Nanoparticule Metalice. Aplicatii In Biochimie

Introducere

Principalul scop al acestei lucrări este acela de prezenta aspecte teoretice și practice ale nanoparticulelor metalice.

Conceptul de nanotehnologie a fost pentru prima dată previzionat de fizicianul Richard Feynman, în anul 1959, într-un discurs intitulat ,,There's plenty Room at the Bottom” [1], în care descrie posibilitatea de manipulare a atomilor și moleculelor cu scopul obținerii de materiale. R. Feynman a fost un avangardist care a pus bazele conceptului de nanotehnologie cu câțiva zeci de ani înainte ca acest lucru să fie posibil.

Faraday [2] a studiat particulele de aur coloidal și a publicat cercetările sale în anul 1857. Motivația acestui studiu a fost culoarea roșie a particulelor de aur în contrast cu cea familiară galbenă a aurului în formă convențională. Printr-un argument similar, utilizarea particulelor metalice (mai mici de 100 nm) pentru a produce efecte decorative în vitraliile pentru ferestrele bisericilor sau în vasele de ceramică ar data nanotehnologia în timpuri medievale sau chiar mai devreme [3],[4]. Dezvoltarea unor metode noi de preparare și folosirea unor tehnici moderne de analiză a nanoparticulelor a condus la apariția nanoștiinței ca un domeniu nou de studiu.

Termenul de nanotehnologie a fost definit de Norio Taniguchi, în 1974, ca fiind ,,procesul de manipulare a materialelor la nivel nanometric, proces dirijat de necesitățile industriei electronice” [5].

PARTEA TEORETICĂ

CAPITOLUL I: Sinteza nanoparticulelor

1.1. Metode fizice de sinteză ale nanoparticulelor

Metodele de sinteză ale nanoparticulelor din vapori metalici nesaturați au la bază teoria clasică a nucleației. În aceste tehnici, materialele țintă sunt evaporate și prin crearea unei stări de înaltă suprasaturare are loc condensarea nanoparticulelor. În general, starea de suprasaturare se poate atinge, fie prin scăderea bruscă a temperaturii sistemului, fie prin reacții chimice în care precursorii înalt volatili sunt transformați în compuși insolubili.

1.1.1. Depunerea fizică a vaporilor (tehnica „bottom up”)

Pentru volatilizarea materialelor țintă se folosesc diferite tehnici, care în principiu coincid cu cele care se aplică și în cazul sintezei altor tipuri de nanoparticule. Aceste tehnici presupun utilizarea laserului, a plasmei, a energiei solare, a descărcărilor în arc sau aplicarea unor temperaturi înalte. Toate aceste tehnici de volatilizare a metalelor permit atât studiul caracteristicilor fizico-chimice ale nanoparticulelor în fază gazoasă, înaintea depunerii acestora pe substraturi, cât și proprietățile filmelor și pulberilor după depunere. Nanoparticulele metalice pot fi sintetizate prin volatilizare termică [6], reacția metalelor în plasmă de hidrogen [7], volatilizarea în flacără [8] .

În metoda clasică de volatilizare termică, o probă metalică sau aliaj este încălzită într-un recipient de wolfram într-un curent de argon sau heliu. Atomii metalici volatilizați își pierd energia cinetică în urma ciocnirilor cu atomii gazului inert, adunându-se în clustere și condensând pe un substrat rece sub forma unor pulberi nanodispersate.

Prin variația vitezei de evaporare, a temperaturii substratului, a presiunii și compoziției gazului se pot obține nanoparticule cu dimensiuni cuprinse între 3-100 nm.

Această tehnică poate fi aplicată și pentru sinteza nanoparticulelor heterometalice de tipul Fe-M (M =Ni, Mn, Co, Pt, Cr) cu dimensiuni de aproximativ 3 nm [9].

Condensarea în gaz inert este un proces fizic în care, prin încălzirea solidului are loc evaporarea sa, într-un gaz inert, până la atingerea suprasaturării, urmată de introducerea unui gaz cu temperatură scăzută, când are loc scăderea bruscă a temperaturii vaporilor și se produce nucleația și creșterea particulelor. Prin includerea în sistem, odată cu fluidul rece, a unui reactiv gazos, cum ar fi oxigenul, se pot obține oxizi ai materialului evaporat [10] .

Filmele nanostructurate pot fi obținute prin ablație laser. Depunerea cu laser pulsat se bazează pe vaporizarea materialului și atingerea suprasaturării sub influența unui fascicul de pulsatoriu care este limitat spațial și temporal. Prin această metodă se produc cantități mici de nanoparticule ale surselor precursoare, care nu pot fi ușor vaporizate.

Generarea prin descărcarea în arc permite vaporizarea metalelor folosind electrozi între care se creează un arc electric, în prezența unui gaz inert sau reactiv. Metoda se utilizează pentru obținerea nanoparticulelor metalice și a celor oxidice.

Pulverizarea în jet de plasma are la bază volatilizarea solidului – sursă, prin bombardare cu un fascicul de ioni sau atomi ai unui gaz inert (Figura 1).

Figura 1. Reprezentarea schematică a procesului de volatilizare a atomilor sau ionilor în urma bombardării probei de pe ținta cu particule cu energie ridicată (imagine adaptată) [11].

1.2. Metode chimice de sinteză ale nanoparticulelor

1.2.1. Sinteza nanoparticulelor prin metoda sol-gel (metoda ,,bottom up”)

Metoda sol-gel este frecvent utilizată, atât pentru obținerea nanoparticulelor metalice, bimetalice sau heterometalice, cât și pentru sinteza nanoparticulelor oxidice. Avantajul acestei metode constă în procesarea materialelor la temperaturi joase, combinarea acestora la nivel molecular, asigurarea unui bun control asupra caracteristicilor nanomaterialelor obținute, oferind astfel posibilitatea extinderii gamei de nanomateriale [12].

Prin tehnica sol-gel s-au preparat nanoparticule de ZnO [13], TiO2 [7],[9],[14] sau SnO2 [15].

Metoda sol-gel implică reacția în soluție a reactanților în scopul producerii unităților primare, de dimensiuni nanometrice numite ,,soluri”, care apoi se pot asambla pentru a forma rețele solide tridimensionale, denumite ,,geluri”. Faza lichidă a gelului umple porii deschiși ai structurii. Compoziția chimică a soluției determină atât morfologia nanostructurilor rezultate cât și compoziția lor chimică, iar acestea la rândul lor vor determina proprietățile materialelor. Evaporarea controlată a fazei lichide conduce la un solid poros și dens numit ,,xerogel”, în timp ce extracția supercritică va conduce la solide foarte poroase, cu masă specifică mică, denumite ,,aerogeluri” (Figura 2).

Figura 2. Etape parcurse în obținerea xerogelurilor și aerogelurilor (imagine adaptată) [16].

Structura gelului este uniformă deoarece atât particulele constituente cât și porii sunt de dimensiuni nanometrice. O asemenea omogenitate asigură uniformitatea proprietăților materialului, acesta fiind avantajul energetic principal al sintezei prin tehnica sol-gel.

Metoda tipică sol-gel implică reacții de hidroliză și de condensare a precursorilor care au loc în mai multe etape și se desfășoară succesiv sau în paralel. Ca precursori se pot folosi atât alcoxizii metalici cât și sărurile organice și anorganice. Pentru dizolvarea precursorilor se folosesc solvenți adecvați, iar pentru declanșarea reacției se folosesc catalizatori.

Hidroliza: M(OEt)4 + xH2O M(OEt)4-x (OH)x + EtOH

Condensarea: M(OEt)4-x (OH)x + M(OEt)4-x (OH)x

(OEt)4-x(OH)x-1 MOM (OEt)4-x(OH)x-1 + H2O

În secvența de reacții de mai sus M reprezintă un cation metalic [17].

În urma reacțiilor de condensare se formează nanoclustere ale oxizilor metalici sau a hidroxizilor, în care sunt angajate și grupările organice incluse sau atașate lor. Într-un sol tipic, nanoclusterele formate prin hidroliză și condensare au de regulă dimensiuni variind între 1-100 nm. Mărimea nanoclusterelor, precum și morfologia și structura produsului final pot fi controlate prin modul de desfășurare al reacțiilor de hidroliză și de condensare.

1.2.2. Sinteza nanoparticulelor confinate cinetic (în nanoreactoare)

Sinteza nanoparticulelor în condiții de limitare cinetică are loc într-o manieră în care se limitează spațial creșterea acestora, fie prin folosirea unei cantități limitate de materiale de alimentare, fie prin plasarea materialului sursă într-un spațiu cu dimensiuni nanometrice (nanoreactoare). Creșterea particulelor încetează în momentul în care este consumată complet cantitatea limitată a materialului sursă sau când spațiul limitat se umple. În general, limitarea spațială se realizează prin folosirea următoarelor metode: sinteze în micele și microemulsii, sinteza în aerosoli și spray-piroliză, sinteza mediată de modelatori de structură.

A. Sinteza nanoparticulelor folosind tehnica microemulsiei

Prin tehnica microemulsiei, s-a sintetizat o gamă largă de nanoparticule metalice.

Figura 3. Sinteza nanoparticulelor în microemulsie (imagine adaptată) [18].

Figura 4. Obținerea nanoparticulelor metalice de Pd prin tehnica microemulsiei (imagine adaptată) [19].

B. Sinteza nanoparticulelor în aerosol

Sinteza nanoparticulelor în aerosol este o metodă ,,top down” care conduce la obținerea nanoparticulelor cu compoziție omogenă, cu mărimi, cristalinități, forme și microstructuri ajustabile. Metoda se aplică în practică sub forma a mai multor variante, care folosesc precursori solizi sau precursori lichizi/gazoși.

Cercetările au precizat folosirea metodelor bazate pe reacții chimice sau pe conversii gaz-solid ca fiind optime pentru atingerea suprasaturării necesare inducerii nucleației omogene.

Sinteza chimică din vapori are la bază formarea fazei de vapori din precursori prelucrați într-un reactor cu pereții fierbinți. Deși în aceste condiții este favorizată nucleația particulelor, metoda prezintă și dezavantaje în cazul depunerilor sub forma unor filme subțiri. Pe această cale s-au sintetizat nanoparticule de W, Cu și Cu2O [20].

1.2.3. Metode specifice de sinteză a nanoparticulelor metalice

A. Termoliza derivaților metalici

Cercetările experimentale au scos în evidență faptul că descompunerea termică a derivaților metalici oferă o mare varietate de posibilități de sinteză a nanoparticulelor metalice.

Yu și colaboratorii [21] au obținut nanoparticule de fier prin tehnica condensării chimice a vaporilor, folosind drept precursor pentacarbonilul de fier. Vaporii Fe(CO)5 au fost transferați din evaporator, cu ajutorul unui curent de argon de înaltă puritate, într-un reactor tubular, unde la 600 °C a avut loc descompunerea acestora, urmată de condensarea nanoparticulelor de fier.

Yang și colaboratorii [22] au preparat nanoparticule de Co-Pd folosind nucleația eterogenă. În acest sens, s-a injectat precursorul de Co într-un amestec surfactant, alcătuit din difenil-eter, 2-hexandiol, acid oleic și trifenilfosfină, care conține și mediul de însămânțare alcătuit din complecși ai Paladiului. Pd(AcAc)2 a fost dizolvat în difenil eter. După încălzire timp de 30 minute la 140 °C, în acest amestec a fost injectată soluția de Co2(CO)8 în diclorobenzen, formându-se nanoparticulele cu diametrul mediu de 8,6 nm.

B. Descompunerea derivaților metalici folosind tratamente ultrasonice

Yin și Wang [23] au sintetizat nanoparticule de cobalt prin descompunerea asistată de ultrasunete a unei surse metalice: Co2(CO)8 în toluen. Pentru a evita aglomerarea cristalelor nou formare s-a folosit bis(2-etilhexil)-sulfosuccinat de sodiu (Na(AOT)), care formează un strat protector la suprafața particulelor. Prin folosirea ultrasunetelor s-a realizat creșterea vitezei de descompunere a derivaților metalici și s-a asigurat formarea unor particule mici și uniforme.

C. Reducerea derivaților metalici

Reducerea sărurilor metalelor tranziționale reprezintă cea mai veche metodă utilizată pentru prepararea nanoparticulelor metalice. Reprezentarea schematică a acestui proces de sinteză a nanoparticulelor metalice este redată în Figura 5.

Figura 5. Formarea coloizilor metalici nanostructurați prin tehnica reducerii sărurilor metalice (imagine adaptată) [24].

În vederea obținerii nanoparticulelor metalice din sărurile metalice corespunzătoare se folosesc diverși agenți reducători puternici: dispersii ale metalelor alcaline în eteri sau hidrocarburi, complecși ai metalelor alcaline cu acceptori de electroni organici (naftalene), NaBH4 sau alte hidruri.

Folosind soluții apoase ale NaBH4 se pot obține, la temperatura camerei, atât nanoparticule homometalice (Ni, Fe, Co) [25],[26] cât și nanoparticule heterometalice (Fe-Co, Fe-Cu, Co-Cu) [27],[28].

Du și colaboratorii [29] au preparat nanoparticule de CoPt3 folosind ca agent de reducere NaBH4. În acest scop, o soluție etanolică de NaBH4 a fost adăugată treptat la o soluție de CoCl2 în etanol, în atmosferă de azot și sub agitare energică la 0 °C. Soluția își schimbă culoarea de la albastru la brun, indicând formarea nanoparticulelor de Co. Peste suspensia astfel formată, se adaugă soluția etanolică de H2PtCl6. După agitare se adaugă agentul de reducere, sub formă de soluție de NaBH4. Nanoparticulele obținute au forme sferice și dimensiuni medii de 2,6-3,3 nm.

Turkevich [30] a prezentat în anul 1951 cea mai populară metodă de obținere a nanoparticulelor de aur prin reducerea sării de aur, HAuCl4, cu citratul de sodiu. Prin această metodă se obțin nanoparticule de aur în formă sferică monodisperse suspendate în apă având diametrul de 10-20 nm. Formarea nanoparticulelor sferice de aur este confirmată de apariția culorii roșii a soluției. Citratul de sodiu adăugat are rolul de a reduce aurul din sarea de aur la aur metalic. Totodată, prin modificarea raportului între sarea de aur și citratul de sodiu se pot obține nanoparticule de dimensiuni diferite. Cu cât raportul molar sare:citrat este mai mare, cu atât dimensiunea nanoparticulelor formate este mai mică. Caracteristica principală a soluției coloidale de aur este dată de banda plasmonică ce apare în jurul valorii de 520 nm în spectrul de absorbție UV-Viz al soluției care conține particulele sferice. Poziția benzii plasmonice în spectrul de absorbție depinde de dimensiunea și forma nanoparticulelor [31].

1.3. ,,Sinteza verde” a nanoparticulelor

Figura 6. Diagramă schematică reprezentând mecanismele din spatele sintezei biogene de nanoparticule metalice (imagine adaptată) [32].

1.3.1. „Sinteza verde” a nanoparticulelor de argint

Li și colaboratorii au obținut nanoparticule de argint din extract de Capsicum annum [33]. Extractul a ilustrat sinteza rapidă a nanoparticulelor datorita schimbului de culoare de la verde la maro închis. Spectrul UV-Viz a arătat un maxim la lungimea de undă de 440 nm, în timp ce microscopia de transmisie electronică a indicat sinteza unor nanoparticule sferice. În studiul respectiv, cercetătorii au propus un mecanism de control al nucleației și al dimensiunii nanoparticulelor rezultate. S-a propus ca ionii de argint să fie supuși unor interacțiuni electrostatice cu proteinele prezente în extract ceea ce duce la formarea unui complex cu argint (Figura 7). În plus, legăturile flexibile dintre proteine și alte biomolecule conduc la formarea de nanoparticule sferice stabile.

Figura 7. Reprezentare schematică a mecanismului de sinteză a nanoparticulelor de argint folosind extract din rădăcină de C.annum (imagine adaptată) [33].

Extractul de semințe de Jatropha curcas a fost de asemenea utilizat pentru sinteza nanoparticulelor de argint [34]. Spectrele UV-Viz ale soluțiilor obținute au prezentat un maxim de absorbție la 425 nm. Microscopia de transmisie electronică de înaltă rezoluție și difracția de raze X, au dovedit faptul că nanoparticulele rezultate au formă sferică. În schimb, studiul FTIR (spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier) a demonstrat faptul că grupările amidice sunt responsabile pentru reducerea ionilor de argint, în timp ce proteinele au acționat ca agenți de stabilizare.

Nanoparticule de argint au fost obținute și din extract apos de rădăcină de Parthenium hysterophorus (o specie de plante cu flori). După sinteză au fost evaluate proprietățile acestora pentru a acționa ca și agent larvicid împotriva Culex quinquefasciatus (o specie de țânțari din regiunile tropicale și subtropicale ale lumii). Spectrul UV-Viz a prezentat un maxim de 420 nm indicând producerea nanoparticulelor de argint. Studiul nanoparticulelor prin microscopia de fluorescență arată că cele mai multe dintre acestea au formă sferică și marginile netede (Figura 8).

Figura 8. Analiza prin microscopia de fluorescență a nanoparticulelor de argint sintetizate [35].

1.3.2.„Sinteza verde” a nanoparticulelor de paladiu

Petla și colaboratorii au sintetizat nanoparticule de paladiu folosind extract de frunze de Glycine max (soia) [36]. Modificarea culorației extractului de frunze de soia cu ionii de paladiu de la portocaliu la maro închis și apariția unei benzi în spectrele UV-Viz la 420 nm confirmă formarea nanoparticulelor de paladiu. Cercetătorii au presupus faptul că proteinele și unii aminoacizi prezenți în extractul de frunze au fost responsabili pentru sinteza nanoparticulelor de paladiu. Analiza FTIR a confirmat faptul că aminoacizii nu au fost implicați doar în acest proces, ci au acționat doar în calitate de surfactanți care au încetinut procesul de aglomerare al nanoparticulelor [37].

1.3.3. „Sinteza verde” a nanoparticulelor de aur

Huang și colaboratorii au raportat formarea de nanoparticule de aur din extractele de frunze uscate la soare de Cinnamomum camphora [38].

Sinteza extracelulară de nanoparticule de aur utilizând extractul de frunză de Coriandrum sativum a fost încercată de Narayanan și Sakthivel [39]. Ei au descoperit că nanoparticulele sintetizate au avut formă triunghiulară cu o dimensiune medie de 6,7-57,9 nm.

Foarte recent, Singh și Bhakat au raportat sinteza nanoparticulelor de aur folosind frunze și scoarță de Ficus carica [40].

1.3.4.„Sinteza verde” a nanoparticulelor de platină

Sinteza nanoparticulelor de platină a fost realizată de Song și colaboratorii [41], folosind extract de frunze de Diopyros kaki. Aceștia au raportat că mai mult de 90% din ionii de platină au fost transformați în nanoparticule, utilizând 10% din concentrația de biomasă a frunzelor, la 95 °C. Mărimea medie a nanoparticulelor sintetizate a fost cuprinsă intre 2 și 12 nm.

CAPITOLUL II: Metode de caracterizare ale nanoparticulelor

Caracterizarea nanoparticulelor este necesară pentru înțelegerea modalității de control, a sintetizei și aplicațiilor nanoparticulelor. Caracterizarea se face prin multiple metode. Tehnicile comunesunt microscopia de transmisie electronică (TEM, SEM), microscopia de forță atomică (AFM), difuzia dinamică a luminii (DSL), spectroscopia de fotoelectroni excitați cu raze X (XPS), difracția de raze X (XRD), spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR), ionizare prin desorbție laser asistată de o matrice (MALDI), rezonanță magnetică nucleară (RMN).

2.1. Microscopia electronică de transmisie

Microscopia electronică de transmisie (TEM) se bazează pe efectul caracteristicilor structurale ale materialului de analizat asupra trecerii unui fascicul accelerat de electroni printr-un eșantion foarte subțire [42]. Rezoluția unui microscop TEM poate ajunge la 1 Å.

Imaginile obținute permit vizualizarea morfologiei particulelor și o estimare a distribuției dimensionale a particulelor, prin analiză statistică a dimensiunii particulelor ale căror diametre au fost determinate.

2.2. Microscopia de forță atomică

Microscopia de forță atomică (AFM) denumită și microscopia de scanarea forței (SFM – Scanning Force Microscopy) reprezintă o tehnică de analiză a topografiei suprafeței, furnizând imagini bi și tridimensionale, cu rezoluție la nivel atomic. Se pot analiza suprafețe de orice natură (metalice, dielectrice, semiconductoare) precum și unele proprietăți locale ale acestora (mecanice și de aderență, termice, electrice, magnetice). Principiul de funcționare al AFM se bazează pe măsurarea forțelor atractive sau repulsive între un vârf subțire și suprafața unui eșantion [43].

2.3. Difracția de radiații X

Difracția de raze X (XRD) este una dintre cele mai importante tehnici pentru determinarea structurii materialelor. Această metodă are la bază fenomenul de difracție la trecerea prin materialul cristalin a radiațiilor X generate de o sursă ca rezultat al interacțiunii fasciculului de electroni accelerați cu atomii materialului din care este confecționat catodul.

2.4. Spectroscopia de fotoelectroni cu raze X

Spectroscopia de fotoelectroni cu raze X (XPS) este o metodă de analiză a suprafeței care se bazează pe măsurarea spectrului de energie a fotoelectronilor emiși de la suprafața materialului în urma interacțiunii cu radiații X moi monocromatice. În general, XPS este utilizată pentru analiza calitativă și/sau cantitativă a compoziției elementale la suprafață și analiza chimică sau a stării electronice a fiecărui element de pe suprafața probei. Este o tehnică de analiză a suprafeței, având un volum de eșantionare ce se extinde de la suprafață până la o adâncime de aproximativ 50-70 Å [43].

2.5. Spectroscopia de absorbție UV-VIZ

Spectrofotometria de absorbție UV–VIZ se bazează pe absorbția radiațiilor electromagnetice în domeniul de lungimi de undă 200-850 nm de către speciile absorbante aflate în stare gazoasă, lichidă și solidă. Radiația absorbită este transformată într-o altă formă de energie, de cele mai multe ori în căldură.

Legea de bază folosită în analizele sau determinările spectrofotometrice, care descrie fenomenul de absorbție, a fost găsită experimental și fundamentată teoretic de către Bouguer (1729), constituind o legatură între cantitatea de lumină absorbită și proprietățiile soluției pe care o străbate.

Legea Lambert – Beer

Să considerăm o radiație incidentă monocromatică, I0, care trece printr-o cuvă în care este plasată proba de analizat, aceasta având grosimea b și concentrația substanței ce absoarbe lumina c. Conform reprezentării din Figura 9, intensitatea finală, I, este mai mică decât cea initială, I0, în urma absorbției luminii, la trecerea prin celulă. O parte din radiația incidentă este absorbită de speciile din soluție și o parte din ea este împrăștiată.

Figura 9. Absorbția luminii în cazul legii Lambert – Beer [44].

2.6. Spectroscopia de absorbție FTIR

Spectroscopia de infraroșu cu transformată Fourier (FTIR), poate fi utilizată pentru investigarea materialelor gazoase, solide, lichide la temperaturi ridicate sau scăzute. Această tehnică se bazează pe interacțiunea dintre radiațiile electromagnetice și un eșantion și pune în evidență natura vibrațiilor legăturilor chimice dintre atomi sau moleculele ce compun materialul. Spectrul FTIR conține informații privind prezența unor grupări funcționale/tipuri de legături în moleculele probei studiate [45].

2.7. Voltametria ciclică

Voltametria ciclică este în prezent cea mai populară tehnică electroanalitică pentru studiul proceselor electrochimice ale speciilor electroactive [46].

Voltametria ciclică constă în modificarea repetata apotențialului unui electrod de lucru, imersat într-o soluție neagitată, într-un anumit domeniu de potențial și măsurarea curentului de electroliză rezultat.

CAPITOLUL III: Aplicații ale nanoparticulelor

3.1. Activitate antibacteriană

Activitatea antibacteriană a nanoparticulelor depinde de doi factori principali: proprietățile fizico-chimice ale nanoparticulelor și tipul de bacterii.

Nanoparticulele sunt capabile să se atașeze la membrana bacteriilor prin interacțiune electrostatică și să perturbe integritatea membranei bacteriene [47].

Structura peretelui celular al bacteriilor joacă un rol important în apărarea acestora în prezența nanoparticulelor. Însă există mai mulți factori care influențează sensibilitatea și toleranța bacteriilor pentru nanoparticule. De exemplu Escherichia coli (-) este foarte sensibilă, în timp ce Staphylococcus aureus (+) și Bacillus subtilis (+) sunt mai puțin sensibile la nanoparticule de oxid de cupru [48]. Efectul antibacterian al nanoparticulelor de argint este mai mare decât efectul nanoparticulelor de cupru împotriva E. coli (-) și S. aureus (+) [49]. S. aureus (+) și B. subtilis (+) sunt mai sensibile decât E. coli la nanoparticulele de oxid de nichel și oxid de zinc [48].

Un alt factor care influențează toleranța bacteriilor față de nanoparticule este rata creșterii bacteriene. Bacteriile care se dezvoltă rapid sunt mai sensibile decât bacteriile cu creștere lentă la antibiotice și nanoparticule [50],[51].

Mecanismele de toxicitate ale nanoparticulelor impotriva bacteriilor depind de compoziția, modificarea la suprafață, proprietățile intrinseci și de speciile bacteriene. Aceste mecanisme sunt foarte complicate și depind de mai mulți factori cum ar fi proprietățile fizico-chimice ale nanoparticulelor.

Nanoparticulele de TiO2 și ZnO au un potențial slab mutagen care induce muțații în Salmonella typhimurium (-) [52]. Nanoparticulele de TiO2 sunt toxice pentru Pseudomonas aeruginosa (-), Enterococcus hire (+), E.coli (-), S. aureus (+) și Bacteroides fragilis (-), numai în condiții de iluminare UV și ucid aproximativ toate bacteriile in decurs de 60 minute. Aceste nanoparticule nu prezintă toxicitate la întuneric [53]. Nanoparticulele de TiO2 pot crește peroxidarea componentei fosfolipide polinesaturate localizată în membrana lipidică și întrerup procesele de respirație celulară [54].

Toxicitatea nanoparticulelor de cupru depinde de mai mulți factori cum ar fi temperatura, pH-ul, concentrația nanoparticulelor și concentrația bacteriilor (E.coli). Temperatura ridicată și pH-ul scăzut măresc toxicitatea. Formele metalice și ionice de cupru produc radicali hidroxil care distrug proteinele esențiale si ADN-ul [55].

Nanoparticulele de aur în soluție, preparate prin reducerea sării de aur, HAuCl4, cu citratul de sodiu, au prezentat efecte fotomutagene asupra Sal. typhimurium (-). Fotomutagenitatea nanoparticulelor de aur depinde de coexistența ionilor Au3+ și citratului; această proprietate nu este legată de proprietățile intrinseci ale nanoparticulelor de aur. Oxidarea ionilor Au3+ și decarboxilarea citratului în prezența luminii induce generarea de radicali liberi care distrug proteinele esențiale și ADN-ul [56].

Nanoparticulele de argint modificate cu titan sunt toxice pentru E. coli și S. aureus. Nanoparticulele de argint interacționează cu membrana bacteriilor și perturbă integritatea membranei. Ionii de argint se leagă de asemenea de atomii de sulf, oxigen și azot aiunor molecule biologice esențiale și inhibă dezvoltarea bacteriilor [57].

Creșterea eficacității proprietăților antibacteriene a fost demonstrată prin studierea efectului nanoparticulelor de argint atât in vitro cât și in vivo [58], în tratamentul arsurilor, a materialelor dentare, în tratarea apei, în loțiuni de protecție solară etc. [59].

Este bine cunoscut și faptul că ionii de argint și compușii pe bază de argint sunt foarte toxici pentru microorganisme, prezentând puternice efecte biocide pe mai mult de 16 specii de bacterii inclusiv E.coli. Există o serie de efecte bactericide ale nanoparticulelor de argint datorate proprietăților unice ale acestora precum dimensiunile mici, suprafața mare, reactivitatea ridicată. Nanoparticulele de argint prezintă proprietăți fizico-chimice și biologice diferitefață de cele ale sărurilor de argint [60]. Mecanismul efectiv bactericid al nanoparticulelor de argint nu este însă bine cunoscut. Unii cercetători susțin că speciile de argint interacționează tiolic cu grupuri de proteine, în bacterii, afectând replicarea ADN-ului (Figura 10) și ARN-ului bacterian [61]. S-a sugerat, de asemenea, că nanoparticulele de argint atașate la suprafața membranei celulare ar perturba funcțiile bacteriilor [62]. S-a raportat faptul că interacțiunea nanoparticulelor de argint cu bacteriile este dependentă de dimensiune [61].

Pe de altă parte, nanoparticulele pot reprezenta un potențial pericol datorită activității lor deosebite produse de aceleași proprietăți care le fac atât de utile, dar care conduc la consecințe neașteptate in urma interacțiunii cu sistemele biologice. Agenția Națională pentru Protecția Mediului consideră argintul o substanță toxică și a stabilit o doză orală de referință de aproximativ 5 μg/kg din greutatea corporală. Pericolul prezentat de argintul coloidal se datorează incapacității de estimare a concentrației de argint din soluții și mărimea reală a nanoparticulelor de argint.

Figura 10. Clusterii de argint interacționează cu gruparile tiolice din proteine, afectând replicarea ADN-ului și ARN-ului bacterian [63].

3.1.1. Acțiunea nanoparticulelor asupra bacteriilor rezistente la medicamente

Uciderea bacteriilor rezistente la antibiotice necesită multiple medicamente scumpe care pot avea efecte secundare. Ca urmare, tratamentele sunt costisitoare și necesită mult timp. Nanoparticulele pot oferi o nouă strategie de combatere a bacteriilor rezistente la medicamente [64]. Direcționarea nanoparticulelor bactericide la bacteria specifică sau la țesutul infectat constituieo perspectivă eficientă în tratarea infecției pentru că acest fenomen minimizează efectele secundare și intensifică activitatea antibacteriană [65].

Nanoparticulele de ZnO sunt toxice pentru bacteriile rezistente la antibiotice (meticilina), cum ar fi Streptococcus agalactiae (+) și S. aureus (+). Aceste nanoparticule sunt capabile să dezorganizeze și să deterioreze membrana celulară, fapt care conduce la o creștere a permeabilității acesteia, fapt care are consecințe grave conducând până la moartea celulei [66].

3.1.2. Nanoparticule împotriva mediului și a ecosistemelor

Utilizarea pe scară largă a nanoparticulelor în domeniul științei biologice, medicină și produse comerciale, poate conduce la posibile scurgeri sau acumularea de nanoparticule în mediu (de exemplu în sol și apă). Protecția mediului și a bacteriilor benefice față de nanoparticule este foarte importantă deoarece, utilizarea nanomaterialelor pe bază de argint, poate conduce la eliberarea de argint în mediu. Scurgerea nanoparticulelor în mediu constituie una dintre cele mai grave amenințări asupra bacteriilor benefice, comunităților microbiane din ecosisteme și sănătatea publică [67]. Multe bacterii aduc beneficii mediului deoarece ele joacă un rol important atât în procesele de bioremediere cât și în fixarea azotului plantelor [68]. De exemplu, în procesul de nitrificare, azotul amoniacal este transformat în nitrit și apoi la nitrat de către bacteriile nitrificatoare. Nanoparticulele de argint (<5 nm) prezintă toxicitate față de bacteriile nitrificatoare prin interacțiunea cu membrana bacteriană a acestora. Eliminarea acestor bacterii din mediu conduce la reducerea cantității de azot asimilate și în consecință interferă în procesul de creștere a plantelor [69].

3.2. Nanoparticule pentru aplicații biomedicale

Particulele de mici dimensiuni și-au găsit aplicații numeroase atât în procesele de diagnoză, cât și în terapie. Nanoparticulele pot fi injectate intravenos, iar fluxul sangvin va asigura transportul acestora la nivelul regiunii de interes. Acest lucru necesită particule care să nu formeze agregate, ce ar putea provoca embolii, care ar duce la blocarea diseminării lor în torentul sangvin și ar putea cauza efecte nedorite asupra țesuturilor normale.

Apariția nanoparticulelor a deschis noi perspective în domenii diferite de studiu împreună cu alte nanomateriale [70]. O serie de studii au vizat domeniul ingineriei biomedicale. Cea mai importantă proprietate a nanoparticulelor, care a atras atenția cercetătorilor din întreaga lume, reprezintă capacitatea acestora de a fi modificate la suprafață. În general, proprietățile dependente de mărimea nanoparticulelor (în special optice, electronice și magnetice) sunt considerate a fi utile pentru aplicațiile biomedicale [71]. În aplicațiile biomedicale, proprietățile magnetice sunt utilizate în dezvoltarea medicamentelor în vederea implementării unor sisteme de livrare țintită a acestora, în timp ce proprietățile optice sunt utilizate în principal pentru diagnosticare [72].

Eficacitatea multor substanțe utilizate azi ca și medicamente se bazează pe efectul lor țintit asupra unor molecule care intră în constituția membranelorsau în citoplasma celulelor agresoare.

Transportul țintit de medicamente s-a dezvoltat inițial în jurul chimioterapiei cancerului. Primul sistem de transport medicamentos la scară nano a fost realizat prin intermediul micelelor lipidice descrise prima dată în 1960, primind apoi numele de lipozomi. În 1976, Langer și Folkman [73] au demonstrat pentru prima dată eliberarea controlată de medicament din nanoparticule pentru ca în 1980 Leserman și colaboratorii acestuia să creeze primii lipozomi țintiți [74].

Primele teste pre-clinice de succes ale nanoparticulelor bazate pe fier sunt atribuite lui Alexiou și colaboratorilor săi [75] care au stabilit parametrii de țintire ai acestui tip de nanoparticule secundar administrării intraarteriale. Ei au utilizat câmpuri magnetice externe pentru a determina acumularea de nanoparticule la nivelul membrului pelvin unde se găsea tumora indusă. Ferofluidele coloidale erau formate din oxizi de fier și hidroxizi pentru a produce agregate de nanoparticule încapsulate într-o matrice polimerică de amidon, în vederea stabilizării acestora și pentru a pune la dispoziție situsuri de legare ale MTX (metotrexat). După trei luni de observație nu s-a mai detectat tumoră restantă histologic la grupul de pacienți care au fost supuși acestui tratament.

Nichelul a fost puțin utilizat pentru a dezvolta structuri care să faciliteze transportul țintit de medicament probabil datorită magnetizației mici (55 emu/g). Cea mai mare parte a acestor studii au folosit oxizi de nichel în vederea obținerii unor compozite hibride cu fier sau cobalt. În aceste studii nanoparticulele de nichel serveau dreptînductori magnetici de hipertermie, platforme de transport de medicamente sau inductori direcți ai apoptozei [76].

În schimb, o serie de studii recente auvizat obținerea de nanoparticulele bazate pe cobalt datorită magnetizației ridicate (160 și 68 emu/g pentru cobalt elemental și respectiv pentru ferita de cobalt). Ferita de cobalt a fost folosită în sinteza de nanoparticule care urmau a fi apoi internalizate în celule țintă precum celulele stem ce urmau a fi apoi ghidate către situsul dorit prin intermediul unui câmp magnetic extern [77].

Pentru aplicațiile medicale, pe lângă cerința obligatorie ca aceste nanoparticule să fie biocompatibile, ele trebuie să fie și stabile, în acest sens s-au propus mai mulți agenți de stabilizare [78]. Le Guevel și colaboratorii [79] au folosit dializa cu citrat pentru a crește gradul de stabilitate a nanoparticulelor de Mn-Zn, urmând ca după funcționalizare, pe suprafața acestora să fie înglobat medicamentul (doxorubicina).

3.2.1. Nanoparticulele de aur în biomedicină

În ultimele decenii, domeniul nanoparticulelor de aur a cunoscut o dezvoltare semnificativă. Acestea s-au dovedit a fi folositoare în numeroase aplicații biomedicale cum ar fi livrarea controlată a medicamentelor, detecție, imagistică biomedicală, biosenzoristică, diagnostic clinic sau terapia cancerului [80]. Nanoparticulele de aur reprezintă o alegere convenabilă pentru efectuarea de teste biologice datorită dimensiunilor reduse, stabilității termice și chimice, simplității metodelor de sinteză cu un grad redus de toxicitate, posibilității de a fi ulterior funcționalizate cu molecule de interes biologic, precum și proprietăților optice distinctive.

A. Proprietățile optice ale nanoparticulelor de aur

În cazul nanoparticulelor cu dimensiuni mult mai mici decât lungimea de undă a luminii, un câmp electromagnetic incident de o frecvență dată va induce o oscilație rezonantă a electronilor liberi din metal. Amplitudinea acestei oscilații atinge maximul la o frecvență specifică, numită rezonanță plasmonică de suprafață (SPR), care determină apariția unei benzi de absorbție intense în spectrul vizibil [81].

În scopul de a urmări o anumită aplicație, SPR a nanoparticulelor de aur poate fi deplasată pe un domeniu spectral larg [82]. În cazut nanoparticulelor de formă sferică SPR se poate deplasa spre lungimi de undă mai mari prin creșterea dimensiunii acestora, însă aceasta este limitată pe domeniul vizibil. Alte metode pentru deplasarea benzii SPR spre domeniul infraroșu apropiat includ modificarea formei nanoparticulelor spre forme anizotrope cum ar fi bastonașe, triunghiuri, forme stelare sau agregarea nanoparticulelor sferice în structuri bine definite.

B. Microscopia în câmp întunecat pe baza nanoparticulelor de aur pentru imagistica celulară

Microscopia în câmp întunecat este una dintre cele mai populare metode de bioimagistică pe baza nanoparticulelor de aur [83]. În urma excitării nanoparticulelor de aur cu lumină albă, frecvențele corespunzătoare frecvenței SPR a nanoparticulelor sunt puternic împrăștiate, această lumină împrăștiată putând fi colectată utilizând o configurație specifică microscopiei. Ca urmare, nanoparticulele se văd ca niște puncte strălucitoare pe fundal negru, având culoarea corespunzătoare frecvenței SPR. Nanoparticulele de aur de diferite dimensiuni și forme au fost utilizate cu succes în microscopia în câmp întunecat pentru detecția celulelor microbiene, imagistica celulelor cancerigene, identificarea receptorilor de pe suprafața acestora, studiul endocitozei sau chiar imagistica unei tumori.

3.3. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul materialelor polimere inteligente și a nanoparticulelor metale nobile

Domeniile dimensionale ale nanoparticulelor au permis depășirea unor bariere fizice specifice, cum ar fi bariera hemato-encefalică [84]. În acest sens, poate una dintre cele mai interesante descoperiri a fost utilizarea nanoparticulelor de metal nobil. Aceste tipuri de transportatori de medicament se degradează lent datorita sensibilității la pH, temperatură sau prin conjugarea lor cu anticorpi specifici împotriva anumitor componente caracteristice zonei de interes [85]. Direcționarea medicamentului către situl de interes se face prin două mecanisme majore de eliberare:

direcționarea pasivă a medicamentului ce se face prin acumularea de chimioterapice în tumorile solide, ca urmare a permeabilității vasculare din țesuturile tumorale;

orientare activă ce implică funcționalizarea suprafeței transportatorilor de medicament cu liganzi care sunt recunoscuți selectiv de receptorii de pe suprafața celulelor de interes, permițând o direcționare mai precisă.

Dezvoltarea unor formulări farmacologice de succes presupuneeliberarea controlată amedicamentului, respectiv folosirea unor materiale biodegradabile. Eliberarea unui medicament poate fi considerată controlată datorită procesului de difuzie sau datorită degradării polimerului ce alcătuiește transportatorul. Potențialitatea mecanismului de eliberare implică:

desorbția-absorbția medicamentului pusă pe seama interacțiunilor cu suprafața materialului;

difuzia prin matricea operatorului de transport;

difuzia prin peretele transportatorului (nanovezicule);

eroziunea matricii transportatoare;

combinarea difuziei cu eroziunea.

Studiile au arătat că eliberarea pulsantă sau discontinuă este forma optimă de eliberare, deoarece imită modul prin care organismul produce în mod natural hormoni. Pentru această eliberare pulsantă sunt necesari acei transportatori de medicamente (polimeri) să răspundă pulsant la aceiași stimuli specifici (de exemplu, expunerea la lumină, modificarea pH-ului sau a temperaturii). Răspunsul polimerilor la stimulii externi este influențatde nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale, parametru care afectează într-o bună măsură proprietățile de suprafață a coloizilor.

Destabilizarea sistemelor coloidale atât sub formă de vezicule lipidice cât și sub formă de nanoparticule este favorizată de diferiți factori cum ar fi pH-ul, temperatura, forța ionică, dimensiunea particulei, fracțiunea de volum a particulelor, ca și prezența la diferite concentrații a polimerului solubil sau tensioactiv. Utilizarea unor polimeri de acoperire a veziculelor lipidice și a nanoparticulelor, conduce automat la modificarea acestor proprietăți de suprafață. S-a observat că prin acoperirea lipozomilor cu polimeri, stabilitatea poate fi îmbunătățită ca urmarea a repulsiei reciproce între bistraturile lipidice. De asemenea, dispersivitatea și stabilitatea în timp a nanoparticulelor poate fi determinată de natura stabilizatorului, adică a unui polimer matrice [86]. În ultimul timp, o atenție deosebită s-a acordat sintezei de compozite care conțin nanoparticule metalice, cum ar fi Au, Ag, Pt, Pd [87] în matricea polimerică. Pentru înțelegerea acestui fenomen este necesară înțelegerea conformației polimerului adsorbit la suprafața nanoparticulei și interacțiunile dintre coloizi. În general stabilitatea unei soluții poate fi mărită prin acoperirea particulelor cu un strat polimeric (conjugare cu un polimer) [88].

Se poate observa (Figura 11), că la diferite concentrații de polimer se produc diferite efecte asupra stabilității coloidale a nanoparticulelor. Unele particule, cum ar fi coloizi în polimerul dizolvat în apă, sunt relativ ușor de stabilizat, datorită forțelor relativ slabe de tip Van der Waals. Particulele de oxizi metalici în apă, prezintă forțe Van der Waals mai puternice și pot fi dificil de stabilizat. Forțele sterice care se manifestă între suprafețele particulelor acoperite cu polimer sau în soluții care conțin polimeri neadsorbiți, pot modula forțele interparticule, producând o forță suplimentară sterică repulsivă (care este la origine predominant entropică), sau o forță de epuizare a atracției dintre ele (finalizare a floculării și a stabilizării). În cazul în care masa moleculară a lanțurilor atașate la o interfață este comparabilă sau mai mare decât cea a polimerului liber, pot avea loc efecte semnificative atât asupra stabilizării cât și a floculării.

Figura 11. Efectul adsorbției de polimer asuprastabilizării și floculării particulelor coloidale (imagine adaptată) [63].

Stabilizarea soluțiilor coloidale este definită în acord cu valoarea medie a potențialului Zeta care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să nu floculeze (Figura 12). Problema stabilizării nanoparticulelor ar trebui să fie rezolvată prin utilizarea unor polimeri sintetici sau naturali, datorită capacității acestor particule de a-și forma o barieră liofilică sterică constituită dintr-un strat continuu de lanțuri polimere solvatate.

Totuși interacțiunile ce au loc între polimeri și nanoparticule sunt extrem de complexe și atunci problema stabilității rămâne încă deschisă.

Figura 12. Sarcina netă de la suprafața unei particule afectează distribuția ionilor în regiunea interfacială înconjurătoare [63].

3.4. Efectul nanoparticulelor de aur asupra fluorescenței proteinelor

Este cunoscut faptul că nanoparticulele modifică spectrul de emisie a substanțelor fluorofore din vecinătatea lor [89]. Aplicații sunt din cele mai diverse, în special în domenii precum biologie moleculară, chimie, știința materialelor, fotonică sau medicină. În special fenomenul de amplificare al fluorescenței este intens studiat datorită potențialelor aplicații în dezvoltarea unor sisteme de detecție bazate pe fluorescență moleculară.

Fluorescența moleculelor este influențată de către rezonanțele plasmonice ale nanoparticulelor metalice prin mai multe mecanisme:

prin amplificarea câmpului electromagnetic incident astfel: la lungimea de undă de rezonanță, în urma interacției dintre lumină și nanoparticulele de metal nobil, rezonanțele plasmonice sunt amplificate [90];

prin stingerea fluorescenței moleculelor, datorată transferului de energie la metal (efect de stingere a fluorescenței) [91];

prin creșterea ratei de dezexcitare a moleculei fluorescente, datorită existenței unui mediu cu o densitate mai mare de stări optice [92].

Unul din efectele cel mai des întâlnite în cazul legării nanoparticulelor de molecule fluorescente îl constituie efectul de stingere a fluorescenței moleculei fluoroforului. De-a lungul timpului, s-au realizat numeroase studii ale efectului de stingere a fluorescenței în prezența nanoparticulelor. În 1999, Murray și colaboratorii au realizat studii de stingere a fluorescenței fluoresceinei în prezența nanoparticulelor de aur stabilizate cu tiopronină [93]. Același grup de cercetători a demonstrat că transferul de energie între nanoparticulă și fluorofor este mai eficient dacă molecula ce stabilizează nanoparticula are lanțul mai scurt. Prin urmare, efectele de stingere a fluorescenței sunt dependente de distanța dintre fluorofor și nanoparticula de aur. Studii similare au demonstrat că efectul de stingere a fluorescenței se datorează creșterii ratei de dezexcitare a moleculei fluorescente, prin cuplajul electronic a moleculelor excitate cu nanoparticula [92].

3.5. Bio-funcționalizarea nanoparticulelor de aur

Nanoparticulele pot fi fabricate având o mare varietate de grupări funcționale la suprafața lor, prin bio-funcționalizare. Pentru a introduce anumite grupări funcționale pe suprafața nanoparticulelor, cel mai simplu mod este acela de a substitui agentul stabilizator al nanoparticulei cu liganzi cu funcționalitate asemănătoare, spre exemplu cu tioli sau grupări di-sulfidice, în cazul nanoparticulelor de aur și argint.

O modalitate nouă de atașare a unor bio-molecule pe suprafața nanoparticulelor presupune activarea selectivă a anumitor grupări funcționale (tioli) de pe suprafața particulelor, folosind laseri de precizie, aceste grupări permițând atașarea ulterioară a unor molecule de interes, cu posibilitatea de a atașa mai multe molecule, cu funcționalități diferite, pe suprafața aceleiași particule [94].

Absorbția bio-moleculelor pe suprafața nanoparticulelor este un subiect de actualitate, fiind studiată în special bio-funcționalizarea nanoparticulelor utilizând peptide [95], proteine [96] și acizi nucleici [97]. În cazul nanoparticulelor stabilizate cu liganzi anionici (precum citratul de sodiu), proteinele de cele mai multe ori se absorb pe suprafața nanoparticulelor prin interacțiuni necovalente, electrostatice [95]. Spre exemplu, nanoparticulele de aur au fost bio-funcționalizate utilizând ca proteine: imunoglobulina G (IgG) [98], albumina serică bovină (BSA) [99], citocromul c, pH-ul soluțiilor fiind ajustat la valoare puțin mai mare decât punctul izoelectric al ligandului (proteinei), înainte de interacțiune. Aceasta permite legarea prin interacțiuni electrostatice a aminoacizilor încărcați pozitiv de pe suprafața proteinei de grupările citrat, negative, ce stabilizeaza nanoparticulele. Au fost raportate studii cu privire la adsorbția pe suprafața nanoparticulelor de aur, prin intermediul interacțiunilor columbiene între grupările -NH2 ale lizinei sau -SH ale cisteinei din structura proteinelor și nanoparticulele respective.

Avantajul adsorbției fizice, în detrimentul legăturilor covalente, este acela că astfel nanoparticulele de aur nu afectează structura macro-moleculelor, menținându-se caracterul nativ al ligandului și specificitatea interacțiunilor cu alte molecule de interes bio-medical [100].

3.6. Aplicații ale nanoparticulelor de aur în bio-detecție

Asamblarea organizată a particulelor de dimensiuni nanometrice prezintă interes pentru oanumită clasă de nanomateriale care oferă un potențial deosebit în realizarea structurilor unidimensionale, bidimensionale și tridimensionale pentru o varietate largă de aplicații [101].

Nanoparticulele metalice se folosesc ca și "blocuri de construcție" în designul diferitelor dispozitive. Legarea nano-materialelor cu suporturile biologice, utilizând specificitatea structurală a materialelor biologice și proprietățile electronice și optice ale nanomaterialelor permit realizarea unor structuri biologice cu caracteristici noi, distincte de cele obișnuite [102]. Posibilitatea de a lega de particule metalice molecule organice a generat un vast domeniu pentru designul nanoparticulelor funcționalizate [103],[104].

Reacțiile de recunoaștere moleculară dintre macromolecule și suprafețe create articifial (nanoparticule bio-funcționalizate) pot fi folosite în controlul proceselor celulare și extracelulare, pentru aplicații terapeutice, oferind noi posibilități de diagnostic și dezvoltarea unor noi sisteme de detecție.

Nanoparticulele de aur bio-funcționalizate pot fi utilizate pentru detectarea diferitelor clase de macromolecule, dintre care cele mai importante sunt proteinele și acizii nucleici. Principiul care stă la baza procedeelor de detecție este specificitatea mare dintre diferite bio-molecule și apariția unor modificări în spectrele optice ale nanoparticulelor de aur bio-funcționalizate în urma complexării.

O altă abordare a bio-senzorilor optici cu nanoparticule de aur o reprezintă detecția SERS, câmpul electromagnetic intens din vecinătatea nanoparticulei ducând la amplificarea semnalului Raman pentru moleculele aflate în apropierea nanoparticulelor, obținându-se astfel sensibilitate de detecție ridicată. În acest sens, s-au obținut bio-senzori colorimetrici bazați pe fenomenul de agregare al nanoparticulelor.

Nanoparticulele de aur pot fi utilizate pentru creșterea sensibilității unor senzori electrochimici. Sunt utilizate în construcția senzorilor fie prin atașarea nanoparticulelor pe suprafața electrodului de lucru, fie prin funcționalizarea lor cu receptori, precum enzime, anticorpi, oligonucleotide [97]. Prin atașarea unor nanoparticule de aur pe un electrod plan, se mărește considerabil suprafața activă a electrodului, sistemul fiind astfel sensibil la variații foarte mici ale curenților sau tensiunii.

Nanoparticulele pot fi asamblate pe o varietate largă de substrate, unele prin mijloace foarte ingenioase, dar tehnica nanoingineriei solicită controlul pe scară nanometrică, și anume controlul asupra morfologiei aranjării nanoparticulelor la suprafață. Substratele pot fi de sticla conductoare (de exemplu sticla ITO – avand la suprafata un strat de oxid de indiu si staniu) sau neconductoare (cuarț, sticlă cu carbonat de sodiu). Toate aceste substrate sunt caracterizate de transparență și de posibilitatea funcționalizării la suprafață a grupării OH. Substratele de sticlă permit caracterizarea filmelor subțiri obtinute, utilizand metode spectroscopice și de microscopie electronică.

Îmbunătățirea semnalului redox de către nanoparticule se datorează reducerii distanței dintre centru activ, redox, al proteinei, și suprafața electrodului plan, astfel se îmbunătățește transferul de sarcină de la electrolit la electrod. Mai mult decat atât, proteinele atașate pe suprafața nanoparticulelor de aur îsi păstrează funcția biologică specifică [100].

Dintre cei mai utilizați biosenzori electrochimici cu nanoparticule de aur, se numără senzorii enzimatici, imunosenzorii, aptasenzorii, în funcție de substanța activă a senzorului [105].

În cazul senzorilor enzimatici, semnalul electric provine de la o reacție enzimatică, în cazul imunosenzorilor, acest semnal apare în urma reacției specifice anticorp-antigen, iar în cazul senzorilor cu ADN (aptasenzorilor), semnalul se datorează în principal complementarității bazelor azotate din macromolecula de ADN.

Biosenzorii electrochimici cu nanoparticule de aur pot fi utilizați pentru detecția unor clase de substanțe: proteine [106],[107], secvențe de nucleotide [108],[109], substanțe cu potențial toxic, cu utilizări în creșterea calității vieții. O componentă importantă a biosenzorilor cu nanoparticule de aur o reprezintă interacțiunea specifică anticorp-antigen (de exemplu:biotină-streptavidină [110], albumină-imunoglobulină). În acest caz, pe un substrat solid se auto-asamblează un strat de nanoparticule de aur biofuncționalizate cu anticorpul. In prezența antigenului dintr-o soluție, se modifică semnalul electrochimic primit de la substratul bio-funcționalizat, astfel realizându-se detecția substanțelor de interes.

Au fost creați senzori electrochimici cu nanoparticule de aur, bio-funcționalizate cu enzime (tirozinază) pentru detecția bisfenolului A, utilizând voltametria ciclică. Tirozinaza este atașată pe nanoparticule prin intermediul glutaraldehidei, iar semnalul este diminuat în urma atașării pe suprafața electrodului a bisfenolului A [111]. Un alt senzor ce utilizează complexul nanoparticule de aur/(clorură de poli-dialil-dimetilamoniu)/nanotuburi de carbon este folosit pentru detecția colesterolului, prin intermediul enzimei colesterol-oxidază, limita de detecție fiind de ordinul milimolilor. [112].

Nanoparticulele de aur îmbunătățesc transferul de sarcină în cazul detecțieiglucozei, prin intermediul glucoz-oxidazei, detecția realizându-se prin măsurători devoltametrie ciclică și spectroscopie de impedanță [113].

Numeroși senzori electrochimici cu nanoparticule de aur se bazează pe activitatea electrocatalitică a peroxidului de hidrogen (apa oxigenată). Prin depunerea nanoparticulelor de aur pe un electrod de platină, acoperit cu un strat de polivinil ferocen (PVF) se realizează detecția amperometrică a unor xantine, răspunsul electrochimic fiind dat, în acest caz, de activitatea electrocatalitică datorată H2O2 ce se formează în urma oxidării analitului [114].

CAPITOLUL IV: Partea experimentală

IV.1 Aparatura, materialele și reactivii utilizați

Aparatura:

Balanța analitică (firma Partner);

pH- metru (firma Hanna Instruments);

Incubator (eppendorf);

Baie cu ultrasunete;

Agitator magnetic;

Spectrofotometru Libra 35S (Biochrom, UK);

Fluorimetru pentru microplăci (Turner Biosystem, USA).

Materiale:

Tuburi Eppendorf;

Pipete automate;

Cilindru gradat pentru măsurarea volumului;

Pipete Pasteur;

Pahar Berzelius;

Baghetă magnetică;

Folie de aluminiu.

Reactivi:

Ulei de porumb;

Ulei de floarea soarelui de primă presă;

Ulei de in;

Ulei de măsline;

Apă bidistilată (de tip MilliQ, Milipore, SUA);

Acid cloroauric;

Citrat de sodiu;

Soluție tampon Hepes (4-(2-hidroxietil)-1-acid piperazinetansulfonic) – KOH, pH = 7;

n-hexan;

vitamina E;

Tirozină;

Carbonat de sodiu;

reactiv Folin-Ciocâlteu.

Figura 1. pH-metru (firma Hanna Instruments; stânga) și agitator magnetic (dreapta).

Figura 2. Spectrofotometru Libra 35S

Figura 3. Incubator

Figura 4. Fluorimetru pentru microplăci

IV.2. Sinteza nanoparticulelor de aur

IV.2.1. Sinteza nanoparticulelor de aur prin reducere cu citrat de sodiu

Nanoparticulele de aur au fost obținute prin reducerea clorurii de aur (III), AuCl3, cu citrat de sodiu în soluție apoasă. Ionii de citrat acționează atât ca agenți reducători, cât și ca agenți de stabilizare.

A. Pregătirea probelor

S-a preparat o soluție de HAuCl4 de concentrație 30,6 mM (coeficientul molar de extincție al Au3+ a fost 0,4 mM-1cm-1). Din soluția stoc inițială s-au preparat două soluții de aur de concentrație 1 mM respectiv 3 mM.

B. Sineza nanoparticulelor de aur

Probele care conțineau un volum de 200 μl soluție de aur au fost incubate timp de 5 minute la 90 °C. Ulterior s-a pipetat un volum de 10 μl citrat 1% si probele au fost termostatate timp de 20 minute și la final răcite sub jet de apă. S-a observat obținerea unei colorații roșii-brune după circa 7 minute, iar la sfârșitul perioadei de incubare (20 minute) colorația a fost albastru-intens (Figura 5):

Figura 5. Virajul de culoare al nanopartoculelor de aur sintetizate.

IV.2.2. Sinteza nanoparticulelor de aur cu soluție tampon Hepes

A. Prepararea soluției Hepes 50 mM

S-a cântărit o cantitate de 1,191 g Hepes, cu masa moleculară de 238,31 g/mol, care a fost dizolvată în 40 mL apă bidistilată. Cu ajutorul unei pipete Pasteur s-a adăugat treptat o soluție de KOH de concentrație 1 M, pentru a ajusta pH-ul soluției la 7. Valoarea pH-ului s-a controlat cu ajutorul unui pH-metru care a fost calibrat în prealabil cu două soluții tampon standard (de pH 7, respectiv 10). După ajustarea valorii pH-ului s-a adaugat apă distilată până ce volumul final al soluției ajunge la 100 mL, într-un cilindru gradat cu aceeași capacitate. În final se transvazează soluția într-un pahar închis.

B. Sinteza nanoparticulelor de aur

Inițial, într-o cuvă, s-au pipetat 900 µL soluție tampon Hepes, pH=7 și 5 µL acid tetracloroauric preparat anterior, pentru a monitoriza periodic reducerea ionilor de aur în soluție, cu ajutorul spectroscopiei UV-Viz. Producerea de nanoparticulelor de aur a fost evaluată cu ajutorul spectrofotometrului într-o gamă de lungimi de undă de la 200 până la 700 nm. Nanoparticulele rezultate s-au evidențiat printr-un maxim de absorbție la lungimea de undă de 600-700 nm. S-au realizat 4 spectre de absorbție, la intervale de timp egale (la fiecare cinci minute; Figura 6; după 15 minute si 20 minute concentrația nanoparticulelor de aur a crescut considerabil) și 10 spectre, la intervale de două minute (Figura 7).

Figura 6. Spectrele de absorbție UV-viz ale nanoparticulelor de aur formate într-un interval de timp de 20 minute, cu citiri din cinci în cinci minute.

Figura 7. Spectrele de absorbție UV-viz ale nanoparticulelor de aur formate într-un interval de timp de 20 minute, cu citiri din două în două minute (de jos în sus).

IV.2.3. Sinteza nanoparticulelor de aur folosind ulei de porumb, n-hexan și soluție tampon Hepes

A. Pregătirea probelor

În 4 tuburi Eppendorf s-au pipetat cantitățile din Tabelul 1.

Tabelul 1. Pregătirea probelor cu sau fără ulei de porumb.

B. Virajul de culoare al nanoparticulelor de aur sintetizate

S-au comparat vitezele de formare ale nanoparticulelor de aur din tuburi, la două temperaturi diferite. Primele două tuburi, T și t, au fost lăsate la temperatura camerei, 25 °C, iar tuburile T' și t' au fost incubate la o temperatură de 95 °C și centrifugate la 4000 rpm.

Formarea nanoparticulelor de aur a fost confirmată vizual, apoi prin spectroscopia UV-Viz.

Soluțiile din tuburile menținute la temperatura camerei și cele incubate s-au colorat după cum urmează:

tubul T → albastru deschis spre alb (la 25 °C, după 30 minute);

tubul t → albastru (la 25 °C, după 30 minute);

tubul T' → roșu-brun deschis (la 95 °C, după 40 secunde și se intensifică după 5 minute);

Tubul t' → roșu-brun (la 95 °C, după 40 secunde și se intensifică după 5 minute).

Figura 8. Virajul de culoare al nanoparticulelor de aur sintetizate la două temperaturi diferite în prezența (T sau T’) sau absența (t sau t’) uleiului de porumb.

Aceste schimbări de culoare indică sinteza nanoparticulelor de aur atât în prezența cât și în absența uleiului de porumb. Interesant este faptul că uleiul de porumb inhibă formarea nanoparticulelor, atât la temperatura camerei, cât și la o temperatură mai ridicată.

C. Analiza UV-Viz a nanoparticulelor de aur sintetizate

Probele care conțineau ulei de porumb au fost diluate în soluția tampon Hepes folosind un raport de 1:4. Prezența nanoparticulelor de aur a fost evidențiată cu ajutorul spectrofotometrului într-un interval de lungimi de undă de la 200 până la 900 nm (Figura 9). Spectrul UV-Viz a prezentat următoarele maxime ce confirmă prezența nanoparticulelor de aur în cazul probelor fără ulei:

soluția fără ulei la 25 °C → 650 nm;

soluția cu ulei la 25 °C → 690 nm;

soluția fără ulei la 95 °C → 340 si 540 nm;

soluția cu ulei la 95 °C → 340 si 540 nm (intensitate mică).

În spectrele UV-Viz se observă faptul că la temperatură mai mare benzile de absorbție caracteristice nanoparticulelor de aur sunt deplasate spre lungimi de undă mai mici.

Figura 9. Spectrele de absorbție UV-Viz ale nanoparticulelor de aur formate la 25 °C, respectiv 95 °C.

Comparând cele două metode de obținere, cu ulei, fără ulei, la temperatură normală și la incubare, se poate spune că, atunci când sintezele se realizează la 95 °C, procesele de nucleație și creștere sunt foarte rapide, iar uleiul de porumb inhibă formarea nanoparticulelor.

IV.2.4. Sinteza nanoparticulelor de aur cu ulei de in, ulei de măsline, ulei de floarea soarelui, n-hexan și soluție tampon Hepes

A. Pregătirea probelor

În 10 tuburi Eppendorf s-au pipetat cantitățile de probe, în conformitate cu Tabelul 2.

Tabelul 2. Volumele componentilor amestecului de reactie (l).

Toate uleiurile au fost dizolvate în n-hexan. Concentrația finală a fost de 1%. m, M, M’ si M’’ sunt soluțiile martor.

B. Virajul de culoare al nanoparticulelor de aur sintetizate

S-au comparat vitezele de formare a nanoparticulelor de aur din tuburi, la temperaturi diferite. Primele patru tuburi, X, Y, Z și m, au fost lăsate la temperatura camerei, 25 °C, iar tuburile X', Y', Z', M, M' și M'' au fost incubate la o temperatură de 95 °C și centrifugate la 4000 rpm.

Formarea nanoparticulelor de aur a fost confirmată vizual, apoi prin spectroscopia UV-Viz.

Soluțiile din tuburile lăsate la temperatura camerei și cele incubate s-au colorat după cum urmează:

tubul X → albastru deschis (la 25 °C, după 30 minute);

tubul Y → albastru (la 25 °C, după 30 minute);

tubul Z → albastru deschis spre alb (la 25 °C, după 30 minute);

tubul m→ albastru (la 25 °C, după 30 minute);

tubul X'→ albastru (la 95 °C, după 40 secunde și se intensifică după 5 minute);

tubul M→ roșu-brun (la 95 °C, după 60 secunde se colorează în albastru și în roșu-brun după 5 minute);

tubul Y'→ roșu-brun (la 95 °C, după 60 secunde se colorează în albastru și în roșu-brun după 5 minute);

tubul M'→ roșu-brun deschis (la 95 °C, după 60 secunde se colorează în albastru și în roșu-brun deschis după 5 minute);

tubul Z' → roșu-brun deschis (la 95 °C, după 60 secunde se colorează în albastru și în roșu-brun deschis după 5 minute);

tubul M''→ roșu-brun deschis (la 95 °C, după 60 secunde se colorează în albastru și în roșu-brun deschis după 5 minute).

Figura 10. Virajul de culoare al nanoparticulelor de aur sintetizate la temperatura camerei (25 °C).

Figura 11. Virajul de culoare al nanoparticulelor de aur sintetizate la incubare (95 °C).

Schimbările de culoare indică sinteza nanoparticulelor de aur.

C. Analiza UV-Viz a nanoparticulelor de aur sintetizate

Din spectrul UV-Viz al nanoparticulelor de aur sintetizate la temperatura camerei (Figura 12) se observă că benzile corespunzătoare uleiurilor de in, măsline și floarea soarelui (roșu, albastru și verde) au intensitate mică, în raport cu banda caracteristică probei de referință. Uleiurile inhibă formarea nanoparticulelor la temperatura camerei.

Figura 12. Spectrele de absorbție UV-Viz ale nanoparticulelor de aur formate la 25 °C în absența (negru) sau prezența uleiurilor (roșu- ulei de in, albastru- ulei de măsline, verde- ulei de floarea soarelui).

Figura 13. Spectrele de absorbție UV-Viz ale nanoparticulelor de aur formate la 95 °C (roșu-ulei de in, verde-ulei de măsline, maro-ulei de floarea soarelui).

Spectrul UV-Viz al nanoparticulelor de aur sintetizate la 95 °C cu diferite uleiuri (Figura 13), prezintă următoarele maxime ce confirmă prezența nanoparticulelor de aur:

ulei de in (roșu) – 620 nm;

ulei de măsline (verde) – 540 nm;

ulei de floarea soarelui (maro) – 540 nm.

S-a constatat faptul că uleiurile de in și floarea soarelui inhibă formarea nanoparticulelor la temperatura camerei, în schimb accelerează formarea lor la incubare. Uleiul de măsline favorizează formarea nanoparticulelor de aur atât la încălzire cât și la temperatura camerei.

Pentru o precizie mai mare experimentul a fost repetat de patru ori. S-au cântărit uleiurile și s-au dizolvat în n-hexan:

1. ulei de porumb: 0,0247 g + 247 μl n-hexan;

2. ulei de in: 0,0335 g + 335 μl n-hexan;

3. ulei de măsline: 0,0477 g + 477 μl n-hexan;

4. ulei de floarea soarelui: 0,0309 g + 309 μl n-hexan.

S-a diluat soluția de AuCl3, de concentrație 46 mM. Într-un tub Eppendorf s-au pipetat 120 μl AuCl3 și 1080 μl apă bidistilată. Soluția rezultată a avut concentrația 4,6 mM.

S-au realizat cele 20 de probe după cum urmează:

Tabelul 3. Pregătirea probelor

Referinta (R): 900 μl soluție tampon Hepes+20 μl n-hexan+30 μl AuCl3;

Ulei de porumb (P): 900 μl soluție tampon Hepes+20 μl ulei de porumb dizolvat în n-hexan+30 μl AuCl3;

Ulei de in (I): 900 μl soluție tampon Hepes+20 μl ulei de in dizolvat în n-hexan+30 μl AuCl3;

Ulei de măsline (M): 900 μl soluție tampon Hepes+20 μl ulei de măsline dizolvat în n-hexan+30 μl AuCl3;

Ulei de foarea soarelui (F): 900 μl soluție tampon Hepes+20 μl ulei de floarea soarelui dizolvat în n-hexan+30 μl AuCl3)

Toate probele au fost incubate timp de 5 minute la temperatura de 95 °C. Soluțiile s-au colorat de la roșu deschis până la roșu brun (Figura 14). Probele care au conținut uleiul de in s-au comportat diferit.

Figura 14. Virajul de culoare al nanoparticulelor de aur sintetizate la incubare (95 °C).

Probele au fost analizate cu ajutorul fotometrului pentru microplăci (Tabelul 4). Pentru fiecare probă s-a calculat media absorbanțelor (la lungimea de undă de 560 nm) rezultată din patru experimente consecutive.

Tabelul 4. Absorbanțele și media acestora pentru fiecare probă.

Figura 15. Diagramă ce reprezintă media absorbanțelor celor patru probe:

proba martor, proba cu ulei de porumb, in, măsline și floarea soarelui.

IV.3. Posibila influență a Vitaminei E asupra formării nanoparticulelor de aur

Uleiurile vegetale sunt acizi grași mono- sau poli-nesaturați și sunt o bogată sursă de vitamine (A, D, E și F).

S-au făcut următoarele diluții ale vitaminei E:

E1 → 5 μl vitamina E + 100 μl n-hexan;

E2 → 5 μl din E1 + 100 μl n-hexan;

E3 → 5 μl din E2 + 100 μl n-hexan;

E4 →5 μl din E3 + 100 μl n-hexan.

Pentru a vedea dacă vitamina E din uleiurile vegetale a intervenit în sinteza nanoparticulelor s-au realizat probe după cum urmează:

tubul 1: (proba martor) → 900 μl soluție tampon Hepes, 20 μl n-hexan și 5 μl clorură de aur;

tubul 2: → 900 μl soluție tampon Hepes, 20 μl E1 și 5 μl clorură de aur;

tubul 3: → 900 μl soluție tampon Hepes, 20 μl E2 și 5 μl clorură de aur;

tubul 4: → 900 μl soluție tampon Hepes, 20 μl E3 și 5 μl clorură de aur;

tubul 5: → 900 μl soluție tampon Hepes, 20 μl E4 și 5 μl clorură de aur.

Toate probele au fost incubate la temperatura de 95 °C și centrifugate la 4000 rpm timp de 5 minute. Inițial probele au fost incolore, apoi virajul de culoare (Figura 16):

Figura 16.Virajul de culoare al probelor după incubare.

S-a constatat faptul că la concentrații mai mici de vitamina E intensitatea culorii soluției incubate a fost mai mare. Astfel, s-a constatat că vitamina E din uleiurile vegetale influențează procesul de formarea a nanoparticulelor de aur.

IV.4. Spectrele UV ale uleiurilor utilizate în sinteza nanoparticulelor

În Figura 17 sunt prezentate spectrele în ultraviolet ale uleiurilor dizolvate în n-hexan.

Figura 17. Spectrele UV-viz ale uleiurilor de porumb (1), in (2); floarea soarelui (3) și măsline (4) dizolvate în n-hexan. 100 mg ulei a fost dizolvat in 500 l n-hexan; probele au fost diluate 1:20 în n-hexan cu o singură excepție–proba cu uleiul de in a fost diluată 1:50. Drept referință s-a considerat spectrul UV-viz al acetatului de α-tocoferil (T; dintr-o tableta Biopharm; de diluție 1:8000).

Datorită faptului că maximul de absorbție al vitaminei E (notată cu T în figura 17) este apropiat de maximele de absorbție ale polifenolilor, este dificil de cuantificat spectral concentrația acestora. Din acest motiv, în etapa următoare s-a încercat cuantificarea polifenolilor prin metoda Folin-Ciocâlteu și implicit stabilirea unor corelații între nivelul și capacitatea acestor compuși de a contribui la formarea nanoparticulelor de aur.

IV.5. Metoda Folin-Ciocâlteu

IV.5.1. Prepararea reactivilor

A. Pregătirea reactivului Folin-Ciocâlteu

1 mL soluție concentrată Folin-Ciocâlteu a fost diluată cu 9 mL apă distilată (soluția A).

B. Pregătirea soluției de carbonat de sodiu

5,75 g carbonat de sodiu au fost diluate cu apă distilată până la un volum total de soluție de 50 mL (soluția B).

C. Pregătirea probelor cu uleiuri dizolvate în n-hexan

1. ulei de porumb: 0,0218 g + 218 μl n-hexan;

2. ulei de in: 0,0426 g + 426 μl n-hexan;

3. ulei de măsline: 0,0234 g + 234 μl n-hexan;

4. ulei de floarea soarelui: 0,0273 g + 273 μl n-hexan.

D. Pregătirea soluției cu tirozină

O cantitate de 1,5 mg tirozină a fost dizolvată în 1 mL soluție carbonat de sodiu rezultând o soluție de concentrație 8,27 mM (soluția C).

IV.5.2. Curba de calibrare în soluție apoasă

Într-o plăcuță s-au pipetat probe în 12 godeuri (6 probe în duplicat) conform Tabelului 5 și s-au citit absorbanțele la o lungime de undă de 750 nm.

Tabelul 5. Pregătirea probelor pentru fotometru.

După adăugarea reactivilor au rezultat colorații albastre, în funcție de cantitatea de tirozină adaugată (Figura 18).

Figura 18. Colorațiile rezultate după adăugarea reactivilor: carbonat de sodiu, tirozină, reactiv Folin-Ciocâlteu.

Figura 19. Curba de calibrare (tirozină).

IV.5.3. Curba de calibrare în prezența n-hexanului

În godeurile unei microplăci s-au adăugat carbonat de sodiu, reactivul Folin-Ciocâlteu și uleiurile dizolvate în n-hexan. S-a observat faptul că reactivul Folin-Ciocâlteu a fost instabil și din acest motiv nu a fost posibilă estimarea concentrației polifenolilor (care de obicei este de ordinul ppm) în prezența acestui solvent organic.

Concluzii

În prima parte a tezei de licență s-au prezentat aspectele teoretice, făcând o trecere în revistă a rezultatelor prezentate în literatura de specialitate, cu privire la metodele de sinteză, caracteristicile și aplicațiile nanoparticulelor metalice.

Nanoparticulele metalice sunt foarte atractive pentru a gamă largă de aplicații cum ar fi în domeniile științei biologice, medicină, produse comerciale și biomedicinei. Însă, pe lângă efectele benefice pe care le oferă, nanoparticulele metalice pot avea și efecte negative, de exemplu asupra mediului și ecosistemului. Utilizarea pe scară largă a nanoparticulelor poate conduce la posibile scurgeri sau acumularea de nanoparticule în mediu (de exemplu în sol și apă).

În partea a doua s-au sintetizat și caracterizat nanoparticule de aur.

S-au preparat nanoparticule de aur pornind de la acidul tetracloroauric, folosind ca agent reducător citratul de sodiu. S-a continuat cu sinteza nanoparticulelor din acidul tetracloroauric în prezența soluției tampon Hepes și în prezența diferitelor tipuri de ulei (ulei de măsline, in, porumb și floarea soarelui) cu scopul implementării unei metode noi pentru obținerea nanoparticulelor metalice.

Formarea nanoparticulelor de aur a fost inițial confirmată vizual și apoi prin spectroscopia UV-Viz (prin determinarea maximului de absorbție). În spectrul vizibil acestea prezintă un maxim de absorbție cuprins în intervalul 510-550 nm, iar creșterea dimensiunii nanoparticulelor generează un nou maxim de absorbție la o lungime de undă superioară.

Comparând cele două metode de obținere, cu ulei, fără ulei, atat la temperatură normală cât și la temperatură ridicată, se poate spune că, atunci când sintezele se realizează la 95 °C, procesele de nucleație și creștere sunt foarte rapide, iar uleiul de porumb inhibă formarea nanoparticulelor. S-a constatat că uleiurile de in și floarea soarelui inhibă formarea nanoparticulelor la temperatura camerei, în schimb accelerează formarea acestorala incubare. Uleiul de măsline accelerează formarea nanoparticulelor de aur atât la încălzire cât și la temperatura camerei. Pentru exactitatea informațiilor experimentul a fost repetat de patru ori.

S-a verificat dacă vitamina E a contribuit la formarea nanoparticulelor. S-a constatat că vitamina E influențează acest proces, iar concentrația polifenolilor din aceste uleiuri a fost infimă și din acest motiv greu de estimat.

Astfel, pe baza rezultatelor experimentale preliminare, ne propunem dezvoltarea unei metode care să ne furnizeze informații legate de calitatea uleiurilor comerciale în funcție de capacitatea acestora de a stimula/inhiba procesul de sinteză al nanoparticulelor metalice.

BIBLIOGRAFIE

[1] R. P. Feynman, “There’s plenty Room at the Bottom,” Eng. Sci., 1959.

[2] M. Faraday, Philos. Trans. R. Soc. London, pp. 147:145–181, 1857.

[3] D.J., Barber, I.C., Freestone, Archaeometry, pp. 32:33–45, 1990.

[4] B. Brunetti, I. Mariani, A. Sgamellotti, F. Cariati, P. Fermo, M. Mellini, C. Viti, Appl. Surf. Sci., pp. 185:206–216, 2002.

[5] N. Taniguchi, Proc. Intl. Conf. Prod. Eng., 1974.

[6] K.Y. Park, M. Ullmann, Y. J. Suh, S. K. Friedlander, J. Nanopart. Res., pp. 3, 309, 2001.

[7] L. B. Lueck, Magn. Media Intern. Newslett, pp. 12, 43, 1996.

[8] T. Tani, L.Madler, S. E. Pratsinis, J. Nanopart. Res., pp. 4, 337, 2002.

[9] A. P. Jamet, W. Wernsdorfer, C. Thirion, D. Mailly, V. Dupuis, P. M’ elinon, Phys. Rev. Lett., pp. 86, 4676, 2001.

[10] D. K. Hermans, S. Sadasivan, C.M.G. Judkins, B.F.G. Johnson, S. Mann, Adv.Mater, pp. 15, 1853, 2003.

[11] R.L. Axelbaum, Proc. of the Joint NSF-NIST Conference on Nanoparticles Synthesis, Processing into-functional nanostructures and characterization.

[12] M. George, A.M. John, S.S. Nair, P.A. Joy, M.R. Anantharam, J. Magn. Magn. Mater., p. 302,190, 2006.

[13] I.M.L. Billas, A. Châtelain, W.A. de Heer, J. Magn. Magn. Mater, pp. 168, 64, 1997.

[14] I.M.L. Billas, A. Châtelain, W.A. de Heer, Surf. Rev. Lett., pp. 2, 429, 1996.

[15] A. Müller, E. Beckmann, H. Bögge, M. Schmidttmann, S. Dress, Ang. Chem. Int., pp. 41, 1162, 2002.

[16] T.M. Tillotson, R.L. Simpson, L.W. Hrubesh, A.Gash, US Patent, No. 6.986.818 B2, 2006.

[17] Eveline Popovici, Emiliana Dvininov, Materiale nanostructurate avansate, 2007, p. 75.

[18] R.J. Higgins, R.L. Goldsmith, US Pat., p. No. 5.879.715, 1999.

[19] J. Kizling, M. Boutonnet-Kizling, P. Steniu, R. Touroude, G. Maire, Electrochem. Colloids Dispersions, pp. 333–344, 1992.

[20] A. Gutsch, M. Kramer, G. Michael, H. Muhlenweg, M. Pridohl, G. Zimmermann, KONA, pp. 20, 24, 2002.

[21] J.-H. Yu, D.-W. Lee, B.-K. Kim, T. Jang, J. Magn. Magn. Mater., pp. 304, 16, 2006.

[22] H. Yang, T. Ogawa, D. Hasegawa, C.N. Chinnasamy, M. Takahashi, J. Magn. Magn. Mater., pp. 304, 10, 2006.

[23] J.S. Yin, Z.L. Wang, Nanostruct. Mater, pp. 10, 845, 1999.

[24] www.strem.com.

[25] O. Masala, R. Seshadri, Annu. Rev. Mater. Sci., pp. 34, 41, 2004.

[26] Q.A. Pankhurst, A.Y. Martinez, L.F. Barquin, Phys. Rev. B, pp. 69, 212401, 2004.

[27] S. Ram, P.S. Frankwicz, Phys. Status Solidi, pp. 188, 1129, 2001.

[28] Y.Q. Yang, C.Y. You, L.L. Hee, J. Alloy Compounds, 2007.

[29] X. Du, M. Inokuchi, N. Toshima, J. Magn. Magn. Mater., pp. 299, 21, 2006.

[30] Turkevich J., P. C. Stevenson, J. Hillier, Discuss. Faraday.Soc. 11, pp. 55–75, 1951.

[31] X. Huan,Characterization and Intracelular Targeting of Biomolecule-Gold Nanoparticle Complexes (Teză de doctorat), 2004.

[32] Akhtar, Mohd Sayeed Panwar, Jitendra Yun, Yeoung-Sang, ACS Sustainable Chemistry & Engineering, vol. 1, no. 6, pp. 591–602, Jun. 2013.

[33] Li, S., Qui, L., Shen, Y., Green Chem., pp. 852–858, 2007.

[34] A. Bar, H., Bhui, D.K., Sahoo, G.P., Sarkar, P., Pyne, S., Misra, Colloids Surf. A, Physicochem. Eng. Asp., pp. 212–216, 2009.

[35] N. K. Mondal, A. Chowdhury, U. Dey, P. Mukhopadhya, S. Chatterjee, K. Das, and J. K. Datta, Asian Pacific J. Trop. Dis., vol. 4, pp. S204–S210, 2014.

[36] A. K. Petla, R.K., Vivekanandhan, S., Misra, M., Mohanty and N. Satyanarayana, J. Biomater. Nanobiotechnol., pp. 14–19, 2012.

[37] M. Rai, A. Yadav, IET Nanobiotechnology, vol. 7, no. 3, pp. 117–24, Sep. 2013.

[38] Huang, J., Qingbiao L., Sun D., Lu Y., Su Y., Yang X.,Wang H., Wang Y., Shao W., He N., Hong J., Chen C., Nanotechnology, pp. 105–106, 2007.

[39] Narayanan, K. B.; Sakthivel, Mater. Lett., p. 62 (30), 4588− 4590, 2008.

[40] Singh P., P. Bhakat, Int. J. Sci. Res. Pub., p. 2 (5), 1−4, 2012.

[41] B. S. Song, J. Y. Kwon, E. Y. Kim, Bioprocess Biosyst. Eng., p. 33 (1), 159−164, 2010.

[42] Rossetti R., Brus L.., J. Phys. Chem., pp. 90:558–560, 1986.

[43] Bubert H., Jenett H., Surf. Thin Film Anal. Princ. Instrumentation, Appl., 2002.

[44] Scocioreanu, Malvina-Simona, Materiale compozite de tip polimer/nanoparticule anorganice. Sinteză și caracterizare optică. p.13.

[45] M. Aluas, S. Simon, Metode experimentale avansate pentru studiul și analiza bio-nano-sistemelor. 2012.

[46] J. Wang, Analytical Electrochemistry, 2000.

[47] Thill A. și colab., Environ. Sci. Technol., pp. 6151–6156, 2006.

[48] Baek Y.W., An Y.J., pp. 409, 1603–1608, 2011.

[49] Lu C. și colab., Slow growth induces heat-shock resistance in normal and respiratory-deficient yeast. Mol. Biol. Cell, pp. 20, 891–903, 2009.

[50] Brown M.R. și colab., J. Antimicrob. Chemother., pp. 22, 777–780, 1988.

[51] Mah T.F., O’Toole G.A., Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol., pp. 9, 34–39, 2001.

[52] Pan X. și colab., Mutagenicity evaluation of metal oxide nanoparticles by the bacterial reverse mutation assay. Chemosphere, pp. 79, 113–116, 2010.

[53] Maness P. și colab., Bactericidal activity of photocatalytic TiO2 reaction: toward an understanding of its killing mechanism. Appl. Environ. Microbiol., pp. 65, 4094–4098, 1999.

[54] Wan Y. și colab., Vancomycin-functionalised Ag@TiO2 phototoxicity for bacteria. J. Hazard. Mater., pp. 186, 306–312, 2011.

[55] Wang S. și colab., Toxic effects of gold nanoparticles on Salmonella typhimurium bacteria. Toxicol. Ind. Health, pp. 27, 547–554, 2011.

[56] Santo C. E. și colab., Contribution of copper ion resistance for survival of Escherichia coli on metallic copper surfaces. Appl. Environ. Microbiol., pp. 74, 977–986, 2007.

[57] Juan L. și colab., Deposition of silver nanoparticles on titanium surface for antibacterial effect. Int. J. Nanomed, pp. 5, 261–267, 2010.

[58] Rai M., Yadav A., Gade A. Biotechnology Advances, p. 27(1): 76–83, 2009.

[59] Durran N., Marcato P.D., Alves O.L., Souza G., J Nanotechnology, p. 3:8, 2005.

[60] J.W. Alexander., Surg Infect (Larchmt), pp. 10:289–292, 2009.

[61] Castellano J.J., Shafii S.M., Ko F., Donate G., Wright T.E., Mannari R.J., Payne W.G., Smith D.J., Robson M.C., Int. Wound. J., p. 4(2): 114–122, 2007.

[62] Zhao G.J., Stevens S.E., Biometals, p. 11(1): 27–32, 1998.

[63] Elena-Laura Obreja, Studiul unor sisteme de nanoparticule cu aplicații în bioinginerie (Teză de doctorat).

[64] Leid J.G. și colab., J. Antimicrob. Chemother., pp. 67, 138–148, 2012.

[65] Sondi I., Salopek-Sondi B., J. Colloid Interface Sci., pp. 275, 177–182, 2004.

[66] Huang Z. și colab., Toxicological effect of ZnO nanoparticles based on bacteria. Langmuir, pp. 24, 4140–4144, 2008.

[67] Gajjar P. și colab., J. Biol. Eng., pp. 3, 9, 2009.

[68] Kumar N. și colab., J. Hazard. Mater., pp. 190, 816–822, 2011.

[69] Choi O., Hu Z., Environ. Sci. Technol., pp. 42, 4583–4588, 2008.

[70] G. Prasad, Biomedical applications of nanoparticles. Safety of Nanoparticles. Springer, pp. 89–109, 2009.

[71] Murray CB., Kagan C., Bawendi, Annu Rev. Mater Sci., pp. 30:545–610, 2000.

[72] Arora P., Sindhu A., Dilbaghi N., Chaudhury, A. Biosensors as innovative tools for the detection of food borne pathogens. Biosens Bioelectron, pp. 28:1–12, 2011.

[73] Langer R., Folkman J., Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules, Nature (London), pp. 263, 797–800, 1976.

[74] Leserman L.D., Barbet J., Kourilsky F., Weinstein, Targeting to cells of fluorescent liposomes covalently coupled with monoclonal antibody or protein A, Nature,pp. 288, 602–604, 1980.

[75] Alexiou C., Arnold W., Klein R., Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting, Cancer Res, pp. 60(23), 6641–8, 2000.

[76] Ahamed M., Akhtar M.J., Siddiqui M.A., Oxidative stress mediated apoptosis induced by nickel ferrite nanoparticles in cultured A549 cells, Toxicology, pp. 283(2–3), 101–8, 2011.

[77] Baldi G., Bonacchi D., Franchini M.C., Synthesis and coating of cobalt ferrite nanoparticles: a first step toward the obtainment of new magnetic nanocarriers, Langmuir, pp. 23(7), 4026–8, 2007.

[78] Gherca D. , Pui A., Cornei M., Cojocariu A., Nica V., Caltun O.F., J Magn Magn Mater, pp. 324, 3906–3911, 2012.

[79] Le Guével X. și colab., J Nanopart. Res., pp. 14, 727, 2012.

[80] Tiwari P. M., Vig K., Dennis V. A., Singh S. R., Nanomaterial, pp. 1, 31–63, 2011.

[81] El-Sayed, S. Link, Optical properties and ultrafast dynamics of metallic nanocrystals Annu. Rev. Phys. Chem, vol. 54, pp. 331–366, 2003.

[82] Xia Y. , Gold and silver nanoparticles: A class of chromophores with colors tunable in the range from 400 to 750 nm Analyst, vol. 128, , pp. 686–691, 2003.

[83] Sokolov K, Wax A, Molecular imaging and darkfield microspectroscopy of live cells using gold plasmonic nanoparticles. Laser Photonics Rev.,” vol. 3, pp. 146–158, 2009.

[84] J. Kopecek, Smart Genet. Eng. Biomater. drug Deliv. Syst., pp. 20:1–16, 2003.

[85] J. Santini, R. Richards, A.C. Scheidt, R. Cima, R. Langer, Angew. Chem. Int. Ed., pp. 39:2396–407, 2000.

[86] O. E. Litmanovich, G. V. Marmuzov, A. A. Litmanovich, I. M. Papisov, Polymer Science, Ser. A 45, 906, 2003.

[87] T. Endo, T. Yoshimura, K. Esumi, J. Colloid Interface Sci., pp. 286, 602, 2005.

[88] P. T. Anastas, J. C. Warner, J. C. Green Chemistry: Theory and Practice, 1998.

[89] Tam F., Goodrich G.P., Johnson B.R., Halas N.J., Nano.Lett., pp. 496–501, 2007.

[90] Dulkeith E., Morteani A.C., Niedereichholz T., Klar T.A., Feldmann J., Levi S.A., van Veggel F.C., Reinhoudt D.N., Möller M., Gittins D.I., Phys. Rev. Lett., p. 203002, 2002.

[91] Kitson S.C., Barnes W.L., Sambles J.R., Phys. Rev. B: Condens. Matter, pp. 11441–11445, 1995.

[92] Szmacinski H., Lakowicz J.R., Johnson M.L., Methods Enzymol., pp. 723–748, 1994.

[93] Templeton A.C., Cliffel D.E., Murray R.W., J.A.C.S., pp. 7081–7089, 1999.

[94] Duroux M., Duroux L., Neves-Petersen M.T., Skovsen E., Petersen S.B., Applied Surface Science, pp. 8125–8129, 2007.

[95] Tullman J.A., Finney W.F., Lin Y.J., Whaley Bishnoi S., Plasmonics 2, pp. 119–127, 2007.

[96] Tkachenko A.G., Xie H., Coleman D., Glomm W., Ryan J., Anderson M.F., Franzen S., Feldheim D.L., J.A.C.S., pp. 4700–4701, 2003.

[97] Daniel M.C., Astruc D., Chem. Rev., pp. 293–346, 2004.

[98] Li-Mei AO, Feng GAO, Bi-Feng PAN, Da-Xiang CUI, Hong-Chen GU, Chinese Journal of Chemistry, p. 253—256, 2006.

[99] Iosin M., Toderas F., Baldeck P. L., Astilean S., Journal of Molecular Structure, pp. 196–200, 2009.

[100] Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Russian Chemical Reviews, pp. 181 – 194, 2007.

[101] Daniel M.C., Astruc D., Chem. Rev., pp. 293–346, 2004.

[102] Liu W.T., J. Bioscience Bioengineering, pp. 1–7, 2006.

[103] Glomm W.R., Preparation and characterization of Nanosized Structures with Applications în Bioscience and Materials (Teză de doctorat), 2004.

[104] Feldheim D.L., A. Foss Colby Jr., Metal Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Applications, Marcel Dekker, 2002.

[105] Guo S., Wang E., Analytica Chimica Acta, pp. 181–192, 2007.

[106] Zhu S.L., Zhang J.B., Yue L.Y.L., Hartono D., Liu A.Q., Advanced Materials Research, pp. 95–98, 2009.

[107] Park T.J., Lee S.Y., Lee S.J., Park J.P., Yang K.S., Lee K.-B., Ko S., Park J.B., Kim T., Kim S.K., Shin Y.B., Chung B.H., Ku S.-J., Kim D.H., Choi I.S. Anal. Chem., pp. 7197–7205, 2006.

[108] Elghanian R., Storhoff J.J., Mucic R.C., Letsinger R.L., Mirkin C.A., Science, pp. 1078–1081, 1997.

[109] Baeissa A., Dave N., Smith B.D., Liu J., ACS Applied Materials and Interfaces, pp. 3594–3600, 2010.

[110] Hu Y., Song Y., Wang Y., Di, J., Thin Solid Films, pp. 6605–6609, 2011.

[111] Alkasir R., Ganesana M., Won Y-H., Stanciu L., Andreescu S., Biosensors and Bioelectronics, pp. 43–49, 2010.

[112] Eguilaz M., Villalonga R., Agui L., Yanez-Sedeno P., Pingarron J.M., Journal of Electroanalytical Chemistry, pp. 171–178, 2011.

[113] Suxia Zhang, Nü Wang, Yaming Niu, Changqing Sun, Sensors and Actuators B: Chemical, pp. 367–374, 2005.

[114] Bas S.Z., Gulce H., Yildiz S., Gulce A., Talanta, pp. 189–196, 2011.