Morbiditatea Globala Prin Tuberculoza

O perioadă de peste 30 ani după 1970 morbiditatea globală prin tuberculoză a înregistrat reduceri progresive semnificative. Deși factorii sociali favorizanți nu au fost îmbunătățiți în aceeași măsură, intensitatea preocupărilor antiepidemice (specifice și nespecifice) și eficiența chimioterapiei au fost esențiale în influențarea acestui trend descendent.

După 1990, doi factori majori au intervenit atît în creșterea morbidității, dar mai ales a mortalității prin tuberculoză: infecția HIV care influențează atât receptivitatea, dar mai ales evoluția bolii, și apariția tulpinilor cu rezistență multiplă la tuberculostatice.

Incidența globală a bolii a fost estimată în lume în anul 2009 la 137 cazuri la 100.000 locuitori (figura 1), ceea ce echivalează cu 9,4 milioanee îmbolnăviri. Această valoare reprezintă o creștere față de 9,3 milioane în 2007, în contextul în care scăderea ușoară a incidenței per capita este depășită prin creșterea demografică. Cele mai multe cazuri au fost raportate în Asia (55%) și Africa (30%), în timp ce un număr mai mic a fost înregistrat în Regiunea Mediteraneană de Est (7%), Europa (5%), America (3%). Din cele 9,4 milioane de cazuri incidente 1,2-1,4 milioane (13-16%) au fost HIV-pozitive (figura 2). Acestea din urmă au provenit în cea mai mare măsură din Africa (78%) și Asia de Sud-Est (13%) (279).

În acest context, în 2008, în Europa se înregistra o prevalență a bolii de 350.000 cazuri, cu o incidență estimată la 39 cazuri la 100.000 locuitori și mortalitate de 7%000, România ocupând locul 52 în lume și locul 4 în Europa (280).

În 2009, în România, incidența TB era 21.457 cazuri noi și 3591 recăderi. După un vârf al incidenței în 2002, incidența cazurilor noi se află pe un trend descendent, în timp numărul de recăderi este relativ constant în ultimii 10 ani (figura 3). Mortalitatea TB cunoaște un trend ușor descendent în ultimul an (figura 4). Geografic, se constată o incidență mai mare în județele de frontieră, în timp ce în zonele centrale incidența este mai scăzută (figura 5).

Figura 1. Incidența TB estimată în 2009.

Figura 2. Prevalența HIV la cazurile noi de TB, în 2009.

Figura 3. Numărul de cazuri noi și recidive TB în România, în perioada 1985-2010

Figura 4. Evoluția mortalității în TB, în România, în perioada 1985-2010.

Figura 5. Incidența TB pe județe în 2010

În actualul context evolutiv, programele naționale de combatere a tuberculozei instituite în multe țări din lume, sub auspiciile regionale și internaționale, sunt axate pe două grupe esențiale de măsuri:

Măsuri antiepidemice de prevenție, ce se adresează depistării cât mai precoce a surselor (bolnavilor neînregistrați) și negativarea lor terapeutică, profilaxiei specifice naționale și protecției receptivilor în focar, instituirii unui program educațional țintit în mediile socio-economice deficitare.

Măsuri de diagnostic și terapeutice conjugate pentru limitarea evoluțiilor, și îndeosebi prevenirea instalării rezistenței la tuberculostatice

Factorii de risc incriminați pentru rezistența bacteriei la tuberculostatice sunt tratamentele anterioare, insuficiente și defectuos conduse (frecvent nesupravegheate). Deși tuberculoza afectează preponderent bărbații, riscul de a găzdui tulpini MDR-TB nu este influențat de sex. În țările Est-europene s-a înregistrat un vârf de incidență al acestor tulpini la pacienții tineri adulți, în timp ce în celelalte țări, frecvența scade liniar, cu vârsta (figura 6). Se estimează că incidența globală a tulpinilor MDR-TB în 2008 a fost de cca 440.000 cazuri, la cazuri noi, sau anterior tratate. Tulpinile rezistente au determinat 150.000 decese, dintre care 97.000 au fost HIV-negative. Nu s-a constatat nici o corelație între statusul HIV și tulpinile MDR, dar dacă studiile vor dovedi că prevalența HIV la pacienții cu MDR-TB este mai mare decât la cei non-MDR-TB atunci datele oferite de OMS cu privire la mortalitate vor trebui ajustate.

În acest context, determinarea MDR-TB devine un factor cheie atât în ceea ce privește eficiența terapeutică, dar și limitarea extinderii fenomenului de multidrug rezistență și prevenirea contagiunii în mediul extraspitalicesc.

Figura 6. Distribuția cazurilor MDR-TB pe grupe de vârstă și localizare geografică.

Eforturile investigării bacteriologice prin metode fenotipice (convenționale) sunt însă consistent limitate de biologia lentă a Mycobacterium tuberculosis, rezultatele fiind accesibile după aproximativ 30 zile pentru izolare și identificare, și alte 21 zile pentru testarea sensibilității izolatelor.

Din aceste motive, eforturile din ultima decadă, în domeniul diagnosticului de laborator, au fost axate pe reducerea duratei investigațiilor bacteriologice.

Introducerea și extinderea testelor moleculare de depistare și chiar identificare direct în prevalat, constituie un avantaj imens prin reducerea duratei la maxim 24 ore, incluzând și depistarea elementelor genetice purtătoare ale rezistenței multiple.

Costurile încă ridicate ale practicii moleculare, atît în ce privește echipamentele, dar mai ales sondele specifice, limitează extinderea acestui sistem de diagnostic în practică.

Metodele alterne fenotipice, pe medii lichide, automatizate, au redus durata diagnosticului microbiologic pozitiv, însă întâmpină același impediment al costurilor și accesibilității.

Între metodele alterne preconizate relativ recent pentru detectarea sensibilității la tuberculostatice se înscrie și utilizarea reacției de reducere a nitraților în nitriți, bazată pe un test simplu, accesibil tuturor laboratoarelor, și care oferă avantajul citirii rezultalelor în 7-14 zile (față de 3 săptămâni prin metoda convențională a mediilor cu antibiotice incluse). Evaluarea acestei metode poate conduce la extinderea ei cel puțin la laboratoarele cu înzestrare modestă.

CAPITOLUL 1

TUBERCULOZA – O PATOLOGIE PARTICULARĂ

SCURTĂ ISTORIE

Originea Mycobacterium tuberculosis a fost și rămâne un subiect de dezbatere și de cercetare. Se consideră că, asemeni actinomicetelor, bacteria a supraviețuit inițial în sol, iar unele specii au evoluat ulterior putând infecta mamiferele. Domesticirea vitelor în urmă cu 10.000-25.000 ani, se pare că a permis pasajul micobacteriilor patogene la om, iar bacteria a putut evolua până la forma sa de azi (241). Această ipoteză este astăzi infirmată, cu ajutorul biologiei moleculare, care a demonstrat o asemănare de 99,9% între membrii complexului M. tuberculosis care include M. bovis.

În istoria medicinei, în secolul al VII-lea Î.C., scrierile asiriene descriau pacienți cu hemoptizie, în timp ce Hippocrate (sec. al V-lea Î.C.) menționa prezența unor pacienți suferinzi de o boală consumptivă (grecește phtizis), care evolua cu dureri toracice, tuse deseori sanghinolentă, către exitus. Se consideră că boala a fost introdusă în aceste zone prin migrarea crescătorilor de vite indo-europeni, ipoteză susținută de cercetările antropologice (97).

În Europa, explozia demografică din ultimul mileniu, și aglomerațiile urbane au devenit epicentre ale endemiilor TB, începând din secolele XVI-XVII. Tuberculoza a atins un vârf de incidență în secolul al XIX-lea, estimându-se că un sfert din populația Europei a decedat datorită bolii (65). În secolul al XX-lea mortalitatea și morbiditatea TB au scăzut în lumea dezvoltată prin serviciile de sănătate și vaccinarea BCG, precum și prin dezvoltarea antibioticelor începând cu anul 1950. Trendul descendent a fost întrerupt în anii 1980, când incidența tuberculozei a înregistrat o nouă creștere. Aceasta s-a datorat în special emergenței HIV-SIDA, cu deprimarea sistemului imun celular. În Europa și Statele Unite ale Americii, boala a fost stăpânită prin alocarea de resurse materiale și umane, precum și prin monitorizarea antibioterapiei (82).

În lumea în curs de dezvoltare, tuberculoza se menține la incidențe crescute de cca 300 cazuri la 100.000 locuitori în Asia și Africa. La fiecare 15 secunde se înregistrează un deces de TB și 8 miliane de persoane de îmbolnăvesc anual de TB. Fără tratament 60% din bolnavi pot muri. Aproape toate aceste cazuri provin din țările sărace, reflectând condițiile sărace de subzistență și absența serviciilor de sănătate. Rezistența la antibiotice în aceste zone și absența antibioticelor de linia a II-a, precum și întreruperea mai devreme a terapiei, sunt factori de eșec terapeutic și de emergență a bolii (110).

De-a lungul secolelor, medici și oameni de știință au căutat să afle etiologia bolii pentru un diagnostic corect și un tratament corespunzător. Hippocrate credea că boala este moștenită genetic, în timp ce Aristotel (secolul al IV-lea Î.C.) considera că este contagioasă, ipoteză susținută și de Galen în secolul al II-lea D.C. În secolul al XVII-lea încă se dezbătea între aceste două teorii, medicii italieni preluând ideea lui Galen, în timp ce savanții din țările nordice pledau pentru natura ereditară a bolii. Diferendele pe această temă au atins un punct culminant în secolul al XIX-lea. În 1865, un militar francez, Jean-Antoine Villemin, a reușit să transmită unor iepuri de laborator boala, prin inocularea lor cu fragmente de țesut obținute de la cadavru, demonstrând natura infecțioasă a maladiei. În 1882, Robert Koch a pus în evidență etiologia bacteriană a tuberculozei, dar mulți oameni de știință au continuat să considere că factorii de mediu au un rol important terapeutic, dovadă fiind numeroasele sanatorii răspândite în Europa secolului XIX.

Era antibioticelor a început odată cu descoperirea streptomicinei de către Schatz și Waksman în 1940 și a continuat cu introducerea și a altor tuberculostatice în tratament, precum izoniazida, rifampicina, pirazinamida. Pe lângă tratamentul etiologic, curativ, introducerea vaccinului BCG, produs din tulpini vii atenuate de M. bovis, de către Calmette și Guerin în 1920, nu a condus la eradicarea bolii, astazi incidența globală fiind maximă (266). În mod cert, sunt necesare noi vaccinuri și antibiotice, precum și accesibilitatea bolnavilor la serviciile de sănătate, ceea ce implică un diagnostic și o schemă terapeutică corepunzătoare, cunoscându-se astăzi fiziopatologia bolii.

FIZIOPATOLOGIA TUBERCULOZEI

Infecția cu M. tuberculosis începe cu fagocitarea bacililor de către macrofagele alveolare. Bacteriile pot rezista mecanismelor bactericide induse de macrofage și se pot replica în fagozom, evitând fagocitoza (23). În final, bacilii conduc la necroza macrofagelor, ajungând din nou în mediul extracelular, de unde sunt preluați de alte macrofage. Acest ciclu de viață se poate sfârși numai în prezența răspunsului imun celular (122), reprezentat de limfocitele Th1 CD4, capabile să sintetizeze INF-, care recunosc macrofagele infectate ce exprimă pe suprafață antigene bacteriene aflate în faza de multiplicare. Pe de altă parte, bacilii pot intra în starea de latență, datorită capacității bacteriei de a supraviețui în condiții neprielnice, generate de gazdă (35). Hipoxia este unul din acești factori care induc intrarea într-o formă adaptativă, „dormantă”. Bacteriile pot supraviețui în granuloame toată viața gazdei, și au abilitatea de se reactiva în condiții de imunodepresie locală (57). La persoanele imunocompetente, reactivarea are loc de obicei în lobii superiori, unde presiunea mare a oxigenului favorizează creșterea bacilară. Tot aici se desfășoară procesul de necroză intragranulomatoasă, inițiat de macrofage, care cresc răspunsul inflamator. Consecința inflamației constă în eroziuni bronșice și drenajul materialului lichefiat, cu apariția cavităților pulmonare. La persoanele imunodeprimate, reactivarea se produce în diferite locații, iar cavitația este mai puțin frecventă datorită lipsei unui răspuns imun energic (93).

Deși au fost înregistrate informații importante despre metabolismul M. tuberculosis, profilul antigenic, abilitatea de a face față condițiilor neprielnice ale gazdei, se cunoaște mai puțin despre organizarea bacililor în faza staționară. Mediul perfect pentru multiplicarea bacteriei este fagozomul, și odată ieșită în mediul extracelular, replicarea se sistează, iar bacilii intră în fază staționară (figura 7), eventual non-replicativă (35). Aceasta probează că există un ciclu constant de fază log versus faza staționară, încă de la începutul infecției, și nu doar în stadiile finale, ca rezultat al presiunii hipoxice din granuloame (270). În această ipoteză, bacilii se adaptează constant la diferite condiții de mediu. Mediul extracelular conține numeroase enzime bactericide rezultate din macrofagele și neutrofilele distruse, și devine acid și hipoxic prin afectarea rețelei de capilare locale (158). Polineutrofilele sunt prezente la începutul infecției și au un timp de viață foarte scurt, determinând bacilii să intre în fază non non-replicativă înainte de declanșarea unui răspuns imun. Bacilii dormanți sunt mai rezistenți în fața răspunsului imun al gazdei, și în consecință numai bacteriile replicative sunt anihilate. În acest proces apar un tip de celule aparent inutile: macofagele „spumoase”. Ca în orice alt proces inflamator cu o rată mare de distrucție celulară, macrofagele fagocitează detritusurile celulare (56). Resturile de membrane bacteriene, bogate în acizi grași și colesterol conduc la formarea de corpi lipidici în citoplasma macrofagelor. În ariile de necroză acest proces este intensificat prin acumularea în plus de lipoproteine extravazate din capilarele distruse. Aceste depozite lipidice pot crește în volum prin acumulare de colesterol și formare de cristale, putând conduce la distrugerea macrofagelor, prin fenomenul de ateroscleroză. În infecția cu M. tuberculosis, macrofagele spumoase fagocitează și bacili non-replicativi (32). Deși intră în mediul intracelular, aceștia din urmă nu se mai multiplică, ci contribuie la formarea corpilor lipici, menținându-se în faza staționară (85). Macrofagele spumoase părăsesc parenchimul prin spațiul alveolar, intrând în componența lichidului alveolar care vehiculează în mod constant particulele toxice inspirate. Bacilii non-replicativi, vehiculați de aerosoli, pot reinfecta parenchimul (36). Această ipoteză poate explica succesul terapeutic cu izoniazidă pentru 9 luni. Conform teoriei clasice, bacteriile non-replicative rezidă în leziunile granulomatoase toată viața gazdei (259), ceea presupune că tratamentul cu un medicament activ pe micobacteriile replicative, nu este eficient decât în prezența unui proces constant de reinfecție. În acest caz, bacilii dormanți ar fi drenați și distruși în stomac, iar izoniazida ar preveni reinfecția. Acest mecanism ar putea explica succesul terapeutic al schemei „gold-standard” (figura 8).

Majoritatea populației este capabilă să asigure un echilibru în declanșarea răspunsului imun (37), dar prezența factorilor favorizanți de mediu, virulența bacteriană, lipsa serviciilor de sănătate și a programelor de prevenție, precum și complianța scăzută a pacienților, conduc la incidența maximă a bolii din prezent.

Figura 8. Mecanisme fiziopatologice ale infecției cu M. tuberculosis și evoluția sub tratament cu izoniazidă.

CAPITOLUL 2.

BIOLOGIA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Mycobacterium tuberculosis reprezintă agentul de temut al „ciumei albe” din Europa secolelor XVII- XVIII, și al tuberculozei multidrog rezistente din zilele noastre. Se consideră că aproape 100% din populația europeană a contactat bacilul și aproximativ 25% din decesele în rândul adulților au fost cauzate de același bacil. În secolul XX au fost descoperite alte noi specii de micobacterii, non-tuberculoase (NTM) sau atipice care deasemeni pot cauza diferite boli.

2.1. CARACTERE DEFINITORII

Genul Mycobacterium este singurul gen din familia Mycobacteriaceae, ordinul Actinomycetales (figura 9), care se poate înrudi cu alte genuri ce conțin acizi micolici. Principalele caracteristici pentru apartenența la acest gen sunt: a) rezistența la decolorare cu soluție acidă și alcool după colorația inițială cu soluție de fucsină; b) prezența acizilor micolici cu catenă lungă de 60-90 atomi de carbon, care sunt clivați în esteri de acizi grași C22-C26 prin piroliză; c) conținutul înalt de C-G al ADN (61-71%), cu excepția M. leprae (250).

M. tuberculosis are formă bacilară, cu dimensiuni de cca 2-4 μm lungime și 0,2-0,4 μm lățime, imobil și nu formează spori. Ca și M. leprae prezintă o creștere lentă pe mediile solide, de peste 7 zile, în condiții ideale de cultivare, pentru a obține colonii vizibile macroscopic. Este o bacterie aerobă, motiv pentru care, în cazurile clasice de tuberculoză, M. tuberculosis ocupă întotdeauna spațiile bine aerate din lobii superiori pulmonari. Bacteria parazitează facultativ macrofagele și are un timp de reproducere foarte lent, de 15-20 ore, caracteristici care îi conferă un anumit grad de virulență. M. tuberculosis nu este clasificat în funcție de colorația Gram, deși conține peptidoglicani în peretele celular. Ca și genul Nocardia, este clasificat ca bacterie acid-alcoolo-rezistentă, datorită impermeabilității membranei celulare la anumiți coloranți.

Figura 9. Taxonomie Mycobacterium tuberculosis.

2.2. PARTICULARITĂȚI STRUCTURALE

Structura peretelui celular al M. tuberculosis merită o atențe deosebită, date fiind trăsăturile sale unice pentru procariote, ceea ce îi conferă și virulența cunoscută. Peretele este compus în principal (60%) din complexe lipidice, alături de molecule polizaharidice de arabinoglicani, susținute într-o rețea proteică de peptidoglicani (figura 10). Fracția lipidică este reprezentată de 3 componente majore: acizi micolici, cord factor și complexe lipidice.

Acizii micolici cu catene lungi (C50 – C60) se leagă de acizii muramici ai peptidoglicanului prin punți fosfodiesterazice, iar de arabinogalactan prin punți glicolipidice. Ei reprezintă până la 50% din fracțiunea uscată a anvelopei celulare, fiind puternic hidrofobi și conferind o permeabilitate redusă a suprafeței bacteriene. Acizii micolici joacă un rol important în virulența bacteriană prin prevenirea agresiunii externe a proteinelor cationice, a lizozimelor sau a radicalilor liberi secretați din granulele fagocitelor, precum și prin apărarea față de fracțiunile complementului seric (125).

Cord factor (trehaloză-dimicolat) imprimă culturii de M. tuberculosis pe mediul lichid aspecte caracteristice de „corzi”. Este produs din abundență de către tulpinile înalt virulente și are rolul de a inhiba migrarea polimorfonuclearelor la locul infecției.

Sulfolipidele peretelui celular, alături de celelalte complexe lipidice, îi conferă acestuia impermeabilitate, rezistență la o serie de substanțe sau molecule (antibiotice, produși acizi sau alcalini, complement seric, radicali liberi).

Un consituent unic ce contribuie în plus în patogenia acestui organism, este lipoarabinomanan (LAM). LAM purificat din tulpini atenuate de bacterii poate varia structural, ceea ce ar conduce la variații în capacitatea de a induce secreția de citokine de către celulele mononucleare (125).

Figura 10. Structura peretelui celular.

2.3. FACTORI ȘI MECANISME DE PATOGENITATE

a) Factori specifici de agresivitate

a1) Proteina 19-kDa este un antigen proteic, recunoscut de celulele T și sistemul complement. La momentul penetrării în celulele fagocitare, această glico-lipo-proteină de suprafață interacționează cu receptorul TLR2, și determină o serie de reacții ineficiente din partea gazdei. Există dovezi sugestive dar neconcluzive, că tulpinile mutante deficitare în proteina 19-kDa sunt rapid înlăturate de la nivelul plămânilor și splinei cobailor infectați. Readăugând gena respectivă, tulpinile redobândesc capacitatea de a se multiplica lent la nivelul plămânilor, ceea ce sugerează că proteina 19-kDa este un factor esențial de virulență.

a2) Glutamin-sintetaza. Acestă enzimă nu este secretată în timpul creșterii bacteriene, și nu se regăsește în filtratul din cultură, ci rezultă în urma lizei celulare. Alături de rolul important în metabolismul azotului, glutamin-sintetaza este implicată în sinteza unor componente poli-L-glutamat-glutamină din peretelui celular al micobacteriilor patogene. Enzima poate fi o posibilă țintă pentru dezvoltarea unor noi substanțe antituberculoase.

a3) Erp. Erp este o proteină de suprafață a M. tuberculosis, similară cu antigenul PLGTAS de 28 kDa, al M. leprae, și este secretat de bacteriile nepatogene.

a4) Sintetaza micocerozică. Enzima catalizează sinteza lanțurilor lungi, polimetilate de acizi grași, numiți acizi micocerozici, și sunt secretate numai de micobacteriile patogene.

a5) FbpA. Mycobacterium tuberculosis deține trei enzime micolil-transferază, codate de fbpA, fbpB și fbpC, care transferă lanțurile lungi de acizi micolici către derivații de trehaloză. Proteinele se pot lega și de fibronectină. Proteinele fbp se regăsesc în filtratul de cultură și sunt cunoscute ca antigen 85A, 85B și 85C (complexul Antigen 85). În cadrul cercetărilor, cele trei gene fbp au fost inactivate separat, dar numai mutanții fbpA au demonstrat atenuarea marcată a creșterii bacteriene în macrofagele umane și murine. Observarea răspunsului imunologic indus de aceste proteine a condus la crearea unei noi linii de vaccin prin introducerea genei fbpB în tulpina M. bovis BCG. Această tulpină recombinată protejează mai bine împotriva infecțiilor cu M. tuberculosis decât o face tulpina BCG.

a6) OmpA. Omp A este o proteină porin-like, ce formează porii în lizozom. Exprimarea genei este indusă de pH scăzut, precum și de asimilarea de către macrofage. O tulpină mutantă OmpA prezintă următoarele caracteristici: deși prezintă o creștere întârziată la pH acid, bacteria se multiplică la nivele corespunzatoare tulpinii mamă; nu poate procesa moleculele mici precum serina, la pH scăzut; prezintă o capacitate redusă de creștere în macrofagele umane și murine. Acestea sugerează că în mediul acid cu care se confruntă bacteria pe parcursul infecției, gena OmpA are un rol important în răspunsul bacteriei la aceste condiții.

a7) HbhA. HbhA este hemaglutinină cu afinitate pentru heparină, localizată pe suprafața bacteriilor virulente. Mutanții hbhA au aceeași abilitate ca și tulpină sușă, de a fi fagocitați și de a se multiplica în macrofagele umane și murine. Ei se multiplică în plămânii cobailor infectați, dar au un timp mai lent de regenerare, atingând un nivel bacterian inferior, comparabil cu tulpina sălbatică. Această caracteristică evidențiază rolul important al HbhA de a interacționa cu pneumocitele, și prin aceasta de a contribui la diseminarea extrapulmonară a bacteriei.

a8) LAM. LAM este un complex glicolipidic ce conține subunități repetitive de arabinoză-manoză, fiind o componentă importantă a peretelui M.tuberculosis. Este cunoscut ca imunomodulator, asemănător cu proteina 19-kDa. Adăugarea de LAM în macrofagele murine deprimă secreția de interferon γ. Deasemeni, LAM poate înlătura radicalii oxigen in vitro, și inhibă protein-kinaza C a gazdei. A fost sugerat că LAM inhibă răspunsul imun față de infecția cu M.tuberculosis, și protejează bacteria de efectele bactericide ale enzimelor implicate în lanțul respirator.

a9) MbtB. MbtB este o enzimă ce catalizează una dintre reacțiile de sinteză a micobactinului. Operonul mbt codifică enzimele responsabile de sinteza a micobactinului și carboximicobactinului, siderofori majori ai bacilului. Operonul este parte dintr-un regulon reprimat de concentrații crescute de fier.

Asemeni altor bacterii patogene, în cadrul infecției, M. tuberculosis necesită un sistem de captare a ionilor de fier – siderofori –, pentru a-i prelua de la proteinele gazdei, precum transferina și lactoferina. Fierul este esențial pentru creșterea bacteriană, astfel încât bacteria trebuie să și-l procure fie de la proteinele gazdei care conțin fier, fie din sărurile insolubile de fier, prezente în mediu. În interiorul bacteriei, sideroforii au funcția de a chela și de a solubiliza, iar ionii de fier transportați de siderofori sunt preluați de sistemele de transport siderofile.

Când gena mbtB este inactivată, tulpina mutantă este incapabilă să sintetizeze sideroforii derivați din micobactin. Mutantul a demonstrat creștere asemănătoare tulpinii sălbatice, pe medii bogate în fier, și creștere limitată pe mediile sărace în fier. În macrofagele umane mutantul a crescut mai lent, indicând că fagozomul implicat este sărac în fier. Mai mult, excesul de fier exacerbează progresia bolii. Aceste observații sugerează că disponibilitatea în fier, conferită prin activitatea sideroforilor, potențează creșterea și agresivitatea bacteriei.

a10) Nitrat-reductaza. Inițial, M. tuberculosis a fost considerat o bacterie obligativ aerobă, dar numeroase experimente au demonstrat că bacteria poate crește în mediu microaerofil, mai ales în ultimul stadiu al infecției (granuloame). Tulpina sălbatică deține o nitrat-reductază (NarG codată de narG), ce permite utilizarea NO3 ca acceptor final de electroni. Capacitatea bacteriei de a se multiplica în mediu microaerofil sau anaerob din timpul infecției este susținută de prezența nitrat-reductazei.

Principala nitrat-reductază membranară (NarGHI) este răspândită și în rândul enterobacteriilor, precum E. coli (286). Enzima este compusă din trei subunități (, și ) și câțiva cofactori responsabili cu menținerea gradientului transmembranar, atașați enzimei. S-a evidențiat că subunitățile și sunt situate în citoplasmă, în timp ce subunitatea este situată în membrană (figura 11).

Subunitatea , de 104-150kDa, codificată de gena narG, conține perechi de Fe-S și atomi de Molibden ca suport pentru reacțiile oxidative.

Subunitatea , de 43-63 kDa, codificată de gena narH este o proteină globulară ce încorporează perechi de Fe-S implcați în reacțiile de oxido-reducere.

Subunitatea , cu dimensiuni de 19-28kDa, codificată de gena narI, este o proteină hidrofobă transmembranară.

Procesul de nitrificare (conversia oxidativă a amoniului la nitrat) și denitrificara (reducerea nitritului la nitrat), oxizii de nitrogen (NO și NO2) sunt implicați în captarea azotului din mediu (figura12).

Figura 11. Organizarea genelor care codifica nitrat-reductaza membranară.

Figura 12. Ciclul biochimic al azotului

Figura 13. Reacții de reducere a nitrogenului la pro- și eukariote

Reducerea nitratului, cea mai importantă etapă din circuitul nitrogenului în natură, îndeplinește câteva funcții: a) utilizarea NO3—ca sursă de nitrogen; b) producerea de energie rezultată din utilizarea NO3— ca acceptor final de electroni; c) disiparea excesului de energie pentru menținerea balanței de oxido-reducere (figura13). Etapa următoare vizează reducerea nitritului (NO3—) la amoniu (NH4+).

Mycobacterium tuberculosis are acces limitat la nutrienți în țesuturile infectate (177). Nitratul este disponibil în aceste țesuturi, fiind generat spontan din acidul nitric (NO). Asimilarea nitrogenului în metabolismul micobacteriilor este esențială pentru supraviețuirea bacteriei in vivo și in vitro. Asimilarea nitratului de către M. tuberculosis a fost raportată încă din 1958 (61) iar studii mai noi au evidențiat că utilizarea nitratului ca singură sursă de azot este posibilă numai datorită funcțiilor îndeplinite de genele narG și nirB (150).

a11) Proteinele de stress oxidativ. Cele mai multe organisme aerobe dețin enzime care degradează peroxizii și superoxizii, rezultați din arderile celulare odată cu radicalii oxigen. Aceste enzime, superoxid-dismutaze, catalaze și peroxidaze, sunt importante în răspunsul bacterian la stresul oxidativ. Deși celulele fagocitare produc radicali oxigen pentru a stopa invazia bacteriană, aceste enzime conferă bacilului „imunitate”, contribuind la virulența acestuia. Enzimele bacteriene care neutralizează radicalii oxigen includ AhpC, o reductază alchil-hidroperoxid, și SodA și SodC – două superoxid-dismutaze ce degradează superoxizii rezultați din lanțul respirator al fagocitelor.

b) Mecanisme particulare de patogenitate

Bacilii tuberculozei se pot atașa direct de receptorii manoză situați pe macrofage prin glicolipidele manozilate de pe suprafața celulară, LAM, sau indirect, prin receptori pentru complement sau receptori Fc.

b1) Aderența. Adezinele specifice implicate în interacțiunea M. tuberculosis și țesuturile gazdă sunt puțin cunoscute. Au fost decelați câțiva factori de aderență, precum hemaglutinina heparinofila (HbhA), o proteină cu afinitate crescută față de fibronectină, un acid polimorfic și o proteină bogată în glicină numite PE-PGRS. HbhA este o proteină de suprafață implicată în aderarea bacteriilor la celulele epiteliale, dar nu și la fagocite. Proteina ar putea fi implicată în diseminarea extrapulmonară după colonizarea inițială, lentă, a gazdei. Proteinele cu afinitate față de fibronectină (FbpA), identificate inițial ca antigen – (complex Antigen 85), pot adera la matricea extracelulară de fibronectină, in vitro. Proteinele de suprafață PE-PGRS, prezente la M tuberculosis și M. bovis, aderă la matricea de fibronectină.

Recent s-a demonstrat ca Mycobacterium tuberculosis produce pili în cursul infecției organismului uman, pili care pot fi implicați în colonizarea inițială a gazdei (8). Microscopia electronică a demonstrat că bacteria produce o rețea de fibre subțiri, răsucite, asemănătoare pililor (MTP). Cercetările biochimice și genetice au confirmat ca bacilul produce pili, a căror unitate – pilin- este codificată de gena Rv3312A. Serul pacienților cu tuberculoză activă conține titruri ridicate de anticorpi anti-MTP, ceea ce sugerează că această structură este produsă in vivo. MTP izolat aderă la matricea extracelulară de laminină in vitro, demonstrând astfel un rol important în colonizarea gazdei. În condițiile în care MTP este produs in vivo, iar M . tuberculosis este un agent patogen transmis aerogen, este foarte probabil ca acești pili să aibă un rol important în transmiterea infecție. Dacă se va dovedi că MTP este esențială în promovarea infecției, atunci factorul MTP purificat ar putea deveni un potențial candidat ca vaccin.

b2) Complexul Antigen 85. Acest complex este compus dintr-o serie de proteine care leagă fibronectina. Ele ajută bacteria să supraviețuiască sistemului imunitar, și contribuie la formarea granuloamelor.

b3) Multiplicare intracelulară.

M. tuberculosis se poate multiplica intracelular, ceea ce eludează mecanismele de apărare ale sistemului imunitar. Odată fagocitat, bacilul inhibă fuziunea fagocitului cu lizozomul prin secreția unei serii de proteine care modifică suprafața fagozomului. Bacilul poate rămâne în fagozom sau se poate elibera, fără alterarea ciclului său reproductiv.

b4) Detoxifierea radicalilor liberi.

Glicolipidele, sulfolipidele și LAM inhibă mecanismele oxidative citotoxice.

Preluarea bacililor de către macrofage prin intermediul receptorilor pentru complement șuntează activarea enzimelor din lanțul oxidativ.

Reacțiile oxidative pot fi contracarate prin producerea de enzime de tipul catalazei sau superoxid-dismutazei.

b5) Timp lent de reproducere.

Datorită timpului lent de regenerare, M. tuberculosis poate scăpa acțiunii sistemului imunitar, care nu îl recunoaște rapid, sau nu este suficient concentrat la locul infecției pentru a-l elimina. Prin această caracteristică bacilul se alătură altor agenți infecțioși care determină infecții cronice, precum M. leprae, Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi.

b6) Cord factor. Cord factor (trehaloză 6, 6’ dimicolat – TDM) este un glicolipid din structura peretelui celular al micobacteriei, care determină creșterea bacteriană sub formă de corzi, ca rezultat al interacțiunilor intercelulare de suprafață. Este asociat în general tulpinilor înalt virulente și induce constituirea granuloamelor. În infecțiile primare, prezența TDM protejează bacteria de mecanismele de apărare ale gazdei, iar in leziunile cavitare TDM contribuie la menținerea sau agravarea acestora (108). Deoarece monostratul de TDM care captușește suprafața bacteriană este mai rigid și mai stabil decât orice structură a gazdei, acesta permite persistența leziunilor cavitare în condițiile unui sistem imun eficient, capabil să controleze infecția în restul organismului.

b7) Concentrația mare de lipide din structura peretelui celular. Aceasta conferă impermeabilitate celulară și rezistență la agenți antimicrobieni, la acțiunea substanțelor acide sau bazice, la liza osmotică indusă de complement sau atacul lizozomal. Un rol important aste atribuit recent unor enzime care contribuie la sinteza lipidelor ciclopropanate (89). Inelele de ciclopropan se formează în membrana lipidică a bacteriilor sub acțiunea unor sintetaze (cyclopropane fatty acid synthase – CFAS). M. tuberculosis deține cinci astfel de enzime înrudite. Studiile au demostrat că o singură enzimă este suficientă pentru persistența infecției și a virulenței tulpinii bacteriene. Aceste sintetaze devin astfel o potențială țintă în cercetările terapeutice antituberculoase.

Odată cu secvențierea genomului Mycobacterium tuberculosis, metodele genetice sunt utilizate tot mai frecvent pentru studierea factorilor de virulență. De la izolarea sa din 1905, tulpina H37Rv de Mycobacterium tuberculosis și-a găsit numeroase aplicații în cadrul cercetărilor medicale, deoarece și-a păstrat complet virulența pe modelele animale, spre deosebire de unele izolate clinice. Este sensibilă la antibioticele antituberculoase, conferind o bază de manipulații genetice. În 1998 Cole et al. Au pus în evidență genomul complet al acestei tulpini, constând în 4.411.529 perechi de baze cu un conținut de G+C de 65,5% (52). (figura 14).

Abordarea genetică urmărește rolul diferitelor gene, la nivelul cărora se induc modificări, inactivări, deleții, ajustări, pe modelele biologice. Într-un articol de sinteză bine documentat, asupra determinanților virulenței M. tuberculosis, Issar Smith (235) a identificat patru enzime din filtratul culturilor, șapte proteine de suprafață, patru grupe de enzime implicate în metabolismul celular (lipidic, de biosinteză a purinelor, de înglobare a metalelor, participante în reacțiile de oxidoreducere) și trei seturi de modulatori ai transcripției care ar putea influența virulența bacteriană.

Din aproape 4000 de gene din genomul M. tuberculosis, 525 sunt implicate în construirea peretelui celular, 188 codifică proteine modulatoare, iar 91 de gene sunt implicate în virulență, detoxifiere și adaptarea celulară. Peste 200 de gene codifică enzime implicate în metabolismul acizilor grași, ceea ce reflectă capacitatea bacilului de a se multiplica în țesuturile infectate, acolo unde acizii grași pot fi singura sursă de carbon. Aceasta constituie o caracteristică importantă a bacteriei în determinarea patogeniei bolii.

Adaptat după Cole

Figura 14. Genom M. tuberculosis. Cercul extern reprezinta scala incepand cu 0 ca origine a replicarii. Primul cerc arata pozitia genelor stabile de ARN (ARNt in albastru, celelalte in roz) si regiunile repetitive (cubul roz); al doilea cerc arata secventele codificatoare (in sensul acelor de ceasornic – verde inchis, in sens contrar – verde deschis); al treila\ea cerc reprezinta secventele repetitive de ADN (de insertie – portocalii; familia 13E12 REP – roz inchis; profagi – albastru); al patrulea cerc arata pozitia membrilor familiei PPE (verde); al cincilea cerc arata pozitia membrilor familiei PE (rosu, cu exceptia PGRS); si al saselea cerc arata pozitia secventelor PGRS (rosu inchis). Histograma centrala reprezinta continutul in G+C, de peste 65% (galben).

CAPITOLUL 3.

Diagnosticul de laborator al tuberculozei

În diagnosticul de laborator al tuberculozei au fost propuse metode bacteriologice de izolare și identificare a M. tuberculosis în prelevate, metode serologice pentru detectarea anticorpilor specifici circulanți și reacții biologice (cutanate) de evaluare a stării de hipersensibilitate la tuberculină. Diagnosticul de certitudine este conferit însă numai de izolarea și identificarea M. tuberculosis din prelevate. Deși au fost propuse relativ recent și metode serologice de investigare cu sensibilitate înaltă, detectarea nivelului de anticorpi specifici circulanți nu se practică în mod curent. Testul de reactivitate cutanată la tuberculină (IDR) este acceptat în învestigarea curentă de hipersensibilizare la antigenele M. tuberculosis, deși relativ specifice, rămâne în continuare un test screening care poate depista o stare imună hiperreactivă, nu neapărat în relație cu boala, ci cu infecția tuberculoasă, fie naturală, fie prin vaccinare BCG (figura 15).

3.1. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC FENOTIPIC

Baciloscopia –este esențială în investigarea microbiologică a tuberculozei și se practică fie prin microscopia optică pe preparate colorate, fie prin microscopia cu fluorescență.

3.1.1.1. Microscopia optică. Este cea mai simplă, cea mai accesibilă și rapidă metodă de depistare a bacililor acid-alcoolo-rezistenți (BAAR) pe frotiuri din probele biologice, în colorațiile Ziehl-Nielsen (figura 16) sau Kinyoun. Cele două colorații utilizează fucsină bazică și etanol pentru prima etapă, și se bazează pe particularitățile de structură ale micobacteriilor, respectiv conținutul ridicat de lipide la nivelul peretelui celular, care conferă rezistență la decolorarea cu acid-alcool și permite recolorarea cu albastru de metilen în etapa a II-a. Ziehl-Nielsen este o colorație la cald, necesitând încălzirea frotiului la flacără în timp ce frotiul este acoperit cu o soluție de fucsină acidă Ziehl. Colorația Kinyoun este o colorație la rece, inferioară ca performanță colorației Ziehl-Nielsen și în consecință rar folosită (239, 260).

Figura 15. Diagnostic de laborator în tuberculoză

Deși are o specificitate de excepție în microbiologie, colorația Ziehl-Nielsen nu este foarte sensibilă, fiind necesari peste 10.000 bacili/ml de spută pentru a depista prezența BAAR. Unele studii au demonstrat creșterea sensibilității la cca 70%, prin utilizarea hipocloritului de sodiu în tratamentul probei biologice, care lichefiază sputa, conducând la o mai bună concentrare în urma centrifugării. Pe același principiu, tratarea probelor cu detergent Zwitterionic, cunoscut ca C18 carboxi-propibetaină (CB18), realizează o concentrație mai bună a bacililor (249). Sensibilitatea ajunge aproape de 100% prin concentrarea probelor de spută prin citocentrifugare (223). Există proceduri și recomandări ce reglementează citirea și interpretarea examenului microscopic care îi conferă atributul de examen “semnificativ” în funcție de numărul BAAR/câmp microscopic.

3.1.1.2. Microscopia prin fluorescență. În prezent, este reevaluată utilizarea auraminei ca metodă pe bază de fluorescență, pentru detectarea micobacteriilor în spută, ajungându-se la o formulă îmbunătățită prin combinarea auramină-O cu rodamină (14, 243). Prin examinare la o magnitudine mai mică, metoda are o rată mai bună de depistare a M. tuberculosis. În acest sens, un studiu care a cuprins 167 laboratoare, a relevat rezultate mai bune prin examinarea în colorație fluorescentă, prin comparație cu Ziehl-Nielsen sau Kinyoun (239). Deoarece sunt mai costisitoare, metodele bazate pe fluorescență sunt utilizate curent numai în laboratoarele care colectează și prelucrează un număr mare de probe biologice (140).

Figură 16. BAAR pe frotiu în colorație Ziehl Nielsen

Izolarea și cultivarea

Medii convenționale

În prezent sunt utilizate diferite medii de cultură pentru izolarea micobacteriilor. Majoritatea conțin ou și verde malachite în concentrație crescută pentru inhibarea bacteriilor de contaminare. Cele mai folosite medii sunt Löwenstein-Jensen (LJ) (figura 16) și Ogawa. În general, după centrifugare, sedimentul este inoculat în 2 flacoane cu mediu LJ. În zonele cu incidență crescută de tuberculoză bovină este necesară utilizarea în plus a mediului Stonebrink. M. bovis și alte două specii din complexul M. tuberculosis (M. microti și M. africanum) sunt incapabile să utilizeze glicerolul din mediu LJ, deoarece nu dispun de enzima piruvat-kinază. În consecință aceste specii nu vor crește pe mediu LJ care conține glicerol ca unică sursă de C (123). Mediul Stonebrink are aceeași compoziție ca LJ, cu deosebirea că glicerolul este înlocuit cu soluție de piruvat de sodiu 0,5%. În condițiile în care cele mai multe laboratoare de diagnostic nu folosesc mediul Stonebrink, există o mare probabilitate de subestimare a M. bovis ca agent etiologic al tuberculozei umane, mai ales în țările în curs de dezvoltare.

www.cdc.com

Figură 17. Mycobacterium tuberculosis pe mediul Löwenstein-Jensen.

Mediul Ogawa are are o compoziție asemănătoare cu mediul LJ, dar este mai economic datorită înlocuirii asparaginei cu glutamatul de sodiu (mai ieftin și mai disponibil). Mediul Ogawa modificat la pH 6,4 este un mediu acidifiat, astfel încât să permită inocularea directă a probelor biologice după decontaminare prin metoda Kudoch.

În trecut, pentru izolarea bacilului Koch au mai fost promovate variante pe bază de ou a mediilor Ogawa și LJ, mai convenabile, deși mai dificil de preparat.

Mediile Middlebrook 7H10 și 7H11 au la bază agar și sunt îmbogățite cu acid oleic, albumină, dextroză și catalază (OADC). Middlebrook 7H9 este un mediu lichid îmbogățit cu ADC. Pentru aceste medii se recomandă incubarea în atmosferă 5%-10% CO2. Deși au o sensibilitate mai mare, au dezavantajul de a fi costisitoare.

Agar-sânge este un mediu de cultură alternativ pentru izolarea micobacteriilor, la fel de eficient ca și mediile pe bază de ou. M. tuberculosis crește pe plăcile cu agar-sânge în 1-2 săptămâni. S-au raportat chiar creșteri mai substanțiale, ca număr de colonii, pe aceste medii (64). Studii preliminare sugerează utilizarea mediilor agar-sânge pentru testarea sensibilității M. tuberculosis la izoniazidă, rifampicină, etambutol sau streptomicină, cu rezultate mai rapide (2 săptămâni), decât pe mediu Middlebrook 7H10 (3 săptămâni) (50,51). Desicarea, un neajuns major al mediilor turnate, poate fi prevenită prin sigilarea plăcilor cu ajutorul unor benzi adezive sau prin înlocuirea plăcilor cu flacoane. Plăcile cu mediu agar-sânge sunt disponibile în cele mai multe laboratoare de bacteriologice. În absența unor medii specifice pentru izolarea micobacteriilor, acestea pot fi folosite în laboratoarele cu resurse limitate.

3.1.2.2. Medii neconvenționale

a) Echipamente automatizate

În 1980, introducerea sistemului automat de cultivare BACTEC TB-460 (Becton Dickinson, Sparks, MD) a permis detectarea M. tuberculosis în 5-10 zile, față de săptămânile necesare în metodele convenționale. Este o metodă radiometrică, care utilizează mediu modificat Middlebrook 7H9, în care acidul palmitic – unică sursă de carbon, este marcat radioactiv cu 14C, iar faza gazoasă din flaconul etanșeizat conține CO2 5%. Bacteriile de contaminare sunt inhibate de un amestec de antibiotice – PANTA (polimixină B, amfotericină B, acid nalidixic, trimetoprim și azlocilină), – care nu elimină însă etapele de decontaminare ale probelor. Pe măsură ce micobacteriile se dezvoltă în mediu, acidul palmitic este metabolizat, rezultând CO2 radioactiv. Gazul din flacon este aspirat ulterior și analizat pentru depistarea radioactivității CO2, ca marker al prezenței micobacteriilor. Adăugarea de β-nitro α-acetilamină β hidroxi-propiofenonă (NAR) contribuie la diferențierea M. tuberculosis – pe care îl inhibă specific, – de alte bacterii (121). Citirea se efectuează de obicei de două ori pe săptămână în primele 15 zile, apoi săptămânal până la 42 zile. Sistemul este superior cultivării pe medii solide, atât ca sensibilitate, cât și ca timp necesar pentru pozitivarea culturilor (232). Chiar și după 20 ani, deși au fost elaborate noi sisteme performante, BACTEC rămâne o metodă competitivă (205). Dezavantajul metodei îl constituie costurile de achiziționare a aparaturii, dar și cele necesare pentru depozitarea și izolarea deșeurilor radioactive.

În 1996, Becton Dickinson propune un nou sistem, bazat pe detectarea creșterii micobacteriilor în lumină fluorescentă. Mycobacteria growth indicator tube (MGIT) utilizează mediu Middlebrook 7H9 modificat, precum și un senzor fluorescent dependent de oxigen. Dezvoltarea micobacteriilor conduce la consumul de oxigen, ceea ce declanșează emisia de lumină fluorescentă, vizibilă la iluminare cu lampa UV. Metoda a fost evaluată în numeroase studii clinice, dovedind o sensibilitate de cca 93%, față de 83% pe mediul LJ (15).

Aceeași firmă dezvoltă câțiva ani mai târziu, o nouă metodă care le sintetizează pe cele două menționate anterior, în sistemul automatizat și non-radiometric BACTEC MGIT 960. Acesta utilizează mediu Middlebrook 7H9, suplimentat cu o mixtură de acid oleic, albumină, dextroză și catalază (OADC), la care se adaugă un amesctec de antibiotice PANTA (polimixină B, amfotericină B, acid nalidixic, trimetoprim și azlocilină) pentru prevenirea contaminărilor. Sistemul funcționează după principiul MGIT, iar citirea se efectuează automat, la interval de o oră, semnalizând pozitivarea culturilor prin detectarea semnalului fluorescent. Un studiu comparativ a relevat diferite grade de sensibilitate pentru BACTEC MGIT 960, Middlebrook 7H11 și LJ de 93%, 76%, respectiv 79% (109). Timpul de pozitivare a culturilor a fost în medie de 12,7 zile în BACTEC MGIT 960. Dezavantajul metodei rămâne costul ridicat al tehnologiei, ceea ce îl face disponibil doar în laboratoarele spitalelor mai specializate.

VersaTREK, cunoscută anterior ca ESP culture II, este comercializată de Trek Diagnostic Systems și utilizează o tehnologie proiectată inițial pentru hemoculturi. Se bazează pe detectarea modificărilor de presiune în flaconul cu mediu de cultură, prin consumul de oxigen, odată cu dezvoltarea micobacteriilor. Este folosit mediul Middlebrook 7H9 îmbogățit cu OADC, la care se poate adiționa două amestecuri de antibiotice. Prima, denumită AS, cuprinde polimixina B, azlocilină, fosfomicină, acid nalidixic, și amfotericina B. Celălalt amestec conține polimixina B, vancomicină, acid nalidixic și amfotercină B (PVNA). De obicei, AS este utilizat pentru probele clinice cu risc scăzut de contaminare, în timp ce PVNA este folosit pentru prelevatele contaminate. În ambele cazuri este urmată etapa de decontaminare, necesară înainte de inoculare pe mediu. Flacoanele sunt incubate și monitorizate automat (figura 17), semnalând pozitivarea culturilor și oprirea incubării. Unele studii, în care s-a comparat eficiența metodei cu rezultatele obținute prin culturi pe medii solide, au demonstrat superioritatea sistemului față de metodele clasice (275). VersaTREK poate aprecia în plus, creșterea micobacteriilor în hemoculturi.

MB/BacT (Organon Teknika, Boxtel, Olanda) este o metodă non-radiometrică, computerizată, care se bazează pe detectarea colorimetrică a producrerii de CO2 eliberat de culturile de micobacterii. Tuburile cu mediu lichid 7H9 au fixate în partea declivă un detector colorimetric, a cărui culoare virează de la verde închis la galben, pe măsura acumulării CO2, produs în cursul metabolismului micobacterian. Un dispozitiv reflectometric înregistrează la fiecare 10 minute lumina reflectată la nivelul detectorului, care crește odată cu virajul culorii acestuia. Când multiplicarea bacteriană atinge o densitate de 106-107 gemeni/ml aparatul semnalează optic și sonor pozitivarea culturii. Mediului de cultură i se adaugă în prealabil o soluție cu factori care stimulează multiplicarea germenilor („soluție de constituire”), iar în cazul produselor patologice contaminate cu floră microbiană – o mixtură de antibiotice în scopul prevenirii suprainfectării culturii. În tuberculoza pulmonară, rezultatul pozitiv se obține în medie cu 10 zile mai devreme decât prin folosirea mediilor solide clasice. În 20-25% din cazuri, semnalul pozitiv poate apărea în 5-7 zile (31). Alte studii comparative au demonstrat reducerea timpului de pozitivare a culturii la 11,3 zile, față de metodele clasice, pentru probele de spută baciloscopic pozitive (167).

BacT/Alert 3D este comercializat de bioMerieux Bact și are la bază același principiu. Creșterea concentrației de CO2 diminuă pH-ul mediului, ceea ce determină virajul de culoare al unui indicator special, de la verde la galben, și este ulterior înregistrat de o unitate reflectometrică. Sistemul este programat să citească rezultatele la fiecare 10 minute și să le transmită automat. Este utilizat mediul Middlebrook 7H9 îmbogățit cu OADC și un amestec de 6 antibiotice (polimixina B, amfotericina B, acid nalidixic, trimetoprim, vancomicină, azlocilină) pentru inhibarea bacteriilor de contaminare. Studii comparative au demonstrat eficiența metodei față de metodele clasice, prin sensibilitatea crescută și timpul scurt până la pozitivarea culturilor (29, 205).

Figură 1. Sistemul VersaTREK.

b) Echipamente utilizate manual

Metode bazate pe utilizarea bacteriofagilor ca indicatori au la bază capacitatea M. tuberculosis de a „găzdui” și susține perpetuarea micobacteriofagilor infectanți. Numărul fagilor endogeni, reprezentând numărul de bacili Koch viabili, este determinat pe o cultură de micobacterii cu creștere rapidă, precum M. smegmatis (161). Cunoscută în forma comercială ca FASTPlaque TB (BIOTEC, Ipswich, Suffolk, UK), metoda are avantajul de a reduce timpul de confirmare a diagnosticului. Prezintă o sensibilitate de 50-65%, iar specificitatea e de 98% pentru probele baciloscopic negative. Sensibilitatea crește la 87,4% și specificitatea la 88,2% pentru sputele pozitive (5, 180). Recent, au fost propuse și alte metode cu ajutorul fagilor „reporter”, purtători de luciferază, care necesită evaluări clinice în țările endemice (16).

Observarea microscopică a microcoloniilor (Microscopic observation broth-drug susceptibility assay – MODS) pe mediu solid (agar 7H11) sau lichid (agar 7H9) a fost descrisă ca metodă de diagnostic, precum și de testare a sensibilității micobacteriilor. Principiul metodei constă în depistarea precoce a trăsăturilor caracteristice culturii de M. tuberculosis, pe mediile lichide (figura 19), cu ajutorul unui microscop inversat (39). Cu o sensibilitatea de 92%, și un timp de detectare de cca 9 zile, MODS a fost propusă ca metodă ieftină, rapidă, specifică și sensibiă, pentru diagnostic și testarea sensibilității în țările în curs de dezvoltare (193). În acest sens, un studiu efectuat în Peru (171) a confirmat eficiența metodei prin sensibilitate de 97,8%, față 89% în sistemele automate de cultură și 84% pe mediul LJ. Dezavantajul îl constituie costurile necesare pentru microscopului inversat, mediul lichid 7H9 îmbogățit cu OADC, suplimente antimicrobiene, și laborator de nivel 2 biorisc dotat cu personal înalt calificat (39). Mediile însămânțate și incubate sunt examinate microscopic la 2-3 zile. Până în ziua a 7-a, pot fi detectate microcolonii de micobacterii cu creștere lentă, precum M. tuberculosis (162).

Agarul în strat subțire (thin layer) 7H11 (TL7H11) permite detectarea a peste 60% din culturile pozitive în primele 10 zile, și peste 80% după două săptămâni de incubare, comparativ cu 10% pe mediul Löwenstein-Jensen (162). Într-un raport cuprinzând 1800 probe biologice, Mejia G.I et al. a relevat o sensibillitate de 72% pentru TL7H11, comparativ cu mediul convențional LJ, și a apreciat că utilizarea simultană a ambelor medii ar crește semnificativ rata de detectare a M. tuberculosis (163). Timpul mediu necesar pentru pozitivarea culturilor a fost de 11,5 zile pentru TL7H11, față de 30,5 zile pentru LJ (214). În aceste condiții, mediul pare suficient de eficient pentru evaluarea aplicării pe scară largă.

www.TuberculosisTextbook.com

Figură 19. Microcolonii de M. tuberculosis după, 4, 6, 8 și 15 zile de incubare.

Septi-check AFB (Roche) reprezintă un sistem cu mediu bifazic, care constă într-un mediu selectiv lichid îmbogățit cu glucoză, glicerină, acid oleic, piridoxal, catalază, albumină, polioxietilen-40-stearat, și suplimentat cu antibiotice (azlocilină, acid nalidixic, trimetoprim, polimixină B și amfotericină B), în care se introduce o lamelă compartimentată în 3 sectoare inegale, și acoperită cu agar chocolat, agar pe bază de ou, respectiv agar 7H11 modificat. O față a lamelei e acoperită de Middlebrook 7H11 cu și fără nitroacetil-aminohidroxipropiofenonă (NAP) pentru diferențierea M. tuberculosis de alte micobacterii. Cealaltă față, divizată în 2 părți, conține mediu LJ modificat, respectiv agar chocolat pentru detectarea contaminanților. Această metodă non-radiometrică are câteva avantaje: timp mai scurt de depistare a micobacteriilor, atmosfera de incubare lipsită de CO2, detectarea simultană a M. tuberculosis, micobacterii non-tuberculoase, și alți germeni aerobi, inclusiv contaminanți. Un studiu multicentric condus în SUA a demonstrat rezultate mai bune în comparație cu alte metode, incluzând și BACTEC 460 TB (111).

TK-Media reprezintă un sistem rapid de cultură care diferențiază creșterea micobacteriilor de contaminanți. Mediul conține un complex de indicatori de culoare, care variază în funcție de metabolismul bacteriilor, mult înainte de apariția coloniilor. Mediul este practic, ieftin, sigur, și nu presupune utilizarea de substanțe radioactive sau lumină UV. Poate fi folosit în format manual sau automat – cuplat cu un incubator Mycolor TK, ce procesează automat rezultatele (225).

Testul nitrat-reductazei (NRA) se bazează pe proprietatea micobacteriilor de reducere a nitratului la nitrit. În acest sens, ajustarea mediului LJ cu KNO3, permite detectarea precoce a creșterii bacililor, cu ajutorul unui reactiv cristalin care declanșează virajul de culoare a lichidului de condens. Virarea culorii în roșu presupune creștere bacteriană și în consecință cultura respectivă este rezistentă la antibioticul testat. Absența virajului denotă inhibiția creșterii și se interpretează că tulpina este sensibilă. NRA permite o detectare rapidă a creșterii micobacteriilor, prin comparație cu metodele convenționale de creștere bacteriană.

3.1.3. Identificarea

Identificarea micobacteriilor prin metode fenotipice se bazează pe caracteristicile lor morfologice, de cultivabilitate, metabolice (enzimatice) și structurale (antigenice).

3.1.3.1. Caracteristici morfologice

Micobacteriile sunt bacili fini, cu dimensiuni de 0,2-0,6m, uneori ramificați, cu aspect de litere unghiulare. În culturile tulpinilor virulente de Mycobacterium sp (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis), microorganismele se pot dispune în paralel, formând corzi flexuoase, ce pot fi observate pe frotiuri, atât din creșterea pe medii solide, dar și pe medii lichide, lipsite de agenți tensioactivi. Dispoziția bacililor în corzi se datorază unui sulfolipid de perete, factorul „cord” (considerat factor de virulență). Tulpini de tip „R” tind să formeze corzi mai laxe, mai puțin bine definite decât M. tuberculosis.

3.1.3.2. Caracteristici de cultivabilitate

Diferențierea culturilor se realizează după temperatura de incubare/ viteza de creștere/ morfologia culturilor/ pigmentare și fotoreactivitate.

Identificarea inițială a M. tuberculosis se bazează pe observarea bacililor acido-alcoolo-rezistenți, prelevați din colonii rezultate în urma incubării la 37°C pe mediul LJ cu glycerol sau piruvat. Primocultura apare după 2-4 săptămâni, iar subculturile după 1-2 săptămâni. Coloniile sunt crem, rugoase, uscate, neregulat proeminente, conopidiforme, greu emulsionabile. Pe frotiul din cultură apare în grămezi sau sub formă de corzi (30).

3.1.3.3. Caracteristici exoenzimatice

Testul producerii de niacină

Acidul nicotinic sau niacina este produs de toate micobacteriile, dar în special de M. tuberculosis, M. simiae și M. bovis BCG prin blocarea căii de metabolizare a acestuia. Niacina acumulată în mediul de cultură este evidențiată de prezența unui pseudohalogen și o amină primară. Micobacteriile niacin-negative sunt foarte rare.

Creșterea în prezența acidului p-nitrobenzoic

Acest acid inhibă creșterea anumitor specii de micobacterii: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti.

Reducerea nitraților

Acest test este foarte util în diferențierea M. tuberculosis, care generează o reacție pozitivă, de M. bovis care nu are capacitatea de a reduce nitratul (tabel 1).

Testul catalazei

Catalaza este o enzimă intracelulară care transformă hidrogenul peroxid în hidrogen și apă. Testul efectuat la 68°C măsoară activitatea catalazei la temperaturi înalte. M. tuberculosis are o reacție negativă, ca și celelalte specii din complexul M. tuberculosis.

Testul pirazinamidazei

Pirazinamidaza este o enzimă care hidrolizeazză pirazinamida la amoniac și acid pirazinoic. Testul este util îndiferențierea M. tuberculosis (pozitiv) de alte specii din complexul M tuberculosis (negative), cu excepția M. canettii, care este pozitiv. Unele tulpini de M. tuberculosis pot dobândi rezistență la pirazinamidă datorită presiunii de selecție induse de această substanță. În consecință, aceste tulpini vor conduce la rezultate negative la acest test.

Creșterea în prezența acidului thiofen-2-carboxilic (T2H)

Acest test este util pentru diferențierea M. tuberculosis care hidrolizează acest compus, de alți membrii din complexul M. tuberculosis. M. canettii și majoritatea micobacteriilor non-tuberculoase sunt deasemeni pozitive.

Alte teste teste biochimice necesare pentru identificarea coloniilor necromogene sunt toleranța la soluție de NaCl 5%, creșterea în prezența ureazei sau arilsulfatazei.

Tabel 1. Caracteristici fenotipice și biochimice ale unor specii de Mycobacterium.

3.1.3.4. Profilul lipidic

Micobacteriile dețin la nivelul peretelui celular un conținut lipidic crescut. Aceste lipide includ acizi micolici, și alți acizi grași saturați sau nesaturați. Acizii micolici sunt acizi grași cu lanț lung, ramificați și sunt prezenți numai la anumite bacterii. Cea mai mare lungime o ating în cadrul peretelul M. tuberculosis (tabel 2).

Tabel 2. Lungimea acizilor grași pentru diferite specii bacteriene

Analiza conținutului lipidic din peretele micobacteriei este utilizată în scopul indentificării speciei. Tehnicile exploatează proprietățile fizice ale lipidelor, de a se se distribui într-o fază fixă, și una mobilă la nivelul peretelui celular. Prima etapă a metodelor constă în extragerea conținutului lipidic din coloniile bacteriene.

Thin-layer chromatography (TLC)

Se utilizează placi subțiri de siliciu la care aderă prin capilaritate acizii micolici extrași din tulpinile micobacteriene, în funcție de afinitatea specifică pe care o manifestă pentru solvent. După colorarea acestor plăci, fiecare specie prezintă un profil al acizilor micolici diferit, după care se pot ulterior identifica prin raportare la profiluri cunoscute (146, 130) ale tulpinilor de referință (figura 20). Dezavantajul metodei este dat de sensibilitatea scăzută. Folosind numai șapte tipuri de acizi micolici, profilurile micobacteriilor patogene generate prin metoda TLC sunt foarte numeroase.

Luquin M, J Clin Microbiol 1991, 29:122

Figura 20. Cromatograme TL de metil-micolați pentru M. tuberculosis ATCC 272294T (linia 1), M. intracellularae ATCC 29548T (linia 2), M. fortuitum ATCC 6841T (linia 3), M. simiae ATCC 25270T (linia 4). Analiza TLC a fost efectuată cu 2 sisteme de diluție n-hexan-eter (A) și diclorometan (B). I, α-mycolat; II, α'-mycolat; III, metoxi-mycolat; IV, keto-mycolat; V, epoxi-mycolates; VI, wax-ester mycolat. F: solvent front.

Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Metoda analizează prezența acizilor grași cu lanț scurt în peretele celular micobacterian. Conținutul gazos (faza mobilă) este utilizat pentru pasajul probei biologice prin conținutul lichid (partea imobilă) aflat într-o coloană. Lipidele extrase din tulpina micobacteriei sunt injectate în aceste medii, iar ridicarea temperaturii până la 300°C conduce la clivajul acizilor grași în esteri cu 22, 24, sau 26 atomi carbon, rezultând în același timp și acizi grași nesaturați (inclusiv acidul tuberculostearic) și alcool. În funcție de acești produși de reacție se definesc diferite profiluri de identificare ale speciilor micobacteriene (figura 21), prin spectrometrie (137, 48).

Acest sistem de identificare a fost adaptat și perfecționat de Mycrobial ID Inc (MIDI, Newark, DE) pentru identificarea a peste 30 specii. Sistemul identifică în mod corect 77% din tulpinile de M. tuberculosis și 83% din cele de M. avium (234). În concluzie, identificarea prin acest sistem trebuie completată cu alte teste biochimice sau morfologice, eventual teste de biologie moleculară (66). Un alt dezavantaj al metodei constă în problemele de reproductibilitate și în capacitatea scăzută de a diferenția numeroasele specii de micobacterii.

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Metoda utilizează presiune înaltă pentru a mobiliza faza lichidă, ce conține extrasul micobacterian, prin porțiunea solidă prezentă în coloană. Acizii micolici extrași sunt separați la momente diferite în coloană, realizând un profil unic, specific. Evidențierea se face pe baza unui sistem ce utilizează fie lumina UV, fie lumina fluorescentă, mai sensibilă. O aplicație mai performantă o reprezintă SIMS (Sherlok Mycobacterian Identification System) – un program computerizat care identifică speciile de micobacterii pe baza profilului de acizi micolici (figura 22) generat prin HPLC (73).

Deși metoda prezintă o specificitate înaltă pentru identificarea anumitor specii micobacteriene, unele sisteme HPLC sunt inconsecvente în identificarea acestora. Unele sunt adaptate pentru depistarea M. tuberculosis complex și M. avium complex, în lumină

Adaptat după Chou S J

Figură 21. Cromatograme ale M. fortuitum, M. genavense, M. simiae și M. tuberculosis. TBSA: acid tuberculostearic.

fluorescentă, direct din mediul BACTEC 12B în care s-a însămânțat inocul confirmat microscopic (124), precum și din flacoanele de VersaTrek Myco (134).

Figura 22. Cromatograma HPLC pentru M. tuberculosis

METODE MOLECULARE DE DIAGNOSTIC

Metodele moleculare sunt utilizate curent pentru detectarea BK direct în prelevate, dar îndeosebi pentru a diferenția speciile tuberculoase de cele non-tuberculoase de micobacterii. În plus, identificarea acizilor nucleici permite tipizarea bacteriei și determinarea profilurilor epidemiologice utile în monitorizarea profilaxiei bolii. Aceste metode se dovedesc rapide și fiabile pentru identificarea germenilor direct din probele de spută, confirmate sau nu microscopic (20).

Hibridizarea acizilor nucleic prin amplificare PCR a devenit cea mai răspândită tehnică de caracterizare a acizilor nucleici pentru micobacterii, încă din 1989 când Brisson-Noel et al. au realizat primele aplicații pentru diagnosticul tuberculozei (20). În anii următori au fost elaborate metode alternative de amplificare, incluzând strand displacement amplification (SDA), transcription-mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), Q-Beta replicase amplification, branched deoxyribonuclic acid (DNA) signal amplification (bDNA), reporter mycobacteriophage methods (firefly luciferase assay) (tabel 3). Obiectivele comune ale tuturor acestor metode de amplificare in vitro sunt: 1) reducerea timpului necesar detectării agentului patogen; 2) creșterea sensibilității și specificității; 3) simplificarea diagnosticului prin automatizare și elaborarea de tenhici non-isotopice.

Metodele moleculare descrise anterior pot fi grupate în 3 categorii: (1) sisteme de amplificare a țintei moleculare (acizi nucleici ARN sau ADN mycobacterieni); (2) sisteme de amplificare a sondei sau primerilor, care exploatează capacitatea de hibridizare a unor sonde (primeri) la țintele moleculare, precum și activitatea enzimatică necesară sintezei sau modificării ADN sau ARN; (3) sisteme de amplificare a semnalului, prin care semnalul generat de sonde este augmentat prin ramificarea neenzimatică a acestora (tabel 3).

În același timp, metodele moleculare se împart în metode directe, care depistează prezența M. tuberculosis direct în probele bologice, și metode indirecte, care permit identificarea micobacteriilor din culturi.

Tabel 3. Metode de amplificare a acizilor nucleici in vitro pentru detectarea M. tuberculosis

NAA: nucleic acid amplification techniques; PCR: polymerase chain reactin; TMA: transcription-mediated amplification; SDA: stradn displacement amplification; NASBA: nucleic acid sequence-based amplification; ADNdc: ADN dublucatenar; ADNmc: ADN monocatenar; ADNc: ADN complementar; ARNr: ARN ribozomal; Q-Beta: Q-Beta replicase amplification; bADN: branch ADN signal amplification; *: tehnici în curs de dezvoltare

Adaptat după Roth et al., 1997

3.2.1. Metode de detecție

Metodele moleculare bazate pe amplificarea PCR au avantajul de a fi aplicate direct probelor biologice, scurtând timpul necesar identificării. Sunt utilizate câteva secvențe specifice: IS6110, regiunile 16S și 23S din ARNr, regiunile DR. Dacă metodele clasice de diagnostic presupun 3-8 săptămâni de incubare a mediilor solide însământate, și cel puțin 2 săptămâni în sistemul BACTEC cu mediu lichid, metodele de amplificare a acizilor nucleici micobacterieni direct din produsul patologic permit identificarea bacililor în timp record. Food and Drug Administration a aprobat două astfel de teste directe: Enhanced Mycobacterium tuberculosis Direct Test (E-MTD; Gen-Probe, San Diego, CA) și Amplicor Mycobacterium tuberculosis Test (Amplicor; Roche Doagnostic Systems, Inc., Branchburg, NJ).

Amplicor Mycobacterium tuberculosis Test (Amplicor; Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, NJ) se bazează pe amplificarea standard PCR a ADN-ului bacterian pentru detectarea micobacteriei direct din probele biologice. ADN-ul micobacterian este amplificat cu primeri specifici, corespunzători genei ARNr 16S. După amplificare, ampliconii sunt denaturați, apoi conjugați, pentru a reacționa ulterior cu peroxid și 3,3' ,5,5'- tetrametilbenzidina în soluție de dimetilformamidă, pentru a forma un complex colorat. Rezultatele sunt cuantificate cu ajutorul unui fotometru. Contaminarea cu produși restanți, din ciclurile de amplificare anterioare, este eliminată prin încorporarea în reacție a dUTP (deoxiuridină trifosfat) și o enzimă de restricție: uracil-N-glicozilază. După procedurile de decontaminare standard, cu N-acetil-L-cisteină-NaOH, rezultatele sunt disponibile în cca 6,5 ore (236). Sensibilitatea metodei pentru probele biologice recoltate de la nivelul căilor respiratorii, este de 79,4-91,9%, iar specificitatea de 99,6-99,8%, fiind capabilă să diferențieze între tulpinile M. tuberculosis și cele non-tuberculoase (276). Pentru probele neconfirmate microscopic (BAAR negative) sensibilitatea metodei scade la 40-73% (236). De aceea testul Amplicor a fost aprobat de FDA pentru detectarea M. tuberculosis doar din probele respiratorii BAAR pozitive. Chin et al. (45) au raportat sensibilitate comparabilă cu cea din culturi (54% față de 56%) pentru depistarea M. tuberculosis în specimene respiratorii, în condițiile în care definiția de caz pentru tuberculoză a fost utilizată ca referință standard. Un alt studiu, condus de Al Zahrani et al., deși a demonstrat o specificitate de 100%, a relevat o sensibilitate de numai 42% față de 73% în culturi, pentru tuberculoza pulmonară neconfirmată microscopic (4).

Enhanced Mycobacterium Direct Test (E-MTD; Gen-Probe, San Diego, CA), presupune amplificarea țintei prin metode non-PCR, și anume prin transcription-mediated amplification (TMA). ARNr eliberat din celule prin sonicare oferă ținte de legare pentru un primer-promoter, la nivelul căruia revers-transcriptaza inițiază transcrierea către un compus hibrid ADNc-ARN. După degradarea catenei de ARN, un al doilea primer se leagă la ADNc care este extins la ADNc dublucatenar, pe care polimeraza ADN îl utilizează pentru formarea de noi molecule ARNr. Produșii ARN astfel obținuți sunt noi matrițe de transcriere și amplificare. Ampliconii ARN sunt detectați cu ajutorul unei sonde ADN. Procedura este izotermică, iar reacțiile se desfășoară într-un singur tub, reducând astfel riscurile de contaminare. După procedurile standard de decontaminare a probelor biologice, testul oferă rezultate în 3,5 ore. Sensibilitatea generală a testului, pentru specimenele respiratorii, comparată cu rezultatele obținute din culturile clasice, este de 90,9-95,2%, iar specificitatea de 98,8-100% (236). E-MTD este aprobată de FDA atât pentru probele biologice confirmate microscopic, cât și pentru cele neconfirmate.

FDA a emis o suită de recomandări de aplicare directă și utilizare a testelor NAA în clinică (42). În acest sens, este recomandată recoltarea de probe de spută în 3 zile diferite pentru a fi analizate în microscopia optică și cultivate pe medii clasice. Testele NAA ar trebui aplicate pentru prima probă biologică, prima probă confirmată microscopic sau alte probe dacă este necesar. Dacă prima probă clinică este BAAR pozitivă și deasemeni pozitivă la testul NAA, atunci pacientul este foarte probabil să aibă tuberculoză. Dacă proba este BAAR pozitivă, dar NAA negativă, metoda moleculară trebuie reevaluată pentru inhibitori biologici. Această variantă este valabilă pentru Amplicor, dar dacă este utilizat E-MTD, atunci trebuie testată o probă biologică la care să se adiționeze ADN micobacterian. Dacă nu sunt detectați inhibitori biologici și testul rămâne negativ, pacientul este infectat foarte probabil cu o micobacterie non-tuberculoasă. Dacă există inhibitori biologici atunci testul NAA nu este relevant. Dacă cel puțin două produse patologice, provenind de la același pacient, neconfirmate microscopic sunt pozitive la testarea NAA, atunci diagnosticul de tuberculoză este foarte probabil. În cazul în care produsele de spută sunt BAAR negative și NAA negative, pacientul poate fi considerat necontagios, dar diagnosticul de tuberculoza activă nu este infirmat, fiind necesară o evaluare clinică și epidemiologică riguroasă în vederea instituirii terapiei (42, 277).

Deoarece metodele clasice de identificare, după caractere fenotipice sau biochimice, pot conduce la rezultate variabile pentru aceeași specie, uneori fără să conducă la o identificare definitivă, metodele moleculare de identificare sunt apreciate și aplicate pe scară din ce în ce mai largă.

3.2.1.1. Metode de hibridizare cu sonde ADN

Sistemul AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, CA) a fost proiectat în urmă cu 20 ani, și rămâne încă suficient de apreciat prin simplitatea procedurilor. Este singurul sistem de hibridizare care nu necesită amplificarea anterioară a sondei (193). Sonda ADN monocatenară este complementară unei secvențe specifice de specie, de la nivelul regiunii hipervariabile 16S ARNr și este marcată cu o moleculă chemiluminescentă. După lizarea celulelor micobacteriene prin sonicare, extractul este amestecat cu sonda, și supus unor proceduri standard, conducând la hibridizarea sondei ADN cu ARNr, prin complementaritate perfectă. Fenomenul de hibridizare este însoțit de emisie de lumină, detectabilă cu ajutorul unui fotometru. Timpul de identificare a bacteriei din cultura pozitivă este de cca 2 ore, iar aparatura necesară constă într-un sonicator și un luminometru.

Sistemul a dovedit sensibilitate și specificitate de 100%, respectiv 97% (253) și este capabil să identifice numeroase specii clinice: M. tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. avium complex, M. kansasii, M. gordonae, dar nu poate diferenția între membrii complexului M. tuberculosis.

BD ProbeTec ET (Becton Dickinson, Sparks, MD) are ca principiu isothermal strand displacement amplification (SDA), prin care se produc numeroase copii ale secvenței IS6110, și utilizează ADN polimeraza. Procesul constă într-o fază inițială de multiplicare a țintei cu ajutorul a două perechi de primeri, urmată de elongație și eliberare de ampliconi. În faza de amplificare exponențială, ampliconii sunt multiplicați cu ajutorul unor enzime de restricție. Sonda complementară IS6110 este dispusă sub formă de ansă și marcată cu două molecule fluorescente, plasate la capete, care se anulează reciproc dacă sunt cuplate, aparținând categoriei de sonde numite „molecular beacons”. După hibridizare, ansa se desface, eliberând cele două molecule fluorescente, cu emisia unui semnal fluorescent. Deși nu este aprobat încă de FDA, studiile demonstrează o sensibilitate care variază între 98,5-100% pentru probele confirmate microscopic (193).

Line-probe assay utilizează revers hibridizarea cu ajutorul unor sonde ADN imobilizate pe un suport de nitroceluloză. Secvețele ADN țintă sunt extrase și amplificate PCR, apoi sunt incubate înpreună cu sondele. După hibridizare, sondele marcate chemiluminescent vor apărea sub formă de benzi colorate. Metodele comerciale disponibile în prezent, care se bazeaza pe acest principiu sunt INNO-LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics, Ghent, Belgium), GenoType Mycobacterium (Hain, Germany) și GenoType MTBC (Hain, Germany).

Sondele sistemului INNO-LiPA constau în secvențe specifice de specie, cuprinse în regiunea 16S-23S a ARNr și conțin o sondă specifică genului Mycobacterium, două sonde specifice de complex (M. tuberculosis și M. avium), și alte 23 sonde care permit identificarea a 18 specii micobacteriene. Rezultatele sunt disponibile în 3 ore (165). O meta-analiză recentă, care cuprinde 14 studii, a relevat o sensibilitate de cel puțin 95% și specificitate de 100% (174).

Sondele sistemului GenoType Mycobacterium sunt fragmente ale regiunii 23S ARNr, comune mai multor specii. În acest caz, identificarea nu se bazează pe specificitatea unui complex hibrid, ci pe profilurile (figura 23) realizate de combinațiile care caracterizează o anumită specie (222). Sistemul cuprinde 2 kituri: unul (GenoType CM) identifică cele mai frecvente specii de micobacterii cu ajutorul a 17 sonde; celălalt (GenoType AS) include 18 sonde pentru identificarea speciilor mai puțin comune. Studiile releva o specificitate de 92,4% și 99,3% și sensibilitate de 97,9% și 99,3% pentru kiturile CM, respectiv AS.

Adaptat după Rossau C, J Clin Microbiol 2006; 44: 335.

Figura 23. Profiluri de hibridizare generate de GenoType CM. 1: martor conjugat; 2: sondă universală; 3: sondă pentru genul Mycobacterium; 4-17: sonde specifice de specie.

Sistemul GenoType MTBC este axat pe identificarea speciilor din complexul M. tuberculosis. Cele 11 sonde utilizate diferențiază speciile M. tuberculosis, M. africanum tip I, M. bovis, M. caprae, M. microtti, precum și M. bovis BCG, dar nu pot distinge M. africanum tip II sau M. canettii (193).

3.2.1.2 Metode de secvențiere

Fiecare regiune genetică cuprinde o parte majoră constantă, și o parte variabilă care reprezintă o potențială țintă de identificare. Cele mai utilizate gene pentru secvențele țintă sunt 16S ARN, 23S ARN, hsp65. Una dintre cele mai utilizate ținte moleculare disponibile în prezent pentru aplicarea metodelor moleculare de diagnostic al tuberculozei, este o secvență de inserție (IS) denumită IS6110 (67). Această secvență este specifică pentru complexul M. tuberculosis și, de obicei, este prezentă în 1-20 copii/ celulă, trăsătură ideală pentru o țintă de amplificare. Descrisă inițial în 1990, IS6110 prezintă o activitate transpozițională intensă, contribuind la variațiile fenotipice și patogenice ale tulpinilor. Studii recente au arătat că la 3,4% din tulpinile M. tuberculosis izolate în România, lipsește secvența IS6110, iar în acest caz, diagnosticul se confirmă prin depistarea secvenței Mt 308 (188). În plus, secvența este utilizată ca marker genotipic în studiile epidemiologice (160).

Amplificarea PCR poate fi realizată cu ajutorul a numeroase tehnici care prezintă sensibilitate, specificitate și aplicabilitate diferite, iar timpul de identificare este redus în medie la 24 ore. Identificarea M. tuberculosis se poate realiza după o singură copie sau după secvențe repetitive de ADN sau ARN bacterian. Secvențele repetitive de acizi nucleici sunt considerate secvențe „preamplificate”, care contribuie la creșterea sensibilității metodei. În plus, mutații survenite la nivelul uneia dintre secvențe nu generează reacții fals negative, deoarece secvențele intacte amplificate conduc la identificarea corectă. Aceste aspecte relevă avantajul utilizării secvențelor repetitive, față de o singură copie.

Amplificarea PCR cu ajutoriul revers-transcriptazei vizează unitățile repetitive de la nivelul genei ARNr 16S. Deoarece dimensiunile secvenței ARNr 16S variază cu specia, aceasta poate servi ca țintă de diferențiere pentru speciile de micobacterii. Metoda s-a dovedit a fi rapidă, eficientă și precisă în comparație cu alte metode genotipice (212).

3.2.1.3. Microarrays ADN

Aceste dispozitive oferă posibilitatea examinării rapide a unui mare număr de secvențe ADN, într-o singură etapă. Metoda se bazează pe hibridizarea ampliconilor PCR marcați fluorescent, obținuți din coloniile bacteriene, cu sondele oligonucleotidice dispuse în microplăci. Cuplarea ampliconilor cu sondele complementare conduce la emisia unui semnal fluorescent, detectabil de un scanner. Sondele au la bază secvența unică 82 din regiunea 16S ARNr, și permit identificarea a 27 specii micobacteriene, precum și 51 de secvențe care conțin mutații la nivelul genei rpoB. Timpul de identificare pentru culturile pozitive microscopic este de cca 4 ore (88, 257).

3.2.1.4. Spoligotiparea se bazează pe amplificarea regiunilor DR, urmată de hibridizarea produșilor de amplificare cu oligonucleotide reprezentând regiunile spacer dintre zonele DR, imobilizate pe o membrană. Profilurile compuse din regiunile spacer sunt comparate cu cele de referință (261). O altă metodă se sprijină pe existența unor „minisateliți” – regiuni care conțin un număr variabil de tandemuri repetitive. Supply et al. (2000) au identificat 41 astfel de loci (245) în genomul M. tuberculosis și i-au denumit mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU). Metoda este reproductibilă, sensibilă și specifică pentru identificarea tulpinilor din complexul M. tuberculosis și reprezintă un instrument fiabil pentru analiza deosebirilor genetice ale micobacteriei pe plan mondial (120).

3.2.2 Metode de genotipare

Genotiparea tulpinilor de M. tuberculosis izolate este utilă în special în studiile epidemiologice, pentru a identifica mai bine factorii care influențează transmiterea tuberculozei și pentru a evalua măsurile de control și profilaxie a bolii (148). Identificarea tulpinii de Mycobacterium tuberculosis poate conduce la depistarea sursei de contaminare, fie că este un singur pacient, fie o întreagă comunitate, precum și la identificarea microorganismelor care au dobândit rezistență la antibiotice (7). Transmiterea bolii pe plan mondial poate fi analizată utilizând tehnici standardizate de amprentare moleculară („molecular fingerprinting”), care permit compararea tulpinilor studiate între diferite regiuni, țări sau continente. Genotiparea permite diferențierea infecției endo- și exogene, și oferă date pentru inițierea măsurilor de control necesare pentru întreruperea lanțului de transmitere a bolii multidrug rezistentă (271).

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) urmărește frecvența unei anumite secvențe la nivel ADN. Ampliconii PCR rezultați sunt selectați cu ajutorul unei enzime de restricție, ulterior sunt supuși unui câmp de electroforeză în care vor migra diferit. Profilurile de migrare obținute sunt comparate cu cele de referință pentru identificarea tulpinii (200).

Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) simplifică într-o anumită măsură metoda anterioară, prin generarea unor fragmente ADN cu masă moleculară mai mare, care vor migra diferit în gelul de electroforeză. Dezavantajul metodei, spre deosebire de RFLP, constă în faptul că profilurile obținute, mai „grosiere”, nu permit vizualizarea diferențelor existente față de tulpina de referință (285).

RFLP cu hibridizare conduce la obținerea polimorfismului ADN prin hibridizarea acizilor nucleici obținuți cu ajutorul enzimei de restricție, cu ADN genomic sau fragmente ADN clonate. Utilizarea ADN-ului genomic ca sondă influențează intrepretarea rezultatelor. Cu toate acestea, unele studii au demonstrat că metoda permite identificarea corectă a tulpinilor de M. tuberculosis (284).

Studiile de epidemiologie moleculară din ultimii 10 ani au oferit o perspectivă complexă asupra evoluției naturale a tuberculozei și a factorilor implicați în transmiterea acesteia. Coroborarea metodelor clasice cu cele moleculare a condus la aprofundarea aspectelor epidemiologice ale bolii, atât în plan local, cât și în plan mondial, fiind descrise caracteristici importante de virulență, potanțial epidemic sau rată de replicare ale anumitor linii filogenetice sau familii de tulpini (159). Susținerea efortului comun de cercetare a mecanismelor moleculare implicate în transmiterea și persistența bolii, precum și identificarea genelor umane de predispoziție, pot contribui la înțelegerea și devoalarea acestui patogen versatil.

CAPITOLUL 4.

DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC AL TUBERCULOZEI

În prezent diagnosticul tuberculozei este susținut prin coroborarea mai multor date – anamnestice, epidemiologice, clinice, biologice, radiologice (193) (tabel 4).

Diagnosticul de certitudine al tuberculozei (TB) presupune evidențierea micobacteriilor în probele biologice (spută, lichid cefalo-rahidian, lichid pleural sau peritoneal, piese de puncție biopsie, etc.), ceea ce este deseori dificil datorită paucibacilarității. Identificarea microscopică și în culturi a M. tuberculosis din spută este cea mai aplicată metodă de diagnostic pentru TB pulmonară, în timp ce boala extrapulmonară este de cele mai multe ori dificil de diagnosticat.

În aceste condiții, imunodiagnosticul este considerat o alternativă atractivă, ce vizează răspunsul imun al gazdei (celular sau umoral), față de prezența infecției sau a bolii active. Utilitatea acestuia este justificată de anumite categorii de pacienți: a) care nu pot expectora; b) la care sputa este microscopic negativă; c) cu TB extrapulmonară.

Pacienții care prezintă infecție sau TB activă manifestă un răspuns imun celular și umoral, ce poate fi surprins atât in vivo, cât și in vitro – mai ales pentru răspunsul imun umoral.

RĂSPUNS IMUN CELULAR

În 1964 Mackaness demonstrează că răspunsul imun al gazdei față de infecția cu M. tuberculosis este mediat celular (147). Răspunsul imun celular presupune activarea limfocitelor T helper (CD4+) și a limfocitelor T citotoxice (CTL) sau killer (de obicei CD8+), care au un rol important în anihilarea sau controlul infecției cronice. Limfocitele T CD4+ se diferențiază în T helper 1 (Th1) și 2 (Th2), care vor secreta cytokine specifice: IFN-γ și factor de necroză tumorală alfa (TNF-α), respectiv IL-4, IL-5, IL-10, IL-13. Răspunsul imun prin Th1 este mediat de CTL, iar cel prin Th2 este urmat de un răspuns umoral, mediat de anticorpi (72). În același timp, IFN-γ și TNF-α secretați de Th1 au activitate litică directă asupra microorganismelor intracelulare, precum M. tuberculosis. Activarea răspunsului imun prin Th1 este dependentă în plus, de IL-12, citokină produsă de macrofage și celulele dendritice (78).

Tabel 4. Metode de diagnostic al tuberculozei.

Hipersensibilitatea de tip întârziat (HS IV) a fost anterior considerată o reacție imună celulară (139), dependentă de prezența celulelor T de memorie. A fost demonstrat că limfocitele Th1 induc răspunsul HS IV, prin secreția de IFN-γ, activator pentru macrofage, în timp ce limfocitele Th2 sunt implicate în răspuns imun celular de tip proinflamator (25). O reacție de tip HS IV la PPD (derivat proteic purificat de tuberculină) reflectă activarea unor clone de limfocite T diferite de cele implicate în răspunsul imun protector. Pais et al. au demonstrat că celulele T implicate în activitatea de protecție față de un inocul cu bacili vii, au vizat filtratul antigenic cu masă moleculară sub 15000 Da, iar celulele recrutate în HS IV la PPD au recunoscut fracția moleculară cu masa cuprinsă între 15000 și 31000 Da (191).

Determinarea INF-γ

Determinarea INF-γ reprezintă una dintre cele mai recent elaborate metode de diagnostic TB și pornește de la premiza că, la indivizii sensibillizați anterior cu antigen tuberculinic, limfocitele T vor produce INF-γ la un nou contact cu antigene ale M. tuberculosis (258). Metoda presupune incubarea unei probe de sânge de la pacient, împreună cu un complex antigenic specific M tuberculosis, dar care nu este prezent la tulpina utilizată pentru vaccinul BCG. Limfocitele T din sânge vor produce INF-γ ca marker al infecției latente sau active TB (141). Antigenele utilizate pentru a stimula secreția de INF-γ definesc cele 2 tipuri principale de teste disponibile: cele bazate pe PPD și cele bazate pe antigenul specific RD1, incluzând ESAT6 (early secretory antigen target 6) sau CFP10 (culture filtrate protein 10). Au fost dezvoltate variante comerciale sau “in-house”, utilizând principiul ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay), sau ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Cele 2 teste comerciale pe principiul ELISA sunt Quantiferon (bazat pe PPD), și Quantiferon-TB Gold (bazat pe ESAT-6 și CFP-10). Testul T SPOT-TB funcționează după principiul ELISPOT și utilizează deasemeni antigene specifice RD1 (63).

Studii recente au arătat că aceste metode, de determinare a INF-γ, sunt mai relevante decât testul cutanat la tuberculină (12, 28, 136) și au câteva avantaje față de testul cutanat. Unul dintre acestea ar fi recoltarea unei probe de sânge, fără a mai fi nevoie de citirea rezultatului la 24, respectiv 72 ore. Automatizarea metodei reduce erorile de interpretare a rezultatelor, acestea fiind în totalitate independente de aprecierea umană subiectivă. Este înlaturată posibilitatea apariției fenomenului de booster, astfel încât, screening-ul persoanelor expuse la infecția TB (personal medical) este fezabil și concludent. În plus, metoda ar putea îmbunătăți acuratețea diagnosticului la pacienții cu infecție latentă la care boala are risc înalt de progresie, dar care prezintă IDR la PPD fals-negativ (infectați HIV) (44).

Alături de aceste avantaje, metoda întâmpină și anumite limite. Unii pacienți ar putea refuza prelevarea unei probe de sânge. Deseori, proba biologică trebuie procesată în interval de maxim 12 ore de la colectare, iar laboratoarele necesită dotări tehnologice corespunzătoare.

Determinarea INF-γ a fost aplicată și la persoanele suspectate cu boală activă. Dezavantajul metodei constă în faptul că detectează atât infecția latentă cât și pe cea activă. Dacă prevalența TB este scăzută în regiunea respectivă, iar datele clinice susțin diagnosticul, atunci un rezultat pozitiv al metodei poate întări diagnosticul clinic. În schimb, în regiunile endemice TB, testul pozitiv este mai puțin relevant pentru boala activă, indicând cel mai probabil o infecție latentă (135). Oricum, pentru că infecția TB reprezintă o condiție esențială pentru boala activă, un rezultat negativ al testului poate exclude diagnosticul TB, în funcție de sensibilitatea metodei. În concluzie, metoda poate servi ca test diagnostic pentru boala activă numai în țările cu prevalență scăzută, și ca test de excludere a diagnosticului TB în țările cu endemie crescută (63).

Quantiferon-TB

Testul QuantiFERON-TB și Bovigam sunt două metode comerciale care măsoară secreția de INF-γ după stimularea in vitro a tuturor celulelor sanguine cu PPD de M tuberculosis și antigene martor (76, 206), pe principiul ELISA. Numeroase studii au evidențiat rezultate comparabile cu testul cutanat în detectarea infecției latente, QuantiFERON-TB fiind mai puțin influențat de vaccinarea BCG. În plus, QuantiFERON-TB a discriminat între M. tuberculosis și micobacteriile non-tuberculoase (244), dar nu și micobacteriile atipice (28).

În 2001 FDA a aprobat utilizarea QuantiFERON-TB în SUA, iar în 2003 CDC (US Centers for Disease Control and Prevention) elaborează un ghid de utilizare a testului pentru diagnosticul infecției latente (281).

Quantiferon-TB Gold

Testul Quantiferon-TB Gold utilizează un complex de antigene tuberculinice, specifice TB (ESAT-6 și CFP-10), care sunt prezente doar la tulpinile de M. Tuberculosis, și absente la micobacteriile din mediu sau tulpina BCG. Astfel, rezultatul testului nu este influențat de vaccinarea anterioară BCG. În plus, determinări succesive nu conduc la rezultate de tip “boost” precum testul cutanat. Dezavantajul metodei constă în necesitatea prelucrării probelor biologice în maxim 12 ore de la recoltare. Nu există date suficiente care să recomande utilizarea metodei la tineri sub 17 ani, la persoane recent expuse la infecție, sau la pacienți imunodeprimați.

În 2005 FDA a aprobat utilizarea Quantiferon-TB Gold pentru detectarea infecției latente sau active TB.

T SPOT-TB

Testul se bazează pe principiul ELISPOT în detectarea INF-γ eliberat in vitro, de celule T stimulate cu antigene TB specifice, de tipul ESAT-6. Lavani et al.au elaborat prima generație de teste ELISPOT pentru diagnosticul infecției TB latente. În studii preliminare, testul a fost pozitiv la 96% din 47 pacienți cu boală activă și la 85% din 26 pacienți cu infecție latentă. ELISPOT a fost negativ la 26 persoane-martor vaccinate BCG, ceea ce confirmă avantajul metodei față de testul cutanat (136).

În 2008 FDA a emis “premarket aproval” pentru utilizarea T SPOT-TB în diagnosticul infecției latente sau active TB.

Determinarea MPB64

MPB64 este un antigen specific pentru complexul M. tuberculosis, și a fost izolat și descris inițial de Harboe (99). Antigenul caracterizează M. tuberculosis, M. bovis, și unele tulpini de M. bovis BCG, fiind evidențiat în timpul creșterii celulare. În 1998, Nakamura et al. au demonstrate că aplicarea unui patch cutanat cu antigen MPB64, putea induce o reacție locală la indivizii cu boală activă, dar nu și la cei cu infecție latentă (182). În alte studii desfășurate în Japonia și Filipine patch-ul cutanat cu MPB64 a diferențiat TB activă de cea latentă cu o sensibilitate de 98% și specificitate de 100%. Mecanismul biologic molecular care să explice această reacție este încă neclar. Testul este în prezent comercializat de Sequella, Inc., (MD, USA). Deoarece este simplă, neinvazivă, și nu necesită un laborator sau personal înalt calificat, metoda are un potențial apreciabil de test diagnostic, în special dacă studiile vor confirma acuratețea și aplicabilitatea la persoanele anergice (HIV pozitive), în contextul în care s-a demonstrat că poate diferenția pacienții cu boală activă de cei cu TB latentă (189).

Intradermoreacția (IDR) la PPD

În 1882, la 8 ani după descoperirea bacilului tuberculinic, Robert Koch anunța un tratament anti-TB. Obținuse un filtrat de cultură de M tuberculosis, inactivat prin căldură, care proteja cobaii de tuberculoza experimentală. Acest produs, cunoscut drept « Koch’s Old Tuberculin » a fost administrat bolnavilor cu tuberculoză, garantându-se vindecarea. În schimb, pacienții cu TB au dezvoltat reacții sistemice secundare administrării, precum febră, mialgii, dureri abdominale, grețuri și vărsături, în contrast față de persoanele sănătoase, care nu au prezentat astfel de reacții. Aceste observații au stat la baza utilizării tuberculinei ca test diagnostic, în ciuda eșecului privind capacitățile sale curative. Injecția intradermică a tuberculinei a fost descrisă de Mantoux, iar metoda s-a răspândit rapid datorită reproductibilității rezultatelor. După aplicarea locală, prin injecție intradermică a tuberculinei, se remarcă un reacție locală după 24-72 ore, exprimată prin indurație, edem, infiltrat monocitar. O reacție pozitivă este indicată de o zonă de indurație cu diametrul transvers mai mare de 10mm. Eritemul izolat nu este concludent. Reacția cutanată, considerată hipersensibilitate de tip întârziat (HS IV), este utilizată în scop diagnostic încă de atunci, pentru a stabili dacă a existat expunere anterioară la antigen tuberculinic. În 1934, Siebert a extras din tuberculina cunoscută un precipitat proteic, pe care l-a numit derivat proteic purificat (PPD), din care, pentru testare, se folosesc 0,1ml ce conțin 5 unități PPD.

Testul intradermic la tuberculină este utilizat pentru a măsura prevalența infecției în comunitate, precum și pentru a selecta persoanele indicate pentru vaccinare BCG.

Deoarece precipitatul proteic conține ingrediente comune cu vaccinul BCG sau micobacteriile din mediu înconjurător, deseori testul cutanat la tuberculină este fals pozitiv. Se estimează că aproape 1/3 din populația cu IDR la PPD pozitivă nu are TB activă. Sensibilitatea testului este apreciată în jur de 70% pentru cazurile cu boală activă. În consecință, testul omite 30% din pacienții infectați. Sensibilitatea scade până la 30% la persoanele imunocompromise.

Testul cutanat este dificil de executat corect, în condițiile în care variații minime survenite în timpul efectuării conduc la variații ale cantității de PPD distribuită intradermic, afectând dimensiunea zonei de indurație, iar măsurarea răspunsului cutanat este convențională și puțin obiectivă.

RĂSPUNS IMUN UMORAL

Studii incipiente care utilizau preparat antigenic neprelucrat de M tuberculosis au demonstrat prezența de anticorpi anti-TB la pacienții cu boală activă. Mai târziu, la indivizi sănătoși, s-au pus în evidență reacții încrucișate generate de flora comensală, de micobacteriile din mediu înconjurător sau de vaccinul BCG (18, 133). În ultimele două decenii a fost testat răspunsul imun umoral față de diferite preparate antigenice PhoS (38 kDa), antigen 85 (30 kDa), lipoproteine (19 kDa), lipoarabinomanan (LAM), etc. Dintre toate, antigenul PhoS (38 kDa) a demonstrat cea mai mare sensibilitate și specificitate (273, 71). A fost remarcat faptul că anticorpii anti-38 kDa apar numai în stadiile avansate de boală (58), iar anticorpii anti-16 kDa, și anti- 88 kDa sunt generați în fazele incipiente ale tuberculozei (133).

În 1989 Bothamley sugerează existența unei asocieri între anticorpii anti-TB și HLA (human leukocytes antigens), ceea ce ar explica răspunsul umoral heterogen în populație (26). Pe măsură ce crește răspunsul umoral, unele gene suprimă activitatea limfocitară spontană sau indusă de antigene, la pacienții DR-2 pozitivi, cu boală activă (229).

De-a lungul timpului, au fost probate numeroase teste serologice care utilizau diferite antigene tuberculinice pentru depistarea anticorpilor specifici, utilizând principii precum ELISA, imunocromatografie, reacții de hemaglutinare (242) (tabel 5).

Au fost aplicate în special în țările în curs de dezvoltare deoarece sunt ieftine, rapide și simple (94). Unele studii au sugerat utilitatea testelor serologice coroborate cu alte tipuri de teste diagnostice, la pacienții cu spute negative în microscopie, în condițiile în care laboratoarele nu dispuneau de condiții tehnice pentru culturi (4). Până în prezent nici un test serologic nu a demonstrat acuratețe și aplicabilitate pe scară largă. Răspunsul umoral exprimat de organismul gazdă prin producerea de anticorpi, este îndreptat nespecific către un complex larg de antigene și variază de la individ la individ. Testele serologice efectuate au demonstrat în general o sensibilitate scăzută de 10-90% și specificitate de 47-100% (242).

În plus față de determinarea anticorpilor ca și răspuns imun față de infecția TB, s-a tentat decelarea directă a antigenelor tuberculinice, prin diferite metode imunologice (tabel 6).

Până în prezent, datele publicate despre eficacitatea testelor serologice relevă acuratețe inconstantă. Nici un test serologic nu poate înlocui diagnosticul microbiologic și îndeosebi cel baciloscopic. Metodele demonstrează aplicabilitate limitată sau inutilă pentru diagnosticul pozitiv TB. În acest context, testele serologice pot aduce date suplimentare în țările în curs de dezvoltare, pe lângă metodele convenționale, și mai ales microscopia directă.

Este importantă cercetarea continuă în acest domeniu, pentru a evalua potențialul diagnostic al antigenelor micobacteriene. Înțelegerea mecanismelor fiziopatologice ale răspunsului imun la pacienții cu infecție TB și dezvoltarea a noi instrumente de diagnostic (genetice), ar putea conduce la elaborarea unor teste serologice rapide, ieftine și precise. Studii ale unor astfel de teste trebuie să se adreseze în special categoriilor de pacienți cu spute neconfirmate microscopic, copiilor sau co-infectaților HIV.

Tabel 5. Metode serologice de depistare a anticorpilor în diagnosticul tuberculozei.

Tabel 6. Metode serologice de depistare a antigenelor în diagnosticul tuberculozei

CAPITOLUL 5.

TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA TUBERCULOSTATICE

5.1. METODE FENOTIPICE CONVENȚIONALE

Metodele fenotipice evaluează gradul de inhibiție a creșterii tulpinilor de micobacterii în prezența unui antibiotic, în funcție de care sunt clasate în tulpini sensibile sau rezistente. O contribuție importantă pentru aceasta clasificare este conferită de limitele înguste de concentrație minimă inhibitorie (CMI) a principalelor tuberculostatice față de tulpinile de bacili izolate de la pacienți nou-descoperiți, netratați (103). Definiția clasică pentru tulpinile rezistente este prezența unui grad de sensibilitate semnificativ mai scăzuta decât a unei tulpini sălbatice, care nu a venit niciodată în contact cu tuberculostatice (33, 34).

Metodele fenotipice bazate pe cultivarea micobacteriilor în prezența antibioticelor pe medii solide cu agar și ou, sunt cel mai des utilizate și pot fi aplicate ca metode directe sau indirecte. Pentru metoda directă, mediile cu antibiotic și martor sunt inoculate direct cu prelevat biologic decontaminat și concentrat, în timp ce pentru metoda indirectă aceleași medii sunt însămânțate cu suspensie din tulpina de micobacterii izolată. Se cunosc trei metode fenotipice convenționale pentru determinarea sensibilității bacilului Koch, utilizând medii solide: metoda proporțiilor, metoda raportului de rezistență și metoda concentrațiilor (33, 34, 126). Recent au fost aprobate alte două metode care utilizează medii lichide, și anume BACTEC (213, 202) și MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) (192, 226).

5.1.1 Metoda proporțiilor

Metoda proporțiilor este cea mai frecvent folosită și determină cu precizie proporția de tulpini rezistente la un anumit antibiotic. În principiu, diluții cunoscute de bacili sunt însămânțate pe medii cu antibiotice și martor. Cel punțin una dintre acestea ar trebui să producă un grup cuantificabil de colonii. Numărul coloniilor obținut pe fiecare din mediile cu antibiotic și martor (fără antibiotic) este înregistrat, apoi se calculează proporția tulpinilor rezistente.

Pe medii Löwenstein Jensen prima citire se realizează la 28 zile de incubare la 37ºC. Dacă proporția bacteriei rezistente este mai mare de 1% pentru izoniazidă, rifampicină și PAS, sau peste 10% pentru celelalte antibiotice, tulpina este considerată rezistentă. Altfel se repetă citirea la 42 zile (102).

Pe medii Middlebrook 7H10/11, incubate în atmosferă 10% CO2, prima citire se efectuează la 21 zile sau mai devreme dacă indică o tulpină rezistentă (126). Concentrațiile critice ale antibioticelor majore testate prin metoda proporțiilor sunt prezentate în tabelul 7.

5.1.2.Metoda raportului de rezistență

Această metodă se bazează pe raportul de rezistență dintre CMI a unei tulpini de testat și CMI a unei tulpini de referință, sensibilă H37Rv, testate în aceleași condiții. Se compară astfel rezistența unei tulpini necunoscute cu o tulpină standard. Se inoculează seturi de tuburi paralele, ce conțin diluții de antibiotic, cu inocul standard din tulpina de testat și de referință, iar citirea se efectuează la 28 zile de incubare la 37ºC. Tuburile ce conțin 20 sau mai multe colonii sunt considerate pozitive, iar CMI se calculează ca fiind concentrația cea mai mică de antibiotic în prezența căreia numărul de colonii este mai mic de 20. Un izolat cu o valoare a raportului de rezistență sub 2 este considerat sensibil, iar peste 8 este considerat rezistent (126, 102).

5.1.3. Metoda concentrațiilor absolute

Această metodă utilizează un inocul standard din cultura tulpinii de testat pe medii cu diluții de antibiotic și martor. Rezistența tulpinii este exprimată ca fiind dată de cea mai mică concentrație de antibiotic are inhibă creșterea tulpinii. Concentrațiile critice de antibiotic sunt aceleași ca și în metoda proporțiilor, dar concentrația de tuberculostatic considerată „critică” trebuie determinată în fiecare laborator clinic în parte (102). Pentru interpretare, citirea se efectuează după 28 zile de incubare la 37ºC sau 35-42 zile dacă nu prezintă o creștere semnificativă. O tulpină este considerată sensibilă dacă numărul de colonii crescute pe mediul cu antibiotic este sub 20 și +3 sau +4 (confluent) pe mediul martor.

Tabel 7. Concentrația critică pentru antibiotice în metoda proporțiilor (mcg/dl)

5.1.4. Metoda radiometrică BACTEC

Metoda este aplicată cu ajutorul sistemului BACTEC TB-460 (Becton Dickinson, Sparks, MD), care utilizează mediu lichid Middlebrook 7H9, conținând C14 marcat în acidul palmitic, unică sursă de carbon (C). Creșterea micobacteriilor și consumul de acid gras marcat radioactiv va produce CO2 marcat, care ulterior va fi detectat în dispozitivul 12B vial și exprimat ca index de creștere. În prezența unui antibiotic, sensibilitatea bacilului Koch este măsurată prin inhibiția zilnică a indexului de creștere. Inoculul standard este însămânțat pe medii cu antibiotic și mediu martor, si incubat la 37ºC. Citirea se efectuează zilnic, iar rezultatele sunt interpretate ca și în metoda proporțiilor, în funcție de valoarea raportului: 1% pentru izoniazidă, rifampicină și PAS, respectiv 10% pentru celelalte antibiotice.

Metoda radiometrică BACTEC a fost aprobată de FDA și considerată „gold standard” pentru testarea sensibilității la tuberculostaticele de primă linie (213, 103). Recent au fost propuse concentrații critice pentru tuberculostaticele de linia a II-a și au fost testate printr-o evaluare multicentrică (201). Avantajul major al metodei este capacitatea de a detecta rezistența la antibiotic mai repede decât prin metodele ce utilizează medii solide. Dezavantajul îl constituie costul aparaturii și deșeurile radioactive ce necesită depozitare și izolare.

MGIT (Myobacteria Growth Indicator Tube)

Metoda MGIT (Becton Dickinson, Sparks, MD) reprezintă o nouă generație de instrumente pentru testarea sensibilității micobacteriilor, atât în format manual, cât și automat (202, 109). Metoda se bazează pe detecția fluorescenței culturilor de micobacterii, în tuburi cu mediu modificat Middlebrook 7H9, în care s-a adăugat un senzor fluorescent dependent de consumul de oxigen. Consumul de oxigen din mediu produce fluorescență la iluminare cu lampa UV (figura 24). Inoculul standard este însămânțat atât pe tuburi cu antibiotic, cât și martor, la 37ºC (ziua 0). Verificarea zilnică în lumina UV începe din ziua a II-a. Prezența unei colorații fluorescente portocalii în tubul cu antibiotic, în același timp cu tubul martor sau la maxim 2 zile de la detectarea ei în tubul martor – semnifică rezistență la antibioticul respectiv. În caz contrar, tulpina este considerată sensibilă. Rezultatul final este apreciat în maxim 12-14 zile de incubare (197).

Palomino JC et al. Tuberculosis 2007. www.TuberculosisTextbook.com, p 644.

Figura 24. Tuburi MGIT cu reacție pozitivă și negativă.

Formatul de utilizare manuală a sistemului MGIT a fost aplicat cu succes, ca metodă directă, utilizând prelevate biologice decontaminate (90). Sistemul a fost utilizat pentru determinarea sensibilității bacilului Koch atât pentru tuberculostaticele de primă linie, cât și pentru cele de linia a II-a (114, 221). Față de metodele convenționale pe medii solide, dar și față de sistemul BACTEC 460, MGIT a demonstrat rezultate semnificativ asemănătoare.

Metoda BACTEC – MGIT

BACTEC – MGIT (Becton Dickinson, Sparks, MD), este o metodă non-radiometrică ce se bazează pe același principiu, al depistării consumului de oxigen care declanșează semnalul fluorescent în lumină UV, dar tuburile sunt incubate și interpretate în interiorul aparatului MGIT 960. Inoculul standard este însămânțat de asemeni în tuburi cu și fără antibiotic, apoi sunt introduse într-un dispozitiv de identificare după un cod de bare. Pentru fiecare pereche identificată se aplică algoritmi de interpretare ca „sensibile” sau „rezistente”, iar rezultatele sunt printate automat (11).

Având în vedere performanțele sistemului MGIT, FDA a aprobat recent utilizarea BATEC – MGIT 960 pentru determinarea sensibilității micobacteriilor la tuberculo-staticele de primă linie (193).

METODE FENOTIPICE NECONVEȚIONALE

Aceste metode sunt non-radiometrice, neinvazive și fără risc de contaminare în timpul citirii și interpretării reacțiilor.

5.2.1. BACT ALERT 3D

Bact Alert 3D (bio Merieux Inc, Durham, NC) are ca principiu detectarea consumului de CO2 eliberat de culturile de micobacterii. Creșterea concentrației de CO2 diminuă pH-ul mediului, ceea ce determină virajul de culoare al unui indicator special, și este ulterior înregistrat de o unitate reflectometrică. Sistemul este programat să citească rezultatele la fiecare 10 minute și să le transmită automat (figura 25). Metoda permite determinarea sensibilității micobacteriilor la antibiotice cu o sensibilitate de 97% pentru rifampicină (RMP) și 100% pentru izoniazidă (HIN) și etambutol (ETB) (272), și o specificitate de 100% pentru RMP, 95% pentru HIN și 98% pentru ETB. Durata medie de obținere a unui rezultat pozitiv a fost de 7,8 zile.

5.2.2. MB-BACT

MB-BACT (Organon Teknika, Boxtel, Olanda) are la bază același principiu, cu o durată medie de determinare a rezistenței de 4,2 zile (2,5-7, 2 zile), iar pentru sensibilitate de 8,2 zile (6,2-10,7 zile) față de streptomicină, HIN, RMP, ETB și Pirazinamidă (PZN) (62). În prezența coloniilor de micobacterii se produce un viraj de culoare de la verde la galben. Dezavantajul metodei constă în rata înaltă de erori majore, legate probabil de lipsa unui standard în ceea ce privește concentrația critică sau prepararea inoculului (204).

www.biomerieux-usa.com

Figura 25. A) Sistemul Bact Alert 3D; B) Interpretarea rezultatelor pozitiv vs negativ.

5.2.3. Versa TREK

Versa TREK (Trek Diagnostic Systems, West Lake, Ohio) reprezintă o variantă78 mai nouă a metodei ESP Culture System II. Proiectată inițial pentru hemoculturi, metoda a fost adaptată ulterior pentru determinarea sensibilității micobacteriilor la antibiotice. Testul a fost validat față de HIN, RMP și ETB. Metoda se bazează pe modificarea presiunii gazului din flacon, prin metabolismul micobacteriilor din mediu lichid. Consumul de oxigen conduce la scăderea presiunii, ceea ce se înregistrează și procesează în sistem conform unor algoritmi prestabiliți. Durata medie de determinare a rezistenței este comparabilă cu cea în sistemul BACTEC 460 (22, 220). A fost demonstrată o concordanță de 98,9% cu sistemul BACTEC 460 (220), cu rezultate disponibile în interval de 4,5 zile (2-8 zile).

5.2.4. E-Test

E-test, disponibil în forma comercială ca AB BIODISK (Solna, Suedia), utilizează stripuri impregnate cu antibiotic pentru citirea directă a CMI (figura 26) pe plăcile de agar. Unele studii care au comparat această metodă cu cea a proporțiilor, au găsit o concordanță de peste 90%, dar s-a reportat o pondere crescută a rezultatelor fals-pozitive în comparație cu BACTEC sau culturile pe mediu Löwenstein Jensen (100).

După Hausdorfer J

Figură 26. E-test pentru M. tuberculosis. Interpretarea CMI se efectuează prin citirea valorilor la nivelul intersectarii zonelor de inhibiție.

5.2.5. Metode bazate pe bacteriofagi

Metodele prin intermediul fagilor, în formă comercializată – FatsPlaque (233), sunt utilizate pentru determinarea rezistenței la rifampicină, atât indirect, din culturi, cât și direct din spută. Rezultatele sunt disponibile în 2 zile, cu o concordanță de peste 95% în comparație cu metoda proporțiilor.

În prezent există două tipuri de metode bazate pe acțiunea fagilor, pentru determinarea sensibilității M. tuberculosis la antibiotice: a) metoda de amplificare biologică a bacteriofagilor (Pha B), descrisă inițial de Wilson et al. la izolatele de micobacterii (274); b) metodă bazată pe capacitatea micobacteriofagilor de a exprima gena luciferazei în prezența bacilului Koch (112).

Metoda de amplificare biologică a bacteriofagilor (Pha B) se bazează pe capacitatea micobacteriilor de a întreține creșterea de micobacteriofagi infectanți (D29). Fagii exogeni neinfectanți sunt inactivați prin tratament chimic. Numărul fagilor endogeni, reprezentând numărul original de bacili vii, este ulterior determinat de o micobacterie cu creștere rapidă, precum M. smegmatis (161), în care se derulează câteva cicluri de infectare, replicare și eliberare a fagilor (figura 27). În cazul unei micobacterii rezistente, bacilul viu protejează fagul, spre deosebire de tulpinile sensibile inhibate de RMP la nivelul ARNm, în care fagul nu supraviețuiește. Micobacteriofagul protejat în bacilii vii, rezistenți, se va replica și va liza în final gazda. Liza este ușor obiectivată în cultura de M. smegmatis ca arii clare sau plaje (figura 28). Numărul de plaje generate de la un inocul este propoțional cu numărul de micobacteriofagi protejați, dependent de numărul de bacili vii, rezistenți la antibiotic.

Într-un studiu efectuat în Uganda pe 149 tulpini, prin metoda dezvoltată și aplicată local („in-house”), utilizând micobacteriofagul infectant D29, s-a determinat rezistența la RMP în 48 ore, cu o sensibilitate de 100% și o specificitate de 96,5% (255). Un alt studiu efectuat pe 89 tulpini, a demonstrat o sensibilitate și specificitate de 100% (181).

Testul comercial FastPlaqueTB a fost evaluată în comparație cu metoda proporțiilor pe agar Meddlebrook 7H11, pentru determinarea rezistenței la RMP, direct din probele de spută (6). Rezultatele au fost disponibile în 48 ore, cu o sensibilitate și specificitate de 100%. Un alt studiu a relevat o sensibilitate de 100% și specificitate de 97,7% (233). O metaanaliză recentă asupra metodei bazate pe fagi, pentru determinarea rezistenței miobacteriilor la RMP, a confirmat sensibilitatea înaltă, dar specificitate variabilă, ușor scăzută. Nu există evidențe suficiente despre acuratețea metodei aplicată direct pe probele biologice (190).

Metoda fagului purtător de luciferază evidențiază bacilii vii prin exprimarea unui semnal luminos de către aceștia, la câteva minute după infectarea cu fagul purtător de gena luciferazei. Producerea semnalului luminos este dependentă de infecția cu fagi, exprimarea genei luciferazei și cantitatea de ATP din celulă (112). Bacilii sensibili incubați cu antibiotic și infectați cu fagi purtători de luciferază, nu vor emite semnal luminos. În schimb, tulpinile rezistente, neafectate de antibiotic, vor produce lumină echivalentă u cea produsă de tulpinile martor infectate cu bacteriofagi, fără antibiotic (210). O altă moleculă semnal este reprezentată de proteina verde fluorescentă (GPF) a meduzei Aequorea victoria, care nu necesită prezența unor factori declanșatori, datorită

Modificat după Pai et al. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2006; 6:427.

Figura 27. Testul de testare a sensibilității M. tuberculosis cu ajutorul bacteriofagilor. Principiul metodei vizează amplificarea bacteriofagilor după infectare cu tulpina de M. tuberculosis izolată, urmată de detectarea creșterii fagilor, ca zone de liză în cultura de Mycobacterium smegmatis.

Modificat după Galí N et al. J Clin Microbiol 2003; 41:2648.

Figura 28. Interpretarea testului pe cultură de M. smegmatis. În cadranul inferior stâng: tulpină RIFr incubată fără RIF (control); în cadranul inferior drept: tulpină RIFr incubată cu RIF; în cadranul superior stâng: tulpină RIFs incubată fără RIF (control); în cadranul superior drept: tulpină RIFs incubată cu RIF.

RIF- Rifampicină; RIFr- tulpină rezistentă la RIF; RIFs- tulpină sensibilă la RIF.

fluorescenței intrinseci a GPF (54). Testele au demonstrat o sensibilitate și reproductibilitate apreciabile, dar nu sunt utilizate de rutină.

Testul cu luciferază a fost probat față de cele 4 antibiotice majore cu o concordanță de 98,6% cu rezultatele obținute prin BACTEC TB 460 (16). O evaluare grafică a timpului de obținere a rezultatelor prin aceste metode, raportate la una dintre metodele genotipice, se regăsește în figura 29 (218).

Într-un studiu recent au fost comparate două metode de determinare a semnalului luminos – fotografică și luminometrică, iar sensibilitatea determinării sensibilității la HIN și RIF a fostde 100%, concluzionând că metodele par adecvate pentru teste screening în supravegherea MDR-TB (101).

.

Modificat după Roth A et al. Eur Resp J 1997; 10:1887

Figură 29. Timpul necesar pentru obținerea rezultatelor prin diferite metode de testare a sensibilității Mycobacterium tuberculosis: BACTEC (87); testul cu bacteriofag marcat cu luciferază (88); PCR cantitativ (89). *: determinarea densității bacteriene din cultură ca inocul standard; linie punctată: timp de cultură pe mediu; linie boldată: media de timp necesar pentru obținerea unui rezultat.

5.2.6. Indexul de acid micolic (MAI)

Testul se bazează pe modificarea metodei de diagnostic prin HPLC (High Performance Liquid Chromatography), prin care un compus cumarinic este folosit ca agent fluorescent al acidului micolic, în locul p-bromofenacil-bromid utilizat ca marker în lumina UV, cunoscând că sensibilitatea de detecție în lumina fluorescentă crește de cel puțin 200 ori. Sensibilitatea este apreciată prin măsurarea ariei totale de sub curba cromatografică de acid micolic prezent într-o cultură de micobacterii, aria având o foarte bună corelație cu logCFU/ml. În funcție de semnal și cuantificarea procedurii, profilul de sensibilitate (figura 30) poate fi aflat în timp de maxim 5 zile (265).

Deși testul este rapid, fidel și reproductibil, poate fi aplicat numai în laboratoare dotate pentru nivelul 3 de biorisc. Raportul cost/ beneficiu este apreciabil deoarece metoda poate fi aplicată concomitent pentru diangnostic și testarea sensibilității.

Modificat după Viader-Salvado JM at al. J Clin Microbiol. 2001; 39:2644

Figura 30. Profilul acidului micolic la tulpina izolată în flaconul fără antibiotic înainte de incubare (A); după 5 zile de incubare fără antibiotic (B); în prezența HIN (C); în prezența RIF (D)

Metoda micocoloniilor (Microscopic observation broth-drug susceptibility assay – MODS) are două variante de determinare a sensibilității pe medii lichide ori medii solide.

Detectarea sensibillității pe mediu lichid prin observare microscopică (MODS) presupune depistarea apariției formațiunilor „cord” ale micobacteriilor, ce pot fi vizualizate pe mediu lichid (figura 31), cu ajutorul unui microscop inversat (40). Probele de spută confirmate microscopic (BAAR +) au fost testate pentru sensibilitatea la HIN și RMP prin MODS. Rezultatele au fost comparate cu o metodă colorimetrică, obținându-se o concordanță de 89%, în cca 9,5 zile. Metoda este rapidă, ieftină, sensibilă și specifică pentru testarea sensibilității micobacteriilor, utilă în special în țările în curs de dezvoltare.

Într-un studiu recent, performanța MODS a fost comparată cu sistemul de cultivare automată și cu metoda proporțiilor pe culturi Löwenstein Jensen (LJ), pentru determinarea directă a rezistenței la HIN, RMP, ETB, streptomicină, pe probe de spută (171). Timpul mediu de exprimare a rezultatelor a fost de 7, 22 și 68 zile pentru MODS, sistem automat, respectiv culturi LJ. Concordanța între MODS și metoda de referință standard pentru determinarea sensibilității, a fost de 97% pentru HIN, 100% pentru RMP, 95% pentru ETB și 92% pentru streptomicină. S-a concluzionat că o singură observare MODS pe cultura unei spute conferă un rezultat mai rapid și mai sensibil pentru detectarea tulpinilor MDR. Dezavantajul metodei îl constituie necesitatea unui microscop inversat pentru observarea creșterii micobacteriilor.

Metoda observației pe strat subțire de agar (TL7H11) s-a dovedit a fi potrivită pentru detectarea MDR-TB, prin comparație cu metoda proporțiilor, rezultatele fiind disponibile în cca o săptămână (214).

Flow-citometrie

Metoda de determinare a sensibilității micobacteriilor (27) la antibiotice prin flow-citometrie, are la bază capacitatea micobacteriilor de a hidroliza diacetatul de fluoresceină (DAF) prin intermediul esterazelor celulare nespecifice. Acumularea fluoresceina in celulele micobacteriilor active metabolic poate fi ușor detectată cu ajutorul flow-citometrului în decurs de 24 ore (129, 185). În schimb, bacteriile distruse sau inhibate de antibiotic hidrolizează semnificativ mai puțin DAF și conțin mai puțină fluoresceină. Concordanța cu metoda proporțiilor a fost de 95%, 92% și 83% pentru HIN, ETB, respectiv RMP.

Dezavantajul îl constituie necesitatea unui laborator de nivel 3 biohazard, precum și costurile ridicate ale tehnologiei și reactivilor.

Caviedes L et al. The Tuberculosis Working Group in Peru. J Clin Microbiol 2000; 38: 1205.

Figură 31. Aspectul Mycobacterium tuberculosis în cultură (serpentine, corzi), cu o magnitudine de x 100, după 25 zile de incubare.

Metode colorimetrice

În ultimii ani au fost propuse câteva metode colorimetrice pentru determinarea rapidă a rezistenței micobacteriilor la antibiotice. Acestea utilizează indicatori REDOX sau săruri tetrazolium pentru a detecta creșterea micobacteriilor. Testele se bazează pe reducerea indicatorului colorat redox, adăugat la mediul de cultură, după ce inoculul a fost însămânțat pe medii cu diferite antibiotice. Rezistența este determinată prin modificarea de culoare a indicatorului, care este direct proporțională cu numărul de micobacterii vii din mediu (195).

Microwell Alamar Blue Assay (MABA)

Alamar Blue (Trek Diagnostics, Ohio, SUA) reprezintă un reactiv brevetat, proiectat pentru determinarea rezistenței micobacteriilor. Reactivul are culoarea albastră în formă oxidată, dar virează spre roz când este redus. Într-un studiu efectuat pentru determinarea rezistenței M. tuberculosis la HIN, RMP, ETB și S, CMI-urile au fost obținute după 1-2 săptămâni, cu un nivel de concordanță de 97% față de metoda proporțiilor (283). Alamar Blue a fost testat în câteva studii, pentru determinarea activității antibacteriene a tuberculostaticelor, folosindu-se microplăci cu mediu (53, 81, 196). S-a obținut o concordanță cu BACTEC 460 de 93,6%, rezultatele cele mai bune referindu-se la rezistența la HIN și RMP. Studiile au dovedit astfel că metoda este simplă, rapidă, ieftină și sigură deoarece utilizează un reactiv stabil, netoxic (81).

Sărurile tetrazolium 3-(4,5-dimetilazol-2-acetil)-2,5-difenil tetrazolium bromid (MTT)

MTT este un compus galben, care poate fi redus de celulele active metabolic la cristale roșii, insolubile, de formazan MTT, ce poate fi măsurat cu un spectrofotometru după solubilizare (175). MTT a fost deasemeni propus ca metodă colorimetrică de determinare a rezistenței micobacteriilor la RMP (92, 176, 2). Într-un studiu desfășurat pe 92 tulpini M. tuberculosis, testul a conduc la aceleași rezultate ca și metoda standard – BACTEC. Recent, testul a fost aplicat și pentru pentru linia a II-a de tuberculostatice, obținându-se rezultate promițătoare (79, 39, 172). Pentru obținerea profilului de sensibilitate mai rapid – 2 săptămâni, în sensul determinării rezistenței la RMP, metoda a fost aplicată direct pe probe biologice, sensibilitatea și specificitatea testului fiind de 98,5% față de rezultatele obținute prin metoda standard indirectă, pe agar 7H11 (1).

Resazurin Microtiter Assay (REMA)

Odată cu decoperirea resazurinului ca principal component al reactivului Alamar Blue (186), acest indicator redox a fost deasemeni inclus în teste de determinare rapidă a rezistenței micobacteriilor la antibiotice (194). REMA permite detectarea rapidă a rezistenței M. tuberculosis la antibiotice, cu o concordanță de 97% în comparație cu metoda proporțiilor pe mediul Löwenstein Jensen. În plus, este aplicată și pentru tuberculostaticele de linia a II-a, precum chinolonele și pirazinamida (151, 142, 152, 156).

Un studiu multicentric care a comparat performața REMA și MTT (figura 32) cu metoda proporțiilor, urmărind determinarea sensibilității M. tuberculosis la HIN, RMP, ETB, S, a obținut nivele de specificitate și sensibilitate între 96% și 99% pentru RMP, HIN, ETB (154). Conform unei analize recente, realizată de Martin, metodele MABA, MTT și REMA aplicate pe tulpini MDR-TB au demostrat sensibilitate si specificitate cuprinse între 89% și 100% în determinarea sensibilității la RMP și HIN (155).

Nitrate Reductase Assay (NRA)

Testul cu nitrat reductază, evaluează consumul de oxigen prin reacție REDOX, fără a utiliza indicatori de culoare, ci îmbogățind mediul LJ cu KNO3 și adăugând un reactiv chimic pentru citirea rezultatelor. Producerea de nitriți este pentru unele bacterii o caracteristică pe baza careia se realizeaza identificarea. În 1981 Lampe a îmbunătățit metoda Gries-Ilosvay de detectare a tulpinilor producătoare de nitriți, utilizând un reactiv cristalin. Experimentele sale au fost confirmate prin metodele clasice pentru bacterii ca Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Proteus sp, Pasteurella multocida, Salmonella sp, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica (138).

Studiul aplicabilității noului reactiv în reacțiile biochimice de identificare a speciilor de Mycobacterium au fost continuate de Warren, confirmând avantajele metodei: i) preparare simplă a reactivilor; ii) proceduri simple de aplicare a testului la tulpinile de Mycobacterium; iii) stabilitatea rezultatelor; iv) viața prelungită a reactivilor, peste 6 luni (268). Pe baza acestor descoperiri, testul a fost aplicat în câteva studii pentru

Modificat după Martin A. et al. Int J Tuberc Lung Dis 2005b; 9: 901-6.

Figura 32. Principiul metodelor cu săruri de tetrazoliu și resazurin.

Modificat după Angeby KAK et al. J Clin Microbiol 2002;40:554

Figura 33. Rezultate obținute prin metoda NRA. O tulpină este considerată rezistentă la un anumit antibiotic dacă în flaconul cu antibiotic se observă o modificare de culoare mai mare decât în flaconul de control cu diluție 1:10. (A) Tulpină sensibilă la toate cele 4 antibiotice; (B) Tulpină rezistentă la toate cele 4 antibiotice.

a determina sensibilitatea Mycobacterium tuberculosis la antibiotice (figura 33), confirmând că metoda îmbunătățită cu reactivul cristalin este ieftină, simplă și rapidă, păstrând calitățile metodei clasice cu reactiv lichid (118, 91, 199, 9). După incubare pe mediul LJ și antibiotic, după 7-14 zile este măsurată capacitatea M. tuberculosis de a reduce nitratul. Tulpinile rezistente care reduc nitratul vor conferi mediului culoarea roz, în timp ce tulpinile sensibile vor fi inhibate de antibiotic (9). În plus, poate fi aplicabilă direct pe probele clinice (biologice) multibacilare, cele mai bune valori pentru sensibilitate (93-100%) și specificitate (100%) obținându-se pentru RMP și HIN (199, 9, 3, 178, 237). Pentru testările directe, timpul mediu de determinare a rezistenței la tuberculostatice a fost de 28 zile (237) sau 18 zile (3) de la obținerea probelor biologice de spută.

Metoda a fost evaluată atât pentru tuberculostaticele de primă linie, cât și Ofloxacină (53, 76, 77), cu concordanță de 99% pentru HIN și ETB și 100% pentru RIF (78) față de metoda proporțiilor, și rezultate în 7-14 zile.

Metoda are avantajul că utilizează același mediu de cultură ca și metoda standard a proporțiilor și poate fi implementată în laboaratoare cu resurse limitate. Studii comparative între MTT, Resazurin și NRA (170) sau Alamar Blue și NRA (132), au demonstrat acuratețea înaltă a NRA, fiabilitatea și în special costul scăzut al metodei.

În concluzie, proprietatea Mycobacterium tuberculosis de a reduce nitrații la nitriți poate fi exploatată cu succes în vederea diagnosticului pozitiv și a sensibilității tulpinilor la antibiotice. În plus, costurile sunt mult mai mici în comparație cu alte metode, conform studiilor de piață (198).

Colorimetric Nitrate Reductase-based Antibiotic Susceptibility test (CONRAS) reprezintă o variantă a NRA, prin utilizarea mediului lichid de cultură ce încorporează KNO3. Este o metodă colorimetrică rapidă, prin care se testează sensibilitatea M. tuberculosis la HIN și RMP, cu rezultate disponibile în 5 zile. Un studiu aplicat pe 74 tulpini izolate, a demonstrat, prin comparație cu metoda standard BACTEC 460TB, o sensibilitate și specificitate de 100% și 95% pentru HIN, respectiv 94% și 100% pentru RMP (246).

TK Medium

TK Medium®, elaborat de Dr. Tanil Kocagöz (80, 225), reprezintă o alternativă inovatoare la mediile de cultură existente în prezent pentru micobacterii. Acesta poate reduce la jumătate timpul de detectare al creșterii bacteriene, comparabil cu sistemele automate. TK medium, presupune un mediu solid de cultură conținând numeroși indicatori de culoare care permit detectarea precoce a activității metabolice a micobacteriilor, precum și sensibilitatea la antibiotice. În timpul incubației, mediul TK de culoare roșie va vira către galben dacă sunt prezente micobacterii, cu mult timp înainte de a putea fi vizualizate coloniile, sau spre verde dacă există contaminare cu alte specii de bacterii sau fungi (figura 34). Aplicând metoda pe 78 tulpini izolate, în comparație cu metoda proporțiilor pe mediu LJ, Bicmen et al. au demonstrat diferite nivele de rezistență pentru HIN, RMP, ETB, S, și anume 24,6%, 22,6%, 22,9% și 21%, față de culturile pe mediu LJ, unde s-au obținut valori de 18,3%, 15,6%, 11%, respectiv 16,6% (24). Într-un alt studiu, efectuat pe 16 tulpini de M. tuberculosis, toate tulpinile sensibile la antibiotic în sistemul BACTEC 460TB au fost sensibile și pe mediul TK, rezultatele obținându-se cu 10 zile mai devreme decât în sistemul standard (19).

www.salubrisinc.com

Figura 34. TK medium. Creșterea micobacteriilor conduce la virajul culorii mediului de la roșu la galben. Contaminanți precum fungii sau bacteriile Gram-negative realizează un viraj de la roșu la verde.

5.2.9.6. Malachite Green Microtube (MGMT)

Indicatorul verde malahit este un component uzual pentru mediul de cultură LJ, de culoare verde închis, ce se decolorează în prezența activității metabolice a M. tuberculosis. Farnia et al. au aplicat pentru prima dată proprietățile acestuia în determinarea sensibilității micobacteriilor la antibiotice de linia I și a II-a, utilizând mediu lichid de cultură 7H9 agar. Sensibilitatea și specificitatea metodei aplicată direct pe probe biologice, prin comparație cu metoda proporțiilor pe mediu LJ a fost de 100% pentru HIN, RMP și CIP, rezultatele fiind disponibile în cca 15 zile, cu limite între 8 și 20 zile (7). Metoda este ușor de aplicat, rapidă, ieftină și sigură, permițând detectarea în timp util a tulpinilor MDR sau XDR-TB.

În 2008 OMS a efectuat o evaluare cost/ eficiență a metodelor de diagnostic și de determinare a sensibilității M. tuberculosis, recent aprobate și a celor aflate în curs de evaluare (tabel 8) (282). Dintre acestea ar putea fi aplicate in laboratoare naționale cu grad biorisc 1 urmatoarele: Detecție automată și screening MDR, Microscopie front-loaded, Interferon , Microscopie în fluorescență LED. Costuri mici sau moderate sunt atribuite metodei cu stripuri, indicatorilor colorimetrici, bacterioscopiei front-loaded sau în fluorescență LED, sistemelor de cultură pe mediu lichid – MODS și pe mediu solid – NRA și TL7H11. Studii pilot, efectuate în laboratoarele de microbiologie, urmează să confirme utilitatea și fiabilitatea metodelor menționate.

Tabel 8. Evaluare cost/ eficiență a metodelor de diagnostic și de determinare a sensibilității M. tuberculosis

METODE GENOTIPICE

Prin metodele genotipice se urmărește evidențierea determinanților genetici cunoscuți, ai rezistenței la antibiotice, a micobacteriilor izolate din probele biologice, în mod direct sau indirect. Spre deosebire de alte bacterii, rezistența Mycobacterium tuberculosis nu este mediată plasmidic, ci este conferită de modificările la nivel cromosomial. Tulpinile MDR – rezistente la cel puțin două antibiotice majore: izoniazidă și rifampicină – necesită identificare cât mai rapidă, probând astfel utilitatea metodelor genotipice. Analiza moleculară a tulpinilor MDR sugerează faptul că micobacteriile devin rezistente prin alterarea țintei antibioticelor (mutații) sau producția în exces a acesteia, minimalizând efectul antibioticelor. De obicei rezistența multi-drug este rezultatul unei achiziții individuale de mutații la nivelul genelor țintă (209). În acest sens au fost identificate o serie de gene (207) corelate cu rezistența (tabel 9).

Pentru determinarea rezistenței prin aceste metode, sunt urmate în principiu două etape:

extracția și amplificarea acizilor nucleici (i.e. amplificarea PCR – Polymerase Chain Reaction – a segmentelor din genomul M. tuberculosis recunoscute ca purtătoare de mutații corelate cu rezistența);

evaluarea produșilor de amplificare pentru evidențierea mutațiilor corelate cu rezistența (198, 60).

Aceste tehnici pot fi clasificate în 3 categorii în funcție de principiul după care se desfășoară: 1) electroforeză; 2) secvențiere; 3) hibridizare. Metodele de secvențiere și hibridizare determină în mod direct și exact mutațiile, în timp ce electroforeza este o modalitate indirectă de depistare a mutațiilor, și nu are abilitatea de a depista cu acuratețe substituția nucleotidului implicat (60).

Avantajele metodelor sunt date de rapiditatea determinării în absența unui timp necesar de cultură, posibilitatea aplicării directe pe probe biologice, reducerea riscului de biohazard și testarea automată (198).

Dezavantajele se referă la contaminarea cu inhibitorii biologici, a probelor clinice, care pot compromite rezultatele finale, precum și la complexitatea echipamentului necesar.

Tabel 9. Gene corelate cu rezistența Mycobacterium tuberculosis la antibiotice

5.3.1. Metode bazate pe electroforeză

Aceste metode urmăresc evidențierea mutațiilor după analiza în câmp electroforetic, a fragmentelor de ADN care cuprind regiuni implicate în rezistența la antibiotice. Mobilitatea segmentelor mutante este diferită de cea a secvențelor de referință. Pentru a facillita detectarea diferențelor de mobilitate, se analizează diferite variante ADN (lanțuri monocatenare, heteroduplex), în condiții electroforetice speciale (pH, geluri de denaturare).

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism analysis) reprezintă una dintre primele metode de depistare a rezistenței micobacteriilor la rifampicină (77). Testul se bazează pe proprietatea unei catene ADN de a-și modifica structura terțiară în funcție de modificările la nivelul bazelor componente. Produșii de amplificare PCR sunt denaturați în fragmente monocatenare ADN. Mobilitatea în gel electroforetic este dependentă de structura lor terțiară. Dacă există modificări la nivelul bazelor componente (mutante), migrarea în câmp electroforetic este diferită de paternul cunoscut pentru tulpinile sălbatice. În combinație cu PCR, SSCP este aplicată pentru detectarea rezistenței micobacteriilor la antibioticele de primă linie (248, 128, 38). Cu toate acestea, metoda este costisitoare și nu suficient de sensibilă.

Dideoxyfingerprinting reprezintă în fapt o extensie a SSCP. Astfel, după amplificarea PCR a fragmentelor ADN vizate, se efectuează o nouă amplificare PCR cu un primer marcat radioactiv, împreună cu un dideoxynucleotid (77). Acesta din urmă are rol de terminator al hibridizării la diferite nivele, obținându-se mai multe fragmente ADN, de dimensiuni mai mici. Produșii sunt ulterior analizați precum în SSCP. Raportarea modificărilor depistate în cazul tulpinilor mutante la un profil mai complex al tulpinii de referință, este mai fidelă, mai precisă (75).

Testul Heteroduplex se bazează pe diferențele profilurilor de migrare în câmp electroforetic ale heteroduplex ADN față de hemoduplex ADN. Produșii de amplificare PCR din tulpina de testat sunt denaturați și amestecați cu o cantitate echivalentă de apliconi denaturați proveniți de la tulpina de referință. Mixtura de ampliconi va fi răcită lent pentru a permite reconstituirea moleculelor de ADN dublucatenare. Dacă tulpina de testat este rezistentă (mutantă), complexul va migra diferit față de homoduplex care nu conține mutații. Metoda a fost aplicată pentru detectarea mutațiilor la nivelul genelor rpoB, katG, rpsL, embB și pncA (169, 55). Unii autori au îmbunătățit sensibilitatea metodei prin aplicarea a 2 gradiente – temperatură și poliacrilamidă –, ceea ce conferă și denumirea acesteia: „double gradient denaturation gel electrophoresis” sau DG-DGGE (227). O altă variantă a metodei Heteroduplex este testul „mismatch RNA-RNA” în care sunt analizați hibrizi ARN formați după tratarea cu ARN-ază, enzimă care clivează heteroduplexul la nivelul necomplementarității (mismatch) (183). Dezavantajele metodei constau în costurile ridicate, consum mare de timp (184), insensibilitatea tehnicii față de regiunile bogate în G-C.

PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) reprezintă o altă metodă prin care sunt identificate mutațiile asociate cu rezistența. Produșii rezultați în urma amplificării PCR sunt supuși acțiunii unei enzime de restricție care acționează specific, la nivelul unor situsuri de clivare cunoscute. În cazul unei tulpini mutante – care a dobândit sau pierdut unele situsuri de clivare – , segmentele ADN rezultate vor avea alte lungimi decât cele ale tulpinii bacteriene de referință. Migrarea în câmp electroforetic va fi alterată, rezultând profiluri diferite în funcție de mutație, numite amprente ADN sau amprente genomice. Deoarece nu toate mutațiile conduc la câștigul sau deleția unui locus de restricție, utilitatea RFLP pentru sceeningul tulpinilor rezistente este limitată (263).

Secvențiere ADN

Secvențierea ADN a produșilor de amplificare PCR, este cea mai utilizată metodă (263), find apreciată ca „gold standard” (198), deoarece este cea mai directă cale pentru definirea rezistenței genotipice (60). Metoda presupune amplificarea regiunilor bogate în codoni asociați cu rezistența, și analiza ulterioară a ampliconilor, după secvențiere. Prin intermediul acesteia se identifică mutațiile la nivelul genei rpoB (RNA polymerase β-subunit) corelate cu rezistența la rifampicină (247), dar și mutațiile responsabile pentru rezistența la alte antibiotice (60, 113, 228). A fost aplicată în format manual în urmă cu câțiva ani, dar în prezent este preferată secvențierea automată (262). Dezavantajele metodei constau în costul ridicat și necesitatea unui personal calificat.

O altă variantă de secvențiere utilizată pentru evidențierea rezistenței M. tuberculosis, este pirosecvențierea (13, 116). Aceasta folosește o tehnică de secvențiere în segmente scurte (30-50 bp) și se bazează pe detectarea cantitativă a pirofosfatului eliberat în urma încorporării nucleotidului în lanțul ADN.

Tehnici de hibridizare

Tehnicile de hibridizare cuprind un grup heterogen de metode, în care unele sunt aplicații la tehnicile PCR și includ sonde ADN specifice, altele sunt metode convenționale de hibridizare, în fază solidă sau lichidă. Toate au ca principiu comun hibridizarea a 2 catene ADN, una provenind de la tulpina de testat, cealaltă de la sonda complementară. Hibridizarea celor 2 catene este foarte stabilă dacă structurile sunt complementare. Dacă există o singură pereche de baze necomplementară datorită modificărilor genetice apărute la tulpina de testat, legarea celor 2 catene este alterată. Toate metodele PCR care utilizează sonde de hibridizare au fost grupate generic în categoria „Real-time PCR” deoarece monitorizează în timp real reacțiile de amplificare PCR.

Hibridizare în fază solidă

În prezent există două tehnici de hibridizare în fază solidă, disponibile pentru detectarea rezistenței la antibiotice pentru Mycobacterium tuberculosis: Line Probe Assay (INNO-LiPA Rif TB Assay, Innogenetics, Gent, Belgia) pentru evaluarea rezistenței la rifampicină și GenoType MTBDR assay (Hain Lifesciences, Nehren, Germania) pentru detectarea simultană a rezistenței la rifampicină și izoniazidă.

Tehnologia LiPA a aparut în urmă cu câțiva ani, și se bazează pe revers- hibridizarea ADN-ului amplificat atât din culturi izolate de bacil, cât și din probe biologice. Produșii rezultați sunt „scanați” cu ajutorul a zece sonde care acoperă regiunea core a genei rpoB a M. tuberculosis (figura 35), imobilizate pe un substrat de nitroceluloză (59). În funcție de prezența sau absența mutațiilor depistate, vizualizate printr-o reacție colorimetrică, tulpina este considerată rezistentă sau sensibilă la rifampicină (217).

În câteva studii metoda a fost aplicată atât pe culturi de micobacterii, cât și direct pe produsul patologic de spută (117, 256, 269, 264). Testul a fost considerat un bun indicator de rezistență, cu o sensibilitate de 98,5% pentru rifampicină (254).

Într-o meta-analiză recentă a unor studii care au aplicat testul LiPA, 12 din 14 studii care au aplicat metoda pe tulpini izolate, au avut o sensibilitate peste 95% și o specificitate de 100%.

Cele 4 studii care au aplicat metoda pe produse biologice specificitatea a rămas 100%, dar sensibilitatea a variat între 80% și 100% (174).

Într-un studiu mai recent, testul aplicat direct pe 420 probe biologice, a demostrat o concordanță de 99,6% între rezistența la rifampicină obținută pe culturi și testul LiPA, confirmând capacitatea acestuia din urmă de a detecta în timp record, cu o tehnică adecvată de extracție a ADN, rezistența la rifampicină direct din probele de spută (256).

GenoType MTBDR determină rezistența la rifampicină și izoniazidă utilizând culturi de bacili, prin detectarea celor mai frecvente mutații la nivelul genelor rpoB și katG (149). Principiul este același ca în testul LiPA, de detectare cu ajutorul unor sonde ADN fixe a produșilor rezultați prin PCR și revers-hibridizare. Într-un studiu recent, metoda aplicată pe 143 tulpini M. tuberculosis – MDR, a evidențiat mutații la nivelul genei rpoB la 99% din tulpini și mutații la nivelul katG la 88,4% din aceleași tulpini (106). Corelația cu metode de secvențiere ADN a fost de 100%, iar sensibilitatea și specificitatea obținute au fost comparabile cu metodele convenționale. Metoda a fost aplicată și direct pe probe biologice, cu o concordanță de 100% față de metodele convenționale (105). Un alt sudiu a demonstrat o sensibilitate de 84,2% pentru rezistența la izoniazidă și 96,2% pentru rifampicină (238).

Ambele metode sunt ușor de aplicat, dar necesită tehnică PCR și specialiști în biologie moleculară. Ca și pentru alte metode genotipice, sensibilitatea testului depinde de cantitatea de ADN din probele biologice, iar la aplicarea directă inhibitorii de contaminare ar putea conduce la reacții fals-negative (198).

Adaptată după Innogenetics NV (Gent, Belgia) 2006 Innogenetics Group

Figura 35. Line-probe assay pentru detectarea rezistenței la antibiotice. (A) Principiul revers-hibridizării. (B) INNO-LiPA. Testul INNO-LiPA conține 10 oligonucleotide proteice (una specifică pentru complexul Mycobacterium tuberculosis, cinci aparținând tulpinilor sălbatice – sonde S, și patru sonde R pentru detectarea mutațiilor specifice) care sunt imobilizate pe stripuri de nitroceluloză. Testul se desfășoară prin extracția ADN și amplificarea PCR a regiunilor ce codifică rezistența la Rifampicină ale genei rpoB. Produșii PCR sunt ulterior hibridizați cu proteinele imobilizate, iar rezultatele sunt interpretate colorimetric.

O altă metodă, ce utilizează același principiu pentru determinarea rezistenței la rifampicină, este rifoligotiparea. Este o metodă mai ieftină, dezvoltată în plan local, de către Institutul Național de Sănătate Publică și Mediu din Olanda, și aplicată inițial la Spitalul Cetrangolo din Buenos Aires – Argentina (173). Gena rpoB a M. tuberculosis este amplificată PCR cu primeri specifici, iar produșii rezultați sunt hibridizați la nivel de oligonucleotide și vor lua contact cu o membrana ADN ce conține atât secvențe rpoB sălbatică, precum și cele mai frecvente mutații corelate cu rezistența la rifampicină. Produșii de amplificare proveniți de la o tulpină rezistentă vor hibridiza mai mult porțiunea din membrană ce conține oligonucleotidele mutante. Rezistența poate fi detectată în câteva ore, după o reacție de intensificare luminescentă. Rezultatele sunt comparabile cu metoda proporțiilor sau MGIT960, sensibilitatea metodei fiind de 92,8% pentru rezistența la rifampicină.

Hibridizare în fază lichidă

Această metodă presupune o combinație PCR-ELISA și este utilizată pentru determinarea tulpinilor rezistente la rifampicină (84). Au fost selecționate 5 oligonucleotide independente din regiunea core a genei rpoB și imobilizate în microplăci, ca sonde de captură. Regiunea rpoB izolată din probele clinice este amplificată și clivată cu digoxygenin, apoi hibridizată cu sondele imobilizate. Un semnal pozitiv corespunde complementarității perfecte cu sondele, deci absența mutațiilor, în timp ce un semnal negativ semnifică prezența acestora.

Hibridizare în microdispozitive

Microdispozitivele, cunoscute și ca „biochips” sau „chips ADN”, sunt recent utilizate pentru determinarea rezistenței micobacteriilor la antibiotice. Metoda se bazează pe hibridizarea ADN-ului obținut din probele clinice, cu oligonucleotide corespunzătoare cu diferitele variante de mutante rpoB, imobilizate pe suport solid de gel poliacrilamidă (MAGIChip) (164) sau microlamele de sticlă (Gen Chip, Affimetrix Inc, Santa Cruy, CA) (257). Regiunea rpoB din tulpina de testat este marcată fluorescent prin PCR, ulterior hibridizată în microdispozitive. Fluorescența este mai mare pentru oligonucleotidele imobilizate, complementare sondelor, în timp ce necomplementaritatea conduce la diminuarea fluorescenței. Intensitatea relativă a fluorescenței între diferitele poziții în microdispozitive, definește profilul mutant al specimenului clinic. Această metodă permite descrierea a 30 de mutante diferite pentru gena rpoB pe suport de poliacrilamidă, și 50 de variante diferite în versiunea GeneChip, în decurs de 24 ore (164), respectiv 4 ore (257). S-a determinat astfel rezistența la HIN și RMP (96). Recent, a fost elaborat un chip ADN mai performant – CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance – care constă într-un microchip-oligonucleotid cuplat cu PCR, prin care se evaluează rezistența la HIN și RMP. Metoda a permis identificarea a 84,1% din tulpinile rezistente la HIN, datorită mutațiilor la nivelul codonilor 315 și inhA15 de pe gena katG, și 100% din tulpinile rezistente la RMP, prin mutații la nivelul codonilor rpoB511, rpoB513, rpoB516, rpoB522, rpoB526, rpoB531, rpoB533. Specificitatea pentru rezistența la HIN și RMP a fost de 100%, respectiv 95,3% (127). Datorită costurilor ridicate, metoda este inaccesibilă în testările de rutină, mai ales în țările cu incidență crescută a tuberculozei.

Real-Time PCR

Metodele real-time PCR monitorizează în timp real amplificarea ADN, prin măsurarea semnalului fluorescent acumulat prin amplificarea produșilor. Acest semnal este legat de sondele ADN complementare catenelor ADN de analizat, și adaptat pentru detectarea mutațiilor la acel nivel.

Tehnologia prin real-time PCR a fost recent aplictă pentru determinarea rezisteței M. tuberculosis. Au fost utilizate diferite sonde, precum sonda TaqMan, „molecular beacons”, sonde FRET (fluorescence-resonance-energy-transfer), bisonde (231). Avantajul testului constă în rapiditate și riscul scăzut de contaminare. Dezavantajul major este dat de echipamentul și reactivii costisitori, precum și necesitatea unui personal înalt calificat. Metoda a fost aplicată pe tulpini de micobacterii, iar mai recent, direct pe probe clinice (224, 219, 69). Rezultatele se obțin în 1,5-2 ore de la extracția ADN.

Sondele TaqMan

Aceste sonde sunt marcate fluorescent la capătul 5', iar la capătul 3' este poziționată o moleculă de inhibare a fluorescenței (quencher). Sonda se leagă complementar de segmentele țintă amplificate. Câtă vreme sondele rămân legate complementar de segmentele țintă, semnalul fluorescent este inhibat de molecula quencher, care îi absoarbe energia prin transfer de electroni. În etapa de elongație a PCR, activitatea de 5'-3'-exonuclează a polimerazei Taq conduce la eliberarea moleculei fluorescente care – odată separată de quencher –, emite lumină fluorescentă a cărei intensitate este înregistrată. Dacă există vreo mutație la nivelul segmentului țintă, acesta nu se va lega de sondă, iar Taq polimeraza nu va recunoaște sonda, și molecula fluorescentă va rămâne atașată de quencher (figura 36). (60).

Un studiu în care a fost aplicată această metodă pentru determinarea rezistenței la RMP și HIN, utilizându-se culturi M. tuberculosis sau probe clinice, a demonstrat o specificitate de 100%, și sensibilitate de 97% și 40% pentru culturi, respectiv prelevate clinice (70).

Dezavantajul metodei constă în necesitatea unui control intern de amplificare, cu sonde complementare, care să garanteze că absența fluorescenței se datorează unor mutații și nu unor deficiențe în mecanismul de amplificare PCR.

5.3.4.2 Molecular beacons

Molecular beacon este o sondă obținută prin hibridizare, monocatenară, formată din oligonucleotide, dispusă sub formă de ansă, la capetele căreia se află un fluorofor, respectiv un sistem de inactivare (quencher). În absența unei ținte, sonda nu este fluorescentă deoarece capetele ansei sunt apropiate și se anulează reciproc prin transfer de electroni. În schimb, în prezența unei ținte ADN complementare, structura sondei se modifică în urma hibridizării, ansa se deschide, iar fluoroforul eliberat va emite lumină. Sunt utilizați fluorofori diferiți pentru ținte diferite (figura 37).

Molecular beacons sunt foarte specifice și pot identifica substituția unui singur nucleotid. Metoda este utilizată pentru genotiparea Mycobacterium tuberculosis, dar și pentru determinarea rezistenței acestuia la antibiotice. Studiile desfășurate au demonstrat

Adaptată după Garcia de Viedma, Clin Microbiol Infect, 2003, 9; 349-359.

Figură 36. Sonda Taqman. La fiecare pas de atașare, sonda se leagă de regiunea complementară din amplicon. Quencher-ul limitează emisia fluorescentă. În etapa de elongare polimeraza Taq întâlnește sonda atașată iar exonucleaza 5'-3' eliberează fluoroforul din sondă, ceea ce conduce la emisia luminii fluorescente. Dacă există mutații în regiunea complementară sondei, aceasta din urmă nu va mai adera la amplicon, iar flouroforul nu va fi eliberat de polimeraza Taq. Prezența mutatiilor este detectată prin măsurarea acumulării fluorescenței în timp real și compararea cu profilul cunoscut al tulpinii sălbatice (ts)

Adaptată după Garcia de Viedma, Clin Microbiol Infect, 2003, 9; 349-359.

Figură 37. Molecular beacons. Molecular beacon este dispus sub formă de ansă, cu capetele fluorescent, respectiv quencher venind în contact și anulând astfel emisia fluorescentă. În etapa de atașare ansa se desface și se leagă complementar de amplicon, iar capătul fluorescent, eliberat de quencher, va fi activ. Dacă există mutații, sonda nu se va atașa la amplicon, și va rămâne sub formă de ansă, fără emisie fluorescentă. Prezența mutației este detectată prin măsurarea acumulării fluorescenței în timp real și compararea cu profilul cunoscut al tulpinii sălbatice (ts)

sensibilitate de 89-98% și specificitate de 99-100% în detectarea rezistenței la rifampicină, și mai mică pentru izoniazidă (68, 144, 203). O variantă mai recentă a metodei, numită „wave-length-shifting molecular beacon” permite analiza simultană a mai multor mutații prin marcarea cu diferiți fluorofori specifici pentru diferite mutații (68). Metoda necesită deasemeni un control intern de amplificare. Deși este aplicată în cadrul serviciilor de sănătate publică, aceasta nu a primit aprobarea FDA pentru uz clinic

5.3.4.3 Sondele FRET

Aceste sonde sunt perechi de sonde proiectate să se lege la segmentul țintă în poziție „head-to-tail” (figura 38). O sondă „anchor” are rol de ancorare și este marcată fluorescent la capătul 3' și o sondă adiacentă „sensor”, marcată fluorescent la capătul 5', are rol de depistare a mutațiilor. Fluorescența acesteia este augmentată de prima sondă, cu condiția ca distanța dintre ele să nu fie mai mare de 5 nucleotide. Când sondele sunt legate complementar de segmentele țintă, există o emisie fluorescentă dată de sonda „sensor”, care este măsurată în timp real. Într-o etapă ulterioră – „melting step”, prin creștere lentă a temperaturii, sonda sensor este separată de țintă, iar dispozitivul va măsura reducerea progresivă a fluorescenței. Prin procesarea datelor înregistrate se constată că temperatura de topire (melting temperature Tm) este mai mare pentru tulpina sălbatică, în timp ce prezența mutațiilor, obiectivate prin necomplementaritatea sondelor cu ținta, conduce la scăderea fluorescenței pentru o Tm mai mică. Astfel, deviația curbei Tm față de cea de referință corespunde existenței unei tulpini mutante.

Prin această metodă s-au analizat rezistența M. tuberculosis la RMP și HIN, prin evidențierea mutațiilor la nivelul genelor rpoB, katG (251), și inh A (252). O variantă complexă (83) permite depistarea tuturor mutațiilor asociate cu rezistența la RMP și majoritatea celor asociate cu rezistența la HIN cu numai 3 perechi de sonde FRET. Acest record a fost posibil prin acordarea rolului de sensor ambelor sonde dintr-o pereche.

Spre deosebire de sondele TaqMan sau molecular beacons, FRET nu necesită control intern de amplificare, deoarece detectarea mutațiilor nu se bazează pe prezența sau abseța semnalului fluorescent, ci pe devierea curbei Tm.

5.3.4.4. Biprobes

In real-time PCR, biprobes – sonde marcate fluorescent la capătul 5', sunt incluse în reacție împreună cu Sybr-Green, un agent a cărui fluorescență este condiționată de contactul cu un segment dublucatenar. La sfârșitul fiecărui ciclu de amplificare se măsoara fluorescența sondei amplificată de SG. Analiza mutațiilor urmează același principiu ca și în cazul sondelor FRET, în care deviația curbei Tm indică prezența mutațiilor.

5.3.5. RT-PCR și analiza temperaturilor de topire (HRM – high resolution melting) -RT-PCR LightScanner 32 Instrument/LS32 (Idaho Technology, Salt lake City, UT)-

este o metodă nouă, simplă, care se desfășoară în sistem închis, cu sensibilitate și specificitate mai mari decât cele obținute prin cromatografie (HPLC) (47). HRM nu utilizează sonde fluorescente costisitoare și nu presupune manevre manuale după amplificarea PCR, ceea ce permite analiza variațiilor genetice (mutații) la nivelul ampliconilor PCR. HRM oferă posibilitatea de a identifica mult mai detaliat decât metoda clasică de analiză a curbelor de topire (classical melting curve analysis) denaturarea termică a lanțurilor duble ADN, oferind mult mai multe informații despre acizii nucleici, pe baza punctelor de topire. Cea mai importantă aplicație a HRM este scanarea genetică, pentru determinarea prezenței mutațiilor în cadrul ampliconilor PCR, ca alternativă a metodelor de secvențiere. Mutația la nivelul unui singur codon poate influența aspectul curbelor temperaturii de topire, conducând astfel la identificarea tulpinii mutante.

5.3.6. Alte metode genotipice

Au fost testate și alte metode de determinare rapidă a rezistenței mycobacteriilor, precum CFLP (Cleavage Fragment Length Poymorphism) (240), metoda „hybridization protection” (168), ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) (73), spoligotipare (145), dar sunt necesare studii aprofundate și comparative pentru confirmare și validare.

Adaptată după Garcia de Viedma, Clin Microbiol Infect, 2003, 9; 349-359.

Figura 38. Sonde FRET. (A) În etapa de atașare, cele două sonde FRET („anchor” și „sensor”) se leagă la fragmentul ADN. Poziționarea sondelor „head-to-tail” permite capetelor fluorescente să fie apropiate. Prin transfer de energie, excitarea sondei „anchor” conduce la stimularea consecutivă a sondei „sensor” cu emiterea de lumină fluorescentă. (B) În etapa „post-melting PCR” este surprins comportamentul sondei „sensor” pentru o tulpină sălbatică, în comparație cu o secvență mutantă. Sonda se desprinde de regiunea complementară la o temperatură mai mare pentru tulpina sălbatică, în timp ce secvența mutantă, slab ancorată, se desprinde mai repede, odată cu creșterea temperaturii. Prezența mutației este detectată prin devierea graficului temperaturii de incalzire față de curba cunoscută a tulpinii sălbatice.

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL 6.

VALOAREA DIAGNOSTICĂ A METODEI CU NITRAT REDUCTAZĂ

6.1. INTRODUCERE

În ultimele decenii, rezistența multidrog a devenit o amenințare importantă în controlul terapeutic al tuberculozei (TB) (279). Detectarea rapidă a rezistenței la rifampicină, marker decisiv al rezistenței multidrog, conferă o mare utilitate clinică, în măsura în care poate identifica pacienții care nu răspund la terapie, ceea ce ar putea contribui la reducerea transmiterii bolii. Screeningul tulpinilor pentru rezistența la rifampicină și izoniazidă, ar fi salutar îndeosebi în țările cu resurse minime, în care este imposibilă realizarea antibiogramei clasice pentru micobacterii, utilizând toate antibioticele antituberculoase de primă linie. Dezvoltarea unei metode alternative, rapide și ieftine, care se poate aplica direct probelor biologice de spută, este benefică pentru Programele Naționale de Control al Tuberculozei, conferind o monitorizare rapidă a pacienților pasibili de TB-MDR (3).

Testele convenționale utilizate pentru detectarea sensibilității Mycobacterium tuberculosis la antibiotice, sunt laborioase și cronofage. Sistemele automate oferă rezultate rapide, dar sunt costisitoare și dificil de aplicat în țările mai puțin dezvoltate (86).

Metoda cu nitrat-reductază (NRA), aplicație a metodei Griess (95), a fost utilizată în ultimul deceniu pentru evaluarea sensibilității Mycobacterium tuberculosis la antibiotice, folosind mediul Löwenstein Jensen (9, 49, 142, 170, 153). Metoda se bazează pe capacitatea Mycobacterium tuberculosis de a reduce nitratul la nitrit, prin acțiunea enzimei nitrat-reductază, reacție semnalată prin virajul de culoare după adăugarea reactivului Griess. NRA permite astfel detectarea rapidă a creșterii micobacteriilor.

Obiectivul acestui studiu a fost evaluarea performanței metodei directe și indirecte cu nitrat-reductază față de metoda clasică a proporțiilor, în determinarea sensibilității la rifampicină și izoniazidă. Metoda directă a fost aplicată direct pe probele de spută provenite de la pacienți cu tuberculoză, în timp ce metoda indirectă a fost aplicată pe tulpinile izolate de Mycobacterium tuberculosis.

6.2. MATERIALE ȘI METODE – METODOLOGIA STUDIULUI

Studiul de față a fost efectuat în Spitalul Clinic de Boli Infecțioase și Tropicale “Dr. Victor Babeș” (SVB), materialele biologice (prelevate patologice, tulpini izolate) fiind puse la dispoziție pentru studiu de către laboratorul de Microbiologie Clinică al acestui spital. Menționez că activitatea laboratorului de Microbiologie Clinică se axează în principal pe aplicarea metodelor de diagnostic bacteriologic, micologic, în vederea susținerii etiologiei diagnosticului de „boală infecțioasă”. Printre numeroasele obiective de activitate ale laboratorului se evidențiază studiul rezistenței agenților infecțioși la antibiotice și chimioterapice, între care o importanță deosebită se acordă depistării tulpinilor multirezistente de Mycobacterium tuberculosis. Pentru întreprinderea acestor activități, laboratorul este acreditat pentru gradul 3 de biorisc.

În figura 39 am schematizat o metodologie de lucru, în care sunt ierarhizate etapele diagnosticului microbiologic al infecției tuberculoase (în cazul de față preponderent respiratorie), în care metodele fenotipice convenționale, considerate „de referință”, se armonizează fie cu metode fenotipice „rapide”, fie cu metode moleculare bazate în cea mai mare parte pe investigări genotipice.

În contextul acestei metodologii, studiul s-a efectuat pe un set de 105 prelevate investigate direct și 34 tulpini izolate în laborator în aceeași perioadă.

Proveniența probelor biologice

În intervalul iunie 2009 – iunie 2010, în laboratorul SVB au fost prelucrate un număr de 5957 prelevate de spută sau aspirat bronșic, din care 1109 au fost pozitive în microscopia optică (18,6%) și din care s-au izolat 1367 tulpini (22,9%). Dintre acestea, în cadrul studiului nostru prospectiv, am folosit 139 probe biologice, dintre care 105 probe de spută și 34 tulpini izolate. Acestea au provenit de la 122 pacienți diagnosticați cu tuberculoză pulmonară, atât cazuri noi, cât și cele la reluare de tratament (câte o singură probă de spută de la fiecare pacient). Bolnavii au avut vârste cuprinse între 18 și 80 de ani, cu o medie de 44,3 ani, iar circa două treimi au fost de sex masculin (80 pacienți). Au fost selectate probele biologice (spută) cu peste 10 bacili acid-alcoolo rezistenți (BAAR)/100 câmpuri (BAAR 1+).

Figura 39. Schema metodologiei studiului întreprins.

Diagnosticul fenotipic și testarea sensibilității la tuberculostatice prin cultivare

În schema din figura 39 am menționat efectuarea unui frotiu direct, din sputa emisă spontan, pentru estimarea reacției inflamatorii (celule epiteliale, macro-/microfage) și evaluarea florei de asociație, respectiv bacili/coci Gram pozitiv/negativ, fungi. Această examinare a fost inconstantă întrucât am urmărit în mod țintit detectarea, izolarea, identificarea și sensibilitatea la antibiotice a BAAR.

Izolarea micobacteriilor din spută, prototip al produselor patologice contaminate cu bogată floră microbiană autohtonă tractului respirator, implică următoarele etape: omogenizarea/ decontaminarea și concentrarea BAAR, deoarece majoritatea produselor sunt paucibacilare și fără parcurgerea acestor etape randamentul izolării este foarte scăzut.

Omogenizarea:

Se folosesc agenți chimici care omogenizează (fluidifică) sputa prin descompunerea structurilor sale organice (mucus, fibrină, detritus) și concomitent distrug flora asociată din produs. Efectul bactericid al substanțelor decontaminante nu este strict selectiv, și variază în funcție de agentul chimic folosit, durata contactului cu germenii și condițiile centrifugării.

Metoda cu hidroxid de sodiu și centrifugare:

Metoda concentrează bine micobacteriile din produsul prelucrat, este simplă, ieftină și asigură un control corect și eficient al contaminării. Soluția de NaOH sterilizată poate fi păstrată câteva săptămâni.

Dezavantaje:

risc de eroare dacă timpul de contact nu este strict controlat și respectat (nu mai mult de 20 minute);

risc de eroare dacă parametrii centrifugării nu sunt optimi (forța relativă de centrifugare de 3000xg, cu o durată de 15-20 minute, în centrifuga cu răcire);

prin această metodă se distrug cca 60% din bacili, chiar dacă este respectată cu rigoare tehnica standardizată, independent de alți factori adiționali (căldura dezvoltată în timpul centrifugării, neutralizarea incorectă).

Materiale necesare

centrifugă cu sistem de securitate biologică și cu răcire;

eprubete (cuve) de centrifugă din material plastic cu capac filetat, cu capacitate minimă de 10ml;

pipete de 1ml, 2ml, 5ml cu pară;

pipete Pasteur de unică folosință;

termostat;

frigider;

mănuși de protecție.

Reactivi

Soluție sterilă de hidroxid de sodiu 4%

Soluție sterilă de HCl 8%;

Soluție de albastru bromtimol (indicator);

Soluție de NaOH 4% cu indicator pH.

Tehnica

Din eșantionul de spută se transferă cu pipeta 2-3ml într-o eprubetă de centrifugă de 10-12ml;

se adaugă un volum egal de soluție de NaOH 4% cu indicator pH;

se înfiletează capacul și se agită;

se lasă în repaus 15 minute la temperatura camerei, cu 1-2 agitări;

se neutralizează cu HCl 8% la pH neutru (galben-verzui);

se completează până la capacitatea eprubetei cu apă distilată;

se centrifughează la 3000xg timp de 15 minute;

se decantează supernatantul reținând 2ml;

se resuspendă în lichidul rămas omogenizând cu pipeta Pasteur.

Examenul microscopic

Etalarea:

se marcheaza lame noi, curate si degresate cu numere complete preluate din registrul de laborator;

cu ansa bacteriologică flambată și răcită se aleg porțiuni purulente, opace din spută sau se prelevă o ansă din sedimentul rezultat după centrifugare și se etalează uniform în porțiunea centrală a lamei, fără să ajungă la marginile lamei;

Uscarea

Lamele se lasă la uscat la temperatura camerei;

Fixarea

Se ține lama cu pensa și se trece partea opusă frotiului prin flacăra becului de gaz de 3 ori;

Se așteaptă răcirea lamelor.

Colorația Ziehl-Neelsen

Colorarea:

Se așează lamele cu frotiurile fixate pe suportul de colorare, fără să se atingă între ele;

Se acoperă complet frotiurile cu soluție 0,3% de fucsină fenicată proaspăt filtrată;

Se trece pe sub lame flacăra unui bec de gaz până la emiterea de vapori, fără să fiarbă;

Se repetă această acțiune de 3-4 ori în primele 3 minute; se lasă până la 10 minute;

Se spală cu jet slab de apă de robinet și se scurge apa.

Decolorarea:

Se acoperă frotiul cu acid-alcool 3% și se lasă pentru decolorare maxim 3 minute;

Se repetă decolorarea dacă frotiul rămâne roșu;

Se spală din nou cu jet slab de apă de robinet și se scurge apa.

Recolorarea

Se acoperă frotiul cu albastru de metilen 0,3% timp de 30 secunde, maximum1 minut;

Se spală blând sub jet de apă de robinet;

Se usucă frotiurile în poziție înclinată pe suport de lame.

Examinarea frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen se face la microscopul optic, folosind obiectivul cu imersie și oculare 10x sau 7x.

Examinara frotiului

Frotiul se examinează dintr-un capăt în celălalt, câmp microscopic după câmp microscopic.

Se examinează minim 100 de câmpuri înainte ca frotiul să fie declarat negativ; dacă frotiul este intens pozitiv, pot fi examinate doar până la 25 câmpuri.

Caracteristicile morfologice ale BAAR:

BAAR au aproximativ 1-10 µm lungime și apar ca bacili subțiri, drepți sau încurbați. În colorația Ziehl-Neelsen, BAAR apar ca bacili roșii, drepți sau ușor încurbați, uneori cu structură granulară, izolați, în perechi sau grupați, evidențiindu-se clar pe fondul albastru al frotiului.

Interpretarea rezultatelor se efectuează conform tabelului 10 (278).

Tabel 10. Exprimarea semnificativă a rezultatelor examenului microscopic

Cultivarea

În diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, și ulterior în testarea chimiosensibilității, cultivarea reprezintă metoda de bază. Cultivarea permite atât izolarea, cât și identificarea bacililor tuberculoși, confirmând etiologia și starea de excretor a pacientului. Este o metodă foarte sensibilă, cu o limită de 10-100 bacili/ml produs (față de 5.000-10.000 în cazul frotiului direct), dar în acelați timp o metodă pretențioasă și complexă.

c1) Însămânțarea

Medii de cultură:

Mediile de cultură trebuie să ofere condiții optime creșterii micobacteriilor, chiar dacă produsul este paucibacilar. În vederea izolării M. tuberculosis au fost propuse și utilizate medii cu compoziții și caracteristici diferite. În tabelul 11 sunt prezentate medii de izolare recomandate fie în sistemul de lucru convențional, fie în sisteme automatizate recomandate de diverse companii. Am practicat izolarea pe mediul Löwenstein Jensen (LJ) deoarece întrunește avantaje deosebite, fiind recomandat în metodologiile internaționale.

Avantaje

Asigură creșterea optimă a micobacteriilor;

Se poate păstra în frigider căteva săptămâni;

Inhibă semnificativ germenii de contaminare prin verdele malachit pe care îl conține;

Se livrează în condiția „gata de folosit”, cu parametrii de calitate controlți și garantați;

Este ieftin.

Dezavantaje

Intervalul de timp necesar pentru a obține o cultură pozitivă este de 4-8 săptămâni;

Contaminarea conduce la pierderea culturii respective.

Tabel 11. Medii de cultură utilizate

Caracteristicile mediului LJ înainte de folosire

Culoarea: verde luminos;

Suprafața mediului trebuie să fie netedă, lucioasă, fără bule de aer.

Să aibă lichid de condensare pe fundul eprubetei;

Tehnica

Am însămânțat 3 tuburi cu mediu Löwenstein Jensen pentru fiecare produs;

Se însămânțează câte 0,2ml sau 4 picături din sedimentul eșantionului de produs prelucrat, în fiecare tub cu mediu de cultură, folosind o pipetă Pasteur;

Se înclină fiecare tub pentru ca inoculul să inunde toată suprafața mediului;

Tuburile însămânțate se pun în poziție înclinată (la un unghi de 25-30º) pe tăvițe speciale, astfel încât lichidul însămânțat să scalde suprafața mediului, dar să nu ajungă la capac;

Capacul nu se închide complet, ci rămâne semiînchis;

Se incubează, în funcție de indicațiile producătorului, 2-5 zile în poziție înclinată (aprox 10°), la termostat de 37ºC, pentru ca excesul de lichid să se evapore;

Se inchide capacul etanș;

Se așează în poziție verticală;

Se elimină tuburile contaminate cu floră de asociație;

Incubarea culturilor și controlul creșterii bacililor:

Se incubează culturile până la 2 luni de incubare, în termostat, la 36,5-37ºC;

Primul control se efectuează la ridicarea tuburilor în poziție verticală și permite excluderea eprubetelor contaminate;

dacă toate cele 3 tuburi sunt contaminate, examenul este comptomis și se repetă;

În continuare, culturile vor fi controlate săptămânal până la împlinirea a 8 săptămâni de incubare (60 de zile).

Caracteristicile coloniilor

Coloniile de bacili tuberculoși devin vizibile în cultura primară după cel puțin 3-4 săptămâni de la însămâțare;

Culoarea coloniilor este crem gălbui-palid, rugoase, cu aspect conopidiform;

În tabelul 12 am sintetizat principalele caracteristici de cultivabilitate pe mediul LJ ale micobacteriilor.

Pe alte medii solide, mediul Ogawa sau mediul Ogawa modificat utilizat în trecut și în țara noastră datorită unor avantaje economice, dezvoltarea coloniilor și aspectul lor este similar. Nu insist asupra acestor caracteristici deoarece, în afara mediului Löwenstein Jensen, nu am mai utilizat alte medii în această lucrare.

c2) Interpretarea rezultatelor:

Tuburile cu mediu solid se examinează la intervale de timp fixe. Rezultatele se exprimă semificativ, conform scalei prezentate în tabelul 13.

Pe preparatul microscopic, frotiul realizat din cultură permite, uneori, evidențierea unei distribuții în corzi-serpentine de diferite lungimi, bacili izolați cu lungime de 3-4 µm fiind în număr mic.

c3) Identificarea definitivă

Pentru identificarea de certitudine s-a utilizat o suită de teste enzimatice, pe baza cărora s-au evidențiat caracterele specifice M. tuberculosis: producerea de catalază inactivată la 68°C, producerea de niacină, reducerea nitraților, rezistența la T2H. Tulpinile rezistente la izoniazidă pot fi disgonice și catalazo-negative. Testele biochimice recomandate pentru identificarea M. tuberculosis au fost prezentate în tabelul 1.

Tabel 12. Morfologia coloniilor de micobacterii pe mediul Löwenstein Jensen

Tabel 13. Exprimarea semnificativă a rezultatelor examenului macroscopic al coloniilor.

Testarea chimiosensibilității

Cunoașterea sensibilității la chimioterapice/ antibiotice a tulpinilor bacteriene este o prevedere esențială în strategia terapeutică a tuberculozei, având în vedere răspândirea largă a rezistenței, cauza principală a eșecului terapeutic și evoluția spre fatalitate a acestei boli. Din rațiuni practice au fost definite mai multe tipuri de rezistență a M. tuberculosis la antibiotice:

Rezistența primară a tulpinilor de M. tuberculosis se întâlnește la pacienții care nu au primit niciodată vreun tratament antituberculos și care s-au contaminat cu bacili chimiorezistenți.

Rezistența dobândită (secundară) a tulpinilor de M. tuberculosis poate fi întâlnită la pacienții care au primit cel puțin o lună de tratament antituberculos. Poate fi afirmată doar în situația în care avem dovada sensibilității inițiale a tulpinii.

Rezistența combinată reprezintă prevalența rezistenței tulpinilor izolate de la toate cazurile de tuberculoză, indiferent dacă au avut tratament antituberculos anterior.

Multidrog rezistența se definește ca rezistență a tulpinilor cel puțin la izoniazidă și rifampicină.

Pentru testarea sensibilității la antibiotice a M. tuberculosis au fost recomandate mai multe metode:

Antibiograma directă folosește ca inocul produsul patologic conținând o mare cantitate de BAAR, după decontaminare. Are dezavantajul erorilor de eșantionare a inoculului bacterian și al ratei de contaminare simultană a culturilor. Furnizează însă rezultate într-un interval mult mai mare decât metodele „indirecte”.

Antibiograma indirectă folosește ca inocul bacterian preparate din cultura izolată și identificată. Are avantajul dimensionării corecte a inoculului bacterian, cu o rată de contaminare nulă, dar prelungește timpul rezultatului cu 3-4 săptămâni.

Dintre metodele recomandate de organismele internaționale mai frecvent utilizate sunt:

metoda proporțiilor,

metoda concentrațiilor absolute,

metoda raportului de rezistență – folosind mediul solid Löwenstein-Jensen,

metoda BACTEC 460 (Becton Dickinson)

BACTEC-MGIT (Myobacteria Growth Indicator Tube) (Becton Dickinson, Sparks, MD)

Ultimele două metode utilizează medii lichide în sisteme automatizate cu parametrii riguros controlați.

Metoda proporțiilor (MP)

Tehnica:

Pregătirea materialelor

Se scot din frigider mediile corespunzătoare numărului de tulpini care urmează să fie testate;

Se numerotează tuburile cu numărul culturii și cu diluția inoculului (câte două tuburi martor și câte un tub cu fiecare substanță antituberculoasă pentru fiecare diluție).

Se marchează tuburile pentru prepararea suspensiei bacteriene, tuburile pentru prepararea inoculului standardizat și tuburile pentru prepararea diluției de însămânțat (câte 5 tuburi pentru fiecare diluție).

Se repartizează câte 1 ml apă distilată sterilă (AD) în tuburile pentru prepararea suspensiei bacteriene și câte 10 ml în tuburile pentru prepararea diluțiilor.

Se numerotează câte o lamă de microscop pentru fiecare cultură.

Prepararea inoculului bacterian

Se folosește cultura de 21-30 zile de la data însămânțării

Primo-cultura cu creștere de 2-3+,

Sau subcultură în cazul primo-culturii îmbătrânite sau sărace, dar nu mai puțin de 10 colonii.

Prepararea suspensiei bacteriene

Se încarcă o ansă spatulată cu bacterii prelevate din cât mai multe colonii, fără să fie antrenat și mediu;

Se emulsionează în 1 ml AD. La sfârșit se etalează un spot pe lamă. După fixare frotiul se colorează Ziehl Nielsen.

Se completează cu AD până la cca 3 ml. Se omogenizează fără a barbota.

Se așteaptă 30 minute să sedimenteze flacoanele mari.

Cu o pipetă sterilă se trece supernatantul într-un alt tub care are dimensiunile etalonului de turbiditate.

Se ajustează turbiditatea prin comparare cu un etalon preparat din vaccin BCG liofilizat, realizând concentrația de 1mg/ml. Etalonarea se poate face utilizând și standardul nr.1 McFarland.

Suspensia bacteriană astfel etalonată corespunde la 106-107 UFC/ml.

Diluarea suspensiei bacteriene:

Se schimbă pipeta după fiecare diluție;

Cu o pipetă sterilă se ia 1 ml din suspensia bacteriană de 1mg/ml și se diluează în 9 ml AD (diluție 10-1);

După omogenizare, se ia 1 ml din diluția 10-1 și se transvazează în 9 ml AD (diluție 10-2);

Se continuă aceeași procedură până la realizarea diluției de 10-5;

Se însămânțează din diluția 10-5 câte 0,2 ml în fiecare din cele două tuburi martor și în fiecare tub test;

Se inundă suprafața mediului cu atenție, asfel încât inoculul să nu ajungă la dop;

Se incubează la 36,5-37ºC, 48-72 ore înclinat astfel încât suprafața pantei să fie orizontală, orientată în sus, cu capacul semi-înfiletat;

După evaporarea lichidului se ridică tuburile în poziție verticală, se închid complet și se incubează în continuare până la 28 zile, când se face prima citire și interpretare a rezultatelor;

Citirea și interpretarea rezultatelor:

Se începe cu citirea rezultatelor pentru tulpina H37Rv pusă în lucru pentru fiecare lot nou de mediu; în interpretarea rezultatelor tuturor antibiogramelor care folosesc același lot, se face referire la această interpretare;

Se examinează tuburile martor pentru tulpinile de testat, numărând coloniile.

Dacă pe tuburile test nu se înregistrează o creștere bacteriană, se consideră tulpina SENSIBILĂ;

Dacă creșterea pe tuburile test este mai mare decât 1% din media numărului coloniilor de pe tuburile martor, se consideră că tulpina este REZISTENTĂ la respectiva substanță antituberculoasă;

Dacă pe tuburile test creșterea este mai mică decât 1% din media numărului coloniilor de pe tuburile martor, se vor reincuba tuburile corespunzătoare tulpinii respective până la 35 zile, când se face citirea finală.

Controlul calității pentru antibigramă:

Mediul Löwenstein Jensen este un mediu coagulat, opac, înclinat, de culoare verde deschis. Umiditatea uniformă a mediului este asigurată prin păstrarea eprubetelor în poziție orizontală. Dacă eprubetele sunt menținute vertical, în partea de jos a mediului va aparea un lichid de condens (incolor). Pot apare rare bule mici produse spontan în timpul coagulării care nu afectează calitatea mediului.

Tulpina M. Tuberculosis ATCC 25177 sensibilă la izoniazidă și rifampicină a fost utilizată pentru controlul calității inhibitorii a nediilor cu antibioticele utilizate.

Diagnosticul fenotipic prin metode automatizate Bact/ALERT

Sistemul BacT/ALERT a fost proiectat pentru culturile de Mycobacterium tuberculosis. Dacă se suplimentează mediul cu lichid de îmbogățire MB/Bact, acesta suportă și creșterea altor microorganisme aerobe. Sistemul include prezența unui agent litic (saponină), polietanolsulfonat (SPS) și alte suplimente care depășesc etapa de procesare a probelor biologice și stimulează creșterea micobacteriilor.

Principiu:

Sistemul utilizează un sensor colorimetric, iar prin lumina reflectată se monitorizează prezența dioxidului de carbon (CO2) produs în mediu. Microorganismele produc dioxid de carbon prin metabolizarea substratului pe care cresc, iar senzorul instalat pe fundul flaconului, permeabil pentru gaz, își schimbă culoarea de la verde-albastru la galben. Lumina reflectată este monitorizată și înregistrată la fiecare 10 minute.

Flacoanele conțin 29 ml mediu împreună cu senzorul sensibil la prezența CO2. Mediul conține Agar Middlebrook 7H9, cazeină (0,1%), glicerol (1%), polietanolsulfonat de sodiu (0,025%) și apă pură. Lichidul de îmbogățire conține albumină bovină (14,5%), clorură de sodiu (2,5%), acid oleic (0,174%), saponină (4,4%) în apă purificată.

După inocularea flacoanelor cu 0,5ml spută și 5 ml lichid de îmbogățire, acestea sunt depuse în sistemul BacT/ALERT, și urmărite până la 42 zile, sau până la pozitivare.

Din flacoanele depistate pozitive se efectuează frotiuri și subculturi. Dacă bacterioscopia este pozitivă, se urmărește identificarea speciei. Dacă atât în colorația Ziehl Nielsen, cât și Gram, frotiul este negativ, ceea ce indică un rezultat fals pozitiv, flaconul este reașezat în dispozitiv.

Dacă frotiurile relevă microorganisme non-micobacteriene, acestea din urmă se vor subcultiva și identifica după caz.

Culturile negative pot fi verificate prin bacterioscopie și subculturi înainte de a fi declarate negative la 42 zile.

Controlul de calitate este realizat având ca referință tulpinile M. avium ATCC 25291 și M. intracellulare ATCC 13950.

6.2.4. Diagnosticul genotipic și determinarea rezistenței la rifampicină prin RT-PCR /HRM

Principiul metodei:

Tehnicile PCR se bazează pe o procedură standard cu aplicații în domenii foarte variate. PCR poate amplifica o cantitate mică de acizi nucleici ADN sau ARN până la o cantitate măsurabilă în câteva ore. Această operațiune implică amestecarea ADN-ului extras cu: primerii, Taq polimeraza (provine de la specia Thermus aquaticus, termofilă, a cărei enzimă suportă temperaturi foarte înalte), nucleotizi liberi și sistemul tampon. Temperatura este alternată între cald și rece pentru denaturare și refacere ADN cu polimeraza care adaugă la fiecare ciclu alte noi lanțuri complementare.

Real-Time PCR, o nouă metodă derivată PCR, permite înregistrarea în timp real a amplificării ADN. Dintre tipurile validate de RT-PCR, am preferat utilizarea de sonde TaqMan. Lumina emisă este recepționată de computer și tradusă într-un grafic care indică ciclurile PCR pe axa x și intensitatea luminoasă logaritmică, direct proporțională cu numărul de copii, pe axa y.

Activarea si prepararea reactivilor, din forma liofilizat, in forma de lucru:

Conținutul kit-ului:

Amestec specific primer/sondă TB;

Control pozitiv TB;

Control extracție internă ADN;

Control extracție internă – primer/sondă;

Apă purificată (fără ARN-aze și ADN-aze).

Protocol:

Se centrifughează inițial, înainte de deschidere, tuburile cu primeri și sonda pentru a asigura precipitarea acestora la baza tubului și a evita ieșirea lor din tub, la momentul deschiderii;

Se resuspendă liofilizatul în apa purificată;

Se adaugă primerii Primer Design 2x precision MasterMix;

Se pipetează acest amestec în capilare conform protocolului PCR

Se prepară cADN pentru fiecare probă, în apa purificată;

Se adaugă cADN în capilare PCR;

Se amplifică conform standard TaqMan:

Se interpretează rezultatele

Etapa de extracție acizi nucleici, prelevate clinice:

Kit de extracție ADN: The Master Pure TM Complete DNA and RNA Purification Kit

The Master Pure TM Complete DNA and RNA Purification Kit conține reactivi necesari pentru extragerea acizilor nucleici dintr-o gamă variată de prelevate biologice. Acest kit utilizează un proces rapid de denaturare, înlăturând macromoleculele de contaminare cu rol de inhibitori proteici nespecifici, fără a utiliza solvenți organici toxici. Acizii nucleici purificați pot fi ulterior analizați prin numeroase aplicații, precum hibridizare sau amplificare PCR.

Protocol extracție și purificare ADN provenit din spută

Se colectează probele și congelează la -70°C, dacă nu intră imediat în procesul de prelucrare;

Se diluează 1µl din Proteinaza K 50µg/µl în 150µl din soluția litică;

Se transferă 150µl din spută în tubul de centrifugă, adaugă 150µl soluția litică ce conține proteinaza K și agită puternic;

Se incubează la 65°C pentru 15 minute și agită la fiecare 5 minute,

Se răcesc probele la gheață pentru 3-5 minute, apoi începe precipitarea acizilor nucleici totali.

Precipitarea acizilor nucleici totali:

Se adaugă 150µl din reactivul de precipitare a proteinelor la 300µl din spută lizată și agită puternic;

Se centrifughează 10 minute la viteză ≥ 10000g la microcentrifugă; dacă conținutul tubului este clar sau sedimentul este foarte mic /lipsește total, se adaugă încă 25µl de reactiv de precipitare și se centrifughează;

Se retransferă supernatantul (cu ADN) prin pipetare (fiecare probă cu vârf separat) în alte tuburi eppendorf, sterile, numerotate și se aruncă tuburile inițiale care conțin sedimentul;

Se adaugă 500µl de isopropranolol peste supernatant, în fiecare tub de lucru; se răsucesc de 30-40 ori până precipită ADN-ul;

Se sedimentează ADN-ul prin centrifugare 10 minute la microcentrifugă;

Se îndepărtează cu atenție isopropranololul (supernatantul) fără a disloca sedimentul;

Se spală de 2 ori cu câte 500µl alcool etilic 75%;

Se resuspendă ADN-ul în 35µl de TE Buffer.

Aparatura necesara etapei de extractie- purificare acizi nucleici:

Hote biosiguranță cls. a II –a 40 Kojair 2009 (flux laminar, UV, gaz);

vortex-mixer;

2 thermoblocuri (Digital Dry Bath 65°C, 37°C);

centrifugă pentru tuburi eppendorf (max 20 000 X g)/ cu și fără răcire SIGMA,

spectrofotometru DNA Specreafuge 24 DAlpha Innotech;

mini centrifugi (max 2 000 X g) Spectrafuge 24 D;

mini LabRoller Rotator;

DNA chill/ racitoare portabile (0°C and – 15°C);

congelator (-80°C) Dometic UF 455G;

pipete monocanal autoclavabile.

2. Prepararea mixului de reactie pentru detectie acizi nucleici, prin tehnica RT PCR:

Kit de detecție: Primer DesignTM Kit (Primer Design 2x PrecisionTM MasterMix) pentru identificarea și cuantificarea genomului M. tuberculosis, având ca țintă IS6110.

Preparare reactivi pentru RT-PCR.

Se stabilește numărul de reacții pentru fiecare primer după formula:

Nr reacții = nr probe + 3 (standard negative, standard pozitiv, suplimentar);

Se scot din congelator MasterMix și Primerul de lucru, iar din frigider apa pură;

Se pregătește un tub steril pentru mixul de reacție care se calculează după formula:

Mix de reacție = Nr reacții x (5µl masterMix + 3,5µl apă + 0,5µl Primer);

Se vortexează și se centrifughează masterMixul și Primerul și se adaugă cantitățile calculate la Mixul de reacți;

Se centrifughează și vortexează Mixul de reacție;

Se introduc în rotorul detașat al aparatului LightScanner32 un număr de capilare egal cu Nr probe + 2 (standard negativ și pozitiv);

În fiecare capilar se pun 9µl Mix de reacție, iar în ultimul capilar se pune 1µl apă și se acoperă cu dopul;

În paralel, se dezgheață probele, se vortexează și centrifughează;

În capilarele pentru probe se adaugă 1µl probă și se acoperă cu dop;

Standardul pozitiv se dezgheață, vortexează și centrifughează, apoi se adaugă 1µl în capilarul corespunzător și se acoperă cu dop;

Se centrifughează toate capilarele utilizând centrifuga cu suporți speciali;

Se reintroduce rotorul în aparatul LightScanner32.

Echipament necesar:

Hota de biosiguranță cls aII- a, hota PCR, în care se prepară mixul de reacție (primer, master- mix, apa),

Vortex- mixer,

Microcentrifuga,

RT-PCR LightScanner 32 Instrument/LS32 (Idaho Technology, Salt lake City, UT).

Acest instrument este un “air thermo-cycler”, care detectează automat prezența acizilor nucleic țintă. Tehnologia combină principiul RT-PCR, termociclarea rapidă și high resolution melting (HRM). Sistemul este configurat cu trei culori pentru detectarea PCR, și o culoare pentru HRM. Am obținut rezultate optime în HRM utilizând LCGreen® Plus dye. Acest sistem are adaptat un computer programat pentru colectarea și analiza datelor, precum și pentru raportarea rezultatelor.

Prin HRM am identificat codonii din gena rpoB purtători de mutații specifice, responsabile de rezistența la RMP a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis, respectiv prezența mutațiilor în codonii 531 și 526, caracterizați prin puncte de topire diferite și aspect corespunzător al curbelor de topire, conform protocolului din tabelele 14 și 15.

Tabel 14. Protocol de lucru RT-PCR & HRM.

Tabel 15. Protocol de detectare a mutațiilor genetice.

Diagnosticul fenotipic și testarea sensibilității la tuberculostatice prin metoda NRA

a) Metoda directă

Metoda a fost descrisă anterior de Musa et al (178), dar cu modificarea compoziției reactivului Griess (acid acetic 286g/l, acid sulfanilic 1,55g/l, naphthylamina 0,31g/l), manufacturat de Merk KGaA. Am folosit mediu Löwenstein Jensen cu 1000mg nitrat de potasiu (KNO3)/ ml, cu și fără antibiotic, furnizat de S.C. Sanimed International Impex S.R.L. Pentru mediul cu rifampicină (RMP) concentrația critică a fost de 40μg/ml, iar pentru cel cu izoniazidă (HIN) concentrația critică a fost de 0,2μg/ml.

Din sedimentul suspendat am inoculat câte 0,2 ml pe 3 tuburi cu medii martor (Löwenstein Jensen cu nitrat de potasiu, fără antibiotic), iar cantitatea rămasă am diluat-o cu apă distilată 1:10, și din diluție am inoculat câte 0,2 ml pe cele 2 tuburi cu mediu Löwenstein Jensen cu nitrat conținând antibiotic, respectiv RMP și HIN.

După 10 zile de incubare la 37ºC, am adăugat 0,2ml reactiv Griess în primul tub cu mediu martor. Dacă s-a observat virajul de culoare spre roz-violet, am adăugat cate 0,2 ml de reactiv și în tuburile cu antibiotic. Dacă nu au fost semnalate modificări de culoare pentru tubul martor, s-a repetat procedura la 14 zile, și la 18 zile, conform algoritmului din figura 40.

Rezultatele au fost considerate pozitive dacă s-a semnalat virajul de culoare de la roz pal (±) la violet (5+), sau negativ dacă nu a existat nici o modificare de culoare. Tulpina a fost considerată rezistentă în condițiile în care virajul de culoare din tubul cu antibiotic a fost mai accentuat decât cel din tubul martor. Tulpina a fost considerată sensibiăl la antibiotice, dacă virajul de culoare a fost absent sau mai slab decât cel din tubul martor.

b) Metoda indirectă

Metoda a a fost descrisa inițial de Angeby et al. (9), dar cu mențiunea că a fost ajustată concentrația critică a HIN. Am utilizat aceleași serii de tuburi cu mediu Löwenstein Jensen cu nitrat de potasiu, cu și fără antibiotice. Am prelevat 2 anse din cultura proaspătă de Mycobacterium tuberculosis, pe care am suspendat-o în soluție tampon, apoi am centrifugat-o pentru a obține o turbiditate de McFarland standard numărul 1. Din această suspensie am inoculat câte 0,2 ml în cele 3 tuburi martor, iar din restul suspensiei am preparat o diluție 1:10 cu apă distilată. Am inoculat câte 0,2 ml din diluția 1:10 în tuburile cu antibiotic. Tuburile au fost ulterior incubate la 37ºC.

După 7 zile, am adăugat câte 0,2 ml reactiv Griess în primul tub cu mediu martor. Dacă s-a observat virajul de culoare spre roz-violet, am adăugat câte 0,2 ml de reactiv și în tuburile cu antibiotic. Dacă nu au fost semnalate modificări de culoare, s-a repetat procedura la 10 zile, și la 14 zile conform algoritmului din figura 41. Izolatul a fost considerat rezistent în condițiile în care virajul de culoare din tubul cu antibiotic a fost mai intens decât cel din tubul martor. Izolatul a fost considerat sensibil la antibiotice, dacă virajul de culoare a fost absent sau mai slab decât cel din tubul martor.

Figura 40. Metoda NRA directă pentru confirmare diagnostic și antibiogramă.

Figura 41. Metoda NRA indirecta pentru confirmare diagnostic si antibiograma

Analiza statistica a datelor.

Analiza statistică a datelor s-a efectuat aplicănd testul Mc Nemar pentru datele rezultate din grupurile pereche. Timpul de detectare a creșterii bacteriene în sistemele pereche a fost comparat prin intermediul t test. Valorile p 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

Performanța metodei NRA față de metoda proporțiilor a fost evaluată prin sensibilitate (capacitatea de a detecta adevărata rezistență) și specificitate (abilitatea de a determina adevărata sensibilitate). Valoarea predictivă pozitivă a metodei (VPP) reprezintă probabilitatea de a fi rezistent, când testul este pozitiv. Valoarea predictivă negativă (VPN) reprezintă probabilitatea de a nu fi rezistent când testul este negativ.

Sensibilitatea = AP/ AP+ FN AP = adevărat pozitiv;

Specificitatea = AN/ AN + FP FP = fals pozitiv;

Valoarea predictivă pozitivă = AP/AP + FP FN = fals negativ;

Valoarea predictivă negativă = AN/ AN + FN AN = adevărat negativ.

Cuantificarea reproductibilității unui test se bazează pe indicele kappa (K).
Concordanța rezultatelor mai multor măsurători, efectuate de diferiți observatori, poate fi mai mult sau mai puțin ridicată. Reproductibilitatea depinde de calitățile reale ale testului (sensibilitate, specificitate), dar și de șansa interpretării. Indicele K evaluează reproductibilitatea, observată în raport cu concordanța legată de hazard, gradul de acord în plus față de ce se poate spera doar de la hazard, și în raport cu acordul maxim, care poate fi obținut în plus față de hazard.

O = acord observat

E = acord așteptat
K = (0-E) / (1-E)
K = 1 pentru o concordanța perfectă.
K = 0 când nu există concordanță decât sub efectul hazardului.
Valorile negative ale K sunt posibile. Ele indică atunci că există mai puține șanse de acord decât cel observat sub efectul șansei.

O = (a + d)/ n

E = (n1/n * m1/n) + (n0/n * m0/n)

Concordanța dintre cele 2 metode a fost estimată prin valoarea K, și interpretată astfel: < 0,2 slabă; 0,2 – 0,4 ușoară; 0,4 – 0,6 moderată; 0,6 – 0,8 bună; > 0,8 excelentă.

REZULTATE

În perioada iunie 2009 – iunie 2010 în laborator s-au prelucrat 5957 probe de spută sau aspirat bronșic, dintre care 18,6% au fost pozitive în microscopia optică, și 22,9% în culturi. Din cele 5957 probe, au fost luate în studiu 139 probe biologice – 105 probe de spută și 34 culturi proaspete de Mycobacterium tuberculosis – provenite de la 122 pacienți, diagnosticați cu tuberculoză pulmonară, fie cazuri noi (64), fie la reluare de tratament (58).

Cele 105 probe de spută cu frotiuri Ziehl Nielsen (ZN) pozitive: 31 probe BAAR 3+, 22 probe BAAR 2+, 50 probe BAAR 1+ sunt ilustrate în tabelul 16. Dintre acestea, două probe au fost contaminate, și alte 33 probe nu au prezentat creștere bacteriană pe mediul LJ-KNO3 în primele 18 zile. Din cele 103 probe de spută necontaminate, 70 (68%) au crescut pe mediul LJ-KNO3 până la 18 zile de la recoltare, în funcție de aspectul microscopic: 25 BAAR 3+, 16 BAAR 2+, 29 BAAR 1+, conform figurilor 42 și 43. Din cele 33 spute necontaminate și necrescute pe mediul de cultură LJ-KNO3 , la 8 dintre ele s-a obținut izolare în cultură prin metode convenționale – culturi pe mediul LJ a Mycobacterium tuberculosis, ceea ce demonstrează existența de tulpini (24,2%) nitrat-reductază negative. Trei dintre acestea au fost confirmate și prin metoda moleculară Real Time PCR.

Tabel 16 . Materiale biologice investigate

.

Figura 42. Diagrama rezultate obținute vs eșec.

Figura 43. Diagrama rezultate obținute din totalul probelor.

Cele 70 probe de spută au provenit de la 47 cazuri noi (CN) de tuberculoză, și 23 de la cazuri aflate la reluare de tratament (RT). La 10 zile s-au pozitivat 17 probe CN, iar la 18 zile s-au pozitivat 10 probe RT (figura 44).

Figura 44. Dispoziția rezultatelor în funcție de tipurile de caz clinic

Figura 45. Dispoziția rezultatelor în perioadele de așteptare.

Culturile bacteriene pentru cele 70 probe de spută au fost obținute: la 10 zile pentru 22 de probe, la 14 zile pentru 26 probe și la 18 zile pentru 22 probe. Cel mai mare număr de culturi bacteriene a fost obținut la 14 zile (26/70), dar se poate afirma că distribuția rezultatelor a fost aproximativ egală pentru cele 3 intervale de urmărire, conform figurii 45. Am constatat că la 10 zile s-au obținut rezultate de la 11 probe BAAR 3+, la 14 zile s-au obținut rezultate de la 11 probe BAAR 2+, iar la 18 zile s-au obținut rezultate de la 8 probe BAAR 1+. Cele mai multe probe BAAR 2+ s-au pozitivat la 14 zile, în timp ce la 10 zile s-au pozitivat cele mai multe probe BAAR 3+ (figura 45).

Citirea rezultatelor la adăugarea reactivului Griess, s-a efectuat cu ușurință, virajul de culoare obținându-se în mai puțin de 10 secunde. S-au înregistrat probe sensibile (S) la ambele antibiotice tuberculostatice, sau numai la unul dintre acestea, precum și probe rezistente (R) la ambele antibiotic (figura 46).

Figura 46. A) Tulpină sensibilă atât la RMP cât și la HIN. B) Tulpină rezistentă la RMP, dar sensibilă la HIN. C) Probă rezistentă la ambele antibiotice.

În tabelele 17, 18 și 19 am sintetizat rezultatele sensibilității obținute prin metoda NRA directă și indirectă, comparativ cu metoda proporțiilor (MP).

Comparația metodei NRA directă cu MP a arătat discrepanță pentru 2 probe, care au fost sensibile prin NRA, dar rezistente prin MP la rifampicină (tabel 17). Cele 8 tulpini semnalate rezistente prin metoda MP au fost ulterior testate prin metode moleculare RT-PCR, confirmându-se acest profil. La izoniazidă au fost semnalate alte 2 rezultate discordante între cele 2 metode, o tulpină sensibilă NRA și rezistentă prim MP, și o tulpină rezistentă NRA și sensibilă prin MP (tabel 17). Probele de spută care au condus la aceste rezultate au provenit de la pacienți aflați în tratament, ceea ce ar putea justifica eroarea înregistrată. Sensibilitatea înregistrată prin metoda NRA directă a fost de 75 % pentru rifampicină și pentru izoniazidă, în timp ce specificitatea a fost mai mare pentru rifampicină -100%, față de 98,4% pentru izoniazidă.

Pentru cele 34 de tulpini obținute din culturi s-a aplicat NRA indirectă pentru determinarea antibiogramei la rifampicină și izoniazidă. Au fost semnalate 4, respectiv 5 rezultate discordante pentru RMP, respectiv HIN. Două tulpini au fost sensibile la RMP prin NRA și rezistente prin MP, și alte două tulpini au fost rezistente la RMP prin NRA și sensibile prin MP. Tulpinile care au condus la aceste rezultate discordante au fost izolate de la pacienți aflați în tratament. Sensibilitatea a fost mai mare pentru NRA directă, dar specificitatea mai mică (tabel 18). Cele 9 tulpini rezistente prin MP, precum și cele 2 tulpini rezistente prin NRA, dar sensibile prin MP au fost testate ulterior prin metode moleculare RT-PCR.

Din cele 34 probe, la 7 zile s-au pozitivat 25, la 10 zile s-au pozitivat 7, iar la 14 zile 2 probe. Majoritatea probelor au oferit rezultate la 7 zile de la obținerea culturii pozitive (figura 47).

Dintre tulpinile de M. tuberculosis luate în studiu, 5 proveneau de la pacienți la care s-a realizat NRA direct din spută. Concordanța a fost de 100% între NRA indirectă și MP pentru cele cinci cazuri (tabel 19).

Tabel 17. Rezistența la RMP și HIN, determinată prin NRA directă și MP

Tabel 18. Rezistența la RMP și HIN, determinată prin NRA indirectă și MP

Tabel 19. Evaluare MP vs NRA directă vs NRA indirectă,pentru 5 cazuri.

Figura 47. Diagrama rezultatelor obținute prin NRA indirectă.

Cele 103 probe de spută luate în studiu, au fost însămânțate și pe mediul convețional LJ, dar și în sistem automat Bact/ALERT, urmărindu-se timpul de pozitivare a flacoanelor. În sistemul Bact/ALERT s-au izolat 95 (92,2%) tulpini, iar pe mediul conventional LJ -78 (75,7%) tulpini (tabel 20). Timpul mediu de detectare a creșterii bacteriene a fost de 14,6 zile prin metoda NRA directă, 13,6 zile în sistem automat Bact/ALERT, respectiv 41,3 zile pe mediul convențional LJ, cu variații corespunzătoare grupului BAAR + (tabel 21).

Tabel 20. Detectarea M. tuberculosis prin NRA directa vs Bact/ALERT, vs mediul LJ.

Tabel 21. Timp de detectare a M. tuberculosis prin metoda neconventionala, automata si convetionala.

La 10 probe s-a efectuat confirmarea diagnosticului de tuberculoză prin RT-PCR. La 3 dintre acestea nu s-au obținut rezultate prin metoda NRA directa (tabel 22). Timpul de detectare a prezenței M. tuberculosis în proba biologică a fost de maxim 6 ore.

În figurile 48-57 sunt reprezentate curbele de amplificare PCR ale celor 10 probe de spută. Încadrată de martorul pozitiv (albastru), și martorul negativ ( apă DNA free – verde), curba de detecție a probei pozitive este paralelă cu martorul pozitiv, în toate cele 10 testări, fără bruiaje grafice date de prezența inhibitorilor (mucus, fibrină, celule inflamatorii). Rezultate pozitive s-au obținut cu valori între 4 copii/l (figura 56) și 2310 copii/l (figura 51). Curba de detecție a amplificat între 29,31 și 37,26 cicluri (tabel 23), față de curba standard.

Tabel 22. Detectare M. tuberculosis prin metoda PCR vs neconvențională, automată și convețională.

Tabel 23. Detectare M. tuberculosis prin metoda RT-PCR

În proba nr 3, cu rezultatul pozitiv minim de 4 copii/l, cantitatea mică de ADN TB determină ascensiunea tardivă a curbei de amplificare, la 37,41 cicluri față de standardul 21,63 cicluri. Situații asemănătoare se remarcă pentru probele nr 2, 5, 7, 8, 9, 10.

În proba nr 4 cantitatea mare de ADN TB determină ascensiunea precoce a curbei, la 29,31 cicluri de amplificare, comparativ cu standardul pozitiv (22,87 cicluri).

Figura 48. Proba 3982 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 49. Proba 56485 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 50. Proba 56716 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 51. Proba 46541 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 52. Proba 29783 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 53. Proba 751 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 54. Proba 16643 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 55. Proba 5866 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 56. Proba 17891 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Figura 57. Proba 19551 – pozitivă în RT-PCR pentru M. tuberculosis.

Probele discordante prin NRA și MP au fost retestate prin metode moleculare RT-PCR/ HRM. Au fost analizate 19 tulpini de Mycobacterium tuberculosis. Opt tulpini au provenit din probe biologice testate prin metoda NRA directă care au relevat profil de rezistență la rifampicină în urma testării NRA sau/și MP: 6 tulpini rezistente prin ambele metode, 2 tulpini sensibile prin NRA, dar rezistente prin MP. Alte 11 tulpini rezistente la rifampicină au provenit din cele 34 testate prin NRA indirectă: 7 rezistente prin ambele metode, 2 rezistente numai prin NRA și alte 2 rezistente numai prin MP.

S-a urmărit prezența codonilor responsabili pentru mutațiile care conferă rezistența la RMP, și anume 526 și 531. Toate cele 19 tulpini testate au fost rezistente la rifampicină. 17 dintre ele aveau mutații la nivelul codonilor 526 sau 531, screening efectuat simultan pentru ambii codoni, iar două tulpini erau rezistente prin alte mecanisme sau mutații la alte nivele genice (tabel 24, figura 58).

Figura 58. Mutații prezente la nivelul codonilor 526 sau 531.

Tabel 24. Mutații prezente la nivelul codonilor 526 sau 531.

Scanarea separată pentru codonul 526 a condus la evidențierea a 6 tulpini cu temperaturi de topire incluse în intervalul Tm 78.99- 79.28, și ΔTm= 0.29, specifice prezenței mutațiilor la nivelul codonului 526, cu sugerarea rezistenței la rifampicină prin acest mecanism (tabelul 25, figura 59); restul de 11 tulpini, nu prezintă codon 526 mutant, presupunandu-se existența mutațiilor în celălalt codon suspectat, 531 (tabel 26, figura 60). 2 din cele 19 tulpini testate, sunt considerate wilde type, deoarece prezintă rezistență la rifampicină prin mutații fie în alt codon existent în gena rpoB, fie prin alt mecanism.

Tulpini mutante la nivelul codonului 526

Tulpini mutante la alt nivel decât codonul 526

Tulpini sălbatice

Figura 59. Mutații la nivelul codonilor 526.

Tabel 25. Mutații la nivelul codonilor 526.

Din 19 tulpini Mycobacterium tuberculosis testate, 11 tulpini au prezentat temperaturi de topire specifice compoziției în baze azotate a codonului (figura 60, tabel 26) mutant 531 (Tm range 80.41- 80.67 si o ΔTm= 0,26). Ultimele 2 tulpini rezistente la rifampicină prezintă mutații fie în alți codoni ai genei rpoB, fie printr-un alt mecanism.

Tulpini mutante la alt nivel decât 531

Tulpini mutante la nivelul codonului 531

Tulpini sălbatice

Figura 60. Mutații la nivelul codonilor 531.

Tabel 26. Mutații la nivelul codonilor 531

Dintre tulpinile testate, 11 au prezentat mutații la nivelul codonului 531, 6 au prezentat mutații la nivelul codonilor 526, iar 2 tulpini au fost rezistente prin mutatii in alti codoni ai genei rpoB sau alte mecanisme (figura 61).

Figura 61. Ponderea tulpinilor rezistente.

În urma testelor de biologie moleculare reținem că 4 tulpini sensibile prin NRA, și 2 tulpini sensibile prin MP au fost rezistente prin metoda RT-PCR HRM, ceea ce confirmă fiabilitatea și sensibilitatea metodelor moleculare de diagnostic. Cu toate acestea, luând ca referință rezultatele obținute prin metoda clasica MP, obținem 17 rezultate pozitive pentru RT-PCR HRM din 19 lucrate.

DISCUȚII

Metodele actuale de determinare a sensibilității la antibiotice a Mycobacterium tuberculosis sunt fie costisitoare, precum sistemele de cultură automatizate, fie cronofage cum sunt metodele bazate pe culturi pe medii solide. Tehnicile de biologie moleculară câștigă teren în domeniul microbiologiei prin acuratețea și rapiditatea determinării diagnosticului sau a profilului sensibilității la antibiotice, dar nu sunt încă accesibile oricărui laborator datorită costurilor implicite ale echipamententelor, consumabilelor și instruirii profesionale. Au fost propuse și alte metode ieftine, cum ar fi MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) sau resazurin (142). Aceste metode s-au dovedit a fi comparabile cu NRA, cel puțin metoda indirectă de testare la rifampicină (132). Aceste metode utilizează un mediu lichid dispus în microplăci, ceea ce face tehnica mult mai complexă și mai riscantă din punct de vedere al biosecurității, iar rezultatele sunt disponibile după cel puțin 7 zile (39).

Capacitatea de a reduce nitratul în nitriți este tipică pentru M. tuberculosis, deși există și alte specii de micobacterii care prezintă această caracteristică, precum M. kansasii. Aceste specii nitrat-pozitive, deși mai rar prezente în spută, pot fi ușor identificate prin testarea lor la acid p-nitrobenzoic. În acest caz, NRA directă poate fi îmbunătățită prin adăugarea de acid p-nitrobenzoic, care să confirme prezența de tulpini din complexul M. tuberculosis (87). Spre deosebire de M. tuberculosis, M. bovis nu reduce nitratul, metoda neputând fi aplicată și în cazul acestor tulpini. O altă cauză de rezultate invalide poate fi reprezentată de reducerea nitritului mai departe, la oxid nitric, reacție care nu este depistată prin adăugarea reactivului Griess.

Metoda NRA directă sau indirectă de testare a sensibilității Mycobacterium tuberculosis la antibiotice, este simplă și reproductibilă. În cazul nostru 32% din probele biologice au condus la rezultate invalide. Opt tulpini izolate prin metode convenționale au provenit din probe de spută din care nu s-au obținut rezultate prin metoda NRA. Putem concluziona că 24,2% din probele negative prin NRA au condus la izolarea de tulpini M. tuberculosis nitrat-reductază negative. Unele studii efectuate în Africa au pus în evidență o frecvență înaltă, de cca 27-40% tulpini M. tuberculosis nitrat-reductază negative (107, 119). Un alt studiu asupra 95 tulpini provenite din diferite țări africane au evidențiat o frecvență scăzută (1%) de astfel de tulpini (157). Aceste cazuri necesită alte metode de determinare a rezistenței bacteriene, decât NRA.

În condițiile în care NRA are ca principiu semnalarea creșterii bacteriene prin reducerea nitratului, rezultatele sunt obținute înainte de perceperea macroscopică a prezenței coloniilor. În studiul nostru, 68% dintre probele biologice au oferit rezultate până la 18 zile, față de metodele indirecte care necesită 21-28 zile până la izolarea tulpinii, ulterior alte 28-48 zile pentru antibiogramă. Timpul necesar obținerii antibiogramei este astfel scurtat de la peste 40 zile prin metode clasice, la 14-18 zile (178). NRA poate fi testat și pe probele de spută slab pozitive în microscopie: BAAR 1+ și BAAR 2+, tulpini care în studiul nostru au reprezentat 64,3% din probe, restul de 35,7% fiind BAAR 3+. În alt studiu, în care proporția probelor de spută cu ≥ 10 BAAR/ câmp a fost de 80%, s-au obținut 96 % din rezultate la 18 zile (178). Același autor a testat probe de spută paucibacilare (< 10 BAAR/ câmp), dar cele mai multe rezultate au fost obținute după 18 zile. Cu cât probele de spută conțin mai mulți bacili pe câmp, cu atât crește probabilitatea de a fi diagnosticate într-un timp mai scurt.

S-a obținut o concordanță excelentă pentru rifampicină și bună pentru izoniazidă între MP și NRA directă. Dintre cele 8 tulpini rezistente la rifampicină prin MP, 2 au fost sensibile prin NRA. De aceea sensibilitatea testului pentru RMP a fost de numai 75%. Cele 2 probe care au arătat discordanță au fost BAAR 1+. Solis et al., care au testat deasemeni probe biologice slab pozitive în microscopia optică (237), au evidențiat specimene fals sensibile prin NRA, spre deosebire de studiul condus de Musa et al. pe probe BAAR 3+, care nu au evidențiat nici un rezultat discordant. Aplicarea metodei pe spute BAAR 2+ a condus la rezulate tardive (peste 18 zile) pentru majoritatea probelor (178). Pentru aceste specimene slab pozitive sunt necesare noi studii care să optimizeze metoda NRA directă de determinare a antibiogramei. Este posibil ca un mediu lichid să reducă timpul de așteptare a rezultatelor pentru aceste probe (246).

Rezultatele experienței pentru rezistența la RMP sunt comparabile cu cele obținute anterior de Affolabi et al. (3). Sensibilitatea și specificitatea înregistrate prin NRA directă au fost de 75% și 100% pentru rifampicină, respectiv 75% și 98,4% pentru izoniazidă.

Prin metoda NRA indirectă majoritatea rezultatelor noastre s-a obținut la 7 zile de la izolarea tulpinilor, mult mai rapid decât MP care durează 3-4 săptămâni, comparabil cu studiile anterioare (9, 49, 142, 230). Dacă în alte studii majoritatea probelor au oferit rezultate după 10 zile (9, 143), noi am obținut cele mai multe rezultate după 7 zile (25/34). Rezultate obținute la 5 zile de la izolarea culturii au fost posibile atunci când metoda a fost aplicată de unii autori pe mediu lichid (246). Sensibilitatea și specificitatea metodei indirecte au fost de 77,7% și 92% pentru rifampicină, respectiv 85,7% și 85,2% pentru izoniazidă, ușor inferioare rezultatelor obținute alți cercetători (10). Ani et al. au obținut pentru RMP o sensibilitate și specificitate de 90%, respectiv 96,6% (87). În general, studiile anterioare au demonstrat concordanță bună sau excelentă între NRA indirectă și metodele clasice, pentru cele 2 antibiotice. Având în vedere că metoda este ieftină, rapidă, reproductibilă, iar rifampicina și izoniazida sunt antibiotice antituberculoase de primă linie, NRA ar putea fi utilizată pentru screeningul rezistenței la aceste substanțe, putând furniza rezultate rapide în ceea ce privește prevalența tulpinilor MDR.

NRA este ieftină, simplu de aplicat și nu necesită echipament special. Dezavantajele biosecurității sunt depașite prin utilizarea mediului solid. Metoda a fost ușor de realizat în laboratorul nostru.

Metode mai rapide de cultivabilitate au fost obținute prin utilizarea de mediu lichid, precum sistemul BACTEC 460, dar cu prețul anumitor limite privind costurile, posibilitatea contaminării sau necesitatea unui laborator grad 3 biorisc. În acest context, a fost elaborată o nouă tehnică – MB/BacT – automatizată, cu monitorizare permanentă, non-radiometrică. Studii preliminare comparative MB/BacT versus BACTEC 460 au demonstrat eficiență asemănătoare (216, 267). Timpul de depistare a micobacteriilor prin MB/BacT, cuprins între 11 și 23 zile, a fost ușor crescut față de cel obținut prin BACTEC 460 (21). Timpul mediu de obținere a izolatelor prin sistemul Bact/ALERT a fost de 13,6 zile, care se încadrează în limitele mai riguroase, de până la 14 zile, recomandate de CDC(41). Timpul de diagnostic prin metoda NRA a fost 14,1 zile, iarpe mediul LJ a fost de 41,3 zile.

În condițiile în care suplimentul antibiotic în sistemul MB/BacT, consta în amfotericină B, polimixină B, trimetoprim și azlocilină au fost descrise rate de contaminare > 9% (216). În studiul de față a fost utilizat un complex antibiotic revizuit, cu suplimentarea vancomicinei ca antistafilococic. Chiar și așa au fost raportate rate de contaminare crescute, cu predominența cocilor Gram pozitivi. Alte studii au raportat o rată de contaminare de 2-5% (43). Rohner et al. (216), utilizând complexul antibiotic inițial, dar cu repicarea tulpinilor izolate, a obținut o rata de contaminare de 4,3%. Cu toate aceste, repicarea nu este întotdeauna o soluție optimă, deoarece întârzie stabilirea diagnosticului.

Dacă rata de contaminare pare să fie unul dintre dezavantajele metodei MB/BacT, avantajele constau în: nivel crescut de automatizare, cu risc scăzut de eroare în prelucrarea și afișarea rezultatelor. Sistemul MB/BacT este un sistem închis, astfel încât după inoculare, nu mai există risc de contaminare încrucișată. Incubatorul face parte din sistem. Deoarece nu este o metodă radiometrică, nu există deșeuri radioactive de administrat. Sistemul are capacitatea de a prelucra datele obținute iar costurile de mentenanță sunt accesibile.

În ultima decadă, metodele moleculare de detectare directă a M. tuberculosis din prelevatul biologic au câștigat teren în laboratoarele de bacteriologie, prin avantajul reducerii timpului de diagnostic.

Ca metodă moleculară de diagnostic am utilizat RT-PCR pentru confirmarea prezenței M. tuberculosis, precum și HRM analysis pentru confirmarea tulpinilor rezistente la rifampicină.

Pentru confirmarea diagnosticului, cele 10 probe de spută au fost supuse tehnicii de detectare ADN TB prin RT-PCR, și au fost toate pozitive, cu valori cuprinse intre 4 si 2310 copii/l. În cele mai multe probe numarul de copii este mic, în funcție de calitatea și omogenitatea eșantionului de 150l folosit în tehnica PCR, cunoscându-se faptul că bacilii acid-alcoolo-rezistenți au tendința la aderare și distribuție neomogenă în volumul de lucru. De aceea, o probă cu rezultat negativ prin tehnica PCR nu exclude un diagnostic pozitiv BK.

Cantitatea mică de ADN are semnificație diagnostică deoarece curba de amplificare s-a evidențiat la sub 40 cicluri, față de standard. Până la 45 cicluri se consideră o reacție pozitivă, indiferent de numărul de copii rezultat. Totuși, un număr mic de copii în intervalul 45-50 cicluri de amplificare ar putea semnifica un rezultat fals pozitiv. Deși în literatură s-au citat situații cu probe paucibacilare PCR negative, în studiul nostru nu s-a înregistrat un astfel de caz, dat fiind și numărul mic de probe luate în studiu pentru detectare PCR și faptul că prelevatele erau BAAR 1+ – 3+. Cu cât numărul de bacili din probă este mai mare, cu atât mai mic este numărul de cicluri necesare pentru a-i pune în evidență (166). Într-un alt studiu de diagnosticare precoce a tuberculozei prin metoda RT-PCR, s-au înregistrat 98,1% rezultate pozitive. Perioada de detecție a cuprins intervalul de 1,5 ore pentru extracție, 10 minute pentru pipetare și 30 minute pentru amplificare și detecție PCR (166). În studiul nostru protocolul de lucru presupunea ca timp de extracție 2,5 ore, prepararea mix reaxctie 30 min, ciclul de amplificare 40 min.

Graficele înregistrate în cercetarea noastră nu au evidențiat modificări sugestive pentru prezența de inhibitori, având curba de amplificare paralelă cu standardul pozitiv.

Cele mai multe rezultate au fost obținute în maxim 6 ore. Probele cu nr 2, 4, 7 si 8 au necesitat repetarea operațiunilor, deoarece curbele inițiale de amplificare au ascensionat la peste 45 cicluri, putând fi interpretate ca fals pozitive. Ulterior s-au înregistrat rezultate clar pozitive, chiar dacă numărul de copii detectat a fost mic.

Pentru confirmarea profilului de rezistență la rifampicină a tulpinilor dubitabile, am utilizat RT-PCR HRM, ca instrument de detectare a genelor de rezistență dispuse în secvența rpoB (115, 264). S-a demonstrat faptul că peste 95% din tulpinile rezistente la rifampicină prezită mutații în regiunea de 81bp cunoscută ca Rifampicin Resistance Determining Region (RRDR) a genei rpoB (211, 247). În acest sens, regiunea RRDR de la nivelul genei rpoB poate fi considerată un marker surogat pentru tulpinile MDR-TB (179).

Dintre cele 19 tulpini testate, 11 au prezentat mutații la nivelul codonilor 531, 6 au prezentat mutații la nivelul codonilor 526, iar 2 tulpini au fost rezistente prin alte mecanisme sau mutații. Alți autori au studiat prezența mutațiilor la nivelul altor codoni din regiunea RRDR: 516, 539, 528, 536 (46); 525, 531, 513, 518 (251). Kocagoz și colaboratorii au urmărit prezența acelorași codoni, determinând astfel rezistența la rifampicină cu o sensibilitate de 92,7% și specificitate de 100% (131). Alte studii au relevant o sensibilitate de 89,3-98,6%, și specificitate cuprinsă între 98-100% (46, 187, 208). Într-o lucrare de cercetare condusă de Hansen, metoda este comparată cu secvențierea ADN și Genotype MTBPlus, demonstrându-se o specificitate maximă de 91,8%, dar o sensibilitate minimă de 83,7% (98).

În concluzie, RT-PCR este un instrument foarte util în diagnosticul TB, dar nu înlocuiește metodele fenotipice. Oferă informații prețioase într-un timp foarte scurt, detectând rapid prezența M. tuberculosis, chiar și în condiții improprii de stocare și transport al sputei, sau sub influența tratamentului (236). Cu toate acestea, metodele genetice nu pot suplini în totalitate metodele fenotipice prin cultivare, ca sensibilitate și specificitate. Pentru diagnosticul de certitudine al infecțiilor cu micobacterii este încă importantă obținerea de colonii izolate, necesare la testarea ulterioară a sensibilității, precum și pentru elaborarea unor screeninguri epidemiologice prin ADN fingerprinting sau pentru depistarea contaminărilor în laboratoare.

Având în vedere avantajele și dezavantajele metodei, sunt necesare studii ulterioare care să aprecieze acuratețea și aplicabilitatea metodei, în condițiile în care nitratul de potasiu ca adjuvant pentru mediul standard, și reactivul Griess sunt materiale ieftine și sigure. NRA are potențialul de a deveni o alternativă ieftină pentru determinarea rezistenței M. tuberculosis, mai ales la RMP și HIN, antibiotice antituberculoase de primă linie. Ar putea fi utilizată ca metodă screening, combinată sau nu cu alte metode. În viitor, metoda ar putea îmbunătăți performanțele programelor de control al tuberculozei, în special în țările endemice.

CONCLUZII

Metodologia actuală de detecție fenotipică prin microscopia optică se afirmă ca un instrument util de orientare privind investigarea prin metode fenotipice (cultivabilitate) și moleculare (genetice).

Metoda actuală de identificare fenotipică prin culturi și investigare metabolică este tardivă, dificilă și costisitoare sub aspect investiție/ timp. Din acest punct de vedere, simplificarea ei se conturează ca o necesitate în această lucrare, prin introducerea de noi metode, îndeosebi metode enzimatice de identificare și testare a sensibilității la antibiotice.

Metodele NRA directă și NRA indirectă de testare a sensibilității Mycobacterium tuberculosis la antibiotice, sunt simple, reproductibile și ieftine.

NRA nu necesită echipament special, iar dezavantajele biosecurității sunt depașite prin utilizarea de mediu standard solid Löwenstein Jensen în care a fost încorporat KNO3.

Metoda NRA evaluată în studiu oferă posibilitatea unei aprecieri rapide și economice a diagnosticului și a sensibilității la tuberculostatice.

Marea majoritate dintre probele biologice au oferit rezultate până la 18 zile, prin NRA directă, față de metodele indirecte care necesită 21-28 zile până la izolarea tulpinii, ulterior alte 28-48 zile pentru antibiogramă.

Din probele investigate prin metode fenotipice, 24,2% izolate de M. tuberculosis au fost nitrat-reductază negative. Opt tulpini izolate prin metode convenționale au provenit din probe de spută din care nu s-au obținut rezultate prin metoda NRA.

Metoda NRA a fost aplicată probelor biologice pozitive în microscopia optică la valori de peste 10 BAAR/ 100 câmpuri.

Rezultatele consemnate au provenit în măsură mai mare de la probe BAAR 3+ (80%). S-au obținut 25 de rezultate pozitive de la 31 probe BAAR 3+. Dintre cele 50 probe biologice BAAR 1+ s-au obținut 29 rezultate(58%).

NRA directă poate fi testată și pe probele de spută slab pozitive în microscopie: BAAR 1+ și BAAR 2+, tulpini care în studiul nostru au reprezentat 64,3% din probe. Cu toate acestea 68% din probe au oferit rezultate până în 18 zile, față de alte studii în care cele mai multe rezultate provenite din spute paucibacilare au oferit rezultate după 18 zile.

Probele biologice slab pozitive în microscopia optică au evidențiat falsă sensibilitate prin NRA. +. Solis et al., care au testat deasemeni probe biologice slab pozitive în microscopia optică, au evidențiat specimene fals sensibile prin NRA (237), spre deosebire de studiul condus de Musa et al. pe probe BAAR 3+, care nu au evidențiat nici un rezultat discordant (178).

S-a obținut o concordanță excelentă pentru rifampicină și bună pentru izoniazidă între MP și NRA directă. Dintre cele 8 tulpini rezistente la rifampicină prin MP, 2 au fost sensibile prin NRA. Cele 2 probe care au arătat discordanță au fost BAAR 1+.

La 14 zile s-au pozitivat trei sferturi din probele provenite de la cazuri noi diagnosticate cu tuberculoză și numai 56 % de la pacienți aflați în retratament. S-a constatat astfel că probele pacienților retratați prezintă o întârziere a creșterii bacteriene, și astfel o decalare a diagnosticului pozitiv.

Sensibilitatea și specificitatea înregistrate prin NRA directă au fost de 75% și 100% pentru rifampicină, respectiv 75% și 98,4% pentru izoniazidă. Rezultatele experienței pentru rezistența la RMP sunt comparabile cu cele obținute anterior de Affolabi et al (3).

Sensibilitatea și specificitatea metodei indirecte au fost de 77,7% și 92% pentru rifampicină, respectiv 85,7% și 85,2% pentru izoniazidă. Tulpinile care au condus la rezultate discordante au fost izolate de la pacienți aflați în retratament.

NRA indirectă are avantajul rezultatelor de antibiorezistență în 100% din cazuri, dar dezavantajul timpului de așteptare, care presupune 21-40 zile necesare obținerii culturii de Mycobacterium tuberculosis.

Majoritatea rezultatelor (25/34) obținute prin metoda indirectă au fost disponibile la 7 zile de la izolarea culturii.

În sistemul Bact/ALERT s-au izolat 95 (92,2%) tulpini, iar pe mediul convențional LJ 78 (75,7%) de tulpini.

Timpul mediu de detectare a creșterii bacteriene a fost de 14,6 zile prin metoda NRA directă, 13,6 zile în sistem automat Bact/ALERT, respectiv 41,3 zile pe mediul convențional LJ și maxim 6-8 ore în RT-PCR HRM.

În lucrarea noastră, RT-PCR HRM a urmărit prezența mutațiilor la nivelul codonilor 526 și 531 din regiunea rpoB.

Majoritatea tulpinilor MDR-TB izolate au prezentat mutații la nivelul codonului 531, mecanism frecvent întâlnit în aria noastră geografică.

RT-PCR este o metoda moleculară foarte utilă în diagnosticul TB, detectând rapid prezența M. tuberculosis, dar nu înlocuiește metodele convenționale de diagnostic.

CAPITOLUL 7.

PROPUNERI

Există preocupări susținute pentru îmbunătățirea capacităților de lucru și eficientizarea costurilor de diagnostic și tratament din tuberculoză. Între aceste preocupări, am considerat oportun propunerea unor sugestii privind activitatea de laborator, care au reieșit din prezenta lucrare astfel:

Probarea suplimentară a avantajelor metodelor alterne la metodologia de diagnostic fenotipic convențional. Consider necesară demonstrarea în continuare a fiabilității noilor metode nu numai în contextul studiilor clinice controlate, dar și în condițiile actuale din laboratoarele de bacteriologie. Unele teste, disponibile deja, sunt promițătoare ca utilitate și costuri, dar valoarea lor în controlul tuberculozei trebuie să fie demonstrată pe scară largă sau la segmente din populația vizată (ie. zone cu prevalență înaltă de MDR-TB).

Aderența la programul anti-TB deja existent. Deseori, implementarea unei noi metode de diagnostic, și mai ales de testare a sensibilității Mycobacterium tuberculosis, implică efectuarea de modificări în programele naționale de control și în ghidurile de tratament. Factorii de decizie trebuie să fie bine informați asupra avantajelor metodei pentru a adopta un set de măsuri pentru implementarea metodei la scară națională. Este de menționat faptul că, nici o tehnică nouă nu poate acoperi, per se, toate nevoile clinicienilor. Managerii de programe împreună cu specialiștii de laborator trebuie să evalueze potențialul metodei și să elaboreze un plan prin care aceasta să completeze eficient alte metode existente. Sunt necesare inițial programe pilot de implementare a metodei, eventual cu sprijinul firmelor producătoare, pentru probarea eficienței metodei, în vederea adoptării sale la scară națională.

Reducerea duratei diagnosticului etiologic. Deși unele metode noi conduc la obținerea de rezultate mult mai rapid decât prin metodele conveționale, rolul lor practic trebuie bine evaluat în condițiile de laborator date. O metodă rapidă care nu poate oferi rezultate credibile și fiabile din motive variate: cerințe de execuție pretențioase, reactivi perisabili, condiții speciale de stocare, interpretare dificilă, incertă, are o valoare neconvingătoare și nu poate fi acceptată numai pe criterii de „noutate” sau „rapiditate” a metodei.

Costurile de producere și mentenanță. Multe dintre tehnologiile moderne presupun costuri inițiale mari de achiziție a echipamentelor, iar ulterior costuri pentru mentenanță și consumabile. Raportul cost/ beneficiu trebuie evaluat luând în considerare costurile inițiale de achiziție și calificare, complexitatea și dificultățile activităților complementare testărilor și costurile de mentenanță (reactivi, etaloane, etc.). Acest raport trebuie să fie economic avantajos față de metodele actuale în uz.

Asigurarea calității. Pentru integrarea unui produs nou în sistemul medical, sunt obligatorii evidențe riguros documentate în ce privește calitatea, fiabilitatea și condiții de eficiență și siguranță, alături de performanțele metodei în sine. Metoda trebuie însoțită de asigurarea unui control de calitate, intern și extern, în condițiile în care un test bun efectuat într-o manieră necorespunzătoare poate fi mai păgubos decât lipsa testului.

Condiții de siguranță și biosecuritate. Multe dintre metodele disponibile recent, necesită echipamente complexe și infrastructură costisitoare de laborator pentru a fi îndeplinite criteriile de biosecuritate. Acete criterii existențiale ale fiecărui laborator trebuie să fie adaptate noilor condiții de lucru și responsabilități în raport cu riscul particular pe care îl incumbă infecțiozitatea ridicată a Mycobacterium tuberculosis. Conștientizarea riscurilor și a măsurilor de biosiguranță corespunzătoare trebuie să fie o preocupare continuă.

Capacitatea de instruire a personalului. Factorii de conducere din laboratoare trebuie să cunoască avantajele metodei și modul de aplicare. În cazul unora dintre metode, personalul trebuie instruit în unul sau două laboratoare. Pentru alte metode, char și pentru cele mai simple, personalul trebuie coordonat cu atenție în plan local. Sunt necesare modificări de infrastructură ale laboratorului, de la minima achiziție de noi medii de cultură și reactivi, până la refacerea unor circuite de materiale și produse biologice.

În ceea ce privește metoda NRA, există numeroase studii care atestă eficiența metodei, în comparație cu metodele clasice sau cu metodele automate, bazate pe secvențiere ADN (106, 113, 262). Timpul de obținere a rezultatelor este foarte scurt, permițând adoptarea tratamentului corespunzător și reducerea răspândirii bolii. Deoarece metoda nu necesită măsuri speciale pentru recoltare/ transport/ conservare, probabilitatea de eșec a metodei este foarte redusă.

Metoda nu necesită echipamente costisitoare și nici personal înalt calificat, și poate fi implementată în laboratoare de bacteriologie amenajate pentru prelucrarea produselor biologice, contaminate cu M. tuberculosis. Eficiența metodei este comparabilă cu cea a metodelor clasice, cronofage.

Controlul de calitate este asigurat de firma producătoare a mediului cu nitrat de potasiu, prin raportare la tulpina M. tuberculosis ATCC 25177 sensibilă la izoniazidă și rifampicină.

Luând în considerare aceste criterii de adoptare a metodei și ca urmare a rezultatelor proprii, consider necesare:

Adoptarea și introducerea testului NRA ca o metodă simplă, fiabilă și eficientă pentru estimarea sensibilității la tuberculostatice, în contextul programului de combatere a tuberculozdei în țara noastră. Beneficiile de calitate și cost întăresc această propunere;

Extinderea practicilor moleculare de diagnostic care permit un diagnostic rapid, de certitudine și urmărirea factorilor genetici de virulență și rezistență la M. tuberculosis.

Susținerea unui program de cercetări pentru identificarea de noi posibilități și capacități de diagnosticare etiologică a tuberculozei și în mod special a detecției MDR.

Bibliografie:

Abate G, Aseffa A, Selassie A, et al. Direct colorimetric assay for rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2004; 42: 871-3.

Abate G, Mshana RN, Miorner H. Evaluation of a colorimetric assay based on 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) for rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2: 1011- 6.

Affolabi D, Odoun M, Martin A, Palomino J C, Anagonou S, Portaels F. Evaluation of direct detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance by a nitrate reductase assay applied to sputum samples in Cotonou, Benin. J Clin Microbiol 2007; 45: 2123–2125.

Al Zahrani K, Al Jahdali H, Poirier L, Rene´ P, Gennaro ML, Menzies D. Accuracy and utility of commercially available amplification and serologic tests for the diagnosis of minimal pulmonary tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med 2000;162:1323–9.

Albert H, Heydenrych A, Brookes R, et al. Performance of a rapid phage-based test, FASTPlaqueTB, to diagnose pulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Africa. Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 529-37.

Albert H, Trollip A, Seaman T, Mole RJ. Simple, phage-based (FASTPlaque) technology to determine rifampicin resistance of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum. 2004. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 8 (9): 1114-1119.

Alland, D., Kalkut, G.E., Moss, A.R., McAdam, R.A., Hahn, J.A., Bosworth, W., Drucker, E. and Bloom, B.R. Transmission of tuberculosis in New York city – an analysis by DNA fingerprinting and conventional epidemiologic methods. N Engl Med 1994; 330: 710–1716.

Alteri, J. C., J. Xicothencatl-Cortes, S. Hess, G. Caballero-Olin, J. A. Giron, R. L. Friedman. 2007. Myzobacterium tuberculosis produces pili during human infection. PNAS 104: 5145-50.

Angeby, K. A. K., K. Lisbeth, and S. E. Hoffner. Rapid and inexpensive drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis with a nitrate reductase assay. J Clin Microbiol 2002; 40:553-555

Ani, A.E., Y.B. Dalyop, O.Agbaji , J. Idoko. 2009. Drug susceptibility test of Mycobacterium tuberculosis by nitrate reductase assay. J Infect Developing Countries; 3(1):16-19.

Ardito F, Posteraro B, Sanguinetti M, Zanetti S, Fadda G. Evaluation of BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT 960) automated system for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2001; 39: 4440-4.

Arend SM, Andersen P, van Meijgaarden KE, et al. Detection of active tuberculosis infection by T cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10. J Infect Dis 2000; 181: 1850-4.

Arnold C, Westland L, Mowat G, Underwood A, Magee J, Gharbia S. Single-nucleotide polymorphism-based differentiation and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculosis from isolates or directly from sputum. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 122-30.

Ba F, Rieder HL. A comparison of fluorescence microscopy with the Ziehl-Neelsen technique in the examination of sputum for acid-fast bacilli. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3: 1101–1105.

Badak FZ, Kiska DL, Setterquist S, Hartley C, O’Connell MA, Hopfer RL. Comparison of mycobacteria growth indicator tube with BACTEC 460 for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens. J Clin Microbiol 1996; 34: 2236–2239.

Banaiee N, Bobadilla-del-Valle M, Bardarov S Jr et al. Luciferase reporter mycobacteriophages for detection, identification, and antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in Mexico. J Clin Microbiol 2001; 39: 3883-8.

Banaiee N, Bobadilla-del-Valle M, Riska PF, et al. Rapid identification and susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from MGIT cultures with luciferase reporter mycobacteriophages. J Med Microbiol 2003; 52: 557-6.

Bardana EJ, McClatchy JK, Farr RS, Minden P. Universal occurrence of antibodies to tubercle bacilli in sera from non-tuberculous and tuberculous individuals. Clin Exp Immunol 1973; 13: 65-77.

Baylan O, KIsa O, Albay A, Doganci L. Evaluation of a new automated, rapid, colorimetric culture system using solid medium for laboratory diagnosis of tuberculosis and determination of anti-tuberculosis drug susceptibility. INt J Tuberc Lung Dis 2004; 8:772-777.

Behr MA, Warren SA, Salamon H, et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 1999;353:444-449.

Benjamin. W. H., K. B. Waites, A. Beverly, L. Gibbs, M. Waller, S. Nix, S. A. Moser, M. Willert, 1998 Comparison of the MB/BacT System with a Revised Antibiotic Supplement Kit to the BACTEC 460 System for Detection of Mycobacteria in Clinical Specimens . J. Clin. Microbiol, 36: 3234–3238

Bergmann, J. S., and G. L. Woods. 1998. Evaluation of the ESP culture system II for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis isolates to four primary antituberculous drugs. J. Clin. Microbiol. 36:2940–2943.

Bermudez LE, Danelishvili L, Early J (2006) Mycobacteria and macrophage apoptosis: complex struggle for survival. Microbe 1:372–375

Bicmen C, Coskun M, Senol G, Florat N, Kocagöz T. Comparison of Dio-TK and Löwenstein-Jensen media for primary culture of mycobacteria: a preliminary study for a new medium [Poster]. Glasgow, UK: 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, May 10–13, 2003.

Black CA. Delayed type hypersensitivity: current theories with an historic perspective. Dermatol Online J 1999; 5: 7.

Bothamley GH, Beck JS, Schreuder GM, et al. Association of tuberculosis and M. tuberculosis- specific antibody levels with HLA. J Infect Dis 1989; 159: 549-55.

Bownds, S. E., T. A. Kurzynski, M. A. Norden, J. L. Dufek, and R. F. Schell.. Rapid susceptibility testing for nontuberculosis mycobacteria using flow cytometry. J. Clin. Microbiol. 1996; 34:1386-90.

Brock I, Munk ME, Kok-Jensen A, Andersen P. Performance of whole blood IFN-gamma test for tuberculosis diagnosis based on PPD or the specific antigens ESAT-6 and CFP- 10. Int J Tuberc Lung Dis 2001; 5: 462-7.

Brunello F, Favari F, Fontana R. Comparison of the MB/BacT and BACTEC 460 TB systems for recovery of mycobacteria from various clinical specimens. J Clin Microbiol 1999; 37: 1206-9.

Buiuc D si M Negut. Tratat de microbiologie clinica. Ed a 3-a.

Buiuc D, Neguț M. Testarea sensibilității mycobacteriilor. În: Tratat de microbiologie clinică, Ed. Medicală, București, 2008.

Caceres N, Tapia G, Ojanguren I et al (2009) Evolution of foamy macrophages in the pulmonary granulomas of experimental tuberculosis models. Tuberculosis 89:175–182

Canetti G, Fox W, Khomenko A, et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes. Bull World Health Organ 1969; 41: 21-43.

Canetti G, Froman S, Grosset J, et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull World Health Organ 1963; 29: 565-78.

Cardona PJ (2007) New insights on the nature of latent tuberculosis infection and its treatment. Inflamm Allergy Drug Targets 6:27– 39

Cardona PJ (2009) A dynamic reinfection hypothesis of latent tuberculosis infection. Infection 37:80–86

Cardona PJ, Revisiting the Natural History of Tuberculosis. Arch. Immunol. Ther. Exp. (2010) 58:7-14.),

Cardoso, R.F., Cooksey, R.C., Morlock, G.P., Barco, P., Cecon, L., Forestiero, F., Leite, C.Q., Sato, D.N., Shikama Md, M.L., Mamizuka, E.M., Hirata, R.D., and Hirata, M.H. (2004). Screening and Characterization of Mutations in Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates Obtained in Brazil. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 3373–3381.S130.

Caviedes L, Delgado J, Gilman RH. Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2002; 40: 1873-4.

Caviedes L, Lee TS, Gilman RH et al. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. J Clin Microbiol 2000; 38: 1203-8.

Centers for Disease Control and Prevention. 1995. Essential components of a tuberculosis prevention and control program. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 44:RR-11.

Centers for Disease Control and Prevention. Update: nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;49:593–4.

Cernoch, P. L., R. K. Enns, M. A. Saubolle, and R. J. Wallace. 1994. Cumitech 16A, Laboratory diagnosis of the mycobacterioses. Coordinating ed., A. S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C

Chapman AL, Munkanta M, Wilkinson KA, Pathan AA, Ewer K, Ayles H, et al. Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIVpositive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells. AIDS 2002;16:2285–93.

Chin DP, Yajko DM, Hadley WK, Sanders CA, Nassos PS, Mandej JJ, Hopewell PC. Clinical utility of a commercial test based on the polymerase chain reaction for detecting Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens. Am J Respir Crit Care Med 1995; 151:1872–7.

Choi GE, SM Lee, Y Jongyoun, SH Hwang, HH Kim, EY Lee, EH Cho, JH Kim, HJ Kim, CL Chang. 2010. High-resolution melting curve analysis for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. J Clin Microbiol. 48:2893-98.

Chou LS, E Lyon and CT Wittwer. A comparison of high-resolution melting analysis with denaturing high-performance liquid chromatography for mutation scanning: cystic fibrosis transmembrane conductance regulation gene as a model. 2005. Am J Pathol. 124: 330-338.

Chou S, Chedore P and Kasatiya S. Use of gas chromatographic fatty acid and mycolic cleavage product determination to differentiate among Mycobacterium genavense, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium simiae and Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 1998; 36: 577-579.

Coban A Y, Birinci A, Ekinci B, Durupinar B. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis with nitrate reductase assay. Int J Antimicrob Agents 2004; 24: 304–306.

Coban AY, Bilgin K, Uzun M, et al. Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin on blood agar. J Clin Microbiol 2005; 43: 1930-1.

Coban AY, Cihan CC, Bilgin K, et al. Blood agar for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against first-line drugs. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10: 450-3.

Cole, S. T., R. Brosch, J. Parkhill, et al. 1998. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393:537–544.

Collins L, Franzblau SG. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1004-9.

Collins LA, Torrero MN, Franzblau SG. Green fluorescent protein reporter micro plate assay for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42:334.

Cooksey, R.C., Morlock, G.P., Holloway, B.P., Limor, J., and Hepburn, M. (2002). Temperature-mediated heteroduplex analysis performed by using denaturing high-performance liquid chromatography to identify sequence polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex organisms. J. Clin. Microbiol. 40, 1610–1616.

D’Avila H, Melo RC, Parreira GG et al (2006) Mycobacterium bovisbacillus Calmette-Guerin induces TLR2-mediated formation of lipid bodies: intracellular domains for eicosanoid synthesis in vivo. J Immunol 176:3087–3097

Dannenberg AM Jr (2006) Pathogenesis of human pulmonary tuberculosis: insights from the rabbit model. ASM Press, Washington).

Davidow A, Kanaujia GV, Shi L, et al. Antibody profiles characteristic of Mycobacterium tuberculosis infection state. Infect Immun 2005; 73: 6846-51.

De Beenhouwer H, Lhiang Z, Jannes G, et al. Rapid detection of rifampicin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tuber Lung Dis 1995; 76: 425-30.

de Viedma DG. Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches. Clin Microbiol Infect 2003; 9:349-59.

DeTurk, W. E. & Bernheim, F. (1958). Effects of ammonia, methylamine and hydroxylamine on the adaptive assimilation of nitrite and nitrate by a mycobacterium. J Bacteriol 75, 691–696

Diaz/Infantes M S, Ruiz/Serrano M J, Martinez-Sanchez L, Ortega A, Bouza E. Evaluation of the MB/BacT Mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2000; 38:1988-89.

Dinnes J, Deeks J, Kunst H, Gibson A, CumminsE, WaughN, Drobniewski Fand Lalvani A. A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection. Health Technology Assessment 2007; Vol. 11: No. 3

Drancourt M, Carrieri P, Gevaudan MJ, Raoult D. Blood agar and Mycobacterium tuberculosis: the end of a dogma. J Clin Microbiol 2003; 41: 1710-1.

Dubos, R., and J. Dubos. 1952. The white plague. Little, Brown and Co, Boston, Mass

Eichbaum Q and Rubin EJ. Advances in laboratory diagnosis and drug susceptibility testing. Am J Clin Pathol 2002; 118(Suppl 1): S3-S17.

Eisenach KD, Cave MD, Bates JH, Crawford JT. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1990; 161: 977–981.

El-Hajj HH, Marras SA, Tyagi S, Kramer FR, Alland D. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacon. J Clin Microbiol 2001; 39(11): 4131-37.

Espasa M, Gonzalez-Martin J, Alcaide F, et al. Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes. J Antimicrob Chemother 2005; 55: 860-5.

Espasa MGJ, Alcaide F, Lonca J, Manterola XM, Verdu´ E, Coll P. Use of real time PCR for direct detection in clinical samples of genetic polimorphisms causing resistance to isoniazid and rifampicin in Mycobacterium tuberculosis. Mila´n XII European Congress of Clinical Microbiology and infectious diseases. Milan: 2002.

Espitia C, Cervera I, Gonzalez R, Mancilla R. A 38-kD Mycobacterium tuberculosis antigen associated with infection. Its isolation and serologic evaluation. Clin Exp Immunol 1989; 77: 373-7.

Esser MT, Marchese RD, Kierstead LS, et al. Memory T cells and vaccines. Vaccine 2003; 21: 419-30.

Fan, X.Y., Hu, Z.Y., Xu, F.H., Yan, Z.Q., Guo, S.Q., and Li, Z.M. (2003). Rapid detection of rpoB gene mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in shanghai by using the amplification refractory mutation system. J. Clin. Microbiol. 41, 993–997.

Farnia P, Masjedi RM, Mohammadi F, Tabarsei P, Farnia P et al. Colorimetric detection of multidrug-resistant or extensively drug-resistant tuberculosis by use of Malachite Green indicator dye. J Clin Microbiol 2008; 46:796-799.

Felmlee TA, Liu Q, Whelen AC, et al. Comparison of single-strand conformation polymorphism and dideoxifingerprinting. J Clin Microbiol 1995; 33: 1617.

Fietta A, Meloni F, Cascina A, Morosini M, Marena C, Troupioti P, et al. Comparison of a whole-blood interferon-gamma assay and tuberculin skin testing in patients with active tuberculosis and individuals at high or low risk of Mycobacterium tuberculosis infection. Am J Infect Control 2003;31:347–53.

Fluit ADC, Visser MR, Schmitz F-R. Molecular detection of antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2001; 14 (4): 836-71.

Flynn JL, Chan J. Immunology of tuberculosis. Annu Rev Immunol 2001; 19: 93-129.

Foongladda S, Roengsanthia D, Arjrattanakool W, Chuchottaworn C, Chaiprasert A, Franzblau SG. Rapid and simple MTT method for rifampicin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 1118-22.

Foundation for Innovative New Diagnostics. www.finddiagnostics.org

Franzblau SG, Witzig RS, McLaughlin JC, et al. Rapid, low-technology MIC determination with clinical Mycobacterium tuberculosis isolates by using the microplate Alamar Blue assay. J Clin Microbiol 1998; 36: 362-6.

Frieden, T. R., P. I. Fujiwara, R. M. Washko, and M. A. Hamburg. 1995. Tuberculosis in New York City—turning the tide. N. Engl. J. Med. 333: 229–233

Garcia de Viedma D, del Sol Diaz Infantes M, Lasala F, Chaves F, Alcala L, Bouza E. New realtime PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2002; 40 (3): 988–95

Garcia L, Alonso-Sanz M, Rebollo MJ, Tercero JC, Chaves F. Mutations in the rpoB gene of rifampinresistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Spain and their rapid detection by PCR-enzymelinked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 2001; 39 (5): 1813–8.

Garton NJ, Christensen H, Minnikin DE et al (2002) Intracellular lipophilic inclusions of mycobacteria in vitro and in sputum. Microbiology 148(Pt 10):2951–2958

Giampaglia C M S, Martins M C, Vieira G B O, et al. Multicentre evaluation of an automated BACTEC 960 system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 2007; 11: 986–991.

Giampaglia, C. M., M. C. Martins, V. T. Inumaru, I. V. Butuem, and M. A. Telles. 2005. Evaluation of a rapid differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis complex by selective inhibition with p-nitrobenzoic acid and thiophene-2-carboxylic acid hydrazide. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 9:206–209.

Gingeras TR, Ghandour G, Wang E, Berno A, Small PM, Drobniewski F, et al. Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of generic MycobacteriumDNA arrays. Genome Res 1998;8:435–48.

Glickman MS, JS Cox, WR Jr Jacobs. A novel mycolic acid cyclopropane synthetase is required for cording, persistence, and virulence of Mycobacterium tuberculosis. 2000. Mol Cell. 5: 717-27.

Goloubeva V, Lecocq M, Lassowsky P, Matthys F, Portaels F, Bastian I. Evaluation of mycobacteria growth indicator tube for direct and indirect drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from respiratory specimens in a Siberian prison hospital. J Clin Microbiol 2001; 39: 1501-5.

Golyshevskaia, V., A. A. Korneev, L. N. Chernoousova, L. G. Selina, T. A. Kazarova, T. D. Grishina, S. G. Safonova, V. A. Puzanov, G. M. Nikolaeva, and N. I. Fadeeva. New microbiological techniques in diagnosis of tuberculosis. Probl. Tuberk. 1996; 6:22-25

Gomez-Flores R, Gupta S, Tamez-Guerra R, Mehta RT. Determination of MICs for Mycobacterium avium-M. intracellulare complex in liquid medium by a colorimetric method. 1995; 33:1842-46.

Gordon S, Mwandumba H (2008) Respiratory tuberculosis. In: Barnes PF, Gordon SB, Davies PDO (eds) Clinical Tuberculosis. Hodder and Stoughton, London) .

Gounder C, Queiroz Mello FC, Conde MB, Bishai WR, Kritski AL, Chaisson RE, et al. Field evaluation of a rapid immunochromatographic test for tuberculosis. J Clin Microbiol 2002;40:1989–93.

Griess J P, Bemerkungen Z A H H. Über einige Azoverbindungen. Ber Deutch Chem Ges 1879; 12: 426– 428.

Gryadunov D, Mikhailovich V, Lapa S, et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 531-9.

Haas, F., and S. S. Haas. 1996. The origins of Mycobacterium tuberculosis and the notion of its contagiousness, p. 3–19. In W. N. Rom and S. Garay (ed.), Tuberculosis. Little, Brown and Co., Boston, Mass

Hansen T. Evaluation of molecular methods used for the rapid detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. 2008. Master of applied science. School of life science, Queensland University of Technology Brisbane, Queensland, Australia.

Harboe M, Nagal S, Patarroyo ME, Torres ML, Ramirez C and Cruz N. Properties of proteins MPB64, MPB70 a,d MPB80 of Mycobacterium bovis BCG. Infection and Immunity 1986; 52:293-302.

Hausdorfer, J., Sompek E, Allerberger F, Dierich MP, Rusch-Gerdes S. E-test for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2:751.

Hazbon MH. Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis. Biomedica 2004; 24: 149-62.

Heifets L. Conventional methods for antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. In: Multidrug-resistant Tuberculosis, Ed.: Bastian I, Portaels F. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands 2000.

Heifets LB, Cangelosi GA. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: a neglected problem at the turn of the century. Int J Tuberc Lung Dis. 1999; 3: 564-81.

Heifets LB. Clinical mycobacteriology. Drug susceptibility testing. Clin Lab Med 1996; 16: 641-56.

Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E. Application of the Genotype MTBDR assay directly on sputum specimens. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10: 1057-9.

Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, Richter E, Niemann S. Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol 2005; 43: 3699-703.

Hoffner, S. E., S. B. Svenson, R. Norberg, F. Dias, S. Ghebremichael, and G.Kallenius. 1993. Biochemical heterogeneity of Mycobacterium tuberculosis complex isolates in Guinea-Bissau. J. Clin. Microbiol. 31:2215–2217.

Hunter RL, M Olsen, C Jagannath, JK Actor. Trehalose 6,6’-dimicolate and lipid in the pathogenesis of caseating granulomas of tuberculosis in mice. 2006. Am J Pathol. 168: 1249-61.

Idigoras P, Beristain X, Iturzaeta A, Vicente D, Perez-Trallero E. Comparison of the automated nonradiometric Bactec MGIT 960 system with Lowenstein-Jensen, Coletsos, and Middlebrook 7H11 solid media for recovery of mycobacteria. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19: 350-4.

Iseman, M. 1994. Evolution of drug resistant tuberculosis: a tale of two species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2428–2429.si, O’Brien, R. J. 2001. Tuberculosis: scientific blueprint for tuberculosis drug development. Global Alliance for TB Drug Development, New York, N.Y.).

Isenberg HD, D’Amato RF, Heifets L, Murray PR, Scardamaglia M, Jacobs MC, Alperstein P and Niles A. Collaborative feasibility study of biphasic system (Roche Septi-Check AFB) for rapid detection and isolation of Mycobacteria. J Clin Microbiol 1991; 29: 1719-1722.

Jacobs WR Jr, Barletta RG, Udani R, et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages. Science 1993; 260: 819-22.

Jalava J, Marttila H. Application of molecular genetic methods in macrolide, lincosamide and streptogramin resistance diagnostics and in detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. APMIS 2004; 112: 838-55.

Johansen IS, Thomsen VO, Marjamaki M, Sosnovskaja A, Lundgren B. Rapid, automated, nonradiometric susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex to four first-line antituberculous drugs used in standard short-course chemotherapy. Diagn Microbiol Infect Dis 2004; 50: 103-7.

Johnson R, EM Streicher, GE Low, PD van Helden, TC Victor. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. 2006. Curr Issues Mol Biol. 8:97-111.

Jureen P, Engstrand L, Eriksson S, Alderborn A, Krabbe M, Hoffner SE. Rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by Pyrosequencing technology. J Clin Microbiol 2006; 44: 1925-9.

Jureen P, Werngren J, Hoffner SE. Evaluation of the line probe assay (LiPA) for rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb) 2004; 84: 311-6.

Kalfin, E., and A. Engibarov. 1989 Guidelines for microbiological diagnosis of infections caused by mycobacteria, p.118-127. In M Stooianova and G. Mitov (ed.), Handbook of instructions for microbiological diagnosis of bacterial infections, vol. 1. Ministry of Public Health, Sofia, Bulgaria

Kallenius, G., T. Koivula, S. Ghebremichael, S. E. Hoffner, R. Norberg, E. Svensson, F. Dias, B. I. Marklund, and S. B. Svenson. 1999. Evolution and clonal traits of Mycobacterium tuberculosis complex in Guinea-Bissau. J. Clin. Microbiol. 37:3872–3878.

Kanduma E, McHugh TD, and Gillespie SH. Molecular methods for Mycobacterium tuberculosis strain typing: a users guide. J Appl Microbiol 2003;94: 781-791.

Katoch VM. Newer diagnostic techniques for tuberculosis. Indian J Med Res 2004; Oct. 418-428.

Kaufmann SH, Cole ST, Mizrahi V et al (2005) Mycobacterium tuberculosis and the host response. J Exp Med 201:1693–1697

Keating LA, Wheeler PR, Mansoor H, et al. The pyruvate requirement of some members of the Mycobacterium tuberculosis complex is due to an inactive pyruvate kinase: implications for in vivo growth. Mol Microbiol 2005; 56: 163-74.

Kellogg JA, Bankert DA, Withers G, Sweimler W, Kiehn TE and Pfiffer GE. Application of Sherlock mycobacteria identification system using high-performance liquid chromatography in a clinical laboratory. J. Clin Microbiol 2001; 39: 964-970.

Kenneth Todar, 2009 – www.textbookofbacteriology.net

Kent PT, Kubica GP. Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory. Atlanta, GA: CDC, 1985.

Kim SY, Park YJ, Song E, et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug- Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis 2006; 54: 203-10.

Kim, B.J., Lee, K.H., Yun, Y.J., Park, E.M., Park, Y.G., Bai, G.H., Cha, C.Y., and Kook, Y.H. (2004). Simultaneous identification of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism and sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). J. Microbiol. Methods 58, 111–118.

Kirk SM, Schell RF, Moore AV, Callister SM, and Mayurek GH. Flow cytometric testing of susceptibilities of Myobacterium tuberculosis isolates to Ethambutol, Isoniazid and Rifampin in 24 hours. 1998; 36: 1568-73.

Knisley CV, Damato JJ, McClatchy JK and Brennan PJ. Rapid and sensitive identification of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 1985; 22: 761-767.

Kocagoz T, Z Saribas, A Alp. 2005. Rapid determination of rifampin resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR. J Clin Microbiol. 43: 6015-19.

Kumar M, Khan IA, Verma V, Qazi GN. Microplate nitrate reductase assay versus Alamar Blue assay for MIC determination of Mycobacterium tuberculosis. INt J Tuberc Lung Dis 2005; 9: 939-941.

Laal S, Samanich KM, Sonnenberg MG, et al. Surrogate marker of preclinical tuberculosis in human immunodeficiency virus infection: antibodies to an 88-kDa secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1997; 176: 133-43.

LaBombardi VJ, Katariwala R. And Pipia G. The identification of mycobacteria from solid media and directly from VersaTREK Myco bottles using the Sherlock Mycobacteria Identification HPLC system. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 478–481.

Lalvani A, Nagvenkar P, Udwadia Z, Pathan AA, Wilkinson KA, Shastri JS, et al. Enumeration of T cells specific for RD1-encoded antigens suggests a high prevalence of latent Mycobacterium tuberculosis infection in healthy urban Indians. J Infect Dis 2001;183:469–77.

Lalvani A, Pathan AA, McShane H, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 824-8.

Lambert MA, Moss CW, Silcox VA, Good RC. Analysis of mycolic acid cleavage products and cellular fatty acids of Mycobacterium species by capillary gas chromatography. J Clin Microbiol 1986; 23: 731-6.

Lampe, A.S. Nonliquid reagent for detecting nitrate reduction. J Clin Microbiol. 1981; 14: 452-454

Landsteiner K, Chase MW. Experiments of transfer of cutaneous sensitivity to simple compounds. Proc Soc Exp Biol Med 1942; 49: 688-90.

Laszlo A. Tuberculosis: 7. Laboratory aspects of diagnosis. CMAJ 1999; 160: 1725–1729.

Lein AD, von Reyn CF. In vitro cellular and cytokine responses to mycobacterial antigens: application to diagnosis of tuberculosis infection and assessment of response to mycobacterial vaccines. Am J Med Sci 1997;313:364–71.

Lemus D, Martin A, Montoro E, Portaels F, Palomino JC. Rapid alternative methods for detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob Chemother 2004; 54: 130-3.

Lemus D, Montoro E, Echemendia M, Martin A, Portaels F, Palomino JC. Nitrate reductase assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: simple and inexpensive method for low-resource laboratories. J Med Microb 2006; 55: 861-863.

Lin SYG, Probert W, Lo M, Desmond E. Rapid detection of izoniazid and rifampin resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis complex from cultures or smear-positive sputa by use of molecular beacons. J Clin Microbiol 2004; 42(9): 4204-8.

Lupin MZ, Stepanshina VN, Shemyakin IG, Shinnick TM. Association of specific mutations in katG, rpoB, rpsL and rrs genes with spoligotypes of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Russia. Clin Microbiol Infect 2007; 13:620-26.

Luquin M, Ausina V, Lopey Calahirra F, Belda F, Garcia Barcelo M, Celma C and Prats G. Evaluation of practical chromatographic procedures for identification of clinical isolates of mycobacteria. J Clin Microbiol 1991; 29: 120-130.

Mackaness GB. The immunological basis of acquired cellular resistance. J Exp Med 1964; 120: 105-20.

Maguire, H., Dale, J.W., McHugh, T.D., Butcher, P.D., Gillespie, S.H., Costetsos, A., Al-Ghusein, H., Holland, R., Dickens, A., Marston, L., Wilson, P., Pitman, R., Strachan, D., Drobniewski, F.A. and Banerjee, D.K. Molecular epidemiology of tuberculosis in London 1995 to 1997 demonstrating low rate of active transmission. Thorax 2002;57: 617–622.

Makinen J, Marttila HJ, Marjamaki M, Viljanen MK, Soini H. Comparison of two commercially available DNA line probe assays for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2006; 44: 350-2.

Malm, S., Y. Tiffert, J. Micklinghoff, S. Schultze, I. Joost, I. Weber, S. Horst, B. Ackermann, M. Schmidt, W. Wohlleben, S. Ehlers, R. Geffers, J. Reuther, and F. C. Bange. 2009. The roles of the nitrate reductase NarGHJI, the nitrite reductase NirBD and the response regulator GlnR in nitrate assimilation of Mycobacterium tuberculosis. Microbiology 155:1332-1339

Martin A, Camacho M, Portaels F, Palomino JC. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3616-9.

Martin A, Montoro E, Lemus D, et al. Multicenter evaluation of the nitrate reductase assay for drug resistance detection of Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Methods 2005a; 63: 145-50.

Martin A, Montoro E, Lemus D, et al. Multicenter evaluation of the nitrate reductase assay for drug resistance detection of Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Methods 2005; 63: 145–150.

Martin A, Morcillo N, Lemus D, et al. Multicenter study of MTT and resazurin assays for testing susceptibility to first-line anti-tuberculosis drugs. Int J Tuberc Lung Dis 2005b; 9: 901-6.

Martin A, Portaels F, Palomino JC. Colorimetric redox-indicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. J Antimicrob Chemother 2007; 59: 175-83.

Martin A, Takiff H, Vandamme P, Swings J, Palomino JC, Portaels F. A new rapid and simple colorimetric method to detect pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis using nicotinamide. J Antimicrob Chemother 2006; 58: 327-31.

Martin, A., J. C. Palomino, and F. Portaels. 2005. Rapid detection of ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis by two low-cost colorimetric methods: resazurin and nitrate reductase assays. J. Clin. Microbiol. 43:1612–1616

Martinez D, Vermeulen M, von Euw E et al (2007) Extracellular acidosis triggers the maturation of human dendritic cells and the production of IL-12. J Immunol 179:1950–1959).

Matehma B, Kurepina NE, Bifani PJ, and Kreiswirth BN. Molecular epidemiology of tuberculosis: current insights. Clin Microbiol Rev 2006;19: 658-685.

McEvoy CRE, Falmer AA, van Pittius NCG, Victor TC, van Helden PD, Warren RM. The role of IS6110 in the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis 2007; 87: 393-404.

McNerney R. Phage replication technology for diagnosis and susceptibility testing. In: Mycobacterium tuberculosis protocols. Methods in Molecular Medicine. Parish T, Stocker NG (editors). Totowa, NY, Humana Press; 2001. pp. 145-54.

Mejia GI, Castrillon L, Trujilo H and Robledo JA. Microcolony detection on 7H11 thin layer culture as an alternative for rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infetion. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3: 138-142.

Mejia GI, Guzman A, Agudelo CA, Trujillo H, Robledo J. Cinco años de experiencia con el agar de capa delgada para el diagnóstico rápido de tuberculosis. [Five year experience with thin layer agar medium for rapid diagnosis of tuberculosis]. Biomédica 2004; 24 Supp 1: 52-9.

Mikhailovich V, Lapa S, Gryadunov D et al. Identification of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips. J Clin Microbiol 2001; 39 (7): 2531–40.

Miller N, Infante S, and Clearly T. Evaluation of the LiPA MYCOBACTERIA assay for identification of Mycobacterial species from BACTEC 12B bottles. J Clin Microbiol 2000; 38: 1915-1919.

Miller N, T. Cleary, G. Kraus, K. A. Young, G. Spruill, H. J. Hnatyszyn. 2002. Rapid and Specific Detection of Mycobacterium tuberculosis from Acid-Fast Bacillus Smear- Positive Respiratory Specimens and Bact/ALERT MP Culture Bottles by Using Fluorogenic Probes and Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol. 40: 4143-47.

Mirovic v and Lepsanovic Y. Evaluation of the MB/BacT System for recovery of mycobacteria from clinical specimens in comparison to Lowenstein-Jensen medium. Clin Microbiol Infect 2002; 8: 709-714.

Miyamoto J, Koga H, Kohno S, Tashiro T, Hara K. New drug susceptibillity test for Mycobacterium tuberculosis using hybridisation protection assay. J Clin Microbiol 1996; 34:1323.

Mohamed, A.M., Bastola, D.R., Morlock, G.P., Cooksey, R.C., and Hinrichs, S.H. (2004). Temperaturemediated heteroduplex analysis for detection of pncA mutations associated with pyrazinamide resistance and differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by denaturing high- performance liquid chromatography. J. Clin. Microbiol. 42, 1016– 1023.

Montoro E, Lemus D, Echemendia M, Martin A, Portaels F, Palomino J C. Comparative evaluation of the nitrate reduction assay, the MTT test, and the resazurin microtitre assay for drug susceptibility testing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob Chemother 2005; 55: 500–505.

Moore DA, Evans CA, Gilman RH, et al. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med 2006; 355: 1539-50.

Morcillo N, Di Giulio B, Testani B, Pontino M, Chirico C, Dolmann A. A microplate indicator- based method for determining the susceptibility of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis to antimicrobial agents. Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8: 253-9.

Morcillo N, Zumarraga M, Alito A, et al. A low cost, home-made, reverse-line blot hybridisation assay for rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 959-65.

Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M. A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. BMC Infectious Diseases 2005; 5: 62.

Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63.

Mshana RN, Tadesse G, Abate G, Miorner H. Use of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide for rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 1998; 36: 1214-9.

Munoz-Elias, E. J. & McKinney, J. D. (2006). Carbon metabolism of intracellular bacteria. Cell Microbiol 8, 10–22.

Musa, H. R., M. Ambroggi, A. Souto, and K. A. Angeby. 2005. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a nitrate reductase assay applied directly on microscopy-positive sputum samples. J. Clin. Microbiol. 43:3159–3561.

Musser JM. 1995. Antimicrobial agents resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev. 8:496-514.

Muzaffar R, Batool S, Aziz F, Naqvi A, Rizvi A. Evaluation of the FASTPlaqueTB assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 635-40.

N Galí, J. Domínguez, S. Blanco, C. Prat, M. D. Quesada, L. Matas, and V. Ausina. Utillity of in-house mycobacteriophage-based assay for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. J Clin Microbiol 2003; 41:2647-49.

Nakamura RM, Velmonte MA, Kawajiri K, Ang CF, Frias RA, Mendoya MT, Montoya JC, Honda I, Haga S, Toida I. MPB64 mycobacterial antigen: a new skin-test reagent through patch method for rapid diagnosis of active tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2(7):541-546.

Nash KA, Gaytan A, Inderlied CB. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by use of a rapid, simple, and specific RNA/RNA mismatch assay. J Infect Dis 1997; 176 (2): 533–6.

Nataraj, A.J., Olivos-Glander, I., Kusukawa, N., and Highsmith, W.E., Jr. (1999). Single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection. Electrophoresis 20, 1177–1185.

Norden, M. A., T. A. Kurzynski, S. E. Bownds, S. M. Callister, and R. F. Schell. Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) by flow cytometry. J Clin Microbiol. 1995; 33:1231–1237.

O´Brien J, Wilson I, Orton T, Pognan F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem 2000; 267: 5421-6.

Ong DCT, WC Yam, GKH Siu, ASG Lee. 2010. Rapid detection of rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis by high-resolution melting analysis. J Clin Microbiol. 48: 1047-54.

Oprișan G, Popa MI, Bălășoiu M, et al. Identification techniques evaluation of IS 6110 and Mt 308 as molecular markers of M. tuberculosis strains isolated in Romania. Pneumophtysiol 1997; 35-8.

Pai M, Kalantri S and Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: part II. Active tuberculosis and drug resistence. Expert Rev Mol Diagn 2006; 6(3):423-432.

Pai M, Kalantri S, Pascopella L, Riley LW, Reingold AL. Bacteriophage-based assays for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a metaanalysis. J Infect 2005; 51: 175-87.

Pais TF, Silva RA, Smedegaard B, Appelberg R, Andersen P. Analysis of T cells recruited during delayed-type hypersensitivity to purified protein derivative (PPD) versus challenge with tuberculosis infection. Immunology 1998; 95: 69-75.

Palaci M, Ueki SY, Sato DN, et al. Evaluation of mycobacteria growth indicator tube for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis isolates from respiratory specimens. J Clin Microbiol 1996; 34: 762–764.

Palomino JC, Leao SC, Ritacco V. Tuberculosis 2007. www.TuberculosisTextbook.com

Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2720-2.

Palomino JC, Martin A, Portaels F. Rapid colorimetric methods for the determination of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Res Adv in Antimicrob Agents Chemother 2004; 4: 29-38.

Palomino JC, Portaels F. Simple procedure for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis using a commercial colorimetic assay. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999; 18: 380-3.

Palomino JC, Traore H, Fissette K, Portaels F. Evaluation of Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3: 344-8.

Palomino JC. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. Eur Respir J 2005; 26: 1-12.

Panaiotov, S., T. Kantardjiev. Nitrate reductase assay for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2002; 40:3881-3882

Patel, S., Wale, S. and Saunders, N. Hemi-nested inverse PCR for IS6110 fingerprinting of M. tuberculosis strains. J Clin Microbiol 1996;34: 1686–1690.

Pfyffer GE, Bonato DA, Ebrahimzadeh A, et al. Multicenter laboratory validation of susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against classical second-line and newer antimicrobial drugs by using the radiometric BACTEC 460 technique and the proportion method with solid media. J Clin Microbiol 1999; 37: 3179-86.

Pfyffer GE, Welscher HM, Kissling P, et al. Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery of acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1997; 35: 364–368.

Piatek AS, Telenti A, Murraz MR et al. Genotypic analzsis of Mycobacterium tuberculosis in two distinct populations using molecular beacons: implications for rapid susceptibilitz testing. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44(1): 103-10.

Piersimoni C, Olivieri A, Benacchio L, Scarparo C. Current perspectives on drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex: the automated nonradiometric systems. J Clin MIcrobiol 2006; 44:20-28.

Piersimoni C, Scarparo C, Callegaro A, et al. Comparison of MB/BacT ALERT 3D System with radiometric BACTEC system and Lowenstein-Jensen medium for recovery and Identification of mycobacteria from clinical specimens: a multicentre study. J Clin Microbiol 2001; 39: 651-7.

Pottumarthy S, Morris AJ, Harrison AC, Wells VC. Evaluation of the tuberculin gamma interferon assay: potential to replace the Mantoux skin test. J Clin Microbiol 1999;37:3229–32.

Ramachandran, R. What is new in the diagnosis of tubeculosis? Part II: Techniques for drug susceptibilitz testing. ICMR Bulletin. Vol. 32, 2002.

Ramirez MV, KC Cowart, PJ Campbell, GP Morlock, D Sikes, JM Winchel, JE Posey. 2010. Rapid detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by use of real-time PCR and high-resolution melt analysis. J Clin Microbiol. 48: 4003-9.

Rattan, A., Kalia, A. And Ahmad, N. Multi drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Molecular Perspectives. Emerg Infect Dis 4: 195, 1998.

Riska PF, Su Y, Bardarov S, Freundlich L et al. Rapid film-based determination of antibiotic susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis strains using luciferase reporter phage and Bronx Box. J Clin MIcrobiol 1999; 37:1144.

Riska PF, WR Jacobs, D Alland. 2000. Molecular determinants of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuber Lung Dis. 4:S4-S10.

Roberts GD, Bottger EC, Stockman L. Methods for rapid identification of mycobacterial species. Clin Lab Med. 1996;16:603-615.

Roberts GD, Goodman NL, Heifets L, et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recovery of mycobacteria and drugsusceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens. J Clin Microbiol 1983; 18: 689–696.

Robledo JA, Mejia G, Paniagua L, Guzman A, Zapata E, Montes F, Montes C. Evaluation of a screening test for rapid detection of MDR-TB and the cost of its utilization in a group of patients. Int J Tuber Lung Dis 2006; 11 (S236) Abstract book.

Robledo JA, Mejia GI, Morcillo N, et al. Evaluation of a rapid culture method for tuberculosis diagnosis: a Latin American multicentre study. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10: 613-9.

Rohner, P., B. Ninet, C. Metral, S. Emler, and R. Auckenthaler. 1997. Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 35:3127–3131.

Rossau R, Traore H, De Beenhouwer H, et al. Evaluation of the INNO-LiPA Rif. TB assay, a reverse hybridization assay for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and its resistance to rifampin. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 2093-8.

Roth A., Schaberg T, Mauch H. Molecular diagnosis of tuberculosis: current clinical validity and future perspectives. Eur Respir J 1997; 10:1877-91.

Ruiz M, Torres MJ, Llanos AC, Arroyo A, Palomares JC, Aznar J. Direct detection of rifampin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in auramine-rhodaminepositive sputum specimens by real-time PCR. J Clin Microbiol 2004; 42: 1585-9.

Ruiz, P., F. J. Zerolo, and M. J. Casal. 2000. Comparison of susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis using the ESP culture system II with that using the BACTEC method. J. Clin. Microbiol. 38:4663–4664.

Rusch-Gerdes S, Pfyffer GE, Casal M, Chadwick M, Siddiqi S. Multicenter laboratory validation of the BACTEC MGIT 960 technique for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to classical second-line drugs and newer antimicrobials. J Clin Microbiol 2006; 44: 688-92.

Russo C, Tortoli E and Menichella D. Evaluation of new GenoType Mycobacterium assay for identification of Mycobacterial species. J Clin Microbiol 2006; 44: 334-339.

Saceanu CA, Pfeiffer NC and McLean T. Evaluation of sputum smear concentration by cytocentrifugation for detection of acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1993; 31: 2371-74.

Sajduda A, Brzostek A, Poplawska M, et al. Molecular characterization of rifampin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Poland. J Clin Microbiol 2004; 42: 2425-31.

Salubris Group. www.salubris.com

Sanders CA, Nieda RR, Desmond EP. Validation of the use of Middlebrook 7H10 agar, BACTEC MGIT 960, and BACTEC 460 12B media for testing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to levofloxacin. J Clin Microbiol 2004; 42: 5225–5228.

Scarpellini P, Braglia S, Carrera P et al. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43 (10): 2550–4.

Sekiguchi J., Miyoshi-Akiyama T., Augustynowicz-Koppec E., et al. Detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2007; 45: 179-192.

Selvaraj P, Uma H, Reetha AM, Xavier T, Prabhakar R, Narayanan PR. Influence of HLA-DR2 phenotype on humoral immunity & lymphocyte response to Mycobacterium tuberculosis culture filtrate antigens in pulmonary tuberculosis. Indian J Med Res 1998; 107: 208-17.

Sethi S, Sharma S, Sharma SK, et al. Drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosisto primary antitubercular drugs by nitrate reductase assay. Indian J Med Res 2004; 120: 468-471.

Shamputa IC, Rigouts L, Portaels F. Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens. APMIS 2004; 112: 728-52.

Siddiqi SH, Hwangbo CC, Silcox V, Good RC, Snider DE, Jr., Middlebrook G. Rapid radiometric methods to detect and differentiate Mycobacterium tuberculosis/M.bovis from other mycobacterial species. Am Rev Respir Dis 1984; 130: 634-40.

Simboli N, Takiff H, McNerney R, et al. In-house phage amplification assay is a sound alternative for detecting rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in low-resource settings. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 425-7.

Smid I, Salfinger M. Mycobacterial identification by computer-aided gas-liquid chromatography. Diagn Microbiol Infect Dis. 1994;19:81-88.

Smith, I. 2003. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. Annu. Rev. Microbiol. 16:463–496

Soini H and Musser JM. Molecular diagnosis of mycobacteria. Clin Chem 2001; 47(5): 809-814.

Solis, L. A., S. S. Shin, L. L. Han, F. Llanos, M. Stowell, and A. Sloutsky. 2005. Validation of a rapid method for detection of M. tuberculosis resistance to isoniazid and rifampin in Lima, Peru. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 9:760–764.

Somoskovi A, Dormandy J, Mitsani D, Rivenburg J, Salfinger M. Rapid direct detection and susceptibility testing of the Mycobacterium tuberculosis Complex for isoniazid and rifampin in smear positive clinical specimens by the PCR-based Genotype MTBDR Assay. J Clin Microbiol 2006; 44: 4459-63.

Somoskovi A, Hotaling JE, Fitzgerald M, O´Donnell D, Parsons LM, Salfinger M. Lessons from a proficiency testing event for acid fast microscopy. Chest 2001; 120: 250-7.

Sreevatsan, S, Bookout JB, Ringpis FM, et al. Comparatice evaluation of cleavage fragment length polymorphism with PCR-SSCP and PCR-RFLP to detect microbial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis. Mol. Diagn 1998; 3: 81.

Stead, W. W. 1997. The origin and erratic global spread of tuberculosis. How the past explains the present and is the key to the future. Clin. Chest Med. 18:65–77

Steingart KR, Henry M, Laal S, Hopewell PC, Ramsay A, Menzies D, Cunningham J, Weldingh K, Pai M. Test for the diagnosis of pulmonary tuberculosiis: a systematic review. PloS Medicine 2007; 4(6):1041-60.

Steingart KR, Henry M, Ng V, et al. Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis 2006; 6: 570-81.

Streeton JA, Desem N, Jones SL. Sensitivity and specificity of a gamma interferon blood test for tuberculosis infection. Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2:443–50.

Supply, P., Mazars, E., Lesjean. S., Vincent, V., Gicquel, B. and Locht, C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome. Molec Microbiol 2000;36: 762–771.

Syre H, Phyu S, Sandven P, Bjorvatn B, Grewal HMS. Rapid colorimetric method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Isoniazid and Rifampin in liquid cultures. J Clin Microbiol 2003; 41: 5173-77.

Telenti A, Imboden P, Marchesi F, et al. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet 1993; 341: 647–650.

Telenti, A., Imboden, p., Marchesi, F., et al. Direct automated detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by polzmerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37:2954.

Thornton CG, MacLellan KM, Brink TL, Lockwood DE, Romagnoli M, Turner J, Mery WG, Schwalbe RS, Moodz M, Lue Y and Passen S. Novel method for processing respiratory specimens for detection of mycobacteria by using C-18 carboxypropylbetaine: Blinded study. J Clin Microbiol 1998; 36: 1996-2003.

Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 8 Volume Set, 10th Edition

Torres MJ, Criado A, Palomares JC, Aznar J. Use of real-time PCR and fluorimetry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol September 2000; 38 (9): 3194–9.

Torres MJCA, Palomares JC, Aznar J. Rapid detection of resistance associated mutations in Mycobacterium tuberculosis by Light Cycler PCR. In: Reischl U, Wittner C, Cockerill F, ed. Rapid Cycle PCR: Methods and Applications. Microbiology and Food Analysis. Springer, Berlin Heidelberg: 2002.

Tortoli E, Simonetti MT, Lavinia F. Evaluation of reformulated chemiluminescent DNA probe (AccuProbe) for culture identification of Mycobacterium kansasii. J Clin Microbiol 1996; 34: 2838-40.

Traore H, Fissette K, Bastian I, Devleeschouwer M, Portaels F. Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosi isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as an initial indicator of multidrug resistance. Int J Tuberc Lung Dis 2000; 4: 481-4.

Traore H, Ogwang S, Mallard K et al. Low-cost rapid detection of rifampicin resistant tuberculosis using bacteriophage in Kampala, Uganda. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2007; 6:1

Traore H, van Deun A, Shamputa IC, Rigouts L, Portaels F. Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis-complex DNA and Rifampin Resistance in Clinical Specimens from Tuberculosis Patients by the Line Probe Assay; a Large Scale Study. J Clin Microbiol 2006; 44: 4384-8.

Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gingeras TR, Kaplan PM, et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol 1999;37:49–55.

Tufariello JM, Chan J, Flynn JL. Latent tuberculosis: mechanisms of host and bacillus that contribute to persistent infection. Lancet Infect Dis 2003; 3: 578-90.

Ulrichs T, Kaufmann SH (2006) New insights into the function of granulomas in human tuberculosis. J Pathol 208:261–269

Van Deun A, Hamid Salim A, Aung KJ, et al. Performance of variations of carbolfuchsin staining of sputum smears for AFB under field conditions. Int J Tuberc Lung Dis 2005; 9: 1127-33.

Van Soolingen, D., Qian, L., De Haas, P.E., Douglas, J.T., Traore, H., Portaels, F., Qing, H.Z., Enkhsaikan, D., Nymadawa, P. and Van Embden, J.D. Predominance of a single genotype of M. tuberculosis in countries of East Asia. J Clin Microbiol 1995;33: 3234–3238.

Victor TC, van Helden PD. Detection of Mutations in Mycobacterium tuberculosis by a Dot Blot Hybridization Strategy. In: Mycobacterium Tuberculosis Protocols. Methods in Molecular Medicine. Vol. 54. New Jersey: Humana Press; 2001. pp. 155-164.

Victor, T.C., van Helden, P.D., and Warren, R. (2002). Prediction of drug resistance in M. tuberculosis: molecular mechanisms, tools, and applications. IUBMB. Life 53, 231–237.

Viveiros M., Leandro C., Rodrigues L., et al. Direct application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex strains and detection of rifampin resistance in 360 smear-positive respiratorz specimens from an area of high incidence of multidrug-resistant tuberculosis. J Clin Microbiol 2005; 43: 4880-84.

Vlader-Salvado JM, Garza-Gonzales E, Valdez-Leal R, et al. Mycolic acid index susceptibility method for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2001; 39:2642-45.

Waaler, H. T. 2002. Tuberculosis and poverty. Int. J. Tubercle Lung Dis. 6:745–746

Wanger, A., R. Clark, J. Bua, A. Edwards, and J. Ho. 1996. Comparison of MB/BacT and conventional methods for detection of mycobacterium species, abstr. U-40, p. 107. In Abstracts of the 96th General Meeting of the American Society for Microbiology 1996. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Warren, N. G., B. A. Body, and H. P. Dalton. An improuved reagent for mycobacterial nitrate reductase test. J Clin Microbiol 1983; 18:546-549

Watterson S.A., Wilson S.M., Yates M.D., Drobniewski F.A. Comparison of three molecular assay for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 1998, 36: 1969-73.

Wayne LG, Sohaskey CD (2001) Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol 55:139–163

Wenger, P.N., Otten, J., Breeden, A., Orfas, D., Beck-Sague, C.M. and Jarvis, W.R. Control on nosocomial transmission of multidrug-resistant M. tuberculosis among healthcare workers and HIV-infected patients. The Lancet 1995; 345: 235–239.

Werngren J, Klinty L, Hoffner S.E. Evaluation of a e with the BacT/ALERT 3D system for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2006; 44:2130-32.

Wilkinson RJ, Haslov K, Rappuoli R, et al. Evaluation of the recombinant 38-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis as a potential immunodiagnostic reagent. J Clin Microbiol 1997; 35: 553-7.

Wilson SM, al-Suwaidi Z, McNerney R, Porter J, Drobniewski F. Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Nat Med 1997; 3: 465-8.

Woods GL, Fish G, Plaunt M, Murphy M. Clinical evaluation of Difco ESP Culture System II for growth and detection of mycobacteria. J Clin Microbiol 1997; 35: 121-4.

Woods GL. Molecular methods in the detection and identification of mycobacterial infections. Arch Pathol Lab Med. 1999;123:1002-1006.

Woods GL. Molecular techniques in mycobacterial detection. Arch Pathol Lab Med 2001;125:122–6.

World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part II: microscopy. WHO/TB/98.258. Geneva, Switzerland. WHO, 1998.

World Health Organization. The WHO/IUATLD global project on anti-tuberculosis drug resistance surveillance. Antituberculosis drug resistance in the world, report no. 3. WHO/ HTM/TB/2005.349. Geneva, Switzerland: WHO, 2004.

www.who.org

www.cdc..gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5202a2.htm

www.stoptb.org

Yajko DM, Madej JJ, Lancaster MV, et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 1995; 33: 2324-7.

Zainuddin, Z.F. and Dale, J.W. Polymorphic repetitive DNA sequences in M. tuberculosis detected with a gene probe from a Mycobacterium fortuitum plasmid. J Gen Microbiol 1989;135: 2347–2355.

Zhang, Y., Mazurek, G.H., Cave, D.M., Eisenach, K.D., Pang, Y., Murphy, D.T. and Wallace, R.J. Jr. DNA polymorphisms in strains of M. tuberculosis analyzed by pulsed-field gel electrophoresis: a tool for epidemiology. J Clin Microbiol 1992;30: 1551– 1556.

Zumft, W. G. (1997) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 533-616