Nanoparticule de Argint

Cuprins

Memoriu justificativ

Marea majoritate a nanocompozitelor ce sunt utilizate ca filme antimicrobiene conțin argint sub formă de nanoparticule, acest element având stabilitate la temperaturi ridicate și volatilitate scazută și fiind recunoscut pentru capacitatea antimicrobiană fața de o varietate de microorganisme. [1,2]

Utilizarea argintului ca agent antimicrobian datează încă din anul 4000 î.Hr. Vasele de argint erau folosite pentru transportul apei în timpul campaniilor militare în vreme ce sărurile de argint erau folosite la păstrarea apei și alimentelor. Metode asemănătoare erau folosite de persoanele care călătoreau pe distanțe foarte lungi de-a lungul continentului Nord American: aruncau o monedă de argint în apă sau lapte pe durata deplasării ca metodă de păstrare a acestora. [3]

Datorită faptului ca s-a descoperit relativ recent faptul ca ionii de argint (Ag+) sunt responsabili de activitatea antimicrobiană, modul prin care argintul iși exercită această activitate antimicrobiană nu este pe deplin înțeles deoarece nu este în totalitate clarificat, însă face parte în continuare din obiectul unor teme de cercetare vaste.

După introducerea antibioticelor (cum ar fi penicilina în 1940), utilizarea argintului a intrat intr-un regres. Însă, evoluția tulpinilor bacteriene, rezistente la cât mai multe antibiotice, a determinat oamenii de știință să caute noi alternative antibacteriene, reluând studiile despre argint, datorită faptului că era deja cunoscut ca un agent antimicrobian [3,4]

Scopul acestui studiu a fost de a obține membrane cu activitate anitimicrobiană ce se prezintă sub forma unei structuri complexe tip sandwich. Straturile exterioare sunt compuse dintr-o membrană de PMMA, în timp ce straturile interioare sunt alcătuite dinr-o membrană comercială modificată în așa fel încat sa dețina proprietăți antimicrobiene. Această caracteristică este rezultatul prezenței în sistem a argintului în compoziția materialului hibrid. Materialul hibrid constă în particule coloidale de polimer și nanotuburi de carbon ce au fost folosite pentru stabilizarea stratului activ, respectiv pentru interconectarea particulelor de polimer. Testele de filtrare au pus în evidența o stabilitate bună a materialelor și o creștere a hidrofilei membranelor hibride. Proprietățile antimicrobiene au fost evaluate folosind Staphylococcus aureus și au fost corelate cu rata de migrare a ionilor de argint.

REFERAT DE LITERATURĂ

Cristalele fotonice

Cristalele repeta sunt materiale cu structura periodica, care poate bloca propagarea radiatiei electromagnetice pe un anumit domeniu al lungimilor de unda (benzi interzise – photonic band gaps materials).  Această  proprietate ne permite să controlăm lumina și efectele produse, care altfel ar fi foarte greu de controlat cu optica convențională. Comportarea cristalelor fotonice este descrisă de ecuațiile lui Maxwell. Aceste cristale expuse la lumina alba devin colorate, fapt care nu se datoreaza absorbtiei luminii sau existența vreunui pigment, fiind o culoare structurală.

Studiul cristalelor fotonice a început acum aproximativ 150 de ani, însa termenul de “cristale fotonice” și conceptele despre benzi interzise au fost folosite în 1987 de E. Yablonivitch și S. John. [5,6]

În ultimile decenii, cristalele fotonice au capatat un interes ridicat datorită structurii care permite modularea semnalului radiatiei electromagnetice, practic a luminii pe diferite direcții ale spatiului. Astfel propagarea undelor electromagnetice prin cristalele fotonice duce la formarea unei benzi interzise [7]. Daca golul de bandă este localizat în apropierea lungimilor de undă corespunzătoare luminii vizibile, cristalele fotonice manifestă culori iridiscente similare cu opalurile naturale, datorită difracției Bragg. [8]

Exploatând aceste proprietăți, cristalele fotonice au fost folosite în multe aplicații optice, pentru a produce LEDuri și dispozitive oce și electronice. Cu toate acestea, una dintre cele mai provocatoare aplicații constă în fabricarea cristalelor fotonice cu benzi interzise 3D situate în jurul valorii de 1.55 µm ceea ce reprezintă lungimea de undă folosită în fibrele optice. [13]

În ultimi ani, cristalele fotonice polimerice s-au dezvoltat pe scară largă folosindu-se metoda de auto-asamblare/ordonare spontană a microsferelor coloidale polimerice (sub 1 µm) cu distribuție dimensională îngustă, acestea gasindu-și aplicații ca device-uri optice de difracție, nano-întrerupatoare optice, senzori chimici sau biochimici și matrițe pentru diverse materiale cu benzi complete. [9, 10, 11]

Polimerizarea în emulsie fără surfactant sau copolimerizarea reprezintă una dintre cele mai importante metode de sinteză pentru particulele de polimer, datorită purității lor precum și posibilitatea obținerii dispersiilor coloidale cu proprietăți de auto-asamblare ce conduc la formarea rețelelor cristaline. Mecanismul general al acestui tip de polimerizare în emulsie este relativ similar cu cel al polimerizarii in emulsie in prezenta surfactantului, prin nucleere omogena.

Polimerizările în absența emulgatorului oferă o serie de avantaje:

puritatea latexurilor este mult mai ridicată decât în cazul celor care se obțin în prezența de emulgator;

nu mai este necesară îndepărtarea emulgatorului din latexul obținut, deci se evită apariția fenomenului de coagulare sau floculare ulterioara;

parametrii reacției de polimerizare pot fi controlați ușor;

dimensiunea particulelor poate fi controlata;

particulele obținute pot fi funcționalizate pe suprafață;

particulele coloidale sintetizate au numeroase aplicații în cele mai variate domenii.

In ultimii ani, cercetatorii și-au îndreptat atenția spre copolimerizările în emulsie în absența surfactantului, remarcând faptul ca se pot obține latexuri monodisperse, cu structuri deosebit de organizate, determinate de particule coloidale care se autoasambleaza [12]-[15], obținând structuri similare cu cele ale opalului sintetic [16].

1.1 Formarea particulelor obținute prin copolimerizare în emulsie în absența surfactantului

La o polimerizare obișnuită în emulsie, în prezența de emulgator distribuția dimensională a particulelor nu este uniformă, monodisperistatea putând fi atinsă prin diverse metode:

polimerizare insămânțată;

adaugarea unor cantități relativ scăzute de emulgator;

introducerea unor amestecuri de emulgatori ionici și neionici.

Copolimerizările conduse în absență de emulgator, în cazul în care comonomerul este ionic, au dus la obținerea unor latexuri monodisperse, ale căror dimensiuni de particule au fost controlate prin intermediul concentrațiilor de inițiatori [12], [13].

Latexurile monodisperse obținute sunt dispersii coloidale în care stabilizarea particulelor se realizează prin încărcarea particulelor pe suprafață cu grupări provenite fie de la inițiator, fie de la comonomer [10]. Aceste grupări de la suprafața particulelor le fac să se respingă într-o oarecare măsură, determinând astfel o structură organizată la nivel coloidal.

In același timp, pentru mecanismul de formare al particulelor coloidale sunt deosebit de importante solubilitățile în apă ale celor doi monomeri. In cazul monomerilor cu solubilitate ridicată în apă, se poate considera faptul că mecanismul determinant il constituie procesul de homopolimerizare. [17-19].

Cercetări recente [17-20], au demonstrat faptul că în timpul reacției poate avea loc automicelizarea radicalilor oligomerici care iși ating limita de solubilitate (lungimea critica a lanțului, ncr), formându-se la finalul reacției particule polimerice de tip miez-coajă în care coaja este predominant hidrofilă, provenind de la monomerul cu solubilitatea cea mai mare în mediul apos [17-20]. Rezultatul direct al mecanismului de nucleere și dinamica cresterii nucleelor initiale se regăsesc în diametrul final al particulelor.

Cristalele fotonice polimerice sunt rezultatul auto-asamblării spontane a particulelor polimerice în rețele tridimensionale, deosebit de organizate, ca urmare a evaporării apei.

Față de o rețea cristalină obișnuită, particulele coloidale sferice practic țin locul moleculelor, atomilor sau ionilor din rețea, formând rețele de tip hcp (hexagonal compact) sau ccp (cubice cu fețe centrate).

În urma evaporării apei, particulele coloidale auto-asamblate au prezentat niște proprietăți optice similare cu opalurile sintetice (Figura 2). Potrivit studiilor recente, cristalele polimerice coloidale sunt considerate cristale fotonice. [21, 22]

Un cristal fotonic este un material nanostructurat care influențează propagarea undelor electromagnetice în aceeași manieră precum o face un semiconductor pentru electroni.

I.1 Tipuri de cristale fotonice

Cristalele fotonice sunt împărțite după structura straturilor periodice din care sunt alcătuite în: uni-, bi- și tri-dimensionale, așa cum observăm și în figura 3. Cel mai simplu cristal fotonic este cristalul unidimensional (1-D), format din doua materiale care alternează periodic pe o directie. În mod similar, într-un cristal fotonic bidimensional constantele dielectrice alternează pe doua direcții, în timp ce cristalul fotonic tri-dimensional oferă un control complet al radiației electromagnetice, datorită periodicității pe toate cele trei direcții. [23]

Fig. 3. Cristale fotonice uni-, bi-, tri- dimensionale [23]

Pentru a înțelege modul de formare a benzilor interzise în cristalele fotonice, ne folosim de ecuațiile lui Maxwell scrise pentru undele electromagnetice care se propagă într-un mediu fără curenți și sarcini libere [15]

Câmpurile electric și magnetic, și , sunt legate de inducția electrica și de inducția magnetică prin două relații ce exprimă răspunsul materialului la excitarea electromagnetică: și .

Cristale fotonice unidimensionale

În cazul cristalelor fotonice unidimensionale, unde mediul stratificat constă din straturi subțiri alternante, având valori diferite ale indicilor de refracție, ca în figura de mai jos, axa x este normala la interfata, iar este perioada. [24]

Fig. 4. Porțiune dintr-un mediu periodic stratificat [23]

Cristalele fotonice bidimensionale

Cristalele fotonice bidimensionale sunt structuri periodice pe două direcții și omogene pe cea de a treia direcție, așa cum se observă din figura 3. Tratarea teoretică se bazează, ca și în cazul uni-dimensional, pe ecuațiile lui Maxwell. Mai mult, ecuațiile valorilor proprii pot fi mult simplificate dacă se consideră că vectorul de undă k este paralel față de planul bidimensional. În acest caz, structura dielectrică este uniformă pe direcția z. [24]

Cristale fotonice tridimensionale

Cristalele fotonice tridimensionale pot bloca propagarea radiației electromagnetice (de o anumită frecvență) în anumite direcții. În cazul în care potențialul de rețea este suficient de puternic, golul s-ar putea extinde în toate direcțiile posibile, rezultând un gol complet in bandă. Aceasta proprietate ajută la controlarea efectului luminii ce trece prin cristalele fotonice.

Ținând cont de acest lucru, este ușor de realizat că una dintre cele mai importante proprietăți ale cristalelor coloidale constă în difracția luminii, conform legii lui Bragg.

I.2 Legea lui Bragg

Structura cristalină se studiază în special cu ajutorul fotonilor. Unghiul sub care este difractată o undă de un cristal depinde în esență de stuctura cristalină și de lungimea de undă a radiației. Atunci când un atom este expus radiației electromagnetice, electronii lui pot împrăștia, în parte sau total, radiația cu frecvența radiației incidente. W.L. Bragg a dat o explicație simplă pentru unghiurile fasciculelor difractate pe un cristal. [24]

Se consideră că undele incidente sunt reflectate regulat pe plane paralele de atomi din cristal, astfel încât fiecare plan reflectă numai o fracțiune foarte mică din radiație, ca o oglindă foarte lucioasă. Fasciculele difractate se obțin numai dacă reflexiile pe planele paralele de atomi interferă în mod constructiv. Se presupune că împrăștierea este elastică, astfel încât lungimea de undă a fotonului nu se schimbă prin reflexie.

Radiația incidentă cade pe planele paralele echidistante cu distanța d. Diferența de drum pentru razele reflectate este 2dsinθ. Interferența constructivă a radiației reflectate se obține atunci când diferența de drum este un număr întreg n de lungimi de undă λ.

Astfel, condiția pentru reflexia radiației incidente este:

2dsinθ = nλ

n – indice pentru planul cristalului;

λ– lungimea de undă a radiației incidente;

d – distanța interplanară;

θ – unghiul dintre radiația incidentă și normala la plan.

Acestă expresie este cunoscută ca legea lui Bragg în cazul difracției de raze X. Legea lui Bragg este o consecință a periodicității rețelei cristaline și este valabilă numai pentru λ≤ 2d. Astfel se explică de ce nu poate fi folosită lumina vizibilă a cărei lungime de undă λ= 4∙103 Ȧ (de ordinul 102 nm) în timp ce distanța interplanară este de ordinul constantei rețelei cristaline și are o valoare de ordinul 3-4 Ȧ. [24]

Legea nu se referă la aranjamentul sau baza de atomi asociată cu fiecare nod. Compoziția bazei determină intensitatea relativă a diferitelor ordine n ale difracției pentru o familie dată de plane paralele (pentru o rețea).

I.3 Efectul legii lui Bragg asupra dispersiilor coloidale

În cazul cristalelor coloidale, are loc difracția radiației cu lungimi de undă de același ordin de mărime (400-800nm). Rezultatul macroscopic constă în împrăștierea luminii (reflexie selectivă) cu lungimi de undă corespunzatoare culorilor violet-albastru-verde și transmisia radiației complementare (oranj-rosu).

Dacă analizăm dispersia coloidală din Figura 6, se poate observa în timpul evaporării solventului apariția unor iridiscențe în diferite zone ale spectrului vizibil datorită selectivității impuse de difracția Bragg. [25-26]

Mecanismul de cristalizare scoate în evidență schimbări permanente din punct de vedere coloristic ale dispersiei coloidale. În primă fază, dispersia este albă datorită faptului că d este mai mare decât particulele de polimer, motiv pentru care dispersia coloidală apare albă. În a doua faza, disperisa coloidală iși schimbă culoarea ca o consecință a datorată fenomenului de evaporare a apei. Sistemul se schimbă în roz, verde, albastru și în final în violet atingând o structură cristalină stabilă, corespunzând aranjamentului CCP [25-26].

Conform legii lui Bragg, schimbarea unghiului dintre radiația inchidentă și planul cristalin duce la schimbări ale lungimii de undă reflectate, respectiv schimbări ale culorii observate (figura 7.). [27-28]

Spectrul UV-VIS al cristalelor fotonice indica în multe cazuri peak-uri ascuțite, ceea ce confirmă existența structurilor regulate, datorită reflexiei Bragg a aranjamentului periodic a particulelor polimerice. [29-30]

Figura 8(b) prezintă spectrul UV-VIS al reflexiei fotografiei corespunzătoare (Figura 8(a)) a unor cristale polimerice coloidale cu particule de diferite mărimi (178 nm, 211 nm, 235 nm și 270 nm).

Există situații în care , acest material prezintă schimbari de culoare (Figura 9) în condiții de stres mecanic. În acest caz, filmul de cristal fotonic ce a fost depus pe o placuță de plastic, și-a schimbat culoarea de la roșu la verde datorită modificării distanței interplanare, în urma alungirii peliculei, rezultând o modificare a distanței interplanare, rezultând mai departe o schimbare în lungimea de undă a luminii difractate. [29]

I.4 Aplicații ale cristalelor fotonice polimerice

Precum a fost menționat și în capitolul anterior cristalele coloidale polimerice nu pot avea benzi interzise complete, dar pot fi folosite ca șabloane pentru a crea structuri noi cu benzi interzise [31]. Modificând compoziția unui cristal fotonic polimeric se pot obține structuri de tip opal invers.

Primul pas în sinteza opalului invers este obținerea opalului sintetic din sfere coloidale polimerice care se autoasamblează în matrici periodice. Golurile dintre particulele de polimer sunt umplute cu diferite soluții ce joacă rol de matrice. După această procedură, sferele polimerice sunt dizolvate sau calcinate lasând spații în matricea polimerică. Rezultatul este un cristal fotonic cu proprietăți optice diferite.

Waterhouse și colaboratorii au obținut structuri de opal invers depozitând prin metoda sol-gel particule anorganice de silice în golurile unui film polimeric fotonic. Sferele de PMMA auto-asamblate au fost îndepartate prin calcinare la 550oC. Prin îndepartarea particulelor de polimer a fost obținuta o matrice macro-poroasă cu FCC (structură cubică cu fețe centrate) a sferelor de aer separate de nanoparticulele anorganice comform schemei prezentate mai jos (Figura 11-a). Mateialele macroporoase formate au fost caracterizate prin analiză SEM în comparație cu matricea de PMMA pentru a evidenția structurile de opal invers (Figura 11-c).

Nanoparticule de argint

II.1 Metode generale de obținere a nanoparticulelor de argint

Toate metodele raportate în literatură referitoare la sinteza nanoparticulelor de argint pot fi clasificate sau grupate, deoarece acestea urmează abordări comune, diferențele limitându-se la reactanții specifici utilizați și la condițiile de reacție.

Principalele clasificări ale metodelor de sinteză a nanoparticulelor de argint sunt:

sinteza „top-down” versus sinteza „bottop-up”;

sinteza „verde” versus sinteza „non-verde”;

sinteza convențională versus sinteza neconvențională.

Tehnicile “top-down” constau în generarea nanoparticulelor prin diverse tehnici de fragmentare. Aceste tehnici implică metode fizice precum frezarea, fotolitografie sau călirea repetată. [34,35]

Tehnicile „bottom-up” pornesc de la o sare de argint (drept precursor) ce este dizolvată într-un solvent, iar apoi în urma unei reacții chimice de reducere are loc formarea atomilor de argint ce cresc în structuri ordonate sau neordonate, ajungând in final la nanoparticule [36]. Tehnicile bottom-up presupun utilzarea agenților de stabilizare care sunt indispensabili pentru controlul dimensiunii și formei particulelor sintetizate. [37]

În Figura 12. este prezentată o schemă comparativă a tehnicilor „top-down” și „bottom-up”.

Fig. 12. Abordările „bottom-up” și „top-down” [3]

Sinteza “verde” folosește spre exemplu zaharuri și extracte din plante ca agenți ecologici pentru formarea și stabilizarea nanoparticulelor de argint [38] însă, în comparație cu sinteza “non-verde”, exista un control scăzut asupra morfologiei nanoparticulelor produse.

Metodele de sinteză pot avea și o alta clasificare și anume: convenționale și neconvenționale. Primele includ folosirea în procesul de sinteză a borohidrurii, a citratatului, a unui sistem de două faze (apă – fază organică), agenți de reducere organici și micelii inverse.

Metodele neconvenționale includ metode de ablație laser, metode radiocatalitice si evaporare la vid. [39].

Abordările „top-down” și „bottom-up” se folosesc în mod curent pentru sinteza de nanoparticule de argint. De obicei, metodele „bottom-up” implică tehnicile chimiei umede.

Trebuie însă menționat că se pot suprapune toate categoriile enunțate mai sus. Spre exemplu, utilizarea de extracte de plante pentru a sintetiza nanoparticule de argint reprezintă o metodă convențională/verde/”bottom-up” de sinteză.

În urma unei analize în ceea ce privește metodele de sinteză a nanoparticulelor de argint și a agenților chimici utilizați, Tolaymat et al [36] a ajuns la concluzia ca borohidrura de sodiu și citratul de sodiu sunt agenții de reducere cei mai utilizați. De asemenea a mai concluzionat faptul că azotatul de argint dizolvat în apă și citratul de sodiu sunt folosiți ca agenți de stabilizare și ca marea majoritate a nanoparticulelor obtinute au formă sferică și dimensiuni mai mici de 20 nm.

II.2 Proprietățile antibacteriene

Nanoparticulele de argint reprezintă un agent antimicrobian eficace împotriva unui spectru larg de bacterii Gram-negative și Gram-pozitive [40,41,42], incluzând și tulpini rezistente la antibiotice. Bacteriile Gram-negative includ genuri cum sunt: Acinetobacter, Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella și Vibrio. Speciile de Acinetobacter sunt asociate cu infecțiile nosocomiale, adică infectii care sunt rezultat al tratamentului într-un spital sau o unitate medicală, dar secundare față de starea inițială a pacientului. Bacteriile gram-pozitive includ multe genuri specii cunoscute, cum sunt: Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Staphylococcus, Listeria și Streptococcus. Bacteriile rezistente la antibiotice includ tulpini cum sunt cele meticilino-rezistente si vancomicino-rezistente Staphylococcus aureus și Enterococcus faecium.

S-a descoperit ca nanoparticulele de argint care au diametrul între 5 și 32 nm sporesc activitatea antibacteriană a diferitelor antibiotice [43], spre exemplu cum este în cazul pencilinei G, amoxicilinei, eritromicinei, clindamicinei și vancomicinei împotriva Staphylococcus aureus și Escherichia coli.[32]

Dependența de dimensiune a activității antimicrobiene a nanoparticulelor de argint (cu diametrul de 1-450 nm) a fost demonstrată pe bacterii Gram-negative [47,44,45] și bacterii Gram-pozitive [45]. Nanoparticulele mici, cu un raport suprafață-volum mare oferă un mijloc mai eficient pentru activitatea antibacteriană, chiar și la concentrații foarte mici.

Cu ajutorul bacteriilor Gram-negative s-a demonstrat, pe langă dependența activității antimicrobiene a nanoparticulelor de argint de dimensiune și concentrație, dependența activității antimicrobiene de forma nanoparticulelor. [46]. Spre exemplu s-a demonstrat, în urma sintezei de nanoparticule de diferite forme (sferice, nanoplăci triunghiulare, alungite) obținute pe căi sintetice, că nanoplăcile de argint prezintă cea mai puternică activitate antimicrobiană. [42]

Proprietățile antibacteriene ale nanoparticulelor de argint vor fi explicate mai în detaliu în sub-capitolele următoare, care vor prezenta mecanismul de acțiune a nanoparticulelor de argint, efectul dimensiunii și formei particulelor asupra proprietăților antimicrobiene precum și metodele de testare a activității antimicrobiene.

II.3 Mecanismul de acțiune antibacteriană al argintului

Mecanismul exact de acțiune antibacteriană a argintului nu este încă pe deplin cunoscut, dar posibilele mecanisme de acțiune al argintului metalic, al ionilor de argint și al nanoparticulelor de argint au fost propuse în conformitate cu modificările morfologice și structurale găsite în celulele microbiene.

Gruparile “tiol” existente în enzimele respiratorii din celulele bacteriene sunt legate de mecansimul de acțiune antibacteriana al argintului. Astfel, argintul se lipește de peretele celular bacterian si respectiv de membrana celulară inhibând în acest mod procesul de repirație [48]. Spre exemplu, în cazul E. Coli argintul acționează prin inhibarea absorbției fosfatului și eliberarea de fosfat, manitol, succinat, prolină și glutamină din celulele de E. coli. [49].

Principalele mecanisme propuse pentru acțiunea antimicrobiană a argintului sunt:

Inactivarea proteinelor. Se presupune că atomii de argint se leagă de grupările tiol (SH-) din enzime, ulterior dezactivând enzimele. Argintul formează legături stabile S-Ag cu grupele tiol ale compușilor din membrana celulară implicați în generarea de energie și în transportul transmembranar al ionilor [50]. De asemenea, se presupune că argintul poate lua parte la reacțiile de oxidare catalitică care au ca rezultat formarea legăturilor disulfidice (R-S-S-R). Acest lucru este posibil deoarece argintul catalizează reacția dintre moleculele de oxigen din celule și atomii de hidrogen din grupele tiol: se formează ca produs apa, iar două grupări tiol sunt legate covalent una de cealaltă printr-o legătură disulfit [51]. Formarea legăturilor disulfidice catalizate de către argint ar putea schimba forma enzimelor celulare, afectând ulterior funcția lor.

Formarea legăturilor disulfidice poate duce la schimbări în structura proteinelor ​și inactivarea enzimelor cheie, cum ar fi cele necesare pentru respirația celulară [51]. Subunitatea proteică ribozomală 30S, succinil-coenzima A sintetaza, transportorul maltozei (MalK) și bifosfat-fructoză aldolaza au fost identificate cu o mare probabilitate ca proteine ​​cu activitate scăzută, după tratarea celulelor cu o soluție de 900 ppb Ag+. S-a emis ipoteza că ionii de argint se leagă de subunitatea ribozomală 30S, dezactivând complexul ribozomal și prevenind translația proteinelor ​​[49].

Asocierea ADN-ului. Un alt mecanism al activității antimicrobiene a argintului a fost propus de Klueh et al, [50]. Aceștia au afirmat că Ag+ intră în celulă și se intercalează între perechile de baze purinice și pirimidinice, perturbând aderarea hidrogenului între cele două componente anti-paralele și denaturând molecula de ADN. Deși acest lucru nu a fost încă dovedit, s-a demonstrat că ionii de argint se asociază cu ADN-ul odată pătrunși în celulă [52].

Pătrunderea în celulă. Cele mai multe dintre mecanismele propuse implică introducerea argintului în celule în scopul deteriorării acestora. Din perspectiva unei proteine​​transmembranare, ionul de argint este o particulă cu o anumită dimensiune, cu sarcina +1. Este posibil ca ionii de argint să aibă acces în interiorul celulelor prin proteinele ​​transmembranare, care, în mod normal, transportă ioni, alții decât ionii de argint. Proteinele​​ transmembranare, cum ar fi CopB-ATP-aza din Enterococcus hirae s-au dovedit a fi capabile să transporte ioni de argint, deși presupusa lor funcție este de transport al cuprului [53]. Acest lucru dovedește că există modalități ca argintul să fie transportat în membrana celulelor, chiar dacă transportatori specifici de argint nu există.

Argintul ionizat. Pentru ca argintul să poată avea proprietăți antimicrobiene, acesta trebuie să fie în forma sa ionizată [54,55]. Argint în formă neionizată este inert [56], dar, în contact cu umezeala conduce la eliberarea de ioni de argint [57]. Astfel, toate formele de argint sau de compuși care conțin argint cu proprietăți antimicrobiene, sunt într-un fel sau altul, surse de ioni de argint (Ag+); acești ioni de argint pot fi încorporați într-o substanță și eliberați lent în timp, sau pot proveni prin ionizarea suprafeței nanoparticulelor de argint.

Atacul asupra bacteriilor Gram-pozitive față de Gram-negative. Există două explicații referitoare la faptul că bacteriile Gram-pozitive sunt mai puțin sensibile la Ag+ față de bacteriile Gram-negative. Prima se referă la sarcina moleculelor de peptidoglican din peretele celular bacterian. Bacteriile Gram-pozitive au mai mult peptidoglican decât bacteriile Gram-negative, datorită grosimii mai mari a pereților celulari, și, pentru că peptidoglicanul este încărcat negativ iar ionii de argint sunt încărcați pozitiv, mai mult argint se poate prinde de peptidoglican în bacterii Gram-pozitive [58]. Sensibilitatea mai scăzută a bacteriilor Gram-pozitive poate fi de asemenea explicată simplu prin faptul că peretele celular al acestora este mai gros decât cel al bacteriilor Gram-negative.

II.4 Mecanismul de acțiune a ionilor de argint

Efectul ionilor de argint asupra bacteriilor poate fi observat prin schimbările morfologice și structurale. Replicarea moleculelor de ADN poate fi realizată atunci cand ele sunt în stare de relaxare însă atunci când se află in formă condensată ele iși pierd capacitatea de replicare, astfel în momentul în care în celulele bacteriene intră ioni de argint, molecula de ADN iși pierde capacitatea de replicare deoarece se transformă în formă condensată, ceea ce conduce la moartea celulelor.[59, 60]

Ionii de argint joacă un rol esențial în activitatea antibacteriană a zeoliților de argint​​. Matsumura et al. 2003, a raportat că acțiunea posibilă a zeolitului ​​de argint ar putea fi datorată absorbției de ioni de argint de către celulele bacteriene atunci când acestea vin în contact zeolitul​​, ioni care inhibă funcțiile celulare și producând daune celulelor. Al doilea mecanism ar putea fi reprezentat de către generarea de molecule reactive cu oxigenul, care inhibă respirația.

II.5 Mecanismul de acțiune a nanoparticulelor de argint

Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor poate fi legată de mai multe mecanisme. Nanoparticulele pot, fie interacționa direct cu celulele microbiene (spre exemplu întrerup transferul de electroni trans-membranar, distrugerea peretelui celular, oxidează componentele celulare) sau pot genera produși secundari (specii reactive la oxigen sau ioni dizolvați ai metalelor grele) care pot provoca daune. Mecanismul antimicrobian al majorității nanoparticulelor este schematizat în Fig. 13.

Fig. 13. Mecanismul antimicrobian al nanoparticulelor [61]

Datorită faptului că din ce în ce mai multe bacterii și dezvoltat și iși dezvoltă rezistența la diferite antibiotice, nanoparticulele de argint au avut o remarcabilă revenire ca și element cu activitate antimicrobiană. Astfel, s-au dezvoltat o serie de aplicații medicale pe bază de nanoparticule de argint ce inlcud creme pe baza de argint, dispozitive medicale acoperite cu argint, nanogeluri, nanoloțiuni etc [54].

Deși activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor de argint este legată de toate mecanismele prezentate mai sus, mecanismul de toxicitate nu este pe deplin înțeles [62].

Nanoparticulele de argint pot deteriora membranele celulare ale microorganismelor prin formarea de „gropi” pe suprafața lor. Mai mult de atât, ele pot pătrunde în interiorul celulelor putând provoca daune ADN-ului [38]. Ionii de argint eliberați din suprafața acestor nanoparticule pot interacționa cu grupele „tiol” din proteine inducând inactivarea bacteriană, condensarea moleculelor de ADN și pierderea capacității lor de replicare [63].

Kim et al. [64] au observat, be baza rezonanței electronice de spin, ca mecanismul antimicrobian al nanoparticulelor de argint este legat în primul rând de formarea radicalilor liberi pentru ca mai apoi acești radicali liberi să producă daune membranelor. Concluzia este ca destabilizarea membranei exterioare a membranlor este afectată de tratamentul cu nanoparticule de argint. Acest lucru indică faptul nanoparticulele de argint perturba componentele exterioare ale membranei precum lipopolizaharidele și culminând cu afectarea membranei citoplasmatice.

Concentrațiile eficace de nanoparticule de argint și ioni de argint sunt la nivel nanomolar, respectiv micromolar. Totuși, nanoparticulele de argint sunt mai eficiente din punct de vedere al activității antimicrobiene [65]. Yoon et al. [66], au observat ca Escherichia coli este mai rezistentă la nanoparticule decât Bacillus subtilis. Astfel, ei au ajuns la concluzia că, sensibilitatea mai mică a E.coli comparativ cu B. subtilis se datorează faptului că membrana exterioară a bacteriilor Gram-negative (cum este E.coli) este construită din molecule de lipopolizaharide bine „împachetate”, conferind o barieră importantă împotriva nanoparticulelor.

II.6 Efectul dimensiunii și formei nanoparticulelor de argint asupra proprietăților antibacteriene ale acestora

Un rol important în determinarea spectrelor de absorbție optică a nanoparticulelor metalice il joaca rezonanța plasmică de suprafață, lungimea de undă a maximului de absorbție crescând o dată cu creșterea dimensiunii nanoparticulelor.

Dimensiuna foarte mica a nanoparticulelor de argint presupune o suprafață de contact mult mai mare între celula bacteriana si particule (suprafață specifică este mai mare cu cât particula este mai mică), de aici rezultând o probabilitate de interacțiune mult mai mare spre deosebire de cazul particulelor mai mari. [47, 46, 67]

Nanoparticulele mai mici de 10 nm interacționează cu bacteriile, producând
efecte electronice care sporesc reactivitatea nanoparticulelor. Astfel, se confirmă faptul că efectul bactericid al nanoparticulelor de argint este dependent de dimensiunea acestora [46,69].

Eficacitatea antimicrobiană a nanoparticulelor depinde de asemenea de forma nanoparticulelor, fapt confirmat prin studierea inhibării creșterii bacteriene prin nanoparticule diferențiat în funcție de forma acestora [46].

Comfrom studiilor lui Pal ș.a. [46], la un conținut de argint de 1 µg nanoparticulele treiunghiulare trunchiate ofera activitate microbiană mai mare spre deosebire de cazul nanoparticulelor sferice unde este necesară folosirea unui minim de argint dge 12,5 µg. De asemenea, particulele sub formă de tijă au nevoie de un conținut de 50+100 µg de argint pentru a produce activitate antimicrobiana.

Martinez-Castanon et al. [68] au studiat efectul dimensiunii nanoparticulelor asupra eficienței antibacteriene. Pentru început, ei au sintetizat nanoparticule de argint cu diametrul de 7 nm, 29 nm și 89 nm. În sinteza celor trei tipuri de nanoparticule de argint cu dimensiuni diferite s-a folosit nitrat de argint ca sursă de ioni de argint și acid galic ca agent de reducere și de stabilizare. Dimensiunile diferite ale nanoparticulelor au fost obținute prin modificarea pH-ului sau iradierea soluțiilor cu lumină UV. Pentru determinarea dimensiunilor medii ale nanoparticulelor de argint sintetizate s-a folosit tehnica TEM (Fig. 14.).

Fig. 14. Nanoparticule de argint de diferite dimensiuni (imagini obținute utilizând tehnica TEM: 7 nm (a), 29 nm (b) și 89 nm (c) [68]

După ce dimensiunile nanoparticulelor au fost confirmate s-a determinat concentrația minimă inhibitoare (MIC) pe E.coli și S.aureus, folosind nanoparticulele sintetizate. Rezultatele testelor au arătat că nanoparticulele mai mici au un efect inhibitor mai pronunțat față de nanoparticulele mai mari și că S. aureus este mult mai rezistent la nanoparticulele de argint decât E. coli. Acidul galic a fost folosit ca martor în testele MIC. Nanoparticulele de argint au fost adăugate in medii de culturi celulare în aceeași soluție în care au fost produse, astfel încât, a fost necesar a se testa dacă acidul galic rezultat ca produs secundar în sinteza nanoparticulelor are sau nu are un efect asupra creșterii celulelor. Pentru testul MIC utilizând E. coli, diferența dintre concentrația minimă inhibitoare a nanoparticulelor de 29 nm și cele de 89 nm a fost nesemnificativă d.p.d.v. statistic (Tabelul 1.).

Tabelul 1. MIC pentru nanoparticule de argint de diferite dimensiuni [68]

Creșterea activității antimicrobiene a nanoparticulelor mici ar putea fi datorate faptului că particulele mai mici petrec mai puțin timp trecând prin membrana celulelor și a peretelui celular și că au o suprafață mai mare raportată la volum [59]. Suprafața mai mare raportată la volum a nanoparticulelor mici, înseamnă că raportat la unitatea de masă de argint, acestea au mai mulți atomi de argint în contact cu soluția decât nanoparticule mai mari. Acest lucru înseamnă că mai mulți atomi de argint din nanoparticule sunt capabili să ia parte la procesele de distrugere a celulelor. Dacă numai stratul exterior de atomi de argint ai unei nanoparticule de argint sunt în măsură să fie ionizați, atunci câteva nanoparticule mari ar trebui să producă mai puțini ioni de argint decât o mulțime de nanoparticule mici. Deoarece ionii de argint sunt cei care conferă proprietăți antibacteriene unui anumit material cu conținut de argint, înseamnă că nanoparticulele mai mici de argint au o mai mare eficacitate antimicrobiană comparativ cu nanoparticulele de argint mai mari.

În plus față de dimensiune, forma nanoparticulelor joacă de asemenea un rol important în activitatea antibacteriană. Pal et al. [58] au sintetizat nanoparticule sferice, în formă de tijă și triunghiulare și au testat pentru fiecare dintre ele activitatea antimicrobiană utilizând E. coli. E. coli a fost brăzdată pe plăci de agar-agar apoi s-au adăugat în plăci diferite câte 1 µg, 12,5 µg, 50 µg respectiv 100 µg din fiecare dintre cele trei tipuri de nanoparticule de argint sintetizate, iar în altă placă s-a adăugat AgNO3. Au fost numărate coloniile care s-au format în fiecare caz și s-au reprezentat grafic pentru fiecare caz în parte (Fig. 15). S-a stabilit că ordinea descrescătoare a activității antibacteriene a celor patru probe cu conținut de argint testate a fost: triunghiulare, sferice, în formă de tijă și AgNO3. Această ordine a activității antibacteriene se explică prin diferitele tipuri de fațete ale nanoparticulelor. Nanoparticulele triunghiulare au avut fațete mai active (fațete dense de electroni) decât nanoparticulele sferice, care, au avut fațete mai active decât nanoparticulele în formă de bastonașe. Astfel, nanoparticulele cu fațete mai active au activitate antibacteriană mai pronunțată.

Fig. 15. Legătura dintre activitatea antibacteriană și dimensiunea nanoparticulelor [67]

II.7 Metode de testare a susceptibilității antibacteriene

În vederea determinării susceptibilității antimicrobiene trebuie respectate o serie de criterii, cum sunt:

Bacteriile supuse testelor de susceptibilitate antimicrobiană trebuie să fie izolate în cultură pură;

Să se utilizeze, pe cât posibil, metode standard de referință pentru identificare, astfel încât bacteriile care fac obiectul testării să fie corect identificate d.p.d.v. al genului și a speciei;

Izolatele bacteriene considerate a fi cele mai importante trebuie păstrate pentru analize viitoare fie prin liofilizare, fie prin conservare criogenică;

Există o serie de factori care influențează testarea susceptibilității antibacteriene, factori care trebuie determinați și optimizați. Cei mai importanți sunt:

Odată ce bacteria a fost izolată în cultură pură, trebuie determinată concentrația optimă de inocul pentru a obține rezultate precise; bacteriile sau alte organisme utilizate în testarea susceptibilității antimicrobiene trebuie să fie dintr-o cultură proaspătă;

Compoziția și prepararea mediilor de agar și bulion folosite (ex: pH, cationi, timină, timidină);

Compoziția solvenților și soluțiilor de diluare utilizate la prepararea soluțiilor stoc;

Condițiile de creștere și incubare (timp, temperatură, atmosferă);

Grosimea stratului de agar;

Numărul de concentrații testate pentru diluția agarului și bulionului;

Probele martor utilizate (incluzând organismele de referință utilizate);

Principalele criterii de care se ține cont în alegerea metodei de testare a susceptibilității antibacteriene:

Flexibilitate

Performanță

Adaptare la sisteme automate și semiautomate

Cost

Reproductibilitate

Fiabilitate

Acuratețe

Disponibilitatea unor date de validare pentru gama de organisme a căror susceptibilitate se dorește a se testa

Există două metode utilizate pentru determinarea susceptibilității antibacteriene, metode care au avut rezultate reproductibile și repetabile. Aceste metode sunt [70,71]:

Difuzia din disc

Diluția cu bulion și agar

II.8 Difuzia din disc

Metoda difuziei din disc (cunoscută și sub denumirea de metoda Kirby-Bauer) se referă la difuzia unui agent antimicrobian cu o concentrație specificată de pe un disc, tabletă, bandă pe care a fost impregnat, într-un mediu de cultură solid care a fost însămânțat cu un inocul selectat, izolat într-o cultură pură.

Metoda difuziei din disc se bazează pe determinarea unei zone de inhibiție proporțională cu susceptibilitatea antimicrobiană a agentului antimicrobian impregnat pe disc. Difuzia agentului antimicrobian în mediul de cultură însămânțat rezultă printr-un gradient. Atunci când concentrația agentului antimicrobian este atât de diluată încât nu mai poate inhiba creșterea organismului de testare, zona de inhibiție este demarcată. Diametrul acestei zone de inhibiție din jurul discului cu agent antimicrobian este corelat cu concentrația minimă inhibitoare (MIC) a combinației agent antimicrobian/microorganism utilizată; zona de inhibiție este invers proporțională cu concentrația minimă inhibitoare. În general, cu cât zona de inhibiție este mai mare, cu atât concentrația agentului antimicrobian necesară pentru inhibarea creșterii microorganismelor este mai mică.

Trebuie menționat că, testele de difuziune bazate doar pe absența sau prezența zonei de inhibiție, fără a se preciza dimensiunea acesteia, nu sunt acceptate ca metode de testare a susceptibilității antimicrobiene.

Această metodă este simplu de efectuat, reproductibilă și nu necesită echipamente costisitoare. Principalele avantaje ale acestei metode sunt:

Costuri scăzute

Ușurință în modificarea discurilor de testare când este necesar

Posibilitatea de identificare a unui subset de izolate pentru testări ulterioare, prin alte metode, cum ar fi determinarea concentrației minime inhibitoare (MIC)

Măsurarea manuală a zonelor de inhibiție poate fi consumatoare de timp. Sunt disponibile dispozitive automate de măsurare a zonelor de inhibiție care pot fi integrate cu sistemele de raportare și manipulare a datelor din laboratoare.

Bibliografie

S. Y. Liau, D. C. Read, W. J. Pugh, J. R. Furr, A.D. Russell, Interaction of silver nitrate with readily identifiable groups: relationship to the antibacterial action of silver ions. Letters in Applied Microbiology, 25, 1997, 279–283.

R. Kumar, H. Munstedt, Silver ion release from antimicrobial polyamide/silver composites. Biomaterials, 26, 2005, 2081–2088.

M. L. W. Knetsch, L. H. Koole, New strategies in the development of antimicrobial coatings: the example of increasing usage of silver and silver nanoparticles, Polymers, 3, 2011, 347

H. J. Klasen, A historical review of the use of silver in the treatment o burns. II. Renewed interest for silver. Burns, 26, 2000, 131-138.

E. Yablonovitch, “Inhibited Spontaneous Emission in Solid-State Physics and Electronics”, inPhysi. Rev. Lett., vol. 58, no. 20, May 1987, pp. 2059-2062.

Sajeev John, “Strong Localization of Photons in Certain Disordered Dielectric Superlattices”, in Physi. Rev. Lett., vol. 58, no. 23, June 1987, pp. 2486-2489.

J. N. Israelachvili, Intermolecular and Surface Forces, 2nd ed.; Academic Press: New York, 1992.

X. He, Y. Thomann, R.J. Leyrer, and J. Rieger, “Iridescent colors from films made of polymeric core–shell particles”, Polym. Bull., vol. 57, no. 5, June 2006, pp. 785–796.

G. I.N. Waterhouse, and M. R. Waterland, “Opal and inverse opal photonic crystals: Fabrication and characterization”, in Polyhedron, vol. 26, Issue 2, Jan. 2007, pp. 356-368.

N. Tetreault, H. Miguez, and G.A. Ozin, “Silicon inverse opal a platform for photonic bandgap research”, in Adv Mater, vol. 16, Sept. 2004, pp. 1471-1476

P.S. Mohanty, H. Dietsch, L. Rubatat, A. Stradner, K. Matsumoto, H. Matsuoka, and P. Schurtenberger, “Synthesis and characterization of novel functional electrosterically stabilized colloidal particles prepared by emulsion polymerization using a strongly ionized amphiphilic diblock copolymer”, in Langmuir, vol. 25, no. 4, Jan. 2009, pp. 1940-1948.

C. Chan, C. Huang, H. Lin, T. Hsu, Nanotechnology, 16, 1440-1444, 2005

Arai M, Arai K, Saito S (1979) J Polym Sci, Part A: Polym Chem 17:3655–3665

Fitch RM, Prenosil MP, Sprick KJ (1969) J Polym Sci, Part C:Polym Symposia 27:95–118

Fitch RM (1973) Polym J 5:467–483

Goodall AR, Wilkinson MC, Hearn J (1977) J Polym Sci, Part A:Polym Chem 15:2193–2218

Chang HS, Chen SA (1988) J Polym Sci, Part A: Polym Chem 26:1207–1229

Ou JL, Yang JK, Chen H (2001) Eur Polym J 37:789–799

Henmei N, Yongzhong D, Guanghui M, Masatoshi N, Shinzo O(2001) Macromolecules 19:6577–6585

Y. Chen, S. Sajjadi, Polymer, 50, 357-365, 2009

H. Cardoso, C. P. Leite, M. Zaniquelli, and F. Galembeck, “Easy polymer latex self-assembly and colloidal crystal formation: the case of poly[styrene-co-(2-hydroxyethyl methacrylate)]”, in Colloid Surface A, vol. 144, Issue 1-3, Dec. 1998, pp. 207-217.

J. Zhang, Z. Sun, and B. Yang, “Self-assembly of photonic crystals from polymer colloids”, in Curr. Opinion in Colloid Interface Sci, vol. 14, Issue 2, Apr. 2009, pp. 103-114.

Drd. Oana – Liliana Grigorescu (Rasoaga), Rezumat teza de doctorat “Proprietăți optice ale unor materiale cu aplicații in fotonică”, 2008 – 2011, http://www.unibuc.ro/studies/Doctorate2012Ianuarie/Grigorescu%20Oana%20Liliana%20-%20Proprietati%20optice%20ale%20unor%20materiale%20cu%20aplicatii%20in%20fotonica/rezumat%20teza%20de%20doctorat.pdf

Kittel, Introduction to solid state physics, Jhon Wiley&sons, eight edition, 2005

H. Fudouzi, “Fabricating high-quality opal films with uniform structure over a large area”, in J.Colloid Interf Sci, vol. 275, Issue 1, Febr. 2004, pp. 277–283.

Z.Z. Gu, H. Chen, S. Zhang, L. Sun, Z. Xie, and Y. Ge, “Rapid synthesis of monodisperse polymer spheres for self-assembled photonic crystals”, in Colloid Surface A, vol. 302, Issue 1-3, July 2007, pp. 312–319.

M . Allard, E. Sargent, E. Kumacheva, and O. Kalinina, “Characterization of internal order of colloidal crystals by optical diffraction”, in Opt Quant Electron, vol. 34, no. 1-3, 2002, pp. 2736.

P. Jiang, G. N. Ostojic, R. Narat, D. M. Mittleman, and V. L. Colvin, “The Fabrication and Bandgap Engineering of Photonic Multilayers”, in Adv Mater, vol. 13, no. 6, Mar. 2001, pp. 389-393.

H. Fudouzi, “Optical properties caused by periodical array structure with colloidal particles and their applications”, in Adv Powder Technol, vol. 20, Issue 5, Sept. 2009, pp. 502–508.

Emoto, E. Uchida, and T. Fukuda, “Fabrication and optical properties of binary colloidal crystal monolayers consisting of micro- and nano-polystyrene spheres”, in Colloid Surface A, vol.396, Febr. 2012, pp. 189– 194.

Y. Li, Z. Sun, J. Zhang, K. Zhang, Y. Wang, Z. Wang, X. Chen, S. Zhu, and B. Yang, “Polystyrene@TiO2 core-shell microsphere colloidal crystals and nonspherical macro-porous materials”, in J Colloid Interf Sci, vol. 325, 2008, pp. 567-572.

Gaillot, T. Yamashita, and C. J. Summers, “Photonic band gaps in highly conformal inverseopal based photonic crystals”, in Phys Rev B, vol. 72, Issue 20, Nov. 2005, pp. 205109-10.

G. I.N. Waterhouse, and M. R. Waterland, “Opal and inverse opal photonic crystals: Fabrication and characterization”, in Polyhedron, vol. 26, Issue 2, Jan. 2007, pp. 356-368.

G. Cao, Nanostructures and nanomaterials. Synthesis, Properties & Applications. London: Imperial College Press., 2004.

Y. Ju-Nam, J. R. Lead, Manufactured nanoparticles: An overview of their chemistry, interactions and potential environmental implications. Sci. Tot. Environ. 400, 2008, 396-414.

T. Tolaymat, A. El Badawy, A. Genaidy, K. Scheckel, T. Luxton, M. Suidan, An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: A systematic review and critical appraisal of peer-reviewed scientific papers. Sci. Tot. Environ. (408)5, 2010, 999-1006.

L. Balan, J. Malval, R. Schneider, D. Burget, Silver nanoparticles: new synthesis, characterization and photophysical properties, Mater. Chem. Phys. 104, 2007, 417–421.

V. K. Sharma, R. A. Yngard, Y. Lin, Silver nanoparticles: green synthesis and antimicrobial activities. Adv. Colloid Interface Sci. 145, 2009, 83–96.

Y. A. Krutyakov, A. Y. Kudrinskiy, A. Y. Olenin, G. V. Lisichkin, Synthesis and properties of silver nanoparticles: advances and prospects. Russian Chemical Reviews 77(3), 2008, 233-257.

M. L. W. Knetsch, L. H. Koole, New strategies in the development of antimicrobial coatings: the example of increasing usage of silver and silver nanoparticles, Polymers, 3, 2011, 347.

J. B. Wright, K. Lam, D. Hansen, R. E. Burrell, Efficacy of topical silver against fungal burn wound pathogens. Am. J. Infect. Control 27, 1999, 344-350.

S. W. P. Wijnhoven, W. J. G. M. Peijnenburg, C. A. Herberts, W. I. Hagens, A. G. Oomen, E. H. W. Heugens, B. Roszek, J. Bisschops, I. Gosens, D. van de Meent, S. Dekkers, W. H. de Jong, M. van Zijverden, A. J. A. M. Sips, R. E. Geertsma, Nanosilver – a review of available data and knowledge gaps in human and environmental risk assessment, Nanotoxicology 3(2), 2009, 109-138.

A. R. Shahverdi, A. Fakhimi, H. R. Shahverdi, S. Minaian, Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli, Nanomedicine 3, 2007, 168-171.

C. Baker, A. Pradhan, L. Pakstis, D. J. Pochan, S. I. Shah, Synthesis and antibacterial properties of silver nanoparticles. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2005, 244-249.

A. Panacek, L. Kvitek, R. Prucek, M. Kolar, R. Vecerova, N. Pizurova, V. K. Sharma, T. Nevecna, R. Zboril, Silver colloid nanoparticles: Synthesis, characterization, and their antibacterial activity. J. Phys. Chem. B 110, 2006, 16248-16253.

S. Pal, Y. K. Tak, J. M. Song, Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2007, 1712-1720.

J. R. Morones, J. L. Elechiguerra, A. Camacho, K. Holt, J. Kouri, J. T. Ramirez, The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology 16(10), 2005, 2346–2353.

H. J. Klasen, A historical review of the use of silver in the treatment o burns. II. Renewed interest for silver. Burns 26, 2000, 131-138.

M. Yamanaka, K. Hara, J. Kudo, Bactericidal actions of a silver ion solution on Escherichia coli, studied by Energy-Filtering Transmission Electron Microscopy and Proteomic Analysis., Applied and Environmental Microbiology 71(11), 2005, 7589-7593.

U. Klueh, V. Wagner, S. Kelly, A. Johnson, J. D. Bryers, Efficacy of Silver-Coated Fabric to Prevent Bacterial Colonization and Subsequent Device-Based Biofilm Formation. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 53, 2000, 621-631.

R. L. Davies, S. F. Etris, The Development and Functions of Silver in Water Purification and Disease Control, Catalysis Today 36, 1997, 107–114.

C. L. Fox, S. M. Modak, Mechanism of silver sulfadiazine action on burn wound infections. Antimicrob Agents Chemother 5(6), 1974, 582–588.

M. Solioz, A. Odermatt, Copper and Silver Transport by CopB-ATPase in Membrane Vesicles of E. hirae, The Journal of Biological Chemistry 270(16), 1995, 9217-9221.

C. Lok, C. Ho, R. Chen, Q. He, W. Yu, H. Sun, P. K. Tam, J. Chiu, C. Che, Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities, Journal of Biological Inorganic Chemistry 14(4), 2007, 527-534.

M. Rai, A. Yadav, A. Gade, Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials, Biotechnology Advances 27, 2009, 76-83.

J. P. Guggenbichler, M. Boswald, S. Lugauer, T. Krall, A new technology of microdispersed silver in polyurethane induces antimicrobial activity in central venous catheters, Infection 27, 1999, 16-23.

C. Radheshkumar, H. Munstedt, Antimicrobial polymers from polypropylene/silver composites—Ag+ release measured by anode stripping voltammetry, Reactive & Functional Polymers 66, 2006, 780-788.

K. Kawahara, K. Tsuruda, M. Morishita, M. Uchida, Antibacterial effect of silver-zeolite on oral bacteria under anaerobic conditions, Dental Materials 16(6), 2000, 452-455.

Q. L. Feng, J. Wu, G. Q. Chen, F. Z. Cui, T. N. Kim, J. O. Kim, A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J Biomed Mater 52(4), 2000, 662–8.

S. Y. Liau, D. C. Read, W. J. Pugh, J. R. Furr, A.D. Russell, Interaction of silver nitrate with readily identifiable groups: relationship to the antibacterial action of silver ions. Letters in Applied Microbiology, 25, 1997, 279–283.

Q. Li, S. Mahendra, D. Y. Lyon, L. Brunet, M. V. Liga, D. Li, P. J. Alvarez, Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and microbial control: potential applications and implications. Water Research 42(18), 2008, 4591–4602.

A. Emamifar, M. Kadivar, M. Shahedi, S. Solaimanianzad, Effect of nanocomposite packaging containing Ag and ZnO on inactivation of Lactobacillus plantarum in orange juice, Food Control 22(3-4), 2011, 408-413.

A. Emamifar, M. Kadivar, M. Shahedi, S. Solaimanianzad, Evaluation of nanocomposite packaging containing Ag and ZnO on the shelf life of fresh orange juice. Innovative Food Science & Emerging Technologies 11(4), 2010, 742–748.

J. S. Kim, E. Kuk, K. N. Yu, J. H. Kim, S. J. Park, H. J. Lee, S. H. Kim, Y. K. Park, Y. H. Park, C. Y. Hwang, Y. K. Kim, Y. S. Lee, D. H. Jeong, M. H. Cho, Antimicrobial effects of silver nanoparticles, Nanomedicine 3, 2007, 95-101.

C. N. Lok, C. M. Ho, R. Chen, Q. Y. He, W. Y. Yu, H. Sun, P. K. H. Tam, J. F. Chiu, C. M. Che, Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. Journal of Proteome Research 5(4), 2006, 916-924.

K. Y. H. Yoon, J. Park, J. Hwang, Susceptibility constants of E. coli and B. subtilis to silver and copper nanoparticles, Science of the Total Environment 373(2-3), 2007, 572–575.

P. Mulvaney, Surface plasmon spectroscopy of nanosized metal particles, Langmuir 12, 1996, 788–800.

G. A. Martinez-Castanon, N. Nino-Martinez, F. Martines-Gutierrez, J. R. Martinez-Mendoza, F. Ruiz, Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different

F. Raimondi, G. G. Scherer, R. Kotz, A. Wokaun, Nanoparticles in energy technology: examples from electochemistry and catalysis, Angew. Chem. 44, 2005, 2190–2209.

E. J. Threlfall, I. S. T. Fisher, L. Ward, H. Tschape, P. Gerner-Smidt, Harmonization of antibiotic susceptibility testing for Salmonella: Results of a study by 18 national reference laboratories within the European Union-funded Enter-Net group. Microb. Drug Resist. 5, 1999, 195–199

R. D. Walker, Antimicrobial susceptibility testing and interpretation of results. In: Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine, Prescott J.F., Baggot J.D., Walker R.D., eds. Ames, IA, 2000, Iowa State University Press, 12–26.

CONTRIBUȚII ORIGINALE

Introducere

Argintul reprezintă o alternativă importantă pentru a conferi materialelor proprietăți antimicrobiene, el fiind folosit în mai multe domenii [1-7]. Activitatea antimicrobiană este dependentă de dimensiunile particulei de Ag, ceea ce reprezintă unul dintre motivele obținerii particulelor nanometrice de Ag [7-9]. Sinteza nanoparticulelor de Ag a fost realizată prin mai multe metode care au constat în proceduri de sinteză complexă precum co-precipitare [10], microemulsie [11], sonicare [12, 13], biosinteză [14], iradiere cu energie înaltă [15] și tehnici chimice și fotochimice [16]. Agregarea nanoparticulelor în soluție poate fi prevenită prin folosirea agenților de stabilizare. Una dintre cele mai folosite metode constă în adăugarea în soluție a liganzilor cu lanțuri organice alchil lungi precum tioli [17], carboxilați [18], alcool polivinil, amine sau polietilenglicol [19].

Coloidele polimerice acoperă un domeniu de auto-asamblare sau auto-aroganizare a sistemeleor polimerice ce conțin o suprafața activă sau proprietăți coloidale. Coloidele polimerice pot fi obținute prin polimerizare în emulsie fară surfactant în mediu apos [21, 21]. Coloidele au o formă sferică iar dimensiunile sunt cuprinse în intervalul câtorva sute de nanometri. Stabilitatea lor este dată de stratul dielectric indus de încărcarea inițiatorului. Datorită dimensiunilor relativ mici ale coloidelor, suprafața lor este mare și are rol de suport în depunerea nanoparticulelor ca urmare a forțelor de adeziune ce permit formarea structurilor de tip core-shell [22, 23]. Astfel, invelișul alcătuit din nanoparticule este stabilizat de atracția forțelor prezente la suprafața coloidului, permițând unui material hibrid să se stabilizeze în mediu apos. Un avantaj important al coloidelor polimerice dispersate în mediu apos îl reprezintă lipsa toxicității ceea ce perimite folosirea lor în domenii foarte variate [24, 25].

Scopul acestui studiu a fost de a obține o membrană cu proprietăți anitmicrobiene. O membrană este o structură de tip film subțire care separă două fluide. Membranele pot prezenta diverse selectivități prin încorporarea sau separarea agenților în structura lor, permițând astfel numai unor particule sa treacă prin ele. Folosirea AgNP ca agent activ în membrane se confruntă cu problema fixării nanoparticulelor, pentru a reduce ieșirea lor afară sau agregarea în timpul procesului de filtrare. [26]

Există mai multe metode de încorporare a nanoparticulelor în structurile membranei [27]. Principalele rute constau în încorporarea nanoparticulelor generate in situ sau ex situ în timpul sintezei membranei [26]. În prima metoda de abordare, sinteza nanoparticulei de argint este bazată pe reducerea ionului argint de solventul polimerului urmată de formarea membranei [26, 28]. Mărimea și forma nanoparticulelor va depinde de ratele relative ale nucleerii, creșterii și stablizării. Metoda ex situ poate implica de asemenea funcționalizarea la suprafața a nanoparticulelor antimicrobiene, ceea ce poate ajuta la procesul polimerizării membranei [29]. Cu toate acestea, ramane de rezolvat principalul dezavantaj, pierderea de Ag din membrană.

Luând în considerare faptul ca polimerul sub formă de coloide poate juca rol de suport, adeziunea AgNP la suprafata coloidelor polimerice se dovedește a fi o alternativa valabilă în creșterea stabilității lor în structura membranei. Cu toate acestea, ansamblul coloide polimerice-AgNP trebuie sa fie stabilizat pentru a realiza un proces de filtrare durabil. În acest scop, s-au folosit nanotuburi de carbon pentru crearea unei structuri de rețele cu sferele de polimer acoperite cu AgNP.

Nanocompozitele pe bază de MWCNT (multi-wall carbon nanotube) au dobandit un interes intens datorită proprietăților imbunatățite precum comportament mecanic, conductivități termice si electrice, împreună cu stabilitate chimică [30, 31]. Deși toxicitatea MWCNT este legată de deteriorarea ADN-ului și inflamații pulmonare [33], studiile recente au scos în evidența că MWCNT pot fi folosite în materiale destinate dezinfecției apelor, purificării [34] iar prin cuplarea cu AgNP în procesele de fotodegradare [35].

O membrană antimicrobiană având un design cu posibile aplicații în purificarea apei ar trebui să implice costuri scăzute ale materialelor și o durata de folosire prelungită. Astfel, scopul acestui studiu este de a încerca satisfacerea acestor necesități sociale și economice.

Pentru a atinge aceste obiective design-ul nou propus implică folosirea diferitelor soluții și materiale pentru a atinge diferite avantaje:

Adeziunea AgNP la coloidele polimerice având grupe funcționale pentru a limita migrarea lor în timpul procesului de filtrare [23];

Crearea unui sistem de rețele între coloidele polimerice și cu adaugarea de MWCNT, obtinând astfel rezistență mecanică crescută precum și integrarea MWCNT în sistem [36];

Folosirea unei membrane comerciale ca suport pentru depunerea unui material hibrid antimicrobian rezultând de asemenea o creștere a hidroficilității;

Încapsularea acestui sistem nou în membrana de PMMA pentru creșterea duratei de viața.

Materiale și metode

Materiale

Stirenul (ST) (Merck) și acidul acrilic (AA) (Sigma Aldrich) au fost purificate prin distilare sub vacuum. Persulfatul de potasiu (KPS) (Merck) a fost recristalizat dintr-un amestec de etanol/apă și uscat sub vacuum. Hexanul a fost uscat prin distilare pe sodiu si ținut pe site moleculare de 4 Å. 3-bromopropan-1-ol (Aldrich), 4-dimetilaminopiridina (Aldrich), N-(3-dimetilaminopropil) N’-carbodiimida (EDC) (Aldrich), 4-dimetilaminopiridina (Aldrich), azotatul de argint (AgNO3) (Aldrich), sulfatul de magneziu (Merck), acidul ascorbic (Merck), citratul de sodiu deshidratat (Merck), borohidrura de sodiu (NaBH4) (Merck), cloroformul (Fluka), polimetilmetactrilatul (PMMA) (Mw=123000, Aldrich) au fost folosite fără purificare.

Nanotuburile de carbon (MWCNT) (Sigma Aldrich) cu o puritate mai mare de 95% au fost folosite ca atare. Ca suport s-a folosit o membrană comerciala de nitrat de celuloză (Sartorius, Cellulose Nitrate (CN) Membrane Filter 11403Z-50–-SCM).

Metode

Prepararea particulelor coloidale de ST-AA

1.3 ml ST și 0.2 ml AA au fost adaugați in 20 ml de apă distilată împreuna cu 0,0125 g KPS. Amestecul de reactiv a fost barbotat cu azot și apoi menținut timp de 8 ore la 75oC sub amestecare continuă. Dispersia finală a fost trecută printr-un proces de dializă în apă distilată pentru 7 zile, folosind niste membrane de dializă formate din celuloză, pentru a îndepărta monomerul nereacționat. Particulele de polimer ST-AA au fost recuperate din latex pe o placuța și apă a fost îndepartată la o temperatură de 60oC timp de 4 ore.

3-azidopropan-1-ol a fost sintetizat pornind de la 3-bromopropan-1-ol conform literaturii [37]

3-Bromo-propan-1-ol (5 g, 3.1 ml, 35 mol) și azida de sodiu (3.9 g, 60 mmol) au fost dizolvate într-un amestec de acetonă (60 ml) și apă (10 ml) iar soluția rezultată a fost încalzită până la reflux pe timp de noapte. După o îndepartare partială a acetonei sub presiune redusă, au fost adaugate 30 ml de apă și amestecul a fost extras cu dietileter (4 X 40 ml). Straturile organice au fost colectate și uscate peste MgSO4 și solventul a fost îndepartat sub presiune redusă pentru a conferi produsului aspect fără culoare.

Sinteza nanotuburilor de carbon hidrolizate cu grupe hidroxil (MWCNTs-OH)

Nanotuburile de carbon în stare pură (0.066 g) și 3-azidopropan-1-ol (0.6 g) au fost adăugate în 11 ml de diclorbenzen, sub atomsferă de azot. Amestecul a fost omogenizat la 80oC pe timp de noapte după care a fost precipitat în 40 ml de dieteileter. Nanotuburile de carbon funcționalizate au fost recuperate prin filtrate și spalate cu dietelieter.

Sinteza materialului hibrid ST-AA-MWCNT

Unei soluții degazate de polimer cu particule de ST-AA (450 mg) în hexan au fost adaugate hidroxibenzotriazol (HOBt) (23 mg, 0.17 mmol), N-(3-dimetilaminopropil) N’-carbodiimidă (EDC) (256 mg, 0.669 mmol), 4-dimetilaminopiridină (DMAP) (27 mg, 0.223 mmol) si 15 mg MWCNTs-OH dispersate în 2.5 ml hexan. Amestecul a fost omogenizat la temperatura camerei sub barbotare cu azot pentru două zile. Amestecul a fost filtrat și purificat prin spălari repetate cu etanol, urmând apoi o uscare la 70oC timp de 4 ore.

Generarea nanoparticulelor de Ag in situ (AgNPs)

0,016 mg de ST-AA-MWCNT au fost dispersate în 10 ml H2O. Peste această soluție au fost adăugate 0,001 g AgNO3 în 1 ml de apă si 0,001 g citrate de Na în 1 ml de apă. Apoi a fost adăugată în picături soluția de NaBH4 cu citrat de Na (0,00075 g NaBH4 + 0,001 g citrate de Na în 1 ml de apă). Soluția obținută a fost folosită pentru realizarea unei membrane active (Strat A) prin metoda dip-coating și uscată la temperatura camerei.

Generarea nanoparticule de Ag ex situ (AgNPs)

2.5 mmol, 0.735 g de citrat de sodiu au fost adaugate peste o soluție de AgNO3 (2.5 mmol, 0.435 g) în 100 ml de apă și amestecarea a durat 30 de secunde, fiind continuă. In același timp, o soluție de NaBH4 (0.3 mmol, 0.012 g) în 3 ml de apă au fost introduse în mixtură și amestecate pentru 60 de secunde, la temperatura camerei. Soluția a devenit galbenă ca rezultat al formării nanoparticulelor de Ag și a fost închisă într-o sticlă de culoare maro la 4oC.

Prepararea membranei active folosind particule de AgNP generate ex-situ

Prepararea unui strat activ implicat în folosirea soluțiilor conținând 30 mg de ST-AA-MWCNT dipsersate prin ultrasonare în 4 ml de soluție de nanoparticule de Ag. Soluția obținută a fost depozitată pe o membrana comerciala o prin metoda dip-coating și uscate la temperatura camerei.

Realizarea încapsulării

Realizarea încapsulării într-o membrană de PMMA a implicat folosirea unei soluții de PMMA de 5% într-un amestec de cloroform/etanol (2:1 v/v) și evaporare la temperatura camerei.

Caracterizare

Spectrul Raman a fost înregistrat pe un Microscop Raman DXR de la Thermo Scientific cu un laser de 633 nm. Fasciculul laser a fost focalizat cu un obiectiv 10x.

Analiza XPS a fost realizată pe un instrument K-Alpha de la Thermo Scientific, folosindu-se o sursa monocromatică Al Kα (1486.6 eV), la presiunea scăzută de 2×10-9 mbar. Energia de legatura a fost calibrata prin fixarea semnalului C 1s la 285 eV ca stabndard intern. Spectrele au fost inregistrate utilizand o energie de 200 eV, iar pentru rezolutie mare 50 eV si 100 scanari. Spectrele finale au fost obtinute prin deconvolutia semnalului N 1s.

Spectrul de absorbție infraroșu a fost înregistrat la temperatura camerei cu un spectrometru Nicolet 6700 FTIR în intervalul 4000-400 cm-1.

Pentru caracterizarea morfologică a materialelor obținute s-au realizat analize de microcopie electronică de baleaj folosindu-se un FE-SEM (Field Emission-Scanning Electron Microscope) – RAITH e Line la 10 kV tensiune de accelerare.

Spectrele de absorbție UV-VIS au fost înregistrate folosindu-se un spectrometru V-500 Able Jasco.

Analizele de microscopie electronică de transmisie de înaltă rezoluție (HRTEM) au fost realizate pe un microscop electronic de rezoluție atomică JEOL JEM-ARM 200F, la 200 kV. Probele pentru TEM au fost preparate in urmatorul mod: 0,02 ml de probă concentrate de ST-AA-MWCNTs-AG au fost diluați 5 ml de apa bidistilată si dispersați prin sonicare timp de 5 minute; o picătură din materialul hibdrid dispersat a fost pusă pe o grila de cupru acoperită cu carbon și lasată la uscat în aer pe o hartie de filtru.

Determinarea activității antimicrobiene a fost realizată folosind Staphylococcus auerus, ATCC 25923 utilizând o metodă similară difuzei din disc Kirby-Bauer [38] în mediu de agar. Bacteriile prelevate au fost crescute timp de 4 ore având o concentrație de 106 CFU/mL (colony forming unit per mL). Membranele (membrane comerciale modificate) de dimensiuni de 6 mm au fost folosite pentru a observa sensibilitatea la diferite încărcături cu stratul activ (A – AgNP generate in situ, B – AgNP generate ex situ și C – materialul hibrid fara AgNP). Analizele au fost realizate folosind câte două discuri din fiecare tip de membrană (A, B și C).

Determinarea conținutului de argint a fost realizată folosind un spectrometru de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS, inductively coupled plasma-mass spectrometer) NexIon 300q (Perkin Elmer). Curba de calibrare a fost realizată cu ajutorul unei matrici standard multielement 5% HNO3 de la Perkin Elmer cu o concentrație de argint de 10 mg/l.

Prepararea probelor pentru determinarea concentrației totale de argint

Discurile de membrane ale sistemelor A, B si C au fost cântarite cu precizie (7,7 mg, 8,2 mg și respectiv 7,5 mg) și introduse în vase de Teflon și 4 ml HNO3 și 2 ml H2O2. Digestia a fost realizată într-un reactor cu microunde MWS-1 (Berghof – 1000W). Programul de digestie a fost următorul: stadiul 1 – 5 minute la 160oC (putere 80%); stadiul 2 – 40 minute la 220oC (putere 80%) și stadiul 3 – 20 minute pentru răcire. După mineralizare, probele au fost diluate până la 10 ml cu apă ultrapură. Soluțiile obținute au fost analizate cu ICP-MS.

Prepararea probelor – determinarea migrării argintului

Migrarea argintului din probe a fost determintă prin extracție cu apă ultrapură comform EN 1186-1:2002. Probele de 3,25 cm2 au fost extrase folosindu-se 32,5 cm3 de apa distilata (1:10, suprafața probei : volum). Condițiile extracției au fost: 2 ore la 80oC. Dupa extracție probele au fost înlaturate și soluția a fost acidulată cu HNO3 1% și analizată la ICP-MS.

ICP-MS

Tehnica ICP-MS are capacitatea de analiză calitativă și cantitativă multielementală care poate fi realizată destul de rapid în comparație cu alte tehnici complementare. Datorită sensibilității sale superioare, ICP-MS este o metodă aleasă pentru cele mai multe determinări de oligoelemnte [46]. Aparatul ICP-MS masoară majoritatea elementelor din tebelul periodic. Elementele ce pot fi analizate cu ICP-MS sunt cele pe fundalurile colorate ilustrate în schema 1.

Schema 1. Elementele ce pot fi analizate cu ICP-MS (cele pe fundal color) [47]

Majoriteatea analizelor realizate cu ICP-MS sunt cantitative. Cu toate acestea, acest aparat poate servi și ca analizor semi-cantitativ. Folosind programul destinat analizei semi-cantitative, o probă poate să fie analizată pentru 80 de elemente în timp de trei minute, oferind informații semi-cantitative rezultând valori cantitative la un procent de 30%. [47]

Probele sunt introduse într-o plasma de argon ca picături de aerosol. Plasma usucă aerosolul, disociază moleculele și apoi rupe un electron din componente, formând astfel ionii care sunt îndreptați catre spectrometrul de masă. Majoritatea aparatelor ICP-MS sunt construite cu spectrometre de masa quadrupole ce scanează rapid masa. La orice timp, de la intrare și până la ieșire, prin spectrometrul de masă poate trece o singură încărcătură, astfel dacă spre exemplu unitatea quadrupole a fost setată să permită trecerea ionilor cu o masă de 23/1, atunci prin spectrometru vor trece numai ionii de Na. [47]

La ieșirea din spectrometrul de masă, ionii lovesc primul “multiplicator de electroni”, ce servește ca detector. Impactul ionilor eliberează o cascadă de electroni, care sunt amplificați până când ajung să fie un impuls măsurabil. Softul compară intensitățile impulsurilor măsurate în funcție de anumite standarde, cele care formează curba de calibrare, pentru a determina concentrația elementului. [47]

Rezultate și discuții

Scopul acestui studiu este de a obține o membrană cu activitate antimicrobiană ce prezintă o structură complexă de tip sandwich (Schema 1). Straturile exterioare sunt compuse din membrana de PMMA, în timp ce straturile interioare constau din membrane comerciale modificate pentru a ajunge la proprietăți antimicrobiene. Această caracteristică este rezultatul prezenței nanoparticulelor de Ag în compoziția materialului hibrid depozitate pe o membrana comerciala. Acest material hibrid constă în coloide polimerice și nanotuburi de carbon care au fost folosite pentru stabilizarea stratului activ, respectiv pentru interconectarea particulelor de polimer (Schema 2).

Schema 2: Design-ul membranei antimicrobiene

Metoda folosită pentru sinteza unui strat activ este prezentată în Schema 2. Primul pas a fost de a obține un azido-alcool și reacția lui cu nanoturburile de carbon, rezultând un produs ușor dispersabil. Acest pas a ajutat în următorul stadiu ce a constat în reactia de esterificare cu grupele carboxil prezente la suprafața particulelor de polimer. Acest material hibrid a servit ca suport pentru fixarea nanoparticulelor cu activitate antimicrobiană folosind două strategii: A) generarea in situ a nanoparticulelor de Ag în prezența unui material hibrid și B) realizarea unui amestec cu particule de Ag preformate (Schema 3).

Schema 3: Prepararea stratului activ antimicrobian

Nanotuburile de carbon funcționalizate (MWCNT-OH) au fost sintetizate folosind reactivitatea functionalității azidei ceea ce realizează o legatură covalentă cu nanotuburile de carbon [39, 40]. Astfel, implicând un azido-alcool, suprafața nanotuburilor de carbon va prezenta grupe hidroxil [41].

Astfel, primul stadiu al acestui studiu a constat în obținerea derivatului azido HO-C3-N3 și caracterizarea cu H-NMR.

Pentru a determina modificarea covalentă a nanotuburilor de carbon cu azido-alcool s-au realizat analize RAMAN și XPS (Figura 2). Spectrul Raman a prezentat o bandă puternica la 1580 cm-1 (G mode) și un peak de dezordine indusă la 1330 cm-1 care ar putea fi datorat defectelor din structura nanotuburuilor (capetele nanotuburilor sau suprafața lor). Comparând rapoartele IG/ID ale probelor, valori care au fost 1.30 pentru nanotuburile de carbon înainte de funcționalizare și 1.19 după tratament, rezultatele au prezentat faptul că modificarea chimică a crescut nivelul de dezordine, însa nu au apărut modificări în funcționalizarea nanotuburilor de carbon [42] . Din analiza XPS am calculat gradul de modificare ce a fost aproape de 4%.

Fig. 2. Spectrul Raman pentru MWCNT: a) MWCNT în stare pură; b) MWCNT modificate (MWCNT-OH)

Polimerizarea în emulsie fără surfactant a sistemului stiren-acid acrilic a permis coloidelor polimerice să conțină grupe carboxil la suprafață [43-45]. Analiza SEM a particulelor a scos în evidența că diametrul mediu se situează în jurul valorii de 200 nm (Figura 3).

Urmatorul pas a constat in legarea particulelor de polimer la MWCNT prin reacția de esterificare a grupelor carboxil prezente în coloide cu grupele hidroxil prezente în MWCNT modificate. Spectroscopia FT-IR a fost folosită pentru caracterizarea materialului obținut, și rezultatele au evidențiat apariția unui semnal la 1235 cm-1 specifice vibrațiilor legăturii C-O datorate grupei esterice. Analiza SEM a fost realizată caracterizării morfologiei materialului.

a)

b)

c)

Fig. 4. Analiza SEM (a) MWCNT în stare pură (b),(c) materialul hibrid

Analiza figurii 4 prezintă faptul că MWCNT nu mai sunt împachetate împreună dar sunt mult mai distantate unele față de celelalte și particulele de polimer sunt atașate la suprafața lor. De asemenea, aglomeratele hibride sunt formate conținând MWCNT și particule de polimer ceea ce reprezintă o confirmare a stabilizării sistemului realizată prin reacția de esterificare. Această stabilizare este necesară datorită faptului ca particulele coloidale de polimer sunt mai mici decât porii membranei comerciale. Astfel, fară stabilizarea particulelor de polimer s-ar detașa și s-ar pierde datorită procesului de filtrare.

Pentru a atinge o activitate antimicrobiană ridicată, AgNP au fost adăugate la sistemul obținut. Prima abordare a constatat în generarea in situ a AgNP. Analiza UV-VIS (Figura 5) a sistemului rezultat a scos în evidență prezența unei benzi de absorbție la 400 nm ceea ce confrimă generarea de nanoparticule de argint.

Fig. 5: Analiza UV-VIS a AgNP generate in situ

Analiza TEM a fost realizată pentru caracterizarea morfologică a materialelor hibride ce conțin AgNP sintetizate in situ (A).

Analiza figurii 6 a evidențiat faptul ca și particulele de polimer și MWCNT sunt acoperite cu AgNP, fiind prezente ca agregate cu un diametru mediu de 5 nm.

A doua metoda de adăugare a AgNP în material a fost realizarea unui amestec fizic format din sinteza AgNP obținut ex situ și dispersie apoasă de coloide polimerice/MWCNT (B). Pentru caracterizarea morfologică materialului hibrid conținând argint (B) au fost realizate analize TEM.

Fig. 7. Analiza TEM a unui material hibrid obținut folosind AgNP sintetizat ex situ (B)

Analiza TEM a sistemului (B) (figura 7) a scos în evidență o polidispersitate dimensională ridicată a AgNP cu diametre cuprinse între 20 și 40 nm. Diferența majoră între sistemele (A) și (B) este localizarea predominantă a AgNP în materialul hibrid pentru (A) în timp ce pentru (B) se formează AgNP izolate. Acest aspect poate fi explicat prin forțele de adeziune puternice prezente în sistemul (A) ca rezultat al AgNP de dimensiuni mai mici datorate procesului de sinteza in situ. Astfel, în cazul sistemului (A) rata de formare a AgNP permite fixarea grupărilor de Ag pe suprafața coloidelor polimerice conducând la un proces de creștere al AgNP predominant pe particulele de polimer. În cazul sistemului (B) formarea aglomeratelor poate fi explicată prin sinteza lor în prezența agentului de stabilizare ceea ce nu permite adeziunea pe suprafața materialului hibrid.

Fig. 8. Analiza UV-VIS a AgNP generate in situ și ex situ

Următorul stadiu al studiului a constat în modificarea suprafeței unei membrane hidrofilice folosind o dispersie apoasă a sistemului (A) sau (B). Procesul de fabricație a implicat obținerea unui strat activ pe ambele fețe ale membranei comerciale.

a)

b)

Fig. 9. Depunerea stratului activ: (a) structura inițiala a membranei (b) stratul activ depus pe suprafața membranei comerciale

Morfologia suprafeței unei membrane modificate a fost investigată prin analiza SEM (Figura 9). Membrana ințială a fost prezentată în Figura 9 (a) ceea ce relevă o structură cu un ordin de porozitate ridicat, cu o medie a mărimii porilor de 1 µm. Din investigarea imaginilor din Figura 9 (b) este posibilă concluzionarea faptului că materialul hibrid acoperă întreaga suprafață a membranei cu anumite lipsuri la marginea discului de membrană ca rezultat al metodei de depunere de tip dip-coating. Cu atât mai mult, suprafața acoperită incomplet reprezinta un procent foarte mic.

Adeziunea stratului activ la membrana comercială nu este suficient pentru a asigura o durata de viața a materialului. Pentru a rezolva această problemă, membrana modificată a fost “încapsulată” folosind o membrana de PMMA. Imaginile acestei membrane de encapsulare ți imaginea în secțiune a structurii membranei finale sunt prezentate în Figura 8.

Fig. 10. Imaginile SEM ale membranei finale incapsulate: (a) imagine în secțiune; (b) imaginea unui strat poros de PMMA

Porii membranei de PMMA obținut au diametrul în jurul valorii de 1 µm, după cum se poate observa din Figura 10 (b). Porozitatea globală a structurii complexului obținut poate fi evaluată din Figura 10 (a) ce evidențiaza o structură poroasă compactă în cazul modificării membranei comerciale. Acest lucru reprezintă un avantaj important pentru procesul de filtrare, ceea ce permite un timp de contact mai mare pentru filtrat și stratul activ antimicrobian.

Pentru a confirma stabilitatea structurii membranei, s-au realizat teste de filtrare continuă (Figura 11) și membrana comerciala a servit ca probă de referința. Fluxurile au fost masurate folosind un modul Sartorius (membrană este fixată pe un suport și fluxul este vertical asupra întregii suprafețe membranei) la 0.1 atm vacuum. Solvenții utilizați (500 ml) pentru determinări au fost apa deionizată și etanolul absolut. De obicei, fluxurile de etanol pentru alcool sunt mai mari decat pentru fluxurile de apă datorită hidrofobicității polimerilor organici, fapt care este adevarat în cazul membranei de nitrat de celuloză (3138 l/m2h pentru etanol și 2281 l/m2h pentru apă). Pentru membrana compozit, fluxul de apă este mai mare decât fluxul de etanol – 1933 l/m2h pentru apă și 936 l/m2h pentru etanol. Acest fapt poate fi explicat prin hidroficilitatea stratului activ (particulele coloide, nanoparticule de Ag și MWCNT-OH) pentru structura membranei compozit. O alta observație care se poate face este variația fluxului în timp este scazută chiar și pentru materialul sintetizat, acest fapt fiind o dovadă a stabilității secțiunii membranei compozit.

Fig. 11. Testele de filtrare continuă folosind apa deionizată și etanol absolut pentru testarea membranei compozit și a membranei comerciale (nitrat de celuloză)

Pentru determinarea activității antimicrobiene, membranele complexe obtinuțe au fost testate folosind Staphylococcus aureus, ATCC 25923 folosind o procedură de difuzie cu disc. Diametrele de inhibare a creșterii (incluzând diametre ale discului de 6 mm), măsurate dupa 2 zile, sunt prezentate în Tabelul 1. Activitatea antimicrobiană este strâns legată de conținutul de argint și de rata de eliberare a argintului. Din acest motiv, s-a folosit ICP-MS pentru a determina concentratia de argint în fiecare sistem și a monitoriza rata de migrație (Tabelul 1).

Tabelul 1: Rezultatele activității antimicrobiene; conținutul de argint și rata relativă de eliberare a argintului

*Determinată cu ICP-MS

**Determinată conform standardului EN 1186-1:2002

Rezultatele prezintă o activitate antimicrobiană bună pentru probleme ce conțin AgNP generete ex situ ceea ce poate fi explicat prin rata relativa ridicată de eliberare a argintului.

Cu toate că sistemul A prezintă concentrații de argint ușor mai ridicate, scăderea activității antimicrobiene este explicată prin rate mai scăzute a migrării de argint. Acest lucru poate fi motivat printr-o adeziune mai ridicată a AgNP generate in situ asupra coloidelor polimerice ceea ce limitează difuzia lor.

Concluzii

Am sintetizat o membrană cu activitate antimicrobiană folosind o noua metodă ce constă în realizarea unei structuri tip sandwich. Procesul de fabricație folosit a implicat transformarea unei membrane comerciale într-un material hibrid utilizând AgNP, particule polimerice și nanotuburi de carbon .

AgNP au fost fixate pe particule polimerice ce au fost stabilizate prin realizarea unei structuri de tip rețea ce implică MWCNT.

Modificarea MWCNT a fost pusă în evidență prin tehnica Raman, XPS și SEM. Fixarea AgNP pe particule a fost analizată prin TEM.

Testele de filtrare au evidențiat o stabilitate bună a materialelor și o creștere a hidrofiliei membranelor hibride. Proprietățile antimicrobiene au fost evaluate folosind Staphilococcus aureus și au fost corelate cu rata migrării ionilor de argint.

Noua membrană permite obținerea unor proprietăți antimicrobiene bune și o stabilitate la filtrare bună implicând procese de obținere ușoare.

.

Bibliografie

[1] J.S. Kim, E. Kuk, K.N. Yu, J.-H. Kim, S.J. Park, H.J. Lee, S.H. Kim, Y.K. Park, Y.H. Park, C.-Y. Hwang, Y.-K. Kim, Y.-S. Lee, D.H. Jeong, M.-H. Cho, Antimicrobial effects of silver nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 3 (2007) 95-101.

[2] S.A. Jones, P.G. Bowler, M. Walker, D. Parsons, Controlling wound bioburden with a novel silver-containing Hydrofiber® dressing, Wound Repair and Regeneration, 12 (2004) 288-294.

[3] V. Ilić, Z. Šaponjić, V. Vodnik, B. Potkonjak, P. Jovančić, J. Nedeljković, M. Radetić, The influence of silver content on antimicrobial activity and color of cotton fabrics functionalized with Ag nanoparticles, Carbohydr. Polym., 78 (2009) 564-569.

[4] P.J. Kelly, H. Li, P.S. Benson, K.A. Whitehead, J. Verran, R.D. Arnell, I. Iordanova, Comparison of the tribological and antimicrobial properties of CrN/Ag, ZrN/Ag, TiN/Ag, and TiN/Cu nanocomposite coatings, Surf. Coat. Technol., 205 (2010) 1606-1610.

[5] S. Lin, R. Huang, Y. Cheng, J. Liu, B.L.T. Lau, M.R. Wiesner, Silver nanoparticle-alginate composite beads for point-of-use drinking water disinfection, Water Res., 47 (2013) 3959-3965.

[6] S. Perera, B. Bhushan, R. Bandara, G. Rajapakse, S. Rajapakse, C. Bandara, Morphological, Antimicrobial, Durability, and Physical Properties of Untreated and Treated Textiles Using Silver-nanoparticles, Colloids Surf., A.

[7] Q.H. Tran, V.Q. Nguyen, A.-T. Le, Silver nanoparticles: synthesis, properties, toxicology, applications and perspectives, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 4 (2013) 033001.

[8] Y. Zhang, H. Peng, W. Huang, Y. Zhou, D. Yan, Facile preparation and characterization of highly antimicrobial colloid Ag or Au nanoparticles, J. Colloid Interface Sci., 325 (2008) 371-376.

[9] A. Panáček, L. Kvítek, R. Prucek, M. Kolář, R. Večeřová, N. Pizúrová, V.K. Sharma, T.j. Nevěčná, R. Zbořil, Silver Colloid Nanoparticles:  Synthesis, Characterization, and Their Antibacterial Activity, The Journal of Physical Chemistry B, 110 (2006) 16248-16253.

[10] A. Peetsch, C. Greulich, D. Braun, C. Stroetges, H. Rehage, B. Siebers, M. Köller, M. Epple, Silver-doped calcium phosphate nanoparticles: Synthesis, characterization, and toxic effects toward mammalian and prokaryotic cells, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 102 (2013) 724-729.

[11] W. Zhang, X. Qiao, J. Chen, Synthesis and characterization of silver nanoparticles in AOT microemulsion system, Chem. Phys., 330 (2006) 495-500.

[12] M. Darroudi, A. Khorsand Zak, M.R. Muhamad, N.M. Huang, M. Hakimi, Green synthesis of colloidal silver nanoparticles by sonochemical method, Mater. Lett., 66 (2012) 117-120.

[13] J.H. Byeon, Y.-W. Kim, A novel polyol method to synthesize colloidal silver nanoparticles by ultrasonic irradiation, Ultrason. Sonochem., 19 (2012) 209-215.

[14] M.F. Lengke, M.E. Fleet, G. Southam, Biosynthesis of Silver Nanoparticles by Filamentous Cyanobacteria from a Silver(I) Nitrate Complex, Langmuir, 23 (2007) 2694-2699.

[15] S.-H. Choi, Y.-P. Zhang, A. Gopalan, K.-P. Lee, H.-D. Kang, Preparation of catalytically efficient precious metallic colloids by γ-irradiation and characterization, Colloids Surf., A, 256 (2005) 165-170.

[16] K.-H. Yang, C.-M. Chang, Using a photochemical method and chitosan to prepare surface-enhanced Raman scattering–active silver nanoparticles, Anal. Chim. Acta, 729 (2012) 1-6.

[17] C. Battocchio, C. Meneghini, I. Fratoddi, I. Venditti, M.V. Russo, G. Aquilanti, C. Maurizio, F. Bondino, R. Matassa, M. Rossi, S. Mobilio, G. Polzonetti, Silver Nanoparticles Stabilized with Thiols: A Close Look at the Local Chemistry and Chemical Structure, The Journal of Physical Chemistry C, 116 (2012) 19571-19578.

[18] Y. Kashiwagi, M. Yamamoto, M. Nakamoto, Facile size-regulated synthesis of silver nanoparticles by controlled thermolysis of silver alkylcarboxylates in the presence of alkylamines with different chain lengths, J. Colloid Interface Sci., 300 (2006) 169-175.

[19] M. Yamamoto, M. Nakamoto, Novel preparation of monodispersed silver nanoparticles via amine adducts derived from insoluble silver myristate in tertiary alkylamine, J. Mater. Chem., 13 (2003) 2064-2065.

[20] E. Rusen, A. Mocanu, C. Corobea, B. Marculescu, Obtaining of monodisperse particles through soap-free polymerization in the presence of C60, Colloids Surf., A, 355 (2010) 23-28.

[21] A. Herzog Cardoso, C.A.P. Leite, M.E.D. Zaniquelli, F. Galembeck, Easy polymer latex self-assembly and colloidal crystal formation: the case of poly[styrene-co-(2-hydroxyethyl methacrylate)], Colloids Surf., A, 144 (1998) 207-217.

[22] T. Taniguchi, T. Inada, T. Kashiwakura, F. Murakami, M. Kohri, T. Nakahira, Preparation of polymer core–shell particles supporting gold nanoparticles, Colloids Surf., A, 377 (2011) 63-69.

[23] E. Vasile, E. Rusen, A. Mocanu, M. Patrascu, I. Calinescu, Polymer colloids and silver nanoparticles hybrid materials, Colloid & Polymer Science, 290 (2012) 193-201.

[24] C. Tapeinos, E.K. Efthimiadou, N. Boukos, C.A. Charitidis, M. Koklioti, G. Kordas, Microspheres as therapeutic delivery agents: synthesis and biological evaluation of pH responsiveness, Journal of Materials Chemistry B, 1 (2013) 194-203.

[25] A. Mocanu, B. Marculescu, R. Somoghi, F. Miculescu, C. Boscornea, I.C. Stancu, Fluorescence enhancement for the complex PAMAM–BSA in the presence of photonic crystal heterostructures, Colloids Surf., A, 392 (2011) 288-293.

[26] J.S. Taurozzi, H. Arul, V.Z. Bosak, A.F. Burban, T.C. Voice, M.L. Bruening, V.V. Tarabara, Effect of filler incorporation route on the properties of polysulfone–silver nanocomposite membranes of different porosities, Journal of Membrane Science, 325 (2008) 58-68.

[27] L.Y. Ng, A.W. Mohammad, C.P. Leo, N. Hilal, Polymeric membranes incorporated with metal/metal oxide nanoparticles: A comprehensive review, Desalination, 308 (2013) 15-33.

[28] J. Kim, B. Van der Bruggen, The use of nanoparticles in polymeric and ceramic membrane structures: Review of manufacturing procedures and performance improvement for water treatment, Environ. Pollut., 158 (2010) 2335-2349.

[29] G. Zhang, S. Lu, L. Zhang, Q. Meng, C. Shen, J. Zhang, Novel polysulfone hybrid ultrafiltration membrane prepared with TiO2-g-HEMA and its antifouling characteristics, Journal of Membrane Science, 436 (2013) 163-173.

[30] Z. Spitalsky, D. Tasis, K. Papagelis, C. Galiotis, Carbon nanotube-polymer composites: Chemistry, processing, mechanical and electrical properties, Prog. Polym. Sci., In Press, Corrected Proof.

[31] D. Tasis, N. Tagmatarchis, A. Bianco, M. Prato, Chemistry of Carbon Nanotubes, Chem. Rev., 106 (2006) 1105-1136.

[32] M. Ghosh, A. Chakraborty, M. Bandyopadhyay, A. Mukherjee, Multi-walled carbon nanotubes (MWCNT): Induction of DNA damage in plant and mammalian cells, J. Hazard. Mater., 197 (2011) 327-336.

[33] D.W. Porter, A.F. Hubbs, R.R. Mercer, N. Wu, M.G. Wolfarth, K. Sriram, S. Leonard, L. Battelli, D. Schwegler-Berry, S. Friend, M. Andrew, B.T. Chen, S. Tsuruoka, M. Endo, V. Castranova, Mouse pulmonary dose- and time course-responses induced by exposure to multi-walled carbon nanotubes, Toxicology, 269 (2010) 136-147.

[34] X. Liu, M. Wang, S. Zhang, B. Pan, Application potential of carbon nanotubes in water treatment: A review, JEnvS, 25 (2013) 1263-1280.

[35] Y. Yan, H. Sun, P. Yao, S.-Z. Kang, J. Mu, Effect of multi-walled carbon nanotubes loaded with Ag nanoparticles on the photocatalytic degradation of rhodamine B under visible light irradiation, Appl. Surf. Sci., 257 (2011) 3620-3626.

[36] A. Mocanu, E. Rusen, B. Marculescu, C. Cincu, Synthesis and characterization of a hybrid material from self-assembling colloidal particles and carbon nanotubes, Colloid & Polymer Science, 289 (2011) 387-394.

[37] Y.-W. Yang, J. Hentschel, Y.-C. Chen, M. Lazari, H. Zeng, R. Michael van Dam, Z. Guan, "Clicked" fluoropolymer elastomers as robust materials for potential microfluidic device applications, J. Mater. Chem., 22 (2012) 1100-1106.

[38] A.W. Bauer, W.M. Kirby, J.C. Sherris, M. Turck, Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method, American Journal of Clinical Pathology, 45 (1966) 493-496.

[39] M. Holzinger, O. Vostrowsky, A. Hirsch, F. Hennrich, M. Kappes, R. Weiss, F. Jellen, Sidewall Functionalization of Carbon Nanotubes, Angew. Chem. Int. Ed., 40 (2001) 4002-4005.

[40] M. Cases, M. Duran, J. Mestres, N. Martín, M. Solà, Mechanism of the Addition Reaction of Alkyl Azides to [60]Fullerene and the Subsequent N2 Extrusion to Form Monoimino-[60]fullerenes, The Journal of Organic Chemistry, 66 (2000) 433-442.

[41] C. Gao, H. He, L. Zhou, X. Zheng, Y. Zhang, Scalable Functional Group Engineering of Carbon Nanotubes by Improved One-Step Nitrene Chemistry, Chem. Mater., 21 (2008) 360-370.

[42] J.-Y. Mevellec, C. Bergeret, J. Cousseau, J.-P. Buisson, C.P. Ewels, S. Lefrant, Tuning the Raman Resonance Behavior of Single-Walled Carbon Nanotubes via Covalent Functionalization, J. Am. Chem. Soc., 133 (2011) 16938-16946.

[43] C.e. Yan, S. Cheng, L. Feng, Kinetics and mechanism of emulsifier-free emulsion copolymerization: Styrene-methyl methacrylate-acrylic acid system, J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem., 37 (1999) 2649-2656.

[44] P.H. Wang, C.Y. Pan, Preparation of styrene/acrylic acid copolymer microspheres: polymerization mechanism and carboxyl group distribution, Colloid & Polymer Science, 280 (2002) 152-159.

[45] V.E. Laine, Photonic Crystals: Fabrication, Band Structure, and Applications, Nova Science Publishers, Incorporated, 2010.

[46] Iordache Andreea-Maria, rezumatul tezei de doctorat Studiul unor sisteme complexe cu aplicații biomedicale si ecologice, Universitatea Babeș-Bolyai, Facultatea de Fizică, Cluj-Napoca 2011

[47] http://www.perkinelmer.com/pdfs/downloads/tch_icpmsthirtyminuteguide.pdf

[48] http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus