Mijloace Si Metode Utilizate In Studierea Celulelor

PROIECT DE DIPLOMĂ

MIJLOACE ȘI METODE UTILIZATE ÎN STUDIEREA CELULELOR

CUPRINS

PARTEA I

CONSIDERAȚII GENERALE

Introducere

Domeniul biologiei celulare cunoaște în ultimile decenii un ritm de dezvoltare mare, devenind deosebit de vast. Datorită concepțiilor general științific, metodologiei și tehnicilor actuale de cercetare, au fost acumulate multe date privind structura și funcțiile biosistemului celular deschis. Aceasta impune în primul rând o selecționare și prezentare judicioasa a materialului atât clasic cât și recent , dar mai ales integrarea lui concepțiilor științifice moderne.

Biologia moleculară are ca obiect de studiu analiza și interpretarea fenomenelor biologice celulare în termeni moleculari. Absolventul de Zootehnie, specializat pe creșterea animalelor, este un specialist de formație complexă, eficiența practică a informațiilor dobândite depinzând de înțelegerea relațiilor dintre Biologia celulară și: Histologie, Embriologie, Anatomie, Fiziologie, Nutriție, Reproducție, Biochimie și respectiv creșterea animalelor.

Biologia celulară oferă posibilitatea înțelegerii proceselor biologice și a elementelor necesare desfășurării activității practice din domeniul creșterii animalelor și a păsărilor. Aceasta trebuie percepută ca un studiu de laborator și/sau o disciplină pur didactică și obligatorie prin procesul de învățământ.

Celula reprezintă unitatea morfo-funcțională de bază a vieții, deci posibilitatea manifestării unei funcții vitale, la nivelul celulei trebuie căutată. Deci, în studierea treptei biologice a vieții, biologia celulară nu numai că nu poate lipsi, dar este prima condiție.

Toate celelalte discipline biologice continuă apoi și lărgesc acest acest studiu, ocupându-se de manifestarea funcțională la nivele structurale de organ, sisteme de organe, organism, apoi comportamentul vieții pe Terra și în final comportamentul vieții in cosmos, Cosmobiologia. Din acest punct de vedere și didactic, nu poate exista nici un fel de suprapunere în predarea disciplinelor, atâta timp cât domeniile sunt delimitate ca nivel de organizare.

Creșterea animalelor după tehnologii moderne presupune cunoașterea de către specialiștii în domeniu a diverselor aspecte tehnologice și economice a acestei ramuri agricole dar și stăpânirea cunoștințelor referitoare la biologia organismului animal.

CAPITOLUL 1

BIOLOGIA CELULARĂ CA ȘTIINȚĂ

1.1. Definiția Biologiei celulare

Biologia celulară sau citologia este o disciplină care studiază celulele: structura lor, organitele pe care le conțin, fiziologia lor, interacțiunea lor cu mediul înconjurător, ciclul lor de viață, diviziunea și moartea lor. Studiul este făcut atât la nivel microscopic cât și la nivel molecular. Cercetările de biologie celulară cuprind întreaga gamă a organismelor, de la organisme unicelulare, ca bacteriile și protozoarele, până la multitudinea de celule specializate din organismul uman (http://ro.wikipedia.org/).

1.2. Metoda de studiu a Biologiei celulare

Ca știință integrativă, biologia celulară este consecința elaborării, perfecționării și aplicării în domeniul biologiei a două grupe de tehnologii, diferite ca mecanism cognitiv, dar complementare ca efect analitico-informațional. Este vorba, mai întâi, de microscopia electronică prin intermediul căreia biologii au descoperit o nouă lume – lumea organizării ultrastructurale.Aplicarea acestei tehnologii a sporit cu trei ordine de mărime (de circa 1000 ori) puterea de rezoluție a microscopului luminescent și a ridicat capacitatea de a obține imagini directe asupra organizării intime celulare, la circa 1 milion față de puterea de discriminare a ochiului liber (V. Teușan și colab., 2007).

Cea de-a doua grupă de tehnologii este cea de microanaliza compoziției chimice a diferitelor organite celulare, pe baza fracționării și purificării lor. Prin această tehnologie nu se obțin imagini sau reprezentări directe, ci se obțin date precise pe baza cărora se pot elabora reprezentări indirecte (sau mentale). Deci, pe această bază ne formăm conceptele despre organizarea și funcționarea intimă a diferitelor organite celulare.

Nu este lipsit de importanță să observăm că puterea de rezoluție a celor două tehnologii este echivalentă – de circa 1 milion – și că datorită acestei puteri de rezoluție similare, cele două tehnologii au împins capacitatea de analiză a materiei vii până la sistemul de subunități celulare de ordinul al doilea – până la nivelul de organizare macromoleculară. Astfel, în prezent, organizarea macromoleculară a organitelor celulare (subunităților de ordinul I) a devenit domeniul comun de investigare în biologia celulară, atât prin metode directe (microscopul electronic) cât și prin metode indirecte (microanaliza pe baza izolării și purificării fracțiunilor de celule) (N.Avram, 1980 ).

1.3. Obiectul de studiu al Biologiei celulare

Biologia celulară are ca obiect de studiu cunoașterea structurilor celulare intime. Prin cercetările de Biologie celulară s-au înregistrat succese remarcabile; pentru dezvoltarea acestei discipline s-a elaborat harta organizării ultrastructurale a principalelor tipuri de celule ce alcătuiesc lumea vie; s-a identificat structura intimă și rolul fiecărui organit în activitatea celulară; s-au clarificat mecanismele esențiale ale unor procese metabolice celulare: sinteza de proteine, secreția, baza mișcărilor celulare, schimburile celulei cu mediul înconjurător, digestia intracelulară, reproducerea celulară etc. În prezent sunt studiate interrelațiile dintre organitele celulare, mecanismele de reglare a proceselor metabolice, creșterea, diferențierea și moartea celulară ( http://ro.scribd.com/).

1.4. Istoricul dezvoltării Biologiei celulare

După inventarea microscopului, la începutul secolului al XVII-lea de către opticienii olandezi, fizicianul englez Robert Hooke (1635-1703) aduce unele îmbunătățiri și observă pentru prima dată o secțiune printr-un dop de plută. În câmpul microscopic el distinge numeroase cămăruțe mici pe care le numește celule. Dat fiind faptul că ceea ce observase el reprezenta membrana celulară (întrucat conținutul celular fiind mort, ceilalți constituenți dispăruseră), Hooke credea că partea importantă a celulei vegetale este membrana. Această primă observație a fost confirmată de mai mulți autori care, cercetând diverse secțiuni din materialul vegetal, considerau corpul plantelor ca fiind altcătuit din "celule" (Malpighi, 1672-1675, și Grew, 1671). Atât studiile microscopice, cât și perfecționarea microscopului au continuat, ceea ce i-a permis lui Corti (1772) să observe mișcarea protoplasmei iar, mai târziu, lui R. Brown (1833) să descopere nucleul în celulele epidermice de orhidee, care ulterior s-a dovedit a fi un organit celular stabil. În ciuda acestor descoperiri, membrana celulară continua să fie considerată pe primul plan, iar nucleul, pe planul doi. Cam în aceeași perioadă, zoologul francez Dujardin (1835) constată că materia esențială a celulei vii este o substanță fluidă și vâscoasă pe care o numește sarcodă. Lucrând independent, botanistul Mohl (1844-1846) ajunge la aceeași concluzie, numind-o însă protoplasmă, termen păstrat până în zilele noastre.

Botanistul Schleiden (1838) și zoologul Schwann (1839) au postulat că proprietățile organismelor pluricelulare depind de activitatea fiecărei celule care le compun și că "tot ce este viu este format din celule". Această teorie s-a fundamentat pe baza numeroaselor cercetări anterioare făcute de Mirbel (1809), Oken (1805), Lamarck (1809), Dutrochet (1824) și Gorianinov (1834). Apariția teoriei celulare a influențat pozitiv toate direcțiile de cercetare în biologie. Mult mai târziu, această teorie s-a completat grație cercetărilor de biochimie și fiziologie care arată că toate celulele se aseamănă oarecum prin compoziția lor chimică, prin caracteristicile metabolismului, cât și prin aceea că organismul pluricelular funcționează ca un tot unitar.

În a doua jumătate a secolului trecut citologia a devenit o știință de sine stătătoare bazată pe progresele făcute în microscopia fotonică și tehnica microscopică. S-a perfecționat stativul microscopic, s-au format modele de microscoape cu cremalieră și revolver, s-a introdus imersia (D. Amici, 1850). Construirea condensatorului (Abbé, 1873), a obiectivelor apocromate și a ocularului compensator au dus la perfecționarea microscopului fotonic (Avram N., 1980).

Între anii 1850 și 1890 tehnica microscopică s-a îmbunătățit prin introducerea unor fixatori, a microtomului, a termostatului, cât și a diferiților coloranți (pentru evidențierea conținutului celular). Aceste perfecționări ale tehnicii microscopice au condiționat descoperirea organitelor celulare și a unor procese celulare.Așa de exemplu, s-a descoperit amitoza (Remak, 1852) și fazele diviziunii cariochinetice la plante (Strasburger, 1875-1878). Flemming (1880) descrie diviziunea celulelor la animale pe care o numește mitoză. El a introdus mulți termeni care se folosesc și astăzi, de exemplu diviziunea directă, indirectă, mitoză, amitoză, formă de rețea (aster), nucleu-fiu, rețea nucleară, cromatină, acromatină, placă ecuatorială, cariochineză (Avram N.,1980).

În paralel cu dezvoltarea Biologiei celulare au apărut și s-au dezvoltat științe noi precum Biochimia și Biofizica. Astfel, s-au pus la punct tehnici noi de fracționare a celulei prin centrifugare diferențiată (Bensley și Hoerr, Albert Claude 1934); cromatografie, electroforeză, polarografie,citofotometrie (THEODOR CASPESSON 1924), rezonanța magnetică nucleară, criofracturarea celulară, rezonanța electronică de spin, spectro-fluorometria etc.

În prezent, Biologia celulară înregistrează progrese și realizări deosebite care au permis studierea structurilor vii până la nivel molecular și submolecular. Astfel, prin descifrarea structurii proteinelor și a acizilor nucleici (ADN și ARN care reprezintă cam 1/5 din materialul celulei și sunt fabricați cu o viteză extraordinară), a fost posibilă elucidarea mecanismelor de replicare a ADN-ului, biosinteză a proteinelor și a genelor și apariția unei noi ramuri a Biologiei celulare denumită biologie moleculară.

Aceasta are ca obiect de studiu analiza și interpretarea fenomenelor biologice celulare în termeni moleculari (http://ro.scribd.com/).

1.5. Istoricul dezvoltării Biologiei celulare în țara noastră

În România, un merit deosebit la dezvoltarea acestei științe îi revine lui GEORGE EMIL PALADE-unul dintre pionierii (alături de Albert Claude, Christian Deduve- și Keith Porter) elaborării tehnologiei electrono-microscopice. Acest laureat al premiului Nobel a pus la punct tehnica fixării, a descoperit și studiat ribozomii, a contribuit la elucidarea mecanismului sintezei proteinelor și a secreției celulare, a studiat permeabilitatea vasculară și biogeneza membranelor.

Școala românească de citologie și-a adus o contribuție importantă la cunoașterea structurilor citologice și histologice. Astfel, școala de microscopie de la Facultatea de Medicină Veterinară din București s-a impus în secolul trecut prin studiile lui Nicolae Cretzulescu (1839), Gh. Polizu, M. Obedenaru, Gh.Marinescu, V. Babeș, I. Cantacuzino. Trebuie amintită aici și contribuția școlii românești de Citofiziologie musculară la dezvoltarea Citologiei românești. În perioada interbelică, școala de Citologie de la Facultatea de Știine naturale din București este reprezentată cu strălucire de Dimitrie Voinov, Th. Dornescu, iar cea de la Cluj-Napoca de I. Scriban. Acești cercetători s-au impus prin studii și descoperiri legate de biologia componentelor celulare intracitoplasmatice și în special de biologia complexului Golgi.

Începând cu anul 1969, se reorganizează și la noi în țară învățământul superior și cercetarea științifică din domeniul bio-medical. Astfel, M. Ionescu-Varo inițiază la Facultatea de Biologie din București primele cursuri și lucrări practice de Biologie celulară, publicând în același timp și primul manual de profil din țară. În 1971, I. Dicul I. Diculescu publică prima monografie de Biologie celulară din literatura română de specialitate. Trebuie menționată contribuția adusă de către Laboratoarele de Microscopie electronică și Biologie celulară de la Universitatea Babeș Bolyiai din Cluj-Napoca, Institutele I. Cantacuzino, V. Babeș, L. Pateur, N. Simionescu, Biologie și Patologie Celulară și Oncologic din București. De asemenea trebuie menționate și Laboratoarele de Biologie celulară, Histologie și Morfo-patologie de pe lângă Facultățile de Medicină a Omului, Farmacie și Medicină Veterinară din Iași, București, Cluj-Napoca și Timișoara.

Rezultatele cercetărilor derulate în aceste laboratoare de către specialiștii din domeniul bio-medical sunt prezentate la Simpozioanele anuale naționale și internaționale de Biologie celulară și publicate în revistele de specialitate (http://ro.scribd.com/).

CAP.2. TEHNICI DE LUCRU ÎN BIOLOGIA CELULARĂ

2.1. Microscopul

Microscopul este un instrument optic de mare precizie, care, pentru a reda imagini mult mărite ale unor specimene sau obiecte mici, foloseste o lentilă sau o combinație de lentile– în special atunci când sunt prea mici pentru a le observa cu ochiul liber.

2.1.1. Tipuri de microscoape

Foarte multe microscoape intră în categoria microscoapelor cu iluminare (au nevoie de lumină pentru a reda o imagine mărită). în această categorie intră două tipuri de microscoape: microscoape biologice (de mare putere) și microscoapele stereo sau de disectie (de putere mai mica)

2.1.1.1.Microscopul biologic este cel mai comun tip de microscop. Mai este numit microscop de cercetare. Puterea de mărire variază între 40 si 1000 de ori dar poate merge până la 1500x sau 2000x. Cea mai importantă zonă folosită este cea între 400x-500x. În cazul acestui tip de microscoape, pentru a obține o imagine mărită, lumina are un traseu unic care trece printr-o serie de lentile – în linie (fiecare lentilă mărește imaginea deja marită de lentila care a precedat-o). Sistemul de lentile constă dintr-un obiectiv (cea mai apropiată lentilă de obiect sau specimen), un ocular (cea mai apropiată lentilă de ochiul observatorului), un mecanism de focusare a imaginii și unul de poziționare a specimenului sau obiectului. În plus, microscopul folosește lumina (reflectată de o oglindă, naturală, de la o altă sursă sau de la un iluminator încorporat) pentru a ilumina specimenul sau obiectul astfel încât acesta să poată fi vazut cu ochiul.

De obicei obiectivul este alcătuit din 3 sau 4 lentile (uneori chiar 5) montate pe un adaptor rotativ pentru obiective astfel încât puterea de mărire să poată fi modificată în funcție de obiectivul selectat. Imaginea produsă este bidimensională (2D) și este de obicei în oglindă și răsturnată. Cea mai folosită metodă de iluminare a specimenului este trans-iluminarea (lumina este proiectată de dedesubt și trece prin preparat).

La o mărire de 400x detaliile sunt la nivel celular în cazul specimenelor biologice. A învăța despre celule și micro-organisme este educațional și foarte important în domenii medicale sau științifice.

Fig.2.1..Microscopul biologic monocular 500 Celestron

2.1.1.2.Microscopul stereo este al doilea tip de microscop în ordinea popularității și mai este denumit microscop de disecție sau de inspecție.

Microscopul stereo este un instrument cu putere mică de mărire. Puterea de mărire poate varia între 10x si 80x – dar de obicei este situată între 10x si 40x. Modelele cu zoom sunt foarte convenabile având de obicei posibilitatea de a mări între 10x si 60x.

Puterile mici de mărire sunt folosite pentru a examina obiecte mai mari precum părți de insecte sau plante, roci sau fosile, timbre, plăci de PC, monede, suprafața diferitelor materiale etc. După caz, mai sunt studiate și lame cu preparate la aceste puteri mici de mărire.

În cazul microscoapelor stereo există două trasee separate ale luminii care produc o imagine tridimensională (3D) a obiectului sau specimenului. Obiectivul constă din două lentile, una langaalta, care corespund celor două trasee amintite mai sus.Parametrii design-ului unui microscop stereo limiteaza efectul 3D doar la puteri mici de mărire.

De obicei sistemul de lentile este alcătuit din obiective (lentilele mai apropiate de obiect sau preparat), oculare (lentilele mai apropiate de ochii observatorului), un mecanism de focusare și unul de poziționare a specimenului sau obiectului. În plus, un microscop folosește lumina (de la lămpi, lumina naturală, iluminator integrat) pentru a ilumina obiectul sau specimenul astfel încât acesta să poată fi observat.

Imaginile sunt corect orientate. Majoritatea microscoapelor stereo au iluminator încorporat sau atașabil, pentru a putea observa specimene de diferite forme sau culori(http://www.skywatcher.ro/).

2.2. Metode pentru examenul citologic în macroscopia fotonică

2.2.1. Metoda efectuării secțiunilor fine

Cu această metodă, din material biologic se obțin secțiuni fine de 3-5 microni. Aceasta se desfășoară în următoarele etape: recoltarea, fixarea, spălarea pieselor, includerea în parafină și deshidratarea.

2.2.1.1.Recoltarea

Recoltarea reprezintă unul din timpii cei mai dificili din tehnica de biologie celulară deoarece după sacrificarea animalului de experiență sau obținerea unui fragment de țesut sau organ prin biopsie sau alt act operator, cu maximum de operativitate trebuie să confecționăm o piesă de material biologic care sa conțină populația de celule necesară studiului.

Recoltarea se face pe o placă de plută sau de P.V.C. foarte curată; se folosesc pense fine fără dinți care se manipulează cu delicatețe pentru a nu strivi preparatul; în același scop, la fasonarea pieselor se folosesc lame de ras noi, degresate.

În cazul în care țesutul are o consistență moale (sistem nervos central, testicol) și fasonarea pieselor nu se poate face fără riscul strivirii lor, se preferă fixarea unor fragmente mai mari timp de 1-2 ore, perioadă în care structurile superficiale se întăresc și permit obținerea lor.

Piesele astfel recoltate trebuie să aibă fețele plane și paralele iar grosimea lor nu trebuie să depășească 1-4mm; aceasta facilitează pătrunderea mai rapidă a fixatorului și evită apariția alterărilor post-mortem.

2.2.1.2.Fixarea

Această operațiune de fixare are drept scop oprirea alterării structurii celulare după scoaterea din organismul viu a unui fragment de țesut conservând forma, structura și compoziția chimică a acestora precum și raporturile reciproce pe care le prezentau în timpul vieții.

Agenții fixatori se combină cu numeroase grupe funcționare ale moleculelor proteice (principalii constituienți celulari) formând macromolecule, insolubile în lichidele utilizate în tehnicile de includere.

Coagularea proteinelor de către agenții fixatori blochează reacțiile enzimatice care împiedică digestia autolitică a celulelor.

Un bun fixator citologic trebuie să întrunească următoarele calități:

Să pătrundă rapid în țesut;

Să producă o reacție cât mai mică a pieselor evitând modificarea taliei, formei și raporturilor dintre celule;

Să permită o bună includere la parafină.

Fixarea se realizează prin:

Agenți fizici -desicare ;

-criodesicare.

Agenți chimici -fixatori simpli;

-amestecuri fixatoare.

Pentru o bună fixare trebuie avute în vedere următoarele reguli generale:

Piesa trebuie să aibă dimensiuni reduse și să vină în contact pe întreaga suprafață cu fixatorul;

Fixarea se face în flacoane cu fund plat și cu dop rodat, permițând ca volumul fixatorului să fie de 40-50 ori mai mare decât cel al piesei;

Piesele se introduc în amestecul fixator ambalate în tifon și poartă un număr de ordine pentru identificare;

Agitarea pieselor din timp pentru a menține aceeași compoziție chimică a fixatorului cu care vin in contact;

Durata fixării variază în funcție de compoziția amestecului fixator, structura și dimensiunile pieselor, temperaturi; există o durată optimă pentru fiecare fixare;

Un fixator utilizat o dată nu mai poate fi folosit pentru fixarea altei piese.

2.2.1.3. Spălarea pieselor

Spălarea este operațiunea prin care se oprește fixarea și îndepărtează excesul de fixator și a unor eventuale structuri false care pot apărea în preparat datorită unor defecte de fixare (în cazul fixării prin lichide care conțin clorură mercurică pot să apară cristale negre, cele mai adesea au localizare extracelulară).

În funcție de fixatorul utilizat, spălarea se poate face cu :

-apă curgătoare în cazul pieselor fixate în formol; nu este indicată oprirea fixării prin apă în cazul utilizării amestecurilor fixatoare conținând trioxid de crom, bicromat de potasiu, tetraoxid de osmiu; o bună spălare cu apă curgătoare durează în medie 12-14 ore.

-alcool când fixatorul conține bicromat de potasiu;

-alcool absolut in cazul folosirii fixărilor pe bază de alcool – Carnoy;

-alcool iodat pentru spălarea pieselor fixate în sublimat.

2.2.1.4. Includerea în parafină

Această operațiune permite debitarea pieselor în secțiuni subțiri (3-5 microni grosime) ce pot fi examinate la microscopul fotonic; ea solidarizează structurile tisulare, păstrând în cursul secționării raporturile normale dintre acestea.

Includerea la parafină se realizează în următorii timpi: deshidratarea, clarificarea, impregnarea cu parafină, includerea propriu-zisă, secționarea, lipirea secțiunilor pe lamă.

2.2.1.4.1. Deshidratarea

Deshidratarea este o operație necesară pentru extragerea apei din piesă (apa nu este miscibilă cu parafina); în acest scop se utilizează alcoolul etilic, acetona, dioxanul.

Deshidratarea cu alcool etilic, cea mai utilizată, se realizează prin trecerea pieselor ambalate în saci de tifon prin băi cu alcooluri de concentrație crescută.Pentru cercetări de citologie se folosesc câte o baie de alcool de 50⁰,70⁰,80⁰,96⁰ și trei băi cu alcool absolut.

Pentru piese cu o grosime de 5 mm, durata deshidratării este de câteva ore (5-8ore). După utilizarea de fixatori anhidrici (Carney, Sanomya), deshidratarea se face în alcool absolut.

2.2.1.4.2.Clarificarea

Clarificarea sau impregnarea piesei cu un solvent al parafinei are drept scop înlocuirea agentului deshidratant (alcoolul) cu o substanță miscibilă, cu parafină.

Pentru clarificare, piesele corect deshidratate sunt trecute prin trei băi succesive de hidrocarburi benzenice (benzen, xilen) sau alcool amilic, durata optimă fiind de 5-8 ore pentru piese cu o grosime de 3-4 mm și de 30 minute-1oră pentru un fragment bioptic. La sfârșitul clarificării piesele devin translucide.

2.2.1.4.3. Impregnarea cu parafină

Se face într-un termostat la temperaturi de 56⁰C în interiorul căruia piesele sunt tratate prin trei băi succesive de parafină topită care se substituie agenților clasificanți. Parafina pentru impregnare conține 5-10% ceară de albine pentru a permite o mai bună secționare a țesutului inclus.

Durata optimă pentru o impregnare corectă variază în funcție de mărimea pieselor (în general 3-6 ore) și de ceea ce dorim să evidențiem (după Hrisch și Bretschneider, colorațiile mitocondriale corecte nu pot fi obținute dacă durata impregnării depășește 90 minute).

Utilizarea includerii sub vid scade mult durata impregnării.

2.2.1.4.4. Includerea propriu-zisă

Includerea propriu-zisă sau turnarea blocului constă în înglobarea pieselor bine impregnate într-un bloc de parafină solidificată, de consistență omogenă. Se toarnă parafină topită într-o formă realizată cu ajutorul barelor Leuchart (în formă de L) sau confecționate din hârtie sau staniol; cu o pensă încălzită se scoate piesa din ultima baie de parafină lichidă și se introduce în parafina turnată anterior, având grijă ca ea să fie orientată cu suprafața care se utilizează secționată spre fundul formei. Pentru identificarea diferitelor piese dintr-un bloc se utilizează în continuare aceleași cartonașe cu numere de ordine care le-au însoțit pe parcursul prelucrării lor, inclusiv în băile de parafină.

După răcirea și întărirea blocului includerea se consideră încheiată.

2.2.1.5.Secționarea

Prin secționare, care se face la microtomul de parafină, din blocurile turnate anterior se obțin secțiuni subțiri de 3-5 microni.

Înaintea secționării, blocul se va modela în formă de trunchi de piramidă patruunghiulară având grijă ca in jurul piesei să rămână o bandă de parafină de 1-2 mm grosime.

Astfel finisat, blocul se fixează cu baza mare pe un port obiect care se montează la microtom.

Microtoamele de parafină sunt tip rotator (Minot, Spencer,etc.) și sunt formate dintr-un mecanism de fixare a port-obiectului (cu blocul de parafină lipit), cuțitul, dispozitivul pentru avansarea piesei și șurubul micrometric cu ajutorul căreia se fixează grosimea secțiunii seriate.

Secțiunile obținute și care aderă una de alta se iau de pe cuțitul microtomului cu ajutorul unui penson și se întind pe o hartie neagră.

Fig.2.2. Microtom de parafină

2.2.1.6. Lipirea secțiunilor pe lamă

În vederea prelucrării lor ulterioare (colorare), secțiunile sunt aplicate pe un port-obiect (lama de sticlă cu dimensiunile de 76 / 26mm și grosimea de 1-1,5mm) bine degresat. Pe lama de sticlă se aplică o picătură de albumină Mayer (50g albuș de ou, 50g glicerină și 1g salicilat de sodiu dizolvat în apă distilată, amestec care se va filtra sub un clopot) sau o soluție apoasă de gelatină 0,1-0,2 % care se întinde bine cu ajutorul pulpei auricularului.

Din panglica de parafină se taie fragmente conținând 3-4 secțiuni pe care le aplicăm (cu fața lucioasă in jos) pe suprafața unsă cu albumină Mayer a lamei; picurăm apă distilată la una din extremitățile panglicii de parafină și înclinăm puțin lama pentru ca secțiunile să plutească, o așezăm orizontal pe o platină încălzitoare unde, în câteva secunde, parafina și secțiunile din ea se descrețesc și se întind complet (la nevoie, pentru întinderea completă a secțiunilor, se pot folosi 2 ace de disociere).

După întinderea completă, apa în exces se îndepărtează de pe lamele puse la înclinat pe un stativ de lemn, se introduc într-un termostat la 37⁰C, unde timp de 24 ore se desăvârșește uscarea și lipirea secțiunilor.

2.2.2. Metoda secționării la gheață

Cu ajutorul microtomului de congelare și a criotomului se pot obține preparate permanente sau temporare făcându-se secțiuni de țesut fixat.

2.2.2.1.Tehnica secționării la microtomul de congelare

Microtomul de congelare funcționează pe același principiu general ca și cel de parafină cu deosebirea că portobiectul este fix iar cuțitul este mobil; de asemenea, portobiectul prevăzut cu orificii la bază, este racordat printr-o condctă capilară la o butelie metalică în care se găsește anhidridă carbonică lichidă sub presiune.

Pe portobiectul microtomului se aplică o rondelă de hârtie de filtru bine îmbibată în apă.

Piesele fasonate din țesutul sau organul proaspăt, nefixat sau fixat, se așează pe rondele de hârtie de filtru umezită. Se confecționează piese cu o grosime de 0,5-0,8 cm.cu fețele plane și paralele.

Se acoperă piesa și portobiectul cu un pahar de sticlă sau plastic transparent, se deschide cu intermitență robinetul buteliei și prin detența vaporilor de anhidridă carbonică se produce înghețarea și aderarea piesei de port-obiect.

Prin intermediul șurubului micrometric se ridică port-obiectul până când piesa ajunge aproape de cuțitul microtomului care are o poziție orizontală. După fixarea grosimii, prin miscări rapide și complete ale suportului de cuțit, se obțin secțiuni de 10-15 microni; acestea se culeg cu pulpa degetului sau cu o pensulă umedă printr-o mișcare de la bază spre tăișul cuțitului și se pun într-un cristalizator cu apa distilată unde se dezgheață și se întind.

Lamele port-obiect, după ce au fost acoperite cu un strat de albumină Mayer, se lasă sa se usuce 15-30 minute la temperatura camerei. Se introduc apoi oblic în vasul cu apă distilată și cu ajutorul unei baghete de sticlă în formă de L secțiunile se pescuiesc pe lame.

Se elimină excesul de apă prin presare ușoară cu o hârtie de filtru și se colorează rapid.

La ora actuala tehnica secționării la gheață se folosește doar pentru lucrări de rutină. Pentru cercetările citologice de finețe se utilizează tehnicile de secționare la criotom.

2.2.2.2.Tehnica secționării la criotom

Această metodă se deosebește de precedenta doar prin faptul că la acest aparat secționarea nu este influențată de temperatura mediului ambiant iar cuțitul și piesa sunt menținute la o temperatură constantă de -12°C – 30°C.

Aparatul este compus dintr-un microtom asemănător cu cel de parafină amplasat într-o incintă izotermă răcită prin intermediul unui agregat frigorific cu freon.

Fig.2.3. Criotomul

2.2.2.3. Tehnica de lucru cu criotomul

Fragmentul de țesut sau de organ nefixat așezat pe o rondea de hârtie de filtru bine umezită este plasat pe portobiectul criotomului.

-portobiectul cu piesa, așezată vertical pe un suport metalic, sunt introduse într-un recipient special care conține un lichid refrigerent (azot lichid- la temperatura -196° C);

-introducerea portobiectului cu piesa congelată în suportul criotomului aflat în camera izotermă și secționarea la grosimi de 5-10 μ;

-secțiunile care rămân întinse pe cuțit se aplică pe lama portobiect prin simplul contact.

CAPITOLUL 3

COLORAREA ȘI COLORANȚII ÎN CITOLOGIE

Colorarea este o etapă obligatorie în studiile de biologie celulară, deoarece colorează și fac vizibile structurile celulare la microscopul fotonic. Ea se realizează cu ajutorul coloranților citologici.

3.1. Coloranții

Coloranții citologici sunt în mod obișnuit produși de natură organică capabili să coloreze selectiv o substanță sau un grup de substanțe dintr-o celulă, conferindu-le culori specifice.

Pentru îndeplinirea acestui deziderat coloranții trebuie să posede :

-grupări atomice speciale sau purtătoare de culoare numite cromofore;

-grupări auxocrome care permit fixarea colorantului pe substanța de colorat din celulă.

Grupările auxocromice determină calitatea de colorant a substanței care posedă grupări cromofore (G.Dumitru, 1975).

3.1.1.Clasificarea coloranților

Coloranții utilizați în citologie pot fi clasificați după mai multe criterii:

a) După origine se disting următoarele tipuri de coloranți:

-coloranți naturali, de origine vegetală (hematoxilina, safranina) sau de origine animală (carminul);

-coloranți sintetici (albastrul de metil, etc.)

b) După comportamentul în soluție se întâlnesc următoarele tipuri de coloranți:

– coloranți acizi sau anionici în care auxocromii sunt reprezentați de anioni: hidroxil, sulfonii, carboxil, etc.și care se atașează de structurile subcelulare încărcate pozitiv (coloranți citoplasmatici: eozina , verdele lumină, etc.);

– coloranți bazici sau cationici în care auxocromii sunt reprezentați în special de gruparea NH3 și se atașează de structurile subcelulare încărcate negativ; ( coloranți nucleari (albastrul de toluidină, etc.)

– coloranți neutri, rezultă din amestecul în anumite proporții a unui colorant bazic cu unul acid; colorează unele incluziuni citoplasmatice cu reacție neutră (eozinatul de azur de metilen, eozinatul de albastru de metilen, etc.).

3.1.2. Principalele metode de colorare

Metodele de colorare se clasifică după următoarele criterii:

a) Numărul coloranților utilizați:

-colorări simple, când se folosește un singur colorant, fie nuclear, fie citoplasmatic;

-colorări combinate, când secțiunile se colorează succesiv cu doi sau mai mulți coloranți. .

b) Utilizarea unor adjuvanți :

-colorarea directă: colorantul se fixează prin simplu contact cu secțiunea;

-colorarea indirectă sau prin mordansare – necesită prezența unui mediator sau mordant (alaunurile, iodul, sărurile de fier, etv.) care fixează colorantul de componentele celulare; combinația dintre colorant și mordant se numește lac (C. Cotrutz și colab., 1989).

Partea a II-a

CONTRIBUȚII PROPRII

CAPITOLUL 4

OBIECTIVELE STUDIULUI

Obiectivele acestei lucrări de diplomă sunt:

-evidențierea necesității cunoașterii metodelor de cercetare și studiere a celulelor in domeniul Biologiei celulare prin prezentarea concretă a materialelor și tehnicilor de studiu în acest domeniu ;

-realizarea unor frotiuri prin metoda amprentelor pe o probă de ficat de pasăre;

-realizarea frotiurilor de sânge de la două specii diferite de animale (mamifer și pasăre);

-observarea la microscop a frotiurilor realizate din sânge de mamifer;

-observarea la microscop a frotiurilor realizate din sânge de pasăre;

-observarea la microscop a amprentelor realizate din ficat de pasăre;

-evidențierea diferențelor dintre rezultatele obținute la cele două categorii de cellule;

-măsurarea cu ajutorul micrometrului a globulelor roșii de la mamifer.

CAPITOLUL 5

DESCRIEREA UNITĂȚII DE LUCRU

Laboratorul de Biologie celulară din cadrul Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară, Facultatea de Zootehnie este laboratorul unde studenții din cadrul acestei instituții își desfășoară activitatea de studiu la disciplina de Biologie celeluară.

Pentru înțelegerea și aplicarea acestei discipline de către studenți laboratorul este dotat cu: microscoape optice și instrumentar de laborator (sticlărie de laborator, stative, cleme, arzător de gaz, suporturi pentru eprubete, foarfece, clești, spatula, hârtie de filtru).

Microscopul optic este un aparat optic de mărit care utilizează ca sursă de radiație fotonul (lumina albă). Calitatea cea mai de preț a unui microscop este puterea de separare sau rezoluția aparatului (cea mai mică distanță la care două puncte pot fi văzute distinct).

Aparatul optic dă o imagine inversată și mult mărită, virtuală sau reală a obiectelor prelucrate după tehnica cito-histologică. Examinarea se face prin transparență, preparatul histologic fiind străbătut de un flux fotonic dirijat. Structurile au diferite densități și determină apariția unor fenomene de refracție și difracție a fluxului fotonic care stau la baza reconstruirii imaginii de către sistemul optic al microscopului.

La formarea imaginii intervin:

-fluxul fotonic (sursa de lumină );

-preparatul;

-obiectivul;

-ocularul;

-ochiul observatorului.

Caracteristicile specifice microscopului optic sunt:

-utilizează o sursă fotonică;

-examinarea se efectuează prin transparență;

-ordinul de mărire al microscopului optic ce utilizează lumina albă este cuprins între 2000- 3000 X;

-acest domeniu poate fi extins până la 7000 X; utilizează ca și sursă fotonică o sursă de lumină cu spectrul în ultraviolet.

Fig.5.1. Microscopul biologic Optika

Parțile componente ale microscopului biologic Optika

Obiectivele

Obiectivele sunt cele mai importante componente ale microscopului. Principala funcție a lor este de a aduna lumina care trece prin specimen și apoi să proiecteze imaginea în corpul microscopului. Mai departe ocularul transmite imaginea la ochiul observatorului.Microscoapele de calitate folosesc obiective din sticlă, nu din plastic.Obiectivele sunt lentilele cele mai apropiate de specimen sau obiect.

Pe obiectivele microscoapelor biologice sunt trecute următoarele informații: puterea, lungimea tubului, N.A. (apertura numerică) grosimea optimă a lamelei (sticlei de protecție), un inel în culoarea specifică puterii de mărire.

Fig. 5.2. Obiective de microscop biologic

Ocularele

Ocularele sunt formate dintr-o serie de lentile montate într-un tub și se poziționează în partea superioară a unui microscop. Funcția principalăa ocularelor este acela de a permite utilizatorului să vadă imaginea focusată, proiectată de obiectiv și să mărească pentru a doua oară această imagine. Ca și în cazul obiectivelor, ocularele construite din plastic asigură o calitate scăzută. Ocularele pot fi de diferite design-uri: Huygens, Ramsden, Kellner, Plossl, etc. și toate sunt potrivite pentru microscoape, diferențele fiind mult mai puține ca în cazul ocularelor folosite la telescoapele astronomice.

Ocularele sunt de obicei de 10x dar există și oculare 5x, 12.5x, 15x si 20x. “x” se referă la puterea de multiplicare a măririi pe care o are obiectivul. Pe oculare sunt înscrise puterea de mărire și diametrul aperturii. Apertura este cea care limitează câmpul vizual.

Fig 5.3. Oculare de microscop biologic

Condensatorul

O lentilă sau un sistem de lentile care se află sub platforma microscoapelor biologice. Functia condensatorului este de a aduna lumina ambientală și de a o concentra într-un con de lumină înspre specimen. Obiectivele puternice au diametre foarte mici și au nevoie de o lumină corespunzatoare.Un condensator clasic este de obicei fixat. Un condensator care se mișcă și este mult mai precis (dar și mai scump) este condensatorul Abbe. Acesta poate fi deplasat de obicei pe verticală, reglându-se cantitatea de lumină transmisă. Se montează sub platformă și are de obicei o apertură de tip iris, ajustabilă pentru a controla diametrul razei de lumină care intră în sistemul de lentile. Condensatorul este foarte util când se folosesc puteri de măriri de 400x sau mai mari.

Diafragma

De obicei se găsește sub platforma microscopului și ajustează cantitatea de lumină care trece spre specimen. Folosește la puteri mari de mărire. Majoritatea microscoapelor biologice au unul din cele două tipuri de diafragme:

Diafragma disc – Este localizată între sursa de lumină și lamă sau specimen. Constă dintr-un disc rotativ și 5-10 orificii de diferite diametre care pot limita cantitatea de lumină care trece.

Diafragma iris – un tip de diafragma mai simplu și mai scump. Au un diametru variabil (precum irisul unui ochi) care are rolul de a limita diametrul orificiului prin care trece lumina. Se poate astfel optimiza rezoluția, contrastul, claritatea. De obicei se controleaza cu ajutorul unei mici manete.

Sistemul de iluminare (sursa de lumina)

Iluminarea este aplicarea de lumină pe specimen sau obiect. Iluminatorul este sursa de lumină care iluminează obiectul sau specimenul pentru a putea fi observat. Iluminarea trebuie sa fie fără reflexii nedorite și uniformă.

Iluminatorul încorporat (sau atașat) asigură iluminarea directă și intensă.Iluminatoarele se află deasupra specimenului atunci când sunt folosite puteri mici de mărire (microscoape stereo) si se numește iluminare incidentă. Daca iluminatorul se află sub specimen atunci este vorba despre transiluminare. Iluminarea care se face atât de deasupra cât și de dedesubt este destinată specimenelor subțiri care prezintă iregularităti pe suprafață. Iluminatoarele pot avea lumina cu intensitate fixă sau variabilă (în acest ultim caz au un buton de reglare a intensității).

Sisteme de focalizare

Sunt folosite pentru focalizarea imaginii privite. Fiecare microscop deține un buton (rotiță) pentru focus rapid (de cursă). Mecanismele de focusare folosite într-un microscop constau dintr-o tijă cu pinion. Acesta este un design care folosește o roată dințată și o tijă dedicată. Tija reprezintă o cale cu dinți iar pinionul are o cursă pe această tijă. Rotind butonul, pinionul se miscă de-a lungul tijei.

Capul (corpul)

Capul este partea superioară a microscopului care conectează ocularul de adaptorul pentru obiective. Capul poate fi rotit 360 de grade, astfel încât doi sau mai mulți observatori să poată vedea specimenul fără a fi nevoie să se deplaseze sau să rotească întreg microscopul.

Adaptorul de obiective.

Adaptorul de obiective este rotativ și se află deasupra platformei microscoapelor biologice și poate susține mai multe obiective, cu puteri diferite de mărire. Rotind obiectivele și plasându-le pe traseul luminii și deasupra specimenelor puteți vedea specimenele la diferite puteri de mărire.Când se rotesc, obiectivele vor face clic în momentul în care ajung în poziția corespunzătoare pentru observații.

Brațul

Este acea parte a microscopului care include mecanismul de focusare și pe care este montată platforma. Brațul oferă rigiditate microscopului, pornind de la bază.  Atunci când se vrea să se miște microscopul trebuie ținut cu o mână de braț și cu cealaltă de sub bază.

Baza

Baza este suportul inferior al microscopului. Oferă echilibru, stabilitate și rigiditate. Găzduiește componentele electrice necesare iluminării.

Tuburile pentru oculare

Mai sunt numite tuburi de observație.Sunt atașate brațului, deasupra adaptorului pentru obiective. Sunt poziționate la 30 de grade sau 45 de grade pentru a asigura observații comfortabile. În capăt, au o lentilă specială, numită lentila tubului. Lungimea tubului are mărime fixă care echivalează cu distanța dintre capătul obiectivului și punctul în care se formează imaginea focusată. Această distanță este hotărâtoare în ceea ce privește posibilitatea de a schimba componentele optice.

Lentila tubului

La capătul tubului pentru oculare se află o lentilă numită lentila tubului. Funcția sa este de a aduna razele paralele de lumină proiectate de obiective și de a le concentra în planul diafragmei ocularului.

Platforma.

Este situată sub obiective și pe ea sunt așezate specimenele sau obiectele pe care doriți să le observați. Au o suprafață fină, plană care poate fi circulară sau rectangulară. La cele mai multe microscoape biologice platforma se mișcă sus-jos în timp ce adaptorul pentru obiective este fix. Platforma are un orificiu care permite trecerea luminii.

Fig.5.4. Platformă mecanică de microscop biologic

CAPITOLUL 6

6.1. INTRODUCERE ÎN TEMA LUCRĂRII PRACTICE

Țesutul sangvin este singurul țesut „lichid” din organismul animal, care circulă printr-un sistem închis de vase. Are origine mezenchimală comună cu a țesuturilor conjunctive, dar față de care prezintă o serie de particularități. Este alcătuit din:

– substanță fundamentală;

– elemente celulare structurale (sau figurate).

Substanța fundamentală este denumită plasmă și nu are o structură histologică. Este lichidă, circulă printr-un sistem conductor și permite elementelor structurale să se deplaseze în interiorul acestora. Are constituția unei soluții de cristaloizi și coloizi în care sunt suspendate celule și fragmente citoplasmatice.

La mamifere și păsări, celulele sanguine sunt de 2 tipuri: roșii și albe iar fragmentele citoplasmatice se numesc plachete sanguine. La mamifere și om hematiile sunt anucleate. La păsări, toate celulele sanguine sunt nucleate.

Cele 2 categorii de celule sanguine (roșii și/sau albe) au preluat denumirea de la aspectul pe care îl au în sângele proaspăt (globulele roșii sau hematii la mamifere și/sau eritrocite la păsări; globulele albe sau leucocite, la ambele clase de vertebrate).

♦ Globulele roșii (hematiile și/sau eritrocitele) sunt elementele sanguine a căror denumire provine de la gr. „ eritros „-roșu. Studiate la microscopul optic din profil au forma unui disc biconcav cu marginile rotunjite; privite din față au formă circulară, cu partea centrală mai clară („pierderea„ nucleului de aceste celule este considerată o adaptare, prin diferențiere extremă, la funcția de a umple complet, citoplasma, cu hemoglobină) (forma discoidală este ideală pentru absorbția și schimbul de gaze, iar marginile netede permit rostogolirea prin lumenul intern al capilarelor). Durata de viață a hematiilor (la mamifere) este de 90-120 de zile.

Biochimic, hematiile sunt alcătuite dintr-un complex coloidal (60 % apă și 40 % proteine) și o heteroproteidă-hemoglobina (obținută din holoproteida-globina și pigmentul –hem). Hemoglobina are proprietatea de a se combina (reversibil) cu oxigenul transformându-se în oxihemoglobină (la nivelul pulmonului unde concentrația de O2 din aerul inspirat este mare) (sângele oxigenat este răspândit în țesuturi prin sistemul circulator). Concomitent, hemoglobina participă la transportul CO2 sub formă de carboxihemogloină de la țesuturi spre pulmoni.

6.2. Materiale și metode de lucru

S-a urmărit în lucrarea practică diferențierea dintre două tipuri de globule roșii respectiv de la mamifere (numite hematii) și păsări (numite eritrocite) prin două probe de laborator prezentate în partea I a acestei lucrări și anume: proba frotiului de sânge și proba amprentelor.

6.2.1. Instrumentar de lucru:

-materialul biologic- reprezentat de sânge proaspăt și ficat de pasăre;

-seringi;

-recipiente pentru sânge;

-mănuși chirurgicale;

-tăvițe;

-lame;

-tampoane de tifon;

-alcool metilic;

-apă bidistilată;

-soluție colorantă May-Grünwald și Giemsa;

-ulei de cedru;

-pipetă;

Figura 6.1. Instrumentar necesar amprentării

6.2.2. Metoda frotiului cu sânge

Frotiul este un preparat microscopic care serealizează prin etalarea materialului biologic înmonostrat pe lame portobiect. Aceste preparatese efectuează din sânge, din secreții (mamare, bronșice, vaginale), din celule provenite dindescuamări epiteliale sau exfoliere și sedimente celulare (urină, suc gastric, bilă, LCR,lichid de ascită sau lichid pleural). Indiferent dematerialul biologic utilizat, tehnica frotiului este des utilizată în citologie, devenindprioritară atât în domeniul cercetării biologice câtși ca procedeu diagnostic în practica medicală.

Examinarea atenta a frotiului de sânge bine efectuat este o parte importantă a evaluării bolilor hematologice. Deși un diagnostic specific poate fi sugerat de datele furnizate de hemograma automată, unele boli pot avea un număr normal de celule, dar morfologie celulară anormală. Frotiul de sânge constituie un mijloc valoros în diagnosticul și evaluarea anemiei, anomaliilor eritrocitare ereditare, infecțiilor, inflamațiilor, leucemiilor și altor boli limfo- și mieloproliferative etc. Semnificașie clinica: I. Aprecierea eritrocitelor pe frotiu: eritrocitele sunt evaluate pentru variașii de mărime, formă, distribuția hemoglobinei și prezenșa de incluzii intracelulare. Examinarea optimă a morfologiei eritrocitare se face într-o arie a frotiului în care hematiile sunt așezate una langăalta, dar nu se suprapun. În mod normal eritrocitele apar de forma rotundă, anucleate, uniforme ca mărime și formă, cu un diametru mediu de 7-8 microni.

Efectuarea preparatului pentru examenul citologic al frotiului sanguin presupune etalarea unei picături de sânge pe o lamă de sticlă și colorarea frotiului astfel încât să poată fi examinat la microscopul optic. Acesta poate fi colorat May-Grünwald-Giemsa sau folosind colorația rapidă.

Metoda de lucru presupune parcurgerea următoarelor etape: prelevarea probelor, ambalarea probelor, identificarea probelor, transportul probelor, realizarea frotiului propriu-zis.

6.2.2.1. Prelevarea probelor

Pentru prelevarea probelor destinate analizelor biochimice se utilizează instrumentar și recipiente confecționate din materiale care, în contact cu probele, nu trebuie să intre în combinații chimice.

Prelevarea probelor de sânge se realizează în următorii pași:

a) Probele de sânge se prelevă prin puncționarea marilor vene, după o prealabilă pregătire a locului de selecție.

b) Se recomandă ca prelevarea probelor de sânge să se realizeze înainte ca animalul să își consume rația alimentară.

c) Timpul scurs de la executarea stazei până la prelevare este de cel mult două minute, deoarece se produc hemoliză și o hemoconcentrație progresivă.

e) Tot pentru a evita hemoliza, sângele este prelevat în eprubete de unică folosință.

6.2.2.2. Ambalarea probelor

1. Pentru a evita contaminarea probelor se utilizează tuburi sau fiole de unică folosință, cu dop etanș. În nici un caz nu se folosesc eprubete cu dopuri de vată sau tifon.

2. Recipientele trebuie să fie închise ermetic pentru reducerea riscului evaporării sau contaminării probelor.

6.2.2.3. Identificarea probelor

1. Sângele este individualizat prin etichetarea tubului.

2. Probele sunt identificate cu numerele care se regăsesc și pe nota de însoțire a probelor și în tabelul însoțitor.

6.2.2.4.Transportul probelor

Probele sunt transportate la laborator în cel mai scurt timp.În general nu există restricții speciale în această privință.

6.2.2.5. Realizarea frotiului cu sânge

Se prelevează o picătură de sânge cu marginea mică a unei lame rodate și se aplică pe una din extremitățile unei lame portobiect, așezată orizontal pe o suprafață plană. Se realizează câteva mișcări de lateralitate pentru ca sângele să se întindă pe toată linia de contact dintre cele două lame care prin alunecare ușoară întinde sângele pe toată lungimea orizontală. Preparatul trebuie să aibă marginile regulate și să nu fie groasă și întreruptă. Se recomandă ca unghiul realizat între cele două lame să fie de 30-35°.Un frotiu bine executat trebuie să fie subțire , să nu acopere toată lama, să aibă două margini laterale și să se termine în franjuri.

Figura 6.2. Tehnica efectuării frotiului sangvin

Figura 6.3. Frotiu înainte de colorare

Urmează fixarea frotiului care se realizează prin tehnica de colorare panoptică May-Grünwald Giemsa.

Colorarea May-Grünwald Giemsa oferă detalii complete pentru studiile de hematologie, folosind eozina și albastru de metilen.

Pe lamele așezate cu frotiul în sus se etalează 10-15 picături din soluția May-Grünwald pentru a acoperi toată suprafața frotiului. Se lasă 2-3 minute, timp în care se produce o fixare a frotiului. Alcoolul metilic din colorantul May-Grünwald acționează ca un fixator.

Peste soluția May-Grünwald se adaugă un număr de picături de apă bidistilată identic cu cel al colorantului. Se agită ușor pentru omogenizare. Se ține un minut.

Se îndepărtează amestecul de colorant de pe lamă și fără spălare, se acoperă lamele cu soluția Giemsa diluată (15 picături soluție Giemsa la 10 ml apă distilată) timp de 30-35 minute.

Se îndepărtează soluția Giemsa și apoi se spală preparatele sub jet de apă la robinet. Dosul lamei se șterge cu un tampon de tifon înmuiat în alcool metilic sau etilic.

Lamele corect colorate sunt ușor translucide și de culoare roz, cu o foarte ușoară tentă violacee.

Figura 6.4. Frotiuri în timpul colorării

6.3. Realizarea frotiului prin metoda amprentelor

În vederea realizării frotiului prin metoda amprentelor este necesar în primul obținerea unui organ de la animalul de experiență. Organul folosit pentru această metodă este ficatul de pasăre.

Mod de lucru:

Într-o primă etapă operatorul își pune mănușile chirurgicale (pentru a nu contamina proba), apoi într-o tăviță de lucru se pune ficatul de pasăre, se cauterizează locul de unde se va preleva proba (în vederea sterilizării locului respectiv) și se taie cu bisturiul o bucățică de ficat se cuprinde între degete și ușor se așează și se apasă cu proba pe lamă în vederea amprentării.

A doua etapă este reprezentată de colorarea lamei cu amprente folosind aceeași metodă ca și în cazul frotiului de sânge.

Figura 6.5. Executarea amprentării

Figura 6.6. Frotiu realizat prin amprentare cu ficat

Figura 6.7. Celule hepatice văzute la microscop

CAPITOLUL 7

REZULTATE OBȚINUTE

7.1. Examinarea la microscop a diferențelor celulelor la cele două specii de animale

La examinarea la microscop, în cazul celor două specii de animale (mamifer și pasăre) legat se observă:

La mamifer- hematiile au formă de discuri rotunde sau ușor ovale cu centrul de culoare mai deschisă și periferia mai intens colorată în galben. Acest aspect se datorează variației grosimii hematiilor care sunt mai groase la periferie – 2, 5 µ- și mai subțiri în centru – 1, 5 µ. Diametrul unei hematii este de aprox. 7, 5 µ. Lipsa nucleului permite o încărcare mai mare cu hemoglobină.

Figura 7.1. Hematii de ponei văzute la microscop

La pasăre- globulele roșii sunt celule de formă eliptică mai mari decât la mamifere și nucleate cu nucleul dispus central .

Figura 7.2. Eritrocite de porumbel pe frotiu de sânge văzute la microscop

7.2. Măsurarea globulelor roșii de mamifer cu ajutorul micrometrului

Diametrul globulelor roșii la mamifere este de aproximativ 7,5 μm cu o grosime centrală de 1μm și la periferie de 2,2 μm. Măsurarea globulelor roșii este posibilă cu ajutorul micrometrului.

Micrometrul este un instrument gradat atașat ocularului unui microscop pentru a măsura dimensiunile obiectelor observate.

Figura 7.3. Micrometru

Materiale necesare pentru măsurarea hematiilor:

-microscop optic;

-frotiu de sânge;

-micrometru ocular (mOc), micrometru obiectiv (mOb).

Tehnica de lucru presupune parcurgerea următoarelor etape:

A. Obținerea unei imagini clare cu ajutorul microscopului optic:

1. Lama cu preparatul biologic se fixează pe platina microscopului (partea cu preparatul biologic îndreptată către obiectiv)

2. Se selectează obiectivul cu puterea de mărire cea mai mică – ex: 4x, 10x

3. Cu ajutorul macrovizei – privind din lateral (nu prin ocular) – se apropie obiectivul mic de lamă cu preparatul biologic până la distanța minimă. Există o distanță minimă de siguranță între obiectivul 4x și lamă, care nu permite spargerea lamei.

4. Cu ajutorul microvizei – privind prin oculare – se ridică încet obiectivul până când se obține o imagine clară.

5. Obiectivul 4x poate fi înlocuit cu un obiectiv cu putere mai mare – ex: 40x. În momentul rotirii obiectivelor nu se atinge preparatul!

6. Din acest moment ajustarea clarității imaginii se efectuează doar folosind microviza. Utilizarea macrovizei conduce la spargerea lamei cu preparatul biologic!

7. Privind prin oculare – se deplasează condensorul cu diafragma complet deschisă până când marginile luminoase coincid cu marginile imaginii obiectivului; se manevrează diafragma condensorului până când marginile câmpului apar nete.

B. Măsurarea diametrului unei hematii:

1. Se identifică micrometrul ocular privind prin ocularele microscopului

2. Se fixează pe platina microscopului frotiul de sânge (partea cu frotiul îndreptată către obiectiv)

3. Se repetă etapele: 2 – 7 de la tehnica anterioară în scopul obținerii unei imagini clare a hematiilor (hematiile sunt roz datorită eozinei din colorația May-Grünwald- Giemsa).

4. Se măsoară diametrul a opthematii în funcție de scala mOc, iar rezultatele se trec într-un tabel (hematiile sunt măsurate în diviziuni mOc).

5. Se calculează valoarea medie a diametrului unei hematii și se calculează eroarea medie.

6. Se îndepărtează frotiul de pe platina microscopului.

7. Se fixează mOb pe platina microscopului (partea cu grila îndreptată către obiectiv)

8. Se repetă etapele: 2 – 7 de la tehnica anterioara în scopul obținerii unei imagini clare a scalei mOb.

9. Se rotește tubul ocular și se deplasează platina microscopului astfel încât scala ocular să se suprapună peste scala obiectiv.

10. Se selectează două repere unde diviziunile celor două scale se suprapun (cu cât numărul de diviziuni ales pe scala obiectiv este mai mare cu atat erorile de măsurare sunt mai mici).

11. Se numără diviziunile de pe scala mOc cuprinse între cele două repere.

12. Se numără intervalele dintre două diviziuni ale scalei mOb cuprinse între cele două repere.

13. Prin regula de trei simplu se calculează diametrul unei hematii în funcție de numărul de intervale ale mOb care corespund diviziunilor mOc; distanța dintre două diviziuni ale mOb este de 0.01 mm = 10 µm (lungimea scalei mOb = 1mm; 100 div; 1mm/100div – distanța dintre două diviziuni = 0.01 mm).

Ex:

Diametrul unei hematii calculat cu scala mOc = 8,4 ± 0,7 div mOc (n = 9)

70 div mOc ––––- 6 intervale mOb (6 x 10 µm = 60 µm)

8,4 div mOc –––– x

x = 7,2 µm

70 div mOc ––––- 6 intervale mOb (60 µm)

0,7 div mOc –––– y

y = 0,6 µm

Diametrul unei hematii = 7,1 ± 0,6 µm (n = 9)

În urma examinării la microscopul cu micrometru a globulelor roșii de mamifer (ponei) am obținut următoarele rezultate:

Tabel 7.1. Diametrul hematiilor de mamifer

CONCLUZII

Concluziile ce se desprind din activitatea de laborator desfășurată sunt:

-microscopul este un instrument utilizat încă din secolul XVI și fără de care biologia celulară fie ea umană, animală sau vegetală nu ar fi existat la nivelul avansat în care se află la momentul actual; de asemenea toate instrumentele de laborator prezintă o deosebită importanță în avansarea studierii biologiei celulare;

-tehnicile de biologie celulară au ajutat la descoperirea lumii ce nu se vede cu ochiul liber și ce prezintă o importanță deosebită în cunoașterea și înțelegerea funcționării oricărui tip de organism fie el uman, animal sau vegetal;

-tehnica frotiului de sânge este extrem de importantă în depistarea rapidă a microorganismelor și în studiul morfologiei necesare unui diagnostic microbiologic;Frotiul de sânge constituie un mijloc valoros în diagnosticul și evaluarea anemiei, anomaliilor eritrocitare ereditare, infecțiilor, inflamațiilor, leucemiilor și altor boli limfo- și mieloproliferative etc.;

-tehnica frotiului realizat prin amprentare este eficientă pentru punerea în evidență a agenților infecțioși fără a recolta sânge (bacterii, paraziti, dermatofiti etc);

-tehnica colorării prezintă de asemenea o deosebită importanță întrucâtpreparatele colorate prezintă avantajul că sunt sterilizate prin fixare, sunt ușor de manipulat și de examinat și pot fi păstrate mult timp. Aceste preparate permit diferențierea bacteriilor după afinitatea lor pentru anumiti coloranți și pot evidenția unele elemente structurale (cili, capsula, spori, granulații, etc.) prin colorații speciale.

BIBLIOGRAFIE

Avram N., 1980. Citologie normală și patologică la animale, Editura Ceres, București;

Benga Gh. 1985. Biologie Celulară și Moleculară, Editura Dacia, Cluj-Napoca;

Cotrutz C., 1989. Biologie celulară, Institutul de medicină și farmacie, Iași;

Cruce M.2002, Biologie Celulară și moleculară, Ed. Aius Craiova;

Cheșcă A., Tilinca M-C.,2009. Biologie celulară și moleculară, Editura Universității Transilvania, Brașov;

Diculescu I. și colab.1983. Biologie celulară, Editura D. P. București;

Dumitru G. 1975. Elemente de Biologie celulară partea I, Universitatea ‘’Alexandru I. Cuza’’, Iași;

Frasinel N. , Verdes D. 1994. Biologie Celulara și Moleculară, Editura Mirton, Timișoara;

Ionescu –Varo M., 1979. Biologie celulară, Editura Didactică și pedagigică, București;

Mixich F., Ardelean A. 2002., Principii fundamentale de biologie moleculara, Ed. Med. Univ. Craiova;

Neacșu I., Cîmpeanu C.S., 2000. Elemente de biofizică și biologie celulară, Editura Cerim, Iași;

Pollard T.,Earnshaw W. 2002. Cell biology;

Teușan V., 2000. Biologie celulară animală, ‘’Editura Ion Ionescu de la Brad’’, Iași;

Teușan V. și colab.,2007. Biologie celulară și animală, Editura Alfa, Iași;

Miclăuș V., 2010. Biologie celulară și histologie generală, Risoprint, Cluj-Napoca;

Vâlcu AL., 1977. Eritrocitul, Editura Medicală, București;

Referințe electronice:

http://ro.wikipedia.org/;

http://ro.scribd.com/;

http://optik.uv.ro/photo.html

http://www.skywatcher.ro/

BIBLIOGRAFIE

Avram N., 1980. Citologie normală și patologică la animale, Editura Ceres, București;

Benga Gh. 1985. Biologie Celulară și Moleculară, Editura Dacia, Cluj-Napoca;

Cotrutz C., 1989. Biologie celulară, Institutul de medicină și farmacie, Iași;

Cruce M.2002, Biologie Celulară și moleculară, Ed. Aius Craiova;

Cheșcă A., Tilinca M-C.,2009. Biologie celulară și moleculară, Editura Universității Transilvania, Brașov;

Diculescu I. și colab.1983. Biologie celulară, Editura D. P. București;

Dumitru G. 1975. Elemente de Biologie celulară partea I, Universitatea ‘’Alexandru I. Cuza’’, Iași;

Frasinel N. , Verdes D. 1994. Biologie Celulara și Moleculară, Editura Mirton, Timișoara;

Ionescu –Varo M., 1979. Biologie celulară, Editura Didactică și pedagigică, București;

Mixich F., Ardelean A. 2002., Principii fundamentale de biologie moleculara, Ed. Med. Univ. Craiova;

Neacșu I., Cîmpeanu C.S., 2000. Elemente de biofizică și biologie celulară, Editura Cerim, Iași;

Pollard T.,Earnshaw W. 2002. Cell biology;

Teușan V., 2000. Biologie celulară animală, ‘’Editura Ion Ionescu de la Brad’’, Iași;

Teușan V. și colab.,2007. Biologie celulară și animală, Editura Alfa, Iași;

Miclăuș V., 2010. Biologie celulară și histologie generală, Risoprint, Cluj-Napoca;

Vâlcu AL., 1977. Eritrocitul, Editura Medicală, București;

Referințe electronice:

http://ro.wikipedia.org/;

http://ro.scribd.com/;

http://optik.uv.ro/photo.html

http://www.skywatcher.ro/