Microscopia holografică digitală [604148]

Universitatea “Politehnica” din București
Facultatea de Electronică, Telecomunicații și Tehnologia Informației

Microscopia holografică digitală

Lucrare de disertație
prezentată ca cerință parțială pentru obținerea titlului de
Master în domeniul Electronică și Telecomunicații
programul de studii de masterat Optoelectronică

Conducător științific Absolventă
Conf. Dr. Ing. Marian VLĂDESC U Ing. Alexandra Cătălina
CAPĂTĂ

2017

Cuprins

CAPITOLUL 1 – Introducere in holografia digital ă ………………………….. ……….. 8
1.1 Principii general e ale holografiei digitale ………………………….. ………………………….. ………….. 8

CAPITOLUL 2 – Descrierea microscopiei holografice digitale …………………… 17
2.1 Principiul de bază a microscopiei holografice digitale ………………………….. …………………… 17
2.2 Microscopia de fază cantitativă ………………………….. ………………………….. ………………………. 21
2.3 Comparații ale microscopiei holografice analogice și digitale ………………………….. ………… 23

CAPITOLUL 3 – Difracția numerică ………………………….. ………………………….. … 25
3.1 Metode de difracție numerică ………………………….. ………………………….. …………………………. 25
3.1.1 Transformarea Fresnel ………………………….. ………………………….. ………………………… 25
3.1.2 Convoluția Huygens ………………………….. ………………………….. ………………………….. ..27
3.1.3 Spectrul unghiular ………………………….. ………………………….. ………………………….. …..28
3.2 Compararea metodelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 28
3.3 Eșantionarea digitală a hologramelor ………………………….. ………………………….. ………………. 30

CAPITOLUL 4 – Configurări digitale ale holografiei ………………………….. ……. 33
4.1 Holografia Fresnel în afara axei ………………………….. ………………………….. ……………………… 33
4.2 Holografia Fourier ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 33
4.3 Holografia planului imaginii ………………………….. ………………………….. ………………………….. 34
4.4 Holografie in linie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 36
4.5 Holografia Gabor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 37
4.6 Holografia digitală de schimbare a fazelor ………………………….. ………………………….. ……….. 37

CAPITOLUL 5 – Tehnici numerice pentru microscopia holografică digitală 41
5.1 Suprimarea termenu lului DC și a imaginii gemene ………………………….. ………………………. 41
5.2 Controlul rezoluției pixelilor în metoda de transformare Fresnel ………………………….. …….41

5.3 Desfacerea fazei optice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 43
5.4 Compensarea aberațiilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….46
5.4.1 Compensarea undelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. 46
5.4.2 Aberație cromatică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….48
5.5 Difracția cu planurile înclinate ………………………….. ………………………….. ……………………….. 49

CAPITOLUL 6 – Aplicații și tehnici speciale de microscopie digitală
holografică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 50
6.1 Microscopia biomedicală ………………………….. ………………………….. ………………………….. …..50
6.2 Holografia campului particulei ………………………….. ………………………….. ………………………. 52
6.3 Microscopia și metrologia microstructurilor ………………………….. ………………………….. …….. 52
6.4 Tomografia holografică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 53
6.5 Holografia cu coerență redusă ………………………….. ………………………….. ………………………… 53
6.6 Reflecția totală internă in microscopia holografică ………………………….. ………………………… 54
6.7 Holografia de scanare optică ………………………….. ………………………….. ………………………….. 54
6.8 Holografia cu interferențe digitale ………………………….. ………………………….. ………………….. 57
6.9 Holografia heterodinelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……59
6.10 Holografia heterodinelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….59

CAPITOLUL 7 – Holografia spectrală ………………………….. ………………………… 60
7.1 Partea teoretică a holografiei spectrale ………………………….. ………………………….. ……………. 60
7.2 Partea practică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 65

CAPITOLUL 8 – Concluzii ………………………….. ………………………….. ……………… 75

CAPITOLUL 9 – Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………….. 76

Lista acronime

1. MHD – Microscopie holografică digitală
2. CCD – Charge -coupled device – Dispozitiv cu cuplaj de sarcină
3. FOV – Camp de vizualizare
4. MEMS – Micro -Electro -Mechanical Systems – Sisteme microelectromecanice
5. CMOS – Complementary metal -oxide -semiconductor – Semicon ductor de metal -oxid
complementar
6. AH – Analogic Hologram – Holograma analogică
7. DH – Digital hologram – Holograma digitală
8. FFT – Transformata Fourier rapidă
9. DGH – Digital Gabor Holography – Holografia digitală Gabor
10. PSDH – Holografia digitala de defazare
11. DC -Termenul de ordin zero
12. DIH – Holografia interferențelor digitale
13. OPU – Desfacerea fazelor optice
14. NDFT -Transformata Fourier discretă neuniform
15. PIV – Velocime tria imagistică a particulelor
16. TIRFM – Microscopia totală de reflexie internă prin fluorescență
17. OSH – Holografia optică de scanare
18. YAG – Yttrium aluminium garnet
19. UV – Ultraviolet
20. DIC – Microscopia de contrast cu interferență diferențială
21. QPM – Microscopie în fază cantitativă
22. SLD – Diodă superlumuminiscentă
23. ADN – Acid dezoxiribonucleic
24. ARN – Acidul ribonucleic

INTRODUCERE

Lucrarea de față iși propune să prezinte principalele aspecte teoretice și practice în
domeniul microscopiei holografice digitale. Conținutul lucrării prezintă c e este o hologramă
digitală , cum se pot obține diferitele tipuri de holograme, avantajele hologramelor digitale,
precum și aplicații în domeniul microscopiei holografice digitale. Am ales această temă deoarece
este un domeniu în curs de de zvoltare , cu o varietate mare de aplicații , care au un impact
puternic asupra viitorului tehnologiei digitale. Holografi a are multe alte aplicații în afară de
redarea imaginilor tridimensionale, în ultimii ani, tehnologia trecând di n laborator în industrie, în
comunicații, medicină și inginerie.
Holografia în ziua de azi este facută digital, înregistrarea hologramelor fiind realizată cu
ajutorul unor camere video numite CCD. Holografia digitală evită prelucrarea chimică și alte
proceduri atribuite holografiei clasice și permite post -procesarea digitală a hologramei
înregistrate. Astfel, reconstrucția imaginii holografice, care conține informații despre frontul de
undă al obiectului, se face numeric cu ajutorul calculatorului și poate furniza informații
tridimensionale ale suprafeței obiectului sau datele grosimii optice.
Holografia digitală oferă o serie de avantaje semnificative, cum ar fi capacitatea de a
dobândi rapid holograme, disponibilitatea informațiilor complete despre amplit udine și de fază a
câmpului optic și versatilitatea tehnicilor de interferometrie și de prelucrare a imaginilor. Într –
adevăr, holografia digitală prin difracția numerică a câmpurilor optice permite tehnici de
prelucrare a imaginilor și a imaginilor care su nt dificil sau imposibil de realizat în holografia
spațiului real.
Procesul de holografie este dezvoltat pentru multe regiuni ale spectrului electromagnetic,
în special holografia cu raze X, cu perspect iva sa de rezoluție atomică , precum și pentru
microhol ografia organismelor vii .
În microscopia digitală holografică, o singură hologramă este utilizată pentru a se
concentra numeric asupra imaginii holografice la orice distanță. Accesul direct la informația de
fază duce la microscopia cu fază cantitativă cu s ensibilitate nanometrică a obiectelor de fază
transparente sau reflectorizante și permite manipulări ulterioare cum ar fi corecția aberațiilor.
Principiile de bază ale holografiei digitale sunt prezentate în capitolul 1 , iar o descriere
generală a microscopiei holografice digitale ( MHD ) este prezentată în capitolul 2 , cu accent pe
microscopia de fază cantitativă prin MHD . Metodele de calcul numeric al difracției sunt descrise
și comparate în capitolul 4 și un număr de tipuri principale de configuraț ii de interferometru
utilizate în experimentele holografice digitale sunt date în capitolul 5. Există numeroase tehnici
numerice care duc la capabilitățile unice și puternice ale holografiei digitale, descrise în capitolul
6. Apoi, în capitolul 7, este pre zentat un studiu al domeniilor de aplicare a MHD , precum și
tehnicile speciale care extind capabilitățile și aplicațiile holografiei digitale.
Această lucrare pune accentul pe aplicațiile micros copice ale holografiei digitale.

8
CAPITOL UL 1 – Intro ducere in holografia digital ă

1.1 Principii generale ale holografiei digitale

Termenii de hologramă și holografie au fost introduși de către Dennis Gabor, care este
considerat părintele hologramei, în 1947. Cuvântul de “ hologramă” este derivat din cuvintele
grecești “holos”, care înseamnă “întreg” sau “complet” și “gram”, care îns eamnă “mesaj”.
Teoria holografiei a fost dezvoltată de către acesta, care era un fizician ungur. Teoria sa a avut la
origine intenția sa de a crește rezoluția microscoapelor electronice .[1,2] . Dennis Gabor a
demonstrat teoria sa cu fasciculul de lumină nu cu ajutorul fasciculului electronic. Rezultatul a
fost prima hologramă care a fost realizată vreodată. Hologramele de început erau lizibile, dar
plăcile aveau multe imperfecțiuni, deoarece acesta nu a avut la dispoziție o sursă lumină
corespunzătoare, pent ru a realiza o imagine contrastantă, o hologramă clară, așa cum putem
astăzi și nici n -a folosit fascicul în afara axei fasciculului de referință. A r fi avut nevoie de o alta
sursă de lumină ș i anume: laser -ul, car e a devenit operațional în 1960 )[3].
Conceptul de hologramă digitală înregistrată este ilustrat în figura 1.1(a). Unda planului de
referință, și reflectat de la obiect interferă pe supra fața unui CCD ( Dispozitiv cu cuplaj de
sarcină ). Holograma rezultată este electronic înregistrată și păstra tă. Obiectul este în general un
corp tridimensional cu o suprafață reflectatându -se difuz, localizat la o distanță de la CCD.
În reconstucția optică imaginea virtuală apare la poziția originală a obiectului și imaginea reală
este formată tot la distanț ă , dar în direcția opusă de la CCD, vezi figura 1.1(b).
Difracția undei de lumină la o deschizătură (în acest caz o hologramă) care este montată
perpendicular pe fascicolul produs este descris de integrala Fresnel/Kirchhoff[ 4,5]:
( )
∫∫ ( ) ( ) (
)

(1.1)
Cu
√( ) ( ) (1.2)
Unde ( ) este funcția hologramei și este distanța dintre un punct în planul
hologramei și un punct în planul reconstruit. Cantitățile geometrice sunt explicate în figura 1.2.
Factorul de înclinare este setat 1, deoarece unghiurile și sunt aproximativ 0. Acesta este
valabil pentru toate algoritmele reconstruite numeric.
Pentru unda planului de refe rință ( ) este dată simplu de amplitudinea reală:
(1.3)

9
Modelul de difracție este calculat la o distantă în spatele planului CCD, ceea ce
înseamnă că se reconstruiește amplitudinea com plexă în planul imaginii reale.
Ecuația ( 1.1) este baza pentru reconstruirea hologramei numerice. Deoarece planul undei
reconstruite ( ) este o funcție complexă, ambele intensități ca și faza pot fi calculate [6].
Acesta este în contrast cu cazul reconstruirii hologramei optice, în care doar i ntensitatea este
facută vizibilă. Această interesantă proprietate a holografiei digitale este utilizată în
interferometria holografică d igitală [7,8].

Figura 1 .1 Holografia digitală
a) Înregistrarea
b) Reconstruirea cu unda de referință
c) Reconstruirea cu unda conjugată de referință

10

Figura 1 .2 Sistemul de coordonate pentru reconstruirea hologramei numerice.

Reconstrucția unei imagini reale nedistorsionate în holografia d igitală este necesară pentru a
insera în loc de în ecuația 1.1[9,10]:

( )
∫∫ ( ) ( ) .
/

(1.4)

√( ) ( ) (1.5)

Această schemă de recontruire este arătată în figura 1.1(c). Imaginea reală apare în acea
poziție, unde obiectul a fost localizat în timpul înregistrării. Trebuie menționat că pentru planul
de referință a undei definit în ecuația 1.3 ambele formule de reconstruire, ecuația ( 1.1) și ( 1.4)
sunt echivalente deoarece .
Configurarea din figura 1.1 cu planul de referință a un dei care influențează perpendicular
pe CCD este deseori utilizat în holografia digitală.
Reconstruirea imaginii virtuale este de asemenea posibilă pri n introducerea proprietățile
imaginii a unor lentile în procesul de reconstrucție numerică. Aceste lentil e corespund cu
lentilele de ochi a unui observator care privește printr -o reconstruire optică a hologramei. În cel
mai simplu caz aceste lentile cu distanța focală sunt considerate de un factor complex [11,12] :

( ) 0
( )1 (1.6)

11

Figura 1.3 Reconstruirea imaginii virtuale

Pentru o mărire de 1 a distanței focale de ⁄ trebuie sa fie utilizată.
Lentilele descrise de ecuația ( 1.6) cauzează aberări ale fazei, care pot fi corectate
înmulțind planul undei reconstuite cu un factor [13]:

( ) 0
( )1 (1.7)
Formula completă pentru recontruirea printre lentilele virtuale cu ⁄ este deci:

( )
( )∫∫ ( ) ( ) ( ) (
)

(1.8)

Reconstruirea hologramei digitale se realizeaza cu ajutorul aproximării Fresnel .
Pentru valorile și precum și pentru valorile și , care sunt mici comparate cu distanța
dintre planul de recontruire și CCD, expresia ecuaț iei (1.5) poate fi dezvoltată î n serii
Taylor [14,15 ]:

( )
( )

,( ) ( ) –

(1.9)
Al patrulea termen poate fi neglijat, dacă este mic în comparație cu lungimea de undă:

12

,( ) ( ) –

(1.10)
Sau

√
,( ) ( ) –

(1.11)
Atunci distanța constă în termeni liniari și pătratici :[16]

( )
( )

(1.12)
Cu aproximare a adunată prin înlocuirea numitoruluiî n 1.4 de în expresia următoare rezultă
pentru reconstruirea imaginii reale:

( )
.
/ ∫∫ ( ) ( ) 0
(( ) ( ) )1

(1.13)

Dacă înmulțirile în argumentul exponen țialei de sub integrală sunt scoase, una e:

( )
(
) 0
( )1
∫∫ ( ) ( ) 0
( 1

[
( )]
(1.14)
Această ecuație se numește Aproximare Fresnel sau Transformare Fresnel datorită
similarității matematice cu Transformata Fourier. Este necesară reconstruirea câmpul undei în
planul din spatele hologramei, în acest caz în planul imag inii reale.
Intensitatea este calculată prin ridicarea la pătrat:
( ) | ( )|
(1.15)
( ) ,( )-
,( )-
(1.16)
Re este partea reală și Im partea imaginară.
Formula de reconstruire pentru imaginea virtuală în aproximarea Fresnel este [17,18 ]:

13

( )
(
) 0
( )1 ( )
∫∫ ( ) ( ) ( ) 0
(

1 [
( )]
(
) 0
( )1
∫∫ ( ) ( ) 0
( 1

[
( )]
(1.17)
Pentru digitalizarea trasformării Fresnel ecuația (1.14) următoarele subtituiri sunt introduse [19]:

(1.18)
Ecuația ( 1.14) devine :
( )
(
) , ( )-
∫∫ ( ) ( ) 0
( 1

, ( )-
(1.19)
O comparație a ecuației ( 1.19) cu definiția bidimensională a trasformatei Fourier arată ca
aproximarea Fresnel până la un factor de fază sferică este Transformata inve rsă Fourier a funcției
( ) ( ) 0
( )1:

( )
(
) , ( )-
2 ( ) ( ) 0
( )13
(1.20)
Funcția poate fi digitalizată dacă funcția hologramei ( ) este eșantionat p e un raster
dreptunghiular de puncte, cu pași și de-a lungul coordonatelor. și sunt
distanțele dintre pixelii vecini pe CCD în direcția orizontală și verticală. Cu aceste valori discrete
a integralei din (1.19) sunt convertite în sume finite [20]:

14
( )
(
) , ( )-
∑∑ ( ) ( ) 0
( )1

, (
)-
(1.21)
Pentru
Conform teoriei Transformatei Fourier alături de și urmatoarea relație
există [21,22,23 ]:

(1.22)
După resubstituire:

(1.23)
Utilizând aceste ecuații (1.21) se convertesc în:
( )
(
) 6 4

57
∑∑ ( ) ( ) 0
( )1

[ (

)]
(1.24)
Aceasta este trasformata Fresnel discretă. Matricea este calculată prin înmulțirea lui ( )
cu ( ) și , ( )⁄( )- și aplicând inversa transformatei Fourier discrete
produsului. Calculul făcut cel mai eficient utilizând algoritmul Trasformatei Fourier
Rapidă(FFT). Factorul din fața sumei doar afectează faza globală și poate fi neglijat, dacă doar
intensitatea conform ecuației (1.15) este cea mai importantă. Aceasta de asemenea în cazul
diferenței de fază dintre hologramele înregistrate cu aceași lungime de undă trebuie să fie
calculate ( ( ) ).[24,25 ]
Formula discretă corespunzătoare pentru reconstruire în direcția lentilelor virtuale cu
(Ecuația 1.17) este:
( )
(
) 6 4

57
∑∑ ( ) ( ) 0
( )1

[ (

)]
(1.25)

15
O hologramă digitală tipică este aratată în figura 1.4. A fost înregistrat cu geometria figurii 1.1.
Obiectul este plasat departe de matricea CCD -ului de 1024 pixeli cu
distanțe între pixeli d e de . Lungimea de undă este 632.8nm. Reconstruirea
numerică conform ecuației (1.14) respectiv (1.24) este demonstrată în figura 1.5. Imaginea reală
a unui zar utilizat ca obiect este observabilă. Partea mai luminată din centre este unda
reconstruită nedifractată și corespunde cu primul termen din partea dreapta a ecuației (1.6).
Deoarece geometria în afara axei imaginii este spatial separată de la ordinea termenului zero.
Cealaltă imagine (virtuală) este în afara focalizării în aceasta re construcție [26].
O proprietate interesantă a holografiei este aceea că fiecare parte din hologramă conține
informații despre întregul obiect. Acest lucru este ilustrat de hologramele din figurile 1.6 și 1.8,
unde maști negre acoperă aproape jumătate din su prafețele hologramei. În ciuda faptului acesta
întregul cub este vizibil în reconstruirile fără obstacole, figurile 1.7 si 1.9. Maștile sunt vizibile
ca niște umbre în odinul temenului zero. Reducerea numărului efectiv de pixeli duce la reducerea
rezoluție i în imaginile reconstruite. Acesta corespunde măririi petei datorită reducerii
deschizăturii în reconstruirea hologramei optice. [27,28].
Conform ecuației1.23 distanțele pixelilor în imaginea reconstruită și depind de
distanta de reconstruire aleasă pentru reconstruirea numerică. Acest lucru se întâmplă
deoarecere ecuația (1.23) corespunde rezoluției limitate a difracției sistemelor optice: holograma
este deschizătura unui sistem optic cu lungimea laterală . Conform teoriei difracției a unui
model difractat se dezvoltă într -o distanță în spatele hologramei. Unde este deci
jumătate de diametru din discul aerisit sau diametrul petei în planul imaginii reconstruite, care
limitează rezoluția. Acest lucru poate fi privit ca un al goritm de „măsurare naturală”, setând
rezoluția imaginii, reconstruite cu o transformare Fresnel discretă, totdeauna la limita
fizică. [29,30 ].

Figura 1.4 Hologramă digitală

Figura 1.5 Reconstruirea numerică

16

Figura 1.6 Hologramă digitală mascată

Figura 1.8 Holograma digitală mascată

Figura 1.7 Reconstruirea

Figura 1.9 Reconstruirea

17
CAPITOLUL 2 – Descrierea microscopiei holografice digitale

2.1 Principiul de bază a microscopiei holografice digitale

O instalare de bază pentru microscopie holografică digitală (MHD ) constă dintr -o sursă
de iluminare, un interferometru, o cameră de digitizare și un calculator cu programe necesare.
Cel mai adesea, un laser este utilizat pentru iluminarea cu coerența necesară pentru a produce
interferențe. Au fost utilizate toate tipurile de lasere, de la laserele He -Ne și laserele pompate
prin diode, până la laserele YAG dub late (adesea denumite pur și simplu ca un laser în stare
solidă solid ă), laserele cu argon, lasere cu colorant acordabile și Ti: Safir laser in femtosecunde .
Pentru tehnicile cu lungimi de undă multiple, două sau mai multe lasere diferite pot fi cuplate la
un interferometru, sau poate fi folosit un laser t unabil [31,32] .
Există, de asemenea, tehnici de coerență redusă, în scopul reducerii petelor si a
zgomotul ui de interferență, sau generarea de contur sau a imaginilor tomografice.

Fig 2.1 (a)Interferometru Michelson pentru microscopia holografică digitală a specimenului
reflectorizant ;
(b) Interferometru Mach -Zehnder pentru microscopia holografică digitală a specimenului
transmisiv.
BS: Divizor de fascicul luminos ; L: lentile.

18
Poate fi utilizat un laser cu impulsuri scurte (picosecunde sau femtosecunde), sau un laser
tunabil poate fi transformat într -o sursă de bandă largă prin eliminarea elementului de reglare.
Chiar și un LED are de obicei o lungime de coerență de aproximativ 10 μm, care poate fi
suficientă pentru microscopia holografică. MHD utilizând un laser cu infraroșu de 10,6 μm CO2
[33], cu radiații moi profilate UV (193 nm), [34] și 32 -nm [35].
Există două tipuri principale de interferometre, interferometrul Michelson pentru obiecte
reflectorizante ș i interferometrul Mach -Zehnder pentru obiecte transmisibile, ele sunt ilustrate în
Fig 2.1. În fiec are diagramă, fascicolele verde de lumină reprezintă intrarea de la laser, albastru
deschis este calea de referință a fascic ulului, iar roșu deschis ilustrează formarea imaginii unui
punct de obiect. În ambele modele, obiectul este iluminat cu un plan de undă , iar referința ajunge
la planul CCD cu aceeași curbură a frontului de undă ca undă obiect, cu excepția unei deplasări
în unghiul de incidență pentru holografia în afara axei. Tipurile de interferometre Mach -Zehnder
necesită mai multe componente, dar oferă o mai mare flexibilitate în aliniere, în special atunci
când se utilizează optica imagistică microscopică. Interferometr ele pot include, de asemenea,
diferite deschideri, atenuatoare și optica de polariz are pentru a controla referința ș i raportul
intensității obiectului. Optica de polarizare poate fi utilizată și în scopul explicit al imaginii
birefringenței. De asemenea, p ot exista diferite tipuri de modulatori, cum ar fi optica montat ă pe
piezo, modulatori de fază cristalină lichidă, modulatori acuso -optici sau electro -optici pentru a
stabili semnale modulate. Pentru mărire se pot utiliza tehnici precum configurația hologr afică
Fourier [36] fără lentile [36], dar în practică mărirea realizabilă este limitată și este preferată și
necesară o mărire explicită a obiectivelor cu obiectiv microscopic. Un alt obiectiv poate fi
utilizat în brațul de referință pentru a se potrivi cu curburile obiectului și a fazelor de referință de
referință.

Fig. 2.2 Procesul de microscopie holografică digitală (ținta de rezoluție) FOV(C âmpul de
vizualizare )= 200 × 150 μm, 1024 × 768 pixeli:
(a) holograma, cu detaliile prezentate în figură ;
(b) spectrul unghiular, cu galben încovoiat zona trece -filtru pentru reconstrucție;
(c) imaginea amplitudinii;
(d) imaginea de fază.

Există multe tehnici versatile în holografia digitală care compensează diferitele tipuri de
aberații și imperfecțiuni ale sis temului optic și, prin urmare, în comparație cu holografia
convențională, cerințele optice și mecanice pot fi semnificativ mai puțin stricte.
De obicei, pentru captarea și digitalizarea unui model de interferență holografică se
foloseste un aparat de foto grafiat CCD sau, mai recent, a camerelor CMOS .
Dimensiunea pixelilor acestor dispozitive este de câteva microni cu număr de pixeli de
aproximativ 10002. Acești parametri sunt principalii factori limitativi în rezoluția MHD și

19
prescriu gama de aplicații, dar se așteaptă ca aceștia să continue să se îmbunătățească în
următorii ani. Modelul de holograme capturat este digitizat de aparatul de fotografiat sau dintr -un
dispozitiv de preluare a cadrelor și este introdus în calculator ca o matrice de 2 -D de întregi cu
rezoluție de 8 biți sau mai mare în tonuri de gri. Sarcina principală a calculatorului este să
efectueze difracția numerică pentru a calcula imaginea holografică ca o serie de numere
complexe 2 -D. În plus, programul de calculator gestionează un număr d e alte sarcini, cum ar fi
pre și post procesarea imaginilor, redarea și stocarea imaginilor, precum și sincronizare sau alte
controale necesare ale aparatului.
Un exemplu de proces MHD este prezentat în Fig. 2.2 folosind o tin ta de r ezolutie cu
camp de vedere (FOV = 200 × 150 μm2). Figura 2.2 (a) este hologr amă, cu detaliile afișate în
inserție, unde sunt vizibile marginile de interferență. Figura 2.2 (b) este spectrul unghiular
(transformarea Fourier), care prezintă picurile de imagine de ordin zero și cele două imagini.
Unul dintre termenii gemeni este selectat cu un filtru de banda numeric (cerc galben). Holograma
filtrată este apoi utilizată pentru difracția numerică pe o distanță corespunzătoare, ceea ce are ca
rezultat imaginea holografică reconstruită ca o matrice 2 -D de numere complexe. Imaginile de
amplitudine și de fază din 2.2 (c), 2.2 (d), se obțin prin luarea mărimii absolute și a fazei mat ricei
complexe. Imaginea de fază reprezintă un profil de fază al câmpului optic reflectat de suprafața
obiectului sau transmis printr -o grosime a unui obiect transparent. Profilul de fază are precizia
unei fracții de lungime de undă optică și, prin urmare, prezintă variații nanometrice ale suprafeței
sau grosimea optică a specimenului. În Fig. 2.2 (d), un fel de scame minuscule sunt vizibile,
aparent o parte din grosimea lungimii de undă, pe care imaginea de amplitudine o pierde
complet. Scara de culori a i maginii fazelor este de 2 π de la albastru la roșu. Suprafața obiectului
este ușor înclinată față de frontul de referință al undei și astfel de aberații pot fi compensate prin
tehnici numerice descrise ulterior.
O trăsătură distinctivă a holografiei este conținutul 3 -D al informațiilor despre imagine.
În MHD , o singură hologramă este utilizată pentru a reconstrui câmpul optic la orice
distanță de hologramă, în limita metodei de aproximare folosită. De exemplu, Fig. 2.3(a) prezintă
o hologramă a unui parame tric. Din holograma unică, imaginea se calculează la distanțe diferite,
care apoi sunt asamblate într -un clip video din 2.3(b). Afișează imaginea parametric care trece
printr -o focalizare optimă, precedată și urmată de imagini mai defocalizate, emulate rot irea unui
buton de focalizare pe un microscop convențional. În Fig. 2.4(a), sunt capturate o serie de
holograme ale unui parameci viu și mai multor euglen e. În scenă, parameciu și euglenele înoată
nu numai în direcții laterale, ci și în adâncimi variate. Î n microscopia video convențională, planul
focal ar fi fost fixat și orice s -ar întâmpla să se afle în acest plan ar fi înregistrat, dar informațiile
despre obiecte care nu se află în planul focal ar fi pierdute definitiv. Cu MHD , filmul holografic
este procesat prin calcularea imaginilor în timp ce se ajustează distanțele de reconstrucție pentru
a urmări un anumit specimen în timp ce înconjoară în sus și în jos volumul de obiecte 3D.
Filmele imaginilor de amplitudine și de fază astfel calculate sunt pre zentate în Fig. 2.4 (b)
și 2.4 (c) și respectiv. În realitate, filmul holografic este o înregistrare completă a spațiului 4 -D a
volumului obiectului.

20

Fig. 2.3 Focalizare numerică MHD pe parameciu
(a) o singură hologramă capturată de aparatul de fotografiat (FOV = 250 × 250 μm, 464 ×
464 pixeli);
(b) video dintr -o serie de imagini holografice calculate la diferite distanțe.

Fig. 2.4 Filme holografice de parame ciu și euglenă :
(a) holograme (vi deo);
(b) imagini de amplitudine (video) ;
(c) imagini de fază (video). (FOV = 250 × 250 μm, 464 × 464 pixeli).

21
2.2 Microscopi a de fază cantitativă

Multe probe biologice microscopice, cum ar fi celulele vii și componentele lor
intracelulare, sunt în mare parte transparente și, prin urmare, problematice pentru microscopia cu
câmpuri luminoase convenționale. Au fost dezvoltate mai multe tehnici pentru a face vizibile
obiecte de fază transparentă [37] care au jucat roluri foarte importante în dezvolta rea biologiei și
medicinii moderne.
De exemplu, în microscopia cu câmp întunecat, numai centrele și limitele de împrăștiere
contribuie la semnalul imaginii cu un fundal zero. În microscopul cu contrast de fază Zernike,
variația fazei este transformată în v ariație de amplitudine prin utilizarea unei plăci de fază și a
unei filtrări spațiale. În microscopia de contrast cu interferență diferențială (DIC), interferența a
Două componente de polarizare prin retezare are ca rezultat imagini care au un efect de umb ră și
astfel oferă o percepție 3 -D asupra obiectului. Microscopia cu interferențe, utilizând un obiectiv
Michelson, de exemplu, produce bretele de grosime egală cu un obiect transparent. Deși aceste
tehnici sunt e ficiente în a face vizibile obiecte transpa rente, conversia de la fază la amplitudine
este neliniară și există artefacte semnificative în imagini cum ar fi halo -ul în contrastul fazei
Zernike și dispariția contrastului de -a lungul direcției perpendiculare pe retezare în DIC. Aceste
tehnici nu produ c imagini faze cantitative.

Fig. 2.5 Procesul de microscopie holografică digitală (celule de ceapă) (FOV = 100 × 100
μm, 416 × 416 pixeli):
(a) holograma;
(b) spectrul unghiular ;
(c) imaginea amplitudinii ;
(d) Imaginea fazei;
(f) imaginea de fază în vizualizarea pseudo -3-D.

Faza optică a luminii transmise prin obiecte transparente poate transmite informații
cantitative despre obiect, cum ar fi grosimea fizică și indexul de refracție [38], care la rândul lor
sunt funcții de densitate fizică sau propri etăți de concentrare chimică. Măsurătorile de mare
precizie ale fazei optice pot evidenția modificări subtile ale acestor parametri care însoțesc
procesele celulare. Pentru a obține imagini de fază cantitativă, se poate efectua o măsurare
interferometrică a unui fascicul de lumină concentrat asupra unui obiect și se poate scana
fasciculul peste obiect în mod raster. Profilele optice bazate pe interferometre de scanare sunt
deosebit de potrivite pentru aplicațiile imagistice în știința materialelor, ca în ME MS și
nanofabricare, datorită gradului de înaltă precizie obținut și naturii statice a obiectelor care sunt
înregistrate [39,40].
Pe de altă parte, constrângerile de viteză și complexitatea mecanică a interferometrelor de
scanare pot restricționa în mod se mnificativ gama de aplicații în imagistica biomedicală [41],

22
unde este necesar să se facă observații ale proceselor dinamice în medii foarte diferite. S -au
înregistrat unele evoluții recente în microscopia cu fază cantitativă 2 -D.
În microscopia de interf erență cu schimbarea fazelor [42,43], imaginea cantitativă a fazei
se obține dintr -o combinație de trei sau mai multe interferograme. Există, de asemenea, o metodă
non-interferometrică de extragere a imaginilor de fază cantitativă de la proprietățile de fo calizare
diferențială ale imaginilor cu intensitate luminoasă în câmp [44,45].
Holografia digitală este un proces foarte eficient pentru obținerea unei microscopii cu
fază cantitativă de înaltă precizie. Imaginea de fază este imediat și direct disponibilă de îndată ce
se calculează matrice complexă 2 -D a imaginii holografice. Este necesară o singură expunere
holografică. Nu implică scanarea raster. Cel mai important, imaginea de fază este o reprezentare
cantitativă a profilului obiectului cu precizie nanome trică și chiar subnanometrică [20,21,46 -48].
Un exemplu de imagistică MHD a unui strat de celule de ceapă este prezentată în Fig. 7,
în care Fig. 2.5 (a) este holograma și fig. 2.5 (b) este spectrul său unghiular. Din cauza structurii
specimenului, vârf urile spectrale sunt mai difuze comparativ cu Fig. 2.5. Figura 7 (c) este
imag inea de amplitudine, analogă cu c eea ce se vede printr -un microscop convențional și Fig. 2.5
(d) este imaginea de fază. Celulele de ceapă au aparent grosimi de câteva microni și , prin urmare,
profilul de fază variază de mai multe cicluri de radiani 2 π. Un algoritm de dezvelire în fază de
domeniu public este utilizat pentru a elimina discontinuitățile 2 π din Fig. 2.5 (e) și este redată în
perspectiva pseudocolor pseudo -3-D din Fig. 2.5 (f). Figura 2.5 (f) este pseudo -3-D în sensul că
profilul înălțimii aparente este profilul grosimii optice care include atât grosimea fizică, cât și
variația indexului și trebuie să f im atenți la interpretarea unei astfel de imagini. Figura 2.6
afișează câteva exemple de imagini cu microscopie în fază cantitativă (QPM) prin MHD . Figura
2.6 (a) este un grup de trei bare pe o tinta de rezolutie. Nivelul de zgomot din zona plană a
imagin ii este măsurat la 3 nm, iar grosimea filmului de crom este măsurată la aproximativ 50 nm,
conform estimării producătorului. Figurile 2.6 (b), 8 (c) sunt celulele SKOV -3 ovariene fixe,
unde se pot identifica mai multe componente intracelulare cum ar fi mem brana nucleară și
cromozomii. Figura 2.6 (d) prezintă mai multe celule roșii sanguine, în timp ce în Fig. 2.6 (e) se
observă o pliu a celulei epiteliale a obrazului, precum și nucleul și mitocondriile. Figura 2.6 (f)
este o imagine a unui cristal mic de cu arț în nisip comun.

23
Fig. 2.6 Exemple de microscopie de fază cantitativă prin holografie digitală:
(a) tinta de rezoluție (25 × 25 μm, 452 × 452 pixeli);
(b) celulele ovariene SKOV -3 (60 x 60 pm, 404 × 404 pixeli);
(c) celula ovariană SKOV -3 (60 × 60 pm, 404 × 404 pixeli);
(d) celulele roșii din sânge (50 × 50 μm, 404 × 404 pixeli);
(e) celula epitelială a obrazului (60 × 60 μm, 404 × 404 pixeli);
(f) cristal de cuarț de nisip (60 × 60 μm, 404 × 404 pixeli).

2.3 Comparații ale microscopiei holografice analogice și digitale

Există o serie de diferențe semnificative între hologramele analogice (AH -Analogic
Holograms) și digitale (DH – Digital holograms ). Cel mai evident, DH nu implică procesarea
fotochimică. Prin urmare, DH este ordine de mărime mai rapidă și poate fi efectuată la rate
video. Hardware -ul suplimentar necesar în DH este camera CCD și un computer, în timp ce
nevoia de facilități camere întunecate și o sursă de produse chimice nu este necesară. Mai mul t,
datorită sensibilității ridicate a CCD în comparație cu emulsia fotografică, timpul de expunere
este redus cu ordine de mărime. De exemplu, o zonă a pixelilor CCD de 100 μm2 poate detecta
cât mai puțini fotoni, în timp ce o zonă similară a unei plăci fo tosensibile de înaltă sensibilitate
necesită milioane de fotoni.
Timpul scurt de expunere l a rândul său implică o mult mai redusă cerință privind
stabilitatea mecanică a aparatului. Mesele optice grele cu izolare prin vibrații nu sunt adesea
critice. Pe d e altă parte, problema principală a DH este rezoluția redusă. Un pixel tipic CCD este
de mai multe microni, iar granulele pe o emulsie fotografică pot fi de 2 ordine de mărime mai
fine. Acest lucru limitează frecvența spațială a marginilor și, prin urmare, mărimea unghiulară a
obiectului la câteva grade pentru DH, în timp ce pentru AH este posibil un maxim de 180 de
grade. Efectul parallax familiar al hologramelor de afișare ale AH nu este în prezent posibil în
DH [49]. Cu toate acestea, rezistența reală a DH este întreaga gamă de tehnici numerice
puternice care pot fi aplicate odată ce holograma intră într -un computer. Un exemplu simplu, dar
semnificativ, se referă la Fig. 2.1 unde o lentilă este utilizată pentru a mări holograma FOV
pentru a se potrivi dim ensiunii CCD. Odată ce computerul citește holograma într -o matrice,
trebuie doar să specificați dimensiunea FOV și lungimea de undă și să procedați pentru a calcula
difracția numerică. Cu toate acestea, în AH, pentru a citi în mod corespunzător holograma m ărită
sau demagnificată, lungimea de undă trebuie, de asemenea, să fie redusă proporțional, o sarcină
foarte greoaie și cea mai puțin posibilă în majoritatea cazurilor. Un alt exemplu este
interferometria holografică utilizând mai multe lungimi de undă. În interferometria AH,
hologramele multiple sunt produse și repoziționate exact și, în mod ideal, fiecare hologramă
trebuie să fie iluminată cu o lungime de undă diferită, care poate fi fizic imposibil. Cel mai
adesea hologramele suprapuse sunt iluminate cu o singură lungime de undă, iar aberațiile
rezultate sunt inevitabile. Cu toate acestea, în DH, suprapunerea constă pur și simplu dintr -o
adăugare de mai multe matrice numerice. Nu există nicio limitare a numărului de tablouri și, în
plus, există modalități de preprocesare a rețelelor pentru a compensa aberațiile cromatice și alte
aberații dacă sunt prezente. Mai multe exemple de putere de prelucrare numerică în DH vor
deveni evidente în următoarele discuții.

24
Datorită sensibilității sale și a versatilității tehnice, microscopia în fază cantitativă este o
zonă foarte importantă și activă de cercetare și aplicații în holografia digitală [20,21,46].
Aberațiile sau alte deformări ale flancurilor de undă pot fi ușor compensate prin utilizarea unui
val de referință de potrivire [22,50,51]. Afisarea în fază optică în mai multe lungimi (vezi
secțiunea 6.3) permite imagistica nanometrică de fază de precizie pe o gamă de micrometri fără
multe probleme asociate cu metodele obișnuite de desfacere a software -ului [23,52]. Aplicația de
microscopie biomedicală este o zonă care poate beneficia în mod semnificativ de noile
capabilități ale holografiei digitale
Prin furnizarea unor metode de evidentiere a unor modificari subtile in stările fizice si
fiziologice ale celulelor si tesuturilor [19,47,53 -55], fara etichetari, minim invaziva si extrem de
sensibile. Materialele și tehnologiile MEMS pot utiliza, de asemenea, holografia digitală în
caracterizarea și testarea diferitelor structuri [56 -61].

25
CAPITOLUL 3 – Difracția numerică

3.1 Metode de difracție numerică

Există o serie de metode diferite pentru calcularea numerică a câmpului de difracție.
Precursorii holografiei digitale [13,62] au implicat holografi a Fourier și, prin urmare, au
necesitat o singură transforma re Fourier pentru reconstrucție. Acest lucru a fost semnificativ din
cauza limitărilor privind puterea computațională. Mai multe abordări comune în holografia
digitală au fost metodele de transform are Fresnel și Huygens, precum și, mai recent, metoda
spectrului unghiular [27,63]. Aceste metode sunt strâns legate între ele, iar terminologia nu este
uniformă. Metoda de transformare Fresnel este o traducere digitală directă a formulei de difracție
Fresnel și, prin urmare, se poate face o comparație directă a datelor digitale .
Rezultate cu expresii analitice, care sunt în mare parte dezvoltate folosind aproximarea
Fresnel.
Metodele de convoluție și spectru unghiular Huygens par foarte asemănătoare di n punct
de vedere analitic, însă implementarea lor digitală duce la diferențe semnificative, după cum se
descrie în continuare. Dintre cele trei metode, numai metoda spectrului unghiular nu necesită o
distanță minimă de reconstrucție și are alte avantaje. Alte metode de difracție numerică includ
abordarea wavelet sau Fresnelet [64,65], transformarea fourieră fracționată pentru sisteme
extrem de astigmatice [66 -69] și ferestre prin analiza Fourier [70]. Diagrama spațială Wigner
este utilizată pentru analiza spațiului -lățime de bandă a formării imaginii holografice [71 -73].
Funcția de transfer optic 3 -D (OTF) pentru MHD este dată în Ref. 74.

3.1.1 Transformarea Fresnel

Sub aproximația Fresnel, propagarea propagării câmpului optic dintr -un plan ∑ 0 0 la z =
0 la un alt plan ∑ de -a lungul axei z este dat de ecuatia. (1):

( ) ( ) 0
( )1 * ( ) ( )+[ ] (1)

( )
0
( )1 (2)

Metoda de transformare Fresnel implică, prin urmare, o singură transformare Fourier și
poate fi implementată eficient prin utilizarea transformării Fourier rapide (FFT) [14, 27, 46, 75 –
80]. Pentru calculul numeric, o zonă X 0 × Y 0 a câmpului de intrare E 0 (x0, y0) este probată pe o
matrice Nx × Ny cu dimensiunea pixelilor δ x0 × δ y0. Câmpul de ieșire este apoi o altă matrice
Nx × Ny cu suprafața X × Y și mărimea pixelilor δx × δy. Un exemplu de difracție numerică prin
metoda de transformare Fresnel este prez entat în Fig. 3.1, unde modelul de intrare la z = 0 este
litera "F" într -un ecran opac cu o suprafață de 100 × 100 μm2 cu 256 × 256 pixeli, iar lungimea
de undă se presupune a fi λ = 0,633 μm.

26

Fig. 3.1 Difracția numerică prin metoda de transformare Fre snel. Fiecare cadru este de
100 × 100 μm2 cu 256 × 256 pixeli. Rândul superior este imaginea de amplitudine, iar fundul este
imaginea de fază, la distanțe 10, 30, 50, 100 și 200 μm și λ = 0,633 μm.

Fig. 3.2 Comparația metodelor de difracție numerică pentru propagare pe o gamă de z = 0
~ 250 μm:
(a) tran sformarea Fresnel
(b) convoluția Huygens
(c) metodele de spectru unghiular. Rândul superior este profilul de amplitudine, iar rândul
inferior este profilul de fază.

Rândul superior arată amplitudinea câmpului difracționat la distanțe de la z = 10, 30, 50,
100 și 200 μm. Rândul de jos prezintă modele de fază corespunzătoare. În imaginile de fază,
factorul exp ( -ikz) a fost înmulțit pentru a elimina variația fazei rapide din cauza propagării
globale a z. Un pixel în E (x, y; z) corespunde cu
, care în ∑ -plan corespunde unde
X0 este dimensiunea planului ∑ 0.

27

(3)

Adică dimensiunea pixelului și mărimea planei plane cresc liniar cu distanța, așa cum
este evident în Fig. 3.1. De fapt, câmpul de vedere la cele cinci dist anțe este de 16, 48, 81, 160 și
320 μm. Există metode pentru a aborda problema re zoluției pixelilor neconstante, este evidentă
prezența unei distanțe minime pentru a obține un model de difracție valid. Pentru a evita aliasing
[81], planul de ieșire ∑ Trebu ie să fie cel puțin la fel de mare ca și planul de intrare ∑ 0, ceea ce
duce la
. Figura 3.2 (a) prezintă o secțiune transversală yz a propagării într -un interval
de z = 0 ~ 250 μm de -a lungul unei linii verticale indicate de săgeata albastră din Fig. 3.1. Locația
= 62μm este indicată cu o săgeată roșie în Fig. 3.2 (a), iar la distanțe mai scurte se observă
împachetarea și aliasingul imaginii de ieșire calculate.

Fig. 3.3 Difracția numerică prin metoda spectrului unghiular, cu același set de parametri ca în
Fig. 3.2.

3.1.2 Convoluția Huygens

Difracția poate fi, de as emenea, calculată ca o integra lă a convoluției :

( ) { * + * +} (4)

( )
[ √ ] (5)

28
Astfel, convoluția Huygens este calculată cu trei transformări Fourier [18,27,76,82,83].
Difracția numerică prin convoluția Huygens utilizând același set de parametri ca în Fig. 3.1 este
prezentat în fig. 3.2 (b) și 3.3. Comportamentul pe distanțe scurte este semnificativ mai bun
decât metoda Fresnel. De asemenea, rețineți că se poate utiliza Fresnel ca o aproximare a SH și
obținerea de rezultate cu calități similare. O astfel de aproximare, cu toate acestea, nu este cu
adevărat necesară.

3.1.3 Spectrul unghiular

Difracția este calculată prin metoda spectrului unghiular în conformitate cu care necesită
două transformări Fourier [19,63,84 -89].

( ) { * +[ ] [ √ ] (√
)}, – (6)

Pentru microscopia holografică planul imaginii, unde câmpul de intrare E 0 poate fi de
fapt o imagine mărită a unui obiect microscopic, dimensiunea efectivă a pixelilor poate fi mai
mică decât lungimea de undă, iar argumentul rădăcinii pătrat d in Ecuatia. ( 6) poate deveni
negativ în părți ale domeniului spectral, iar apoi este necesară funcția de cerc.
Difracția numerică prin spectrul unghiular folosind același set de parametri ca în Fig. 3.1
este prezentat în fig. 3.2 (c) și 3.4. Această metodă oferă imagini de difracție valide la distanțe
scurte, până la zero.

3.2 Compararea metodelor

Referindu -ne la Fig. 3.5, metoda spectrului unghiular se bazează pe propagarea undelor
plane. Eșantionarea undelor plane de către pixelii discreți ai CCD nu variază în funcție de
distanță și, prin urmare, metoda spectrului unghiular nu are nici o limitare a distanței. Pe de altă
parte, metoda de transformare Fresnel se bazează pe propagarea sfericelor de sferice (sau
aproximari parabolice).

29

Fig. 3.4 Propagarea (a) undelor plane și (b) undelor sferice în spațiul numeric digitizat.

Fig. 3.5 Difracția numerică prin metoda de convoluție Huygens, cu același set de parametri ca în
Fig. 3.1.

Când centrul de curbură este prea aproape de matricea CCD, loca l frecvența de franjuri
pe planul CCD poate fi mai mare decât frecvența Nyquist. Aceasta se întâmplă atunci când
distanța este mai mică decât √(
) ., care în exemplul nostru este de 72 μm.
Comportamentul câmpului de difracție calculat prin cele trei metode într -un interval de z = 0 ~
250 μm este arătat în Fig. 3.2. Mai mult, există, de asemenea, o distanță maximă care oferă
modele de difracție corecte pentru metoda de transformare Fresnel. P entru distanțe destul de
mari, perioada de margine devine mai mare decât întreaga matrice CCD, fără înregistrarea
informațiilor de difracție. Aceasta se întâmplă atunci când distanța este mai mare decât

. care, pentru exemplul nostru numeric, e ste de 7900 μm. Spectrul obișnuit nu are nici această
limitare. Trebuie remarcat faptul că terminologia și aproximările relevante ale diferitelor metode

30
din literatura de specialitate nu sunt uniforme, iar compararea rezultatelor, cum ar fi distanțele
minime și maxime, trebuie făcută cu puțină grijă [90].

3.3 Eșantionarea digitală a hologramelor

Dimensiunea finită și eșantionarea discretă de către matricea CCD modifică proprietățile
imagistice holografice pe care le -am obținut în Sec. 2.2 [[73,76,80,91 -94]. Să presupunem că
dimensiunea matricei CCD este X0 × Y0 cu pixeli Nx × Ny, astfel încât pitchul pixelului să fie
δx0 × δy0 = (X0 / Nx) × (Y0 / Ny). Să presupunem, de asemenea, că aria sensibilă a unui pixel
CCD este γxδx0 × γyδy0, unde γx și γy sunt factorii de umplere.

( ) (
) [ (
) (
)]
(7)

Funcția de eșantionare CCD este scrisă ca [93,95 -97] unde din nou abreviem termenii y
și, de asemenea, renunțăm la indicele γ. Funcția de pieptene (x / δx) este o serie de funcții delta
cu intervale δx, iar funcțIa rectangulara a dreptunghiului (x / a, y / b) are o valoare de unu în
interiorul dreptunghiului cu dimensiunea a × b și zero în exterior.

, ( ) ( ) –
∫ ( ) ,
(

) 4

5

4

5-
(8)

Considerăm formarea imaginii holografice prin surse punctuale și multiplicăm funcția de
eșantionare P (x 0, y0) în interiorul integratului de difracție Fresnel.

, ( ) ( ) –
∫ ( ) ,
(

) 4

5

4

5-

Efectul funcției de eșantionare asupra integratului este, pentru o funcție f (x 0),

31
∫ ( ) ( ) ∑∫ ( )
( )
( )
(9)

De asemenea, rețineți că la poziția imaginii holografice z = Z ± și integrarea și sumarea sunt ușor
de realizat.

( )
, ( ) ( ) – 6
4

5 7
6
( )
7 [
( )
]
[
( )
] 6
( )
7

(10)

Linia inferioară a Ecuația (10) arată efectul eșantionării digitale [76]. Funcția sinc are o lățime de

între primele zero. Pentru un factor mic de umplere γ → 0, imaginea este uniformă în
amplitudine în planul imaginii. Pe de altă parte, integrarea pe suprafața pixelil or cu un factor de
umplere mai mare are drept rezultat vignetarea, în special pentru distanța mai mică a imaginii Z±.
Factorul sine -peste -sine al Ecuația (10) dă rezoluția laterală a unei imagini punctuale
, care
arată dependența așteptată de d iafragma numerică a matricei camerei [32]. De asemenea, rețineți
că imaginea punctuală se repetă pe o perioadă de
. Această perioadă trebuie să fie mai mare
decât dimensiunea
A matricei camerei [81], care conduce la distanța minimă zmin = X ± 22λN, așa cum se vede în
Sec. 3 .1.
Pentru a estima rezoluția axială, să presupunem că toate cele trei puncte sursă sunt pe axa z.
Apoi, câmpul construit de -a lungul axei z este dat de:

( ) ∑∫ .
/
.
/

6
(

) 7
(11)

32

Fig. 3.6 Holografia Fresnel în afara axei. Albastrul reprezintă fascicule de referință, iar roșu
reprezintă propagarea dintr -un punct pe obiect: (a) înregistrarea și (b) reconstrucția.

Suma integrală este aproape de zero, cu excepția cazului în care faza exponenței variază lent în
intervalul X 0, ceea ce conduce la o rezoluție axială de 2λ
.
Pentru o configurare de microscopie holografică cu un obiectiv obiectiv, așa cum este ilustrat în
Fig. 2.1, punctul de sursă E 1δ (x – x1, y – y1, z – z1) se poate referi de fapt la un punct de obiect
imaginat și mărit de obiectiv. În acest caz, E 1 este un punct în interiorul PSF al imaginii, iar
descrierea urmează ca mai înainte. Alternativ, și echivalent, E 1 se referă la un punct de obiect
real și matricea CCD se referă la imaginea sa proiectată în volumul obiectului prin lentila
obiectivului. În acest caz, matricea CCD este demagnificată de către obiectiv și un punct de
obiect este răspândit de un PSF demagn ificat, de asemenea.

33
CAPITOLUL 4 – Configurări digitale ale holografiei

4.1 Holografia Fresnel în afara axei

Se prezintă o prezentare generală a principalelor tipuri de configurații de interferometru
utilizate în holografia digitală. În primul rând, holografia Fresnel se referă la o configurație în
care obiectul este o distanță finită de planul hologramei și refe rința este de obicei un val de plan.
Apoi, imaginile se formează la poziția obiectului și poziția sa în oglindă în raport cu holograma,
cu mărirea unității, așa cum se arată în Fig. 3.6. Pentru a evita suprapunerea referinței și a
imaginilor, undele de ref erință și de obiect sunt decalate de un unghi, așa cum a fost inițial
realizat de Leith și Upatnieks [6]. Poziția și mărirea imaginii pot fi manipulate prin utilizarea
unor ref erințe, altele decât unda plan . Plasarea la o distanță suficient de mare și util izarea
transformării Fresnel permit imaginarea unui obiect mai mare decât dimensiunea matricei CCD,
cum ar fi aplicațiile metrologice macroscopice [[14,77,98,99]]. De asemenea, o lentilă de
imagine poate fi utilizată pentru a forma o imagine mărită [46] sa u demagnificată a obiectului,
care apoi se propagă în planul hologramei. De exemplu, în Ref. 77, o lentilă negativă este
utilizată pentru a forma o imagine demagnificată a unui obiect mare, reducând astfel lărgimea de
bandă a frecvenței spațiale.

4.2 Hol ografia Fourier

După cum este bine cunoscut, câmpul din planul focal spate este transformarea Fourier a
câmpului de obiect la planul frontal focal. Holograma este înregistrată cu o undă de referință
plană [Fig 4.1 (a)]. În reconstrucție, o undă de referin ță plană și o lentilă produc transformarea
inversă, adică imaginea [Fig. 4.1 (c)]. Alternativ, holografia Fourier fără lentile este posibilă
prin plasarea unei referințe a sursei punctului la planul obiectului [Fig. 4.1 (b)], iar reconstrucția
se desfășoară în același mod ca înainte [36,94]. Dar în holografia digitală, reconstrucția este
deosebit de simplă, deoarece necesită doar o singură transformare Fourier a hologramei
înregistrate [13,62]. În primul experiment digit al de microholografie Fourier din Ref. 62, o
picătură de glicerol plasată lângă specimenul de pe un diapozitiv de microscop a acționat ca
lentila de focalizare pentru a forma referința sursei punctului în fața obiectivului Fourier. De
asemenea, a fost intr odus un obiectiv numeric pentru a focaliza imaginea la diferite distanțe.
Microscopia cu rezoluție înaltă este posibilă folosind o configurație relativ simplă [100], si o
analiză detaliată a formării imaginii în holografia digitală Fourier fără lentilă est e dată în Ref. 91.
În microholografia Fourier fără lentilă, obiectul poate fi plasat aproape de senzor, ceea ce
mărește deschiderea nume rică și îmbunătățește rezoluția. Dar aceasta introduce aberații în
reconstrucție din cauza încălcării cerinței frecvenței Nyquist. Holograma este extinsă și
interpolată, urmată de înmulțirea unei funcții de transfer, înainte de transformarea Fourier, pentru
a obține o imagine de înaltă rezoluție fără aberație. Ref. 98 face o comparație a diferitelor
configurații de interfero metru în contextul aplicațiilor metrologice macroscopice.

34

Fig. 4.1 Holografi a Fourier și Fourier fără lentilă:
(a) înregistrarea hologra mei Fourier utilizând o lentilă;
(b) înregistrarea cu hologramă Fourier fără lenti lă;
(c) reconstrucția prin transfo rmarea Fourier reprezentată cu lentila Fourier.

4.3 Holografia planului imaginii

Obiectul poate fi plasat aproape de planul hologramei, astfel încât z 1 ≈ 0. Apoi Z± ≈ z1 și
X± = ∓x1, astfel încât imaginea se formează în apropierea planului hologramei la poziția
obiectului. În holografia spațiului real, acest lucru este util pentru crearea de holograme care pot
fi văzute cu lumină scăzută a coerenței, deoarece distanța imaginii nu este foarte mare în
comparație cu lungimea coerenței. În holografia micro scopică, acest lucru nu ar fi util pentru că
nu există o mărire, dacă nu se utilizează un microscop pentru a vizualiza holograma. Pe de altă
parte, o lentilă obiectivă poate fi utilizată pentru a forma în apropierea planului hologramei o
imagine mărită a o biectului, iar imaginea holografică
Reconstrui imaginea mărită [Fig. 16 (a)]. Imaginea va reproduce corect profilul de amplitudine al
obiectului, dar nu și profilul de fază. Alternativ, obiectivul obiectiv poate fi utilizat pentru a
forma o imagine mărită a interferenței holografice, incluzând atât obiectul, cât și referința de
scriere [Fig. 16 (b)]. În holografia spațiului real, o reconstrucție care utilizează aceeași lungime
de undă din holograma mărită ar avea ca rezultat o imagine nemagnificată a dimens iunii

35
obiectului original. Pentru a menține mărirea, ar trebui să folosiți o lungime de undă mai lungă
de același factor de mărire, dar o astfel de lungime de undă lungă ar fi în infraroșu sau cuptor cu
microunde.
În microscopia digitală holografică, aceas tă configurație este deosebit de flexibilă pentru că
O holograma dobândită poate fi scalată numeric în funcție de dimensiunile fizice ale obiectului,
indiferent de dimensiunea imaginii pe CCD. De fapt, o matrice CCD demagnificată este plasată
în apropierea poziției obiectului.

Fig. 4.2 Înregistrarea hologramelor planului imaginii prin proiecția unei imagini mărite a
obiectului pe planul hologramei, suprapuse cu un val de referință plane (a) sau (b) o undă de
referință corespunzătoare valorii de undă.

Odată ce interferența holografică mărită este introdusă în calculator, este doar o chestiune
de atribuire a dimensiunii originale a cadrului microscopic și a lungimii de undă corecte
Care a fost folosită pentru crearea interferențelor holografice. Imaginea reconstruită numeric va
reprezenta corect amplitudinea și faza spațiului original de obiecte microscopice.
Nicio hologramă digitală de tip hologramă digitală a fost utilă într -o serie de domenii de aplicare
diferite, inclusiv în microscopia biologică [47 ], unde este important să se poată monitoriza
specimenul viu imaginat. Este, de asemenea, avantajos pentru îmbunătățirea eficienței colectării

36
luminii în velocimetria particulelor . Pentru MHD care utilizează lumină de coerență scăzută, una
funcționează ne apărat în apropierea conf igurației planului imaginii [83 ].

4.4 Holografie in linie

O holografie în afara axei este necesară pentru a evita suprapunerea imaginilor de ordin
zero și holografic. Însă acest lucru reduce în realitate conținutul informațional al hologramei la
un sfert din numărul de pixeli, ceea ce este o premieră în holografia digitală. Cu o holografie in
linie, câmpul de obiect este în general aliniat cu fasciculul de referință și este utilizat întregul
număr de pixeli holograma, ceea ce con duce la distanțe minime mai scurte pentru reconstrucția
Fresnel și rezoluție mai mare a imaginii rezultate (Fig. 4.3). Un număr de metode au fost propuse
și demonstrate pentru a reduce sau elimina efectul imaginii de ordin zero și gemene, după cum se
descr ie mai tarziu.
Termenul de ordin zero (sau DC) poate fi suprimat parțial prin simpla scădere a
intensității medii a întregii holograme sau, alternativ, prin preluarea transformării Fourier a
hologramei și aplicarea unui filtru de trecere în apropierea fre cvenței zero. Eficacitatea filtrării
înalte depinde de conținutul spectral al obiectului.
Expunerile separate ale grinzilor de referință și ale obiectului și scăderea lor de la
holograma înainte de filtrarea cu comandă zero îmbunătățește rezultatul. Îndep ărtarea imaginii
gemene este mai puțin simplă [79] și necesită tehnici speciale cum ar fi metoda multiexpoziției
care schimbă faza. Pe de altă parte, metoda de filtrare cu trecere înaltă
Poate fi eficient atunci când natura dinamică a obiectului exclude me toda de schimbare a fazelor.

Fig. 4.3 Holografia in -line: (a) suprapunerea în linie a grinzilor de obiect și de referință și (b)
reconstrucția imaginilor suprapuse și a celor de tip twin.

37
Fig. 4.4 Holografia Gabor:
(a) înregistrarea prin suprapunere a referinței și a componentei sale împrăș tiate dintr -un obiect
punct;
(b) reconstrucția unei imagini punctuale și a gemului ei defocalizat.

4.5 Holografia Gabor

În holografia Gabor, obiectul este iluminat cu o singură rază de lumină și nu există un val
de referință separat (figura 4.4). Partea luminii care este împrăștiată de obiect este valul
obiectului, iar restul care nu suferă acțiuni de împrăștiere ca val de referință. Metoda este mai
eficientă cu cât obiectul este mai mic, astfel încât referința nu este deranjată excesiv.
Din cauza acestei constrângeri și datorită simplității configurației optice, holograma
Gabor este utilă în special pentru analiza imagin ii particulelor, precum și pentru fibrele subțiri.
Holografia digitală Gabor (DGH) poate oferi noi posibilități pentru aplicații mai largi ale acestei
configurați i simple. De exemplu diferența dintre două holograme consecutive dintr -un film
holografic scade complet fundalul în timp ce dezvăluie mișcarea particulelor sau a microbilor.
Pentru particulele microscopice, problema imaginii gemene este adesea neglijabilă, deoarece
chiar și la distanțe relativ scurte starea Fraunhofer este satisfăcută, iar imaginea g emenei este
comp let defocalizată. I nspecția simplă a profilurilor de intensitate printr -o particulă a permis o
estimare a coordonatelor poziției 3D a particulei într -un interval de
Acuratețea câtorva sute de nanometri. Când a fost derivată derivatul unui p olinom de ordinul doi
montat la profilurile de intensitate, coordonatele X, Y și Z ale particulelor pot fi determinate în
limita a 50 nm. Un dispozitiv subacvatic a utilizat DGH pentru a investiga particule, bacterii,
parametri ș i alți microbi de înot, iar câmpul de flux detaliat al copepodului de aliment are a fost
măsurat folosind DGH. Configurația DGH este, de asemenea, in -line, dar în această revizuire
holografia in -line se referă la una cu un val de referință separat. Cu DGH, obiectul
Trebuie să umple do ar o mică parte a câmpului, în timp ce holografia în linie cu referințe
nu are o astfel de constrângere. În configurația in -line, scăderea termenilor de ordin zero și twin
este importantă, în timp ce cu DGH acești termeni au probabil un efect neglijabil.

4.6 Holografia digitală de schimbare a fazelor

Configurația în linie utilizează numărul total de pixeli pentru formarea imaginii
holografice, dar termenii de ordin zero și cei doi gemeni se suprapun pe imagine. O metodă
foarte eficientă de eliminare a a cestor termeni a fost introdusă de Yamaguchi și Zhang [24], unde
câmpul complex la hologramă este obținut prin interferometrie de schimbare a fazei. Din câmpul
complex la planul hologramei, inclusiv informațiile amplitudinii și fazei, câmpul optic din oric e
alt plan poate fi obținut prin una din metodele de difracție numerică.

38

Fig. 4.5 Holografie digitală schimbătoare de faze. PZT: oglindă piezomontată pentru modularea
fazei de referință.

Pentru simplitate, presupuneți că referința este o undă plană incidentă în mod normal pe
planul hologramei: E R (x, y) = E R exp (iψ). Valoarea obiectului are distribuțiile amplitudinii E O
(x, y) și faza φ (x, y), astfel încât:

( ) ( ) ,( ( )- ( ), –
(12)

Apoi, intensitat ea interferenței este:

( ) | | ( ) ( ) , ( ) –
(13)

In patru etape holografia digitala de defazare (PSDH), patru holograme cu defazări ψ = 0, π / 2,
π, 3π / 2 sunt achiziționate, de exemplu printr -o oglindă de referință montat piezo (fig. 4.5.):

(14)

Care sunt apoi combinate numeric pentru a extrage profilurile de amplitudine și de fază, astfel
încât

39
( )
[( ) ( )]

( ) [
( )]
(15)

Aceasta definește complet câmpul optic complex E O (x, y; 0) al obiectului la nivelul
hologramei și teoria difracției poate fi utilizată pentru a calcula câmpul optic E O (x, y; z) la orice
distanță z de la hologramă . O procedură similară este dată în Ref. 120. Aceste proceduri elimină
complet contribuții le din termenii de ordin zero și gemeni. Numărul de expuneri holograme
necesare este redus cu un PSDH în trei trepte [76] cu deplasări de fază ψ = 0, π / 2, π:
( )
[( ) ( )]

( ) 6( )
( )7
(16)

Este posibilă și o metodă în două etape [121,122]
( ) ( ) ( )( )
, ( )-
(17)

Care necesită două expuneri la trecerea de fază plus expuneri separate ale intensității
obiectului și ale referinței. Recent, a fost introdusă o metodă în două etape, fără a fi necesară
expunerea separată a intensității r eferințelor sau obiectelor. Sunt disponibile, de asemenea,
metode de extracție în faze cu schimbări de fază necunoscute sau aleatorii.
Principiul general de schimbare a fazelor se aplică în alte configurații dife rite. De exemplu,
schimbarea de fază este introdusă pe o porțiune a spectrului Fourier prin proiectarea unui
modulator de fază aperturată pe planul focal al lentilei imagistice, care amintește de microscopia
cu contrast de fază Zernike. Obiectul este poziționat pe planul focal, iar CCD dobândește trei sau
patru holograme Fourier cu schimbări de fază corespunzătoare, ceea ce elimină componentele
spectrale zero și cele două. Există o altă metodă de extragere a profi lului de fază de la o singură
interferogramă prin montarea sinusoidelor peste intensitatea interferențelor variabilă încet.
Metoda se numește metoda de deplasare fazică a spațiului purtător sau metod a de montare
sinusoidală [9 ], care necesită o singură exp unere la interferograme, dar în detrimentul rezoluției
spațiale. Funcționează pe marginile de interferență la nivelul imaginii și nu necesită transformare
Fourier. Este valabil dacă faza se schimbă încet peste câțiva pixeli, așa că:

( ) 6( ( ) ( ))
( ) ( ) ( )
7
(18)

40
Unde I (x, y) este modelul de interferență, k 0 este frecvența franjelor purtătoare și
X este pasul pixelului. O metodă mai generală care funcționează pentru undele de referință
curbate, precum și unde le plan .. Eroarea în schimbarea de fază în reconstrucție în raport cu
schimbarea de fază în înregistrare poate duce la anularea incompletă a termenilor dc și conjugat .
O modalitate de a estima și de a corecta eroarea este prin minimizarea erorii imaginii d e
amplitudine reconstru ită comparativ cu obiectul . Metode mai generale sunt dat e în care transferul
de fază între două expuneri este calculat pe baza unei considerații statistice a interferogramei, iar
corecția pentru instabilitatea intensi tății este de as emenea dată [13]. În Ref. 1 4, o frecvență
diferențială între obiect și fasciculele de referință a fost stabilită folosind modulatori acousto –
optici, astfel încât trecerea de fază între cadrele CCD consecutive să poată fi controlată cu
precizie și să atingă sensibilitatea finală a unui zgomot fotoelectron per pixel – numit și
holografie digitală heterodyne. O analiză a zgomotului și sensibilități i PSDH a fost făcută în Ref.
35. Conceptul de schimbare a fazei pentru holografia convențională a fost iniț ial introdus de
Gabor și Goss [ 36], dar complexitatea sistemului opto -mecanic a fost substanțială, în timp ce
prin implementarea digitală, manipularea algebrică a diferiților termeni nu prezintă o astfel de
dificultate. Prin urmare, tehnica găsește aplicații în multe domenii dife rite, inclusiv în
microscopie [37]
De măsurare a formei de suprafață [38] și holografie color [ 39]. PSDH poate fi aplicată cu
configurații Fresnel pentru imagistică macroscopică [24] sau pentru configurarea planului
imaginii pentru micro scopie [98].

41
CAPITOLUL 5 – Tehnici numerice pentru microscopia holografică
digital ă

5.1 Suprimarea termenu lului DC și a imaginii gemene

Termenul de ordin zero (sau DC), care include intensitățile câmpului de referință și
obiect, poate fi redus prin scăderea valorii medii din matricea hologramă. Deoarece obiectul și
câmpurile de referință au variații spațiale, componenta DC are o cantitate finită de propagare
spectrală în jurul frecvenței zero. Un efect de filtrare cu trecere înaltă a fost obținut prin
împărțirea unui cartelă de 3 × -3 pixeli a frecvenței zero din spectrul te [78]. O abordare mai
eficientă este aplicarea unui filtru numeric sau a unei măști direct pe spectr ul Fourier (sau
unghiular) al hologramei în afara axei, așa cum a demonstrat mai întâi Cuche, Marquet și
Depeursinge [ 40].
Metoda poate fi folosită nu numai pentru a suprima termenul DC, ci și pentru a selecta
unul din termenii de ghilimele de ordinul înt âi, precum și a elimina componentele spectrale
falsificate din cauza reflexiilor parazite și a interferențelor, îmbunătățind astfel calitatea imaginii
reconstituite. Un efect similar poate fi realizat fizic prin plasarea unei măști adecvate în planul
Fouri er al unei configurații de lentile 4f, dar metoda numerică oferă o flexibilitate și o
versatilitate semnificative. De exemplu, masca spectrală numerică poate fi ușor de configurat cu
o funcție de fereastră netezită pentru a reduce fringing -ul în imaginea r econstruită.
Achiziționarea și scăderea separată a intensităților de referință și a obiectului de la holograma
poate fi utilă [1 7], chiar și cu filtrarea numerică în afara axei, permițând lărgimea de bandă mai
mare a filtrului. Rețineți că holograma filtra tă numeric poate avea valori pozitive și negative ale
pixelilor cu media apropiată de zero, caracteristică care nu este posibilă într -o hologramă în
spațiu real.
Componenta DC este filtrată prin aplicarea unui filtru de trecere în spectrul Fourier al
unei holograme în linie. Termenul de imagine dublă este redus, dar nu este eliminat, prin
imagistica numerică a diafragmei și prin suprimarea zgomotului de conjugat afară în afara
deschiderii. Alternativ, cu o deschidere la un plan Fourier, imaginea diafragmei este suprimată și
partea conjugată este utilizată pentru a reconstrui imaginea conjugată a obiectului. Combinațiile
a două sau mai multe holograme cu schimbări stochastice în obiectele de tip obiect între ele au
condus la eliminarea te rmenilor dc și twin [ 79,11]. Ho lograma digitală cu schimbare de fază
elimină foarte eficient termenii de imagine dc și twin, așa cum este descris mai înainte.

5.2 Controlul rezoluției pixelilor în metoda de transformare Fresnel

În metoda de transformare Fresnel de difracție numerică, dimensiunea pixelilor variază
liniar cu distanța, ca
. Prin urmare, câmpul vizual al planului imaginii crește cu distanța
și, prin urmare, obiecte mai mari decât matricea CCD pot fi înregistra te utilizând transformarea
Fresnel dacă obiectul este la o distanță suficient de mare. Pe de altă parte, acest lucru poate cauza

42
probleme atunci când mai multe imagini holografice cu distanțe diferite de imagine trebuie
combinate pentru interferometria hol ografică. De asemenea, rezoluția pixelilor variază în funcție
de lungimea de undă, ceea ce poate cauza probleme pentru metodele de holografie cu lungimi
multiple, cum ar fi holografia colorului sau desfacerea fazei optice.
O modalitate de a aborda problema este prin interpolarea pixelilor. Imaginile de
amplitudine pot interpola corect, dar imaginile de fază probabil nu ar fi datorate fazei înfășurate
la multipli de 2π. O soluție mai bună este o ferită de padding -ul zero [1 2], unde holograma este
căptușită cu pixeli cu valoare zero în jurul limitei, astfel încât mărimea efectivă a hologramelor
= N’δx crește liniar cu distanța de reconstrucție z și rezoluția pixelilor la imagine Planul

rămâne constant.
O altă metodă este oferită într -o transformare Fresnel în două etape pe distanțele z 1 și z 2,
astfel încât z = z 1 + z 2 este distanța totală [143] (figura 5.1). Având în vedere dimensiunea
cadrului hologramei X 0, mai întâi transformarea Fresnel se calculează la un plan intermediar la
z1. Dim ensiunea cadrului este
. Apoi, o altă transformare Fresnel se calculează pe
restul distanței z 2, astfel încât dimensiunea finală a imaginii este

. Prin
urmare, dimensiunea finală a cadrului poate fi ajustată prin ale gerea corectă a raportului
. O
variantă a fost introdusă în Ref. 144 utilizând un proces în două etape. Prima difracție la un plan
intermediar este calculată utilizând un spectru unghiular, a cărei rezoluție a pixelilor este
constantă pe orice dista nță. A doua difracție până la final a planului imaginii are rezoluție
variabilă. Această metodă se poate ocupa de distanțe mici între holograme și imagini, în timp ce
în metoda Fresnel în două etape, dacă distanța este foarte mică în comparație cu distanț a minimă
de reconstrucție | z | << z min, atunci raportul
nu poate avea prea multe variații.
Cu metod a de transformare Fresnel în două etape, poate exista o pierdere de informații
dacă dimensiunea cadrului Fresnel
este mai mică decâ t dimensiunea reală a difracției
optice, care depinde de conținutul spectral al obiectului [75]. Pentru a evita distorsionarea
imaginii finale datorită pierderii câmpului de difracție, unul dintre etapele Fresnel este înlocuit cu
un spectru unghiular sau c u un calcul Rayleigh -Sommerfeld, care acoperă un cadru mai mare
decât cadrul Fresnel. M etoda de transformare Fresnel și tigla schimbată a fost utilizată pentru a
controla rezoluția pixelilor, precum și dimensiunea matricei .

43

Fig. 5.1 Metoda de transformare Fresnel în două etape. : plan de intrare; : plan intermediar;
si : planul de ieșire.

5.3 Desfacerea fazei optice

Imaginile de fază generate de holografia digitală, precum și cele mai multe tehnici de
imagistică de fază, suferă de ambiguități modulo 2π. Un obiect a cărui variație a grosimii optice
depășește lungimea de undă produce imagini în fază înfășurată, cu discontinuități la fiecare 2π de
profil de fază. S -au dezvoltat numeroși algor itmi de dezactivare a fazelor [46, 47], dar rămâne o
provocare pentru a găsi soluții care să poată aborda eficient toate tipurile de topologii de fază.
Acest lucru se datorează faptului că majoritatea procedurilor de desfacere se bazează pe strategii
diferite pentru a găsi discontinuitățile de fază și pentru a face judecăți cu privire la modul de
cusătură a regiunilor discontinue.
Cel mai adesea, algoritmii sunt exigenți la calcul și au dificultăți în manipularea
diferitelor tipuri de topologii de fază. Faza optică de desfacere (OPU), bazată pe o holografie
digitală cu lungimi multiple, oferă o metodă rapidă, eficientă și deterministă.
De exemplu, două holograme ale aceluiași obiect sunt achiziționate utilizând două
lungimi de undă diferite λ1 și λ2, iar imaginile de fază φ 1 (x, y) și φ 2 (x, y) sunt obținute din ele.
Fiecare dintre aceste profiluri de fază variază în fază de la 0 la 2π, iar profilurile grosimii optice
corespunzătoare ajung până la λ 1 și, respectiv, λ 2. Acum, scăzând cele două Δφ = φ 1 – φ2, urmată
de adăugarea lui 2π oriunde Δφ <0, rezultă o nouă imagine a fazei care variază de la 0 la 2π,
a cărei lungime de undă efectivă sau lungimea de undă sintetică este dată de:

| | (19)
Noua imagine de fază se ocupă de variații ale grosimii optice de până la , care pot fi
făcute suficient de mari pentru a acoperi variația maximă a grosimii obiectului prin alegerea

44
diferențelor de lungime de undă suficient de mici. Dacă, totuși, imaginile de fază inițială au
anumite cantități de zgomot, spune ε · 2π, atunci nou a imagine de fază conține aceeași cantitate
de zgomot de fază, ceea ce se traduce în zgomot în profilul de grosime optică, în loc de ελ 1,
Prin același factor ca lungimea de undă sintetică. Zgomotul poate fi redus la nivelul inițial
utilizând noua hart ă a fazelor ca ghid pentru a decide cum să despachetați hartă φ 1. Aceasta este,
harta nouă fază este dat de:

6
7
(20)

Unde int reprezintă un coeficient întreg. Această schemă funcționează dacă zgomotul
amplificat nu depășește lungimea de undă originală ε < <λ1, care stabilește lungimea de undă
diferențială minimă și, prin urmare, lungimea maximă de undă sintetică:

| |

(21)

Dacă zgomotul este mai excesiv sau este nevoie de o lungime de undă mai mare de sinteză, se
poate continua cu o metodă ierarhică care utilizează trei sau mai multe lungimi de undă după
cum urmează [148]. Începeți de la λ 1 și alegeți λ 2> λ 1 astfel încât
, adică:

(22)

Zgomotul asociat cu noua hartă de fază a este ε 12 =
Apoi, alegeți λ 3> λ 2 pentru a forma:

(23)

Care satisface automat Ecuatia . (21). Utilizați acum și ca cele două noi hărți de fază
pentru a forma o nouă combinație

(24)

Astfel încât
. Zgomotul asociat cu este ε 23 =
. În general, lungimea de undă n λ n>
λn-1 este aleasă pentru a forma:

45

(25)

Astfel încât
, unde
. Procesul continuă până când este
suficient de mare pentru domeniul z al obiectului.

Metoda de desfacere în fază optică (OPU ) a fost aplicată la microscopia cu fa ză
cantitativă din Refs. 23 și 49. OPU cu două lungimi de undă poate fi obținută prin holografia
digitală cu o singură expunere prin multiplexarea unghiulară [21,52,54,59], așa cum se arată în
Fig. 5.2. Inter ferometrul dublu constă dintr -un braț obiect obișnuit și două brațe de referință
separate iluminate de două lasere cu lungimi de undă diferite. Bratele de referință sunt aliniate
astfel încât marginile celor două lungimi de undă să fie perpendiculare între ele. Pe spectrul
unghiular, vârfurile apar ca două perechi distincte, astfel încât imaginile holografice pot fi
procesate separat prin selectarea corespunzătoare a vârfului pentru fiecare lungime de undă.
Figura 5.3 (d) este un exemplu al unei imagini de fază MHD a suprafeței unei probe de cărbune
lustruit, despachetată de OPU, în timp ce Fig. 5.3 (e), 5.3 (f) sunt desfacute de un algoritm
software disponibil.
Evident, metoda bazată pe software are dificultăți în a gestiona zone izolate de profil de
fază, în timp ce OPU generează profile de fază corecte, indiferent de topologie. OPU constă doar
din câteva operații algebrice și booleene și, prin urmare, este foarte rapid și cererea de calcul este
scăzută. Metoda este în întregime deterministă și nu depind e de nici o estimare a topologiei unui
cartier de pixeli.

Fig 5.2 . Interferometru holografic cu două lungimi de undă. Filtrele ND și polarizatoarele P1 și
P2 sunt folosite pentru a controla intensitatea fasciculelor laser [59].

Pentru măsurătorile macroscopice cu grosimi în intervalul de centimetri, diferența de
lungime de undă trebuie să fie de ~ 10-5λ sau mai multe gigahertzi în diferența de frecvență, care
poate fi produsă prin modularea cavității cu laser [150] sau prin modularea electrooptică. Pentru
imagistica microscopică a celulelor biologice cu grosimea <50 – μm, diferența lungimii de undă

46
trebu ie să fie Δλ> 5 nm, ceea ce ar necesita lasere separate sau un laser tunabil. Pentru
diferențele de lungime de undă mai mari, formarea imaginii poate fi afectată de aberațiile
cromatice ale sistemului. Elementele optice sau obiectul în sine pot avea aberaț ie cromatică, sau
în cazul metodei de transformare Fresnel pentru difracția numerică, dimensiunea imaginii
reconstruite depinde de lungimea de undă. În DH, este o chestiune simplă de a compensa
aberația prin ajusta rea distanței de reconstrucție [ 51] sau pr in scăderea hologramelor de referință
fără obiect [51]. OPU a fost aplicat și microscopiei de interferență cu trecerea de fază, utilizând
trei LED -uri ca surse de lumină. Metoda este suficient de rapidă pentru anali za vibrațiilor în timp
real.

5.4 Comp ensarea aberațiilor

5.4.1 Compensarea undelor

Datorită accesului numeric direct la profilul fazei frontului de undă, cu holografia
digitală, este posibilă manipularea profilurilor de fază cu flexibilitate și versatilitate neegalate de
orice alte metode imagistice [18,46]. De exemplu, în MHD cu mărire microscopică, utilizarea
lentilei obiectivului care corespunde curburii este avantajoasă pentru a reduce frecvența
marginilor, dar este inutil și nu este necesar să aliniați precis obiectivele. În schimb, ca în Fig. 23,
orice curbură reziduală poate fi com pensată prin utilizarea unui val numeric curbat de referință
[22,54]. Compensarea aberațiilor sferice a fost demonstrată în Ref. 54 prin înmulțirea funcției de
aberație cu holograma și ajustarea fină a parametrilor pentru cel mai bun PSF. În general, o
lentilă parametrică numerică este utilizată pentru schimbarea, mărirea și compensarea completă a
aberaț iilor în Ref. 55 și în Ref. 50, utilizarea polinomului Zernike este folosită pentru a scădea
curbură și aberații din fundalul imaginii MHD . În Ref. 56, asti gmatismul este corectat prin
aplicarea efectivă a două distanțe diferite de reconstrucție pentru axele x și y. Corectarea
anamorfis mului este demonstrată în Ref. 57. În micro scopia holografi că Fourier fără lentilă,
obiectul poate fi plasat în apropierea se nzorului, ceea ce mărește deschiderea numerică și
îmbunătățește rezoluți e. Dar aceasta introduce aberații în reconstrucție din cauza încălcării
cerinței frecvenței Nyquist.
Holograma este extinsă și interpolată, urmată de înmulțirea unei funcții de transf er,
înainte de transformarea Fourier. Este obținută o imagine cu rezoluție înaltă fără aberație. În Ref.
59, sunt descrise și comparate mai multe metode de compensare aberației.

47

Fig. 5.3 Faza optică în două faze de despachetare pe imaginile unui eșantion de cărbune poros:
(a) imagine de amplitudine; Fazele cu o singură lungime de undă reconstruite la
(b) λ 1 = 532 nm și (c) λ 2 = 633 nm; (D) redarea 3D a fazei de fază cu două lungimi de undă; (F)
hărți fază dezvelite faza reconstituită la (e) λ1 = 532 nm și (f) λ 2 = 633 nm pentru comparație.
Toate dimensiunile imaginii sunt de 98 × 98μm2 [59].

48
5.4.2 Aberație cromatică

Aberarea cromatică poate afecta tehnicile holografice digitale cu lungimi multiple,
efectul principal fiind variația poziției și mărirea imaginii. Corecția aberației în microscopia
convențională implică proiectarea complexă și costisitoare a lentilelor, optimizată doar pentru o
gamă limitată de parametri. În holografia digitală, pe de altă parte, imaginile cu diferite lungimi
de undă pot fi calculate la diferite distanțe și mărimi adecvate ajustate pentru cea mai bună
aliniere înainte de suprapunerea numeri că a imaginilor reconstituite [ 51]. În Ref. 51, pentru două
OPU lungimi de undă, aberația frontală a valurilor este înregistrată separat fără obiectul de
interes și este scăzută din imaginea fazei dezvelite a obiectului.

Fig. 5.4 Compensarea curburii la capăt: (a) imaginea de fază cu curbură datorată nepotrivirii de
referință și (b) imaginea de fază după compensare [ 59].

Fig. 5.5 Geometria difracției cu planuri înclinate pentru rotirea numai în jurul axei y: planul de
intrare , planurile de ieșire (nerotita) și (Rotita).

49
5.5 Difracția cu planurile înclinate

În unele tehnici și aplicații ale holografiei digitale, apar situații în care trebuie să se ia în
considerare difracția între planurile care sunt înclinate unul față de celălalt. Un exemplu este
examinarea câmpurilor de particule într -un plan orientat arbi trar. Un alt exemplu este
microscopia holografică totală de reflexie internă , unde geometria sistemului optic dictează
reconstrucția holografică pe un plan la un ungh i mare în raport cu axa optică . Dezvoltarea unei
optici integrate este o altă zonă în care planul optic pertinent se poate schimba în direcții
arbitrare. Au fost dezvoltate mai multe tehnici, principala strategie fiind aceea de a evita
integrarea directă a integrării de difracție astfel încât să poată continua să utilizeze transformare a
Fourier rapidă. D ifracția este descrisă cu o ecuație integrală Rayleigh -Sommerfeld, unde autorii
fac referire la faptul că, în ceea ce privește calculul numeric, nu este necesară aproximarea
Fresnel sau Fraunhofer. Se încorporează propagarea între planurile încli nate prin transformarea
coordonatelor.
Transformarea este o rotație în domeniul Fourier (figura 5.5). Folosind metoda spectrului
unghiular, câmpul optic de intrare este transformat în Fourier pentru a obține spectrul său
unghiular. Vectorul de undă al une i valuri plane se transformă în funcție de

(26)

Din cauza rotației, intervalele uniforme ale probelor de frecvență devin neuniforme, iar
transformarea inversă Fourier provoa că o problemă n umerică. În Ref. 62 și 6 3, spectrul este
interpolat în intervale uniforme. Imaginea finală, obținută prin transformarea inversă Fourier a
produsului spectrului unghiular și a factorului de fază de propagare, conține o eroare datorată
interpolării.
O hologr amă digitală conține informații complete 3 -D, ceea ce duce la eventualul
surprinzător . Faptul că, în principiu, imaginea poate fi reconstruită pe un plan înclinat într -un
unghi arbitrar, până la 90 de grade. Problema este că integrarea difracției nu este direct accesibilă
la utilizarea FFT. În Ref. 87, sunt utilizate trei transformări de coordonate pentru a realiza
reconstrucția imaginii fără pierderea conținutului de frecvență și cu aceleași dimensiuni ale
pixelilor ca și holograma. Primele două transform ări sunt rotația și înclinarea planului imaginii,
iar ultima este pentru schimbarea unghiului de vizualizare. Include o combinație a interpolației și
a transformării Fourier discrete neuniform (NDFT) și obține un timp de calcul redus. În Ref. 164,
integral a de difracție este realizată folosind FFT de -a lungul axei netilate, în timp ce axa înclinată
este manipulată prin însumarea directă a integrantei.
O metodă conceptuală simplă, dar mai puțin eficientă este de a construi un volum de 3 -D
de pixeli de imagin e reconstruiți (voxeli) și pentru a compune imaginea de -a lungul unui plan
orientat arbitrar prin colectarea pixelilor adecvați [ 13]. Reconstrucția unei imagini holografice cu
unghiuri de vizualizare variabi le este descrisă în Ref. 49 și 65. O imagine tomo grafică pe un plan
înclinat în volumul de imagine al holografiei de interferență digitală a fost demonstrată în Refs.
66 și 67.

50
CAPITOLUL 6 – Aplicații și tehnici speciale de microscopie
digitală holografică

6.1 Microscopia biomedicală

Holografia digitală oferă o serie de noi capacități pentru microscopia biomedicală. Pentru
a vizualiza diferite tipuri de celule, inclusiv celulele ovariene SKOV -3 [47,54], celulele
fibroblaste [19], testul amoeba [180] și celulele roșii din sânge [53], s -a aplicat m icroscopia de
fază cantitativă (DH -QPM). Este, de asemenea, folosit pentru a investiga diversele dinamici
celulare, cum ar fi modificările induse de medicamente î n celulele tumorale pancreatice. MHD
este utilizat pentru a monitoriza microchirurgia laser a celulelor roșii din sânge (RBCs), celulele
epiteliale ale rinichiului din ratina de șobolan (PTK2) și celulele retinei pentru evaluarea
cantitativă a afectării celulare celulare și a reparației în timp real. În Ref. 53, membrana virală a
celulelor roșii di n sânge (celule roșii din sânge) .
Fluctuațiile de 37 nm sunt măsurate și comparate cu celule fixate cu etanol, care au o
fluctuație foarte scăzută de 5 nm. Contribuțiile la grosimea optică a grosimii fizice și indicele de
refracție sunt decuplate prin mapa rea fazelor cu două soluții de perfuzie cu indici de refracție
diferiți. Indicele de refracție al RBC este măsurat astfel încât să fie n = 1,394 ± 0,008.
Deformarea veziculelor fosfolipide într -un flux microcanal a fost măsurată prin DH -QPM
ca un model de celule roșii în fluxul capilar [58]. Elementele de celulă și subcelulară sensibile la
timp sunt afișate cu rezoluție submicronică, cu difracție limitată [19]. Filmele de amplitudine
holografică și imaginile fagilor ale microbilor și celulelor vii, cum ar fi înotarea parametrică
printre alți microbi și celule fibroblaste în procesul de migrare, sunt realizate dintr -o serie de
holograme și reconstruite cu focalizare numerică reglabilă.
O altă tehnică notabilă pentru microscopia de fază cantitativă este microscopul Fourier
Phase (FPM), care are o configurație asemănătoare cu microscopul de tip Zernike, dar cu filtrul
de fază înlocuit cu un modulator de lumină spațială pentru a permite ach iziția de schimbare a
fazei într -un interferometru de cale comună [ 43], așa cum este ilustrat în Fig. 6.1. Holografia
digitală Gabor este excelentă pentru imagistica distribuți ei 3-D a microbilor particulari. Diferența
dintre cadrele consecutive ale unei serii de timp este deosebit de utilă pentru urmărirea mișcării
microbilor, care, de asemenea, diminuează efectiv zgomotul de fond. Instrumentele subacvatice
au fost construite pentru a monitoriza p lanctonul și particulele marine. DGH a fost utilizată
pentr u a investiga câmpul de curgere gen erat de apendicele de copepod [ 19]. Un volum de
eșantion de apă care conține copepoduri este însămânțat cu particule marker și iluminat cu un
laser expandat și colimat HeNe.

51

Fig. 6.1 Microscop de fază de fază. FL: lent ilă Fourier; PPM: modulator de fază programabil

Fig. 6.2 Aranjament optic pentru holograma Gabor imagine dubla [111].

Pozițiile 3 -D ale particulelor copepod și trasorului pot fi determinate prin reconstrucția
numerică a hologramei, dar rezoluția axi ală (~ 500μm) este mult mai săracă decât rezoluția
laterală (~7,4μm). Disparitatea în rezoluție este depășită prin utilizarea unei oglinzi înclinate
pentru a forma imagini duble cu vederi perpendiculare (figura 26), oferind astfel rezoluții
izotrope 3 -D. A naliza filmelor holografice a evidențiat câmpul de viteză și traiectoriile
particulelor antrenate de copepod având un model de recirculare în cadrul de referință al
copepodului. Modelul este cauzat de scufundarea copepodului la o rată mai mică decât viteza sa
de scufundare terminală, datorită

52
Forța de propulsie generată de curentul de alimentare. Forța de propulsie generată de apendicele
ei de alimentare a fost măsurată la 1,8 x 10 -8 N.
Deformarea țesuturilor sub impact mecanic a fost înregistrată utilizând holografia digitală cu
dublu pu ls [83]. Recunoașterea și identificarea celulelor biologice prin hologr afia digitală a fost
studiată [ 84].

6.2 Holografia campului particulei

Velocimetria imagistică a particulelor (PIV) a fost o zonă de aplicare importantă a
holografiei convențional e [85 -87], dar mai mulți factori și -au limitat aplicațiile practice mai largi,
cum ar fi dificultatea imaginii în timp real și complexitatea instrumentelor. Digitalizarea digitală
Gabor poate elimina o mare parte din ac este limitări, permițând monitorizarea în timp real a
pozițiilor 3D și distribuția câmpului de particule cu complexitate și întreținere a inst rumentelor
reduse semnificativ. Problemele fundamentale ale PIV holografice (HPIV) sunt revizuite în Ref.
15 și se observă că HPIV digital poate revitaliza imagis tica holografică a particulelor . S-a studiat
măsurătorile poziției 3 -D ale microsferelor prin DGH și a obținut precizie de 50 n m în toate cele
trei direcții [ 16]. În locul utilizării profilului de intensitate al imaginii reconstruite, minimizarea
varianței părții imaginare a amplitudinii complexe a fost
A fost găsit ă îmbunătățirea mă surării locației planului focal. Setarea cu două fascicule cu
două fascicule, ca în Fig. 6.2, a fost utilizat în imagistica gene rală a particulelor aplicațiile [ 11] și
o sursă de coerență redusă sunt utilizate pentru im agistica de particule în Ref. 1 6 pentru a reduce
zgomotul coerent. Dubois și Grosfils au introdus o holografie digitală de câmp întunecat pentru
studierea nanopartic ulelor mai mici decât rezoluția optică. DGH este, de asemenea, utilizat
pentru măsurarea poziției și orientării 3D a unui segment de microfibră. Aplicațiile imagistice
biomedicale cu particule de DGH au fost observate mai devreme.

6.3 Microscopia și metr ologia microstructurilor

MHD este deosebit de util pentru caracterizarea MEMS din cauza profilului de suprafață
relativ neted și bine definit [60, 90]. Grinzile, podurile și membranele microcantilare sunt
înregistrate prin holografie fazică cantitativă [22]. Descărcarea în fază optică cu mai multe
lungimi de fază a imaginilor în fază produce măsurări de formă și deformare cu precizie
submicronă pe u n interval de mai multe microni. Diverse tehnici optice, inclusiv holografia
digitală, pentru caracterizare a dispo zitivelor MEMS .
Microscopia cu fază cantitativă prin DH oferă, de asemenea, un instrument unic pentru
monitorizarea proceselor optice neliniare, cum ar fi domeniil e cristalului feroelectric [61, 92]. O
holografie digitală a fost utilizată pentru a m ăsura modificările indexului de refracție în timpul
scrierii cu laser a ghiduri lor de undă în sapphire Ti3 + [ 93], precum și ghidurile de undă scrise în
substraturi de sticl ă folosind un laser Ti: safir [ 94]. DH este utilizată în măsurători în unghi de
înaltă precizie 3 -D prin analizarea spectrului unghiular al interferenței holografice [ 95]. S -a
obținut precizia de 0,005 arc sec. Suprafețele de particule de cărbune lustruite au fost analizate
[59]. Cartelele microalaniere lichide reglabile sunt caracteriza te prin holografia digitală [57]. În

53
Ref. 96, a doua generație de armonici la suprafața aerului de sticlă a fost studiată prin stabilirea
unei interferențe între a doua armonică a undelor de referință și semnalul SHG de la interfață
utilizând o iluminare l aser focalizată cu femtosecond. Imagistica printr -un mediu nelin iar a fost
demonstrată în Ref. 97. Birefringența unui material poate fi înregistrată utilizând două refer ințe
cu polarizări ortogonale [ 98]. Cele două referințe sunt multiplexate cu unghi, ca î n holografia cu
două lungimi de undă, pentru a obține două perechi de spectre în domeniul Fourier.

6.4 Tomografia holografică

Deși holografia reproduce câmpul optic 3 -D al obiectului, o imagine holografică la o
anumită distanță conține nu numai imagine a în focalizare, ci și contribuțiile avioanelor în afara
focului. Faza microscopică în fază cantitativă prin MHD profilează, de asemenea, variația fazei
acumulate de -a lungul direcției de propagare a luminii. Pe de altă parte, variația amplitudinii sau
indicele de refracție a dispersiei 3D față de volumul obiectului prezintă un mare interes în
numeroase aplicații în imagistica biomedicală, metrologie, analiza câmpurilor de particule etc.
Există două abordări principale pentru realizarea unor astfel de imagi ni tomografice. Una este
prin achiziționarea câmpului optic transmis din numeroase direcții diferite și combinarea
proiecțiilor cu un algoritm de propagare înapoi.
Celălalt este prin utilizarea efectelor de interferență cu coerență scăzută pentru a izola
interacțiunea luminii cu o secțiune transversală a volumului obiectului. Similar cu tomografia cu
raze X (CT) asistată de calculator, tomografia holografică a unei structuri de fază 3 -D a fost
realizată prin rotirea specimenului celular în volumul obiectulu i [80,81, 99]. Tehnica este
demonstrată și pentru profilurile tomog rafice ale microfibrelor [20,2 1]. În loc să se rotească
complet, unghiul de iluminare este scanat într -un interval finit
În [22,2 3]. Spre deosebire de proiecția umbrelor în alte metode de tomografie, holografia digitală
permite propagarea înapoi care include efecte de difracție pentru o reconstrucție mai precisă și cu
rezoluție mai mare – numită și to mografie de difracție optică [2 4,25].

6.5 Holografia cu coerență redusă

Folosirea lumin ii cu coerență redusă în holografia generală are o istorie îndelungată și a
fost aplicată în holografia digitală în principal pentru două scopuri: reducerea zgomotului coerent
fals și generarea de imagini tomografice sau topografice. Lungimea coerenței scu rte poate fi
utilizată în imaginile tomografice sau topografice prin extragerea doar a părții unui obiect care se
află în lungimea coerenței în raport cu fasciculul de referință. Primele astfel de demonstrații au
fost holografia digit ală cu lumină în zbor în Ref. 26 și 2 7, unde părțile fasciculului de referință au
fost întârziate cu cantități diferite, iar imaginea reconstruită a afișat diferite părți ale obiectului cu
distanțe diferite. Pentru imagistica tomografică și topografică, rezoluția adâncimii este
determinată de lungimea de coerență a laserului. De exemplu, o lățime spectrală laser de 30 nm
corespunde unei lungimi de coerență de aproximativ 10 um. Imagistica topografică cu rezoluție
de adâncime de 20 μm a fost demonst rată utilizând un laser diod [2 8]. Spre deosebire de
imaginile de interferență cu coerență redusă, holograma sau camera este focalizată la o distanță

54
arbitrară față de planul obiectului, iar imaginea obiectului este reconstruită prin propagare
numerică. Prin urmare, imagistica de interf erență poate fi considerată un caz special
holografie. Un alt efect util al luminii cu coerență scăzută este reducerea zgomotului de
interferență falsă din părțile sistemului optic care nu se află în lungimea coerenței [83]. O sursă
de lumină cu o coerență spațială controlată este posibilă prin focalizarea unei lumini laser pe o
placă de sticlă difuzor rotativă [1 5]. Metoda este aplicată anal izei câmpurilor de particule [1 6] și
măsurătorilor de concentraț ie a fluidului [58]. În Ref. 2 9, mai multe holograme care folosesc
lungimi de undă diferite sunt suprapuse pentru a observa reducerea zgomotului de cenușă.

6.6 Reflecția totală internă in microscopia h olografic ă

Microscopia adeziunii celulare este importantă pentru o înțelegere mai profundă a
mișcării celulare și a morfogenezei. Instrumentele principale pentru imagistica și studierea
acestor procese de suprafață au fost microscopia totală de reflexie internă prin fluorescență
(TIRFM) și microscopia de reflexie a interferenței. În TIRFM, câmpul evanescent este utilizat
pentru iluminarea selectivă a stratului de contact al celulei. În contrast, în microscopia
holografică TIR (TIRHM), interacțiunea câmpului evanescent cu stratul de contact are ca rezultat
modularea profilului de fază în lumina reflectată TIR [60, 64]. Modularea fazei este apoi
detectată și înregistrată prin microscopia de fază cantitativă
Din MHD . Metoda este neinvazivă, nu necesită fluorofori și folose ște la maxim iradierea de
intrare. Geometria sistemului optic necesită imagistică numerică pe un plan la un unghi de
înclinare mare, dar din nou holografia digitală oferă o capacitate unică de reconstrucție pe un
plan înclinat, așa cum este descris mai dev reme. Observăm că TIR a fost de asemenea utilizat
pentru iluminarea obiectului în holografia digitală pentru mi croscopia cu câmp întunecat [21 ].
Un aparat TIRHM bazat pe un interferometru Mach -Zehnder este prezentat în Fig. 6.3, și un
exemplu de set de ima gini amoeba proteus este prezentat în Fig. 6.4.

6.7 Holografia de scanare optică

În locul unei interferențe a câmpurilor de obiect și de referință la holograma, holografia
optică de scanare (OSH) iluminează obiectul cu un câmp de interferență creat de suprapunerea a
două fascicule coerente, care apoi este scanat peste obiect ( Figura 6.5). Lumina transmisă sau
reflectată de obiect este apoi colectată și detectată de un detector de puncte. O descriere teoreti că
detaliată este dată în Ref. 14 și 15. Lumina detectată poate fi de fapt o emisie secundară, cum ar
fi fluorescența, și nu trebui e să fie coerentă. Din acest motiv, OSH are un potențial unic pentru
microscopia de fluorescență 3 -D. De fapt, modul de detectare poate fi variat astfel încât
proprietatea de coerență a procesului de imagistică variază de la liniar în amplitudine la
intens itate liniară.

55

Fig. 6.3 Aparatură pentru TIRHM: (a) BS: separatoare de fascicule; M: oglinzi; A: planul
obiectului; H: plan holografic. (B) Detaliu al prismei TIR.

Fig. 6.4 Imagini TIRAM ale amoeba proteus vii: (a) holograma, (b) imaginea amplitu dinii și (c)
imaginea de fază. FOV = 250 μm (comprimat înclinat) × 125 μm [164]

56

Fig. 6.5 Modele de zone Fresnel la două distanțe diferite. Scanarea modelelor din punctele P1
sau P2 înregistrează pozițiile 3D ale acestor puncte

Fig. 6.6 Procesul holografic de interferență digitală.

O altă tehnică pentru holografia cu lumină incoerentă, numită holografie spațio –
temporală, se bazează pe interferența modulată în timp între valul obiectului și elevul d e referință
al funcției delta [ 18]. O s erie de timp a imaginilor de interferență este analizată pentru a extrage
componenta de frecvență de modulație de la fiecare pixel, care constituie hologra ma complexă
cu bandă laterală [ 19]. Se demonstrează că se realizează o metodă de închidere cu coerenț ă
scăzută pentru a produce imagini tomografice ale unui obiect (o aripă de insecte) în spatele unei
sticlă măcinată [ 20].

57
6.8 Holografia cu interferențe digitale

Tomografia cu coerență redusă poate fi sintetizată utilizând o d iversitate de lungimi de
undă [21,2 2]. În holografia interferențelor digitale (DIH), tomografia unui volum 3 -D este
construită prin achiziționarea unei serii de holograme în timp ce lungimea de undă este scanată
într-un interval [23, 24] (Figura 30). Să presupunem că un obiect e ste iluminat de un fascicul
laser cu lungimea de undă λ.Aminime r0 de pe obiect împrăștie lumina într -un wavelet Huygens,

( ) ( | |)
(27)

Unde funcția obiectului ( ) este proporțională cu amplitudinea și faza waveletului împrăștiate
sau emise de punctele obiect. Pentru un obiect extins, câmpul la “r” este

( ) ∫ ( ) ( | |)
(28)

Unde integrala este peste volumul obiectului. Amplitudinea și faza acestui câmp
La nivelul hologramei z = 0 este înregistrat de hologramă ca H (xh, yh; λ). Procesul holografic se
repetă folosind N lungimi de undă diferite, generând hologramele H (x h, yh; λ1), H (x h, yh; λ2); . .
, H (x h, yh, λN). Din fiecare hologramă, câmpul E (x, y, z; λ) se calculează ca o matrice complexă
3D față de volumul din vecinătatea obiectului (figura 30). Apare suprapunerea acestor matrice N –
D

∑∫ ( )
( | |) ∫ ( ) ( ) ( )
(29)

Adică, pentru un număr suficient de mare de lungimi de undă, câmpul rezultat este proporțional
cu câmpul de la obiect și nu este zero numai la punctele obiectului. În practică, dacă se folosește
un număr finit N de lungimi de undă cu incrementare uniform Δ(1 / λ) a lungimilor de undă
inverse, atunci imaginea obiectului A(r) se repetă (alta decât efectul de difra cție / defocalizare a
propagării) la o lungime de undă Λ=[Δ(1 / λ)]-1, cu rezoluție axială δ = Λ / N. Prin folosirea
valorilor corespunzătoare Δ(1 / λ) și N, lungimea de undă a buclei Λ Poate fi potrivită
domeniului axial al obiectului, și δ la nivelul dor it de rezoluție axială.

58

Fig. 6.7 Exemple de imagini de topografie și tomografie DIH. (A), (b) și (c) prezintă randarea în
perspectivă a unor date imagine de volum 3 -D ale amprentei degetului prin DIH din câteva
unghiuri diferite de vizualizare. Volumul imaginii este de 4, 86 mm × 4,86 mm × 0,210 mm . (D)
și (e) prezintă volumul reconstruit al probei nervului optic uman: (d) secțiunea transversală x -y,
FOV = 1100 × 1100μm2; (E) secțiuni transversale y -z, 1100 x 280,35 pm2, la x1, x2 și x3; (F)
secțiunile tr ansversale x -z, 280,35 × 1100μm2, la y1, y2 și y3 .

DIH a fost aplicat la imagistica tomografică a țesuturilor retiniene și pentru generarea
profilurilor 3-D ale amprentei digitale (figura 6.7). Reconstrucția DIH pe un plan înclinat arbit rar
a fost demons trată. O diodă superlumuminiscentă (SLD) și un filtru tunibil acousto -optic au fost
utilizate ca sursă de lungime de undă variabilă în Ref. 85. S -a demonstrat rezoluția de adâncim e
tomografică submicronică și a fost utilizată pentru profilarea membrane lor eritrocitare de la 3 -D.

59
6.9 Holografia heterodinelor

Holografia digitală heterodină este o extensie a holografiei digitale care schimbă faza .
Utilizând o pereche de AOM -uri, referința este transmisă frecvent în raport cu fasciculul
obiectului cu un sfert din rata cadrelor CCD (fig. 6.8), astfel că patru cadre consecutive
dobândesc un set de imagini în fază cvadratură. Holografia heterodinelor în configurație în afara
axei a fost utilizată pentru filtrarea componentelor reziduale de ordin zero și f als pentru a obț ine
o sensibilitate maximă . Holografia digitală Heterodyne, împreună cu iluminarea TIR, este
utilizată pentru a imagina particule de aur su b formă de lungime subwave .

Fig. 6.8 Aparat pentru holografia heterodinei. AOM: modulatori acous to-optici; BS: splitter d e
fascicul; F: frecvențe optice.

În holograma digitală în timp, o suprafață vibrată afișează marginile întunecate la
zerourile funcției Bessel J 0 (z), unde z es te amplitudinea vibrațiilor. Pentru vibrațiile cu
amplitudine mare, franjurile devin prea numeroase și dificil de rezolvat. Holografia digitală
laterală folosește o holografie digitală heterodyne cu decalajul de frecvență al referinței reglate la
orice a n -armonie frecvenței vibrațiilor, permițând observarea selectiv ă a zo nelor cu amplitudine
mare.

60

CAPITOLUL 7 – Holografia spectrală

7.1 Partea teoretică a holografiei spectrale

Depozitarea și recuperarea ulterioară a formelor de undă de femtosecondă se realizează
prin efectuarea holografiei spectrale cu ajutorul unui aparat de formare a impulsurilor de
femtosecundă. Citirea hologramei spectrale se face prin utilizarea unui impuls de referință scurt
care produce atât reconstruiri reale cât și inversate in timp ale semnalului original. Convoluțiile
și operațiile de corelare sunt realizate prin utilizarea impulsurilor de formă pentru citire. Aceste
experimente demonstrează posibilita tea filtrării spectrale neliniare și a procesării semnalelor de
undă optice de femtosecundă [101] .
Masurarea fazelor si a amplitudinii componentelor de frecventa optică dispersată spațial
s-a dovedit a fi o tehnică puternică pentru modelarea temporală a imp ulsurilor ultrascurte. Prin
intermediul acestei tehnici s -au sintetizat formele de undă de femtosecundă în conformitate cu
specificațiile pentru experimente, incluzând codarea impulsurilor pentru comunicațiile spectrului
extins, propagarea solitonului întu necat în fibre și generarea de fononi coerenți prin împrăștiere
Raman în domeniul timpului. Au fost, de asemenea, raportate alte tehnici de modelare a
impulsurilor. În toate aceste metode, modelarea impulsului se realizează prin filtrarea liniară a
frecven țelor optice individuale care compun impulsuri ultrascurte incidente.
Mazurenko a propus posibilitatea stocării și reconstruirii formelor de undă ultrarapide
prin înregistrarea holografică a frecvenței dispersate spațial :" În contrast cu metoda echo –
foton ică, această tehnică poate utiliza medii de înregistrare neselective spectrale. S -a putut
raporta stocarea și prelucrarea impulsurilor de femtoseconde modelate cu ajutorul holografiei
spectrale într -un aparat de formare a impulsurilor. Rezultatele noastre demonstrează inversarea
timpului, corelație și convoluție, precum și stocarea și citirea ulterioară a forme de undă optice
de femtosecundă ."
Experimentele au constituit un analog temporal al holografiei spațiale standard, în care
informațiile despre un fas cicul de semnal spațial modelat este înregistrat ca un set de franjuri
care apar ca urmare a interferenței cu o grindă de referință uniformă spațial. Iluminarea ulterioară
a hologramei cu un fascicul uniform de testare (sau citire) reconstruiește o imagine reală sau
conjugată a fasciculului de semnal, în funcție de geometrie.
În studiile de domeniu, referința este un impuls scurt cu un spectru larg și neted.
Semnalul este un impuls de formă cu informații modelate pe spectru. Hologramele spectrale sunt
scrise prin înregistrarea tiparelor individuale de margine care apar ca urmare a interferenței
dintre potrivirea, componentele de frecvență separate din punct de vedere al spațiului de la
semnalele și a impulsurilor de referință. Iluminarea ulterioară cu un imp uls scurt de testare (sau
citire) produce o replică reală sau în timp inversă a impulsului de semnal inițial, din nou în
funcție de geometrie. Iluminarea cu un impuls de încercare în formă de timp are ca rezultat un

61
impuls de ieșire care este fie corelarea , fie convoluția formelor de citire și ale semnalului, din
nou analogic cu holografia spațială convențională.
Schema obținerii holografiei spectrale este arătată în Fig. 7.1. Aparatul constă dintr -o
rețea de difracție de n rânduri / mm plasate în planurile focale exterioare ale telescopului de
mărire a unității, care constă din două lentile de focalizare, camera. O placă termoplastică plasată
la jumătatea distanței dintre lentile servește ca un mediu holografic subț ire. Impulsurile de
referință , sunt genera te de un laser de colorare blocat în mod de impuls de coliziune.
Fasciculul este generat prin trecerea impulsurilor printr -un al doilea aparat programabil
de formare a impulsurilor care utilizează un modulator de fază cu cristal lichid cu 128 de
elemente p entru a realiza controlul calculatorului asupra formei de undă a semnalului. În fața
formatorului de impuls holografic, fasciculele de referință și de semnal sunt setate pentru
propagarea paralelă, dar noncolinieră, cu întârziere relativă de timp zero.
Prima rețea de difracție și lentilele dispersează spațial componentele individuale de
frecvență optică (de -a lungul unei direcției x). Dispersia spectrală este dată de ⁄
( ), unde și reprezintă lungimea focală, perioada rețelei de difracție și respe ctiv
unghiul de difracție.

62

Fig. 7.1. Schema ilustrativă a aparatului pentru holografia spectrală de femtosecundă.
(a) Configurarea pentru înregistrarea hologramei spectrale. Este afișată numai jumătatea
din față a aparatului de împrăștiere a pulsurilor. Vederea extinsă a hologramei spectrale
ilustrează un posibil model de interferență între semnalele dispersate spectral și cele de referință.
(b) Setarea pentru citirea hologramei spectrale.

După înregistrare, hologramele spectrale au fost citi te utilizând un fascicul de testare.
Forma câmpului reconstruit E out (ω) poate fi scrisă după cum urmează:

( ) ( ) ( ) , ( ) –
( ) ( ) ( ) , ( ) –
(7.1)
Aici, ( ) ( ) ( ) sunt amplitudini sp ectrale de test, referin ța si respectiv semnalul
câmpului, sunt vectorii de propagare a acestor fascicole chiar înaintea hologramei.

63
Relatia 7.1 presupune ca înregistrarea este proporțională liniar expunerii si neglijează efectele
care apar datorită rezoluției spectrale finite a apartului de modelare a impului. Pentur un impuls
de test, care este o replică a impulsului scurt de referință, primul termen a relației reprezintă
semnalul impuls real reconstruit care iese din hologramă în direcția , unde al doilea
termen înseamnă o recontruire a timpului inversat propagându -se de -a lungul .
Pentru comoditate, am reutilizat fie fasciculul original de referință, fie fasciculul de semnal ca
fiind unul de t est. Faza care nu este utilizată ca fascicul de testare este blocată în timpul citirii.
Atunci când fasciculul de referință servește drept test ( ), ne uităm la fascic olul real
reconstruit care iese de -a lungul ; celălalt fascicul difractat de -a lungul a , ratează cel
de-al doilea obiectiv al camerei și este pierdut. În mod similar, atunci când , se examină
fasciculul difracționat invers temporal de-a lungul . Rețineți că modulatorul de cristal lichid
folosit pentru a controla forma de undă a semnalului poate fi reprogramat înainte de citire. În
toate cazurile, formele temporale ale fasciculelor reconstruite sunt măsurate prin corelarea
intensi tății încrucișate cu impulsurile de femtosecundă direct din laserul blocat în modul de
coliziune.
Un exemplu simplu al rezultatelor obținute este prezentat în Fig. 7.2. Au fost înregistrate
mai întâi holograme spectrale pentru impulsuri de semnal neimpres ionate întârziate (sub
controlul motorului pas cu pas) în diferite cantități față de fasciculul de referință și apoi citite cu
un impuls scurt de testare. Datele sunt reprezentate grafic pentru patru holograme separate,
corespunzând impulsurilor de semnal întârziate cu 0, 1, 2 și respectiv 3ps. Figura 7.2 (a) prezintă
impulsuri reale reconstruite citite cu Timpii de sosire a impulsurilor sunt identici cu cei
ai impulsurilor de semnal inițiale. Figura 7.2 (b) prezintă măsurători ale impulsurile inversate în
timp citite cu . Timpii de sosire a impulsurilor sunt acum opuși celor ai impulsurilor de
semnal inițiale. Aceste date demonstrează abilitatea de a înregistra holograme spectrale și de a
recon strui replici reale și în timp invers ale semnalului original . Acest lucru se întâmplă deoarece
semnalele care ocupă o fereastră temporală care depășește inversul rezoluției spectrale
disponibile nu pot fi înregistrate efectiv . Rezoluția spectrală este det erminată de dispersia
unghiulară a rețelelor de difracție și de divergența intrării și poate fi îmbunătățită prin creșterea
dispersiei unghiulare și a dimensiunii fasciculului de intrare.

64

Fig. 7.2. Forme de undă reconstituite din patru holograme spectrale separate. Hologramele sunt
înregistrări ale impulsurilor de semnal scurte (neformate) întârziate cu 0, 1, 2 și, respectiv, 3 ps,
după cum se observă în figură.
(a) Impulsuri reale reconstruite citite cu .
(b) Impulsuri timereversate citite cu .

Depozitarea și citirea impulsurilor de formă sunt ilustrate în Fig. 7.3. Forma de undă a
semnalului a fost generată prin programarea modulatorului de fază a cristalului lichid pentru o
modulare în fază spectrală a formei ( ).3 Aici este și faza în radiani, este
frecvența optică în terahertz și este frecvența centrală. Profilul de intensitate măsurat al
impulsului de semnal este reprezentat grafic în fig. 7.3 (a). Modularea fazei cubice conduce la o
distorsiune complica tă, nesimetrică a impulsului în domeniul timpului. Efectele principale sunt
apariția unei coadă oscilantă lungă (datorată interferenței componentelor de frecvență optică
întârziate, distanțate la fel de sus și sub frecvența centrală) și o ușoară extindere și întârziere a
impulsului inițial. Neregularitățile din coada oscilantă sunt cauzate de devierea de la o
dependență exactă de fază cubică. Distorsiunea datorată variației fazei cubice este un efect
important atunci când impulsurile ultrascurte se propagă în fibrele optice la așa numita lungime
de undă de dispersie zero.

65

Fig. 7.3. Măsurători de corelație a intensității arătând stocarea holografică și rec onstruire a unui
impuls de semnal distorsionat prin modularea fazei spectrale cubice. Curbele sunt norm alizate
individual pentru aceeași înălțime.
(a) Impuls de semnal de intrare.
(b) Impulsul de ieșire real reconstruit ( ).
(c) Impuls de ieșire inversat în timp ( ).
(d) Autocorelarea câmpului de semnal, obținută folosind un impuls de test i dentic cu impulsul de
semnal (cu ). Vârful este de fapt de 1,6 ori mai mare decât cel din (c).
(e) Autoconvoluția inversată în timp a campului de semnal, obținută folosind un impuls de test
inversat în raport cu impulsul de semnal (cu ). Vârful este de fapt de 2 ori mai slab decât
cel din (c).

66
Figurile 7.3 (b) și 7.3 (c) reprezintă schemele de impulsuri reconstruite obținute prin
utilizarea impulsurilor de test de durată -75-fs, cu și respectiv . Așa cum era de
așteptat, impulsurile reconstruite corespund, respectiv, replicilor reale și reversate in timp a
impulsului de semnal distorsionat. Prin utilizarea impulsurilor de testare formate (cu ),
se poate demonstra, de asemenea, operații complexe de procesare a semnalu lui. Al doilea termen
în relatia (7.1), proporțional cu ( ) ( ) ( ), corespunde în domeniul timp a corelării
formelor de undă de test și a semnalului, convolut cu referință. Întrucât referința este în esență un
impuls, convoluția are un efect redus. Rezultatul este apoi corelația câmpului (sau amplitudinii)
între test și semnal (nu corelația intensității măsurată frecvent prin intermediul tehnicii de
generare a doua armonici). Figura 7 (d) a rată r econstrucția obținu tă pentru impulsuri de testare și
semnale identice. În acest caz, ( ) ( ) este în esență unitate, deoarece ( ) ( )sunt
modulate numai în f ază. I eșirea, care este autocorelarea câmpului de semnal, este un impuls scurt
femtosecund fără trăsături și fără distorsiuni.
Intensitatea este crescută cu 60% în comparație cu cea a impulsului invers in timp din
Fig. 7.3 (c). Acest rezultat ilustrează utilizarea holografiei spectrale pentru a genera filtre
potrivite pentru forme de undă ultra -rapid e.
Figura 7.3 (e) arată ieșirea care apare atunci când testul este setat pentru o modulare de
fază spectrală egală și opusă celei a semnalului. În acest caz, testul este o replică inversă in timp
a semnalului; i eșirea este autoconvoluția unei forme de undă a semnalului inversat în timp.
Rezultatul este o modulare de fază cubică de două ori mai mare c a cea a semnalului original.
S-a demonstrat deci stocarea și reluarea ulterioară a pulsurilor optice în formă de
holografi e spectrală într -un aparat de emitere a impulsurilor femtosecundă. Această tehnică oferă
un m ecanism pentru efectuarea unor operații importante de procesare a semnalului, cum ar fi
inversarea timpului, corelația, convoluția și filtrarea potrivită, pe forme de undă ultrascurte.

7.2 Proba practică

Neavând la dispoziție o aparatură specială pentru microscopia holografică digitală, pentru
proba practică am folosit un spectrometru care pune in evidență cu spectrul de absorbție
compoziția și concentrarea unor substanțe (microscop ul care face acelasi lucru dar mai elaborat
și mai precis) , ceea ce, ca și microscopia asigur ă datele n ecesare pentru sanatatea publică.
Experimentul a fost făcut în cadrul institutului ” Centrul de Cercetări Avansate pentru
Materiale, Produse și Procese Inovative” – CAMPUS al Universității Politehnica București.
Spectru constă in toate valorile pe care o marime fizică le are. Există spectre continue,
sau discrete. Spect rul electromagnetic conține toat e radiațiile electromagnetice existente până
acum. Se poa te vedea ex plicit în figura 7.1 .

67

7.1 Diagrama spectrului electromagnetic

Spectrofotometria constă într -o măsurătoare cantitativă a spectrelor de absorție, respectiv
de a spectrelor de emisie ale unei subtanțe. Absorbția radiației electromagnetice este maximă la o
anumita lungime de undă, iar emisia radiației electromagnetice re prezintă emisia anumitor
lungimi de unda, in functie de mol ecula, ca rezultat al excitarii molecule [109] .
Energia radiatiei i ncidente poate fi absorbita la nivel atomic – electronii “sar” pe niveluri
energetice superioare; energia absorbita corespunde diferentei de energie intre nivelul
fundamental si nivelul excitat, de aceea spect rul de absorbtie va fi discret sau la n ivel molecular
energia va fi utilizata creșterea vitezei de agitatie moleculara (energie cinetic a), rezultând efect
termic, spectru de absorbț ie continuu . Moleculele care au abso rbit energie intră într -o stare
excitat ă, cu timp de v iață scurt; revenirea la starea fundamental ă se face prin eliberare de energie,
prin emisia radiativă sau neradiativă.
Cromoforii sunt anu mite grupări din str uctura unei molecule, responsabile pentru
culoarea acesteia. Fiecare cromofor va avea un maxim de absorbție specifi c. Când într-o
molec ulă există mai mulți cromofori, aceaștia iși infl uențează reciproc maximele de absorbtie
obținându -se un efect un efect b atocromic/ efect hipsocromic sau un e fect hipercromic (absorbt ie
crescuta) / efect hipocromic (absorbtie scazuta) reprezentate în figura 7.2.

Fig. 7.2 Maximele de absorbție

68
Din spectrul de absorbție pot fi scoase informații structurale, în funcție de maximul
obținut. Amplitudinea abs orbtiei depinde de concentratia substantei putându -se face d etermin ări
de concentra ții ADN/ARN, d etermin ări ale densit ății bateriilor într-o cultura, s creening
toxicologic etc . Are la baza Legea Beer -Lambert, care reprezint ă legătura dintre intensitatea
luminii care traversează o soluție și concentrația soluției respective.

(7.1)

Unde este intensitatea luminii incidente, I este intensitatea luminii emergente, C este
concentra ția solu ției, d este grosimea cuvetei cu solu ție, iar este coeficient ul de absorb ție.
Coeficientul de absorb ție depinde de lungimea de und ă.
In se utilizează cel mai frecvent în spectrofotometrie doi parametri pentru a calcula
absorbția: transmisia (T) și extinc ția (E) .
Spectrul de absorbtie este i nfluentat de: c oncentraț ie, temperatura ,pH. Formele dimerice
sau trimerice a le moleculelor au varfuri de absorb ție suplimentare .
Activitatea experimentală a constituit în folosirea unui spectrometru care pune în
evidență cu ajut orul spectrul de absorbție, compoziția și concentrarea unor substanțe .
Schema de lucru a constat dintr -un spectometru Cary Series UV -Vis conectat la un
calculator, folosind o aplicație definită numită The Cary WinUV având mai multe subprograme
și diferite probe sub forma de pulb ere care au fost diluate în apă[110].

Fig 7. 3 Schema de lucru a spectrofotometrului Cary Series UV -Vis

69

Prima proba a constituit -o o pulbere de cacao. Am amestecat -o cu apă pentru a obține o
soluție slabă, și apoi am introdus -o într-un recipient special în spectrofotometru.
Din aplicația The Cary WinUV am ales programul”Scan” pentru a obține diagramele.
La început am efectuat o scanare cu corecție a valorilor inițiale .
Această procedură descrie cum se efectuează o scanare a lungimii de undă de la 800 nm
la 200 nm cu corecția de bază.
Am dat clic pe ”Zero ” pentru a efectua un zero. Rezultatul obținut este afișat în figura
7.4.

Fig 7.4 S canare a lungimii de undă de la 800 nm la 200 nm cu corecția de bază

Am selectat ”Baseline Correction” pentru a efectua o corecție de referință pentru fiecare
punct de date a probei.

70

Fig 7.5 Scanarea probei cacao cu corecția de bază .

Dupa care am început scanarea apăsând butonul ”Connect”. La sfârșitul scanării am
obținut diagrama spectrului de absorbție a unei soluții slabe de cacao, care este afișată în figura
7.6.

Fig 7.6 Diagrama spectrului de absorbție a unei concentrații slabe de cacao.

71
Se poate observa ca absorbția are loc atat in vizibil cât și in roșu. Maxima este undeva la
0.9.
Apoi am mărit concentrația de cacao, obținându -se diagrama spectrului de absorbție în
figura 7.8.

Figura 7.8 Diagrama spectrului de absorbție a unei concentrații slabe de cacao

După care am facut o a doua măsuratoare, obținând alte valori, deoarece substanța s -a
depus. Lucru observat în figura 7.9.

72

Figura 7. 9 v dupa ce aceasta s -a depus

În cazul nostru am obținut un maxim de x=2,848 la lungimea de undă .
Concentrația se poate obține cu ajutorul formulelor de mai jos[109] .

(7.2)

A doua probă folosită a fost una de boia. Tot la fel am măsurat întâi pentru o concentrație
mai slabă și apoi pentru una mai mare.
Se poate vedea în figura 7.10 spectrul de absorbție a unei concentrații de boia slabe.

73

Fig 7.10 Diagrama spectrului de absorbție a unei concentrații slabe de boia

Maximul obținut pentru o concentrație mică a fost de x=4,20 pentru lungimea de undă
350,69.
Pentru a obține o conce ntrație mai mare, am mai adăugat cacao. Am obținut astfel o
concentrație de cac ao mai mare, scanând proba din nou, am obținut rezultatul în figura 7.11.

Fig 7.11. Diagrama sp ectrului de absorbție a unei concentrați i mare de boia

74

S-a obținut deci un maxim de x=9,91 pentru lungimea de undă 349nm. Se poate observa
clar că absorbția se realizează la o lungime de undă de 349nm.

Cea de -a treia proba a fost o pulbere de budincă de culoarea fistic. La o concentrație mai
slabă am obținut rezultatele din figura 7.12.

Fig 7.12 Diagrama spectrului de absorbție a unei concentrații de budincă de fistic

Din diagramă se poate observa că absorția atinge un maxim de x =3,6 la lungime de undă
de 413nm.

Ultima probă a fost o pulbere roz pentru tort. Rezultatele obținute sunt afișate în figura
7.13.

75

Fig 7.13 Diagrama spectrului de absorbție a unei concentrații de pulbere pentru tort.

Se poate observa din grafic ca am obținut două maxim e, primul de 3,5 la o lungime de
undă de 294nm, iar cel de al doilea la x=2,23 corespunzător lungimii de undă 515nm.
În concluzie cu ajutorul spectrofotometrul ui am putut determina compoziți a și
concentra ția unor probe diferite , însă cu ajutorul microscopului î ntr-un timp mult mai scurt am fi
putut determina aceste componente.

76
CAPITOLUL 8 – Concluzii

Am prezentat o tehnic ă inovatoare în curs de dezvoltare în holografia digitală, cu accent
pe tehnicile și aplicațiile microscopi ce. Într -o istorie relativ scurtă, interesele și activitățile au
crescut exponențial, după cum arată o scurtă privire la statistici. Un număr din ce în ce mai mare
de cercetători – nu numai în domeniul fizicii optice și ingineriei optice, dar și în domenii diverse
de aplicații precum microbiologia, medicina, știința marină, analiza particulelor,
microelectromecanica și metrologia – realizează noile capabil ități ale holografiei digitale. Mai
întâi, prin înlocuirea proceselor fotochimice greoaie cu imaginile optoelectronice, holografia
digitală permite îmbunătățirea ordinii de mărime a vitezei de achiziție și a sensibilității.
Caracteristicile atractive ale MHD sunt: o rată de achiziție foarte ridicată (limitată doar de
frecvența de achiziție video) , monitorizarea activității fiziologice și patologice a culturii celulare
și a țesuturilor, imagistică non -contact, non -distructivă, fără markeri in vivo.
Datorită fizicii lentilelor, microscoapele tradiționale care utilizează lentile au câmpuri
limitate d e vedere. Microscoapele holografice digitale nu au lentile, deci pot avea câmpuri de
vedere mai largi. În plus, oamenii trebuie, de obicei, să folosească butoane pentru a se concentra
pe diferite adâncimi dintr -o probă într -un microscop tradițional. Într -un microscop holografic
digital, computerul funcționează pentru dvs. și poate face și alte corecții ale imaginii.
În al doilea rând, reprezentarea numerică a câmpurilor optice produce o serie de
interferențe și alte tehnici de manipulare dificile sau imposi bil de realizat în holografia spațiului
real. În sfârșit, disponibilitatea fazei complexe a câmpurilor optice duce la microscopia cu fază
cantitativă într -o manieră directă, extrem de sensibilă și versatilă. Într -adevăr, holografia digitală
este considerat ă a fi un progres care poate revitaliza zona generală a holografiei, a cărei
dezvoltare a fost oarecum stagnantă, iar aplicațiile constrânse. Odată cu dezvoltarea continuă a
tehnologiilor electronice de imagistică și de calcul, este ușor să vă imaginați un viitor apropiat
atunci când, de exemplu, rezoluția pixelilor va fi comparabilă cu media fotochimică și
încărcătura computațională nu va deveni o problemă prea mare. Cu astfel de evoluții tehnologice,
vor apărea noi capabilități de imagistică holografică c are vor fi imaginate conceptual.
Neavând la dispoziție o aparatură specială pentru microscopia holografică digitală, pentru
proba practică am folosit un spectrometru care pune in evidență cu ajutorul spectrul de absorbție
compoziția și concentrarea unor s ubstanțe (microscopul care face acelasi lucru dar mai elaborat
și mai precis) , ceea ce, ca și microscopia asigură datele necesare pentru sanatatea publică.
Accelerarea progreselor va necesita, de asemenea, reexaminarea multor preconcepții
moștenite de la holografia convențională, cum ar fi abordările generale ale configurației
aparatelor, comportamentul zgomotului și domeniul de aplicare al aplicațiilor. Acesta este într –
adevăr un moment interesant pentru holografia digitală în general și s ă speră m că aceas tă
revizuire va contribui la explorarea curiozităților studenților și cercetătorilor mai capabili în
domeniu.

77
CAPITOLUL 9 – Bibliografie

[1] D. Gabor, “Un nou principiu al microscopului” Nature 161, 777 –778 (1948).
[2] D. Gabor, “Microscopie prin fronturi de undă reconstruite,” Proc. Roy. Soc. A197, 454 –487
(1949).
[3] D. Gabor, “Microscopie prin fronturi de undă reconstruite: II,” Proc. Phys. Soc. B64, 449 –
469
(1951).
[4] G.L. Rogers, “Experimente în microscopia de difracție,” Proc. Roy. Soc. Edin burgh 63A,
193–221 (1952).
[5] E.N. Leith and J. Upatniek, “Fronturi de unda reconstituite și teoria comunicării,” J.
Opt. Soc. Am. 52, 1123 –1130 (1962).
[6] E.N. Leith and J. Upatnieks, “Reconstruirea fronturilor de unda cu obiecte cu ton continuu”
J. Opt. Soc. Am. 53, 1377 –1381 (1963).
[7] E.N. Leith and J. Upatnieks, “Reconstruirea fronturilor de unda cu obiecte iluminare difuza si
obiecte tridimensionale” J. Opt. Soc. Am. 54, 1295 –1301 (1964).
[8] P. Hariharan, Holografia optică: principii, tehnici ș i aplicații, 2 ed. Cam –
bridge University Press, Cambridge, UK (1996).
[9] N. Collings, Modelarea optică a modelelor utilizând tehnici holografice, Addison –
Wesley, New York (1998).
[10] R.A. Fisher, Conjugarea fazei optice, Elsevier, New York (1983).
[11] G. Faigel and M. Tegze, “Holografia X -ray,” Reports Progress Phys. 62, 355 –393
(1999).
[12] J.C. Solem and G.C. Baldwin, “Micro -holografie a organismelor vii,” Science 218,
229–235 (1982).
[13] J.W. Goodman and R.W. Lawrence, “Formarea imaginii digitale d e la holograme detectate
electronic,” Appl. Phys. Lett. 11, 77 –79 (1967).
[14] U. Schnars and W. Juptner, “Înregistrarea directă a hologramelor de către o țintă CCD și
reconstrucție numerică,” Appl. Opt. 33, 179 –181 (1994).
[15] B.R. Brown and A.W. Lohman n, “Filtrare spațială complexă cu măști binare,” Appl.
Opt. 5, 967 –969 (1966).
[16] L.P. Yaroslavsky and N.S. Merzlyakov, Metode de holografie digitală, Consultants
Bureau, New York (1980).
[17] W. Jueptner and U. Schnars, Holografia digitală: înregistrare a hologramelor digitale,
Reconstrucție și tehnici conexe, Springer -Verlag, Berlin (2005).
[18] S. Grilli, P. Ferraro, S. De Nicola, A. Finizio, G. Pierattini, and R. Meucci, “Reconstrucția
întregului câmp de unde optice prin holografie dig itală,” Opt. Expr ess 9, 294 –302 (2001).
[19] C.J. Mann, L.F. Yu, and M.K. Kim, “Filme de mișcare celulară și sub -celulară prin
microscopie digitală holografică,” Biomed. Eng. Online 5:21, 10 (2006).
[20] E. Cuche, F. Bevilacqua, and C. Depeursinge, “Holografia digitală pen tru imagistica
cantitativă de contrast în fază,” Opt. Lett. 24, 291 –293 (1999).
[21] J. Kuhn, F. Charriere, T. Colomb, E. Cuche, F. Montfort, Y. Emery, P. Marquet, and C.
Depeursinge, “Precizie axonală sub -nanometrică în microscopia digitală holografică,” Meas.
Sci. Technol. 19, 074007 (2008).
[22] P. Ferraro, S. De Nicola, A. Finizio, G. Coppola, S. Grilli, C. Magro, and G. Pier –

78
attini, “Compensarea curburii frontale a undelor inerente în microscopia digitală coerentă
holografică pentru imagistica cantitativă de contrast în fază,” Appl. Opt. 42, 1938 –1946
(2003).
[23] J. Gass, A. Dakoff, and M.K. Kim, “Faza de imagistică fără 2 pi ambiguitate prin holograma
digitală cu lungimi de undă multiple,” Opt. Lett. 28, 1141 –1143 (2003).
[24] I. Yamaguchi and T. Zhang, “Holografia digitală schimbătoare de faze,” Opt. Lett. 22,
1268 –1270 (1997).
[25] W.B. Xu, M.H. Jericho, I.A. Meinertzhagen, and H.J. Kreuzer, “O holografie holografică
digitală pentru aplicații biologice,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11301 –11305
(2001).
[26] A.F. Doval, “O abordare sistematică a holografiei TV,” Meas. Sci. Technol. 11, R1 -R36
(2000).
[27] U. Schnars and W.P.O. Juptner, “Înregistrare digitală și reconstrucția numerică a
hologramelor,” Meas. Sci. Technol. 13, R85 -R101 (2002).
[28] B. Javidi and T. Nomura, “Securizarea informațiilor prin utilizarea holografiei digitale,”
Opt. Lett.25, 28 –30 (2000).
[29] J.W. Goodman, Introducere în optica Fourier, 2 ed. McGraw Hill, Boston (1996).
[30] E.N. Leith, J. Upatnieks, and K.A. Haines, “ Microscopie prin fronturi de undă reconstruite,”
J. Opt. Soc. Am. 55, 981 –986 (1965).
[31] R.W. Meier, “Mărirea și aberațiile din ordinul 3 în holografie,” J. Opt. Soc. Am.
55, 987 –992 (1965).
[32] E. Wolf, “Determinarea amplitudinii și fazei câmpurilor îm prăștiate prin holografie,” J.
Opt. Soc. Am. 60, 18 –20 (1970).
[33] S. De Nicola, P. Ferraro, S. Grilli, L. Miccio, R. Meucci, P.K. Buah -Bassuah, and
F.T. Arecchi, “Măsurători în infraroșu a formei digitală 3D reflexiv -holografic,” Opt.
Commun. 281, 1445 –1449 (2008).
[34] G. Pedrini, F.C. Zhang, and W. Osten, “Microscopie digitală holografică în adâncime (193
nm) ultraviolet,” Appl. Opt. 46, 7829 –7835 (2007).
[35] A.S. Morlens, J. Gautier, G. Rey, P. Zeitoun, J.P. Caumes, M. Kos -Rosset, H.
Merdji, S. Kazami as, K. Casson, and M. Fajardo, “Microscopie digitală holografică
submicrometrică digitală la 32 nm cu armonici de înaltă ordine,” Opt. Lett. 31, 3095 –3097
(2006).
[36] G.W. Stroke, “Metoda Fourier -transformare fără lentile pentru holografia optică,” Appl.
Phys.
Lett. 6, 201 –203 (1965).
[37] P. Torok and F.J. Kao, Imagistica optica si microscopie: Tehnici si sisteme avansate, Eds.
Springer -Verlag, Berlin (2003).
[38] J. Beuthan, O. Minet, J. Helfmann, M. Herrig, and G. Muller, “Variația spațială a indicelui
de refracție în celulele biologice,” Phys. Med. Biol. 41, 369 –382 (1996).
[39] Y.Y. Cheng and J.C. Wyant, “Interferometrie cu 2 faze de lungime de undă,” Appl. Opt.
23, 4539 –4543 (1984).
[40] K. Creath, “Măsurarea înălțimii pasului utilizând interferometr u cu 2 faze de lungime de
undă”, Appl. Opt. 26, 2810 –2816 (1987).
[41] X.H. Li, T. Yamauchi, H. Iwai, Y. Yamashita, H.J. Zhang, and T. Hiruma, “Imagine de fază
cantitativă în câmp, prin interferometrie cu lumină albă, cu stabilizare în fază activă și aplic area
acesteia la probe biologice,” Opt. Lett. 31, 1830 –1832 (2006).

79
[42] S.K. Debnath, M.P. Kothiyal, and J. Schmit, “Spectrul microscopic de interferență pentru
schimbarea fazelor cu lumină albă pentru măsurarea profilului gros al straturilor transparente de
peliculă subțire pe suporturi modelate,” Opt. Express 14, 4662 –4667 (2006).
[43] G. Popescu, L.P. Deflores, J.C. Vaughan, K. Badizadegan, H. Iwai, R.R. Dasari, and M.S.
Feld, “Faza microscopică pentru investigarea structurilor și dinamicii biologice,”
Opt. Lett. 29, 2503 –2505 (2004).
[44] A. Barty, K.A. Nugent, D. Paganin, and A. Roberts, “Cantitate de microscopie cu fază
optică,” Opt. Lett. 23, 817 –819 (1998).
[45] T.E. Gureyev, A. Pogany, D.M. Paganin, and S.W. Wilkins, “Algoritmi liniari pentru
recup erarea fazelor în regiunea Fresnel,” Opt. Commun. 231, 53 –70 (2004).
[46] E. Cuche, P. Marquet, and C. Depeursinge, “ Contrastul amplitudinii și contrastul cantitativ
simultane cu fază prin reconstrucția numerică a hologramelor în afara axei Fresnel,” A ppl. Opt.
38, 6994 –7001 (1999).
[47] C.J. Mann, L.F. Yu, C.M. Lo, and M.K. Kim, “Microscopia cantitativă de contrast de înaltă
rezoluție prin holografie digitală,” Opt. Express 13, 8693 –8698 (2005).
[48] B. Kemper and G. von Bally, “Microscopie holografică di gitală pentru aplicații cu celule vii
și inspecție tehnică,” Appl. Opt. 47, A52 -A61 (2008).
[49] L.F. Yu, Y.F. An, and L.L. Cai, “Reconstrucția numerică a hologramelor digitale cu
unghiuri de vizualizare variabile,” Opt. Express 10, 1250 –1257 (2002).
[50] L. Miccio, D. Alfieri, S. Grilli, P. Ferraro, A. Finizio, L. De Petrocellis, and S.D. Nicola,
“Compensarea directă completă a aberațiilor în microscopia cantitativă a fazelor subțiri
in obiecte printr -o singură hologramă digitală,” Appl. Phys. Lett. 90, 04 1104 (2007).
[50] A. Stern and B. Javidi, “O holografie digitală cu rezoluție îmbunătățită, utilizând teorema
generalizată de eșantionare pentru câmpurile limitate local pe bandă,” J. Opt. Soc. Am. A -Opt.
Image Sci. Vis. 23, 1227 –1235 (2006).
[52] J. Kuhn, T. Colomb, F. Montfort, F. Charriere, Y. Emery, E. Cuche, P. Marquet, and C.
Depeursinge, “microscopia digitală holografică digitală cu o lungime de undă cu o singură
achiziție de holograme în timp real,” Opt. Express 15, 7231 –7242 (2007).
[53] B. Rappaz, A. Barbul, A. Hoffmann, D. Boss, R. Korenstein, C. Depeursinge, P.J.
Magistretti, and P. Marquet, “Analiza spațială a fluctuațiilor membranei eritrocitare prin
microscopie digitală holografică,” Blood Cells Mol. Dis. 42, 228 –232 (2009).
[54] A. Khmaladze, M. Kim, and C.M. Lo, “Imagistica prin fază a celulelor prin holografie
digitală simultană cu reflecție în două lungimi de undă ,” Opt. Express 16, 10900 –10911 (2008).
[55] B. Kemper, D. Carl, J. Schnekenburger, I. Bredebusch, M. Schafer, W. Domschke,
and G. von Bally, “Investigarea celulelor tumorale ale pancreasului viu prin microscopie digitală
holografică,” J. Biomed. Opt. 11:3, 033001 (2006).
[56] M.M. Hossain and C. Shakher, “Măsurarea temperaturii în flux convectiv liber laminar
utilizând holografia dig itală,” Appl. Opt. 48, 1869 –1877 (2009).
[57] L. Miccio, A. Finizio, S. Grilli, V. Vespini, M. Paturzo, S. De Nicola, and P. Fer –
raro, “Liniile microallenilor lichizi reglabile în configurație fără electrozi și caracterizarea lor
precisă prin microscopie de interferență,” Opt. Express 17, 2487 –2499 (2009).
[58] C. Minetti, N. Callens, G. Coupier, T. Podgorski, and F. Dubois, “Măsurători rapide ale
profilurilor de concentrație în interiorul obiectelor deformabile în microflowuri cu holografie
digitală cu coe rență spațială redusă,” Appl. Opt. 47, 5305 –5314 (2008).

80
[59] A. Khmaladze, A. Restrepo -Martinez, M. Kim, R. Castaneda, and A. Blandon, “Simularea
simultană a unei holograme digitale de reflecție cu lungimea de undă aplicată studiului probelor
de cărbune p oros,” Appl. Opt. 47, 3203 –3210 (2008).
[60] L. Xu, X.Y. Peng, J.M. Miao, and A.K. Asundi, “Studii de holografie digitală microscopică
cu aplicații la testarea microstructurii,” Appl. Opt. 40, 5046 –5051 (2001).
[61] S. Grilli, M. Paturzo, L. Miccio, and P. Ferraro, “Investigarea in situ a polarizării periodice
în LiNbO3 congruent prin microscopie interferențială cantit ativă,” Meas. Sci. Technol. 19,
074008 (2008).
[62] W.S. Haddad, D. Cullen, J.C. Solem, J.W. Longworth, A. McPherson, K. Boyer, and
C.K. Rhod es, “Microscopul holografic cu transformata Fourier,” Appl. Opt. 31, 4973 –4978
(1992).
[63] M.K. Kim, L.F. Yu, and C.J. Mann, “Tehnologii digitale de holografie digitală și
interferențe cu lungimi de undă cu mai multe lungimi de undă,” in Digital Holograph y and Three
Dimensional Display: Principles and Applications, pp. 51 –72 (2006).
[64] M. Liebling, T. Blu, and M. Unser, “Fresnelet: noi baze de valuri multiresolution pentru
holografia digitala,” IEEE Trans. I mage Process. 12, 29 –43 (2003).
[65] L. Onural, “Difracția de la un punct de vedere al undei,” Opt. Lett. 18, 846 –848
(1993).
[66] M. Brunel, S. Coetmellec, D. Lebrun, and K.A. Ameur, “Contrast fazic digital cu
transformarea fourieră fracționată,” Appl. Opt. 48, 579 –583 (2009).
[67] N. Verrier, S. Coet mellec, M. Brunel, and D. Lebrun, “Holografia holografică digitală în
sistemele optice groase: aplicare la vizualizare în țevi,” Appl. Opt. 47, 4147 –4157
(2008).
[68] N. Verrier, S. Coetmellec, M. Brunel, D. Lebrun, and A. Janssen, “O holografie digitală î n
linie cu o grindă Gaussiană astigmatică: o reconstrucție cu unghi larg,” J. Opt.
Soc. Am. A -Opt. Image Sci. Vis. 25, 1459 –1466 (2008).
[69] U. Iemma, L. Morino, and M. Diez, “Holografia digitală și descompunerea lui Karhunen –
Loeve pentru analiza modală a structurilor vibratoare bidimensionale,” J. Sound Vibr.
291, 107 –131 (2006).
[70] Y. Fu, G. Pedrini, B.M. Hennelly, R.M. Groves, and W. Osten, “O holografie digitală cu o
lungime de undă imagineplane pentru măsurarea dinamică,” Opt. Lasers Eng. 47, 552 –557
(2009).
[71] A. Stern and B. Javidi, “Condiții de lățime de bandă pentru spațiu pentru o microscopie
digitală holografică digitală care schimbă faza,” J. Opt. Soc. Am. A -Opt. Image Sci. Vis. 25,
736–741
(2008).
[72] S. De Nicola, A. Finizio, G. Pierattin i, D. Alfieri, S. Grilli, L. Sansone, and P. Fer –
raro, “Recuperarea informațiilor de fază corecte în microscopia holografică digitală cu lungimi
multiple, prin compensarea aberațiilor cromatice,” Opt. Lett. 30, 2706 –2708
(2005).
[73] L. Xu, X.Y. Peng, Z.X. Guo, J.M. Miao, and A. Asundi, “Analiza imagistică a holografiei
digitale,” Opt. Express 13, 2444 –2452 (2005).
[74] S.S. Kou and C.J.R. Sheppard, “Imagistica în microscopia holografică digitală,” Opt.
Express
15, 13640 –13648 (2007).

81
[75] D.Y. Wang, J. Zhao, F. Zhang, G. Pedrini, and W. Osten, “Implementarea numerică de
înaltă fidelitate a propagării Fresnel în mai multe etape pentru reconstrucția hologramelor
digitale,”
Appl. Opt. 47, D12 -D20 (2008).
[76] I. Yamaguchi, J. Kato, S. Ohta, and J. Mizuno, “Formarea imaginii în holografia digitală cu
trecerea de fază și aplicațiile la microscopie,” Appl. Opt. 40, 6177 –6186 (2001).
[77] U. Schnars, T.M. Kreis, and W.P.O. Juptner, “Înregistrarea digitală și reconstrucția
numerică a hologramelor: Reducerea spec trului de frecvență spațială,” Opt. Eng. 35,
977–982 (1996).
[78] T.M. Kreis and W.P.O. Juptner, “Suprimarea termenului de dc în holografia digitală,” Opt.
Eng. 36, 2357 –2360 (1997).
[79] D.S. Monaghan, D.P. Kelly, N. Pandey, and B.M. Hennelly, “Îndepărtar ea în holografie
digitală utilizând iluminarea difuză,” Opt. Lett. 34, 3610 –3612 (2009).
[80] D.P. Kelly, B.M. Hennelly, N. Pandey, T.J. Naughton, and W.T. Rhodes, “Limite de
rezoluție în sistemele holografice digitale practice,” Opt. Eng. 49, 095801 (2009 ).
[81] L. Onural, “Eșantionarea câmpului de difracție,” Appl. Opt. 39, 5929 –5935 (2000).
[82] J.C. Li, P. Tankam, Z.J. Peng, and P. Picart, “Reconstrucția holografică digitală a obiectelor
mari, utilizând o abordare prin convoluție și o mărire reglabilă,” Opt. Lett. 34, 572 –574 (2009).
[83] F. Dubois, L. Joannes, and J.C. Legros, “Îmbunătățirea imaginii tridimensionale cu un
microscop digital cu holografiere, cu o sursă de coerență parțială parțială,” Appl. Opt. 38,
7085 –7094 (1999).
[84] L.F. Yu and M.K. Kim, “Lungimea de scanare a hologramelor de interferență digitală
pentru imagistica tomografică tridimensională prin utilizarea metodei sp ectrului unghiular,” Opt.
Lett.30, 2092 –2094 (2005).
[84] Myung K. Kim , ”Principii și tehnici de microscopie holografi că digitală ” Universitatea din
Florida de Sud, Departamentul de Fizică, 14 mai 2010.
[85] G. Sheoran, S. Dubey, A. Anand, D.S. Mehta, and C. Shakher, “Holografia digitală pentru a
reconstrui imaginile tomografice de tipul swept -source,” Opt. Lett. 34, 1879 –1881
(2009).
[86] J.W. Weng, J.G. Zhong, and C.Y. Hu, “Reconstrucția digitală bazată pe difracția de spectru
unghiular cu creasta transformării wavelet în microscopia cu contrast fază holografică,” Opt.
Express 16, 21971 –21981 (2008).
[87] S.J. Jeong and C.K. Hong, “Reconstrucția imaginii menținută în dimensiunea pixelului a
hologramelor digitale pe planuri înclinate arbitrar prin metoda spectrului unghiular,” Appl. Opt.
47, 3064 –3071 (2008).
[88] S. Kim and S.J. Lee, “Măsurarea debitului 3D laminar în interiorul unui micro tub folosind
velocimetria de urmărire a particulelor holografice micro -digitale,” J. Micromech. Microeng. 17,
2157 –2162 (2007).
[89] H. Sun, H. Dong, M.A. Player, J. Watson, D.M. Paterson, and R. Perkins, “Holografie video
digitală l iniară pentru studiul proceselor de eroziune în sedimente,” Meas. Sci. Technol.
13, L7 -L12 (2002).
[90] D. Mas, J. Perez, C. Hernandez, C. Vazquez, J.J. Miret, and C. Illueca, “Calcul numeric
rapid al modelelor Fresnel în sisteme convergente,” Opt. Commun. 227, 245 –258 (2003).
[91] C. Wagner, S. Seebacher, W. Osten, and W. Juptner, “Inregistrare digitala si reconstructie
numerica a hologramelor Fourier fara lentile in metrologie optica,” Appl. Opt. 38, 4812 –
4820 (1999).

82
[92] P. Picart, J. Leval, D. Mounier, and S. Gougeon, “Unele oportunități de analiză a vibrațiilor
cu o medie de timp în holografia digitală Fresnel,” Appl. Opt. 44, 337 –343 (2005).
[93] T.M. Kreis, “Analiza de frecvență a holografiei digitale,” Opt. Eng. 41, 771 –778
(2002).
[94] H.Z. Jin, H. Wan, Y.P. Zhang, Y. Li, and P.Z. Qiu, “Influența parametrilor structurali ai
CCD asupra imaginii de reconstrucție a hologramelor digitale,” J. Mod. Opt. 55, 2989 –3000
(2008).
[95] C.S. Guo, L. Zhang, Z.Y. Rong, and H.T. Wang, “Efectul factorului d e umplere a pixelilor
CCD asupra hologramelor digitale: comentariu asupra lucrării "Analiza frecvenței holografiei
digitale" și "Analiza frecvenței holografiei digitale cu reconstrucție prin convoluție’,” Opt.
Eng. 42, 2768 –2771 (2003).
[96] T.M. Kreis, “R esponse to “Efectul factorului de umplere al pixelilor CCD asupra
hologramelor digitale: comentariu asupra lucrării "Analiza de frecvență a holografiei digitale" și
"Analiza de frecvență a holografiei digitale cu reconstrucție prin convoluție’,” Opt. Eng. 42,
2772 –2772
(2003).
[97] T.M. Kreis, “Analiza de frecvență a holografiei digitale cu reconstrucție prin convoluție,”
Opt. Eng. 41, 1829 –1839 (2002).
[98] G. Pedrini, H.J. Tiziani, and Y.L. Zou, “Holografia Tv digitală de tip puls dublu,” Opt.
Lasers Eng. 26, 199 –219 (1997).
[99] U. Schnars and W.P.O. Juptner, “Înregistrarea digitală și reconstrucția hologramelor în
interferometria holografică,” Appl. Opt. 33, 4373 –4377
(1994).
[100] M. Gustafsson, M. Sebesta, B. Bengtsson, S.G. Pettersson, P. Egelberg, an d T. Lenart,
“Microscopia cu transmisie digitală de înaltă rezoluție – o abordare holografică Fourier,” Opt.
Lasers Eng. 41, 553 –563 (2004).
[101] A.M. Weiner, D. E. Leaird, D.H. Reitze și E.G. Park Bellcore , ”Holografia spectrală a
pulsurilor femtosecunde în formă ”, Opt. Letters / Vol. 17, No. 3 / February 1, 1992
[102] P. C. Logofatu, F. Garoi, A. Sima, B. Ionita, D. Apostol ” Experimente holografice clasice
în termeni digitali ” – Institutul Național de fizica laserilor , plasmei și radiațiilor, Măgurele
[103] U. Scnars, W. Jueptner – ”Holografia digitală: înregistrarea holografică digitală,
reconstrucția numerică și tehnicile conexe”
[104] Cursul ”Dispozitive optoelectronice”, Prof. Univ.Dr.Ing P. Schiopu
[105] Cursul ” Tehnici optolectronice de investigare a materialelo r”, Prof. Univ G. Stanciu
[106] Cursul ” Dispozitive laser acordabile ”, Prof. V. Feie ș
[107] Cursul ” Senzori optoelectronici ”, Conf. Dr. Ing. M. Vlădescu
[108] Cursul ” Circuite optoelectronice ”, Conf. Dr. Ing. M. Vlădescu
[109] ” Spectrofotometrie” ,UMF Carol Davila, Catedra de Biofizica
[110] Agilent Technologies , ”Cary WinUV – Software Manual ” , Ninth edition, September 2011