Modificari ALE Imunitatii Innascute LA Pacientul Chirurgical

MODIFICARI ALE IMUNITATII INNASCUTE LA PACIENTUL CHIRURGICAL

CUPRINS

PARTEA I: Partea generala- Stadiul actual al cunoasterii

Capitolul 1: introducere-imunitatea innascuta

1.1 Componente ale imunitatii innascute

1.2 Celulele implicate în răspunsul imun înnăscut

1.3 Componenta umorală a răspunsului imun înnăscut

1.4 Citokinele pro- si antiinflamatorii

Capitolul 2: reactia de faza acuta postoperatorie

2.1 Reactia sistemica de faza acuta

2.2 Citokine implicate in raspunsul de faza acuta

2.3 Proteinele de faza acuta

Capitolul 3: pacientul septic

3.1 SIRS, sepsis, soc septic- criterii clinice de definitie

3.2 Endotoxinele

3.3 Receptori implicati in recunoasterea stimulului endotoxinic

3.4 Recunoasterea LPS de catre TLR

3.5 Caile de semnalizare intracelulara ale TLR

3.6 microRNA- noi actori implicati in sepsis

3.7 Toleranta la endotoxina ca mecanism protector in sepsis

Capitolul 4: pacientul splenectomizat

4.1 Elemente de anatomie macroscopică și microscopică a splinei

4.2 Fiziopatologia funcțiilor splinei

4.3 Rolul splinei în imunitatea înnăscută

4.4 Sepsis postsplenectomie- OPSI

PARTEA A II-A: Partea speciala- Contributii personale

Studiul nr. 1: modificari ale imunitatii innascute la pacientul septic

Material si metoda

Rezultate

Discutii

Studiul nr. 2: modificari ale imunitatii innascute la pacientul splenectomizat

Material si metoda

Rezultate

Discutii

Concluzii

Bibliografie

Partea generală

Capitolul 1: introducere-imunitatea innascuta

1.1 Componente ale imunitatii innascute

Sistemul imunitar (din lat. imunis = liber, curat) cuprinde mecanismele de apărare ale organismelor vii față de agenții patogeni. Este format din două mari componente: imunitatea înnăscută și imunitatea adaptativă.

Imunitatea înnăscută sau nespecifică grupează mecanismele imune care formează prima linie de apărare împotriva infecțiilor. Acest tip de răspuns nu este specific unui antigen, cu toate că include mecanisme celulare și moleculare care recunosc anumite clase moleculare antigenice, dar care sunt prezente înainte de contactul organismului cu agentul agresor, iar acțiunea lor oferă răgazul intrării în funcțiune a răspunsului imun adaptativ (Murphy, 2008).

Imunitatea înnăscută sau nespecifică este antigen independentă și nu prezintă memorie imunologică. Aceasta înseamnă că celulele sistemului imunitar înnăscut sunt capabile să recunoască și să reacționeze la agenții patogeni în mod general, fără a conferi o imunitate protectoare sau de lungă durată gazdei. Este sistemul imunitar dominant la plante, fungi, insecte și organisme pluricelulare (Abbas, 2012).

Imunitatea înnăscută este moștenită genetic și nu mai poate fi influențată până la sfârșitul vieții. Ea utilizează receptori codificați genetic pentru recunoasterea microorganismelor patogene, iar acest fapt o diferențiază de cealalată componenta a imunitații, cea dobandita care este prezentă numai la vertebrate. Prin intermediul acestor receptori sistemul imun înnăscut poate detecta un set limitat de structuri microbiene. Cu alte cuvinte, sistemul imunitar funcționeazã pe principiul “gata fãcut”, adică receptorul de antigen preexistă pe suprafața limfocitelor, astfel încât problema diversitãții anticorpilor trebuie explicată pe baze genetice (Abbas, 2012).

Practic, imunitatea înnăscută se referă la toate componentele sistemului imun pe care organismul le posedă încă de la naștere și constă dintr-o serie de factori care sunt operaționali împotriva oricărui antigen (Lambris, 2007). Aceste structuri reprezintă prima linie de apărare împotriva microorganismelor cu potențial patogen.

Imunitatea înnăscută sau nespecifică este asigurată de:

Structurile (barierele) anatomice cu rol protector (tegumente, mucoase – intestinală, respiratorie).

Enzimele din secrețiile exocrine – lizozimul, bactericina.

Mucusul care acoperă mucoasele.

pH-ul acid al sucului gastric, care împiedică colonizarea bacteriană.

Colicinele produse de flora saprofită din intestin.

Temperatura corpului prin declanșarea reacției febrile, ce creaza un mediu nefavorabil dezvoltarii microorganismelor.

Presiunea mare a O2 în alveolele pulmonare ce inhibă dezvoltarea germenilor anaerobi la acest nivel.

Răspunsul inflamator

Bariera celulara – prin celulele cu rol fagocitar: PMN, macrofage.

Hemostază.

1.2 Celulele implicate în răspunsul imun înnăscut

Principalele celulele efectoare ale sistemului innascut sunt polimorfonuclearele (in special cele neutrofile), macrofagele (MF) si celulele natural killer (NK). Macrofagele și polimorfonuclearele sunt celule fagocitare pentru microorganisme. Celulele NK au activitate impotriva celulelor proprii infectate viral si celulelor tumorale.

Polimorfonuclearele neutrofile (PMN) sunt celule provenite din celulele stem hematopoietice, fiind cele mai numeroase elemente ale formulei leucocitare (60-70% sau în valori absolute 2500-5000/mm3). Durata de viață în circulația sistemică este de 24 ore. Neutrofilele străbat endoteliul capilar prin diapedeză și se deplasează direcționat (chemotactism) pentru a putea ajunge la nivelul țesutului infectat. PMN intervin în apărarea nespecifică împotriva bacteriilor extracelulare, pe care le fagocitează și le digeră datorită echipamentului enzimatic conținut în lizozomi (Abbas, 2012; Lambris, 2007).

Celulele macrofage (MF) provin din măduva osoasă hematogenă. Forma circulantă a acestora e reprezentată de monocite, care după ce tranzitează pentru numai 12-24 de ore torentul sanguin, ajung în țesuturi, prin traversarea peretelui capilar prin diapedeză,ele fiind atrase de o serie de factori chemotactici, unde devin macrofage mature, constituind sistemul monocit-macrofag (mononuclear fagocitar). MF se găsesc la nivelul: țesutului conjunctiv, membranei bazale a vaselor de sânge de calibru mic, țesutului pulmonar (macrofagele alveolare), ficatului (celulele Kupffer), sinusoidelor splenice, nodulilor limfatici, glomerulilor renali (celulele mezangiale), microgliilor centrale, osteoclastelor (Abbas, 2012; Lambris, 2007).

MF au o durată mare de viață (până la 2 ani). De asemenea, ele pot prezenta antigene limfocitelor T, jucând astfel un rol important și în apărarea imună specifică (rol de celule prezentatoare de antigen- APC).

În focarul infecțios fagocitele sunt atrase de factori de origine bacteriană și factori chemotactici ce apar în cursul răspunsului inflamator (C5a, kalicreina produsă de țesuturile lezate, produși rezultați din metabolismul acidului arahidonic: prostaglandine, tromboxan A2, leucotriene). După aderarea Ag la suprafața PMN sau a MF, semnalul rezultat inițiază faza de înglobare a Ag prin activarea sistemului contractil de actină-miozină care emite pseudopode ce vor înconjura Ag până ce acesta este complet înglobat într-o vacuolă (fagozom). Fagozomul va fuziona cu lizozomii primari pentru a forma fagolizozomii în care enzimele lizozomale vor declanșa digestia. Totodată are loc explozia respiratorie – un termen ce denumește o activare puternică a metabolismului oxidativ al PMN (Murphy, 2008). Astfel incat distrugerea Ag se desfășoară prin două mecanisme:

-sub acțiunea enzimelor lizozomale

-prin intensificarea bruscă a metabolismului oxidativ ce însoțește fagocitoza, cu formare de ioni de superoxid (O3-), oxigen atomic (O-), radicali hidroxil (OH-), peroxid de hidrogen (H2O2) și hipoclorit. Toți acești produși sunt puternic bactericizi.

Celulele dendritice reprezintă aproximativ 2% din populația celulară a unui țesut (Banchereau, 2000). Acestea constituie un grup heterogen de celule, care se diferențiază dintr-un progenitor medular comun CD34+, din care rezultă două linii celulare, una mieloidă și una limfoidă:

-din linia mieloidă se formează celulele Langerhans și celulele interstițiale. Acestea sunt localizate la nivelul principalelor porți de intrare în organism (epiderm, mucoase), fiind primele care vin în contact cu Ag.

-din linia limfoidă se maturează celulele dendritice din timus, care prezintă autoantigenele către LT. Ele induc toleranța imunologică și exprimă markerul CD8 al LT (Abbas, 2012).

Celulele dendritice mature și activate secretă citokine (IL-1, TNF-α, IL-8, IL-10, IL-12) și chemokine, care acționează autocrin sau paracrin asupra altor celule dendritice sau LT (2003).

Celulele dendritice îndeplinesc în cadrul răspunsului imun următoarele funcții:

captează Ag de la porțile de intrare.

transportă Ag spre organele limfoide secundare – ganglionii limfatici și splină.

prezintă în organele limfoide secundare Ag spre LB și LT (Steinman, 2009).

1.3 Componenta umorală a răspunsului imun înnăscut

Sistemul complement (SC) reprezintă un complex de proteine serice care interacționează pentru a forma un sistem efector, capabil să detemine liza unor celule străine și/sau o serie de activități biologice importante, cu rol esențial în desfășurarea răspunsului imun.

Mecanismul general de activare a sistemului complement implică activarea celor aproximativ 30 de proteine componente în trei cascade enzimatice legate între ele, denumite calea clasică, calea alternă și calea manozei. Cele trei căi se intersectează într-un punct comun reprezentat de conversia componentei C3 în fragmentele C3a și C3b, evenimentul cheie al activării sistemului complement (Abbas, 2012).

Calea alternă acționează în prima etapă a raspunsului imun umoral (opsonizarea), favorizând captarea Ag de către MF. Calea clasică acționează în ultima etapă: distrugerea Ag corpusculat prin liză osmotică (Abbas, 2012; Lambris, 2007).

Rolurile biologice ale complementului:

declanșarea inflamației: activarea complementului aduce după sine declanșarea reacției inflamatorii prin produșii intermediari rezultați pe parcursul activării. Astfel, C5a este un puternic factor chemotactic și chemokinetic pentru PMN care vor fi atrase în focarul inflamator. C3a și C5a joacă rol de anafilatoxine și ele vor determina degranularea mastocitelor cu eliberarea de produși vasoactivi.

opsonizarea: fagocitele au pe suprafața lor receptori pentru C3b și antigenele de care s-a fixat complementul vor adera astfel de celulele fagocitare.

citoliza: Ag corpusculate pe care s-a fixat complementul sunt lizate sub acțiunea asa-numitului “complex de atac al membranei”- MAC (C5 – C9). Indiferent de calea de activare a componentelor SC, odata activate acestea contribuie la functia esențială a SC, care este citoliza celulelor străine, mecanismul leziunilor induse de SC fiind de tip osmotic; componentele MAC atașate secvențial la membrana celulei-străine creează în aceasta orificii suficient de mari pentru a putea permite trecerea masiva a apei și electroliților (fiind hidrofile în regiunea centrală), dar prea mici pentru proteine și acizi nucleici, ceea ce în final determină explozia celulei sau citoliza (Murphy, 2008).

Opsoninele sunt substanțe care aderă de suprafața unui microorganism făcându-l accesibil fagocitozei. Cele mai importante opsonine sunt IgG și C3b.

Fragmentul C3b apare prin clivarea componentei C3 a complementului, în urma activării cascadei complementului pe calea clasică sau alternă. Fragmentul C3b este o opsonină nespecifică, ce se atașează de membrana antigenică. Acest complex se leagă de un receptor glicoproteic pentru C3b prezent pe membrana fagocitelor (CR – complement receptor), ceea ce are ca rezultat fagocitoza eficientă a antigenului (Murphy, 2008).

Opsoninele specifice sunt anticorpii implicați în apărarea antiinfecțioasă dobândită – în special IgG1 și IgG3. Aceste molecule se leagă mai întâi de suprafața antigenului corpusculat (bacterie) prin fragmentul Fab, iar apoi prin fragmentul Fc se leagă de receptorii FcyR de pe suprafața celulelor fagocitare (Murphy, 2008).

Interferonii (IFN) au rol de mesageri intercelulari și aparțin clasei citokinelor. Aceștia sunt produși de o mare varietate de celule, ca răspuns la prezența macromoleculei de ARN, un indicator-cheie al infecțiilor virale. IFN asistă răspunsul imun prin inhibarea replcient de mari pentru a putea permite trecerea masiva a apei și electroliților (fiind hidrofile în regiunea centrală), dar prea mici pentru proteine și acizi nucleici, ceea ce în final determină explozia celulei sau citoliza (Murphy, 2008).

Opsoninele sunt substanțe care aderă de suprafața unui microorganism făcându-l accesibil fagocitozei. Cele mai importante opsonine sunt IgG și C3b.

Fragmentul C3b apare prin clivarea componentei C3 a complementului, în urma activării cascadei complementului pe calea clasică sau alternă. Fragmentul C3b este o opsonină nespecifică, ce se atașează de membrana antigenică. Acest complex se leagă de un receptor glicoproteic pentru C3b prezent pe membrana fagocitelor (CR – complement receptor), ceea ce are ca rezultat fagocitoza eficientă a antigenului (Murphy, 2008).

Opsoninele specifice sunt anticorpii implicați în apărarea antiinfecțioasă dobândită – în special IgG1 și IgG3. Aceste molecule se leagă mai întâi de suprafața antigenului corpusculat (bacterie) prin fragmentul Fab, iar apoi prin fragmentul Fc se leagă de receptorii FcyR de pe suprafața celulelor fagocitare (Murphy, 2008).

Interferonii (IFN) au rol de mesageri intercelulari și aparțin clasei citokinelor. Aceștia sunt produși de o mare varietate de celule, ca răspuns la prezența macromoleculei de ARN, un indicator-cheie al infecțiilor virale. IFN asistă răspunsul imun prin inhibarea replicării virale în celulele gazdă, activarea celulelor NK și a MF, determinând rezistența celulelelor gazdă la infecții virale (Fitzgerald, 2013).

Se descriu 3 clase de interferoni: IFN-α (secretat de MF și PMN), IFN-β (secretat de fibroblaști) și IFN-y (secretat de LT după stimularea acestora cu un Ag).

Lizozimul reprezintă o mucopeptidază prezentă aproape în toate umorile organismului (ser, lacrimi, salivă, secreție nazală), fiind absent în lichidul cefalorahidian (LCR), urină și umoarea apoasă. Se găsește totodată și în citoplasma PMN, MF și celulelor Paneth. Lizozimul este o enzimă care distruge peretele bacterian, prin hidroliză specifică, avand efect bactericid asupra multor bacterii gram pozitive : streptococi (inclusiv Streptococcus mutans, implicat în cariogeneză), stafilococi, Proteus, Brucella. Alte bacterii sunt rezistente. Este posibil ca lizozimul să coopereze cu IgA secretor pentru efectul bactericid (Abbas, 2012; Murphy, 2008).

Histamina acționează asupra celulelor endoteliale determinând contracția acestora. Astfel crește permeabilitatea vasculară, ceea ce facilitează pătrunderea fagocitelor și a altor leucocite circulante în țesuturile infectate (Murphy, 2008).

Properdina este un factor stabilizator al C3 și C5 convertazelor, prelungind activitatea lor. Aceasta reprezintă un complex de anticorpi naturali ce se formează de-a lungul vieții individului ca rezultat al stimulărilor cu antigene ale microflorei intestinale normale (Murphy, 2008).

Proteina C reactivă (PCR) este sintetizată în ficat și inițiază opsonizarea și fagocitoza antigenelor corpusculate (bacterii). Totodată, PCR este capabilă să fixeze și să neutralizeze substanțele toxice endogene provenite din leziunile celulare. Este un marker precoce al inflamației, cu un nivel seric crescut declanșat de răspunsul de fază acută (reacție nespecifică a organismului, mediată de citokine: IL-1, IL-6, TNF-α și IFN) (Gruys, 2005).

Proteina C reactivă este compusă din cinci unități polipeptidice necovalente identice aranjate sub forma unui pentamer ciclic. Ea este capabilă să determine activarea sistemului complement pe calea clasică, ceea ce duce la atașarea fragmentului C3b pe suprafața Ag care devine astfel opsonizat (Abbas, 2012).

1.4 Citokinele pro- si antiinflamatorii

Citokinele sunt molecule de natură proteică ce au rolul important de a transmite informații între celulele sistemului imun, care le și produc. Deci au rol de mesageri intercelulari. Nu au rol efector prin ele însele și majoritatea sunt secretate, dar pot fi și unele exprimate pe suprafata membranelor sau stocate in rezervoare in matricea extracelulara. Acestea se leaga de receptori specifici de pe suprafata celulelor tinta si majoritatea sunt factori de crestere sau de diferentiere care actioneaza asupra acestor celule din cadrul sistemului hematopoietic.

Exista patru caracteristici principale ale citokinelor:

Pleiotropia, cele mai multe dintre citokine au mai multe tipuri de acțiuni; de exemplu IL-6 vor stimula hepatocitele sa produca proteine de faza acuta si de asemenea un factor de crestere pentru celulele B

Redundanța, majoritatea citokinelor au efecte biologice care se intalnesc si la alte citokine; de exemplu, ambele, IL-2 si IL-15 produc proliferarea celulelor T

Potența, majoritatea citokinelor actioneaza la nivel nanomolar sau femtomolar

Actionează ca parte a unei rețele sau cascade; majoritatea citokinelor sunt parte a unei cascade de citokine, eliberate succesiv si actioneaza adesea sinergic (Dinarello, 2000)

Printre cele mai importante se numară: interleukinele – care se notează de la 1 la 13, factorii de stimulare a hematopoiezei, interferonii, factorii de necroză tumorală, factorii de creștere si factori supresori (2003; Dinarello, 2000).

După mecanismul de acțiune, citokinele se împart în două categorii: proinflamatoare (TNFα, IL – 1,6 și 8, G-CSF) și antiinflamatoare (IL-10, receptorii de TNF și receptorul de IL-1).

IL-1 este produsă de macrofage și fibroblaști. Stimulează proliferarea LT și LB activate ;induce producția de citokine de către macrofage ;induce apariția pe endoteliu a moleculelor de adeziune pentru PMN și limfocite ;induce febră și sinteza hepatică a proteinelor de fază acuta; stimulează osteoclaștii care produc resorbție osoasă (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura IL-1 (http://en.wikipedia.org/wiki/Image: IL-1 _structure.png)

IL-2 este produsă de LTH. Efectele ei se exercită prin receptorul membranar CD25, numit și IL-2 R. Acțiunile IL-2 sunt urmatoarele : cea produsă de LTH1 stimulează RIC si cea produsă de LTHp și LTHo stimulează RIU primar, care apare la primul contact cu antigenul și se caracterizează prin producția de IgM (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura IL- 2 (http://en.wikipedia.org/wiki/Image: IL-2_structure.png)

IL-4 este produsă de LTH2. IL-4 stimulează RIU secundar, care apare după contacte repetate cu antigenul, prin mai multe acțiuni :stimulează producția și maturația medulară a LB ;crește funcția de APC a limfoblastului B ; activează mecanismul de comutare izotipică a producției de imunoglobuline a plasmocitului, adică inhibă producția de IgM caracteristice RIU primar și stimulează producția de IgG caracteristice RIU secundar (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura IL-4 (http://en.wikipedia.org/wiki/Image: IL-4 _structure.png)

IL-6 este produsă de LTH2 și MF. IL-6 are mai multe acțiuni :stimulează RIU prin stimularea producției medulare a LB și a activării lor; are efect antiinflamator pentru că stimulează sinteza hepatică de proteine de fază acută, cum sunt : α 1-antitripsina, α 2-macroglobulina, α 1-antiplasmina (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura IL- 6 (http://en.wikipedia.org/wiki/Image: IL-6 _structure.png)

TNF (tumor necrosis factor) este o citokina proinflamatorie al carui nume deriva din capacitatea de a distruge celulele tumorale si de a induce necroza hemoragica in tumorile transplantate la soarece.

TNF-α (casectina) si TNF-β (limfotoxina) au fost descrise initial ca factori citotoxici produsi de macrofage si respectiv de limfocite; ulterior s-a descoperit ca TNF-α si TNF-β sunt doua proteine care prezinta omologie la 34% din secventele de aminoacizi3;5. Ambii mediatori actioneaza asupra celulelor tinta prin aceeasi receptori si din acest motiv au efecte biologice similare, dar nu identice (2003).

Este produs nu numai de macrofage si monocite, ci si de limfocite, mastocite, neutrofile, keratinocite, astrocite, microglii, celule musculare netede si unele linii celulare tumorale5. Cantitati mari de TNF sunt eliberate la contactul macrofagelor, limfocitelor T CD4+ si a celulelor natural-killer (NK) cu lipopolizaharidele, produsii bacterieni si interleukina 13 (2003).

Legarea TNF-α de receptor determina modificari conformationale in structura receptorului, care conduc la activarea in cascada a transcriptiei altor proteine implicate in proliferarea celulara, raspunsul inflamator si apoptoza celulara. TNF-α poate avea o actiune locala paracrina (cresterea locala a concentratiei TNF poate cauza semnele cardinale ale inflamatiei: roseata, durere, caldura si tumefactie) sau poate actiona la distanta, asemenea hormonilor endocrini. Datorita prezentei receptorilor sai in majoritatea tesuturilor, TNF-α exercita o varietate larga de efecte biologice: efecte citolitice si citostatice asupra celulelor tumorale; efect chemotactic asupra neutrofilelor; creste permeabilitatea la nivelul celulelor endoteliale din regiunea cu inflamatie; acestea nu determina numai acumularea de celule imune ci are impact si asupra procesului de coagulare; activeaza diverse procese metabolice din celulele musculare si adipocite pentru a furniza energia necesara reactiei inflamatorii; la nivelul macrofagelor stimuleaza fagocitoza si producerea de prostaglandina E; la nivelul altor tesuturi creste rezistenta la insulina; activeaza osteoclastele, deci stimuleaza resorbtia osoasa; este factor de crestere pentru fibroblasti si stimuleaza sinteza de colagenaza; intensifica proliferarea limfocitelor T dupa stimularea cu interleukina 23; determina anorexie si febra, actionand ca un pirogen endogen; este responsabil pentru sindromul de casexie asociat cu procesele maligne si cu majoritatea infestarilor parazitare (Dinarello, 2000).

Determinarea nivelului seric de TNF-α constituie un marker pentru raspunsul inflamator sistemic (SIRS) asociat cu sepsisul, traumatismele si insuficienta cardiaca. Anumite studii au indicat asocierea concentratiei de TNF-α in lichidul cefalorahidian cu gradul de activitate in scleroza multipla; pe de alta parte, determinarea TNF-α ar putea fi utila in diferentierea meningitei bacteriene de alte cauze de meningita (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura TNF-α (http://en.wikipedia.org/wiki/Image: TNF-α _structure.png)

IFNy considerat principala citokina responsabila de imunitatea mediata celular, este un activator major al macrofagelor.

Receptorul specific pentru IFNy se afla in special pe suprafata macrofagelor, celulelor NK. Din punct de vedere structural, acest receptor apartine superfamiliei receptorilor citokinici (de tip interferon); este un heterodimer compus din 2 subunitati, IFNGR1 si IFNGR2 (sau IFNyRα si IFNyRβ). Mutatii ale genelor ce codifica subunitatile IFNGR1 si IFNGR2 sunt responsabile de susceptibilitatea crescuta la infectii cu mycobacterii si Salmonella.

IFNy este produs in principal de catre limfocitele T helper de tip 1 (ca raspuns la stimularea antigenica si mitogena), de celulele NK (consecutiv actiunii IL-2, anticorpilor anti-CD16 si in prezenta macrofagelor) si de celulele T citotoxice.

IFNy mediaza cresterea expresiei moleculelor de histocompatibilitate (MHC) de clasa I si II. IFNy stimuleaza in principal prezentarea antigenului si productia de citokine a monocitelor, precum si celelalte functii efectoare ale acestor celule: aderenta, fagocitoza, secretia, arderile respiratorii si productia de NO (monoxid de azot). Astfel, IFNy favorizeaza acumularea macrofagelor la nivelul situsului raspunsului imun celular precum si abilitatea acestora de a distruge microorganismele intracelulare. De asemenea IFNy stimuleaza si capacitatea altor celule de a distruge microorganisme, precum a celulelor NK si a neutrofilelor. Asemanator celorlalti interferoni (in special INFα si IFNβ) inhiba replicarea virala (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura IFN-y (http://en.wikipedia.org/wiki/Image: IFN-y _structure.png)

IL10- funcția majoră a interleukinei 10 (IL-10) este de a servi ca principal antiinflamator si imunosupresor in cadrul mecanismelor de modulare a raspunsului organismului la diversi factori patogeni (Dinarello, 2000).

Receptorul specific pentru IL-10 (IL-10R) apartine superfamiliei receptorilor citokinici (de tip interferon). Acesta se afla in special pe suprafata celulelor hematopoietice (macrofage, celule mastocitare), expresia sa la nivelul celulelor nehematopoietice fiind inductibila de catre stimuli precum lipopolizaharide.

Citokina IL-10 este produsa de numeroase celule: limfocite T helper de tip 1 si 2 (Th1 si Th2), limfocite T citotoxice, celule B activate, monocite, macrofage, keratinocite, celule epiteliale bronsice. Lipopolizaharidele, TNFα si alte citokine sunt inductori ai IL-10.

Citokina IL-10 este considerata un puternic inhibitor al productiei de citokine provenite din variate tipuri celulare. Astfel, IL-10 induce scaderea productiei de: IFNy si IL-2 (din limfocitele Th1), IL-4 si IL-5 (din limfocitele Th2), IL-1b, IL-6, IL-8, IL-12 si TNF-α (din fagocitele mononucleare), IFNy si TNF-α (din celulele NK). De asemenea IL-10 inhiba expresia moleculelor MHC II, CD23, ICAM-1, CD80 si CD86 de la nivelul celulelor dentritice si a altor APC. Scaderea productiei de citokine de catre limfocitele Th1 si Th2 este mediata de acest efect al IL-10 asupra expresiei CD80 si CD86 (2003; Fitzgerald, 2013).

Structura IL-10 (http://en.wikipedia.org/wiki/Image:IL-10_structure.png)

Capitolul 2: reactia de faza acuta postoperatorie

2.1 Reactia sistemica de faza acuta

Inflamația reprezintă o reacție de apărare a țesuturilor vascularizate față de o agresiune locală. Ea implică în primul rând o reacție locală, care poate fi însoțită de un număr mare de modificări sistemice și metabolice cunoscute ca – răspuns sau reactie de fază acută. Inflamatia se desfasoara in mai multe etape: etapa alterativa (de agresiune), etapa vasculo-exsudativa (etapa reactionala), etapa productiv-proliferativa si etapa reparatorie (de vindecare, cicatrizare).

Fenomenele lezionale debuteaza prin modificari ale tesutului interstitial si celulelor parenchimatoase, urmate de stimularea terminatiilor nervoase senzitive si modificarea nespecifica a calibrului si permeabilitatii vaselor mici (produsa de actiunea directa a agentului etiologic). Stimulul antigenic, prin intermediul reactivitatii imune, favorizeaza aparitia si eliberarea in mediu a unui mare numar de molecule proteice si lipidice, care prin rolul enzimatic (proteinele) sau generarea de radicali liberi de oxigen (lipidele, derivatii acidului arahidonic) favorizeaza distrugerea celulara si tisulara.

Celulele lezate pun in libertate proteaze si kinaze, de tipul factorului Hageman, plasminogenului, kininogenului, primului factor al complementului, care ajung in lichidul interstitial, ca urmare a modificarilor nespecifice de calibru si permeabilitate a vaselor mici. In cadrul sindromului reactional, sunt elaborati o serie de mediatori chimici, avand origine plasmatica sau celulara (PMN, macrofage, mastocite, bazofile, eozinofile, trombocite).

In ceea ce priveste citokinele, acestea sunt secretate de celule specifice (efectoare), in special macrofage, limfocite, celule epiteliale, avand ca functie principala modularea comportamentului celulelor din apropiere (Gruys, 2005).
In cadrul reactiei inflamatorii unele citokine au efecte proinflamatorii (IL-1, IL-6, TNFα, IL-8, IFNy, CSF), altele au efecte antiinflamatorii (IL-4, IL-10, TGFβ).

Inflamația are un rol important în mecanismele de apărare ale gazdei și protejează organismul prin:

distrugerea microorganismelor și substanțelor străine;

izolarea microorganismelor, care devin incapabile să exercite efectul lor biologic; un astfel de proces de izolare necesită un răspuns inflamator constant.

Stimulii care determină un răspuns de fază acută sunt variati, incluzand orice agresiune asupra organismului: infecțiile bacteriene și virale, injuriei tisulare posttraumatice sau postoperatorii, infarctul tisular, arsurile, neoplaziile sau bolile imunologice, etc.

Există mai multe tipuri de reacții inflamatorii, în funcție de: agentul inițiator, componentul de recunoaștere din sistemul imun de apărare al organismului (sistemul complement sau recunoaștere imună), mediatorii inflamației (mediatorii inflamației derivați din sistemul complement, factori chemotactici derivați din lipide, chemokine, citokine IL-1, IL-6, TNF-alfa) și celulele care se acumulează la locul reacției inflamatorii. Reactia sistemica de faza acuta (RFA) reprezinta un mecanism de aparare innascut al organismului ce presupune cresterea productiei anumitor proteine plasmatice denumite proteine de faza acuta (PFA). Orice forma de trauma sau leziune tisulara ce implica un raspuns inflamator determina, inevitabil, RFA care este o perioada biologica de ᾽autoreparare᾽ in care organismul gazda incearca sa-si refaca homeostazia normala (Kehlet, 1991). Cu toate acestea o FRA excesiva poate fi daunatoare conducand catre autotrauma (Baigrie, 1992).

La locul leziunii se activeaza celulele inflamatorii ce elibereaza cosecutiv citokine proinflamatorii printre care cele mai importante sunt TNF-α, IL-1 si IL-6 (Vasilescu, 1996). Reactia initiala consta in eliberarea de IL-1 si TNF-α de catre macrofage si monocite la nivelul tesuturilor lezate. Consecutiv este stimulata secretia si eliberarea de IL-6 principala citokina responsabila de efectele sistemice ale RFA: febra, tahicardie, accelerarea catabolismului (Wortel, 1993). Acest raspuns determina, la randul sau, productia unei cantitati si mai mari de citokine si alti mediatori ai inflamatiei care difuzeaza in spatiul extracelular si sunt deversate in circulatie. Aceste citokine ajung pe calea torentului sanguin la nivel hepatic, unde stimuleaza hepatocitele sa produca anumite proteine, numite proteine de faza acuta pozitive (ex. proteina C reactiva- PCR) in timp ce sinteza altor proteine este scazuta, respectiv proteinele de faza acuta negative (ex. albumina) (Buttenschoen, 2001). Reactia de faza acuta cu modificarile plasmatice care o insotesc este benefica pentru organism prevenind devzoltarea microbiana si ajutand la restabilirea homeostaziei. Unele PFA opsonizeaza microorganisme si activeaza sistemul complement, altele inlatura reziduuri celulare si radicali liberi sau neutralizeaza enzime proteolitice.

La ora actuala este cunoscut faptul ca amploarea acestui fenomen este proportionala cu severitatea traumei (Berger, 1995) iar nivelul plasmatic al proteinelor de faza acuta unei traume chirurgicale de exemplu (Vittimberga, Jr., 1998). Raspunsul este initial localizat la nivelul leziunii (Vasilescu, 2003a) (ex. plaga chirurgicala) unde activarea celulelor inflamatorii ce apartin sistemului imun stimuleaza eliberarea de citokine. In acest sens mai multe studii au demonstra ca abordul minimal invaziv produce o trauma chirurgicala mai diminuata si, in consecinta, o RFA de intensitate mai scazuta (Hewitt, 1998; Vittimberga, Jr., 1998). Acest avantaj este cu atat mai importat in cazurile interventiilor chirurgicale majore, pentru patologie maligna cu o manipulare mai mare a organelor intraabdominale, anastomoze digestive, timp operator si pierderi sanguine mai mari. In aceste cazuri, pe langa stimulul parietal, toti factoriii enuntati contrubuie la activarea sistemului imun innascut. Abordul minimal invaziv implica un raspuns postoperator mai atenuat, datorat inciziei parietale mai mici, pierderilor sanguine mai reduse si manipularii intestinale mai putin agresive, toate acestea contribuind la o recuperare mai rapida postoperatorie. Mai mult decat atat, scaderea intensitatii RFA si menajarea sistemului imun innascut la pacientii neoplazici cu un status imunologic oricum deprimat de afectiunea de baza, le permite acestora nu doar o mai buna recuperare postoperatorie dar ar putea influenta si evolutia bolii insasi (Hewitt, 1998).

2.2 Citokine implicate in raspunsul de faza acuta

In cadrul reactiei inflamatorii, intervin citokine, avand efecte proinflamatorii (IL-1, IL-6, TNFα, IL-8, IFNy, CSF) sau efecte antiinflamatorii (IL-4, IL-10, TGFβ).
Citokinele proinflamatorii au ca sursa celulara macrofagele si limfocitele T activate in prezenta bacteriilor, dar si celulele endoteliale, fibroblastii si neutrofilele. Se stabileste o anumita ierarhie intre citokinele participante la raspunsul inflamator: IL-1 si TNFα sunt principalii reprezentanti cu efecte inflamatorii locale si sistemice; ei stimuleaza productia de IL-6, IL-8 si CSF (Baigrie, 1992; Kehlet, 1991).

Sub actiunea endotoxinelor bacteriene, a IL-2, IL-4, IL-6, IFNy, GM-CSF, M-CSF, fagocitele mononucleare secreta M-CSF, GM-CSF, G-CSF, IL-6, IL-1 si TNFα; IL-1, TNFα, IL-3, IFNy stimuleaza celulele endoteliale si fibroblastele sa secrete GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-6, IL-8, amplificand raspunsul inflamator (Vasilescu, 1996).
Citokinele actioneaza prin receptorii membranari cuplati cu proteina G. Este generat mesagerul secund (fosfatinozitolul, diacilglicerolul), care impune fluxul de calciu citosolic; mesagerii activeaza proteinkinaza si regleaza activitatea moleculara prin controlul transcriptional modulat de diferite grupe de proteine nucleare.

Citokinele proinflamatorii:
IL-1 si TNF mediaza migrarea si activarea locala a celulelor fagocitare si eliberarea mediatorilor lipidici de tipul PGE2, tromboxanului si factorului activator plachetar (PAF) (Baigrie, 1992).
IL-1 induce si sinteza de IL-8, care este un factor chemotactic extrem de activ pentru neutrofile si monocite, stimuland totodata si eliberarea enzimelor din neutrofile. IL-1 si TNF actioneaza sinergic pentru a media efectele inflamatorii locale si sistemice, si anume: local, produc chemotaxia neutrofilelor, eliberarea de granule, amplifica metabolismul oxidativ; la distanta, tintele celulare sunt celulele endoteliale, hepatocitele, fibroblastii.
Febra din cadrul raspunsului inflamator, avand rol protectiv, este consecinta indirecta a actiunii IL-1 pe celulele endoteliale capilare din hipotalamus. Acestea secreta prosta-glandine, care ridica pragul termostatului hipotalamic (Vasilescu, 1996).
Pe hepatocite, efectul este de stimulare a sintezei de reactanti de faza acuta: fibrinogen, proteina C-reactiva. La nivelul maduvei osoase hematogene, IL-1 sti-muleaza expresia receptorilor M-CSF, G-CSF, GM-CSF pe celulele stem in repaus si determina eliberarea neutrofilelor (Bagby, 2000).

Sub actiunea IL-1, monocitele secreta citokine proinflamatorii si GM-CSF.
In fibroblasti si celulele sinoviale, IL-1 augmenteaza sinteza de colagenaze si prostaglandine (Dinarello, 2000).

IL-6 stimuleaza sinteza proteinelor de faza acuta la nivelul hepatocitului: fibrinogen, ceruloplasmina, haptoglobina umana, alfa2-macroglobulina, inhibitorul cisteinproteinazei; impreuna cu IL-1 sti-muleaza sinteza de proteina C-reactiva, amiloid seric A, haptoglobina, hemopexina C3a, d1 glicoproteina. De asemenea, actioneaza asupra hipotalamusului ca factor pirogen endogen si stimuleaza activitatea fagocitara a leucocitelor si participarea acestora la citotoxicitatea celulara mediata de anticorpi (Vasilescu, 1996; Wortel, 1993).

IL-8 reprezinta un factor chemotactic pentru neutrofile si induce eliberarea de enzime proteolitice (van Eeden, 2000).

CSF (factorul stimulator al celulelor stem) stimuleaza functia neutrofilelor si a macrofagelor (van Eeden, 2000).

IFNy creste sensibilitatea celulei tinta la actiunea citokinelor proinflamatorii (Dinarello, 2000).

Citokinele antiinflamatorii:

TGF-β inhiba adeziunea leucocitelor la peretele endotelial si migrarea la locul inflamatiei. Substratul molecular al efectului inhibitor este diminuarea expresiei moleculelor de adeziune ELAM-1 pe suprafata celulelor endoteliale.
De asemenea, stimuleaza chemotaxia neutrofilelor, dar impiedica activarea lor; in infarctul miocardic acut, administrarea de TGF-β limiteaza influxul de sange in zona infarctizata, restrangand leziunea inflamatorie (Beutler, 2004).

IL-4 este antiinflamatoare prin actiunea ei pe monocite; reduce adezivitatea acestora stimulata prin IL-3 si GM-CSF, scade productia de radicali liberi de oxigen si inhiba secretia de IL-1, IL-8 si TNF (Terashima, 1998).

IL-10 inhiba productia citokinelor proinflamatorii, stimuleaza sinteza de IL-1 de catre macrofage si reduce productia de radicali liberi ai oxigenului si azotului (Vasilescu, 1996).

Citokinele implicate in reactia inflamatorie (Gaman, 2001)

2.3 Proteinele de faza acuta

Atunci cand exista un focar inflamator in sange cresc concentratiile interleukinelor 1, 6, care sunt eliberate de catre celulele imunocompetente de la nivelul acestui focar. De asemenea, la ficat ajung, pe langa interleukina 1, interleukina 6 si alte resturi celulare sau bacteriene si proteine degradate. Ele ajung in ficat pe cale circulatorie si stimuleaza sinteza proteinelor de faza acuta (PFA) (Gruys, 2005).

PFA își modifică concentrația în cursul răspunsului de fază acută în sensul:

creșterii – proteinele de fază acută pozitive – componentele complementului C3, C4 și ceruloplasmina (cresc de <2×normalul), alfa1-antitripsina și fibrinogenul (de 2-3×normalul), proteina C reactivă (10-1000×normalul), feritina etc.

scăderii – proteinele de fază acută negative – albumina, transferina, etc (Lothar, 1998).

Această reacție are la bază reglarea expresiei genice a proteinelor de fază acută la nivel hepatic, sub influența citokinelor, între care IL-6 are un rol esențial.
În cazul reacției inflamatorii acute, creșterea concentrației proteinelor de fază acută este corelată cu activitatea răspunsului inflamator (Buttenschoen, 2001). În disfuncția de organ fără inflamație, ea nu este prezentă. Prin urmare, determinarea proteinelor de fază acută este un criteriu important pentru diferențierea dintre afectarea inflamatorie și funcțională a unui organ.
Afecțiunile maligne pot de asemenea conduce la o creștere a proteinelor de fază acută; utilizarea lor poate fi limitată însă în cazul asocierii unei infecții.

În inflamația cronică, creșterea proteinelor de fază acută este adesea mai mică decât se așteaptă pentru severitatea afecțiunii; aceasta se datorează fenomenului de “down-regulation” la nivelul sintezei (Lothar, 1998).

In inflamatiile acute cresc in special fractiile α1 si α2 ale globulinelor. Albumina si β globulinele pot fi micsorate. Proteinele totale sunt la limita superioara a normalului.

In mod normal alfa 1 si alfa 2 globulinele sunt sintetizate de catre ficat la un nivel bazal scazut si prezinta o concentratie plasmatica mica. Proteinele de faza acuta indeplinesc mai multe roluri in inflamatie:

joaca rolul de inhibitie a unor enzime proteolitice, care sunt deversate in focar prin distrugerea celulelor. Aceste enzime determina distrugerea proteinelor locale.

Astfel de enzime sunt: tripsina, chemotripsina, plasmina. PFA joaca rolul unor antienzime, limiteaza efectul restrictiv al enzimelor proteolitice. Cele mai cunoscute proteine de faza acuta cu rol de antienzima sunt: alfa 1 antitripsina, alfa 2 macroglobulina, alfa 2 antiplasmina.

au capacitatea de a se cupla cu resturile din focar, detritusul celular, pe care le transporta la ficat si splina unde sunt fagocitate

unele proteine de faza acuta au rol bacteriostatic (transferina, CRP) si bactericid.

CRP inițiază opsonizarea și fagocitoza antigenelor corpusculate (bacterii), activeaza cascada complementului. Totodată, PCR este capabilă să fixeze și să neutralizeze substanțele toxice endogene provenite din leziunile celulare. Ea înregistrează o creștere pronunțată, curând ( după 6-10 ore) de la stimulul inflamator, fiind un marker precoce al inflamației; de asemenea, după abolirea stimulului, ea înregistrează o scădere rapidă a concentrației (datorită timpului scăzut de înjumătățire) (Gruys, 2005)

Pe electroforeza proteinelor, un semn precoce al unui răspuns de fază acută, este creșterea alfa1-globulinelor , datorită creșterii alfa1-antitripsinei; aceasta este urmată de o creștere a alfa2-globulinelor, datorită creșterii haptoglobinei și ceruloplasminei. Fibrinogenul și CRP sunt localizate în banda beta-globulinelor, care nu înregistrează o creștere la analiza serului, pentru că fibrinogenul lipsește, iar CRP nu este detectabila din cauza concentrației prea mici. Modificările alfa-globulinelor apar după 24-48h de la inițierea răspunsului inflamator (Gabay, 1999).

Patternurile caracteristice ale modificarilor concentrațiilor plasmatice a unor proteine de faza acută , după un stimul inflamator moderat (Gabay, 1999)

Capitolul 3: pacientul septic

3.1 SIRS, sepsis, soc septic- criterii clinice de definitie

Sepsisul definește o stare clinico-biologică foarte gravă care rezultă dintr-un răspuns sistemic al gazdei la o afecțiune de cauză infecțiosă. Sepsisul are o incidență în creștere și constituie a doua cauză de deces în unitățile de terapie intensivă non-coronariene precum și cea de-a zecea cauză de deces globală în țările dezvoltate, în pofida progreselor din domeniul antibioterapiei (Hotchkiss, 2006).

Sepsisul se caracterizeaza prin asocierea sindromului de răspuns inflamator sistemic (SIRS) cu o sursă dovedită de infecție. Adică prezența a 2 sau mai multe din următoarele criterii ale conferintei de consens ale ACCP/SCCM din 1992 ce definesc SIRS în contextul unui focar infecțios (Bone, 2009):

temperatură corporală centrală sub 36 °C sau peste 38 °C;

tahicardie (peste 90 bătăi/minut);

tahipnee (peste 20 respirații/minut sau PaCO2 sub 32mmHg);

leucocitoză peste 12.000/mm3 sau leucopenie sub 4.000/mm3 sau
prezența neutrofilelor imature în proporție de peste 10%.

Într-o fază evolutivă spre agravare, sindromul septic devine sever (sepsis
sever), când se asociază cu hipoperfuzie tisulară sau hipotensiune și disfuncție organică, manifestate prin acidoză lactică, oligurie sau alterarea acută a stării mentale a pacientului (Bone, 2009).

Vorbim de șoc septic când în prezența tulburărilor de perfuzie tisulară și/sau disfuncție organică, infecția induce hipotensiune arterială rezistentă la reechilibrare volemica corecta. Hipotensiunea indusa de sepsis reprezinta tensiunea sistolica < 90 mmHg sau o reducere cu 40 mm Hg fata de nivelul de baza în absenta altor cauze de hipotensiune. Chiar dacă hipotensiunea a fost tranzitorie sau tensiunea arterială a fost
restabilită prin administrarea unui agent inotrop pozitiv sau vasopresor, cât timp
bolnavul manifestă o disfuncție organică sau prezența hipoperfuziei, el trebuie
considerat în stare de șoc septic (Bone, 2009).

Disfuncția organică interesează de obicei mai multe viscere și realizează într-o stare evolutivă avansată sindromul disfuncției organice multiple (MODS), care trebuie apreciat drept stadiul terminal al șocului septic. MODS se caracterizeaza prin alterarea functiei viscerelor, astfel încât homeostazia nu poate fi mentinuta fara interventie terapeutica.

Sepsisul este declanșat de stimuli bacterieni dar este întreținut și modulat de o multitudine de mediatori endogeni activați într-o cascadă de evenimente imunologice complexe. Principalii mediatori ai sindromului inflamator sistemic (SIRS) din sepsis sunt reprezentați de citokine și chemokine, sintetizate de numeroase tipuri celulare. Acestea pot modula fenotipul sau activitatea diverselor subseturi leucocitare și al altor tipuri de celule (fibroblaste, celule endoteliale).Sinteza și eliberarea excesivă a acestor mediatori circulanți poate însă conduce la activarea necontrolată a diferite subseturi leucocitare, a sistemului complementului, a căilor de activare ale coagulării și sistemului fibrinolitic și care în final pot genera leziuni microvasculare care rezultă în ischemie tisulară și disfuncție de organ.

Răspunsul la agresiunea microbiană se desfășoară în mai multe etape, care se pot succeda rapid și pot antrena deteriorarea, uneori severă și reversibilă a stării generale și în final decesul pacientului. Din aceste motive, prognosticarea evoluției spre stadii avansate sau deces are o importanță deosebită în adaptarea timpurie a măsurilor terapeutice.

Diagnosticul, monitorizarea și tratamentul pacienților cu sepsis precum și stratificarea în funcție de gravitate și prognostic necesită criterii și definiții precise. Actualmente acestea se bazează în principal pe evaluarea disfuncțiilor de organ (APACHE, SOFA) (Minne, 2008). Unele dintre acestea prezintă avantajul simplității dar toate sunt extrem de nespecifice și nu permit stratificarea precisă și formularea rapidă a prognosticului răspunsului gazdei la infecție. Tendința actuală este de identificare de noi criterii de evaluare rapidă și eficientă, bazate pe mecanismele patogenetice implicate în răspunsul sistemic. Astfel, pe lângă aceste scoruri clinice în continuă reanalizare, zeci de molecule bioactive, solubile sau celulare au fost propuse ca markeri ai prezenței, severității sau evoluției sepsisului, datorită rolului lor fiziopatologic în sepsis. Acestea ar putea revela noi intervale de oportunitate și intervenție terapeutică, care să preceadă apariția elementelor actuale de diagnostic, care se instalează în faze avansate ale sindromului și sunt nespecifice. Din nefericire, caracteristicile majorității acestora (dinamică, sensibilitate, specificitate) s-au dovedit nesatisfăcătoare iar cercetările destinate identificării unui marker al sepsisului continuă.

3.2 Endotoxinele

Fac parte din structura peretelui celular al bacteriilor gram negative și sunt eliberate în mediu după moartea celulei. Structura endotoxinelor este lipopolizaharidica (LPS); de aceea se mai numesc si lipoglicani si sunt formate din:

un glicofosfolipid ce se numește lipidul A

core (miezul) oligozaharidic format din zaharuri, etanolamină și acid fosforic

antigenul O, polizaharidic, un lanț lung, de zaharide, mai puțin obișnuite, specific de specie (Knirel, 2011).

Antigenul O reprezinta portiunea variabilă a moleculei de LPS, asigurând în acest mod specificitatea antigenică, spre deosebire de lipidul A, care reprezintă partea stabilă, deși s-a demonstrat, că în anumite cazuri și acesta poate varia ( la nivel de radicali acil ai acizilor organici componenți, între specii bacteriene sau chiar în cadrul speciei). Acest aspect conferă unora dintre LPS proprietați antagoniste (Knirel, 2011).

Grupul de gene ce codifica moleculele de LPS prezintă o mare variabilitate între speciile și subspeciile de bacterii patogene ce afectează plantele sau animalele.

Partea activă este lipidul A, celelalte având rol de carrier. Lipidul A, singur, este inert fiind insolubil în apă, dar devine activ în combinație cu celelalte componente ale endotoxinei. Acesta se leagă de o proteină hepatică- LBP (LPS-binding protein). Complexul LPS-LBP se leagă mai departe de receptorul CD-14 și de receptorul toll-like din componența macrofagelor, declanșand eliberarea citokinelor proinflamatorii (IL-1, IL-6, TNF-a), PAF, NO, prostaglandine, radicali de oxigen, proteaze (Netea, 2002); acești mediatori au capacitatea de a cauza distrugeri endoteliale și de a potența exprimarea de adezine, ceea ce facilitează extravazarea leucocitelor și acumularea acestora în țesuturi (Abbas, 2012). Efectele endototoxinei nu sunt specifice speciei, ci sunt identice indiferent de la ce bacterii gram negative provine.

Anumite studii au demonstrat că la bovine, carora li s-a indus mastita prin intermediul LPS, s-au gasit ulterior cantitati mari de IL-1 sau IL-6 in lapte (Raetz, 2002). Oamenii sunt insa mai sensibili la actiunea LPS decat oricare alta specie; odoza de 1µg/kg induce soc septic, pe cand soarecii tolereaza o doza de o mie de ori mai mare. Acest lucru ar putea avea legatura cu diferentele intre nivelele de anticorpi circulanti intre cele doua specii.

Structura lipopolizaharidelor (http://en.wikipedia.org/wiki/File:LPS.svg)

3.3 Receptori implicati in recunoasterea stimulului endotoxinic

Invazia gazdei de catre agenti patogenici infectiosi declanseaza o serie de raspunsuri imune prin interactiunea dintre diferiti factori de virulenta ai potegenilor si mecanismele de supraveghere imuna ale gazdei. Interactiunile gazda-patogen sunt initiate, in general, prin recunoasterea de catre organismul gazda a unor structuri moleculare ale patogenului cunoscute sub denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) esentiale pentru supravietuirea acestuia (Janeway, Jr., 2002). Aceste PAMPs sunt recunoscute de receptori codificati genetic exprimati de celulele sistemului imun innascut precum celulele dendritice, macrofage si neutrofile, denumiti PRRs (pattern recognition receptors).

Detectarea eficienta a PAMPs declanseaza rapid raspunsuri imune din partea gazdei prin activarea unor cai complexe de semnalizare, ce culmineaza cu inducerea raspunsurilor inflamatorii madiate de diferite tipuri de citokine si chemokine, ce faciliteaza eradicarea ulterioara a agentului patogen (Kawai, 2010).

La ora actuala sunt descoperite si caracterizate mai multe clase de PRRs, precum receptorii Toll-like (TLRs), receptorii RIG-I-like (RLRs), receptorii NOD-like (NLRs), receptori ADN. Aceste clase de PRR reprezinta punctul initial al recunoasterii patogenice (extra- sau intracelulare) ce deceleaza diferite clase de molecule, incluzand proteine, lipide, carbohidrati si acizi nucleici (Kumar, 2009).

Receptorii toll-like (TLRs) reprezinta cea mai larg studiata clasa de PRRs si sunt considerati senzorii primari ai patogenilor. Domeniul imunobiologiei TLR-urilor s-a dezvoltat rapid dupa descoperirea proteinelor Toll la musculita de otet (drosophila melanogaster). Gena Toll, descoperita prima data la Drosophila controleaza pattern-ul dorso-ventral in perioada de dezvoltare embriogenica a mustei. Proteina produsa de gena Toll este un receptor transmembranar important pentru imunitatea antifungica a adultului de Drosophila.

Primul receptor uman Toll-like a fost descris in 1994 de catre Nomura si colaboratorii (Nomura, 1994). Pentru ca functia imuna a receptorului Toll nu era inca descoperita, s-a presupus ca TIL (acum cunoscut sub numele de TLR 1) ar putea participa in dezvoltarea mamiferelor. Totusi, in 1991, (inaintea descoperirii TIL-ului), a fost observata o molecula cu rol clar in functia imuna la mamifere, receptorul pentru interleukina-1, care are structura omologa cu receptorul Toll al Drosophilei, portiunile citoplasmatice ale ambelor molecule fiind similare.

In 1997, Charles Janeway si Ruslan Medzhitov au aratat ca un receptor Toll-like, cunoscut acum drept TLR-4, ar putea, cand este legat artificial de antibiotice, sa produca activarea anumitor gene necesare pentru initializarea unui raspuns imun adaptativ (Medzhitov, 1997).

Pana in prezent au fost descoperite la om si soarece 13 tipuri de TLR numerotate astfel: TLR1-TLR13. Ele au fost descoperite si la alte mamifere, toate functionand, se pare, ca receptori ai sistemului de aparare nespecifica. TLR-urile difera prin expresie, specificitatea de unire cu ligandul, calea de semnalizare utilizata si raspunsul celular pe care il induc. Desi nu se cunosc toti liganzii TLR la momentul actual, cei cunoscuti sunt PAMP-uri derivate din toate clasele majore de patogeni – bacterii, virusuri si protoazoare. TLR1-TLR9 sunt comuni pentru om si soarece. TLR10 se exprima doar la om (datorita unui stop-codon pe gena TLR10 la rozatoare), in timp ce TLR11 este exprimat doar la soareci. TLR10 la om si TLR12 RLR13 la soareci nu sunt foarte bine caracterizate , iar functiilor sunt inca neclare. TLR1, 2, 4, 5 si 6 sunt exprimate pe suprafata celulara si recunosc PAMPs-uri bacteriene, fungice sau de la protozoare, in timp ce TLR3, 7, 8 si 9 se exprima intracelular si recunosc acizi nucleici virali sau bacterieni (Brint, 2005; William, 2008).

Nu se stie inca daca TLR-urile pot recunoaste produse moleculare asociate cu parazitii multicelulari. PAMP-urile care semnalizeaza utilizand TLR-uri sunt foarte diferite structural si le lipsesc proprietatile chimice comune. Mecanismul exact de recunoastere a PAMP-urilor de catre TLR-uri nu este inca cunoscut, dar informatiile disponibile sugereaza ca TLR-urile recunosc liganzii in mod direct si ar putea functiona ca PRR-uri bona fide. Este interesant faptul ca cel putin cateva TLR-uri pot recunoaste mai mult de un ligand si de asemenea acesti liganzi pot fi structural neinruditi. Alt aspect important al functiei TLR-urilor este ca unele TLR-uri utilizeaza proteine accesorii pentru recunoasterea ligandului (Kawai, 2010).

TLR-urile sunt o familie de glicoproteine transmembranare de tip I care sunt formate dintr-un domeniu extracelular bogat în leucinã (leucine rich repeat domain -LRRs) sau domeniul inalt repetitiv de leucina necesar reconoasterii PAMPs si un domeniu intracitoplasmatic (Toll/interleukin-1 receptor –TIR domain) necesar semnalizarii intracelulare. Domeniu intracelular TIR este omolog  cu  domeniul intracelular al membrilor famililei de receptori IL-1. LRR-urile sunt gasite in multe proteine functionale distincte unde se pare ca sunt implicate in interactiunile dintre proteine si recunoasterea liganzilor. Domeniul TIR este un modul de semnalizare conservat, gasit in proteine citoplasmatice ale animalelor si plantelor, pe langa receptorii Toll si IL-1. Aproape, daca nu chiar toate proteinele care contin domenii TIR in animale si plante sunt implicate in caile de aparare ale gazdei. Structura sterica a domeniului extracelular necesar recunoasterii PAMPs a fost descifrata pentru o serie de TLR. Forma spatiala a TLR-urilor este caracteristica- de potcoava (Kumar, 2009; Takeuchi, 2010).

TLR sunt de asemenea de importanta deosebita pentru activarea si maturarea limfocitelor B in timpul infectiilor sau dupa vaccinari, prin cai dependente sau independente de limfocitele T. TLR regleaza raspunsul limfocitelor B inducand proliferarea acestora, schimbarea izotopului Ig. TLR pot de asemenea regla diferentierea si mentinerea limfocitelor T si B prin productia de IL-12, IL-23 si IL-27. Aceste citokine induc dezvoltarea Th1 si Th17 si ajuta astfel raspunsul imun mediat celular (Rakoff-Nahoum, 2009).

Structura TLR3 (http://en.wikipedia.org/wiki/File:TLR3_structure.png)

Structura TLR4 (http://en.wikipedia.org/wiki/File:TLR4_structure.png)

TLR4 (numit si CD284) este exprimat de multe tipuri de celule, predominant de celulele sistemului imun, inclusiv macrofagele, celulele dendritice, neutrofilele, celulele mastoide si limfocitele B (Medzhitov, 2001). TLR4 este exprimat si de numeroase tipuri de celule nehematopoetice, inclusiv celulele endoteliate, fibroblasti, celule epiteliale de suprafata si celule musculare. TLR4 este receptorul de transductie a semnalului pentru LPS-uri. Acest fapt a fost descoperit prin clonarea de pozitie a genelor LPS la soarecii C3H/HeJ si a fost confirmat la soarecii TLR4 knockout. In soriceii C3H/HeJ, TLR-ul nu poate semnaliza ca raspuns la LPS din cauza unei mutatii punctiforme in domeniul TIR care se traduce prin substitutia prolinei cu histidina in pozitia 712. Analiza soriceilor C3H/HeJ si soriceilor TLR4 knockout au demonstrat ca TLR4 este crucial in recunoasterea LPS-ului si raspunsul macrofagelor, celulelor dendritice si limfocitelor B (Medzhitov, 1997). Raspunsurile in vivo la LPS (cum ar fi socul endotoxic) sunt complet revocate in soriceii cu deficit de TLR4.

3.4 Recunoasterea LPS de catre TLR

 Mecanismul de recunoastere al LPS-urilor de catre TLR4 este complex si necesita o multitudine de proteine accesorii. LPS se leaga mai intai de LBP (LPS-binding protein), o proteina serica care leaga monomeri de LPS si ii transfera la CD14 (Akira, 2009). CD14 este o proteina exprimata pe suprafata macrofagelor si pe unele subpopulatii de celule dendritice, dar exista si ca proteina solubila in ser. CD14 leaga LPS cu o mare afinintate dar ii lipseste un domeniu intracelular pentru semnalizare. Importanta CD14 in recunoasterea LPS a fost demonstrata prin defectul in raspunsul la LPS in soriceii cu deficit de CD14 (Akira, 2003; Wright, 1990). Domeniul extern al TLR 4 este asociat cu o alta proteina accesorie numita MD-2. MD-2 este o proteina mica fara domeniu transmembranar, dar se gaseste pe suprafata celulara in complex cu TLR4. Functia MD-2 nu este inca cunoscuta cu exceptia faptului ca este necesara pentru recunoasterea LPS de catre TLR4. Diferite abordari experimentale au indicat ca TLR4 si MD-2 realizeaza un contact direct cu LPS, desi mai sunt multe elemente nedescoperite despre compozitia complexului TLR4 si a mecanismului de recunoastere a LPS (Shimazu, 1999).  

Problema recunoasterii LPS se complica si mai mult prin descoperirea unui alt receptor de pe membrana celulara care se pare ca coopereaza cu TLR4 in recunoasterea LPS de catre limfocitele B. Aceasta proteina, numita RP105 (CD180), este prezenta aproape exclusiv pe limfocitele B si are un domeniu extern inrudit cu cel al TLR4 (Miyake, 1998). Similar TL4, RP105 este asociata prin domeniul sau extern unei proteine accesorii numite MD-1, care este omologa proteinei MD-2. Spre deosebire de TLR4, proteinei RP105 ii lipseste un domeniu TIR, dar are in schimb o scurta coada citoplamatica care contine regiunea cu proprietati tirozin fosforilante, YXXI. Imperecherea incrucisata a arp105 duce la proliferarea limfocitelor B si cresterea numarului de molecule costimulante CD80/CD86, efect similar celui produs de stimularea LPS (Miyake, 1998). Se cunoaste de asemenea ca RP105 induce activarea familiei tirozin kinazice Src, inclusiv LYN. Deletia genei RP105 duce la reducerea capacitatii de a raspunde la stimularea cu LPS a limfocitelor , desi defectul nu este la fel de complet cu cel observat in deficitul limfocitelor B de TLR4. Deci, RP105 coopereaza cu TLR4 in recunoasterea LPS de catre limfocitele B dar mecanismul acestei cooperatii ramane necunoscut.

TLR4 este implicat si in recunoasterea altor liganzi, cum ar fi acidul lipoteicoic (LTA), component al peretelui celular al bacteriilor gram pozitive, HSP60 (heat-shock protein 60), proteina de fuziune (F) a virusului respirator sincitial (Rich, 2005).     

3.5 Caile de semnalizare intracelulara ale TLR

Activarea TLR de catre produse microbiene duce la activarea a numeroase gene care determina raspunsurile inflamatorii si imune. Acestea includ citokine inflamatorii (ex. TNF-1, IL-1, IL6 si IL-12), chemokine (ex: IL-8 chemoatractant neutrofilic), molecule efectoare antimicrobiene (ex: sintetaze de oxid nitric si peptide microbiene) si MHC si molecule co-stimulante, toate acestea contribuind la eradicarea agentului patogen (Kawai, 2010).

Stimularea TLR-urilor activeaza calea NF-κB precum si 3 cai de semnalizare MAP kinazica, JNK, p38, si ERK. Functia a diverse componente a cailor de semnalizare TLR au fost elucidate prin abordari biochimice si/sau a genelor knockout. Aceste complicatii includ proteinele adaptor MyD88 si Tollip, serin/treonin protein kinaza IRAK (receptorul IL-1 asociat kinazic) si ligaza ubiquitinei TRAF6 (receptor TNF asociat factorului 6), MAP kinaz kinaz kinaza (MAP3K) TAK1 si  kinaza I-B IKKa si IKKb. Toate aceste componente functioneaza atat in caile de semnalizare TLR cat si pentru receptorul IL-1 (Kawai, 2010; Kumar, 2009; Takeuchi, 2010).

Legarea TLR induce dimerizarea receptorilor (sau oligomerizare de ordin mai mare) si/sau o schimbare conformationala care activeaza urmatoarele evenimente de semnalizare. TLR activate recruteaza proteinele adaptante MyD88 sau Tollip (Aderem, 2000). MyD88 este formata dintr-un capat N terminal, domeniu al mortii si un capat C terminal, domeniu TIR. Domeniul TIR al MyD88 interactioneaza cu domeniul Tr al TLs, cat timp domeniul mortii interactioneaza cu domeniul moarte in IRAK. Deci MyD88 functioneaza recrutand IRAL pentru a activa receptorii si, demonstrat prin studii de gene tintite, are un rol crucial in semnalizarea downstream  a IL-1R si TLR2 (Adachi, 1998). Tollip este de asemenea asociat cu IRAK si s-a demostrat ca recruteaza IRAK la complexe receptoare; nu se cunoaste inca cum este functia sa diferita de cea a MyD88 care este inca clara. Deci, Tollip are deficit de domeniu TIR, dar are domeniu C2, care in alte proteine mediaza legarea de lipide membranare (Burns, 2000; Didierlaurent, 2006).

In plus fata de IRAK, doua kinaze relativ apropiate, IRAK2 si IRAKM, au fost de asemenea identificate si raportate ca functioneaza in caile de semnalizare TLR si IL-1R. Existenta mai multor IRAK-uri, dintre care unele ar avea functii similare sau redundante, ar putea explica de ce deficitul de IRAK1 la soricei (spre deosebire de cei carora le lipsesc MuD88) au un defect mai bland in semnalizarea TLR (Medzhitov, 2007). Recrutarea IRAK la receptori duce la autofosforilarea IRAK si disociatia de la complexul receptor.  Odata fosoforilat IRAK, interactioneaza si activeaza TRAF6, care este membru a familiei TRAF din clasa liganzilor RING-finger E3. Alti membri ai familiei TRAF transduc semnalul prin receptori apartinand superfamiliei de receptori TNF. Activarea TRAF5 este declansata prin oligomerizare indusa de interactii cu IRAK fosforilata. Odata activat TRAF6 functioneaza in tandem cu enzimele noncanonice E2 care conjuga ubiquitina Ubc13 si Uev1A, pentru a conjuga lanturi de poliubiquitina pe ea insasi (si probabil pe alte tinte neidentificate inca).

Spre deosebire de lanturile de poliubiquitina care tintesc substrate pentru degradare de proteaze 26S, care sunt legate prin K48 a ubiquitinei, TRAF6 catalizeaza conjugarea lanturilor noncanonice K63-linked polyubiquitin (Akira, 2006). In sisteme de reconstituire in vitro evenimentul de ubiquitinare este necesar si suficient pentru activarea ulterioara a complexelor IKK de catre kinaza TAK1. Cum TAK1 nu pare a fi o tinta a ubiquitinarii nu este inca clar cum autoubiquitinarea TRAF6 acitiveaza TAK1. Totusi TAK1 activata de TRAF6 fosforileaza IKKbeta, care duce la activarea caii NF-B. In plus TAK1 activat de TRAF6 fosforileaza si MAP kinaz kinaza MKK6, care in schimb fosforileaza MAPK JNK. Deci activarea TAK1 de catre o reactie de ubiquitinare catalizata de TRAF6 duce la activarea atat a caii NF-B cat si a celei AP-1 (Kumar, 2011). Pe langa TAK1, alte kinaze (precum MAP3K NIK) pot de asemenea activa complexul IKK in sisteme in vitro. Studii genetice nu sprijina rolul crucial pe care aceste kinaze l-ar avea intr-o activare a IKK mediata de TLR (sau IL-1R); ramane de vazut daca soriceii cu deficit TAK1 vor avea un defect in aceasta privinta.

Familia de factori transcriptionali NF-B joaca un rol crucial in apararea nespecifica. La musti, cat si la mamifere majoritatea genelor de inductie a apararii sunt reglate foarte strict, cel putin in parte, de catre caile NF-B. NF-B este de obicei compus dintr-un heterodimer de 2 transactivatori ai familiei Rel/NF-B (cei mai comuni sunt p50 si p65) legati de o unitate inhibitorie numita I-B ( inhibitor al B). In celule nestimulate, I-B mascheaza situsul de legare al semnalului nuclear NF-B si deci blocheaza translocarea nucleara. In urma stimularii de liganzi TLR si IL-1 (precum si alte semnale), I-B este rapid fosforilat si degradat de proteaza 26S. Eliberat de ancora citosolica, NF-B poate transloca spre nucleu unde activeaza expresia genelor tinta. Degradarea dependenta de fosforilare a I-B, un checkpoint esential in activarea NF-B este controlat de complexul IKK (kinaza I-B) . complexul IKK este format din 2 kinaze, IKK-alpha si IKK-beta si o a treia subunitate necatalitica, IKK-gamma. Studii mutagene au stabilit ca tinte ale fosforilarii IKK-beta serina 32 si 36 (Kumar, 2011). Fosforilarea la aceste locuri da posibilitatea recunoasterii I-B de catre proteina F-box/WD, beta-TrCP, subuniatea receptoare a unui complex ligand SCF mutisubunitar care ulterior ubiquiteaza I-B si deci tinteste I-B pentru degradare.

In timp ce toate TLR-urile (si IL-1R) pot induce calea de semnalizare descrisa mai sus, este clar ca unele, daca nu chiar toate, trebuie sa activeze si cai aditionale. Prima proba a semnalizarii diferite de catre TLR-uri a venit odata cu analiza de celule provenite din soricei cu deficit de MyD88. Macrofagele cu deficit de MyD88 au esuat sa produca citokine inflamatorii ca raspuns la stimularea cu LPS, dar surprinzator si-au pastrat capacitatea de activare a NF-B si MAP kinaze (Kawai, 1999; Takeuchi, 2000). Deoarece TLR4 este necesar tuturor raspunsurilor celulare la LPS, aceste observatii au sugerat existenta unei cai MyD88 independente care sa induca NF-B si MAP kinaze. Exista insa si TLR-uri care nu determina niciun raspuns celular in absenta MyD88. Liganzii TLR pot fi divizati in 2 categorii respectand caile pe care le induc: CpG si MALP-2 (care semnalizeaza prin TLR9 si respectiv TLR2) necesita MyD88 pentru toate raspunsurile analizate, in timp ce LPS si poly(IC) (care semnalizeaza prin TLR4 si respectiv TLR3), au nevoie de MyD88 pentru producerea de citokine, dar pot activa NF-B si MAP kinaza in absenta MyD88. In plus, TLR3 si TLR4 pot induce maturarea DC printr-o cale MyD88 independenta (Kumar, 2011). IL-1R este dependenta de MyD88 pentru a semnaliza. Deci, TLR2, TLR9 si IL-1R semnalizeaza numai printr-o cale MyD88 dependenta, in timp ce TLR4 si TLR3 pot semnaliza si printr-o cale MyD88 independenta (Medzhitov, 2007; Yamamoto, 2002).

Un nou domeniu TIR continand proteine care ar duce la activarea caii MyD88 independente in aval de TLR4 si TIRAP (pentru domeniile TIR care contin o proteina adaptoare, cunoscuta si ca Mal, pentru adaptori MyD88-like). Acest adaptor, care contine un domeniu TIR la capatul C terminal, a fost implicat in semnalizarea MyD88  independenta deoarece o forma negativa dominanta de TIRAP inhiba activarea NF-B indusa de TLR4 dar nu si TLR9 sau IL-1R (Horng, 2002). O alta proteina care ar putea avea un rol in activarea raspunsurilor MyD88 independente este kinaza reglata de interferon, PKR. PKR este activata de LPS, poly(IC), si CpG in macrofagele salbatic si de catre LPS si poly(IC), dar nu si de CpG in omologii cu deficit de MyD88 (Kumar, 2009). PKR se asociaza cu TIRAP, sugerand ca TIRAP ar putea regla activarea PKR in calea MyD88 independenta in aval de TLR4 (Horng, 2001).

Tintele caii de semnalizare MyD88 independente au fost identificate printr-un studiu de hibridizare comparand tipurile salbatice si cele cu deficit de MyD88 de macrofage stimulate cu ligandul LPS TLR4. Aceste gene codifica chemokina IP-10, si genele induse de interferon GARG16 si IRG1. Ligandul TLR2, MALP-2, care induce IL-12 si TNF asa cum fac si alti liganzi TLR, nu induc expresia IP-10. IP-10 este deci un exemplu de gena reglata/activata de un subset de TLR-uri. Identificarea altor astfel de gene si raspunsuri reglate diferit de TLR-uri diferite va fi importanta in intelegerea aparitiei raspunsului imun mediat de TLR-uri (Sieling, 2002).

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Toll-like_receptor_pathways_revised.jpg

Majoritatea studiilor au fost insa efectuate utilizand un singur ligand si pe animale de laborator, astfel incat ele ar putea sa nu reflecte intocmai complexitatea interactiunii gazda-patogen in contextul patologiei umane (Vasilescu, 2009a). In plus, patogenii sunt constituiti din multiplii liganzi care pot activa multiple cai de semnalizare rezultand in interferenta semnalelor transmise si, deci, o gama variata de raspunsuri imune. De aceea este necesar ca studiile viitoare de imunobiologie sa se concentreze pe stimularea celulelor imune cu mai multi liganzi simultan pentru a descifra reteua de efecte imune innascute si influenta lor asupra raspunsului adaptativ.

La ora actuala, studiile umane sugereaza ca TLR-urile nu ofera protectie imuna impotriva unei game variate de agenti infectiosi si, deci, ca exista PRR-uri neidentificate cu rol esential in apararea antimicrobiana. De aceea este necesara identificarea si caracterizarea de noi PRR-uri. aceste studii vor fi importante nu doar pentru intelegrea corecta a interactiunii gazda-patogen, dar si pentru dezvoltarea unor strategii terapeutice adecvate.

3.6 microRNA- noi actori implicati in sepsis

MicroRNA sunt fragmente de ARN non-codant, recent descoperite, cu o lungime de 20- 22 de nucleotide. Rolul lor constă în reglarea post-transcripțională a expresiei genelor prin degradarea sau represia translației unor tipuri specifice deARNmesager ("target"). Importanța microRNA-urilor în reglarea funcțiilor celulare normale a devenit mai clară odată cu descoperirea și studierea mai multor tipuri de microRNA,respectiv a targetului lor, ARN mesager. Rolul exact al rețelei de microRNA precum și rolul individual al fiecărui microRNA în cadrul proceselor celulare se află în continuare în studiu (Du, 2007; Lu, 2009).

Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferențierea și ciclul celular. MicroRNA sunt implicate în reglarea funcțiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut și a celui dobândit, în dezvoltarea și diferențierea celulelor imune și în prevenirea autoimunității (Lewis, 2005; Selbach, 2008). MicroRNA sunt una din cele mai bine caracterizate categorii de ARN non-codante (ncRNA), adică ARN care nu pot fi transformate în proteine. Ele sunt implicate în dezvoltarea organismelor (plante, insecte, nematode, fungi,virusuri, inclusiv organismul uman unde modulează până la o treime din genele ce alcătuiesc genomul uman).

Primul microRNA, microRNA lin-4, a fost descoperit în1993 de către Victor Ambros, Rosalind Lee și RhondaFeinbaum în timpul unui studiu efectuat pe Caenorhabiditis elegans. Rolul său este acela de a controla tranziția de la stadiul de larvă la stadiul de adult prin inhibiția specifică a translației ARN mesager lin-14 în proteina lin-14, esențială în acest proces de dezvoltare (Lee, 1993). Curând după acest eveniment, au fost descoperite mii de microRNA, foarte bine conservate de-alungul evoluției speciilor eucariote și care îndeplinesc un rol important în reglarea negativă a expresiei genice.

Rolul microRNA in sepsis

In sistemul imun, microRNA intervin în diferențierea celulelor limfocitare B și în inducția, funcția și menținerea reglării liniei celulare limfocitare T. La nivelul celulelor dendritice și macrofagelor intervin prin intermediul receptorilor Toll-like și au rolul de a supresa funcția lor efectoare înainte de activarea lor sau de a urmări funcția lor după stimulare (Lu, 2009). Studii recente au dovedit implicarea acestei clase de RNA non-codant în infecțiile virale. Unele microRNA protejează împotriva infecțiilor virale sau ajută sistemul imun în combaterea acestor infecții (exemplu: miR-32), alte microRNA sunt utilizate sau sintetizate de către virusuri pentru a contribui la menținerea latentă a infecției virale (virusul Epstein- Barr, citomegalovirusul – HCMV) (Pauley, 2008). Expresii modificate ale microRNA s-au întâlnit în unele tipuri de proliferare malignă, unde pot avea atât rol de onco- gene (miR-21, miR-106 și miR-155), cât și de supresoare tumorale (let-7, miR15a/16, miR-34a și miR-143/145). Prima dovadă în acest sens a fost reprezentată de două tipuri de microRNA, miR15a/miR-16-1 ce reglează post-transcripțional factorul anti-apoptotic Bcl2. O expresie crescută a acestora este corelată cu moartea celulară programată întâlnită în cadrul leucemiilor limfocitare cronice. Expresii crescute ale miR155 s-au găsit în cazul unor tumori solide precum tumorile de sân, de colon, de plămân dar și în limfoame Hogdkin sau limfoame cu celule B. Un alt microRNA, let-7 reglează negativ expresia oncogenei Ras, iar o exprimare scăzută a acestui microRNA este corelată cu un prognostic prost în cazul cancerului de plămân (Pauley, 2008).

Unele microRNA sunt deja utilizate ca biomarkeri în cancere, iar altele sunt candidate pentru terapia genică a cancerului (Croce, 2009). Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a monocitelor și macrofagelor, s-a înregistrat o creștere a expresiei unor tipuri de microRNA cum ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-132 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006; Tili, 2007).

3.7 Toleranta la endotoxina ca mecanism protector in sepsis

Imunitatea înnăscută joacă un rol important în prima linie de apărare a organismului prin identificarea microorganismelor patogene de către receptorii de recunoaștere specifică de pe suprafața monocitelor, macrofagelor și celulelor dendritice. O clasă de receptori implicați în imunitatea înnăscută, bine caracterizată și bine conservată de-alungul evoluției speciilor este reprezentată de Receptorii TOLL-like (TLR). Semnalul indus de LPS prin intermediul receptorilor TLR4 duce la activare factorului de transcripție NF-kB și la producția de citokine inflamatorii precum TNF-a, IL-1/3 și antiiflamatorii cum ar fi IL-10 (Sheedy, 2008). Acest proces necesită o reglare fină pentru a preveni inflamația excesivă ce poate conduce la șoc endotoxinic, insuficiență de organ și în final la deces.

Un mecanism de adaptare fiziopatologică și de apărare împotriva acestor inflamații excesive este reprezentată de toleranța la endotoxină (TE). Celulele expuse repetat la concentrații scăzute de endotoxină intră într-o stare tranzitorie în care nu mai răspund la următoarele stimulări cu endotoxină, respectiv devin tolerante la endotoxină. Fenomenul a fost observat in vitro și in vivo atât la animalele de experiență cât și la oameni. Prima experiență a fost efectuată în 1946 de către Paul Beeson (Beeson, 1947) care a observat că în urma injectării repetate zilnic cu LPS la iepuri s-a produs o scădere progresivă a răspunsului febril. Rolul principal al TNF-a în acest fenomen a fost apreciat abia în 1980, când a fost considerat cel mai bun marker al toleranței la endotoxină. Expresia acestui mediator a scăzut drastic la a doua stimulare cu LPS la animale, spre deosebire de răspunsul la prima stimulare (Vasilescu, 2009a). Astfel, putem considera toleranța la endotoxină un fenomen exclusiv experimental care cuprinde trei etape:

1. prima etapă: stimularea cu LPS la care monocitele/macrofagele răspund prin eliberarea unor mari cantități de citokine pro-inflamatorii, spre exemplu TNF-a;

2. a doua etapă: intervalul de timp până la cea de-a doua stimulare;

3. a treia etapă: stimularea repetată, la care răspunsul monocitelor/macrofagelor este cu o eliberare scăzută de citokine pro-inflamatorii, respectiv TNF-a.

Apariția acestui fenomen a fost raportată în diverse situații patologice ca sepsisul, pancreatita acută, intervențiile chirurgicale majore, trauma.

Un exemplu relevant de toleranță la endotoxină s-a observat la nivelul leucocitelor pacienților cu sepsis. Complexitatea acestei boli constă în natura sa bi-fazică, caracterizată inițial de inflamație exagerată, urmată apoi de o fază de "imunosupresie", în care celulele se află într-o stare refractară, asemănătoarea celei prezente în cadrul fenomenului de toleranță la endotoxină. Mai mult, monocitele izolate de la pacienții cu sepsis prezintă aceleași caracteristici întâlnite în cadrul fenomenului de toleranță la endotoxină: scăderea expresiei genelor citokinelor inflamatorii (TNFa, IL-6, IL-2, IL-1/3), cresterea expresiei genelor citokinelor anti-inflamatorii (IL-10, TGF/3), reducerea capacității de a prezenta antigenul datorită scăderii expresiei unor molecule MHC de clasa II, scăderea expresiei HLA-DR la monocite, cuplată cu o proliferare deficitara a liniei celulare limfocitare T precum și o scădere a producției de IFNy (Biswas, 2009).

Starea de toleranță la endotoxină în cadrul sepsisului se consideră a fi un mecanism de protecție împotriva șocului endotoxinic și ischemiei. Apariția sa este asociată cu un risc crescut de a dezvolta infecții secundare. Mortalitatea în sepsis datorată acestor infecții secundare este strâns corelată cu starea de imunosupresie dezvoltată în timpul toleranței la endotoxină (Biswas, 2009).

Progesele recente in intelegerea procesului inflamatiei, caii de semnalizare TLR si modularea expresiei genice a sistemului monocito/macrofagic a determinat o revizuire a fenomenului tolerantei la endotoxina in lumina acostor noi descoperiri.

In primul rand TE poate fi vazuta ca un raspuns de feedback negativ ca rezultat la un proces inflamator dereglat (ex. sepsis)

In al doilea rand este mai degraba un caz de reprogramare genetica si imunomodulare decat un fenomen de downregulation global al expresiei si functiei genetice. In acest context temenul de ᾽toleranta᾽ ar putea fi inselator.

In al treilea rand reglementarea fenomelului se face la multiple niveluri implicand receptori, molecule semnal, regulatori negativi si modificari post-transcriptionale precum remodelarea cromatinei si reglarea de catre miRNA

Si nu in ultimul rand aceasta stare endotoxin-toleranta, termen resstrictionat la sepsis sau SIRS poate fi observata in multe alte situatii clinice precum ischemia hepatica, sindroamele coronariene, fibroza cistica si poate chiar in cancere. Astfel incat lectiile invatate din fenomenul tolerantei la endotoxina ar putea fi relevante in intelegerea altor afectiuni. Cu toate acestea ramane un subiect deschis daca toleranta la endotoxina reprezinta o paradigma generala a imunosupresiei in diferite boli.

Capitolul 4: pacientul splenectomizat

4.1 Elemente de anatomie macroscopică și microscopică a splinei

Splina este un organ limfoid abdominal caracteristic vertebratelor, având o greutate la om de 150-250 de grame. În cavitatea peritoneală splina este situată în etajul superior, delimitată superior de diafragm și inferior de mezocolonul transvers. Deși este un organ mobil, în special cu mișcările respiratorii, splina este menținută în poziție prin legăturile peritoneale, prin aspirația toracică și prin presiunea intraabdominală, realizată de contracția tonică a mușchilor anterolaterali ai abdomenului. Cu mișcările respiratorii, splina își schimbă în medie cu 2 cm poziția în ortostatism (Popovici, 1995).

Mobilitatea ei este condiționată totodată de mobilitatea stomacului si colonului transvers. Ligamentele care participă la menținerea splinei în poziție sunt: ligamentul gastro-splenic, care se continuă superior cu ligamentul gastro-frenic, ligamentul freno-colic stâng și cel mai puternic dintre toate, ligamentul spleno-renal (Popovici, 1995).

Splina se aseamănă ca formă cu o boabă de cafea și i se descriu, o față diafragmatică și o față viscerală, ce prezintă la rândul său o fațetă renală, o fațetă gastrică și inferior fațeta colică.

Fața diafragmatică (dorsolaterală) a splinei este convexă și se aplică pe partea costală a hemidiafragmului stâng, de la coasta a IX-a la coasta a XI-a. Prin intermediul diafragmului, fața diafragmatică are raporturi cu sinusul pleural costodiafragmatic stâng și în inspir, cu lobul pulmonar inferior stâng, ceea ce explică coafectarea splinei și complexitatea leziunilor în traumatismele toracice inferioare.

Fața viscerală (ventromedială) prezintă un șanț longitudinal (marginea medială), care o împarte în două zone concave distincte: zona ventrocranială ce se mai numește și fațeta gastrică datorită raporturilor sale cu fața posterioară a fundului și a părții proximale a corpului gastric și zona dorsocaudală sau fațeta renală care este în raport cu fața ventrolaterală a rinichiului stâng (Angelescu, 2007).

Pe fațeta gastrică, la 1-5 cm de marginea medială și paralelă cu ea, se găsește hilul splinei format dintr-o înșiruire de fosete vasculare, dispuse pe unul sau două rânduri, la nivelul cărora intră sau pleacă vasele pediculului splenic. Hilul este în mod obișnuit în raport intim cu coada pancreasului, într-o zonă numită fațeta pancreatică. Polul inferior al splinei prezintă o impresiune a flexurii colice stângi (fațeta colică).

Cei doi poli splenici sunt uniți prin marginea dorsală și marginea ventrală, ultima fiind mai ascuțită, convexă și având adesea incizuri (creneluri), care sunt utile în recunoașterea clinică a organului (Angelescu, 2007; Popovici, 1995).

(Angelescu, 2007)

Fiind situată sub rebordul costal stâng, splina nu se poate palpa. Ea poate fi palpată în splenomegalii sau la cei cu ptoză viscerală (mai frecvent la femei). Matitatea splenică prin percuție, dă imaginea unei jumătați de elipsă cu extremitatea anterioară la locul unde linia axilară întretaie coasta aX-a sau aXI-a. Matitatea extremității superioare nu se poate stabili din cauza marginii inferioare a plămânului stâng (Popovici, 1995).

Splina este învelită de peritoneul visceral, hilul fiind singura zonă în care lipsește foița viscerală peritoneală. La nivelul hilului se întâlnesc ligamentele peritoneale ale splinei, care ancorează organul la viscerele învecinate și îl mențin suspendat în hipocondrul stâng: ligamentul sau epiploonul gastro-splenic (la porțiunea verticală a marii curburi gastrice), ligamentul pancreatico-splenic (la pancreas) conținând coada pancreasului și pediculul vascular splenic, ligamentul spleno-renal (la rinichiul stâng) și freno-splenic. Ligamentul spleno-colic (sau freno-colic stâng) susține polul inferior splenic. Mobilitatea splinei depinde de tensiunea sau laxitatea ligamentelor și a vaselor splenice (Angelescu, 2007; Popovici, 1995).

Irigația arterială este asigurată în principal de artera splenică, ram al trunchiului celiac. Rareori, artera splenică provine direct din aortă. După ce emite ramuri pancreatice pentru corp si coadă, artera gastroepiploică stângă și arterele gastrice scurte, artera splenică se divide în vecinătatea hilului în două ramuri principale sau artere polare (84% din cazuri) sau trei ramuri principale (16% din cazuri). Artera polară superioară ia naștere precoce din trunchiul arterei splenice, înainte de divizarea acestuia, în 75% din cazuri, ceea ce are importantă în rezecțiile splenice subtotale. Uneori, aceasta provine direct din trunchiul celiac. Fiecare ramură a arterei splenice se ramifică în 4-6 ramuri secundare, care pătrund în parenchim și se divid din nou rezultând in jur de 36 de ramuri arteriale subsegmentare (Ilkins, 2003).

În ceea ce priveste microirigația splinei, aceasta e realizată de arterele trabeculare care după cateva rânduri de ramuri pătrund in pulpa splenică și devin artere pulpare (arteria pulparis). In reticulul splenic in jurul arterelor pulpare se află tecile si foliculii limfatici, fapt pentru care au fost numite artere centrale (arteria centralis) deși, uneori sunt la periferia foliculului. Artera centrală e de tip muscular și se divide la nivelul tecilor si corpusculilor în mai multe ramuri care se desprind radiar și in unghi drept, ce merg spre periferie. Artera centrală dă naștere la ieșirea din teci si corpusculi unei alte categorii de artere, care se anastomozează între ele, numite arteriole penicilata (arterial penicilaris), un tip de arteriole terminale deci, cu calibrul de 25 mm, situate in cordoanele pulpei roșii.

Aceste arterio (Ilkins, 2003; Popovici, 1995)le dau naștere capilarelor glumare fapt pentru care sunt numite si arteriole preglumare. Ele au o particularitate, prin aceea că in porțiunea lor precapilară prezintă teci de inveliș. La nivelul tecilor sunt inconjurate de numeroase macrofage dând vasului un aspect ovoid sau elipsoidal, de unde și denumirea de arteriole elipsoidale (arteria ellipsoidea).

Drenajul venos este asigurat de vena splenică, care se formează la nivelul hilului prin confluența venelor segmentare (2-6), satelite ale ramurilor arteriale. Trunchiul venos primește ca afluenți venele gastrice scurte, vena gastroepiploică stângă și venele pancreatice care însoțesc arterele corespunzătoare (Popovici, 1995).

În traiectul său retropancreatic se unește cu vena mezenterică inferioară si apoi cu vena mezenterică superioară pentru a forma trunchiul venei porte. Anastomozele afluenților venei splenice cu tributarele venei gastrice stângi, cu venele esofagiene și diafragmatice stângi reprezintă căi colaterale în sindromul hipertensiunii portale și cauza varicelor gastrice si esofagiene (Ilkins, 2003).

Deși reprezintă un organ limfoid important, splina este integrată în sistemul vascular sangvin și nu are vase limfatice aferente. Vasele limfatice eferente au originea în pulpa albă, sunt satelite vaselor sangvine și drenează în ganglionii hilului splenic. Ganglionii hilari primesc vasele limfatice ale marii curburi gastrice prin ligamentul gastrosplenic (satelite venelor scurte si venei gastroepiploice stângi), vasele limfatice din porțiunea stângă a marelui epiploon și limfaticele cozii pancreasului.

Unele vase eferente din ganglionii splenici fac releu în ganglionii limfatici retropancreatici (grupul pancreaticosplenic) pentru a ajunge în grupul celiac iar altele drenează direct in ganglionii celiaci (Ilkins, 2003).

Inervația este asigurată de fibre nervoase vegetative, aproape exclusiv simpatice, deși există și câteva fibre vagale ce provin din plexul celiac. Plexul nervos splenic se formează in hil și înconjoară ramurile vasculare extrasplenice și intrasplenice. Fibrele eferente motorii, mai sărace decât la alte mamifere, se distribuie mușchilor netezi si controlează contracțiile splinei (Angelescu, 2007).

Arteriografiile, tehnicile de coroziune si ligatura ramurilor hilare ale arterei splenice au demonstrat existența a 2-5 segmente splenice care sunt autonome din punct de vedere vascular, ramurile de diviziune primară ale arterei splenice fiind artere terminale la nivelul parenchimului splenic (Ilkins, 2003).

Segmentele splinei corespund numeric arterelor și venelor hilare, sunt despărțite de septuri avasculare sau slab vascularizate și se suprapun perpendicular pe axul lung al organului. La poli, segmentele sunt piramidale, iar in partea centrală au forma de “pană”. Prezența segmentelor face posibilă efectuarea splenectomiilor parțiale. Între arterele segmentare și ramificațiile lor nu există conexiuni sau acestea se reduc la câteva anastomoze mici care traversează septurile intersegmentare și au importanță in rezecțiile parțiale. Existența acestor conexiuni intersegmentare și a unor anastomoze între ramurile extrasplenice ale arterei splenice (20 % din cazuri) explică de ce ligatura vaselor hilare sau embolizarea lor este uneori bine tolerată, fără necroza totală de splină (Ilkins, 2003).

Splina este invelită de o capsulăcu grosimea de 0,1 mm, alcatuită din colagen reticular si țesut conjunctiv elastic. Fibrele muscular netede sunt inconstante și slab reprezentate la om. Prezența capsulei explică posibilitatea formării hematoamelor subcapsulare și facilitează splenorafia. De pe fața internă a capsulei splenice se desprind prelungiri trabeculare ce pătrund in parenchim.

La nivelul hilului, capsula se reflectă pe vasele sangvine și ajunge în pulpa splenică sub forma unor teci conjunctive perivasculare. Între prelungirile trabeculare există o bogată rețea de fibre reticulare care reprezintă suportul parenchimului splenic format din pulpa albă si pulpa roșie (Angelescu, 2007; Popovici, 1995).

Pe secțiune, examenul macroscopic al splinei evidențiază nodulii albicioși ai pulpei albe, încastrați intr-o matrice de culoare roșie care este pulpa roșie.

Structura microscopică este extrem de complexă datorită inticării elementelor componenete ale pulpei albe și roșii si distribuției lor pe arborizație particulară a circulatiei intrasplenice, centrată pe arterele segmentare (Ilkins, 2003)i.

Arterele segmentare, care pătrund în parenchim la nivelul hilului, se continuă în trabecule ca artere trabeculare. Acestea se divid la nivelul pulpei în arterele pulpare, care sunt înconjurate de o teacă limfoidă. Din ele se branșează arterele centrale și foliculare care se termină în foliculii limfatici splenici (corpusculii malpighieni). Înca înainte de a părăsi foliculii limfatici, artera centrală se divide în 50 de ramuri precapilare drepte- arterele penicilate, care își pierd teaca limfoidă și se ramifică în rețeaua capilară. Arterele penicilate se recunosc după îngroșările parietale caracteristice (tecile Schweiger-Seidel).

Capilarele venoase părăsesc sinusul pentru a conduce sângele venos (Ilkins, 2003) în venele pulpare și trabeculare, de unde este preluat de venele segmentare și apoi de vena splenică.

Pulpa albă este formată din țesutul limforeticular splenic, echivalent cantitativ cu cel al tuturor ganglionilor limfatici și reprezentând aproximativ 25% din totalitatea țesutului limfatic al organismului (Ilkins, 2003).

Pulpa albă reprezintă aproximativ 15% din parenchimul splenic și cuprinde tecile limforeticulare periarteriale și foliculii limfatici, în numar de 10-20 000. Foliculii au un centru germinativ dispus excentric față de artera centrală. Teaca limfoidă periarterială conține predominent limfocite T si câteva plasmocite și macrofage. Foliculii limfatici sunt ingroșari ale tecilor limfoide. Ei sunt încastrați în zona marginală externă plasată la interfața dintre pulpa roșie si cea albă. Foliculii limfatici conțin, de asemenea, multe limfocite T, amestecate cu limfocite B. Centrii germinativi foliculari sunt similari celor din ganglionii limfatici și se formeaza după stimularea antigenică. Ei conțin macrofage dendritice,între care se găsesc numeroase limfocite si plasmocite (Ilkins, 2003).

Pulpa roșie reprezintă 85% din parenchimul splenic și este alcatuită din sinusurile vasculare și rețeaua intersinusoidală care conține cordoanele pulpei splenice Billroth. Sinusurile sunt dispuse ca o rețea între capilarele arteriale și cele venoase, ambele joncțiuni fiind prevazute cu structuri sfincteriene. Ele sunt catati largi, complexe, delimitate de celule endoteliale stelate care sunt alungite și aliniate pe axul longitudinal al sinusului. Spațiile dintre celulele endoteliale (porii sinusali) permit trecerea hematiilor, granulocitelor și plachetelor. Celulele endoteliale aparțin sistemului reticulohistiocitar (Altamura, 2001; Ilkins, 2003).

Suprafața adventicială a peretelui sinusal este acoperită și ancorată de rețeaua intersinusală care conține celulele reticulare stelate și dendritice ale cordoanelor Billroth. Reticulul pulpar înconjură atât teaca limfoidă periarterială, cât și foliculii limfatici. În ochiurile rețelei intersinusale se găsesc eritrocite, granulocite, limfocite mari și macrofage.
Zona marginală desparte pulpa albă de cea roșie și are structură morfologică și funcții proprii în apărarea imunologică. Ea este alcatuită din țesut reticular, sinusuri și macrofage și reprezintă locul de trecere al limfocitelor T si B conținute în tecile limfoide periarteriale și foliculi în circulația sanguină. La acest nivel antigenii sanguini sunt captați și procesați de către macrofage și celule reticulare pentru a ajunge în contact cu limfocitele (Chadburn, 2000; Mebius, 2005).

Splina: pulpa albă, arteriola centrală cu țesut limfoid periarteriolar, HE, 10x

4.2 Fiziopatologia funcțiilor splinei

Funcția esențială a splinei este reprezentată de filtrarea sângelui, prin care se rețin celule și fragmente celulare sau particule anormale. Aceasta acțiune este favorizată de circulația dificilă prin rețeaua reticulară a cordoanelor și de numeroasele macrofage care le căptușesc (Mebius, 2005).

Tecile limfatice periarteriale constituie un pat de filtrare specializat pentru reținerea limfocitelor T și oferă un micromediu reactiv pentru acest tip de limfocite.

Foliculii limfatici rețin prin filtrare limfocitele B și le permit să reacționeze imunologic. Dacă nu au reacționat, atât limfocitele B cât și T pot părăsi splina pe căile limfatice (Altamura, 2001).

În zona marginală, situate între pulpa albă și cea roșie, există o circulație sangvină activă provenită din arterele centrale și ramurile lor. Limfocitele sunt dirijate spre pulpa albă pentru a fi sortate în limfocite B si T. Monocitele sunt sechestrate și activate în macrofage. Eritrocitele anormale sunt stocate și fagocitate. Trombocitele sunt stocate în cantități mari ce pot fi rapid eliberate in circulație (Ilkins, 2003).

Păturile de filtrare ale pulpei roșii pot lua forma unui lobul în care se descarcă un vas arterial și care este drenat de sinusuri venoase. Paturile de filtrare pot fi restrânse la cordoane ce pătrund între sinusurile venoase, într-un sistem anastomozat extensiv. Macrofagele pot crește rapid în număr prin captarea și diferențierea monocitelor circulante. Reticulocitele pot fi reținute prin completarea maturării dupa care sunt eliberate in circulație.Eritrocitele ajunse la limita de viață sunt fagocitate. Celulele bariera, prin reglarea circulatiei in paturile de filtrare, influenteaza fixarea si migrarea celulelor vehiculate de sange, retin pe suprafata lor aderenta microorganism circulante, pozitionandu-le pentru a fi fagocitate de macrofage. Sunt filtrate bacteria, ineosebi cele capsulate, ca pneumococii , explicand sensibilitatea persoanelor splenectomizate la infectii cu astfel de bacteria. De asemenea sunt retinute granule de hemosiderina, corpusculi Heinz, corpi Howell-Jolly, fragmente eritrocitare, paraziti malarici.Celulele bariera protejeaza coloniile de celule hematopoietice, citokinele si alte substante reglatoare, retinandu-le (Bratosin, 1998).

Pasajul prin paturile de filtrare reprezinta un stress mechanic si reologic pentru celulele sangvine. In plus, faptul ca arterele penicilate care patrund in pulpa rosie se ramifica in unghi drept, duce la indepartarea unei parti a plasmei, cu concentrarea eritrocitelor. In acest fel se produc modificari prin scaderea concentratiei de oxygen si cresterea cantitatii de acid lactic, acest lucru crescand stress-ul celular. Paturile filtrante retin pentru fagocitoza celulele care nu suporta stress-ul. Alterarile matabolice duc la pierderi de membrane si tendinta la sferocitoza. Sferocitele nu sunt flexibile si nu se pot strecura prin reteaua reticulara. Cresterea adeziunii eritrocitelor si reducerea vitezei circulatiei favorizeaza macrofagia. Eritrocitele acoperite cu anticorpi, indeosebi cele care au atasat si complement, de asemenea pierd o parte din membrane.Aceste eritrocite sunt recunoscute de receptorii Fc si C3b de pe suprafata macrofagului si fagocitate. In toate aceste situatii, eritrocitele necesita cateva pasaje prin splina, pentru ca stress-ul repetat sa le altereze profund (Bratosin, 1998). Eritrocitele nedeformabile sunt retinute si la nivelul fantelor interendoteliale din sinusurile venoase.

Funcția imunologică a splinei constă in reținerea limfocitelor T si B in pulpa albă și zona marginală, capturarea antigenelor, procesarea acestora și punerea in interacțiune cu limfocitele. Din aceasta rezultș producerea de anticorpi, indeosebi IgM. In acest process sunt interesate macrofagele care prelucreaza antigenele, secreta factori de crestere, interleukine pentru proliferarea si diferentiarea limfocitelor, secretă component ai sistemului complement si fagociteaza complexe immune circulante. Deoarece o mare parte din sange trece prin splina, acest organ este de prima importanta in supravegherea antigenelor sangvine (Altamura, 2001).

Splina are capacitatea de a localiza si elimina complexele imune circulante acest lucru avand o mare implicatie clinica, deoarece depunerea complexelor in tesuturi genereaza leziuni tisulare mediate imunologic. La pacientii cu boli imunologice prin complexe imune, ca nefrita sau vasculita, afectarea functionala splenica poate fi ameliorate prin plasmafereza sau plasma exchange. Pe de alta parte, saturarea macrofagelor cu complexe immune poate reduce potentialul acestora de retinere a altor particule.Acest defect poate fi datorat, in parte, reducerii fluxului sangvin splenic prin activarea complementului dependent de complexele imune (William, 2007).

Injectarea intravenoasa de Salmonella marcata cu I125 este urmata de detectarea, in zona marginala si in cordoanele splenice, a markerului, care apoi se concentreaza in zona marginala. De aici este transferat in foliculii limfatici ai pulpei albe, mai intai in mantaua periferica si dupa patru ore in celulele centrului germinativ. Dupa 48 de ore toata cantitatea de radiotrasor este conentrata in central germinativ (Tarlinton, 1998).

Primul raspuns la antigen este dupa 24 de ore, cu expansiunea centrului germinativ, cu numeroase mitoze si aparitia de plasmocite. Dupa 72 de ore apar anticorpii care ajung la un nivel maxim dupa 7 zile. Dependent de celulele dendritice foliculare apar si celulele B cu memorie. Celulele dendritice pot capta complexe imune si le prezinta limfocitelor B, accelerando-se astfel raspunsul secundar.Limfocitele T sunt constituiente ale tecilor limfatice periarteriale.

Dezvoltarea este dependenta de timus, unde se matureaza dup ace sunt eliberate din maduva osoasa. Celulele T, obtinute prin canularea ductului thoracic, marcate radioactive si injectate intravenous la primitori sinergici, se localizeaza initial in zona marginala, dupa care se indreapta selective spre tecile limfatice periarteriale, unde are loc proliferarea limfocitelor T, cu expansiunea clonala. Distributia subseturilor de limfocite T, CD4 (helper/inducer) si CD8 (suppressor/cytotoxic), in tecile limfatice este similara cu cea din sangele periferic, adica 2:1. In splina normal doar un mic procentaj de limfocite T exprima receptori IL-2, adica sunt activate. De remarcat e faptul ca splina este o sursa importanatde limfocite TCD8, capabile sa transfere tolerant la gazed inocente si dupa ce se matureaza in splina, migreaza in ganglionii limfatici (Altamura, 2001; Jirillo, 2003; Timens, 1991).

In concluzie, splina captează particule neantigenice (corpi Heinz, hemosiderina), ca acțiune a macrofagelor și in foarte mică măsură a calulelor endoteliale.In al doilea rând, reține particulele proteice antigenice (bacteria, celule, fragmente tisulare). In al treilea rand, sangele este epurat de complexele imune care include sau nu fragmente de complement. In al patrulea rand, antigenii solubili (produse bacteriene, imunoglobuline) in forma monomerica sunt retinuti de macrofage cu mai mare dificulate decat particulele antigenice.

Funcția de rezervor a splinei este posibilă prin inervarea vaselor, a rețelei reticulare si acapsulei, ceea ce favorizeaza contractia sau relaxarea. Splina umanăreține și inmagazinează trombocite, limfocite si reticulocite.Rezervorul splenic si sângele sunt in permanentă comunicare și schimb de celule (Bratosin, 1998).

Dacă se reinfuzează trombocite autologe marcate, 30% din acestea sunt stocate in splina și pot fi mobilizate prin injectare de adrenalina. Splina reprezintă, de asemenea, un mare rezervor de limfocite B sau T. In urma transfuziei de limfocite autologe marcate cu Cr51, in splină se regăsește un număr dublu de limfocite, fata de sange. In mod normal eritrociele nu sunt retinute in splina dar la pacientii cu splenomegalie, 10-40% din eritrocite sunt stocate.

Crizele hemolitice acute din siclemie si malaria, cu sechestrare si distructie eritrocitara masiva intr-o splina cu crestere rapida, pot declansa stari de soc. In schimb, reticulocitele sunt retinute selectiv in splina pentru maturare si curatare de incluzini, dupa care sunt repuse in circulatie.

Reglarea volumului sangvin poate fi realizata in parte prin controlul asupra volumului de plasma si sinteza de albumine. La pacientii cu splenomegalii cornice massive, volumul plasmatic si al cantitatii totale de albumina este crescut fata de normal. Nivelul acestei cresteri depaseste volumul de plasma present in splina, desi splina poate contine mai mult de 11% din volumul total plasmatic. Dupa splenectomie sunt necesare 6 luni pana cand cantitatea de plasma si albumina ajunge la niveluri mici, stabile.

Funcția hematopoietica este proprie splinei numai in viata intrauterine. Dupa naștere splina nu mai posedăun micromediu adecvat pentru hematopoieza.Limfocitele si monocitele din splină provin din maduva osoasăși sunt reținute in păturile de filtrare din pulpa albăși roșie.

Situația este diferită in unele stări patologice. Suprasolicitarea hematopoiezei in hemolizele cornice intense duce la redesteptarea sediilor embrio-fetalew, in primul rand al splinei, prin refacerea micromediului hematopoietic in care se colonizeaza celulele stem din circulatie. Splina imensa din talasemia majora este rezultatul distructiei intense de eritrocite patologice, rigide, dar si a focarelor de eritropoieza. Hematopoieza splenica se reia si in stari patologice, ca bolile mieloproliferative.

Reutilizarea fierului captat de macrofagele splenice depinde de subpopulația de macrofage care a actionat. In sferocitoza ereditara, fagocitoza are loc in sau in vecinatatea sinusurilor venoase. Macrofagele si celulele endoteliale pot ceda usor fierul transferinei plasmatice, care sa-l transporte sis a-l cedeze eritroblastilor sau macrofagelor din maduva osoasa.In anemia hemolitica autoimuna, multe eritrocite sunt fagocitate de macrofage in miscare, in imposibilitate de a recicla fierul (Brendolan, 2007; de Porto, 2010).

4.3 Rolul splinei în imunitatea înnăscută

Modul în care este structurat țesutul splenic, în așa fel încât cea mai mare parte a sângelui de la acest nivel trece prin zona marginală și de acolo, mai departe, de-a lungul celorlalte compartimente ale pulpei albe, permite monitorizarea eficientă a torentului sangvin de către sistemul imun.

Rolul important al splinei în protecția împotriva agenților patogeni din sânge a fost evidențiat în studii pe pacienți splenectomizați la care s-a demonstrat un deficit în formarea răspunsurilor imune împotriva câtorva produse bacteriene, și necesită, așadar, profilaxia antibiotică pe termen lung a infecțiilor (de Porto, 2010; Vasilescu, 2003b; Vasilescu, 2006).

Este acoperitã de o capsulã conjunctivã, cu puține fibre musculare și incapabilã de contracții ample, de la care pornește o rețea de trabecule conjunctive, ce împart țesutul splenic în compartimente comunicante. În fiecare compartiment se gãsesc pulpa albã și pulpa roșie, sprijinitã pe țesutul conjunctiv reticular.În trabeculele conjunctive se gãsesc arterele trabeculare (ramificații ale arterei splenice).

Când ating diametrul de circa 200 μm, arterele pãrãsesc trabeculele conjunctive și pãtrund în parenchimul splenic. Ele dau ramificații laterale (arteriole), fiecare arteriolã fiind acoperitã de un manșon dens de țesut limfoid. In jurul arteriolei se gãsesc limfocite, distribuite într-o stromã conjunctivã, ce formeazã teci limfoide periarteriolare (PALS = periarteriolar lymphoid sheats) sau manșoane coaxiale de limfocite, în jurul arteriolelor. Arteriola are o poziție centralã în manșonul limfoid. Pulpa albã este împãrțitã într-o zonã centralã bogatã în celule T – teaca limfoidã periarteriolarã (PALS) – înconjuratã de foliculi primari care conțin celule B. In fiecare folicul primar se gãsește o aglomerare de celule foliculare dendritice (FDC) (Altamura, 2001).

Pulpa albã este separatã de pulpa roșie (RP) prin sinusul marginal (MS). Sinusul marginal este inclus într-un strat de limfocite ale zonei marginale (MZ). Adiacente sinusului marginal sunt macrofagele metalofile, care se crede cã au rol important în reglarea traficului în spațiile pulpei roșii și albe. Canalele colapsate (CC) par a fi ariile prin care limfocitele intrã și ies din pulpa albã (Jirillo, 2003; Timens, 1991).

Totalitatea tecilor periarteriolare (manșoane limfoide coaxiale) formeazã pulpa albã a splinei. Manșoanele au o zonã internã, bogatã în limfocite T și o zonã externã bogatã în limfocite B, grupate în aglomerãri denumite foliculi. Limfocitele pulpei albe se vãd pe secțiunea țesutului ca zone alb-cenușii, înconjurate de pulpa roșie.Teaca limfocitarã periarteriolarã constituie regiunea timodependenta, în timp ce foliculii limfoizi și țesutul limfoid adiacent reprezintã zona timoindependenta (Jirillo, 2003; Timens, 1991).

Pulpa roșie înconjurã pulpa albã și este formatã din cordoane de țesut splenic (cordoane Bilroth) situate printre sinusurile venoase. Unele capilare arteriale se pot conecta cu sinusurile venoase, dar majoritatea arteriolelor penicilate se deschid în cordoanele Bilroth (circulație deschisã). Sinusurile venoase sunt canale vasculare, delimitate de endoteliu și o membranã bazalã. Endoteliul este perforat de spații poligonale mari, așezate ordonat.

Cordoanele Bilroth sunt formate dintr-o rețea tridimensionalã de celule reticulare și fibre reticulare, care formeazã o unitate funcționalã cu adventicea sinusurilor. In aceastã rețea se deplaseazã celulele splenice libere cu funcție fagocitarã (macrofage). Cordoanele Bilroth comunicã cu sistemul venos al splinei (Jirillo, 2003; Timens, 1991).

Antigenele din sânge sunt preluate de macrofagele zonei marginale și ajung în pulpa albã. Sinteza anticorpilor fațã de antigenele circulante este una din funcțiile majore ale splinei. Celulele B activate în pulpa albã, migreazã în pulpa roșie, unde se gãsește majoritatea plasmocitelor. In zona marginalã se gãsește majoritatea celulelor NK (de Porto, 2010).

Splina nu are circulație limfaticã. La nivelul splinei, limfocitele ies din sânge prin peretele capilarelor zonei marginale, care este foarte permeabil și se distribuie în pulpa albã, iar de aici strãbat drumul invers și ajung în pulpa roșie, în sinusurile venoase. Acestea comunicã atât cu capilarele zonei marginale, cât și cu sistemul venos al splinei. Limfocitele pãrãsesc splina prin vena splenicã.

Zona marginalã este implicatã în ambele tipuri de rãspuns imun (prin intermediul populatiilor specifice de macrofage si al limfocitelor B), pe când pulpa albã este restrictionatã numai la nivel de rãspuns imun dobândit.

Un rol central în acest tip de imunitate innascuta îl joacã TLRs (toll-like receptors). Acesti receptori sunt exprimati de cãtre monocito /macrofage si celulele epiteliale si endoteliale, ca si de celule din variate sisteme de organe. TLRs recunosc în mod individual componente microbiene distincte (Altamura, 2001).

Splina este un organ limfatic cu rol fundamental in apararea antiinfectioasa. Pulpa alba care reprezinta compartimentul imunologic activ al splinei este impartita in doua zone limfocitare distincte ce contin limfocite T, respectiv B. Splina imbina intr-un mod unic aparare imuna innascuta si dobandita, fiind capabila de un raspuns imediat, nespecific la stimulul bacterian (apararea innascuta) cat si un raspuns ulterior, specific ceea ce presupune interactiunea celulelor efectoare imune specifice unui anumit antigen cu ajutorul moleculelor complexului major de histocompatibilitate (MHC- Major Histocompatibility Complex) exprimate de celulele prezentatoare de antigen (APC- antigen-presenting cell) (Mebius, 2005). Aceasta presupune faptul ca splina joaca un rol fundamental in clearance-ul bacterian fie prin raspuns antigenic, fie prin capacitatea bactericida a macrofagelor. De asemenea exista dovezi ca splina contribuie si la decontaminarea endotoxinica bacteriana (Altamura, 2001).

Tecile limfatice periarteriale (PALS -periarterial lymphatic sheaths) contin limfocite T si reprezinta zona timodependenta, in timp ce foliculii limfatici (primari si secundari) contin limfocite B si reprezinta zona timoindependenta a pulpei albe. acwstia circumscriu tecile limfatice (Mebius, 2005). O alta zona importanta din structura splinei este zona marginala care circumscrie foliculii primari sau zona de manta a foliculilor sendari. Zona marginala pare sa fie locul initial in care patrund limfocitele B si T si iau contact cu antigenele circulante. In zona marginala se gasesc limfocitele B cu memorie consecutiv raspunsului imun primar.

In ceea ce priveste macrofagele splenice, ca si efectori ai imunitatii inascute, cele din pulpa rosie sunt mai putin diferentiate, exprima niveluri ridicate de molecule MHC II si fagociteaza polizaharidele capsulare ale S. pneumoniae (Timens, 1991). Macrofagele zonei marginale sunt mai diferentiate, au o exprimare limitata a moleculelor MHC II si se afla in contact strans cu limfocitele B (Timens, 1991).

Capacitatea de fagocitoza a macrofagelor splenice este fundamentala pentru indepartarea bacteriilor din torentul sanguin, intrucat macrofagele zonei marginale actioneaza ca APC pentru polizaharidele bacteriene, inducand secretia de catre limfocitele B a anticorpilor specifici IgM anti-polizaharid. Acest clearance bacterian este mai putin eficient la pacientii splenectomizati (Jirillo, 2003).

Rolul splinei de a modula capacitatea bactericida a macrofagelor alveolare a fost sugerata de observatia ca soarecii splenectomizati au afectata aceasta functie. Au fost studiate in special rolul IL-1 si al G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor- factorul de crestere al coloniilor de granulocite). S-a constatat ca activitatea acestor citokine este diferita la soarecii splenectomizati, sugerand faptul ca splina ar genera factori care potenteaza functia macrofagelor alveolare. Mai mult decat atat, s-a demonstrat faptul ca G-CSF protejeaza gazda de efectele letale ale LPS inhiband eliberarea de TNF-α (Hebert, 1994).

Cu toate acestea splina joaca un rol specific in apararea anti bacterii incapsulate. Aceasta se datoreaza in special zonei marginale care contine celulele B ale zonei marginale (MZ B cells) si macrofage. Macrofagele sunt capabile sa captureze din circulatie bacterii incapsulate in intregime si sa initieze un raspuns imun umoral. Celulele B ale zonei marginale reprezinta o populatie distincta de limfocite B care dezvolta in primii ani de viata mutatii ale receptorilor de imunoglobuline (Ig) fara a fi implicate in vreun tip de raspuns imun (van den Dobbelsteen, 1993). Consecutiv stimularii de catre antigenele exprimate de bacteriile incapsulate aceste celule B pot prolifera rapid diferentiindu-se fie in APCs, fie in celule plasmatice secretante de anticorpi IgM, IgG si IgA, circuland in plasma pentru cateva luni. Aceste celule B ale zonei marginale nu se diferentiaza in celule B cu memorie si reprezinta, de aceea, parte integranta a raspunsului imun innascut impotriva patogenilor (van den Dobbelsteen, 1993).

Pentru reținerea eficientă a antigenelor și microorganismelor patogene din sânge, celulele rezidente ale zonei marginale exprimă niște receptori specifici. Astfel macrofagele zonei marginale exprimă:

"toll-like receptor", ca majoritatea macrofagelor tisulare din organism;

receptorul SIGNR1 ce leagă eficient antigenele cu structură polizaharidică și este crucial pentru preluarea și îndepărtarea M. tuberculosis, S. pneumoniae și a variatelor virusuri;

receptorul MARCO ce recunoaște mulți agenți patogeni, incluzând E. coli și S. aureus.

Macrofagele metalofilice ale zonei marginale exprimă:

SIGLEC1 – moleculă ce leagă acidul sialic de pe suprafața celulelor ce aparțin sistemului imun și, de asemenea, reziduuri ale acestui acid de pe suprafețele celulare ale agenților patogeni; expresia moleculei SIGLEC1 poate fi privită ca și un mecanism adaptat concentrării patogenilor din sânge în această regiune și eliminării acestora prin fagocitoză (așa cum se întâmplă în cazul preluării LPS al N. meningitidis).

Postsplenectomie, mecanismele de clearance bacterian sunt alterate crescand riscul la acesti pacienti de sepsis cu bacterii gram pozitive dar si gram negative, si care este cunoscut sub numele de OPSI (overwhelming post-splenectomy infection). Sepsisul postsplenectomie are, de obicei un curs fulminant cu o mortalitate cuprinsa inte 50-70% (Okabayashi, 2008). OPSI este cauzat in special de bacterii incapsulate gram pozitive precum Streptococcus pneumoniae (care este agentul etiologic in aproximativ 80% din cazuri), Neisseria meningitidis si Haemophilus influenzae. In ceea ce priveste mecanismele patogenice ale sepsisului cu bacterii gram pozitive par sa existe similitudini cu sepsisul gram negativ, cel putin in ceea ce priveste eliberarea de mediatori nocivi si citokine .

Sepsisul gram negativ este consecinta LPS eliberat de peretele bacterian in tesuturile gazdei si care interactioneaza cu receptori CD14 si TLR la nivelul macrofagelor declansand eliberarea de citokine proinflamatorii precum IL-1β, IL-6 si TNFα cu cascada infalmatiei consecutiva. Anterior a fost raportata capacitatea peretelui celular al bacteriilor gram pozitive de a interactiona cu molecule semnalizatoare precum CD14. Cu toate acestea alti autori au demonstrat ca streptococii de grup B tip III activeaza productia de TNF de catre monocitele din sangele periferic pe o cale CD14 independenta (Medvedev, 1998).

Iata deci ca splina joaca un rol important in protectia gazdei impotriva patogenilor bacterieni, iar indepartarea ei ar trebui sa reprezinte o decizie medicala atent cantarita si nu o manevra chirurgicala nediscriminativa (Tiron, 2008; Vasilescu, 2006). De exemplu la pacienti cu risc crescut de sepsis cum ar fi cei infectati cu virus hepatitic C, boli inflamatorii intestinale sau neoplazici splenectomia nu este recomandabila, pentru a evita eventuale complicatii fatale (Altamura, 2001).

4.4 Sepsis postsplenectomie- OPSI

Practicarea de rutina a splenectomiei in trecut a dus la numeroase complicatii, cele mai de temut fiind complicatiile septice. Sepsisul postsplenectomie cunoscut ca OPSI (overwhelming postsplenectomy infection) apare cu incidenta de aproximativ 5% la pacientii splenectomizati, risc care este de 4 ori mai mare la copii sub 5 ani. Desi acest risc este mai mare in perioada imediat urmatoare splenectomiei, el se mentine toate viata. In ciuda profilaxiei antibiotice si a masurilor de terapie intensiva mortalitatea prin OPSI este de 50-70%. S. pneumoniae este agentul cauzator al cel puțin 80% din cazurile de OPSI; în apariția și dezvoltarea infecțiilor fatale la pacienții splenectomizați pot fi implicate, însă, și bacterii gram-negative (Salmonella, E.coli au fost izolate în cursul sepsisului) (Okabayashi, 2008).

OPSI are un curs fulminant, de multe ori precedat de un tablou simptomatic nespecific: febră, migrene, senzație de greață, diaree, stare de rău general. Cei mai mulți dintre pacienți dezvoltă coagulare intravasculară diseminată. Acidoza și insuficiența renală reprezintă, de multe ori, complicații majore.

Dintre cazurile raportate în literatura de specialitate, OPSI apare în anumite circumstanțe, cum ar fi infecțiile nosocomiale și condițiile de imunosupresie (Tiron, 2008). OPSI poate fi atribuit pierderii în urma splenectomiei a două importante funcții splenice:

Producția de anticorpi specifici epitopilor polizaharidici ai bacteriilor încapsulate.

Fagocitoza particulelor opsonizate în cordoanele pulpei roșii splenice.

Mecanismele prin care splina reușește să protejeze organismul de microorganismele invadatoare nu sunt pe deplin intelese. Cu toate acestea, există studii care susțin faptul că răspunsul primar splenic de producere a anticorpilor IgM împotriva polizaharidelor capsulare ale S. pneumoniae ar fi suficient pentru a realiza îndepărtarea bacteriei din organism .

Macrofagele splenice joacă un rol vital în îndepărtarea bacteriilor din circulația sangvină. Spre exemplu, polizaharidele pneumococului sunt distruse la nivel splenic într-un mod extrem de eficient, pe când, în lipsa splinei, acestea se acumulează în ganglionii limfatici. Macrofagele zonei marginale funcționează ca și celule prezentatoare de antigen pentru polizaharide, transferand aceste antigene de tip T-independent limfocitelor B care vor induce apariția anticorpilor anti-polizaharidici de tip IgM (Hebert, 1994; Jirillo, 2003).

Existenta acestui risc a dus la reevaluarea indicatiilor splenectomiei. Au fost studiate alternative terapeutice ca splenectomiile partiale practicate initial in traumatismele splenice al caror benficiu este discutat in prezent in cazul mai multor afectiuni: chiste neparazitare, hamartoame si tumori splenice benigne, pseudotumorile inflamatorii ale splinei, boala Gaucher, talasemia majora, microsferocitoza ereditara, leucemia cronica mielogena. Abordul folosit poate fi deschis sau minimal invaziv (laparoscopic/ robotic). Cel din urma aduce beneficiile chirurgiei minimal invazive, atat in splenectomia totala cat si in cea subtotala.

Funcțiile imune ale splinei sunt clar demonstrate atât de datele experimentale, cât și de realitatea clinică. Ele sunt dependente de existența unui volum suficient de țesut splenic, bine vascularizat. Se justifică, astfel, efortul chirurgical de conservare a țesutului splenic prin splenectomie parțială sau splenectomie subtotală (Vasilescu, 2003b; Vasilescu, 2005; Vasilescu, 2006).

Partea speciala

Studiul nr. 1: modificari ale imunitatii innascute la pacientul septic

Pornind de la dorința și necesitatea de a identifica o posibilă rezolvare a problemelor ridicate de aspectul complex al modificărilor sistemice care intervin la pacienții septici aflati in unitatile de terapie intensiva, s-a născut ideea realizării acestui studiu.

Complexitatea și importanța deosebită a problematicii analizate au dus la intenția de a realiza o cercetare de profunzime în această direcție, deoarece stratificarea pe grupe de risc a pacientilor septici, care sa permita o interventie terapeutica prompta reprezintă un deziderat major.

Studiul de fata isi propune evaluarea raspunsului imun la pacientul septic pe stadii de severitate a bolii. Obiectivul principal il constituie imunitatea innascuta a carei evaluarea s-a realizat prin determinarea nivelului de citokine pro- respectiv antiinflamatorii ( IL-6, IL-10) utilizand tehnica ELISA.

Scopul urmărit a fost acela de a preciza importanța practică si implicatiile prognostice ale determinării nivelurilor serice ale citokinelor în cele trei faze de evoluție a sepsiului- sepsis fara disfunctii, sepsis sever, soc septic, corelate cu scorurile de gravitate utilizate in practica curenta pentru stratificarea pacientilor pe grupe de risc.

Citokinele, ca polipeptide de semnalizare intercelulară produse de către celulele activate pe parcursul inflamației și care participă la producerea acesteia, sunt cel mai important stimulator al reacției sistemice, astfel că evaluarea lor in diferite stadii de gravitate a sindromului septic isi propune să depisteze acele cazuri cu risc de evolutie nefavorabila spre exitus si, eventual, stabilirea unui cut-off specific pentru fiecare citokină studiată.

Acest studiu isi propune si de a încerca o nouă abordare, aceea a măsurării simultane a mai multor biomolecule (microRNA) cu ajutorul tehnicii qRT- PCR și de a determina eficiența și relevanța acesteia în diagnosticul și monitorizarea pacienților cu sepsis .

De asemenea am realizat analiza si corelarea rezultatelor obtinute cu severitatea bolii. Aceasta corelare ar putea deveni un instrument important atât pentru cercetare cât și pentru practica medicală în cazul pacienților cu sepsis.

Material si metoda

Studiul prospectiv efectuat a cuprins un lot de 99 pacienti operati in perioada octombrie 2009- august 2012 in Clinica de Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni si internati in Sectia de Terapie Intensiva. Pacienții au fost selecționați dintr-un număr de 3647 pacienți adulti admiși în cadrul Sectiei de Terapie Intensiva în această perioadă dintre care 1483 chirurgicali.

Datele referitoare la pacienti au fost obținute din studiul foilor de observație, al protocoalelor operatorii și din studiul monocitelor din sângele periferic și eliberării de citokine de către acestea, cu ajutorul tehnicii ELISA.

Parametrii studiați au fost:

Vârsta și sexul pacienților;

Cauza directa a sepsisului;

Numărul de leucocite din sângele fiecărui pacient în parte;

parametrii biologici de evaluare a gravitatii sepsisului evaluat prin scorul SOFA si APACHE la includerea in studiu;

statusul pacientilor la iesirea din studiu

Valoarea plasmatică a citokinelor IL-6, IL-10 măsurate la includerea in studiu (în pg/ml);

expresia relativa a microRNA din plasma si leucocite

În vederea stabilirii corecte a severității sepsisului și a evaluării obiective a prognosticului, am utilizat scoruri prognostice bazate pe date clinice și paraclinice obiective, cât mai rapid și ușor de obținut (SOFA, APACHE).

Criteriile de includere in studiu au fost reprezentate de prezența a 2 sau mai multe din următoarele semne în contextul unui focar infecțios, conform criteriilor ACCP/SCCM Consensus Conference din 1992 de definire a sepsisului:

temperatură corporală centrală sub 36 °C sau peste 38 °C;

tahicardie (peste 90 bătăi/minut);

tahipnee (peste 20 respirații/minut);

leucocitoză peste 12.000/mm3 sau leucopenie sub 4.000/mm3 sau prezența neutrofilelor imature în proporție de peste 10%.

Criteriile de excludere au fost urmatoarele: pacienti cu imonodepresie severa, boli autoimune asociate, chimioterapia, tratament cronic cu corticosteroizi, status posttransplant.

De la fiecare pacient a fost recoltata cate o proba de sange la includerea in studiu. Toti pacientii au fost urmariti timp de 7 zile. Statusul clinico-biologic al pacientilor a fost monitorizat prin evaluarea urmatoarelor functii, cu calcularea scorului SOFA:

respiatorie (ventilatie mecanica, raport PaO2/FiO2)

cardiovasculara (tensiune arteriala, suport vasopresor)

hepatica (bilirubina totala, colesterol si transaminaze serice)

renala (uree si creatinina serica, debit urinar-ml/24h)

neurologica (GCS, sedare)

De asemena am calculat si scorul APACHE la momentul includerii in studiu. La iesirea din studiu am notat statusul fiecarui pacient : viu sau decedat.

Pentru lotul de pacienti septici au fost incluse in studiu si doua loturi martor formate din pacienti fara sepsis operati in clinica noastra (11 cazuri), respectiv voluntari sanatosi (29 de cazuri).

In vederea evaluarii raspunsului imun nespecific comparativ la pacientii cu si fara sepsis (operati/sanatosi) am dozat urmatoarele citokine: IL 6, IL10, dozari efectuate in cadrul Laboratorului central de Hematologie prin metoda ELISA (enzyme-linked-immnosorbent assay), utilizand kituri cu anticorpi monoclonali (R&D Systems).

ELISA este o tehnică foarte precisă, cantitativă, ce cuprinde atât o metodă imunologică, bazată pe specificitatea anticorpilor monoclonali cât și o metodă biochimică de reacție enzimatică.

În Laboratorul de cercetare a hematopoiezei-Fundeni această metodă este aplicată în mod curent din anul 1995, pentru determinarea concentrației serice/plasmatice a unor factori de creștere hematopoietici (eritropoietina) și a unor interleukine/citokine, precum Il-18, VEGF etc.

Principiul metodei

Probele care conțin factorul sau citokina de testat sunt puse în contact cu anticorpul monoclonal specific, care este fixat pe pereții unei plăcuțe de microtitrare. Se adaugă al doilea anticorp, conjugat cu o enzimă cu turnover rapid si ușor de studiat și apoi o soluție substrat pentru activitatea enzimei. Cantitatea factorului de studiat va fi proporțională cu activitatea enzimei, măsurată în condiții standard. Citirea probelor este făcută de un spectrofotometru, la o anumită lungime de undă, pe care o indică protocolul de lucru pentru fiecare citokină în parte, in acest caz 450 nm.

Pentru acuratețea determinărilor, trebuie subliniată importanța modului de colectare și de stocare a probelor, iar acest aspect va fi menționat în continuare.

Colectarea și stocarea probelor

Probele pot fi recoltate pe heparină, citrat sau EDTA. Întrucât pentru citrat sau heparină se impune o atenție crescută, acestea trebuind să fie nepirogene, pentru a evita producerea endogenă de citkine, recoltarea s-a efectuat pe EDTA, în concentrație de 1.5 mg/ml sânge (tuburi cu căpăcel mov). De altfel, s-a constatat că pe EDTA citokinele au și o stabilitate mai mare, alcătuindu-se chiar o scară a stabilității: Il-1 este mai stabilă decât Il-6, iar TNF-α este factorul cel mai puțin stabil (Riches, 1992; Thavasu, 1992).

In mai putin de 30 min de la recoltare, probele au fost centrifugate timp de 15 min la 1000g (se calculează nr. de turații/min în funcție de raza centrifugii; la noi, pe centrifuga Jouan, 2400 t/min). Plasma poate fi lucrată imediat sau este păstrată la -20oC, maximum 3 luni. Se evită înghețarea-dezghețarea repetată prin stocarea în mai multe porții.

In cazul Il-10, este specificat în protocol să nu fie lucrate probele hemolizate. De asemenea, trebuie folosite numai tuburi de polipropilenă/polietilenă, nu de sticlă.

Pentru evitarea contaminării încrucișate, trebuie, desigur, să fie schimbat vârful pipetei de fiecare dată (chiar și în cazul standardelor) .

Valori normale

În privința valorilor normale, datele ce însoțesc kit-urile de reactivi (R&D Systems), pentru determinarea citokinelor amintite, sunt următoarele:

Il-6 – ser/plasmă: 33 cazuri <3.12pg/ml; Il-10 – ser/plasmă: < 7.8pg/ml

În unele studii valorile normale diferă puțin de cele de mai sus. Astfel, pentru Il-10, unii autori consideră valorile normale între 5 – 19pg/ml, cu o valoare mediană sub 5pg/ml (Cortes, 1995). Pentru Il-6, anumiți autori indică valori normale sub 14.7pg/ml (Maes, 1994). De asemenea, prin investigarea unor variații sezonale, bianuale etc., în nivelul seric al Il-6, au fost observate variații semnificative statistic (Maes, 1994).

În aceste condiții s-a impus și în cazul nostru, alcătuirea unui lot de subiecți normali, pentru obținerea valorilor proprii condițiilor noastre de lucru, în investigarea citokinelor.

Evaluarea expresiei relative a miRNA

A doua parte a studiului si-a propus identificarea unor miARN-uri din plasma si leucocite care sa diferentieze pacientii cu stadii precoce de sepsis fata de subiectii sanatosi si de asemenea sa determine daca nivelul acestor miARN se coreleaza cu severitatea sepsisului evaluata prin scorul SOFA.

Pentru aceasta parte a studiului am colectat 24 de probe de plasma si/sau leucocite de la 17 pacienti cu sepsis operati in Clinica de Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni in perioada septembrie 2012- decembrie 2012 internati in sectia de terapie intensiva si 32 de probe de la 32 de martori sanatosi. Lotul de pacienti a fost monitorizat timp de 7 zile. Scorul SOFA a fost calculat in zilele 1 si 7; de asemena am notat statusul fiecarui pacient la iesirea din studiu: viu sau decedat. Am obtinut atat probe de leucocite cat si plasma de la 10 pacienti septici si 12 martori si doar plasma de la ceilalti 7 septici si 20 de martori. Pentru 7 pacienti am avut probe de plasma atat in ziua 1 cat si in ziua 7. Leucocitele din sangele periferic au fost obtinute din 5ml sange integral venos recoltat pe EDTA.

Principiul metodei

Dupa purificarea ARN total leucocitar sau plasmatic in laboratorul de biologie moleculara, am identificat miRNA-urile exprimate diferit la septici comparativ cu martorii prin tehnica microarray folosind 470 de miARN-uri umane, care este deci o analiza calitativa. Purificarea s-a facut cu Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) pentru ARN leucocitar, respectiv kitul de purificare a ARN total (Norgen Biotek Corporation, Ontario, Canada) pentru ARN plasmatic conform instructiunilor de producator. Ulterior, prin qRT-PCR Taqman (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction), care reprezinta o analiza cantitativa, am determinat expresia relativa fata de un normalizator ales a anumitor gene target care au fost gasite cu expresie diferita la microarray. Particularitatea o constituie metoda de detectie a produsului PCR, care este cuantificat in cursul desfasurarii reactiei in faza exponentiala (‘in timp real”) prin monitorizarea fluorescentei emise la fiecare ciclu de amplificare, spre deosebire de detectia colorimetrica care avea loc la sfarsitul reactiei, in tehnologia conventionala.

Normalizatorul este un miARN a carui expresie nu difera intre cele doua tipuri de probe- septici si martori. In acest studiu s-a folosit ca normalizator U6B snARN pentru ARN leucocitar si miR-192 (un miR endogen) pentru probele din plasma.

 In treimea inferioara a regiunii de amplificare exponentiala se stabileste o valoare prag (“assigned fluorescence level”); traversarea acestei valori marcheaza declansarea amplificarii. Pentru fiecare proba se determina cu exactitate ciclul de amplificare in care se inregistreaza depasirea valorii prag (Ct= critical threshold value). Cu cat valoarea Ct este mai mare, cu atat titrul miRNA este mai mic.

Expresia relativa a fiecarui miRNA am calculat-o ca diferenta intre numarul de cicli de amplificare la care s-a inregistrat depasirea valorii prag fata de valoarea prag a normalizatorului.

Evaluarea genelor target

Am utilizat doua baze de date independente si complementarea pentru predictia genelor target ale miRNA, respectiv miRGen ( http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html) ce cuprinde tergeturi pentru miRNA animale in conformitate cu programele consacrate de predictie a genelor target miRanda, TargetScanS, si PicTar. In al doilea rand am utilizat baza de date RNA22 ( http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html) de identificare a genelor target

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

De asemenea, din probele plasmatice restante am dozat si nivelul urmatoarelor citokine: TNFα, IL-10 si IL-18 utilizand kiturile de reactivi continand anticorpi monoclonali R&D Systems. Citirea probelor este făcută de un spectrofotometru, la o anumită lungime de undă, pe care o indică protocolul de lucru pentru fiecare citokină în parte, in acest caz 450 nm. Determinarile au fost lucrate in duplicat, iar semnificatia statistica a fost evaluata cu ajutorul testului Student t-test (p,0.05).

Pentru prelucrarea statistică a datelor s-au folosit pachetul software GraphPhadPrism,versiunea 5.0 specializat în calcule statistice științifice, și modulul Data Analysis al programului Microsoft Excel, impreuna cu suita XLSTAT pentru MS Excel.

Rezultate

Studiul datelor demografice in lotul studiat a relevat urmatoarele:

Varsta medie in grupul pacientilor septici a fost de 53,11 ani (SD 15,07) cu o mediana de 54 (19-85).

Distribuția pe sexe în lotul studiat a fost de 41 pacienți de sex feminin și 58 pacienți de sex masculin.

In cadrul lotului studiat, etiologia sepsisului a fost urmatoarea: peritonita acuta generalizata 37 de cazuri, pneumopatii acute postoperatorii 21 de cazuri, pancreatita acuta severa 19 cazuri, infectii urinare 12 cazuri, infectii de cateter venos central 7 cazuri, celulite postoperatorii 3 cazuri. De mentionat ca toti pacientii luati in studiu au fost operati in Clinica de Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni.

Distributia pacientilor pe grade de severitate a sepsisului a fost urmatoarea: sepsis fara disfunctii 36 de cazuri, sepsis sever 41 de cazuri, soc septic 22 de cazuri

Statusul grupui dupa incheierea perioadei de urmarire, respectiv ziua a 7-a a fost de 77 de suprevietuitori si 22 de decedati

Investigarea profilului citokinic si a mortalitatii pe lotul celor 99 de pacienti a demonstrat ca concentratia plasmatica a ambelor tipuri de citokine atat cea proinflamatorie (IL 6) cat si antiinflamatorie (IL 10) a fost mai mare la septici comparativ cu pacientii operati fara sepsis, si la acestea mai mare decat la subiectii sanatosi; de asemenea s-a corelat pozitiv cu stadiul de severitate al sepsisului si s-au inregistrat niveluri crescute la cei care au decedat la iesirea din studiu fata de supravietuitori.

De asemnea am cercetat corelarea nivelului de citokine cu o serie de parametrii clinici si biologici: scorurile SOFA si APACHE, numarul de leucocite, numarul de trombocite, tensiunea arteriala medie, alura ventriculara, temperatura, varsta. Am oservat ca nivelul citokinelor atat pro- cat si antiinflamatorii se coreleaza pozitiv cu scorurile SOFA si APACHE si negativ cu presiunea arteriala medie.

Evaluarea profilului miRNA leucocitar

In grupul de 17 pacienti septici la care am facut evaluarea profilului miRNA reprezentat de 9 femei si 8 barbati, varsta medie a fost 55,4 ani (SD 17,13).

Toti pacientii au fost operati in Clinica de Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institului Clinic Fundeni si admisi in sectia de Terapie Intensiva pentru sepsis de diferite stadii de gravitate dupa cum urmeaza: sepsis fara disfunctii- 5 cazuri,sepsis sever 9 cazuri, soc septic 3 cazuri.

Punctul de plecare al sepsisului a fost: peritonita postoperatorie 9 cazuri, pulmonar 4 cazuri, pancreatita acuta 3 cazuri si 1 caz de ocluzie intestinala.

Pentru a determina daca paternurile miRNA sunt diferite la pacientii septici fata de martori am comparat prin microarray expresia a 470 de miRNA-uri umane din probele de leucocite. Astfel a fost evidentiat un set de 17 miRNA exprimate diferit in cele doua grupuri (septici si martori). Dintre acestea am identificat 4 miRNA-uri, respectiv miR-150, miR-182, miR-342-5p si miR-486 al caror nivel de expresie a fost de cel putin 2 ori diferit intre probele provenind de la septici, respectiv martori: miR-486 si miR-182 fiind supraexprimate iar miR-150 si miR-342-5p fiind subexprimate la pacientii septici.

Pentru confirmare am efectuat ulterior, utilizand acelasi ARN leucocitar total purificat, si qRT-PCR TaqMan pentru cele 4 miRNA mentionate anterior. Ca normalizator a fost utilizat U6B. Pentru toate cele 4 gene am identificat aceeasi variatie ca si in cazul microarray si, cu exceptia miR-486 diferenta a fost de cel putin 2 cicli, dupa cum este ilustrat si in figura de mai jos.

Am identificat astfel un patern al expresiei miRNA la debutul sepsisului, respectiv in prima zi de admisie in sectia de Terapie Intensiva

Evaluarea miR-150 plasmatic

In aceasta parte a cercetarii, am studiat expresia in probele de plasma a miR-150, intrucat pentru acest miRNA am constat cele mai pronuntate diferente intre septici si martori (figura anterioara). Astfel am investigat expresia miR-150 prin qRT-PCR din 24 de probe de plasma provenind de la septici (16 in prima zi si 8 in ziua 7) si 32 de probe martor. Iniat am folosit U6 si U6B ca normalizatori, dar, intrucat aceste miRNA-uri s-au degradat in plasma, nu am obtinut rezultate reproductibile in determinari triplicate. Ulterior am analizat 2 miRNA-uri (miR-192 si let-7a) care, conform datelor de array, nu au avut variatii de expresie intre cele 2 loturi. Rezultatele reproductibile cele mai bune le-am obtinut cu miR-192, astfel incat am folosit acest miRNA ca normalizator. Am constatat miR-150 a fost semnificativ subexprimat in probele de plasma atat in ziua 1 cat si in ziua 7 (p=0.001, respectiv p=0.005).

Aceste rezultate indica faptul ca nivelul plasmatic al miR-150 (exprimat ca relativ la miR-192) este similar expresiei leucocitare, si reprezinta un indicator fiabil de debut al sepsisului; de mentionat ca nu am constat corelatii intre expresia miR-150 plasmatic si numarul de leucocite de la pacientii septici,indicand ca miR-150 nu este doar un biomarker al numarului de leucocite circulante.

La evaluarea expresiei miR-182 si miR-342-5p, celelate miRNA exprimate diferit in leucocite, trendul variatiei a fost similar ca in leucocite pentru miR-342-5p, dar opus pentru miR-182; nici unul nu a fost exprimat semnificativ diferit, probabil datorita numarului mic de probe in care au avut expresii detectabile (4 pentru miR-182 si 3 pentru miR-342-5p).

In evaluarea expresiei relative a miR-150 plasmatic in sepsis (din datele de qRT-PCR) am constat de asemenea o corelatie intre expresia relativa miR-150/miR-192 si scorul SOFA sau gradul de severitate al sepsisului (sepsis fara disfunctii, sepsis sever, soc septic).

Coniderand cutoff valoarea de 8.5 a raportului miR-150/miR-192 (reprezentand o diferenta de cel putin 3 ciclii de amplificare) am constat ca toti pacientii cu raport mai mare au avut scor SOFA mic si invers; toti cei 3 pacienti cu soc septic au avut raport mai mic de valoarea cutoff. Mai mult decat atat expresia relativa miR-150/miR-192 s-a corelat negativ cu scorul SOFA, avand valori mai mici la pacientii cu sepsis sever fata de cei cu sepsis fara disfunctii si mai mici la cei cu soc septic.

Aceste rezultate sustin observatia initiala, aceea ca pacientii septici au miR-150 mai putin exprimat decat subiectii sanatosi. De fapt pacientul cu cea mai mare expresie relativa a miR-150 (97.24) a avut cele mai scazute scoruri SOFA atat in ziua 1 cat si in ziua 7. Mai mult decat atat nu am constat diferente semnificative in expresia miR-150 intre zilele1 si7, pentru scoruri SOFA similare.

Investigarea eventualelor corelatii intre expresia miR-150 si gene ale imunitatii innascute

Ca urmator pas am investigat daca variatiile expresiei miR-150 se datoareaza unor factori exogeni, sau sunt legate de patogeneza sepsisului. O cale ar fi identificarea unor corelatii intre nivelul de expresie miR-150 si gene ce codifica proteine implicate in patogeneza sepsisului. Dereglarea expresiei miR-150 ar trebui astfel sa afecteze translatia acestor gene codante. De aceea am efectuat predictia genelor taget pentru acest miRNA utilizand miRGen si am gasit cel putin 20 de gene target implicate in imunitate; printre acestea s-a numarat si IL18, care a fost raportat ca fiind crescut la pacientii cu sepsis (15- 17 GC). Mai mult decat atat, utilizand baza de date KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database)  pentru analiza sistematică a genelor și funcțiilor acestora, conține informații despre căile metabolice, am constatat ca genele target ale miR-150 sunt semnificativ (p=0.05) grupate in cateva cai si primele 5 cele mai supreexprimate sunt toate implicate in sepsis:

MAPK- inhibarea ei in socul endotoxinic amelioreaza suprevietuirea si previne sepsisul (18 gc)

Wnt- releaza inflamatia (19 gc) si produce rezistenta la insulina (20,21 gc)

ErbB (22 gc) si mTOR (23 gc) sunt implicate in raspunsurile imune si inflamatie

Intrucat este bine cunoscut faptul ca IL-10 si TNFα sunt mediatori ai inflamatiei implicati in raspunsul imun innascut si sepsis (24, 25 gc) am utilizat un program suplimentar de predictie a genelor target- RNA22 pentru a depista posibile regiuni de interactiune cu miR-150. Practic miR-150 prezinta regiuni complementare cu IL-10, TNFα si Il-18 in principal la capatul 5’, si cel mai extins cu IL-18.

Aceste date sugereaza o posibila interactiune directa, si cel mai impornat pentru aceasta etapa a sudiului, o posibila corelatie negativa intre expresia citokinelor si a miR-150. De aceea am dozat prin metoda ELISA aceste citokine din aceleasi probe de plasma din care s-a efectuat deteminarea miR-150. Am constatat ca existe diferente semnificative statistic intre cele doua grupuri de pacienti (septici si martori) pentru fiecare citokina in parte si de asemenea nivelul de citokine se coreleaza cu expresia plasmatica a miR-150 atat la pacientii septici, cat si la martori.

IL-10

expresie relativa miR-150/miR-192

IL-18

expresie relativa miR-150/miR-192

TNFα

expresie relativa miR-150/miR-192

Aceste date sustin conceptul de hipersecretie de citokine pro- si antiinflamatorii in sepsis si sugereaza o posibila corelatie functionala intre nivelul plasmatic al miR-150 si al citokinelor pe grade de severitate ale sindromului septic.

Considerand separarea pacientilor septici conform expresiei miR-150 raportata la miR-192 ca normalizator am constatat ca nivelul IL-18 a fost semnificativ diferit intre cele doua categorii functie de valoarea cutoff de 8.5. De aceea am raportat valoarea IL-18 la expresia miR-150 si am observat ca pacientii cu raport miR-150/miR-192 mai mic de 8.5 au avut un raport IL-18/miR-150 semnificativ statistic mai mare (de cel putin 10 ori mai mare, p=0.05) decat pacientii cu raport miR-150/miR-192 mai mare de 8.5.

Desi nu am putut exclude o corelatie intamplatoare demonstrand prin studii functionale o interactiune directa intre miR-150 si una sau mai multe citokine, studiul de fata sugereaza o posibila corelatie functionala intre nivelul plasmatic al miR-150 si al citokinelor in sepsis si ca raportul miR-150/ IL-18 ar putea fi un indicator prognostic de evaluare al severitatii sepsisului.

Discutii

Sepsisul definește o stare clinico-biologică foarte gravă care rezultă dintr-un răspuns sistemic al gazdei la o afecțiune de cauză infecțiosă. Sepsisul are o incidență în creștere și constituie a doua cauză de deces în unitățile de terapie intensivă non-coronariene precum și cea de-a zecea cauză de deces globală în țările dezvoltate, în pofida progreselor din domeniul antibioterapiei.

Pe masura aprofundarii cunostintelor de fiziopatologie a agresiunii bacteriene si a raspunsului organismului-gazda la aceasta, s-au facut eforturi de definire a notiunilor de sepsis, sindrom septic, soc septic. Au fost stabilite criterii de încadrare în clasa pacientilor septici. Bone defineste notiunea de "sepsis" pe baza unor criterii clinice simple: suspiciunea de infectie plus raspunsul sistemic al organismului-gazda la ea Termenul de "sindrom septic" este propus pentru cazurile la care, pe lânga criteriile enumerate, se poate pune în evidenta si cel putin un semn de alterare a perfuziei tisulare; cel de "soc septic" este dedicat situatiilor de sindrom septic cu hipotensiune (tensiune arteriala sistolica sub 90 mm Hg sau o scadere a tensiunii arteriale medii sub 40 mm Hg fata de nivelul de baza la un pacient hipertensiv) (Bone, 2009; Cohen, 2009; Funk, 2009). Orientata clinic, definitia lui Bone se bucura de o larga utilizare în literatura. Ea raspunde necesitatii de standardizare a diagnosticului din numeroasele studii multicentrice dedicate fiziopatologiei si tratamentului sepsisului.

Pentru multi autori ea nu este însa suficient de cuprinzatoare. Intr-adevar, nu sunt rare cazurile în care criteriile de definire a sepsis-ului sunt respectate fara ca o infectie sa poata fi demonstrata: dupa politraumatisme, în pancreatita acuta, în hematoamele mari retroperitoneale (Sibbald, 1991). In aceste cazuri, evolutia grava a pacientilor catre insuficienta multipla de organ si mortalitatea ridicata sunt similare celor ale cazurilor de infectii grave.

Conform teoriei mediatorilor, în sepsis pot fi încadrate fenomenele care reflecta raspunsul mecanismelor de aparare ale gazdei, suprastimulate si necontrolate, la agresiunea infectioasa dar si non-infectioasa, într-o anumita succesiune: factor declansator infectios sau non-infectios, celule tinta asupra carora se exercita efectul factorului declansator, mediatori eliberati de aceste celule, efecte biologice ale mediatorilor, efecte clinice.

Acest punct de vedere aliniaza sepsisul noilor concepte asupra bolnavului grav care au dus la conturarea de noi entitati clinice: insuficienta multipla de organ (MOF, MSOF) si, mai nou, sindromul de raspuns inflamator sistemic (SIRS) si sindromul de disfunctie organica sistemica (MDOS).

Conceptul de “sindrom septic” asa cum a fost el definit de Bone, era lipsit de sensibilitate.

Interrelatia infectie, sepsis si sindromul de raspuns sistemic inflamator (SIRS) au format obiectul unor reuniuni internationale de consens. SIRS poate fi rezultatul unei cauze infectioase sau neinfectioase (traumatism, pancreatita sau arsuri). In urma acestei conferinte de consens s-au facut o serie de recomandari de standardizare a termenilor de sepsis sau SIRS.

Criteriile conferintei de consens ale ACCP/SCCM s-au dovedit a fi extrem de sensibile în identificarea pacientilor cu SIRS/sepsis. Utilizarea clinica a cestor criterii tinde sa includa si pacienti cu forme mai putin agresive de boala. Pentru a creste specificitatea definitiei si a facilita luarea deciziei clinice pentru pacientii individuali se recomanda utilizarea concomitenta a scorurilor de severitate. Astfel se realizeaza combinarea criteriilor de sepsis si sechele ale sepsisului cu stratificarea riscului estimata prin determinarea pozitiei pacientului în continuumul severitatii bolii, permitînd un tratament individualizat în fiecare situatie clinica.

Pe de alta parte, era evident pentru toata lumea ca leziunile si disfunctiile caracteristice pentru o inflamatie necontrolata pot avea si alte cauze declansatoare decât infectia. Astfel s-a ajuns la o solutie de compromis: introducerea termenului systemic inflamatory response syndrome (SIRS) , cel de sepsis fiind rezervat cazurilor la care cauza este infectia (Bhatia, 2009). Criteriile de SIRS recomandate de conferinta de consens din 1992 sunt: Când SIRS este rezultatul unui proces infectios confirmat se recomanda folosirea termenului de sepsis. In aceasta acceptiune sepsisul reprezinta o subclasa a SIRS si anume pe cea incluzînd etiologiile infectioase.

Sepsisul este, intr-adevar, declanșat de stimuli bacterieni dar este întreținut și modulat de o multitudine de mediatori endogeni activați într-o cascadă de evenimente imunologice complexe. Sinteza si eliberarea excesivă a acestor mediatori circulanți poate conduce la activarea necontrolată a diferite subseturi leucocitare, a sistemului complementului, a căilor de activare ale coagulării și sistemului fibrinolitic și care în final pot genera leziuni microvasculare care rezultă în ischemie tisulară și disfuncție de organ.

Răspunsul la agresiunea microbiană se desfășoară în mai multe etape, care se pot succeda rapid și pot antrena deteriorarea, uneori severă și ireversibilă a stării generale și în final decesul pacientului. Din aceste motive, prognosticarea evoluției spre stadii avansate sau deces are o importanță deosebită în adaptarea timpurie a măsurilor terapeutice.

Pana nu demult se credea ca sepsisul este consecinta doar a hiperactivarii sistemului imun innascut si a cascadei consecutive a inflamatiei ca si raspuns la infectia microbiana severa sau dauna tisulara severa (Bone, 2009). Cu toate acestea, esecurile terapiilor antiinflamatorii in sepsis demonstrate in trialuri clinice au ridicat intrebarea daca mortalitatea in sepsis deriva de fapt numai din raspunsul inflamator necontrolat (Remick, 2003). Desi unii pacinti decedeaza in faza initiala, de hiperinflamatie a sepsisului, cei mai multi mor ulterior in faza de imunosupresie.

In sepsis se produce o dereglare a homeostaziei diferitelor sisteme biologice ale raspunsului inflamator. La debut, eliberarea unei mari cantitati de PAMPs determina hiperstimularea receptorilor (PRRs) ai celulelor implicate in raspunsul imun. Celulele imune activate elibereaza mari cantitati de citokine si alti mediatori ai inflamatiei (asa numita ‘furtuna a citokinelor’- ‘cytokine storm’), radicali liberi si enzime care convertesc efectele normale, benefice ale inflamatiei intr-un raspuns excesiv ce produce dauna asupra propriului organism si apoptoza celulara. Apoptoza limfocitelor si celulelor dendritice (DCs) contribuie ulterior la supresia raspunsurilor imune in sepsis (Hotchkiss, 2006). Pe langa scaderea efectiva a numarului de celule, apoptoza limfocitelor si celulelor dendritice contribuie la imunoparalizie prin efecttul imunosupresiv al celulelor apoptotice. in contrast cu acestea, apoptoza macrofagelor si neutrofilelor pare a fi neafectata sau chiar scazuta in sepsis. Astefel, in timp ce apoptoza limfocitelor si celulelor dendritice determina imunosupresie severa plasand pacientul la risc pentru infectii secundare severe, nozocomiale, diminuarea ritmului de moarte celulara pentru neutrofile creste gradul de dauna produs de activitatea lor proinflamatorie (Hotchkiss, 2002).

Studiile anterioare au demonstrat ca in sepsis apar concomitent atat un raspuns inflamator cat si unul antagonic antiinflamator. Rezultatele cercetarilor au aratat ca pe langa o concentratie plasmatica ridicata de citokine proinflamatorii , la pacintul septic se inregistreaza si concentratii ridicate ale citokinelor antiinflamatorii precum IL10 fapt sustinut si de cerecetarea de fata. Un studiu condus de van Dissel si colab. a investigat profilul citokinic si mortalitatea pe un lot de 464 de pacienti si a demonstrat ca un raport crescut IL10/TNFα se coreleaza pozitiv cu mortalitatea (van Dissel, 1998). In cercetarea de fata concentratia plasmatica a ambelor tipuri de citokine s-a corelat pozitiv cu stadiul de severitate al sepsisului si, de asemenea, s-au inregistrat niveluri crescute la cei care au decedat la iesirea din studiu fata de supravietuitori.

Iata deci ca o concentratie plasmatica ridicata a citokinelor la debut poate fi un indicator prognostic pentru mortalitatea precoce in sepsis. Alte studii au obsevat reducerea nivelurilor plasmatice atat a citkinelor pro- cat si antiinflamatorii, in sprijinul ideei de imunosupresie in sepsis (Ertel, 1995; Munoz, 1991; Rigato, 2003; Sinistro, 2008). Ertel si colab. (Ertel, 1995) a stimulat cu LPS probe de sange integral de la pacienti cu si fara sepsis si a constatat ca productia de TNFα, IL-1β si IL-6 la septici a fost sub 10-20% fata de nivelurile inregistrate la pacientii fara sepsis.

Aceleasi rezultate le-a obtinut si Munoz si colab. (Munoz, 1991), respectiv o scadere a capacitatii de productie a citokinelor TNFα, IL-1β si IL-6 de catre monocitele stimulate cu LPS la lotul septic fata de cel martor. Sinistro si colab (Sinistro, 2008) a stimulat monocite din sangele periferic de la pacienti septici si sanatosi si a constatat ca sub 5% din monocitele septicilor produc citokine, comparativ cu 15-20% in lotul martor.

Un studiu condus de Weighardt si colab. (Weighardt, 2000) privind sepsisul postchirurgie abdominala a investigat de asemenea eliberarea de citokine de la nivelul monocitelor sub stimul endotoxinic. Sepsisul postoperator a fost asociat cu productia scazuta atat a citokinelor proinflamatorii cat si a celor antiinflamatorii. Supravietuirea s-a corelat pozitiv cu recastigarea capacitatii de raspuns inflamator, dar nu si a celul antiinflamator. Impreuna, toate aceste studii indica faptul ca unii pacienti septici produc rapid cantitati mari de citokine atat pro- cat si antiinflamatorii, cum este si cazul studiului de fata; in alte cazuri predomina productia de citokine antiinflamatorii sau se inregistreaza o supresie globala a eliberarii de citokine.

Diagnosticul, monitorizarea și tratamentul pacienților cu sepsis precum și stratificarea în funcție de gravitate și prognostic necesită criterii și definiții precise. Actualmente acestea se bazează în principal pe evaluarea disfuncțiilor de organ (APACHE, SOFA) (Minne, 2008).

Unele dintre acestea prezintă avantajul simplității dar toate sunt extrem de nespecifice și nu permit stratificarea precisă și formularea rapidă a prognosticului răspunsului gazdei la infecție. Mai mult decat atat, este cunoscut acum faptul ca sepsisul nu este o boala distincta ci un sindrom complex, dinamic si heterogen. Poate avea o multitudine de etiologii iar susceptibilitatea individuala la sepsis poate fi influentata de numerosi factori. In special factori genetici si epigenetici cum ar fi mutatiile la nivelul genelor ce codifica PRRs sau mediatorii inflamatiei si receptori lor pot avea consecinte in raspunsul individual la agresiunea microbiana (Levy, 2003; Vasilescu, 2009b).

Sepsisul postoperator dupa chirurgia abdominala este responsabil de aproximativ 13% din admisiile in unitatile de terapie intensiva (Hutchins, 2004; Lichtenstern, 2007). Studiile anterioare au aratat ca eradicarea focarului septic abdominal este importanta cand pacientii dezvolta postoperator semne de sepsis cu punct de plecare abdominal (Hutchins, 2004) din pacate insa diagnosticul precoce al sepsisului postoperator este, de multe ori, extrem de dificil intrucat semnele clinice (durerea, modicari ale statusului neurologic, etc.) si cele de laborator (ex.: proteina C reactiva) sau febra sunt nespecifice (Lichtenstern, 2007). De aceea identificarea unor noi markei diagnostici ar putea avea avantaje fata de parametrii clinici si de laborator in identificarea precoce a pacientilor cu sepsis postoperator. Fiziopatologia sepsisului constituie încă o temă de discuție. Incompleta înțelegere a fenomenelor fiziopatologice au drept consecință o mortalitate încă ridicată. Sepsisul este declanșat de stimuli bacterieni dar este întreținut și modulat de o multitudine de mediatori endogeni activați într-o cascadă de evenimente imunologice complexe.

Tendința actuală este de identificare de noi criterii de evaluare rapidă și eficientă, bazate pe mecanismele patogenetice implicate în răspunsul sistemic, inclusiv prin studiul și utilizarea diverselor biomolecule. Acestea ar putea revela noi intervale de oportunitate și intervenție terapeutică, care să preceadă apariția elementelor actuale de diagnostic, care se instalează în faze avansate ale sindromului și sunt nespecifice.

Din nefericire, caracteristicile majorității acestora (dinamică, sensibilitate, specificitate) s-au dovedit nesatisfăcătoare iar cercetările destinate identificării unui marker al sepsisului continuă. De aici deriva necesitatea identificarii de noi biomarkeri cu rol diagnostic si prognostic pentru sepsis, corelati cu severitatea bolii si dezvoltarea de noi directii de tratament.

Recent au fost descoperite mici fragmente de ARN non-codant numite microRNA. Rolul lor constă în reglarea post-transcripțională a expresiei genelor prin degradarea sau represia translației unor tipuri specifice deARNmesager ("target"). Importanța microRNA-urilor în reglarea funcțiilor celulare normale a devenit mai clară odată cu descoperirea și studierea mai multor tipuri de microRNA, respectiv a targetului lor, ARN mesager. Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferențierea și ciclul celular.

MicroRNA sunt implicate în reglarea funcțiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut("innate imunity") și a răspunsului imun dobândit ("accuired imunnity"), în dezvoltarea și diferențierea celulelor imune și în prevenirea autoimunității. In sistemul imun, microRNA intervin în diferențierea celulelor limfocitare B și în inducția, funcția și menținerea reglării liniei celulare limfocitare T. La nivelul celulelor dendritice și macrofagelor intervin prin intermediul receptorilor Toll-like și au rolul de a supresa funcția lor efectoare înainte de activarea lor sau de a urmări funcția lor după stimulare. Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a monocitelor și macrofagelor, s-a înregistrat o creștere a expresiei unor tipuri de microRNA cum ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9. miR-132. Pe plan clinic la pacientii septici au fost detectate niveluri modificate a mai multor tipuri de miRNA-uri: miR-146, miR-155, miR150, miR-132 (Nahid, 2009; Vasilescu, 2009b). Datorita rolului important pe care il au in reglarea translatiei citokinelor proinflamatorii, miRNA-urile influenteaza semnificativ patogeneza sepsisului (Giza, 2010).

Fiziopatologia sepsisului constituie încă o temă de discuție. Incompleta înțelegere a fenomenelor fiziopatologice au drept consecință o mortalitate încă ridicată în sepsis. Identificarea unor markeri de diagnostic specifici ai patogenezei acestuia ar face posibile noi abordari terapeutice. La modul ideal fiecare pacient ar trebui monitorizat in parte pentru a detecta precoce modificari ale unor markeri specifici ai raspunsului imun in vederea unei terapii imunomodulatorii specifice.

In acest studiu prospectiv am analizat expresia miRNA intr-un lot de pacienti septici si am constatat, analizand profilul miRNA prin microarray in leucocite urmat de qRT-PCR din probele de plasma ca expresia miR-150 este semnificativ scazuta comparativ cu martorii sanatosi si poate fi utilizat pentru evaluarea severitatii sepsisului.

Acest studiu aduce elemente de noutate din mai multe puncte de vedere. Pe de o parte se adreseaza unei probeleme serioase de sanatate, sepsisul dintr-o perspectiva noua- aceea a implicarii moleculelor de ARN non-codant. Sepsisul reprezinta o cauza majora de deces in unitatile de terapie intensiva. Mortalitatea globala la pacientii cu sepsis postoperator este de aproximativ 30-35%; cu toate acestea mortaliatea in sepsisul sever este de peste 50% (Hotchkiss, 2003; Libert, 2003). In consecinta sepsiul sever este o enitate mare consumatoare de resurse de terapie intensiva. Am constatat ca la pacientii septici spectrul miRNA exprimate difera de subiectii sanatosi atat in leucocite (considerate celulele implicate in perturbarile imune caracteristice sepsisului) cat si in plasma in prima zi de admisie in unitatea de terapie intensiva. Expresia a trei miRNA a fost diferita- miR-150, miR-182, si miR-342-5p in leucocitele pacientilor comparativ cu subiectii sanatosi. In acest sens a fost publicat un studiu recent in vivo care a evaluat modificarea profilului miRNA leucocitar ca raspuns la endotoxinemie.

ARN leucocitar a fost izolat din probe de sange venos de la trei subiecti voluntari inainte si la patru ore dupa injectare de LPS, apoi a fost sutiat profilul miRNA. Cinci miRNA au fost gasite cu expresie diferita dupa injectarea LPS: patru dintre ele au fost scazute (miR-146b, miR-150, miR-342 si let-7g) si unul crescut (miR-143) (Schmidt, 2009). Un alt studiu in vivo a demonstrat ca miR-150 controleaza expresia factorului de transcriptie c-Myb intr-o maniera doza-dependenta, afectand dramatic diferentierea si activarea limfocitelor B (Xiao, 2007). Aceste date sustin importanta functionala a diminuarii expresiei miR-150 la pacientii septici. In plus, recent au fost raportate si modificari ale expresiei miR-21 la pacienti cu soc septic (Fredriksson, 2008), largind astfel spectrul alterarilor miRNA in sepsis.

In al doilea rand, identificarea recenta a miRNA in serul si plasma subiectilor sanatosi si a celor cu diverse stari patologice, de exemplu cancer, deschide drumul explorarii miRNA ca biomarkeri de diagnostic si monitorizare a tratamentului (Cortez, 2009). Desi rolul functional a majoritatii miRNA umane ramane a fi descoperit, aceste molecule par sa fie regulatori cheie ai expresiei genice. Sudiul de fata sustine ipoteza implicarii miRNA in controlul sistemului imun cu posibilitatea de a utiliza miRNA cu expresie modificata ca biomarkeri de diagnostic si prognostic. Sepsisul reprezinta doar cea mai recenta adaugire in lista lunga a conditiilor patologice asociate cu modificarea expresiei miRNA. In studiul de fata am gasit nu doar expresia modificata a miR-150 la pacienti comparativ cu lotul martor, dar si corelatia nivelului miR-150 cu scorul SOFA (nu si cu numarul total de leucocite), ceea ce sugereaza ca miR-150 ar putea fi folosit ca biomarker de evaluare a severitatii sepsisului datorita corelatiei cu scorul SOFA. Candidati suplimentari pentru studii pe loturi mai mari ar putea fi si miR-182 si miR-342-5p care au fost gasiti cu expresie diferita in leucocitele pacientilor septici si ale subiectilor martor.

Nu in ultimul rand studiul releva si un nou potential mecanism implicat in patogenia disfunctiilor imune din sepsis. Disfunctia mecanismenlor reglatoare poate conduce catre un proces inflamator necontrolat, rezultand intr-o imunosupresie profunda si, in final, deces (Hotchkiss, 2001; Hotchkiss, 2002; Hotchkiss, 2006). Studiul de fata dezvaluie controlul miRNA al genelor pro- si anti-inflamatorii implicate in sepsis. Astfel, espresia miR-150 se coreleaza cu principalele gene imune, precum TNFα, IL-10 si IL-18. Prin urmare, alaturi de miR-155 (Baltimore, 2008) si miR-125 (Tili, 2007), miR-150 ar putea fi unul din principalii regulatori ai functiei imune, iar studiul de fata dezvaluie importanta clinica a corelatiei dintre expresia miR-150 si nivelul citokinelor la pacientul septic.

Concluzii

Fiziopatologia sepsisului constituie încă o temă de discuție. Incompleta înțelegere a fenomenelor fiziopatologice au drept consecință o mortalitate încă ridicată. Sepsisul este declanșat de stimuli bacterieni dar este întreținut și modulat de o multitudine de mediatori endogeni activați într-o cascadă de evenimente imunologice complexe. Răspunsul la agresiunea microbiană se desfășoară în mai multe etape, care se pot succeda rapid și pot antrena deteriorarea, uneori severă și ireversibilă a stării generale și în final decesul pacientului. Din aceste motive, prognosticarea evoluției spre stadii avansate sau deces are o importanță deosebită în adaptarea timpurie a măsurilor terapeutice. Desi unii pacienti decedeaza in faza initiala, de hiperinflamatie a sepsisului, alti mor ulterior in faza de imunosupresie.

In studiul de fata concentratia plasmatica a ambelor tipuri de citokine(pro- si antiinflamatorii) s-a corelat pozitiv cu stadiul de severitate al sepsisului si, de asemenea, s-au inregistrat niveluri crescute la cei care au decedat la iesirea din studiu fata de supravietuitori. Iata deci ca o concentratie plasmatica ridicata a citokinelor la debut poate fi un indicator prognostic pentru mortalitatea precoce in sepsis. De asememnea am oservat ca nivelul citokinelor atat pro- cat si antiinflamatorii se coreleaza pozitiv cu scorurile SOFA si APACHE si negativ cu presiunea arteriala medie.

Identificarea unor markeri de diagnostic specifici ai patogenezei acestuia ar face posibile noi abordari terapeutice. La modul ideal fiecare pacient ar trebui monitorizat in parte pentru a detecta precoce modificari ale unor markeri specifici ai raspunsului imun in vederea unei terapii imunomodulatorii specifice.

O abordare a selectiei pacientilor pentru terapia imunomodulatoare individualizata in sepsis ar putea fi screeningul genetic. Dovezile ca raspunsul hiperinflamator din sepsis si intraga cascada de modificari ale homeostaziei ce deriva din acesta poate altera expresia genica sunt in crestere. Raspunsurile inflamatorii din sepsis produc modificari epigenetice, cu alerarea consecutiva a expresiei genelor ce regleaza activarea raspunsurilor imune facand gazda mai susceptibila la infectii. Detectarea rapida a acestor modificari epigenetice induse de sepsis ar permite identificarea la timp a depresiei sistemului imun si administrarea terapiei imunomodulatoare.

Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferențierea și ciclul celular. MicroRNA sunt implicate în reglarea funcțiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut și a celui dobândit, în dezvoltarea și diferențierea celulelor imune și în prevenirea autoimunității (2,3)

Desi rolul functional a majoritatii miRNA umane ramane a fi descoperit, aceste molecule par sa fie regulatori cheie ai expresiei genice. Sudiul de fata sustine ipoteza implicarii miRNA in controlul sistemului imun cu posibilitatea de a utiliza miRNA cu expresie modificata ca biomarkeri de diagnostic si prognostic. Sepsisul reprezinta doar cea mai recenta adaugire in lista lunga a conditiilor patologice asociate cu modificarea expresiei miRNA. In cercetarea de fata am identificat un miRNA specific- miR-150, care a fost gasit cu expresie diferita atat in leucocite cat si in plasma pacientilor septici comparativ cu lotul martor. Limitele acestei parti a studiului sunt numarul mic de probe utilizate pentru detectarea expresiei miRNA, provenind toate din acelasi centru, numai de la pacienti cu sepsis poschirurgical.

Studiul nr. 2: modificari ale imunitatii innascute la pacientul splenectomizat

Pornind de la dorința și necesitatea de a identifica o posibilă rezolvare a problemelor ridicate de aspectul complex al modificărilor sistemice care intervin la pacienții splenectomizati, s-a născut ideea realizării acestui studiu.

Complexitatea și importanța deosebită a problematicii analizate au dus la intenția de a realiza o cercetare de profunzime în această direcție, deoarece evaluarea statusului imun al pacientilor splenectomizati are rol prognostic in ceea ce priveste supravegherea clinica si paraclinica ulterioara.

Studiul de fata isi propune evaluarea raspunsului imun dupa splenectomia subtotala comparativ cu cea totala. Obiectivul principal il constituie imunitatea innascuta a carei evaluarea s-a realizat prin determinarea nivelului de citokine pro- respectiv antiinflamatorii ( TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, IFN-y) utilizand tehnica ELISA.

Scopul studiului este de a evalua modificările răspunsului imun după splenectomia subtotală comparativ cu splenectomia totală. Conservarea unui fragment de parenchim splenic (cand acest lucru este posibil) este justificata de rolul important pe care splina il joaca in reactia de aparare a organismului impotriva infectiei. Acest rol este important mai ales la copii, dar si la adulti, splenectomia subtotala reducand riscul sepsisului postoperator si al complicatiilor hematologice.

Obiectivul principal îl constituie imunitatea innascută. Evaluarea imunitații înnăscute a fost realizata prin determinarea capacității de eliberare de citokine de către monocitele din sângele periferic al pacienților, sub stimul endotoxinic.

Ipoteza de lucru e constituitã de faptul cã conservarea de parenchim splenic atenuazã efectele splenectomiei totale asupra imunitãții înnãscute dat fiind rolul important al splinei in acest tip de imunitate.

Întrebările la care vom încerca să găsim un răspuns sunt:

Splenectomia subtotală permite prezervarea funcției imunologice a splinei la același nivel cu cel preoperator?

Cum influenteazã exereza splinei, fie ea totalã sau subtotalã, eliberarea de citokine sub stimul endotoxinic, în comparație cu situația preoperatorie?

Este metoda WBS o modalitate bunã de cuantificare a functiei imunologice a parenchimului splenic restant post-splenectomie parțialã?

Care sunt limitele metodei WBS în ceea ce privește studiul de fata?

Material si metoda

Acest studiu prospectiv cuprinde un număr de 28 de pacienți splenectomizați total sau subtotal pe cale clasica sau minimal invaziva pentru diferite afecțiuni splenice în perioada octombrie 2009- octombrie 2012 in Clinica de Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni.

Datele referitoare la pacienti au fost obținute din studiul foilor de observație, al protocoalelor operatorii și din studiul monocitelor și eliberării de citokine de către acestea, cu ajutorul tehnicii ELISA, din sângele periferic al pacientilor.

Parametrii studiați au fost:

Vârsta și sexul pacienților;

Tipul bolii ce determină afectare splenică;

Valoarea plasmatică a citokinelor TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, IFN-y măsurate preoperator (în pg/ml) , la 7 zile si la o lună postoperator inainte si după stimulare cu LPS bacterian;

Numărul de leucocite si de monocite secretoare de citokine din sângele fiecărui pacient în parte

Pentru interpretarea datelor obtinute au fost folosite elemente de statistica descriptiva.

Vom observa, prin comparație cu literatura de specialitate, că rezultatele studiului nu diferă substanțial de datele raportate de către alți autori, în alte studii publicate pe această temă.

Pe de alta parte numărul relativ mic de cazuri și heterogenitatea lotului studiat (boli diferite ce dau și afectarea splenică, status biologic preoperator, posibilele complicații postoperatorii în cazul măsurării post-intervenție chirurgicală a citokinelor, vârsta și sexul diferit) pot constitui puncte de critică aduse acestei analize.

Descrierea tehnicii WBS

Probele de sânge au fost prelevate de la pacienți cu o zi inainte de operație, prin puncționarea venei cubitale, în timp ce catetere venoase centrale au fost montate, în condiții de strictă asepsie, pentru a putea obține probele postoperatorii.

Peste probele de sânge (15 ml în tuburi de propilen) a fost adaugată o substantă anticoagulantă, și anume 15 UI de heparinat de sodiu pentru fiecare ml de sânge. Substanța anticoagulantă a fost testată înainte pentru a putea verifica absența contaminării cu endotoxina.

O parte alicotă din sângele heparinizat, 15 UI/ml de sânge, a fost amestecată cu endotoxina provenind de la Escherichia coli 055:B5, până la o concentrație finală de 0,1 ng per ml de sânge.

Aceste probe stimulate cu endotoxina bacteriană, împreună cu cele fără endotoxină, pentru fiecare pacient în parte și provenind de la determinările preoperatorii și postoperatorii de la șapte zile și o lună, au fost incubate pentru două ore la 37°C, într-o atmosferă cu 5% CO2. După aceste două ore, plasma a fost separată de hematocrit prin centrifugare la 2000 g pentru 10 minute.

Au fost masurate nivelele următoarelor citokine: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 și IFN-y.

Valorile citokinelor plasmatice au fost cuantificate prin utilizarea de teste ELISA obținute de la Immunotech Co. (Hamburg, Germany). Citokinele au putut fi cuantificate după ce probele au fost stocate la – 80° C. Valorile citokinelor determinate în probele fără stimulare LPS, au fost considerate valori bazale.

În probele de sânge nestimulate cu endotoxina s-a observat că eliberarea de citokine de către monocite a fost nesemnificativă pe perioada celor două ore de centrifugare. În ceea ce privește probele de sânge stimulate cu LPS eliberarea de citokine a fost crescută, și ca o particularitate, dar care nu are relevanța asupra studiului nostru, eliberarea de TNF-α a atins un vârf la patru ore după stimulare și apoi început să descrească.

Schema metodei WBS

A. B. A. B. A. B.

Două eprubete cu sânge În proba A se adaugă Se incubează pentru integral și anticoagulant 0,1 ng/ml de sânge de LPS 2 ore la 37°C

C1 C2-pot apărea citokine datorită

A. B. agitației create de centrifugare

Supernatant C1+C2=valoarea totală(reală)

Centrifugare a citokinelor

ELISA pentru citokineleTNF-α, IL-1,IL-6,IL-10,IFN-y

Pentru toți pacienții incluși în studiu am măsurat valorile acestor citokine (bazale și după stimularea cu LPS bacterian), atât preoperator, cât si postoperator (la 7 zile si la o lună).

Apoi am calculat numărul monocitelor, secretoare de citokine, per mililitru de sânge, utilizând numărul de leucocite, obținute din hemoleucogramă si procentul de monocite obținut din formula leucocitară, efectuate pentru fiecare pacient preoperator și postoperator, la 7 zile, respectiv o luna.

Am raportat apoi valorile citokinelor, obținute în urma stimulării sangvine cu LPS, la numărul de monocite per ml, calculate anterior, și am obtinut, o asa numită, valoare corectată a citokinelor, pentru fiecare pacient si determinare în parte pentru a evidentia capacitatea monocitului de a elibera citokine sub stimul endotoxinic. Valorile corectate au fost cele utilizate pentru comparația, în ceea ce privește eliberarea de citokine, între cele două grupuri de pacienți, adică cei cu splenectomie totală și cei cu splenectomie subtotală.

Am calculat media valorilor corectate ale citokinelor,separat pentru fiecare grup de pacienți în parte și separat pentru fiecare dintre cele trei date de determinare ale citokinelor, adică preoperator, la 7 zile și la o lună. Cea properatorie am considerat-o valoarea de referință pentru a putea observa daca au existat diferențe în ceea ce privește eliberarea de citokine la determinările ulterioare în cadrul aceluiași grup de pacienți și între pacienții din cele două grupuri diferite (cu splenectomie totală si subtotală).

Rezultate

Distribuția pe sexe în lotul studiat a fost de 18 pacienți de sex feminin și 10 pacienți de sex masculin. Numărul relativ mic de cazuri se datorează epidemiologiei reduse a unora dintre afecțiunile pacienților din cadrul studiului. În cadrul lotului există heterogenitate din punct de vedere, atât al vârstei cât și al afecțiunilor ce au impus splenectomia fie ea totala sau subtotala, ceea ce a reprezentat o limitare a studiului în ceea ce privește interpretarea rezultatelor.

Vârsta medie a fost de 36.71 de ani (SD 21.52) cu o mediană de 35.5 ani.

In cadrul grupului studiat au fost efectuate 19 splenectomii totale si 9 splenectomii subtotale.

Distribuția pe afecțiuni cu determinare splenica în lotul de 19 pacienți cărora li s-a efectuat splenectomie totală: 5 cazuri de purpura trombocitopenică idiopatică; 4 cazuri de ciroza heaptica cu hipersplenism hematologic secundar; 3 de limfom malign non-Hodgkin dintre care unul avea si hepatită cronica virală C; 2 de talasemie majora; unul cu leucemie cu celule păroase și cu hepatită cronică cu virus B; un caz cu metastaze splenice dupa adenocarcinom prostatic radiotratat ; unul cu leucemie limfatică cronică tipul B și cu anemie hemolitică autoimună; unul cu metaplazie mieloida cu mielofibroza si cavernom portal si un caz cu abcese splenice de cauza tuberculoasa.

După cum se observă, cea mai frecventă afecțiune, ce a necesitat splenectomie, în rândul pacienților cu splenectomie totală, a fost purpura trombocitopenică idiopatică.

Distribuția pe afecțiuni în lotul de 9 pacienți cărora li s-a efectuat splenectomie subtotală a fost: 5 cazuri de microsferocitoză ereditară; 2 de β talasemie minora; un chist seros de pol superior splenic; un caz cu abcese bacteriene splenice si spline accesorii (2) la care s-au conservat splinele accesorii.

În rândul pacienților, cărora li s-a efectuat splenectomie subtotală, cea mai frecventă afecțiune a fost microsferocitoza ereditară.

Studii anterioare au demonstrat faptul că, infuzia de lipopolizaharid (LPS) în probe de sânge uman, determină o activare a monocitelor cu o sinteză și secreție excesivă de citokine proinflamatorii (Berger, 1997; Bruunsgaard, 1999; Buttenschoen, 2008; Knirel, 2011). Asa cum am mai prezentat citokinele sunt mediatori ai inflamației secretați de numeroase celule din organism, printre care și macrofagele din splină, ca răspuns al prezenței de antigene bacteriene (LPS), această reacție făcând parte din cadrul imunității înnăscute a gazdei respective. Cantități crescute de citokine în organism determină afectare tisulară severă, insuficiență organică și în final moarte. Acestea sunt responsabile de efectele din cadrul răspunsului inflamator: febră, tahicardie, nivele ridicate de prostaglandine, catabolism accelerat (Berger, 1997; Buttenschoen, 2008).

Metoda de lucru utilizată în cadrul studiului- "Whole blood stimulation"( WBS)- creează un micromediu ce reproduce conditițiile ce duc la apariția și dezvoltarea sepsisului utilizându-se probe de sânge periferic de la pacienți.

Probele de sânge au fost stimulate cu LPS bacterian și s-au măsurat nivelele următoarelor citokine: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 și IFN-y.

Pentru toți pacienții incluși în studiu am măsurat valorile acestor citokine (bazale și după stimularea cu LPS bacterian), atât preoperator, cât si postoperator (la 7 zile si la o lună).

Apoi am calculat numărul monocitelor, secretoare de citokine, per mililitru de sânge, utilizând procentul de monocite obținut din formula leucocitară, efectuată în urma analizelor de laborator întreprinse fiecărui pacient preoperator și postoperator, și de asemenea, din numărul de leucocite, obținute din hemoleucogramă.

Am raportat apoi valorile citokinelor, obținute în urma stimulării sangvine cu LPS, la numărul de monocite per ml, calculate anterior, și am obtinut, o asa numită, valoare corectată a citokinelor, pentru fiecare pacient în parte. Valorile corectate au fost cele utilizate pentru a face comparația, în ceea ce privește eliberarea de citokine, între cele două grupuri de pacienți, adică cei cu splenectomie totală și cei cu splenectomie subtotală.

Am calculat media valorilor corectate ale citokinelor,separat pentru fiecare grup de pacienți în parte și separat pentru fiecare dintre cele trei date de determinare ale citokinelor, adică preoperator, la 7 zile și la o lună. Aceste medii au fost comparate pentru a putea observa daca au existat diferențe în ceea ce privește eliberarea de citokine la determinările ulterioare în cadrul aceluiași grup de pacienți și între pacienții din cele două grupuri diferite (cu splenectomie totală si subtotală).

În cazul pacienților cu splenectomie subtotală am obținut următoarele valori corectate:

TNF-α – preoperator = 7.5 pg/ml, 7 zile = 4.7 pg/ml, o luna = 7.5pg/ml;

IL-1 – preoperator =0.017pg/ml, 7 zile=0.007 pg/ml, o luna=0.018 pg/ml;

IL-6 – preoperator =3.8 pg/ml, 7 zile=3.04 pg/ml, o luna=5 pg/ml;

IL-10 –preoperator =0.027 pg/ml; 7 zile=0.027 pg/ml; o luna=0.042pg/ml;

IFN-y –preoperator =0.019 pg/ml, 7 zile=0.0052 pg/ml, o luna=0.01pg/ml.

Repezentarea grafica a variației citokinelor (mediile valorilor corectate) între cele trei determinări ( preoperatorie, la 7 zile și la o lună) la pacientii cu splenectomie subtotala este urmatoarea:

În cazul pacieților cu splenectomie totală rezultatele au fost :

TNF-αp reoperator =10.3 pg/ml pg/ml, 7 zile=5.34pg/ml, o luna=7.32 pg/ml;

IL-1 preoperator =0.029 pg/ml, 7 zile=0.008 pg/ml, o luna=0.02 pg/ml;

IL-6 preoperator =5.09 pg/ml; 7 zile=3.8 pg/ml, o luna=4.56 pg/ml;

IL-10 preoperator = 0.033 pg/ml, 7 zile=0.023 pg/ml, o luna=0.029 pg/ml;

IFN-y preoperator =0.017 pg/ml, 7 zile=0.0054 pg/ml,o luna=0.0095pg/ml.

Repezentarea grafica a variației citokinelor (mediile valorilor corectate) între cele trei determinări ( preoperatorie, la 7 zile și la o lună) la pacientii cu splenectomie totala este urmatoarea:

Aceste diferente sunt ilustrate in tabelul de mai jos:

Se observa cã în cazul pacienților cu splenectomie totalã, valorile tuturor citokinelor luate in studiu scad, în general, la a treia determinare, fațã de cea realizatã preoperator.

În ceea ce privește pacienții cu splenectomie subtotalã, valorile citokinelor au o tendinta de crestere la o luna, chiar peste valoarea initiala.

Studiul de fata si-a propus decelarea eventualelor diferențe între secreția de citokine, atât proinflamatorii cât și antiinflamatorii, de cãtre monocitele din sângele periferic al unor pacienți, aflați în douã grupuri diferite, adică cei cărora li s-a efectuat splenectomie subtotalã și cei cu splenectomie totalã, și cum variazã numãrul acestor citokine, la același pacient, comparativ la determinarile efectuate preoperator si postoperator, pentru a putea demonstra dacã prezervarea unei parți din parenchimul splenic, întradevãr menține funcția imunã a splinei la un nivel suficient de ridicat pentru a asigura protecția împotriva bacteriilor.

Intrucat am constat ca exista variatii individuale mari in ceea ce priveste secretia preoperatorie de citokine, nivelul preoperator al citokinelor ( media valorilor corectate) a fost ajustat la valoarea 1, pentru cã este mãsura de referințã din cadrul acestui studiu, și am raportat celelalte valori, de la a doua si a treia determinare postoperatorie (adică de la 7 zile și o lunã) , la aceasta, permițandu-ne astfel sã observãm dacã au existat diferențele de care aminteam anterior și cât de importante au fost ele.

Reprezentarea grafica a variatiei IL-6 comparativ intre cele doua grupuri (splenectomie totala vs. subtotala) este reprezentata in graficele de mai jos:

Reprezentarea grafica a variatiei TNF comparativ intre cele doua grupuri (splenectomie totala vs. subtotala) este reprezentata in graficele de mai jos:

Reprezentarea grafica a variatiei IL-1 comparativ intre cele doua grupuri (splenectomie totala vs. subtotala) este reprezentata in graficele de mai jos:

Reprezentarea grafica a variatiei IL-10 comparativ intre cele doua grupuri (splenectomie totala vs. subtotala) este reprezentata in graficele de mai jos:

Reprezentarea grafica a variatiei IFN-y comparativ intre cele doua grupuri (splenectomie totala vs. subtotala) este reprezentata in graficele de mai jos:

În ceea ce privește pacienții cu splenectomie subtotală, valorile citokinelor IL-1, TNF, IL-6 si IL-10 măsurate la 7 zile au crescut comparativ cu nivelul preoperator, iar IFN-y a scăzut. La o luna postoperator, valorile tuturor citokinelor luate in studiu sunt crescute.

În cazul pacienților cu splenectomie totală, la a doua determinare, valorile tuturor citokinelor luate in studiu sunt crescute; la o luna postoperator valorile IL-6 si TNF sunt scazute, iar nivelurile de IL-1, IL-10 si IFN raman usor crescute, dar la un nivel mai redus comparatic cu pacientii cu splenectomie subtotala.

Comparand rezultatele obinute in cele doua grupuri de pacienti (cu splenectomie totala si subtotala) am observat ca la o luna postoperator (cand practic nu mai poate fi vorba de reactie de faza acuta postoperatorie) secretia stimulata de citokine este mai pronuntata la cei splenectomizati subtotal. Aceasta constatare sustine ipotaza de lucru, aceea ca prezervarea de parenchim splenic atenuazã efectele splenectomiei totale asupra imunitãții înnãscute dat fiind rolul important al splinei in acest tip de imunitate.

Reprezentarea grafica a diferentelor in secretia de citokine la o luna postoperator dintre cele doua grupuri este urmatoarea:

Discutii

Cu toate progresele terapiei intensive si in ciuda aparitiei de noi clase de antibiotice, problema mortalitatii prin OPSI a dus la scaderea numarului de splenectomii si la aparitia tehnicilor de chirurgie conservatoare a splinei.

Pacientii cu indicatie hematologica de splenectomie au un risc mai mare de OPSI fata de cei cu patologie traumatica. Cele mai multe cazuri de OPSI survin in primii 2 ani postsplenectomie, dar riscul persista toata viata.

Primele splenectomii subtotale deschise cu indicatie hematologica au fost raportate la inceputul anilor ’90 de catre Tchernia & co (11 cazuri) (Tchernia, 1997) pentru microsferocitoza ereditara; splenectomia subtotala se practica de asemenea si pentru boala Gaucher, talasemiea majora, sickle cell disease, fibroza chistica, mielofibroza si metaplazie mieloida si afectiunile traumatice ale splinei.

Rezultatele hematologice au fost incurajatoare si s-a demonstrat ca splina restanta isi pastreaza functia fagocitara prin determinarea numarul de “pitted cell” cu ajutorul microscopiei de interferenta cu dublu contrast.

Centrul de Chirurgie Generala si Transplant Hepatic al Institutului Clinic Fundeni este singurul centru din tara in care se practica incepand cu anul 2001 splenectomie subtotala de indicatie hematologica atat deschis cat si prin abord laparoscopic. De asemenea centrul are cea mai bogata experienta din tara in chirurgia laparoscopica si robotica a splinei -peste 350 de cazuri.

Splenectomia subtotalã a beneficiat în ultimii ani de o atenție crescutã , fiind privitã ca o alternativã la splenectomia totalã în tratarea multor afecțiuni cu determinare splenicã, cum ar fi de exemplu o serie de afecțiuni hematologice. Chiar dacã splenectomia totalã are efecte net benefice in astfel de afecțiuni, reducând simptomele și îmbunãtãțind semnificativ calitatea vieții acestor pacienți, totuși in urma exerezei totale a splinei se vor manifesta ulterior consecințele aspleniei, una dintre cele mai importante fiind infecțiile fulminante cu diferite bacterii încapsulate, cum ar fi Streptococcus pneumoniae (OPSI). OPSI este precedat de un tablou clinic nespecific ce cuprinde febrã, migrenã, senzație de greațã, diaree, stare de rãu general.

Cei mai mulți dintre pacienți dezvoltã coagulare intravascularã diseminatã si de asemenea, acidoza și insuficiența renalã reprezintã, de multe ori, complicații majore, iar mortalitatea este cuprinsã între 50% și 60%. S-a demonstrat ca OPSI survine în principal în caz de infecții nosocomiale sau în cazul pacienților imunodeprimați (Crandall, 2009; Okabayashi, 2008; Vasilescu, 2003b; Vasilescu, 2006).

Acest sindrom apare în urma splenectomiei pentru cã se pierd astfel douã importante funcții ale organului în cauzã : producția de anticorpi specifici epitopilor polizaharidici ai bacteriilor încapsulate și fagocitoza particulelor opsonizate în cordoanele pulpei roșii splenice.

Riscul acestor infecții este mai mare la copii decât la adulți, de aceea splenectomia parțialã a ajuns de primã indicație în anumite afecțiuni hematologice întâlnite la aceștia, cum ar fi de exemplu sferocitoza ereditarã. Un alt motiv ar fi cã OPSI este frecvent letal la copii, și un anumit risc se menține în ciuda imunizãrii împotriva Streptococus pneumoniae, Neisseria meningitidis și Haemophilus influaenzae și, de asemenea, profilaxiei antibiotice postoperatorii. De asemenea asplenia anatomicã sau funcționalã predispune la o incidențã mare de afecțiuni ale tractului respirator cu germeni încsapsulați în cazul copiilor.

Recunoasterea susceptibilitatii crescute la infectie a pacientilor splenectomizati, respectiv infectii cu bacterii incapsulate, a contribuit semnificativ la intelegerea rolului in imunitate al splinei (Hazlewood, 1992). Zona marginala a splinei este sediul major al generarii de anticorpi independenti de LT, principala linie de aparare a sistemului imun contra antigenelor carbohidrate din capsula bacteriana. Aceasta descoperire a dus la aparitia vaccinurilor anti Staphilococus pneumoniae, Haemophilus influenzae tip B si Neisseria meningitides tip A si C.

Efectul splenectomiei asupra imunitatii celulare este inca incomplet elucidat. Au fost descrise modificari functionale ale sistemului de LT-scaderea raspunsului limfoproliferativ la stimularea mitogenica la pacientii splenectomizati (Downey, 1987; Kreuzfelder, 1991; Wang, 1991). Efectul splenectomiei asupra diferitelor subpopulatii limfocitare a fost variabil, unele studii raportind o scadere a LT in singele periferic, sau numai a anumitor subpopulati (Westermann, 1990), in timp ce alte studii nu arata nici o modificare (Passlick, 1991). Cele mai multe dintre studii au ca scop evaluarea efectelor splenectomiilor posttraumatice asupra imunitatii celulare. Cea mai frecvanta modificare observata este scaderea CD4+ CD45RA+, care se mentine pe timp indelungat precum si scaderea raportului CD4/CD8.

Este cunoscut faptul că splina deține un rol deosebit de important în cadrul imunității înnăscute a gazdei.

Funcția imunologică a splinei constă in reținerea limfocitelor T si B în pulpa albă și zona marginală, capturarea antigenelor, procesarea acestora și punerea în interacțiune cu limfocitele. Din aceasta rezultă producerea de anticorpi, îndeosebi IgM. În acest proces sunt interesate macrofagele care prelucrează antigenele, secretă factori de creștere, interleukine pentru proliferarea și diferențierea limfocitelor, secretă componente ale sistemului complement si fagocitează complexe imune circulante. Deoarece o mare parte din sânge trece prin splină, acest organ este de primă importanță în supravegherea antigenelor sangvine. Splina are capacitatea de a localiza si elimina complexele imune circulante, acest lucru având o mare implicație clinică, deoarece depunerea complexelor în țesuturi generează leziuni tisulare mediate imunologic (de Porto, 2010).

Cu toate că mecanismele prin care splina asigură protecția organismului împotriva agenților patogeni nu e pe deplin elucidat, mai multe studii au demonstrat ca rãspunsul primar splenic de producere a anticorpilor IgM împotriva polizaharidelor capsulare ale S. pneumoniae ar fi suficient pentru a realiza îndepãrtarea bacteriei din organism. Polizaharidele pneumococului sunt distruse la nivel splenic într-un mod extrem de eficient, pe când, în lipsa splinei, acestea se acumuleazã în ganglionii limfatici. Macrofagele zonei marginale functioneazã ca și celule prezentatoare de antigen pentru polizaharide, transferand aceste antigene de tip T-independent limfocitelor B care vor induce apariția anticorpilor antipolizaharidici de tip IgM.

Astfel se poate spune că splina participă în cadrul imunității înnăscute prin intermediul unor celule B cu memorie, ce sunt analoge unor celule ce produc atat anticorpi naturali cât si anticorpi impotriva antigenelor T-independente, cum ar fi polizaharidele pneumococice. Anticorpii naturali sunt în special de tip IgM, ce apar independent pe prima imunizare și leagă antigene cu afinitate scazută. S-a observat că celulele B cu memorie lipsesc la indivizii asplenici.

Din acest motiv splenectomia afecteazã rãspunsul primar la antigenele intravasculare T-dependente, care este diminuat. Sunt dovezi care atestã faptul cã rãspunsurile imune de tip T-dependent sunt alterate chiar și pentru antigene prezentate pe alte rute decât cea sangvinã.

Pacienții splenectomizați au concentrații scãzute de IgM si prezintã un proces alterat de schimbare a IgM cãtre IgG, precum și o funcție deficitarã a limfocitelor B în rãspunsurile de tip T-dependent.

La acesti pacienți se constată de asemenea apariția unei limfocitoze pe termen lung datorită unei creșteri semnificative a tuturor subseturilor, cu excepția subpopulației de celule T CD4+ CD45RA+, ce este un subset de limfocite naive ce nu răspund la antigenele nou apărute.

În plus, s-a observat și o redistribuire a subpopulațiilor de limfocite T din sângele periferic în urma splenectomiei și astfel, procentul de limfocite T CD4+ scade, iar raportul CD4/CD8 se reduce.

Schimbările ce apar în cadrul numãrului absolut al sub-seturilor de limfocite din sângele periferic dupã splenectomie se pot datora absenței splinei ca și rezervor de limfocite circulante, pe când modificãrile ce apar în distribuția acelorași subseturi s-ar putea datora diferențelor în proprietãțile de migrare și în mecanismele de reglare ale acestora din cadrul fiecãrui subset în parte. Studii recente au arãtat faptul cã limfocitele din sângele periferic se împart în douã grupuri ce se deosebesc în ceea ce priveste proprietãtile lor de migrare: grupul de limfocite recirculante (GLR sau limfocitele ce migreazã între organele limfatice secundare) si grupul de limfocite nerecirculante (GLNR sau limfocitele care circulã între splinã si compartimentul sangvin al organismului); splina are rol de reglare a cineticii limfocitelor din grupul GLR, prelungind timpul în care acestea se localizeazã în afara compartimentului sangvin si controlând stationarea lor în ganglionii limfatici; se pare cã splina nu participã în reglarea cineticii compartimentului GLNR. Imediat dupã splenectomie, migrarea grupului GLR prin ganglionii limfatici este accelerat, pe când mecanismele ce intervin în reglarea grupului GLNR sunt încetinite, având ca urmare o crestere relativã sau absolutã a numãrului limfocitelor B ce constituie cea mai mare parte a compartimentului GLNR.

Aceasta crestere celulara nu este suficientã pentru a preveni aparitia OPSI ce poate surveni chiar si la multi ani dupa splenectomie.

Dupã splenectomie, s-a descoperit aparitia în sânge a unor procente crescute de limfocite T CD4+ si CD8+ activate ce au o persistentã productie de citokine (IFN-g, IL-2 si IL-10).

Continua activare pe perioade lungi de timp a limfocitelor T CD4+ ar putea duce la o stare de depletie a celulelor T de memorie. Aceasta poate fi explicatia faptului cã, în urma splenectomiei, rãspunsurile implicate în rememorarea antigenicã sunt alterate.

De asemenea s-a observat o crestere atat a procentului, cat si a numarului absolut de celule NK ce ar putea contribui la aparitia unor efecte adverse, cum ar fi dezvoltarea unei neutropenii semnificative ce se manifesta clinic prin infectii repetate.

Astfel, se poate afirma ca, rolul absentei splinei in producerea acestui grav sindrom septicemic pare a fi consecutiv unei prabusiri imunologice a organismului prin urmatoarele mecanisme: scaderea capacitatii de epurare a sangelui de unii antigeni; reducerea capacitatii de elaborare a unor imunoglobuline; diminuarea productiei de opsonine; absenta tufsinului- un tetrapeptid-hormon sintetizat in splina, care stimuleaza activitatea fagocitara a leucocitelor.

De aceea prezervarea unei portiuni din splina, in general 20% din masa acesteia, se efectuaza cu scopul de a preveni toate aceste complicatii, in acelasi timp pacientul beneficiind si de o terapie eficace a afectiunii de care sufera si pentru care splenectomia are indicatie (Vasilescu, 2001; Vasilescu, 2003b; Vasilescu, 2006).

Pentru a demonstra faptul că funcția imunologică a splinei s-a menținut după o splenectomie parțială, în comparație cu cea totală, se utillizează anumite metode, printre care și cea de stimulare a sângelui, in vitro, înainte și după intervenție, cu diferite antigene bacteriene, cum ar fi lipopolizaharidele (LPS), și se observă, asa cum am realizat în acest studiu, dacă apar diferențe între nivelele sangvine ale mediatorilor inflamației, și anume citokinele, eliberate de către celule aparținând răspunsului imun înnăscut al gazdei respective, din care face parte de altfel și splina, în speță monocite, căci ele au fost masurate în sângele acestor pacienți.

După calculele efectuate, am observat că aceste diferențe întradevăr există.

În ceea ce privește pacienții cu splenectomie subtotală, valorile citokinelor IL-1, IL-6 si IL-10 măsurate la 7 zile au crescut comparativ cu nivelul preoperator, TNF-α a ramas nemodificat, iar IFN-y a scăzut. La o luna postoperator, valorile citokinelor TNF-α, IL-1, IL-6 si IL-10 au crescut și IFN-y a scăzut.

În cazul pacienților cu splenectomie totală, la a doua determinare, valorile IL-6 si IL-10 au crescut, dar la un nivel mai scazut decat in cazul grupului cu splenectomie subtotala, IL-1 a ramas aproximativ constant, iar TNF-α si IFN-y au scazut; la o luna posoperator valorile tuturor citokinelor au scăzut, exceptând IL-6, care a rămas nemodificat.

Comparand rezultatele obinute in cele doua grupuri de pacienti (cu splenectomie totala si subtotala) am observat ca la o luna postoperator (cand practic nu mai poate fi vorba de reactie de faza acuta postoperatorie) secretia stimulata de citokine este mai pronuntata la cei splenectomizati subtotal. Aceasta constatare sustine ipotaza de lucru, aceea ca prezervarea de parenchim splenic permite mentinerea funcției imune a splinei, prin intermediul macrofagelor din pulpa albă, care secretă citokine după ce sunt stimulate cu LPS, astfel încât valorile acestora sunt crescute postoperator, în mare parte, în cazul pacienților cu splenectomie subtotală și sunt scăzute în cazul celor cu splenectomie totală.

Metoda utilizată în cadrul studiului de față și prin care am reușit să ajungem la aceste rezultate, respectiv Whole Blood Stimulation ( WBS) este o metoda foarte fiabilă, deoarece reduce factorii perturbatori, legați de culturile celulare de monocite din sângele periferic, cum ar fi contaminarea cu endotoxina a acestora, influețând astfel rezulatele finale și modificându-le.

Sangele integral reprezinta un mediu fiziologic, unde eliberarea de citokine poate fi studiata, deoarece sunt pastrate aici LPS binding protein si modulatorii secretiei acestora, cum ar fi cortisolul (Berger, 1997; Ertel, 1995).

Prin aceasta metodă am creat un model ex-vivo de sepsis, cu toate că nu poate sa confere informatii despre procesele inflamatorii din tot organismul, însă poate fi analizată secreția de citokine dintr-un compatiment al acestuia, în acest caz porțiunea numită PALS a splinei (Ertel, 1995).

Există anumite studii care au demonstrat că TNF-α este un trigger al eliberării de citokine, așa ca TNF-α, poate induce ea singură eliberarea, de exemplu, de IL-1 sau IL-6, în aceeași manieră ca și endotoxinele. Aceste studii sugerează de asemenea ca TNF-α acționează ca un stimul pentru IL-1 sau IL-6, în timpul sepsisului, pentru că s-a observat că atunci cand bacteriile sau endotoxinele ajung în sânge, are loc o masivă eliberare de TNF-α, urmată abia dupa aceea de un varf al eliberarii de IL-1 sau IL-6 (Cannon, 1990a; Rodrick, 1992).

Și în cadrul studiului nostru am observat, în cazul tuturor pacientilor, că valorile TNF-α după stimularea cu LPS sunt cu mult crescute față de valorile bazale, urmate de o crestere a valorilor IL-1 si IL-6, cu mult modificate, de asemenea, față de valorile lor bazale.

Exista numeroase studii in literatura de specialitate privind rolul splenectomiei subtotale în prezervarea funcției imunologice a splinei.

Astfel un studiu publicat în anul 1997 de catre Moeniralam et al (Moeniralam, 1997), a avut scopul de a demonstra faptul ca splina este si ea implicata, alaturi de ficat, in producerea de IL-6,care este o citokina proinflamatorie, dupa stimularea cu endotoxina bacteriana, datorita functiei imunologice pe care aceasta o detine.

În studiu au fost incluși două loturi de câte șapte caini: sapte fără ( cel de control) și sapte cu splenectomie totala. Acestora li s-a administrat un bolus de endotoxina, 1µg/kg, pentru a putea induce o eliberare majora de citokine, dar care sa nu produca complicatii hemodinamice.

Valorile citokinei IL-6, după administrarea de endotoxina, au fost masurate atat la cainii din grupul de control cat si la cei splenectomizati si s-a observat ca in cazul celor din urma acestea au fost mai mari decat la ceilalti, ceea ce demonstreaza splina moduleaza cinetica citokinelor.

Aceste rezultate sunt relevante și pentru studiul nostru arătând faptul că splina are rol în imunitatea înnăscută, iar splenectomia totală, spre deosebire de cea subtotală, privează organismul gazda de posibilitatea de apărare în fața bacteriilor, provocând astfel complicații infecțioase grave.

Un alt studiu pe aceasta tema a fost publicat in anul 2009 (Nakae, 2009).

În studiu au fost incluși 450 de pacienți tratați în 7 spitale în perioada 1982-2005, dintre care au supraviețuit doar 362 și au fost externați din spital. 100 din acești pacienți au suferit splenectomie totală, 124 de pacienți au suferit diverse metode prin care s-a conservat o parte din țesutul splenic, inclusiv 81 cu embolizarea arterei splenice, 43 cu splenorafie si ceilalti cu splenectomie partiala. 138 de pacientiau fost tratati fara nici o interventie chirurgicala sau radiologica.

Severitatea traumatismului splenic a fost evaluata raportandu-se la clasificarea JAST 1997 ( Japanese Association for the Surgery of Trauma).

Probele de sange au fost prelevate de la pacienti pentru masurarea celulelor sangvine in totalitate, corpilor Howell-Jolly si pentru analiza chimica ( AST, ALT, LDH, fosfataza alcalina, colesterol total si bilirubina totala), proteina C reactiva, imunoglobuline ( IgA, IgG, IgM), complement ( C3,C4,CH50), subseturi de limfocite (CD3, CD4, CD8 si CD19) si anticorpi anticapsulari specifici impotriva S.pneumoniae. Toate aceste examinari detaliate, precum si CT au fost efectuate doar pentru 58 dintre pacienti (24 cu splenectomie totala si 34 cu splenectomie subtotala), pe o perioada cuprinsa intre iunie 2006 si mai 2007.

Examinările hematologice au evidențiat faptul că numărul total de leucocite, de limfocite și de trombocite a fost mai mare în cazul pacienților cu splenectomie totală, ceea ce denotă o funcție de fagocitare și de filtrare diminuată, deși trebuie luat în considerare în interpretarea acestor rezultate și nivelurile de opsonine, statusul postoperator, efectele transfuziei de sânge. De asemenea corpii Howell-Jolly au fost observați în probele de sânge ale majorității pacienților cu splenectomie totală, prezența lor indicand o funcție de fagocitare diminuată în organismul acestora.

Deși au existat numeroase studii care au aratat că nivelurile de imunoglobuline, în special IgM, au scăzut după efectuarea splenectomiei totale, pentru diverse cauze, inclusiv traumatisme, în studiul lor nu a fost relevată nici o diferență semnificativă între nivelurile de imunoglobuline M măsurate ( media în cazul pacienților cu splenectomie totală a fost de 93± 48 mg/dl și în cazul celor cu splenectomie totală a fost de 101±51 mg/dl).

Totuși valorile postoperatorii ale IgM, în cazul ambelor grupuri de pacienți, au fost mai scăzute față de valorile preoperatorii, la o mare parte din ei, și anume: IgM<110 mg/dl la 17 din 24 de pacienți cu splenectomie totală și la 23 din 34 de pacienti cu splenectomie subtotală.

În ceea ce priveste nivelurile de anticorpi anticapsulari specifici impotriva S.pneumoniae, s-a constatat ca pacientii cu splenectomie subtotala tind sa aiba un raspuns imun prin acesti anticorpi insuficient pentru un numar mai mare de serotipuri ale bacteriei fata de cei cu splenectomie totala.

Analizând toate aceste rezultate, si mai ales pe cele ale anticorpilor IgG specifici, IgG si IgM nespecifici si numarul limfocitelor B, acestia au ajuns la concluzia ca pacientii cu splenectomie totala nu prezinta un status mai favorabil din punct de vedere al acestor anticorpi, ci din contra, in unele cazuri, ar putea fi chiar mai suceptibili la infectii decat ceilalti.

Pacienții cu splenectomie subtotala sunt la fel de imunocompromisi ca cei cu totala, desi le-a fost prezervata o anumita parte din splina, probabil nu indeajuns pentru pastrarea intacta a functiilor imunologice, si de aceea necesita vaccinare si preventie a infectiilor ca si ceilalti.

În studiul publicat în 2007 (Pratl, 2008) ce s-a desfășurat în perioda august 1996 și septembrie 2004, au fost incluși 8 pacienți ( patru de sex masculin și patru de sex feminin), fiecare dintre ei prezentând sferocitoză ereditară, de la forma moderată la severă.

Diagnosticul a fost stabilit prin examinări citologice ale unor probe de sânge periferic și prin efectuarea unui test de fragilitate osmotică eritrocitară.

Scopul studiului a fost de a investiga beneficiile unei tehnici de splenectomie subtotale, si anume embolizarea arterei splenice, utilizata ca metoda terapeutica in sferocitoza ereditara, in ceea ce priveste reducerea ratei complicatiilor hemolitice, cat si mentinerea unei functii imune reziduale a splinei.

Decizia de a utiliza această tehnică terapeutică la cei 8 pacienți luați în studiu s-a bazat pe evoluția clinică pe parcursul supravegherii acestora, luându-se în calcul gradul anemiei cronice, numărul de transfuzii sangvine necesare, gradul splenomegaliei, prezența litiazei veziculare sau frecvența crizelor aplastice sau hemolitice.

După intervenție au fost administrate tuturor pacienților antibiotice cu spectru larg pe o perioadă cuprinsă între 7 si 9 zile.

Deși nu a fost administrată nici unui pacient profilaxie cu penicilină, nu a fost înregistrat nici un caz de OPSI in perioada urmatoare de observatie. Ca si in cazul splenectomiei subtotale laparoscopice, embolizarea arterei splenice comporta foarte putine complicatii operatorii si postoperatorii, in comparatie cu cea totala, reduce nevoia de analgetice si timpul de spitalizare.

In 2006 a fost publicat un alt studiu legat de splenectomia subtotală (Hery, 2008).

În studiu au fost incluși 11 pacienți,copii, care au suferit splenectomie subtotală laparoscopică, în perioada cuprinsă între martie 2002 și septembrie 2006.

Datele colectate despre pacienți au constat în : varsta, sex, stare clinica, prezenta indicatiilor operatorii, rezultatele examinarilor radiologice, tehnica chirurgicala, necesitatea transfuziilor sangvine perioperatorii si postoperatorii, complicatiile imediat postoperatorii si din perioada de monitorizare.

Pacienții au fost incluși în două grupuri, unul cu afectiuni hematologice (sase cu sferocitoza ereditara si unul cu hemoglobinoza E) si unul cu tumori splenice ( doua chisturi si doua hemangioame).

S-a observat de asemenea, si prin rezultatele acestui studiu, ca splenectomia subtotala e cea mai buna cale de a preveni infectiile grave postoperatorii, pentru ca prezerva rolul imunologic al splinei, pentru ca nici un pacient nu a dezvoltat aceasta complicatie dupa indepartarea portiunii splenice,

De asemenea în urma splenectomiei subtotale au fost reduse si complicatiile hemolitice, pentru ca in cazul tuturor pacientilor valorile hemoglobinei au crescut, revenind la normal si nici unul nu a necesitat transfuzii sangvine postoperatorii.

Ertel si colab. (Ertel, 1995) a demonstrat prin stimularea sangelui integral cu LPS, metoda folosita si in studiul de fata sinteza scazuta de citokine in sepsis. In cadrul studiului s-a utilizat sange integral recoltat de la 15 pacienti aflati in stare septica si de la 20 de pacienti reprezentand grupul de control, ce nu prezentau nici unul dintre criteriile sepsisului ( in expectative interventiei chirurgicale reprezentate de cura herniei sau colecistectomie). Sangele de la pacientii septici a fost recoltat in ziua admisiei in spital si apoi la 1, 2, 3, 5, 7 si 10 zile dupa si de la cei din grupul de control , doar preoperator pentru a exclude orice influenta asupra rezultatelor, cauzata de stresul chirurgical sau de anestezie, pentru a putea masura nivelele de citokine proinflamatorii TNF-α, IL-1 β si IL-6 si cinetica acestora.

O parte din sangele, de la fiecare pacient in parte, din cadrul ambelor grupuri, respectiv cel cu septici si cel de control , a fost stimulat cu antigene bacteriene , si anume lipopolizaharid provenind de la E.coli, in cantitate de 1µg/ml, masurandu-se comparativ nivelele de citokine TNF-α, IL-1 β si IL-6 de aici in momentul incubarii si la 24 de ore ulterior, si de asemenea din partea de sange nestimulata.

S-a observat o crestere semnificativa a nivelului de citokine proinflamatorii in sangele stimulat cu LPS bacterian la 24 de ore de la incubatie, in cazul pacientilor din grupul de control , in timp ce in cazul pacientilor septici , din contra, s-a inregistrat o scadere marcata a acestora , ce s-a mentinut de altfel 10 zile. Acest lucru demonstreaza ca in cazul organismelor imunodeprimate, cum se intampla in cazul pacientilor septici, monocitele din sange nu mai sunt capabile de a sintetiza si elibera citokine proinflamatorii ca raspuns la un stimul antigenic, de exemplu bacterian.

Si in cadrul studiului de fata s-a observat, de asemenea, ca in cazul pacientilor cu splenectomie totala, considerate organisme imunodeprimate, nivelele de citokine proinflamatorii sunt mult mai scazute dupa stimulare cu antigen bacterian, decat in cazul celor cu splenectomie subtotala, acetia din urma avand inca conservata o parte din functia imuna a splinei.

Alti autori (Moshtaghi-Kashanian, 2006), au studiat productia de citokine in sangele unor pacienti cu β-talasemie, utilizand metode in-vivo si in-vitro.

A fost colectat sange, in mediu aseptic, ce a fost apoi heparinizat, de la 22 de pacienti, cu varste cuprinse intre 10 si 12 ani, afectati de β talasemie, cu mentiunea ca jumatate dintre ei erau splenectomizati. Au fost colectate de asemenea si probe de sange de la 10 pacienti sanatosi, ce a servit drept grup de control.

O parte din proba respectiva de sange, de la fiecare pacient in parte , a fost utilizata pentru a evalua nivelele de citokine IL-2, IL-10, TGF- β 1 plasmatice, iar cealalta parte a fost stimulata prin adaugarea unei mixturi de antigene bacteriene , reprezentate de LPS si PHA ( concentratie de 1, respectiv 10 micrograme⁄ml), la interval diferite de timp ( 4, 24, 48, 72 ore).

Rezultatele studiului au aratat ca nivelul de TGF- β 1 din sangele pacientilor splenectomizati sunt considerabil mai mari decat cel din sangele celor din grupul de control ( p<0.01), in probele stimulate cu antigene bacteriene. Prin teste realizate in vitro s-a aratat ca nivelul de IL-2, in probele nestimulate, este mai mic la pacientii cu β-talasemie (cei fara splenectomie), decat la cei din grupul de control ( p<0.01). In schimb la cei splenectomizati rezultatele pentru IL-2 au fost similare cu cele pentru TGF- β 1.

Aceste rezultate sunt in concordanta cu cele din studiul de fata, cum ca prin splenectomie totala se pierde si importanta funcie imuna a acestui organ, expunand oragnismul gazda la infectii importante in fata atacului antigenic bacterian.

Există anumite studii care au demonstrat că desi nivelul de TNF-α creste de mai multe ori si intr-un timp mult mai scurt decat cel al altor alte interleukine proinflamatorii, in caz de soc septic , nu se poate spune totusi ca TNF -α, poate induce ea singură eliberarea, de exemplu, de IL-1 sau IL-6, în aceeași manieră ca și endotoxinele. Studiul citat in continuare sugerează ca TNF-α nu acționează ca un trigger pentru alte citokine proinflamatorii , în timpul sepsisului, desi s-a observat că atunci cand bacteriile sau endotoxinele ajung în sânge, are loc o masivă eliberare de TNF-α, urmată abia dupa aceea de un varf al eliberarii de IL-1 sau IL-6 (Cannon, 1990b). Au fost masurate nivelele de interleukine IL-1β, IL-1α si TNF-α din sangele prelevat de la 44 de subiecti sanatosi, 15 pacienti in stare de soc septic si 6 subiecti voluntari carora li s-a administrat o cantitate de endotoxina bacteriana.

S-a observat ca nivelle de interleukina IL-1 α au fost scazute ( 40 pg⁄ml) sau nedetectabile in oricare dintre situatii. In 67% din cazuri, in randul subiectilor sanatosi ,nivelele de interleukina IL-1 β au fost <70 pg⁄ml. Pacientii aflati in soc septic au avut nivele ridicate in sange de TNF-α ( 119±30 pg⁄ml), fiind corelate cu severitatea bolii ( r=.73, p=.003).

In acest caz nu s-a observat totusi vreo corelatie intre nivelele de TNF-α si IL-1 β. In randul subiectilor carora li s-a administrat endotoxina bacteriana s-a observant o crestere a nvelului de IL-1 β de la un nivel bazal de 35 ± 5 pg/ml la un maxim de 69 ± 27 pg/ml in timp de 180 min. Peak-ul de TNF-α a fost de 15 ori mai mare decat cel de IL-1β, si intr-un timp de doua ori mai scurt, insa la fel ca si la pacientii septic, fara a exista vreo corelatie intre aceste doua situatii.

La fel se poate observa si in studiul de fata luand in considerare exemplul unuia dintre pacienți, în varstă de patru ani, din grupul celor cu splenectomie subtotală, la care valorile bazale ale TNF-α la cele trei determinari au fost : 9.3 pg/ml, 7.3 pg/ml si 10.1 pg/ml.

Cele masurate din sangele stimulat cu LPS bacterian au fost :354 pg/ml, 815 pg/ml and 2755 pg/ml; ; IL-6: valori bazale (3.6 pg/ml, 14.1 pg/ml si 35.8 pg/ml) și valori LPS stimulate (328 pg/ml, 1832 pg/ml and 3439 pg/ml).

Se observă din aceste măsuratori o crestere semnificativă a valorilor citokinelor dupa stimularea cu LPS, însă nu putem afirma daca cresterea IL-1 si IL-6 a fost în vreun fel influențată de TNF-α.

Concluzii

În urma comparației efectuate între pacienții cu splenectomie totalã și cu splenectomie subtotalã, se constată diferențe in ceea ce privește eliberarea de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF-α, IL-1, IL-6 si fara diferențe in ceea ce priveste eliberarea de citokine antiinflamatorii, cum ar fi IFN-y.

Analizând aceste rezultate, se poate afirma cã fragmentul de parenchim splenic conservat prin efectuarea splenectomiei subtotale, încã pãstreazã intactã funcția imunã a acesteia, prin intermediul macrofagelor din pulpa albã, care secreta citokine dupa ce sunt stimulate cu LPS, astfel încat valorile acestora sunt crescute postoperator, în mare parte, în cazul pacienților cu splenectomie subtotalã si sunt scãzute sau rãmân nemodificate în cazul celor cu splenectomie totalã.

Având în vedere rolul splinei în apãrarea împotriva bacteriilor gram negative, pentru cã este parte integrantã a imunitații înnãscute,aceste date aduc argumente în favoarea conservãrii pe cât posibil de parenchim splenic, mai ales la copii. Printre pacienții din studiul de fațã este inclusã și aceastã categorie de vârstã.

Datele obtinute confirmã si ele cã metoda ” Whole Blood Stimulation” ( WBS) e o metodã de încredere pentru analiza funcției imunologice a splinei.

Limitele acestui studiu sunt :

numar mic de pacienți, fiindca indicatia de splenectomie subtotalã e relativ rarã;

metoda de laborator e complexã;

modalitatea de determinare a citokinelor e scumpã (tehnica ELISA) ;

faptul ca existã heterogenitate de varsta și de diagnostic.

In concluzie, datele ce reies din studiul de fațã susțin faptul ca splenectomia subtotala prezerva functia imuna a splinei, evaluata prin testarea tolerantei la endotoxina. Evaluarea statusului imun a pacientilor splenectomizati are rol prognostic in ceea ce priveste supravegherea clinica si paraclinica ulterioara. Cea mai importanta aplicatie clinica a studiului este impunerea unor noi tehnici chirurgicale (splenectomie subtotala) in special in tratamentul bolilor hematologice si in patologia pediatrica cu impact semnificativ asupra mortalitatii si morbiditatii.

Studiul contribuie la largirea registrului de pacienti splenectomizati, unic in tara noastra, care vor beneficia de cele mai noi si moderne mijloace de diagnostic, investigatie paraclinica si tratament

Reference List

1. The Cytokine Handbook, Elsevier Science San Diego 2003.

2. Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology, Elsevier Saunders Philadelphia 2012.

3. Adachi, O., Kawai, T., Takeda, K., Matsumoto, M., Tsutsui, H., Sakagami, M., Nakanishi, K., and Akira, S. Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-mediated function, Immunity., 1998 9(1):143-150.

4. Aderem, A. and Ulevitch, R.J. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response, Nature, 2000 406(6797):782-787.

5. Akira, S. TLR Signaling, Springer-Verlag Berlin 2006.

6. Akira, S. Innate immunity to pathogens: diversity in receptors for microbial recognition, Immunol.Rev., 2009 227(1):5-8.

7. Akira, S. and Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family, Immunol.Lett., 2003 85(2):85-95.

8. Altamura, M., Caradonna, L., Amati, L., Pellegrino, N.M., Urgesi, G., and Miniello, S. Splenectomy and sepsis: the role of the spleen in the immune-mediated bacterial clearance, Immunopharmacol.Immunotoxicol., 2001 23(2):153-161.

9. Angelescu, N. Tratat de patologie chirurgicala, Editura Medicala 2007.

10. Bagby, G Jr and Heinrich, M. in Growth Factors, Cytokines and the Control of Hematopoiesis, Hoffman, R. Churchill Livingstone, Philadelphia 2000.

11. Baigrie, R.J., Lamont, P.M., Kwiatkowski, D., Dallman, M.J., and Morris, P.J. Systemic cytokine response after major surgery, Br.J.Surg., 1992 79(8):757-760.

12. Baltimore, D., Boldin, M.P., O'Connell, R.M., Rao, D.S., and Taganov, K.D. MicroRNAs: new regulators of immune cell development and function, Nat.Immunol., 2008 9(8):839-845.

13. Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y.J., Pulendran, B., and Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells, Annu.Rev.Immunol., 2000 18(767-811.

14. Beeson, P.B. TOLERANCE TO BACTERIAL PYROGENS : I. FACTORS INFLUENCING ITS DEVELOPMENT, J Exp.Med., 1947 86(1):29-38.

15. Berger, D., Boelke, E., Seidelmann, M., Vasilescu, C., and Beger, H.G. Endotoxin-induced cytokine release from whole blood – similarities between monocyte dysfunction in septic disease and during post-operative acute phase response, J Endotox Res, 1997 4(1):17-24.

16. Berger, D., Boelke, E., Stanescu, A., Buttenschoen, K., Vasilescu, C., Seidelmann, M., and Beger, H.G. Endotoxemia and mediator release during colonoscopy, Endoscopy, 1995 27(9):671-675.

17. Beutler, B. SHIP, TGF-beta, and endotoxin tolerance, Immunity., 2004 21(2):134-135.

18. Bhatia, M., He, M., Zhang, H., and Moochhala, S. Sepsis as a model of SIRS, Front Biosci.(Landmark.Ed), 2009 14(4703-4711.

19. Biswas, S.K. and Lopez-Collazo, E. Endotoxin tolerance: new mechanisms, molecules and clinical significance, Trends Immunol., 2009 30(10):475-487.

20. Bone, R.C., Balk, R.A., Cerra, F.B., Dellinger, R.P., Fein, A.M., Knaus, W.A., Schein, R.M., and Sibbald, W.J. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. 1992, Chest, 2009 136(5 Suppl):e28-

21. Bratosin, D., Mazurier, J., Tissier, J.P., Estaquier, J., Huart, J.J., Ameisen, J.C., Aminoff, D., and Montreuil, J. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review, Biochimie, 1998 80(2):173-195.

22. Brendolan, A., Rosado, M.M., Carsetti, R., Selleri, L., and Dear, T.N. Development and function of the mammalian spleen, Bioessays, 2007 29(2):166-177.

23. Brint, E. and Luke, A.J. Toll-like receptors in inflammation, Springer Basel 2005.

24. Bruunsgaard, H., Pedersen, A.N., Schroll, M., Skinhoj, P., and Pedersen, B.K. Impaired production of proinflammatory cytokines in response to lipopolysaccharide (LPS) stimulation in elderly humans, Clin.Exp.Immunol., 1999 118(2):235-241.

25. Burns, K., Clatworthy, J., Martin, L., Martinon, F., Plumpton, C., Maschera, B., Lewis, A., Ray, K., Tschopp, J., and Volpe, F. Tollip, a new component of the IL-1RI pathway, links IRAK to the IL-1 receptor, Nat.Cell Biol., 2000 2(6):346-351.

26. Buttenschoen, K., Buttenschoen, D.C., Berger, D., Vasilescu, C., Schafheutle, S., Goeltenboth, B., Seidelmann, M., and Beger, H.G. Endotoxemia and acute-phase proteins in major abdominal surgery, Am.J.Surg., 2001 181(1):36-43.

27. Buttenschoen, K., Kornmann, M., Berger, D., Leder, G., Beger, H.G., and Vasilescu, C. Endotoxemia and endotoxin tolerance in patients with ARDS, Langenbecks Arch.Surg., 2008 393(4):473-478.

28. Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W., Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., and . Circulating interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin fever, J Infect.Dis., 1990a 161(1):79-84.

29. Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W., Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., and . Circulating interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin fever, J Infect.Dis., 1990b 161(1):79-84.

30. Chadburn, A. The spleen: anatomy and anatomical function, Semin.Hematol., 2000 37(1 Suppl 1):13-21.

31. Cohen, J. Sepsis and septic shock: inching forwards, Clin.Med., 2009 9(3):256-257.

32. Cortes, J.E., Talpaz, M., Cabanillas, F., Seymour, J.F., and Kurzrock, R. Serum levels of interleukin-10 in patients with diffuse large cell lymphoma: lack of correlation with prognosis, Blood, 1995 85(9):2516-2520.

33. Cortez, M.A. and Calin, G.A. MicroRNA identification in plasma and serum: a new tool to diagnose and monitor diseases, Expert.Opin.Biol.Ther., 2009 9(6):703-711.

34. Crandall, M., Shapiro, M.B., and West, M.A. Does splenectomy protect against immune-mediated complications in blunt trauma patients?, Mol.Med., 2009 15(7-8):263-267.

35. Croce, C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer, Nat.Rev.Genet., 2009 10(10):704-714.

36. de Porto, A.P., Lammers, A.J., Bennink, R.J., ten Berge, I.J., Speelman, P., and Hoekstra, J.B. Assessment of splenic function, Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis., 2010 29(12):1465-1473.

37. Didierlaurent, A., Brissoni, B., Velin, D., Aebi, N., Tardivel, A., Kaslin, E., Sirard, J.C., Angelov, G., Tschopp, J., and Burns, K. Tollip regulates proinflammatory responses to interleukin-1 and lipopolysaccharide, Mol.Cell Biol., 2006 26(3):735-742.

38. Dinarello, C.A. Proinflammatory cytokines, Chest, 2000 118(2):503-508.

39. Downey, E.C., Shackford, S.R., Fridlund, P.H., and Ninnemann, J.L. Long-term depressed immune function in patients splenectomized for trauma, J Trauma, 1987 27(6):661-663.

40. Du, T. and Zamore, P.D. Beginning to understand microRNA function, Cell Res., 2007 17(8):661-663.

41. Ertel, W., Kremer, J.P., Kenney, J., Steckholzer, U., Jarrar, D., Trentz, O., and Schildberg, F.W. Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic patients, Blood, 1995 85(5):1341-1347.

42. Fitzgerald, K., Gearing, A., and Callard, R. The Cytokine Factsbook, 2013.

43. Fredriksson, K., Tjader, I., Keller, P., Petrovic, N., Ahlman, B., Scheele, C., Wernerman, J., Timmons, J.A., and Rooyackers, O. Dysregulation of mitochondrial dynamics and the muscle transcriptome in ICU patients suffering from sepsis induced multiple organ failure, PLoS.One., 2008 3(11):e3686-

44. Funk, D.J., Parrillo, J.E., and Kumar, A. Sepsis and septic shock: a history, Crit Care Clin., 2009 25(1):83-101, viii.

45. Gabay, C. and Kushner, I. Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation, N.Engl.J Med., 1999 340(6):448-454.

46. Gaman, A. and Gaman, G. Citokinele, rol in hematopoieza, Medicina Moderna, 2001 8(9):486-491.

47. Giza, D.E. and Vasilescu, C. [MicroRNA's role in sepsis and endotoxin tolerance. More players on the stage], Chirurgia.(Bucur.), 2010 105(5):625-630.

48. Gruys, E., Toussaint, M.J., Niewold, T.A., and Koopmans, S.J. Acute phase reaction and acute phase proteins, J.Zhejiang.Univ Sci.B, 2005 6(11):1045-1056.

49. Hazlewood, M.A., Kumararatne, D.S., Webster, A.D., Goodall, M., Bird, P., and Daha, M. An association between homozygous C3 deficiency and low levels of anti-pneumococcal capsular polysaccharide antibodies, Clin.Exp.Immunol., 1992 87(3):404-409.

50. Hebert, J.C., O'Reilly, M., Yuenger, K., Shatney, L., Yoder, D.W., and Barry, B. Augmentation of alveolar macrophage phagocytic activity by granulocyte colony stimulating factor and interleukin-1: influence of splenectomy, J.Trauma, 1994 37(6):909-912.

51. Hery, G., Becmeur, F., Mefat, L., Kalfa, D., Lutz, P., Lutz, L., Guys, J.M., and de, L.P. Laparoscopic partial splenectomy: indications and results of a multicenter retrospective study, Surg.Endosc., 2008 22(1):45-49.

52. Hewitt, P.M., Ip, S.M., Kwok, S.P., Somers, S.S., Li, K., Leung, K.L., Lau, W.Y., and Li, A.K. Laparoscopic-assisted vs. open surgery for colorectal cancer: comparative study of immune effects, Dis.Colon Rectum, 1998 41(7):901-909.

53. Horng, T., Barton, G.M., Flavell, R.A., and Medzhitov, R. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors, Nature, 2002 420(6913):329-333.

54. Horng, T., Barton, G.M., and Medzhitov, R. TIRAP: an adapter molecule in the Toll signaling pathway, Nat.Immunol., 2001 2(9):835-841.

55. Hotchkiss, R.S. and Karl, I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis, N.Engl.J Med., 2003 348(2):138-150.

56. Hotchkiss, R.S. and Nicholson, D.W. Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in sepsis, Nat.Rev.Immunol., 2006 6(11):813-822.

57. Hotchkiss, R.S., Tinsley, K.W., Swanson, P.E., Grayson, M.H., Osborne, D.F., Wagner, T.H., Cobb, J.P., Coopersmith, C., and Karl, I.E. Depletion of dendritic cells, but not macrophages, in patients with sepsis, J.Immunol., 2002 168(5):2493-2500.

58. Hotchkiss, R.S., Tinsley, K.W., Swanson, P.E., Schmieg, R.E., Jr., Hui, J.J., Chang, K.C., Osborne, D.F., Freeman, B.D., Cobb, J.P., Buchman, T.G., and Karl, I.E. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T lymphocytes in humans, J Immunol., 2001 166(11):6952-6963.

59. Hutchins, R.R., Gunning, M.P., Lucas, D.N., Allen-Mersh, T.G., and Soni, N.C. Relaparotomy for suspected intraperitoneal sepsis after abdominal surgery, World J Surg., 2004 28(2):137-141.

60. Ilkins, B.S. and Right, D.H. Ilustrated Pathology of the Spleen, Cambridge University Press New York 2003.

61. Janeway, C.A., Jr. and Medzhitov, R. Innate immune recognition, Annu.Rev.Immunol., 2002 20(197-216.

62. Jirillo, E., Mastronardi, M.L., Altamura, M., Munno, I., Miniello, S., Urgesi, G., and Amati, L. The immunocompromised host: immune alterations in splenectomized patients and clinical implications, Curr.Pharm.Des, 2003 9(24):1918-1923.

63. Kawai, T., Adachi, O., Ogawa, T., Takeda, K., and Akira, S. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin, Immunity., 1999 11(1):115-122.

64. Kawai, T. and Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors, Nat.Immunol., 2010 11(5):373-384.

65. Kehlet, H. The surgical stress response: should it be prevented?, Can.J.Surg., 1991 34(6):565-567.

66. Knirel, A.Y. and Valvano, A.M. Bacterial Lipopolysacchararides – Structure, Chemical Synthetis, Biogenesis and Interactions with Host Cells, Springer New York 2011.

67. Kreuzfelder, E., Obertacke, U., Erhard, J., Funk, R., Steinen, R., Scheiermann, N., Thraenhart, O., Eigler, F.W., and Schmit-Neuerburg, K.P. Alterations of the immune system following splenectomy in childhood, J Trauma, 1991 31(3):358-364.

68. Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S. Toll-like receptors and innate immunity, Biochem.Biophys.Res.Commun., 2009 388(4):621-625.

69. Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system, Int.Rev.Immunol., 2011 30(1):16-34.

70. Lambris, J.D. Current Topics in Innate Immunity, Springer Philadelphia 2007.

71. Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14, Cell, 1993 75(5):843-854.

72. Levy, M.M., Fink, M.P., Marshall, J.C., Abraham, E., Angus, D., Cook, D., Cohen, J., Opal, S.M., Vincent, J.L., and Ramsay, G. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference, Intensive Care Med., 2003 29(4):530-538.

73. Lewis, B.P., Burge, C.B., and Bartel, D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets, Cell, 2005 120(1):15-20.

74. Libert, C. Inflammation: A nervous connection, Nature, 2003 421(6921):328-329.

75. Lichtenstern, C., Schmidt, J., Knaebel, H.P., Martin, E., Buchler, M.W., and Weigand, M.A. Postoperative bacterial/fungal infections: a challenging problem in critically ill patients after abdominal surgery, Dig.Surg., 2007 24(1):1-11.

76. Lothar, T in Inflammation, Lothar Thomas, Frankfurt /Main 1998.

77. Lu, L.F. and Liston, A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system, Immunology, 2009 127(3):291-298.

78. Maes, M., Stevens, W., Scharpe, S., Bosmans, E., De, M.F., D'Hondt, P., Peeters, D., Thompson, P., Cosyns, P., De, C.L., and . Seasonal variation in peripheral blood leukocyte subsets and in serum interleukin-6, and soluble interleukin-2 and -6 receptor concentrations in normal volunteers, Experientia, 1994 50(9):821-829.

79. Mebius, R.E. and Kraal, G. Structure and function of the spleen, Nat.Rev.Immunol., 2005 5(8):606-616.

80. Medvedev, A.E., Flo, T., Ingalls, R.R., Golenbock, D.T., Teti, G., Vogel, S.N., and Espevik, T. Involvement of CD14 and complement receptors CR3 and CR4 in nuclear factor-kappaB activation and TNF production induced by lipopolysaccharide and group B streptococcal cell walls, J.Immunol., 1998 160(9):4535-4542.

81. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity, Nat.Rev.Immunol., 2001 1(2):135-145.

82. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response, Nature, 2007 449(7164):819-826.

83. Medzhitov, R., Preston-Hurlburt, P., and Janeway, C.A., Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity, Nature, 1997 388(6640):394-397.

84. Minne, L., Abu-Hanna, A., and de, J.E. Evaluation of SOFA-based models for predicting mortality in the ICU: A systematic review, Crit Care, 2008 12(6):R161-

85. Miyake, K., Shimazu, R., Kondo, J., Niki, T., Akashi, S., Ogata, H., Yamashita, Y., Miura, Y., and Kimoto, M. Mouse MD-1, a molecule that is physically associated with RP105 and positively regulates its expression, J Immunol., 1998 161(3):1348-1353.

86. Moeniralam, H.S., Bemelman, W.A., Endert, E., Koopmans, R., Sauerwein, H.P., and Romijn, J.A. The decrease in nonsplenic interleukin-6 (IL-6) production after splenectomy indicates the existence of a positive feedback loop of IL-6 production during endotoxemia in dogs, Infect.Immun., 1997 65(6):2299-2305.

87. Moshtaghi-Kashanian, G.R., Gholamhoseinian, A., Hoseinimoghadam, A., and Rajabalian, S. Splenectomy changes the pattern of cytokine production in beta-thalassemic patients, Cytokine, 2006 35(5-6):253-257.

88. Munoz, C., Carlet, J., Fitting, C., Misset, B., Bleriot, J.P., and Cavaillon, J.M. Dysregulation of in vitro cytokine production by monocytes during sepsis, J Clin.Invest, 1991 88(5):1747-1754.

89. Murphy, K., Travers, P., and Walport, M. Janeways Immunology, Garland Science 2008.

90. Nahid, M.A., Pauley, K.M., Satoh, M., and Chan, E.K. miR-146a is critical for endotoxin-induced tolerance: IMPLICATION IN INNATE IMMUNITY, J.Biol.Chem., 2009 284(50):34590-34599.

91. Nakae, H., Shimazu, T., Miyauchi, H., Morozumi, J., Ohta, S., Yamaguchi, Y., Kishikawa, M., Ueyama, M., Kitano, M., Ikeuchi, H., Yukioka, T., and Sugimoto, H. Does splenic preservation treatment (embolization, splenorrhaphy, and partial splenectomy) improve immunologic function and long-term prognosis after splenic injury?, J Trauma, 2009 67(3):557-563.

92. Netea, M.G., van, D.M., Kullberg, B.J., Cavaillon, J.M., and van der Meer, J.W. Does the shape of lipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors?, Trends Immunol., 2002 23(3):135-139.

93. Nomura, N., Miyajima, N., Sazuka, T., Tanaka, A., Kawarabayasi, Y., Sato, S., Nagase, T., Seki, N., Ishikawa, K., and Tabata, S. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1, DNA Res, 1994 1(1):27-35.

94. O'Connell, R.M., Taganov, K.D., Boldin, M.P., Cheng, G., and Baltimore, D. MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2007 104(5):1604-1609.

95. Okabayashi, T. and Hanazaki, K. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults – a clinically preventable disease, World J.Gastroenterol., 2008 14(2):176-179.

96. Passlick, B., Izbicki, J.R., Waydhas, C., Nast-Kolb, D., Schweiberer, L., and Ziegler-Heitbrock, H.W. Posttraumatic splenectomy does not influence human peripheral blood mononuclear cell subsets, J Clin.Lab Immunol., 1991 34(4):157-161.

97. Pauley, K.M. and Chan, E.K. MicroRNAs and their emerging roles in immunology, Ann.N.Y.Acad.Sci., 2008 1143(226-239.

98. Popovici, A. Splenectomia – indicatii medico-chirurgicale, Editura Militara 1995.

99. Pratl, B., Benesch, M., Lackner, H., Portugaller, H.R., Pusswald, B., Sovinz, P., Schwinger, W., Moser, A., and Urban, C. Partial splenic embolization in children with hereditary spherocytosis, Eur.J Haematol., 2008 80(1):76-80.

100. Raetz, C.R. and Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins, Annu.Rev.Biochem., 2002 71(635-700.

101. Rakoff-Nahoum, S. and Medzhitov, R. Toll-like receptors and cancer, Nat.Rev.Cancer, 2009 9(1):57-63.

102. Remick, D.G. Cytokine therapeutics for the treatment of sepsis: why has nothing worked?, Curr.Pharm.Des, 2003 9(1):75-82.

103. Rich, T. Toll and Toll-like receptors: An Immunologic Perspective, Springer New York 2005.

104. Riches, P., Gooding, R., Millar, B.C., and Rowbottom, A.W. Influence of collection and separation of blood samples on plasma IL-1, IL-6 and TNF-alpha concentrations, J Immunol.Methods, 1992 153(1-2):125-131.

105. Rigato, O. and Salomao, R. Impaired production of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha but not of interleukin 10 in whole blood of patients with sepsis, Shock, 2003 19(2):113-116.

106. Rodrick, M.L., Moss, N.M., Grbic, J.T., Revhaug, A., O'Dwyer, S.T., Michie, H.R., Gough, D.B., Dubravec, D., Manson, J.M., Saporoschetz, I.B., and . Effects of in vivo endotoxin infusions on in vitro cellular immune responses in humans, J Clin.Immunol., 1992 12(6):440-450.

107. Schmidt, W.M., Spiel, A.O., Jilma, B., Wolzt, M., and Muller, M. In vivo profile of the human leukocyte microRNA response to endotoxemia, Biochem.Biophys.Res Commun., 2009 380(3):437-441.

108. Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., and Rajewsky, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs, Nature, 2008 455(7209):58-63.

109. Sheedy, F.J. and O'Neill, L.A. Adding fuel to fire: microRNAs as a new class of mediators of inflammation, Ann.Rheum.Dis., 2008 67 Suppl 3(iii50-iii55.

110. Shimazu, R., Akashi, S., Ogata, H., Nagai, Y., Fukudome, K., Miyake, K., and Kimoto, M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4, J Exp.Med., 1999 189(11):1777-1782.

111. Sibbald, W.J., Marshall, J., Christou, N., Girotti, M., McCormack, D., Rostein, O., Martin, C., and Meakins, J. "Sepsis"–clarity of existing terminology … or more confusion?, Crit Care Med., 1991 19(8):996-998.

112. Sieling, P.A. and Modlin, R.L. Toll-like receptors: mammalian "taste receptors" for a smorgasbord of microbial invaders, Curr.Opin.Microbiol., 2002 5(1):70-75.

113. Sinistro, A., Almerighi, C., Ciaprini, C., Natoli, S., Sussarello, E., Di, F.S., Calo-Carducci, F., Rocchi, G., and Bergamini, A. Downregulation of CD40 ligand response in monocytes from sepsis patients, Clin.Vaccine Immunol., 2008 15(12):1851-1858.

114. Steinman, R M and Hemmi, H. in Dendritic Cells: Translating Innate to Adaptative Immunity, The Rockefeller University, New York 2009.

115. Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., and Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2006 103(33):12481-12486.

116. Takeuchi, O. and Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation, Cell, 2010 140(6):805-820.

117. Takeuchi, O., Takeda, K., Hoshino, K., Adachi, O., Ogawa, T., and Akira, S. Cellular responses to bacterial cell wall components are mediated through MyD88-dependent signaling cascades, Int.Immunol., 2000 12(1):113-117.

118. Tarlinton, D. Germinal centers: form and function, Curr.Opin.Immunol., 1998 10(3):245-251.

119. Tchernia, G., Bader-Meunier, B., Berterottiere, P., Eber, S., Dommergues, J.P., and Gauthier, F. Effectiveness of partial splenectomy in hereditary spherocytosis, Curr.Opin.Hematol., 1997 4(2):136-141.

120. Terashima, T., English, D., Hogg, J.C., and van Eeden, S.F. Release of polymorphonuclear leukocytes from the bone marrow by interleukin-8, Blood, 1998 92(3):1062-1069.

121. Thavasu, P.W., Longhurst, S., Joel, S.P., Slevin, M.L., and Balkwill, F.R. Measuring cytokine levels in blood. Importance of anticoagulants, processing, and storage conditions, J Immunol.Methods, 1992 153(1-2):115-124.

122. Tili, E., Michaille, J.J., Cimino, A., Costinean, S., Dumitru, C.D., Adair, B., Fabbri, M., Alder, H., Liu, C.G., Calin, G.A., and Croce, C.M. Modulation of miR-155 and miR-125b levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock, J.Immunol., 2007 179(8):5082-5089.

123. Timens, W. The human spleen and the immune system: not just another lymphoid organ, Res.Immunol., 1991 142(4):316-320.

124. Tiron, A. and Vasilescu, C. [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2008 103(3):255-263.

125. van den Dobbelsteen, G.P., Brunekreef, K., Kroes, H., van, R.N., and van Rees, E.P. Enhanced triggering of mucosal immune responses by reducing splenic phagocytic functions, Eur.J.Immunol., 1993 23(7):1488-1493.

126. van Dissel, J.T., van, L.P., Westendorp, R.G., Kwappenberg, K., and Frolich, M. Anti-inflammatory cytokine profile and mortality in febrile patients, Lancet, 1998 351(9107):950-953.

127. van Eeden, S.F. and Terashima, T. Interleukin 8 (IL-8) and the release of leukocytes from the bone marrow, Leuk.Lymphoma, 2000 37(3-4):259-271.

128. Vasilescu, C. [Laparoscopic splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2005 100(6):595-598.

129. Vasilescu, C., Berger, D., Buttenschon, K., Seidelmann, M., and Beger, H.G. Endotoxin-induced release of interleukin 6 and interleukin 1 beta in human blood is independent of tumor necrosis factor alpha, Eur.Surg.Res., 1996 28(1):55-62.

130. Vasilescu, C., Herlea, V., Buttenschoen, K., and Beger, H.G. Endotoxin translocation in two models of experimental acute pancreatitis, J.Cell Mol.Med., 2003a 7(4):417-424.

131. Vasilescu, C., Olteanu, M., and Flondor, P. How relevant are in vivo and in vitro studies for clinical sepsis? A mathematical model of LPS signaling based on endotoxin tolerance, Chirurgia.(Bucur.), 2009a 104(2):195-201.

132. Vasilescu, C., Rossi, S., Shimizu, M., Tudor, S., Veronese, A., Ferracin, M., Nicoloso, M.S., Barbarotto, E., Popa, M., Stanciulea, O., Fernandez, M.H., Tulbure, D., Bueso-Ramos, C.E., Negrini, M., and Calin, G.A. MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis, PLoS.One., 2009b 4(10):e7405-

133. Vasilescu, C., Stanciulea, O., Colita, A., Stoia, R., Moicean, A., and Arion, C. [Laparoscopic subtotal splenectomy in the treatment of hereditary spherocytosis], Chirurgia.(Bucur.), 2003b 98(6):571-576.

134. Vasilescu, C., Stanciulea, O., Tudor, S., Stanescu, D., Colita, A., Stoia, R., Coriu, D., Colita, A., and Arion, C. Laparoscopic subtotal splenectomy in hereditary spherocytosis : to preserve the upper or the lower pole of the spleen?, Surg.Endosc., 2006 20(5):748-752.

135. Vasilescu, C., Tomulescu, V., Ciurea, S., and Popescu, I. [Laparoscopic splenectomy–lessons learned from a series of 40 cases. The advantages of the postero-lateral approach], Chirurgia.(Bucur.), 2001 96(2):231-236.

136. Vittimberga, F.J., Jr., Foley, D.P., Meyers, W.C., and Callery, M.P. Laparoscopic surgery and the systemic immune response, Ann.Surg., 1998 227(3):326-334.

137. Wang, J.K. and Hsieh, K.H. Immunologic study of the asplenia syndrome, Pediatr.Infect.Dis.J, 1991 10(11):819-822.

138. Weighardt, H., Heidecke, C.D., Emmanuilidis, K., Maier, S., Bartels, H., Siewert, J.R., and Holzmann, B. Sepsis after major visceral surgery is associated with sustained and interferon-gamma-resistant defects of monocyte cytokine production, Surgery, 2000 127(3):309-315.

139. Westermann, J., Schwinzer, R., Jecker, P., and Pabst, R. Lymphocyte subsets in the blood. The influence of splenectomy, splenic autotransplantation, ageing, and the site of blood sampling on the number of B, T, CD4+, and CD8+ lymphocytes in the rat, Scand.J Immunol., 1990 31(3):327-334.

140. William, B.M. and Corazza, G.R. Hyposplenism: a comprehensive review. Part I: basic concepts and causes, Hematology., 2007 12(1):1-13.

141. William, E.P. Fundamental Immunology, Lippincott Williams Philadelphia 2008.

142. Wortel, C.H., van Deventer, S.J., Aarden, L.A., Lygidakis, N.J., Buller, H.R., Hoek, F.J., Horikx, J., and ten Cate, J.W. Interleukin-6 mediates host defense responses induced by abdominal surgery, Surgery, 1993 114(3):564-570.

143. Wright, S.D., Ramos, R.A., Tobias, P.S., Ulevitch, R.J., and Mathison, J.C. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein, Science, 1990 249(4975):1431-1433.

144. Xiao, C., Calado, D.P., Galler, G., Thai, T.H., Patterson, H.C., Wang, J., Rajewsky, N., Bender, T.P., and Rajewsky, K. MiR-150 controls B cell differentiation by targeting the transcription factor c-Myb, Cell, 2007 131(1):146-159.

145. Yamamoto, M., Sato, S., Hemmi, H., Sanjo, H., Uematsu, S., Kaisho, T., Hoshino, K., Takeuchi, O., Kobayashi, M., Fujita, T., Takeda, K., and Akira, S. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4, Nature, 2002 420(6913):324-329.

Reference List

1. The Cytokine Handbook, Elsevier Science San Diego 2003.

2. Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology, Elsevier Saunders Philadelphia 2012.

3. Adachi, O., Kawai, T., Takeda, K., Matsumoto, M., Tsutsui, H., Sakagami, M., Nakanishi, K., and Akira, S. Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-mediated function, Immunity., 1998 9(1):143-150.

4. Aderem, A. and Ulevitch, R.J. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response, Nature, 2000 406(6797):782-787.

5. Akira, S. TLR Signaling, Springer-Verlag Berlin 2006.

6. Akira, S. Innate immunity to pathogens: diversity in receptors for microbial recognition, Immunol.Rev., 2009 227(1):5-8.

7. Akira, S. and Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family, Immunol.Lett., 2003 85(2):85-95.

8. Altamura, M., Caradonna, L., Amati, L., Pellegrino, N.M., Urgesi, G., and Miniello, S. Splenectomy and sepsis: the role of the spleen in the immune-mediated bacterial clearance, Immunopharmacol.Immunotoxicol., 2001 23(2):153-161.

9. Angelescu, N. Tratat de patologie chirurgicala, Editura Medicala 2007.

10. Bagby, G Jr and Heinrich, M. in Growth Factors, Cytokines and the Control of Hematopoiesis, Hoffman, R. Churchill Livingstone, Philadelphia 2000.

11. Baigrie, R.J., Lamont, P.M., Kwiatkowski, D., Dallman, M.J., and Morris, P.J. Systemic cytokine response after major surgery, Br.J.Surg., 1992 79(8):757-760.

12. Baltimore, D., Boldin, M.P., O'Connell, R.M., Rao, D.S., and Taganov, K.D. MicroRNAs: new regulators of immune cell development and function, Nat.Immunol., 2008 9(8):839-845.

13. Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y.J., Pulendran, B., and Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells, Annu.Rev.Immunol., 2000 18(767-811.

14. Beeson, P.B. TOLERANCE TO BACTERIAL PYROGENS : I. FACTORS INFLUENCING ITS DEVELOPMENT, J Exp.Med., 1947 86(1):29-38.

15. Berger, D., Boelke, E., Seidelmann, M., Vasilescu, C., and Beger, H.G. Endotoxin-induced cytokine release from whole blood – similarities between monocyte dysfunction in septic disease and during post-operative acute phase response, J Endotox Res, 1997 4(1):17-24.

16. Berger, D., Boelke, E., Stanescu, A., Buttenschoen, K., Vasilescu, C., Seidelmann, M., and Beger, H.G. Endotoxemia and mediator release during colonoscopy, Endoscopy, 1995 27(9):671-675.

17. Beutler, B. SHIP, TGF-beta, and endotoxin tolerance, Immunity., 2004 21(2):134-135.

18. Bhatia, M., He, M., Zhang, H., and Moochhala, S. Sepsis as a model of SIRS, Front Biosci.(Landmark.Ed), 2009 14(4703-4711.

19. Biswas, S.K. and Lopez-Collazo, E. Endotoxin tolerance: new mechanisms, molecules and clinical significance, Trends Immunol., 2009 30(10):475-487.

20. Bone, R.C., Balk, R.A., Cerra, F.B., Dellinger, R.P., Fein, A.M., Knaus, W.A., Schein, R.M., and Sibbald, W.J. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. 1992, Chest, 2009 136(5 Suppl):e28-

21. Bratosin, D., Mazurier, J., Tissier, J.P., Estaquier, J., Huart, J.J., Ameisen, J.C., Aminoff, D., and Montreuil, J. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review, Biochimie, 1998 80(2):173-195.

22. Brendolan, A., Rosado, M.M., Carsetti, R., Selleri, L., and Dear, T.N. Development and function of the mammalian spleen, Bioessays, 2007 29(2):166-177.

23. Brint, E. and Luke, A.J. Toll-like receptors in inflammation, Springer Basel 2005.

24. Bruunsgaard, H., Pedersen, A.N., Schroll, M., Skinhoj, P., and Pedersen, B.K. Impaired production of proinflammatory cytokines in response to lipopolysaccharide (LPS) stimulation in elderly humans, Clin.Exp.Immunol., 1999 118(2):235-241.

25. Burns, K., Clatworthy, J., Martin, L., Martinon, F., Plumpton, C., Maschera, B., Lewis, A., Ray, K., Tschopp, J., and Volpe, F. Tollip, a new component of the IL-1RI pathway, links IRAK to the IL-1 receptor, Nat.Cell Biol., 2000 2(6):346-351.

26. Buttenschoen, K., Buttenschoen, D.C., Berger, D., Vasilescu, C., Schafheutle, S., Goeltenboth, B., Seidelmann, M., and Beger, H.G. Endotoxemia and acute-phase proteins in major abdominal surgery, Am.J.Surg., 2001 181(1):36-43.

27. Buttenschoen, K., Kornmann, M., Berger, D., Leder, G., Beger, H.G., and Vasilescu, C. Endotoxemia and endotoxin tolerance in patients with ARDS, Langenbecks Arch.Surg., 2008 393(4):473-478.

28. Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W., Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., and . Circulating interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin fever, J Infect.Dis., 1990a 161(1):79-84.

29. Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W., Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., and . Circulating interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin fever, J Infect.Dis., 1990b 161(1):79-84.

30. Chadburn, A. The spleen: anatomy and anatomical function, Semin.Hematol., 2000 37(1 Suppl 1):13-21.

31. Cohen, J. Sepsis and septic shock: inching forwards, Clin.Med., 2009 9(3):256-257.

32. Cortes, J.E., Talpaz, M., Cabanillas, F., Seymour, J.F., and Kurzrock, R. Serum levels of interleukin-10 in patients with diffuse large cell lymphoma: lack of correlation with prognosis, Blood, 1995 85(9):2516-2520.

33. Cortez, M.A. and Calin, G.A. MicroRNA identification in plasma and serum: a new tool to diagnose and monitor diseases, Expert.Opin.Biol.Ther., 2009 9(6):703-711.

34. Crandall, M., Shapiro, M.B., and West, M.A. Does splenectomy protect against immune-mediated complications in blunt trauma patients?, Mol.Med., 2009 15(7-8):263-267.

35. Croce, C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer, Nat.Rev.Genet., 2009 10(10):704-714.

36. de Porto, A.P., Lammers, A.J., Bennink, R.J., ten Berge, I.J., Speelman, P., and Hoekstra, J.B. Assessment of splenic function, Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis., 2010 29(12):1465-1473.

37. Didierlaurent, A., Brissoni, B., Velin, D., Aebi, N., Tardivel, A., Kaslin, E., Sirard, J.C., Angelov, G., Tschopp, J., and Burns, K. Tollip regulates proinflammatory responses to interleukin-1 and lipopolysaccharide, Mol.Cell Biol., 2006 26(3):735-742.

38. Dinarello, C.A. Proinflammatory cytokines, Chest, 2000 118(2):503-508.

39. Downey, E.C., Shackford, S.R., Fridlund, P.H., and Ninnemann, J.L. Long-term depressed immune function in patients splenectomized for trauma, J Trauma, 1987 27(6):661-663.

40. Du, T. and Zamore, P.D. Beginning to understand microRNA function, Cell Res., 2007 17(8):661-663.

41. Ertel, W., Kremer, J.P., Kenney, J., Steckholzer, U., Jarrar, D., Trentz, O., and Schildberg, F.W. Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic patients, Blood, 1995 85(5):1341-1347.

42. Fitzgerald, K., Gearing, A., and Callard, R. The Cytokine Factsbook, 2013.

43. Fredriksson, K., Tjader, I., Keller, P., Petrovic, N., Ahlman, B., Scheele, C., Wernerman, J., Timmons, J.A., and Rooyackers, O. Dysregulation of mitochondrial dynamics and the muscle transcriptome in ICU patients suffering from sepsis induced multiple organ failure, PLoS.One., 2008 3(11):e3686-

44. Funk, D.J., Parrillo, J.E., and Kumar, A. Sepsis and septic shock: a history, Crit Care Clin., 2009 25(1):83-101, viii.

45. Gabay, C. and Kushner, I. Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation, N.Engl.J Med., 1999 340(6):448-454.

46. Gaman, A. and Gaman, G. Citokinele, rol in hematopoieza, Medicina Moderna, 2001 8(9):486-491.

47. Giza, D.E. and Vasilescu, C. [MicroRNA's role in sepsis and endotoxin tolerance. More players on the stage], Chirurgia.(Bucur.), 2010 105(5):625-630.

48. Gruys, E., Toussaint, M.J., Niewold, T.A., and Koopmans, S.J. Acute phase reaction and acute phase proteins, J.Zhejiang.Univ Sci.B, 2005 6(11):1045-1056.

49. Hazlewood, M.A., Kumararatne, D.S., Webster, A.D., Goodall, M., Bird, P., and Daha, M. An association between homozygous C3 deficiency and low levels of anti-pneumococcal capsular polysaccharide antibodies, Clin.Exp.Immunol., 1992 87(3):404-409.

50. Hebert, J.C., O'Reilly, M., Yuenger, K., Shatney, L., Yoder, D.W., and Barry, B. Augmentation of alveolar macrophage phagocytic activity by granulocyte colony stimulating factor and interleukin-1: influence of splenectomy, J.Trauma, 1994 37(6):909-912.

51. Hery, G., Becmeur, F., Mefat, L., Kalfa, D., Lutz, P., Lutz, L., Guys, J.M., and de, L.P. Laparoscopic partial splenectomy: indications and results of a multicenter retrospective study, Surg.Endosc., 2008 22(1):45-49.

52. Hewitt, P.M., Ip, S.M., Kwok, S.P., Somers, S.S., Li, K., Leung, K.L., Lau, W.Y., and Li, A.K. Laparoscopic-assisted vs. open surgery for colorectal cancer: comparative study of immune effects, Dis.Colon Rectum, 1998 41(7):901-909.

53. Horng, T., Barton, G.M., Flavell, R.A., and Medzhitov, R. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors, Nature, 2002 420(6913):329-333.

54. Horng, T., Barton, G.M., and Medzhitov, R. TIRAP: an adapter molecule in the Toll signaling pathway, Nat.Immunol., 2001 2(9):835-841.

55. Hotchkiss, R.S. and Karl, I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis, N.Engl.J Med., 2003 348(2):138-150.

56. Hotchkiss, R.S. and Nicholson, D.W. Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in sepsis, Nat.Rev.Immunol., 2006 6(11):813-822.

57. Hotchkiss, R.S., Tinsley, K.W., Swanson, P.E., Grayson, M.H., Osborne, D.F., Wagner, T.H., Cobb, J.P., Coopersmith, C., and Karl, I.E. Depletion of dendritic cells, but not macrophages, in patients with sepsis, J.Immunol., 2002 168(5):2493-2500.

58. Hotchkiss, R.S., Tinsley, K.W., Swanson, P.E., Schmieg, R.E., Jr., Hui, J.J., Chang, K.C., Osborne, D.F., Freeman, B.D., Cobb, J.P., Buchman, T.G., and Karl, I.E. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T lymphocytes in humans, J Immunol., 2001 166(11):6952-6963.

59. Hutchins, R.R., Gunning, M.P., Lucas, D.N., Allen-Mersh, T.G., and Soni, N.C. Relaparotomy for suspected intraperitoneal sepsis after abdominal surgery, World J Surg., 2004 28(2):137-141.

60. Ilkins, B.S. and Right, D.H. Ilustrated Pathology of the Spleen, Cambridge University Press New York 2003.

61. Janeway, C.A., Jr. and Medzhitov, R. Innate immune recognition, Annu.Rev.Immunol., 2002 20(197-216.

62. Jirillo, E., Mastronardi, M.L., Altamura, M., Munno, I., Miniello, S., Urgesi, G., and Amati, L. The immunocompromised host: immune alterations in splenectomized patients and clinical implications, Curr.Pharm.Des, 2003 9(24):1918-1923.

63. Kawai, T., Adachi, O., Ogawa, T., Takeda, K., and Akira, S. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin, Immunity., 1999 11(1):115-122.

64. Kawai, T. and Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors, Nat.Immunol., 2010 11(5):373-384.

65. Kehlet, H. The surgical stress response: should it be prevented?, Can.J.Surg., 1991 34(6):565-567.

66. Knirel, A.Y. and Valvano, A.M. Bacterial Lipopolysacchararides – Structure, Chemical Synthetis, Biogenesis and Interactions with Host Cells, Springer New York 2011.

67. Kreuzfelder, E., Obertacke, U., Erhard, J., Funk, R., Steinen, R., Scheiermann, N., Thraenhart, O., Eigler, F.W., and Schmit-Neuerburg, K.P. Alterations of the immune system following splenectomy in childhood, J Trauma, 1991 31(3):358-364.

68. Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S. Toll-like receptors and innate immunity, Biochem.Biophys.Res.Commun., 2009 388(4):621-625.

69. Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system, Int.Rev.Immunol., 2011 30(1):16-34.

70. Lambris, J.D. Current Topics in Innate Immunity, Springer Philadelphia 2007.

71. Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14, Cell, 1993 75(5):843-854.

72. Levy, M.M., Fink, M.P., Marshall, J.C., Abraham, E., Angus, D., Cook, D., Cohen, J., Opal, S.M., Vincent, J.L., and Ramsay, G. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference, Intensive Care Med., 2003 29(4):530-538.

73. Lewis, B.P., Burge, C.B., and Bartel, D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets, Cell, 2005 120(1):15-20.

74. Libert, C. Inflammation: A nervous connection, Nature, 2003 421(6921):328-329.

75. Lichtenstern, C., Schmidt, J., Knaebel, H.P., Martin, E., Buchler, M.W., and Weigand, M.A. Postoperative bacterial/fungal infections: a challenging problem in critically ill patients after abdominal surgery, Dig.Surg., 2007 24(1):1-11.

76. Lothar, T in Inflammation, Lothar Thomas, Frankfurt /Main 1998.

77. Lu, L.F. and Liston, A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system, Immunology, 2009 127(3):291-298.

78. Maes, M., Stevens, W., Scharpe, S., Bosmans, E., De, M.F., D'Hondt, P., Peeters, D., Thompson, P., Cosyns, P., De, C.L., and . Seasonal variation in peripheral blood leukocyte subsets and in serum interleukin-6, and soluble interleukin-2 and -6 receptor concentrations in normal volunteers, Experientia, 1994 50(9):821-829.

79. Mebius, R.E. and Kraal, G. Structure and function of the spleen, Nat.Rev.Immunol., 2005 5(8):606-616.

80. Medvedev, A.E., Flo, T., Ingalls, R.R., Golenbock, D.T., Teti, G., Vogel, S.N., and Espevik, T. Involvement of CD14 and complement receptors CR3 and CR4 in nuclear factor-kappaB activation and TNF production induced by lipopolysaccharide and group B streptococcal cell walls, J.Immunol., 1998 160(9):4535-4542.

81. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity, Nat.Rev.Immunol., 2001 1(2):135-145.

82. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response, Nature, 2007 449(7164):819-826.

83. Medzhitov, R., Preston-Hurlburt, P., and Janeway, C.A., Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity, Nature, 1997 388(6640):394-397.

84. Minne, L., Abu-Hanna, A., and de, J.E. Evaluation of SOFA-based models for predicting mortality in the ICU: A systematic review, Crit Care, 2008 12(6):R161-

85. Miyake, K., Shimazu, R., Kondo, J., Niki, T., Akashi, S., Ogata, H., Yamashita, Y., Miura, Y., and Kimoto, M. Mouse MD-1, a molecule that is physically associated with RP105 and positively regulates its expression, J Immunol., 1998 161(3):1348-1353.

86. Moeniralam, H.S., Bemelman, W.A., Endert, E., Koopmans, R., Sauerwein, H.P., and Romijn, J.A. The decrease in nonsplenic interleukin-6 (IL-6) production after splenectomy indicates the existence of a positive feedback loop of IL-6 production during endotoxemia in dogs, Infect.Immun., 1997 65(6):2299-2305.

87. Moshtaghi-Kashanian, G.R., Gholamhoseinian, A., Hoseinimoghadam, A., and Rajabalian, S. Splenectomy changes the pattern of cytokine production in beta-thalassemic patients, Cytokine, 2006 35(5-6):253-257.

88. Munoz, C., Carlet, J., Fitting, C., Misset, B., Bleriot, J.P., and Cavaillon, J.M. Dysregulation of in vitro cytokine production by monocytes during sepsis, J Clin.Invest, 1991 88(5):1747-1754.

89. Murphy, K., Travers, P., and Walport, M. Janeways Immunology, Garland Science 2008.

90. Nahid, M.A., Pauley, K.M., Satoh, M., and Chan, E.K. miR-146a is critical for endotoxin-induced tolerance: IMPLICATION IN INNATE IMMUNITY, J.Biol.Chem., 2009 284(50):34590-34599.

91. Nakae, H., Shimazu, T., Miyauchi, H., Morozumi, J., Ohta, S., Yamaguchi, Y., Kishikawa, M., Ueyama, M., Kitano, M., Ikeuchi, H., Yukioka, T., and Sugimoto, H. Does splenic preservation treatment (embolization, splenorrhaphy, and partial splenectomy) improve immunologic function and long-term prognosis after splenic injury?, J Trauma, 2009 67(3):557-563.

92. Netea, M.G., van, D.M., Kullberg, B.J., Cavaillon, J.M., and van der Meer, J.W. Does the shape of lipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors?, Trends Immunol., 2002 23(3):135-139.

93. Nomura, N., Miyajima, N., Sazuka, T., Tanaka, A., Kawarabayasi, Y., Sato, S., Nagase, T., Seki, N., Ishikawa, K., and Tabata, S. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1, DNA Res, 1994 1(1):27-35.

94. O'Connell, R.M., Taganov, K.D., Boldin, M.P., Cheng, G., and Baltimore, D. MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2007 104(5):1604-1609.

95. Okabayashi, T. and Hanazaki, K. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults – a clinically preventable disease, World J.Gastroenterol., 2008 14(2):176-179.

96. Passlick, B., Izbicki, J.R., Waydhas, C., Nast-Kolb, D., Schweiberer, L., and Ziegler-Heitbrock, H.W. Posttraumatic splenectomy does not influence human peripheral blood mononuclear cell subsets, J Clin.Lab Immunol., 1991 34(4):157-161.

97. Pauley, K.M. and Chan, E.K. MicroRNAs and their emerging roles in immunology, Ann.N.Y.Acad.Sci., 2008 1143(226-239.

98. Popovici, A. Splenectomia – indicatii medico-chirurgicale, Editura Militara 1995.

99. Pratl, B., Benesch, M., Lackner, H., Portugaller, H.R., Pusswald, B., Sovinz, P., Schwinger, W., Moser, A., and Urban, C. Partial splenic embolization in children with hereditary spherocytosis, Eur.J Haematol., 2008 80(1):76-80.

100. Raetz, C.R. and Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins, Annu.Rev.Biochem., 2002 71(635-700.

101. Rakoff-Nahoum, S. and Medzhitov, R. Toll-like receptors and cancer, Nat.Rev.Cancer, 2009 9(1):57-63.

102. Remick, D.G. Cytokine therapeutics for the treatment of sepsis: why has nothing worked?, Curr.Pharm.Des, 2003 9(1):75-82.

103. Rich, T. Toll and Toll-like receptors: An Immunologic Perspective, Springer New York 2005.

104. Riches, P., Gooding, R., Millar, B.C., and Rowbottom, A.W. Influence of collection and separation of blood samples on plasma IL-1, IL-6 and TNF-alpha concentrations, J Immunol.Methods, 1992 153(1-2):125-131.

105. Rigato, O. and Salomao, R. Impaired production of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha but not of interleukin 10 in whole blood of patients with sepsis, Shock, 2003 19(2):113-116.

106. Rodrick, M.L., Moss, N.M., Grbic, J.T., Revhaug, A., O'Dwyer, S.T., Michie, H.R., Gough, D.B., Dubravec, D., Manson, J.M., Saporoschetz, I.B., and . Effects of in vivo endotoxin infusions on in vitro cellular immune responses in humans, J Clin.Immunol., 1992 12(6):440-450.

107. Schmidt, W.M., Spiel, A.O., Jilma, B., Wolzt, M., and Muller, M. In vivo profile of the human leukocyte microRNA response to endotoxemia, Biochem.Biophys.Res Commun., 2009 380(3):437-441.

108. Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., and Rajewsky, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs, Nature, 2008 455(7209):58-63.

109. Sheedy, F.J. and O'Neill, L.A. Adding fuel to fire: microRNAs as a new class of mediators of inflammation, Ann.Rheum.Dis., 2008 67 Suppl 3(iii50-iii55.

110. Shimazu, R., Akashi, S., Ogata, H., Nagai, Y., Fukudome, K., Miyake, K., and Kimoto, M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4, J Exp.Med., 1999 189(11):1777-1782.

111. Sibbald, W.J., Marshall, J., Christou, N., Girotti, M., McCormack, D., Rostein, O., Martin, C., and Meakins, J. "Sepsis"–clarity of existing terminology … or more confusion?, Crit Care Med., 1991 19(8):996-998.

112. Sieling, P.A. and Modlin, R.L. Toll-like receptors: mammalian "taste receptors" for a smorgasbord of microbial invaders, Curr.Opin.Microbiol., 2002 5(1):70-75.

113. Sinistro, A., Almerighi, C., Ciaprini, C., Natoli, S., Sussarello, E., Di, F.S., Calo-Carducci, F., Rocchi, G., and Bergamini, A. Downregulation of CD40 ligand response in monocytes from sepsis patients, Clin.Vaccine Immunol., 2008 15(12):1851-1858.

114. Steinman, R M and Hemmi, H. in Dendritic Cells: Translating Innate to Adaptative Immunity, The Rockefeller University, New York 2009.

115. Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., and Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2006 103(33):12481-12486.

116. Takeuchi, O. and Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation, Cell, 2010 140(6):805-820.

117. Takeuchi, O., Takeda, K., Hoshino, K., Adachi, O., Ogawa, T., and Akira, S. Cellular responses to bacterial cell wall components are mediated through MyD88-dependent signaling cascades, Int.Immunol., 2000 12(1):113-117.

118. Tarlinton, D. Germinal centers: form and function, Curr.Opin.Immunol., 1998 10(3):245-251.

119. Tchernia, G., Bader-Meunier, B., Berterottiere, P., Eber, S., Dommergues, J.P., and Gauthier, F. Effectiveness of partial splenectomy in hereditary spherocytosis, Curr.Opin.Hematol., 1997 4(2):136-141.

120. Terashima, T., English, D., Hogg, J.C., and van Eeden, S.F. Release of polymorphonuclear leukocytes from the bone marrow by interleukin-8, Blood, 1998 92(3):1062-1069.

121. Thavasu, P.W., Longhurst, S., Joel, S.P., Slevin, M.L., and Balkwill, F.R. Measuring cytokine levels in blood. Importance of anticoagulants, processing, and storage conditions, J Immunol.Methods, 1992 153(1-2):115-124.

122. Tili, E., Michaille, J.J., Cimino, A., Costinean, S., Dumitru, C.D., Adair, B., Fabbri, M., Alder, H., Liu, C.G., Calin, G.A., and Croce, C.M. Modulation of miR-155 and miR-125b levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock, J.Immunol., 2007 179(8):5082-5089.

123. Timens, W. The human spleen and the immune system: not just another lymphoid organ, Res.Immunol., 1991 142(4):316-320.

124. Tiron, A. and Vasilescu, C. [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2008 103(3):255-263.

125. van den Dobbelsteen, G.P., Brunekreef, K., Kroes, H., van, R.N., and van Rees, E.P. Enhanced triggering of mucosal immune responses by reducing splenic phagocytic functions, Eur.J.Immunol., 1993 23(7):1488-1493.

126. van Dissel, J.T., van, L.P., Westendorp, R.G., Kwappenberg, K., and Frolich, M. Anti-inflammatory cytokine profile and mortality in febrile patients, Lancet, 1998 351(9107):950-953.

127. van Eeden, S.F. and Terashima, T. Interleukin 8 (IL-8) and the release of leukocytes from the bone marrow, Leuk.Lymphoma, 2000 37(3-4):259-271.

128. Vasilescu, C. [Laparoscopic splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2005 100(6):595-598.

129. Vasilescu, C., Berger, D., Buttenschon, K., Seidelmann, M., and Beger, H.G. Endotoxin-induced release of interleukin 6 and interleukin 1 beta in human blood is independent of tumor necrosis factor alpha, Eur.Surg.Res., 1996 28(1):55-62.

130. Vasilescu, C., Herlea, V., Buttenschoen, K., and Beger, H.G. Endotoxin translocation in two models of experimental acute pancreatitis, J.Cell Mol.Med., 2003a 7(4):417-424.

131. Vasilescu, C., Olteanu, M., and Flondor, P. How relevant are in vivo and in vitro studies for clinical sepsis? A mathematical model of LPS signaling based on endotoxin tolerance, Chirurgia.(Bucur.), 2009a 104(2):195-201.

132. Vasilescu, C., Rossi, S., Shimizu, M., Tudor, S., Veronese, A., Ferracin, M., Nicoloso, M.S., Barbarotto, E., Popa, M., Stanciulea, O., Fernandez, M.H., Tulbure, D., Bueso-Ramos, C.E., Negrini, M., and Calin, G.A. MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis, PLoS.One., 2009b 4(10):e7405-

133. Vasilescu, C., Stanciulea, O., Colita, A., Stoia, R., Moicean, A., and Arion, C. [Laparoscopic subtotal splenectomy in the treatment of hereditary spherocytosis], Chirurgia.(Bucur.), 2003b 98(6):571-576.

134. Vasilescu, C., Stanciulea, O., Tudor, S., Stanescu, D., Colita, A., Stoia, R., Coriu, D., Colita, A., and Arion, C. Laparoscopic subtotal splenectomy in hereditary spherocytosis : to preserve the upper or the lower pole of the spleen?, Surg.Endosc., 2006 20(5):748-752.

135. Vasilescu, C., Tomulescu, V., Ciurea, S., and Popescu, I. [Laparoscopic splenectomy–lessons learned from a series of 40 cases. The advantages of the postero-lateral approach], Chirurgia.(Bucur.), 2001 96(2):231-236.

136. Vittimberga, F.J., Jr., Foley, D.P., Meyers, W.C., and Callery, M.P. Laparoscopic surgery and the systemic immune response, Ann.Surg., 1998 227(3):326-334.

137. Wang, J.K. and Hsieh, K.H. Immunologic study of the asplenia syndrome, Pediatr.Infect.Dis.J, 1991 10(11):819-822.

138. Weighardt, H., Heidecke, C.D., Emmanuilidis, K., Maier, S., Bartels, H., Siewert, J.R., and Holzmann, B. Sepsis after major visceral surgery is associated with sustained and interferon-gamma-resistant defects of monocyte cytokine production, Surgery, 2000 127(3):309-315.

139. Westermann, J., Schwinzer, R., Jecker, P., and Pabst, R. Lymphocyte subsets in the blood. The influence of splenectomy, splenic autotransplantation, ageing, and the site of blood sampling on the number of B, T, CD4+, and CD8+ lymphocytes in the rat, Scand.J Immunol., 1990 31(3):327-334.

140. William, B.M. and Corazza, G.R. Hyposplenism: a comprehensive review. Part I: basic concepts and causes, Hematology., 2007 12(1):1-13.

141. William, E.P. Fundamental Immunology, Lippincott Williams Philadelphia 2008.

142. Wortel, C.H., van Deventer, S.J., Aarden, L.A., Lygidakis, N.J., Buller, H.R., Hoek, F.J., Horikx, J., and ten Cate, J.W. Interleukin-6 mediates host defense responses induced by abdominal surgery, Surgery, 1993 114(3):564-570.

143. Wright, S.D., Ramos, R.A., Tobias, P.S., Ulevitch, R.J., and Mathison, J.C. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein, Science, 1990 249(4975):1431-1433.

144. Xiao, C., Calado, D.P., Galler, G., Thai, T.H., Patterson, H.C., Wang, J., Rajewsky, N., Bender, T.P., and Rajewsky, K. MiR-150 controls B cell differentiation by targeting the transcription factor c-Myb, Cell, 2007 131(1):146-159.

145. Yamamoto, M., Sato, S., Hemmi, H., Sanjo, H., Uematsu, S., Kaisho, T., Hoshino, K., Takeuchi, O., Kobayashi, M., Fujita, T., Takeda, K., and Akira, S. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4, Nature, 2002 420(6913):324-329.