α-MSH Hormon de stimulare melanocitară STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII 1. Sistemul tegumentar: elemente de anatomie chirurgicală 1. Surgical anatomy of… [304215]

ABREVIERI UTILIZATE ÎN TEXT

IgA Imunoglobulina A

IL-8 Interleukine

α-MSH Hormon de stimulare melanocitară

STADIUL

ACTUAL

AL

CUNOAȘTERII

1. Sistemul tegumentar: elemente de anatomie chirurgicală

1. [anonimizat] ([anonimizat], sudoripare, etc.). Printre funcțiile și proprietățile fundamentale ale pielii se numără cea de barieră (fizică, chimică, biologică) a organismului, [anonimizat], [anonimizat], proteine, carbohidrați, etc. [anonimizat], senzitivă, secretorie, excretorie și de sinteză a vitaminei D sunt de asemenea asigurate de către piele (MILLER, 2013).

[anonimizat], și dinspre proximal înspre distal în cazul membrelor (SCHUMMER, 1981; SCOTT, 1980; SCOTT, 1995, STRICKLAND, 1963; WEBB, 1954). [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. Ph-[anonimizat] (RIPPKE, 2002; RIPPKE, 2004).

Structural, [anonimizat] (THERESA FOSSUM, 2007). Învelișul extern al pielii cuprinde 4 tipuri celulare distincte: keratinocite (≈ 85%), melanocite (≈ 5%), celule Langerhans (≈ 3-8%) și celule Merkel (≈ 2%) (Goldsmith, 1991; Scott 1995; White, 1995). [anonimizat] a 5 straturi, după cum urmează: [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat]; [anonimizat]-a lungul marginilor viabile a plăgilor reprezintă sursa de celule epiteliale necesară acoperirii acestora (PAVLETIC, 2010). [anonimizat]-8 sau peptide neuroimunomodulatoare și antiinflamatoare (α-MSH), participând astfel la reacțiile inflamatorii și imunologice. [anonimizat], determinând activarea limfocitelor T, atunci când pielea este integră. Răspunsul inflamator în cazul activării limfocitelor T joacă un rol semnificativ în numeroase patologii ale pielii (HALES, 1998; MILLER, 2013). [anonimizat] (THERESA FOSSUM, 2007).

[anonimizat], de reticulină (precolagen) și dintr-o [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] (UITTO, 2008; MILLER, 2013), având un rol major în vindecarea plăgilor. [anonimizat], fibroblastele, mastocitele și plasmocitele sunt localizate preponderent în segmentul superficial al dermului. Rețeaua capilară cutanată, limfaticele, filetele nervoase, foliculii piloși, mușchii arrector pili și structurile glandulare sunt prezente tot la nivelul dermului (PAVLETIC, 2010).

Anexele cutanate includ foliculii piloși, glandele sudoripare și glandele sebacee. Alte structuri glandulare cutanate sunt reprezentate de glandele mamare, supracaudale, sacii anali, glandele circumanale caudale si perianale, toate având origine ectodermică (PAVLETIC, 2010).

Foliculii piloși prezintă cinci componente majore: papila dermală, matricea, firul de păr propriu-zis, teaca internă și teaca externă, fiind divizați în scop descriptiv în trei segmente anatomice, respectiv infundibulum, istm și segment inferior (MILLER, 2013). Celulele epiteliale ale tecii externe reprezintă sursa principală de reepitelizare a defectelor cutanate de grosime parțială (PAVLETIC, 2010).

Glandele sebacee sunt glande acinare holocrine, atașate foliculului pilos. Sebocitele diferențiate secretă sebumul încărcat lipidic, care este descărcat prin canalul excretor la suprafața pielii (THIBOUTOT, 2004; CATHERIN NIEMANN, 2009). Rolul sebumului este de a menține suprafața pielii fină și pliabilă, prin pelicula formată la suprafața stratului corneum, care va limita evaporarea, menținând statusul normal de hidratare (MILLER, 2013).

Glandele sudoripare se clasifică în epitrichiale și atrichiale. Glandele epitrichiale sunt distribuite la nivelul pielii cu păr, lipsind de la nivelul tălpilor sau planului nazal. Aceste glande sunt localizate mai profund față de cele sebacee și se deschid la nivel infundibular, deasupra deschiderii ductului sebaceu. Glandele epitrichiale sunt mai dezvoltate și mai numeroase la nivelul joncțiunilor musculo-cutanate, iar secreția lor are rol prin feromonii conținuți, dar și prin calitățile antimicrobiene (conținut în IgA) (JENKINSON, 1990; MILLER, 2013). Glandele atrichiale (merocrine) sunt prezente doar la nivelul tălpilor (SCOTT, 1980), fiind localizate la nivelul dermului profund si hipodermului, iar ductul excretor se deschide direct la suprafața tălpii. La nivelul secreției acestor glande a fost evidențiată prezența citocrom oxidazei, succinazei, fosfatazei alcaline și a fosforilazelor (MONTAGNA, 1967).

Secreția glandeloc sebacee și epitrichiale au importanță în practica chirurgicală în special atunci când aceasta este excesivă, fiind asociată cu procese inflamatorii ale pielii, cu precădere în regiunile bogate în aceste structuri glandulare. În astfel de situații, îngrijirea tegumentului necesită o atenție sporită, pentru a preveni macerarea și infecțiile secundare umidității crescute (PAVLETIC, 2010).

Hipodermul (subcutis) are origine mezenchimală și este dispus subiacent dermului, fiind bogat în țesut adipos și țesut conjunctiv lax (SCHUMMER, 1981; KAREN TOBIAS, 2012). Stratul superficial al hipodermului, papillae adiposae, vine în contact cu dermul, nivel la care mărginește foliculii piloși, glandele sudoripare și vascularizația în vederea protejării acestor structuri de forțele de presiune. Printre funcțiile subcutisului se numără cea de rezervă energetică, termogeneză, izolator termic, înveliș protector și suport, fiind totodată și un rezervor important de steroizi (MILLER, 2013).

Vascularizația tegumentului este divizată în trei plexuri majore intercomunicante de artere și vene, astfel: plexul superficial (subpapilar), plexul cutanat (intermediar) și plexul profund, subdermic (subcutanat) (KAREN TOBIAS, 2012). Microcirculația este asigurată prin intermediul arteriolelor, capilarelor arteriale și venoase și venulelor (BERARDESCA, 1995). Cel mai reactiv segment al microcirculației, precum și punctul de migrare al celulelor inflamatorii din patul vascular spre țesuturi și de creștere a permeabilității vasculare în fenomenele inflamatorii este reprezentat de vasele dermice superficiale, prin venulele postcapilare (MILLER, 2013).

Musculatura pielii include mușchii erectori ai firului de păr (mm. arrectores pilorum), mușchi netezi, bine dezvoltați pe linia dorsală a gâtului, trunchiului și cozii. Fibrele musculare striate sunt prezente în fascia superficială, adiacentă subcutisului și sunt reprezentate la nivel cranial de mușchii panniculus carnosus: sphincter colli superficialis, platisma, și sphincter colli profundus. Mușchiul cutaneous trunci acoperă o mare parte a toracelui și abdomenului, extinzându-se de la regiunea gluteală până la torace. Mușchii cutanați sunt atașați dermului și sunt ancorați la fascia subcutanată, iar prin contracția lor este permisă mișcarea voluntară a pielii și sunt erectați foliculii piloși (EVANS, 2012). Importanța chirurgicală a mușchilor panniculus rezidă în asocierea intimă a vascularizației cutanate și a plexului subdermic cu această structură musculară, astfel încât păstrarea ei în contact cu pielea adiancentă în timpul manoperelor chirurgicale este esențială pentru asigurarea rezervelor vasculare la acel nivel (PAVLETIC, 2010).

Inervația pielii este realizată prin filete somatosenzitive și motorii, cu rol în medierea senzațiilor de durere, presiune, căldură și în controlul răspunsului pilomotor, rezistenței vasculare, activității glandulare dar și în modularea unor procese inflamatorii, proliferative sau reparatorii. Fibrele nervoase cutanate sunt în contact intim cu vasele dermice, mastocitele, fibroblastele, keratinocitele și celulele Langerhans (ANSEL, 1997; MILLER, 2013).

1.1. Particularități anatomice ale sistemului tegumentar la carnivorele domestice și șobolani

1.1. Anatomical features of the integumentary system in domestic carnivores and rats

Caracteristicile sistemului tegumentar variază cantitativ și calitativ între specii, dar și între rasele aceleiași specii sau între indivizii aparținând aceleiași rase; de asemenea, există variații între regiunile corporale și diferențe determinate de vârsta sau sexul individului (MILLER, 2013).

Grosimea medie a pielii la câine variază între 0.5– 5.0 mm. (STRICKLAND, 1963; SCOTT, 1980), iar la pisică între 0.4- 2.0 mm. (KRAL, 1964; SCOTT, 1995), în timp ce grosimea epidermului la ambele specii variază între 0.1-0.5 mm grosime (STRICKLAND, 1963; LLOYD, 1982). Reînnoirea completă a celulelor epidermice la câine durează aproximativ 22 de zile (BAKER, 1973), activitatea mitiotică a epidermului fiind intensificată în cazul plăgilor chirurgicale induse (WINSTANLEY, 1975). Crestele epidermice și bulbii foliculilor piloși lipsesc la nivelul pielii cu păr, atât la câine, cât și la pisică (DUNSTAN, 1995; MILLER, 2013).

O varietate de factori influențează pH-ul pielii; acesta variază la câine între 4.84-9.95 (SCOTT, 1980; MEYER, 1991; RUEDISUELI, 1998) și la pisică între 6.39-6.64 (SZCZEPANIK, 2011). Aparent, pelicula lipidică în cazul ambelor specii este de origine epidermică și conține o cantitate mai mare de esteri sterolici, esteri ai colesterolului și diesteri față de pelicula lipidică umană (CLARYS, 1995). Cantități mici de mucină pot fi prezente la nivelul pielii la ambele specii, în special în jurul anexelor și vaselor de sânge (ZANNA, 2009; MILLER, 2013). La câine se diferențiază trei subtipuri de mastocite dermice: T (triptază), C (chimază) și TC (triptază și chimază) (KUBE, 1998).

La șobolan, structura pielii este fundamental asemănătoare cu a celorlalte mamifere. Grosimea epidermului variază între 25-35 µm; stratum spinosum este unistratificat în mod obișnuit, față de epidermul uman, unde la acest nivel sunt incluse mai multe straturi de keratinocite. Proeminențele epidermice specializate se numesc domi tactili și conțin celule Merkel (mecanoreceptori), fiind comune la șobolan. Similar speciei canine, rozătoarele nu prezintă creste epidermice la nivelul pielii trunchiului.

Fibrele de colagen de tip I și III, precum și cele elastice sunt abundente la nivelul dermului. Mastocitele dispersate prezintă numeroase similarități cu cele localizate în dermul uman, iar grosimea dermului nu variază odată cu vârsta sau ciclul foliculului pilos. Vascularizația dermului este mai puțin abundentă, principalele rețele capilare fiind asociate cu bulbul pilos. În regiunea profundă a dermului, un strat de țesut adipos și țesut conjunctiv lax conectează pielea de fascia musculară superficială. La șobolan, adipocitele au culoare maro și conțin numeroase vacuole adipoase. Mușchiul panniculus carnosus este prezent și la această specie, fiind un strat muscular relativ subțire, însă mult mai puternic reprezentat decât la om, care își păstrează constantă grosimea de-a lungul vieții animalului (WINGERD, 1988; TREUTING, 2017).

2. Plăgile cutanate

2. Skin wounds

Plaga reprezintă o pierdere a continuității celulare și anatomice la nivelul suprafeței externe a corpului sau a unui organ intern (FOWLER, 1999; Pavletic, 2010). Identificarea etiologiei plăgilor, înțelegerea mecanismului fiziopatologic, dar și cunoașterea metodelor corecte de evaluare a diferitelor tipuri de plăgi sunt elemente esențiale în vederea elaborării unui protocol terapeutic eficient (CARRIE SUSSMAN, 2007).

2.1. Aspecte etiologice ale plăgilor cutanate

2.1. Etiology of skin wounds

În funcție de agentul etiologic determinant, plăgile pot fi incizionale (lacerații), rezultate prin abraziune, prin avulsie și delabrante, prin forfecare, prin puncție, prin arsură, prin arme de foc sau chirurgicale (excizionale).

Lacerația este o plagă rezultată prin incizarea tegumentului cu un obiect ascuțit (lamă de bisturiu, sticlă, cuțit, etc.) și care se poate extinde și la nivelul planurilor anatomice subiacente (musculatură, tendoane, nervi); trauma țesutului perilezional este adesea minimă (FOWLER, 1999; KAREN TOBIAS, 2012).

Abraziunea este creată de fricțiunea mecanică a epidermului și a dermului superficial, prin contactul acestor structuri cu o suprafață care este acționată tangențial. Aceste plăgi sunt foarte frecvente în accidentele rutiere sau la nivelul pernițelor plantare și palmare ca și consecință a exercițiului îndelungat pe suprafețe aspre. Deși sunt dureroase, aceste leziuni sunt asociate cu o sângerare minimă și au un timp de vindecare scurt, prin reeptielizare.

Plăgile rezultate prin avulsie și delabrante sunt caracterizate de pierderea extensivă a tegumentului, cu expunerea consecutivă a patului plăgii și contaminarea bacteriană extensivă. Pielea poate fi intactă, însă este avulsată și separată de țesutul subcutanat și de circulația regională, motiv pentru care sunt anticipate necroze tisulare. Aceste plăgi apar cel mai frecvent la nivelul extremităților distale ale membrelor, în accidente rutiere sau prin mușcătură.

Plăgile produse prin forfecare sunt similare cu cele delabrante, însă implică și lezarea planului osos sau a articulațiilor; sunt extrem de predispuse infecțiilor, necesitând o perioadă lungă de vindecare.

Plăgile produse prin puncție sunt rezultatul acțiunii directe a unui obiect ascuțit, acționat pe plan perpendicular față de piele. Plăgile perforante prezintă un punct de intrare și unul de ieșire, iar cele penetrante au doar un punct de intrare, fiind cel mai adesea reprezentate de mușcături; acestea se pot complica prin tracțiune, lacerație, sau contuzie, cu separarea planurilor anatomice (FOWLER, 1999; PAVLETIC, 2010; KAREN TOBIAS, 2012).

Plăgile excizionale sunt plăgi chirurgicale, create cel mai frecvent în scopul cercetării unor mecanisme moleculare și celulare care intervin în procesele de vindecare a rănilor, în diferite condiții experimentale. Până în prezent, în acest scop au fost descrise diferite tehnici de realizare și modele de plăgi excizionale (FRANK, 2003; WANG, 2013; CAMILA MOREIRA, 2015), majoritatea constând în excizarea unui lambou cutanat care implică toată grosimea tegumentului.

2.2. Clasificarea plăgilor

2.2. Wound classification

Vechimea plăgii, extinderea traumei sau gradul de contaminare bacteriană au fost considerate de-a lungul timpului criterii de clasificare ale plăgilor, create în scopul incadrării rănilor într-un tipar terapeutic corelat fiecărei clase de plagă. Aceste clasificări însă sunt bazate exclusiv pe intervalele de timp petrecute de la apariția plăgilor, și trebuiesc corelate cu examenul clinic pentru a putea anticipa evoluția acestora și pentru a lua decizia terapeutică optimă (KAREN TOBIAS, 2012).

În prezent, plăgile se clasifică în funcție de gradul de contaminare bacteriană. Clasa I include plăgile cu o vechime cuprinsă între 0-6 ore de la producere, și care prin urmare sunt minim contaminate (<106 bacterii/gram țesut), fiind considerată în literatura de specialitate „perioada de aur” a vindecării plăgilor, întrucât intervalul de timp este insuficient pentru o replicare bacteriană care să cauzeze infecția acestora.

Clasa a II-a include plăgile cu o vechime între 6-12 ore și la nivelul cărora a avut loc replicarea bacteriană. Rănile incluse în clasa a III-a sunt mai vechi de 12 ore și se consideră că replicarea microbiană a atins un nivel critic, declanșănd infecția locală. La nivelul acestora adesea se identifică focare purulente, țesut devitalizat sau corpi străini (THERESA FOSSUM, 2007; PAVLETIC, 2010; KAREN TOBIAS, 2012).

2.3. Vindecarea plăgilor

2.3. Wound healing

Vindecarea plăgilor este un proces dinamic și complex care cuprinde din punct de vedere temporal patru etape esențiale: hemostaza, inflamația, proliferarea și remodelarea (ZACHARY, 2016). Deși fazele se succed obligatoriu în această ordine, durata fiecărei etape este variabilă, la nivelul aceleași leziuni fiind uneori întâlnite diferite stadii de vindecare.

Fiecare etapă este reglată de mediatori, denumiți citokine, care pot acționa asupra celulelor care le sintetizează (autocrine), celulelor adiacente (paracrine) sau asupra celulelor aflate la distanță (endocrine). Citokinele pot determina producerea de către celule a proteinelor, enzimelor, proteoglicanilor, atașarea glicoproteinelor și a altor componente indispensabile în vindecarea tisulară. Citokinele atașate la receptorii de suprafață ai celulelor și care reglează funcția și creșterea celulară sunt denumite factori de creștere. Aceste proteine extracelulare își au originea în diferite țesuturi și există ca multiple izoforme. Printre cei mai cunoscuți factori de creștere se numără: factorul de creștere derivat din plachete (PDGF), factorul de creștere epidermic (EGF), fibroblastic (FGF), factorul de creștere insulin-like 1 (IGF-1), factorul de transformare și creștere β și α (TGF- β; TGF- α), factorul de creștere vasculară endotelială (VEGF), etc. Cele mai importante efecte la nivel celular ale acestor proteine sunt chemotaxisul, promovarea mitozelor, stimularea și activarea celulară, reglarea unor componente care intervin în vindecarea plăgilor (PAVLETIC, 2010). Rolul matricei extracelulare este esențial în integrarea și medierea acestor semnale (BEHM, 2011). În tabelul 1 sunt redate funcțiile principalilor factori de creștere, precum și originea acestora.

Tabelul (Table) 1

Principalii factori de creștere implicați în vindecarea plăgilor, sursa și funcțiile acestora

The main growth factors involved in wound healing: source and functions

Sursă: LAWRENCE, 1994; PAVLETIC, 2010; BEHM, 2011, KAREN TOBIAS, 2012;

2.3.1. Faza hemostatică și inflamatorie

Lezarea vaselor de sânge determină expunerea colagenului subendotelial la plachete, rezultând agregarea și aderarea acestora, în special la colagenul din membrana bazală. Plachetele aderate încep secreția unor substanțe vasoconstrictoare,

pentru a menține constricția vaselor lezate, pentru a iniția trombogeneza care să prevină hemoragia locală și pentru a iniția angiogeneza, parțial prin eliberarea factorilor PDGF și TGF- β. La 24 de ore de la injuria vasculară, inflamația acută este deplin instalată, persistând până la 96 de ore în cazul în care apar și alți factori perturbatori precum infecția sau traumatismul. Permeabilitatea vasculară crescută și eliberarea prostaglandinelor, dar și a unor factori chemotactici (complementul, IL-1, TNF- α, TGF, etc.) stimulează migrarea neutrofilelor, urmate de monocite, limfocite și fibroblaste. Neutrofilele, macrofagele și limfocitele sunt elementele care predomină în timpul inflamației; cele din urmă sunt esențiale în procesul de vindecare, în timp ce rolul neutrofilelor nu este esențial, întrucât funcția acestora în fagocitoză și apărare antimicrobiană poate fi preluată de către macrofage. În schimb, vindecarea este sever afectată atunci când activarea macrofagelor este supresată. Macrofagele activate pot activa la rândul lor limfocite, care vor elibera limfokine (interferoni, interleukine) și care la rândul lor vor acționa asupra macrofagelor pentru a elibera citokine adiționale precum TNF-α sau IL-1; această interacțiune între elemente asigură o prezență îndelungată a citokinelor în patul plăgii. De asemenea, macrofagele stimulează angiogeneza prin producerea VEGF, proangiogenic potent a cărui contribuție reprezintă peste 50% din activitatea proangiogenică generală la nivelul plăgii (FOWLER, 1999; KOH, 2011; ZACHARY, 2017).

Anumite molecule ale matricei extracelulare, precum proteoglicanii, fiind încărcate negativ, atrag și leagă molecule încărcate pozitiv, precum factori de creștere, chemokine, citokine, metaloproteinaze, etc. Colagenul și fibrina induc la rândul lor chemotaxisul, proliferarea celulară și angiogeneza (ZACHARY, 2017).

2.3.2. Faza proliferativă

La aproximativ 24-36 de ore de la inițierea leziunii, are loc diviziunea și multiplicarea fibroblastelor și a celulelor endoteliale. Factorii responsabili de proliferarea acestor celule, respectiv citokinele și factorii de creștere (EGF, FGF, IL-1, VEGF, TGF-β), sunt derivați în cea mai mare pare din plachete, celule epiteliale și endoteliale, fibroblaste și macrofage activate. Faza proliferativă poate dura 3-4 săptămâni sau mai mult, dependent de dimensiunea plăgii și este caracterizată prin angiogeneză, epitelizare și fibroplazie/ desmoplazie (FOWLER, 1999; ZACHARY, 2017).

Celulele endoteliale vor prolifera din venulele intacte localizate în apropierea plăgii și vor forma noi capilare în vederea inițierii angiogenezei, pe care se vor dezvolta mugurii endoteliali. Mugurii se unesc între ei și sunt canalizați, fiind declanșată circulația sangvină (FOWLER, 1999). Un factor proangiogenic important este Cyr-61 (cysteine-rich angiogenic inducer-61), eliberate de fibroblaste și care reglează expresia VEGF și IL-1β, dar și a colagenului de tip I (CHEN, 2001). Stabilirea unei circulații permanente crește activitatea mitiotică a celulelor mezenchimale adiacente, iar pe măsură ce rețeaua vasculară avansează, celulele țesutului conjunctiv sunt recunoscute ca și fibroblaste. Neutrofilele și limfocitele intră în apoptoză și sunt ingerate de macrofage, iar fibrilele de colagen dispuse paralel încep să înlocuiască spațiile inițial acoperite cu proteoglicani, protocolagen și tropocolagen. În cursul acestei faze intervin un număr extrem de mare de molecule, printre care celulele t-helper tip 2 mediate de IL-4, care induc formarea unui subtip special de macrofage, stimulator al producției de colagen (MOSSER, 2008), proteina matrilin-2, implicată în proliferarea fibroblastelor și în interacțiunile matricei extracelulare (ICHIKAWA, 2008), activina (WANKELL, 2001), IL-4, care activează arginaza din macrofage, determinând producția de ornitină, un precursor important în sinteza colagenului (MOSSER, 2008; BEHM, 2011), etc.

Canalele limfatice se dezvoltă într-o manieră similară vaselor de sânge, însă mult mai lent, astfel încât drenajul limfatic este slab în fazele inițiale ale vindecării plăgii (FOWLER, 1999).

2.3.3. Faza de remodelare

Etapa de remodelare începe la aproximativ 3-4 săptămâni de la injurie, doar în condițiile în care fazele precedente au fost realizate cu succes (ZACHARY, 2017); în stadiul inițial al acestei faze, matricea este subțire și permite migrarea celulelor în patul plăgii, astfel încât până la dezvoltarea tensiunii isometrice, remodelarea depinde de fenomenul de migrare celulară și de proteoliza proteinelor matricei (BROUGHTON, 2006; KAREN TOBIAS, 2012). Această matrice temporară s-a dezvoltat din fibrina și fibronectina produsă în cursul hemostazei, din care ulterior a rezultat formarea glicozaminoglicanilor și proteoglicanilor prin activitatea fibroblastică, ca și răspuns la activitatea TGF- β, PDGF, FGF, metaloproteinazelor și a inhibitorilor metaloproteinazelor (KAREN TOBIAS, 2012; ZACHARY, 2017).

Colagenul de tip I și III reprezintă peste 95% din colagenul cicatricial; în timp ce dermul normal este constituit in proporție de 20% din colagen de tip III, acesta se regăsește în țesutul de granulație în proporție de 30%. În cicatricea matură, în urma dispunerii paralele a fibrelor și înlocuirii parțiale a colagenului de tip III, acesta va fi prezent într-un procent de 10% (BAILEY, 1975; EHRLICH, 1996). Cu cât nivelul de colagen tip III este mai mare în țesutul de granulație, cu atât fibrilele sunt mai glicosilate și prin urmare, mai subțiri, astfel încât matricea este fragilă în această etapă. Pe măsura modificării raportului dintre cele două tipuri de colagen, rigiditatea și rezistența matricei crește. Consecutiv scăderii tensiunii exercitată asupra marginilor plăgii, datorită depunerii de colagen, miofibroblastele și producția de colagen vor regresa (KAREN TOBIAS, 2012). În cazul persistenței forțelor mecanice, producția de colagen prin intermediul fibroblastelor continuă, rezultănd o vindecare anormală (BROUGHTON, 2006). La o săptămână de la injurie, plaga posedă 3% din rezistența sa finală, iar după 3 săptămâni, 20%; abia la 3 luni, aproximativ 80% din rezistența inițială va fi dobândită, fără a mai crește ulterior (FOWLER, 1999; ETHRIDGE, 2007).

2.4. Vindecarea plăgilor: aspecte comparative interspecifice

2.4. Species differences in wound healing

Etapele de bază ale vindecării plăgilor se succed cronologic similar și implică tipuri celulare asemănătoare la toate speciile, însă experiența clinică a demonstrat de-a lungul timpului că există diferențe considerabile între mamifere cu privire la acest proces complex (BOHLING, 2006). Numeroase specii utilizate experimental în studierea vindecării plăgilor (șobolan, șoarece, iepure, hamster) posedă mușchiul panniculus carnosus, care contribuie semnificativ la procesul de vindecare, prin contracție și formarea colagenului, astfel încât relevanța rezultatelor obținute în raport cu specia umană este discutabil. Specia suină este considerată cea mai apropiată de om din punct de vedere al structurii anatomice a pielii, fiind împreună cu șobolanul modelele experimentale standard utilizate pentru acest tip de investigații (GOTTRUP, 2000).

Numeroase studii au evidențiat diferențe remarcabile între specia canină și felină, privind densitatea ramificațiilor terțiare ale vascularizației cutanate, mult mai complexă în cazul canidelor, în special la nivelul trunchiului; perfuzia cutanată este astfel semnificativ mai scăzută la feline, influențând negativ vindecarea plăgilor (TAILOR, 1992; BOHLING, 2004). Formarea și cantitatea țesutului de granulație este de asemenea distinctă între cele două specii; la câine, acesta se dezvoltă simultan din subcutisul expus, în timp ce la feline apare întâi la marginea plăgii, avansând lent pe suprafața acesteia. Acest factor afectează in mod indiscutabil rata de vindecare la feline, care per total este mai redusă decât la canide, atât în ceea ce privește contracția cât și epitelizarea. Prin îndepărtarea subcutisului s-a demonstrat la ambele specii o scădere semnificativă a ratei de formare a țesutului de granulație și a contracției plăgii, impactul asupra acestor parametrii find însă mai mare la feline (BOHLING, 2006). Formarea cictricelor hipertrofice la carnivore este relativ rară, cel mai adesea fiind determinată de traumatismele cronice asupra pielii (JOHNSTON, 1984). Deși în mod tradițional recunoscut precum o specie lipsită de reacții cicatriciale hipertrofice, șobolanul posedă structuri adipoase cu aspect de dom, orientate spre derm, care pot influența apariția cicatricilor hipertrofice (ZUO, 2016).

2.5. Factori care întârzie vindecarea plăgilor cutanate

2.5. Factors that inhibit wound healing

Factorii care inhibă vindecarea rănilor cutanate au fost clasificați în 11 categorii și repartizați în două clase majore, respectiv factori locali și sistemici. Factorii locali includ: perfuzia plăgii, viabilitatea tisulară, existența hematoamelor și/ sau a seroamelor, infecțiile și factorii mecanici. Printre factorii sistemici se numără: imunodeficiențele, prezența proceselor neoplazice, a afecțiunilor sistemice, a injuriilor termice sau a cicatrizării excesive (FRANZ, 2008, KAREN TOBIAS, 2012).

Oxigenarea plăgii este esențială pentru metabolismul celular prin prevenirea infecțiilor, inducerea angiogenezei, stimularea diferențierii keratinocitelor și proliferării fibroblastelor, stimularea migrării, reepitelizării, sintezei de colagen și contracției plăgii (BISHOP, 2008; GUO, 2010). Rata de perfuzie tisulară poate scădea drastic consecutiv hipovolemiei, hipotensiunii, leziunilor la nivel venos/artierial, durerii, diabetului mellitus, vârstei înaintate sau frigului excesiv; căldura poate determina creșterea perfuziei tisulare (WOTHLEY, 2000; WILLIAMS, 2006; FRANZ, 2008).

Prezența țesuturilor neviabile la nivelul plăgilor inhibă dezvoltarea țesutului de granulație și migrarea keratinocitelor, esențiale pentru reepitelizare; țesutul necrotic reprezintă un mediu propice pentru dezvoltarea și proliferarea bacteriană, determinând cu ușurință apariția celulitei, osteomielitei și chiar a septicemiei (MILWARD, 1995; SINGHAL, 2001; CARLY KIRSHEN, 2006).

Colecțiile de fluide pot rezulta în urma hemoragiei (hematoame), inflamației (seroame) sau acumulării de limfă. Aceste colecții pot interfera cu vindecarea plăgilor prin acțiune mecanică, prin ischemie consecutivă compresiunii, prin însămânțare bacteriană sau prin crearea de spații moarte (FRANZ, 2008). Etiologia este multifactorială și include hemostaza inadecvată, întreruperea drenajului limfatic, lezarea suprafețelor tisulare sau existența coagulopatiilor sistemice. Nu în ultimul rând, migragrea leucocitelor și eliberarea de histamine și prostaglandine determină vasodilatație și producție de fluid seros interstițial (LINDSEY, 1990; BULLOCKS, 2006).

Infecția plăgilor apare atunci când mecanismul de apărare și echilibrul local al țesutului gazdă este înfrânt de prezența bacteriilor multiplicate (FRANZ, 2008). Atât bacteriile, cât și endotoxinele pot determina o creștere pe termen lung a citokinelor proinflamatorii (IL-1, TNF-α), prelungind faza inflamatorie; astfel, este inițiată cronicizarea procesului. Nivelul metaloproteinazelor matriceale și cel al inhibitorilor naturali ai proteazelor este crescut, ceea ce determină un dezechilibru în conținutul local al proteazelor, care va conduce la degradarea rapidă a factorilor de creștere (MENKE, 2007; GUO, 2010).

Integritatea imunității umorale și celulare este esențială pentru o vindecare normală a plăgilor, fiind demonstrată inhibarea vindecării în neutropenie (NICHOLSON, 2002). Numeroase boli primare, precum imunodeficiența felină virală, diabetus mellitus sau hiperadrenocorticismul determină imunosupresie (KAREN TOBIAS, 2012), scăderea activității celulelor killer (NK) și a numărului limfocitelor-T fiind evidențiată în hiperadrenocorticism (MASERA, 1999). Efecte imunosupresive au fost raportate și in cazul hemotransfuziilor, fiind afectată consecutiv vindecarea diferitelor plăgi datorită activității leucocitare, dar și prin inhibarea interleukinei IL-2 (MUNIREDDY, 2010).

Întrucât terapia de combatere a cancerului are ca scop inhibarea proliferării și funcției celulare, capacitatea de vindecare a plăgilor este de asemenea diminuată, majoritatea agenților chemoterapeutici fiind citotoxici, antiproliferativi sau antimetabolici (COHEN, 2007; FRANZ, 2008). Radioterapia interferează semnificativ cu vindecarea plăgilor, prin reducerea densității vascularizației și apariția fibrozei, până la diminuarea oxigenului sub nivelul tisular adecvat unei funcționalități optime (BENNETT, 2016).

Injuriile termice severe perturbă mediul biochimic al plăgii, determinând dezorganizarea și întârzierea regenerării la nivel local; împreună cu deficitele tisulare, acești factori facilitează apariția cicatrizării anormale a plăgilor termice (LANIER, 2011; LODER, 2015).

2.6. Protocoale experimentale curente de inducere și evaluare a vindecării plăgilor

2.6. Current experimental models of wound healing

Heterogenitatea plăgilor, dar și natura multifactorială a vindecării acestora, care este influențată de numeroși factori externi, determină necesitatea utilizării unor modele animale în vederea studierii aprofundate a mecanismelor de vindecare (GOTTRUP, 2000). Speciile de animale cele mai utilizate ca și modele in vivo de evaluare a regenerării plăgilor sunt șoarecii și șobolanii (ANSELL, 2014). Deși o perioadă îndelungată de timp a existat o tendință generală în rândul cercetătorilor de a considera modelul murin extrem de limitat în ceea ce privește validitatea și relevanța datelor obținute în raport cu specia umană sau chiar cu alte specii animale, datorită convingerii că mobilitatea pielii și dezvoltarea mușchiul panniculus carnosus ar contribui semnificativ la închiderea plăgii prin contracție și formare de colagen, studii recente indică contrariul. Aparent, contracția și reepitelizarea au avut loc în procent de 40-60% ca și etape individuale în vindecarea plăgilor excizionale la trei linii distincte de șoarece, permițând astfel evaluarea clară a procesului de reepitelizare (CHEN, 2015).

Până în prezent au fost dezvoltate numeroase modele de vindecare a plăgilor (incizionale, excizionale, complete, termice), cu scopul de investiga complexitatea problemelor de regenerare epitelială, atât în medicina umană cât și în cea veterinară. Un astfel de model este și modelul de vindecare al plăgilor excizionale, care este în mod curent cel mai utilizat în studiul fenomenelor tisulare asociate cu regenerarea cutanată, precum hemoragia, formarea țesutului de granulație, reepitelizarea și angiogeneza, având însă o serie de limitări (DI PIETRO LUISA, 2003; WANG, 2013, WILHEM, 2016).

Modelul excizional îndeplinește o mare parte dintre criteriile unui model corespunzător de reproducere al plăgilor, fiind ușor de realizat și de investigat, implicând costuri și timp de execuție relativ reduse, iar plăgile se pot crea aproape oriunde pe suprafața corporală, cel mai des fiind utilizată regiunea dorsală. Prin intermediul acestui model se testează în mod curent eficacitatea diferitelor tipuri de pansamente, substituenți dermici sau agenți locali, evaluarea fiind realizată prin măsurători succesive ale dimensiunilor plăgii la intervale regulate de timp, examinări histologice și teste moleculare. Modelul poate prezenta numeroase variații în privința unor aspecte precum: numărul și dimensiunea plăgilor induse pe un animal, care poate varia între 2 și 20 mm, instrumentul chirurgical utilizat în crearea defectelor și alegerea pansamentelor ocluzive sau a bandajelor neocluzive, care pot influența decisiv evoluția plăgilor (DYSON, 1988; ANSELL, 2014). Plăgile pot fi realizate cu bisturiul circular utilizat în recoltarea biopsiilor prin perforare (tip „punch”) sau cu foarfeca, interesând epidermul, dermul, grăsimea subcutanată și mușchiul panniculus carnosus (GOTTRUP, 2000; DI PIETRO LUISA, 2003).

O serie de parametrii pot fi cuantificați în vederea evaluării procesului de vindecare al plăgilor excizionale, precum: dimensiunea, rezistența, reepitelizarea, răspunsul inflamator, markeri de proliferare tisulară și gradul de cicatrizare. Deși planimetria macroscopică non-invazivă (fotografierea seriată a plăgilor, zilnic) este utilizată frecvent pentru estimarea gradului de regenerare, aceasta rămâne o metodă incertă din punct de vedere al acurateții măsurătorilor privind inflamația sau depunerea matricei extracelulare, procese ce nu pot fi cuantificate macroscopic. Analiza histologică reprezintă metoda „gold standard” de evaluare a acestor parametrii (LEMO, 2010; ANSELL, 2014; MOREIRA, 2015).

Tehnicile complementare, precum colorațiile speciale și imunohistochimia ajută microscopia clasică în evaluarea cu acuratețe a componentelor care intervin în vindecarea plăgilor. Tricromic Goldner sau Tricrom Masson sunt colorații care permit evidențierea fibrelor de colagen la nivelul plăgii (AKESON, 2005; LEE, 2012), în timp ce markeri imunohistochimici precum antiloricrina se utilizează pentru a marca diferențierea și maturarea celulelor epiteliale (LEE, 2012), CD31 pentru vasele de neoformație (XU, 2015), Vimentina pentru evidențierea celulelor mezenchimale (fibroblaste) (MAI, 2008) și diferite citokeratine pentru evidențierea epidermului regenerat (MOLL, 1998; GUPTA, 2014).

Percepția conform căreia vindecarea plăgilor la rozătoare se realizează în cea mai mare parte prin contracție, a condus la dezvoltarea unor protocoale de inducere a plăgilor derivate din modelul excizional clasic, precum este cazul modelului excizional cu adiție de splinturi sau a compresiunii unui pliu de piele cu un cadru metalic (MICHAEL, 2013). Primul model presupune securizarea prin sutură sau adeziv chirurgical a unui inel siliconic în jurul defectului cutanat, menit să minimizeze contracția plăgii (WANG, 2013). Deși procesul de contracție este încetinit, aparent acest lucru se realizează prin opunerea unei rezistențe față de forțele contractile intrinseci din zona plăgii, ceea ce determină transmiterea unor semnale mecanice și biochimice la nivelul defectului. Mai mult decât atât, s-a sugerat faptul că aplicarea unor inele în jurul plăgii ar preveni expunerea acesteia la nivele normale de solicitare mecanică, alterând astfel procesul de vindecare (DAVIDSON, 2013). Deși nu există un model unic ideal pentru toate tipurile de studii care vizează regenerarea cutanată, până la momentul acutal se consideră faptul că modelul excizional simplu este unul concludent și reproductibil, care se vindecă atât prin contracție cât și prin epitelizare, fiind validat de majoritatea studiilor în domeniu (CHEN, 2015).

3. Managementul plăgilor deschise: proceduri terapeutice adjuvante în accelerarea regenerării cutanate

3. Open wounds management: adjunctive therapeutic procedures for enhancement of wound healing

Principiile de bază ale terapiei plăgilor au fost elaborate cu decenii în urmă de către Esmarch și Halsted, fără a suferi modificări majore până în prezent. Acestea subliniau importanța manipulării delicate a țesuturilor, pentru a minimiza trauma chirurgicală indusă de chirurg, a hemostazei adecvate, a conservării aportului vascular, a obliterării spațiilor moarte, a drenajului corespunzător, a prevenirii stazelor venoase dar și a respectării măsurilor de sepsie și antisepsie (PAVLETIC, 2010; KAREN TOBIAS, 2017). În ultimii ani înțelegerea mecanismului de vindecare al plăgilor a crescut remarcabil, astfel încât în prezent genetica, citokinele, proteazele, chemokinele sau peptidele reglatoare sunt atent studiate ca și parte a strategiilor terapeutice (SCHREML, 2010). Se anticipează faptul că introducerea biomaterialelor inovative și a dispozitivelor biomedicale va avea un impact viitor profund în ameliorarea a numeroase patologii cutanate a căror terapie este in prezent problematică (SALAMONE, 2016).

3.1. Metode de tratament

3.1. Types of wound management

Plăgile pielii se pot trata prin sutură primară (vindecare per primam intentionem), sutură primară intârziată, cicatrizare per secundam și sutură secundară (per tertiam intentionem) (FOWLER, 1999). Alegerea opțiunii terapeutice este dependentă de diverși factori, precum: vechimea plăgii, gradul de contaminare și de traumatizare tisulară, vascularizația regională, existența unor afecțiuni sistemice concomitente, posibilitatea închiderii plăgii fără tensionare excesivă sau crearea de spații moarte. Specia pacientului trebuie de asemenea luată în considerare, ținând cont de faptul că, față de specia canină, în cazul felinelor rezistența suturilor primare este mai redusă, iar vindecarea per secundam a plăgilor este mai îndelungată (BOHLING, 2004; KAREN TOBIAS, 2012).

3.1.1. Vindecarea primară

Sutura primară sau vindecarea per primam intentionem constă în apoziția marginilor plăgii prin fixarea acestora cu ajutorul suturilor, capselor sau adezivilor chirurgicali, sau prin aplicarea unei grefe imediat după apariția injuriei (KAREN TOBIAS, 2012). Sutura primară se realizează doar în cazul plăgilor minim contaminate (clasa I), fără potențial ischemic, după ce în prealabil s-a realizat lavajul și debridarea acestora (FOWLER, 1999). Plăgile încadrate in clasa a II-a pot fi tratate prin sutură primară doar dacă contaminarea și trauma sunt minimale și pot fi gestionate la momentul suturii. Orice plagă care poate fi excizată în totalitate poate fi transformată într-o plagă chirurgicală tratabilă prin sutură primară (KAREN TOBIAS, 2012).

3.1.2. Vindecarea primară întârziată

Această metodă de apoziție a marginilor plăgii se realizează într-un interval de timp care variază între 3-5 zile de la apariția injuriei și are ca scop reducerea ratei de infecție la nivelul plăgii, prin scăderea contaminării bacteriene, creșterea oxigenării și implicit a rezistenței locale (CHIANG, 2006; SINGH, 2016). Toaleta mecanică și chimică locală și debridarea țesuturilor neviabile este urmată de tratarea plăgii prin pansamente locale, schimbate la intervale de maxim 12 ore până la momentul închiderii plăgii prin metoda aleasă, care se va realiza în intervalul mai sus menționat, dacă infecția este suprimată și apare țesutul de granulație (DUNN, 2005). Această opțiune de tratament permite manipularea în timp a patului plăgii pentru a asigura suprimarea sau reducerea contaminării bacteriene și sporirea viabilității tisulare anterior închiderii chirurgicale. Plăgile aparținând clasei a II-a pot fi manageriate cu succes prin această metodă (KAREN TOBIAS, 2012).

3.1.3. Cicatrizarea per secundam

Vindecarea prin contracție și epitelizare reprezintă o opțiune terapeutică la care se recurge frecvent în cazul plăgilor intens contaminate, cu devitalizări tisulare severe, în care lavajul și debridarea sunt esențiale, însă închiderea primară sau închiderea primară întârziată nu sunt recomandate. Defectele cutanate care nu pot fi închise prin tehnici chirurgicale convenționale (localizate în regiuni corporale lipsite de elasticitate), plăgile vindecabile per secundam în cazul pacienților cu proprietari constrânși financiar sau plăgile trunchiului în cazul pacienților tineri, care au o capacitate remarcabilă de vindecare per secundam reprezintă cazuri în care această metodă terapeutică poate fi utilizată cu succes (PAVLETIC, 2010; KAREN TOBIAS, 2012). Numeroase studii au evidențiat potențialul cicatrizării per secundam în plăgi ale capului (MOHS, 1978), ale trunchiului, membrelor (LATEO, 2006), suprafetelor plantare, etc (LATEO, 2013).

Deși orice plagă poate fi lăsată sa se cicatrizeze per secundam, nu toate plăgile vor beneficia de această metodă, uneori rezultatul final fiind defavorabil. Epiteliul nou format esta fragil, friabil, iar contracția excesivă a plăgii va interfera cu reepitelizarea completă, astfel încât în centrul plăgii vor rămâne zone de țesut de granulație, proliferativ (JOHNSTON, 2017). Aceste situații pot fi preîntâmpinate prin evaluarea tensiunilor cutanate, preferabil ulterior reducerii tumefacției locale, întrucât edemul separă colagenul dermic și fibrele de elastină, care se vor retracta puternic în primele zile după injurie, exacerbând defectul cutanat. Tensiunea cutanată se evaluează prin manipularea tegumentului marginal plăgii spre centrul acesteia (PAVLETIC, 2010).

3.1.4. Vindecarea secundară (per tertiam intentionem)

Închiderea secundară a plăgii are loc la cel puțin 3-5 zile de la producerea injuriei, după formarea țesutului de granulație, care facilitează controlul infecției și ocupă spațiul creat de defectul cutanat. Acest tip de vindecare se pretează plăgilor sever contaminate, cu suprafețe mari de țesut devitalizat, unde epitelizarea și contracția nu au capacitatea de a închide complet plaga, sau când vindecarea per secundam nu este de dorit. Tehnica presupune excizia țesutului de granulație și a marginilor plăgii, lavajul abundent și apoziția marginilor plăgii. Închiderea plăgii în prezența țesutului de granulație este oarecum dificilă, datorită lipsei de elasticitate și pliabilitate la nivel local; prin excizarea acestuia, închiderea plăgii dobândește un aspect cosmetic. Consecutiv, este recomandată aplicarea unor pansamente absorbante, nonaderente, cu scopul de a oferi un suport mecanic plăgii și de a absorbi exsudatul (THERESA FOSSUM, 2013).

3.2. Utilizarea materialelor funcționale în aplicații terapeutice ale plăgilor excizionale

3.2. Functional materials for open wound healing

În sens general, materialul funcțional este definit ca un material creat pentru a induce o activitate biologică specifică. Biomaterialul reprezintă o substanță care suferă o serie de reacții de suprafață specifice atunci când este implantat în organism, ceea ce va duce la formarea unui strat de hidroxiapatită (HA), responsabil de formarea unei legături puternice cu țesuturile moi sau dure înconjurătoare. Abilitatea unui material de a forma la suprafață un strat similar HA atunci când este imersat într-un fluid biologic simulat in vitro, este adesea percepută ca și un indicator al bioactivității sale (RAHAMAN, 2011).

Matricea ideală trebuie sa fie biocompatibilă, să nu prezinte citotoxicitate, să promoveze adeziunea și proliferarea celulară, să prezinte proprietăți mecanice similare cu cele ale țesuturilor pe care le înlocuiesc, să posede o arhitectură poroasă tridimensională care să permită proliferarea celulară, vascularizația și difuziunea nutrienților între celulele matricei. Nu în ultimul rând, biomaterialul trebuie să se degradeze în produși nontoxici care pot fi ușor resorbiți sau excretați din organism, la o rată care să se sincronizeze cu sinteza de țesut nou, dar și să poată fi procesat în mod economic în forme și dimensiuni anatomice, sterilizabile pentru utilizarea clinică (RAHAMAN, 2011).

Condițiile enumerate mai sus pot fi îndeplinite prin utilizarea unor hidrogeluri bioactive, precum sunt cele pe bază de colagen, hidroxiapatită, chitosan, alginat, elastină, sau precursori polietilenglicolici (PEG). Aceste hidrogeluri au demonstrat citocompatibilitate, fără a genera răspuns inflamator semnificativ, oferind totuși un support fizico-chimic eficient pentu a susține procesul de regenerare tisulară (EDWARDS, 2004; STYNES, 2008; PIRAINO, 2015). Pe lângă proprietățile native pe care le au, anumite biomateriale pot furniza molecule funcționale terapeutice la locul plăgii; alginatul, PEG sau materialele pe bază de poliacid lactic-co-glicolic (PLGA) pot elibera controlat eliberarea unor substanțe active incorporate în matricea acestora (HINES, 2013; PIRAINO, 2015).

Printre cele mai recente și relevante categorii de biomateriale utilizate în regenerarea plăgilor se numără pansamentele având ca și constituenți siloxisilanul, dextranul, uretanul, colagenul, pansamentele cu componente bioactive (fibrina, acidul hialuronic), cu grupări de celule încapsulate (poli-β-aminoesteri, fibrina, PEG), eliberatoare de acizi nucleici (colagenul, acidul hialuronic, poliuretanul, chitosanul, dextranul), bazate pe țesuturi animale (submucoasa intestinului subțire, membrana amniotică, fibroina, colagenul marin), sau încărcate cu antibiotice sau alte substanțe active (chitosanul, PEG, caraagenanul, hidroxipropilmetilceluloza, poliuretanul, dextranul). Nanoparticulele metalice cu constituenți de tipul argintului, magneziului, oxidului de ceriu (CHIGURAPATI, 2013), cuprului, oxidului de fier, aurului (RANDERIA, 2015), sau cele încărcate cu antibiotice (poliacrilații, chitosanul, gelatina), eliberatoare de oxid nitric (tetraetilortosilicații, PEG, silicații), derivate din produși naturali (genipina, argintul, PEG) (NARAGINTI, 2016), bazate pe lipide (proteolipozomi în hydrogel alginat, exozomi) sau pe polimeri (hialuronanul, chitosanul, pectin, dioxidul de titan) sunt terapii bazate pe nanoparticule în curs de dezvoltare (DAS, 2016). Dintre ceramice, sticlele bioactive au fost îndelung studiate în ceea ce privește contribuția adusă la regenerarea țesuturilor osoase (TAVAKOLIZADEH, 2017), iar aplicațiile recente în domeniul regenerării țesuturilor moi, și în particular în vindecarea plăgilor au oferit rezultate promițătoare (NASERI, 2017).

4. Sticla bioactivă în tratamentul plăgilor excizionale

4. Bioactive glass for wound healing applications

Sticla bioactivă aparține unei categorii de biomateriale vitroceramice, cu remarcabile proprietăți bioactive și biocompatibile, ceea ce îi conferă o promițătoare utilitate în domeniul ingineriei biomedicale (DAY, 2003; YLÄNEN, 2011). De la descoperirea primului compus chimic pe bază de sticlă bioactivă (45S5), denumit comercial Bioglass®, și până în prezent, numeroase alte compoziții aparținând acestei clase de biomateriale au fost identificate ca fiind eficiente în ingineria tisulară (GERHARDT, 2010; RAHAMAN, 2011). Structural, sticlele bioactive se clasifică în trei categorii, în funcție de oxidul formator care predomină în compoziția acestora, astfel : silicate (SiO2), boratice (B2O3) și fosfatice (P2O5) (BAINO, 2009).

În urma obținerii unor rezultate clinice extrem de încurajatoare privind vindecarea plăgilor cronice de tipul ulcerelor diabetice, care au o rată redusă de vindecare prin tratament convențional (JUNG, 2011; BAINO, 2016), sticlele bioactive au continuat să genereze un interes major și în domeniul regenerării țesuturilor moi, respectiv al vindecării plăgilor excizionale (LIN, 2012).

4.1. Sinteza și proprietățile fizice esențiale ale sticlei bioactive

4.1. Synthesis and physical properties of bioactive glasses

Sticlele bioactive anorganice convenționale reprezintă o combinație omogenă de oxizi alcalini, metale alcalino-pamântoase, boron, silicon sau aluminiu și se pot obține prin procedeul convențional de topire, evaporare termică, pulverizare magnetron, prin tehnica sol-gel, etc. (MATTOX, 1998; LOMBARDI MARIANGELA, 2013). Toate sticlele, indiferent de metoda prin care sunt sintetizate au în comun două caracteristici: structura sticlei și modificarea graduală a unor proprietăți atunci când sunt încălzite sau răcite între forma solidă (sticla) și forma lichidă (topitura) (BOCCACCINI, 2017). Proprietățile fizice ale acestora pot fi descrise ca și funcții aditive ale oxizilor care le constituie (ZHANG, 2009).

Cerințele procesării sticlelor trebuie să fie conforme cu standardele minime impuse pentru fabricarea biomaterialelor. Reactivi chimici de calitate superioară și înalt purificați sunt utilizați pentru crearea loturilor compoziționale. Sticlele obținute prin topire sunt sintetizate în cuptoare electrice, prin topirea acestor serii de reactivi chimici la temperaturi înalte. În acest scop se utilizează creuzete ceramice sau de platină, pentru a evita contaminarea probelor cu oxizi de la nivelul creuzetului. Binecunoscuta formulă 45S5 și alte sticle bioactive comerciale sunt produse prin topire. În general, timpul de topire pentru loturi mici variază între 1 și 24 de ore, uneori fiind necesare chiar și două topiri succesive pentru a crește gradul de omogenitate al probei. Prin răcirea rapidă a probei apar benzi de tensiune în structura sticlei, care îi deteriorează stabilitatea mecanică. Pentru a evita acest fenomen, proba este supusă unui tratament de călire la 450-550°C, dependent de compoziția sticlei și de temperatura de înmuiere. Aceasta din urmă este determinată pe baza analizei termice diferențiale a sticlei (DUCHEYNE, 2011).

Modelarea probei variază în funcție de destinația finală, cel mai frecvent aceasta fiind presată sub formă de monoliți, bastonașe sau fibre. Prin zdrobirea și trecerea prin sită a sticlei, se pot obține forme particulate și pudrate la dimensiunea dorită. O atenție deosebită trebuie acordată pe tot parcusul procesului de sinteză, pentru a minimiza posibila contaminare a materialului (YLÄNEN, 2011; JONES, 2015). Particulele bioactive pot fi ulterior dispersate în matrici polimerice, utilizate ca și învelișuri pe diferite implante, dispersate ca atare sau chiar injectate direct la nivelul țesutului (VICHERY CHARLOTTE, 2016).

Printre caracteristicile fizice esențiale ale sticlelor se numără vâscozitatea, expansiunea termică, cristalizarea și rezistența mecanică (BOCCACCINI, 2017).

Vâscozitatea sticlei intervine în determinarea parametrilor de topire necesari pentru obținerea unei compoziții omogene, lipsită de incluziuni gazoase vizibile. În sinteza sticlei bioactive, următoarele puncte de vâscozitate standard sunt de interes: topirea sticlei la 102.0 dPa s, temperatura de lucru a sticlei la 104 dPa s, temperatura de transformare a sticlei la aproximativ 1011.3 dPa s și înmuierea la aproximativ 1013 dPa s (BOCCACCINI, 2017; YLÄNEN, 2011).

Un coeficient de expansiune termică adaptat substratului metalic este una dintre cerințele esențiale în prepararea unui înveliș sinterizat de sticlă bioactivă, menit să îmbunătățească bioactivitatea implantului (BELLUCCI, 2011). În cazul unei diferențe majore între coeficienții de expansiune termica ai învelișului, respectiv ai implantului, sticla bioactivă va suferi procese de fragmentare, astfel rezultând un înveliș incomplet (SAAD, 2012).

Sticlele bioactive au o tendință crescută de cristalizare, fie în timpul preparării, ceea ce face dificilă obținerea acesteia în stare amorfă, fie în timpul procesării ulterioare la temperaturi înalte (VEDEL, 2008; BRAUER, 2012). O metodă simplă de a determina procesarea sticlelor la temperaturi înalte, fără apariția cristalizării, este calcularea diferenței de temperatură dintre debutul cristalizării și tranziția sticlei (GALLIANO, 1995; BRAUER, 2015). Acest interval de procesare, ΔT, reprezintă intervalul de temperatură la care vâscozitatea sticlei permite sinterizarea acesteia, tragerea în fibre sau alte manopere de procesare.

Rezistența mecanică trebuie să fie suficient de crescută încât biomaterialul să persiste la locul implantării fără a suporta modificări mecanice. După implantare, va suferi un proces de dizolvare, care poate conduce la formarea de fisuri, în special în timpul supunerii la încărcătură și stres mecanic (BOCCACCINI, 2017). Durabilitatea mecanică este un dezavantaj major al sticlelor bioactive poroase, datorită fragilității intrinseci a acestora, dar și datorită porozității interconectate crescute, necesară pentru penetrarea celulară, vascularizație și circulația nutrienților (GERHARDT, 2010; RAHAMAN, 2011; BOCCACCINI, 2017).

4.2. Caracterizarea structurală a compozițiilor vitroase

4.2. Structural characterization of glasses

La implantarea în organism, sau în condiții in vitro similare, sticlele bioactive suferă un proces de degradare și conversie la o structură amorfă de fosfat de calciu (frecvent hidroxiapatită), care este responsabilă de formarea legăturilor chimice puternice dintre sticle și țesuturile înconjurătoare (NARAYAN, 2013). La baza formării acestor legături chimice stau fenomenul de disoluție dependentă de timp și reacțiile de precipitare ale sticlei în soluția inconjurătoare. Modificările de concentrație ionică au loc în jurul sticlei reacționate și conduc la formarea stratului de conversie la interfața cu mediul (BOCCACCINI, 2017). Comportamentul care determină funcționalitatea sticlei este condiționat de proprietățile cristalografice, de fixare și microstructurale ale acesteia (BANERJEE, 2012). Tehnicile de analiză ale acestor proprietăți sunt discutate succint în cele ce urmează.

4.2.1. Evaluarea degradării și conversiei

Cinetica degradării sticlei și conversia in vitro sunt evaluate prin imersarea materialului (sub formă particulată, poroasă, discoidală, etc.) într-o soluție apoasă fosfatică, de tipul SBF- Fluid Corporal Simulat (Simulated Body Fluid), la 37°C, măsurând pierderea de masă a probei la diferite intervale de timp (HUANG, 2006; YAO, 2007; FU, 2010; RAHAMAN, 2011). SBF-ul deține concentrații ionice similare cu cele ale plasmei sangvine umane, astfel încât bioactivitatea in vivo a unui biomaterial poate fi estimată prin formarea apatitei în această soluție (KOKUBO, 2006).

Pe lângă pierderea de masă, disoluția ionică a speciilor solubile (Na+, (BO3)3-, Si(OH)4, etc.) este acompaniată și de variația pH-ului soluției de imersie, în timp (RAHAMAN, 2011).

4.2.2. Determinarea produșilor de disoluție ionică

Prin eliberarea ionilor de la nivelul sticlei, sunt activate familii de gene variate care reglează procesele de osteogeneză, producția de factori de creștere, adsorbția de proteine și atașamentul celular la suprafața sticlei reacționate (HENCH, 2000; XYNOS, 2000; VALERIO, 2004). Numeroase studii au demonstrat potențialul produșilor rezultați în urma disoluției ionice, în ceea ce privește stimularea angiogenezei (DAY, 2005; GORUSTOVICH, 2009; LEU, 2008), osteogenezei (XYNOS, 2001) sau a activității antibacteriene (ALLAN, 2001; JONES, 2006; HU, 2009).

În vederea evaluării disoluției ionice a diferitelor biomateriale este utilizată o metodă de analiză denumită spectometrie de emisie cu plasmă cuplată inductiv (ICP-OES) (Tantra, 2016), prin care sunt detectați ionii eliberați în soluția fiziologică de imersie. Această tehnică implică detectarea, măsurarea și analizarea radiațiilor electromagnetice care sunt fie absorbite, fie emise de la nivelul atomilor sau ionilor elementelor de interes din probă. Informația cantitativă (nivelul) este derivată din cantitatea radiațiilor electromagnetice absorbite sau emise de către atomii sau ionii de interes, în timp ce informația calitativă (tipul elementelor) este obținută din nivelele de undă la care radiația electromagnetică este absorbită sau emisă de la nivelul atomilor sau ionilor. Unul dintre avantajele majore ale tehnicii ICP-OES constă în acoperirea unei game largi de elemente chimice decelabile. Datorită intervalului dinamic liniar extrem de larg, metoda permite măsurarea urmelor unui singur analit și măsurarea simultană a mai multor analiți prezenți în cantități considerabile, fără diluție anterioară, separare sau preconcentrare. Tehnica prezintă cele mai reduse interferențe ca și severitate, comparativ cu restul metodelor spectometrice atomice utilizate în mod uzual. Deși aceste interferențe spectrale sunt responsabile de inacuratețea tehnicii, flexibilitatea de a alege între numeroase linii de emisie, combinată cu corecțiile interferențelor spectrale sofisticate face posibilă măsurarea lipsită de interferențe a majorității elementelor chimice (OLESIK, 1991; CAZES, 2004).

4.2.3. Evaluarea microstructurală prin microscopie electronică de baleiaj

Microscopia electronică de baleiaj (SEM) cuplată cu spectroscopia de raze X dispersivă în energie (EDS), este o tehnică microanalitică elementală care permite identificarea și cuantificarea elementelor din sistemul periodic, cu excepția H, He și Li, care sunt prezente ca și constituenți majori (minim 10% din masă), constituenți minori și urme. Aceste detectări se realizează pe baza identificării unor vârfuri de raze X rezultate prin excitarea unor electroni. Analiza calitativă SEM-EDS presupune atribuirea elementelor vârfurilor de raze X caracteristice, recunoscute in spectrul EDS. Obținerea unor rezultate cu specificitate crescută este o provocare chiar și în cazul detectării constituenților majori, iar nivelul de dificultate crește pe măsură ce concentrațiile elementale scad, până la nivelul constituenților minori, respectiv urmelor. Tehnica prezintă vulnerabilități care pot degrada rezultatele analitice, în special atunci când identificarea vârfurilor de raze cu ajutorul software-urilor se realizează automat; uneori se pot confunda chiar și vârfurile majore, frecvența erorilor fiind mai mare pe măsură ce concentrațiile elementelor scad (NEWBURY, 2012).

4.2.4. Analiza spectrală prin difracție de raze X

Difracția de raze X (XRD) permite identificarea cu ușurință a apatitei la nivelul suprafeței biomaterialului (DUCHEYNE, 2015), fiind o tehnică cristalografică utilizată în vederea decelării și cuantificării fazelor cristaline prezente în diferite materiale solide și pudre. La direcționarea razelor X asupra unei probe cristaline, o anumită proporție sunt difractate, producând un model de difracție. De la nivelul unui astfel de model, fazele cristaline pot fi identificate prin comparație cu bazele de date internațional recunoscute (de tipul Centrului Internațional al Datelor de Difracție- ICDD), care cuprinde modelele de referință. Prin capacitatea de a măsura distanțele medii dintre straturile sau rândurile de atomi, determinarea orientării cristalelor, identificarea structurilor cristaline dintr-un material necunoscut dar și măsurarea dimensiunilor, determinarea formelor și a stresurilor interne ale unor regiuni cristaline, XRD reprezintă o metodă de analiză actuală extreme de utilă în caracterizarea bioactivității materialelor(KALANTAR-ZADEH, 2008).

4.2.5. Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier FT-IR

Una dintre cele mai comune metode de evaluare a structurii moleculare și a caracteristicilor de suprafață ale unui biomaterial solid este spectroscopia vibrațională (NOTINGHER, 2003). FT-IR reprezintă tehnica spectroscopică cea mai frecvent folosită în caracterizarea suprafețelor biomaterialelor reacționate în SBF sau după implantare, respectiv în evidențierea stratului de HA (PEREIRA, 1995; NOTINGHER, 2003). Principiul pe care se bazează această metodă este iradierea biomaterialului cu o sursă IR și absorbția radiației cu o anumită lungime de undă caracteristică în domeniul IR, generând banda spectrală, care poate permite identificarea unor compuși (PRADHAN, 2017). Vibrațiile caracteristice prezenței HA produc picuri în domeniul numerelor de undă cuprinse între 560 – 604 cm-1 (PEREIRA, 1994).

4.2.6. Spectroscopia în domeniul ultraviolet și vizibil UV-VIS

Spectroscopia UV-VIS este frecvent utilizată în chimia analitică, atât în analiza cantitativă a elementelor, cât și în cea calitativă (CHAU, 2000). Moleculele care conțin electroni π și n au capacitatea de a absorbi radiația luminoasă în domeniul UV-VIS. Spectroscopia UV-VIS se diferențiază de cea IR prin lungimile de undă excitate și prin faptul că moleculele suferă tranziții electronice în domeniul ultraviolet sau vizibil, pe când în spectroscopia FT-IR, acestea suferă tranziții vibraționale în domeniul infraroșu. Analiza poate fi realizată în vederea evaluării unor biomateriale dispersate în solvenți, dar și pentru caracterizarea biomaterialelor solide, în starea lor naturală (WANG, 2013). Mai mult decât atât, spectroscopia UV-VIS permite măsurarea cantitativă a precursorilor ionilor metalici pe parcursul formării nanoparticulelor metalice (OKITSU, 2013).

4.3. Potențialul antibacterian al sticlelor bioactive și evaluarea acestuia

4.3. Antibacterial efficacy of bioactive glasses

În ultimii ani a existat un interes sporit pentru studiul potențialului antibacterian al sticlelor bioactive asupra diferitelor tulpini microbiene, justificat de capacitatea limitată a antibioticelor sistemice de a atinge concentrații optime în diferite țesuturi țintă, dar și de faptul că tot mai puține antibiotice sunt aprobate de asociațiile care reglementează alimentația și medicamentele la nivel mondial, și tot mai multe antibiotice aprobate între anii 1980-1990 sunt în prezent retrase de pe piață (R.A.P. SOCIETY, 2014; FERNANDES, 2017).

Mecanismele prin care compozițiile vitroase exercită activitate antibacteriană includ modificarea pH-ului și a presiunii osmotice locale, precum și lezarea peretelui bacterian prin acțiunea fragmentelor de sticlă care creează orificii la acest nivel, favorizând astfel pătrunderea agenților antimicrobieni în citoplasmă (BEGUM, 2016; DRAGO, 2018). Prin creșterea locală a alcalinității, apare un factor de stres care acționează asupra agentului bacterian, și care determină astfel o modificare morfologică și ultrastructurală la nivelul bacteriei (RAN, 2013).

Interesul crescut față de efectul antibacterian al diferitelor compoziții de sticlă este confirmat de numărul mare de studii recent publicate în acest domeniu. Biosticla 45S5 s-a dovedit a fi eficientă în inhibarea unor tulpini bacteriene cu potențial patogen din flora orală, precum Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans și Actinomyces viscosus, prin efectul ionilor eliberați în mediul fiziologic asupra pH-ului și osmolarității (ALLAN, 2001). Prin introducerea de Cu în compoziția sticlelor silicate, s-a obținut o activitate antibacteriană mai pronunțată împotriva S. aureus la testarea prin metoda difuzimetrică (MIOLA, 2016), în comparație cu sticlele lipsite de Cu. De asemenea, o activitate bactericidă marcantă a fost exprimată asupra unor tulpini gram negative precum P aeruginosa și E coli, de către sticlele silicate aparținând sistemului SiO2–CaO–P2O5–Ag2O, cu 2 mol% Ag (NEZAFATI, 2012). Mai mult decât atât, Zhang și colab. au pus în evidență efectul antibacterian al unor sticle bioactive fără componente cu activitate specific bactericidă, asupra unui număr mare de bacterii, printre care se numără E. coli. P. aeruginosa, M. catarrhalis, E. faecalis și S. epidermis. Și în acest caz, efectul antibacterian a fost atribut capacității materialelor vitroase de a determina modificări de pH și osmolaritate la nivelul mediului fiziologic local (ZHANG, 2010).

Eficiența antibacteriană a sticlelor este depedentă de rata de eliberare a ionilor in mediul fiziologic de implantare al acestora. Ionii puși în liberatate pot interacționa cu membrana citoplasmatică, determinând disfuncții la nivelul activității enzimatice intra- și extracelulare. Eliberarea ionilor determină de asemenea modificări de pH ale mediului fiziologic de imersie, în sensul creșterii acestuia, ceea ce contribuie semnificativ la deteriorarea integrității membranei citoplasmatice, și consecutiv, la denaturarea proteinelor (FERNANDES, 2017).

Printre metodele in vitro cele mai frecvent utilizate pentru evaluarea activității antimicrobiene a sticlelor se numără metoda diluției și tehnica difuzimetrică. În timp ce metoda difuzimetrică este o analiză calitativă, care poate clasifica tulpina bacteriană ca fiind susceptibilă, intermediară sau rezistentă la acțiunea materialului testat, diluția este cantitativă, întrucât poate determina concentrația inhibitorie minimă și concentrația letală minimă. Acuratețea ambelor metode este dependentă de dimensiunea inoculului, tipul mediului de cultură și durata perioadei de incubație. Tehnicile au fost standardizate de către Institutul pentru Standarde Clinice și de Laborator (CLSI) și Comisia Europeană privind Testarea Sensibilității Antimicrobiene (EUCAST) (EUROPEAN COMMITTEE FOR ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TESTING OF THE EUROPEAN SOCIETY OF CLINICAL DISEASES, 2003; MATUSCHEK, 2014; FERNANDES, 2017).

CONTRIBUȚIA

PERSONALĂ

x. Motivația și obiectivele cercetării

x. Motivation and objectives of the research

x. Sinteza și caracterizarea in vitro a unor sisteme oxidice vitroase cu aplicabilitate în vindecarea plăgilor

x. Synthesis and in vitro characterization of various glass systems for wound healing studies

x.1. Obiectivele studiului

x.1. The main objectives

Lucrarea de față își propune să descrie sinteza a două sisteme oxidice vitroase distincte, aparținând sistemului (60-x)B2O3xZnO34CaO1CuO, respectiv (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, și să evalueze in vitro anumite caracteristici fizice ale acestora, în vederea determinării caracterului biocompatibil și anticipării comportamentului in vivo. În acest scop, ne-am propus următoarele obiective:

Obiectivul 1. Sinteza a cinci probe vitroase boratice, cu compoziții procentual distincte, aparținând sistemului (60-x)B2O3xZnO34CaO1CuO, unde x=5, 10, 15, 20, 25 mol% ZnO.

Obiectivul 2. Sinteza a șase probe vitroase fosfatice, cu compoziții procentual distincte, aparținând sistemului (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, unde x=0, 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO și a matricei 80KPO3· 20ZnO.

Obiectivul 3. Evaluarea in vitro a unor caracteristici fizice ale probelor obținute, prin metode analitice, cu scopul anticipării caracterului biocompatibil și aplicabilității acestora în terapia plăgilor cutanate.

x.2. Materiale și metodă

x.2. Materials and method

x.2.1. Sistemul (60-x)B2O3xZnO34CaO1CuO

Cinci probe aparținând sistemului (60-x) B2O3x ZnO34CaO1CuO, unde x=5, 10, 15, 20, 25 mol% ZnO și cu rații B2O3/ZnO egale cu 11; 5; 3; 2; 1.4, au fost preparate utilizând solvenți chimici de înaltă puritate. În acest scop s-au cântărit și omogenizat următorii reactivi chimici, sub formă de pudră: oxid de zinc (ZnO), oxid de cupru (CuO), acid boric (H3BO3) și carbonat de calciu (CaCO3). Compozițiile au fost supuse topirii la 1230°C (Protherm, Laboratory Furnaces, PLF 150/9), timp de 25 minute, în creuzete ceramice. Probele au fost răcite rapid la temperatura camerei, prin stingerea topiturilor între două plăci de cupru. Suprafețele sticlelor astfel obținute au fost supuse evaluării microscopice (Olympus BX51), iar imaginile au fost captate cu ajutorul camerei digitale Olympus SP350. Ulterior, compozițiile au fost zdrobite într-un mojar cu pistil din agat și trecute printr-o sită, pentru a obține în final forme particulate cu diametrul (d)< 0.075 mm.

x.2.1.1. Evaluarea degradării probelor și a variației pH-ului lichidului de imersie

În vederea evaluării comportamentului biologic, au fost cântărite fragmente de dimensiuni similare din fiecare probă, cu ajutorul balanței analitice (Acculab- ATL224I), înainte de a fi imersate în câte 5 ml de soluție salină 0.9% și incubate la 37°C, timp de 7 zile. La sfârșitul perioadei, fiecare probă a fost scoasă din fluidul de imersie și tamponată ușor cu hârtie de filtru, pentru a înlătura excesul de ser fiziologic de pe suprafața ei. Proprietatea de degradare a probelor a fost reprezentată de pierderea de masă, și a fost calculată utilizând ecuația m= 100(mi-mf)/mi, unde mi reprezintă masa inițială a eșantioanelor și mf este masa cântărită după 7 zile de imersie.

PH-ul soluției saline a fost măsurat cu ajutorul pH-metrului (HANNA PH Meter HI 96107), înainte și după finalizarea perioadei de imersie, la temperatura de 37°C a serului fiziologic.

x.2.1.2. Analiza disoluției ionice

Câte 100 mg de probă microparticulată din fiecare eșantion a fost imersată în câte 5 ml de apă deionizată, fiind ulterior incubate la 37°C, timp de 5 zile. Utilizând tehnica analitică ICP-OES, cu ajutorul spectrometrului (FMD-07 Spectro Analytical Germany), au fost determinate concentrațiile ionilor de Cu, Zn, B, Ca și Al eliberate în cursul procesului de degradare de la nivelul probelor în apa deionizată. Pentru calibrare s-a utilizat soluție stoc standard de calibrare multielementală 1000 mg L-1 (Merck, Darmstadt, Germany); eroarea estimată în procesul de măsurare a fost de +/- 5%.

x.2.1.3. Caracterizarea microstructurală și analiza elementală a probelor

Probele au fost caracterizate din punct de vedere morfologic și structural, ulterior imersării unor fragmente din fiecare probă în ser fiziologic 0.9%, timp de 7 zile, la 37° C. Morfolgia suprafeței probelor a fost evaluată prin analize SEM, în timp ce tehnica analitică EDS a permis caracterizarea chimică elementală a sticlelor.

În urma analizei XRD (Bruker D8 Advance), au fost identificate fazele cristaline de la suprafața probelor la sfârșitul perioadei de imersie, pentru a putea caracteriza cu acuratețe modificările apărute în urma contactului cu mediul fiziologic.

x.2.2. Sistemul (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5

Șase probe aparținând sistemului (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5 unde x=0, 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO și matricea 80KPO3· 20ZnO au fost obținute prin topirea în rapoarte adecvate (conform tabelului x), a următorilor solvenți chimici de înaltă puritate: oxid de cupru (CuO), fosfat de potasiu (KH2PO4), oxid de zinc (ZnO) și oxid de argint (Ag2O). Reactivii chimici au fost cântăriți, omogenizați, și supuși topirii în creuzete ceramice, timp de 30 de minute, la 1000°C (LAC Ht Industry). Probele astfel obținute au fost răcite rapid la temperatura camerei, prin stingerea topiturilor între două plăci de inox. Ulterior, compozițiile au fost zdrobite într-un mojar cu pistil din agat, în vederea obținerii acestora în formă pudrată.

Tabelul (Table) X

Compoziția elementală a probelor sintetizate(mol %)

Elemental composition of the synthesized glass samples (mol %)

x.2.2.1. Analiza in vitro a disoluției ionice și evaluarea pH-ului probelor

În vederea evaluării comportamentului in vitro al sticlelor, s-a recurs la cântărierea (Precisa Gravimetrics XT220A) a câte 75 mg din fiecare probă, care a fost ulterior imersată în 5 ml de fluid biologic simulat (SBF), preparat în prealabil conform rețetei Kokubo (KOKUBO, 1990), pornind de la reagenții redați in tabelul X. Aceștia au fost adăgați în ordinea și cantitatea din tabel, unui volum de 700 mL de apă deionizată. Toate probele au fost imersate în triplicat, în recipiente de polietilenă cu închidere etanșă și incubate într-un agitator orbital (Heidolph Unimax 1010), la 37°C, fiind în permanență agitate blând, cu o frecvență de 120 rotații pe minut (figura X). Probele au fost astfel menținute pentru următoarele intervale de timp: 24, 72, respectiv 168 de ore (MAÇON, 2015). Același protocol a fost realizat și pe SBF simplu (martor). La sfârșitul fiecărei perioade de imersie, s-a măsurat pH-ul soluțiilor SBF la 37°C. S-a realizat centrifugarea și decantarea probelor, în vederea recoltării componentei lichide. Ulterior, probele au fost spălate cu acetonă și apă deionizată, în scopul inactivării lor.

Soluția de imersie a fost supusă analizei de spectrometrie de emisie cu plasmă cuplată inductiv (ICP-OES) (FMD-07 Spectro Analytical Germany), pentru a se decela cantitativ (mg/L) speciile ionice de Cu, Zn, Ag, K și P eliberate la nivelul soluției de imersie (SBF), în urma procesului de conversie. Eroarea estimată a procesului de măsurare a fost de +/- 5%.

Tabelul (Table) X

Reagenții utilizați în vederea preparării SBF-ului

Reagents used to prepare the SBF solution

x.2.2.2. Caracterizarea microstructurală și analiza elementală a probelor

Consecutiv imersării în SBF, pudrele au fost uscate și colectate în vederea evaluării caracterului bioactiv prin difracție de raze X (XRD). Identificarea și caracterizarea fazelor cristaline din probele reacționate cu SBF-ul în cele 3 intervale de timp (24, 72 de ore, respectiv 7 zile) s-a realizat pe baza difractogramelor obținute cu ajutorul unui difractometru tip Shimadzu 6000 cu radiație de cupru, la o viteză de scanare de 2°/min, în intervalul 2θ= 10–70. Probele ca atare au fost scanate cu o viteză de 1°/min.

Evaluarea morfologiei de suprafață atât a probelor ca atare, cât și a celor reacționate, a fost realizată prin analiza SEM, cu ajutorul unui microscop electronic de baleiaj (Hitachi SU8230 SEM), la o tensiune de accelerare de 30kV și o intensitate a curentului de 10 µA.

Microanaliza calitativă și cantitativă a probelor, înainte și după imersie, s-a realizat prin tehnica EDS, cu ajutorul software-ului Aztec (Oxford Instruments), la o tensiune de accelerare de 30 kV și distanță de lucru de 15mm. Compoziția medie în procente atomice a fost determinată prin analizarea a zece arii diferite de la nivelul fiecărei probe.

X.2.2.3. Analiza spectrofotometrică a probelor

Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) a fost realizată pentru identificarea lungimilor de undă a căror absorbție este corelată cu structura chimică a probelor. Analiza a fost realizată atât pentru pudrele ca atare, cât și pentru cele reacționate cu soluția de imersie, în cele 3 intervale de timp amintite anterior. În acest sens, au fost omogenizate câte 0.005 g pudră cu 0.2 g bromură de potasiu (KBr), fiind ulterior presate sub formă de discuri la presa hidraulică (Specac Ltd) (figura X). Spectrele au fost înregistrate cu ajutorul spectrometrului Jasco FT/IR-4100, cu o rezoluție spectrală de 4 cm-1, în intervalul numerelor de undă 350-4000 cm-1, cu 256 scanări/ probă.

Spectroscopia de absorbție în domeniile ultraviolet, vizibil (UV-VIS) a probelor ca atare și a celor imersate în SBF, a fost realizată în vederea identificării picurilor de absorbție caracteristici unor compuși chimici prezenți în structura probelor. Spectrele au fost obținute la temperatura camerei, cu ajutorul unui spectrometru model JASCO V-550, în intervalul spectral 200-1800 nm și la rezoluția de 2nm.

x.3. Rezultate și discuții

x.3. Results and discussion

x.3.1. Sistemul (60-x)B2O3xZnO34CaO1CuO

În urma procesului de topire, s-au obținut cinci compoziții de sticlă procentual distincte, aparținând sistemului (60-x)B2O3x ZnO34CaO1CuO, unde x=5, 10, 15, 20, 25 mol% ZnO și raportul B2O3/ZnO egal cu 11; 5; 3; 2; 1.4. După răcirea rapidă a probelor la temperatura camerei și obținerea sticlelor ca atare (figura X, A.), acestea au fost zdrobite și trecute prin sită, rezultând forme particulate cu diametrul < 0.075 mm (figura 1, B.). În general, sticlele compacte obținute prin topire pot fi turnate sub formă de monoliți sau măcinate, în vederea obținerii pudrelor constituite din particule de diferite dimensiuni. Întrucât particulele sunt dense, dimensiunea acestora determină raportul dintre aria suprafeței și volum (NASERI, 2018); cu cât particulele sunt mai mici, cu atât raportul este mai mare și reactivitatea suprafeței probelor în mediul de implantare este mai crescută.

x.3.1.1. Aspecte morfologice ale probelor sintetizate

Probele sintetizate au fost examinate macroscopic și microscopic în vederea caracterizării morfologice, înainte și la finalul celor 7 zile de imersie in soluție salină. Macroscopic, probele ca atare aveau suprafețe netede, aspect omogen, erau transparente și colorate în nuanțe de albastru, datorită prezenței cuprului în structura acestora. Consistența sticlelor era dură, fiind dificil de fragmentat și de măcinat (figura X, A). Microscopic, probele prezentau un aspect “spongios”, datorat unor surplusuri de masă de sticlă și discontinuități ale suprafeței, rezultate în urma stingerii topiturii între cele două plăci de cupru. În profunzimea structurii probelor, se puteau observa incluziuni reduse (5- 10 µm), datorate probabil unui tratament termic deficitar (figura X, A).

În cazul tuturor probelor, la finalul perioadei de imersie, a fost pus în evidență un strat nou format, vizibil macroscopic, cu o grosime de aproximativ 0.5 mm, fragil și casant, de culoare albă. Stratul a fost mai puternic evidențiat la nivelul probelor unde x=10, 15, 20 mol% ZnO, acoperind in totalitate stratul de suprafață inițial, neted și transparent (figura X, C). Evaluat microscopic, stratul superficial prezenta un aspect cristalizat, iar subiacent, suprafața sticlei avea un aspect neted, lipsit de discontinuitățile prezente înainte de imersie. Incluziunile din structura probelor erau semnificativ scăzute ca număr și dimensiuni (figura X, B). În anumite regiuni, datorită grosimii stratului nou format și a opacității acestuia, evaluarea microscopică nu s-a putut realiza. Conform analizei XRD, stratul format la interfața dintre sticlă și mediul de imersie a fost reprezentat de un compus chimic denumit hidroxid dublu stratificat, o structură similară hidrotalcitului, descrisă ulterior în caracterizarea microstructurală și elementală a probelor.

x.3.1.2. Rata de degradare a probelor și evoluția pH-ului soluției de imersie

Pierderile de masă în cazul celor cinci probe sunt prezentate în figura x, cea mai semnificativă fiind înregistrată în cazul probei (60-x)B2O3xZnO34CaO1CuO, unde x=10 mol% ZnO (ΔM= 1.76%). Cea mai redusă pierdere de masă a fost determinată în cazul probei unde x=25 mol% ZnO (ΔM= 0.03%). Pierderea medie de masă în cazul tuturor sticlelor a fost ΔM= 0.86%. Deși pierderile de masă au fost relativ reduse, aceastea au avut loc, indicând prezența unui proces de degradare; rata redusă de degradare și conversie este în general caracteristică sticlelor silicate, fiind un impediment în coordonarea cu viteza de formare a țesuturilor, atunci când aceasta este crescută (HUANG, DAY, 2006; HUANG, RAHAMAN, 2006). În cazul de față, rata de degradare a probelor nu a fost dependentă de conținutul în bor al acestora. Rezultatele obținute de Huang în 2006, care au demonstrat o creștere a pierderii de masă și a reactivității materialului pe măsura suplimentării conținutului în B2O3 al probelor, sunt în contradicție cu rezultatele obținute în studiul de față.

Valoarea pH-ului serului fiziologic la 37°C este de 5.4. În figura X sunt reprezentate modificările de pH ale serului fiziologic, datorate interacțiunii cu probele vitroase. Cea mai semnificativă creștere a valorii pH-ului a fost înregistrată în cazul probei (60-x)B2O3xZnO34CaO1CuO, unde x=15 mol% ZnO, cu 3.5 unități, urmată de proba x=10 mol% ZnO, cu 3.4 unități; proba x=25 mol% ZnO a modificat în cea mai mică măsură pH-ul serului fiziologic, respectiv cu 1.9 unități. Creșterea pH-ului este datorată modificării concentrațiilor ionice care apar în urma degradării probelor (HUANG, DAY, 2006). Cea mai mică creștere a valorii pH-ului s-a înregistrat în cazul probei cu cea mai redusă concentrație de bor și cu cea mai crescută concentrație de Zn. Acest fenomen are loc datorită faptului că, atunci când ZnO este eliberat de la nivelul sticlei în concentrații mai mari în soluția salină, are loc cristalizarea acestuia în hidroxidul carbonatat mixt, conform rezultatelor XRD. Astfel, influența sa asupra pH-ului e semnificativ redusă.

x.3.1.3. Disoluția ionică

În tabelul x sunt prezentate valorile concentrațiilor ionice obținute din apa deionizată pentru elementele chimice indicate, la finalul perioadei de imersie, în cazul fiecărei probe vitroase.

Tabelul (Table) X

Concentrațiile ionice (mg/L) identificate consecutiv imersării probelor în apă deionizată

Concentration of ions (mg/L) identified in the deionized water following immersion of the samples

Cele mai crescute concentrații de B, Zn și Ca au fost identificate la nivelul probei x=25 mol% ZnO (650 mg/L, 0.054 mg/L, respectiv 1270 mg/L). Concentrația maximă de Cu a fost identificată la nivelul probei x=15 mol% ZnO, (0.075 mg/L).

Prezența ionilor de Cu în lichidul de imersie prezintă semnificație biologică prin proprietățile antiinflamatoare, antiinfecțioase, antibacteriene și proangiogenice ale acestuia (BARBUCCI, 2005), fiind distribuit uniform la nivelul celulelor endoteliale umane în faza activă de angiogeneză (FINNEY, 2009). Ionii de Zn sunt implicați în diferite procese enzimatice, antiinflamatoare (LANG, 2007), au rol antibacterian (BOYD, 2009) și joacă un rol important în sinteza proteinelor. Aparent, Zn este un participant activ la sinteza colagenului (HENKIN, 1974). Acesta are rol în stabilizarea membranelor celulare și semnalizarea intracelulară, fiind activ implicat în procesul de vindecare al plăgilor. La nivelul marginilor plăgilor au fost identificate nivele de Zn crescute cu 15-20% în primele 24 de ore de la producere, atingând creșteri de până la 30% în timpul fazelor de granulație și proliferare epidermică (LANSDOWN, 1999).

În ceea ce privește concentrația de Cu, doza letală (LD50) identificată după 24 de ore de incubație pe fibroblaste de șoarece L929 a fost de 46 mg/L (Cao, 2012), pe când fenomenele de citotoxicitate cauzate de Zn se manifestă la concentrații cuprinse între 10-250 mg/L (LODEMANN, 2013; ZHANG, 2011). Boronul este aparent implicat în sinteza proteoglicanilor, colagenului și proteinelor (BENDERDOUR, 1997), crește turnover-ul matricei extracelulare, favorizează fosforilarea proteică și intervine în sinteza de citokine și generarea radicalilor liberi (NZIETCHUENG, 2002)

x.3.1.4. Caracterizarea microstructurală și elementală

În figura x sunt prezentate micrografiile SEM obținute de la suprafața probelor x=10, 15 mol% ZnO, la finalul perioadei de imersie în SBF. La acest nivel au fost observate aglomerări structurale cu aspect conopidiform (figura X, A), sferic (figura X, B), precum și structuri cu forme geometrice regulate, bine delimitate (figura X, C-D).

Caracterizarea elementală a suprafeței probelor s-a realizat prin analiza EDS, fiind reprezentată în figura X. La suprafața tuturor probelor s-au regăsit nivele de Si, Ca, C și Zn, rezultate în urma interacțiunii compozițiilor cu mediile de imersie. Nivele reduse de Mg s-au regăsit în patru compoziții, lipsind în cazul probei cu cea mai mică concentrație în bor, iar Cu a fost prezent doar la suprafața a două compoziții vitroase. Semnificația prezenței ionilor de Cu și Zn la nivelul plăgilor a fost discutată anterior. În ceea ce privește efectul ionilor de Si, testele in vitro și in vivo au evidențiat accelerarea proliferării fibroblastice și a sintezei fibrelor de colagen în stadiile incipiente ale vindecării plăgilor (PARK, 2017). Ionii de Ca au un potențial rol stimulator asupra dezvoltării țesutului de granulație în primele trei zile de la inițierea injuriei cutanate, probabil prin intermediul sistemului Ca2+- calmodulin (MIZUMOTO, 1987). De asemenea, un studiu recent a evidențiat efectele pozitive ale ionilor de Mg2+ și Si4+ cu privire la neovascularizație și depunerea și maturarea colagenului în comparație cu lotul martor, în plăgile excizionale la șobolani (SASAKI, 2017).

Evaluarea XRD a detectat picuri de difracție caracteristici pentru Zinc Aluminiu Carbonat Hidroxid Hidrat, o structură similară hidrotalcitului, cunoscută și sub denumirea de hidroxid dublu stratificat, cel mai intens fiind identificat la 11.65° (figura X). Compusul are comportament catalizator, modificator de anioni, însă cea mai importantă utilitate a sa este capacitatea de a putea fi folosit ca și substrat pentru imobilizarea unor materiale biologice (TICHIT, 2003; CAVANI, 1991). Dezvoltarea acestei interfețe este rezultatul interacțiunii dintre ionii de Zn și Al, în condiții hidrotermice alcaline. Koh obține acest compus chimic și îl utilizează cu succes ca și substrat de sinteză pentru nanobastonașe de ZnO, dispuse hexagonal (KOH, 2005).

Tabelul (Table) X

Compoziția elementală a suprafeței probelor după 7 zile de imersie in soluție salină 0.9%

EDS results (wt.%) of glass sample surfaces after 7 days of soaking in 0.9% saline solution

O altă structură identificată prin intermediul picurilor de difracție la interfața probelor, este Cupru Aluminiu Sulfat Hidroxid Hidrat, având o intensitate maximă la 8.31° și o frecvență a picurilor semnificativ redusă în comparație cu hidroxidul dublu stratificat, însă fără a prezenta o semnificație de interes biomedical. De asemenea sunt prezente linii de cristalizare suplimentare, reprezentând picuri de sare, care provin de la nivelul fluidului de imersie.

x.3.2. Sistemul (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5

În urma procesului de topire, au fost obținute șapte probe vitroase fosfatice, cu compoziții procentual distincte, aparținând sistemului (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, unde x= 0, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20 mol % CuO. După răcirea rapidă a probelor la temperatura camerei și mojararea acestora, s-au obținut forme pudrate (figura X). Cea mai utilizată metodă de obținere a sticlelor este reprezentată de fuziunea prin topire a doi sau mai mulți constituenți oxidici. Tehnica de preparare influențează în mod substanțial densitatea, aria suprafețelor, dar și porozitatea materialelor. În general, dimensiunea particulelor, porozitatea și aria suprafeței sunt mai mari în cazul sticlelor obținute prin metoda sol-gel (KAUR, 2015). Sticlele produse prin topire au o structură mai densă și sunt caracterizate printr-un un grad mai redus de omogenitate. Avantajele acestei tehnici sunt reprezentate de costul mai redus și expeditivitatea procedurii, fiind pretabilă în sintetizarea unor cantități crescute de materiale vitroase. Forma pudrată este în general obținută în vederea aplicațiilor dentare, în regenerarea plăgilor și purificare (ZHANG, 2014).

Adiția a 1-10 mol% de CuO în compoziția sticlei fosfatice determină scăderea gradului de degradare a acesteia, însă sporește concentrația ionilor de Cu2+ eliberați, cu potențial antibacterian, prin creșterea raportului arie suprafață: volum (HOPPE, 2011).

x.3.2.1. Evaluarea disoluției ionice prin analiza ICP-OES

În urma analizei elementale ICP-OES, realizată pe soluțiile de imersie (SBF), au fost detectate concentrațiile ionice de Cu, Zn și Ag la diferite intervale de timp (24, 72, 168 ore). În figura X sunt prezentate concentrațiile ionilor de Cu, eliberate gradual din probele sintetizate. Conform figurii, se poate observa faptul că în primele 24 de ore are loc o eliberare crescută a ionilor de Cu în soluția de imersie, atingându-se rapid concentrații cuprinse între 0,51-74,21 ppm. Aceste valori sunt, în mod previzibil, dependente de masa de CuO introdusă în probe, ceea ce determină o creștere a concentrației ionice odată cu creșterea masei; rezultate similare au fost obținute și în alte studii (NEEL, 2005; POPESCU, 2016), în ceea ce privește dependența masă inițială-concentrație eliberată. După primele 24 de ore, concentrația ionică fie stagnează, fie scade sau crește extrem de ușor, în general fiind vizibil un aspect liniar în intervalul 24-168 ore, fără variații majore ale concentrațiilor ionice. Singura excepție de la acest comportament este prezentă în cazul probei matrice, care nu conține CuO; valoarea obținută la 72 de ore în soluția de imersie este irelevantă și probabil eronată, datorită nivelului extrem de mic de concentrație detectat.

Datorită rolurilor biologice complexe îndeplinite mai ales la nivel endotelial, identificarea și cuantificarea ionilor de Cu in fluidele de imersie este extrem de utilă. Până în prezent, au fost detectate nivele semnficative de Cu la nivelul celulelor endoteliale umane pe parcursul procesului de angiogeneză (FINNEY, 2009), fiind astfel asociat cu stimularea proliferării endoteliale la oameni (HU, 1998). De asemenea, ionii de Cu s-au dovedit a avea un efect stimulator sinergic asupra angiogenezei, atunci când sunt asociați cu factorul de creștere angiogenic FGF-2 (GÉRARD, 2010; HOPPE, 2011). Proprietățile angiogenice ale Cu sunt atribuite capacității sale de creștere a răspunsului celular endotelial, ca urmare a activării factorului indus de hipoxie (HIF)-1α. Totuși, depășirea unor intervale de concentrație optime la nivel tisular, poate determina citotoxicitate prin generarea de specii de radicali liberi, cu declanșarea unor fenomene neurodegenerative (GAETKE, 2003; HUNG, 2010; STÄHLI, 2015).

Conform unui studiu recent (ALARIFI, 2013), o concentrație de 5 mg/L de nanoparticule de CuO, echivalentă cu 5 ppm, nu determină citotoxicitate semnificativă asupra liniei de keratinocite umane HaCaT (3,8% toxicitate celulară), în urma testării simultane a funcției mitocondriale (MTT) și a eliberării de lactat dehidrogenază (LDH). Concentrațiile care depășesc 10 mg/ L, respectiv 10 ppm, determină injurii la nivelul membranei celulare și eliberare de LDH. Prin urmare, rezultatele analizei ICP privind concentrația CuO eliberată de sticlele luate în studiu, sugerează prezența unor valori cuprinse în intervalul de viabilitate celulară.

În figura X sunt redate concentrațiile ionilor de Zn detectate în soluția de imersie, la 24, 72 și 168 de ore. Cinetica eliberării ionilor de Zn este similară cu cea a ionilor de Cu, astfel încât în primele 24 de ore are loc o eliberare crescută de ioni, urmată de variații nesemnificative ale concentrației în intervalul 24-168 de ore. Prin introducerea ZnO în probe, numărul atomilor de oxigen scade, astfel încât legăturile dintre atomii de Zn și oxigen scad și ele, predominând legăturile covalente, în detrimentul legăturilor ionice. Astfel, Zn se transformă din modificator în formator, fiind legat puternic prin intermediul legăturilor covalente, ceea ce inhibă eliberarea lui din rețea.

Eliberarea ionilor de Zn la nivelul soluției de imersie sugerează un potențial antibacterian al probelor (LANSDOWN, 2007). În plus, Zn este un element identificat în concentrații crescute la nivel perilezional în faza inflamatorie timpurie a vindecării plăgilor, fiind implicat și în diminuarea speciilor reactive de oxigen (PRASAD, 2014; KOGAN 2017). Menținerea integrității peretelui celular, sinteza ADN, ARN și a proteinelor, precum și stimularea proliferării fibroblastelor s-au dovedit a fi dependente și de prezența Zn la nivel celular (ZAGOREN, 2007; MARRIAGE-ARCARI REBECCA, 2016).

Testarea capacității citotoxice a nanoparticulelor de ZnO asupra liniei de keratinocite umane HaCaT a arătat faptul că atingerea și depășirea unor concentrații de 20 ppm în mediul de cultură al keratinocitelor determină afectarea viabilității populației celulare (LEE, 2012). Acest rezultat indică necesitatea realizării unor diluții seriate în studiul de față, pornind de la concentrațiile obținute inițial prin ICP, pentru a obține valori încadrabile în intervalul de viabilitate celulară.

Valorile ionilor de Ag eliberate în mediile de imersie au fost sub limita de detecție a aparatului, respectiv sub 0,02 mg/L. Studiile anterioare au indicat faptul că activitatea antimicrobiană asupra unor tulpini bacteriene precum E. coli, P. Aeruginosa sau S. aureus este exprimată la concentrații ionice de Ag+ cuprinse între 50 – 200 mg/L (BELLANTONE, 2002), în timp ce concentrația bactericidă minimă a Ag este considerată a fi egală cu 0.1 mg/L (SARAVANAPAVAN, 2004). De asemenea, concentrații de nanoparticule de Ag cuprinse în intervalul 0,25 – 2,5 mg/L s-au dovedit a fi pretabile în aplicații topice în vindecarea plăgilor, fără a genera fenomene de citotoxicitate fibroblastică (AMBROZOVÁ, 2017). Prin urmare, valorile detectate din probele luate în studiu se află sub limitele indicate ca având un potențial antimicrobian și este puțin probabil ca activitatea antibacteriană împotriva S. aureus și E. Coli a acestora să fie determinată de prezența Ag introdus în masa sticlelor. Totuși, eliberarea ionilor de Ag pare să fie în general redusă în SBF, comparativ cu alte medii de imersie (BALAMURUGAN, 2008).

x.3.2.2. Evoluția pH-ului lichidului de imersie

În figura X este redată evoluția pH-ului SBF-ului după 72, respectiv 168 de ore de imersie a probelor, la o temperatură de 37°C. PH-ul SBF-ului a fost adus la valoarea de 7.4 înainte de inițierea imersiei. Comportamentul pH-ului a fost relativ similar în toate cazurile, fiind observabilă o evoluție liniară până la 72 de ore, cu modificări nesemnificative în sensul creșterii valorilor cu 0 până la 0.02 unități. În intervalul 72 – 168 de ore, pH-ul soluției de imersie a crescut liniar în cazul tuturor probelor cu valori cuprinse între 0.8 și 0.15 unități, ceea ce indică predominanța ionilor H+ în SBF la momentul măsurătorii.

Datele bibliografice (SHARPE, 2009) au arătat faptul că, atât keratinocitele, cât și fibroblastele au o rată de proliferară ideală atunci când pH-ul de la nivelul plăgii se află în intervalul 7.2- 8.3. În consecință, valorile obținute la măsurătorile de pH în cazul probelor studiate se încadrează în intervalul indicat și indică un potențial stimulator în ceea ce privește rata de proliferare și migrare celulară la nivelul epidermului și dermului.

x.3.2.3. Caracterizarea microstructurală și analiza elementală a probelor

Micrografiile SEM realizate la suprafața probelor înainte și după 168 de ore de imersie în SBF, sunt prezentate în figura X. În ceea ce privește morfologia de suprafață, se poate observa un aspect neted și omogen în cazul tuturor probelor ca atare, înainte de a fi imersate în soluția SBF. Dupa 168 de ore, se evidențiază cu ușurință apariția unui strat superficial compus din numeroase formațiuni cu aspect cristalizat, iregulate, care formează aglomerări neomogene la suprafața tuturor probelor. Aceste structuri au o morfologie neregulată și dimensiuni variate, care nu depășesc dimensiunea de 10 µm.

Conform datelor obținute din analiza EDS, suprafața sticlelor a suferit un proces de fosfatare pe parcursul perioadei de imersie, ceea ce a condus la formarea sărurilor de Zn. Acest fenomen este susținut și de rezultatele disoluției ionice, care indică o scădere progresivă a concentrației ionilor de Zn2+ și P din soluția SBF, odată cu creșterea timpului de imersie. Migrația ionilor de Cu2+ din structura probelor în soluția de imersie a condus probabil la formarea Cu(OH)2, care este o bază slabă. Afinitatea crescută a ionilor de Zn2+ pentru anionii de oxigen a determinat cristalizarea mai facilă

a acestora, în comparație cu ionii de Cu2+, astfel rezultând ocuparea valențelor și, în consecință, eliberarea ionilor de Cu2+ în soluția SBF.

ROLUL SARURILOR DE ZINC IN COMPORTAMENTUL BIOMATERIALULUI

În figura X sunt prezentate difractogramele probelor luate în studiu, obținute în intervalul de scanare 2Ɵ= 10-70°, la o viteză egală cu 1 grad/min, înainte și la 24 de ore de la imersie în SBF. Evaluarea XRD a identificat prezența unor peak-uri de difracție caracteristici pentru clorura de argint (AgCl) la nivelul tuturor probelor imersate. Intensitatea liniilor de difracție a fost marcantă în special la nivelul 2Ɵ= 27.82°, 32.24°, respectiv 46.23°, conform filei 31-1238. De asemenea se poate observa faptul că peak-urile sunt mai reduse ca și intensitate și frecvență în proba x= 0% mol. CuO, devenind mai proeminente odată cu creșterea masei de AgO introdusă în probe. DL PETRU și discutie despre hidroxiapatita

Formarea AgCl este probabil datorată eliberării ionilor de Ag+ în timpul procesului de imersie în SBF, urmată de reacția acestora cu Cl din fluidul de imersie și formarea unor săruri insolubile, care precipită la suprafața probelor (GARGIULO, 2013). În timp ce prezența sărurilor de AgCl poate indica un potențial antibacterian, depunerea rapidă a acestora la suprafața probelor poate întârzia interacțiunea cu fluidul de imersie, și prin urmare poate amâna formarea hidroxiapatitei, dar și schimbul de ioni dintre sticlă și SBF (POURSAMAR, 2011; NEZFATI, 2012).

Linii de cristalizare suplimentare, reprezentând picuri de sare, au fost identificate cu preponderență la 2Ɵ= 31.69°, 45.44° și 56.47°, conform filei 05-0628. Apariția acestora este determinată de precipitarea NaCl din fluidul de imersie.

2.3.3.4. Analiza spectrofotometrică

Spectrele de absorbție UV-vis înregistrate la nivelul probelor ca atare sunt prezentate în figura X. După cum se poate observa, în cazul matricii, nu au fost observate benzi de absorbție. În cazul tuturor celorlalte probe a fost înregistrată o singură bandă de absorbție, în jurul valorii de 900 nm, determinată de prezența ionilor de Cu2+și care crește în intensitate odată cu creșterea concentrației de CuO introdusă în sticlă. Această bandă de absorbție corespunde tranziției electronice de pe nivelul 2B2g pe 2B1g pentrul ionul de Cu2+. Banda este foarte largă, datorită contribuției mai multor tranziții electronice la această absorbție. Comportamentul probelor luate în studiu este în concordanță cu rezultatele altor cercetări publicate anterior (BAE, 1994).

Un alt aspect evidențiat la nivelul spectrelor este faptul că poziția semnalului de absorbție nu se modifică odată cu nivelul de dopare al sticlelor, astfel încât simetria ionilor de Cu nu variază odată cu creșterea concentrației de CuO. Prezența unei singure benzi de absorbție pentru Cu2+ indică o distorsiune tetragonală redusă. Geometria moleculară în jurul ionului de Cu2+ este octaedrală, fiind înconjurat de șase atomi de oxigen.

FT-IR

2.4. Concluzii

2.4. Conclusions

1. În studiul de față s-au obținut două sisteme oxidice vitroase: (60-x) B2O3· xZnO· 34CaO·1CuO, respectiv (CuO)x· (KPO3)79.5-x·(ZnO)20· (Ag2O)0.5.

2. Probele aparținând sistemului boratic au demonstrat un caracter puternic reactiv, în special în cazul probelor x= 10, 15, 20 mol% ZnO.

3. Probele aparținând sistemului boratic au avut o rată de degradare redusă și independentă de concentrația în bor și au determinat modificări de pH la nivelul fluidului de imersie, în sensul creșterii acestuia.

4. Probele aparținând sistemului boratic au determinat eliberarea ionilor de Cu, Zn, B și Ca în fluidul de imersie, concentrațiile de Cu și Zn fiind prezente sub pragul de citotoxicitate fibroblastică.

5. La suprafața sticlelor boratice, micrografiile SEM au evidențiat structuri morfologice regulate de hidroxid dublu stratificat.

6. Compozițiile boratice sintetizate în studiul de față nu s-au pretat pentru testarea pe modele experimentale în vederea regenerării cutanate, datorită modificărilor majore de pH pe care le determină la nivelul fluidului de imersie, precum și ratei reduse de degradare în timp.

7. La imersarea în SBF, sticlele fosfatice au eliberat concentrații de Cu dependente de masa de CuO introdusă în probă, iar concentrația ionilor de Ag s-a aflat sub limita de detecție a aparatului.

8. Sticlele fosfatice nu au modificat semnificativ pH-ul fluidului de imersie, aceasta fiind o caracteristică importantă pentru stimularea ratei de proliferare a keratinocitelor și fibroblastelor.

9. Micrografiile SEM au evidențiat apariția unui strat cristalizat, format din săruri de Zn, la interfața dintre sticlele fosfatice și soluția de imersie.

10. Difractogramele probelor au evidențiat picuri de difracție caracteristice pentru AgCl, NaCl și posibil HA; DE CONTINUAT LA FINALIZAREA IR si XRD.

3. Evaluarea in vitro a potențialului citotoxic al sistemului oxidic vitros (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, asupra liniei de keratinocite umane HaCat

3. In vitro assay of (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5 glasses cytotoxicity towards HaCat keratinocytes

3.1. Obiectivele studiului

3.1. The main objectives

Scopul acestui capitol a fost de a evalua potențialul citotoxic al sistemului oxidic vitros (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, unde x= 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO, asupra liniei de keratinocite umane HaCat. Pentru îndeplinirea acestui scop, ne-am propus următoarele obiective:

Obiectivul 1. Cultivarea liniei de keratinocite umane HaCat.

Obiectivul 2. Evaluarea efectului citotoxic prin intermediul testului cu bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT).

Obiectivul 3. Identificarea și stabilirea concentrației maxime de probă care nu prezintă efect inhibitor asupra liniei celulare HaCat.

3.2. Materiale și metodă

3.2. Materials and method

3.2.1. Cultivarea liniei de keratinocite umane HaCat

Celulele aparținând liniei de keratinocite umane HaCat au fost cultivate în mediul Dulbecco Eagle modificat (MDEM), care a fost suplimentat cu ser fetal de vițel 10%, L- glutamină 1% și penicilină- streptomicină 1%, la temperatura de 37°C, CO2 5% și o umiditate a aerului de 95%. Procesul de expansiune celulară s-a realizat până la obținerea unei confluențe de 80%. Ulterior, celulele au fost tripsinizate și însămânțate în 96 de godeuri, la densitatea de 12×103 celule/ godeu. În cele din urmă, celulele au fost lăsate in repaus timp de 24 de ore, pentru a permite atașarea și expansiunea acestora până la faza exponențială.

3.2.2. Evaluarea potențialui citotoxic al probelor vitroase asupra celulelor HaCat, prin intermediul testului MTT

Evaluarea citotoxicității celulare s-a realizat prin metoda indirectă a testului MTT, care a urmărit efectul produșilor de disoluție ionică eliberați din structura sticlelor asupra viabilității liniei de keratinocite umane HaCat. Principiul metodei constă în capacitatea celulelor viabile de a transforma compusul MTT în formazan, o substanță de culoare violet, cu o absorbanță maximă de aproximativ 570 nm. Acest proces are loc prin cataliza enzimatică a MTT-ului de către succinat dehidrogenaza mitocondrială (CHACON, 1996), o proteină intrinsecă a membranei mitocondriale interne (HINTON, 1997). Când celulele mor, își pierd capacitatea de a transforma MTT-ul în formazan, astfel încât formarea culorii mov este considerată un indicator care reflectă doar prezența celulelor viabile (RISS, 2013).

Conform standardelor 10993-5:2009(E) ale Organizației Internaționale de Standardizare (ISO) care reglementează protocolul de testare indirectă a viabilității celulare, pudrele de sticlă au fost sterilizate și dispersate în mediul de cultură al celulelor, la o concentrație de 1 mg/ml (100%), cu care au fost lăsate în contact timp de 24 de ore, la 37°C. După centrifugare, supernatantul cu concentrația de 1 mg/ml (100%) a fost colectat în tub steril, fiind denumit în continuare „extract”. S-au realizat diluții seriate pornind de la această concentrație a extractului, până la obținerea unei diluții de 1×10-3 mg/mL (0.1%) în mediul de cultură suplimentat cu fenol roșu, un indicator de pH (figura X). În continuare, celulele au fost expuse la câte 100 µL de extract cu concentrațiile menționate anterior, timp de 24 de ore. La finalul acestei perioade, celulele au fost expuse la o concentrație de 0.5 mg/ml de soluție MTT și lăsate la incubator pentru 1.5 ore, pentru ca soluția să fie redusă la formazan. Extractul a fost eliminat din godeuri, și cristalele de formazan rezultate au fost solubilizate cu isopropanol acidifiat. Pe fiecare placă au fost introduse un control netratat (0), reprezentând mediul de cultură simplu și un control pozitiv, reprezentând celule în apoptoză, tratate cu soluție Tween 20, în concentrație de 1%.

Absorbanța soluției a fost citită cu ajutorul spectrofotometrului Epoch Microplate la lungimea de undă de 550 nm, iar cea a controlului netratat la 630 de nm. Pentru fiecare concentrație s-au realizat 6 replicate, iar rezultatele procentuale au fost raportate la controlul netratat, care reprezintă viabilitate 100%.

3.3. Rezultate și discuții

3.3. Results and discussion

Testul de viabilitate celulară MTT a fost realizat în vederea evaluării activității mitocondriale a keratinocitelor HaCat, prin măsurarea procentajului de viabilitate la 24 de ore de la incubarea celulelor tratate cu extractele de diferite concentrații (Figura X).

Deoarece viabilitatea celulară a crescut odată cu scăderea concentrației extractului, este evident faptul că toxicitatea asupra keratinocitelor HaCat a devenit marcantă odată cu creșterea concentrației de CuO din sticle. Atunci când concentrațiile extractelor au variat între 1 mg/ml și 0.1 mg/ml, toate probele au indus citotoxicitate mai crescută, în comparație cu controlul pozitiv (apoptoză). La concentrații ale extractului de 0.01, 0.005 și 0.001 mg/ml, se poate observa că toate probele, cu excepția matricei, au determinat o viabilitate de minim 80% a liniei celulare, ceea ce, conform standardelor 10993-5 ISO, indică un efect non-citotoxic al produsului testat. Variația viabilității celulare la aceste concentrații ale extractului nu a fost marcantă și nici uniformă. Mai mult decât atât, în cazul probelor x= 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO, extractele au demonstrat un efect proliferativ asupra liniei celulare, comparativ cu controlul netratat. Prin urmare, concentrația maximă a extractului care nu a determinat un efect inhibitor asupra liniei celulare a fost de 0.01 mg/ml, în cazul tuturor probelor studiate.

La o concentrație a extractului mai mare de 0.01 mg/ml, a avut loc o modificare bruscă și imediată a pH-ului mediului de cultură, indicată de virarea culorii mediului din roșu în transparent, care însă a dobândit o nuanță verde-albastră datorită prezenței CuO în probe (Figura X). Această modificare a culorii mediului este datorată scăderii pH-ului sub valoarea de 6.2 unități și este asociată cu un fenomen generalizat de mortalitate celulară (HELD, 2018). Modificarea pronunțată a pH-ului mediilor de cultură puse în contact cu sticlele este un proces tot mai frecvent întâlnit în studiile de citotoxicitate realizate pe diferite tipuri celulare. Aparent, la nivelul acestor medii are loc un schimb de ioni extrem de intens pe parcursul imersiei sticlelor, care determină o modificare brutală a pH-ului și care în final induce o citotoxicitate marcantă. Cu toate acestea, fenomenul nu este observat în mod constant și in vivo (EL-RASHIDY, 2017), ceea ce a impus dezvoltarea unor protocoale recente de pretratare a sticlelor, care să limiteze aceste variații false de pH ale mediilor de cultură celulare (CIRALDO, 2018).

Rezulatele unui studiu recent (ALARIFI, 2013) indică valori similare cu privire la citotoxicitatea CuO asupra keratinocitelor HaCaT. Mai precis, la concentrația de 0.01 mg/ml a extractului, toxicitatea înregistrată dpă 24 de ore de contact cu linia celulară a fost de 13.99%. În același context, toxicitatea celulară obținută în cazul probelor noastre a variat între 9 și 18%. Mai mult decât atât, probele x= 0.5, 1 și 5 mol. % CuO au determinat o viabilitate celulară de 100% sau chiar au stimulat proliferarea celulară, în comparație cu controlul netratat. Spre deosebire de studiul menționat, în cazul nostru nu au fost obținute diferențe notabile între concentrațiile de 0.01 și 0.005 mg/ml ale extractului asupra viabilității celulelor, probabil datorită prezenței și a altor ioni (Zn, K, Ag) în compoziția sticlelor, cu efect biologic asupra liniei celulare testate.

Efectuarea metodei directe MTT de testare a citotoxicității a fost imposibilă în cazul de față, întrucât fragmentele de sticlă din mediul lichid au împiedicat pipetarea, iar prin sedimentarea acestora la fundul godeului, au interferat cu traversarea fasciculului de lumină al spectrofotometrului.

Deși testarea in vitro a citotoxicității unui biomaterial este mereu ofertantă prin prisma expeditivității procedurii și prin aderarea la conceptele de bioetică, este important de menționat faptul că efectele in vitro obținute asupra celulelor nu sunt întotdeauna în perfectă concordanță cu cele obținute în condiții experimentale. Acest lucru este datorat numeroaselor diferențe care există între sisteme biologice complexe precum țesuturile vii, și o cultură celulară, care reprezintă un mediul artificial extrem de bine controlat și izolat de intervenția factorilor externi, reprezentând un unic tip celular (ROSENGREN, 2005). Mai mult decât atât, studiile in vitro permit testarea efectului indus de material asupra celulelor în urma unui contact de scurtă durată cu acestea, în general limitat la 12-24 de ore. Totuși, efectele biologice in vivo sunt complexe și se extind frecvent pe o perioadă de timp care depășește 24 de ore (VAN TIENHIVEN, 2006). Prin urmare, deși evaluarea in vitro are o valoare orientativă semnificativă, aceasta nu poate înlocui testarea materialelor pe modele animale, care permit o interacțiune complexă cu diferite tipuri celulare, hormoni, proteine și enzime (THRIVIKRAMAN, 2014).

3.4. Concluzii

3.4. Conclusions

1. În studiul de față s-a realizat evaluarea citotoxicității sistemului oxidic vitros (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, unde x= 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO, asupra liniei de keratinocite umane HaCaT.

2. Potențialul citotoxic al sticlelor a fost direct proporțional cu concentrația de CuO din compoziția acestora.

2. Extractele cu concentrații cuprinse între 1 mg/ml și 0.1 mg/ml au determinat în cazul tuturor probelor modificări rapide și severe ale pH-ului mediilor de cultură, sub 6.2 unități. În aceste cazuri, efectul citotoxic obervat asupra keratinocitelor a fost crescut, în comparație cu controlul pozitiv.

3. La concentrații ale extractului de 0.01, 0.005 și 0.001 mg/ml, toate probele, cu excepția matricei, au determinat o viabilitate de minim 80% a liniei celulare. Mai mult decât atât, aceste concentrații ale extractelor au determinat în cazul probelor x= 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO, un efect proliferativ asupra liniei celulare, comparativ cu controlul netratat.

4. Concentrația maximă a extractului care nu a determinat un efect inhibitor asupra liniei celulare a fost de 0.01 mg/ml, în cazul tuturor probelor studiate, cu excepția matricei.

5. Deși reprezintă o tehnică simplă și expeditivă de evaluare a potențialului citotoxic, testul MTT de viabilitate celulară are o valoare orientativă. Datorită condițiilor extrem de diferite în care se desfășoară interacțiunea cu mediul celular in vitro și in vivo, aplicabilitatea rezultatelor obținute prin această tehnică la nivelul țesuturilor funcționale, este limitată.

4. Evaluarea in vitro a potențialului antibacterian al sistemului oxidic vitros (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5

4. In vitro evaluation of the antimicrobial properties of the (CuO)x•(KPO3)79.5-x•(ZnO)20•(Ag2O)0.5 glass system

4.1. Obiectivele studiului

4.1. The main objectives

Scopul acestui capitol a fost de a evalua in vitro activitatea antibacteriană a sistemului oxidic vitros (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5, unde x= 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 mol% CuO, față de două tulpini bacteriene frecvent asociate infecțiilor cutanate. De asemenea, s-a urmărit compararea rezultatelor obținute cu eficiența antibacteriană a unor antimicrobiene uzual recomandate în terapia plăgilor. Pentru îndeplinirea acestui scop, ne-am propus următoarele obiective:

Obiectivul 1. Evaluarea activității antibacteriene a probelor vitroase împotriva tulpinilor microbiene S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922), prin metoda difuzimetrică Kirby-Bauer.

Obiectivul 2. Identificarea concentrațiilor minime bactericide și evaluarea efectului bactericid/ bacteriostatic al probelor vitroase asupra celor două tulpini.

Obiectivul 3. Compararea activității antibacteriene determinată de probele vitroase asupra tulpinilor S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922), cu cea a ciprofloxacinei și amoxicilinei.

4.2. Materiale și metodă

4.2. Materials and method

4.2.1. Evaluarea activității antibacteriene

Două tulpini bacteriene, S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922), au fost testate prin metoda difuzimetrică Kirby- Bauer standardizată, în vederea stabilirii sensibilității la compozițiile vitroase luate în studiu și, comparativ, la ciprofloxacină și amoxicilină. Pentru însămânțarea plăcilor s-au folosit 0.5 unitati McFarland (echivalentul a 107 bacterii/mL), aplicate cu bețișoare de bumbac sterile pe agar cu mediu Luria Bertani. În locul discurilor convenționale, impregnate cu antibiotice, au fost realizate discuri de sticlă cu diametrul de 14 mm., prin presarea pudrelor la presa hidraulică (Specac Ltd), (Figura X).

Concomitent, s-a testat și eficiența antibacteriană a ciprofloxacinei și a amoxicilinei împotriva tulpinilor bacteriene menționate. În acest sens, s-au utilizat discuri sterile goale, impregnate cu 5 µg/disk ciprofloxacină și 23 µg/disk amoxicilină. Plăcile au fost ulterior incubate la 37°C, timp de 18 ore; după acest interval, s-a recurs la măsurarea cu rigla a diametrului discului clar (haloului) din jurul discurilor, respectiv a microcomprimatelor, acesta reprezentând zona de inhibiție (în mm.). Valorile citite au fost interpretate conform standardelor CLSI 2011 (Clinical Laboratory Standards Institute).

4.2.2. Evaluarea activității bacteriostatice și bactericide

Pentru a evalua efectul bacteriostatic, respectiv bactericid al probelor asupra celor două tulpini microbiene, s-a preluat materialul biologic de pe întreaga suprafață a halourilor cu un bețișor de bumbac steril, umezit în prealabil în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și s-a dispersat în 4 ml de PBS steril. După agitarea viguroasă a soluției, s-a prelevat câte 1 ml și s-a insămânțat câte o placă, pe agar cu mediu Luria Bertani. Plăcile au fost incubate timp de 18 ore, la 37°C. La sfârșitul acestei perioade, s-au numărat coloniile formate și au fost exprimate în unități formatoare de colonii (ufc/mL), fiind raportate la suprafața haloului.

4.3. Rezultate și discuții

4.3. Results and discussion

4.3.1. Evaluarea activității antibacteriene

Două tulpini microbiene, S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922), au fost testate prin metoda difuzimetrică Kirby- Bauer standardizată, în vederea stabilirii sensibilității la discurile sintetizate din probele vitroase și, comparativ, la ciprofloxacină și amoxicilină. În tabelul X sunt redate diametrele (mm) zonelor de inhibiție determinate de toate probele vitroase luate în studiu, precum și de antibioticele testate asupra tulpinilor S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922).

Tabelul (Table) X

Diametrele zonelor de inhibiție determinate de discurile de sticlă, ciprofloxacină și amoxicilină și asupra tulpinilor S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922).

Diameters of the inhibition zones growth around the glass disks, amoxicillin and ciprofloxacin against S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC 25922)

*Conform standardelor CLSI 2011

În figura X sunt prezentate zonele de inhibiție ale dezvoltării tulpinii S. aureus (ATCC 25923), determinate de ampicilină și ciprofloxacină, precum și de discurile de sticlă. Conform CLSI 2011, pentru a indica susceptibilitatea S. aureus la amoxicilină, diametrul zonei de inhibiție trebuie să fie mai mare sau egal cu 20 mm, în timp ce pentru a indica sensibilitatea aceleiași tulpini la ciprofloxacină, diametrul zonei de inhibiție trebuie să fie mai mare de 21 mm.

Pentru amoxicilină, s-a obținut un diametru de 35 mm al zonei de inhibiție, în timp ce pentru ciprofloxacină, diametrul a fost de 28 mm. Aceste valori indică susceptibilitatea tulpinii S. aureus (ATCC 25923) față de ambele antibiotice.

În ceea ce privește discurile de sticlă, diametrele zonelor de inhibiție au variat între 31 și 41 mm, și au prezentat adiacent un halou neclar, de 4 mm, bogat în colonii. Toate probele au determinat zone de inhibiție comparabile sau superioare ciprofloxacinei, în timp ce probele x= 5 mol% CuO și x= 10 mol% CuO au determinat zone de inhibiție superioare amoxicilinei. Nu a fost observată o relație de dependență între concentrația de CuO și diametrul zonei de inhibiție.

Conform CLSI 2011, pentru a indica susceptibilitatea E. coli (ATCC 25922) la amoxicilină, diametrul zonei de inhibiție trebuie sa aibă un diametru mai mare sau egal cu 24 mm. Pentru a indica sensibilitatea aceleiași tulpini la ciprofloxacină, diametrul zonei de inhibiție trebuie să fie mai mare sau egal cu 30 mm. Diametrul zonei de inhibiție pentru amoxicilină a fost 11 mm, ceea ce a indicat rezistența tulpinii, în timp ce pentru ciprofloxacină a fost 26 mm, având semnificația unei slabe susceptibilități. Conform datelor din tabelul X, probele de sticlă luate în studiu au determinat zone de inhibiție ale dezvoltării tulpinii E. coli cu diametre cuprinse între 16-18 mm, inferioare ciprofloxacinei, însă superioare amoxicilinei (Fig. X). Spre deosebire de efectul antistafilococic, în cazul tulpinii E. coli s-a observat existența unei relații de dependență între concentrația de CuO și diametrul zonei de inhibiție, acesta fiind superior în cazul probelor x= 1, 3, 5, 10 mol% CuO.

Proprietățile antistafilococice ale probelor de sticlă sunt determinate de ionii de Cu și Zn din probe, care au capacitatea de a fi eliberați din matrice in fluidele de imersie, în concentrații antibacteriene (DRAGO, 2018). Un studiu recent (BEJARANO, 2016), a pus în evidență potențialul antistafilococic al unor sticle îmbogățite cu Zn și Cu, încorporate în polimeri biodegradabili și destinate regenerării oasoase. În plus, s-a observat faptul că sticlele ce conțin ambii ioni, au o capacitate antistafilococică mai puternică decât cele care conțin un singur tip de ioni, fie de Zn, fie de Cu. Un alt studiu (BEHEREI, 2009) a demonstrat capacitatea antibacteriană a unei compoziții vitroase îmbogățită cu ioni de Zn și Cu, sintetizată sub formă de pudră prin metoda sol-gel și încorporată într-o matrice polimerică din chitosan, destinată de asemenea regenererării osoase. Diametrele zonelor de inhibiție obținute în studiul menționat variază între 1,1-2,2 cm, ceea ce indică o activitate antistafilococică mai redusă decât cea determinată de probele vitroase obținute în studiul de față.

GHOLIPOURMALEKABADI și colaboratorii (2016), au sintetizat compoziții vitroase dopate cu F și Ag, care au deteminat zone de inhibiție ale dezvoltării tulpinii E. coli cu diametre cuprinse între 7±2 – 8±2 mm; aceste valori au fost raportate de către autori ca fiind intens antibacteriene. Diametrele zonelor de inhibiție determinate de sticlele sintetizate în studiul de față, au fost superioare celor raportate în studiul menționat anterior, având valori duble în toate cazurile.

Alte date din literatura de specialitate arată că sticlele îmbogățite cu Ag au un potențial antibacterian crescut împotriva E. coli, însă este necesară eliberarea unei concentrații superioare de Ag față de cea eliberată de probele luate în studiu. DAI și colaboratorii, (2009), obțin un efect bactericid foarte rapid asupra E.coli (în primele 2 ore de contact cu tulpina), și chiar sterilizarea completă a mediului în 24 de ore. Concentrațiile de Ag eliberate în mediul de imersie în acest caz sunt însă mult mai mari decât cele eliberate de probele luate în studiu, variind între 2- 3,5 mg/L. Acest comportament ar putea indica faptul că efectul antibacterian asupra tulpinii E. coli al sticlelor studiate este determinat de ionii de Cu și Zn, eliberați în concentrații mult mai mari în mediul de imersie.

4.3.2. Evaluarea activității bactericide

Activitatea bacteriostatică și bactericidă a probelor vitroase față de tulpinile bacteriene S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922) este redată în tabelul X. Se poate observa faptul că sistemul vitros a manifestat activitate bactericidă față de S. aureus în cazul probelor cu concentrația molară a CuO mai mare sau egală cu 3%. Probele cu concentrații mai mici, au deteminat un efect bacteriostatic.

În ceea ce privește efectul bactericid față de E. coli, au fost testate doar probele cu concentrațiile molare x=0 și 10% CuO, prima dovedind activitate bacteriostatică și cea din urmă, bactericidă.

Tabelul (Table) X

Efectul bactericid al probelor de sticlă asupra tulpinilor bacteriene S. aureus (ATCC 25923) și E. coli (ATCC 25922)

Bactericidal activity of the glass samples against S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC 25922) strains

4.4. Concluzii

4.4. Conclusions

1. În urma efectării tehnicii difuzimetrice Kirby- Bauer pentru testarea sensibilității tulpinii de S. aureus la discurile de sticlă, s-au obținut diametre ale zonelor de inhibiție superioare celor determinate de amoxicilină în cazul probelor x=5, 10 mol. % CuO. Diametrele zonelor de inhibiție au fost superioare celor determinate de ciprofloxacină în cazul tuturor probelor.

2. În urma efectării tehnicii difuzimetrice Kirby- Bauer pentru testarea sensibilității tulpinii E. coli la discurile de sticlă, s-au obținut diametre ale zonelor de inhibiție superioare celor determinate de amoxicilină în cazul tuturor probelor, însă inferioare celor determinate de ciprofloxacină.

3. Activitatea bactericidă a probelor vitroase față de tulpina bacterienă S. aureus a fost evidentă la concentrații molare de CuO mai mari sau egale cu 3 %. Concentrațiile mai mici au determinat un efect bacteriostatic.

4. Sticla cu concentrația molară a CuO de 10%, a manifestat activitate bactericidă față de tulpina E. coli.

5. Efectul regenerativ al sistemului oxidic vitros

(CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5 asupra plăgilor cutanate excizionale la șobolani (Rattus norvegicus): model experimental

5. Cutaneous wound healing effect of the (CuO)x·(KPO3)79.5-x·(ZnO)20·(Ag2O)0.5 glass system in rats (Rattus norvegicus): an experimental study

5.1. Obiectivele studiului

5.1. The main objectives

Scopul acestui capitol a fost de a evalua din punct de vedere clinic, histopatologic și imunohistochimic regenerarea unor plăgi cutanate excizionale, tratate cu sistemul oxidic vitros (CuO)x•(KPO3)79.5-x•(ZnO)20•(Ag2O)0.5, la șobolani (Rattus norvegicus). Pentru îndeplinirea acestui scop, ne-am propus următoarele obiective:

Obiectivul 1. Inducerea pe cale chirurgicală a plăgilor excizionale la șobolani Wistar.

Obiectivul 2. Implementarea protocolului terapeutic al plăgilor excizionale, utilizând compoziția vitroasă (CuO)x•(KPO3)79.5-x•(ZnO)20•(Ag2O)0.5, unde x= 5 mol% CuO.

Obiectivul 3. Evaluarea macroscopică a ratei de închidere a plăgilor tratate cu compoziția vitroasă, comparativ cu plăgile control.

Obiectivul 4. Evaluarea histologică a gradului de regenerare tisulară la nivelul plăgilor tratate, atât în faza de granulație cât și în cea de remodelare, comparativ cu plăgile control.

Obiectivul 5. Evaluarea și cuantificarea imunohistochimică a unor markeri de proliferare celulară, la plăgilor tratate, în fazele de granulație și de remodelare, comparativ cu plăgile control.

5.2. Materiale și metodă

5.2. Materials and method

5.2.1. Material biologic

În vederea realizării acestui studiu, s-au utilizat 20 de șobolani (Rattus norvegicus) din linia Wistar, masculi și femele clinic sănătoși, cu vârsta de 1 an și greutatea aproximativă de 350 grame, procurați dintr-o unitate crescătoare autorizată. Pe tot parcursul studiului animalele au fost cazate respectând standardele ISO 10993-2 (10993-2, 2004), în sistem de tip IVC cu umididate relativă de 55%± 10% și temperatură de 25± 2°C, ciclu lumină/ întuneric de 12/12h. Animalele au avut acces ad libitum la rezervoare de apă filtrată și furaj standard granulat pentru rozătoare (Institutul Cantacuzino București, România). Culcușul a fost reprezentat de fragmente aseptice de lemn, autoclavate. Animalele au fost cântarite și examinate clinic înainte și pe parcursul desfășurării experimentului. Toate procedurile care au implicat utilizarea animalelor de laborator au urmat liniile directoare și normele europene 337 stabilite de Directiva UE 2010/63/UE și Legea 43/2014 din România.

Proiectul experimental a fost autorizat de către Direcția Sanitar Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor Cluj (Autorizație de proiect nr. 131/ 10.07.2018).

5.2.2. Protocolul experimental

Protocolul experimental și inducerea chirurgicală a plăgilor excizionale s-au realizat în conformitate cu Standardele ISO 10993-6 (10993-6, 2004), în cadrul Unității de Creștere și Utilizare a Animalelor de Laborator a Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară Cluj Napoca, cu autorizația sanitar veterinară CJ 715 din 19.12.2017.

Investigarea efectului regenerativ al compoziției vitroase s-a realizat prin instituirea unui protocol standard de inducere al plăgilor excizionale la șobolani (MOREIRA, 2015; CHEN, 2015). În acest scop, animalele au fost cântărite și supuse neuroleptanalgeziei, prin administrarea intramusculară de xilazină (6 mg/ kg greutate corporală) și ketamină (60 mg /kg greutate corporală), (FLECKNELL, 2009). Preoperator, s-a recurs la tunderea părului de pe suprafața toraco-abdominală dorsală, urmată de epilarea pielii utilizând o cremă depilatoare comercială (Veet®, Reckitt Benckiser). După antisepsia chimică a pielii cu iod povidonă și irigare cu etanol, s-au realizat câte două plăgi excizionale cu diametrul de 8 mm, cu ajutorul punch-ului de biopsie (KAI Medical, Gima® Italia), de-o parte și de alta a coloanei vertebrale toracale, la aproximativ 1 cm distanță de procesele spinoase. Plăgile create au interesat întreaga grosime a tegumentului, încluzând mușchiul panniculus carnosus (WANG, 2013; MOREIRA, 2015) și au fost clasificate astfel: plagă control (stânga) și plagă tratată (dreapta). După lavajul plăgilor cu soluție salină și asigurarea hemostazei prin compresiune, s-a recurs la introducerea în plaga control a unui gel steril comercial, vâscos, conținând apă și electroliți, fără substanțe active (Hydrosorb® Gel, Paul Hartmann AG.). A doua plagă a fost tratată în cazul tuturor indivizilor cu o cantitate de 0.001 g compoziție vitroasă (CuO)x•(KPO3)79.5-x•(ZnO)20•(Ag2O)0.5, unde x= 5 mol% CuO sub formă de pudră, omogenizată cu gelul Hydrosorb®. Pudra a fost în prealabil sterilizată în microtuburi de tip Eppendorf și răcită la temperatura camerei; încorporarea compoziției vitroase în gelul vâscos a permis o distribuție uniformă a substanței active în patul plăgii. Ulterior, plăgile au fost acoperite, utilizând pansamente cu burete central neaderent (Tegaderm Foam, 3MTM), feșe elastice autoadezive (Peha-haft, Paul Hartmann AG.) și plasturi de mătase hipoalergenici (Omnisilk, Paul Hartmann AG.).

Animalele au fost monitorizate pe întreaga durată a studiului, pentru prevenirea infecțiilor și a durerii. Durerea a fost monitorizată cu ajutorul metodei grimasei faciale (Rat Grimace Scale) (SOTOCINAL, 2011), pentru a respecta principiile celor 3R (înlocuire, reducere, rafinament), impuse de Asociația animalelor de laborator și de legislația Europeană (FENWICK, 2009). Astfel, toate animalele au primit postoperator, timp de trei zile, analgezie opioidă cu Tramadol (10 mg/kg greutate corporală, subcutanat), (DREANCA ALEXANDRA, 2016).

Zilnic, plăgile au fost tratate conform protocolului descris și pansamentele au fost înlocuite. După 6 zile de studiu, 10 șobolani au fost eutanasiați conform Standardelor Internaționale în vigoare (AVMA Guidelines, 2013), prin narcoză prelungită, urmată de dislocare cervicală. Cu ajutorul bisturiului, s-a recoltat zona de interes împreună cu aproximativ 5 mm din țesutul adiacent, în vederea examinării histologice și imunohistochimice. După 14 zile, procedura de eutanasie și de recoltare a probelor s-a realizat identic în cazul celor 10 șobolani rămași (GANGULI-INDRA, 2014), (Figura X).

5.2.3. Evaluarea macroscopică a defectelor cutanate

Zilnic, aspectul morfologic al defectelor cutanate a fost evaluat din punct de vedere macroscopic, și diametrul plăgilor a fost măsurat cu ajutorul unui șubler electronic digital. De asemenea, plagile au fost evaluate semicantitativ pentru urmatoarele aspecte morfologice macroscopice: culoarea patului plăgii, prezența exudatului, prezența crustelor, marginile plăgii, creșterea în volum a suprafeței plăgii, consistența țesutului adiacent plăgii (LEE, 2015).

5.2.4. Examenul histologic al defectelor cutanate

Examenul histologic și tehnica imunohistochimică au fost realizate în cadrul disciplinei de Anatomie Patologică a Facultății de Medicină Veterinară Cluj-Napoca. În acest scop, biopsiile tisulare au fost fost fasonate, fixate timp de 24 de ore în soluție tamponată de formol 10%, incluse în parafină și secționate la o grosime de 3 μm, cu un microtom manual RM 2125 RT (Leica Biosystems). Cele două secțiuni obținute din fiecare probă au fost colorate automat cu Hematoxilina-Eozină (H&E) și Tricromic Goldner (T&G). Prin colorația T&G, fibrele de colagen se colorează în diferite nuanțe de verde (LEE, 2015).

5.2.5. Tehnica imunohistochimică

Secțiunile tisulare au fost etalate pe lame speciale, tratate cu polizină (Polysine slides, Termo Scientific), și menținute la termostat la 37oC, timp de 12 ore. Ulterior, secțiunile au fost colorate cu ajutorul sistemului automat Leica BOND MAX (Leica Biosystems), utilizându-se următorii anticorpi: CD31 (clona JC70A, Leica), Vimentină (clona V9, Leica) și multicitokeratină (clona AE1/AE3, Leica). Pentru detecția expresiei imunohistochimice s-a folosit kit-ul de detecție Bond™ Polymer Refine Detection (DS9800, Leica Biosystems). Anticorpul primar a fost înlocuit cu IgG1 de șoarece (Cod X0931, Dako, Glostrup, Denmark), reprezentând controlul negativ. Imunopozitivitatea a fost evaluată prin prezența culorii maro la nivel citoplasmatic și/sau membranar, cu intensitate si distribuție diferite.

5.2.6. Cuantificarea modificărilor histologice și evaluarea expresiei imunohistochimice

Evaluarea microscopică a secțiunilor s-a realizat cu ajutorul microscopului Olympus BX 41. Imaginile au fost obținute cu ajutorul unei camere digitale Olympus UC30, iar cuantificarea semiautomată a unor parametri histologici și imunohistochimici a fost realizată prin intermediul programului Olympus Stream Basic.

Secțiunile tisulare au fost evaluate pentru următorii parametri histologici: gradul de reepitelizare, maturarea și organizarea epidermului, formarea țesutului de granulație, colagenizare, prezența celulelor inflamatorii și formarea țesutului cicatricial in zona dermului. Modificările tisulare au fost cuantificate semicantitativ, utilizând un scor lezional notat de la 0 la 3 pentru fiecare parametru histologic (epitelizare, vascularizație, răspuns inflamator celular, țesut de granulație și colagenizare), (Tabel X).

Tabelul (Table) X

Scorul histologic pentru cuantificarea epitelizării, vascularizației, țesutului de granulație si răspunsului inflamator celular

Histological scoring of epithelialization, vascularization, granulation tissue and inflammatory cell response

Sursă: KARADAG, 2007

Gradul de cicatrizare (scorul histologic total) a fost obținut prin însumarea tuturor parametrilor histologici și a fost evaluat pe o scală între 1 si 4 pentru fiecare individ (Tabel X).

Tabelul (Table) X

Scorul histologic total pentru cicatrizarea plăgii cutanate

Total histological scoring for skin wound scarring

Sursă: KARADAG, 2007

Grosimea stratului epitelial regenerat, prezent pe suprafața plăgii cicatrizate, a fost cuantificat în cinci zone diferite, iar în final a fost realizată media aritmetică a acestor valori (GUL, 2018).

În secțiunile colorate T&G, gradul de dezvoltare/acumulare a fibrelor de colagen a fost evaluat semicantitativ în timpul formării țesutului de granulație, remodelării matricei extracelulare și prezenței țesutului cicatricial dermal. Intensitatea culorii verzi a țesutului regenerat este dată de cantitatea relativă a fibrelor de colagen prezentă în zona afectată (ARAMWIT, 2007).

Pentru evaluarea imunohistochimică a neoangiogenezei (numărul de vase de neoformație), au fost analizate două secțiuni seriate de la fiecare individ introdus în studiu. Pentru fiecare secțiune au fost alese randomizat trei câmpuri microscopice de 40x, din zona defectului tisular (HU, 2018).

5.3. Rezultate și discuții

5.3. Results and discussion

5.3.1. Aspectul macroscopic al plăgilor

Aspectul morfologic al plăgilor cutanate, tratate cu gelul Hydrosorb® (plăgi control) și cu sistemul oxidic vitros (CuO)x•(KPO3)79.5-x•(ZnO)20•(Ag2O)0.5, unde x= 5 mol% CuO (plăgi tratate), este prezentat în figura X.

În intervalul 1-3 zile, plăgile cutanate au devenit ușor neregulate, datorită contracției țesutului muscular subiacent panniculus carnosus, neexistând diferențe majore între plăgile control și tratate. Majoritatea plăgilor cutanate au fost acoperite de cruste sero-hemorgice uscate, acestea fiind inevitabil detașate în timpul manoperei de schimbare a pansamentelor. Începând cu ziua a patra, plăgile tratate

From day 3 to day 9, the ointmenttreated

groups exhibited yellowish-brown, moist, soft,

and supple scabs with red rims along the margins.

After day 12, the Vaseline and AJE treated group did

not exhibit thick scabs and bleeding, whereas the

control and SSD treated group showed thick, dry,

and dark brown scabs that were intact. By day 15,

re-epithelialization was observed in all ointmenttreated

groups but the control group. Wounds healed

best in the 20 % CGE treated group after day 12: the

wounds nearly healed, while the wound of control

and SSD-treated group still exhibited a dry appearance

with dark brown scab

5.3.2. Examenul histologic

Aspectul general al plăgilor cutanate

La 6 zile postoperator, în zona defectului cutanat s-a observat prezența unui țesut de granulație acoperit de o crustă serocelulară, cu o grosime variabilă, dar nesemnificativă între cele două tipuri de plăgi (Fig. X). De asemenea la acest nivel s-a observat lipsa epidermului, foliculilor piloși și a glandelor anexe. Pielea adiacentă defectului cutanat nu a prezentat modificări microscopice.

La 14 zile după realizarea defectelor cutanate, examenul microscopic a scos în evidență prezența unui țesut conjunctiv imatur, acoperit de un epiteliu ușor neregulat.

Diametrul plăgilor, evaluat între marginile defectului cutanat, a fost relativ mai mic în cazul plăgilor tratate comparativ cu cele control, la 6 (p>0.05) respectiv 14 zile (p>0.05), dar fără a avea o semnificație statistică importantă.

Gradul de regenerare tisulară

Structura microscopică a țesutului de granulație a constat într-o substanță fundamentală bogată, pe alocuri având un caracter mixoid bazofil, numeroase fibroblaste, vase sanguine (capilare de neoformație), celule inflamatorii (mononucleare și neutrofile) și rare fibre de colagen. La 6 zile postoperator, țesutul de granulație (p<0.05), neoangiogeneza (p<0.05) și procesul de reepitelizare (p<0.05) au fost mai mai evidente la nivelul plăgilor tratate față de cele control. Reacția inflamatorie a fost relativ similară în cele două tipuri de plăgi.

La 14 zile postoperator, țesutul de granulație a fost înlocuit în totalitate cu un țesut conjunctiv imatur, alcătuit din numeroase fibrocite, fibre de colagen eozinofile și subțiri, dispuse în fascicule scurte neuniforme sau paralel între ele, dar perpendiculare pe capilarele de sânge; matricea extracelulară a fost semnificativ redusă cantitativ. De asemena țesutul de granulație (p<0.05) și neoangiogeneza (p<0.05) au fost mai mai proeminente la nivelul plăgilor tratate față de cele control. Reacția inflamatorie a fost discreta sau chiar absentă în unele cazuri, fără a exista diferențe între cele două tipuri de plăgi (p>0.05).

Gradul de cicatrizare al plăgilor tratate fost semnificativ mai mare comparative cu plăgile control, atât la 6 zile (p<0.05) cât și la 14 zile (p<0.05).

Grosimea și morfologia epiteliului regenerat

Epidermul adiacent plăgilor a fost uniform, subțire, alcătuit din 2-4 straturi de keratinocite mature, unite prin joncțiuni evidente, strat granular evident și numerouse filamente de keratină dispuse pe suprafața acestuia (Fig. XA). Un grad redus de reepitelizare, constând în prezența unor cuiburi sau insule mici de celule epiteliale, dispuse la marginile plăgilor, a fost observat la 6 zile după realizarea defectelor cutanate (Fig. X B și C). Celule epiteliale au fost neuniforme, rotunde, ovale sau poligonale, mari, cu joncțiuni slab evidente, citoplasma intens bazofilă, nuclei mari și veziculoși, nucleoli supranumerari și proeminenți, și rare diviziuni mitotice. La acest interval de timp, nu au existat diferențe semnificative între cele două plăgi cu privire la gradul de reepitelizare (p>0.05).

La 14 zile postoperator, defectele cutanate au fost acoperite în totalitate de un epiteliu scuamos, bine diferențiat, keratinizat, ușor neregular (Fig. XC) sau uniform (Fig. XD), cu o grosime semnificativ mai redusă în cazul plăgilor tratate (p<0.05). Procesul de diferențiere sau maturare (keratinizare, strat granular, aspect uniform) al epiteliului de acoperire a fost mai evident la nivelul plăgilor tratate comparativ cu plăgile control.

Colagenizarea țesutului cicatricial

Dermul țesutului normal, adiacent plăgilor, este format dintr-un număr mare de fibre de colagen, groase și de culoare verde (colorație Tricrom Goldner – T&G), dispuse în planuri diferite (Fig. X A și B).

La 6 zile postoperator, țesutul de granulație prezent la nivelul plăgilor control (Fig. X C) a conținut un număr mai redus de fibre fine de colagen comparativ cu cel de la nivelul plăgilor tratate (Fig. X D). La 14 zile, fibrele de colagen au fost mai groase și mai abundente decât cele de la 6 zile; la plăgile tratate (Fig. X F), fibrele de colagen au fost mult mai evidente și mai organizate decât cele prezente la nivelul plăgilor control (Fig. X E).

5.3.3. Examenul imunohistochimic

Evaluarea regenerarii tisulare prin MCK și Vimentină

Reepitelizarea plăgilor cutanate a fost confirmată prin intermediul tehnicii imunohistochimice, utilizând anticorpi specifici pentru filamentele intermediare (citokeratine) prezente în citoplasma cheratinocitelor epidermului. Expresia MCK în zonele epitelizate s-a observat prin colorarea în nuanțe de maro, datorită diaminobenzidinei, a citoplamei cheratinocitelor. La 7 zile postchirurgical, MCK a fost exprimată discret și focal, în apropierea marginilor plăgilor, fiind în concordanță cu reepitelizarea parțială a acestor plăgi cutanate. La 14 zile postoperator, expresia MCK fost intensă și uniformă la nivelul ambelor tipuri de plăgi, neexistând diferențe între acestea (Fig. X).

Expresia Vimentinei a fost mai crescută la 14 zile postoperator, mai ales la nivelul plăgilor control (Fig. X). Acest lucru se datorează gradului intens de colagenizare și a reducerii numărului de celule mezenchimale de la nivelul plăgilor tratate, comparativ cu cele control.

Evaluarea angiogenezei prin CD31

Anticorpul CD31 a fost utilizat pentru marcarea celulelor endoteliale mature și evaluarea neoangiogenezei la nivelul zonelor de regenerare tisulară. Astefel, la 7 zile postoperator s-a observat creșterea numărului de capilare neoformație la nivelul zonelor de regenerare comparativ cu țesutul normal adiacent plăgilor. Numărul de capilare a fost semnificativ mai mare la nivelul plăgilor tratate (Fig. X) comparativ cu cele control (p < 0.05). La 14 zile, numărul de capilare de neoformație s-a redus semnificativ fața de cel prezent la 6 zile (Fig. X), atât în cazul plăgilor control (p < 0.05) cât și a celor tratate (p < 0.05). De asemenea, la intervalul de 14 zile postoperator, s-a observat o creștere semnificativă a numărului de vase de neoformațtie la nivelul plăgilor tratate (Fig. X) față de cele control (p < 0.05), evidențiind astfel rolul compoziției vitroase utilizate în angiogeneza asociată regenerării tisulare.

.

BIBLIOGRAFIA

ALARIFI S., ALI D., VERMA A., ALAKHTANI S., ALI B. A., 2013, Cytotoxicity and genotoxicity of copper oxide nanoparticles in human skin keratinocytes cells, International Journal of Toxicology 32(4):296-307.

AVMA Guidelines. 2013, AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals.

ISO 10993-2 I. 2004, International Organization for Standardization, Biological evaluation of medical devices – Part 2: Animal Welfare Requirements: 1-13.

ISO 10993-6 I. 2004, International Organization for Standardization, Biological evaluation of medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation: 1-19.

GANGULI-INDRA G., 2014, Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model, Methods in molecular biology 1210:151-9.

HU H., TANG Y., PANG L., LIN C., HUANG W., WANG D., JIA W., 2018, Angiogenesis and Full-Thickness Wound Healing Efficiency of a Copper-Doped Borate Bioactive Glass/Poly(lactic-co-glycolic acid)Dressing Loaded with Vitamin E in Vivo and in Vitro, ACS Applied Materials & Interfaces 10(27), 22939–22950.

ARAMWIT P., SANGCAKUL A., 2007, The effects of sericin cream on wound healing in rats, Biosci Biotechnol Biochem. 71(10):2473-7.

GUL W., LI Y., YANG X., JIN Z., SHEN J., GOU Z., 2018, Systematic investigation of a new nanoscale bioactive glass on wound healing in vivo in comparison with the clinically applied 45S5 Bioglass, Science Repository.

KARADAG C. A., BIRTANE M., AYGIT A. C., UZUNCA K., DOGANAY L., 2007, The Efficacy of Linear Polarized Polychromatic Light on Burn Wound Healing: An Experimental Study on Rats, Journal of Burn Care & Research 28(2), 291–298.

LEE K., LEE B., LEE M. H., KIM B., CHINANNAI K. S., HAM I., CHOI H. Y., 2015, Effect of Ampelopsis Radix on wound healing in scalded rats, BMC complementary and alternative medicine 15:213.

SOTOCINAL S. G., SORGE R. E., ZALOUM A., TUTTLE A. H., MARTIN L. J., WIESKOPF J. S., MAPPLEBECK J. C., WEI P., ZHAN S., ZHANG S., MCDOUGALL J. J., KING O. D., MOGIL J. S., 2011, The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain 7:55.

DREANCA A. I., BEL L., SEVASTRE B., MARCUS I., 2016, Applications of rat grimace scale method in postoperative pain management in rats. Bull Univ Agric Sci Vet Med Cluj Napoca 74: 1: 1-6.

FENWICK N., GRIFFIN G., GAUTHIER C., 2009, The welfare of animals used in science: How the ”Three Rs” ethic guides improvements, The Canadian Veterinary Journal 50: 523-530.

FLECKNELL P., 2009, Laboratory animal anesthesia, Academic Press, Elsevier, pp. 19-20.

CHEN L., MIRZA R., KWON Y., DIPIETRO L., KOH T., 2015, The murine excisional wound model: Contraction revisited, Wound Repair and Regeneration 23(6): 874-877.

DAI C., YUAN Y., LIU C., WEI J., HONG H., LI X., PAN X., 2009, Degradable, antibacterial silver exchanged mesoporous silica spheres for hemorrhage control, Biomaterials 30(29): 5364-5375.

GHOLIPOURMALEKABADI M., SAMENI M., HASHEMI A., ZAMANI F., ROSTAMI A., MOZAFARI M., 2016, Silver- and fluoride-containing mesoporous bioactive glasses versus commonly used antibiotics: Activity against multidrug-resistant bacterial strains isolated from patients with burns, Burns 42(1):131-140.

DYSON M., YOUNG S., PENDLE C. L., WEBSTER D. F., LANG S. M., 1988, Comparison of the effects of moist and dry conditions on dermal repair, J Invest Dermatol 1988; 91: 434–9.

BEHEREI H. H., MOHAMED K. R.., MAHMOUD A. I., 2009, Preparation, Bioactivity and Antibacterial Effect of Bioactive Glass/Chitosan Biocomposites, IFMBE proceedings 23(1): 1199–1203.

BEJARANO J., DETSCH R., BOCCACCINI A. R., PALZA H., 2016, PDLLA scaffolds with Cu- and Zn-doped bioactive glasses having multifunctional properties for bone regeneration, Journal of biomedical materials research A 00A(00): 1-11.

THRIVIKRAMAN G., MADRAS G., BASU B., 2014, In vitro/ In vivo assessment and mechanisms of toxicity of bioceramic materials and its wear particulates, Royal Society of Chemistry 4: 12763-12781.

VAN TIENHOVEN E. A., KORBEE D., SCHIPPER L., VERHAREN H. W., DE JONG W. H., 2006, In vitro and in vivo (cyto)toxicity assays using PVC and LDPE as model materials, J Biomed Mater Res A 78(1):175-82.

ROSENGREN A., FAXIUS L., TANAKA N., WATANABE M., BJURSTEN L. M., 2005, Comparison of implantation and cytotoxicity testing for initially toxic biomaterials, J Biomed Mater Res A 75(1):115-22.

CIRALDO FRANCESCA E., BOCCARDI E., MELLI V., WESTHAUSER F., BOCCACCINI A. R., 2018, Tackling bioactive glass excessive in vitro bioreactivity: Preconditioning approaches for cell culture tests, Acta Biomaterialia 75:3-10.

EL-RASHIDY A. A.,. ROETHER J.A., HARHAUS L., KNESER U., BOCCACCINI A.R., 2017, Regenerating bone with bioactive glass scaffolds: a review of in vivo studies in bone defect models, Acta Biomaterialia 62: 1-28.

CHACON E., ACOSTA D., LEMASTERS J. J., 1996, Primary cultures of cardiac myocytes as in vitro models for pharmacological and toxicological assessments. In: CASTELL J. V., GÓMEZ- LECHÓN M. J., editors. In vitro models in pharmaceutical research. Academic Press, San Diego, California.

HINTON R. H., MULLOCK B. M., 1997, Isolation of subcellular fractions. In: GRAHAM J. M., RICKWOOD D., editors. Subcellular fractionation: A practical approach. Oxford University Press, New York, USA.

RISS T. L., MORAVEC R. A., NILES A. L., DUELLMAN S., BENINK H., WORZELLA T., MINOR L., 2013, Cell Viability Assays. In: SITTAMPALAM G. S., COUSSENS N. P., BRIMACOMBE K., et al., editors. Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences.

HELD P., 2018, Using the Cytation 5 Cell Imaging Microplate Reader to Monitor Cell Culture Status, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT USA.

B. S. Bae, M. C. Weinberg, 1994, Optical absorption of copper phosphate glasses in the visible spectrum, J. Non-Cryst. Solids 168:223-231.

GARGIULO N., CUSANO A. M., CAUSA F., CAPUTO D., NETTI P. A., 2013, Silver-containing mesoporous bioactive glass with improved antibacterial properties, J Mater Sci: Mater Med 24(9):2129-35.

R.A.P. Society, 2014, US Launches New Antibiotics Strategy, Calls for New Regulatory Efforts and Incentives.

POURSAMAR S. A., AZAMI M., MOZAFARI M., 2011, Controllable synthesis and characterization of porous polyvinyl alcohol/hydroxyapatite nanocomposite scaffolds via an in situ colloidal technique, Colloids Surf. B: Biointerfaces, 84:310-316.

NEZAFATI N., MOZTARZADEH F., HESARAKI S., MOZAFARI M., SAMADIKUCHAKSARAEI A., HAJIBAKI L., GHOLIPOUR M., 2012, Effect of silver concentration on bioactivity and antibacterial properties of SiO2-CaO-P2O5 sol-gel derived bioactive glass, Key Engineering Materials Vols. 493-494: 74-79.

SHARPE J. R., HARRIS K. L., JUBIN K., BAINBRIDGE N. J., JORDAN N. R., 2009, The effect of pH in modulating skin cell behaviour, Br J Dermatol.161(3):671-673.

BALAMURUGAN A., BALOSSIER G., LAURENT-MAQUIN D., PINA S., REBELO A. H., FAURE J., FERREIRA J. M., 2008, An in vitro biological and anti-bacterial study on a sol-gel derived silver-incorporated bioglass system, Dent Mater 24(10):1343-51.

AMBROŽOVÁ N., ZÁLEŠÁK B., ULRICHOVÁ J., ČÍŽKOVÁ K., GALANDÁKOVÁ A., 2017, Low concentrations of silver nanoparticles have a beneficial effect on wound healing in vitro, Journal of Nanoparticle Research 19(3): 15.

BELLANTONE M., WILLIAMS H. D., HENCH L. L., 2002, Broad-spectrum bactericidal activity of Ag2O-doped bioactive glass, Antimicrob Agents Chemother 46 (6):1940-5.

MARRIAGE-ARCARI REBECCA, 2016, The role of zinc in wound healing, Wound Care Canada 14(3): 18-22.

ALLAN I., NEWMAN H., WILSON M., 2001, Antibacterial activity of particulate Bioglass® against supra- and subgingival bacteria, Biomaterials 22(12):1683-7.

ANSEL C. J., ARMSTRONG C. A., SONG I., QUINLAN K., OLERUD J.E., CAUGHMAN S.W., BUNNETT N.W., 1997, Interactions of the Skin and Nervous System, Journal of Investigative Dermatology 2(1): 23-26.

LEE S. H., LEE H. R., KIM Y., KIM M., 2012, Toxic response of zinc oxide nanoparticles in human epidermal keratinocyte HaCaT cells, Toxicology and Environmental Health Sciences 4(1):14-18.

BAILEY A. J., SIMS T.J., LELOUIS M., BAZIN A., 1975, Collagen polymorphism in experimental granulation tissue, Biochemical and Biophysical Research Communications 66: 1160-5.

BAINO F., NOVAJRA G., MIGUEZ-PACHECO V., BOCCACCINI A.R., VITALE-BROVARONE C., 2016, Bioactive glasses: Special applications outside the skeletal system, Journal of Non-Crystalline Solids 432 A, 15–30.

BAINO F., VERNĖ E., VITALE- BROVARONE C., 2009, 3-D high strength glass-ceramic scaffolds containing fluoroapatite for load-bearing bone portions replacement, Materials Science and Engineering:C 29(6), 2055-2062.

BAKER B.B.,MAIBACH H.I., PARK R.D., MCFARLAND L.Z.,O’BRIEN T.R., 1973, Epidermal cell renewal in the dog, American Journal of Veterinary Research 34:93.

LEMO N., MARIGNAC G., REYES-GOMEZ E., LILIN T., CROSAZ O., EHRENFEST D. M., 2010, Cutaneous reepithelialization and wound contraction after skin biopsies in rabbits: a mathematical model for healing and remodelling index, Vet Arh 80:637-52.

BARBUCCI R., LAMPONI S., MAGNANI A., PIRAS F.M., ROSSI A., 2005, Role of the Hyal-Cu (II) complex on bovine aortic and lymphatic endothelial cells behavior on microstructured surfaces, Biomacromolecules 6: 212-219.

BEGUM S., JOHNSON W., WORTHINGTON T., MARTIN R., 2016, The influence of pH and fluid dynamics on the antibacterial efficacy of 45S5 Bioglass, Biomedical Materials,11(1):015006.

BEHM B., BABILAS P., LANDTHALER M., SCHREML S., 2011, Cytokines, chemokines and growth factors in wound healing, Journal of the European Academy of Dermatology and Venerology 26(7): 812-820.

BELLUCI D., CANILLO A., SOLA A., 2011, A new potassium-based bioactive glass: sintering behavior and possible applications for bioceramic scaffolds, Ceramics International 37, 145-157.

BENDERDOUR M., HESS K., DZONDO-GADET M., DOUSSET B., NABET P., BELLEVILLE F., 1997, Effect of boric acid solution on cartilage metabolism, Biochemical and Biophysical Research Communications 234: 263-268.

BENNETT M. H., FELDMEIER J., HAMPSON N. B., SMEE R., MILROSS C., 2016, Hyperbaric oxygen therapy for late radiation tissue injury, The Cochrane Database of systematic reviews 4.

BERARDESCA E., ELSNER P., WILHEM K-P, MAIBACH HI, 1995, Bioengineering of the Skin: Cutaneous Blood Flow and Erythema, CRC Press, Boca Raton, FL.

BISHOP A., 2008, Role of oxygen in wound healing, Journal of wound care 17(9): 399-402.

BOCCACCINI A. R., BRAUER D. S., HUPA L., 2017, Bioactive glasses: fundamentals, technology and applications, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK.

BOHLING M. W., HENDERSON R. A., 2006, Differences in Cutaneous Wound Healing Between Dogs and Cats, Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 36: 687-692.

BOHLING M. W., Henderson R. A., SWAIM S. F., KINCAID S. A., WRIGHT J. C., 2004, Cutaneous wound healing in the cat: a macroscopic description and comparison with cutaneous wound healing in the dog, Veterinary Surgery 33(6): 579-87.

BOYD D., CARROLL G., TOWLER M.R., FREEMAN C., FARTHING P., BROOK I.M., 2009, Preliminary investigation of novel bone graft substitutes based on strontium-calcium- zinc-silicate glasses. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 20:413–20.

BRAUER D. S., 2015, Bioactive Glasses—Structure and Properties, Angewandte Chemie International Edition 54, 4160–4181.

BRAUER D. S., ANJUM M. N., MNEIMNE M., WILSON R. M., DOWEIDAR H., HILL R. G., 2012, Fluoride-containing bioactive glass-ceramics, Journal of Non-Crystalline Solids 358 (12-13), 1438-1442.

BROUGHTON G. 2nd, JANIS J. E., ATTINGER C. E., 2006, The basic science of wound healing, Plastic and reconstructives surgery 117(7 Suppl):12S- 34S.

BULLOCKS J., BASU C. B., HSU P., SINGER R., 2006, Prevention of Hematomas and Seromas, Seminars in Plastic Surgery 20(4): 233-240.

CAVANI F., TRIFIRO A., VACCARI A., 1991, Hydrotalcite-type anionic clays: preparation, properties and applications, Catalysis Today 11(2):173-301.

CHEN C. C., MO F. E., LAU L. F., 2001, The angiogenic factor Cyr61 activates a genetic program for wound healing in human skin fibroblasts, The Journal of Biological Chemistry 276: 47329-47337.

CHIANG R.A., CHEN S.L., TSAI Y.C., BAIR M.J., 2006, Comparison of primary wound closure versus open wound management in perforated appendicitis, Journal of the Formosan Medical Association 105:791-5.

CHIGURUPATI S., MUGHAL M. R., OKUN E., DAS S., KUMAR A., MCCAFFERY M., SEAL S., MATTSON M. P., 2013, Effects of cerium oxide nanoparticles on the growth of keratinocytes, fibroblasts and vascular endothelial cells in cutaneous wound healing. Biomaterials 34, 2194–2201

CLARYS P., BAREL A., 1995, Quantitative evaluation of skin surface lipids, Clinics in Dermatology 13:307.

COHEN M. H., GOOTENBERG J., KEEGAN P., PAZDUR R., 2007, FDA drug approval summary: bevacizumab plus FOLFOX4 as second-line treatment of colorectal cancer, The oncologist 12(3):356-61.

DAS S., BAKER A. B., 2016, Biomaterials and nanotherapeutics for enhancing skin wound healing, Frontiers in bioengineering and biotechnology 4:82.

DAY D. E., WHITE J. E., BROWN R. F., MCMENAMIN K. D., 2003, Transformation of borate glasses into biologically useful materials, Glass Technology 44:75–81.

OKITSU K., 2013, UV-Vis Spectroscopy for characterization of metal nanoparticles formed from reduction of metal ions during ultrasonic irradiation. In: UV-VIS and Photoluminescence Spectroscopy for Nanomaterials Characterization, Eds: KUMAR C. S., Springer-Verlag Berlin, Heidelberg.

DAY R. M., 2005, Bioactive glass stimulates the secretion of angiogenic growth factors and angiogenesis in vitro, Tissue Engineering 11(5-6): 768-77.

DAVIDSON J. M., YU F., OPALENIK S. R., 2013, Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models, Adv Wound Care (New Rochelle) 2(4):142-148.

DI PIETRO LUISA, BURNS A. L., 2003, Methods in molecular medicine, Vol. 78: Wound healing: Methods and Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ.

DRAGO L., TOSCANO M., BOTTAGISIO M., 2018, Recent Evidence on Bioactive Glass Antimicrobial and Antibiofilm Activity: A Mini-Review, Materials (Basel), 11(2):326.

DUCHEYNE P., HEALY K., HUTMACHER D.E., GRAINGER D.W., KIRKPATRICK C.J., 2011, Comprehensive Biomaterials, Volume 1, Elsevier, Amsterdam; Boston.

DUNN D. L., 2005, Ethicon Wound Closure Manual, Ethicon Inc., Somerville, NJ.

ANSELL D. M., CAMPBELL L., THOMASON H. A., BRASS A., HARDMAN M. J., 2014, A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models, Wound Rep Reg 22 281–287.

DUNSTAN R.W., 1995, A pathomechanistic approach to diseases of the hair follicle, The British Veterinary Dermatology Study Group 17:37.

EDWARDS R., HARDING K. G., 2004, Bacteria and wound healing, Current Opinion in Infectious Diseases 17(2): 91-96.

EHRLICH H. P., KRUMMEL T. M., 1996, Regulation of wound healing from a connective tissue perspective, Wound Repair and Regeneration 4:203.

GUPTA A., KUMAR P., 2015, Assessment of the histological state of the healing wound, Plast Aesthet Res 2: 239-42.

MOLL INGRID, PIA H, SCHMIDT H., MOLL R., 1998, Characterization of Epidermal Wound Healing in a Human Skin Organ Culture Model: Acceleration by Transplanted Keratinocytes, Journal of Investigative Dermatology 111(2):251-258.

ERIO P., PEREIRA M. M., GOES A. M., LEITE M. F., 2004, The effect of ionic products from bioactive glass dissolution on osteoblast proliferation and collagen production, Biomaterials 25(15), 2941-8.

ETHRIDGE R., LEONG M., PHILLIPS L., 2007, Wound healing, în TOWNSEND C., BEACUHAMP R., EVERS B., MATTOX K., Sabiston textbook of surgery, Ed. 18, Elsevier Health Sciences, St. Louis.

EVANS H. E., DELAHUNTA A., 2012, Miller’s Anaomy of the Dog, Elsevier Saunders W. B.

FINNEY L., VOGT S., FUKAI T., GLESNE D., 2009, Copper and angiogenesis: unravelling a relationship key to cancer progression, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 36 (1):88-94.

FOSSUM THERESA W., 2013, Small Animal Surgery, Fourth Edition, Elsevier Mosby, St. Louis, Missouri.

FOSSUM THERESA W., HEDLUND CHERYL S., JOHNSON ANN L., SCHULZ K.S., SEIM III H.B., WILLARD M.D., BAHR ANNE, CARROLL GWENDOLYN L., 2007, Small Animal Surgery Third Edition, Mosby Elsevier, St. Louis, Missouri.

FOWLER D., WILLIAMS J.M., 1999, BSAVA Manual of Canine and Feline Wound Management, BSAVA, Cheltenham, United Kingdom, Pp.1-

FRANK S., KÄMPFER H., 2003, Excisional Wound Healing. In: DIPIETRO L.A., BURNS A.L., Wound Healing. Methods in Molecular Medicine™, Vol. 78, Humana Press, Totowa, NJ.

FRANZ M. G., ROBSON M. C., STEED D. L., BARBUL A., BREM H., COOPER D. M., LEAPER D., MILNER S. M., PAYNE W. G., WACHTEL T. L., WIERSEMA-BRYANT L., 2008, Guidelines to aid healing of acute wounds by decreasing imprediments of healing, Wound Repair and Regeneration 16: 723-748.

FU Q., RAHAMAN M. N., FU H., LIU X., 2010, Bioactive glass scaffolds with controllable degradation rates for bone tissue engineering applications. I. Preparation and in vitro degradation. Journal of Biomedical Materials Research 95A:164–71.

GAETKE L. M., CHOW C. K., 2003, Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients, Toxicology 189:147–63.

GALLIANO P.G., PORTO LOPEZ J.M., 1995, Thermal behavior of bioactive alkaline-earth silicophosphate glasses, Journal of Materials Science: Materials in Medicine 6: 353-359.

GÉRARD C., BORDELEAU L-J., BARRALET J., DOILLON C. J., 2010, The stimulation of angiogenesis and collagen deposition by copper, Biomaterials 31(5):824-31.

MAI R., GEDRANGE T., LEONHARDT H., SIEVERS N., LAUER G., 2009, Immunohistochemical Comparison of Markers for Wound Healing on Plastic-Embedded and Frozen Mucosal Tissue, Cells Tissue Organs 190:34-41.

XU H., LV F.,ZHANG Y., YI Z., KE Q., WU C., LIU M., CHANG J., 2015, Hierarchically micro-patterned nanofibrous scaffolds with a nanosized bio-glass surface for accelerating wound healing, Nanoscale 7(44): 18446-452.

MICHAEL S., SORG H., PECK C. T., REIMERS K., VOGT P. M., 2013, The mouse dorsal skin fold chamber as a means for the analysis of tissue engineered skin, Burns 39: 82–8.

GERHARDT L. C., BOCCACCINI A. R., 2010, Bioactive Glass and Glass-Ceramic Scaffolds for Bone Tissue Engineering, Materials 3(7), 3867-3910.

GOLDSMITH L. A., 1991, Phisiology, Biochemistry and Molecular Biology of the Skin, 2nd Edition, Oxford University Press, New York.

GORUSTOVICH A. A., ROETHER J. A., BOCCACCINI A. R., 2009, Effect of bioactive glasses on angio- genesis: a review of in vitro and in vivo evidences. Tissue Engineering Part B: Reviews.

GOTTRUP F., AGREN M. S., KARLSMARK T., 2000, Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue, Wound Repair and Regeneration 8:83- 96.

GUO S., DIPIETRO L. A., Factors affecting wound healing, Journal of Dental Research 89(3): 219-29.

HALES J.M., CAMP R.D, 1998, Potent T cell stimulatory material with antigenic properties in stratum corneum of normal human skin, Journal of Investigative Dermatology 110:725.

HENCH L. L., XYNOS I. D., BUTTERY L. D., POLAK J. M., 2000, Bioactive materials to control cell cycle, Materials Research Innovations 3, 313-323.

HENKIN R.I., 1974, Zinc in wound healing, The New England Journal of Medicine, 291:675-676.

HINES D. J., KAPLAN D. L., 2013, Poly(lactic-co-glycolic) acid-controlled-release systems: experimental and modeling insights, Critical reviews in therapeutic drug carrier systems 30(3): 257-276.

HOPPE A., GÜLDAL N. S., BOCCACCINI A. R., 2011, A review of the biological response to ionic dissolution products from bioactive glasses and glass-ceramics, Biomaterials 32: 2757-2774.

HU G-F., 1998, Copper stimulates proliferation of human endothelial cells under culture, J Cell Biochem 69(3):326-35.

HU S., CHANG J., LIU M., NING C., 2009, Study on antibacterial effect of 45S5 Bioglass®, Journal of Materials Science: Materials in Medicine 20(1):281-6.

HUANG W., DAY D.E., KITTIRATANAPIBOON K., RAHAMAN M.N., 2006, Kinetics and mechanisms of the conversion of silicate (45S5), borate and borosilicate glasses to hydroxiapatite in dilute phosphate solution, Journal of Materials Science: Materials in Medicine 17: 583-96.

HUANG W., RAHAMAN M. N., DAY D. E., LI Y., 2006, Mechanisms of converting silicate, borate, and borosilicate glasses to hydroxiapatite in dilute phosphate solution, Physics and Chemistry of Glasses: European Journal of Glass Science and Technology Part B 47: 647-58.

HUNG Y. H., BUSH A. I., CHERNY R. A., 2010, Copper in the brain and Alzheimer’s disease, J Biol Inorg Chem 15:61–76.

ICHIKAWA T., SUENAGA Y., KODA T., OZAKI T., NAKAGAWARA A., 2008, Np63/BMP-7-dependent expression of matrilin-2 is involved in keratinocyte migration in response to wounding, Biochemical and Biophysical Research Communication 369:994-1000.

JENKINSON D. M., 1990, Sweat and sebaceous glands and their function in domestic animals, Advances in Veterinary Dermatology 1, Bailiére Tindall, Philadelphia.

Johnston D. E., 1984, Wound healing in dogs and cats, Clinics in Dermatology 2(3): 143-153.

JOHNSTON S.A., TOBIAS KAREN, 2017, Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult: Volume Two, 2nd Edition, Elsevier, St. Louis, Missouri.

JONES J., EHRENFRIED L., SARAVANAPAVAN P., HENCH L., 2006, Controlling ion release from bioactive glass foam scaffolds with antibacterial properties, Journal of Materials Science: Materials in Medicine 17(11):989-96.

JONES J.R., 2013, Review of bioactive glass: From Hench to hybrids, Acta Biomaterialia 9, 4457–4486.

FERNANDES J. S., GENTILE P., PIRES R. A., REIS R. L., HATTON P. V., 2017, Multifunctional bioactive glass and glass-ceramic biomaterials with antibacterial properties for repair and regeneration of bone tissue, Acta Biomaterialia 1(59):2-11.

JUNG S.B., DAY D.E., DAY T., STOECKER W., TAYLOR P., 2011, Treatment of non-healing diabetic venous stasis ulcers with bioactive glass nanofibers, Wound Repair and Regeneration 19: A30.

KALANTAR-ZADEH K., FRY B., 2008, Nanotechnology- Enabled Sensors, Springer.

KAUR G., PICKRELL G., SRIRANGANATHAN N., KUMAR V., HOMA D., 2015, Review and the state of the art: Sol–gel and melt quenched bioactive glasses for tissue engineering, J Biomed Mater Res Part B 2015:00B:000–000.

KIRSHEN CARLY, WOO K., AYELLO E. A., SIBBALD R. G., 2006, Debridement: A Vital Component of Wound Bed Preparation, Advances in Skin & Wound Care 19:506-19.

KOH T. J., DIPIETRO L. A., 2011, Inflammation and wound healing: the role of the macrophage, Expert Reviews in Molecular Medicine 13(23).

KOH Y. W., LOH K. P., 2005, Hexagonally packed zinc oxide nanorod bundles on hydrotalcite sheets, Journal of Materials Chemistry 15: 2508-2514.

KOKUBO T., KUSHITANI H., SAKKA S., KITSUGI T., YAMAMOTO T., 1990, Solutions able to reproduce in vivo surface-structure changes in bioactive glass-ceramic, Journal of Biomedical Materials Research 24: 721–34.

KOKUBO T., TAKADAMA H., 2006, How useful is SBF in predicting in vivo bioactivity?, Biomaterials 27(15), 2907-2915.

KUBE P, AUDIGĖ L., KŰTHER K., WELLE M., Distribution, density, and heterogeneity of canine mast cell depending on fixation techniques, Histochemistry and Cell Biology 110:129.

LANG C., MURGIA C., LEONG M., TAN L-W., PEROZZI G., KNIGHT D., 2007, Anti- inflammatory effects of zinc and alterations in zinc transporter mRNA in mouse models of allergic inflammation, American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 292(2):L577-84.

LANIER S. T., MCCLAIN S. A., LIN F., SINGER A. J., CLARK R. A., 2011, Spatiotemporal progression of cell death in the zone of ischemia surrounding burns, Wound Repair and Regeneration 19:622–35.

LANSDOWN A.B.G., SAMPSON B., ROWE A., 1999, Sequential changes in trace metal, metallothionein and calmodulin concentrations in healing skin wounds, Journal of Anatomy 195 (Part 3): 375–86.

LANSDOWN A. B. G., MIRASTSCHIJSKI U., STUBBS N., SCANLON E., AGREN M. S., 2007, Zinc in wound healing: Theoretical, experimental, and clinical aspects, Wound Repair Regen, 15(1): 2–16.

PRASAD A. S., 2014, Zinc is and antioxidant and anti-inflamatory agent: Its role in human health, Frontiers in Nutrition 1:14.

LATEO S. A., LANGTRY J.A.A., 2013, A prospective case series of secondary intention healing for surgical wounds on the dorsum of the hand, Clinical and Experimental Dermatology 38, 606-611.

ZAGOREN A., JOHNSON D., AMICK N., 2007, The role of nutrition in wound care. In:. Chronic Wound Care: A Clinical Sourcebook for Healthcare Professionals. 4th ed. Krasner D, Rodeheaver G, Sibbald R (eds.), Malvern, PA: HMP communications; pp. 127.

LATEO S., LANGTRY J.A.A., 2006, Secondary intention healing for surgical wounds on the trunk and extremities, British Journal of Dermatology 155(Suppl. 1): 101-2 (abstract).

LEU A., LEACH J., 2008, Proangiogenic potential of a collagen/bioactive glass substrate, Pharmaceutical Research 2; 25(5):1222-9.

LIN C., MAO C., ZHANGJ., LI Y., CHEN X., 2012, Healing effect of bioactive glass ointment on full-thickness skin wounds, Biomedical Materials 7 (2012) 045017.

LINDSEY W. H., MATERSON T. M., SPOTNITZ W. D., WILHEM M. C., MORGAN R. F., 1990, Seroma prevention using fibrin glue in a rat mastectomy model, Archives of Surgery 125(3):305-7.

KOGAN S., SOOD A., GARNICK M. S., 2017, Zinc and Wound Healing: A Review of Zinc Physiology and Clinical Applications, Wounds: a compendium of clinical research and practice 29(4): 102-106.

LLOYD D.H., GARTHWAITE G., 1982, Epidermal structure and surface topography ofcanine skin, Research in Veterinary Science 33:99.

LODEMANN U., EINSPANIER R., SCHARFEN F., MARTENS H., BONDZIO A., 2013, Effects of zinc on epithelial barrier properties and viability in a human and a porcine intestinal cell culture model, Toxicology In vitro 27: 834-843.

LODER S., PETERSON J. R., BA, AGARWAL S., EBODA O., BROWNLEY C., DELAROSA S., RANGANATHAN K., CEDERNA P., WANG S.C., LEVI B., 2015, Wound healing immediately post-thermal injury is improved by fat and adipose derived stem cell isografts, Journal of Burn Care & Research 36(1):70-76.

LOMBARDI MARIANGELA, GREMILLARD L., CHEVALIER J., LEFEBVRE L., CACCIOTTI I., BIANCO A., MONTANARO L., 2013, A comparative study betweem melt-derived and sol-gel synthesized 45S5 bioactive glasses, Key Engineering Materials 541: 15-30.

MAÇON A., KIM T., VALLIANT E. et al., 2015, A unified in vitro evaluation for apatite-forming ability of bioactive glasses and their variants, Journal of Materials Science. Materials in medicine 26(2):115.

MASERA R. G., STAURENGHI A., SARTORI M. L., ANGELI A., 1999, Natural killer cell activity in the peripheral blood of patients with Cushing’s syndrome, European Journal of Endocrinology 140(4):299-306.

MATTOX D. M., 1998, Handbook of physical vapour deposition processing (PVD): Film Formation, Adhesion, Surface Preparation and Contamination Control, Noyes Publications, Oxford, UK, pp. 29-54.

MCANULTY P. A., DAYAN A. D., GANDERUP N. C., HASTINGS K. L., 2012, The minipig in biomedical research, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL.

MENKE N. B., WARD K. R., WITTEN T. M., BONCHEV D. G., DIEGELMANN R. F., 2007, Impaired wound healing, Clinical Dermatology 25:19-25.

MEYER W., NEURAND K., 1991, Comparison of skin pH in domesticated and laboratory mammals, Archives of Dermatological Research 283: 16.

MILLER W.H., GRIFFIN C.E., CAMPBELL KAREN L., 2013, Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology 7th edition, Mosby Elsevier, St. Louis, Missouri.

MILWARD P. A., 1995, Common problems associated with necrotic and sloughy wounds, British Journal of Nursing 4(15).

MIOLA M., VERNÉ, 2016, Bioactive and Antibacterial Glass Powders Doped with Copper by Ion-Exchange in Aqueous Solutions, Materials, 9(405):1-16.

MIZUMOTO T., 1987, Effects of the calcium ion on the wound healing process, The Hokkaido Journal of Medical Science 62(2):332-45.

MOHS F.E., 1978, Chemosurgery: microscopically controlled surgery for skin cancer-past, present and future, The Journal of Dermatologic surgery and oncology 4(1):41-54.

MONTAGNA W., 1967, Comparative anatomy and physiology of the skin, Archives of Dermatology 96:357.

MOREIRA CAMILA F., CASSINI-VIEIRA P., FELIPETTO da SILVA M., SILVA BARCELOS L., 2015, Skin Wound Healing Model- Excisional Wounding and Assessment of Lesion Area, Bio-Protocol 5(22).

MOSSER D. M., EDWARDS J. P., 2008, Exploring the full spectrum of macrophage activation, Nature Reviews Immunology 8:958-69.

MUNIREDDY S., KAVALUKAS S., BARBUL A., 2010, Intra-abdominal Healing: gastrointerstinal tract and adhesions, The Surgical Clinics of North America 90(6):1227-36.

NARAGINTI S., KUMARI P. L., DAS R. K., SIVAKUMAR A., PATIL S. H., ANDHALKAR V. V., 2016, Amelioration of excision wounds by topical application of green synthesized, formulated silver and gold nanoparticles in albino Wistar rats. Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications 62, 293–300.

NARAYAN R., COLOMBO P., 2013, Advances in Bioceramics and Porous Ceramics V, The American Ceramic Society, Wiley.

NASERI S., LEPRY W., NAZHAT S., 2017, Bioactive glasses in wound healing: hope or hype?, Journal of Materials Chemistry B, 5: 6167-6174.

NASERI S., NAZHAT S. N., 2018, Bioactive and soluble glasses for wound-healing applications. In: Bioactive glasses: materials, properties and applications. Second Edition. Ed: YLÄNEN H., Woodhead Publishing Elsevier.

NEEL E. A., AHMED I., PRATTEN J., NAZHAT S. N., KNOWLES J. C., 2005, Characterisation of antibacterial copper releasing degradable phosphate glass fibres, Biomaterials 26(15):2247-54.

NEWBURY D. E., RITCHIE N. W .M., 2012, Is Scanning Electron Microscopy/Energy Dispersive X-ray Spectrometry (SEM/EDS) Quantitative?, Scanning 00, 1-28, Wiley Periodicals, Inc.

NEZAFATI N., MOZTARZADEH F., HESARAKI S., MOZAFARI M., SAMADIKUCHAKSARAEI A., HAJIBAKI L., GHOLIPOUR M., 2012, Effect of silver concentration on bioactivity and antibacterial properties of SiO2-CaO-P2O5 sol-gel derived bioactive glass, Key Engineering Materials Vols., 493-494: 74-79.

NICHOLSON M., BEAL M., SHOFER F., BROWN D. C., 2002, Epidemiologic evaluation of postoperative wound infection in clean-contaminated wounds: A retrospective study of 239 dogs and cats, Veterinary Surgery 31(6):577-81.

NIEMANN CATHERIN, 2009, Differentiation of the sebaceous gland, Dermatoendocrinology 1(2): 64-67.

NOTINGHER I., JONES J. R., VERRIER S., BISSONB I., EMBANGAA P., EDWARDS P., POLAKB J. M., HENCH L.L., 2003, Application of FTIR and Raman spectroscopy to characterisation of bioactive materials and living cells, Spectroscopy 17: 275-288.

NZIETCHUENG R.M., DOUSSSET B., FRANCK P., BENDERDOUR M., NABET P., HESS K., 2002, Mechanisms implicated in the effects of boron on wound healing, Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 16, 239-244.

AKESON W. H., MASSIE J. B., HUANG B., GIUREA A., DENG R. S., GARFIN S. R., KIM C. W., 2005, Topical high-molecular-weight hyaluronan and a roofing barrier sheet equally inhibit postlaminectomy fibrosis, The Spine Journal 5(2): 180-190.

LEE Y. H., CHANG J. J., CHIEN C. T., YANG M. C., CHIEN H. F., 2012, Antioxidant sol-gel improves cutaneous wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats, Exp Diabetes Res: 504693.

PARK J. U., JUNG H. D., SONG E. H., CHOI T. H., KIM H. E., SONG J., KIM S., 2017, The accelerating effect of chitosan-slica hybrid dressing materials on the early phase of wound healin, J Biomed Mater Res B Appl Biomater 105(7):1828-1839.

PARK S. A., TEIXEIRA L. B., RAGHUNATHAN V. K., COVERT J., DUBIELZIG R. R., ISSEROFF R. R., SCHURR M., ABBOTT N. L., MCANULTY J., MURPHY C. J., 2014, Full-thickness splinted skin wound healing models in db/db and heterozygous mice: Implications for wound healing impairment, Wound Repair and Regeneration 22:368-380.

PAVLETIC M. M., 2010, Atlas of Small Animal Wound Management and Reconstructive Surgery Third Edition, Wiley-Blackwell, New Jersey, USA.

Pereira M. M., Clark A. E., Hench L. L., 1994, Calcium phosphate formation on sol‐gel‐derived bioactive glasses in vitro, Journal of Biomedical Materials Research 28(6):693-698.

PEREIRA M. M., HENCH L. L., 1996, Mechanisms of hydroxyapatite formation on porous gel-silica substrates, Journal of Sol-Gel Science and Technology 7(1-2):59-68.

PIRAINO F., SELIMOVIĆ, 2015, A current view of functional biomaterials for wound care, molecular and cellular therapies, BioMed Research International Volume 2015.

PRADHAN S., RAJAMANI S., AGRAWAL G., DASH M., SAMAL S. K., 2017, NMR, FT-IR and raman characterization of biomaterials. In: Characterization of polymeric biomaterials, Eds: TANZI MARIA CRISTINA, FARE SILVIA, Woodhead Publishing Elsevier, pp: 158-159.

RAHAMAN M, DAY D, BAL B, FU Q, JUNG S, BONEWALD L, TOMSIA A, 2011, Bioactive glass in tissue engineering, Acta Biomaterialia 7, 2355-2373.

RAN S., HE Z., LIANG J., 2013, Survival of Enterococcus faecalis during alkaline stress: changes in morphology, ultrastructure, physiochemical properties of the cell wall and specific gene transcripts, Archives of Oral Biology, 58(11):1667-76.

RANDERIA P. S., SEEGER M. A., WANG X. Q., WILSON H., SHIPP D., MIRKIN C. A., PALLER A. S., 2015, siRNA-based spherical nucleic acids reverse impaired wound healing in diabetic mice by ganglioside GM3 synthase knockdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 112, 5573–5578.

RIPPKE F., SCHREINER V., DOERING T., MAIBACH H. I., 2004, Stratum corneum pH in atopic dermatitis: impact on skin barrier function and colonization with Staphylococcus aureus, American Journal of Clinical Dermatology 5: 217- 223.

RIPPKE F., SCHREINER V., SCHWANITZ H.J., 2002, The acidic milieu of the horny layer: new findings on the physiology and pathophysiology of skin pH, American Journal of Clinical Dermatology 3: 261- 272.

WANG H. CHU P. K., 2013, Surface Characterization of Biomaterials. In: Characterization of Biomaterials, Eds: BANDYOPADHYAY A., BOSE S., Elsevier, Oxford, UK.

RUEDISUELI F. L., 1998, The measurment of skin pH in normal dogs of different breeds in KWOCHKA K. W., WILLEMSE T., VON TSCHARNER CLAUDIA, Advances in Veterinary Dermatology Volume 3, Butterworth- Heinemann, Boston.

SAAD B.H., 2012, Modeling of Viscosity and Thermal Expansion of Bioactive Glasses, ISRN Ceramics Vol. 2012.

SALAMONE J. C., SALAMONE A. B., SWINDLE-REILLY K., LEUNG K., MCMAHON R. E., 2016, Grand challenge in Biomaterials-wound healing, Regenerative Biomaterials 127-128.

SASAKI Y., SATHI G. A., YAMAMOTO O., 2017, Wound healing effect of bioactive ion released from Mg-smectite, Mater Sci Eng C Mater Biol App 77:52-57.

SCHREML S., SZEIMIES R. M., PRANTI L., LANDTHALER M., BABILAS P., 2010, Wound healing in the 21st century, Journal of the American Academy of Dermatology 63(5):866-81.

SCHUMMER A., WILKENS H., VOLLMERHAUS B., HABERMEHL K., 1981, The Circulatory System, the Skin, and the Cutaneous Organs of the Domestic Mammals, Springer Verlag Berlin Heidelberg GmbH.

SCHUMMER A., WILKENS H., VOLLMERHAUS B., HABERMEHL K-H., 1981, The Circulatory System, the Skin, and the Cutaneous Organs of the Domestic Mammals, Springer-Verlag Berlin.

SCOTT D. W., 1980, Feline Dermatology 1900- 1978: A monograph, Journal of the American Animal Hospital Association 16: 331.

SCOTT D. W., MILLER W. H., GRIFFIN C. E., 1995, Muller and Kirk’s Small Animal Dermatology 5’th Edition, W. B. Saunder Company.

SINGH P.K., SAXENA N., PODDAR D., GOHIL R.K., PATEL GAURAV, 2016, Comparative study of wound healing in primary versus delayed primary closure in contaminated abdominal surgery, Hellenic Journal of Surgery 88:5, 314-320.

SINGHAL A., REIS E. D., KERSTEIN M. D., 2001, Options for nonsurgical debidement of necrotic wounds, Advances in Skin & Wound Care 14(2):96-100.

STÄHLI C., JAMES-BHASIN M., HOPPE A., BOCCACCINI A. R., NAZHA S. N., 2015, Effect of ion release from Cu-doped 45S5 Bioglass® on 3D endothelial cell morphogenesis, Acta Biomaterialia 19: 15-22.

STRICKLAND J. H., CALHOUN M.L., 1963, The integumentary system of the cat, American Journal of Veterinary Research 24: 1018.

STRICKLAND J.H., CALHOUN M.L., 1963, The integumentary system of the cat, American Journal of Veterinary Research 24:1018.

STYNES G., KIROFF K., MORRISON W. A., KIRKLAND M. A., 2008, Tissue compatibility of biomaterials: benefits and problems of skin biointegration, ANZ Journal of Surgery 78(8): 654-659.

SUSSMAN CARRIE, BATES-JENSEN BARBARA, 2007, Wound care. A Collaborative Practice Manual for Health Professionals Third Edition, Wolters Kluwer; Lippincott Williams& Wilkins, Pp. 319.

SZCZEPANIK M. P., WILKOLEK P. M., ADAMEK L. R., POMORSKI Z.J., 2011, The examination of biophysical parameters of skin (transepidermal water loss, skin hydration and pH value) in different body regions of normal cats of both sexes), Journal of feline medicine and surgery 13(4):224-30.

TAVAKOLIZADEH A., AHMADIAN M., FATHI M.H., DOOSTMOHAMMADI A., SEVEDJAFARI E., ARDESHIRYLAJIMI A., 2017, Investigation of osteoinductive effects of different compositions of bioactive glass nanoparticles for bone tissue engineering, American Society for Artificial Internal Organs: 1992 63(4): 512-517.

TAYLOR G. I., MINABE T., 1992, The angiosomes of the mammals and other vertebrates, Plastic and reconstructive surgery 89(2): 181-215.

THIBOUTOT D., 2004, Regulation of human sebaceous glands, Journal of Investigative Dermatology 123:1-12.

TICHIT D., COQ B., 2003, Catalysis by Hidrotalcites and Related Materials, Cattech 7(6):206-217.

TOBIAS KAREN, 2017, Manual of Small Animal Soft Tissue Surgery, Second Edition, Wiley-Blackwell, NJ, USA.

TOBIAS M. KAREN, JOHNSTON A. S., 2012, Veterinary Surgery: Small Animal, Volume Two, Elsevier Saunders, St. Louis, Missouri.

TREUTING P.M., DINTZIS S.M., MONTINE K.S., 2017, Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat and Human Atlas, Academic Press, Elsevier.

UITTO J., CHU M-L., GALLO R., 2008, Collagen, elastic fibers and extracellular matrix of the dermis. În WOLFF K., GOLDSMITH L.A., KATZ S.I.: Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine, ed 7, Vol 1, New York, McGraw-Hill, pp. 517–542.

VEDEL E., ARSTILA H., YLANEN H., HUPA L., HUPA M., 2008, Predicting physical and chemical properties of bioactive glasses from chemical composition. Part 1: viscosity characteristics, Glass Technology: European Journal of Glass Science and Technology, Part A, 49(6), 251-9.

VICHERY Charlotte, NEDELEC J., 2016, Bioactive Glass Nanoparticles: From Synthesis to Materials Design for Biomedical Applications, Materials 9, 288.

WANG X., GE J., TREDGET E.E., WU Y., 2013, The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation, Nature Protocols 8(2): 302-309.

M.I. EUROPEAN COMMITTEE FOR ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TESTING OF THE EUROPEAN SOCIETY OF CLINICAL DISEASES, 2003, Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by broth dilution, Clin. Microbiol. Infect. 9 (8): ix–xv.

MATUSCHEK E., BROWN D. F. J., KAHLMETER G., 2014, Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories, Clin. Microbiol. Infect. 20 (4): O255–O266.

WANKELL M., KAESLER S., ZHANG Y. Q., FLORENCE C., 2001, The activin binding proteins follistatin and follistatin-related protein are differentially regulated in vitro and during cutaneous wound repair, Journal of Endocrinology 171:385-95.

WEBB A. J., CALHOUN M. L., 1954, The microscopic anatomy of the skin of mongrel dogs, American Journal of Veterinary Research 15: 274.

WHITE S. D., YAGER J. A., 1995, Resident dendritic cells in the epidermis: Langerhans cells, Merkel cells and melanocytes, Veterinary Dermatology 6: 1.

WILHEM K. P., WILHEM D., BIELFELDT S., 2016, Models of wound healing: an emphasis on clinical studies, Skin Research and Technology 0:1-10.

WILLIAMS D. T., PRICE P., HARDING K. G., The influence of diabetes and lower limb arterial disease on cutaneous foot perfusion, Journal of vascular surgery 44(4):770-5.

WINGERD B.D., 1988, Rat Dissection Manual, The Johns Hopkins University Press Baltimore & London.

WINSTANLEY E.W., 1975, The rate of mitotic division in regenerating epithelium in the dog, Research in Veterinary Science 18:144.

WORTHLEY L. I., Shock: a review of pathophysiology and management. Part I, Critical care and resuscitation 2(1): 55-65.

XYNOS I. D., EDGAR A. J., BUTTERY L. D. K., HENCH L. L., POLAK J. M., 2001, Gene-expression profiling of human osteoblasts following treatment with the ionic products of Bioglass® 45S5 dissolution, Journal of Biomedical Materials Research 55(2): 151-7.

XYNOS I. D., EDGAR A. J., BUTTERY L. D., HENCH L. L., POLAK J. M., 2000, Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis, Biochemical and Biophysical Research Communications 276(2):461-5.

YAO A., WANG D. P., HUANG W., RAHAMAN M. N., DAY D. E., 2007, In vitro bioactive characteristics of borate-based glasses with controllable degradation behavior, Journal of the American Ceramic Society 90:303–6.

YLÄNEN, H. O., 2011, Bioactive glasses. Materials, properties and applications. UK, Cambridge: Woodhead Publishing Limited.

ZACHARY J. F., 2017, Pathologic Basis of Veterinary Disease 6th Edition, Elsevier, St. Louis, Missouri.

ZANNA G., DOCAMPO M.J., FONDEVILA D., BARDAGl M., BASSOLS A., FERRER L., 2009, Hereditary cutaneous mucinosis in shar pei dogs is associated with increased hyaluronic synthase-2 mRNA transcription by cultured dermal fibroblasts. Veterinary Dermatology 20:377–382.

ZHANG D., VEDEL E., HUPA L., HANNU T. A., HUPA M., 2009, Predicting physical and chemical properties of bioactive glasses from chemical composition. Part 3: In vitro reactivity, Glass Technology: European Journal of Glass Science and Technology Part A, 50 (1), 1–8.

ZHANG X., 2014, Inorganic Biomaterials: Structure, Properties and Applications, Smithers Information Ltd, United Kingdom, pp. 15-16.

ZHANG X.Q., YIN L.H., TANG M., PU Y.P., 2011, ZnO, TiO(2), SiO(2,) and Al(2)O(3) nanoparticles-induced toxic effects on human fetal lung fibroblasts, Biomedical and Environmental Sciences 24: 661-669.

ZUO Y., YU X., LU S., 2016, Cone of skin exists in rat: A „hypertrophic scarring free” animal, Anatomical Record 299(8): 1140-4.

CHAU F., LEUNG A., 2000, Applications of Wavelet Transform in Spectroscopic Studies. In: Wavelets in Chemistry, Eds: Walczak B., Elsevier Science Publishers, Amesterdam, Netherlands.

ZHANG D., LEPPÄRANTA O., MUNUKKA E., YLÄNEN H., VILJANEN M.K., EEROLA E., HUPA M., HUPA L., 2010, Antibacterial effects and dissolution behavior of six bioactive glasses, J. Biomed. Mater. Res., Part A 93A (2): 475–483.