Militaru Toleranta Halofite Teoretic 03.05.2018 [628730]

UNIVERSITATEA „BABEȘ -BOLYAI” CLUJ -NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biochimie

LUCRARE DE LICENȚĂ

Conducător științific: Absolvent: [anonimizat], 2018

2
UNIVERSITATEA „BABEȘ -BOLYAI” CLUJ -NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biochimie

Investigarea exprimării unor gene
implicate în conferirea toleranței la
sare la specii halofite

Conducător științific: Absolvent: [anonimizat], 2018

3
Cuprins
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 4
Capitolul 1. Salinitatea solului ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 4
Capitolul 2. Mecanisme de toleranță ale plantelor la solurile sărate ………………………….. ………………….. 7
2.1. Plante halofite ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 7
2.2. Mecanisme de toleranță ale plantelor la solurile sărate ………………………….. …………………….. 8
2.2.1. Adaptări anatomice la salinitate ………………………….. ………………………….. …………………… 8
2.2.2 Adaptări moleculare la salinitate: antioxidanți și specii reactive de oxigen + pg 8
WaniSH ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 9
2.2.3. Acumularea de substanțe osmoprotectoare ………………………….. ………………………….. …. 12
2.2.4. Mecanisme hormonale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 12
2.2.5. Mecanisme de transport ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 13
Capitolul 3. Investigarea exprimării unor gene implicate în conferirea toleranței la sare la specii
halofite ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 19
3.1. Argument și obiective ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 19
3.2. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 19
3.2.1. Materialul vegetal ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 19
3.2.2. Extracția ARN ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 20
3.2.3. Revers -transcrierea ARN ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 21
3.2.4. Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) ………………………….. ……………………. 21
3.3. Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 21
3.3.1. Rezultatele extracției de ARN ………………………….. ………………………….. …………………….. 21
3.3.2. Rezultatele reverstranscrierii de ARN ………………………….. ………………………….. …………. 22
3.3.3. Rezultatele qPCR ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 22
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 23
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 24

4

Introducere
Problematica uaygfy7egfiugdifugsdugausdbfu hdsliubflksbflkjsbdflkfjd bgsjbjbvjbdfkjv
bdfjkbvkjdfb
vkhjdfbvjkdfbvjbfdfjhvbdjhfbvkjdhbvjfdbjvhbdjvfbjhdbfvjhbdjvkbdjkvbjkfdbvjdbvjdbhbvsdkjbvxcvjxio
vjodivoidsofiviohdfpguhepigheirhgiuerhiugheriuohgiuerhiguheihgiehgieurhgieuhriugheiuhrgiuheirghi
eohigeurhgiuehgiouehroiguhroihgiousdoiugoisbdgiouberoygeyrgbobog uesbroger8e9r8gheriohfoiuhi
uhgreiuhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhgdslfgueirhgiuerhiugheriuohgiuerhiguheihgiehgieurhgie
uhriugheiuhrgiuheirghieohigeurhgiuehgiouehroiguhroihgiousdoiugoisbdgiouberoygeyrgboboguesbro
ger8e9r8gheriohfoiuhiuhgreiuhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhgdslfgueirhgiuerhiugheriuohgiuer
higuheihgiehgieurhgieuhriugheiuhrgiuheirghieohigeurhgiuehgiouehroiguhroihgiousdoiugoisbdgioube
roygeyrgboboguesbroger8e9r8gheriohfoiuhiuhgreiuhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhgdslfgu
Capitolul 1. Salinitatea solului

Salinitatea este o caracteristică de bază a solurilor din zonele aride și semiaride . În
ultimele decenii, arealul solurilor saline s -a extins ca urmare a schimbărilor de temperatură și
a activităților antropice.
Procesul de salinizare , premergător procesul ui de deșertificare, a fost definit prin
creșterea sărurilor solubile pe profilul solului la o concentrație mai ridicată decât intervalul
obișnuit. Exemple de săruri determinante ale salinității solului sunt clor urile, sulfa ții și
carbon ații de magneziu (Mg) , calciu (Ca), potasiu (K) și sodiu (Na). Proveniența sărurilor este
multiplă, acestea fiind antrenate în orizonturile solului prin intermediul apei puse în mișcare în
mod natural (infiltrați a apei de subsol sau de mare , ploi , eroziunea substratului litologic ,
inundații ) sau în urma activității umane (irigații , reziduuri industriale, îndepăr tarea
rădăcinilor ).
Un fenomen tot mai des întâlnit este salinizarea solului urmată rapid de un proces de
sodificare și, implicit , alcalizare prin acumularea predominantă a ionilor de Na+. Prin urmare,
nivelul de sărăturare al unui sol este caracterizat atât prin procentul de salinizare, câ t și prin
procentul de alcali zare identificat e în orizonturile solului respectiv (Lupașcu și colab., 1998).
Pe lângă creșterea toxicității față de speciile slab tolerante, s tructura unui astfel de sol nu este
îndeajuns de aerată pentru infiltrarea apei, amplificând problema irigării culturilor.
Salinitate a solului es te de obicei determinată prin tehnici bazate pe principiul
conductanței electrice (EC) , în cazul determinărilor efectuate pe teren . Procesul implică
determinarea concentrație i sărurilor solubile din extractul apos al unui sol prin măsurarea
rezistivității electrice și a comportării electromagnetice . Conductanța este măsurată în dS/m

5
(deciSiemens/metru) , unde 1 dS/m = 667 TDI (Total Dissolved Ions) . În urma măsurătorilor,
au fost stabilite praguri de salinitate ale solului (Tabel 1).

Tabel 1. Clasificare pr aguri de salinitate .

Clasa salinității dS/m-1
(Hardie și
Doyle, 2012 ) TDI
(mg/L) g/L mM pentru NaCl
(Muns și Tester,
2008 )
nesalin 0 – 2 0 – 1334 0 – 1.334 0 – 20
scăzută 2 – 4 1334 – 2668 1.334 – 2.668 20 – 40
moderată 4 – 8 2668 – 5336 2.668 – 5.336 40 – 80
ridicată 8 – 16 5336 – 10672 5.336 – 10.672 80 – 160
severă 16 – 32 10672 – 21344 10.672 – 21.344 160 – 320
extremă >32 >21344 >21.344 >320

În agricultură , utilizarea unei surse de apă pentru irigare cu o concentrație salină mai
mare de 2 g/L presupune un risc crescut pentru culturile glicofitice și arhitectura solului.
Conform Bazei Mondiale de Referințe pentru Resursele Solului (World Reference
Base for Soil Resources), solurile descrise anterior sunt de tip soloncec (SC) și soloneț (SN) ,
încadrate în categoria solurilor ce limitează dezvoltarea rădăcinilor (IUSS Working Group
WRB, 2015) .
Institutul Apei, Mediului și Sănătății din cadrul Universității Națiunilor Unite (UNU
Institute for Water, Environment and Health) și FAO au raportat pierderea în ultimele decenii
a peste 20% din suprafața globală destina tă agriculturii , iar în raportul tehnic realizat de JRC
(Joint Research Centre) al Comisiei Europene s-au estimat 18,3 milioane ha de soluri
europene degradate de săruri, inclusi v din România (JRC -ESDAC, 2016) (Fig. 1) .

6

Figura 1. Salinizarea și sodificarea solurilor la nivel global, conform campaniei FAO Word Soil Day 2016
(Organizația pentru Alimentație și Agricultură a Națiunilor Unite)
http://www.fao.org/global -soil-partnership/wsd2016/wsd2016/en/

Solurile saline conțin o cantitate de săruri îndeajuns d e mare astfel încât să producă
efecte negative asupra creșterii și dezvoltării speciilor de plante .
Procesele de salinizare, observate încă de către vechile civilizații, sunt naturale sau
antropice și constau în acumularea de săruri în concentrații ce reduc calitatea și fertilitatea
solurilor. În urma mișcărilor naturale sau antropice ale surselor de umiditate, apa acumulată la
nivelul so lului fie se evaporă, fie este absorbită și eliminată de vegetație prin transpirație,
sărurile acumulându -se la suprafața frunzelor și în sol, mai ales în lipsa ploilor și irigării
corespunzătoare. Acumularea în sol de elementele neesențiale este toxică pe ntru plantă, în
cazul solurilor de tip SC și SN fiind amplificată problema competitivității dintre
micronutrientul Na+ și absorbția nutrienților esențiali în dezvoltare . Cu excepția unor câteva
specii de plante C -4 (Brownwell and Crossland 1974) , deficien ța de Na+ nu prezintă semne
vizibile și nu împiedică desfășurarea normală a căilor metabolice . Prin urmare, plantele și -au
dezvoltat mecanisme de internalizare sau de excludere a unor astfel de nutrienți redundanți,
cele mai performante fiind la halofite. Problematica acestor ioni nu este doar redundanța, ci și
interferența lor în procesul de asimilare a unor elemente esențiale precum Ca2+ și K+, canalel e
și transportori i acestora fiind ocupați prin competiție de cationii de Na+. Prin urmare, primele

7
semne ale toxiinfecției cu sodiu sunt întrepătrunse cu cele ale carențelor de nutrienți. Spre
exemplu piticism și cloroza frunzelor bătrâne în cazul deficeinței de ioni mobili de K+ și
necroza marginilor foliare a frunzelor tinere pentru deficiența de Ca2+.
În prezent există tehnici agricole ce sunt sugerate și aplicate în încercarea de a menține
sub control nivelul sărurilor, dar viteza schimbărilor climatice și chiar practicile inadecvate
din domeniul agriculturii grăbesc procesul de salinizare și , implicit , de erodare a solurilor într –
un ritm care nu p oate fi contracarat. În cadrul procesului de îmbunătățire a sistemului agric ol
sunt propuse soluții ce implică utilizarea speciilor halofite. Aplicabilitatea acestora este
multiplă, dar cele mai impor tante sunt folosirea lor ca plante de cultură, plante pentru
fitoremediere sau plante model pentru dezvoltarea unor noi specii tolerante. Pentru ca aceste
soluții să fie viabile, este necesară înțelegerea imaginii de fundal a mecanismelor genetice ce
deter mină fenotipul adecvat toleranței la salinitatea crescută în mediul de creștere.

Capitolul 2. Mecanisme de toleranță ale plantelor la soluri le sărate
2.1. Plante halofite
Estimativ, Pământul prezintă un volum de 1 .386 miliarde km3 apă, din care 97, 5% este
apa salină a oceanelor, mărilor și a altor surse saline (lacuri sărate , apă subterană salină)
(Eakins și Sharman, 2010) . În ciuda abundenței apei marine, o mare parte a plantelor
terestre,în special cele folosite și în agricultură, prezintă o rezistență scăzută la salinitatea
crescută în mediu .
O definiție larg acceptată este aceea că halofitele sunt speciile de plante care reușesc să
parcurgă un ciclu complet de viață chiar la concentrații de 200 mM NaCl în sol (Flowers și
colab., 1986 ). Baza de date eHALOPH (Flowers, 2014) are în evidență mai mult de 1.500 de
halofite, incluzând specii slab tolerante la sare.
Spectrul de adaptare la salinitate este larg, iar împărțirea în categorii în funcție de acest
criteriu nu este făcut conform unui sistem unic. În lucrarea de față, informațiile și datele vor fi
raportate ținând cont de sistemul de clasificare al plantelor din România, propus de Grigore și
Toma (2010) , bazat pe observații de anatomie integrativă :
1. Extremh alofite – specii puternic adaptate mediilor saline. Sunt identificate două tipuri :
a. ireversibile – speciile sunt adaptate exclusiv mediului salin. adaptările
anatomice preponderente sunt prezența țesuturi lor suculente, necesare pentru
diluarea concen trațiilor crescute de săruri . Alte adaptări anatomice des întâlnite
sunt policambia și lignificare intensă a cambiului din rădăcini și tulpini Grigore
și Toma, 2010) .

8
b. reversibile – adaptări le la salinitate sunt mai puțin pronunțate , dar se pot încă
observa anumite grade de policambie și suculență , alături de prezența
perișorilor secretori . Sunt capabile de a se adapta transferului într -un sol mai
puțin salin (Grigore și Toma, 2010) .
2. Mezohalofite – halotolerante ce prezintă adaptări anatomice intermediare între
extremhalofite și glicofite. Se dezvoltă în diferite tipu ri de soluri. Adaptări anatomice
ce indică o rezistenț ă la salinitate sunt prezența aerenchimului, endoderm ului bine
dezvoltat, țesuturi lor suculente , stomate lor scufundate și celule lor buliforme . După
cum se observă, aceste adaptări sunt întâlnite și în alte tipuri de condiții ecologice
extreme (Grigore și Toma, 2010) .
3. Glicofite – specii cu o sensibil itate crescută la mediul salin, lipsite de adaptările și
mecanismele necesare supraviețuirii.
Plantele extremhalofite se dezvoltă în soluri cu o concentrație salină a extractului apos
de până la 10 g/L, iar mezohalofitele pot tolera concentrații de până la 5 g/L. În cazul
glicofitelor a fost calculată o limită de supraviețuire de 2, 5 g/L (Brouwer, Goffeau și
Heibloem, 1985) .

2.2. Mecanisme de toleranță ale plantelor la solurile sărate
Toleranța la salinitate este indusă în urma întrepătunderii unor mecanisme complexe
ce implică biosinteza moleculară, controlul enzimatic și transportul membranar. As tfel, putem
observa diferite moduri de contracarare a efectelor salinității, de la speciile care excretă
excesul de săruri prin glande specializate până la compartimentalizarea mineralelor în vacuole.
Salinitate nu este un factor de stres singular, fiind însoțită de deficit hidric și stres termic. Prin
urmare, adaptările la mediul salin prezintă caractere întâlnite și în cazul factorilor de stres
menționați anterior.

2.2.1. Adaptări anatomice la salinitate
Cele mai întâlnite și bine descrise adaptări anat omice la mediul salin sunt suculenț a,
poziția stomatelor, fenomenul de policambie, prezența formațiunilor secretoare de săruri ș i
structuri foliare modificate .
Suculența este un aspect anatomic ce constă în prezența țesuturilor vegetale abun dente
în apă ca urmare a atingerii și mențineri t urgescenței celulare maxime.
Poziția stomatelor este esențială în conservarea eficientă a apei. Astfel, celulele
stomatale vor fi prezente în stratul profund al epiteliilor atunci când în mediul de viață

9
umiditatea este redusă sau prezente substanțe în concentrații crescute care îngreunează
procesul de hidratare.
Policambia ete o altă adaptare cu rol in conservarea apei deja existentă în
țesuturi/sistemul vascular.
Formațiunile secretoare de săruri
Structuri foliare m odificate
Lignificarea este un alt răspuns proporțional cu severitatea factorilor de stres ce au
repercusiuni asupra peretelui celular . Procesul de ligni ficare este reglat hormonal, prin
intermediul acidului jasmonic (Denness și colab., review Sharma 83) .

2.2.2 Adaptări moleculare la salinitate: a ntioxidanț i și specii reactive de oxigen + pg 8
WaniSH
La nivel molecular, salinitatea activează multiple căi de răspuns, printre care
mecanism e de ajustare la stresul osmotic cu ajutorul aparatului enzimatic , inducând și
modulând procese protective precum lignifi carea și compartimentalizarea.
Salinitatea crescută în mediu determină creșterea osmolarității și diminuarea, chiar
pierderea, homeostaziei ionice din plantă. Drept urmare, în organismul afectat su nt pornite căi
de semnalizare ce vor activa răspunsuri protectoare : modificarea metabolismului și modularea
transportului de ioni. În cazul modificărilor metabolice crește sinteza și acumularea de
osmoliți compatibili și de antioxidanți neenzimatici, dar ș i supraproducția de ROS ce va
semnalizarea sinteza antioxidanților enzimatici . Modificarea transporturilor ionice, alături de
osmoliți și antioxidanți, va induce fie compartimentalizarea, fie excluderea și excreția ionilor
toxici (WaniSH, pg 82) .
În condiții de stres este activată transcrier ea unor seturi specifice de gene implicate în
controlul răspunsurilor la factori de stres. Aceste seturi sunt grupate în două clase mari, în
funcție de mecanismul implicat. Astfel, în prima clasă sunt grupate trei etape celulare
importante: cascadele de semnalizare, controlul transcrierii și degradarea produșilor de
transcriere (proteine). În cea de a doua clasă regăsim mecanis me de protecție membranară și
osmoprotecție, componentele „cheie” fiind substanțele antiox idante (metale chelatante,
reducători ioni, ROS -scavangers) (Pardo, 2010) .
Speciile reactive de oxigen (ROS ) sunt o categorie de radicali liberi derivați, după cum
sugerează denumirea, din metabolismul oxigenului molecular . Direct proporțională cu nivelul
de stres, concentrația ridicată de specii reactive de oxigen reprezintă o puternică influență
asupra integrității structurilor lipidice, proteinelor și acizilor nucleici . Rezultatul este de obicei
activarea prematură a proce sului de apoptoză (Mittler, 2002) .Situații precum expunerea

10
prelungită la radiații UV, radiații ionizante, căldură sau concentrația extreme de substanțe sunt
demonstrate a provoca stres oxidativ, o urmare a creșterii rapide a nivelurilor de specii
reactive eliberate ce vor afecta negativ structurile celulare.
Totuși, existența ROS în organisme este importantă, fiind componente ale mecan ismului de
protecție imună , în ciclul celular , homeostazie și în semnalizarea celulară („semn alizare
oxidativă”) , necesare în controlul creșterii polarizate (), dezvo ltării și adaptării la stimuli de
stres(Foyer & Notor, 2009) . Prin urmare, ROS sunt molecule, radicali și ioni cu o activitate
duală, prezente în toate celulele, nu numai în cele influențate de stresor , localizate la nivelul
cloroplastelor, mitocondriilor, peroxizomilor, reticulului endoplasmatic, pereților
celulari (Sharma, Jha, Dubey, & Pessarakli, 2012) .

Tabel 2. Exemple de specii reactive de oxigen (Sharma, Jha, Dubey, & Pessarakli, 2012)
Denumire Formulă Detalii ?
Superoxid O2•− -inițiază o cascadă de reacții ce generează ROS
„secundari”
-reactivitate moderată (Sharma, 2012)
Hidrogen peroxid H2O2 este transportat între diferite compartimente celulare
-reactivitate moderată(Sharma, 2012)
Radical hidroxil •OH +++++

Enzime antioxidante întâlnite în astfel de sisteme sunt superoxiddismutaza, ascorbat
peroxidaza, catalaza, glutation reductaza și glutation peroxidaza (Tabel 3) . Prin
supraexprimarea în linii mutante s -a observat că acest tip de enzime cresc toleranța
organismelor în mediile saline .

Tabel 3. Exemple de enzime antioxidante
Denumire + E.C. Localizare Rol Referințe
Superoxid
dismutaza
EC 1.15.1.1 -toate tipurile de
celule
-în cloroplaste,
mitocondrii, citosol -prima barieră împotriva stresului
oxidativ
-catalizează dismutarea O2•−la
H2O2 Ashraf 2009
Catalaza -ubicuitar -catalizează dismutarea H2O2 la
H2O și O 2
-nu are nevoie de donatori de
electroni
-este cel mai p uțin reactiv Foyer, 2009
Sharma,
2012
Ascorbat
peroxidaza +++++ -metabolizare H2O2(afinitate mai
crescută decât catalaza)
Glutation
peroxidaza +++++ -metabolizare H2O2 Foyer, 2009
Peroxiredoxina +++++ -reducere peroxizi Foyer, 2009
Monoxid de azot +++++ -interacționează cu H2O2

Sistem antioxidant neenzimatic
+++++ (Tabel 4)

11
+betacianină la S. salsa

Oxidul nitric sau monoxidul de azot este o moleculă liposolubilă. Îndeplinește diverse roluri,
printre care cea de specie reactivă de oxigen și cea de mediere prin semnalizare a
mecanismelor de creștere și dezvoltare.

Tabel 4. Exemple de alte substanțe antioxidante
Denumire Localizare Rol Referințe
Ascorbat -majoritatea
tipurilor celulare,
preponderent în
citoplasmă
-abundent în
țesuturi
fotosintetice -cel mai abundent
-protecție macromolecule
-regenerează α -tocof erol din rad.
tocoferoxil
-reacționează direct cu O2•−și H2O2 Sharma,
2012
Glutation -prezent în toate
compartimentele
celulare -reacționează direct cu O2•−, H2O2și •OH
-în creșterea și diviziunea cel.
-reglare enzimatică
-sint. proteine, ac. nucleici, fitochelatine
-regenerare ascorbat Sharma,
2012
Tocoferol
(vt. E) -doar în țesuturile
verzi -protecție lipide și alte componente
membranare (antioxidant lipofilic) Sharma,
2012
Carotenoizi +++++
-antioxidant lipofilic
-absorbție lumină 400 -550 nm și
transferă energia către clorofilă
-precursori moleculare de semnalizare Sharma,
2012
Compuși
fenolici +++++
-activitatea antioxidantă cea mai intensă
-chelatare ioni metalici
-reacție directă cu ROS
-inhibă peroxidarea lipidică
-scad fluiditatea membranară Sharma,
2012

12
2.2.3. Acumularea de substanțe osmoprotectoare
Efecte majore ale salinității ridicate sunt producerea dezechilibrelor ionice și instalarea
stresului hiperosmotic . S-a observat că prezența compușilor cu azot (arginină, prolină, amoniu,
glicinbetaină, poliamine ) toleranța la stresul osmotic a fost îmbunătățită, ca urmar e a
capacității compușilor de a acționa ca substanțe osmoprotectoare. Prin urmare, pre zența
compușilor pe bază de nitrogen în plante va facilita controlul osmotic, incapacitarea speciilor
reactive de oxigen și, implicit, stabilizarea structurii cuaternare a prot einelor (Munns și colab.,
2012; Rontein, 2002).
pg 7 WaniSH – 1.3.2 Osmotic Tolerance
tabel substanțe osmoprotectoare

+++++

2.2.4. Mecanisme hormonale
Speciile reactive de oxigen sunt necesare în cantități mici pentru dezvoltarea corectă a
organismelor. Un exemplu de rol pozitiv îndeplinit de ROS este acela de a activa sinteza unor
hormoni necesari unei plante pentru a răspunde la influențele din mediu (Sharma, 2012).
Controlul hormonal este intim implicat în semnalizarea și modularea mecanismelor de
răspuns la factorii de stres. Cei mai î ntâlniți și studiați hormoni sau substa nțe cu acțiune
hormonală la plante sunt auxine le, gibereline, citokinine le, etilena (singurul h. gazos la plante )
acidul abcisic (mesager chimic pentru a anunța creșterea deficitului hidric/deshidratarea ).
Mecanismul hormonal este implicat în semnalizarea și modularea proceselor de creștere și
dezvoltarea, dar și a celor de răspuns la factorii de stres. pg 395 WaniSH
Acid abscisic –> închidere stomate ; produs în organele în curs de deshidratare (inclusiv
semințe ; ac. abcisic semnalizează celulelor stomatale deficitul de apă, iar acestea răspund prin
eliberarea de ioni ce vor scoate apa din acestea, scăzând turgescența acestora /devenind flacide
pentru a acoperi orificiul stomatal ).
Auxină –> gravitropism radicula r. Rolul acestui hormon în rezistența la salinitate
Ac. giberelic (gibereline) –> germinare semințe, apoptoză
Ac. jasmonic –> biosinteză lignină
Ac. salicilic –> hipersenzitivitate, stres osmotic
Citokinine, etilena

13

2.2.5. Mecanisme de transport
În condiții de salinitate crescută a solului este continuat influxul radicular de Na+
apoplastic sau simplastic, prin canale cationice și transportori. În aceste cazuri, supraviețuirea
unei plante depinde de capacitatea acesteia de a își menține homeostazia ionică intracelulară
prin mecanimse de restricți onare a acumulării unei cantităț i citosolice toxice de sodiu.
Sodiul este preluat din sol și, alături de alte elemente, este transportat prin lichidul
țesutului radicular în trei moduri: simplastic, apoplastic și transcelular. Dintre acestea, calea
apoplastică va întâmpina o barieră restrictivă la nivelul endodermului radicular unde este
prezentă banda Ca spari (hidrofobă) (Schreiber et al. 2005; Plett and Moller 2010) .
Căile de protecție cele mai întâlnite implică fie mecanismul excluderii de sodiu, fie
mecanismul de sechestrare în compartimente intracelulare. Primul mecanism este cel des
observat, fiind f olosit într -o anumită măsură de mezohalofite, glicofite și plante de cultură
precum orezul și grâul (Gorham et al. 1990; Munns et al. 2006) .
Sechestrul de sodiu (compartimentalizarea) este mecanismul dezvoltat ca o metodă de
control a stresului osmotic și menținerea turgescenței normale . Pe lângă acest control ionic,
ajustarea osmotică implică și activitatea unor soluți organici compatibili precum zaharuri,
prolina și betaina. Compartimentalizarea Na+ este făcută, preponderent, prin intermediul
produșil or de transcripției ai subfamiliei de gene NHX. Proteinele rezultate se găsesc
transmembranar, la nivelul vacuolei, endozomului și veziculelor de transport (Pardo et al.
2006) .
Subfamilia de gene NHX au drept transcript proteine membranare multi –
pass/politopice .

2.2.5.1. Calea SOS și influența asupra mecanismului NHX
Din familia SOS, SOS1 codifică proteine ce mediază excluderea sodiului încă de la
interfața rădăcină –sol. În condiții de stres salin moderat, SOS1 facilitează trecerea Na+ în
xilemul radicular pentru a fi izolat și stocat în vacuolele mezofilului foliar. Dar în condiții de
stres salin extrem, SOS1 devine implicat în descărcarea Na+ din xilemul radicular pentru a
evita eventuale daune foliare provocate de supraîncărcarea vac uolelor cu Na+ (Shi, 2002) .La
ce specii de plante ?
O concentrație anormală d e sodiu induce creșterea concentrației de Ca2+ și activarea
protein -kinazei dependente de Ca2+ și specifice complexului SOS3/SOS2, eliberând SOS2.
SOS2, la rândul ei, va activa, prin fosforilare, o serie de antiporteri: SOS1 (ținta principală) ,
Na+/H+ al NHX și H+/Ca+ al CAX1 (Quintero et al. 2002; Cheng et al. 2004) . Activitatea

14
kinazică a SOS2 și implicit a țintelor sale poate fi încetinită sau chiar inhibată de alte căi,
precum cea a ABI2 (Ohta et al. 2003). Din complexul SOS3/SOS2, SOS3 este componenta
proteică sensibilă la creșterea nivelului de calciu (Liu and Zhu 1998; Ishitani et al. 2000) , iar
SOS2 este componenta proteică cu activitate kinazică necesară fosforilării domeniilor de
autoinhibiție ale antiporterilor membranari (Quintero et al. 2011; Feki et al. 2011) .
Calea antiporterului SOS1 în combaterea stresului salin moderat a fost cel mai bine
studiată la glicofitul Arabidopsis thaliana . Activitatea AtSOS1 s -a dovedit a fi crucială în
expulzarea sodiului din celulele epidermului radicular aflate în proximitatea sau chiar în
contact cu solul salin. De asemenea, s-a observat r olul AtSOS1 în controlul concentrației de
Na+ din seva xilemului, ionul fiind transportat înspre vacuolele din mezofilul foliar pentr u a fi
izolat (Shi et al. 2000, 2002) . Putem deduce că, în cele din urmă, capacitatatea de stocare a
vacuolelor este un factor de influență al nivelului de rezistență la mediul salin.

2.2.5.2. Pompele vacuolare pentru protoni și influență lor asupra mecanismului NHX
Transportul membranar este esențial în menținerea homeostaziei celulare ce implică
un control fin al acidității celulare și o bună protecție față de acumularea intracelulară a unor
concentrații toxi ce de substanțe, printre care și sărurile.
Familiile de pompe protonice vacuolare dependente de adenozin t rifosfat (V -ATPaze)
și de pirofosfatază (V-PPaze) sunt pompe protonice ce sunt asamblate la nivelul tonoplastului
din celula vegetală, rolul lor principal fiind medierea transportului de protoni dinspre
citoplasmă înspre interiorul vacuolei (Drobny, M. și colab., 2003) . Prin această funcție de
modulare a gradientului de pH intracelular, pompele vacuolare de protoni determină forțele
proton -motrice ce vor influența activitatea altor schimburi între compartimentele celulare,
cum este în cazul activrii proteinelor antiport Na+/H+ necesar e pentru compartimentalizarea
concentrației toxice de Na+ (Blumwald și Poole , 1987).
Numărul de pompe vacuolare dependente de ATP și numărul celor dependente de PP
este aproximativ egal (Drobny, M. și colab., 2003). În condiții saline, exprimarea genelor
pentru pompele protonice vacuolare , prin urmare este intensificată introducerea H+ în lumenu l
vacuolar ce va fi „moneda” de schimb pentru antiporterul Na+/H+. Prin urmare, un criteriu
care poate determina nivelul de rezistență al unei halofite este capacitatea augmentată de
transcriere a pompelor vacuolare (Niu, X. și colab., 1993 ).
Adenozin -trifosfataza vacuolară este un complex enzimatic format din două dome nii
multiheteromerice ce conlucrează pentru a rezulta un efect de rotație. Numele acestui tip de
pompă este dat de localizarea la nivel vacuolar (V) și de substratul necesar pentru inducerea
mecanismului de transport (ATP). Hidroliza ATP este îndeplinită de domeniul citosolic V 1,
iar translocarea protonilor este realizată prin intermediul domeniului integrat în tonoplast V0
(Forgac, M., 1999 ) (Drobny, M. și colab., 2003) . Domeniul V 1 este format din….. Isoforme ale
acestei holoenzime sunt identificate în cadrul tuturor speciilor de eucariote
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1218484/ .
Pirofosfataza vacuolară este un homodimer polipepti dic cu masa moleculară variabilă
de la specie la specie (Sato și colab ., 1991; Tzeng și colab., 1996) . Este localizat
intramembranar și energia este dată de pirofosfataza anorganic ă (PP i). În ciuda dimensiunilor
mici, o singură subunitate a homodimerului este îndeajuns pentru a fi prezentă o reacție
enzimatică (Tzeng și colab., 1996; Drobny și colab., 2003). Este ubicuitară la nivelul
tonoplastului plantelor superioare , dar a fost identificată și la unele specii de alge (Nakanishi

15
și colab., 1999; Ikeda și colab., 1991, 1999) , fungi (Macdonald și Weeks, 1988), protozoare
(Rodrigues și colab., 1999), bacterii aerobe (Schocke și Schink, 1998) și archaea (Drozdowicz
și colab., 1999) https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014579307003225#bib35 .

grafic V -ATP aza
EC-3.6.1.36
kDa

V0 9.1 nm Mariaux și colab.,
1994) grafic V -PPaza
EC-3.6.1.1
79-80 kDa (masa moleculară – variabil per specie )
smallest 73 kDa in mung bean ….69 kDa la S. salsa
(https://academic.oup.com/jxb/article/52/365/2355/543851)

6.7-7.2 nm (diametru componentă intramembranară –
(Mariaux și colab., 1994))

2.2.5. 3. Influența trasnscriptului HKT asupra mecanismului NHX
HKT este o familie de gene ce codifică transportori specifici de Na+. Controlează
influxul de Na+ în celulele radiculare, în cazul unor concentrații externe scăzute de Na+ și K+ ,
dar fa ță de SOS și NHX nivelul de protecție față de toxicitatea salină este mai scăzut (Horie,
2009). La organismul model A. thaliana proteina din familia HKT cu un nivel de activitate
relevant în combaterea stresului salin s -a determinat a fi AtHKT1;1, dar în condițiile în car e
activitatea celor lalți antiporteri radiculari (ex. AtSOS1) nu este inhibată .

2.2.5.4. Mecanismul NHX
NHX este o clasă de transport ori trans membranari, încadrați în familia de antiportori
CPA1, subfamilia NHX/NHE (Saier, 2000). Sunt două clase: I și II. Antiporterii NHX de la
nivel vacuolar facilitează un schimb electroneutru între Na+ citosolic ș i H+ vacuola r.
Activitatea NHX este influențată de pompele pr otonice vacuolare, acestea reglând gradientul
forței proton -motrice (Blumwald 1987). , și de SOS2 ce fosforilează domeniul de autoinhibiție
din componenț a antiporterului NHX .
Sunt încadrați în the monovalent cation:proton antiporter 1 (CPA1) transporter (TC
2.A.36) family (conform bazei de date TCDBi ).
Prin prezența lor la nivelul membranelor vacuolare și endosomale, antiporterii NHX 1
sunt piese importante nu numai în gestionarea concentrațiilor toxice de ioni, ci și în
menținerea pH -ului optim pentru desfășurarea normală a proceselor celulare de creștere și
dezvoltare , fapt demonstrat și prin expresia i n drojdii a ScNHX1 de la specia halofită Suaeda
corniculata (Brett el al. 2005) . Mai mult, supraexprimarea familiei NHX ar putea fi o cheie în
îmbunătățirea toleranței la secetă și factorii de stres aferenți ( stres termic , stres hidric) (Apse
et al.1999; Zhang and Blumwald 2001; Xue et al. 2004;Liu et al. 2010; Brini et al. 2007).

16
NHX1 este cel mai implicat în sechestrarea sodiului la nivel vacuolar și scăderea
concentrației citosolice pentru menținerea optimă a raportului ionic K/Na.
Antiportorii NHX tra versează membrana de mai multe ori, prezentând între 10 și 12
domenii transmembranare și un capăt hidrofilic intravacuolar (Yamaguchi et al. 2003).
Analize asupra A. thaliana în condiții saline au determinant creșterea exprimării
AtNHX din clasa I în frunze (1, 2 și 4) și rădăcini (AtNHX3) . Deși, în totalitatea sistemului
radicular activitatea NHX3 este pregnantă, la nivelul guard cells este mai intensă activitatea
AtNHX 1, 2 și 5 (Shi and Zhu 2002; Rodriguez -Rosales et al. 2009).
NHX1 este o genă codificatoare pentru un antiportor Na+/H+, la nivelul tonoplastului.
Astfel, în prezența stresului salin, NHX1 este implicată în compartimentalizarea vacuolară a
ionilor de Na+ (Nass, 1998). Mecanismul implică sechestrarea ionilor de Na+ din citoplasmă
ca urmare a creșterii gradientului electrochimic prin pomparea H+ de către pompe le vacuolare
de protoni . În condiții de stres salin este menținut un raport ridicat K+/Na+ în citoplasmă prin
acumularea Na+ în vacuole.
Genele NHX identificate la organisml model A. thaliana au secvențe scurte, între 500
și 550. Excepțiile sunt NHX8 cu o secvență de 756 și NHX7 cu 1.146 (dublu față de restul
genelor NHX). O observație interesantă este puternica influență a controlului prin mecanismul
SOS în cazul excepțiilor.
Inhibitori: CML1 8/CAM15 (pentru transportul de Na, dar nu si K), amiloroid și
substanțe bazate pe amiloroid,benzamil, quinina.
Inductori: NaCl (în mod dependent sau independent de ABA) , KCl, sorbitol, ABA,
Na+.
NHX1 Calcium and pH -dependent interaction with CML18/CAM15 (increases when
pH decreases, better at pH 5.5 than at pH 7.5). Present in flowers, particularly in petals,
stamens and anthers (including pollen). Slightly expressed in developing ovaries, strongly
expressed in developing embryos and in siliques outer int eguments (mostly in base and tips).
During first days after germination, mainly localized in roots, including root tips. Later,
ubiquitous except in root tips.
NHX5 și NHX6 sunt necesari în proliferarea și expasiunea celulară, dar nu și în
diferențiere. Activitatea celor două este întrepătrunsă, un deficit în dezvoltare cauzat de lipsa
lor fiind observat abia în cazul liniilor dublu -mutante NHX5 -NHX6. The Arabidopsis
intracellul ui sol salin. ar Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and
necessary for plant growth and development."
Bassil E., Ohto M.A., Esumi T., Tajima H., Zhu Z., Cagnac O., Belmonte M., Peleg Z.,
Yamaguchi T., Blumwald E.Plant Cell 23:224 -239(2011) [PubMed] [Europe PMC]

17

18
NHX7 este controlat pozitiv de mecanismul de semnalizare SOS, fiind implicate
kinaza CIPK24/SOS2 pentru complexul SOS2 -SOS3 și senzorul pentru Ca2+ CBL4/SOS3.
Supraexprimarea NHX7 este îndeajuns pentru creșterea rezistenței la toxicitatea u nui sol salin.
Este implicat în răspunsul la stresul oxidativ, fiind activ în metabolismul ROS și foarte
sensibil la creșterea concentrației de H 2O2. Este presupus a fi SOS1. Este indus de prezența
ionilor de Na.
NHX8 este cunsocut și ca SOS1B.
NHE -1 are ca domeniu heli x transmembranar.
Procese biologice și moleculare în care mecanismul NHX este prezent:
transport transmembranar electroneutru între H și cationi (predomiant Na, K)
stimul dezvoltare foliară
toleranță crescută în soluri saline
reglare volum celular
reglare pH intracelular
control stomate
N.B. Proteinele sunt cunsocute fie ca NHE ( Na+/H+ exchanger ) fie ca Nhx ( Na+/H+
antiporter )
desen celulă cu interacțiunea dintre HKT, SOS, NHX
desen cu internalizarea sărurilor toxice
desen cu excluderea sărurilor toxice

19
Capitolul 3 . Investigarea exprimării unor gene implicate în conferirea
toleranței la sare la specii halofite
3.1. Argument și obiective
Investigarea mecanismelor moleculare ce susțin toleranța crescută la sare este o
necesitate/cerință esențială ce trebuie ?satisfăcută? pentru a putea dezvolta mai departe
răspunsurile potrivite la probemele de mediu întâlnite în agricultură.
Ca urmare a preponderenței sărurilor de sodiu în solurile supuse salifierii, este
important st udiul mecanismelor implicate în combaterea toxicității la Na+.
Scopul lucrării de față este completarea cunoștințelor colective actuale cu privire la
exprimarea genelor de rezistență la halofite.
Obiectivele sunt investigarea exprimării NHX în cazul unor specii de halofite din
România și revizuirea informațiilor actuale necesare pentru interpretarea corectă a rezultatelor
obținute.
Sau
Scopul: investigarea exprimării NHX în cazul unor specii de halofite din România
Obiective: izolarea ARN, generarea și analiza cDNA și interpretarea rezultatelor conform
informației colective actuale.

3.2. Materiale și metode
3.2.1. Materialul vegetal
Materialul vegetal a fost colectat din zone cu sol afectat de salinitate din Timișoara,
Sic și Cojocna. Speciile analizate au fost Limonium gmelinii , Phragmites australis , Salicornia
europaea , Salsola soda și Sueda maritima . Extracția a fost realizată porn ind de mixuri de
țesuturi de la fiecare specie (frunză,tulpină, rădăcină) .
poza1 p2 p3
p4 p5 p6

Conform caracteristicilor anatomice, Salicornia europ aea și Suaeda maritima sunt
specii extrem -halofite ireversibile, prezentând…………… (Grigore și Toma, 2010) .
Y sunt reversibile, ca urmare a prezenței…….
Z sunt mezohalofile.
Genul Phragmites este reprezentat de specii perene de ierburi ce se dezvoltă în zone
umede din teritorii supuse unui climat temperat sau tropical . În multe dintre aceste l ocuri,
speciile din acest gen au tendințe invazive cu efecte negative asupra altor specii de plante, dar
existența acestora continuă să fie importantă pentru buna dezvoltare a unor animale de stufăriș .

20
Din cadrul acestui gen am ales ca obiect de studiu Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud ,
dat fiind caracterul ei cosmopolitan. P. australis , cunoscută popular drept trestia
comună, ………………uses (edible)
Genul Salicornia este recunoscut pentru speciile anuale, suculente și halofite, acestea
proliferând în zone calde și cu o concentrație salină ridicată . ……………..uses (edible , biodiesel ,
fitoextragere )

3.2.2 . Extracția ARN
Consecință a proprietăților biochimice, ARN -ul este o moleculă cu mult mai labilă ca
ADN -ul, așadar este nevoie de o alegere atentă a protocolului de extracție astfel încât să fie
contracarate dificultățile aduse de structură, cât și pentru a elimina ribonucleazele ce lulare și
evitarea contaminării cu cele existente în mediu.
Orice protocol pentru izolarea de ARN începe cu pulverizarea țesuturilor și lizarea
celulelor.
Cea mai importantă diferență între protocoale constă în alegerea soluțiilor tampon pentru
lizare.
Există două mari categorii:
-cele care folosesc agenți haotropici puternici (ex. săruri guanidinice, fenol, cloroform, SDS)
-cele care folosesc soluții -tampon hipotonice ce distrug doar membrana plasmatică, în așa fel
încât organitele și nucleul să rămână intacte (acestea vor fi îndepărtate prin centrifugare)
Agenții haotropici sunt preferați deoarece, pe lângă distrugerea membranelor
plasmatice și ale organitelor, inactivează în mod eficient și activitatea RNazelor.
Extracția de ARN a fost efectuată urmând instrucțiunile a două protocoale diferite.
pentru a identifica metoda Un mod a fost cu kitul Sigma Spectrum Plant Total RNA
(#STRN50) , iar cel de al doilea cu T RIzol (TRI Reagent) .
Protocolul de extracție cu Trireagent (Sigma) a fost adaptat după Chomczy nski și
Sacchi (1987) .
Principiu:
Motivația folosirii:
Pro și cons pt. metodă:
Componente și echipamente :
Variabile ce pot influența datele și moduri de a le controla:
II. Extracția cu TRIzol
TRIzol este un tampon guanidinic folosit ca o alternativă la extragerea „clasică” fu
fenol. Soluți e haotrofică

21
3.2.3 . Revers -transcrierea ARN
RT-PCR este o tehnică derivată a principiului de bază din PCR. Este o etapă necesară
pentru generarea ADN -ului complementar (cDNA) matricei ARN izolată în etapa anterioară.
Procesul este biocatalizat de enzima revers -transcriptaza , astfel se poate transcrie și analiza
moleculele de ARN. Reverse transcriptase is used also to create cDNA libraries from mRNA.
The commercial availability of reverse transcriptase greatly improved knowledge in the area
of molecular biology, as, along with other enzymes, it allowed scientists to clone, sequence,
and characterise RNA
Principiu:
Motivația folosirii:
Pro și cons pt. metodă:
Componente și echipamente:
Variabile ce pot influența datele și moduri de a le controla:

3.2.4 . Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)
qPCR este o tehnică de analiză moleculară utilizată pentru a determina simultan
calitativ și cantitativ secvențe specifice de ADN.
Principiu:
Motivația folosirii:
Pro și cons pt. metodă:
Componente și echipamente:
Variabile ce pot influența datele și moduri de a le controla:

În cazul P. australis gena de referință aleasă este actina, iar pentru S. europaea este
ubiquitina.

3.3. Rezultate și discuții
3.3.1. Rezultatele extracției de ARN

22
3.3.2 . Rezultatele reverstranscrierii de ARN

3.3.3 . Rezultatele qPCR
Exprimarea genei de referință (actină) în cazul P. australis este deficitară. Este recomandată
utilizarea unei alte gene cu o mai mare stabilitate a controlului endogen .
Phragmites australis NHX Act ∆Ct Avg ∆Ct STDEV
PaSic cDNA 4 21.72 26.39 -4.67
PaSic cDNA 4 21.71 26.28 -4.57
PaSic cDNA 4 21.79 27.04 -5.25 -4.83 0.37
PaDinias cDNA1 (3) 21.95 32.74 -10.79
PaDinias cDNA1 (3) 22.01 32.97 -10.96
PaDinias cDNA1 (3) 21.86 30.34 -8.48 -10.08 1.39
PaDinias cDNA 2 (1) 22.86 35.19 -12.33
PaDinias cDNA 2 (1) 23.25 32.32 -9.07
PaDinias cDNA 2 (1) 23.16 33.12 -9.96 -10.45 1.69

Salicornia europaea NHX UBC ∆Ct Avg ∆Ct STDEV
Se Sic cDNA 6 18.03 13.5 4.53
Se Sic cDNA 6 18.47 13.64 4.83
Se Sic cDNA 6 18.19 13.52 4.67 4.68 0.15
Se Sic cDNA 10 18.94 13.64 5.3
Se Sic cDNA 10 18.42 13.31 5.11
Se Sic cDNA 10 18.00 13.5 4.5 4.97 0.42
Se Cojocna cDNA 16 18.86 13.25 5.61
Se Cojocna cDNA 16 18.97 13.09 5.88
Se Cojocna cDNA 16 18.71 12.89 5.82 5.77 0.14

23

Concluzii
În urma experimentului putem intui că anumite gene de referință , deși sunt ubicuitar
existente, au stabilitate în exprimare diferită în funcție de genul speciei. ACTIN se dovedește a avea
pentru ….. no one gene has a stable expression under eve ry experimental condition, as numerous
studies reported that expression of housekeeping genes can also vary considerably with experimental
conditions. Consequently, normalization of gene expression results under all experimental conditions
with a single co ntrol can bias the result. Therefo re, it is necessary to validate the expression stability
of a control gene under specific experimental conditions prior to its use for normalization -14.0-12.0-10.0-8.0-6.0-4.0-2.00.0Nivelul relativ de exprimareLocația
PaNHX1Sic Dinias 3 Dinias 1
0.01.02.03.04.05.06.07.0
Sic Sic CojocnaNivelul relativ de exprimare
LocațiaSeNHX1

24
Due to limited set of samples and genes tested, however, it remained unclear whether these and
other traditionally used reference genes are in fact the best possible choices for normalizing gene
expression data in Phragmites/ Salicornia. Numerous studies have shown that the expression of even
the housekeeping genes can vary under given situations [10]. This may partly be explained by the fact
that housekeeping genes are not only implicated in the basal cell metabolism but also participate in
other cellular functions [25,26]. Taken together, these results suggest that the hou sekeeping genes
are regulated differently in different plant species and may exhibit differential expression patterns.
Therefore, a reference gene with stable expression in one organism may not be suitable for
normalization of gene expression in another or ganism under a given set of conditions and needs to
be validated before its use.

Bibliografie

1. Blumwald, E., & Poole, R. (1987). Salt tolerance in suspension cultures of sugar beet :
induction of na/h antiport activity at the tonoplast by growth in salt. Plant Physiol. , 83 (4),
884-887.
2. Brouwer, C., Goffeau, A., & Heibloem, M. (1985). Irrigation Wa ter Management: Training
Manual No. 1 – Introduction to Irrigation. FAO, Rome.
3. Drobny, M., Fischer -Schliebs, E., Lüttge, U., & Ratajczak, R. (2003). Coordination of V -ATPase
and V -PPase at the Vacuolar Membrane of Plant Cells. In K. Esser, U. Lüttge, W. Be yschlag, &
F. (. Hellwig, Progress in Botany (Vol. 64, pp. 171 -216). Berlin, Heidelberg: Springer.
4. Drozdowicz, Y., Lu, Y. -P., Patel, V., Fitz -Gibbon, S., Miller, J., & Rea, P. (1999). A thermostable
vacuolar -type membrane pyrophosphatase from the archaeon Pyrobaculum aerophilum:
implications for the origins of pyrophosphate -energised pumps. FEBS Lett. , 460 , 505 -512.
5. Eakins, B. W., & Sharman, G. F. (2010). Volumes of the World's Oceans from ETOPO1. Boulder,
CO: NOAA National Geophysical Data Center.
6. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). (2011). The State of the
World's Land and Water Resources for Food and Agriculture: Managing systems at risk.
London/Rome: Earthscan/FAO.
7. Flowers, T. J., & Colmer, T. D. (2008). Salinity tolera nce in halophytes. New Phytologist , 179 ,
945–963.

25
8. Flowers, T., Hajibagheri, M., & Clipson, N. (1986). Halophytes. The Quarterly Review of
Biology (61), 313 –337.
9. Forgac, M. (1999). Structure and properties of the vacuolar (H+) -ATPases. J. Biol. Chem. , 274
(19), 12951 -12954.
10. Foyer, C. H., & Notor, G. (2009). Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling,
acclimation, and practical implications. Antioxid Redox Signal. , 11(4):861 -905.
11. Grigore, M. N., & Toma, C. (2010). A proposal for a new halophyt es classification, based on
integrative anatomy observations. Oltenia Journal for Studies in Natural Sciences , 26 (1).
12. Hardie, M., & Doyle, R. B. (2012). Measuring Soil Salinity. Methods Mol Biol. , 913 , 415 -25.
13. Ikeda, M., Rahman, M., Oritani, C., Umami, K., Tanimura, Y., Akagi, R., et al. (1999). A
vacuolar Ht -pyrophosphatase in Acetabularia acetabulum: molecular cloning and comparison
with higher plants and a bacterium. J. Exp. Bot. , 50, 139 -140.
14. Ikeda, M., Satoh, S., Maeshima, M., Mukohata, Y., & Morit ani, C. (1991). A vacuolar ATPase
and pyrophosphatase in Acetabularia acetabulum. Biochim. Biophys. Acta. , 1070 , 77-82.
15. IUSS Working Group WRB. (2015). World Reference Base for Soil Resources 2014, update
2015, International soil classification system for naming soils and creating legends for soil
maps. Rome: FAO.
16. MacDonald, J., & Weeks, G. (1988). Evidence for a membrane -bound pyrophosphatase in
Dietyostelium discoideum. FEBS Lett. , 238 , 9-12.
17. Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. ,
7(9):405 -10.
18. Nakanishi, Y., Matsuda, N., Aizawa, K., Kashiyama, T., Yamamoto, K., Mimura, T., et al. (1998).
Molecular cloning of vacuolar H+ -pyrophosphatase and its developmental expression in
growing hypocotyls of mung bea n. Plant Physiol. , 116 , 589 -597.
19. Niu, X., Narasimhan, M., Salzman, R., Bressan, R., & Hasegawa, P. (1993). NaCl Regulation of
Plasma Membrane H+ -ATPase Gene Expression in a Glycophyte and a Halophyte. Plant
Physiology , 103 (3), 713 -718.
20. Pardo, J. M. (201 0). Biotechnology of water and salinity stress tolerance. Current Opinion in
Biotechnology , 21:185 -196 .
21. Rodrigues, C., Scott, D., & Docampo, R. (1999). Presence of a vacuolar H+ -pyrophosphatase in
promastigotes of Leishmania donovari and its localisation to a different compartment from
the vacuolar H+ -ATPase. Biochem. J. , 340 , 759 -766.
22. Sato, M., Maeshima, M ., Ohsumi, Y., & Yoshida, M. (1991). Dimeric structure of H+ –
translocating pyrophosphatase from pumpkin vacuolar membranes. FEBS Letters , 290 , 177 –
180.

26
23. Schafer, F. Q., Wang, H. P., Kelley, E. E., Kueno, K. L., Martin, S. M., & Buettner, G. R. (2002).
Comp aring beta -carotene, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants. Biological
Chemistry , 383(3 -4):671 -681.
24. Schocke, L., & Schink, B. (1998). Membrane -bound proton -translocating pyrophosphatase of
Syntrophus gentianae, a syntrophically benzoate -degr ading fermenting bacterium. Eur. J.
Biochem. , 256 , 589 -594.
25. Sharma, P., Jha, A. B., Dubey, R. S., & Pessarakli, M. (2012). Reactive Oxygen Species,
Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in Plants under Stressful
Conditions. Journal of Bota ny , vol. 2012.
26. Tzeng, C., Yang, C., Yang, S., Jiang, S., Kuo, S., Hung, S. -H., et al. (1996). Subunit structure of
vacuolar proton -pyrophosphatase as determined by radiation inactivation. Biochem. J. , 316 ,
143-147.