MOLECULARI PENTRU REZISTENȚA GRÂULUI COMUN ( TRITICUM AESTIVUM ) LA SEPTORIOZĂ ( SEPTORIA TRITICI ) (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) CONDUCĂTOR… [612673]

UNIVERSITATEA DE STIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ
VETERINARĂ CLUJ NAPOCA
SCOALA DOCTORALA
FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Biolog DANA M. BOTA (CURTICIU)

SELECTIA ASISTATĂ DE MARKERI
MOLECULARI PENTRU REZISTENȚA GRÂULUI
COMUN ( TRITICUM AESTIVUM ) LA
SEPTORIOZĂ ( SEPTORIA TRITICI )

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC
Prof. Univ. Dr. CONSTANTIN BOTEZ

CLUJ -NAPOCA
2010

3
CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 3
CAPITOLUL I ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 4
1.1. Agentul patogen și simptomele bolii ………………………….. ………………………….. …………….. 4
1.2. Metode de combatere a bolilor ………………………….. ………………………….. …………………….. 6
1.3. Determinismul genetic al rezistenței grâului la septorioză ………………………….. …………. 7
CAPITOLUL II ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 7
2.1. Clasificarea și caracteristicile markerilor moleculari ………………………….. ……………….. 7
2.2 Aplicațiile markerilor moleculari în ameliorarea plantelor ………………………….. ………… 8
CAPITOLUL III ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 9
3.1. Selecția asistată de markeri ………………………….. ………………………….. …………………………. 9
3.2. Atribuirea markerilor genelor de interes ………………………….. ………………………….. ……… 9
CAPITOLUL IV ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 9
4.1. Scopul si obiectivele tezei de doctorat ………………………….. ………………………….. ………….. 9
4.2. Mat erialul biologic utilizat ………………………….. ………………………….. ……………………….. 10
4.3. Metode de lucru ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 10
4.3.1. Izolarea si cuantificarea ADN -ului ………………………….. ………………………….. …………. 10
4.3.2. Amplificarea ADN -ului cu ajutorul markerilor RAPD ………………………….. …………… 10
4.3.3. Amplificarea ADN -ului cu ajutorul markerilor SSR ………………………….. ……………… 10
4.3.4. Electroforeza fragmentelor de ADN ………………………….. ………………………….. ………. 11
4.3.5. Preluarea și analiza imaginilor ………………………….. ………………………….. ……………….. 11
4.3.6. Menținerea, multiplicarea și conservarea sporilor de Septoria tritici ……………………. 11
4.3.7. Metoda Bulk Segregant Analysis ………………………….. ………………………….. ……………. 11
4.3.8. Clonarea ADN -ului din benzile polimorfe ………………………….. ………………………….. .. 11
4.3.9. Obținerea materialului segregant F 2 în urma hibridării formelor parentale ……………. 12
CAPITOLUL V ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 12
5.1. Rezultate privind izolarea ADN -ului ………………………….. ………………………….. ………….. 12
5.2. Rezultate privind selecția pentru rezistența grâului la septorioză utilizând tehnica
SSR ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 12
5.2.1 Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile parentale …………………………. 12
5.2.2. Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile dihaploide ………………………… 15
5.3. Rezultate privind atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistență pe
baza cosegregării ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 16
5.3.1 Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile parentale ………………………….. 16
5.3.2. Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile dihaploide ……………………….. 16
5.4. Rezultate privind atribuirea markerilor molecula ri RAPD genelor de rezistență pe
baza metodei BSA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 17
5.4.1. Obținerea materialului hibrid ………………………….. ………………………….. …………………. 17
5.4.3. Atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenta la Septoria tritici pe
baza metodei BSA ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 17
5.4.4. Stabilirea relațiilor de linkage dintre markeri RAPD atribuiți genelor de rezistență și
genele de rezistență la STB ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 18
5.5. Rezultate preliminare privind clonarea produșilor de amplificare ………………………. 19
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 20
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 21

3
INTRODUCERE

În cadrul a cestei teze de doctoat ne -am propus studierea cu ajutorul tehnicilor de biologie
moleculară, mai ales cu ajutorul markerilor moleculari, a polimorfismului molecula r la nivel de
ADN în scopul identificării unor markeri asociați cu genele de rezistență la septorioză. În
principal s -a realizat testarea markerilor moleculari RAPD ( Random Amplified Polymorphic
DNA ) și a markerilor microsatelitici SSR ( Simple Sequence Re peat) pentru realizarea selecției
asistate de markeri pentru rezistența grâului comun ( Triticum aestivum ) la septorioză.
Grâul este una din cele mai vechi plante de cultură, are o importanță alimentară deosebită
și are cea mai largă răspândire pe glob, oc upând circa 90% din suprafața mondială cultivată cu
cereale. Această cereală este atacată de numeroase boli dintre care una din cele mai imp ortante
este septorioza, produsă de agentul fitopatogen Mycosphaerella graminicola . În țara noastră
această boală poate produce, în anii cu toamne și primăveri ploioase, pagube ce pot ajunge la 10 –
15% din producția de grâu. Interesul față de acest agent patogen a fost stimulat de preocuparea
cultiva torilor și a oamenilor de știint ă din zonele geografice cu cele mai mar i suprafețe cultivate
cu acestă cereală, unde focarele bolii sunt capabile să reducă randamentul culturilor pană la 30 –
40% (Eyal et al., 198 7).
Ca metode de combatere ale acestei boli se pot utiliza cultivare rezistente, efectuarea
controlului chimic și a plicarea practicilor agricole. Una dintre metodele de combatere a bolilor
larg răspândite este combaterea chimică, dar utilizarea fungicidelor este legată și de o serie de
dezavantaje care nu pot fi trecute cu vederea:
 sunt costisitoare, producerea lor nec esitând cantități importante de materii prime și un
consum ridicat de energie;
 tratamentele chimice trebuie repetate în fiecare an, iar în cazul unor boli de mai multe ori
pe an; unele sunt fitotoxice față de unele soiuri ale ale aceleiași culturi, etc.
În prezent, în numeroase tări se execută lucrări ample de ameliorare a rezistenței plantelor
la bolile care se transmit prin semințe.
Cercetările noastre s -au desfașurat pe durata a trei ani, 2006 -2009, perioadă în care am
efectuat experimente atât în campul experimental, cât și în laborator.
Departamentul de Genetică și Ameliorare a Plantelor al USAMV Cluj -Napoca, unde mi –
am desfășurat activitatea are o bună colaborare cu Instututul National de Cercetare – Dezvoltare
Agricola (INCDA) Fundulea, institut ce ne -a pus la dispozitie materialul biologic necesar
realizării acestui studiu . O parte din rezultate prezentate î n acesta t eza au fost publicate de mine
și de catre conducatorul meu de doctorat sub for ma de articole (Botez et al., 2007; Botez et al.,
2009; Dana Curticiu et al., 2009), precum ș i sub forma de postere (Botez et al., 2008; Dana
Curticiu et al., 2008; Dana Curticiu et al., 2007).
Pentru realizarea acestui proiect am avut ca suport financiar proiectul CEEX cu titlul
„Construirea unei noi baze genetice pentru cerealele viitorului” și grantul CNCSIS tip TD, pe
care l -am castigat în anul 2008. În timpul programului de doctorat am b eneficiat de o bursă
Socrates -Erasmus la Universitatea din Copenhaga, Facultatea de Știinte ale Vieții, unde, sub
îndrumarea profesorului Sven B. Anderson și a profesorului asociat Anna Maria Torp am avut
oportunitatea de a -mi îmbunatăți cunoștințele teore tice și practice î n domeniul geneticii
moleculare.
Doresc sa adresez mulț umirile cuvenite tuturor care, direct s au indirect, prin sugestiile
oferite au contribuit la finalizarea acestei teze. Pe tot pa rcursul efectuarii acestei lucră ri am
beneficiat de sprijinul permanent al domnului profes or dr. Constantin Botez, conducătorul
științific al tezei de doctorat, că ruia ii aduc, pe ac esta cale, cele mai sincere mulț umiri pentru
îndrumarea activității mele ș tiintifice.
Cu acesta ocazie adresez multumiri conducerii Universității de Științe Agricole și

4
Medicină Veterinară Cluj –Napoca, conduc erii Facultății de Agricultură ș i colectivu lui de la
disciplina de Genetică ș i Ameliorarea Plantelor pentr u asigurarea cadrului academic știintific în
care mi -am desfăș urat activitatea pe parcursul anilor de studiu.
Multumesc domnului dr. Nicolae N. Saulescu de la INCDA Fundulea ș i doam nei dr.
Rozalia Kadar de la SCDA Turda pentru pun erea la dispoziț ie a materialului biologic necesar î n
experimentele noastre.
Dore sc să le mulțumesc colegilor de doctorat : Daniela, Erika, Laura, Raluca, Ioana C.,
Ileana, Stefana, Carmen, Fr ancesca, Ioana P., Tiberia, Alex, Moumen, Paul R. și Cristi, pentru
sprijinul și ajutorul acordat. Le multum esc, de asemenea, colegilor de master: Oana ș i Paul.
Nu în ultimul rân d țin să mulțumesc familiei , sotului meu și prietenilor pentru sprijinul
moral și material, pentru susținerea și înțelegerea pe care mi -au acordat -o pe parcursul acestor
ani de studiu.

CAPITOLUL I
1.1. Agentul patogen și simptomele bolii
Introducere
Septorioza grâului este produsă de mai multe specii ale genului Septoria , dintre care două
sunt mai răspândite: Septoria tritici și Septoria nodorum . Septoriozele grâului sunt larg
răspândite în toate țările cultivatoare de cereale păioase, cauzând boli foliare a grâului ( figura 1 ),
ce au un impact mare asupr a producției de grâu (Eyal, 1999). Amelioratorii urmăresc crearea
unor genotipuri rezistente la boli, care să prezinte calitate, randament, și să fie stabile într -o gamă
largă de medii de viață. Necesitatea rezistenței durabile este o prioritate pentru ame lioratori,
deoarece ameliorarea culturilor pentru a obține o productivitate ridicată și stabilă, este practic
imposibil de făcut la cultivare de grâu ce nu prezintă rezistență la cele mai importante boli.
Agentul patogen
Agentul fitopatogen, Septoria t ritici este o ciupercă bipolară heterotalică (Kema et al.,
1996) care produce septorioza , fiind una din cele mai periculoase boli a grâului comun,
producând importante pierderi economice. În țara noastră, septorioza apare în fiecare an,
producând pagube ma i mari când condițiile atmosferice favorizează o apariție timpurie a ei
(Alexandrii et al., 1969).
În România, în prezent, cele mai cultivate soiuri de grâu sunt mai mult sau mai putin
predispuse la Septoria tritici, prin urmare rezistența la acest agent patogen este o prioritate în
programele de ameliorare (Mincu, 1999) . În ciuda importanței economice, baza moleculară a
virulenței și patogenitatea agentului fitopatogen, nu sunt complet înțelese (Palmer & Skinner,
2002). Ascomicetele care rareori produc sp ori sexuați, sunt cunoscute sub numele dat de
înmultirea asexuată, care este complet diferit de numele dat de înmulțirea sexuată. În cazul
nostru, agentul patogen se înmulțeste atât pe cale sexuată – stadi ul pefect sau telomorf , cât și
asexuată – stadiu im perfect sau anamorf, infecțiile primare fiind inițiate în principal de ascospori
produs i în pseudotecii (Agrios, 1997).
Procesul de infectie
Sursele primare de inoculul, în ciclul bolii, sunt ascosporii purtați de vânt și
picnidiosporii purtați de stropi i de ploaie, proveniți din resturile de plante infectate sau din
semințele infectate. Ascosporii și picnidiosporii sunt eliberași în condiții de umiditate ridicată,
ascosporii fiind eliberati din pseudotecile mature pe tot parcursul anului (Palmer & Skinne r,
2002). Picnidiosporii pot fi transportați vertical de către stropii de ploaie, de la baza plantei spre
frunzele superioare, sau orizontal, spre frunzele din jur. Intervalele lungi fară ploi pot limita
dispersia sporilor, atât pe vertical, cât și pe oriz ontal (Eyal et al., 1987).

5
Atacul începe mai întâi pe frunzele de la baza plantei și apoi treptat pe cele superioare;
când atacul este puternic (pete numeroase), frunzele se uscă de timpuriu, începând cu cele de la
bază; plantele atacate se dezvoltă slab , se maturează forțat și dau o producție de boabe inferioară
cantitativ și calitativ. Atacul se manifestă sub forma unor pete mici, mai puțin evidente, cu puține
picnidii (Alexandrii et al.,1969). Odată ajunsă pe frunze, ciuperca colonizează mezofilul,
neproducând haustorii; în condiții optime de temperatură și umiditate, patogenul produce cloroza
și necroza țesutului plantei atacate (Dancer et al., 1999; Kema et al., 1996). Viteza de distrugere
a țesutului atacat (10 zile de la inoculare), precum și faptul că celulele plantei sunt afectate, fară
prezența miceliului, sugerează faptul că ar putea exista unii compuși toxici solubili implicaț i în
interactiunea grâu -agent patogen. Cu toate acestea, nici un compus biologic activ, nu a fost izolat
(Eyal, 1999).
Perioada de incubație (până la apariția petelor) este relativ scăzută (6 -7 zile), pe când
perioada de fructificare (până la formarea picnidiilor) este de 11 -15 zile. Agentul patogen
infectează mai frecvent și mai puternic limbul (Sivanesan, 1990), mai rar ș i mai slab tecile
frunzelor, tulpinile și spicele, infecție observață doar în condiții optime de dezvoltare a bolii, în
condiții naturale (Jones & Cooke, 1969; Brokenshire, 1975; Brokenshire, 1976).
Simptomele bolii
În condiții optime pe frunzele plantelo r tinere se observă pete ovale sau de formă
neregulată, la început de culoare verde pal, apoi brună. Pe frunzele plantelor mai dezvoltate, pe
partea superioară și mai ales pe cea inferioară, apar pete asemănătoare, dispuse de -a lungul și
între nervurile fr unzei. Petele cresc repede și i -au o formă alungită, eliptică; uneori se prezintă ca
dungi longitudinale și au o culoare brună deschis (figura 1 -B).Cu timpul, țesutul din dreptul
petelor se uscă și se deschide la culoare, mai ales în centrul petei, devenind cenușiu -albicios,
rămânând înconjurat de o margine brună deschis sau brună -cenușie. Petele de pe frunze au o
lungime de câțiva milimetrii până la 1 cm.

Fig. 1. Atac de Septoria tritici pe frunze de grâu
A. sursa: http://www.omafra.gov.on.ca/french/crops/facts/90 -008f4.jpg
B. sursa: http://www.freefoto.com/images/07/45/07_45_66 -Wheat_web.jpg
C. sursa: http://www.ksre.ksu.edu/library/plant2/EP133.pdf
D. sursa: http://www.hgca.com/hgca/wde/IMAGES/Septoria%202.JPG

Într-o fază mai avansată a bolii, la suprafața petelor apar picnidiile, cufundate ușor în
epidermă, care se văd ca niște puncte mici, negricioase, dispuse în rânduri paralele de-a lungul
nervurilor (figura 1-A). Boala se transmite de la un an la altul prin resturile de plante atacate
(frunze, tulpini, plevi), astfel ciuperca se poate menține în viață în condiții nefavorabile o
A
C B
D

6
perioadă de timp mai îndelungată (mai mult de 1 an) sub formă de miceliu și de conidii în
picnidii.
După semănat, în cursul germinării boabelor de grâu, ciuperca trece de pe boabele
contaminate de anul trecut pe plantele tinere ieșite din acestea (figura 2) , pe care l e infectează
(infecție germinală). În urma infecțiilor de toamnă, boala apare pe frunzele de grâu prin
simptomele descrise. În frunzele de grâu, miceliul ciupercii rămâne activ chiar la temperaturi
foarte scăzute.

Fig. 2 . Ciclul de viată al agentului patogen Septoria tritici
(sursa :http://www.hgca.com/minisite_manager.output/3619/3619/Cereal%20Disease%20Encycl
opedia/Diseases/Septoria%20Leaf%20Blotch.mspx?minisiteId=26 )

În timpul primăverii și al verii, ciuperca se înmulțește și se răspândește prin picnospori,
care infectează plantele și produc mai multe serii de infecții secundare. În afară de grâu, agentul
patogen S. tritici atacă și culturile de secară, orz și diferite plante de nutreț (sp. de Poa, Bromus,
etc.), dar neproducând pagube î nsemnate ( Ao&Griffiths, 1976).
1.2. Metode de combatere a bolilor
Impactul economic al acestui agent patogen cu privire la productivitatea și calitatea
culturii de grâu a devenit tot mai pronunțat datorită rezistenței medii sa u scăzute a cultivarelor
existente. Distribuția acestui patogen este dependentă de practicile agricole aplicate, de exemplu
rotația culturilor este un factor cheie care afectează obținerea de viitoare culturi de grâu, de
calitate și cu o productivitate rid icată (Cook & Veseth, 1991).
Cercetătorii recomandă efectuarea rotației corespunzătoare a culturilor, în combinație cu
alte practici agricole pentru a reduce severitatea bolilor, cum ar fi aratul (King et al., 1983),
îndepărtarea și arderea resturilor veg etale de la cultura precedentă, etc. (Eyal et al., 1987). Pe
langă folosirea de cultivare ce prezintă rezistență la boli, se poate apela și la combatea chimică
prin utilizarea fungicidelor. O varietate de fungicide sunt recomandate și folosite pentru cont rolul
septoriozei: Bravo 500 SC, Artea 330 EC, Prosaro 250 EC, Falcon 460 EC, etc.
Combaterea integrată reprezintă combinarea tuturor metodelor de combatere menționate
mai sus, cu o serie de măsuri agrofitotehnice care au drept scop reducerea la minimum a ratei de
îmulțire a paraziților și întărirea capacității de dezvoltare a plantelor și implicit a rezistenței
Pseudotecile și
picnidiile se dezvoltă
producând leziuni
Formele de rezistență sunt miceliul, picnidii
si pseudotecii rămase pe resturile plantelor Toamna și primăvara
cerealele sunt
infectate prin
ascosporii purtați de
vânt
Picnidii Picnidiile ajung pe plante
prin intermediul
picăturilor de ploaie
Peritecii
Ascospori

7
naturale a acestora.
Aplicarea tuturor masurilor de igienă culturală, ca de exemplu: îngroparea resturilor
vegetale care au ramas după strânsul paielor și cocenilor, menținerea curată a terenului pentru
lucrări corespunzatoare în intervalul de la aratura de vară pană la însămânțare, combaterea
buruienilor în tot cursul vegetației stânjenesc dezvoltarea bolillor (Ceapoiu et al., 1983).
1.3. Determ inismul genetic al rezistenței grâului la septorioză
În ultimii ani s -au facut progrese în ceea ce privește nivelul de rezistență a grâului la STB
(Septoria trititci blotch ), mai mulți factori influențând acest progres: creșterea patogenului în
cultură fi ind lentă, nevoia de condiții speciale de mediu pentru efectuarea infecțiilor, precum și
greutatea întâmpinată la evaluarea simptomelor la plantele infectate (Goodwin et al., 2007).
Gena Stb1 denumită de Wilson în 1985, a fost identificată la cultivarul Bulgaria 88 de
către Rillo si Calswell (1966); genele Stb2 și Stb3 au fost descoperite în Australia de către
Wilson (1985) la cultivarul Veranopolis și Israel 493. Gena Stb4 a fost descoperită la cultivarul
Tadorna de Somasco și colaboratorii în anul 1996 , iar gena Stb8 a fost descoperite la varietatea
Synthetic W7984 , fiind cartate pe cromozomii 5BL, 3BS, 6DS, 7DS, respectiv 7BL. Aceste gene
au fost identificate prin infecție naturală, probabil dintr -un amestec de genotipuri patogene. Gena
Stb1 a fost in trodusă la cultivarul roșu de iarnă Indiana, Oasis și Sullivan (Patterson et al., 1975,
1979), această genă a conferit rezistența la septorioză în statul Indiana, precum și în alte părți ale
vestului Statelor Unite. Gena Stb4 a fost introdusă în Californi a la cultivarul Tadinia și a conferit
rezistența o p erioadă de 15 ani (Somasco et al., 1996), dar în anul 2000 acest cultivar nu a mai
fost rezistent și acum este considerat un cultivar ele ce a incorporata aceasta gena sunt
considerate sensibile la septori oză (Jackson et al., 2000).
Celelalte gene: Stb5 (Arraiano et al. 2001 b), Stb6 (Brading et al. 2002) , Stb7(McCartney
et al. 2003) , Stb8 (Adhikari et al. 2003), Stb10 , Stb11 , Stb12 (Chartrain et al. 2005 a, 2005 b) și
Stb15 (Arraiano et al. 2007) au fost id entificate la varietățile: Sinthetic 6x, Flame Hereward,
Estanzuela Federal, graul sintetic W7984, Kavkaz -K4500, TE911, Kavkaz -K4500, respectiv
Arina fiind cartate pe cromozomii 7DS, 3AS, 4AL, 1D, 1BS, 4AL si 6AS (Goodwin et al.,
2007). Distribuția acesto r gene este pe 10 cromozomi ai grâului, aproximativ egală în genomul
A, B și D .
CAPITOLUL II
2.1. Clasificarea și caracteristicile markerilor moleculari
Markerii genetici reprezintă forme diferite ale aceleiași gene care controlează expresii
fenotipice m utante și permit identificarea prezenței unei gene la nivel individual. Markerii
genetici se bazează pe polimorfismul genei la nivelul expresiei fenotipice în relație cu condițiile
de mediu. Există trei tipuri de markeri genetici : morfologici , biochimici și moleculari Markerii
moleculari sunt cei mai utilizați datorită numărului lor nelimitat, aceștia provenind din diferite
tipuri de mutații ale ADN -ului: substituții (mutații punctiforme), rearanjamente (inserții sau
deleții) sau erori în replicarea ADN -ului în tandem. Acești markeri sunt neutrii deoarece sunt
localizați în regiuni necodate a ADN -ului, de asemenea, markerii moleculari sunt practic în
număr nelimitat și nu sunt influențați de condițiile de mediu sau de stadiul de dezvoltare al
plantelor (Win ter & Kahl, 1995). Avantajele și dezavantajele principalelor tipuri de markeri
moleculari sunt prezentate în tabelul 1.

8

Tabel 1 .
Avantajele și dezavantajele celor mai utilizați markeri moleculari pentru analiza QTL
(după Collard et al l., 2005)

Marker molecular
Codominant – C
Dominant -D
Avantaje
Dezavantaje

RFLP (Restriction
fragment Length
Polymorphism) C Reproductibilitate
Necesită mult timp
Metodă complexă
Necesită cantități
mari de ADN
RAPD (Random
Amplified
Polymorphic
DNA) D Metodă rapidă si
simplă
Ieftină
Necesită cantitati
mici de ADN Metodă
nereproductibilă
SSR (Simple
Sequences Repeat) C Metodă simplă
Repetabilitate
Necesită mult timp
Metodă complexă
Necesită folosirea
gelurilor de
poliacrilamidă
AFLP (Amplified
fragment Length
Polymorphism) D Polimorfism ridicat Necesită cantități
mari de ADN
Metodă complexă

Markerii moleculari pot fi clasificați în trei clase în functie de metoda lor de detecție:
(A) markeri moleculari bazați pe hibridizare,
(B) markeri moleculari bazați pe P CR,
(C) markeri mo leculari bazați pe secvența ADN.
2.2 Aplicațiile markerilor moleculari în ameliorarea plantelor
În ameliorarea convențională, rezultatele și viteza de răspuns obținute prin aplicarea
selecției fenotipice au depins, pe lângă alți factori, de posibilitatea de a distinge și capitaliza
variațiile genetice ținând cont de faptul că cele mai importante caractere sunt poligenice și deci
puternic influențate de mediu. Între modalitățile folosite, de mare interes s -a dovedit posibilitatea
de a iden tifica caractere fenotipice evidente, cu determinism genetic simplu și puțin influențate
de mediu, care să fie asociate cu caractere importante urmărite de ameliorator. Aceste caractere,
numite gene marcatoare sau markeri genetici, au fost folosite de amel iorarea convențională acolo
unde a fost posibil, pentru a îmbunătății eficiența programelor de ameliorare.
Identificarea unei noi clase de markeri genetici, respectiv a markerilor moleculari,
reprezintă un adevărat eveniment revoluționar în metodologia de ameliorare a plantelor.
Strategia utilizării markerilor moleculari se bazează pe evidențierea polimorfismului molecular,
polimorfism care la genomurile plantelor este datorat, în mare parte, variației cantității de ADN
repetitiv. Cele mai importante aplic ații ale markerilor moleculari în ameliorarea plantelor sunt
reprezentate de selecția asistată de markeri, accelerarea backcrossului, detectarea diversității și
diferențelor genetice dintre diferite populații.

9
CAPITOLUL III
3.1. Selecția asistată de marker i
Markerii moleculari care sunt strâns linkați cu gene importante în sens agronomic sunt
folosiți ca instrumente moleculare pentru selecția asistată de markeri în ameliorarea plantelor
(Ribaut & Hoisington, 1998). Cu ajutorul markerilor moleculari se urmăr ește efectuarea unei
selecții indirecte a caracterelor de interes folosind strânsa legatură (linkage -ul) dintre gena sau
genele care controlează caracterul și un marker molecular, metodă ce poartă numele de selecție
asistată de markeri (MAS – Marker Assist ed Selection ).
Selecția asistată de markeri constă în identificarea unei legaturi strânse între genele care
controlează caractere agronomice și markeri moleculari, precum și utilizarea acestor markeri
pentru a îmbunătați linii sau cultivare (Dudley, 1993 ). Genele sunt moștenite împreună, iar prin
prezența uneia (gena marker, la care este cunoscută secvența de nucleotide) se confirmă că și
cealaltă genă ce determină caracterul dorit este prezentă în acel individ.

3.2. Atribuirea markerilor genelor de inte res
Pentru a putea fi folositi în munca de selecție, markerii trebuie să fie atribuiți genelor de
interes, acest lucru se face prin trei metode:
1. Cosegregare – prin analiza relației de linkage dintre marker și gena de interes, mai intâi
markerul trebuie aso ciat genei de interés, iar apoi se face analiza de linkage: dacă distanța dintre
marker și genă este mică, markerul se atribuie genei respective.
2. Utilizarea liniilor NIL (Near Izogenic Lines) – obtinute prin metoda backross care constă
în încrucișarea unu i soi recurent cu un soi donor. În continuare se face selecția formelor care
poartă gena de la donor și care se retroîncrucișează în continuare cu recurentul. Se obține o linie
NIL asemănătoare cu recurentul, dar care poartă gena de la donor. Urmează a se face o
caracterizare moleculară atât a soiului recurent, cât și a liniei NIL. Dacă prin analiza fingerprint –
urilor de la soiul recurent și linia NIL se evidențiază un polimorfism se poate presupune că
markerul molecular ce definește acest polimorfism poate fi atribut genei provenite de la donor.
3. Prin utilizarea metodei BSA (Bulk Segregant Analysis )- metodă ce presupune alegerea a
două forme parentale extreme: una rezistentă și una sensibilă la care s -au dovedit a fi polimorfe
la nivel molecular (Michelmor e et al., 1991) . Acestea se hibridează, și în gen F 2 segregantă se
face o grupare a indivizilor sensibili și rezistenți. Se face extracția ADN -ului și în cadrul fiecărei
grupe se amestecă. Urmează amplificarea ADN -ului și analiza polimorfismului molecular: dacă
între cele două grupe apare un polimorfism molecular (o bandă în plus) la forma rezistentă
înseamnă că markerul molecular respectiv poate fi atribuit genei pentru care s -a făcut selecția.
Acest sistem funcționează numai dacă gena pentru care se face selecția este în faza de cuplare cu
markerul molecular.
CAPITOLUL IV
4.1. Scopul si obiectivele tezei de doctorat
Scopul principal al cercetărilor noastre se referă la testarea și obținerea de noi markeri
moleculari în vederea selecției asistate de marke ri moleculari pentru rezistența grâului comun
(Triticum aestivum ) la septorioză ( Septoria tritici ). Utilizarea markerilor moleculari pentru
selecție oferă avantajul că aceștia nu sunt influențați de condițiile de mediu, fiind indiferenți de
expresia genică . În condițiile în care s -au stabilit relații de înlănțuire strânsă între markeri și
genele de interes se poate face o selecție indirectă pe bază de markeri vizând ameliorarea

10
caracterului dorit.
Primul obiectiv al acestui proiect este testarea unor marker i de tip microsatelit SSR în
vederea selecției pentru rezistența grâului la septorioză. Al doilea obiectiv este atribuirea
markerilor moleculari RAPD pe baza cosegregarii. Al treilea obiectiv este atribuirea markerilor
moleculari RAPD pe baza metodei Bulk Segregant Analysis .
Al patrulea obiectiv se refera la clonarea benzilor polimorfe, atribuite genelor de
rezistenta, in vederea convertiri markerilor RAPD polimorfici în markeri specifici SCAR
(Sequence Characterised Amplified Region ).
4.2. Materialul bio logic utilizat
Materialul biologic util izat a fost obținut de la INCDA Fundulea. Pentru acest proiect am
luat în studiu:
 22 de cultivare din care 14 soiuri prezintă gene de rezistență și 8 soiuri sensibile la
septorioză considerate forme parentale;
 9 linii dihaploide considerate a fi rezistente la septorioză;
 23 de linii dihaploide din care 21 linii se consideră a fi rezistente la septorioză și 2 linii
sensibile la această boală ;
 material segregant F 2 obținut prin hibridarea formelor parentale.
Utilizarea liniilor dihaploide, obținute prin dubla rea numărului de cromozomi a haploizilor
de grâu rezultați dintr -un material hibrid, se justifică prin faptul că liniile dihaploide sunt stabile
în descendență, fixând în stare homozigotă recombinarile rezultate în urma hibridărilor. Astfel
este de aștepta t ca în cadrul fiecarei linii să nu existe variabilitate genetică (și nici segregare) și în
consecință să se poată face o selecție a liniilor și nu a plantelor individuale (Botez et al., 2006).
4.3. Metode de lucru
4.3.1. Iz olarea si cuantificare a ADN -ului
Izolarea ADN -ului
Metodele de izolare a ADN -ului au ca și criterii de bază puritatea, integritatea și
cantitatea de ADN obținută. S -a demonstrat puritatea ADN -ului este unul dintre cei mai
importanți factori în reproductibilitatea metodei RAPD. Utilizarea matriței de ADN cu o
puritatea mare asigură reproductibilitate prin metoda RAPD.
Aceste metode urmăresc eliminarea polifenolilor și a polizaharidelor care determină
izolarea unor extracte de ADN cu o culoare brună, inaccesibile enzimelor de re stricție.
Cuantificarea ADN -ului
Cuantificarea ADN -ului a fost realizată și cu ajutorul instrumentului NanoDrop Nd -1000
UV/Vis 1µl Spectrophotometer (Labtech International) conectat la PC.
4.3.2. Amplificarea ADN -ului cu ajutorul markerilor RAPD
Prin am plificarea ADN -ului cu markerii RAP D (Williams et al., 1990) se obțin produși
de amplficare ce se separă, prin migrare electroforetica î n gel de agaroză colorat cu bromura de
etidiu, sub forma unor benzi de dimensiuni diferite. Reac ția de amplificare se re alizează automat
în termocyclerul Palm Cycler (Corbett research). Pentru amplificarea probelor noastre de ADN
s-a utilizat un număr de 20 de markeri random.
4.3.3 . Amplificarea ADN -ului cu ajutorul markerilor SSR
Secvenț ele microsate lit sunt constituite d in repetiții în tandem ale unor secvenț e di, tri
sau tetra nucleotidice, cele mai frecvente fiind secventele dinucleotidice, de exemplu (AC) n.
Markerii SSR utilizați în acest studiu au fost selectaț i pe baz a literaturii de specialitate, în prezent

11
fiind id entificaț i markeri m icrosatelitici linkati cu o genă sau mai multe gene de rezistență la
septorioza grâ ului comun, a stfel a u fost testați 16 markeri SSR.
4.3.4. Electroforeza fragmentelor de ADN
Electroforeza este un fenomen fizico -chimic de deplasare a particulelor purtătore de
sarcini electrice sub influența unui câmp electric. Într -un câmp electric uniform generat de doi
electrozi, particulele încărcate electric se deplasează înspre electrozii de sarcină electrică opusă.
În condiții standardizate ale m ediului de migrare și ale câmpului electric, mobilitatea
electroforetică depinde în mod esențial de mărimea și forma moleculelor.
În condiții standardizate ale mediului de migrare și ale câmpului electric, mobilitatea
electroforetică depinde esențial de m ărimea și forma moleculelor, prin urmare particulele de
mărime mai mică, încărcate electric și aflate în migrare, se deplassează mai repede decât cele
care au mărime mai mare. În timpul migrării, bromura de etidiu migrează spre catod, în sens
opus față de ADN. Dacă migrarea durează prea mult, o cantitate semnificativă de bromură de
etidiu este îndepărtată din gel, făcând dificilă vizualizarea benzilor sărace în ADN (Dordea et al.,
2003).
4.3.5. Preluarea și analiza imaginilor
După prealabla colorare cu b romura de etidiu produ șii de amplificare au fost vizualizați
cu ajutorul transluminatorului UV si aparatul BioSpectrum AC Imaging System (Ultra Violet
Products, UVP) si cu ajutorul programului Vision Works LS.
4.3.6. Menținerea, multiplicarea ș i conservar ea sporilor de Septoria tritici
Materialul biologic, sporii de Septoria tritici (izolatele IPO 323 și IPO 94269 ) au fost
obtinuți de la Universitatea din Wageningen, Olanda și au fost utilizați pentru infecția artificială
a unor hibrizi de grâu pentru a e videnția rezistența acestora la acest agent fitopatogen.
În vederea păstrarii și multiplicării acestui material am folosit două medii de cultură:
mediu solid PDA (Potato Dextrose Agar) și mediu lichid YGM (Yeast Glucose Medium),
urmând apoi crioconservar ea lui pentru utilizările ulterioare.
4.3.7. M etoda Bulk Segregant A nalysis
Metoda Bulk Segregant Analysis este utili zată pentru identificarea rapidă a markerilor
linkati de gene specifice sau gene aflate în anumite regiuni genomice (Michelmore et al., 199 1)
și implică compararea a două amestecuri (bulk -uri) de ADN provenit de la mai multi indivizi
apartinând unei populatii segregante generate în urma încrucișării dintre doi părinti. Fiecare
amestec (bulk) conține indivizi care sunt identici pentru un carac ter sau pentru o genă de interes,
dar sunt diferiți în ceea ce privește alte trăsături și gene . Cele două bulk -uri sunt, prin urmare,
contr astante pentru o trasatură, de exemplu, rezistente și sensibile la o anumita boală, în cazul
nostru, la septorioză. Aceste bulk -uri sunt analizate pentru a identifica markeri care le deosebesc.
Markerii care sunt polimorfici între bulk -uri vor fi linkati g enetic de locusul/loci care determină
caracterul pentru care s -a făcut analiza. Metoda are aplicații în alcătuirea hartilor genetice, care
au fost întocmite pentru multe specii (O’Brien, 1990), astfel sunt acoperite regiuni de interes în
care nu sunt cunos cuți markeri linkati.
4.3.8. Clonarea ADN -ului din benzile polimorfe
În cercetările noastre ne -am propus clonarea AD N-ului din benzile polimorfe obț inute
prin amplificar ea ADN -ului cu markeri RAPD . Benzile sunt izolate din gelul de agaroză sau din
gelul d e poliacrilamidă, sunt clonate într -un vector în vederea secvențierii lor, urmând
construirea de primeri specifi, SCAR, pentru fragmentul de la care s -a plecat. Clonarea include
următoarele etape:

12
1. Obținerea pasagerului – in acest studiu, pasagerul este un produs PCR obț inut din
reamplificarea benzilor izolate din gelul de agaroză 1%.
Obținerea pasagerului prin amplificare PCR se realizează prin utilizarea unor vectori de
tipul A -T, care poartă la capătul 3 o timină ce este complementară adeninei care se ad augă din
greșală sub acțiunea Taq polimerazei în cadrul procesului de amplificare; vectorul și pasagerul
vor avea capetele monocatenare adezive A -T.
2. Pregătirea pasagerului, în cazul în care introducerea directă în vector nu este posibilă.
3. Ligarea pasageru lui de vectorul de clonare cu ajutorul ADN -ligazei.
4. Introducerea vectorului recombinant în gazdă (transformarea celulelor competente).
Există specii în mod natural competente ( Bacillus subtilis ) și specii la care competența
este indusă ( Escherichia coli ), inducerea se face în prezența clorurii de calc iu și a temperaturii
ridicate. Î n cazul de fata am folosit kitul TransformAidTM Bacterial Transformation Kit
(Fermentas).
5. Identificarea și izolarea celulelor gazdă ce poartă un anumit pasager pe mediu selectiv.
După analiza produș ilor PCR, coloniile care au insertul dorit se multiplică pe mediu
lichid LB cu ampicilină în vederea izolă rii ADN -ului plasmidial. ADN -ul plasmidial astfel
obtinut se trimit e la secventiat, pe baza secvenț ei construindu -se noi primeri.
4.3.9. Obținerea materialului segregant F 2 în urma hibridării formelor parentale
În cadrul fiecărei specii există un număr mare de gene valoroase și pentru crearea de
ecotipuri echilibrate ameliora ea caută să îmbine cât mai multe gene favorabile. Pri ncipala cale de
a realiza aceast lucru o constituie recombinarea, prin hibridare.
Materialul biologic parental a fost semănat în câmpul experimental în toamna anului
2006, în anul următor efectuându -se hibridările după cum urmează: sau folosit toți parinții
rezistenți, precum și tr ei parinți sensibili, notați cu : 15 (Farmec), 16 (Delabrad) și 17 (F96869G1 –
108). In acest studiu a m incrucisat genitorii materni cu cei paterni in vederea testarii
descendentilor F 2 pentru rezistenta lor la agentul patogen Septori a tritici .
În toamna anului 2007, combinațiile hibride F 1 au fost semănate în câmpul experimental.
Generația F 2 segregantă a fost semănată în câmpul experimental al gradinii agrobotanice (16
combinații) în anul următor . In 2009, descendentii F 2 au fost recoltați, și prin urmare au fost și
analizați în laborator.
CAPITOLUL V
5.1. Rezultate privind izolarea ADN -ului
La formele parentale concentratia ADN -ului a variat intre 242 ng/µl (proba 5) si 889
(proba 5), iar puritatea a variat intre 1,82 (pro ba 10) si 1,98 (proba 6). ADN -ul extras a fost
ulterior diluat cu apă ultrapură la o concentrație finală a soluției de lucru de 30 ng/µl.
În urma izolarii ADN -ului la cele 23 de linii dihaploide s-au obtinut concentrații care au
variat între 434 ng/µl (p roba 6) și 2933 ng/µl (proba 17) și purități între 1,48 (proba 13) ș i 2,01
(proba 1) , iar p rin extracț ia ADN -ului din indivizii F2 s-au obținut concentrații care au variat între
386 ng/µl (proba 67) si 3830 ng/µl (proba 70) și puritaăți de 1,84 (proba 14) și 2,15 (proba 49).

5.2. Rezultate privind selecț ia pentru rezistența grâului la septorioză utilizând
tehnica SSR
5.2.1 Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile parentale
Pentru realizarea primului obiectiv al acestei teze de doctorat am testat markeri
moleculari de tip mic rosatelit SSR, cu scopul realizării selecț iei asistate de ma rkeri pentru
rezistența grâului la septorioză .

13
În acest studiu am dorit să aflăm ce gene sunt prezente î n materialul nostru biologic,
pornind de la testare a moleculară a formelor parentale rezistente, respec tiv sensibile la agentul
fitopatogen Septoria tritici , urmâ nd efectuarea evaluarii fenotipice în câ mp. Astfel s-au testat
mai mulți markeri SSR descriși în literatură ca fiind asociați unor gene de rezis tență la
septorioză, asupra genotipurilor individuale de la toate variantele de material biologic parental.
În figura următoare este reprezentat p rofilul electroforetic al produșilor de amplificare
obtinuț i prin amp lificarea ADN -ului cu markerul Xgwm577, asociat genei de rezistență Stb8. În
urma analizei individuale de câte cca. 10 plante, în două repetiții, s -au obținut rezultate foarte
diverse. Pentru unele linii parentale s -a confirmat prezența benzii de 180 pb, specifică formelor
rezistente, și deci s -a confirmat prezența genei Stb8 (liniile 8, 11, 13 și 14), pentru alte linii (2, 3,
6 si 9) s -a observat o segregare, la unii indivizi banda de 180 pb fiind prezentă , iar la alte linii (1,
4, 5, 7, 10 si 12) banda respectivă nu a apă rut, gena Stb8 fiind, deci, absentă (tabel 2).

Figura 3. Polim orfismul identificat de markerul Xgvm577 , L- ladder 100pb

Tabel 2.

Analiza geneti că realizată cu ajutorul markerului Xgwm577

Nr Nr. Genotipuri Marker Xgwm577
Observații
R I R II
Total RI
+ – R II
+ – Total
+ –
1 9 10 19 0 9 0
10 0 19 Rez.neconfirmată
2 8 9 17 1 7 0 9 1 16 Segregare
3 9 8 17 1 8 0 8 1 16 Segregare
4 10 6 16 0 10 0 6 0 16 Rez.neconfirmată
5 10 8 18 0 10 0 8 0 18 Rez.neconfirmată
6 8 8 16 3 5 0 8 3 13 Segregare
7 9 9 18 0 9 0 9 0 18 Rez.neconfirmată
8 2 8 10 2 0 8 0 10 0 Rez.confirmată
9 9 7 16 7 2 7 0 14 2 Segregare
10 9 7 16 0 9 0 7 0
16 Rez.confirmată
11 9 9 18 9 0 9 o 18 0 Rez. confirmată
12 7 5 12 0 7 0 5 0
12 Rez.neconfirmată
13 10 10 20 10 0 10 0 20 0 Rez. confirmată
14 10 10 20 10 0 10 0 20 0 Rez. confirmată
L=100pb
11.9 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 13.9
13.10 14.1 14.2 14.3 14.4 14.5 14.6 14.7 14.8 14.9 14 .10 15 16 17 21 L=100p b

14
Rezultatele obținute în urma testării markerului pSc H20 (F3/R3), marker specific
genomului de secar ă, sunt prezentate în tabelul 3. Acest marker este asoc iat introgresiilor
provenite de la secară în genomul grâului, fiind cunoscut faptul că rezistența graului la agentul
patogen Septoria tritici provine și de la secară. La unele linii parentale, considerate rezistente (2,
6, 7, 8, 10, 11, 13 si 14), banda d e 1400 pb a fost prezentă, iar la alte linii (1, 5 și 9) s -a observat
o segregare, confirmând prezența genelor de la secară în genealogia liniilor respective. Din
păcate, această observație este valabilă și în cazul a două soiuri considerate sensibile la
septorioză (17 și 21), banda de 1400 pb fiind prezentă. Se poate concluziona că existența
introgresiuniulor de la secară nu constitue o garanție a prezenței genelor de rezistență la
septorioză.
Tabel 3.
Analiza genetic ă realizată cu ajutorul markerului pSc H20
Nr
. Nr. Genotipuri Marker pSc H20 Observații
R I R II Total RI
+ – R II
+ – Total
+ –
1 9 10 19 – – 5 5 5 5 Segregare
2 8 9 17 – – 9 0 9 0 Rez.confirmat ă
3 9 8 17 – – 0 8 0 8 Rez.neconfirmată
4 10 6 16 – – 0 6 0 6 Rez.neconfirmată
5 10 8 18 – – 7 1 7 1 Segregare
6 8 8 16 – – 8 0 8 0 Rez.confirmată
7 9 9 18 – – 9 0 9 0 Rez.confirmată
8 2 8 10 – – 8 0 8 0 Rez.confirmată
9 9 7 16 – – 5 2 5 2 Segregare
10 9 7 16 – – 7 0 7 0 Rez.confirmată
11 9 9 18 8 1 8 1 18 0 Rez. confirmată
12 7 5 12 0 7 0 5 0
12 Rez.neconfirmată
13 10 10 20 10 0 10 0 20
0 Rez. confirmată
14 10 10 20 10 0 10 0 20
0 Rez. confirmată
15 Bulk 0
16 Bulk 0
17 Bulk + Banda prezentă
18 Bulk 0
19 Bulk 0
20 Bulk 0
21 Bulk + Banda prezentă
22 Bulk 0

În figura 4 se prezintă polimorfismul identificat cu ajutoru l markerului pSc H20 la unele
linii parentale considerate rezistente (6, 7 și 8) și sensibile (15 la 22). Acest marker, prin banda
de 1400 pb, specifică genomului de secară, ar putea să fie luat în considerare ca marker pentru
trierea genotipurilor de grâu rezistent/sensibil la septorioză. Afirmăm acest lucru deoarece liniile
parentale ce au prezentat această bandă (8, 11, 13 si 14) au fost confirmate ca purtătoare a unor
gene de rezistență și cu ajutorul markerului OPH20, specific genomului de secară, d ar și
markerului Xgwm577 asociat cu gena de rezistență Stb8.

15

Figura 4. Polimorfismul identificat de markerul pSc H20 , L- ladder 100 pb
5.2.2. Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile dihaploide
Au fost testate genotipic, cu ajutor ul markerilor SSR lincati cu gene de rezistență la
septorioză, linii dihaploide de grâu, obținute prin dublarea numărului de cromozomi ai
haploizilor rezultați dintr -un material hibrid. Utilizarea liniilor dihaploide se justifică prin faptul
că sunt stabi le în descendență, fixând în stare homozigotă recombinările rezultate în urma
hibridărilor. Este așteptat faptul ca în cadrul fiecărei linii să nu existe variablitate genetică, nici
segregare, astfel fiind posibilă efectuarea unei selecții a liniilor, nu a plantelor individuale.
În fig ura 5 sunt prezentate rezultatele obținute cu markerul Xgwm313, banda de 197 pb,
asociată genei de rezistență Stb7, a fost prezentă la unele linii dihaploide (5.5 și 6.2) și nu a fost
prezentă la celelate linii analizate (5.1 , 5.2, 5.4, 5.5, 5.7, 6.1, și 6.3).

Figura 5. Produșii de amplificare obținuți cu markerul Xgwm313, L – ladder 100 pb

La soiurile sensibile (19, 20 și 21) fiind prezentă alela de sensibiltate (200 pb) la gena
Stb7, excepție făcând doar soiul 18, la care a apărut bandă de 197 pb. Se poate aprecia deci că
linile 5.3 și 6.2 poartă gena de rezistență Stb7, totodată confirmându -se natura homozigotă a
liniilor dihaploide prin faptul că toate plantele individuale din cadrul liniei 6.2 poartă gena de
rezistență și toate plantele individuale din cadrul liniei 6.3 nu poartă această genă.
Pentru markerul Xgwm493 s -au obținut produși de marime asemanatoare între linile
dihaploide considerate a fi rezistente la septorioză și souirile sensibile. În cazul a două linii
dihaploide (9, 11) produșii au avut o marime diferită, 171 pb, față de produșii obținuți de la
liniile sensibile, intre 149 pb si 153 pb. Acest fapt poate conduce la încadrarea acestor linii ca
fiind purtătoare a genei de rezistență Stb2 (figur a 4). Se poate remarcă faptul că valorile obținute
de noi pentru marimea alelei de rezistență (171 pb) diferă de valorile obținute (125 pb) de către
Adhikari și colaboratorii lui (Adhikari et al., 2004b).

16

Figura 6. Produșii de amplificare obținu ți cu markerii Xgwm493 F/R, L – ladder 50 pb

Prin testarea markerului Xg wm577 (figura 7) asociat genei de rezistență Stb8, s-a obținut
un singur produs de amplificare la fiecare linie dihaploi dă testată având valori între 140 pb și 200
pb. La unele linii dihaploide (1 la 17; 20 ș i 21) a apărut o bandă cu dimensiuni cuprinse între 160
pb și 200 pb, considerată a fi alela de rezistență a genei Stb8. La două linii dihaploide
considerate rezistente la se ptorioză (18 ș i 19) și la linia sensibilă (23) a apărut banda de 146 pb,
considerată alela de sensibilitate la septorioză (Adhikari et al., 2003). În urma rezultatelor astfel
obținute se poate considera că liniile 18 și 19 nu poartă gena de rezistență Stb8, iar liniile
dihaploide notate de la 1 la 17, 20 si 21 sunt purtatoare a genei Stb8.

Figura 7. Produș ii de amplificare obținuți cu markerul Xgwm577 , L-ladder 50 bp
5.3. Rezultate privind atrib uirea markerilor moleculari R APD genelor de rezistență pe
baza cosegregă rii
5.3.1 Rezultate privind amplifi carea ADN -ului de la liniile parentale
În acest studi u am testat 14 linii ce prezintă rezistență la agentul patogen Septoria tritici ,
evidențiată în câmpul experimental ș i 8 soiuri considerate a fi sensibile la acest agent patogen. Al
doilea obiectiv al p rezentei teze a fost acela de atribuire a markerilor molec ulari RAPD genelor
de rezistență Stb pe baza cosegregarii.
Dintre c ei 20 primerii random testați, 11 primeri au evidențiat diferențe între populațiile
bulk 1 -14 a formelor parentale ce prezintă re zistență, comparativ cu formele parentale
caracterizate a nu avea r ezistență la septorioză (15 -22).
5.3.2. Rezultate privind amplificarea ADN -ului de la liniile dihaploide
Prin amplificarea ADN -ului provenit de la cele 9 linii di haploide cu primerul OPH 20 s-a
obținut banda de 1400 pb la unele proveniențe. Banda nu a apărut la 2 linii parentale fără
rezisten ță luate ca referință (figura 8).
În cazul amplificarii cu prime rii OPAB 18 și OPB 08 s-a obținut o bandă de 1200 pb la
liniile dihaploide testate, band ă ce nu ap are la forma sensibilă de referință. Și în cazul
amplificării cu primerul Mic 14, OPC13 și OPC 10 s-au obținut , de asemenea , benzi polimorfice

17
între liniile dihaploide și formele sensibile la septorioză (Curticiu et al., 2007; 2009) .

Figura 8. Polimorfismul obținut cu primerul OPH 20, L= 100 pb
5.4. Rezultate privind atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistență pe
baza metodei BSA
5.4.1. Obț inerea materialului hibrid
Pentru realizarea celui de al treilea obiectiv al aces tei teze formele parentale rezistente au
fost incrucisate cu unele forme parentale sensibile pela agentul patogen S. tritici , astfel au fost
obtinuti hibrizii F 1, care s -au autopolenizat, rezultând generația segregantă F2 (tabel 4).

Tabel 4.
Generația F 2 segregantă obținută în câmpul experimental
Nr. Combinații
hibride Genealogie
Părinți rezistenți x Părinți sensibili
1. P1 X P16 ALTAR 84/Aegilopsis squarosa (219)/2 SERI/3/F96869G1 -1
x DELABRAD
2. P4 X P16 FARMEC/Aegilopsis squarosa x DELABRAD
3. P5 X P16 CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1 -3
x DELABRAD
4. P6 X P16 CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202 /3/Bucur/4/ Jiana
x DELABRAD
5. P8 X P16 TAM1074/T.Timopheevi(TA870),(KSWGRC36)/Glosa
x DELABRAD
6. P5 X P17 CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1 -3 x F96869G1 -108 x
DELABRAD
7. P6 X P17 CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x F96869G 1-108
8. P9 X P17 T. Timopheevi/T. Monococum/2 F132/3/2 Crina x F96869G1 -108

5.4.3. Atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenta la Septoria tritici pe baza
metodei BSA
În acest studiu am folosit metoda Bulk Segregant Analysis , metoda ce presupune izolarea
individuală a ADN -ului de la câte cinci -zece plante aparținând fiecărui grup (sensibil respectiv
rezistent), amestecarea, în cantități egale, în cadrul fiecărui grup a ADN -ului obținut de la
plantele individuale, pentru a obține cele do uă bulkuri cu ADN, specifice celor două grupuri de
plante ( Michelmore et al., 1991) . Urmează amplificarea ADN -ului de la cele două bulk -uri cu
primeri decameri, separarea produșilor de amplificare prin e lectroforeză în gel de agaroză,
analiza polimorfismul ui molecular și atribuirea benzlor polimorfe prezente la forma rezistentă și
absente la forma sensibilă, genelor de rezistență.
În cazul de față s-a efectuat i zolarea ADN -ului de la cele două grupuri și î n cadrul
fiecarui grup ADN -ul a fost amestecat (bu lk). Pasul urmator a fost amplificarea ADN -ului cu
mai mulți primeri decameri, dintre care 4 au evidențiat polimorfism între cele două grupuri,

18
polimorfism constând în prezența/absenț a uneia sau mai multor benzi. Markerii mol eculari
trebuie sa fie linkati în faza de cuplare cu gena de rezistență, adică gena ș i markerul trebuie să fie
înlanțuiți în același cromozom, banda polimorfă trebuie să fie prezentă la forma rezistentă și
absentă la forma sensibilă .
Astfel de rezultate au fost obținute în urma testări i markerilor OPC04 și OPA11 și al
migră rii produșilor de amplificare î n gel de agaroză . În alte situații acesta condiție nu a fost
indeplinită, adică banda polimorfă a fost prezentă la forma sensibilă și a lipsit la forma rezistentă .
5.4.4. Stabilirea rel ațiilor de linkage dintre markeri RAPD atribuiți genelor de rezistență
și genele de rezistență la STB
În acest studiu am urmărit stabilirea relațiilor de linkage între markeri moleculari de tip
RAPD și genele de rezistență Stb prin metoda analizei descend enților F 2. Descendenții F 2 sunt
rezultați din diferite încrucuișări între părinți ce prezintă rezistență la septorioză cu parinți ce
sunt sensibili la acestă boală. Prin testarea markerilor RAPD, produșii de amplificare sunt
migrați în gel de agaroză, ia r genotiparea plantelor individuale pentru rezistență poate fi
asigurată de prezența sau absența benzii marker în gel. La grâu gena de rezistență și markerul au
fost înlanțuite în faza de cuplare:
Tabel 5 .
Stabilirea relațiilor de link age dintre marker ș i genă
TIP PARENTAL TIP
RECOMBINAT
TOTA L
Marker
Combinația
hibridă
Plante
Rezistente
cu banda
polimorfă
(x pb) Plant e
Sensibile
fară
banda
polimorf
ă (x pb) Plante
Sensibile
cu banda
polimorf
ă (x pb) Plante
reziste
nte fară
banda
polimo
rfă (x
pb)
OPA 11 P9 X P17 50
(1072 pb) 28 12 30 120
OPC 13 P9 X P17 61
(350 pb) 28 12 19 120
OPC 04 P6 X P17 38
(510 pb) 19 9 14 80

1. Pentru combinația hibridă P9 X P17 testat ă cu markerul OPA 11, frecvența fenotipului
dublu recesiv este de 21.6% (sau 0.216) De aici rezultă că frecvența gameților de tip
parental este: 2√0.216 = 0.931 , iar frecvența gameților de tip recombinant este de 1 – 0.931=
0.0690. Așadar distanța dintre genă și markerul OP A11 este de 0.069 unitați de recombinare
(6 cM).
2. Pentru combinația hibridă P9 X P17, testată cu markerul OPC 13, distanța dintre genă și
marker este de 3 cM.
3. Pentru combinația hibridă P6 X P17 testată cu markerul OPC 04 s -au obținut distanța de 2
cM intre genă si marker.
Odată cu identificarea acestor markeri linkați cu rezistența la septorioză selecția asistată
de markeri poate fi realizată din fazele timpurii de dezvoltare a plantelor, înlăturând astfel

19
deficiențele cauzate de timp și nemaifiind nevoie de realizarea infecțiilor artificiale cu agentul
patogen.
5.5. Rezultate preliminare privind clonarea produșilor de amplificare
Ultimul obiectiv al cercetărilor noastre constă în clonarea ADN -ului din benzile
polimorfe obținute prin amplificarea ADN -ului cu markeri RAPD, fiind continuarea celui de al
doilea obiectiv propus și realizat, adică atribirea markerilor RAPD genelor de rezistență pe baza
cosegregării. Pentru relizarea acestui obiectiv s -a realizat amplificarea ADN -ului provenit de la
liniile rezi stente la septorioză cu markeri RAPD care au fost atribuiți genei de rezistență. Pentru
amplificarea ADN -ului s -au utilizat trei markeri RAPD (OPH20, OPC04 și OPC13). Produșii de
amplificare PCR obținuți au fost introduși în vectorul de clonare linearizat pGEM -T – Easy
Vector, iar reacția de ligare s -a realizat peste noapte la temperatura de 40C într -un volum de
reacție de 10µl (1µl pGEM -T – Easy Vector, 6µl produs PCR, 1µl T4 AND ligază, 1µl tampon
de ligare 10x, 1µl ddH 2O). Au fost folosiți și vectorii d e clonare pJET 1.2/blunt și PTZ57R/T.
Transformarea bacteriană gazdă a ADN -ului recombinant s -a realizat cu kitul Transform AidTM
Bacterial kit.

Figura 9. Produșii de amplificare obținuți cu markerii RAPD: OPH20, OPC04 și OPC13
la câteva linii d ihaploide de grâu (5.3, 5.7, 6.1, 6.1, 6.3) și linii parentale de grâu (8,11,13,14) cu
rezistență de câmp la Septoria tritici

Coloniile albe apărute au fost verificate prin amplificare PCR într -un amestec de reacție
ce conține: 10xTaq buffer, dNTP mix, Fo rward primer, Reverse primer, Taq polymeraza și
ddH 2O și au fost subcultivate în continuare pe mediu selectiv. Ca bacterii gazdă am utilizat două
tulpini de E. coli : JM 109 și GM 2163, rezultatele cele mai bune fiind obținute folosind tulpina
GM 2163.
În figura urmatoare sunt prezent ate coloniile albe (cu insert) ș i albastre (fara insert)
rezultate prin folosirea vectorului PTZ57R/T ( InsTAcloneTM PCR Cloning kit) , iar î n figura 1 1
sunt prezentate colonii albe obtinute prin folosirea vectorului pJET 1.2/blunt.

Figura 1 0. Colonii bacteriene (fără insert – coloniile albastre / cu insert – coloniile albe)
transformate cu vectorul PTZ57R/T (imagine stanga) si cu vectorul pGEM -T (imagine dreapta)

20

Figura 1 1. Colonii bacteriene albe (cu insert) ob ținute cu vectorul pJET 1.2/blunt

Prin folosirea vectorului pJET 1.2/blunt (CloneJETTM Cloning Kit ) au fost obținute
colonii albe ce au pasager integrat în vector. Prin folosirea vectorului pJET 1.2/blunt
(CloneJETTM Cloning Kit) au fost obținute colonii albe ce au pasager integrat în vector. S-au
recoltat câteva colonii ce au fost multiplicate pe mediu LB cu ampicilină în vederea izolării
ADN -ului plasmidial, urmând amplificarea secventelor clonate cu primerii specifici vectorului,
ce flancheaza aceste secvenețe (pJET1 și pJET1R).
Clonarea a reușit la banda de 350 pb pornind de la amplificarea ADN -ului parental
(proveniența 6) cu primerul OPC03 folosind kitul CloneJETTM Cloning Kit . ADN -ului
plasmidial izolat a fost secvențiat în laboratoarele firmei Mycrosinth (Elveția), urmând
construirea de primeri specifici, pentru convertirea markerului molecular RAPD în marker
SCAR.
CONCLUZII

Concluzii privind relizarea primului obiectiv propus în prezenta teză de doctorat –
testarea unor markeri de tip microsatelit – SSR în vederea selecției pentr u rezistența grâului la
septorioză:
 Izolarea ADN -ului s -a efectuat conform protocolului care utilizează CTAB, cantitatea și
puritatea ADN -ului obținut a fost bună;
 Markerii moleculari SSR au fost utilizați cu succes pentru selecția din cadrul unor
descende nțe segregante a indivizilor purtători a unor alele de rezistență la Septoria, precum și
pentru selecția liniilor dihaploide purtătoare a unor gene de rezistență:
 În cazul liniilor dihaploide s -a stabilit cu ajutorul markerilor moleculari SSR, că majoritat ea
acestora poartă, cel puțin, o genă de rezistență, mai frecvent întâlnite fiind genele Stb7 și Stb8
și posibil Stb4. Mai puțin frecvent s -a întâlnit gena Stb2. Pentru genele Stb1, Stb3, Stb5 și
Stb6 rezultatele nu sunt concludente. Plantele individuale d in cadrul fiecări linii nu au
segregat (imaginea electrtoforetică a fost monomorfă) confirmând natura lor homozigotă.
Concluzii privind relizarea celui de al doilea obiectiv propus în prezenta teză de doctorat
– atribuirea markerilor RAPD pe baza cosegreg ării:
 Markerii RAPD testați au dat o bună amplificare la toate genotipurile studiate: dintre cei 20
de markeri testati, 11 au evidențiat polimorfism la populatiile bulk provenite de la liniile
recombinante rezistente la septorioză, față de formele parenta le caracterizate a fi sensibile:
 Benzile polimorfe obținute sunt considerate a fi candidate de markeri moleculari pentru
genele de rezistență la Septoria tritici .
Concluzii privind relizarea celui de al treilea obiectiv propus în prezenta teză de doctorat
– atribuirea markerilor RAPD pe baza metodei BSA:
 S-a obtinut un număr de 8 combinatii hibride F 2 care au fost supuse infecțiilor artificiale cu
spori de S. tritici .
 S-au efectuat analize moleculare asupra bulk -urilor de la plantele rezistente și sensibile cu
markeri RAPD și au fost atribuiți markeri random genelor de rezistență la septorioză .

21
 S-au stabilit relații de linkage dintre markeri RAPD atribuiți genelor de rezistență și genele
de rezistență la septorioza:
Concluzii privind relizarea celui de al pa trulea obiectiv propus în prezenta teză de
doctorat – clonarea benzilor polimorfe atribuite genelor de rezistență în vederea convertirii
markerilor RAPD în markeri SCAR:
 Folosind kitul CloneJETTM Cloning Kit s-a reușit clonarea ADN -ului de la provenienta 6
de ADN parental cu rezistență la septorioza, folosind markerul RAPD – OPC13 (banda
polimorfică de 350 pb). După clonarea și secvențierea ADN -ului sunt construiți markeri SCAR.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

ADHIKARI, T.B., J.M. ANDERSON, S.B. GOODWIN, 2003, Ide ntification and
molecular mapping of a gene in wheat conferring resistance to Mycosphaerella graminicola , In:
Phytopathology, 93(9): 1158 -1164
ADHIKARI, T.B., H. WALLWORK, S.B. GOODWIN, 2004b, Microsatellite Markers
Linked to the Stb2 and Stb3 Genes for Re sistance to Septoria tritici Blotch in Wheat. Crop Sci.,
44:1403 -1411
AGRIOS, G. N., 1997, Plant Pathology 4th edition, Academic Press, p. 286 -289; 310
ALEXANDRI, Al., M. OLANGIU, M. PETRESCU, I. POP, E. RĂDULESCU, C.
RAFAILĂ, V. SEVERIN, 1969, Tratat de fitopatologie agricolă vol.II, Editura Academiei
Republicii Socialiste România p. 78 -84
AO, H.C. & GRIFFITHS, 1976, Change in virulence of Septoria nodorum and S. tritici
after passage through alternative hosts, Transactions of British Mycological Society 66: 337 -340
ARRAIANO, L.S., L. CHARTRAIN, E. BOSSOLINI, H.N. SLATTER, B. KELLER,
J.K.M. BROWN, 2007, A gene in European wheat cultivars for resistance to an African isolate
of Mycosphaerella graminicola , Plant Pathology 56, 73 –78. doi: 10.1111/j.1365 –
3059 .2006.01499.x
ARRAIANO, L.S, A. J. WORLAND, C. ELLERBROOK, J.K.M. BROWN, 2001,
Chromosomal location of a gene for resistance to Septoria tritici blotch ( Mycosphaerella
graminicola ) in the hexaploid wheat ‘Synthetic 6x’, Theoretical and Applied Genetics 103, 758 –
764. doi: 10.1007/s001220100668
BOTEZ C., DANA CURTICIU, LAURA COTA, 2008, Dihaploid wheat lines se lection
with SSR marker for Septoria tritici resistance, Buletinul USAMV -CN, 65/2008, ISSN 1454 –
2382
BOTEZ C., DANA CURTICIU, LAURA COTA, N.N. SAULESCU, 2009, Marker
assisted selection for Septoria tritici resistance in wheat dihaploid lines, Not. Bot. Ho rt. Agrobot.
Cluj, 37:253 -255
BOTEZ, C., N.N. SĂULESCU, MONICA IUORAȘ, P. RAICA, 2006, Preliminary
results to the marker assisted selection for disease resistance of common wheat (Triticum
aestivum), Buletin USAMV -CN, 63/2006
BRADING, P. A, E.C.P. VERSTAPPEN, G.H.J. KEMA, J.K.M. BROWN, 2002, A
gene -for-gene relationship between wheat and Mycosphaerella graminicola , the Septoria tritici
blotch pathogen. Phytopathology 92, 439 –445. doi: 10.1094/PHYTO.2002.92.4.439
BROKENSHIRE T., 1975, Wheat seed in fection by Septoria tritici , Transactions of the
British Mycological Society 64: 331 -334
BROKENSHIRE T., 1976, The reaction of wheat genotypes to Septoria tritici , Annals of
Applied Biology 82: 415 -423
CEAPOIU, N., F. NEGULESCU, 1983, Genetica și amelior area rezistenței la boli a

22
plantelor, Editura Academiei Rep. Socialiste Romania
COLLARD, B.C.Y., M.Z.Z. JAHUFER, J.B. BROUWER, E.C.K. PANG, 2005, An
introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker -assisted selection for
crop impr ovement: The basic concepts, Euphytica 142, 169 -196, doi: 10.1007/s10681 -005-1681
CURTICIU DANA MARIA, BALAZS ERIKA, BRICIU DANIELA, BR ICIU C. A.,
TAOUTAOU A., POP TIBERIA, GANEA STEFANA, COTA LAURA, BOTEZ C., 2009,
RAPD and SSR marker selection for some dihaploid wheat lines for Septoria tritici resistance,
Journal of Horticulture, Forestry and Biotehnology 13: 114 -117
CURTICIU DANA MARI A, C. BOTEZ, COTA LAURA, LUCACI MEDA, 2007,
Marker asisted selection for Septoria tritici resistance of common wheat , Buletinul USAMV -CN,
64/2007, ISSN 1454 -2382
CURTICIU DANA MARIA, DANIELA TRIFAN, AL. C. BRICIU, ERIKA BALAZS,
LAURA COTA, C. BOTEZ, 2008 , General aspects regarding Septoria tritici blotch on wheat,
Buletinul USAMV -CN, 65/2008, ISSN 1454 -2382
DANCER, J., A. DANIELS, N. COOLEY, S. FOSTER, 1999, Septoria tritici and
Stagnospora nodorum as model pathogens for fungicide discovery, In: Lucas, J.A., P. Bowyer,
& H.M. Anderson (Eds.), Septoria on cereals: A s tudy of pathosystems, pp. 316 -331, CABI
Publishing, Cambridge
DORDEA, MANUELA, N. COMAN., CORNELIA CRACIUNAȘ, C. ANDRAȘ, 2003,
Genetică Generală și Moleculară – abordare practică, Presa Universitară Clujană
DUDLEY, J. W., 1993, Molecular markers in plant im provement: Manipulation of genes
affecting quantitative traits, Crop Science 33: 660 -668
EYAL, Z., 1999, The Septoria tritici and Stagnospora nodorum blotch diseases of wheat,
Eur. Journal of Plant Patholology 105:629 -641
EYAL, Z., A.L. SCHAREN, J.M. PR ESCOTI, M. van GINKEL, 1987, The Septoria
diseases of wheat: Concepts and methods of disease management, Mexico, D.F: CIMMYT
GOODWIN, S.B, 2007, Back to basics and beyond: increasing the level of resistance to
Septoria tritici blotch in wheat, Australian Plant Pathology, 36, 532 -538
JACKSON, L.F., J. DUBCOVSKY, L.W. GALLAGHER, R.L. WENNIG, J. HEATON,
2000, Regional barley and common and durum wheat performance tests in California,
Agronomy Progress Report 272: 1 -56
JONES, D., & B.M. COOKE, 1969, The epidem iology of Septoria tritici and Septoria
nodorum. 1. A tentative key for assessing Septoria tritici infection on wheat heads, Trans. Br.
Mycol. Soc. 53, 39 -46
KEMA, G.H.J., J.G. ANNONE, T. SAYOUD, C. van SILFHOUT, M. van GINKEL, J.
de BREE, 1996, Genetic variation for virulence and resistance in the wheat – Mycosphaerella
graminicola pathosystem, I. Interaction between pathogen isolates and host cultivars,
Phytophatology 86, 213 -220. Doi: 10.1094/Phyto -86-213
KING, J.E., R.J. COOK, S.C. MELVILLE, 1983, A review of Septoria diseases of wheat
and barley, Ann. Appl. Biol. 103:345 -373
McCARTNEY, C.A., A.L. BRULE -BABEL, L. LAMARI, D.J. SOMERS, 2003,
Chomosomal location of a race -specific resistance gene to Mycosphaerella graminicola in the
spring wheat ST6, I n: Theoretical and Applied Genetics, 107,1181 -1186
MICHELMORE, R.W., I. PARAN, R.V. KESSELI, 1991, Identification of markers
linked to disease -resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect
markers in specific genomic regions by using segregating populations, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, Genetics, p. 9828 -9832
MINCU, M., 1999, Response of winter wheat genotypes to artificial inoculation with
several Septoria tritici populations, In: Septoria and Stagnosphora diseases of ce reals: A
compilation of global research, CYMMIT, Mexico, p.167 -170

23
O'BRIEN, S. J., 1990, Genetic Maps, Cold Spring Harbor Lab., NY, vol. 6
PALMER, CLAIRE -LOUISE & WENDY SKINNER, 2002, Mycosphaerella
graminicola : latent infection, crop devastation and genom ics, Molecular and Plant Pathology
PATTERSON F.L., G.E. SHANER, D.M. HUBER, H.W. OHM, R.E. FINNEY, R.L.
GALLUN, J.J. ROBERTS, 1979, Registration of Sullivan wheat, Crop Science 19: 297
PATTERSON F.L., J.J. ROBERTS, R.E. FINNEY, G.E. SHANER, R.L. GALLUN,
H.W. OHM, 1975, Registration of Oasis wheat, Crop Science 15: 736 -737
RIBAUT, J.M. &D. HOISINGTON, 1998, Marker -assisted selection: New tools and
strategies, Trends Plant Science 3: 236 –239.
RILLO A.O. & R.M CALDWELL, 1996, Inheritance of resistance to Septoria tritici in
Triticum aestivum subsp. vulgare , Bulgaria 88, Phytopathology 56:597
SIVANESAN, A., 1990, Mycosphaerella graminicola , Mycopathologia 109:51 -53
SOMASCO, O.A., C.O. QUALSET C.O., D.G. GILCHRIST, 1996, Single -gene
resistance to Septoria tric i blotch in the spring wheat cultivar ‘Tadinia’, Plant Breeding 115:261 –
267. doi: 10.1111/j.1439 -0523.1996.tb00914.x
WILLIAMS, J.G.K., A.R. KUBELIK, K.J. LIVAK., 1990, DNA Polymorphism
Amplified by Arbitrary Primers are useful as genetic markers, Nucleic Acids Res. 18:6231 -6235
WINTER, P., G. KAHL, 1995, Molecular marker technologies for plant improvement,
World Journal of Microbiology and Biotechnology 11: 438 -448

http://www.omafra.gov.on.ca/french/crops/facts/90 -008f4.jpg
http://www.freefoto.com/i mages/07/45/07_45_66 –Wheat_web.jpg
http://www.ksre.ksu.edu/library/plant2/EP133.pdf
http://www.hgca.com/hgca/wde/IMAGES/ Septoria%202.JPG
http://www.hgca.com/minisite_manager.output/3619/3619/Cereal%20Disease%20Encyclopedi a/
Diseases/Septoria%20Leaf%20Blotch.mspx?minisiteId=26

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY
MEDICINE CLUJ NAPOCA
DOCTORAL SCHOOL
FACULTATY OF AGRICULTURE

Biologist DANA M. BOTA (CURTICIU)

MARKER ASSISTED SELECTION FOR DISEASE
RESISTANCE OF COMMON WHEAT ( TRITICUM
AESTIVUM ) TO SEPTORIA TRI TICI BLOTCH
(SEPTORIA TRITICI )

(SUMMMARY OF THE Ph.D. THESIS)

SCIENTIFIC COORDINATOR
Prof. Univ. Dr. CONSTANTIN BOTEZ

CLUJ -NAPOCA
2010

25

CUPRINS
SUMMARY ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 26
CHAPTER I ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 26
1.1. Pathogen agent and simptomatology ………………………….. ………………………….. ………….. 26
1.2. Methods o f disease control ………………………….. ………………………….. ……………………….. 27
1.3. Genetic determinism of wheat resistance to septoria tritici blotch ………………………….. . 27
CHAPTER II ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 28
2.1. Characteristics and classification of molecular markers ………………………….. ……………….. 28
2.2. Application of molecular markers in plant breeding ………………………….. …………………….. 28
CHAPTER III ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 29
3.1. Marker assisted selection ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 29
3.2. Award mar kers to genes of interest ………………………….. ………………………….. ……………….. 29
CHAPTER IV ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 29
4.1. Aim and objectives ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 29
4.2. Biological material ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 29
4.3. Working methods ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 30
4.3.1. DNA isolation and quantification ………………………….. ………………………….. …………… 30
4.3.2. DNA amplification using RAPD markers ………………………….. ………………………….. … 30
4.3.3. DN A amplification using SSR markers ………………………….. ………………………….. …… 30
4.3.4. Electrophoresis ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 30
4.3.5. Image capture and analysis ………………………….. ………………………….. ……………………. 30
4.3.6. Maintenance, multiplication and conservation of Septoria tritici isolates ……………… 31
4.3.7. Bulk Segregant Analysis ………………………….. ………………………….. ……………………….. 31
4.3.8. DNA cloning from polymorphic bands ………………………….. ………………………….. ……. 31
4.3.9. Obtaining F2 generation from parental crossing ………………………….. ……………………. 31
CHAPTER V ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 31
5.1. Results regarding DNA isolation ………………………….. ………………………….. ………………….. 31
5.2. Results regarding septoria tritici blotch disease resistance on wheat using SSR technique
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 31
5.2.1. Results regarding DNA amplification on parental lines ………………………….. …………. 31
5.2.2. Results regarding DNA amplification on double haploid lines ………………………….. .. 32
5.3. Results regarding assigning of RAPD markers to resistance genes based on cosegregation
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 32
5.3.1. Results regarding DNA amplification on parental lines ………………………….. …………. 32
5.3.2. Obtaining hybrid mat erial ………………………….. ………………………….. ……………………… 33
5.4. Establishing linkage relationships between assigned RAPD markers and STB resistance
genes ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 33
5.5. Results regarding cloning of amplification products ………………………….. ……………………. 34
CONCLUSIONS ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 34

26
SUMMARY

Object of the PhD thesis is th e wheat disease Septoria tritici blotch, whi ch has been
studied in order to identify molecula r markers linked to resistance genes to the disease , using
molecular biology technique, especially using m olecular markers. Testing was done mainly
using RAPD and SSR marker assisted selection to achieve the resistance of common wheat
(Triticum aestivum ) to Septoria tritici pathogen .
Bread wheat is the most widely grown and consumed food crop in the world. This cereal
is attacked by many pathogens of which one of the most common is Mycosphaerella
graminicola (anamorph Septoria tritici ) causing septoria tritici blotch disease. S. tritici is
considered to be more confined to Mediterranean -type climates (wet wint ers with temperate
temperatures). In our country this disease can occur during the rainy autumns and springs,
damage can reach 10 -15% of the wheat yield. Wheat breeding is focused on developing widely
adapted, disease -resistant genotypes with high yields a nd grain quality that are stable across a
wide range of environments. Incorporating durable resistance is a priority since breeding for
stable yields without adequate resistance against the major diseases would be impossible.
This pathogen is now an impo rtant cause of wheat disease i n Europe. Despite its
economic importance, molecular basis of virulence and pathogenicity of the pathogen are not
fully known (Palmer & Skinner, 2002) . Several d isease control methods, such as chemical
control and breeding for resistant cultivars, are taken in use to control this disease. T he use of
fungicides is linked to a number of disadvantages that cannot be overlooked: – are expensive,
their production requires large quantities of raw materials and energy -intensive; – chemical
treatments should be repeated every year, and some are harmful to the environment, etc.

CHAPTER I
1.1. Pathogen agent and simptomatology
Mycosphaerella graminicola is a plant pathogenic bipolar heterothallic ascomycete
(Kema et al., 1996) that causes septoria tritici leaf blotch of wheat. The researchers deal with
genetic, cultural and chemical control measures which is one of the major means for protecting
wheat production . In Romania most currently grown wheat cultivars are more or less susceptible
to Septoria tritici , therefore, resistance to this pathogen is a highly -priority breeding goal
(Mincu, 1999). The fungus reproduces both sexually and asexually, primary infections being
initiated by airborne ascospores, which are produced in pseudothecia. Primary inoculum for the
wheat diseases caused by these pathogens is most often airborne ascospores, but may also be
wind – and rain -borne conidia. Symptoms typically appear within 14 -21 days after initial
infection and there can be many cycles of asexual re production during the course of an epidemic .
New sources of resistance are required as only a few varieties currently available have
adequate levels of resistance. Location o f resistance in synthetic wheat is interesting because
they are relatively easy to cross with common wheat and their resistance can be introgressed into
agronomically acceptable genotypes and combined with other resistances. Chromosomal
location of the resistance is the step preceding the development of recombinant chromosome
lines and mapping genes.
Higher levels of resistance are supposed to be genetically or epidemiologically linked to
late heading and tallness. The presence of genetic linkages can complicate the breeding for early
heading, short cultivars resistant to septoria triti ci blotch. It is also necessary to know to what
extent resistance is present against a wide spectrum of isolates and whether that resistance is
expressed at all stages of plant development. Furthermore, some cultural practices, such as N –
fertilisation may modify the expression of the disease. Also the relation between disease
response and yield loss is not fully clarified.

27
Incidence of S. tritici depends on cultivar susceptibility, inoculum availability, crop
management practices, and favorable environment al conditions (low temperature, high humidity,
and frequent rain). Climatic factors, especially precipitation, affect fungal growth and the amount
and timing of spore production, as well as the release, dispersal, and deposition of spores. This
fungus is p athogenic on number of Triticum spp. and causes severe yield losses on bread wheat
(Triticum aestivum ) in most places where this crop is grown (Eyal et al., 1987).
1.2. Methods of disease control
The economic impact of this pat hogen on wheat production (yield and quality) has
become more pronounced in part due to the increased genetic resistance of wheat to other foliar
pathogens, su ch as rusts and powdery mildew and low resistance of cultivars. The distribution of
this patho gen is dependent on wheat debris management and the involvement of both airborne
and splash -dispersal mechanism should dictate measures to reduce the amount of infected debris
in the wheat cropping systems. Disease severity can be modified by various cultural practices:
crop rotation is a k ey factor affecting the health and productivity of future wheat crops (Cook &
Veseth, 1991) .
Researchers recommended proper crop rotation in combination with other practices to
reduce the severity of Septoria diseases , tillage operation such as plowing h ave been
recommended as a means to reduce residue (King et al., 1983). Cultural practices that reduce
wheat residue through plowing, burning, removal for feeding, crop rotation, etc., help remove the
major source of primar y inoculum (Eyal et al., 1987). Management of the disease is by planting
of resistant cultivars when avai lable or, when feasible economically, by spraying fungicides. A
variety of fungicides are recommended and used to control septoria tritici blotch: Bravo 500 SC,
Artea 330 EC, Prosaro 25 0 EC, Falcon 460 EC, etc. It is undeniable that in combating chemicals
were obtained some good results, but the use of fungicides is linked to a number of
disadvantages that cannot be overlooked:
 fungicides are expensive, their production requires large quantities of raw materials and
energy -intensive; chemical treatmen ts must be repeated every year or several times a year;
 some are phytotoxic to certain varieties of the same culture and can be toxic to animals,
especially mammals and humans;
 can change the ecological balance by polluting the atmosphere, soil and water;
 favor the emergence of new forms of pest resistance to fungicides as a result of directional
selection pressure or mutagenic action of chemicals on the parasites.
Integrated control is to combine all the above control methods, with a series of m easures
aimed to minimize the rate of infections and strengthen the capacity of plant development and
therefore their natural resistance. Implementation of all cultural hygiene measures, such as:
burying plant debris, plowing, sowing, and weed control are recommended and used in
controlling the pathogen (Ceapoiu et al., 1983).
1.3. Genetic determinism of wheat resistance to septoria tritici blotch
More than 12 resistance genes have been mapped, with one or more associated molecular
markers each. Stb1 named by Wilson in 1985 was identified on the wheat cultivar Bulgaria 88 by
Rillo and Caldwell (1966); genes Stb2 and Stb3 were identified in Australia by Wilson (1985),
and were derived originally from cvv. Veranopo lis and Israel 493 . Stb4 gene was discovered in
cv. Tado rna by Somasco et al. in 1996, and Stb8 gene was discovered in Synthetic W7984
wheat, mapped on 5Bl, 3BS, 6DS, 7DS and 7BL chromosomes.
The Stb1 gene was incorporated into the Indiana soft r ed winter cvv. Oasis (Patterson et
al., 1975, 1979), this gene provided long -lasting resistance to wheat in Indiana and other parts of
the Midwest US. The Stb4 gene was bred into Tadinia cv. And was effective for 15 years
(Somasco, 1996), but this resistan ce broke down by 2000 (Jackson et al., 2000) and cultivars that
contain it now are considered susceptible.
These genes are distributed on 10 wheat chromosomes, occurring equally on the A, B and

28
D genomes (Goodwin S.B., 2007).
CHAPTER II
2.1. Characteristi cs and classification of molecular markers
Genetic markers represent genetic differences between individual organism or species;
generally, they do not represent the target genes themselves but act as “signs” or “flags”. Genetic
markers are located in clo se proximity to genes (“tightly linked”) may be referred to as gene
“tags”. These markers do not affect the phenotype of the trait of interest because they are located
only near or “linked” to genes controlling the trait. All genetic markers occupy specifi c genomic
positions within chromosomes (like genes) called “locus/loci”. There are three major types of
genetic markers:
► Morphological (classical or visible) – themselves are phenotypic traits or characters, for
example: flower colour, seed shape or pigmen tation;
► Biochemical – include allelic variants of enzymes called isozymes (differences in enzymes),
can be detected by electrophoresis and specific staining;
► DNA or molecular – reveal sites of variation in DNA.
Molecular markers are the most widely used type of marker predominantly due to their
abundance, they arise from different classes of DNA mutations such as: substitution mutations
(point mutation), rearrangements (insertion or deletions) or errors in replication of tandem
repeated DNA . These marker s are selectively natural because they are usually locat ed in non –
coding regions of DNA; also they are practically unlimited in number and are not affected by
environmental factors and/or the developmental stage of the plant (Winter & Kahl, 1995).
2.2. App lication of molecular markers in plant breeding
Using classical breeding methods the results obtained are dependent, in addition to other
factors, to the ability to differentiate genetic variations because most of the characters are
strongly influenced by the environmental conditions. Between different methods used the
possibility to identify phenotypic characters with simple genetic determinism and that are less
influenced by environment and associated with important traits, are great interest to the bree ders.
These characters, named genetic marker or marker genes, are and has been used to improve
efficiency of breeding programs.
Identification of a new class of genetic markers, molecular markers, represents a truly
revolutionary event in plant improvem ent methodology. Strategies using molecular markers
reveal polymorphism ; this molecular polymorphism is due to largely change of the amount of
repetitive DNA in plants genome .
Molecular markers are widely accepted as potentially valuable tools for crop
improvement in rice wheat , maize , barle y, oilseeds and pasture species . Some studies suggest
that molecular markers will play a vital role in enhancing global food production by improving
the efficiency of conventional plant breeding programs (Kasha, 1999; Ortiz, 1998). The most
important applications of molecular markers in plant breeding are the marker assisted selection,
detecting diversity and genetic differences between populations.

29

CHAPTER III
3.1. Marker assisted selection
Molecular markers that ar e tightly linked to genes of interest to breeders could be used
for marker assisted selection (Ribaut & Hoisington, 1998). The major breeding goals of mapping
and tagging genes are to perform indirect selection for desired traits using the linkage between
the target gene and a molecular marker, called marker assisted selection (MAS). MAS consist of
identification of a tight linkage between genes controlling agronomic traits and molecular
markers, and the use of these markers to improve lines or cultivars (D udley 1993). The
availability of marker systems suitable for large -scale application of MAS and the ability to
analyze vast numbers of plants in a time -adequate and cost -effective manner is one of the major
constraints in MAS implementation .
3.2. Award mar kers to genes of interest
Assigning markers to the gene can be done in three ways:
1. Cosegregation – analyzing the relationship of linkage between marker and gene of interest: if
the distance between marker and gene is small, marker gene is assigned;
2. Near Izogenic Lines – obtained by backcross method ;
3. Bulk S egregated Analysis – method involving F2 generation obtained by crosses between two
extreme forms: a resistant plant and sensitive plant that proved to be polymorphic at the
molecular level (Michelmore e t al., 1991). F2 generation individuals are group ed on susceptible
and resistant individuals; two bulked DNA samples are generated, each bulk contains individuals
that are identical for a particular trait or genomic region, but arbitrary at all unlinked regions.
The two bulks are screened for differences using molecular markers: if molecular polymorphism
is revealed (an extra band) that means that molecula r markers can be assigned to the gene that
selection has been made. This system works only if gene selection is made is in coupling phase
with molecular markers.
CHAPTER IV
4.1. Aim and objectives
The aim of this thesis was to find new molecular markers linked with common wheat
(Triticum aestivum ) resistance genes to septoria tritici blotch ( Septoria tritic i) using marker
assisted selection (MAS).
The first goal of this project is to test microsatellite -SSR markers for wheat resistance
genes to septoria tritici blotch selection.
The second objective is to assign RAPD markers to resistance genes based on co
segregation.
The third objective is to assign RAPD markers based on Bulk Segregant Analysis.
The fourth objective relate to the DNA cloning from polymorphic bands, assigned to
resistance genes, in order to convert RAPD polymorphic markers into specifi c SCAR (Sequence
Characterized Amplified Region) markers.
4.2. Biological material
The biological material used was delivered from INCDA Fundulea, represented by:

30
 22 cultivars: 14 lines of bread wheat with field resistance to septoria tritici blotch and 8
susceptible lines to this disease;
 9 double haploid lines with resistance to septoria tritici blotch;
 23 double haploid lines: 21 re sistant lines and 2 susceptible lines.
4.3. Working methods
4.3.1. DNA isolation and quantification
DNA isolation from bio logical material was made by Roger et al. protocol (1988). The
process comprises three major steps:
– Cell lyses and DNA release;
– Purification of a particular type of DNA;
– Achieving a DNA solution of known purity and concentration.
DNA quantification was mad e using NanoDrop UV/Vis 1µl Spectrophotometer (Labtech
International) connected to PC.
4.3.2. DNA amplification using RAPD markers
RAPDs are DNA fragments amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR) usig
short synthetic primers of random sequence (Williams et al., 1990) ; amplified fragments are
separated by electrophoresis and polymorphisms are detected as the presence or absence of
particular size. To amplify our DNA we used 20 random primers.
4.3.3. DNA amplification using SSR markers
Microsatellite s are molecular marker loci consisting of tandem repeat units of very short
(1-5 basepairs) nucleotide motif, for ex. (AC) n.
In this study we tested 16 pairs of SSR primers, which are known that they are linked to
resistance genes to septoria tritici blot ch.
4.3.4. Electrophoresis
DNA electrophoresis is an analytical technique used to separate DNA fragments by size.
DNA molecules which are to be analyzed are set upon a viscous medium, the gel, where an
electric field forces the DNA to migrate toward the positive potential, the anode , due to the net
negative charge of the phosphate backbone of the DNA chain. The separation of these fragments
is accomplished by exploiting the mobility with which different sized molecule s are able to
traverse the gel: l onger molecules migrate more slowly because they experience more drag
within the gel. The types of gel most commonly used for DNA electrophoresis are agarose (for
relatively long DNA molecules) and polyacrylamide (for high resolution of short DNA
molecules, for example in DNA sequencing ).
4.3.5. Image capture and analysis
The DNA fragments of different lengths are visualized using a fluorescent dye specific
for DNA, such as ethidium bromide . The gel shows bands corresponding to different DNA
molecules populations with different molecular weight. Fragment size is usually reported in
"nucleotides", "base pairs" or "kb" (for thousands of base pairs) depending upon whether single –
or double -stranded DNA has been separated. Fragment size determination is typically done by
comparison to commercially available DNA ladders containing linear DNA fragments of known
length. The visualization of PCR products was made wit h BioSpectrum AC Imaging System
(Ultra Violet Products, UVP) and they were analyzed using Vision Works LS program.

31
4.3.6. Maintenance, multiplication and conservation of Septoria tritici isolates
Septoria tritici isolates (IPO 232, IPO 94269) were provid ed by Wageningen University
(Netherland) useful for artificial infection of our wheat hybrids. In order to multiply and
conserve these isolates were necessary two culture media: PDA (Potato Dextrose Agar) and
YGM (Yeas Glucose Medium); pure culture was cri opreserved for future experiments.
4.3.7. Bulk Segregant Analysis
Bulk Segregant Analysis method is a rapid procedure for identifying markers in specific
regions of the genome (Michelmore et al., 1991) ; the method involves comparing two pooled
DNA sample s of individuals from a segregating population originating from a single crosses.
Within each bulk the individuals are identical for the trait or gene of interest but are arbitrary for
all other genes; the two pools contrasting for a trait, e.g., resistant and susceptible to a particular
disease, in this case, septoria tritici blotch, are analyzed to identify markers that distinguish them.
Markers that are polymorphic between the pools will be genetically linked to the loci
determining the trait used to con struct the pools. This method has immediate applications in
developing genetic maps (O’Brien, 1990).
4.3.8. DNA cloning from polymorphic bands
The last objective of this thesis was related to the DNA cloning from polymorphic bands ,
in order to convert RA PD polymorphic markers into specific SCAR (Sequence Characterized
Amplified Region) markers. DNA cloning is a technique to reproduce DNA fragments. It can be
achieved by two different approaches: cell base and using Polymerase Chain Reaction . Parental
wheat DNA was amplified with RAPD markers, followed by electrophoresis and polymorphic
bands were excised from agarose gel. PCR products were cloned using pGEM Easy Vector
Sistem (Promega), pJET 1.2/blunt (CloneJETTM PCR Cloning Kit, Fermentas), and PTZ57/T
vector (InsTAcloneTM Cloning Kit, Fermentas).
4.3.9. Obtaining F2 generation from parental crossing
Biological material was sown in experimental field in autumn 2006, the wear follow ing
crosses were performed using all parental lines with filed resistance to septoria tritici blotch and
three susceptible parents (15 – Farmec; 16 – Delabrad; 17 – F96869G1 -108). F 1 hybrids were sown
in autumn 2007; following year we harvested F 2 generation in order to test the resistance to
Septoria tritici pathogen.
CHAPTER V
5.1. Results regarding DNA isolation
DNA isolation from wheat leaves was carried out as described by Roger et al. (1988),
CTAB -based method. Good results were obtained.
5.2. Results regarding septoria tritici blotch disease resistance on wheat using SSR tec hnique
5.2.1. Results regarding DNA amplification on parental lines
To achieve the first objective of this thesis we tested microsatellite markers in order to
achieve marker -assisted selection for resistance in wheat to Septoria . Our trials were to find what
genes are present in our biological material. The parental lines considered resistant to septoria
tritici blotch (1 to 14) and susceptible forms were tested using several SSR markers described in
the literature as associated with Septoria resistance gen es, also field phenotypic evaluation has
been made.

32
In our experiment two markers (Xgwm44 and Xgwm111) could not discriminate the
Septoria resistant from the susceptible form. The Xgwm44 marker, revealed a not very obvious
the 182 bp product amplificatio n, associated with Stb5resistance gene (the 182 bp band appeared
only at one line).The Xgwm 577 marker provided good results; a 180 bp product of
amplification, associated with Stb8 resistance, gene was present at some resistant lines (8, 11, 13
and 14), s o we can consider that these lines carry Stb8. The pSCH20 marker, specific to rye
genome, appeared in the individual plants from 2, 6, 7, 8, 10, 11, 13 and 14 resistant lines to
Septoria. This suggests that resistance genes come from ry e genome.
5.2.2. Results regarding DNA amplification on double haploid lines
The Xgwm493 marker linked to Stb2 locus gave straightforward results (figure 1).

Figure 1. Amplification products obtained with Xgwm493 marker, L – ladder 50 bp

Most of the field resistant double haploid lines had amplification products similar to those
of the susceptible lines (22 and 23), being considered deprived of STB2 allele for resistance to
septoria tritici leaf blotch. Only two lines (9 and 11) had amplification products considered as
harboring Stb2 allele for resistance. Good results were obtained for Stb4 with Xgwm111 marker
and Stb6 with Xgwm369 marker.
5.3. Results regarding assigning of RAPD markers to resistance genes based on cosegregation
5.3.1. Results regarding DNA amplification on parental lines
RAPD markers linked with Septoria resistance genes could be revealed by analysis of
molecular polymorphism obtained with different primers among different resistant wheat lines
and susceptible wheat parental forms. For each primer, we ca n consider as candidate that marks a
resistance gene, the amplification products present in resistant lines and absent in the susceptible
parent.

Figure 2. Amplification products obtained with OPH20 marker,
L- ladder 100 bp
The OPH20 primer that u sually gives one 1400 bp product of amplification for rye
introgression in the wheat genome has given such a product in almost all resistant lines (figure
2).
The OPC4 primer gives two candidates, one of approximately 510 bp and another of
approximately 15 00 bp revealed in almost all resistant lines. The OPC 13 primer gives one
candidate of 350 bp and the Mic 14 primer gives one candidate of 550 bp.

33
5.3.2. Obtaining hybrid material
To achieve the third objective of this thesis we made crosses between resis tant plants with
susceptible S. tritici pathogen; F1 hybrids were obtained which were self pollinated resulting F 2
segregating generation (Table 1 ).

Table 1.
F2 generation obtained in field
No. Hybrids Genealogy
Resistant parent x S usceptible parent
1. P1 X
P16 ALTAR 84/Aegilopsis squarosa (219)/2
SERI/3/F96869G1 -1
x DELABRAD
2. P4 X
P16 FARMEC/Aegilopsis squarosa x DELABRAD
3. P5 X
P16 CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1 -3
x DELABRAD
4. P6 X
P16 CIT3/T.Tauschi(T2460)/2 29S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x DELABRAD
5. P8 X
P16 TAM1074/T.Timopheevi(TA870),(KSWGRC36)/Glosa
x DELABRAD
6. P5 X
P17 CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1 -3 x
F96869G1 -108 x DELABRAD
7. P6 X
P17 CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x F96869G1 -108
8. P9 X
P17 T. Timopheevi/T. Monococum/2 F132/3/2 Crina x
F96869G1 -108

5.4. Establishing linkage relationships between assigned RAPD markers and S TB resistance
genes
Genetic mapping of STB resistance genes progressed rapidly after 1995 and now more
than 12 genes have been mapped, with one or more associated molecular markers each, these
genes are distributed on 10 wheat chromosomes, occurring equally on the A, B and D genomes
(Goodwin, 2007).
Good flanking markers are essential to ensure th at the resistance gene is not lost during
the process of marker assisted selection. It is desirable to have markers that are linked more
closely than those identified thus far, both for marker assisted selection and for possible map –
based cloning of the ge nes in the future Cloning and sequencing of the correct locus can allow
the primers to be extended and possibly made more specific.
Another use for molecular markers will be to combine resistance to multiple diseases and
pests, this is being attempted alre ady for the Stb2 gene on chromosome 3BS. This chromosome
arm also contains gene Sr2 for resistance against stem rust , and major quantitative trait loci
(QTL) for resistance to Stagonospora nodorum blotch and Fusarium head scab . All of these
resistances ori ginated in different cultivars of wheat. Attempts are under way to combine these in
coupling into a single linkage block with good resistance to all four diseases. Similar map
locations between other STB resistance genes and genes for resistance to various pests and

34
pathogens also exist and could be exploited to develop linkage blocks with multiple resistances.
In this study we aimed to establish linkage relationships between molecular markers like
RAPD’s and STB resistance genes using F2 generation analysi s. F2 generation is the result of
various crosses between the resistance forms to Septoria tritici with susceptible forms to this
disease . Good results were obtained by testing OPA11 , OPC13 and OPC04 markers: OPA11
marker is linked to Stb resistance gene a t the distance of 6 cM, OPC 13 is linked at the distance
of 3 cM and OPC04 is linked at the distance of 2 cM.

5.5. Results regarding cloning of amplification products
The last objective of our research is the cloning of DNA bands obtained by amplificatio n
of polymorphic DNA with RAPD markers. This objective was achieved by cloning DNA of a
resistant line with RAPD markers that were assigned previous to the resistance gene. For DNA
amplification we used three RAPD markers (OPH20, OPC04 and OPC13). Best res ults were
obtained with CloneJET TMCloning Kit .
The white colonies were multiplied on LB media supplemented with appropriate
antibiotic, then plasmid DNA was isolated and sequenced in order to design specific primers and
converting RAPD marker into SCAR ma rker.

CONCLUSIONS
Conclusions concerning the issuing of the first obje ctive proposed in this thesis – testing
microsatellite -SSR markers for wheat resistance genes to septoria tritici blotch selec tion:
Isolation of DNA was performed according to protoc ol using CTAB, quantity and purity
of DNA obtained was good; SSR markers have been used successfully for the se lection of
segregating generation of individuals carriers of alleles for resistance to Septoria and carrier
selection double haploid lines of res istance genes:
The double haploid lines tested carried at least one resi stance gene, most frequently Stb4,
Stb7 and Stb8. For resistance genes Stb1, Stb3, Stb5 and Stb6 results were not conclusive.
Individual plants within each double haploid line were no t segregated confirming the ir
homozygous nature.
Conclusions concerning the issuing of the second objective -assign ing RAPD markers to
resistance genes based on co segregation :
RAPD markers tested gave good amplification in all genotypes studied: of the 20 markers
tested, 11 showed polymorphism in bulk populations from recombinant lines resistant to
Septoria tritici , compared to parental forms characterized to be susceptible to this pathogen :
Polymorphic bands obtained are considered as candidate molecular markers for Septoria
tritici resistance genes.
Conclusions concerning the issuing of the third obje ctive – assigning RAPD markers
based on Bulk Segregant Analysi s method:
Were obtained eight F 2 combinations which have tested using artificial infection w ith
spores of S. tritici . Molecular analyses w ere performed o n bulks of resistant and susceptible
plants with RAPD markers . Linkage r elations were established between RAPD markers and
resistance genes to septoria tritici blotch.
Conclusions concerning the issuing of the fourth objective -DNA cloning from
polymorphic bands, assigned to resistance genes, in order to convert RAPD polymorphic
markers into specific SCAR markers:
Parental DNA was cloned using CloneJETTM cloning kit and OPC13 (RAPD marker )
(350 bp polymorphic band). After cloning and sequencing D NA, SCAR markers are designed .