Morfologia Tumorilor Tesuturilor Limfoide la Carnivore

Diverse2

Morfologia Tumorilor Tesuturilor Limfoide la Carnivore

Byadmin ianuarie 1, 2024

Morfologia tumorilor țesuturilor

limfoide la carnivore

CUPRINS

Introducere

PARTEA I – DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND MORFOLOGIA TUMORILOR ȚESUTURILOR LIMFOIDE LA CARNIVORE

CAPITOLUL I

PARTICULARITĂȚI MORFOLOGICE ALE LIMFOAMELOR LA CARNIVORE

1.1 Limfomul canin

1.1.1 Etiologie

1.1.2 Simptomatologie

1.1.3. Aspecte morfopatologice

1.1.4. Diagnostic

1.1.5. Tratament

1.1.6. Prevenție

1.2 Limfomul felin

1.2.1. Etiologie

1.2.2. Simptome

1.2.3. Leziuni

1.2.4. Diagnostic

1.2.5. Tratament

1.3 Limfomul Hodgkin

1.3.1 Etiologie

1.3.2 Manifestări clinice

1.3.3 Aspecte citologice

1.3.4 Diagnostic

1.3.5 Tratament

CAPITOLUL II

CADRUL ORGANIZATORIC ÎN CARE S-AU EFECTUAT STUDIILE

PARTEA A II-A – CONTRIBUȚII PROPRII

CAPITOLUL III

OBIECTIVELE ȘI METODOLOGIA CERCETĂRII

3.1. Obiective

3.2. Material și metodă

CAPITOLUL IV

REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1 Epidemiologia limfoamelor maligne

4.2 Etiologia

4.3 Tablou clinic

4.4 Clasificare

4.5 Leucozele limfoide – stadializare

4.6 Mastocitomul

4.7 Plasmocitomul (mielomul multiplu

4.8 Metastazarea nodală a melanomului malign

4.9 Metastazele adenocarcinomului mamar în limfonoduri

CONCLUZII

LISTA FIGURILOR

Fig. 4.1 – Câine. Limfonod retrofaringian mult mărit în volum. Limfosarcom……………..42

Fig. 4.2 – Câine. Limfosarcom. Limfonod submandibular………………………………………….42

Fig. 4.3 – Câine. Limfosarcom. Limfonod popliteu mărit în volum și infiltrat hemoragic……………………………………………………………………………………………………………43

Fig. 4.4 -Câine. Limfosarcom. Localizare splenică. Formațiuni tumorale multiple……….43

Fig. 4.5 – Câine. Limfosarcom. Localizare splenică. Formațiuni tumorale multiple………44

Fig. 4.6 – Câine. Limfosarcom. Localizare renală. Noduli slăninoși multipli localizați în

Corticală……………………………………………………………………………………………………………..44

Fig. 4.7 – Câine. Limfosarcom. Localizare hepatică………………………………………………….45

Fig. 4.8 – Limfosarcom. Limfonod popliteu. Col. MGG, x1000…………………………………45

Fig. 4.9 – Limfosarcom. Limfonod popliteu. Sinusuri subcapsulare infiltrate cu limfocite

tumorale.Col. HEA, x 40………………………………………………………………………………………46

Fig. 4.10 – Limfosarcom. Limfonod popliteu. Col. HEA, x 1000……………………………….46

Fig. 4.11 – Limfosarcom. Limfonod popliteu. Col. HEA, x 200…………………………………47

Fig. 4.12 – Limfosarcom. Limfonod popliteu. Col. HEA, x 400…………………………………47

Fig. 4.13 – Câine. Limfonod inghinal. Col Giemsa, x 400…………………………………………49

Fig. 4.14 – Câine. Limfonod inghinal. Col HEA, x 1000…………………………………………..50

Fig. 4.15 – Câine. Limfonod inghinal. Col HEA, x 1000…………………………………………..50

Fig. 4.16 – Câine. Plasmocitom. Limfonod. Col. HEA, x 400……………………………………52

Fig. 4.17 – Câine. Plasmocitom. Limfonod. Col. HEA, x 400……………………………………52

Fig. 4.18 – Câine. Limfonod mediastinal. Metastază melanom malign. Col. HEA, x 100……………………………………………………………………………………………………………………..54

Fig. 4.19 – Câine. Limfonod mediastinal. Metastaza melanom malign. Col. HEA, x 400……………………………………………………………………………………………………………………..54

Fig. 4.20 – Câine. Metastază a adenocarcinomului mamar pectoral în limfonodul axilar…………………………………………………………………………………………………………………..55

Fig. 4.21 – Metastază adenocarcinomatoasă în limfonodul axilar. Col. HEA, x 400………56

Fig. 4.22 – Infiltrat tumoral subcapsular. Limfonod axilar. Col. HEA, x 400………………..56

LISTA TABELELOR

Tabelul 1.1 – Combinații de chimioterapice utilizate în terapia limfomului canin…………18

Tabelul 1.2 – Protocoale de ultimă alternativă în limfom……………………………………………18

Tabelul 1.3 – Protocolul COAP……………………………………………………………………………….19

Tabelul 1.4 – Protocoale aplicate în limfom……………………………………………………………..20

INTRODUCERE

Oncologia este ramura științei medicale, care se ocupă de studierea etiologiei, patogenezei, diagnosticului, simptomatologiei, tratamentului, și a prevenției cancerului.

Incidența tumorilor în rândul animalelor de companie a crescut semnificativ în ultimii ani. Tumora rezultă din transformarea celulelor normale în celule maligne anormale, evoluând sub diferite forme. Unele forme tumorale implică dezvoltarea unor formașiuni solide, altele afectează sângele sau măduva osoasă, iar alte forme implică țesuturile limfoide. Acestea se pot dezvolta în orice sistem sau organ din organismul animal. În formele avansate de boală, aceste celule diseminează sau metastazează în alte regiuni (sisteme sau organe), ele putându-se răspândi în țesuturile învecinate sau în sistemul sangvin și limfatic. Simptomele, tratamentul și prognosticul variază în funcție de tipul tumorei și de situația prezentă.

Una dintre cele mai des întâlnite forme tumorale la carnivore este limfomul malign (limfosarcomul). Acesta afectează țesuturile limfoid sau organele ce conțin acest tip de țesut (splină, ficat, timus, măduva osoasă, etc.)

Din păcate, etiologia celor mai multe forme tumorale la carnivore rămâne în continuare necunoscută și, prin urmare, prevenția este dificilă.

PARTEA I

DATE BIBLIOGRAFICE PRIVIND MORFOLOGIA TUMORILOR ȚESUTURILOR LIMFOIDE LA CARNIVORE

CAPITOLUL I

PARTICULARITĂȚI MORFOLOGICE ALE LIMFOAMELOR LA

CARNIVORE

Limfomul este unul dintre cele mai des întâlnite forme de cancer care afectează limfocentrii și alte organe care conțin țesut limfoid (www.vet-magazin.ro). Conceptul de limfom malign cuprinde boli care, în trecut, aveau individualitate clinică: limfosarcomul, reticulosarcomul, tumora Burkitt, boala Brill-Symmers (www.boli-medicina.com). La câine, termenul cel mai des întâlnit este limfom malign sau limfosarcom, care este o boală progresivă și multisistemică, ce se datorează expansiunii celulelor maligne din măduva osoasă, timus, limfocentrii, ficat, splină și alte țesuturi (www.vet-magazin.ro).

Ca și incidență, cancerele limfocitare ocupă locul trei in oncologia canină, limfomul fiind cel mai comun. Se apreciază însa, că femelele care au fost diagnosticate cu această afecțiune supraviețuiesc un interval mai lung de timp decât masculii aflați într-o situație similară. Limfoamele pot afecta câinele la orice varstă, însă se întalnesc cel mai frecvent la subiecții trecuți de cinci ani. În cazul pisicilor, limfoamele se clasifică în funcție de zona afectată. Dacă la câine, cea mai frecventă formă este cea multicentrică, implicând în primul rând limfonodulii periferici, la feline, forma intestinală (alimentară) este comună, putând fi afectată însa, orice zonă unde există țesut limfatic. În trecut, înainte de aplicarea pe scară largă a vaccinarii antileucemice la pisici, predomina o formă mediastinală de limfom (www.veterinarul.ro).

Limfoamele se pot clasifica în funcție de:

Aspectul citologic: bine diferențiate (limfocitice) și slab diferențiate (limfoblastice).

Distribuția tumorilor: foliculare și difuze.

Organele afectate: timice, cutanate, multicentrice.

Tipul de limfocite: limfocite B, limfocite T, celule NK.

Acute si cronice (www.wikivet.net).

Deși există numeroase clasificări care încadrează în mod precis limfoamele pe subcategorii (de exemplu, clasificarea WHO publicată în 2001), în practica curentă acestea sunt împărțite în limfoame non-Hodgkiniene și boala Hodgkin.

Cauzele apariției limfoamelor sunt multiple și incomplet elucidate: se face referire la caracterul ereditar al afecțiunii (de exemplu, anomaliile cromozomiale), dar se consideră de asemenea, că apariția populațiilor de limfocite maligne este indusă viral :se apreciază în cazul canidelor existența unui virus asemănător celui responsabil de producerea leucemiei feline (www.veterinarul.ro).

Sunt suspectate și alte cauze, cum ar fi:

de mediu: expunerea la ierbicide, la radiații magnetice.

disfuncțiile imune (www.vet-magazin.ro).

Simptomele limfomului sunt legate de localizarea tumorii (sau tumorilor). În funcție de localizarea acestora, semnele clinice diferă. Când limfomul este localizat la nivel gastrointestinal, semnele clince ale bolii sunt reprezentate de vomituriții repetate, diaree, pierdere în greutate și lipsa apetitului. În forma mediastinală (localizare toracică), se observă dificultăți de respirație și zgomote cardiace supraadăugate. Forma cutanată poate prezenta noduli unici sau multipli la nivelul pielii sau a cavității bucale. Aceste deformări ale suprafeței pot fi însoțite de prurit, eritem sau ulcerații. Limfomul mai poate avea localizare cardiacă, oculară sau osoasă. Limfomul generalizat nu produce durere, cu excepția cazului în care este cuprins și sistemul osos. Rar, se poate localiza și la nivelul sistemului nervos central (www.medicalvet.ro).

Din punct de vedere microscopic, limfomul se caracterizează printr-o populație de celule distincte, cu numeroase limfoblaste, celule cu nuclei măriți și nucleoli proeminenți, bazofile cu citoplasmă redusă, cu o rată mitotică crescută (www.wikivet.net). Un aspect normal constă în 75-95% (de obicei 90%) în limfocite de dimensiuni mici; un limfocit de dimensiuni mici este ușor mai mare decat o hematie la câine, și de 1.5-2 ori mai mare decat o hematie la pisică. Celelalte tipuri de celule sunt prezente în numar mic: limfoblaste, prolimfocite, neutrofile, macrofage, etc (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004). Limfoblastele normale au dimensiuni mai mari decât limfocitele mici normale (Harvey, L., Atlas of veterinary hematology, 2001). Limfomul este recunoscut citologic prin raportul dintre limfoblaste și limfocite. Când sunt prezente mai mult de 50% limfoblaste, diagnosticul de limfom este sigur (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004).

Diagnosticul de limfom se bazează pe rezultatele examenului fizic și examenlului citologic. Efectuarea examenului citologic este unicul diagnostic de certitudine. Biopsia limfocentrilor sau organelor afectate confirmă diagnosticul. Hemoleucograma, biochimia serului, analiza urinei, radiografiile și/sau examene cu ultrasunete (ecografice) sunt efectuate, în general, pentru a evalua starea de sănătate și de a determina implicarea altor organe (www.medicalvet.ro).

Stadiul bolii este foarte important pentru tratament și prognostic, fiecare stadiu fiind însoțit de simptome sistemice.

Stadiul I: doar un limfocentru afectat sau țesut limfoid într-un organ afectat.

Stadiul II: limfocentrii dintr-o anumită zonă.

Stadiul III: implicarea tuturor limfocentrilor.

Stadiul IV: toți limfocentrii sunt afectați plus ficatul sau splina.

Stadiul V: toți limfocentrii sunt afectați plus măduva osoasă (www.vet-magazin.ro).

Tratamentul constă, de obicei, în chimioterapie. În aproape toate cazurile se administrează o combinație de medicamente, pe parcursul a mai multor săptămâni (www.medicalvet.ro). Vindecarea completă este rară, dar există tratam Secrets, 2004).

Diagnosticul de limfom se bazează pe rezultatele examenului fizic și examenlului citologic. Efectuarea examenului citologic este unicul diagnostic de certitudine. Biopsia limfocentrilor sau organelor afectate confirmă diagnosticul. Hemoleucograma, biochimia serului, analiza urinei, radiografiile și/sau examene cu ultrasunete (ecografice) sunt efectuate, în general, pentru a evalua starea de sănătate și de a determina implicarea altor organe (www.medicalvet.ro).

Stadiul bolii este foarte important pentru tratament și prognostic, fiecare stadiu fiind însoțit de simptome sistemice.

Stadiul I: doar un limfocentru afectat sau țesut limfoid într-un organ afectat.

Stadiul II: limfocentrii dintr-o anumită zonă.

Stadiul III: implicarea tuturor limfocentrilor.

Stadiul IV: toți limfocentrii sunt afectați plus ficatul sau splina.

Stadiul V: toți limfocentrii sunt afectați plus măduva osoasă (www.vet-magazin.ro).

Tratamentul constă, de obicei, în chimioterapie. În aproape toate cazurile se administrează o combinație de medicamente, pe parcursul a mai multor săptămâni (www.medicalvet.ro). Vindecarea completă este rară, dar există tratamente care au dus la perioade lungi de remisie. Media primei remisii este de 6-8 luni. Cea de-a doua remisie este mult mai scurtă și mult mai greu de obținut. Media de supraviețuire din momentul diagnosticării, cu tratament este de 9-12 luni.

Când costul tratamentului contează, Prednisone-ul, folosit singur, poate să îmbunătațească simptomele într-un mod spectaculos, dar nu ajută și la rata de supraviețuire. Dacă analizăm rata de supraviețuire al unui câine tratat cu Prednisone, față de unul netratat putem constata că ambele sunt la fel, de una-două luni. Folosirea Prednisone-ului ca și tratament singular o perioadă, poate duce la rezistența și față de alte chimioterapice.

S-a constatat faptul că femelele răspund mai bine la tratament, decât masculii, iar câinii de talie mică par să răspundă mai bine decât cei de talie mare (www.vet-magazin.ro).

1.1 Limfomul canin

Între 15 % și 20 % din tumorile maligne la câini sunt limfoame. Limfomul afectează în primul rând câinii adulți și seniori. Nu pare să fie o predilecție de sex. Rasele de Golden Retriever, Boxer, Bullmastiff, Basset, Saint Bernard, Scotish Terrier, Airedales și Bulldog par a avea un risc crescut de a face limfoame. Numai 10 % până la 20 % din câini sunt bolnavi când li se pune diagnosticul; majoritatea sunt aduși la medicul veterinar din cauza inflamației limfonodurilor (www.medicalvet.ro).

1.1.1 Etiologie

Nu se cunoaște etiopatogeneza (cauzele) limfoamelor la câine. Unii autori aduc în discuție o posibilă corelație genetică, însă trebuie efectuate studii suplimentare pentru a determina factorii de risc implicați în limfomul canin. Câinii care au un sistem imunitar reprimat par a fi supuși unui risc mai mare (www.medicalvet.ro).

De asemenea, legat de apariția limfoamelor la câine se face referire, tot mai frecvent, la caracterul ereditar al afecțiunii, aserțiune susținută de existența, la unii dintre subiecții afectați de această formă de cancer, a unor disfuncționalitați în codarea unei gene responsabile de supresia tumorală. În lumina acestor elemente se suspicionează că transformarea malignă a limfocitelor s-ar datora inițial prezenței țesutului limfoid compromis de defecte genetice, iradiere, agenți imunosupresori sau a unor disfuncționalitați de ordin imunitar, elemente care predispun subiectul acțiunii carcinogenilor (www.veterinarul.ro).

1.1.2. Simptomatologie

Limfomul canin este un cancer heterogen, cu o simptomatologie variată care depinde în principal de regiunile și/sau organele afectate de boală.

Un prim simptom nedureros al limfomului malign este limfoadenopatia. Odată cu apariția acesteia, celule maligne se pot infiltra în alte organe, precum ficat, splină, măduva osoasă.

Odată cu evoluția tumorilor maligne în diferite organe se pot observa și alte simptome cum ar fi: depresie, letargie, febră, deshidratare, pierderi în greutate, inapetență, anorexie, diaree, vomă, constipație, melenă, distensie abdominală, polidipsie, poliurie, dispnee, alopecie, prurit, dezorientare, ataxie, schimbări comportamentale. Limfomul este cel mai comun tip de cancer care provoacă hipercalcemie la câine (www.vet-magazin.ro). La 15% din câinii cu limfom, nivelul calciului din sânge va fi mai mare decât valorile normale (www.medicalvet.ro).

La câine, limfomul poate evolua sub patru forme, caracterizate, pe langă manifestari particulare specifice, și prin simptome generale (febră, scadere ponderală, anorexie).

A) Limfom multicentric, ce afectează, în mod difuz, limfonodulii/organele limfoide, într-o proporție însemnată. Cel mai evident simptom îl constituie adenopatia, limfonodulii (cervicali, axilari și invinali) fiind măriți, nedureroși (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la câine și pisică, 2007). Hipertrofierea excesivă a tonsilelor poate cauza disfagie, concomitent cu îngreunarea drenajului limfatic, aspect tradus clinic prin incapacitatea de a degluti saliva, care se va scurge pe membrele anterioare (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la căine și pisică, 2007).

B) Limfom alimentar, localizat strict în sfera tubului digestiv, boala evoluând mult timp sub forma unui sindrom sub – ocluziv. Pe langă simptomatologia specifică îngustarii lumenului intestinal, câinii afectați se emaciază, datorită malabsorbției.

C) Limfom mediastinal, foarte rar la câine, a cărui dezvoltare implică timusul. Simptomatologia este circumscrisă de sindromul mediastinal (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la căine și pisică, 2007). Limfomul mediastinal are un prognostic mai slab decât celelalte, mai ales cel în care este întâlnită și hipercalcemia (www.vet-magazin.ro). S-a estimat ca 10-40% din câinii cu limfom mediastinal prezintă hipercalcemie (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004).

D) Limfom cutanat, ce afectează în principal pielea și limfonodulii superficiali și care se caracterizează clinic prin apariția a numeroase placarde rozacee care se dezvoltă la nivel cutanat (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la câine și pisică, 2007). Limfomul cutanat este un tip de cancer mai rar întâlnit. El poate fi clasificat ca epiteliotrop sau non-epiteliotrop. Forma epiteliotropă este forma tip T (mai este numită și micoza fungică), iar forma non-epiteliotropă este forma tip B. Forma epiteliotropă apare ca orice inflamație la nivelul pielii, care progresează în noduli și plăgi. Forma non-epiteliotropă poate avea o varietate mult mai mare de manifestări, de la un simplu nodul până la zone de ulcerații și căderi masive de păr (www.vet-magazin.ro). Limfomul cutanat poate sa apară și la nivelul cavitații bucale, fiind adesea confundată în primele stadii cu gingivita (www.vet.purdue.edu).

E) Limfomul extranodal, formă rară, descrisă ca o formațiune (sau mai multe) care pot apărea la nivelul: rinichilor, ochilor, SNC. Limfomul ocular în 20-25% dintre cazuri poate duce la glaucom, sângerări oculare, desprinderi de retină și orbire. În cazul limfosarcomului de SNC, ca și simptome putem întâlnii convulsii și paralizii (www.vet-magazin.ro).

1.1.3. Aspecte morfopatologice

Limfonodurile periferice și interne sunt mărite în volum (forma multicentrică) și nedureroase la palpare. Limfonodurile afectate au un grad crescut de mobilitate, consistență ușor ridicată și fără demarcare cortico-medulară. Adesea se asociază cu hepatomegalie și splenomegalie. În forma gastro-intestinală sunt afectați nodulii mezenterici (www.merkvetmanual.com).

1.1.4. Diagnostic

Diagnosticul se bazează pe biopsie urmată de examinarea microscopică a țesutului limfoid și pe examenul hematologic. Probele se recoltează din mai multe limfonoduri, preferabil din limfonodurile prescapulare sau poplitee. Se identifică o populație monomorfică de celule limfoide, de dimensiuni mari (limfoblaste), medii sau mici. Folosirea anticorpilor specifici permite identificarea limfocitelor B și T (www.veterinarul.ro).

Din punct de vedere citologic, limfomul cutanat este descris ca o populație uniformă de limfoblaste cu nucleu de formă ovală sau variabilă, având cromatină granulară si 1-3 nucleoli. Citoplasma, în cantitate puțină, este bazofilă. Ocazional, limfoblastele pot apare ca histiocite.

Analizele hematologice pot indica anemia. Aceasta este de regula normocitară, normocromă, nonregenerativă. Neutrofilia este prezentă la 25-40% din cazuri și trombocitopenia la 35-50% din cazuri. Dacă stadiul este avansat și cuprinde ficatul, se pot observa și creșteri ale ALT și AST (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004).

1.1.5. Tratament

Limfomul reprezintă tipul de cancer cel mai intens studiat în oncologia canină. În această situație, tratamentul presupune asocierea a mai multor agenți citotoxici, cu mecanisme de acțiune diferite și a căror toxicitate nu se suprapune, prevenindu-se astfel dezvoltarea unei noi generații de celule maligne, rezistente la terapie (www.veterinarul.ro). Tratamentul constă, de obicei, într-o combinație de medicamente orale și injectabile administrate săptămânal. Unele medicamente utilizate în mod obișnuit includ ciclofosfamidă, vincristină, doxorubicină și prednisolon. Protocolul va fi adoptat de medicul veterinar.

Unii proprietari aleg să nu ofere tratament câinilor care dezvoltă limfom. Speranța de viață a acestor câini cu limfom generalizat (stadiile III, IV sau V) este, în medie, de la 4 la 6 săptămâni (www.medicalvet.ro).

Tratamentul standard recurge la 5 substanțe citotoxice, administrate în diverse combinații (vincristină, L-asparaginază, prednison, ciclofosfamidă si doxorubicină), timp de nouă săptămâni. Dacă acest prim tratament (de inducție) are succes, se va continua cu un tratament de întreținere pentru o perioadă de minimum doi ani. Chimioterapia constituie alegerea optimă în cazul limfoamelor multicentrice, înregistrându-se o rată de remisie de 70-95%, pe perioada căreia subiecții nu manifestă niciun fel de simptom. Datorită faptului că în multe dintre cazuri chimioterapia este bine tolerată de către pacient, calitatea vieții acestuia se îmbunătățește considerabil pe perioda remisiei. Actualmente, există o multitudine de protocoale indicate în terapia limfomului la câine, dar indiferent de protocolul aplicat, la majoritatea pacienților remisiunea dispare în medie dupa 6-9 luni de la inițiere (minimum câteva săptămâni; maximum ani). În majoritatea cazurilor, remisia poate fi reindusă prin reaplicarea protocolului terapeutic. După cea de-a doua, respectiv a treia pierdere a stării de remisie, rata subiecților care răspund pozitiv la terapie scade simțitor. Această lipsă de receptivitate se datorează, în principal, dobândirii de catre celulele maligne a rezistenței fată de agenții citotoxici (www.veterinarul.ro). Câteva dintre posibilitățile terapeutice aplicate în limfomul canin sunt prezentate in Tabelul 1.1.

Tabelul 1.1

Combinații de chimioterapice utilizate în terapia limfomului canin

(www.veterinarul.ro)

În principiu, este de așteptat ca după o perioadă de recurență, majoritatea limfoamelor să recidiveze. În aceste situații se recomandă a se recurge la unul dintre urmatoarele protocoale (Tabelul 1.2).

Tabelul 1.2

Protocoale de ultimă alternativă în limfom

(www.veterinarul.ro)

Câinii tratați inițial recurgându-se la protocolul COP (terapie combinată: ciclofosfamidă + vincristină + prednison) sau COAP (COP + citozin-arabinozidă), sunt supuși, după scurgerea a opt săptămâni de terapie de inducție, la o terapie de întreținere a remisiei, constând în aplicarea protocolului LMP (metotrexat + clorambucil + prednison) pe toată perioada în care remisia persistă (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la câine și pisică, 2007).

Protocolul COAP este detaliat in Tabelul 1.3.

Tabelul 1.3

Protocolul COAP

(www.veterinalul.ro)

În situația în care la sfârșitul celor opt săptmâni de terapie COAP nu se induce remisia totală sau în situația în care remisia se pierde, în cursul aplicării protocolului LMP, se administrează adițional (la LMP) vincristină 0,5 mg/m2, tot la 2 săptămâni, alternativ cu clorambucil. În cazul în care, nici în acest context, remisia nu poate fi indusă, doza este crescută la 0,75 mg/ m2.

Prin includerea în terapie, alături de protocolul LMP, a vincristinei, remisia poate fi menținută o lunga perioadă de timp. În cazul în care remisia se pierde, creșterea dozei de vincristină nu este suficientă pentru menținerea acesteia, impunându-se un nou protocol de inducție. În cazul câinilor supuși unei inducții conținând doxorubicină (ex. protocolul Wisconsin-Madison, timp de 19 săptmâni), în situația în care subiectul se află în remisie completă, la sfârșitul terapiei, nu este necesar tratament de întreținere. Urmatoarele combinații terapeutice induc remisia in 75- 80% dintre cazuri, durata medie fiind de 175-369 zile, iar supraviețuirea în medie un an (excepție fac limfoamele cu LT) (www.veterinarul.ro).

O parte dintre protocoalele mai des aplicate ca inductoare ale remisiei în limfomul canin, au fost sintetizate in Tabelul 1.4.

Tabelul 1.4

Protocoale aplicate în limfom

(www.veterinarul.ro)

În interpretarea acestuia se va ține cont de faptul că în situațiile în care două protocoale sunt compuse din aceleași citotoxice, există diferențe legate fie de frecvența de administrare, fie în legatură cu doza acestora. În momentul pierderii stării de remisie, terapia de 19 săptămâni va fi reinițiată. În cel de-al doilea ciclu terapeutic se va ține cont de toxicitatea doxorubicinei, aceasta fiind substituită cu actinomicina-D sau mitoxantrona. După obținerea pentru a doua oară a remisiunii, în general, se recurge la protocolul LMP (+/- vincristină), pentru menținere. În situația în care nu poate fi indusă cea de a doua remisie sau aceasta s-a pierdut, ori în cazul în care subiectul nu răspunde la primul protocol, se va iniția un nou protocol, fară doxorubicină (Morris J., Dobson J., Small Animal Oncology, 2001).

O altă alternativă terapeutică o reprezintă asparginaza, care administrată ca agent citotoxic unic, induce în majoritatea cazurilor o remisiune completă, dar de scurtă durată, motiv pentru care se impune asocierea cu alți agenți. În principiu, acest citostatic, a carui administrare este limitată la 2- 3 ședințe, va fi utilizat doar în situațiile extreme. Asparginaza este contraindicată la câinii cu posibile afecțiuni pancreatice.

Radioterapia urmată de transplant de maduvă constituie o metodă modernă, foarte utilă în terapia limfoamelor multicentrice. În lipsa tratamentului, câinii afectați de limfom sucombă într-un interval de 4-6 săptămâni de la diagnosticarea afecțiunii. Se apreciază că limfoamele dezvoltate din LT sunt mult mai agresive și beneficiază de un prognostic negativ, în comparație cu cele care au la bază malignizarea LB. Terapia induce remisiunea tumorală în aproximativ 90% dintre cazuri, durata acesteia fiind in concordanță cu terapia aplicată. Administrarea prednisonului, de pildă, în monoterapie, ameliorează calitatea vieții subiectului pe un interval de circa 30 de zile. Asocierea acestuia cu ciclofosfamida, dublează acest interval (www.veterinarul.ro).

Terapia cu prednison oral poate reduce inflamațiile și disconfortul, dar durata de viață nu se va prelungi semnificativ. De asemenea, trebuie remarcat faptul că tratamentul cu prednison oral înainte de chimioterapie nu este recomandată, putând reduce eficacitatea chimioterapiei.

Câinii supuși tratamentelor cu chimioterapice au o speranță de viață mai mare, putându-se extinde la un an, poate chiar mai mult. În cazul în care un câinele tolerează chimioterapia (ceea ce se intamplă la majoritatea), calitatea vieții este îmbunătățită pe perioada de tratament. Chimioterapia pentru limfom la câine este considerat unul dintre tratamentele de cancer de succes. Din moment ce un an reprezintă aproape 10% din durata de viață a unui câine, creșterea speranței de viață în urma tratamentului limfomului este considerată o reușită (www.medicalvet.ro).

1.1.6. Prevenție

Datele acumulate evidențiază legatura existentă între apariția limfomului și anumite deficiențe ale sistemului imun sau imunodepresie. În consecință, prevenția limfomului impune protejarea subiecților predispuși (imunodeficiența sau autoimunopatii) de influența carcinogenilor (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la câine și pisică, 2007).

1.2. Limfomul felin

Ca și la canide, limfomul la feline se clasifică în funcție de tipul de țesut afectat:

Alimentar: afectează stomacul și/sau intestinele.

Mediastinal: afectează țesutul limfatic din cavitatea toracică.

Multicentric (nodal): sunt afectatate mai multe limfonoduri, deseori și alte țesuturi.

Extranodal: sunt afectate alte tipuri de țesuturi, aceste limfoame fiind greu integrate în celelalte categorii; sunt afectați rinchii, cavitatea nazală, encefalul, etc (www.icatcare.org).

1.2.1. Etiologie

Limfomul apare la pisicile de varstă medie și înaintată (www.petplace.com). Cu toate că nu se cunosc rase mai predispuse la îmbolnavire decat altele, este documentat faptul că pisicile Siameze sunt mai predispuse la apariția limfomului mediastinal (www.marvistavet.com). Femelele și masculii sunt afectați în mod egal.

Pisicile nevaccinate de curte au un risc mai mare decat pisicile de apartament de a contracta virusul leucemiei feline (www.vet.cornell.edu).

Pisicile infectate cu virusul leucemiei feline (FeLV) si virusul imunodeficienței feline (FIV) au un risc crescut de dezvoltare a limfoamelor. Pisicile infectate cu FeLV deseori dezvoltă limfom la vârste fragede (www.petplace.com).

Adesea este cauzat de virusul leucemiei feline, retrovirus din familia Oncovirinae. Exista 4 subgrupe cu importantă clinică. Marea majoritate a pisicilor sunt infectate cu FeLV-A, forma arhetipală a virusului. Noi forme mutante ale formei originale (FeLV-B, FeLV-C, FeLV-T) se pot dezvolta de asemenea la pisici. FeLV-B este raspunzător de apariția neoplasmelor, FeLV-C este asociat cu apariția hipoplaziei eritroide (și consecutiv cu anemia severă) și FeLV-T infectează și distruge limfocitele de tip T. Aceste subtipuri se detectează (dar nu se diferențiază) cu ajutorul kiturilor/testelor de depistare a FeLV (www.merkvetmanual.com).

Există numeroase cazuri de limfom apărut la pisici neinfectate cu FeLV și astfel se suspectează totodată și o predispoziție genetică (www.felinelymphoma.org).

Cercetările recente demonstrează riscul crescut de formare a limfomului la pisicile crescute într-un mediu poluat cu fum de țigară. Mecanismul apariției nu este complet elucidat (www.petplace.com).

1.2.2. Simptome

Afecțiunile asociate cu FeLV sunt numeroase și cuprind: anemie, neoplasm, imunosupresie, boli autoimune, boli ale sistemului reproducător, enterită, stomatită, disfuncții neurologice. Anemia cauzată de FeLV este normocromă și nonregenerativă (deoarece maduva roșie hematogenă este afectată de infecția virală și implicit celulele stem hematopoietice). Se observă totodată și trombocitopenie și neutropenie (www.merkvetmanual.com).

Hipoalbuminemia este considerată un semn constant al limfomului (www.vetbook.org). Asociată cu hipoproteinemia, indică un limfom alimentar sau renal. Hipercalcemia este rară la feline (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004).

Imunosupresia determinată de FeLV determină un risc crescut de infecții secundare bacteriene, micotice și virale. S-au constat la pisicile infectate cu FeLV concentrații scăzute de complement în sânge, ceea ce duce la creșterea oncogenității virusului. Complexele imune formate în prezența unei cantități medii de antigen determină vasculită sistemică, glomerulonefrită, poliartrită, etc. Probleme reproductive sunt în mod frecvent asociate cu infecția FeLV. Avortul, involuția placentară, asociate cu endometrita sunt des semnalate (www.merkvetmanual.com).

Simptomele la pisicile afectate de limfom depind în primul rând de locația tumorii. În general, se remarcă limfonoduri mârite, apatie, vomă, diaree, apetit redus/absent, scăderea greutații (www.petplace.com).

Forma multicentrică, spre deosebire de canide, este mult mai rară la pisici (www.felinelymphoma.org). Apare cu implicarea majorității limfonodurilor, frecvent a splinei și ficatului.

1) Limfomul gastro-intestinal (alimentar) apare la pisicile în vârstă de 9-13 ani, cu un istoric medical în care predomină voma, diareea și/sau scăderea în greutate. Apetitul la aceste pisici variază: poate fi normal, excesiv, redus sau absent. Se caracterizează prin prezența unei tumori (sau a mai multor) la nivelul intestinului, care poate determina obstrucții intestinale. Este cea mai des intalnită formă de limfom la pisici.

2) Limfomul renal este una din cele mai agresive forme de limfom la pisici. Simptomele sunt asemănătoare cu cele ale unei insuficiențe renale: polidipsie, poliurie, apetit scăzut, scădere în greutate, uneori vomă. Spre deosebire de cazurile tipice de insuficiență renală, unde rinichii au un volum scăzut, la pisicile cu limfom renal se remarcă volumul mărit al rinichilor. Pot fi FeLV pozitive.

Pisicile cu limfom mediastinal au vârste cuprinse de regulă între 2 și 5 ani, sunt FeLV pozitive și prezintă dispnee, tahipnee. Această formă de limfom este rară. La fel de rar este limfomul nazal, caracterizat prin dispnee, strănut și jetaj (www.marvistavet.com).

Limfomul SNC apare mai des la pisicile tinere, mai mici de 3 ani, FeLV pozitive. Afectează de regulă maduva spinarii, ducând la o sensibilitate a trenului posterior, paralizie (www.langvordvet.co.uk).

1.2.3. Leziuni

Limfomul alimentar este caracterizat de prezența unei tumori (sau a mai multor) la nivelul tubului digestiv postdiafragmatic sau de o infiltrație a celulor tumorale în peretele tubului digestiv (www.marvistavet.com). Ecografia abdominală este utilă în evidențierea îngroșarii peretelui tubului digestiv, numărul și mărimea maselor tumorale. Din punct de vedere histopatologic, limfomul se diferențiază în limfomul limfocitic (celule mici, bine diferențiate) și cel limfoblastic (celule mari). Această diferențiere este utilă în stabilirea planului terapeutic (www.ncbi.nlm.nih.gov). Se clasifică de asemenea în limfom în stadiu avansat, manifestat cu tumori focale și multi-focale, cuprinzând des ficatul, splina, limfonodurile învecinate și stadiul neavansat, asociat mai mult cu infiltrația difuză a celulelor tumorale (www.langvordvet.co.uk).

Spre deosebire de celelalte forme, limfomul nazal se caracterizează prin prezența unei tumori localizate (www.langvordvet.co.uk).

Forma mediastinală afectează timusul și limfonodurile sternale. De regulă, mediastinul este ocupat de o masă tumorală omogenă, de consistență moale sau ridicată, care înconjoară inima (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.2.4. Diagnostic

Diagnosticul de limfom la pisici se bazează pe rezultatele examenului fizic și examentului citologic. Hemoleucograma, biochimia serului, analiza urinei, radiografiile și/sau examenele cu ultrasunete (ecografice) sunt efectuate, în general, pentru a evalua starea de sănătate a pisicii și de a determina implicarea altor organe. Testarea pentru FeLV și FIV poate arăta că o pisică este pozitivă pentru una sau ambele dintre aceste boli (www.medicalvet.ro)

În practica curentă sunt des folosite 3 teste: ELISA, IFA (imunofluorescența) și PCR (www.merkvetmanual.com).

1.2.5. Tratament

Tratamentul constă, de obicei, în chimioterapie. În aproape toate cazurile se administrează o combinație de medicamente, pe parcursul a mai multor săptămâni. Aceste medicamente pot include clorambucil , doxorubicină, ciclofosfamidă, vincristină, L – asparginasă și prednisolon sau prednison. În unele cazuri, cum ar fi pisicile cu limfom nazal, poate fi utilizată radioterapia. În general, pisicile tolerază chimioterapia foarte bine (www.medicalvet.ro).

Ca și în cazul câinelui, există o serie de alternative, care pot fi aplicate în funcție de situație:

Protocolul COP (ciclofosfamidă + vincristină + prednison), care induce o remisie a cărei durată poate ajunge la un an și chiar să depășească acest interval;

Ciclofosfamidă + vincristină + metotrexat cu o durată medie de supraviețuire de 12 săptmâni;

CHOP-like protocol (COP + doxorubicină + L-asparaginază + metotrexat), care poate induce remisii de până la 40 de săptămâni;

În limfoamele intestinale se poate recurge la chimioterapia prednison + clorambucil, obținându-se remisiuni complete de pâna 20 de luni.

Pisicile cu limfom, tratate exclusiv cu prednison au o speranță de viață de 45-60 de zile. Remisia și rata de supraviețuire a pisicilor cu limfom variază în funcție de prezența FeLV, localizarea tumorii/tumorilor, cât și de rapiditatea identificării și tratării bolii. Aproximativ 55-70 % dintre pisici vor avea o remisie completă pentru 20-30 luni. Pisicile care sunt infectate cu FeLV sau FIV au o rată mai scăzută de răspuns la terapie, precum și un timp mai scurt de supraviețuire după tratament.

Preventiv, trebuie să se ia în considerare vaccinarea contra FeLV (www.medicalvet.ro).

1.3. Limfomul Hodgkin

Limfomul Hodgkin este o formă rară de cancer, fiind o tumoră malignă a limfonodurilor, afectând rar țesutul limfoid extranodal (www.pathologyatlas.ro). Limfomul Hodgkin a fost descris la câini, pisici, cai, șoareci, șobolani, dihori (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004). Cu toate acestea, în stadiile avansate, se extinde sistemic. Clinic, limfomul Hodgkin se stadializează după clasificarea Ann Arbor:

Stadiul I – Localizare într-un singur grup ganglionar sau un singur organ extralimfatic

Stadiul II- Localizare în două sau mai multe grupe ganglionare de aceeași parte a diafragmului

Stadiul III- Localizare în grupe ganglionare de o parte și de alta a diafragmului, +/- localizare splenică

Stadiul IV- Localizare difuză sau diseminată în organe extralimfatice: ficat, splină (www.epathology.ro)

Limfomul Hodgkin reprezintă o proliferare neoplazică a celulelor limfoide, implicând țesuturile limfoide. Celula malignă este celula Reed-Sternberg (R-S), celule esențiale pentru diagnosticarea limfomului Hodgkin. Cu toate că prezența lor este necesară pentru diagnostic, ele nu sunt specifice acestui tip de limfom, așadar nu sunt suficiente pentru stabilirea clară a diagnosticului.

Sunt separate de limfoamele non-Hodgkin datorită aspectului histologic distinct și manifestării clinice (www.med-ed.virginia.edu).

Celulele limfoide ce declanșează boala Hodgkin aparțin regiunii paracorticale a limfonodulilor. (Borbil S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la câine și pisică, 2007).

1.3.1. Etiologie

Etiologia limfomului Hodgkin nu este cunoscută. Cu toate acestea, prezintă risc crescut organismele cu sistemul imun compromis, care urmează un tratement cu imunosupresoare sau cele infectate cu virusul Epstein-Barr (www.nhs.uk). De asememea poluarea atmosferică, poluarea solului cu pesticide și aberațiile cromozomiale conduc la un risc crescut de îmbolnavire (www.merkvetmanual.com).

1.3.2. Manifestari clinice

În limfomul Hodgkin, limfocitele de tip B încep să se înmulțească eratic și să se acumuleze în limfonoduli. Aceștia își pierd proprietățile și devin vulnerabili infecțiilor.

Simptomul caractersitic limfomului Hodgkin este inflamația nedureroasă a limfonodulilor axiali, inghinali și din regiunea gâtului. Inflamația se datorează acumularii treptate a limfocitelor B modificate. Alt simptom specific în limfomul Hodgkins este febra. Totodată se asociază cu scăderea în greutate, apatie (datorită numarului scăzut de golbule roșii) și apetit redus. Au fost raportate cazuri în care au fost semnalate și tahipnee și prurit (www.nhs.uk).

1.3.3. Aspecte citologice

Limfomul Hodgkin este o proliferare tumorală malignă primară a țesutului limfoid ganglionar (foarte rar, extraganglionar) caracterizat histologic prin prezența unei componente tumorale reprezentate de celula Reed-Sternberg (clasică și variante) alături de o componentă reactivă netumorală reprezentată de limfocite normale, eozinofile, plasmocite, histiocite, PMN-uri, vase de neoformație si fibroză.

Clasificarea histologică a limfomului Hodgkin ține cont de arhitectura și de proporția dintre cele două componente:

A) Limfom Hodgkin clasic:

cu scleroză nodulară (60-80% din cazuri)

bogat în limfocite (5 %)

celularitate mixtă (15 – 30 %)

depletie limfocitara (sub 1 %)

B) Limfom Hodgkin nodular cu predominanță limfocitară (www.pathologyatlas.ro).

Limfomul cu scleroză nodulară este cea mai comună formă de limfom Hodgkin, afectând în principal limfonodurile axiale și cele din regiunea gâtului. Limfomul cu celularitate mixtă este o formă tumorală caracteristică limfonodurilor axiale. Limfonodul cu depleție limfocitară este rar și apare de regulă la organismele cu vârstă înaintată. Cand afecțiunea este descoperită, de obicei este într-o formă avansată, când afectează splina si ficatul. Limfomul Hodgkin nodular cu predominanță limfocitară (5% din cazuri) este caracterstic limfonodurilor din regiunea gâtului (www.cancer.org).

1.3.4. Diagnostic

Diagnosticul pentru limfomul Hodgkin este dificil de pus fară extirparea unui întreg ganglion limfatic. Asta se datorează faptului că elementele netumorale (reactive) sunt mult mai numeroase decât cele tumorale (Cowell, R., Veterinary Clinical Pathology Secrets, 2004).

Celula Reed-Sternberg (clasică) reprezintă componenta tumorală a cărei prezență este obligatorie (alături de componenta netumorală) pentru diagnosticul de limfom Hodgkin. Reprezintă aproximativ 1 – 2 % din masa tumorală. În peste 98 % din cazuri, are origine în celula limfocitară de tip B. Caracteristici: dimensiuni de 20 – 50 microni, citoplasmă abundentă, omogenă/fin granulară, amfofilă; 2 nuclei așezați "în oglindă" sau "în ochi de bufniță", cu membrana nucleară groasă prin dispunerea cromatinei nucleare pe fața internă a membranei nucleare. Fiecare nucleu are câte un nucleol mare, eozinofil, cu halou. Componenta netumorală (obligatorie pentru diagnostic) este reprezentată de: limfocite normale, eozinofile, plasmocite, histiocite, PMN-uri, vase de neoformație și fibroză.

Variante ale celulei Reed-Sternberg :

celula Hodgkin (celula Reed-Sternberg mononucleată)

celula Reed-Sternberg lacunară

celula Reed-Sternberg pleomorfă

celula Reed-Sternberg "pop-corn" (limfo-histiocitară)

celula Reed-Sternberg mumificată (www.pathologyatlas.ro).

La anumite variante ale celulei Reed-Sternberg citoplasma eozinofilă se retractă în timpul efectuării frotiului, formând un gol în jurul nucleului, generând un artefact de fixare, ce dă impresia că celula se află într-un spațiu optic vid (celula R-S lacunară). Altă variantă a celulei R-S este cea "pop-corn": prezintă nucleu lobat, cromatină fină și nucleoli mici (www.med-ed.virginia.edu). Sunt celulele canceroase depistate în formă nodulară cu predominanță limfocitară a limfomului Hodgkin (www.cancer.org). Celula R-S mumificată are nucleu compact, fară nucleol, cromatină bazofilă (www.pathologyatlas.ro).

1.3.5. Tratament

Tratamentul are ca scop principal distrugerea celulelor tumorale. Tipurile principale de tratament sunt: radioterapie, chimioterapie sau prin asocierea celor două metode. Planul de tratament se stabilește în funcție de stadiul bolii. Dacă stadiul este incipient se recomandă chimioterapie și radioterapie. Când forma este într-un stadiu avansat se asociază și un tratament steroidian (www.cancerresearchuk.org).

CAPITOLUL II

CADRUL ORGANIZATORIC ÎN CARE S-AU EFECTUAT STUDIILE

Studiul s-a realizat în cadrul Universității de Științe Agricolo și Medicină Veterinară ‘‘Ion Ionescu de la Brad’’ din Iași. Examinarea necropsică, recoltarea și prelucrarea probelor s-a efectuat în cadrul Facultații de Medicină Veterinară, în laboratorul disciplinei de Anatomie Patologică.

În structura laboratorului intră mai multe încăperi, începând cu cea pentru recepția și refrigerarea cadavrelor, sala de necropsie, laboratorul pentru prelucrarea histologică a probelor și cel de microscopie. Organizarea laboratorului de histopatologie este specifică, cuprinzând dulapuri pentru stocarea instrumentarului, coloranților și substanțelor chimice, corpuri suspendate pentru sticlăria de laborator, fișet pentru depozitarea lamelor după prelucrarea și înregistrarea acestora, mese de lucru, faianțe și mese suport pentru aparatură, scaune și chiuvetă din inox.

Apartura din dotare cuprinde: etuvă Binder pentru includerea la parafină, microtom automat rotativ cu reacție SLEE CUT 6062 pentru realizarea secțiunilor, dispersor de parafină SLEE MPS/W, incubator NEMMERT, placă șofantă, baie de flotație termostată Leica, termostat electronic, hotă de absorbție cu sistem electric de ventilație și spațiu de depozitare pentru substanțele volatile CARBO 1200 COMB, centrifugă, balanță analitică, linie de deparafinare succesivă, ceas cu cronometru, cuptor cu microunde, bec de gaz și frigider.

În cursul recoltării, fasonării și prelucrării probelor s-a utilizat instrumentar divers, cuțite, bisturie, pense, foarfece, tăvi metalice, forme de aluminiu (încorporează 10-12 piese simultan) sau casete special dimensionate, băi de colorare. Sticlaria de laborator cuprinde pahare Berzelius, baloane Erlenmeyer, cilindrii gradați, eprubete de diferite dimensiuni, flacoane pentru depozitarea substanțelor utilizate, lame de sticlă port – obiect, lamele.

Prelucrarea histologică necesită utilizarea de substanțe chimice cu rol divers: coloranți (Hematoxilină, Eozină, Albastru de metil (HEA), Acid Periodic, Fuxină Schiff), fixatori (Formaldehidă), soluții alcoolice de deferite concentrații, lichid Bouin, xilen, acizi, apă distilată și apă litinată.

Laboratorul de microscopie cuprinde un microscop optic, unul elecronic și o cameră foto digitală ce permite înregistrarea imaginilor histologice observate la microscop, în formă electronică și un computer.

După realizarea examenului necropsic, recoltarea și fixarea în soluție de formaldehidă 10%, fragmentele au fost încorporate în parafină cu ajutorul procesorului de țesuturi Leica TP1020. Secționarea la dimensiunea 5 – 6 µm s-a realizat cu microtomul SLEE CUT 6062. După o prealabilă deparafinare și rehidratare s-a realizat colorarea secțiunilor, prin metoda tricromică Masson (H.E.A.) sau P.A.S.. Analizarea lamelor astfel obținute, s-a realizat cu microscopul optic Leica DM 750, la care este atașată o cameră foto digitală Leica ICC50 HD. Finalizarea imaginilor obținute s-a realizat cu programul Leica Application Suit Software, versiunea 4.2.

Dotarea de ultimă generație a făcut posibil ca cercetările întreprinse să se poată realiza corect, respectând toate etapele, pentru ca rezultatele obținute să fie cât mai clare și să poată fi analizate pentru concluzionarea unor aspecte relevante.

PARTEA A II-A

CONTRIBUȚII PROPRII

CAPITOLUL III

OBIECTIVELE ȘI METODOLOGIA CERCETĂRII

3.1. Obiective

Obiectivele cercetărilor efectuate au constat în evidențierea diverselor tipuri de limfoame întalnite la câinii și pisicile luate în studiu. Cauzele apariției limfoamelor sunt multiple și incomplet elucidate. Se presupune că acestea apar în urma infecțiilor virale, disfuncțiilor imune și/sau poluării mediului. Importanța decelării și încadrării teoretice a acestor afecțiuni derivă din necesitatea întregirii tabloului clinic și lezional în diverse organopatii, având în vedere rolul important al sistemului limfatic (alături de sistemul sangvin) în homeostazie, echilibrul mediului intern și transportul principiilor nutritive din organism.

3.2. Material si metodă

În intervalul 2013-2015, materialul de studiu a fost reprezentat de formațiuni tumorale limfonodale provenite de la 12 de cadavre de câini și unul de pisică, decedați sau eutanasiați, În intervalul respectiv nu a fost surprins la pisică decât un singur caz de metastază tumorală la nivelul limfonodului axilar a unui adenocarcinom mamar M1 stânga.

După efectuarea necropsiilor, limfonodurile recoltate au fost fotografiate și fișate. Pentru realizarea examinării histologice au fost prelevate câte două-patru fragmente de limfonod de la fiecare caz, dar și alte organe aflate în strânsă relație anatomo-fiziologică (splină, ficat, etc).

După recoltare, fragmentele au fost fixate în soluție apoasă de formaldehidă 10%, fasonate, incluse în parafină, secționate la 5µm și colorate prin metodele: Hematoxilină – Eozină (colorația bicromică, HE), Hematoxilină – Eozină – Albastru de metil (colorația tricromică Masson, HEA), Hematoxilină – Eozină – Safran (HES), Acid Periodic – Fuxină Schiff (PAS), Acid Periodic – Fuxină Schiff – verde luminos (PAS – verde luminos).

3.2.1. Tehnica histopatologică pentru includerea la parafină

Tehnica histologică pentru includerea la parafină cuprinde următoarele etape:

Recoltarea

Instrumentarul utilizat în această etapă trebuie să fie curat și ascuțit, pentru evitarea strivirii țesutului.

Zona ce urmează a fi recoltată trebuie să fie reperezentativă iar prelevarea ei trebuie să cuprindă atât țesutul lezionat, cât și țesutul nemodificat. Probele nu vor fi mai mari de 1 cm3, pentru ca fixatorul să le poată pătrunde (15 mm lungime, 10 mm lățime, 5-6 cm grosime).

B) Fixarea

Principalul obiectiv al fixării în patologie este menținerea aspectelor morfologice ale țesutului, probei recoltate, cât mai clar și fidel realității. Se obține astfel fixarea unei structuri la un anumit moment considerat, minimalizându-se pierderile celulare și extracelulare, datorate distrucțiilor enzimatice și autolizei, fenomenelor vitale din țesuturi. Totodată se protejează materialul recoltat de acțiunea microorganismelor, fixatorul chimic acționând în scop sterilizator și întarindu-l pentru acțiunile următoare.

S-a utlizat o metoda chimică de fixare, cu soluție apoasă de formaldehidă 10%, aceasta coagulând proteinele structurale, conservând legăturile peptidice și structura generală a organitelor celulare, având totodată o bună viteză de preparare și persistență în timp.

S-a realizat o primă fixare de 24-48 de ore și după o prealabilă fasonare (la 4-5 mm) o a doua fixare, cu fixator proaspăt. Se utilizează flacoane de sticlă, de 100-200 de ml în care fixatorul va depăși volumul pieselor de 20 de ori.

C) Includerea la parafină

Cuprinde 4 pași: deshidratare, clarificare, impregnarea cu parafină și includerea propriu-zisă.

Dehidratarea

Eliminarea apei din țesuturi este necesară pentru că aceasta nu este miscibilă cu parafina. Piesele au fost trecute prin trei bai de soluții alcoolice de concentrații crescânde: 80%, 90% și alcool absolut. În fiecare baie piesele se mențin câte două ore.

Clarificarea

Această etapă este necesară pentru extragerea etanolului din piese, parafina nefiind miscibilă nici cu acesta. Piesele au fost ținute în patru băi, două de acetonă și două de benzen, câte două ore.

Impregnarea la parafina

Acest proces conferă pieselor duritatea și omogenitatea necesare secționării. Pentru aceasta s-a utilizat termostatul de parafină, fiind aplicate câte trei băi de parafină lichidă, de câte două ore, la 56°C.

Includerea propriu-zisă

Pentru încorporarea într-un bloc de parafină a fiecărei piese, se utilizează forme de aluminiu (au permis încorporarea a 10-12 piese simultan) sau casete special dimensionate în funcție de mărimea pieselor de inclus.

D) Secționarea

Microtomul manual sau semiautomat se utilizează pentru a obține secțiuni de 5-6 µm. Pliurile, ce pot apărea datorită unei ușoare comprimări a pieselor la secționare, se pot elimina prin etalarea secțiunilor pe lama de sticlă port-obiect.

Etalarea se realizează cu ajutorul ‘‘acelor de disociere’’, prin două metode: scufundarea secțiunilor în baie de apă la 40°-50°C și manipularea lor de la suprafața apei, direct cu lama de sticlă sau etalarea pe lamă pe o picatură de apă încalzită la becul de gaz.

E) Colorarea

Colorarea s-a realizat pentru a putea observa cât mai detaliat, atât structura normală cât și cea modificată, a pieselor. Astfel pentru orientare generală s-a utilizat Hematoxilină – Eozină (HE) și Hematoxilină – Eozină – Albastru de metil (HEA).

Înainte de colorarea efectivă lamele au fost supuse deparafinării și rehidratării.

I. Deparafinarea cuprinde cinci băi de benzen de câte 10 minute.

II. Rehidratarea s-a realizat în cinci etape, după cum urmează:

Alcool etilic absolut – 10 minute.

Alcool etilic 90% – 10 minute.

Alcool etilic 80% – 10 minute.

Apă robinet – 10 minute.

Apă distilata – pasaj.

Metoda Hematoxilină – Eozină – Albastru de metil (HEA) (Metoda tricromică Masson) cuprinde urmatoarele etape:

III. Colorare.

Hematoxilină Mayer – 10 minute.

Apă robinet – pasaj.

Apă litiană – 10 minute.

Apă distilată – pasaj.

Eozină – 10 minute.

Apă distilată – pasaj.

Acid fosfomolibdenic 1% – 10 minute.

Apă distilată – pasaj.

Albastru de metil 1% – 3 minute.

Apă distilată – pasaj.

IV. Deshidratare.

Alcool etilic 80% – 10 minute.

Alcool etilic 90% – 10 minute.

Alcool etilic absoult – 10 minute.

V. Clarificare.

Benzen I – 10 minute.

Benzen II – 10 minute.

Benzen III – 10 minute.

Benzen IV – 10 minute.

Benzen V – 10 minute.

VI. Montarea.

După clarificare secțiunile se montează cu balsam de Canada și apoi se examinează la microscop.

Metoda Acid Periodic – Fuxină Schiff (PAS)

III. Colorare.

Acid periodic 1% – 10 minute.

Apă robinet – 5 minute.

Apă distilată – pasaj.

Reactiv Schiff – 15 minute.

Apă sulfuroasă – 3 minute.

Apă sulfuroasă – 4 minute.

Apă robinet – pasaj.

Hematoxilina Mayer – 4 minute.

Apă robinet – pasaj.

Apă litiană – 5 minute.

Apă distilată – pasaj.

IV. Deshidaratare.

Alcool etilic 80% – 3 minute.

Alcool etilic 90% – 3 minute.

Alcool etilic absolut – 10 minute.

V. Clarificare.

VI. Montarea.

3.2.2 Tehnica examenului citologic din limfonodurile superficiale

Examenele citologice ale limfonodurilor superficiale pe cainii în viață s-au efectuat prin puncția cu ac fin. Câinii au fost in prealabil anesteziati, regiunea a fost tunsă și aseptizată în vederea puncției. Puncția s-a realizat prin aspirarea cu o seringa de 5 ml cu ac G22. Preparatele au fost colorate May-Grunwald-Giemsa și examinate la microscopul optic.

CAPITOLUL IV

REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1 Epidemiologia limfoamelor maligne

După limfoamele mamare și cele cutanate, limfoamele maligne la câine sunt socotite ca având o frecvență destul de ridicată, situându-se pe locul trei. Nu există o predispoziție de sex, dar s-a dovedit că unele rase sunt mai sensibile, cum ar fi rasa Boxer, care se situează pe primul loc, iar vârsta la care apare cel mai frecvent este cuprinsă între 5 și 9 ani.

4.2 Etiologia

În limfoamele maligne sunt implicați agenți etiologici și factori predispozanți care au capacitatea de a transforma țesutul limfoid în forme neoplazice. Nu a fost identificat încă un agent viral bine determinat, direct implicat în leucemii și limfoame, dar studiile sugerează că unele virusuri pot juca un rol important în etiopatogenia acestor afecțiuni.

Herpesviridele au fost izolate de la om purtător de limfom BURKIT (virus Epstein-Barr) și de la păsări în boala Mareck (Baba. A. I.,2002). În 1969, MAKUK și colab. au izolat o particulă virală de tip Herpesvirus de la câine cu limfom malign care, inoculat la câinii tineri, a produs în limfonoduli un sindrom hemoragipar și leziuni de tipul limfomului malign.

Retroviridele au fost identificate din limfoame maligne și din celule leucemice, la numeroase specii de animale și om. Au fost izolate lentivirusuri în diferite boli de tip neoplazic ale țesutului limfoid (oaie, capră, cal, pisică, câine și om).

Oncornovirusurile au fost identificate la bovine, la șoareci, pui de gaină, maimuță, pisică și om, care prezentau diferite tipuri de neoplasme limfoide (Baba. A. I.,2002).

Particule virale de tip retrovirus au fost evidențiate în fimfomul malign al câinelui. S-au identificat particule retrovirale de tip C în celulele din biopsia unui limfom malign și particule retrovirale de tip A în mastocioame și în limfocitele B.

4.3 Tabloul clinic

Clinic, limfomul malign la câine se manifestă diferit, în funcție de localizarea și forma bolii. Forma multicentrică este cea mai frecventă, urmată de forma mediastinală anterioară, apoi forma gastrointestinală și cea cutanată. Mai sunt și formele extralimfonodulare: oculare și în SNC. Semnele clinice generale sunt reprezentate de pierderea în greutate, anorexie și adinamie, semne ce se instalează progresiv.

4.4 Clasificare

Forma multicentrică debutează cu limfadenopatie, cu generalizare într-un timp foarte scurt, hipertrofie, de 2-10 ori față de normal, cu suprafața neregulată sau netedă, cu limfonoduli mobili, nedureroși și fermi la palpare. Hepatomegalia și splenomegalia sunt prezente. Incidența acestei forme de limfom malign la câine este de 80%. Microscopic, neoplasmele sunt formate din celule mononucleate anaplazice, cu nucleii veziculoși, cu citoplasma ușor eozinofilă; celule binucleate și multinucleate, gigante. Țesutul pulmonar este infiltrat cu celule pleiomorfe cu necroze și depunere de fibrinoid perivascular (Baba. A. I.,2002).

Limfomul malign limfocitar difuz cu celule mici se caracterizează prin index mitotic scăzut și prin arhitectură difuză. Nucleii au formă rotundă, cu periferia uniformă, au mărimea eritrocitelor și sunt lipsiți de nucleoli. Citoplasma se colorează slab și este puțin abundentă. Aceste celule seamănă cu limfocitele, dar se diferențiază prin numărul mare și tipul arhitectural, ceea ce permite și stabilirea diagnosticului.

Limfomul limfocitar de tip plasmocitoid se caracterizează prin dispunerea excentrică a nucleilor, cu o citoplasmă foarte abundentă colorată predominat neutrofil (Baba. A. I.,2002).

Limfomul malign limfoblastic are arhitectură difuză, un indice mitotic ridicat (pâna la 3 mitoze/câmp), iar celulele au citoplasma puțin abundentă și slab delimitată. Nucleii sunt rotunzi sau ușor neregulați, cu cromatina omogenă și 1-3 nucleoli.

4.5 Leucozele limfoide – stadializare

Limfosarcomul

În evoluţia leucozei limfoide a câinelui se constată o anumită stadializare conturată morfoclinic:

Stadiul I se manifestă prin cuprinderea unui singur nod limfatic sau a unui singur organ limfoid, excluzând măduva osoasă;

Stadiul II se exteriorizează prin afectarea mai multor noduri limfatice dintr-o anumită regiune corporală;

Stadiul III defineşte generalizarea hiperplaziei nodurilor limfatice;

Stadiul IV se caracterizează prin extinderea procesului hiperplazic şi la nivelul ficatului şi al splinei;

Stadiul V este expresia afectării măduvei osoase şi/sau a altor sisteme organice, manifestându-se prin leucemie persistentă.

Această stadializare fiind de dată relativ recentă, n-a intrat în prezentările curente ale bolii, care este cunoscută mai mult prin formele morfoclinice, respectiv forme: multicentrice, digestive, timice şi extranodale.

Forma multicentrică, limfomul malign sau limfomatoza de sistem are o incidență foarte ridicată în rândul populației canine, reprezentând 45-84% din cazurile de leucoză şi cuprinzând la început nodurile limfatice, care cresc în dimensiuni de 3-10 ori, și adesea ficatul şi splina, ce îşi măresc volumul fie prin hiperplazie tumorală difuză fie prin noduli de diferite dimensiuni (forma difuză/focalizată). Se asociază măduva osoasă, intestinele, rinichii, cordul, tonsilele, pancreasul, globii oculari etc.

Forma digestivă (alimentară) are o incidenţă de 7-45% şi constă în afectarea intestinelor, a limfonodurilor mezenterice şi frecvent a splinei şi a ficatului.

Forma timică (mediastinală) este mai rară (2-3%) şi se manifestă în special la nivelul nodurilor limfatice mediastinale şi a timusului toracic, care sunt mărite în volum.

Forma extranodală se caracterizează prin localizări predominante în afara nodurilor limfatice şi cu incidenţă mai mare la nivelul pielii, unde de altfel este şi mai bine studiată (Paul I, 2013).

În cazuistica noastră limfosarcomul a fost observat în stadiul IV, fiind afectate, pe lângă limfonoduri și alte organe (ficat, rinichi, splină) la 4 cazuri, toți câinii cu vârste cuprinse între 6 -11 ani.

Efectuarea examenului citologic este unicul diagnostic de certitudine. Biopsia limfonodurilor, mai ales a celor mărite în volum, și/sau organelor afectate confirmă diagnosticul. Sunt de un real folos în orientarea diagnosticului și radiografiile, ecografiile, hemoleucograma, examenele biochimice.

Macroscopic, limfonodurile erau mărite în volum, slăninoase pe suprafața de secțiune, cu o consistență crescută, infiltrate uneori hemoragic și presărate cu zone de necroză pe suprafața de secțiune.

Microscopic, s-a observat ștergerea arhitecturii specifice prin dispariția structurilor caracteristice corticalei și medularei și supraîncărcarea sinusurilor cu celule tumorale. În profunzime masa neoplazică înlocuiește sinusurile și cordoanele și colonizează travee conjunctive. Se observă fibre fine de reticulină delimitează grupe de celule tumorale, fibrele de colagen fiind hialinizate.

La examenul histologic și citologic s-au evidențiat în sinusurile subcapsulare ale limfonodurilor celule rotunde mici, cu indice mitotic ridicat și atipii de diviziune. Stroma este foarte săracă, conține puține fibre și capilare lipsite de pereți proprii.

4.6 Mastocitomul

A fost semnalat la 2 cazuri, un mascul de Doberman, cu vârsta de 6 ani și un metis de Cocker cu vârsta de 8 ani. În cazustica noastră s-a identificat mastocitomul în forma tumorală difuză (leucemia cu mastocite) sau generalizată.

Au fost identificate localizări la nivelul mucoasei bucale, zona genitală, la nivelul membrelor și a limfonodurilor inghinale și submandibulare. Localizarile extracutanate sunt practic expresia metastazării procesului tumoral. Acestă formă corespunde unei proliferări generalizate a mastocitelor maligne, mai ales în limfonoduri, splină, maduva osoasă și ficat. Ea poate fi asociată cu mastocitoamele multiple cutanate.

Clasificarea acestora utilizează criterii foarte precise: diametrele nucleilor și citoplasmelor, pleiomorfismul celular, celularitatea neoplasmului și metacromazia granulațiilor citoplasmatice.

Histologic, celulele sunt asezate în cordoane sau sub forma de grupuri compacte, separate de fibre de colagen discrete. Mastocitele sunt rotunde sau usor ovoide, putând fi uneori poligonale sau ușor alungite. Nucleul este variabil ca mărime și formă, observându-se frecvent mitoze. Granulațiile intracitoplasmatice variază canumăr și mărime direct proporțional cu gradul de maturitate al celulelor. Granulațiile sunt intens metacromatice și mari în mastocitele mature.

4.7 Plasmocitomul (mielomul multiplu)

A fost identificat la 12 cadavre de câini și unul de pisică.

Mielomul multiplu sau plasmocitomul, este un proces neoplazic multicentric metastatic ce se caracterizează prin proliferarea plasmocitelor secretante de IgA. Unele plasmocite nu sunt secretorii.

Este localizat mai frecvent la nivelul oaselor craniene şi ale bazinului, la nivelul coastelor şi al oaselor lungi dar şi în ficat, splină, nodurile limfatice, rinichi şi mai rar în pulmoni, suprarenale, pancreas şi prostată.

În literatura de specialitate, au fost citate cazuri mai puțin comune de localizări primare extramedulare, în oasele lungi, cât și în vertebre, mandibulă, laringe, limbă, penis, rect, oase craniene, splină, ficat și stomac.

Cauzele certe ale plasmocitomului sunt încă incerte, fiind totuși incriminați factorii genetetici, agenții virali, stimularea imună indusă de parazitismul cronic multiplu, precum și expunerea prelungită la factori carcinogeni. Etiologia virală este încă discutată. Sunt afectaţi mai ales câinii în vârstă, frecvenţa cea mai mare observându-se la 9 ani.

Histologic, se observă stergerea arhitecturii limfonodului și prezența unor celule cu citoplasmă abundentă și granule specifice.

4. 8 Metastazarea nodală a melanomului malign

Microscopic, celulele neoplazice sunt strâns grupate în jurul vaselor sanguine și al nervilor. Celulele neoplazice au forme diferite (rotunjite, fusiforme, sincițiale, epitelioide), în formele cele mai agresive având caractere anaplazice. Mitozele, sunt mai puțin numeroase, dar frecvent atipice. Încărcătura cu granule de melanină este variabilă. Faptul că celulelor melanice sunt prezente și în vasele sanguine și limfatice are semnificația unei malignități foarte ridicate.

Chiar dacă tumorile primare sunt intens pigmentate, tumorile secundare au o încărcătura de melanină foarte diferită care a necesitat clasificarea tumorilor în subtipuri, de la amelanotice până la hipermelanotice. Relația dintre gradul de malignitate și încărcătura celulelor cu melanină nu este complet elucidată.

Histologic, nodulul tumoral este centrat pe un vas de sânge (arteriolă) ale cărui medie și adventiție sunt infiltrate variabil cu celule pigmentare. Metastaza este constituită din celule pleomorfe dense, unele având forme alungite, fusiforme, altele rotunjite sau poligonale; citoplasma este puțină, eventual excentrică. Nucleii sunt mari și neregulați, veziculoși, cu cromatina pulverulentă și cu un nucleol proeminent. Încărcarea cu melanină este mare, mitozele sunt relativ puține. La periferia nodulilor melanotici, se observă o zonă cu aspect de pseudocapsulă formată prin condensarea structurilor specifice limfonodale și a țesutului conjunctiv stromal, inegală ca grosime, depășită de câteva melanocite neoplazice infiltrate.

4.9 Metastazele adenocarcinomului mamar în limfonoduri

Acestea au fost observate la 4 cazuri. Adenocarcinomul mamar a fost diagnosticat la cățele cu vîrsta de peste 9 ani si nesterilizate. Metastazele au avut o frecvență foarte mare în limfonodurile axilare și cele inghinale superficiale.

Limfonodurile afectate erau mărite în volum, cu o consistență dură, presărate cu hemoragii și necroze, și aderente de țesuturile limitrofe.

Metastazele erau constituite din punct de vedere histologic din celule slab diferențiate, pleiomorfe, cu nuclei veziculoși. Mitozele erau frecvente și atipice.

CONCLUZII

Cele mai frecvente tumori identificate în prezentul studiu, în ordinea descrescătoare a frecvenței au fost: limfosarcomul (6 cazuri), metastazele adenocarcinomului mamar (4 cazuri) în limfonodurile axilare și inghinale superficiale, plasmocitomul (2 cazuri) și mastocitomul (2 cazuri), metastaza a melanomului malign (1 caz).

Metastaze ale melanomului malign localizat în faringe la un câine metis cocker, au fost identificate în limfonodurile retrofaringiene.

Metastazele (tumorile secundare) adenocarcinomului mamar la cățea și pisică au fost identificate în limfonodurile santinelă (inghinali și axilari).

BIBLIOGRAFIE

Argyle, D., Decision Making in Small Animal Oncology, Editura Blackwell Publishing, 2008.

Baba, Ioan Alecsandru, Oncologie comparată, Editura Academiei Române, București, 2002.

Borbil, S., Bazele teoretice ale practicii oncologice la câine și pisică, Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2006.

Clerens, J., Sparky Fights Back : A Little Dog's Big Battle Against Cancer, Editura Foley Square Books, 2006.

Cote, E., Clinical Veterinary Advisor: Dogs and Cats, Editura Elsevier, 2010.

Cowell, Rick L., Veterinary Clinical Pathology Secrets, editura Elsevier, 2004.

Cowell, Rick L., Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat, Editura Elsevier, 2013.

Crump Kenneth, Thamm Douglas, Cancer Chemotherapy for the Veterinary Health Team, Editura Wiley – Blackwell, 2011.

Downing, R., Pets Living With Cancer: A Pet Owner's Resource, Editura AAHA Press, 2000.

Dressler, D., The Dog Cancer Survival Guide: Full Spectrum Treatments to Optimize Your Dog's Life Quality and Longevity, Editura Elsevier, 2011.

Eldredge, D., Cancer And Your Pet: The Complete Guide to the Latest Research, Treatments, and Options, Editura Capital Books, 2005.

Fletcher, C., Diagnostic Histopathology of Tumors, Editura Churchill Livingstone, 2000.

Gough, A., Breed Predispositions to Disease in Dogs and Cats, Editura Wiley-Blackwell, 2010.

Hahn, K., Veterinary Oncology: The Practical Veterinarian Series, Editura Butterworth-Heinemann, 2002.

Harvey, John W., Atlas of veterinary hematology: blood and bone marrow of domestic animals, editura Elsevier, 2001.

Henry, C., Cancer Management in Small Animal Practice, Editura Saunders Elsevier, 2009.

Little, S., The Cat: Clinical Medicine and Management, Editura Saunders, 2011.

Maddison, E.J., Clinical Reasoning in Small Animal Practice, Editura Wiley-Blackwell, 2015.

Messonnier, S., The Natural Vet's Guide to Preventing and Treating Cancer in Dogs, Editura New World Library, 2006.

Morris J., Dobson J., Small Animal Oncology, Editura Blackwell Science Ltd., Oxford, 2001.

Moulton, J., Tumors in Domestic Animals, Editura University of California Press, 1990.

North, S., Small Animal Oncology: An Introduction, Editura Saunders Elsevier, 2009.

Oglivie, G., Feline Oncology, Editura Veterinary Learning Systems, 2001.

Ogilvie, G., Managing the Veterinary Cancer Patient: A Practice Manual, Editura Veterinary Learning Systems, 1995.

Orey, C., Cancer: The Essential Guide to Natural Pet Care, Editura BowTie Press, 1999.

Raskin, R., Meyer, D., Canine and Feline Cytology: A Color Atlas and Interpretation Guide, Editura Elsevier, 2015.

The International Agency for Research on Cancer, WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissue, Editura World Health Organization, 2008.

Theilen, G., Veterinary Cancer Medicine, Editura Lea & Febiger, 1987.

Villalobos, A., Canine and Feline Geriatric Oncology: Honoring the Human-Animal Bond, Editura Wiley-Blackwell, 2007.

Withrow J. Stephen, Vail D., Small Animal Clinical Oncology, Editura Elsevier, 2012.

www.boli-medicina.com

www.cancer.org

www.cancerresearchuk.org

www.epathology.ro

www.felinelymphoma.org

www.icatcare.org

www.langvordvet.co.uk

www.med-ed.virginia.edu

www.medicalvet.ro

www.merkvetmanual.com

www.ncbi.nlm.nih.gov

www.nhs.uk

www.pathologyatlas.ro

www.petplace.com

www.vet.cornell.edu

www.vet-magazin.ro

www.vetbook.org

www.veterinarul.ro

www.wikivet.net