Microsporidia (1300 specii, în 170 de genuri) [302321]

CUPRINS

Introducere

Articolul 2 [anonimizat]-al doilea Congres Internațional al Arhitecților și Tehnicienilor Monumentelor Istorice, 25-31 mai 1964, afirmă ideea că pentru conservarea și restaurarea monumentelor trebuie să se facă recurs la toată știința și tehnica ce poate contribui la studiul și protejarea patrimoniului arhitectural.

[anonimizat] (de aici dualitatea artistică și istorică) sau care prin existența lor contribuie la conturarea peisajului cultural.

Principiul conservării monumentelor afirmă prioritatea păstrării pe cât posibil a [anonimizat].

[anonimizat] a fi o colecție de soluții concrete la probleme dedegradare a [anonimizat] o incursiune în substraturile aplicării acestui principiu; o prezentare a modului cum peisajul antropic este modelat în permanență de alte forme de viață; o descriere a interacțiunii dintre regnuri; un reminder ca nu suntem singuri și că timpul devine evident prin ciclicitatea formelor de viață.

[anonimizat] a [anonimizat]. Lucrarea de față descrie modul în care aceștia interacționează cu diferite suprafețe ale construcțiilor și obiectelor patrimoniu:

Capitolul 1 prezintă un istoric al cercetărilor în domeniu și a descoperirilor recente; Capitolul 2 [anonimizat], [anonimizat]; Capitolul 3 descrie 5 tipuri de suprafețe și felul cum organismele interacționează cu acestea producând degradări; în Capitolul 4 [anonimizat]; Capitolul 5 ilustrează relația interfungală de antagonism ca posibilă soluție de bioremediere; Capitolul 6 reprezintă partea practică a lucrării, în care sunt descrise pe scurt 8 genuri de fungi identificate la cele 3 construcții dintre care 2 [anonimizat]-o [anonimizat].

[anonimizat]. În 1969 Whittaker publică o schemă de clasificare în care împarte lumea vie în cinci regnuri ca urmare a observațiilor: [anonimizat]; [anonimizat]; [anonimizat]- [anonimizat] s-au despărțit de la un grad de organizare unicelular.

[anonimizat] 800-900 [anonimizat] 2007, [anonimizat] (Hibbet și colab., 2007):

Microsporidia (1300+ specii, în 170 de genuri);

Chytridiomycota (706 specii în 105 genuri);

Blastocladiomycota (179 specii în 14 genuri) ;

Neocallimastigomycota (20 specii în 6 genuri);

Glomeromycota (169 de specii în 12 genuri);

Ascomycota (64163 specii în 6355 genuri);

Basidiomycota (31515 specii în 1589 genuri).

Primele organisme terestre de dimensiuni mari, descoperite în cele mai vechi fosile datând din Ordovincianul mijlociu (acum 460 milioane de ani) până la începutul Devonianului alcătuiesc așa numitul phytodebris. Prin analiza izotopilor de carbon s-a arătat că aceste organisme, în special genul Prototaxites, au fost de fapt fungi, având nutriție heterotrofă, care depindeau de producătorii primari (existenți deja de 2 miliarde de ani pe Terra)- cianobacterii, alge eucariote, licheni și briofite; specimenele de Prototaxites care dominau peisajul din Devonianul inferior, acum 400 milioane de ani, atingeau 9 m înălțime, fiind cel mai mare organism terestru.

Fungii sunt organisme cu nutriție heterotrofă cu rol ecologic în : reciclarea biomasei prin descompunerea materiei organice, producerea de metaboliți externi, dizolvarea mineralelor, stabilizarea structurii solului sau acțiunea mecanică asupra acestuia, retenția și mobilizarea de apă și nutrienți, formarea de asociații simbiotice-micorize, licheni,asocieri cu insecte, alte nevertebrate; infectarea plantelor și animalelor, etc.

Corpul vegetativ, sau talul fungal este alcătuit dintr-o masă de hife denumită miceliu, care explorează habitatul extinzându-se; la întâlnirea unei surse de hrană, rata de extindere scade și hifele încep să se ramifice, acaparând nutrienții. Dezvoltarea miceliului este astfel exponențială, cu fuziunea hifelor spre centru și reacții de evitare spre margini, rezultând o formă circulară în plan (prin autotropism-autoevitare) (Moore și colab., 2011). Miceliile sunt multinucleate, cu nucleii migrând în două direcții diferite de-a lungul hifei, cu o concentrație mai mare spre capete, acumulând informații despre sursele de hrană, necesitatea sintezei anumitor enzime, manifestând continuu modificări de natură epigenetică.

În experimentele realizate, s-au izolat fungi aparținând filumurilor Zygomycota, actual Glomeromycota (caracterizat de formarea de zygosporangi în cadrul reproducerii sexuale) și Ascomycota (cel mai vast filum, specifică fiind formarea de asce cu ascospori).

Definiții

Monument

Construcție sau parte de construcție, împreună cu instalațiile, componentele artistice, elementele de mobilare interioară sau exterioară care fac parte integrantă din acestea, precum și lucrări artistice comemorative, funerare, de for public, împreună cu terenul aferent delimitat topografic, care constituie mărturii cultural-istorice semnificative din punct de vedere arhitectural, arheologic, istoric, artistic, etnografic, religios, social, științific sau tehnic (Legea 422-2001).

Mărturie, operă de artă și obiect cu semnificații culturale (Carta de la Veneția, 1964)

Operă creată de mâna omului și edificată în scopul precis de a conserva pentru totdeauna prezent și viu în conștiința generațiilor viitoare memoria unei anumite acțiuni sau a unui anume destin. (Alois Riegl- Der Moderne Denkmalkultus, sein Wessen und seine Entstehung, 1903)

Biodeteriorare

schimbare nedorită a proprietăților unui material cauzată de activitatea vitală a unui organism (Hueck, 1968).

proces prin care agenți biologici, organisme vii pot cauza scăderea calității structurale și a valorii unui material (Rose, 1981).

rezultatul unui complex de interacțiuni între biodeteriogeni (organisme care se dezvoltă pe suprafața, în profunzimea sau în apropierea monumentului), și substrat, respectiv condițiile de microclimat (Gomoiu, 2008).

Există o diferență între biodegradare și biodeteriorare (Allsop et al. 2006), biodegradarea implicând o modificare desirabilă, pozitivă a materialelor produsă de microorganisme, în timp ce biodeteriorarea se referă la un impact negativ al activității organismelor vii. Biodegradarea poate fi: biofizică, biochimică și estetică (Allsopp, Seal. 2006, Gaylarde et al. 2003).

Istoric. Cercetări recente

În literatura antică romană există indicații privind protecția lemnului prin carbonizare superficială (Vitruvius- De Arhitectura) sau tratare cu ulei de cedru (Plinius cel Bătrân- Naturalis Historia). Exemple de practici din al doilea mileniu ar fi: în 1609, regele James al Angliei pornește o investigație pentru a stopa degradarea cu “putregai uscat” a flotei regale; în 1781, botanistul Franz Xavier von Wulfen identifică și denumește ciuperci responsabile de degradări la construcțiile din lemn: Serpula lacrymans, Coniophora puteana.; alți micologi preocupați de studiul degradărilor- Persoon1881, suedezul Fries-1921; Kickx- Belgia- 1867 în lucrarea “Flore cryptogamyque des Flandres”. (MUSTAȚĂ și colab., 2009); pentru protecția picturilor de frescă se fondează în 1957 Institutul Central de Restaurare din Roma; În Anglia în 1946, în lucrarea “Decay of timber and its preventions” – Cartwright și Findlay vorbesc despre ciuperci și insecte xilofage; Hickin (1963), Savory (1971) White (1970)-Coggins (cu lucrari in 1975, 1977, 1980) elaborează studii despre Serpula lacrymans;în Franța- Dirol- studiază degradarea lemnului produsă de Coriolus versicolor (1976), Serpula lacrymans (1978) ; Libotte (1984); în Germania- Rypacek ( 1966), Seifert (1968); Elveția –Walchli (1970, 1973, 1983) vorbesc despre distribuția ciupercilor xilofage dupa altitudine și influența temperaturii asupra dezvoltării; în Australia- Thornton prezintă metoda detectării lemnului degradat cu ajutorul curenților pulsatori (1979).Serpula lacrymans, a fost studiată de Jennings si Bravery (1991)- “Serpula lacrymans, Fundamental Biology and Control Strategies). Finlanda- Paajanen, Viitanen- 1988 despre problema degradării stâlpilor de lemn utilizați în fundații la clădirile istorice.

Instituții specializate în protecția lemnului și expertiza construcțiilor- British Wood Preserving Association, Building Research Establishment, Timber Research and Development Association (Marea Britanie), Institut fuer Holzqualitaet und Holzschaeden (Germania).

În Romania primele referiri la ciuperci lignicole le fac Schur (1853) și Fuss(1953, 1865).

Alte repere recente de cercetare

În studiul bacteriilor implicate în biodegradare, amintim: Midle et al (1983)- identifică prezența Thiobacilillor și rolul lor în degeadare asistemului de apă din Hamburg; Sand și Bock (1984) explică coroziunea biogenică a acidului sulfuric pe sistemul de alimentare cu apă din Hamburg; Sand et al (1984) descrie rolul bacteriilor sulfur oxidatoare în degradarea betonului;Vicke et al. (1999)- experimentează monitorizarea rezistenței diferitelor tipuri de beton; Videla et al (2000) vorbește despre biodeteriorarea siturilor arheologie maya- bacterii, cianobacterii, fungi; Papida et al (2000) prezintă influența MO alături de factori de mediu asupra deteriorării materialelor (calcar, dolomit); Saiz Jimenez et al (2000) sesizează prezența bacteriilor halofile și halotolerante în monumente deteriorate; Lamenti et al. (2000) prezintă colonizarea de către MO fotosintetizatoare a marmurei din gradinile Boboli, Florența; Vincke et al(2001) studiază comunitățile microbiene corodatoare ale țevilor de beton; Herrera et al (2004) prezintă biodeteriorarea într-o biserică de patrimoniu din Columbia; Kawai et al (2005) descrie biodeteriorarea betonului sub influența acidului sulfuric; Crispim și Gaylarde (2005) vorbește despre importanța cianobacteriilor ca biodeteriogeni; De Graef et al (2005) prin microtomografie cu raze X monitorizează activitatea bacteriană în pori; Lors et al (2009) corelează biodeteriorarea betonului cu variația pH-ului.

În studiul fungilor biodegradatori, s-au implicat: Gomez- Alarcon et al. (1994), care testează capacitatea unor tulpini de Fusarium și Penicillium izolate de pe calcarul bisericii din Carrascosa del Campo (Spania) de a produce acizi organici, (acid oxalic, fumaric și succinic); Diakumaku et al. (1995) studiază interacțiunea dintre fungi negri Phoma, Alternaria cu suprafața de marmură (patternul de penetrare, alterarea culorii, compoziției minerale); Gomez- Alarcon et al. (1995) studiază monumente din Alcala de Henares, Spania invadate de Alternaria, Penicillium, Phoma, Trichoderma, Urocladium, Dichtyodesmium; Wollenzien et al (1995) izolează fungi filamentoși și microcoloniali (MCF) din zone aride mediteraneene, majoritatea producători de melanină; Arocena et al (2003) prezintă deteriorarea rocilor granitice prin producerea de săruri organice; Hirakawa et al (2003)- simulează creșterea fungală pe mortar de interior; Karyz , Wazny (2007) prezintă biodegradarea materialelor poroase și a lemnului; Giannantonio et al (2009)- simulează în laborator degradarea betonului de către fungi.

Mecanismele biodeteriorării

2.1. Aspecte ecologice

Dintre factorii de mediu care influențează dezvoltarea, cel mai mare impact îl au temperatura și umiditatea.

Temperatura- Constantele termice variază de la un organism la altul, existând trei categorii de microorganisme: 1. Psichrofile (criofile) –suportă de la 0° până la -8°C, temperatura optimă fiind de 10-20°C.- specii aparținând genurilor- Botrytis, Mucor, Penicillium, Candida etc. 2. Mezofile –cresc la 5-40°C, cu un optim între 20-25° C- majoritatea microorganismelor. 3. Termofile – cresc la temperatura optimă de 40°C; temperatura minimă de 20° C; cea maximă de 60° C: – Aspergillus fumigatus, A. niger, Mucor pusillus, Chaetomium thermophile, Torula termophila.

Umiditatea – Organismele se împart în: 1. Higrofile- au nevoie de umiditate mare, 2. Mezofile –se dezvolvoltă bine în medii cu umiditate moderată, 3. Xerofile- specii adaptate la uscăciune. (Coniophora cerebella – buretele de pivniță- se dezvoltă bine la umiditate mare 50-60 %, Gloeophyllum abietinum, întâlnit pe lemnul de conifere, preferă o umiditate de 30-40 %).

Lumina – influențează dezvoltarea și sporularea ciupercilor. În general, ciupercile preferă lumina difuză, dar unele specii se dezvoltă în mod deosebit în condiții de întuneric sau lumină puternică- ex. Alternaria alternata sporulează bine la lumină puternică.

Curenții de aer- au rol în diseminarea sporilor.

pH-ul- Majoritatea ciupercilor cresc bine la un pH acid- 5-6, altele în mediu neutru, un număr foarte restrâns preferă pH-ul alcalin (unele specii de Fusarium).

Factorii trofici- Elementele de bază pentru nutriția ciupercilor sunt carbon, azot, hidrogen, oxigen, elemente secundare – fosfor, siliciu, potasiu, sodiu, calciu, magneziu, fier , mangan; în cantități foarte mici, necesită fluor, cobalt, nichel, zinc.

Ca sursă de carbon, ciupercile folosesc amidon, celuloză, hemiceluloză, pe care le descompun cu ajutorul enzimelor; unele pot folosi carbonul din lipide. Ca sursă de azot deservesc azotații, azotiții, sărurile de amoniu, aminoacizii, peptonele.

În funcție de modul de hrănire, ciupercile sunt parazite (obligate sau facultative) sau saprofite. (Mucor, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Verticillium, Cladosporium, Alternaria) . Speciile saprofite sunt de asemenea obligate sau facultative (BARBU și colab., 1983).

2.2. Bioreceptivitatea materialului

Alături de condițiile demediu, structura și compoziția materialului,sunt decisive și compoziția minerală (excesul de carbon favorizează instalarea MO- ex. rocile calcaroase), sau porozitatea(porii mari oferă posibilitatea de contaminare temporară), alcalinitatea, compoziția în substanțe organice.

2.3. Factori ai degradării

Microorganismele- bacterii, cianobacterii, alge, licheni, fungi, protozoare – sunt capabile să biodeterioreze aproape orice material, prin diferite metode:

prezența fizică – ex: celulele microbiene de 0,3-2 µm capabile să deterioreze circuite

acizii anorganici- acid nitric (produs de Nitrosomonas, Nitrobacter) și acidul sulfuric (Thiobacillus), acid carbonic (din reacția CO2 cu apa), acid sulfuros.

Acizii organici-produși de metabolism, acționează ca agenți chelatori ai ionilor de metal sau degradează prin acțiunea lor protonică. (ex: acid acetic, gluconic, oxalic, axalacetic, malic, glycoxylic, alături de molecule de aminoacizi, polizaharide). Acidul oxalic poate proteja rocile calcaroase prin formarea oxalatului de calciu de culoare galben-ocru, patina nobilă.

Solvenți organici- acid acetic, formic, butiric; alcooli: etanol, propanol, butanol, cetone.

Săruri- anionii produși finali de metabolism reacționează cu compuși cationici din materiale ceramice dând săruri solubile. La temperaturi scăzute, hidratarea sărurilor duce la creșterea conținutului de apă, generând degradare mecanică. Prezența sărurilor poate crește producția de polizaharide și densitatea biofilmului, sau poate atrage colonizarea cu Archee halotolerante, accelerând procesul de deteriorare .

Noxe- hidrogen sulfurat (H2S), oxizi de azot- (H2S este nutrient pentru Thiobacilus, care produce acid sulfuric)

Biofilme- rețin în matricea polizaharidică particule din aer, aerosoli, minerale, compuși organici. Sunt consorții cu activitate metabolică ridicată unde se acumulează cantități mari de enzime digestive. Caracterul ionic al compușilor polimerici din biofilme face ca acestea să acumuleze rășini schimbătoare de ioni (ex. calciu). Biofilmele protejează de acțiunea biocidelor, împiedică penetrarea materialelor de conservare, stimulează contracția și expansiunea prin păstrarea umezelii continue, pot schima dimensiunea porilor, cantitatea de apă, duritatea suprafețelor, greutatea, blochează evaporarea apei din porii materialului. Biofilmele au un coeficient termic de conductibilitate mai mic decât piatra, ceea ce duce la un transfer inegal de căldură. Totuși, în anumite condiții polizaharidele din biofilme pot avea un rol protectiv, contribuind la consolidarea suprafeței, inhibând dizolvarea acesteia.

Exoenzime- folosite pentru a degrada substratul. Unele, cum ar fi rășini, ceruri, carbohidrați pot îmbunătăți calitatea materialului.

Agenți chelatori, de emulsifiere- transformă substanțe hidrofobe în hidrofile, cresc biodegradabilitatea – aminoacizi , peptide, fosfolipide.

Tabel 1. Organisme care degradează componentele constructive (RH= umiditate relativă)

Substraturi

3.1.Piatră

Piatra poate favoriza dezvoltarea ciupercilor în prezența unor substanțe organice, sau a bacteriilor. Degradarea pietrei se face prin producerea de acizi organici (acid citric, acid oxalic, acid glucuronic, gluconic, lactic, fumaric), care formează complecși de chelați cu cationii metalici ai substratului. Astfel se produce dizolvararea materialelor care conțin fier, magneziu și fosfați- calcare, minerale silicate.

Microorganismele corozive sunt în mare parte bacterii chemoorganotrofe și fungi chemoorganotrofi. Speciile colonizatoare depind de caracteristicile rocii: pH-ul, procentul de carbonat și porozitatea, hidrofobicitatea, procentul de dizolvare, compoziția minerală.

Exemple: Pe piatra din ruinele cetăților dacice s-au identificat următoarele specii de fungi-Alternaria alternata, Trichoderma viridae, Fusarium oxisporum, Cladosporium herbarum , Verticillium). (BARBU și colab., 1983). De pe marmura de la Acropole s-au izolat specii de Torula, Alternaria, Pythomyces, Urocladium- fungi negri. (URZI și colab., 1992). În cazul rocii bazaltice din regiunea Etna, Italia, produșii de metabolism ai Penicillium simplicisimum atacă prin hidroliză silicații de la suprafața rocii (prin solubilizarea siliciului, aluminiului, fierului și manganului). La templul Ta Nei, Angkor, Cambodgia, prima etapă o reprezintă colonizarea cu alge și cyanobacterii- prima patină observată este de culoare roșie, provenind de la alga verde Trentepholia. Peste acestea s-au observat asociații de Scytonema, Gleocapsa, Stigonema, cu fungi (Endcarpon), licheni (Basidia), formând o patină gri-negricioasă.

Există două tipuri morfologice de fungi care trăiesc pe piatră, în funcție de condițiile de mediu: în mediile temperate și umede, predomină hifomicetele , care formează micelii în porii pietrei, cele mai importante: Cladosporium, Epicoccum, Aureobasidium, Botrytis, Aspergillus, Cephalosporium, Spicaria, Fusarium, Mucor, Hormodendron, Penicillium, Trichoderma, Phoma. În medile aride și semiaride, mediteraneene, predomină drojdiile negre și fungii microcoloniali, din genurile Hortaea, Alternaria, Sarcinomyces, Coniosporium, Capnobotryella, Exophiala, Knufia, Trimmatostroma, adesea în asociere cu licheni. Fungii negri trăiesc adânc în granit, calcare și marmure pe care le erodează prin atac chimic și mecanic, fiind principalul agent responsabil de fenomenul de bio-pitting. Datorită pigmenților melanici din peretele celular, roca devine neagră complet sau cu pete (STERFLINGER și colab., 2013).

3.1.1.Fungii negri

Deși sunt cele mai agresive microorganisme care deteriorează piatra, sunt adesea confundați cu depunerile de praf și impurități de pe marmură; sunt greu de evidențiat deoarece multe din ele reacționează negativ la mediile folosite pentru izolare. Acești fungi joacă un rol major în biodeteriorarea suprafețelor albe și galbene prin avantajul selectiv în perioadele extreme climatice.

Sunt caracterizați de o creștere meristematică (producerea de celule izodiametrice, bombate, cu pereți celulari groși în care este depozitatată melanina). Rămân metabolic activi chiar și cu cantități reduse de nutrienți. Caracteristicile lor comune sunt: formează colonii mici, negre, cresc foarte încet pe medii de cultură; se reproduc prin creștere izodiametrică; cresc în condiții oligotrofe; rezistă la uscăciune, cresc la o temperatură optimă de 20-25 °C; rezistă la stres osmotic, cresc în concentrații mari de sare; rezistă la expuneri mari la UV.

Pot crea trei tipuri de biodeteriorare: 1. Creștere între cristale, cu dizlocarea cristalelor; 2. Biopitting- creștere în cavități; 3. Creștere în fisuri.

Specii: Trimmatostroma abietis, Aureobasidium pullulans, Hortaea werneckii, Alternaria sp., Botryomyces sp., Coniosporium sp..

Pe monumentele de piatră sunt observate frecvent pelicule de oxalat, provenind din depozitele de pe suprafața exterioră a hifelor.

3.1.2. Tipuri de colorație:

Pete negre-maronii sunt date de fungi care oxidează fierul și manganul sau fungi care precipită oxizii de mangan și fier. Alte astfel de pete se datorează formării de pigmenți melanici, prin originea humică a acestor substanțe, sau prin reacția polizaharidelor cu aminoacizii la căldură intensă și expunere de lungă durată la lumină.

Petele negre-maronii sunt create de Dematiaceae, care sunt asociate cu formarea de hife specializate pentru uscăciune. Pigmentația este cauzată de produși metabolici, melanină și melanoidină și produși externi polimerizați. Melanina fungală este numită și alomelanină.

Petele verzi- sunt asociate în mare parte cu pigmenți proveniți din alge și cianobacterii.

Petele galben-orange- se datorează procesului de biopitting produs de alge, licheni și cianobacterii sau din oxidarea fierului și a pigmenților carotenoizi. Culoarea roșie ruginie poate proveni de la fungi care oxidează manganul; în cazul microorganismelor fototrofice, culoarea poate proveni de la pigmenții ficobilină, caroten și pigmenții carotenoizi, produși de degradare ai clorofilei. Un procent mai mare de clorofilă b față de clorofila a poate da culoarea neagră, iar produșii de degradare ai clorofilei a dau culoarea ruginie.

Petele roșu oranj și maro de pe gresii pot proveni de la: derivații clorofilei, caroten și pigmenți carotenoizi, melanina fungală, minerale, fier, magneziu, oxalați de fier și mangan produși de bacterii, fungi și licheni, oxizi și oxi-hidrați de fier și mangan produși în condiții atmosferice.

3.1.3. Crustele negre

Compoziția crustelor negre constă într-o serie de compuși organici înmagazinați într-un matrix mineral. Din crustele negre se pot izola două categorii de fungi: care folosesc carbohidrați similari fungilor saprofitici și cei care folosesc derivați de petrol din depozitele de poluanți, care dau această culoare.

Del Monte et. al (1981) identifică două tipuri de particule în crustele negre – particule sferice, neregulate, cu porozitate mare și particule sferice, cu suprafață netedă, ambele cu diametru de 10 µm, conținând carbon, siliciu, sulfură, aluminiu, calciu. Lipidele extractibile din cruste sunt: hidrocarburi aromatice, acizi grași (esteri de metil). Hidrocarburile policiclice aromatice sunt rezultatul combustiei biomaselor și, ca particule din aer, rămân blocate în suprafețele materialelor de construcție (alături de alcani, alchene, alchilbenzen, acizi α, ω-dicarboxilici, hidrocarburi diterpenoide, hidrocarburi triterpenoide, terpani triciclici etc )

Fenantrenul este un poluant prezent în cantitățile cele mai mari dintre hidrocarburi poliaromatice, concentrații mari din acestea găsindu-se în crusta neagră care acoperă de obicei calcarul. Microoroganismele îl asimilează fie din aer fie dizolvat în apa din structura poroasă și îl metabolizează în componente celulare sau în produși de degradare care afetează mai departe piatra. (SAIZ-JIMENES și colab., 1997)

Într-un experiment de testare a capacității de mineralizare a fenantrenului a bacteriilor de pe crusta neagră a catedralei din Sevilla, genurile Bacillus și Pseudomonas au demonstrat afinități diferite față de medii cu sau fără piatră, in vitro. Bacillus a mineralizat la o rată maximă indiferent dacă mediul conținea sau nu piatră, în timp ce Pseudomonas a preferat mediul cu piatră cu crustă neagră de pe care a fost izolat. Mineralizarea a început rapid, fără o fază de lag, și a atins după 100 de zile un maxim de 35-27% substrat mineralizat. . Genurile izolate de pe astfel de situri sunt bacterii care pot să trăiască în medii cu fenantren ca unică sursă de carbon (Pseudomonas, Bacillus, Nocardia, Planococcus).

3.1.4. Pitting

Procesul de pitting reprezintă un fenomen de degradare punctiformă, care apare prin unirea mai multor pori cilindrici adiacenți. Procesul este influențat de caracteristicile fizico-chimice ale materialului, morfologia și micromorfologia suprafeței, înclinarea și gradul de expunere al acesteia, acțiunea uneltelor modelatoare. Aceste formațiuni sunt rezultatul acțiunii microorganismelor, care odata ce găsesc condiții de dezvoltare continuă să erodeze în jur. Pentru monumentele din Forul lui Traian și Forul Roman din Roma s-au identificat găuri de dimensiuni de la câțiva mm la 20 mm, adâncime de la 2 mm la 6-7 mm, produse de bacterii .

3.2. Lemn

Fungii lignicoli au un rol major în menținerea sănătății ecosistemelor, recircularea nutrienților, biodiversitate, fiind principalii agenți de degradare din habitatele forestiere. Factorii care determină compoziția în fungi lignicoli ai masei lemnoase forestiere sunt: specia gazdă, dimensiunea, microclimatul, gradul de descompunere a lemnului, poziția față de copacul inițial, diametrul). Speciile monocentrice, cu un singur punct inițial de creștere, au nevoie de mai mult substrat decât cele policentrice. Speciile policentrice au astfel un avantaj (BIRSAN și colab., 2010).

În cazul construcțiilor, principalele cauze care conduc la degradarea lemnului sunt: amplasarea pe terenuri nedrenate, neizolarea fundațiilor și a soclurilor împotriva infiltrațiilor, utilizarea lemnului insuficient uscat (cu o umiditate de peste 15%), neasigurarea spațiilor de ventilare, utilizarea de specii lemnoase nedurabile pentru grinzi, cosoroabe, tălpi (fag, molid, carpen), neizolarea pereților exteriori, scurgerea neadecvată aapelor pluviale, utilizarea de materiale de umplutură sub pardoseli, executarea necorespunzătoare a șarpantelor, lipsa măsurilor de hidroizolare , prezența lemnului abandonat în apropiere, lipsa încălzirii, poziționarea structurii aproape de pământ, inundațiile periodice, plasarea plantelor și a debrisului vegetal în apropiere, netratarea lemnului(COJOCARIU și colab., 2010).

Tipuri de ciuperci în funcție de atacul produs: endotrofe (degradează lemnul în profunzime până la putregai), ectotrofe (degradează în suprafață), ectoendotrofe.

Ciupercile endotrofe sunt în general basidiomicete (cu excepția fam. Polyporaceae), produc enzime capabile să degradeze peretele celular- Merulius, Coniophora, Poria, Lenzites, Lentinus, Coriolus, Paxillus, Ganoderma. Ciupercile ectotrofe și ecto-endotrofe sunt în general ascomicete- Alternaria, Aureobasidium, Bispora, Sclerophoma, Torula, Trichoderma, Trichotecium, Paecilomyces, Penicillium, Aspergillus, Chetomium globosum (poate degrada și până la putregai).

Berinde clasifică tipurile de putregai astfel: după culoare- alb, alb-gălbui, brun roșcat, cafeniu; după structura macroscopică- tare, fibros, cubic, sfărâmicios, moale; după aspectul microscopic- alveolar, coroziv, pectinolitic; dupa conținutul de apă- uscat, umed.

Structura lemnului

O secțiune prin tulpina unui arbore tânăr evidențiază structura primară a lemnului: epiderma, formată dintr-un singur strat de celule, scoarța- din mai multe straturi de celule parenchimatice cu țesuturi mecanice spre exterior; cilindrul central-stel- cu vase conducătoare libero-lemnoase (lemn/xilem la interior, liber/floem la exterior). La plantele lemnoase spre deosebire de cele ierboase, există și o structură secundară,

DURAMENUL

Duramenul reprezintă zona interioară formată din vase cu pereți mineralizați, are o culoare mai închisă, este mai veche. Nu este prezentă la toate speciile, apare la vârste diferite ale arborelui (la fag la 35 de ani, stejar 20 de ani, salcâm 3-5 ani). Alburnul este zona exterioară duramenului, de culoare mai deschisă, fiziologic activă.

Caracteristicile duramenului sunt: nu prezintă celule parenchimatice vii, toate substanțele de rezervă sunt transformate în substanțe de duramificare (gome), nu prezintă amidon, prezintă tile în vase.Din zona de duramen se pot extrage substanțe fungicide, de exemplu: pinosilnină, alfapinen (la pin), dihidrobietină (la salcâm), tanin (la stejar). Lemnul fără duramen prezintă o permeabilitate mai ridicată la apă și aer, lipsa produșilor fungicizi, prezența hidraților de carbon asimilabili. Permeabilitatea ridicată poate fi, totuși, un avantaj în cazul tratamentului cu fungicide .

Degradările produse de ciuperci sunt de trei tipuri: alterări cromatice, mucegaiuri și putregaiuri.

3.2.1. Alterările cromatice

Apar când agenții biologici nu degradează peretele celular, utilizând doar componentele celulare. Discolorarea este prima etapă a atacului, înaintea instalării putregaiului. Alterări cromatice în nuanțe de cenușiu produse de Dyatripe disciformis, Schizophyllum commune, Ustulina deusta. Alterări în roz, roz gălbui- Fomes fomentarius, Ganoderma aplanatum, Stereum hirsutum, Coriolus hirsutus. Discolorări în tonuri de roșu- Hypoxylon coccineum, Stereum purpureum.Colorarea în albastru este provocată de Ophiostoma, Trichosporium tingens, Discula pinicol, Sclerophoma entoxylina .

3.2.2. Mucegăirea lemnului

Speciile reprezentative care provoacă mucegăirea lemnului sunt: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Paecillomyces, Cladosporium, Aureobasidium, Bispora, Neurospora, Mucor, Chaetomium .

Tabel 2.-Mucegaiuri ale lemnului și culorile lor

3.2.3. Putrezirea lemnului

a. Compoziția chimică a lemnului

Principalele surse de hrană pentru ciuperci sunt: celuloza- polizaharid ce diferă în proporție de la o specie la alta- fag 40-43%, brad 55-58%, bumbac matur 92-94%; hemiceluloza-polizaharid format prin condesarea unui număr mai mic de molecule de glucoză; lignina-oferă rezistență peretelui celular al plantei.

Descompunerea celulozei

Celuloza este cel mai abundent compus organic de pe Pământ și este depozitul a 50 % din carbonul organic, fiind un polimer de molecule de glucoză legate prin legături β1-4. Descompunerea ei se produce în mai multe etape, rezutând prima dată resturi de 100-300 de molecule de glucoză. Fracția rezistentă la hidroliză se numește celuloză cristalină, iar cea hidrolizată, celuloză amorfă. Complexul de celulaze al bazidiomicetelor ce produc putregaiuri sau al ascomicetelor ca Trichoderma constă în enzime hidrolitice: endoglucanază, exoglucanază și celobiază (β glucozidază) care lucrează sinergic (complex de enzime extracelular denumit celulozom). Endoglucanaza atacă celuloza aleator, producând glucoză, celobioză (dizaharid ) și celotrioză (trizaharid). Exoglucanaza atacă de la capătul moleculei, îndepărtând unitățile de glucoză. Celobiaza hidrolizează celobioza la glucoză.

atacului enzimelor hidrolitice.

Cristalele de oxalat ce inconjoară hifele fungale sunt responsabile de reducerea ionilor ferici la ioni feroși, ajutând la clivarea oxidativă a celulozei. Ciupercile mucegaiurilor albe, deși produc H2O2 pentru degradarea ligninei nu secretă cristale de oxalat și deci nu depolimerizează oxidativ celuloza. (Moore și colab., 2011)

Descompunerea hemicelulozei

Hemiceluloza este un nume generic pentru polimeri ce conțin zaharuri hexoze și pentoze, posibil înlocuibile cu acid uronic și acetic. Principala hemiceluloză din plante este xylanul (polimeri de pentoză și xiloză legați 1-4), alături de araban(poliarabinoză), galactan(poligalactoză), manan, glucomanan.

Degradarea ligninei

Lignina este o moleculă cu greutate moleculară mare, insolubilă, compusă din derivați metoxilați ai benzenului, monolignoli, în special alcoolii coniferil, sinapil și coumaril, în proporții diferite la diferite plante. Putregaiurile albe degradează lignina, producând astfel depigmentarea. Degradarea oxidativă a ligninei depinde de un set de enzime, incluzând: lignin-poroxidaza (proteină ce conține fier și catalizează oxidarea dependentă de H2O2), manganaz-peroxidaza (același rol), lacaza (proteină cu cupru care catalizează demetilarea componentelor ligninei). Un alt rol îl are și glioxal oxidaza, enzimă extracelulară generatoare de peroxid. Procesul de catabolism al ligninei implică:

Drumul enzimelor prin lemn

Există două posibilități de eliberarea a enzimelor degradatoare:

Prin vârfurile hifelor, acestea fiind mai permeabile; dizolvarea lemnului trebuie să se producă la terminațiile hifelor pentru a permite creșterea acestora.

prin partea din spate a hifei, fiind eliberate odată cu moartea acesteia (situație probabilă datorită incapacității moleculei mari de a traversa peretele hifei).

Tabel 3.-Pierderea în greutate datorată atacului ciupercii la alburnul de pin

Tabel 4. Descompunerea lemnului de către Serpula lacrymans, (după 18 săptămâni de incubație)

b. Putregaiul maro

Este cauzat de bazidiomicete, care provoacă o discolorație la început spre roșu, ruginiu, apoi spre brun. Lemnul devine sfărâmicios și se desface în bucăți prismatice, prin acțiunea ciupercilor care consumă celuloza și hemicelulozele, nu și lignina. Hifele ciupercilor pătrund in interiorul celulei și distrug peretele celular de la interior spre exterior, lăsând o vreme neatacată lamela mijlocie. Putregaiul brun scade rezistența la încovoiere mai puternic decât cel mucilaginos.

Hifele putreagaiului maro cresc în mare parte în lumenul lemnului fără contact direct cu peretele celular (prin pori, canale). Întâi se produce degradarea peretelui celular primar și secundar 1, în vreme ce peretele secundar 2 și cel terțiar rămân o vreme intacte. Pentru a ajunge la celuoză și hemiceluloză, este modificată conformația ligninei prin agenți oxidativi cu moleculă mică

Deși nu prezintă enzimele specifice de degradare a ligninei, ciupercile putregaiului maro modifică totuși această moleculă. Un indicator al modificării este demetilarea și acumularea de produși oxidați. Efectul a fost evidențiat prin măsurarea absorbanței UV și analiză în lumină polarizată a unor microsecțiuni din probe de Pinus sylvestris, expus atacului cu Antrodia vaillantii timp de 22 de zile, în zona peretelui celular secundar al traheidelor (REHBEIN și colab., 2011).

Fig. 4- Secțiuni prin lemn atacat de ciuperci

Tabel 5-Tipuri de putregaiuri. Legenda: tip de putregai: M (maroniu), A (alb), U (umed)

Specii care formează putregaiul maroniu

Serpula lacrymans, sin. Merulius lacrymans

Prin metabolismul ridicat ciuperca își poate asigura singură umezirea substratului (prin degradarea hidraților de carbon în dioxid de carbon și apă); ea secretă mai multă apă decât se poate evapora, apărând astfel picături de exudat (de aici denumirea). Poate crește semnificativ și pe zidărie umedă. Este alcatuită din corp sporifer, miceliu și rizomorfe. În stadiul tânăr, hifele miceliene sunt subțiri, prezintă cleme de conectare frecvente. Pereții celulari prezintă numeroase perforații de mici dimensiuni și cristale de oxalat de calciu. Rizomorfele, albe sau cenușii la maturitate, ajută la propagarea la distanțe mari, prin anastomoza filamentelor miceliene în cordoane friabile.

Corpul fructifer este cărnos, alb, de 10 mm grosime, la maturitate de mărimi diferite, de la câțiva cm2, până la 1 m2. Suprafața himenială are o culoare galben-ruginie, este mărginită de o zonă sterilă, albă, cu aspect pufos. Corpul fructifer se usucă după diseminarea sporilor și poate rămâne aderent mai mulți ani. Sporii sunt galben portocalii, au formă elipsoidală, lungimea de 9-10 microni, lățime 4-5µm și își pot păstra vitalitatea aproximativ 3 ani. În condiții de umidate și la temperatura de 7-8 °C, miceliul poate rămâne viabil 9-10 ani. (MUSTAȚĂ și colab., 2009)

Condiții de dezvoltare: temperaturi de 15-20 °C (inhibiție sub 4 °C si peste 20 °C); umiditate relativă a aerului 60-80%, a lemnului 30-40% (minim 20%). Preferă pH-ul acid, nu se dezvoltă în spațiile lipside de oxigen, sau cu exces de CO2 (autoinhibiție metabolică).

Coniophora puteana, sin. Coniophora cerebella- ciuperca de pivniță

Superficial, filametele cresc asemănător vaselor de sânge de pe cerebel, de unde denumirea cerebella. Determină un putregai prismatic ce se desprinde în bucăți mai mici decât la Merulius. Lemnul își schimbă culoarea de la galben-brun la brun închis pe măsura avansării atacului. .

Plăcile de corpuri fructifere au culoare galben-aurie la început, cu timpul devin brun măslinii, marginea lor devine crem cu aspect pâslos. Sunt de consistență moale, friabilă când devin uscate, se desprind ușor de pe suport. . Hifele mature prezintă cleme de conectare simple, duble și în verticil și au grosime de 10-12µm. Miceliul tânăr este alb, culoarea evoluând spre brun-cafeniu. Rizomorfele sunt mai elastice, mai subțiri si mai puțin compacte decât la Merulius larymans.

Crește la temperatură optimă de 23-24 °C, în intervalele de 3-34°C, umiditate de 50-60%; la uscare pronunțată se inactivează și se distruge. Poate produce un atac activ la interiorul lemnului, invizibil la suprafață.

Poria vaillanti(buretele de subteran, ciuperca albă de casă, buretele țurțure al minelor)

Apare în condiții de umiditate excesivă, determină un putregai roșiatic cubic care se desprinde în bucăți mici. Hifele tinere sunt subțiri, cu diametrul de 2-5 µm, cele mature au în jur de 8 µm. Miceliul tânăr crește în formă de evantai, iar în condiții optime dă naștere unor mase mari care atârnă ca niște stalactite, ce la atingere își micșorează volumul. Rizomorfele sunt albe, cu secțiune rotundă, flexibile, slab ramificate. Corpurile fructifere au aspect de plăci, uneori cu tuburi formate din pori mari, angulari. Sporii sunt incolori ovali sau reniformi.

Daedalea quercina (iasca de cioată a stejarilor)

Trăiește pe cioatele de stejar . Atacă mai întâi alburnul determinând o putrezire roșiatică apoi brună. Lemnul putrezit se desface în cuburi și prisme.Corpurile fructifere apar la suprafața porțiunilor afectate; sunt multianuale, suberoase, sesile, gălbui pe partea superioară, fin păroase, cu zone concentrice. (BARBU și colab., 1983)

Lentinus lepideus(buretele de subteran)

Atacă lemnul în zona centrală, unde produce fisuri longitudinale, lemnul ia o nuanță închisă. Hifele tinere sunt subțiri, hialine. Prezintă cleme rare, fără cistide. Formează frecvent clamidospori cu pereți groși.Corpul fructifer are formă de pălărie cu lame și picior, de culoare galben-brună, de dimensiuni 5-10-15 cm în diametru, de structură cărnoasă în stadiul tânăr, lemnoasă în cel matur. Crește în condiții de uscăciune și temperaturi ridicate (8-38C, optim 27-29C).

Poria monticola (Buretele grinzilor)

Se manifestă prin pete de culoare galben-brun sau roz-brun, odată cu scăderea rezistenței lemnului. Hifele au grosime de 2-4µm (tinere) și 3-9 µm (mature), prezintă cleme caracteristice și clamidospori. Corpul fructifer este lipit de substrat, de 2-3 mm grosime , cu o margine albă sterilă; prezintă tuburi de 1-2,5 mm lungime, cu pori angulari care în final confluează formând un por de 1 mm diamteru. Sporii sunt cilindrici, elipsoidali , cu dimensiuni de 4,5µm- 6,5 µm X 2,5-3 µm. Condiții de creștere: pH=3, temperatură optimă 35C.

Lenzites abietina(buretele de tâmplărie)

Atacă lemnul de rășinoase, în special cel expus unor variații mari de temperatură și umiditate, creând condiții pentru invazia altor ciuperci (Merulius , Coniophora) prin faptul ca lemnul devine higroscopic. În stadiul timpuriu, lemnul este colorat în galben, în stadiul avansat devine brun roșcat. Hifele mature prezintă cleme sub formă de medalioane. Corpurile fructifere ies la suprafață prin crăpăturile longitudinale, sub forma unor pete de culoare ruginie. Sporii sunt incolori, cilindrici 3-4 µm X 9-12 µm. Miceliul tânăr este rezistent la temperaturi ridicate și uscăciune , între 5-36 °C.

Fructificațiile sunt subțiri, sesile, cu o lățime de 0,5-3 cm; lungimea poate atinge zeci de cm, prezintă o margine întoarsă. Himenoforul este lamelar, cu lamele neregulate de culoare brună cenușie, pe care se află sporii.

Phellinus cryptarum

Apare doar pe lemn în construcții, ca și S. lacrymans. Corpul sporifer matur este plat, întins pe suport 10-12 cm lățime, 40 cm lungime și 2-4 cm grosime. Ciuperca este multianuală, se poate întâlni în mai multe straturi de tuburi suprapuse. Prezintă o consistență tare, lemnoasă, o tramă subțire de culoare ocru spre brun. Tuburile au lungimi de 1-9 mm și sunt colorate spre brun. Produce un putregai alb, și dă lemnului o consistență lânoasă, acesta putând fi desfăcut în fibre. Razele mediene rezistă acțiunii enzimelor secretate de ciupercă și apar ca niște lame in țesutul degradat- caracterul ajuta la identificarea speciei (MUSTAȚĂ și colab., 2009).

Fibroparia vaillanti

Ciuperca albă de casă- se dezvoltă preponderent în mine sau subsoluri calde și umede. Corpurile sporifere au forme diferite, forme de plăci de 0,8-0,7 până la 15mm, cu tuburi cu pori vizibili, angulari. Tuburile sunt albe, fragile, de forma unor țurțuri. Produce un putregai brun, prismatic, nu la fel de profund ca cel produs de Serpula lacrymans. În lemn, hifele tinere au dimensiuni de 2-5µm, cele mature de 5-8µm (MUSTAȚĂ și colab., 2009).

Dacrymyces stillatus

Produce un putregai brun, prismatic, foarte mărunt- 2-2 mm, de suprafață. Degradează atât lemnul de foioase cât și cel de rășinoase. La elementele de grosimi mai mari, este succedat de alte specii, cum ar fi Gleophyllum sepiarium, G. abietinum la rășinoase și Tramentes versicolor la lemnul de foioase.

Gleophylum sepiarum, Gleophylum abietinum (sin. Lentius sepiarium, Lentius abietinum)

Apar în paralel în majoritatea cazurilor, cunt cei mai periculoși agenți de biodegradare din muzeele în aer liber. Produc un putregai brun, prismatic, în profunzimea lemnului. Atacul devine vizibil la suprafață doar la apartiția corpurilor sporifere, după ce lemnul din interior a fost puternic degradat.

Hypnodontia breviseta

Specie comună atât pe lemnul din pădure cât și pe cel din construcții. Corpurile sunt de forma unor pojghițe albe sau crem, cu dinți foarte mici (MUSTAȚĂ și colab., 2009).

c. Putregaiul alb

Este produs de bazidiomicete care degradeaza celuloza, hemicelulozele și lignina. Aspectul degradărilor poate varia, nefiind unul prismatic, lipsind crăpăturile transversale. Procesul de descompunere poate avea două forme:

-hifele produc mici găuri în peretele celular, care se măresc treptat

-se extrage inițial lignina din peretele celular, începând din partea interioară a celulei. Dupa dizolvarea stratului de pectină, celulele se despart unele de altele, lăsând spații goale în masa lemnului. Culoarea albă se datorează atât celulozei nedescompuse cât și enzimelor oxidative.

Hifele putregaiului alb cresc tot în lumen și degradarea se face de la interior la exterior, pereții sunt degradați aproximativ simultan, nealterând brusc proprietățile mecanice ale lemnului. Lignina este descompusă cu enzimele: ligninperoxidaza, manganperoxidaza, laccaza.

Trametes abietina

Specie comună pe trunchiurile de conifere. Corpurile fructifere sunt semicirculare , mici, de 1-3 cm, sesile. Partea superioară a fructificației prezintă șanțuri albicioase cenușii sau roșiatice.

Coriolus versicolor

Iasca de cioată a foioaselor, specie cosmopolită, apare sporadic și pe conifere. Corpurile fructifere sunt asociate mai multe la un loc, suprapuse, pălăria este semicirculară, cu diametru de până la 6 cm, grosime de 1-3 cm , consistență pieloasă. Pe partea inferioară prezintă pori de formă circulară, de diametru 0,1-0,3 mm.

Coriolus hirsutus

Determină un putregai alb, cu dungi galbene; într-un stadiu avansat de descompunere, lemnul se desface pe linia inelelor anuale. Corpurile fructifere sunt semicirculare, suprapuse, fără picior, cu o pălărie de 3-10 cm diametru. Partea superioară a pălăriei este păroasă, albicioasă gălbuie sau cenușie, cu zone concentrice mai închise și mai deschise.

Fomes fomentarius

Iasca fagului, atacă numeroși arbori din pădure (fag, carpen, ulm, stejar, salcâm) și pomi fructiferi. Formează corpuri fructifere mari de 10-40 cm diametru, cu grosime de până la 25 cm, cu partea superioară netedă, cu zone concentrice, anuale, de culoare cenușie sau brună. Pe partea inferioară prezintă pori mici, rotunzi, bruni. Ciuperca infectează lemnul la nivelul unor răni, de unde pătrunde în zona centrală, unde provoacă o decolorație în dungi alb gălbui (BARBU și colab., 1983).

d. Putregaiul mucilaginos

Produs de ascomicete, pe lemnul expus la umiditate mare. Ciupercile implicate prezintă rezistență la umiditate foate ridicată și anaerobioză. Lemnul este distrus de la exterior spre interior, atât albunul cât și duramenul, fiind caracteristică distrugerea lamelei secundare a pereților celulari, în care hifele produc găuri.

O particularitate a modului de acțiune a putregaiului umed este că, spre deosebire de celelalte două tipuri care se dezvoltă în lumenul celular, hifele acestuia cresc în interiorul peretelui celular, unde dau naștere la șiraguri de caverne de forme romboidale, ascuțite la vârf, care la microscop apar întunecate. Cavernele urmează structura fibrei celulozice, cu deviații de 20- 25 de grade. În microscopie electronică se observă ca aceste caverne sunt unite printr-un canal foarte subțire, prin care trece o hifă de dimensiune foarte mică (0,3-0,4 µm cu tot cu perete celular, 0,15-0,3 µm la interiorul peretelui celular). Prin această gâtuire sunt transportate organitele și nucleul hifei (HUCKFELDT și colab., 2011).

e. Degradarea bacteriană

Degradarea lemnului din cauze bacteriene se face începând de la stratul S3, lăsând în urmă o structură cu o densitate mare de electroni. Apoi, microorganismele formează în stratul S2 structuri asemănătoare unui tunel, cu reziduuri de material mai mult sau mai puțin dense (mai dens în zona lemelei mijlocii) (HUCKFELDT și colab., 2011)

Fig. 7- Etapele degradării bacteriene a lemnului (REHBEIN și colab., 2008).

Fig. 8. Exemple de degradare bacteriană a lemnului.(REHBEIN și colab., 2011)

Fig. 9. Analize de M.E. a degradărilor bacteriene

Lemnul colonizat de putregaiuri maronii este mai atractiv pentru insecte decât cel colonizat de putregai alb sau umed (unele sprecii atrag termite- Coniophora olivacaea, Poria monticola, Botrydiptodia theobromae, în timp de alte specii resping termitele- Gleophyllum trabeum, Ganoderma applanatum ; acestea din urmă pot fi folosite pentru exterminarea lor- Aspergillus niger, Paecilomyces fumosoroseus, Conidioblosus coronatus, sau pot parazita aceste insecte- Termitaria, Cordicepioideus, Antennopsis)

3.3. Hârtie

Biodegradatorii folosesc ca sursă de hrană substanțele de origine vegetală și animală din cărți: piele, pergament, hârtie, adezivi etc.

Ciupercile pot ataca cărțile la o umiditate a aerului de 65 % , adica de 10 % a hârtiei- umiditatea de sporulare.Acestea pot să posede enzime celulozolitice, afectând proprietățile mecanice ale hârtiei sau pot degrada prin producerea de pigmenți cauzând pete de diferite culori; pot provoca decolorarea scrisului până la ștergerea lui completă. Cele mai frecvente ciuperci izolate de pe cărți și documente de arhivă sunt: Chetomium globosus, Trichoderma, Stachybotrys, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Stemphilium, Trichoderma viride (celulolitică, provoacă pete verzi).

Pentru conservarea cărților și evitarea mucegaiurilor se recomandă o temperatură de 16-18°C și o umiditate de 45-60 %.

Degradarea documentelor de pergament, alcătuit în mare parte din colagen, este un proces complex, care implică degradarea oxidativă a lanțurilor de aminoacizi și clivarea hidrolitică a structurii peptidice. Bacteriile cu proprietăți proteolitice joacă un rol major în degradarea pergamentelor: Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Virgibacillus, Micromonospora. Pergamentul este atacat și de fungi proteolitici, specii de Ascomycete:Chaetomium, Gymnoascus, fungi mitosporici- Acremonium, Epicoccum, Trichoderma, Verticillum.(STERFLINGER și colab., 2013)

3.4. Beton

Betonul este un material eterogen alcătuit din ciment Portland, agregate(59-75% vol) și apă. Biodegradarea materialului de origine minerală este favorizată de concentrația crescută de carbonați și compuși anorganici de sulf, în colaborare cu agresiunile de origine abiotică și biotică. Dintre substanțele care produc o degradare rapidă a betonului amintim: clorura de aluminiu, disulfitul de calciu, acid clorhidric, acid florhidric, acid azotic, acid sulfuric, sulfuros, sulfat de aluminiu, nitrat de amoniu, sulfat de amoniu, sulfit de amoniu, sulfură de amoniu.

Tabel 6. Degradarea betonului, a cărămizii și mortarului.

Acizii organici reacționează cu componentele de bază ale cimentului, hidroxidul și carbonatul de calciu. MO fermentative care secretă acid lactic, acetic și butiric dau naștere la săruri hidrosolubile. Efectul asupra comportamentului structural depinde de compoziția în agregate a betonului: în cazul cimentului cu calcar și dolomite, dizolvarea agregatelor se face în același ritm cu cea a cimentului; betonul cu agregate de siliciu, granit și bazalt va avea un comportament diferit. Astfel sunt influențate rezistența la compresiune și întindere a structurii.

Dioxidul de carbon reacționează cu apa formând carbonat de calciu hidrosolubil Ca(HCO3)2. Efectul depinde de porozitatea betonului și de gradul de pătrundere a apei.

Acid azotic creat de bacteriile care descompun ureea, reacționează cu compușii de calciu formând nitrat de calciu.

Acidsulfuric și sulfuros: Acidul sulfuros produs de bacteriile sulfat reducătoare din zone anaerobe (coroziunea canalelor de alimentare), este transformat în acid sulfuric, care atacă pasta de ciment formând sarea Candlot (CaO)6(Al2O3)(SO3)3. 32H2O, uneori thaumasit, CaSiO3·CaSO4·CaCO3·15H2O. În timpul cristalizării, aceste săruri își măresc volumul de două ori ducând la expansiunea și dezintegrarea betonului.

Deteriorarea propriu-zisă a betonului se datorează activității bacteriilor sulfat oxidatoare Acidithiobacillus și Thiobacillus. Experimental, pierderile de masă în cazul mostrelor de beton tratate cu apă cu bacterii din aceste genuri sunt de 30 de ori mai mari decât în cazul unui tratament cu o apă sterilă.

După construcție, betonul este imun la atacul biologic datorită alcalinității crescute, pH-ul mare fiind cauzat de hidroxidul de calciu, un produs secundar al hidratării cimentului. Acidul sulfuric, în faza inițială, poate duce la formarea gipsului Ca SO4, care poate avea un comportament de protecție, în același fel în care primul strat de rugină protejează metalul.

În timp, pH-ul este redus prin carbonarea și neutralizarea sulfurii de hidrogen, de către bacterii sulfat reducătoare/ oxidatoare. Când pH-ul este neutru sau acid (sub 9), își fac loc microorganismele neutrofile și acidofile- specii de Thiobacillus- T. thioparus, T. novellus, T. neapolitanus, T. intermedius, T. thiooxidans (la pH sub 5, produce cantități mari de acid sulfuric, scăzând pH-ul la 1,5). La pH 3, T. thiooxidans crește foarte puternic. PH-ul scăzut favorizează formarea de sulf elementar, pe care T. thiooxidansîl oxidează la ioni. Ph-ul continuă să scadă până la 1, când devine inhibitor chiar și pentru T. thiooxidans. Biofilmul creat de microorganismele colonizatoare contribuie la biodeteriorarea chimică a betonului.

În 1963, în tunelul metroului din Varșovia s-au gasit în matrixul de beton corodat fungii Coniophora puteana și Serpula lacrymans; testate pe cimen Portland 450 timp de 6 luni acestea au produs: o creștere a umidității de 18-25%, scăderea pH-ului de la 12 la 5-7, scădere a rezistenței la încovoiere de 5- 20 % (una din mostre a înregistrat o scădere a rezistenței de 80 %).

Sinergismul speciilor Fusarium și Acidothiobacillus poate duce la eliberarea ionilor de calciu din structura betonului și integrarea acestora în polimeri extracelulari, contribuind la degradare.

3.5. Opere de artă

Cea mai mare parte a colonizatorilor operelor de artă sunt microorganisme care trăiesc și în sol (fungi-Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Chaetomium, Alternaria; bacterii- Pseudomonas, Arthrobacter, Streptomyces), în cantități diferite, de exemplu: de pe o frescă din Mânăstirea Sf. Damina din Assisi s-au izolat mai mult de 33 de specii din 17 genuri, de pe o pictură murală din catedrala Cantembury doar una singura (Beauveria alba). Chiar în același loc, se pot întâlni specii diferite, în funcție de poziția în încăpere, nivelul de lumină, temperatură, umiditate. Din frescele subterane se izolează în mare parte specii din ordinul Actinomycetales, majoritatea din genul Streptomyces sau Nocardia.

3.5.1. Frescă

În cazul frescelor exerioare, în special cele de pe peretele nordic al construcțiilor, algele, lichenii și fungii pot produce degradări agresive (la mânăstirile Văratec, Voroneț, Arbore s-au izolat Cladosporium herbarum, Aspergillus repens, Alternaria alternata, Stemphylium piriforme, Chaetomium globosum, Ch. Murorum). Organismele se hrănesc cu substanțele organice folosite în tehnica de executare a frescei .

Ritmul colonizării

Colonizarea frescelor subterane se face într-un ritm mai rapid după deschiderea lor și accesul publicului, datorită creșterii cantității de lumină, a umidității, a schimbului de materie organică. De exemplu, la deschiderea sălilor hipogee din Domus Aurea din Roma, în 1951, în zonele de frescă expuse la lumină au apărut foarte rapid cruste verzi, predominant Cynobacterii(Lyngbya) și alge, furnizând substrat pentru bacteriile heterotrofe sau fungii saprofiți. Un caz similar s-a remarcat la o biserică din Spania, unde poluarea cu dioxid de sulf din zonă a furnizat condițiile dezvoltării unor bacterii sulf oxidatoare și sulf reducătoare, acestea oferind substratul organic necesar pentru creșterea unor bacterii și fungi cu metabolism heterotrof, ultimii fiind responsabili de degradări și desprinderi din frescă.

După Karpovich-Tate și Rebrikova, chiar și în prezența substratului organic (componente ale frescei) primi colonizatori sunt bacteriile autotrofe, nitrificatoare, care furnizează material organic pentru colonizatorii secundari (în experiment MO izolate sunt în totalitate capabile de hidroliza PC bacterian). Bacterii din genul Arthrobacter au fost izolate de pe o biserică medievală din Rostov, Rusia, fiind resposabile de oxidarea plumbului din pigmenți, producând pete negre-maronii (Pb2+ la Pb4+). Teste suplimentare au arătat că petele negre pot apărea din reacția dintre sulfura de plumb din pigmenți și hidrogenul sulfurat H2S produs de alte bacterii .

Picturi

Componentele materialelor picturale sunt vehicolul, pigmentul, aditivul și solventul. Cel mai adesea au fost izolate din picturi speciile Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Proteus,Escherichia, Micrococcus, Serratia, Aeromonas(bacterii aerobe); Bacteroides, Clostridium, Desulfvibrio, Bifidobacterium(bacterii anaerobe);Rhizopus arrhinus, Aspergillus niger, A. ustus, Penicillium citrinum, Chaetomium globosum, Alternaria altanata (fungi).

Un studiu a analizat compoziția în microorganisme a vopselurilor folosite în pictură , arătând că materia primă este bogată în nutrienți pentru a susține această dezvoltare, găsindu-se următoarele specii: fungi – Aspergillus flavus, Penicillum citrinum, A. niger; bacterii- Bacillus polymyxa, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Bacillus brevis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus brevis (OBIDI și colab., 2009).

În cazul picturilor, atacul începe întotdeauna dinspre pânză, datorită biodegradabilității sau a climatului creat între pânză și perete. Pe fața internă a peliculei pictate se crează astfel mici fracturi și desprinderi.

Cele mai susceptibile atacului sunt picturile în tempera, cu cazeină sau cu ou, clei, ulei de in, gumă arabică din pasteluri și acuarele. Prezența metalelor grele- alb de plumb, oxid de zinc- și a verniului final (rășini, ceară) hidrofob- scade nivelul atacului.

Mecanic se produce desprinderea și fisurarea stratului pictural; enzimatic se produce descompunerea constituenților stratului pictural; producerea de metaboliți interacționează cu substratul ducând la transformări chimice (prin acid oxalic, acid citric). Producerea de pigmenți determină formarea de pete persistente, uneori iremediabile dacă acestea ating stratul pictural.

Specii izolate din picturi: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Phoma pigmentivora, Aureobasidium, (lianții pigmenților de ulei) Geotrichum (lianți pe bază de cazeină), Mucor, Rhizopus (ulei).

În cazul picturilor de șevalet, s-a observat o succesiune a fungilor colonizatori, inițial Aspergillus, apoi Alternaria, și în final Aureobasidium pullulans.

Speciile predominante găsite pe pictură sunt Bacillus pumilus (bacterie), Aspergillus niger și Penicillium chrysogenum (fungi). Incubate experimental pe același tip de picturi, izolate, acestea nu s-au dezvoltat. Astfel se poate concluziona că prezența lui Aspergillus niger a stimulat creșterea și supraviețuirea pentru B. pumilus, efectul stimulator fiind stopat de cicloheximid, inhibitor al sintezei proteice la eucariote, nu și la pocariote (probabil prin activitatea celulozolitică și proteolitică, A. niger furniza bacteriei macromoleculele hidrolizate).

Biocleaning

Biocleaning-ul este o variantă fiabilă de restaurare, intens documentată și susținută de proiecte regionale sau europene (BIOBRUSH EVK4-2001-00055). Cercetarea vizează investigarea specificității microorganismelor (până acum studiate fiind Desulfvibrio desulfuricans, Desulfvibrio vulgaris, Pseudomonas stutzeri și altele), reducerea timpului de tratament, costuri, numărul de aplicări, sistemul de livrare. Avantajele procedurii sunt: lipsa riscurilor, simplitatea operațiilor, capacitatea de adeziune, costul scăzut, aplicarea directă.

Spre deosebire de tratamentul chimic cu fungicide, aplicarea unui control al biodeteriorării pe baza interacțiunii dintre microorganisme reprezintă o alternativă care nu afectează mediul, nu prezintă un pericol pentru animale și nu pune în pericol sănătatea omului .

Exemple: Trichoderma sp. poate fi folosită împotriva speciilor: Polyporus adustus, Polystictus hirsutus, P. versicolor, Stereum purpureum; Scytalidium lignicola împotriva Lentinus lepideus. Culturile pure de Bacillus subtilis inhibă creșterea fungilor Alternaria tenuis, Trichoderma reesei și Aureobasidium pullulans in vitro.

Primele încercări de biocleaning s-au facut în 1970 pe pânze și hârtie. În 1982 s-a făcut prima încercare de a aplica amilaza și proteaza pentru a îndepărta adezivul de pe spatele unei picturi în ulei; lipazele cantonate în gel de agaroză au fost folosite pentru picturi în ulei ; suprafețe de marmură pătate de bacteria Serratia au fost curățate cu enzima lacază.

În prezent există și se aplică amilaze, proteaze și esteraze pentru curățarea operelor de artă. Lipazele, care pot proveni din pancreas sau specii microbiene (Penicillium, Aspergillus, Bacillus), sunt folosite alături de pepsină, tripsină, proteaze (extrase din Bacillus , Aspergillus, stomac). Protocolul de biocleaning necesită cunoașterea următorilor parametri: suprafața pe care se acționează, activitatea enzimei izolate, temperatura la care enzima este activă, pH-ul).

O alternativă la curățarea enzimatică este folosirea de bacterii vii; bacteria Desulfvibrio desulfuricans îndepărteaza crusta neagră reducând sulfații la sulfiți de hidrogen.

Un studiu compară eficiența curățării cu metode chimice(30 g EDTA, 50 g carbonat de amoniu, 10 ml surfactand Contrad, în 100 ml apa distilată) cu bio-cleaning-ul (tulpină de Desulfvibrio vulgaris ATCC 29579 în Carbogel). Substratul de marmură prezenta un pattern de microfracturi umplute parțial cu ghips, acoperit de 2 straturi de cruste maronii negre. Crusta exterioară era compusă din gips și conținea particule bogate în fier, silicon și aluminiu, structura era poroasă, de forme neregulate. Stratul interior era compact, de culoare ocru (oxalat de calciuși ghips, calcit și resturi organice). Acest strat interior poartă numele de patina nobilă și spre deosebire de crusta neagră trebuie să rămână intact la curățare.

Curățarea chimică s-a facut incomplet și neuniform, în zonele albite s-a eliminat complet stratul ocru, în zonele curățate complet fiind afectată și coeziunea substratului de marmură.

În urma curățării cu ajutorul bacteriei Desulfvibrio vulgaris, aspectul marmurei devine omogen, de culoare ocru. Stratul interior ocru fiind compact, patina nobila, a rămas intactă la acțiunea bacteriei, în schimb stratul de gips din crusta neagră a fost dizolvat complet.

Ionii de calciu rezultați din dizolvarea gipsului în reacție cu CO2 din metabolismul bacterian au format calcit, care a ajutat la consolidarea prin mineralizare a operei de artă. Carbonații nou formați din bacterii sunt mai rezistenți la stres mecanic și mai puțin solubili decât calcitul anorganic (CAPPITELLI și colab., 2007).

Pseudomonas stutzeri a fost folosită pe o frescă a cimitirului din Pisa , pentru a degrada straturile organice de adeziv prin hidroliză fără a altera culoarea.

Fig. 10. Comparație între metode de restaurare a marmurei.

Deși nu a afectat structura substratului, tehnica laser nu a îndepărtat complet crusta neagră, analiza stratigrafică a arătat prezența gipsului, oxalaților și silicaților, de asemenea și o variație de culoare.

Pseudomonas stutzeri este aerotolerantă, în metabolismul său transformă sulfatul SO42- în ion de sulf S2; este foarte selectivă, netoxică și eco-compatibilă.

Testele s-au realizat pe marmură albă, marlstone și serpentine, cele mai bune rezultate obținându-se pe marmura albă. Eficacitatea depinde și de grosimea stratului și de cantitatea de metale grele, acestea influențând metabolismul și rata de penetrare a microorganismelor (GIOVENTU și colab., 2012).

Biomineralizarea

O metodă de protecție și restaurare a pietrei este folosirea de bacterii care produc precipitarea carbonatului de calciu. Microorganismele sunt izolate din pietre și identificate după analiza ADNr 16S: tulpini de Pseudomonas, Pantoea și Cupriavidus. Cei mai importanți parametri de studiat pentru aceste bacterii heterotrofe aerobe sunt: deaminarea oxidativă a aminoacizilor, degradarea ureei, utilizarea acizilor organici.

NH3+H2O =NH4+ + OH- (creșterea Ph-ului produce precipitarea CaCO3)

CO2+H2O=H2CO3=H+HCO3- = CO32- + H+

Bacteriile care posedă urează catalizează hidroliza ureei la carbonat și amoniu. Acizii organici asimilați ajută la precipitare.

Specii de Bacillus au fost folosite pentru proprietățile ureolitice; hrănite cu medii adecvate acestea produc biomineralizarea. Bacillus sphaericus a fost inițial aplicat pe calcar (Dick et al. 2006), și apoi pe beton (De Muynck et al. 2008a). Bacillus pasteurii a fost folosit pentru a umple crăpăturile din beton (Bang et al. 2001) și din cărămizi (Sarda et al. 2009). Pentru relevanța experimentului s-a folosit marmură de la Muntele Penteli (Grecia), aceeași ca la majoritatea monumentelor din Atena.

Speciile de Pantoea (P. agglomerans. P. vagans) creează ansambluri sferice și o suprafață de marmură netedă de bacterii mineralizate(vaterit). Pseudomonas chlororaphis a produs morfologii sferice în amestec cu bacili mineralizați. Bacillus licheniformis T10 a creat o suprafață de biomineral neuniformă de bacili mineralizați (vaterit). Bacillus cereus a creat un amestec de vaterit și calcit. Vateritul este reprezentat de bacterii propriu-zise mineralizate, calcitul de morfologii dendritice de cristale. Cupriavidus metallidurans a acoperit marmura cu morfologii de sfere calcaroase, bacili scurți și combinații de sfere și bacili mineralizați.(DASKALAKIS și colab., 2013)

Biomineralizarea și biocleaning-ul reprezintă tehnici fiabile și de viitor pentru restaurare.

Antagonism

În mediul natural, fungii coexistă în comunități formate din mai multe specii, fiind astfel obișnuită interacțiunea interspecifică și competiția pentru resurse.

Există două tipuri de maniferstări are competiției între fungi: prima se referă la puterea de colonizare a unui substrat nou, și se bazează pe capacitatea de dispersie, viteza de germinație a sporilor, creștere, abilitatea de a utiliza substratul; a doua se referă la agresivitatea cu care o specie invadează un substrat populat deja de o altă specie.

Antagonismul la distanță

Apare când una sau ambele specii produc enzime, toxine și alți metaboliți cu rol antifungic sau schimbă ph-ul mediului. Dintre produșii organici volatili ai fungilor amintim: alcooli, aldehide, compuși aromatici, esteri, cetone. Compușii organici care difuzează acționează la o distanță variabilă, afectând germinarea, formarea miceliului, forma acestuia, stimularea producției de enzime ligninolitice. Producția de astfel de substanțe influențează specia de fungi care urmează în dezvoltarea coloniei. (Watkinson și colab.).

Producerea de compuși organici volatili ajută microorganismele în adaptarea la condițiile de mediu, volatilitatea asigurând răspândirea pe o distanță variabilă. Interacțiunile mediate de astfel de substanțe sunt subtile, nu neapărat inhibitorii, adesea manifestate prin schimbări ale ratei de creștere și prin stoparea activității enzimelor. Efectele sunt tranzitorii, la îndepărtarea antagonistului organismele se refac. Speciile de Trichoderma sunt recunoscute pentru producerea de compuși volatili cu efect antifungic- heptanal, octanal și 2-metil-1-butanol. Dintre speciile testate Trichoderma viridae, T. pseudokoningii, T. aureoviride în antagonism cu Serpula lacrymans, cea mai eficientă s-a dovedit T. aureoviridae, inhibând creșterea miceliului de S. lacrymans cu o rată de 91,6+- 1,6%; T. viridae a avut un efect de inhibiție mai redus, de 54,1+-10,44%.

Efectul se manifestă prin inhibarea producerii a două proteine,cu posibil rol în creșterea miceliului, a căror activitate s-a normalizat după îndepărtarea antagonistului ( o proteină de 29,1 kDa și una de 32,2 kDa).

Genul Trichoderma

Genul Trichorema are un rol foarte însemnat în natură, fiind de aceea exploatat în industrie datorită capacităților sale: protejează plantele de infecțiile fungale și de patogenii bacterieni, produce enzime, antibiotice și alți metaboliți iar unele specii sunt comestibile. Colonizează plantele, animale marine, solul. Majoritatea speciilor produc pigmenți de la verde la roșu.

Cea mai importantă caracteristică este aceea că sunt antagoniști pentru patogenii plantelor prin hiperparazitism, competiție și antibioză.

Hiperparazitismul cunoaște următoarele faze: recunoașterea patogenului, atacul, penetrarea gradată a celulelor antagonistului. Acest proces este realizat prin enzime litice de degradare a peretelui celular compus din chitină și glucan. Speciile de Trichoderma produc celulaze, chitinaze, xilanaze, pectinaze, glucanaze, lipaze, amilaze, arabinaze, proteaze și alți compuși volatili. Dintre acestea, chitinazele sunt cele mai importante: endochitinaze, chitobiozidază, β-N-acetilglucosamidază. Enzimele proteolitice controlează activitatea și stabilitatea enzimelor extracelulare. Unele specii sunt capabile să producă siderofori, compuși chelatori ai fierului. Blocând ionii de fier din mediu, crează un deficit de nutrienți pentru alți fungi. Trichoderma este imună la compuși toxici eliberați de plante ca răspuns la infecție- fitoalexine, flavonoizi, terpenoizi, fenoli.

În cadrul genului s-au descoperit 180 de metaboliți secundari responsabili de antibioză, care acționează sinergic împreună cu enzimele litice. Interacționând cu plantele, în asociații ca micorizele, Trichoderma le stimulează producerea de vitamine, capacitatea de mobilizare și transport a mineralelor; unele specii produc zeaxantină și giberelină, compuși care accelerează germinarea semințelor. Unele tulpini produc acid glonic, citric, care facilitează eliberarea de ioni de fosfor și microelemente, stimulând creșterea plantelor .

Tabel 7. Activitatea enzimelor implicate în antagonism.

Afectul antagonist asupra fitopatogenilor poate fi valorificat în agricultură, fiind testat in vitro, de ex: Trichoderma inhibă dezvoltarea fungului Fusarium solani, , Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Pythium ultimum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Stemphylium radicinum.. Capacitatea de a produce celulaze poate fi exploatată în solubilizarea fibrei de bumbac, bioprocesarea deșeurilor, reciclarea hârtiei etc.

Trichoderma este un adevărat parazit pentru alte genuri de fungi gazdă. Schema de mai jos prezintă mecanismul micoparazitismului.

Ca efect al penetrării parazitului, gazda începe să prezinte o liză puternică, vacuolizarea citoplasmei, formarea timpurie de clamidospori și inducerea formării de cordoane de miceliu prin anastomozarea filamentelor hifelor (Daami-Remadi și colab.).

PARTEA PRACTICA

6.1. Scopul lucrarii

Studiul prezent urmărește identificarea și caracterizarea fungilor filamentoși implicați în procesul de deteriorare a materialelor de construcții din cladirile de patrimoniu sau cu valoare arhitecturală. După izolare și identificare s-a trecut la descrierea relațiilor ecologice în cadrul regnului, a posibilelor interacțiuni de tip antagonism.

Materiale și metode

Prelevare și izolare

În perioada decembrie 2016- ianuarie 2017 au fost preluate probe din cele trei locații, inoculate pe medii de cultură specifice (Sabouraud lichid și solid). Probele au constat în bucați de material de dimensiuni aprox. 1cmx1cmx1cm desprinse din construcții (tâmplărie, grinzi, tenciuieli, zidărie). După incubare 7 zile la temperatura camerei s-a realizat un prim pasaj pentru izolarea fungilor, apoi un al doilea (toate în plăci Petri cu medii Sabouraud).

Tehnica colorației Bleu-Cotton-Lactofenol (BCLP)

După al doilea pasaj de izolare s-a trecut la determinarea prin analiză la microscopul optic, cu obiectiv 20 X, 40 X. Tehnica Bleu Cotton Lactofenol este cea mai utilizată metodă de preparare și de observare a fungilor. Soluția are trei componente: fenol (omoară organismele vii), acid lactic (păstrează structura fungilor), bleu-coton (colorează chitina din peretele celular al fungilor). Pentru preparare s-a lucrat sub hotă în condiții sterile; pe o lamă sterilă și degresată s-a plasat o picătură de BCLP; cu o bucată de scotch tăiată s-a desprins material fungal de pe placa cu mediu; s-a plasat scotch-ul peste picătura de BCLP, evitând formarea bulelor; s-a analizat la microscop optic cu obiectiv 10 X, 20 X, 40 X.

Studii de antagonism

Testele de antagonism s-au realizat pe plăci Petri cu medii Sabouraud, pe care s-au înămânțat câte două tulpini din specii diferite, după cum urmează: s-a împărțit placa în două după diametrul cercului (D).

Caracterizarea biochimica a tulpinilor prin spectrometrie MALDI-TOF

Spectrometria de masa MALDI-TOF este o metodă analitică versatilă pentru a detecta și caracteriza amestecuri de molecule oranice, în special polimeri sintetici și biopolimeri. MALDI este prescurtarea de la Matrix-Assisted Laser Desorbtion Ionisation. Metoda de ionizare implică o rază de laser care lovește un matrix de molecule mici organice, transformându-le în ioni gazoși fără a le fragmenta și a le descompune. TOF este prescurtarea de la Time of Flight, o metodă de spectrometrie în masă care separă ionii în funcție de raportul dintre masă și sarcina electrică, determinând acest raport în funcție de timpul necesar moleculei ionizate pentru a ajunge la un detector.

Etapele spectrometriei în masă MALDI-TOF sunt: ionizarea moleculei sau mixului de analizat (se face în prezența unui matrix menit să faciliteze ionizarea absorbând energia razei laser de 337nm și trecând materia de analizat în forma gazoasă); sortarea ionilor, detectarea ionilor. Sistemul de spectrometrie în masa TOF accelerează ionii într-un câmp cu voltaj mare, care le aplică o cantitate constantă de energie cinetică. Rezultatul este că cel mai mic dintre ioni se va deplasa cel mai repede. Detectorul TOF înregistrează timpul necesar unei grupări de ioni pentru a străbate o anumită distanță. Cunoscând timpul și sarcina câmpului electric, spectrofotometrul calculează raportul masă/ încărcare energetică al fiecărui ion. (sursa online 1)

Identificarea fungilor filamentoși prin spectrometria în masă MALDI-TOF se bazează pe o bază de date ce necesită o actualizare permanentă pentru o identificare cât mai exactă.

Rezultate

Izolarea speciilor de fungi microscopici filamentoși de pe cladiri de patrimoniu

În cadrul studiului, au fost prelevate mostre de materiale degradate provenind de la două monumente istorice de clasă B din județul Neamț și de la o construcție aflată într-o zonă de protecție din București. În tabele și grafice sunt prezentate genurile izolate de pe fiecare material dintr-o anume locație, precum și numărul de apariții al acelui gen în condiții de laborator.

Conacul lui Aristide Caradja, Grumăzești, jud. Neamț

Cod LMI: NT-IV-m-B-10762

Construit între anii 1890-1895 de principele Aristide Caradja (1861-1955),în stil neoclasic, parter. Prezintă o verandă lungă pe latura de vest, trei intrări și un parc dendrologic în jur. Aristide Caradja a realizat aici celebra colecție de fluturi acum în proprietatea Muzeului Antipa (exemplare din România China, India, America Centrală și de Sud). Casa a fost retrocedată moștenitorilor în 2001, dar degradarea ei continuă.

Conacul fam. Catargi, Tupilați, jud. Neamț

Cod LMI: NT-II-a-B-10723

Pe un teren de 10 400 mp, înconjurat de un zid de piatră nefasonată, cu turnuri circulare, se întind conacul și dependințele(locuințe pentru îngrijitori, grajduri, beciuri, hambare din sec. XVI). Conacul are un etaj și o boltă de trăsură cu stâlpi și deschideri în arcadă. Situația juridică incertă a dus la distrugerea lui în timp, actualmente fiind proprietate privată.

Str. Barbu Ștefănescu Delavrancea nr. 24, București

Cladirea a fost construită între 1910-1920. În urma unui incendiu care a afecatat acoperișul, locuința a rămas expusă ploii și intemperiilor. Acestea, impreună cu folosirea utilajelor de stingere a focului au creat un climat propice dezvoltării pe pereți a diferitelor specii de mucegaiuri.

TENCUIALA cameră

GRINDA

TENCUIALA HOL

Examinarea caracterelor de cultură și de colonie și a aspectului microscopic al tulpinilor fungice izolate

În urma analizei la microscop s-au identificat 8 genuri, după cum urmează:

Mucor sp.(Fresen)

Regn Fungi,

Diviziune Zygomycota,

Clasa Mucormycota,

Ordin Mucorales,

Familia Mucoraceae

Majoritatea membrilor ordinului Mucorales sunt saprofite, iar cel mai comun gen, Mucor, este întâlnit în sol, putregaiurile plantelor, alte ciuperci etc. Ciclul de viață: sporangiosporii multinucleați germinează dând naștere unui miceliu + sau-. Miceliile de polaritate diferită, dacă ajung în proximitate unul de altul,dau naștere la zigofori, hife aeriene specializate, care se apropie una de alta prin tropism activ la distanță de câțiva mm. Când doi zigofori vin în contact, pereții fuzionează și elongația se oprește. Zigoforii se umflă în regiunea adiacentă zonei de contact și dau naștere la doi progametangi multinucleați. Prin delimitarea de zona adiacentă a zigoforului (denumită apoi suspensor), fiecare progametang devine gametang. Se produce fuziunea celulelor și a nucleilor prin distrugerea pereților celulari adiacenți, dând naștere la zigospori diploizi. La unele genuri fuzionează majoritatea nucleilor, la altele doar doi nuclei. Nucleii nefuzionați se distrug. Germinarea zigosporului se face după 30-90 de zile. Înaintea germinării se produce meioza, rezultând un miceliu haploid, cu sporangiofori cu apofiză și columelă, sporangiu cu sporangiospori. În condiții nefavorabile formează clamidospori terminali sau intercalari, sau oidii (celule individuale cu aspect de drojdii) (Moore și colab., 2011).

Fig.13 – Structuri ale genului Mucor sp.- foto: sursă proprie

Rhizopus sp. (Ehrenb. 1820)

Regn Fungi,

Filum Zygomycota,

Clasa Mucormycotina,

Ordin Mucorales,

Familia Mucoraceae

Gen ce cuprinde 10 specii saprofitice, din ordinul Mucorales, în trecut în familia Mucoraceae. Prezintă trei categorii de hife, stoloni, rizoizi și sporangiofori, la capătul cărora se găsesc sporangii rotunde, negre cu spori multinucleați imobili.

Penicillium sp. (Link, 1809)

Regn Fungi,

Filum Ascomycota,

Clasa Eurotiomycetes,

Ordin Eurotiales,

Familia Trichocomaceae

Una dintre cele mai comune specii de fungi, răspândită într-o gamă variată de habitate, sol, vegetație, aer, interior și exterior, alimente. Funcția naturală este de descompunător al materiei organice. Prezintă interes industrial datorită producției de enzime degradatoare, antibiotice etc. Reproducerea asexuată se face prin conidii, structuri susținute de conidiofori, ramificați sau nu, cu metule și fialide ce se termină cu sterigme (Moore și colab., 2011).

Simultan, structurile se înconjoară de hife vegetative ce formează o cleistotecie.

Aspergillus sp.(Micheli, 1729)

Aspergillus niger a fost descris prima dată în 1867 într-un manuscris de către botanistul francez Philippe Edouard Leon van Tieghem. Este un gen de anamorfe, cu speciile grupate în aprox. 10 genuri de teleomorfe. Nu sunt foarte selectivi cu mediul abiotic, suportând temperaturi de 6-55°C și uscăciune severă, medii nutritive variate-pot fi saprofiți, patogeni la plante, animale, oameni. Secretă cantități mari de proteine, acizi organici, metaboliți- micotoxine- aflatoxina, ochratoxina.

Reproducerea asexuată implică formarea în miceliu a unei celule cu pereți îngroșați- celulă picior, din care va crește un conidiofor care se continuă cu o veziculă terminală, cu numeroși nuclei.

Din vezicula terminală cresc fialide cilindrice, compacte, acoperind complet vezicula, din care cresc conidii uninucleate. Unele specii prezintă și metule. Reproducerea sexuată este foarte rară, pierdută în evoluție, uneori anteridiile lipsind complet, genul fiind homotalic; singura specie heterotalică este A. heterothallicus.

Fig.17 – Imagine microscopică a conidioforului și veziculei terminale -Aspergillus sp. foto: sursă proprie

Alternaria sp. (Micheli, 1729)

Regn Fungi,

Filum Ascomycota,

Clasa Eurotiomycetes,

Ordin Eurotiales,

Familia Trichocomaceae

Reproducerea sexuată se întâlnește la unele teleomorfe, care produc peritecii cu ostiole, cu asce cu ascospori. Genurile prezintă conidiile în lanțuri. Sunt specii saprofitice, responsabile de deteriorarea lemnului, plasticului, vopselelor, hranei, produselor textile etc. .

Botrytis sp. (Pers., 1794)

Regn Fungi,

Filum Ascomycota,

Clasa Leotiomycetes,

Ordin Helotiales,

Familia Sclerotiniaceae

Fig. 19–Imagine microscopică a conidioforului aparțănând genului Botrytis sp(Sursă proprie).

Trichoderma sp. (Persoon)

Regn Fungi,

Filum Ascomycota,

Clasa Sordariomycetes,

Ordin Hypocreales,

Familia Hypocreaceae

Speciile genului se întâlnesc în mod frecvent în sol și rizomorfele plantelor, în medii naturale sau agricole, în păduri, pe lemnul în degradare, în aer, praf, habitate marine în apa de băut. Unele specii sunt endofite ale plantelor, colonizatori ai mediilor naturale și artificiale, patogeni facultativi, ocupând diferite nișe ecologice. Genul cuprinde mai mult de 200 de specii, iar teleomorfa ei este genul Hypocrea; se poate hrăni prin micoparazitism. Trichoderma reesei este folosită industrial pentru producerea de celulaze și hemicelulaze, ligninaze. Cea mai mare aplicație practică o au metaboliții secundari, cu rol în apărare chimică și comunicare, rol antibiotic, rol antifungic, rol de protecție a plantei gazdă (terpene, pirone, polichetide etc.). Compușii volatili au rol în biocontrol (ciclohexani, ciclopentani, acizi grași,esteri, derivați ai benzenului).

Fusarium sp. (Link, 1809)

Regn Fungi,

Filum Ascomycota,

Clasa Sordariomycetes,

Ordin Hypocreales,

Familia Nectriaceae

Fungi filamentoși, frecvent întâlniți în sol și plante. Denumirea vine la forma fusiformă a conidiilor. Prezintă trei structuri de reproducere asexuată: microconidii(din conidiofori), macroconidii(din sporodochie) și clamidospori (pe și în hife). După plasmogamie și cariogamie, periteciile produc clone meiotice de spori recombinați. Acestea formează micelii haploide, care dau naștere la cele trei tipuri de spori mitotici. Unele specii produc micotoxine care pot afecta cerealele (fumonisină).

Epicoccum sp. (Link)

Regn Fungi,

Filum Ascomycota,

Clasa Dothidiomycetes,

Ordin Pleosporales,

Familia Pleosporaceae

Specii saprofitice, colonizează reziduuri vegetale, unele plante marine, alti fungi. Aparține categoriei Dematiacae datorită producției de melanină. Genul cuprinde peste 70 de specii și nu sunt cunoscute teleomorfele. Coloniile au culori deschide de galben, oranj, roșu, uneori striații negre sau maronii. Creșterea lor este rapidă, ajung la 6 cm în 2 zile la temperatura camerei. Formează blastoconidii întunecate, sferice, de 15-25 de µm diametru. Conidiile cresc pe o sporodochie formată din hife fibroase, care macroscopic se vede în pustule pe materialul vegetal. Sporii sunt dispersați activ prin separarea conidiei de sporodochie printr-un sept dublu. Crește la temperaturi ideale de 23-38 C, la un pH de 5-6. Produce metaboliți de interes, agenți antifungali, pigmenți. A fost utilizat în biosinteza de nanoparticule de argint și aur. Facultativ poate crește și sub apă. Pigmenții sunt folosiți ca agenți antifungali. Din el se extrage colorantul fluorescent epicocononă, folosit la analizele Western Blot. (sursa online 2)

6.3.3. Rezultatele testelor de antagonism

Fiind un proces natural întâlnit între specii diferite de fungi, în care una domină pe alta sau în care acestea își împart resursele și teritoriul, antagonismul a apărul în mod natural și în plăcile cultivate în laborator.

6.3.4. Concluziile identificărilor prin spectrometrie MALDI-TOF

În urma analizelor de spectrofotometrie MALDI-TOF, s-au identificat până la nivel de specie următoarele tulpini:

Rezultatele analizei MALDI-TOF confirmă în unele cazuri, genul stabilit prin analiza coloniei și a aspectului microscopic. În alte cazuri, ca cele prezentate în coloana Discuții, excluzând posibilitatea contaminării plăcii, se demonstrează din nou dificultatea de a izola o specie de fungi deoarece strategia de supraviețuire în natură a speciei este ca acestă să rămână latentă sub formă sporală. La intervale de timp, pe substrat se alternează specia care dezvoltă miceliul, cealaltă râmănănd sub formă de spori o anumită perioadă.

Concluzii

Fungii au colonizat mediul terestru cu mult înaintea plantelor vasculare, creând condițiile dezvoltării acestora prin eroziunea rocilor și formarea solului, furmizarea de minerale și metaboliți organici. Activitățile metabolice ale celulelor fungice, care demult au contribuit la echilibrarea ecosistemelor pe Terra, ridică însă probleme legate de biodegradarea materialelor în societatea modernă.

De asemenea, anumite procese fiziologice care le fac eficiente în natură, permitând supraviețuirea coloniei fungice sau a speciei în sine, le fac dificil de manipulat in condiții de laborator, și anume: interacțiunea antagonică (ce împiedică izolarea unei anumite specii fungice dintr-un consorțium), succesiunea speciilor în ecosistem (dezvoltarea după pasaj a unei tulpini aparținând altei specii față de cea prezentă inițial, datorită prezenței sporilor care germinează doar după eliminarea coloniilor unei alte specii, după consumarea resurselor nutritive din mediu), dezvoltarea unei culturii după incubare prelungită de 5-6 luni de la însămânțare.

Studiul realizat pe un număr de 3 clădiri istorice, din care 2 clasate în lista monumentelor istorice (conacul lui Aristide Caradja din Grumăzești și conacul familiei Catargi din Tupilați) și una în zonă istorică potejată (str. Barbu Ștefănescu Delavrancea nr. 24, București) a evidențiat prezența fungilor din genurile: Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Botrytis, Alternaria, Trichoderma, Mucor, Epicoccum, Rhizopus.

Rezultatele testelor de antagonism au arătat că puse în contact, genul Mucor domină genul Fusarium; genul Trichoderma domină genurile Fusarium, Penicillium; genul Fusarium domină genul Penicillium. Datorită invazivității crescute, a volumului mare al miceliului și vitezei de creștere colonia de Mucor tinde să se dezvolte peste cea de Trichoderma (la fel și Rhizopus ), însă Trichoderma le parazitează hifele, diminuându-le expansiunea.

Lucrarea de față este o incursiune în regnul fungilor, o prezentare generală a relațiilor din ecosisteme, o bază de pornire pentru alte studii mai amănunțite și cu specificitate mai mare. Rezultatele experimentelor sunt aplicabile atât în domeniul protecției patrimoniului și a tratamentelor de restaurare, cât și în studiul general al materialelor și al proceselor de degradare, cu implicațiile care decurg, de natură economică, socială, de sănătate, psihologică etc.

Bibliografie online:

https://en.wikipedia.org/wiki/Epicoccum_nigrum

https://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po?event=fungi&type=primary&species=17

https://en.wikipedia.org/wiki/Botrytis_cinerea

https://extension.illinois.edu/hortihints/0012c.html