alimentarea este selectată automat, în lipsa unei surse de alimentare externe.[22]

Alimentarea externă, adaptor AC-DC sau baterie, trebuie să furnizeze între 6 și 20 de volți, de preferat cel puțin 7V, pentru menținerea stabilității plăcuței, și cel mult 12V, pentru a evita riscul supraîncălzirii.[22]

Arduno Mega 2560 are și un buton de reset. Acesta permite reînceperea utimului program scris, fără a fi nevoie de reîncărcare.

Plăcuța Arduino Mega 2560 are 54 de pini digitali care pot fi utilizați atât ca intrare, cât și ca ieșire. O parte dintre ei, îndeplinesc funcții specializate. Astfel, 16 pot servi ca intrări analogice, 8 intervin în formarea perechilor RX-TX, în vederea stabilirii de porturi hardware seriale (pinii 0 -1, 19-18, 17-16, 15-14), 15 pot fi ieșiri de semnale PWM (pinii 2-13, 44-46).[22]

Pentru comunicarea serială, în cazul Arduino Mega 2560, pot fi utilizați orice pini digitali, dacă se introduce în program biblioteca SoftwareSerial. Programul bioimprimantei 3D se folosește de această abordare, pentru a face posibilă comunicarea serială simultană, prin Bluetooth și prin Monitorul Serial, oferit de mediul de dezvoltare integrat al Arduino, Arduino IDE.[22]

Pinii plăcuței Arduino pot fi interfațați cu scuturi (shield-uri). Un scut este o plăcuță cu circuite imprimate care facilitează utilizarea plăcii Arduino.[22] Acestea sunt dedicate unei întrebuințări limitate. Un exemplu de scut, folosit în acest proiect, este Ramps 1.4.

Memoria microcontrollerului ATmega2560 este împărțită în: 256 KB memorie flash, 8 KB memorie SRAM (Static Random Access Memory) și 4 KB memorie EEPROM (Electrically Erasable Programmable Read-Only Memory).[22]

Fiecare tip de memorie are propria întrebuințare. În memoria flash este stocat programul Arduino, denumit sketch. 8KB sunt rezervți bootloaderului, care îndeplinește funcția de programator hardware. EEPROM păstrează informații pe perioade lungi. În SRAM, memorie volatilă, sunt stocate variabilele utilizate de sketch, în timpul rulării sale.[22]

Un sketch conceput în Arduino IDE este salvat cu extensia .ino. Fișierul este compus din două funcții principale: setup() și loop(). În setup() se inițiază setările. Aceasta este rulată la începutul programului. loop() se reexecută continuu până la oprirea alimentării cu energie a sistemului.[22]

Câteva dintre funcțiile elementare în utilizarea plăcuței Arduino sunt: pinMode(), digitalWrite() și digitalRead(). Aceste funcții definesc pinii digitali drept intrări sau ieșiri.[22]

Comanda părților electronice și electromecanice se face cu ajutorul bibliotecilor specifice. Trebuie menționat că o bibliotecă inclusă într-un sketch este și ea încărcată în memoria flash.[22]

Ramps 1.4

Figura . Ramps 1.4

Ramps 1.4 este un scut compatibil cu Arduino Mega 2560. În Figura 3.12 Ramps 1.4 se observă potrivirea fizică dintre placa roșie, Ramps 1.4 și placa Arduino Mega 2560, situată în partea de jos.

Fiind special proiectat pentru imprimantele 3D, Ramps 1.4 e ușor de adaptat pentru bioimprimantă. Din cele cinci socluri disponibile pentru driverele motoarelor pas-cu-pas (Figura 3.13 Ramps 1.4 – soclu pentru driver), de tip A4988, în construirea bioimprimantei sunt utilizate numai trei. Două socluri sunt pentru motoarele care permit mișcarea în sistemul cartezian xOy, și un soclu pentru motoarele care fac posibilă mișcarea pe axa Oz.

Figura . Ramps 1.4 – soclu pentru driver

Alți pini utili pentru bioimprimantă sunt cei care se conectează la termistori, la patul încălzit, la motorul de curent continuu și la modulul Bluetooth. În Figura 3.14 Ramps 1.4 conectat cu restul sistemului se pot vedea pinii utilizați și cei rămași liberi în urma construirii bioimprimantei 3D.

Ramps 1.4 dispune și de pini care pot fi folosiți pentru îmbunătățirea sistemului, prin adăugarea de componente ca: ecranul LCD, adaptorul pentru card SD, ventilatorul.

Figura . Ramps 1.4 conectat cu restul sistemului

Modulul Bluetooth HC-05

Figura . Modul Bluetooth HC-O5

Pentru facilitarea interacțiunii utilizatorului final cu sistemul bioimprimantei 3D, se introduce modulul Bluetooth HC-05 (Figura 3.15 Modul Bluetooth HC-O5). Prin intermediul acestuia are loc un schimb de informații, în timp real, între bioimprimantă și un alt dispozitiv conectat la acest modul, cum ar fi un smartphone.

Comunicarea se realizează la distanțe de până la 10 metri, cu o viteză de transmitere a datelor, baudrate, între 9600 și 460800 biți pe secundă.

Tensiunea de alimentare admisă a plăcuței este cuprinsă între 3.6 și 6V (Figura 3.16 Modul Bluetooth HC-O5 – configurația pinilor), astfel, de pe plăcuța Ramps, trebuie folosiți pini de 5V, cum sunt: D64 și D66.

Figura . Modul Bluetooth HC-O5 – configurația pinilor

Pentru comunicarea Bluetooth este nevoie de o aplicație pentru comunicații seriale. Acestă aplicație trbuie să ofere o interfață grafică pentru conectarea cu modulul, scrierea datelor de transmis și afișarea datelor trimise de programul bioimprimantei. Un exemplu de aplicație mobilă gratuită este Bluetooth Terminal. Adresa modului utilizat este: 20:17:02:27:04:15.

Modulul Bluetooth face posibilă executarea unor comenzi, de către bioimprimantă, scrise în limbaj natural. Pentru aceasta, codul Arduino interpretează fiecare mesaj primit și transmite apoi plăcuței comenzile corespunzătoare mesajului, cum ar fi chiar afișare unui răspuns utilizatorului.

Driverul A4988 și motoarele pas cu pas

Figura . Motor pas-cu-pas bipolar

În construirea bioimprimantei 3D, sunt utilizate motoare pas-cu-pas (Figura 3.17 Motor pas-cu-pas bipolar și Figura 3.18 Motor pas-cu-pas – Nema17) pentru realizarea modelului tridimensional. Acestea sunt potrivite datorită preciziei pașilor executați.

Pentru deplasarea pe axele Ox și Oy sunt utilizate două motoare pas-cu-pas bipolare, ca cel vizibil în Figura 3.17 Motor pas-cu-pas bipolar, cu o cursă maximă de aproximativ 3.5 cm și 20 de pași executați într-o mișcare de revoluție. Funcționează normal prin alimentarea cu 5V.

Figura . Motor pas-cu-pas – Nema17

Tot motoare pas-cu-pas sunt și motoarele Nema 17 (Figura 3.18 Motor pas-cu-pas – Nema17). Ele permit deplasarea sistemului pe axa Oz. Sunt potrivite pentru această aplicație datorită puterii mai mari pe care o dezvoltă, necesară ridicării sau coborârii ansamblului seringii.

Deși se folosesc două motoare, este nevoie de un singur driver, deoarece ele trebuie să acționeze simultan. În faza de construire, trebuie lipite firele de la cele două motoare în așa fel încât să se obțină un montaj paralel. Întrucât nu este nevoie de viteză mare pe axa Oz, acest mod de conexiune nu prezintă dezavantaje.

Figura . Driver A4988

Driverul A4988 (Figura 3.19 Driver A4988) este special priectat pentru comandarea motoarelor pas-cu-pas. Are un pin pentru controlul direcției și, un altul, pentru numărul de pași executați. Pentru comanda acestui tip de motoare, în cadrul programului implementat, trebuie inclusă biblioteca AccelStepper.h. Este echipat cu protecție pentru supratemperatură, supracurent și subtensiune.

Un mare avantaj al său este prezența potențiometrului pentru limitarea curentului de output. Deoarece ansamblul electronic al bioimprimantei este alimentat cu 12V, iar moatarele pentru axele Ox și Oy au nevoie de numai 5V pentru funcționare, prin reglarea potențiometrului se poate omite această diferență.

Driverul TB6612FNG și motorulul de curent continuu

Figura . Ansamblu seringă

Pentru crearea subsistemului de extrudare a biocernelii (Figura 3.20 Ansamblu seringă), se utilizează un motor de curent continuu, fără perii, menit să acționeze pistolul unei seringi. Puterea dezvoltată de motor este mică, dar suficientă pentru apăsarea pistonului.

Acestui motor i se aplică tehnica de modulare PWM (modulare în lățime a impulsurilor). Prin acestă tehnică se variază direct tensiunea de funcționare a motorului, deci turația acestuia.

Figura . Driverul motorului de curent continuu

Driverul TB6612FNG (Figura 3.21 Driverul motorului de curent continuu) poate comanda mișcarea a două motoare de curent continuu. Pentru bioimprimantă este utilizat un singur motor. Cu ajutorul driverului, se poate comanda direcția și viteza de funcționare a motorului de curent continuu. Ramps 1.4 nu are soclu special dedicat acestui tip de driver. Astfel, pentru conectarea lui, trebuie, în prealabil, identificați pinii liberi care îndeplinesc cerințele tehnice de funcționare ale acestui driver. În sketchul actual sunt utilizați pinii digitali 5, 24 și 26.

Releu SSR 12VDC

Figura . Releu

Releul static (Figura 3.22 Releu), SSR (solid-state relay), utilizat în construirea aplicației este de tip SPDT, un pol și două contacte: NO (contact normal deschis în repaus) și NC (contact normal închis). Rolul acestuia este de a redirecționa curentul mare, necesar funcționării patului încălzit, dearece s-a ajuns la topirea mufei de alimentare, prin supraîncălzirea ei, în timpul funcționării patului încălzit.

Conectarea releului la patul încălzit se face prin firul albastru din Figura 3.23 Conectarea releului, contactul normal deschis. Comenzile, către releul conectat la pinul D8, de pe placa Ramps, pornesc sau opresc funcționarea patului încălzit, firul alb și firul negru fiind conectate la bobină. Alimentarea se face prin firul galben. Releul funcționează corespunzător, numai dacă primește 12V.

Figura . Conectarea releului

Termistorii și patul încălzit

Pentru a asigura o temperatură în jurul valorii de 37°C, în structura bioimprimantei, este inclus un pat încălzit, și doi termistori.

Patul încălzit, PCB MK2b, este un circuit imprimat. Alimentarea lui cu 12V, tensiunea aplicată circuitului bioimprimantei, presupune crearea unei legături între pinii 2 și 3 de pe acesta, conform instrucțiunilor.

Termistorii sunt de tip NTC 3950. La temperatura de 25°C, prezintă o rezistență de 100KΩ. Cu ajutorul lor se citește temperatura de la nivelul patului încălzit și de lângă cilindrul în care se află materialul pentru printat. O dată citită temperatura, se trimit comenzi către pinul D8, la care e conectat releul, pentru a porni sau opri încălzirea patului.

Sursa de alimentare

Figura . Sursă de alimentare

Bioimprimanta dezvoltată necesită alimentarea cu 12V, tensiune asigurată de sursa din Figura 3.24 Sursă de alimentare. Această sursă de alimentare acceptă o tensiune de intrare între 100V și 240V, AC, cu frecvență de 50/60 Hz.

Luând în calcul prețul mic al sursei, deși în specificațiile tehnice e precizat că poate furniza un curent cu intensitatea de 30A, în realitate, furnizează mai puțin. O mare parte din intensitatea furnizată, aproximativ 10A, este necesară patului încălzit.

3.4 Modul de funcționare al bioimprimantei 3D

Procesul actual de bioimprimare 3D are loc pe baza unui model descris de un vector de coordonate, formatul unei coordonate fiind {X, Y, Z}. Sistemul trece prin fiecare coordonată și, ajuns în punctul respectiv, va acționa motorul de curent continuu, împingând pistonul seringii și, implicit, eliberând o cantitate de biocerneală în vasul Petri. Înaintea pornirii bioimprimării 3D, vasul Petri trebuie introdus în incintă, o dată cu seringa încărcată cu biocerneală, și poziționat corespunzător semnelor de pe patul de bioimprimare. Cantitatea de biocerneală extrudată este constantă pe tot parcursul procesului bioimprimării 3D. Înaintea încheierii programului, sistemul revine, de fiecare dată, la coordonatele inițale: {0, 0, 0}, ca metodă de siguranță în vederea conservării stabilității punctelor. Poziția 0, pe axa Oz, însemnă poziționarea varfului seringii în aer, la o distanță considerabilă față de vasul Petri.

Programul are și o funcție care permite bioimprimare unui pătrat pe mai multe niveluri: print_square_levels(). Executarea funției se face în urma stabilirii următorilor parametrii:

dimensiunea laturii pătratului

numărul de niveluri

Există două căi de cominicare a utilizatorului cu programul: prin Monitorul Serial al Arduino IDE și/sau prin Bluetooth. Este posibilă atât comunicarea simutană prin cele două metode, cât și separată.

Interacțiunea prin Bluetooth

Cazul interacțiunii exclusive prin Bluetooth, este posibil, dar limitat. Aceasta are loc pe baza setului de comenzi, case-insensitive: start, pause, continue.

În primul rând, pentru comunicarea Bluetooth, este nevoie de o aplicație pentru comunicații seriale. Un exemplu de aplicație mobilă gratuită este Bluetooth Terminal. Adresa modului Bluetooth utilizat este: 20:17:02:27:04:15.

Pornirea bioimprimantei se face prin alimentarea sursei de la priză, urmată de conectarea dispozitivului master la modulul Bluetooth (ex., telefonul mobil), urmată de apăsarea butonului de reset de pe placa Ramps 1.4.

După resetare, se scrie și trimite, prin aplicația pentru comunicare serială, comanda start. După aceasta, programul întreabă dacă se dorește bioimprimarea coordonatelor din memorie, cele încărcate o dată cu ultimul sketch, sau definirea unei structuri noi. Dacă se alege a doua variantă, se va mai cere, de către program, latura pătratului și numărul de niveluri.

De notat faptul că distanța dintre puncte este una standard. Pentru modificarea ei trebuie modificați, în fișierul Bioprinter.h, parametrii: X_DISTANCE, Y_DISTANCE, Z_DISTANCE, și reîncărcat programul.

În timpul frmării modelului se pot transmite, oricând, comanda pause. Aceasta are rolul de a suspenda execuția modelului bioimprimat, dar nu înainaintea de a trece în poziția inițială. Astfel, dacă se decide abandonarea execuției programului, la următoarea pornire a sistemului, poziția va fi mereu cea inițială.

Pentru reluarea execuției programului, trebuie trimisă comanda continue.

Oprirea definitivă se face prin întreruperea alimentării. Această procedură trebuie aplicată imediat în cazul în care:

se simte miros de fum,

se observă topirea vreounei componente,

ansamblul seringii întâmpină obstacole în momentul deplasării pe axa Oz,

motoarele produc un zgomot neobișnuit,

deși ajuns la capăt, pistonul seringii continuă să fie împins,

alte situații neprevăzute care pot produce daune bioimprimantei 3D.

Interacțiunea prin Arduino IDE

Pentru a putea fi bioimprimate structuri personalizate, în momentul de față, bioimprimanta necesită instalarea softwareului Arduino IDE. Acesta poate rula pe sistemele de operare Windows, Linux și Mac. Vitezele de funcționare a motoarelor, deci viteza de bioimprimare și temperaturile de la capetele celor doi termistori, sunt parametri reglabili cu rol important în obținerea structurii personalizate.

Modelul unei structuri trebuie transpus în coordonate specifice sistemului. Astfel, valoarea unei coordonate X sau Y variază între -800 și 800, pe când cea a lui Z poate varia mult mai mult. Valorile pozitive sunt pentru deplasarea într-o singură direcție, iar cele negative presupun deplasarea în direcția opusă.

Partea de cod, care acționează motorul DC, de curent continuu, comandă viteza de extrudare. Această viteză este reglabilă, cu valori între 0 și 255. Implicit este 180. Cantitatea de biocerneală împinsă de seringă este, de asemenea, reglabilă din program prin modificarea duratei de funcționare a motorului DC.

Pentru cele mai bune rezultate, valorile parametrilor cheie trebuie determinate experimental, cum ar fi coordonatele și vitezele. Fiind un prototip, calibrarea sistemului se realizează manual.

Înaintea încărcării unui sketch trebuie selectat portul USB de comunicare serială și plăcuța destinație. În cazul apariției de erori în timpul încărcării sketch-ului, acestea vor fi afișate de către Arduino IDE.

După încărcarea programului, fără a deconecta plăcuța Arduino, se poate deschide Serial Monitor pentru comunicarea serială cu programul care rulează. Trebuie ținut cont de faptul că e necesară setarea corect a baudrate, viteza de comunicare, în concordanță cu valoarea acesteia din cadrul funcției Serial.begin, din sketch.

Experimente, rezultate și discuții

4.1 Experimentele și rezultatele utilizării altor componente

Figura . Arduino Uno și drivere A4988

Dezvoltarea proiectului Construirea și comanda unei bioimprimante 3D a început de la un ansamblu (Figura 4.1 Arduino Uno și drivere A4988) format dintr-o plăcuță Arduino Uno, un shield pentru motoarele pas-cu-pas, sistemul xOy și două drivere A4988. În urma proiectării cu succes a unei funcții prin care se contura un cerc, am trecut la următorul pas, adăugarea motorului care avea să împingă pistonul unei seringi.

Figura . Sistem printare 2D

În cadrul acestei etape am testat un motor pas-cu-pas care, inițial, a părut că nu are suficientă putere să împingă o seringă goală, de 2.5 ml, întrucât sărea de pe axă. După ce am fixat, prin întărire cu lipici, elementul care juca, a fost posibilă împingerea seringii. Ulterior, am renuțat la varianta motorului pas-cu-pas datorită dificultății creării montajului pentru împingerea seringii.

Înaintea utilizării driverului TB6612FNG al motorului DC, am încercat varianta folosirii unui microcontroller montat pe breadboard, ca în Figura 4.2 Sistem printare 2D. Montajul a funcționat bine, dar am renunțat la el prentru că ocupa mult spațiu, spre deosebire driverul TB6612FNG.

Tot în cadrul acestei etape, am introdus in cod o metoda care permite afișarea variabilelor de tip float. Spre final, am renunțat la aceasta pentru că nu era ceva esențial și ocupa spațiul de memorie inutil.

În urma unor calcule, am ajuns la valoarea de 0,03 ml pentru volumul de aer extrudat într-un singur pas al motorului DC. Acestă valoare e echivalentă cu pasul minim posibil executat de motorul DC.

Merită menționat faptul că este foarte ușor nu îți dai seama că plăcile, în cazul de față, Arduino Mega 2560 și Ramps 1.4, nu sunt înfipte bine una într-alta. Ca urmare a acestei scăpări, pinii digitali ai Ramps-ului sunt nefuncționali, spre deosebire de cei analogici.

O dată cu trecerea la Arduino Mega 2560, a trebuit schimbată tensiunea de alimentare. Pentru a evita supraîncălzirea vreounui element, situație întâlnită înainte și rezultată cu topirea capetelor firelor de alimentare, am testat cu succes funcționarea sistemului, format din toate cele șase motoare, la o tensiune de alimentare de 7.5V.

Utilizarea unei tensiuni de alimentare de 12V a avut ca efect creșterea mare a temperaturii motoarelor de pe axele Ox și Oy. Aceste motoare, necesită numai 5V și nu era la îndemână înlocuirea lor. Prin rotirea potențiometrului driverului A4988, am reușit fixarea acestei probleme.

4.2 Atenționări

În cazul în care o componentă electromecanică nu funcționează conform așteptărilor, trebuie verificat dacă:

este bună conexiunea firelor;

primește suficient curent sau dacă i se aplică tensiunea corectă;

pinii din sketch corespund pinilor reali;

pinii utilizați nu sunt folosiți de mai multe ori;

direcția de deplasare din sketch face posibilă mișcarea reală;

programul ajunge să execute partea de cod aferentă comenzii pentru deplasare.

Utilizarea componentelor imprimate 3D, implică verificarea lor, adaptarea prntru proiectul personal, și modificarea în vederea reducerii la minim a cantității de material ce intră în alcătuirea lor, pentru a minimiza costurile de imprimare 3D. Trebuie avută grijă când se încearcă prelucrarea mecanică a acestor piese, deoarece crapă destul de repede. Tot legat de aceste componente, trebuie verificate ofertele mai multor firme, deoarece prețurile variază foarte mult.

Atunci când utilizăm un kit al unui proiect pe care vrem să îl adaptăm, trebuie să verificăm dacă dimensiunile pieselor din listele online corespund nevoilor noastre și dacă avem nevoie de toate elementele listei. Tot în acest caz, trebuie acordată atenție diferențelor dintre versiuni.

Pentru lipirea firelor pe patul încălzit, trebuie utilizată o temperatură în jurul valorii de 400°C, altfel nu se vor lipi. Firele lipite cu motoarele se pot deslipi.

Deși se presupune că se pot folosi orice pini digitali, pentru comunicația serială, în realitate, nu toți suportă întreruperi. Următorii pini pot fi utilizați pentru RX: 10 – 15, 50 – 53, A8 (62) – A15 (69).

Stabilitatea sistemului xOy trebuie verificată des. Privind structura cutiei din plexiglass, trebuie verificate periodic șuruburile și piulițele, pentru că strângerea lor nu s-a dorit a fi foarte puternică, pentru a nu se ceda plexilass-ul.

Trebuie evitată aplicarea alcoolului pe sufrafața plexiglass-ului, pentru că, în urma tăierii laser s-au creat niște tensiuni care pot ceda, rezultând deteriorarea materilului. În situația în care o piesă a cutiei este deteriorată, se poate înlocui ușor, sistemul fiind prins cu șuruburi.

Concluzii

5.1 Avantajele și dezavantajele aplicției dezvoltate

Avantajul major al bioimprimantei 3D obținute, este că se poate utiliza și pentru alte tipuri de celule, nu numai pentru piele, prin configurarea parametrilor mediului conform cerințelor tipului celulelor, seatarea vitezei de imprimare, setarea cantității de substanță eliberată.

Sistemul rezultat are o precizie ridicată a eliberării unei cantități constante de material și a plasării acestuia la distanțe exacte, într-o abordare punctiformă. Prin modificarea timpului de funcționare a motorului DC este posibilă și depunerea unei cantități variabile de biocerneală în decursul unui aceluiași ciclu de bioimprimare 3D. Acționarea continuă a motorului DC (timpul de întârziere = 0) și mărirea vitezei celorlalte motoare, rezultă într-un proces continuu.

Forma printată poate fi foarte complexă, din punct de vedere structural.

Se poate obține și o structură cu tipuri de celule diferite, fie prin rularea mai multor programe, succesiv, cu schimbarea seringii între ele, fie prin introducerea unei metode, în sketch, care să determine intrarea sistemului în pauză, atunci când e nevoie de schimbarea seringii.

Bioimprimanta 3D rezultată este ușor de realizat. Nu este compusă din foarte multe elemente, iar cele care intră în alcătuirea ei sunt ieftine și se găsesc în toate magazinele de profil.

Caracterul modular pe care îl are bioimprimanta 3D construită, este un avantaj din punct de vedere al mentenanței și al duratei de viață.

Întrucât aplicația dezvoltată este doar un prototip, o parte din dezavantaje pot fi văzute ca îmbunătățiri ulterioare.

Celele mai mar dezavantaje a ceea ce am obținut, sunt: dependența de Arduino IDE și lipsa unei aplicații de creare a modelului ce se dorește a fi bioimprimat 3D.

Un alt dezavantaj major este faptul că sistemul care împinge seringa, nu știe să recunoască poziția pistonului, rezultând fie în pierderea de material, dacă se recurge la depozitarea primelor picături într-un loc separat, fie într-o structură defectă în punctele inițiale.

5.3 Posibilități de îmbunătățire

O îmbunătățire esențială a sistemului dezvoltat, este asamblarea unei lămpi UV care să sterilizeze incinta, dar să nu influențeze proprietățile biocernelii. Una dintre soluțiile pe care le văd, este cea în care razele UV să acționeze înaintea începerii procesului de bioimprimare 3D

O serie de îmbunătățiri pot fi legate de proprietățile fizico-chimice ale aerului din incinta bioimprimantei 3D. Astfel, procesul de reglare a temperaturii poate fi îmbunătățit, prin adăugarea unui sistem de răcire. Ar putea fi controlate nivelurile de: umiditate, O2 și CO2.

O îmbunătățire ușor de realizat, o reprezintă extinderea suprafeței de imprimare. Aceasta se poate face prin construcția unui nou sistem mecanic pentru axele Ox și Oy. Se poate adăuga și un suport nou din plexiglass, pentru aceasta.

O dezvoltare ulterioară, destul de importantă, ce priveșre creșterea gradului de automatizare al sistemului, este adăugarea senzorilor pentru recunoașterea, în orice moment, a poziției pistonului seringii, dar și a vârfului acesteia.

Partea de acționare a seringii ar putea fi înlocuită cu un sistem pneumatic. Acest sistem ar consta dintr-o pompă de aer conectată, printr-un furtun, la o seringă plasată perpendicular pe seringa cu biocerneală.

O altă îmbunătățire vizează facilitarea interacțiunii utilizatorilor cu bioimprimanta 3D, prin introdcerea unui touchscreen cu o aplicație special dezvoltată, care să permită:

afișarea și reglarea parametrilor sistemului, cum ar fi: temperatura, vitezele motoarelor, nivelul de umiditate și de dioxid de carbon din aer, și altele;

interfață pentru afișarea graficelor variațiilor parametrilor, în timp real;

o listă cu modele standard pentru bioimprimat.

Tot o îmbunătățire accesibilă este introducerea unui adaptor pentru un card SD și a cardului SD, cu scopul stocării de date, în fișiere. Acestă îmbunătățire, alături de o aplicație care să permită tansferul serial de fișiere, ar face posibilă utilizarea bioimprimantei 3D, independentă de Arduino IDE. Sckech-ul ar citi coordonatele direct din fișier.

Realizarea unui algoritm pentru imprimarea unei imagini 3D

În funcție de tipul de celule care urmează a fi imprimate și de cantitatea minimă de substanță eliberată la executarea unui pas de către motorul care acționează seringa, se poate crea un algoritm care să transforme o imagine în coordonate ale sistemului fizic. Funcția de conversie ar trebui să aibă capacitatea de a asocia volumului unei picătri fizice de substanță, un anumit număr de pixeli din imagine, astfel încât modelul imprimat să se asemene cât mai bine cu modelul din imagine. Algoritmul ar putea fi conceput în așa fel încât să permită reprezentarea în coordonate 3D.

Construcția acestui algoritm va necesita o serie de teste ale sistemului de bioimprimare, pentru determinarea pasului minim al motorului care acționează seringa în funcție de viscozitatea biocernelii care urmează să fie bioimprimată. De asemenea, ar fi nevoie de unelte speciale, cu care să se poată măsura dimensiunile foarte mici ale cantității minime de substanță eliberată.