MICROPROPAGAREA in vitro [305181]

MICROPROPAGAREA in vitro

metodă de înmulțire și conservare a resurselor vegetale

Argument privind tema luată în studiu (în loc de introducere)………………………..p. 3

PARTEA I. [anonimizat] …………………………..p. 7

1. Nutriția plantelor superioare. Generalități……………………………………………..p. 7

1.1. Elementele nutritive. Importanța și funcțiile lor în metabolismul plantlor

1.1.1. Metabolismul secundar al plantelor superioare

1.2. Absorbția nutrienților și factorii care o influențează

1.3. Fotosinteza plantelor verzi. Câteva considerații

2. Creșterea și dezvoltarea plantelor. Efectele fiziologice………………………………..p. 22

2.1. Creșterea și efecte fiziologice asupra plantelor

2.2. Dezvoltarea plantelor. Ciclul de viață a plantelor

2.3. Fitohormonii și rolul în fiziologia creșterii și dezvoltării plantelor

2.4. Factorii de mediu implicați în creșterea și dezvoltarea plantelor

3. Înmulțirea plantelor superioare………………………………………………………..p. 35

3.1. Înmulțirea vegetativă a plantelor superioare

3.2. Înmulțirea plantelor prin țesut formativ meristematic

PLANȘA I. Modele privind tipurile de înmulțire vegetativă……………………………p. 44-45

PLANȘA II. Înmulțirea din țesut formativ sau meristem

ANEXA I. . ELEMENTELE MINERALE (nutritive). Rolul și funcțiile lor……… ……pp. 47

ANEXA II. Metaboliții secundari ai plantelor

ANEXA III. Fitohormonii și rolul în creșterea la plante

ANEXA IV. Moduri de realizare a înmulțirii vegetative artificiale

BIBLIOGRAFIE (Partea I)…………………………………………………………………..p. 51

PARTEA II. Micropropagarea și totipotența celulei vegetale in vitro……………………p. 54

INTRODUCERE. Capacitatea dediferențiere și regenerare a celule vegetal

4. Generalități privind organizarea laboratorului de micropropagare………………………..p 56

4.1. [anonimizat] a laboratorului

5. Mediile aseptice pentru cultura țesutului vegetal in vitro…………………………………p. 65

5.1. Preparare a [anonimizat]

5.2. Componentele mediilor de cultură aseptice

5.2.1. [anonimizat]

5.3. [anonimizat] a unui mediu aseptic

6. Materialul vegetal. Natura explantelor cultivate in vitro…………………………..p. 75

6.1. Planta mamă și selecționarea ei

6.1.1. Tipurile de explante. Însușiri morfologice

6.1.2. Sterilizarea țesuturilor vegetal

6.2. Operațiuni aplicate inoculilor (incizarea, inocularea)

7. Înmulțirea plantelor prin micromultiplicare in vitro………………………………p. 88

7.1. Etapele micromultiplicării plantelor in vitro

8. Morfo-fiziologia țesuturilor cultivate in vitro………………………………………p. 94

8.1. Diferențierea și regenerarea in vitro

8.1.1. Diferențierea de calus sau calusogeneza in vitro

8.2. Organogeneza la nivelul explantelor cultivate in vitro

8.2.1. Rizogeneza și caulogeneza in vitro

PLANȘE Foto. 1 – 4………………………………………………………………….p. 105

ANEXA 1 și 2…………………………………………………………………………………….p 109

Bibliografie (PARTEA II.)……………………………………………………………..p. 111

PARTEA III.

CONSERVAREA și MICROPROPAGAREA in vitro a unor grupe de specii……p. 119

9. Obiective și realizări în micropropagare in vitro la Solanum tuberosum L………..p. 121

9.1. Utilizarea culturilor in vitro în multiplicarea și ameliorarea cartofului

9.1.1. Înmulțirea și conservarea in vitro a unor soiuri autohtone și străine de cartof

10. Micropropagare in vitro a unor specii de plante. Generalități…………………..p. 164

10.1. Conservarea prin micropropagare in vitro a unor specii spontane

10.1.1. Conservarea in vitro a unor elemente botanice periclitate din județul Bihor

10.2. Înmulțirea in vitro a unor specii de importanță economică

(medicinale, aromate, condimente)

ANEXA I. Trepte sozologice după IUCN…………………………………………………p. 210

ANEXA II. Rezervații cu valoare botanică din județul Bihor

ANEXA III. Rarități floristice din ariile protejate ale județului Bihor

ANEXA IV. Metode de conservarea a materialului vegetal ex situ

ANEXA V. Cele mai bune rezultate și medii la speciile din flora spontană cultivate in vitro

ANEXA VI. Cele mai bune rezultate la speciile aromate, condimente, medicinale in vitro

Bibliografie partea III……………………………………………………………………..p. 214

Glosar………………………………………………………………………………………p. 224

Rezumat Ro.………………………………………………………………………………..p.232

Summary….……………………………………………………………………………….p. 235

Argument privind tema luată în studiu

(în loc de introducere)

In 1902 Haberland formula teoria totipotentialitatii celulare, conform căreia celula vegetala poate genera o planta întreaga întrucât ea conține toata informația genetica necesara. Celula vegetală – unitatea lumii vii – este organizată unitar, separată de organismul întreg, poate funcționa ca „organism primitiv”, datorită informației genetice pe care o deține, capacitate care a stat și la baza tehnicii de micropropagare in vitro. Experiențele de culturi de țesuturi inițiate nu au confirmat teoria formulata de Haberland. Eșecul acestor experimente s-au datorate în primul rând faptului că explantele au fost detașate din țesut diferențiat funcțional (din organe senescente, îmbătrânite), stadiu în care celula țesutului detașat nu are capacitate de-a diferenția, capacitatea de a diferenția este dată de prezența celule tinere meristematice; și în al doilea rând datorită lipsei fitohormonilor și a sursei de carbon din mediu de cultură (zaharoză ori glucoză), cu rol de-a stimula valoarea energetică a țesutului.

Teoria lui Haberland este confirmata de Morel și Martin ceva mai târziu (în 1952), care bazându-se pe teoria totipotenței celulei vegetale, au perfecționat metoda. Au cultivat țesut meristematic caulinar pe medii aseptice obținând in vitro plante sănătoase, libere de viruși, rezultând plante devirozate, cu o rată de înmulțire mare, de nerealizat prin tehnica de înmulțire clasică. Abia în anii ̕ 60 a început etapa modernă a cercetărilor de culturi de explante vegetale in vitro, elaborându-se tehnici eficiente de regenerare și cultivare a țesuturilor vegetale pe medii controlate.

A trecut câteva decenii (cca. 60 ani) de când în țara noastră au apărut primele preocupări legate de biotehnologiile vegetale și de micropropagarea in vitro a plantelor de interes economic, ornamental, biologic etc. Specialiștii și cercetării din domeniu au elaborat lucrări de valoroase care de-a lungul timpului au stat la baza multor lucrări în acest domeniu constituind o sursa de inspirație, dând posibilitatea noii generații de a compara ceea ce au obținut în domeniul micropropagării in vitro în experiențele recente, cu realizările din decursul acestor decenii. Studiile acestora au constituit și pentru mine un imbold și model în redactarea acestei lucrări.

Laboratorul de biotehnologii vegetale al Facultății de Protecția Mediului a Universității din Oradea este tânăr, dar are preocupări variate din domeniul biotehnologiilor moderne și de interes. Printre acestea aș aminti și cercetările de micropropagare in vitro a unor specii de interes economic (expl. cartoful, leguminoase furajere etc.), medicinale, aromate, condimente, ornamentale etc., domeniu în care îmi desfășor și eu activitatea. Apoi sub conducerea șefului departamentului conf. univ. dr. Laslo Vasile se fac cercetări in domeniul biologiei moleculare si a biotehnologiilor verzi de obținere a nanoparticulelor.

De remarcat sunt preocupările noastre de conservare a unor specii din flora spontană prin microînmulțire in vitro, în scopul protecției lor. Ne-am orientat cu precădere asupra speciilor din Rezervația Parcului Natura Munții Apuseni, cele de pe raza județului Bihor, vulnerabile și amenințate cu dispariția. Majoritatea acestor speciilor din flora spontană aflate pe aria județului, sunt ocrotite și conservate în incinta ariilor protejate ale RPNMA. Cu toată această protecție, unele din aceste specii mai ales de interes fitofarmaceutic sau cu valoare ornamentală sunt culese, fie în scop farmaceutic fie în scop ornamental și se află în pericol de dispariție.

Lucrarea este concepută în trei părți: partea I. prezintă aspecte de „Morfologia și fiziologia plantelor”. În elaborarea acestei părți am ținut cont de scopul didactic al lucrării, considerând că este de interes pentru student să-și reamintească și să-și fixeze anumite noțiuni din morfologia și fiziologia plantelor, care stau și la baza evoluției țesutului vegetal cultivat prin micropropagare in vitro. Am prezentat tema „Nutriția plantelor superioare” importanța, caracteristicile și funcțiile elementelor nutritive în metabolismul plantei, procesul absorbției nutrienților și factorii care influențează procesul, precum și câteva considerații privind asimilația clorofiliană (proces caracteristic plantelor verzi și esențial pentru ele). Alte procese fiziologice abordate au fost „Creșterea și dezvoltarea plantelor”, insistând asupra meristemului, țesut care înglobează în structura lui celule cu capacitate de a se diferenția și de a da naștere la plante identice cu planta de la care s-a detașat țesutul. Natura fitohormonilor și a factorilor de mediu implicați în creșterea și dezvoltarea plantelor, sunt alte aspecte abordate, ca și procesul dezvoltării, cu fazele ciclului de dezvoltare la plante. Această parte se încheie cu „Înmulțirea clasică a plantelor superioare”, moduri de înmulțire: reproducerea sexuată și înmulțirea vegetativă, și aspecte de înmulțire din țesut formativ, meristematic.

Partea II intitulată „Micropropagarea și totipotența celulei vegetale in vitro” cu aspecte legate de capacitatea de dediferențiere și regenerare a celulei în condițiile controlate, in vitro. Totipotența celulei vegetale la plantele superioare este dată de capacitatea acestora de a se înmulți atunci când celula sau țesutul este detașat din organismul întreg și când îi sunt asigurate toate condițiile de mediu necesare pentru a genera noi plante: deci capacitatea celulei izolate de a genera inițial in vitro tulpini. Alte aspecte incluse în această parte a lucrării sunt legate de organizarea unui laborator de micropropagare, protocolul de lucru: mediile aseptice pentru cultura țesutului vegetal in vitro, materialul vegetal, natura explantelor cultivate, precum și etapele concrete ale micropropagării plantelor superioare in vitro. Partea se încheie cu prezentarea aspectelor legate de procesele de dediferențiere, regenerare, organogeneză, rizogeneză, caulogeneză și calusogeneză a țesuturilor vegetale in vitro.

Partea III cuprinde „Conservarea plantelor prin micropropagare in vitro”, modele de micropropagare in vitro la unele grupe de plante studiate în laboratorul nostru. Domeniile utilizării practice a tehnicii: în ameliorarea cartofului și cultura in vitro a unor soiuri autohtone și străine de cartof, precum și în conservarea in vitro a unor specii din flora spontană, specii vulnerabile sau amenințate cu dispariția, dar și aspecte de înmulțire in vitro a unor specii medicinale, aromate și condimente.

Am urmat o bursă postdoctorală de un an și jumătate, în proiectului POSDRU/159/1.5/S/140106, studii doctorale și posdoctorale Orizont 2020: promovarea interesului național prin excelență, competitivitate și responsabilitate ȋn cercetarea științifică fundamentală și aplicată românească. Partener: Institutul de Economie Mondială, cu tema „Cercetări privind conservarea „ex situ” prin tehnici „in vitro” a unor specii endemice, rare și periclitate din flora României”, cu studiu de caz: „Categorii sozologice de specii din unele arii protejate ale județului Bihor”. Am încercat să fac cunoscută bogăția lumii vegetale din ariile protejate ale județului Bihor, în dorința de a contribui la conservare florei spontane din această regiune, inițiind înmulțirea in vitro a unor plante spontane din Muntele Șes: Campanula rotundifolia L. ssp. polimorpha, specie rară și vulnerabilă; Drosera rotundifolia Huds., specie critic periclitată; Dianthus spiculifolius din P.N.M.A. critic periclitată, iar din Pădurea cu narcise (sat Alparea), specie vulnerabilă Narcissus poeticus L. Specii le-am cultivat in vitro în scopul multiplicării lor, urmărind conservarea pe cale neconvențională a lor pentru a contribui la asigurarea viabilității ariilor și sit-urilor din județul Bihor. După stagiu, am continuat conservarea acestor specii in vitro (urmărind alte aspecte), experimentând specii noi, în cadrul laboratorului de biotehnologii vegetale a Facultății de Protecția Mediului, sperând la continuarea acest proiect de interes.

Că am reuși sau nu să stimulez interesul studenților de la Facultatea de Protecția mediului pentru acest domeniu foarte interesant, incitant și actual, rămâne să constat în timp, prin prezența la cursuri a lor în număr cât mai mare și manifestarea dorinței de a participa la teme de cercetare din laborator și de a elabora lucrări de licență și master în acest domeniu.

PARTEA I. Biologia și morfo-fiziologia plantelor superioare

Nutriția plantelor superioare. Generalități

Organismul plantelor superioare prin procesul de nutriție preiau substanțele anorganice din mediu și le transformă în compuși organici necesari ciclului lor de viață. Modul de nutriție al plantelor superioare, în toate etapele de dezvoltare este o nutriție fotoautotrofă, adică sintetizează substanțele organice doar în prezența luminii, cu excepția perioadei de germinație a semințelor, când embrionul seminței se hrănește autotrof.

Plantele iau substanțelor organice din sol. Preferința unor specii de plante pentru anumite tipuri de sol se datorează modului de nutriție: cunoașterea acestui mod de nutriție poate duce la obținerea unor culturi standard (mai ales la speciile din cultura mare – grâu, orz, porumb etc.) și optimizarea necesarului de substanțe minerale. Solul conține un amestec de minerale (molecule organice și anorganice, aer, apă, diferite organisme etc.) și este un suport fizico-chimico-biologic în creșterea plantelor. Componenta biologică este reprezentată de microorganisme (bacterii, ciuperci): nevertebrate au nevoie de apa și aerul din sol și consumă o parte de elementele minerale din substrat, existând o competiție între aceste animale și plantele superioare. Pe un hectar de pământ sunt cca. 3 tone de organisme care asigură schimbul de gaze cu mediul, cu rol în procesul de ecologizare a solului. Cea mai mare cantitate de substanțe minerale se formează primăvara și scade vara datorită activității microorganismelor și a rădăcinilor din sol. Cea mai importantă sursă de substanțe pentru sol o asigura rădăcinile moarte: datorită selectivității limitate pentru mineralele din sol, rădăcinile plantelor absorb odată cu nutrienții și elemente toxice (dăunătoare).

Consumul de nutrienți la plante se face prin apa din sol care disociază în ioni și hidroxil (H20 <–> OH- + H+), ceea ce dă pH-ul solului, care influențat de descompunerile de substanță organică și de căderile de ploi, cu rol important în creșterea și dezvoltarea plantelor, disponibilizând elemente minerale necesare plantei și favorizând absorbția minerală care se realizează prin rădăcini (pH-ului rădăcinii este ușor acid, de 5.5- 6.5). Nevoia plantei față de concentrația de ioni de hidrogen este diferită: de exemplu, cartoful preferă un pH=5.0-5.5, iar leguminoasele furajere perene un pH=7.0-8.0, valori care intensifică creșterea și dezvoltarea speciilor amintite.

Nutriția minerală a plantelor este: calitativă (legată de natura chimică a elementelor minerale) și cantitativă ( de volumul de minerale necesare plantei pentru a putea trăi). Nutriția minerală cantitativă trebuie privită practic, deoarece planta poate crește și dezvolta și în anumite condiții satisfăcătoare: în schimb optimul creșterii plantei se realizează numai în condiții optime de mediu.

Studiile de laborator privind necesitatea mineralelor și calitatea acestora au stabilit că unele sunt absolut necesare pentru supraviețuirea plantelor (N, P, K, Ca, Mg, Cu, Zn, Mn, B, Mo, Cl, Na). Necesitatea față de anumite elemente minerale este dată de funcția elementului în procesele metabolice din plantă. După rolul mineralelor în metabolismul celulei vegetale, acestea s-au clasificat în trei grupe:

cu rol plastic în sinteza unor substanțe de constituție: C, H, N, S, P, Ca, Mg, Si;

cu rol metabolic, care catalizează, activează sau inhibă activitatea unor enzime (Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, B);

cu rol hidro-electrolitic, care reglează echilibrul osmotic al celulei, modificând permeabilitatea și proprietățile fizico-chimice (K, Na, Ca, Mg) .

Necesarul de minerale al plantei este asigurată prin modul cum celula absoarbe și transportă aceste elemente în plantă: procese (absorbția și transportul mineralelor din plantă) dependente de anumiți factori externi și interni. În condiții controlate de mediu in vitro, acești factori sunt asigurați în funcție de necesitățile speciei și a de metabolismul plantei, pentru stimularea creșterii și dezvoltării diferitelor tipuri de țesuturilor vegetale (explante), prin adausul unor componenții în mediului de cultură aseptic (conceput adecvat), dar și prin reglarea factorilor de climă necesari speciei.

1.1. Elementele nutritive. Importanța și funcțiile lor în metabolismul plantei

În nutriția unei plante elementul mineral este considerat esențial atunci când în lipsa acestuia planta nu poate să se dezvolte și nu există posibilitatea înlocuirii lui cu un alt element. Aceste minerale sunt grupate după concentrația relativă a lui în țesutul plantei, în două grupe:

Macroelemente, în număr de nouă: C, H, O, N, S, P, K, Ca și Mg;

Microelemente, în număr de opt: Fe, Cl, B, Mn, Zn, Cu, Mo, și Ni.

În ANEXA I. (ELEMENTELE MINERALE. Rolul și funcțiile lor) sunt prezentate microelementele și macroelementele, cu simbolurile lor, cu specificația importanței lor la plantele superioare, cu funcțiile biologice și efectele lor în urma deficitului sau excesului unuia dintre elemente. În afara datelor cuprinse în această anexă redăm mai jos câteva aspecte legate de macroelemente, insistând mai cu seamă asupra microelementelor necesare plantelor.

Macroelementele sunt absorbite de plantă sub formă de anioni (N, S, P, Si, Cl) și cationi (K, Ca, Na, Mg). Rolul fiziologic al lor este dat de participarea la sistemele funcționale ale celulei și la funcțiile fiziologice pe care le exercită (la doză normală, exces sau carență). Urmărind ANEXA I. constatăm că primele trei elemente C, H și O nu sunt considerate macroelemente pentru că se obțin din apă și CO2. Microelementele sunt co-factori ai enzimelor, necesare în cantitate foarte mică, dar deficiența sau lipsa lor produc fenomene nedorite la plante (cloroza, inhibarea creșterii frunzelor, etc.). Intervin în metabolismul plantei, prin catalizarea reacțiilor de: oxidare, reducere și stimulare a proceselor fiziologice, intensifică acțiunea vitaminelor, enzimelor și a hormonilor din plante. La lipsa sau insuficienta lor, plantele suferă prin apariția simptomelor de carență, iar excesul acestora determină toxicitate. Efectul lipsei, deficitului sau al excesului unor macroelemente, sau microelemente în mediile nutritive s-au demonstrat prin experiențe fiziologice.

Fig. 1 Reacția plantelor de porumb la lipsa din soluția nutritivă a unor macro. N, P și K

Lipsa celor mai importante macroelemente pentru plante (N, P, K) s-a demonstrat la porumb și este redată în fig. 1 care relevă faptul că planta crescută pe o soluție nutritivă completă este dezvoltată normal, iar cea crescută în lipsă de azot are sistem radicular slab, partea aeriană mică, nedezvoltată. Se știe că azotul are rol structural intrând în componența aminoacizilor și proteinelor. Carența în fosfor este asemănătoare lipsei de N (cu rol energetic asupra ATP): lipsa potasiului influențează negativ aspectul părții aeriene, iar lipsa fosforului afectează structura enzimelor respiratorii (fosforul asigură hidratarea celulelor).

A. B.

Fig. 2. Carența de calciu: A- la frunzele de sfeclă; B – la tuberculii de cartof

Tot prin experiențe fiziologice la plante s-a demonstrat efectele deficitului la alte elemente nutritive, astfel deficitul de calciu determină deformarea frunzelor de sfeclă și apariția unor pete albicioase pe marginea frunzei (fig.2A), iar deficitul de calciu la cartof afectează mărimea tuberculilor și în final producția de cartof (fig. 2B).

Fig. 3. Plantă de căpșun crescută în deficit de Fier (decolorarea frunzelor)

La plantele s-a demonstrat efectul deficitului sau excesul unor microelemente: astfel Fe fiind implicat în sinteza clorofilei și a proteinei în citoplasmă, deficitul se manifestă prin cloroza sistemului foliar, decolorarea frunzelor și în final căderea lor (fig.3).

Fig. 4. Excesul de magneziu la frunzele de fasole

Toxicitatea unor elemente apare la excesul lor în sol ori în soluția nutritivă administrată. Familiile botanice au sensibilitate diferită la excesul de mangan, a căror simptome indică gradul de toxicitate a elementului în plantă. Printre plantele sensibile se numără și fasolea, la care excesul manganului se manifestă la frunze prin apariția clorozei între nervurile frunzei și apoi apariția petelor de necroză (fig. 4).

Prezentăm mai jos alte microelemente cu rol mai puțin important pentru plante sau elemente cu implicație numai la anumite grupe de plante:

Cobalt, element esențial pentru algele albastre-verzi, implicat în biosinteza glucidelor, lipidelor, fixarea N molecular, biosinteza clorofilei etc. Are rol în creșterea conținutului de amidon la tuberculii de cartof, stimulează activitatea bacteriilor fixatoare de azot fiind prezent în coenzima Vitamine B12 (pe care plantele superioare nu o produc). Excesul duce la cloroze, necroze, creșterea încetinită și în final moartea plantei. Iodul, deși se găsește în cantitate mică în plante, favorizează formarea fructelor (greutatea masei proaspete) și creșterea în lungime a plantelor. Iodul în plante se găsește sub formă de ioduri și compușii organici (legat de molecula de proteină și de aminoacid). Cadmiu nu este esențial metabolismului plantei, fiind în general toxic. Acumulat în organele aeriene, inhibă fotosinteza, iar excesul determinând cloroza frunzelor. Cromul nu este necesar plantelor, se găsește în cantitate mare în sol, apă și materia vegetală, aflat în exces încetinește creșterea la unele plante, afectează frunzele și dezvoltarea inflorescenței.

Plumbul este prezent în solurile agricole, unde se acumulează prin folosirea unor insecticide, acționând la nivelul celulei, inhibă sinteza clorofilei, germinația semințelor și absorbția CO2. Aluminiu, aflat în cantitate mare în sol este eliberat sub formă Al3+. Toxicitatea mărită crește odată cu căderea ploilor acide cauzate de prezența combustibililor fosili, de poluare în general. Acționează la nivelului țesutului meristematic, inhibă dezvoltarea rădăcinilor, stopează creșterea plantei, frunzele devin mici și cu pete de necroză.

Funcțiile elementelor nutritive la plantele superioare. Plantele superioare sintetizează nutrienții organici cu ajutorul procesului de fotosinteză, iar nutrienții anorganici îi preia din mediul în care trăiesc sub formă de ioni sau molecule. Funcțiile elementelor nutritive în metabolismul plantei sunt foarte diverse, pe lângă funcția structurală, unele catalizează o serie de reacții biochimice, iar altele au rol în activitatea enzimatică. Existând diferențe mari privind concentrația elementelor minerale de la specie la specie, s-a propus o altă clasificare a componentelor nutritive, ținând cont de funcțiile fiziologice și biochimice ale acestora în patru grupe pe care le prezentăm sumar în tabelul 1.

Tabel 1. Clasificarea elementelor minerale după funcțiunile fiziologice și biochimice

Funcțiile nutrienților minerali în metabolismul celulei sunt bine stabilite. Astfel, unele elemente cu rol important în complexele moleculare cum sunt: H, C și O sau altele ca N, S și P intră în alcătuirea aminoacizilor: Fe intră în compoziția proteinelor și enzimelor; K+ cantitativ este cel mai important ion anorganic din organismul vegetal (cca. 0,1-0,2 mol/l se găsește în citoplasmă) și împreună cu ionul de Ca2+ (antagonist) determină vâscozitatea citoplasmei, factor osmotic al turgescenței, componente ale pectinelor din peretele celular.

Rolul nutrienților în metabolism s-a stabilit prin experiențe fiziologice care au demonstrat că la plante apar simptomele de carență dacă unul sau mai multe elemente sunt în cantitate insuficientă și simptome de toxicitate dacă elemente se găsesc în exces. Disponibilitatea nutrienților din sol la concentrația necesară plantei, aduce după sine stimularea creșterii ei: dacă concentrația de substanțe necesară plantei crește, are loc o stagnare în evoluție, dacă concentrația se menține mare o anumită perioadă de timp, apare toxicitatea și creșterea plantelor este inhibată. Simptomele deficienței nutrienților din sol sunt de cele mai multe ori vizibile. Amintim unele dintre cele mai întâlnite reacții:

stoparea creșterii tulpinii plantelor în cazul deficitului de azot și a rădăcinilor în cazul deficitului în fosfor;

cloroză, cauzată de scăderea sintezei pigmentului clorofilian din lipsă de magneziu, azot și fier;

necroză, apare la frunzele tinere din cauza lipsei magneziului, potasiului sau manganului, lipsa lor manifestându-se prin schimbarea culorii (culoarea roșie datorită antocianilor aparține lipsei fosforului).

Aceste simptomele pot apărea la întreaga plantă, în cazul deficienței unui grup de substanțe minerale (exp. lipsa de potasiu, cupru, magneziu, zinc și sulf).

Metodele de cercetare a rolului și implicațiilor nutriției minerale la plante sunt numeroase, amintim: analiza chimică, diagnoza foliară, izotopii radioactivi, metoda plantelor indicatoare, metoda mixă (agronomică), dar și metoda sintetică a mediilor nutritive lichide care face posibilă stabilirea rolului fiziologic al fiecărui element din plantă, metoda demonstrând că soluțiile pure sunt toxice, pe când în amestec își pierd toxicitatea datorită unor reacții antagonice dintre ioni. Aceste soluții de amestec de săruri trebuie să fie echilibrate, cantitatea totală nu trebuie să depășească 2grame/litru de apă (cca. 6-8 macroelemente și 4-6 microelemente, un anume raport cantitativ al ionilor).

Rolul și funcțiile elementelor nutritive în metabolismul plantelor superioare au aceleași implicații asupra țesuturilor și celulelor acestor plante și în condițiile in vitro. De aceea în compoziția mediilor de cultură aseptice trebuie să se țină cont de nevoile plantei în nutriția clasică a ei, pentru a preîntâmpina modificările morfo-fiziologice la nivelul organelor plantulelor diferențiate in vitro. Amintim astfel cercetări și studii pentru stabilirea concentrațiilor exacte de macroelemente, microelemente și hormonale, la grupe și familii de specii de plante cultivate in vitro. La unele grupe de plante s-a reușit formularea unor medii de bază cu largă utilitate sau compoziții de medii cu specificitate (cu combinații fitohormonale adecvate și adausuri suplimentare de substanțe necesare). Unele studii au avut ca scop testarea anumitor compoziții de mediu, elaborând ghiduri care descriu modul și metoda de alcătuire și selectare a mediului chiar în cultura unei singure specii, familii sau grup de specii apropiate filogenetic, sau chiar a unui anumit tip de explant.

Metabolismul secundar al plantelor superioare

Plante produc o varietate mare de compuși organici, care nu au o anumită funcție în creșterea și dezvoltarea lor, denumiți metaboliți secundari și care nu au implicare în ciclul de viață a plantei. Aplicarea unor tehnici de identificare a metaboliților secundari, cum ar fi de exemplu: spectroscopia, rezonanța magnetică etc., au dus la creșterea interesului biochimiei pentru produșii secundari ai metabolismului plantei, utilizându-se ca remedii în diferite afecțiuni sau ca arome, parfumuri, otrăvuri etc. Speciile de plante au capacitatea de-a forma metaboliți în țesuturile specializate ale lor și în anumite faze de dezvoltare: chiar pigmentul clorofilian este considerat un metabolit secundar (se formează numai în celulele fotosintetice ale plantei. Metaboliții secundari au funcții ecologice, fiind implicați în supraviețuirea speciilor de plante și se clasifică în trei grupe:

terpenoizi (sunt cca. 25.000 de compuși): sunt mai multe tipuri distincte de terpenoizi, în funcție de câte unități C5 conține în formulă: sunt cu două unități C5 (monoterpene), cu trei unități de C5 (sesquiterpene), cu pateu unități C5 (diterpene) și cu șase C5 (triterpene, care sunt: steroli, saponine, cardenolide);

alcaloizi (cca. 12.000 de compuși), conțin alcaloizi purinici, glicozide (cianogene, alcaloidale, steroidice), rășini glicozidice, antibiotice glucidice, glucozinat, betalaine;

fenilpropanoizi (cca. 8000 de compuși), obținuți din biosinteza acidului shikinic, lignină, taninuri, flavonoide.

Terpenoizii au structură mare și se formează pe unitatea de izopropen cu cinci unități de carbon, cel mai important este izoprenul, compus volatil eliberat prin fotosinteză. Monoterpenele se găsesc în uleiurile volatile extrase din flori și uleiurile esențiale din plantele aromate și din conifere. Plantele din fam. Euphorbiaceae produc diterpene, de tipul forbolului toxic pentru piele și prin ingerare. Din Taxus brevifolia se extrage taxolul (anticancerigen). Un grup mare de alcaloizi considerați toxine vegetale se găsesc în tuberculii de cartof și fructele de tomate (solanina și chaconina în cartof și tomatina în tomate), cu efect teratogen care dau fructelor un gust amar. Alcaloizii purinici se găsesc în cca. 100 de plante: cafeina care se găsește în fructele și frunzele tinere de cafea care conțin 1-2% cafeină, implicată în apărarea chimică și în alelopatie. Prin inginerie genetică vegetală s-au obținut plante care sintetizează o cantitate redusă de cafeină, dar și plante transgenice de tutun cu rezistență la boli. Alcaloizii sunt sintetizați numai dacă în celula plantei există enzime (precursori) implicate în acest proces: la plantele din fam. Solanaceae alcaloizii din rădăcină sunt transmiși în părțile aeriene ale plantei. Alcaloizii pot avea un rol de apărare împotriva fungilor și bacteriilor și împotriva speciilor reactive la oxigen, participând în reacțiile metabolice.

Multe dintre plante produc metaboliți secundari foarte importanți, dar unele se află în populații reduse sau sunt greu de cultivat prin tehnologii clasice (sunt specii cu creștere lentă sau au origine în zone inaccesibile de pe Glob). Sunt alcaloizi cu rol în boli și maladii grave, dar care se află în cantitate extrem de redusă în plante: amintim alcaloizii vincristina și vinblastina care se găsesc în Catharanthus roseus în cantitate de 0,001-0,003 % substanță uscată/organ cu rol chemioterapeutic.

ANEXA II. prezintă: terpenoizi, alcaloizi și compușii fenolici, cu caracteristicile și importanță lor la plante.

Absorbția nutrienților și factorii care o influențează

Necesarul de elemente minerale este asigurat de modul cum celula absoarbe și transportă acești nutrienți în plantă. Absorbția și transportul mineralelor în plantă depinde de două categorii de factori: externi: temperatura, lumina, umiditatea aerului, solului: compoziția și reacția solului; interni: natura speciei, starea fiziologică a plantei (vârsta) și condițiile fitosanitare. Implicația acestor două grupe de factori se face simțită și în condițiile de creștere și dezvoltare in vitro a țesuturilor vegetale. Aceștia sunt prezenți și activi în funcție de necesitățile speciei de plantă și fac în așa fel ca procesele metabolice in vitro (în condiții controlate) să fie activate și să se desfășoare normal.

Este cunoscut faptul că plantele pot adopta mecanisme sau strategii care măresc capacitatea rădăcinilor de a absorbii elementele minerale din sol (cum ar fi schimbarea arhitecturii rădăcinii și a disponibilității ionilor din sol) sau constituind asociații simbiotice (micorize). Plantele superioare absorb elementele nutritive la nivelul rădăcinilor, iar deficitul sau excesul acestora rădăcina, le elimină la nivelul rizosferei: sistemul radicular poate inhiba sau stimula procesul absorbției. Ionii sunt absorbiți de rădăcină prin flux de soluție (conform gradientului apei) și prin difuziunea lor spre rădăcină. Cei mai importanți factori de care depinde absorbția elementelor minerale sunt disponibilitatea de ioni, nevoile plantei și structura solului care poate mări sau micșora capacitatea plantei de a exploata nutrienții din sol. Astfel, pe solurile cu structură compactă, activitatea micorizelor (asociațiile simbiotice) este diminuată, ceea ce declanșează o stare de stres, care duce la reducerea capacității de absorbție a elementelor minerale de către rădăcină. La nivelul radicinii, absorbția este influențată de:

• de disponibilitatea nutrienților în sol,

• de pH-ul solului,

• excesul unor substanțe (chelați organici, carboxilați etc.),

• de interacțiunile dintre ioni,

• de procesele fiziologice care au loc la nivelul rădăcinilor.

Plantele au mecanisme de control și reglare a absorbției. Un astfel de mecanism este acela care ține cont de nevoia de nutrienți a plantei, iar pentru o absorbție este importantă dezvoltarea sistemului radicular: valoarea lui dată de numărul, vigoarea și structura lor spațială.

Fig. 5. Vârf de rădăcină cu exsudat radicular (mucilagiu), care asigură absorbția mineralelor

La un deficit sau exces de elemente nutritive, rădăcina poate elimina în spațiu rizogen substanțe numite exsudate radiculare, care pot inhiba sau stimula absorbția nutrienților din sol. Acest exsudat eliminat în sol conține diferite substanțe: mucilagii polizaharidice, enzime (molecule cu greutate mare), acizi organici, aminoacizi, glucide, fenoli (substanțe cu greutatea moleculară mică), care se amestecă cu mineralele și bacteriile dând mucilagiul (fig. 5).

La nivel celular, absorbția în rădăcină are loc prin peretele celulei, prin citoplasmă și plasmodesme, astfel concentrația ionilor de K, Na, Cl, poate fi de 50 până la 1000 de ori mai mare în celula plantei decât în soluția solului. Mecanismul de transport a ionilor prin membrana celulei se face cu ajutorul unor proteine membranare specifice acestui transport.

Fig. 6 Rădăcini: A. cu micorize; B. fără micorize

Asociațiile simbiotice caracteristice lumii vegetale presupune o asociație între o plantă și un microorganism (cianobacterii, fungi) care aduc beneficii ambilor parteneri din asociație. Astfel rădăcinile plantei formează cu microorganismele asociații numite micorize, din care beneficiază în principal planta gazdă primind pe această cale un supliment de nutrienți minerali, dar și microorganismul (fungii) care sunt alimentați cu carbohidrați. Micorizele sunt organe „himere” cu 25-40% hife de ciuperci care intră în simbioză cu rădăcina plantei. Sunt plante care formează micorize dar și familii de plante care nu formează (expl. plantele acvatice, fam. Brassicaceae și Chenopodiaceae). În fig. 6 prezentăm formarea micorizelor pe rădăcini.

Bacteriile simbionte din rădăcină, de exemplu cele din familia Fabaceae (fasolea) fixează azotul atmosferic formând nodozități (în anaerobioză azotul din atmosferă este transformat în amoniu): acestea se numesc fertilizatori vii deoarece măresc în mod ecologic cantitatea de N din sol. Bacteriile sunt în întregime dependente de planta gazdă, care asigură azot anorganic necesar în sinteza aminoacizilor și amidelor. Alte simbioze generatoare de nodozități sunt între plante leguminoase și actinomicete, dar și plante superioare și ceanobacterii.

Conținutul și circuitul mineralelor în sol este influențat de variația sezonieră a factorilor de mediu, de intrările și ieșirile de substanță din ecosistem, realizându-se prin două circuite:

deschise, cu câștiguri și pierderi de materie organică mare (intrări și ieșiri): de explul circuitul azotului în atmosferă (sau a azotului), care antrenează cea mai mare parte a materiei și unde intrările se datorează ploii și fixării azotului atmosferic, iar pierderile spălării și denitrificării;

închise, cum este cel al fosfaților (circuitul fosforului), la care câștigurile și pierderilor sunt reduse.

Într-un an, ciclul azotului transformă cca. 109 tone azot, asigurând productivitatea biologică dată de intrările de azot anorganic în biosferă (prin fixare azotului atmosferic).

1.3. Fotosinteza plantelor verzi. Câteva considerații

Prin fotosinteză, plantele verzi preiau din atmosferă CO2 în prezența luminii și îl transformă în substanțe organice cu degajare de O2 (fotos = lumină, sintesis = sinteză). Importante pentru acest proces sunt radiațiile solare, mai ales spectrul vizibil cu λ = 400-700nm. Din radiația care ajunge la suprafața frunzei, abia 1% este folosit în fotosinteză. Rolul principal al fotosintezei este de-a menținere cantitatea de CO2 din atmosferă la 0,03% (gaz din emisiile industriale, arderile combustibililor și respirația viețuitoarelor): acumulat ar fi dăunător, dar menținerea constantă a O2 este necesară în respirație. Fotosinteza asigură o compoziție constantă a gazelor din atmosferă. Plantele consumă în permanență CO2 (din fenomenele vulcanice, arderi, respirație, fermentație) și elimină O2. Consumul mare de combustibili fosili a făcut ca fotosinteza să fie folosită în scop energetic, așa numita energie verde, prin folosirea biomasei din plante, la prepararea unor combustibili neconvenționali.

Fig. 7. Schema fotosintezei

La plante fotosinteza are loc la nivelul pigmenților din cloroplaste și se desfășoară în 4 etape dependente de lumină: 1. absorbția luminii, 2. reacția fotochimică, 3. transportul electronilor, 4. reacția fixării și reducerii CO2 (fază independentă de lumină): vezi fig. 7.

Dependente de lumină sunt: absorbția luminii de către cloroplaste; reacția fotochimică a luminii cu excitarea pigmenților și etapa de fixare și de reducere a CO2 prin transportul electronilor cu formarea ATP și a agentului reductor NADPH.

Independentă de lumină este faza biochimică a fixării și reducerii CO2, cu formare de substanțe organice (Fig. 7).

Cloroplastele sunt organite specializate în fotosinteză, delimitate la exterior de citoplasmă cu membrană dublă și în interior de membrană. Frunza (cu toate părțile ei), tulpina și părți din floare sunt organe principale specializate în fotosinteză. Cloroplastele în faza de creștere celulară sintetizează mari cantități de lipide, proteine (cca. 50% din totalul proteinelor din frunze), acizi nucleici (ADN, ARN), pigmenți clorofilieni și carotenoizi. Lumina influențează sinteza clorofilei prin fotoconversia fitocromului, mărind biosinteza. Fitocromul este procesul de formare a cloroplastelor și asigură transcripția genelor. Enzimele care transportă electroni sunt proteine membranare, legate de clorofila și pigmenții receptori (recepționează radiația solară). La plantele verzi distribuția pigmenților este variată, cantitatea și natura lor este dependentă de specie și de factorii ecologici, iar biosinteza este determinată de lumină, temperatură și substanțele minerale. Se cunosc trei grupe mari de pigmenți:

Clorofilieni, sintetizați în lumină albă, responsabili în procesul fotosintezei prin asimilarea pigmentului clorofilă (de aici fotosinteza se mai numește și procesul asimilației clorofiliene). Sunt mai multe tipuri de clorofile, dar clorofila a este pigment universal prezent în toate organismele plantelor verzi fotosintetizante (apoi mai sunt: clorofila b, carotenoizii și ficobilinele sunt accesorii sau pigmenți auxiliari).

Clorofila a este asociată cu proteina, are formula C55H72O5N4Mg (Fe, Co și Zn catalizează legarea Mg): în structura ei intră N și Mg. Pigmenții clorofilieni sunt insolubili în apă și solubili în alcool și acetonă: au caracteristica de a absorbi radiații cu o anumită lungime de undă, au fluorescență (captează radiația luminoasă), molecula de pigmenți are o orientare particulară (dipolaritate), iar sub influența luminii are proprietatea de a se fotooxida.

Carotenoizi, pigmenți de culoare galbenă, portocalie sau roșie cu formula C40H56, care absorb radiațiile luminoase în zona albastră/verde (λ = 420-480nm). Sunt peste 600 de tipuri de carotenoizi din care cca. 120 implicați în fotosinteză. Deși considerați pigmenți auxiliari (accesori), au rol de fotoprotecție, mecanism care permite disiparea energiei excedentare înainte de a fi afectată celula.

Ficobilini (bilinici), prezenți în celula algelor, cu structură asemănătoare clorofilei (formați din patru nuclee pirolice, fără magneziu și fitol). Modificările în compoziția luminii au determinat o anumită distribuție a organismelor acvatice în adâncime (algele roșii sunt situate la o adâncime mai mare de 100m). Sunt două tipuri de pigmenți bilinici: a) ficocianina, pigment albastru din algele albastre, albastre-verzi; b). ficoeritrina, pigment de culoare roșie din algele roșii.

Factorii care influențează procesul fotosintezei de la nivelul plantelor verzi sunt: gradul de deschidere a stomatelor de pe suprafața frunzelor, care datorită luminii intervine în acest mecanism (plantele prezintă adaptări care ajută la captarea luminii) și mișcările cloroplastelor frunzei care asigură un control al cantității de lumină absorbită (adaptări anatomice care măresc reflexia luminii în frunză și reduc absorbția ei). În funcție de ecologia lor plantele sunt influențate diferit de lumină (expl. plantele heliofile au nevoi mărite de intensitatea luminii); plantele superioare se caracterizează prin fenomenul de aclimatizare, adaptare la spectru larg al intensității luminoase. Declanșarea fotosintezei și drumul ei depinde de pigmenții asimilatori de care dispune planta. În timpul fotosintezei temperatura optimă este un factor aflat în relație strânsă cu lumina și concentrația de CO2: când factorii de mediu externi sunt favorabili are loc creșterea concentrației de CO2 (la 2-5%), intensificând fotosinteza. Intensitatea fotosintezei este determinată și influențată de concentrația de O2 (atunci când depășește valoarea normală de 20,95%), dar și de influența directă sau indirectă a nutriției minerale (de exemplu: fosfații participă la formarea ATP-ului, azotul în sinteza proteinelor, iar sulful intervine prin formarea aminoacizilor etc.).

2. Creșterea și dezvoltarea plantelor. Efectele fiziologice

Potrivit metabolismului lor plantele acumulează o mulțime de substanțe și compuși chimici din mediul înconjurător, sintetizând produșii necesari procesului de reproducere pentru asigurarea continuității vieții organismului vegetal. Planta ca organism viu are însușirea și capacitatea de a sintetiza și acumula de-a lungul vieții noi substanțe, etapă în care celula vegetală își mărește volumul declanșând astfel creșterea. Creșterea este un proces de acumulare a masei vegetale a plantei realizat prin mărirea permanentă și ireversibilă a numărului de celule și în final a întregului organism vegetal. Când celula se apropie de mărimea normală în urma dezvoltării ei, devine o celulă adultă, caracterizată prin anumite procese metabolice și funcții, care sunt declanșate de către țesuturile și organele plantei.

2.1. Creșterea și efectele fiziologice asupra plantelor

Procesul creșterii se referă în principal la formarea organelor plantei: nu include formarea organelor reproductive, care este o fază distinctă din procesul de creștere și dezvoltare a plantei. Creșterea are loc în trei etape: creșterea embrionului, extensia celulei și diferențierea celulară.

Creșterea embrionului are loc la nivelul meristemului (din zona apicală a rădăcinii, tulpinii, frunzelor, fructelor etc.), cu formarea unei protoplasme dense, fază stimulată de prezența nucleului, ribozomilor, vitaminelor, enzimelor, hormonilor etc. Protoplasma densă are rol în metabolismul glucidelor, proteinelor, lipidelor.

Extensia celulei se realizează prin mărirea volumului ei treptat și definitiv până atinge la forma și dimensiunea genetică a celulei speciei. Rol în această etapă îl are membrana celulozică, în biochimismul căreia intervin acizii nucleici, hormonii etc. După această etapă celulele intră în regresie fiziologică încheindu-și ciclul vieții.

Diferențierea celulară se declanșează odată cu îngroșarea peretelui celular, ceea ce duce la formarea țesuturilor definitive (epidermă, scoarță, vase conducătoare etc.).

Diferențierea celulelor este reglată de factori interni cum sunt vitaminele și hormonii. Este știut că hormonii endogeni auxinici stimulează diferențierea sistemului radicular, iar citochininele endogene influențează și declanșează caulogeneza (formarea de organe).

Tabel 2 Căi de realizare a creșterii celulei vegetale

Creșterea celulei plantelor superioare este un proces complex prin care este evaluată reacția plantei la anumiți factori de stres, localizând în timp și spațiu căile prin care se realizează acest proces. Deci etapele sau căile creșterii sunt diviziunea celulară și expansiunea celulară (extensia), căi care au loc la nivelul diferitelor organe ale plantei, au anumite caracteristici, cauzalitate și depind de o mulțime de factori (tabel 2).

Creșterea celulei vegetale are loc la nivelul țesutului meristematic sau a celulelor meristematice care sunt numite centre cu funcțiuni specializate și care datorită unor interconexiuni caracteristice dau naștere la noi și noi celule. Meristemele sunt țesuturi care asigură creșterea plantelor superioare, creșterea celulară, proces morfo-funcțional care se desfășoară treptat și asigură etapele în dezvoltarea plantei. În momentul în care funcțiile plantei intră în declin și meristemul își încetinește activitatea, până la oprirea ei. Funcționarea meristemului este sezonieră, celulele meristemului își încetinesc activitatea în anotimpul rece și cu zile scurte și o reiau odată cu creșterea naturală a zilei lumină și a temperaturilor. Celula meristematică are dimensiune mică, formă poligonală, învelită de o membrană celulozică, cu conținut bogat în citoplasmă, cu nucleu mare central și cu numeroase mitocondrii. Există trei tipuri de meristeme cu derivatele lor, două dintre acestea sunt esențiale (primar și secundar). În tabelul 3 este prezentată o clasificarea a meristemelor după poziția pe plantă.

Tabel 3. Clasificarea meristemelor după poziția țesutului pe plantă

Meristemul primar are origine embrionară, iar cel secundar conține celule definite morfo-funcțional, trecând printr-un proces de diferențiere. Dar există și un al treilea tip de meristem, care se formează la țesuturile plantelor cultivate in vitro în condiții controlate pe medii aseptice, care la rândul lui pot fi de mai multe feluri și a cărui evoluție o urmărim noi în procesul de micromultiplicare in vitro.

Meristemul primar: este un țesut care conține celule cu capacitate de diviziune și care pot avea poziție apicală (terminală) situate la vârful rădăcinii sau al tulpinii, cu o structură complexa și variată, sau poziție axilară (meristeme formate din celule situate la baza axilei unei frunze sau a unei bractee). Structura meristemului la aceste nivele este prezentată în fig. 10 A și B, din care constatăm că meristemul radicular este diferit ca structură și funcționalitate de cel caulinar. Atât cele apicale cât și cele axilare au în vârf niște celule tinere numite celule inițiale care înglobează meristemul primordial (promeristemul). Meristemele primare sunt:

laterale, situat la nivelul cambiului; cel intercalar format la nivelul țesuturilor cu o structură formată definitiv (în internoduri, tulpini, organe florale etc.);

adventive formate prin inducere (îndeosebi in vitro), a cărei diferențiere trebuie dirijată spre organogeneză cu formare a unui nou organism;

și foliare situate în frunzele tinere și în primordiile foliare. Activitatea acestor meristeme este corelată cu procesul de creștere a frunzelor și a cărui activitate încetează odată cu ajungerea frunzei la mărimea speciei.

Meristemul secundar: este situat în interiorul țesutului unui organ unde capătă proprietatea de a se înmulți, de a se transforma treptat și apoi și capacitatea de diferențiere. Acest tip de meristem este întâlnit la speciile lemnoase, în cambiu și felogen. Cambiul se formează în interiorul unor organe (rădăcina și tulpina), iar prin activitatea lor (în interiorul sau exteriorul acestor organe) determină o îngroșare secundară a organelor. Sunt situații când țesutul cambial poate apărea și la specii ierboase, care în ciclul vieții pot suferi modificări secundare în special la rădăcinoase (ex. la morcov). Felogenul este situat în afara organelor, în cortex (în scoarță): activitatea acestor celule poate avea loc la exteriorul organelor, formând suberul, sau în interior formând scoarța secundară.

Meristemul special. Cunoașterea structurii și a morfologiei meristemului apical și axial are importanță pentru cultura in vitro a meristemului în scopul obținerii de plante libere de boli și dăunători (devirozate) care se realizează prin cultura in vitro a unui țesut meristematic foarte mic (microscopic) de cca. 0,2mm, lipsit de patogeni, dar cu celule regenerative. Meristemele speciale apar pe suprafața calusului, formând meristemoizii, cu capacitatea de a regenera mugurași sau rădăcinițe, deci de a evolua spre rădăcină sau tulpină, iar când această celulă meristematică crește bipolar va da naștere la embrioni somatici. Deci după diferențierea calusului in vitro se formează niște conuri de creștere mici (meristemoizi) care pot dat naștere la meristeme de tulpină sau radiculare, în funcție de unele condiții de cultură (compoziția mediului, factorii de mediu din camera de creștere, natura calusului etc.).

2.2. Dezvoltarea plantelor. Ciclul de viață a plantelor

Procesul dezvoltării plantelor, este asigurat de transformări care au loc trecând prin faza: vegetativă, generativă, maturitate, senescență și moartea plantei. Ciclul de dezvoltare a unei plante denumit și ciclul ontogenetic, începe de la sămânță și se încheie cu înflorirea și fructificarea și are durată diferită manifestată în limite largi: la bacterii câteva minute, la algele verzi de la câteva ore la săptămâni, etc.. După germinația seminței se declanșează procesul de creștere, proces care la nivelul țesuturilor plantei nu este nici uniform și nici întâmplător. Celulele meristemului apical au o creștere specifică din regiunea sub apicală determinând astfel mărimea și forma plantei primare. Acest ciclu de dezvoltare a plantelor este influențat de factorii interni și externi și cuprinde următoarele faze în dezvoltarea plantei:

faza de tinerețe (sau juvenilă), care este incapabilă de înflorire și reproducere și variază în funcție de caracteristicile genetice ale speciei.

faza de maturitate este faza în care planta înflorește, se reproduce (faza reproductivă), care apoi este urmată de senescență (faza de îmbătrânire).

faza de creștere, care se situează la vârful organului de creștere (apical), la nivelul frunzei (bazal) sau deasupra nodurilor (intercalar). Această fază are capacitate cea mare de sinteză a substanțelor nutritive implicate în creșterea zonei respective.

Ciclul de creștere și dezvoltare al unui organism vegetal este prezentat sugestiv în fig. 8 și cuprinde totalitatea proceselor prin care trece planta, începând cu faza formării zigotului și până la formarea gameților, deci din clipa formării unei semințe, până în momentul diferențierii unei noi semințe.

Fig. 8. Ciclul de dezvoltare a plantelor

Cele trei faze în dezvoltarea plantei: juvenilă, vegetativă și generativă sunt prezentate schematic în tabelul 4.

Tabel 4. Fazele de creștere și dezvoltare a unui organism vegetal

În procesul de dezvoltare și diferențiere a celulei vegetale se pune problema felului cum zestrea genetică este influențată sau modificată. O caracteristică morfologică și funcțională a zigotului este polaritatea la nivelul celulei vegetale, care se transmite embrionului prin diviziune transversală, dând naștere la 2 structuri: o celulă cu citoplasmă din care se va forma embrionul și la una bazală vacuolară din care se va dezvolta suspensorul. Aceste două structuri arată modul în care cele 2 celule surori alăturate (în urma diferențierii), se formează două grupuri de celule distincte care se susțin în procesul creșterii și dezvoltării (fig. 9).

Fig. 9 Polaritatea embrionului. Etapele embriogenezei

A= stadiul a două celule (ac= apicală; bc=celulă); B = stadiul de 8 celule (superior = embrionul, baza = suspensorul); Stadii: C = globular incipient; D = globular avansat; E = de tranziție,; F = cordiform

Dezvoltarea vegetativă începe cu o singură celulă numită zigot, care parcurge în evoluție cele trei etape: diviziunea, expansiunea și diferențierea celulară. Zigotul declanșează procesul de embriogeneză care dă naștere la embrion ce deține structuri organizate caracteristice speciei. La nivelul embrionului numărului de celule este mult mai mare decât la nivelul suspensorului (fig. 9, poziția suspensorului). După trecerea embrionului de la stadiul globular la cel cordiform începe diferențierea cotiledoanelor, la nivelul cărora diviziunea celulei este mult mai intensă. Polaritatea este o proprietate a celulei vegetale organizate, bine structurate care lipsește în cazul structurilor nediferențiate, neorganizate (expl. culturile de calus), datorită mediului de cultură diferit față de cel natural. Embrionul este un punct de plecare în creșterea celulei cu două polarități: a). morfologică dată de axa rădăcină-tulpină; b). fiziologică indusă de hormonul auxină (sensul de transport al auxinei).

Embrionul tânăr conține structuri ale organele principale din plantă rădăcină, tulpină și cotiledoane. Embrionul matur conține celelalte structuri ale frunzelor, rădăcinilor laterale, mugurilor, primordiilor florale și structuri mature (floem, xilem, etc.) specializate și reproductive. Creșterea plantelor superioare (în lungime sau grosime) are loc datorită procesului de multiplicare celulară în zona meristemului, urmată de mărirea în volum a fiecărei celule. Meristemele sunt celule cu caracteristici embrionare sau embriogene, caracter pe care îl poate păstra o perioadă nelimitată (chiar mii de ani la unele specii lemnoase). Morfogeneza și formare celulelor meristematile la nivelul apexului caulinar (fig. 10 A) are loc la nivelul organele cu creștere ortotropă, tulpină și organele laterale atașate ei, frunzele și mugurii. Formarea celulelor meristematice la nivelul rădăcinii și funcționarea acestora prezentate în Fig. 10 B, sunt determinate de capacitatea rădăcinii de a penetra solul, de a absorbii apa și substanțele nutritive.

A. B.

Fig. 10. Forma celulelor meristematice: A. în apexul caulinar; B. la nivelul rădăcinii

Fig. 11. Meristem la nivelul tulpinii (meristem caulinar)

La plantele superioare, tulpina apare în urma dezvoltării mugurelui axilar (fig.11), format în zona axilei primordiei foliare, din celule specifice de origine exogenă: rădăcina se dezvoltă la capătul discului, zona meristemului apical radicular, format din celule specifice de origine endogenă. Fig. 12 prezentăm fitomerelor la rădacină și tulpină. Modul de creștere și formare a primordiilor foliare este dat de filotaxie: reflectă numărul și ordinea frunzelor pe tulpină.

Fig. 12. Fitomerele la rădăcină și tulpină

Fig. 13. Forma nespiralată a dispunerii organelor pe frunză (pe verticală): A = fragment de tulpină; B = diagrama foliară (F=frunză, n = nod, in = internod; t = tulpină cu 1-2 frunze)

Unii autori consideră că sunt două moduri de dispunere a frunzelor: nespiralat și spiralat, deci sub forma unei spirale longitudinale, spirale denumite și parastihuri (fig. 13). În concluzie putem spune că dezvoltarea morfologică și anatomică a tulpinii are loc în timp și spațiu cu dezvoltarea celorlalte organe ale plantei și este rezultatul acțiunii factorilor de mediu și a condiționării genetice, având la bază unele mecanisme (exempl. feedback).

2.3. Fitohormonii cu rol în fiziologia creșterii și dezvoltării plantei

În procesul de creștere plantele au nevoie de unele substanțe ce se formează în plantă, fitohormoni, substanțe stimulatoare și regulatoare a creșterii, care sunt endogene (sintetizate natural de plante), dar și exogene (sintetizate chimic). Hormonii după modul de acționare se grupează în trei mari categorii:

A. stimulatoare (Auxine, Gibereline, Citochinine și Etilena) cu origine endogene sau exogene și rol în stimularea creșterii și dezvoltării plantelor. Auxinele sunt compuși organici și rol asupra metabolismului plantei: la unele legume (tomate, pepene, păr etc.), administrate în timpul deschiderii florilor determină partenocarpia. Reducerea treptată a lor și acumularea inhibitorilor determină la pomii fructiferi căderea prematură a fructelor. Giberelinele sunt sintetizate de toate organele plantei, dar aplicate unor bulboase (prin injectare), giberelinele pot substitui temperaturile joase și pot scoate unele specii din repaus obligatoriu, iar la bulbii de narcise intensifică creșterea lăstarilor floriferi.

B. retardante (grupa I până la grupa VIII), sintetizați chimic în ultimele decenii, cu rol principal de a întârzia un timp diviziunea și elongația celulei, și uneori chiar creșterea și dezvoltarea plantei în ansamblul. La unele specii pot stimula maturarea fructului și înflorirea.

C. cu rol inhibitor: naturali inhibitor beta, sau acidul abscisic, cumarina, scopoletina, florizinul și sintetici: hidrazida maleică, actinomicid D, cloramfenicol.

ANEXA III. – Fitohormonii și rolul în creșterea la plante, prezintă cele 4 grupe stimulatoare (auxine, gibereline, citochinine și etilena), rolul lor asupra plantei și caracteristici. Fitohormonii sunt substanțe cu masă moleculară mică, aplicați în doză moderată, au efect reglator al creșterii. Nu sunt sintetizați într-o zonă anumită din plantă (bine delimitată), sinteza lor fiind influențată de factorii de mediu. Intervin în metabolismul plantei având acțiune nespecifică. Concentrația și natura lor influențează procesele fiziologice din plantă și stimulează sensibilitatea celulelor receptoare. Amintim și alte efectele ale lor:

1. AUXINELE. Cantitatea cea mai importantă de auxine endogene este sintetizată la nivelul meristemului apical caulinar, frunzele tinere, fructe și semințe în curs de dezvoltare: acționează stimulator la nivelul celulei, mărindu-i suprafața, intensificând diviziunea ei, creșterea peretelui celular, mărind permeabilitatea membranei, formarea calusului, diferențierea și elongația tulpinii (ex. AIA). Auxinele sintetice sunt utilizate pentru stimularea formării rădăcinilor la butași sau ca ierbicid selectiv în distrugerea buruienilor. Inhibă sinteza acizilor nucleici, creșterea rădăcinilor, germinația și senescența. Nu intervin în dezvoltare, coacerea fructelor și în dormanță. Aplicate țesuturilor cultivate in vitro stimulează formarea rădăcinilor (în funcție de natura și concentrația lor asigură un sistem radicular corespunzător).

2. GIBERELINELE: stimulează sinteza acizilor nucleici, permeabilitatea membranei, mărirea și diviziunea celulei, formarea calusului, cambiului, în procesul dediferențierii, la dominanța apicală și alungirea tulpinii; în dezvoltarea organelor (reproducătoare, partenocarpiei) și înflorire, în dormanța și producerea α amilazei. Inhibă dominația apicală, dezvoltarea și coacerea fructelor. Nu are efect asupra diviziunea și creșterea peretelui celulei, formarea rădăcinii, abscizie, geotropism, fototropism etc..

3. CITOCHININELE: substanțe rezultate din descompunerea ADN-ului, se găsesc în țesuturile meristematice (apex, frunze tinere, cambiu etc.). Stimulează diviziunea celulară, permeabilitatea și mărirea membranei celulare, sinteza acizilor nucleici, formarea calusului, cambiului, diferențierea, alungirea tulpinii, creșterea frunzelor, a rădăcinilor, dezvoltarea organelor florale etc. In vitro, alături de auxină regenerează plante întregi dintr-un țesutul sau celulă. Inhibă dominația apicală, dezvoltarea fructelor, germinația și grăbește senescența. Nu are efect asupra formării rădăcinii, a înflorire, a dezvoltării organelor de reproducere, a coacerii fructelor, a dormanței, absciziei, fototropism și geotropism.

4. ETILENA (E), hormon sub formă de gaz care se găsește în spațiile intercelulare ce conțin aer (insolubilă în apă). Stimulează permeabilitatea celulei, dezvoltarea fructelor și coacerea, înflorirea și formarea organelor și a florilor, α amilazei, germinația, grăbește senescența, influențează fototropismul și distribuția nutrienților în plantă. Inhibă: diviziunea și creșterea în volum a celulei, diferențierea, elongația tulpinii, dominația apicală, formarea rădăcinilor, frunzelor. Nu are efect asupra peretelui celulei, dominanței apicale, dezvoltării organelor de reproducere, creșterii fructelor, a distribuției nutrienților, etc.

5. ACIDUL ABSCISIC (ABA) se formează în frunze, rădăcini și în fructe în timpul coacerii. Stimulează dezvoltarea și coacerea fructelor, germinația semințelor, senescența, distribuția nutrienților. Inhibă activitatea celulei, diferențierea, formarea cambiului, calusului, elongația, dominanța apicală, organelor florale, procesul dormanței etc..

Hormonii sunt esențiali în fazele de dezvoltare a plantei: în germinația semințelor, determină imbibiția seminței prin absorbția apei și expansiunea embrionului; în dezvoltarea fructului, influențează inițierea și diviziunea celulei, maturarea fructului; în senescența plantei, situată între maturitatea reproductivă și moartea ei. Hormonii transmit mesajele de la factorii de mediu externi, chiar la o concentrație redusă datorită capacității lor de mobilizare. Sunt cazuri când unele mesaje nu se datorează mecanismului hormonal, cum este de exemplu mesajul care ajunge la rădăcină în urma modificării intensității luminii .

2.4. Factorii de mediu implicați în creșterea și dezvoltarea plantelor

Pe lângă substanțele hormonale, regulatoare ale procesului de creștere al plantelor, un rol esențial în acest proces îl au factorii mediului: lumina, temperatura, umiditatea, oxigenul, substanțele nutritive, care produc modificări în metabolismul lor, fiind implicați în procesele biochimice și biofizice din citoplasmă.

Factorii sunt prezentați în tabel 5. De exemplu: anumite condiții de temperatură care determină inducția florală; alternanța de temperatură influențează dezvoltarea florilor; temperaturile scăzute și cele ridicate au rol în procesele de creștere și dezvoltare; cele scăzute grăbesc înfloritul, se implică în creșterea și dezvoltarea plantelor (reglate de fitohormoni); cele ridicate în adaptarea plantelor prin sintetizarea proteinelor care previn „șocul termic”.

Cantitatea, calitatea și durata luminii, sunt reglate prin asigurarea la plante a fotorecepției, fototropismului și fotoperiodismulului. Receptorii de lumină nu pot fi studiați în condițiile culturii in vitro a plantelor, deoarece reacția de răspuns a acestora se pierde în aceste condiții, iar efectele pot fi independente. Fotomorfogeneza se referă la germinarea semințelor fotosensibile, fitocromul fiind implicat în germinație, iar durata fotoperioadei în repaus, intervenind, ca și în evoluția plantelor crescute la întuneric (fenomen de-etiolare) inhibarea creșterii tulpinilor și expansiunea frunzelor.

Tabel 5. Factorii de mediu cu rol în creșterea și dezvoltarea plantelor

În fotomodularea creșterii unor plante la lumină, s-a cercetat aplicarea luminii roșii (λ= 730nm) în prezența fitohormonului giberelină (GA3), cu efect asupra creșterii și elongației tulpinii la nivelul internodurilor.

3. Înmulțirea plantelor superioare

Toate organismele vegetale au însușirea de a se reproduce, de a se înmulți și a da naștere la indivizi noi, însușire caracteristică și înmulțirii vegetative a plantelor, înmulțirea însemnând mărirea numărului de indivizi de obicei prin reproducere. Viața plantei se asigură în principal prin funcțiile celor trei organe esențiale ale ei: rădăcina, tulpina, frunza, organe cu proprietăți complexe care asigură în plantă o mulțime de procese (nutriția, respirația, creșterea, dezvoltarea etc.). Înmulțirea plantelor are ca scop formarea noului individ, se desfășoară într-un anumit timp (mai lung sau mai scurt) și este în strânsă dependență de factorii de mediu. Ereditatea organismului vegetal face posibilă intervenția în modificarea informației genetice, iar variabilitatea face posibilă adaptarea organismelor la condițiile noi de viață, modificate. Informația genetică este localizată în ADN, iar prin reproducere se asigură transmiterea caracterelor (din generație în generație) de la genitori (părinți) la urmași.

Proprietate organismelor vii și deci și a plantelor de a se reproduce și de a da naștere la generații succesive, asigurând perpetuarea și existența speciilor. Plantele noi înmulțite continuă viața în urma unei creșteri și dezvoltări asemănătoare plantei – mamă, dar nu identice cu aceasta, având însușiri comune cum ar fi: detașarea, (desprinderea), reîntinerirea și capacitatea de a trăi, de a se dezvolta și de a supraviețui independentă și singură. Dar nu orice porțiune sau organ vegetal desprins din plantă poate forma o nouă plantă, porțiunea desprinsă trebuie să dețină capacitatea de a evolua și de a urma ciclul de viață prin funcții și caracteristici proprii. După trăsăturile generale ale plantelor există trei grupe mari de înmulțire: vegetativă, reproducere sexuată (prin semințe) și înmulțire asexuată (prin spori).

A. Reproducerea sexuată (din semințe): în acest caz are loc un fenomen de reproducere adevărat: apar inițial organele specializate în reproducere (gameții masculi și femeli), din care după actul sexual rezultă zigotul (oul, celula germinativă).

B. Înmulțirea vegetativă : un proces simplu și de scurtă durată, deoarece nu se repetă toate stadiile din dezvoltare ale plantei, aceasta își continuă viața începând din stadiul în care s-a desprins organul (țesutul) de la planta-mamă (de la care s-a pornit înmulțirea). Înmulțirea vegetativă este considerată un simplu proces de regenerare sau „restituție” (fenomen de reproducere propriu-zisă), pornind de la o părticică, celulă, țesut, organ, care detașate din planta întreagă se poate înmulți și poate asigura nutriția, creșterea și dezvoltarea plantei noi. Ne vom ocupa separat de înmulțirea vegetativă.

C. Înmulțirea asexuată se realizează prin celule special adaptate „celule germinative asexuate”, numite și spori, formte la maturitatea plantei. La acest mod de înmulțire nu participă niciodată două celule de sex diferit: este întâlnit la plantele inferioare: alge, ciuperci, briofite, pteridofite, care formează spori speciali, care prin germinație formează plante noi.

Reproducerea sexuată (înmulțirea prin semințe), este considerată metoda cea mai evoluată în reproducerea plantelor și mai complicată, deoarece prezintă o mare variabilitate. Gameții sexuali sunt cei care realizează reproducerea sexuată: variați ca formă, conținut și mărime, ei se unesc prin copulație (fecundare), urmată de diviziunea reducțională din care rezultă celula (oul sau zigotul). Acest tip de înmulțire este obligatorie la majoritatea plantelor, deoarece asigură perpetuarea speciei. Există unele plante superioare la care sexualitatea a degenerat sau chiar a dispărut, așa cum este întâlnit și fenomenul de parasexualitate. Metoda se aplică în special la plantelor anuale și bianuale (mai rar la perene). Dezavantajul este că nu transmite întotdeauna caracterele unei varietăți deoarece zestrea genetică deținută de către un individ se referă doar la ciclul ontogenetic al lui. Însă avantajul este acela că dintr-o singură plantă se obțin un număr foarte mare de semințe: care trebuie să îndeplinească anumite condiții pentru a germina. Inițial se face un control asupra purității seminței, a facultății germinative, energiei germinative și apoi se stabilește valoarea culturală a speciei (cantitatea de sămânță necesară/suprafață). Condiții de cultură de asemenea trebuie să fie la un anumit standard.

3.1. Înmulțirea vegetativă la plantele superioare

Înmulțirea vegetativă este forma de reproducere cea mai întâlnită la majoritatea plantele superioare. Când se produce singură se numește înmulțire vegetativă naturală, iar când intervine omul se numește înmulțire vegetativă artificială (tabelul 6 redă cele mai întâlnite moduri de înmulțire vegetativă naturală folosite în practică: sciziparitatea, fragmentarea, prin organe vegetative, pentru obținerea de stoloni, drajoni, lăstari, rizomi, tuberculi, tuberule, bulbi, muguri în repaus: iar la plantele inferioare, scleroți, rizomorfe, talidii și macrociști).

Tabel 6 Moduri (tehnici) de realizare a înmulțirii vegetative naturale

Unele din organele vegetale (exp. stolonii) cresc într-un an de la câțiva cm la 1 m și produc în 2 ani cca. 200 de plante (exp. Fragaria-Fig. 14). Organele vegetale (tuberculi, bulbili) se întâlnesc la plantele din stepă, regiuni muntoase și polare unde ciclul de vegetație scurt nu permite maturarea seminței, aceste plante posedă proprietatea de viviparitate (fig. 15).

Fig. 14. Prezența tuberculelor la specia Fig. 15. Viviparitatea la Dentaria bulbifera (A)

Ficaria verna (A); B. tubercule mărite și la Poa bulbosa

(t=tulpină, p=pețiol)

Înmulțirea vegetativă artificială este o metodă cunoscută și aplicată de cultivatorii de plante pentru multiplele ei avantaje (Tabel 7).

Tabel 7. Avantajele înmulțirii vegetative artificiale

Avantajele înmulțirii vegetative au dus la perfecționarea metodelor și tehnicilor, la stabilea a peste zece tipuri de organe și metode care pot asigura înmulțirea plantelor. ANEXA IV. prezintă înmulțire vegetativă cu definirea metodelor, modul de realizare a tehnicii și exemple de specii la care se poate aplica tehnica. La acest mod de înmulțire pe lângă avantaje amintim și dezavantajul că prin înmulțirea vegetativă se formează un număr mai mic de indivizi, de ordinul zecilor (nu de ordinul sutelor ca la înmulțirea prin semințe) și că transmiterea bolilor la descendenți este mai accentuată decât la înmulțirea prin sămânță.

Înmulțirea vegetativă este o sursă de apariție a unor forme sau varietăți noi, indivizi cu calități superioare, care se transmit la următoarele generații tot prin înmulțirea vegetativă. Însă pot apărea și fenomene nedorite, descendenți degenerați: datorate aplicării repetată a înmulțirii vegetative, condițiilor de mediu nefavorabile, organe de înmulțire necorespunzătoare care rezultată de la plantele mamă care nu sunt apte pentru reproducere. Planta mamă, trebuie să aibă anumite însușiri: o vegetație bună (sănătoasă și bine dezvoltată), o înflorire bogată și frumos colorată: planta-mamă trebuie să fie reprezentativă pentru specie sau soi. În completarea ANEXEI IV. (Moduri de realizare a înmulțirii vegetative artificiale), venim cu imagini de plante, la care se aplică tehnica și sugestii.

Dorim să insistăm asupra tipurile de înmulțire cegetativă, prezentate în PLANȘA I. Modele privind tipurile de înmulțire vegetativă (de la fig. 19 la fig. 24). Astfel: Despărțirea sau desfacerea tufelor, se face în anumite părți ale plantei (cu un sistem de rădăcini aferente). Metoda se practică frecvent în floricultură la o mulțime de specii perene și la arbuștii ornamentali (Aster, Viola, Chrysanthemum, Artemisia, Dianthus etc.), dar și în legumicultură (mai ales la speciile perene cultivate pentru frunze, cele aromate, condimente etc.), la fel și la arbuștii fructiferi (ex: Rubus, Ribes) prin divizarea tufelor. La Fragaria vesca (fig. 16) întâlnim înmulțirea prin stoloni, tulpini repente și târâtoare care cresc pe suprafața pământului dând naștere la rădăcini. Multe specii perene își asigură perpetuarea înmulțindu-se prin rizomi (îngroșări ale tulpinii de la baza solului), un exemplu este specia Iris germanica (fig. 17).

Rădăcinile tuberizate sunt un alt mod de înmulțire a plantelor, comun pentru Solanum tuberosum, cartoful (fig. 18). Stolonii, sau ramurile formate la cartof pătrund în pământ, vârfurile lor se umflă și dau naștere la tuberculi (organe de înmulțire): fenomenul este întâlnit și la topinambur. Sunt unele specii mai ales legumicole și floricole care în fiecare an produc un tubercul radicular (rădăcini tuberizate), cum este Daucus carota (morcovul), Dahlia etc. (fig. 19), dar și unele orhidee. Rădăcinile tuberizate sunt rădăcini care au și funcție de depozitare a substanțelor de rezervă. Aceste substanțe de rezervă de depozitează fie în liberul lemnos (fig. 19A – cum este cazul la morcov, Daucus carota), sau pot da în fiecare an un tubercul cu substanțe de rezervă (fig. 19B – expl. la Dahlia), ori substanțele se pot depune în scoarța primară (fig. 19 C – expl. la Ficaria verna).

Bulbul este un microblast subteran cu un mugur la interior din care se dezvoltă părți aeriene. La baza frunzelor se formează solzi sau teci din care se inițiază niște bulbili (uneori cu înveliș exterior); la unele specii nu se dezvoltă acest înveliș exterior cum este Lilium candidum (fig. 20). Se cunosc două feluri de bulbi: tunicați, cum este cazul cepei (frunzele groase învelesc în tunică frunze brune subțiri; și solzoși, cum este cazul speciei Lilium candidum (fig. 20).

Bulbotuberculul sunt îngroșări ale părții de jos a tulpinii aeriene care formează la bază un disc cu rădăcini adventive și face trecerea între bulb și tubercul la care substanțele nutritive se acumulează în partea axială umflată (fig. 21).

Marcotele sunt ramuri care ating solul și care înrădăcinează până primăvara și se pot detașează de planta-mamă primăvara (Fig. 22, PLANȘA I), rezultând noi plante. Marcotele se fac din vârful ramurii prin mușuroire sau din alte părți (așezate vertical, orizontal, șerpuit).

Butașul, organ vegetativ detașat din plantă, care în condiții favorabile formează rădăcini și dă naștere la o nouă plantă. Operația de butășire se aplică doar la plantele care au capacitatea de a forma rădăcini adventive, iar butașul se poate detașa din tulpină sau frunză (fig. 23). Din fiecare lăstar de tulpină (fig. 23 I) va da naștere la rădăcini și deci la o nouă plantă prin: butaș simplu (A); și prin butași cu călcâi (B și C). Butăși din frunze (fig. 23 II: A – Cirus, B- Ficus), cu formarea rădăcinilor dând muguri de creștere (din aceștia se va dezvolta o plantă).

Altoirea este o operație mai complexă, necesită anumite condiții de compatibilitate între altoi și portaltoi. Este o metodă foarte veche, la aplicarea căreia trebuie să ținem cont de gradul de înrudire fitogenetică a partenerilor, de polaritatea și vârful altoiului. Se cunosc peste 150 metode de altoire, unele comune tuturor plantelor ierboase și lemnoase, altele însă pot fi aplicate numai la anumite plante. În tabelul 8, prezentăm cele cinci grupe de altoire. Fig. 24 din PLANȘA 1 prezintă tipurile de altoire practicate și la noi în țară la plantele horticole.

Tabel 8. Grupe de altoire și caracteristica lor.

Metodele amintite mai sus sunt considerate metode de înmulțire vegetativă provocate tradițional, dar există și o altă grupă de înmulțire vegetativă plecând de la diferite explante (porțiuni din plante și țesuturi) sau celule, cultivate in vitro.

Căile de înmulțire a plantelor superioare fac posibilă trecerea de la înmulțirea sexuată și vegetativă tradițională, la înmulțirea in vitro, metodă care constituie preocuparea acestei lucrări și va fi prezentată în capitolele următoare. În fig. 25 este relevantă pentru metoda de înmulțire clasică a plantelor superioare (în partea stângă) și metoda de înmulțire in vitro (în partea dreaptă), prezentate schematic și comparativ.

Fig. 25 Reprezentarea schematică a celor două tipuri de înmulțire: clasică și prin micropropagare (microînmulțire) in vitro

La plantele superioare se aplică curent înmulțirea pe cale sexuată (din sămânță) sau vegetativă plecând de la porțiuni din plantă care detașate pot regenera un nou organism. Ereditatea și variabilitatea sunt proprietăți care stau la baza metodei de micropropagare in vitro a plantelor: metoda în funcție de tipul de țesut detașat poate fi: 1. Cultură din țesut meristematic apical sau lateral; 2. din porțiuni din plantă (fragmente), nod, internod, frunză, porțiune de rădăcină etc. 3. Cultură de minibutași in vitro care implantați pe substratul de cultură asigură înmulțirii speciei; 4. Cultura de celule in vitro; 5. Cultura de protoplaste in vitro; 6. Cultura de țesut calusal in vitro; 7. Metoda embriogenezei somatice in vitro. Dintre aceste culturi cele care au legătură cu micropropagarea in vitro vor fi abordate în ultima parte a lucrării.

3.2. Înmulțirea plantelor prin țesut formativ meristematic

Unele celule ale plantelor superioare odată cu maturizarea, creșterea lor sau chiar îmbătrânirea, pierd cea mai mare capacitate a lor, totipotența. În această fază a pierderii totipotenței (la senescență, îmbătrânire), există totuși celule în unele zone din plantă care fac excepție, deoarece înregistrează activitatea celulară intensă. Celulele meristematice au capacitate mare de multiplicare, iar țesutul meristematic este o structură generatoare de celule de dimensiune mică (cu vacuole mici), poligonale, bogate în citoplasmă, cu un nucleu mare dispus central și membrană celulozică. În fig. 26 sunt prezentate astfel de structuri: la vârful vegetativ al primordiilor foliale (A) și la celulele inițiate în vârful tulpinii (B) la specia Equisetum maximum (PLANȘA II). La tulpina unor specii bulboase ca de exemplu Lilium usitattisimun, avem o secțiune transversală prin tulpină (fig. 27), din care putem observa componentele tulpinii: epiderma (ep), scoarța (sc), periciclul (f), liberul primar și secundar (lib.), lemnul secundar și primar (lm), cambiu (c), lacuna mediană (lac), măduva (m). Fig. 28 prezintă secțiunea transversală prin vârful tulpinii de Veronica cu: con de creștere (c), primordi foliare (f), primordiile mugurilor (m), precambiu (pc) și măduva (m).

Înmulțirea prin țesut formativ meristematic este tot o formă de înmulțire vegetativă plecând de la țesut juvenil de câțiva cm diametru detașat din vârful tulpinii sau lateral tulpinii, sau din conurile de creștere care conțin celule formative meristematice și care au calitatea de a fi liberi de agenți fitopatogeni. În domeniul horticulturii și mai ales a floricultură în ultimii 40-45 de ani, micromultiplicarea in vitro a căpătat o amploare sporită, datorită avantajelor metodei, iar utilizarea țesuturilor meristematice pentru obținerea de plante prin culturi in vitro face posibilă obținerea de plante libere de boli și dăunători.

PLANȘA I. Modele privind tipurile de înmulțire vegetativă

Fig. 16. Înmulțirea prin stoloni (sau marcotaj natural) Fig.17. Iris germanica- reproducerea

la frăguțe (Fragaria vesca) și înmulțirea prin rizomi

Fig. 18. Tuberculi la cartof Fig. 19 Tipuri de rădăcini tuberizate

(Solanum tuberosum) (A=Daucus c. ;B=Dahlia v.; C=Ficaria v.)

Fig. 20 Înmulțirea prin bulbi cu solzi Fig. 21. Înmulțirea prin bulbo-tubercul

(Lilium candidum) (la Crocus sativus; A= întreg; B= secționat)

Fig. 22. Marcotajul orizontal simplu I. II.

Fig. 23. Butași: I=din tulpină: A=simplii; B și C

= cu călcâi; II. din frunză cu formarea rădăcinii:

A=Cirus; B= Ficus

Fig. 24. Tipuri de altoire: A = în copulație (a=simplă, b= ameliorată); B = în despicătură; C= în triangulație; D = sub scoarță; E = laterală

PLANȘA II. Înmulțirea din țesut formativ sau meristem

Fig. 26. Vârf vegetativ la Equisetum maximum Fig. 27. Secțiune transversală prinstraturile de celule

cu primordii foliale (A); celula inițială dintr-o tulpină de Lilium usitattisimum (ep=epidemă,

de la vârful tulpinii(B) sc=scoarță,f=fibre periciclice, lib1=liber pr.

lib2= liber sec., c= cambiu, lm1=lemn pr.,

lm2= lemn sec.,lac= lacuna mediană, m= măduvă)

Fig 28. Secțiune transversală prin vârful tulpinii a speciei Veronica

(c=con de creștere; f= primordii foliare; m= primordiile mugurilor;

pr,=procambiu; md.=măduvă)

ANEXA I. ELEMENTELE MINERALE (nutritive). Rolul și funcțiile lor(Heller, R.. 1953)

ANEXA II. Metaboliții secundari ai plantelor (după Buchanan, BB., Gruissem, W., Jones, R., 2006)

ANEXA III. Fitohormonii și rolul în creșterea la plante (Milică., C., 1982; Dobrotă, p. 256,modificat)

ANEXA IV: Moduri de realizare a înmulțirii vegetative artificiale (Buia , Péterfi, 1965, 222-228)

BIBLIOGRAFIE

Badea, E.M., Săndulescu, D., 2001, Biotehnologii vegetale,, Ed. Fundația BIOTECH, Buc.

Bandici, G.E., 2001, Fiziologia plantelor, Ed. Dacia, Cluj-Napoca

Bărbat, I., 1977, Creșterea plantelor, În: Milicǎ M. și colab., Ed. Didact. și Pedag., București.

Bărbat, I., Calancea, I., 1981, Nutriția minerală a plantelor, Editura CERES, Buc.;

Boldor, O., Trifu, M., Raianu, O., 1981, Fiziologia plantelor, Ed. Did. și Ped., București;

Buchanan, BB., Gruissem, W., Jones, R., 2006, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Am Soc. Of Plant Physiol., 1367;

Buia, Al., 1962, Botanica, vol I. Morfologia plantelor, Lito. Inst Agronomic., Craiova

Buia Al., Péterfi St., 1965, BOTANICA agricolă, vol. I. Morfologia, Ed. Agro-Silvică, Buc.

Bușe Dragomir L., 2011, Fiziologia generală a plantelor; Ed. SITECH, Craiova.

Chirilei, H, Pușcaș, M, Bărbat, I, 1970, Fiziologia plantelor microbiol., Ed. Didactică și Pedagogică, București.

Cachiță, D., 1987, Metode in vitro la plantele de cultură, Ed. CERES, București;

Deliu, Cornelia., 1999, Morfologia și anatomia plantelor; Pressa Univ. Clujană,

Dobrotă C., 2012-2013, Fiziologia plantelor, Vol 1.și II, Ed. RISOPRINT, Cluj-Napoca;

Fitter, A., Hay, RK, 2002, Environmental Physiology of Plant, Acad. Press;

Gamborg OL., Wetter, LR., 1975, Pl. Tissue Cult. Methods, Ed. N.R.C., Canada, Saskatoon;

Heller, R., 1953, Recherches sur la nutrition minérale des tissus végétaux cultives in vitro, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11

Lockhart, 1991, Interacțions between gibberellins and various environmental factor son stem growth, Am. J. Bot., 48, 516-525

Lambers, H., Champin, SF, Ponce, TJ., 2008, Pl. Physiol. Ecology, Springer Sci., pp. 604;

Liphadzi, MS., Kirkham, MB., 2008, Physiological Effects of Heavy Mrtsld on Plant Growth and Funcțion in Plant-Environment Interacțion, CRC Press.

Libbert,F. 1993 Lehrbuch der Pflanzenphysiologie, Ed. Gustav Fischer Verlag Jena, Stuttgart;

Linsmeier E. M., Skoog F., 1965, Physiol. Plant, t.18, 100-127

Liphadzi, MS., Kirkham, MB., 2008, Physiological Effects of Heavy Mrtsld on Plant Growth and Funcțion in Plant-Environment Interacțion, CRC Press.;

Margara J., 1982, Bases de la multiplication végétative. Les méristèmes et l'organogènese., INRA; Versailles;

Milică CI., Dorobanțu, N, Nedelcu, p., Baia, V, Suciu, T, Popescu, F, Teșu, V., Molea, I., 1982, Fiziologia plantelor, Editura Didactică și pedagogică, București;

Milică, M., Stan, S., Tonca, D., 1983, Substanțe bioactive în horticulturǎ, Ed. Ceres, Buc.,

Mohr, H., Schopfer, P., 1995, Plant Physiology, EdL Springer-Verlag, Berlin Heidelberg;

Moore, T.C., 1989, Biochemistry and Physiology of Pl. Hormones, Springer-Verlag Berlin.

Murashige T., Skoog A. 1962, Revised medium for rapid growth and bioassays with tabbacco tissue cultures, Physiol. Plant, (15), 85-90;

Neamțu, G., Irimie, F., 1991, Fitoregulatorii de creștere, Ed. CERES, București,

Nicolae, I.,2008, Fiziologia plantelor, Editura SISTECH, Craiova;

Nobel, P, 2005, Physicochemical and Environmental Pl. Psysiolo, Elsevier, Acad. PressUSS;

Pamfil, D., 1980, Cultura de meristeme in vitro, Horticultura nr.3

Pollard, JW., Walker, JM., 1990, Plant Cel land Tiss. Cult., HUmanaPress, Clifton, N. Jersey;

Postgate, J., 1998, Nitrogen fixation, Cambrifge, Univ., Press;

Preda, M., 1976, FLORICULTURĂ, Ed. CERES, București:

Raicu, P, Badea, E., 1990. Biotehnologii moderne, Ed. Tehnicǎ București.

Raicu, P., Badea, E., 1986, Cultura de celule și biotehnologiile moderne, Ed. Știi și Enciclop.

Ridge, I.., 2002, Plants, Oxford Univ. Press Inc., New-York;

Schenk, R.U., A.C. Hildebrandt, A.C., 1972, Medium and techniques for introduction growth of monocotyledonos and dicotyledonos plant cell culture, Can. J. Bot.

Scopfer P, Brennicke A, 1999, Pflanzenphysiologie, Ed. Spring.Verlag, Berlin, Heidel, NY.

Selosse, MA., 2009, La symbiose, structures et functions role ecologique et evolutif, Ed. Magnard, Vuibert;

Skoog, F 1957, Chemic. Regula. of growth and organ form. in pl. tiss cult in vitro, S.E.B,11

Sumălan, R., 2006, Fiziologia plantelor, Editura Eurobit, Timișoara;

Taiz, L., Zeiger, E., 2010, Plant Physiology, Sinauer Assoc., SUA;

Zăpârțan M., 2004, Low temperatures replaced by GA3, tratment, for blooming enhacement in some cultiv of Narcissus, in: Nat. Resour. and Sust Dev, Oradea-Debrecen, 24. 04.04, 35;

Toma LD., Robu, T., 2000, Fiziologia plantelor, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iași;

Wang H., Yamaguchi, A., 2006, Growth and Function of Roots under Abiotic Stress in Soils, in Plant-Environment Interactions, CRC Press.

***http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/biobk/biobookps.html

P A R T E A II. Micropropagarea și totipotența celulei vegetale in vitro

INTRODUCERE. Capacitatea de diferențiere și regenerare a celulei vegetale

Capacitatea celulei vegetale de a se reproduce și de a da naștere la o nouă plantă identică genetic cu planta mamă este rezultatul activității țesutului meristematic. Creșterea plantelor se datorează multiplicării celulelor meristematice, urmată de creșterea în volum a fiecărei celule în parte. Totipotențialitatea celulei capacitatea ei de a o plantă nouă, identică cu planta mamă, datorită în principal proprietății de a deține informația genetică necesară reproducerii. Fenomenul totipotenței celulei a primit multe definiții, dar este cert faptul că se manifestă numai atunci când celula sau țesutul este detașat din organismul întreg, asigurându-i-se toate condițiile de care are nevoie și poate să pună în valoare informația genetică din genomul ei. Dicționarul definește fenomenul totipotenței celulei vegetale prin capacitatea celulei izolate, nediferențiate de a regenera planta în întregul ei și a fost dovedită experimental pentru prima dată prin culturi de celule și țesuturi in vitro, fiecare celulă regenerând un nou organism vegetal identic cu organismul de la care provine celula sau țesutul cultivat in vitro.

Țesuturile meristematice conțin celule care au capacitatea de a se divide și a da naștere la noi plante: celula diploidă conține informația genetică care-i permite să evolueze și să se dezvolte individual, iar nucleul ei este capabil să diferențieze in vitro indivizi complet organizați.

Fenomenul totipontenței este demonstrat la mijlocul secolului trecut la celula animală, însă în paralel este studiat și la plante. La morcov celule izolate in vitro generează calus din care se formează plante întregi. Embrionii somatici cultivați in vitro pot regenera țesut, calus, suspensii de celule, protoplaste și celule izolate mecanic. Capacitatea unei celule singure, a unui țesut sau embrion somatic de a regenera o plantă întreagă, depinde de un complex de factori: de clima, competența celulei sau a țesutului, de reacția recalcitrantă a unei specii, de prezența fitohormonilor etc.

Capacitatea celulei vegetale de a dediferenția este un fenomen care are loc în mod obișnuit in vitro (rar in situ) și constă în stimularea proliferării celulelor detașate într-un țesut nediferențiat, care în anumite condiții pot rediferenția. Fenomenul poate apărea și în urma rănirii țesutului sau a celulelor, în zona rănită se diferențiază de cele mai multe ori un țesut calusal, bogat în fitohormoni și enzime endogene.

Nu toate celulele au capacitatea de a se diferenția, procesul fiind inegal răspândit în organele plantei și în structurile ei morfofuncționale, existând deosebiri privind capacitatea dediferențierii la nivelul celulelor care sunt detașate din același organ sau țesut, afirmație dovedită prin multiple experiențe inițiate in vitro la diferite tipuri de țesuturi și diferite specii de plante, cu poziție filogenetică mai apropiată sau mai îndepărtată.

Desprins de planta mamă organul, țesutul sau celula va suferi un șoc traumatic, care uneori poate avea și un rol pozitiv, acela de-a stimula generarea compușilor chimici și de a regla funcționalitatea celulei. În țesuturile rănite (incizate) se acumulează substanțe cu rol în inducerea dediferențierii celulei și stimularea înmulțirii ei.

Pe lângă substanțele stimulatoare – fitohormonii – mai există și alți factori implicați direct în regenerarea și multiplicarea celulelor in vitro, care determină evoluția țesutului in vitro, cum ar fi:

compoziția mediilor aseptice de cultură, natura și concentrația componentelor mediului,

tipul de explant și starea fiziologică a plantei de la care provin explantele (în principal vârsta și sănătatea țesutului),

condițiile de incubare a țesutului (factorii de climă din camera de creștere a explantelor inoculate: lumină, temperatură, umiditate) etc.

În subcapitolele care urmează încercăm să abordăm unele aspecte esențiale ale factorilor cu rol decisiv în procesul de regenerare, diferențiere, dediferențiere, creștere și micropropagare a celulelor și țesuturilor in vitro.

4. Generalități privind organizarea laboratorului de micropropagare

Spațiul pentru laboratorului de micropropagare a plantelor in vitro, trebuie să îndeplinească unele condiții obligatorii legate de dimensiunea laboratorului, spațialitatea, prezența instalațiilor care să asigurare condițiile de perfectă funcționare (a luminii, curentului, gazului, a sursei de apă, a canalizării etc.), asigurarea curățeniei și păstrarea în condiții de siguranță a materialelor necesare și în special a substanțelor care intră în compoziția mediilor aseptice (substanțe chimice cu regim special). Esențial în asigurarea activității de micropropagare este asepsizarea spațiului de desfășurare a operațiunilor necesare: sterilizarea mediilor de cultură, sterilizarea materialului vegetal recoltat din natură (radacini, frunze, muguri, fragmente de tulpina, semințe etc.). În laboratorul de micropropagare sunt două zone între care existe o delimitare:

Zona nesterilă: include vasele de laborator necesare (posibilitățile de spălare, sterilizare), laboratorul propriu-zis cu aparatura (etuve, frigidere, agitatoare, balanțe etc), o cameră de creștere în funcție de cerințele de lumină, temperatură, umiditate.

Zona sterilă: cuprinde camera sterilă cu hota de suflat aer steril, care variază ca număr, pot fi 1 -2 -3 hote în camera sterilă în funcție de fluxul de lucru din laborator, de numărul de specii pe care dorim să le înmulțim și de scopul urmărit. Hota asigură mediul steril necesar pentru sterilizarea materialului vegetal, prelevarea tipului de țesut dorit, adăugarea în mediu a fitohormonilor și vitaminelor, porționarea mediilor în vase, inocularea propriu-zisă, subcultura plantelor, minibutășirea etc.

Laboratorul de micropropagare cuprinde trei secțiuni distincte sau spații care asigură procesul de micropragare. Figura 29 redă schematic părțile componente ala laboratorului: spațiul pentru prepararea mediilor de cultură; camera sterilă și camera de creștere, iar fig. 30 imagini generale legate de aparatura din laboratorul de micropropagare și conservare (imagini originale).

Fig. 29. Organizarea laboratorului de culturi de țesuturi in vitro

Camera pentru prepararea mediilor: autoclav (1), distilator și chiuvetă (2), plita cu agitator (3), pH-metru (4), masa de lucru (5), masa de lucru și etajere (6), etuvă (7), cuptor cu microunde (8), frigider (9), dulapuri (10), cărucior (11). Cameră sterilă (transfer): hotă (1), masã (2), pompă peristatică (3), scaune (4), arzător + sterilizatoare (5), butelie de gaz(6), binocular (7), agitator (8). Cameră de creștere, cu rafturi+ sursă iluminat.

a. Masă de lucru cu vase de laborator b. Spălător (Chiuvetă) cu rastel pt. scurgere apei

c. Etuva d. Bidistilator

e. Centrifuga f. Balanță

g. Ph-metru (cutia de protecție; conținutul)

h. Agitator orbital

i. microscop cu cameră (diferite poziții)

j. consolă, vedere generală – microscop cu camera, leptop, etuve, etc.

Fig. 30. Aparatura din laboratorul de micropropagare și conservare- imagini generale

(a = masă de lucru cu vase de laborator; b. = spălător – chiuvetă cu rastel pentru scursul apei din veselă; c. = etuvă; d. = bidistilator; e. = agitator; f. = balanță; g. = pH=metru (cutia de protecție și conținutul) ; h. = agitator orbital; i = microscop cu cameră; j = consolă, vedere generală; microscop cu cameră, leptop, etuve, etc.)

4.1. Amenajarea propriu-zisă a laboratorului

De reținut că laboratorul conține cele două zone sau spații pe care le prezentăm schematic mai jos, fiecare zonă cu componentele necesare desfășurării operațiunii de micropropagare a speciilor de plante.

Partea nesterilă, sau zona nesterilă, este prezentată în tabelul 9 și redă succint dotările acestei părți foarte importante a laboratorului, de la care pleacă reușita activității. Dimensiunea fiecărei părți a acestei zone va fi stabilită în funcție de volumul de muncă și de numărul personalului care desfășoară activitate în cadrul acestui spațiu.

Tabel. 9. Prezentarea schematică a zonei nesterile a laboratorului de micropropagare

Fig. 31. Camere de creștere Sanyo, imagini din exterioare și interior(original)

Partea sterilă a laboratorului este practic camera sterilă, încăpere unde se execută operația de sterilizare a materialului vegetal și se face inocularea propriu-zisă sau subcultura și minibutășirea neo-plantulelor regenerate și multiplicare in vitro. Este o încăpere izolată de restul laboratorului, dar amplasată în apropierea zonei nesterile pentru a facilita desfășurarea operațiunilor de micropropagare. În interiorul camerei sterile se găsesc una, două, chiar până la trei hote cu flux de aer orizontal, steril și continuu (denumite și boxe). Numărul acestora este stabilit în funcție de volumul de muncă existent, stabilit printr-un plan sau program de cercetare și în funcție de scopul cercetării. În interiorul boxei se introduc vasele sterile cu mediu de cultură, alte vase (Petri, Erlenmeyer, Berzelius etc.), instrumentarul și materiale necesare operațiunii de micropropagare (folie pentru opturarea vaselor, creioane, etc.).

Funcționarea lămpilor cu UV este foarte importantă. Ele se pornesc cu cca. 20 minute, iar la cca. 5 minute după stingere, operatorul poate intra în hotă având alături toate instrumentele și materialele necesare desfășurării operațiunilor in vitro. Nu se intră în boxă și nu este recomandat să se lucreze, pe timpul funcționării lămpilor cu UV. Pentru o perfectă asepsizare a zonei este necesară menținerea curățeniei zilnice a încăperii sterile. Dotarea laboratorului de biotehnologii nu este foarte costisitoare și se stabilește în funcție de scopul urmărit, în acest caz micropropagarea in vitro a unor specii de plante, cu diferită valoarea biologică și economică. Atunci când este vorba de operațiuni mai complexe (suspensii celulare, criostocare, protoplaste etc.), și dotarea laboratorului va fi îmbunătățită în funcție de operațiunea stabilită. Personalul necesar pentru toate etapele micropropagării se stabilește funcție de volumul de muncă, și poate fi alcătuit din 2-3 tehnicieni specializați în micropropagare și un specialist în tehnologia de aclimatizare ex vitro a neo-plantulelor obținute in vitro, supravegheați de o persoană cu pregătire superioară (biolog, inginer). Trebuie să existe relații de colaborare cu instituțiile de cercetare de acest profil (agrotehnicieni), personal tehnic calificat și necalificat care să asigure măsurile agrotehnice și fitosanitare, pentru aclimatizarea neo-plantulelor ex vitro, plantarea la locul stabilit a neo-plantulelor obținute in vitro. Laboratorul poate fi constituit simplu, prin măsuri de readaptare a altor laboratoare existente (biologie, chimie, fiziologie, agrotehnică etc.), adăugând anumite dotări specifice tehnicii de micropropagare in vitro (aparatură, substanțe, personal, etc.).

Masa sterilă sub UV b. Masa sterilă cu medii și instrumentar

c. Masa sterilă cu materialul vegetal pentru inoculare

Fig. 32 Masa de suflat aer steril cu posibilități de funcționare

Dotările laboratorului de micropropagare și conservare a plantelor. Un laborator de micropropagare a plantelor in vitro cuprinde, dotările prezentate în tabelul 10, dotări care trebuie utilizate în funcție de nevoile laboratorului și volumul de lucru. Pentru laboratorul specializat exclusiv pe micropropagare, unele materiale, aparate, dispozitive, substanțe chimice etc. pot lipsi, operația rezumându-se la măsuri chirurgicale mai simple, și de cele mai multe ori efectuate cu baza existentă într-un laborator de biochimie, chimie, de fiziologia plantelor etc.

Tabel. 10. Dotările laboratorului de micropropagare cu materiale și aparatură

Pe lângă dotările amintite, prezentăm și dotările existente într-un laborator de micropropagare și biotehnologii (relevante și imaginile). Un loc distinct îl au substanțele chimice de care este nevoie pentru prepararea mediilor (vor fi prezentate în capitolul mediile de cultură, preparare mediului si componentele lui). Cele mai importante substanțe dintr-un mediu, cu concentrația mică, medie și maximă (în mg/l), sunt prezentate în tabel 11.

Tabel 11. Substanțe chimice frecvent întâlnite pentru micromultiplicarea in vitro.

5. Mediile aseptice pentru cultura țesuturilor vegetale „in vitro”

Pentru alegerea unei compoziții corecte a mediului de cultură, trebuie să ne raportăm la tipul de inocul, natura lui, proveniența, vârsta (starea fiziologică a țesutului), perioada din an când s-a recoltat planta etc., aspecte care trebuie avute in vedere când dorim sa optimizăm compoziția mediului de cultura. Fiecare tip de țesut (celula, calus, organe sau părți de organe etc.), au capacitatea de a regenera datorită țesutului meristematic (celulelor meristematice). Regenerare și multiplicare in vitro este dependentă de compoziția mediilor și în special de prezența fitohormonilor, de tipul și concentrația lor.

Mediile de cultură aseptice au rol esențial în reușita și evoluția unei culturi in vitro și conțin grupe de compuși chimici cu rol de surse de carbon, surse de azot, vitamine, stimulatori de creștere după scopul urmărit. Progresele importante în domeniu optimizării compoziției mediilor de cultura s-au înregistrat abia după mijlocul secolului trecut, atunci când pe baza a numeroase studii au fost concepute si testate un mare număr de medii de cultura cu o compoziție specifica pentru speciile cultivate in vitro.

S-au conceput medii utilizate la un număr mare de specii, stabilindu-se cel mai eficient mediu pentru o specie. Formulele de mediu au fost utilizate inițial la țesutul de soia și tutun cultivat in vitro. În jurul anilor 1950 s-a stabilit rolul nutrienților la cultura in vitro a țesutului vegetal iar ceva mai târziu s-a stabilit rolul substanțelor nutritive la suspensiile celulare.

5.1. Prepararea mediilor de cultură. Substanțele chimice necesare

Mediile pentru cultura in vitro, în funcție de natura, cantitatea compușilor și de raportul ionic (stabilit după autoclavare), au caracteristici speciale care asigură creșterea anumitor specii, țesuturi sau tipuri de explante in vitro (Anexa 2. Medii frecvent folosite. Autorii rețetelor de mediu). Astfel, pentru cultura de:

calus sunt indicate mediile după Heller – 1953 și Murashige -Skoog (MS) – 1962

rădăcini și regenerarea in vitro, mediu după White (W) – 1963;

antere, mediu Nitsch – Nitsch (NN) – 1969;

mediu Schenk-Hildebrandt (SH) 1972 pentru cultura in vitro a țesuturilor de la speciile lemnoase și arbustifere;

mediile Murashige-Skoog (MS) – 1962 și Gamborg (G5) sunt utilizate pentru orice țesut sau organ cultivat in vitro ș.a.m.d..

Prin dizolvarea în apă a sărurilor minerale, componentele lor se disociază în ioni (formă de activare a sărurilor), pot fi absorbite și se pot face schimburi ionice între celule și mediul de cultură. Echilibrul ionilor asigură declanșarea tuturor fazelor de dezvoltare a inoculilor cultivați in vitro, multiplicarea celulelor, creșterea, organogeneza, embriogeneza etc. Pentru ușurarea preparării mediilor de cultură se elaborează in prealabil soluții concentrate-stoc (mult mai concentrate decât soluțiile de lucru). Se păstrează în frigider conform recomandărilor, iar în caz că apar depuneri sau floculări nu se mai folosesc (se prepară soluțiilor proaspete).

Tabel 12. Elementele chimice componente ale mediului de cultură (de bază)

Elementele care alcătuiesc mediu de cultură sunt prezentate în tabelul 12. Dintre microelemente, fierul (Fe) este greu accesibil pentru celula vegetală, de aceea se aplică chelatizarea, adăugarea FeSO4- 27,8 mg/l sau Na2FDTA-37,3mg/l). Soluțiile stoc la utilizare se aplică diluate în funcție de mediu. Mediile de cultură conțin două grupe de substanțe:

Substanțe anorganice; macroelemente, microelemente, FeEDTA (chelat de Fe) din care se fac soluții stoc.

Substanțe organice; vitamine, aminoacizi (la care se prepară soluțiile stoc), glucide, fitohormoni (pentru fiecare tip de fitohotmon se prepară soluție stoc) și agar.

Cele mai utilizate medii de cultură pentru diferite specii și tipuri de explante sunt: după Murashige-Skoog (MS)-1962, Linsmaier-Skoog (LS)-1965, Gamborg (G5)-1968, Heller (H)-1953,, Nitsch and Nitsch (NN)-1969, Schenk-Hildebrandt (SH)-1972, White (W)-1963, etc.. Se pot folosi macroelemente. după un autor și microelemente după altul. Aceiași abordare o putem avea chiar și pentru vitaminele, aminoacizii, fitohormonii. Nu este indicată modificarea concentrației stabilite de autor. Anexa 1. prezintă compușii chimici (formula chimică și greutatea moleculară).

În prepararea unei soluții stoc trebuie să se țină cont de anumite condiții și etape care trebuie urmate cum ar fi:

stabilirea concentrației soluțiilor (exprimate în: %, mg/l, ppm., M, µM, mM etc.);

dizolvarea și omogenizarea componentelor soluțiilor corectă;

solubilitatea substanțelor, a fitohormonilor, etc. Tabelul 13 prezintă condițiile preparării soluțiilor- stoc.

Tabel 13. Condiții de preparare a unei soluții stoc

Prepararea soluției stoc de FeEDTA, se face prin combinarea a 5.57 g/l FeSO4 (FeSO4·7H2O) cu 7,45 g/l Na2EDTA, care se dizolvă separat și se adaugă la volumul de 1000 ml apa bidistilata și dacă este necesar se ajustează pH-ul la valoarea de 5,5. Soluția stoc de FeEDTA se păstrează în sticle închise la culoare și la rece. Este necesară 5 ml soluție stoc de FeEDTA pentru prepararea unui litru de mediu.

Prepararea soluțiilor stoc de fitohormoni se face în funcție de clasele de substanțe, grupate după rolul și acțiunea lor asupra plantelor. Tabelul 13 prezintă condițiile de prepararea a unei soluții stoc. Astfel auxinele și giberelinele (pudre) se dizolvă în alcool absolut sau etilic 96%, iar citochininele în cantitate mică de HCl – 0.15 N. Redăm mai jos modul de preparare a soluțiilor de fitohormoni:

Auxinele (2,4D, ANA), 50mg se dizolvă în 2-5ml alcool etilic, se încălzește ușor și se diluează la 100ml apă distilată: se păstrează la 4-50C în frigider cca. 20 zile.

Benziladeninei (BAP): se dizolvă 21,5 mg de BA într-o cantitate foarte mică de HCl 0.15 N, se dizolvă încălzită ușor și se diluează la 100ml apă distilată: soluțiile de citochinine se păstrează la 4-5oC cca. 3 luni.

Tabel 14. Fitohormonii folosiți la cultura in vitro (solventul și condiții de păstrare

Fitohormonii se dizolvă în diferiți solvenți (baze, alcooli, aciizi și au anumite condiții de păstrare pentru conservarea proprietăților. Tabelul 14 redă fitohormonii cel mai des folosiți la culturile in vitro și substanța chimică în care se dizolvă, pentru obținerea soluției stoc și condițiile de păstrare al amestecului stoc (macroelemente, microelemente, vitamine, FeEDTA și hormoni). Pregătirea soluțiilor stoc de fitohormoni se face la boxă și se adaugă prin filtru Millipor în mediu, după autoclavare, conform rețetei. Prepararea mediilor urmărește etapele:

de analiză a reacției sărurilor care conțin un anumit număr de molecule de apă,

de stabilirea pH-ului,

de adăugarea substanței solidificante, dacă dorim un mediu solid adăugăm agarul,

in final sterilizarea prin autoclavare.

Vase necesare preparării mediului trebuie pregătite în prealabil: un cilindru gradat, un Erlenmeyer de un litru, pipete, balanța, sticle de ceas și sticle cu soluțiile stoc (macroelemente, microelemente, vitamine), zaharoza și agar. Tabelul 15 prezintă etapele preparării mediului, cu specificația ca după autoclavare și pipetarea fitohormonilor, se porționează în recipiente sterile la boxă, și se lasă să se răcească sub hota cu flux de aer steril (cca. 24 de ore), pentru a fi mai ușoară inocularea și pentru evitarea infecțiilor.

Tabel 15 Etapele preparării unui mediu de cultură (prezentare sumară)

5.2. Componentele mediilor de cultură

Evoluția țesutul cultivat in vitro depinde de factorii din mediul înconjurător (valorile de temperatură, lumină, umiditate etc.) și de compoziția mediului aseptic de cultură care conține după unii autori, pe lângă 95% apă și cca. 20 de componente diferite. Pentru ca planta să desfășoare procesele fiziologice (în special fotosinteza) in vitro, mediul de cultură trebuie să conțină anumite componentele sau nutrienții. Apa este necesară în întreg ciclul de viță a plantelor. La fel și la cultura in vitro a unor țesuturi vegetale nevoia de apă este permanentă. Pentru prepararea mediilor, apa trebuie să fie pură, fără ioni, cationi, microorganisme, impurități, de aceea este necesară tratarea apei prin metode de distilare sau bidistilare, care elimină orice impurități, particule, microorganisme, etc.

Tabel 16 prezintă compușii care intră in compoziția unui într-un mediu de cultură (tipul de produs), preparat pentru creșterea și dezvoltarea unui țesut sau unor celule vegetale.

Tabel 16. Compuși care alcătuiesc mediu de cultură necesar țesuturilor vegetale cultivate in vitro

Nutriția plantelor din mediul natural de viață, se realizează prin asimilarea unor elemente minerale din sol, ori prin suplimentarea acestora prin aplicarea îngrășămintelor (naturale sau sintetice), suplimentare care se administrează în funcție de nevoile speciei. În condițiile controlate, in vitro țesutul vegetal are nevoie de aceiași nutrienți (ca și în cultura normală), pentru desfășurarea ciclului de viață și care asigură creșterea și dezvoltarea noilor plantule regenerare in vitro. Necesarul plantei în macro. in vitro este de ordinul molilor (M) sau milimolilor, iar micro. de ordinul micromolilor: adăugate în mediu funcție de specie și procesul fiziologic pe care vrem să-l inducem țesutului. Mediul conține macroelemente și micronutrienți salini, cu rolul fiziologic specific în plantă.

Macroelementele: Azot (N), sub formă de NH4NO3 (nitrat de amoniu): aflat în structura coenzimelor, a vitaminelor din grupa B (B1, B6, B12), a pigmenților clorofilieni și fiobilini, a stearidelor vegetale, în structura moleculelor de nucleoproteine, proteine, lipoproteine etc.;

Potasiul (K), sub formă de KNO3 (nitrat de potasiu), cu rol în sinteza aminoacizilor și proteinelor, este un biocatalizator;

Calciul (Ca), sub formă de CaCl2·2H20, are rol în mitoza celulei, în organizarea cromozomilor, prezent în structura unor enzime (lipaza, esteraza, colinesteraza) depozitate în celulă la nivelul protoplasmei, vacuolelor, cloroplastelor etc.;

Magneziul (Mg), sub formă de MgSO4·7H20, indispensabil plantelor în anumite procese (fotosinteză, sinteza glucide, lipide etc.), în activitatea enzimelor care iau parte la respirația celulei, la sinteza acizilor nucleici;

Fosforul, sub forma KH2PO4 (fosfat acid de potasiu), asigură transportul de energie în celula vegetală, rol în ciclul Krebs (fosforilare), în sistemul Redox (în lanțul respirator).

Microelementele: Fierul sub formă de chelați de Fe (FeNaEDTA) influențează: fotosinteza, metabolismul azotului, biosinteza pigmenților clorofilieni, carotenoizi etc.;

Borul: acid boric (H3BO3) influențează procesele fiziologice la nivelul celular;

Manganul: sulfat de mangan (MnSO3·4H20) implicat în procesele de fosforilare etc.;

Zincul: sulfat de zinc (ZnSO4·7H20), în structura unor enzime, fosfataza, dehidrogenaza, în plantă favorizează creșterea conținutului de auxină, apoi influențează vâscozitatea protoplasmei, mărind conținutul de zahăr solubil etc.;

Iodul este întâlnit sub formă de iodură de potasiu (KI);

Molibdenul: molibdat de sodiu (Na2MoO4·2H20), în biosinteza clorofilei și sinteza unor proteine: la leguminoasele furajere intensifică formarea nodozităților pe rădăcini etc.;

Cuprul: sulfat de cupru, CuSO4·5H20 și cobaltul sub formă de CoCl2·H20 intră în compoziția vitaminelor din grupa B.

În ultimul timp se folosesc medii de cultură gata preparate de către anumite companii specializate, în scopul ușurării preparării mediului. Se pot cumpăra pe lângă soluțiile stoc de macro., micro. și de vitamine, zaharoză, agar și mediul în întregime cu sau fără hormoni.

5.2.1. Sterilizarea vaselor, apei și a mediilor

După sticlărie, medii și apa, sterilizarea vizează și incintele sau încăperile unde se lucrează, îmbrăcămintea personalului care operează. Preventiv, trebuie menținută curățenia încăperii, spălarea consolelor, podelelor, rafturilor etc., aspirarea pereților și a podelelor periodic. Îmbrăcămintea folosită de personal: pantofi, bonetă, mască, halat de laborator etc., se lasă în afara camerei sterile, ca și bijuterii sau ceasuri. Se folosesc halate păstrate în boxa sterilă, papuci, bonete pentru păr și măști de unică folosință (după caz pentru persoane răcite sau alergice la unele substanțe de dezinfecție, sau chimice din mediu).

De asemenea după ce mediile sterilizate, apa pentru clătire și materialul vegetal (și ele sterilizate) au fost introduse în boxă, ca și instrumentarul și obiectele de îmbrăcăminte sunt sterilizate, se puse în zona UV-ului și se aprind lămpile cu UV (timp de 20 minute). Noaptea se recomandă aprinderea UV-ului în partea sterilă a laboratorului, iar la începerea programului se stinge, ca să se aprindă iar înainte de inoculare cu cca. 20 minute.

Sterilizarea materialului vegetal va fi prezentată în acest capitol la subcapitolul următor (6) care va prezenta rezultatele obținute în urma testării soluțiilor sterilizatoare privind tipul de soluție, concentrație și tipul de țesut (meristem, apex, boboc, nod etc.): etapa de sterilizare cea mai avantajoasă este cea care asigură procentul cel mai scăzut de infecții apărute la țesuturile inoculate in vitro și care nu produce necrozarea țesutului. La sterilizarea vaselor de laborator din sticlă se recomandă metoda de sterilizare uscată (la cald, în etuvă), pentru înlăturarea microorganismelor rezistente la unii agenți dezinfectanți, iar flacoanele cu mediu de cultură se pot steriliza la umed, în autoclav. Amintim etapele sterilizării sticlăriei de laborator:

Sterilizarea la uscat se face cca. 2-3ore la 160oC, pentru distrugerea microorganismelor rezistente la căldură și pre-sterilizarea sticlăriei la temperaturi de peste 180oC, operație care depinde de calitatea sticlei (dacă suferă degradare, poate emana substanțe toxice în mediul de cultură, nefaste țesutului vegetal);

Spălarea vaselor de laborator trebuie făcută ca să înlăture orice posibilități de infecție, care are urmări nedorite în procesul micropropagării in vitro;

Vasele noi din sticlă se folosesc abia după spălarea corespunzătoare și autoclavarea acestora. Se recomandă spălarea mecanică a sticlăriei noi, deoarece apa este mult mai caldă și înlătură mai bine impuritățile;

Expunerea vaselor la temperatură ridicată depinde de calitatea sticlei, care la peste +180oC se poate degrada și elimina în mediu de cultură a unor compuși toxici;

Sisteme de opturare: dopurile de vată, celuloza, material plastic termorezistent se sterilizează în etuvă (100-120 min./120oC), capacele metalice și folia de aluminiu;

Aparatura din interiorul boxei: binocular, stereomicroscopul, lampa, stative metalice etc. se șterg cu alcool 70o, iar unele părți se pot și flamba.

Apa pentru prepararea mediului este apa bidistilată (bidistilarea elimină impurităților din apa de robinet). Pentru sterilizare, apa de robinet se pregătește în baloane cu fund drept tip twist (cu capac) sau Erlenmeyere, care se lasă goale un sfert din vas. Se acoperă cu dopuri din vată învelite în hârtie, care se scot în condiții sterile, iar după turnarea apei în cilindru (pentru prepararea mediului) dopul se flambează;

Apa pentru clătirea materialului vegetal se sterilizează în etuvă 2 ore, la 180oC: vasele (borcanele) cu apă, bine închise, păstrate la boxă până la utilizarea apei pentru clătirea materialului vegetal sterilizat. Se fac 4-5 clătiri, după decantarea soluției de: hipoclorit de calciu sau natriu, apă oxigenată sau bromată, clorură mercurică etc.

Sterilizarea instrumentarului: pensete, bisturie, lamele de diferite tipuri, foarfeci, ace, lame etc. se face prin introducerea în alcool 70o și apoi flambarea la roșu. La bisturie și lame, flambarea afectează lama și trebuie ascuțite când începem o nouă secționarea a țesutului.

Sterilizarea mediilor de cultură se face prin autoclavare în anumite etape și cu desfășurare rapidă a unor etape pe care le prezentăm mai jos:

După prepararea mediului (după rețeta stabilită) se recurge la autoclavare;

După autoclavare mediul se plasează în boxă pentru introducerea componentele prin filtrul Millipor: hormonii care nu se autoclavează, pentru că își pierd calitățile;

Autoclavarea se desfășoară în autoclav sau oala sub presiune (de 8-10-15 litri);

Sterilizarea la autoclav se face timp de cca. 15 minute la o temperatura de 121oC;

După porționarea mediilor în vasele de cultură, acestea se închid și se păstrează în boxa cu aer steril pentru inocularea în cel mai scurt timp;

Sterilizarea holderelor în care a fost incorporat filtrul Millipor se face la temperatură de cca. 120oC. iar filtrele se aruncă după folosire.

5.3. Etape propriu-zise de preparare a unui mediu aseptic

Inițial se pregătește sticlăria necesară preparării unui litru de mediu: Erlenmeyer de 1 litru (Berzelius mai mare de 1 litru), cilindru de 1 litru, balanța, pipete; soluțiile stoc necesare compoziției mediului (mg/l, moli-M, conversia mM în mg/l, sau a mg/l în mM). Se stabilesc următoarele etapele de preparare a mediului, ținând cont de rețeta de mediu:

Într-un vasul Erlenmeyer de 1 litru se pune apă bidistilată jumătate din volum;

se adăugăm 10 ml din soluțiile stoc de: macro., micro., NaFeEDTA (FeSO4·7H2O;

NaEDTA) și mezo-inozitol, se omogenizează pe agitator;

se ajustează pH-ul soluție care trebuie să fie cuprins între 5,4 – 5,8 (cu NaOH sau HCl, în funcție de valoare), se adaugă apă bidistilată până la volum de 1 litru;

pentru un mediu solid se adaugă agentul gelifiant (agarul) topit prealabil în cuptorul cu microunde (sau pe o plită ușor încălzită). Dacă mediul din rețetă este lichid, se trece direct la autoclvarea și porționarea lui;

porționarea mediului (lichid sau solid), se face ochiometric, sau cu pistol gradat, în vase de cultură, apoi se acoperă cu dopurile existente și se trec la autoclavare:

după autoclavarea mediului, iar apoi porționează în vasele de cultură la hota sterilă. Odată cu mediul, vasele de cultură se autoclavează și sistemul de opturarea (dopurile sau foiță de alufolie): cca.15 min. la 121oC: în același timp se autoclavează și apa pentru clătirea materialului vegetal (borcane) și instrumentarul (păstrat în caserolă sau învelite în alufolie);

după autoclavare, mediul se trece la hota sterilă (Fig. 31), unde se introduc vitaminele (acid nicotinic, pyridoxină, tiamină) și fitohormonii (conform concentrațiilor stabilite în rețeta de mediu), cu ajutorul unor siringi sterile cu filtru Millipor, aflate deja în condițiile aseptice ale hotei;

se face porționarea și repartizarea mediului în flacoane, apoi acoperirea acestora și menținerea în hotă până la inoculare.

inocularea este operațiunea propriu-zisă de implantare a țesutului pe mediu (cu aderență și ținând cont de polaritate dacă este cazul) care se poate face imediat după răcirea mediului autoclavat și cu adausul de vitamine și hormoni (după rețetă), sau cel mult după 24-48 de ore, pentru a nu se altera.

păstrarea flacoanelor cu mediu: pentru a urmări apariția eventuală a infecțiilor în mediu, cauzate de autoclavarea defectuoasă ( pană de curent, de gaz etc.), de anumite inadvertențe apărute la prepararea lui, sau a unor soluții stoc mai vechi și precipitate, este necesar menținerea în caserole ermetic închise, cca. 4-5 zile.

crearea condițiilor optime pentru observații care vizează parametrii stabiliți de scopul experimentului, desfășurate în funcție de evoluția țesutului sau a explantului (după săptămâni sau luni). Observațiile se fac vizual sau prin desființarea culturii pentru măsurători concrete (a lungimii plantulelor și a rădăcinilor etc.).

Dacă mediile sunt limpezi, se consideră sterile și se pot inocula în aceiași zi sau după maximum 24 de ore. Până la răcire și inoculare vasele care conțin mediul de cultură steril se păstrează în caserole ermetic închise, pentru a preîntâmpina contactul cu aerul care poate genera infecții sau poate determina deshidratarea mediului: și de asemenea eventualul contact cu praful din încăpere care poate duce la infecții. Se păstrează de obicei în locuri răcoroase și întunecoase, în hotă, la cca. 4oC. Dacă mediul de cultură conține componente care se pot altera, se are în vedere inocularea lor cât de repede posibil, chiar și în aceeași zi.

6. Materialul vegetal. Natura explantelor cultivate in vitro

Micropropagarea in vitro se realizează printr-un număr mare de tehnici, care au părți comune oricărui tip de micropropagare (inițierea culturii și subcultura) sau parți caracteristice doar unui anumit tip de cultură in vitro (de calus, protoplaste, suspensii celulare).

Părțile comune ale operațiunii de micropropagare sunt prezentate schematic in tabel 17. Părțile caracteristice doar anumitor tipuri de culturi in vitro sunt întâlnite la cultura de protoplaste, la suspensii celulare și la cultura de calus (calusogeneza).

Tabel 17 Caracteristicile comune ale unei culturi in vitro

Cultura de protoplaste. Protoplastele sunt celule a căror perete celular a fost îndepărtat facilitând astfel schimburile de substanță cu mediul extracelular. Cultura de protoplaste implică trei etape, pe care le prezentăm sumar:

Izolarea protoplastelor: se poate face din toate organele plantei, dar frunza este cel mai des folosită: operațiunea este exemplificată la cartof (se ia epiderma inferioară printr-un tratament mecanic sau enzimatic).

Protoplastele izolate se cultivă pe medii lichide sau semilichide . La câteva ore începe să regenereze peretele celular, procesul putând dura cca. 3 săptămâni. După acest timp apar colonii mici de celule de cca. 1mmØ, care transferate pe un mediu cu fitohormoni (în special citochinine și auxine), declanșează procesul de organogeneză și embriogeneză, cu formare de plante.

Fuzionarea protoplastelor: un fenomen fizic care presupune dispariția barierelor de incompatibilitate, făcând posibilă fuzionarea celulară interspecifică. Fuziunea poate fi spontană sau indusă chimic.

Dezvoltarea plantelor în urma fuziunii celulelor protoplasmatice. Primul hibrid interspecific se obțin în 1987 (Nicotiana glauca și langsdorfii), iar inter-genetic în 1978 între cartof și roșii (Solanum tuberosum x Esculentum lycopersicum).

Cultura de suspensii de celule, are ca scop folosirea tehnicilor în obținerea de metaboliți secundari (compuși, hormoni, enzime, proteine, aditivi alimentari, pesticide etc.) utili în industria farmaceutică, cosmetică, alimentară etc. În 1956, Ashok și Gunjan obțin un prim brevet pentru cultivarea unor țesuturi de plante în acest scop.

Cultura de calus. Încă la începutul secolului XIX se observă pe organele rănite sau pe explantele in vitro apariția unui țesut cu capacități regenerative care a primit denumirea de calus, format dintr-o masă de celule neorganizate rezultate în condițiile sus amintite. Semnalat pentru prima dată in vitro în 1939 de trei colective de cercetători: White induce formare de țesut calusal la Nicotiana prin surplus de fitohormoni, iar Gautheret și Nobecourt, menține timp îndelungat cultura de calus de morcov, pe mediu suplimentat cu auxine.

Natura materialului vegetal, a organelor și țesuturilor donatoare de explante este factor de bază în procesul de micromultiplicare in vitro. Astfel, la semințe (permeabilitatea tegumentului), ca și la flori, învelișului floral care adăpostește organele florii (când prelevăm organe florale), sau la muguri (când desprindem meristem), la toate aceste organe este esențială alegerea corespunzătoare a soluției dezinfectante, a concentrației și duratei tratamentului, pentru obținerea unei culturi in vitro cu grad redus de infecți. La materialul vegetal detașat din porțiuni din plantă aflate în contact cu solul (rădăcini, bulbi, etc.), posibilitatea infecțiilor este mare (solul este purtător de germeni) sunt necesare operații premergătoare inoculării:

curățirea mecanică a organelor provenite din această zonă, cu ajutorul unei perii (nu aspre) pe suprafața țesutului până la îndepărtarea impurităților;

clătiri repetate cu unele saponine (detergent, Tween, etc.) și găsirea metodei adecvate de înlăturare a spumei rezultate;

mărirea duratei tratamentului de sterilizare și a concentrației substanței;

menținerea organelor vegetale un anume timp sub UV (cca. 20 minute, nu mai mult pentru a nu induce apariția unor mutații);

clătiri repetate la chiuvetă sub jet puternic de apă, câteva zeci de minute, până când apa devine relativ limpede;

clătiri repetate cu apă distilată până când apa care se scurge de pe țesutul vegetal să fie fără impurități, limpede.

Sunt laboratoare de micropropagare in vitro cu amenajări de excepție: bioreactoarele folosite în valorificarea biomasei obținute din culturile in vitro: operatiunile din bioreactoare sunt robotizate, necesitând dotare corespunzătoare și personal bine instruit tehnic.

6.1. Planta mamă și selecționarea ei

O cultură in vitro poate fi inițiată din material vegetal recoltat de la plante din natură (frecvent utilizată) sau din plante in vitro (plantule sterile) de la care detașăm explante prin tehnica de minibutășire in vitro. O cultură in vitro poate fi înființată și din plantule regenerate in vitro, material folosit în micropropagare prin tehnica minibutășirii in vitro (secționarea în porțiuni de țesut cu păstrarea viabilității). Minibutășirea se aplicată în scopul obținerii unui număr mare de exemplare din specia respectivă, caz în care pot apărea situații mai complexe, când din materialul obținut in vitro dorim să inițiem un alt tip de cultură, cum ar fi calusul- țesut din care putem iniția o cultură de suspensii celulare (la speciile medicinale, suspensia asigură extragerea compusului activ din biomasa obținută). Pot exista situații de înființare a unei culturi de protoplaste (din frunzulițele plantulelor obținute in vitro), cultură sterilă ș.a.m.d. Înființarea unei culturi primare sau a unei subculturi trebuie să aibă în vedere următoarele: scopul urmărit, specificul și caracteristicile culturii, componența mediilor de cultură aseptice, prezența anumitor fitohormoni și concentrația acestora.

Planta din natură, asigură înființarea unei culturi noi in vitro, acest tip de cultură stând la baza tehnicii micropropagării in vitro a unei specii noi. Trebuie urmărite câteva etape legate de planta mamă, donatoarea de explante, prezentate în tabel 18.

Tabel 18 Etapele alegerii materialului biologic donator de explante și caracteristici

Noi urmărim micropropagarea unor specii de interes economic, ornamental sau a unor specii din flora spontană pentru obținerea unui număr mare de exemplare identice cu planta mamă și introducerea lor în cultură ori în arii protejate. Aspectele legate de planta mamă trebuie corelate cu factorii eco-fiziologici din camera de creștere: temperatură, umiditate, intensitatea și durata luminii (reglați în funcție de speciei). Metode de sterilizare adecvată, testarea tipului de substanță la specii sensibile, a concentrației și duratei tratamentului asigură o bună micropropagare. Găsirea metodei de sterilizare corecte duce la înlăturarea infecții care pot apărea la inoculii cultivați in vitro și la creșterea ratei de micropropagare.

6.1.1. Tipurile de explante. Însușiri morfologice

Imaginându-ne o plantă întreagă și urmărind-o de la vârf până la rădăcină, putem stabili tipurile de explante care pot fi detașate: de la vârf (apexul sau bobocul floral) și până la rădăcină, care cultivate in vitro pe medii adecvate pot genera noi plante, sau o multitudine de plante identice cu planta mamă, asigurând multiplicarea plantei și conservarea ei in vitro, iar în final, aclimatizate ex vitro, în câmp sau în zonele de origine ale speciei. Explantele detașate de la planta întreagă, conțin țesut cu capacitate proprie (diferită) de regenerare, de evoluție și dezvoltare (fig. 33). Evoluția morfogenă a tipurilor de explante cultivate in vitro este dependentă în special de specie, soi sau genul plantei, de rezerva de fitohormoni endogeni din țesutul plantei (și ea dependentă de tipul de explant, de specie, gen și soi), și nu în ultimul rând de natura și concentrația fitohormonilor prezenți în mediul de cultură aseptic. Explante sau țesuturi care se pot detașa de la o plantă sunt prezentate mai jos într-o anumită ordine (din vârf și până la sistemul radicular), explante care pot asigura un randament sporit al înmulțirii in vitro a unor specii vegetale. Explante și țesuturile pot fi următoarele:

Țesut meristematic (apex caulinar), detașat de la plantă pentru multiplicare in vitro are o dimensiune de 1-5mm: pentru obținerea de plante libere de viroze meristemul trebuie să fie foarte mic de cca. 0.5mm. Mărimea țesutului apical va asigura o regenerare și creștere rapidă a plantei, un procent de viabilitate și supraviețuire maximă a țesutului in vitro, reacție dependentă și de natura speciei. Apexul în cca. 8 săptămâni va genera plantule, complet conformate cu înălțime corespunzătoare și sistem radicular bine dezvoltate și capacitate mare de aclimatizare ex vitro asigurată de valoarea sistemului radicular. La Vitis vinifera putem afirma că explante din apex și nod de la soiurile de viță de vie, au manifestat cea mai bună capacitate de multiplicare in vitro. Evoluția apexului este determinată de balanța hormonală: una echilibrată formată de auxină și o citochinină (0,5-1mg/l) va genera plantule în funcție de specie; iar o balanță hormonal cu conținut în 2,4D și aport de BAP (cca.1,0-1,5mg/l 2,4D + 2.0mg/lBAP) va induce formarea țesutului calusal; o parte din primordiile apexului se va transforma în muguri, care detașați și subcultivați pe un mediu proaspăt echilibrat în fitohormoni, vor genera plante. Amintim astfel rezultatele cercetărilor legate de înmulțirea meristematică a unor orhidee (expl. Cymbidium), care sub acțiunea acidului β indolil acetic și a procainei, influențează pozitiv activitatea peroxidazică la nivelul protocormului de orhidee cultivat in vitro. Iar apexul caulinar detașat de la plante mature de Chrysanthemum în cca. 8- 10 săptămâni de la inocularea in vitro a regenerat plantule înrădăcinate, înalte de cca 5-8cm, cu capacitate sporită de aclimatizare.

Boboc floral de cca. 3-4 mm cultivat in vitro semnalează o evoluție dependentă de soi, de rezerva de hormoni endogeni din țesut, dar și de compoziția mediului de cultură aseptic etc. Manifestarea capacității morfogenetice a bobocului cultivat in vitro depinde foarte mult de stadiul de anteză în care s-a aflat în momentul inoculării (expl. la soiuri de Superfresia cultivată in vitro din boboc floral, în diferite stadii de anteză). Bobocul tânăr are cea mai mare capacitate de multiplicare in vitro. Folosind explante din boboc foarte tânăr cu dimensiune de 5-6mm, evoluția este bună, în funcție de soi, de condițiile de cultură in vitro. Când mediul de cultură conține doză mai mare de citochinine se diferențiază un număr mare de mugurași. Fitohormoni în doză echilibrată stimulează diferențierea unei plante neînrădăcinată: citochinină + auxină în mediu (doză mai mare: 2mg/l BAP + 0.5 mg/l AIB) generează plantule complet conformate, evoluție dependentă de natura speciei.

Diferite părți din plantă : nod, internod, porțiuni din acestea etc. sunt explante care cultivate in vitro evoluează în funcție de o mulțime de factori implicați în procesul regenerării țesutului vegetal in vitro, cum ar fi: specia, genul, starea fiziologică a plantei mame donatoare de explant, compoziția mediului, momentul prelevării țesutului etc.

Explante detașate din frunzele plantelor: nod, pețiol, nervură, teacă, porțiune din limb etc. Aceste tipuri de explante au o evoluție cu totul particulară și vom încerca să exemplificăm la câteva specii cu valoare floricolă: porțiunile din frunză au indus înmulțirea in vitro a unor specii floricole (Chrysanthemum și Saimpaulia), care cultivate pe mediu cu o balanță hormonală echilibrată (formată dintr-o auxină și o citochinină), au stimulat multiplicarea, cu regenerarea mugurilor foliari și a sistemului radicular. Cea mai mare capacitate organogenetică in vitro la Chrysanthemum s-a obținut din porțiuni de pețiol, din teaca și limb foliar (Fig. 33).

Organe de rezervă și reproducere (bulb, bulbili etc.), de la care se desprind porțiuni de solz cu o zonă de disc, care conține țesut cu capacitate sporită de regenerare și dus la regenerarea rapidă de bulbi in vitro. În zona discului diferențiază normal bulbilii.

Porțiuni din rădăcină, drajoni, marcote, tulpini subterane etc. Rădăcina are un geotropism pozitiv. Explantele din rădăcină in vitro sunt influențate de geotropism negativ (în sens invers gravitației): rădăcina in vitro poate pierde capacitatea de a percepe forța de gravitație și uneori se îndreaptă în sus spre gura flaconului, datorită nevoii de oxigen.

Cultură liberă de viroze: din meristeme mici de 0,2-0,5mm, prelevat din organe florale se prelevează în anumite stadii ale bobocului (pre-anteză).

Cultura de embrioni: prelevarea embrionilor se face din sămânța matură, iar cei imaturi din sămânță nematurizată (în primele faze de diferențiere). Evoluția organelor florale este determinată de compoziția mediului și scopul urmărit.

Fig. 33. Tipuri de explante detașate de la specia Chrysanthemum morifolium Ramat

și evoluția lor.

6.1.2. Sterilizarea țesuturilor vegetal

Nu se cunosc modele standard de sterilizare ceea ce face dificilă sterilizarea materialului vegetal: nu se pot da rețete de sterilzare a unui anumit tip de explant sau a unei anumite specii, ce se poate aprecia exact este aplicarea tratamentului de sterilizare în funcție de natura țesutului, de prezența sau absența pubescenței pe organele plantei sau a țesutului cerat. În cazul situațiilor amintite (pubescență, ceară etc.), este nevoie de o sterilizare mult mai complex: tratament chimic sau mecanic prealabil aplicat țesutului și apoi aplicarea substanțe sterilizatoare în concentrație mai mare și timp mai îndelungat de tratament.

Sterilizare este considerată o operație absolut necesară la cultura țesuturilor de plante in vitro și constă în distrugerea organismelor și sporilor de pe suprafața țesutului folosind anumite substanțe chimice, cu aplicarea unor măsuri de protejare a țesutului de agenții care pot distruge celulele componente ale țesutului, prin folosirea de soluții și timp de tratament corespunzător. Sterilizarea se aplică funcție de natura speciei, iar tatonările prealabil și repetate pot asigura un bun tratamentul în așa fel încât să nu distrugă țesutul. La aplicarea sterilizării trebuie să ținem cont de următoarele indicații:

Calitatea materialului vegetal: trebuie avut în vedere natura țesutului, consistența, juvenilitatea, pubescența etc.

Tipul de substanțe sterilizatoare: care se alege în funcție de natura țesutului.

Concentrația substanței sterilizatoare: stabilită după tatonări repetate, aplicate la un număr de specii cu constituție fiziologică diferită.

Durata tratamentului de dezinfecție a materialului vegetal: ca și în cazul punctului B și C, se ține cont de natura materialului vegetal.

Țesuturi și organe care ridică probleme speciale: necesită un tratament special prin înlăturarea prealabilă a impurităților (din sol) sau a părților afectate și mărirea suprafeței de aderare a soluției, apoi se aplică etapele de sterilizare(de la punctul F):

La tulpini sau muguri cu urme de atac de insecte, lenticele, pori de ciuperci și microorganisme, soluția se aplică în funcție de structura țesutului și intensitatea atacului: se face clătire prealabilă cu alcool, apoi soluție dezinfectată în doză și durată mai mare.

Organe cu pubescență intensă (exp. Pelargonium), prezintă inconvenientul menținerii infecțiilor la nivelul porilor și trebuie găsită formula de dezinfectat cea mai dură care să elimine sporii sau bacteriile, dar să nu afecteze țesutul (se aplică tratament mecanic, cu tatonări prealabile).

La organe cu epiderma rugoasă sau striațiuni, înaintea clătirii cu alcool se aplică un tratament mecanic cu o periuță mai dură sau pilă, care pătrunde prin striațiuni și înlătură impuritățile și spori.

La organe de rezervă care provin de la suprafața solului sau subteran (marcote, rădăcini, bulbi, bulbili, tuberculi, etc.), se aplică prealabil tratament mecanic și abia apoi se scoate țesutul din profunzime (exp. la tuberculi etc.). La bulbii și tuberobulbi se secționează organul și se pregătesc explante din solzi cu o porțiune din disc, unde este locul de diferențiere a mugurașilor sau bulbililor (organele de reproducere).

Organe cu structură sensibiliă a epidermei sau a tegumentului, cu strat de ceară pe cuticulă etc.: se înlătură tegumentului cerat pentru a se face tratamentul mecanic sau chimic și abia apoi se aplică dezinfecție chimică.

Semințe din inflorescență: la aceste tipuri de explante se aplică tratament de înmuiere prealabilă a tegumentului seminței în apă călduță.

la speciile sâmburoase (din fruct) se poate iniția o cultură de embrioni, desprinși din sămânță sau sâmbure care are un grad ridicat de sterilitate. La sâmburi se aplică și tratament mecanic (durata tratamente depinde de consistența tegumentului seminal).

Măsurile de dezinfecție a materialului vegetal cultivat in vitro, se aplică în funcție de natura, structura, starea de sănătate a plantei-mamă și de tipul de substanțe dezinfectante folosite la cultura in vitro.

Tabel 19. Substanțe chimice utilizate în dezinfecția țesuturilor vegetale cultivate in vitro

Substanțele chimice utilizate, concentrația acestor (exprimată în %) și timpul de tratament a țesutului (exprimat în minute), sunt prezentate în tabelul 19. Experiențele îndelungate privind dezinfecția materialului vegetal donator de explante au permis stabilirea eficienței fiecărei substanțe chimice dezinfectante: astfel, hipocloritul de calciu, hipocloritul de natriu, ca și apa cu brom, au efect dezinfectat foarte bun: apa oxigenate și clorura mercurică dezinfectează mulțumitor, iar antibioticele bine.

Etapele clasice ale unei sterilizări de organe sau țesuturi. În această fază se ține cont de tatonările făcute la experiențele anterioare și de literatura de specialitate. Putem indica schematic următoarele etape: • secționarea (fasonarea) în fragmente nu prea mici pentru a se aplica o înlăturare a țesutului compromis; • clătirea țesutului în alcool 70%, timp de cca.30 secunde; • introducerea în hipoclorit de calciu + o picătură de Tween 20 sau 80 (4-20% funcție de speciei); • clătiri succesive cu apă distilată sau bidistilată până la înlăturarea spumei de Tween sau impuritățile hipocloritului.

Observații asupra stării materialului vegetal sterilizat. La unele specii țesutul suferă, după aplicarea unei durate mai mari de tratament, prin apariția necrozei și a unei zone albicioase, care la contact cu aerul din boxă se poate accentua. Zona afectată se elimină prin secționare înainte de inocularea țesutului sau explantului pe mediu de cutltură, la camera sterilă. Urmează apoi fasonarea explantelor (nod, internod, apex, boboc, etc.) și se recurge la o inocularea rapidă a acestora pe mediu de cultură, pentru a nu interveni deshidratarea țesutului. Dacă țesutul a fost afectat la sterilizare după inocularea, în câteva ore se necrozează.

6.2. Operațiuni aplicate inoculilor cultivați in vitro

La operațiunea de inoculare propriu-zisă, trebuie luate niște măsuri de funcționare a laboratorului de biotehnologii vegetale, care se referă la incinta încăperii serile, la masa sau boxa de suflat aer steril, la echipamentul personalului, instrumentar etc., și obiecte utile adăpostite în boxa (și materialul vegetal sterilizat), ca de altfel toate operațiile au loc în boxă.

Camera sterilă este încăperea în care se află boxa (masa de suflat aer steril), unde se află materialul vegetal, instrumentarul și alte instrumente necesare inoculării propriu-zise. Mai este un cuier cu echipamentul pentru personal, păstrat la UV, un dulap cu materiale necesare (vată, sticlărie, instrumente etc.), măsuță pe rotile pentru ușurarea muncii și stative pentru mediu, registre și alte materiale, toate inițial păstrate la UV, cca. 20-30 minute înaintea inoculării propriu-zisă.

Echipamentul pentru utilitatea personală a operatorilor, până la inoculare se păstrează în încăperea sterilă la UV. Echipamentul constă în halate, bonete, măști, mănuși etc. aflate în incinta boxei, necesare operatorilor din incintă și pe care le îmbracă la intrare și le dezbracă la terminarea operației. Instrumentarul și alte utilități: instrumentarul necesar format din: bisturie, anse, ace, pensete, lame pentru secționarea țesutului. Apoi vas cu alcool, în care se introduc instrumentele înainte de flambare și un stativ de aluminiu (flambat inițial) pe care se plasează instrumentarul steril.

Alte materiale necesare în boxă sunt: sistemele de acoperire ale flacoanelor cu mediu (folie filmată, pătrate de plastic menținute în alcool), vată dopuri, vase Petri sterile, un Berzelius mare pentru depozitarea resturilor vegetale, vas cu alcool 70% în care se introduc instrumentele după fasonarea materialului și care se flambează din nou. Becul de gaz sau vacuum se păstrează lângă locul unde lucrează operatorul în fața lui împreună cu instrumentele (pentru flambare de câte ori este nevoie). În hotă, pe masa melaminată se află și flacoanele cu mediu introduse înaintea operației de sterilizare a materialului vegetal.

Materialul vegetal se sterilizează înainte de intrarea operatorilor în incinta sterilă și se menține la hotă. În momentul sterilizării mâinilor, operatorul principal face secționarea materialului vegetal după tipul de explant dorit (apex, nod, internod, frunză, porțiune din frunză, etc.), prin înlăturarea părții din plantă afectată de soluția dezinfectantă sau necrozată. După dimensionare, explantul se prinde în pensetă și se introduce în flaconul cu mediu, ținând cont de polaritate, apoi flaconul cu explantul se flambează la gură și se plasează opertorului numărul 2 pentru opturare. Apoi penseta se introduce în vasul cu alcool și se flambează din nou pentru a continua inocularea.

Sistemele de opturare s-au perfecționat mereu, s-a început cu dopuri de vată învelite în tifon care se autoclavau, apoi cu folie de plastic porționată în pătrate menținute în hotă (în alcool într-un vas Petri), cu alufolie etc. În ultimul timp se folosește folia de film sterilă care se pune cu partea lipicioasă pe gura flaconului, apoi se rupe și se lipește folia de pereții laterali ai flaconului cu mediu și inocul prin flambare.

Flacoanele inoculate se mențin la hotă până se notează pe eticheta flaconului câteva simboluri: varianta este trecută inițial după autoclavare, apoi simbolul speciei, data inoculării, tipul de explant. În funcție de mărimea hotei (de spațiul din hotă), flacoanele inoculate se scot din boxă la terminarea inoculării pentru a nu se introduce microbi, prin scoaterea mâinilor la exteriorul hotei, deși UV-ul a funcționat timp de 20-30minute înaintea intrării operatorilor.

Tabel 20. Prezentarea schematică a operațiunilor din hota sterilă. Inocularea

Tabelul 20 prezintă schematic operațiunile la masa de suflat aer steril într-o anumită ordine, fiecare operațiune desfășurându-se cu caracteristica ei și într-o anumită ordine. Operatorii care execută aceste operații sunt persoane (cca. 2 la număr prezente în camera sterilă, la masă), care au beneficiat de un instructaj obligatoriu de protecția muncii, pentru a evita fenomene nedorite. Trebuie să fie pregătiți pentru a acorda la nevoie primul ajutor. Prezența cutiei sanitare de prim ajutor trebuie să fie în incinta sterilă cu tot conținutul necesar.

Regimul de cultură a explantelor vegetale inoculate in vitro. După inocularea flacoanelor cu mediu împreună cu țesutul sunt păstrate în condițiile camerei de creștere (la lumină sau întuneric), în funcție de nevoile speciei și de tipul de explant, pentru a favoriza declanșarea inducției.

Regimul de lumină este de asemenea dependent de specie, de tipul de inocul și de faza de dezvoltare. Cea mai utilizată fotoperioadă este de 16 ore de lumină, urmată de 8 ore de întuneric. Flacoanele sunt păstrate în încăperi cu rafturi climatizate (fitotroane), sau în dulapuri compartimentate. Intensitatea luminoasă variază cu tipul, în funcție de inocul și scopul experimentului. Se utilizează lumină fluorescentă difuză cu intensitate de 1 Klux, dar sunt situații când în anumite faze în dezvoltarea plantelor, iluminarea poate varia între 2 până la 10 Klux. Uneori este nevoie de lumină continuă sau lumină fluorescentă cu incandescență pentru a satisface un spectru larg, dar și lumină fluorescentă roșie-violacee care influențează inducerea organogenezei inoculilor cultivați in vitro.

Regimul de temperatură în camera de creștere este situat între 24 – 25oC pentru evitarea încălzirii flacoanelor cu mediu și cu inoculii vegetali. Pentru asigurarea unui regim termic corespunzător creșterii și dezvoltării plantulelor obținute in vitro și cerinței speciilor. Plasarea flacoanelor pe rafturi se face la o anumită distanță între flacoane și între rânduri (cca. 35 cm, este spațiul cel mai bun), care permite și o captare mai bună a luminii necesară creșterii și dezvoltării țesuturilor vegetale in vitro.

Umiditatea echilibrată asigură păstrarea mediului de cultură solid sau lichid în stare bună fără deshidratarea mediului. Valorile de umiditate sunt situate la cca 50-55%.

Schimbul de gaze îl asigură difuziunea sau agitarea activă a flacoanelor. La mediile lichide se folosesc agitatoarele pe plan orizontal sau vertical.

7. Înmulțirea plantelor prin micromultiplicare in vitro

Tehnica de micropropagare in vitro la plante este metoda care asigură obținerea unui număr de plante mult mai mare ca prin oricare altă tehnică, cu scopul obținerii de plante identice cu planta mamă de la care s-a recoltat explantul (țesutul) și pe care dorim să o înmulțim in vitro. Explantele, sau țesuturile folosite pentru multiplicare in vitro a speciei dorite, pot avea origine și natură diferită. Prezentăm mai jos aceste tipuri de explante:

Țesuturi de mărime diferită. Meristemul primar, sau vârful vegetativ al plantei care se detașează din plantă la dimensiunea de cca. 0,2-03 cmØ, atunci când dorim să obținem o cultură de plante lipsite de fitopatogeni, sau poate fi ceva mai mare până în 0,5cmØ când dorim să obținem multiplicare; meristemul secundar, desprins de pe lăstari laterali care asigură același scop al multiplicării; alte țesuturi pot fi cu structură tisulară heterogenă (cambium, parenchim etc.); țesutul calusal, țesut care se formează cu mare frecvență și cu capacitate mare de proliferare in vitro. Direcția în evoluția calusului in vitro poate fi influențată de o mulțime de factori (specia, compoziția mediului, natura calusului etc.).

Organe desprinse de la planta mamă donatoare de explante după sterilizarea materialului vegetal și inoculate in vitro. Fiecare porțiune din plantă are capacitate proprie de regenerare și multiplicare in vitro și reacție diferită în funcție de o mulțime de factori (natura speciei, tipul de explant, compoziția mediului de cultură etc.). Între organe amintim: boboc floral, mugur vegetativ, frunze și porțiuni din frunze – teacă, nervuri, pețiol, nod, internod etc., floare și organe de floare etc.

Celule și protoplaste, obținute din suspensii celulare primare; protoplastele sunt celule fără perete celular cu capacitate regenerativă, evoluția lor este dependentă de: gen, specie, condiții de cultură in vitro etc.

Înmulțirea plantelor in vitro presupune două tipuri de operațiuni:

unele se desfășoară în condiții normale nesterile,

celelalte în condiții de perfectă sterilizare a atmosferei, a mediului și a materialului cu care se lucrează.

Tabel 21 Operațiuni desfășurate în regim nesteril necesare culturii in vitro

Operațiunile desfășurate în condiții clasice, nesterile sunt prezentate în tabelul 21 și constituie etape comune unei culturi in vitro: fie că sunt legate de alegerea plantei mamă donatoare de explante sau organe, alegerea mediului adecvat, selecționarea materialului diferențiat și format in vitro: pentru microbutășirea sau conservare a unor specii în colecții menținute in vitro (cu condiția de reîntinerire periodică), fie în final cu parcurgerea etapelor necesare aclimatizării în condiții ex vitro a noilor plantule. Fiecare operație din tabel este redată cu exemple la unele specii pe parcursul lucrării.

Operațiunile care necesita un mediu steril pot fi considerate cele din tabelul 22: sterilizarea materialului vegetal, a mediilor de cultură, prepararea materialului vegetal pentru inoculare (secționare, dimensionare), inocularea propriu-zisă pe medii, păstrarea în condiții sterile, alegerea materialului obținut in vitro etc.

Tabel 22. Operațiuni desfășurate în condiții sterile necesare culturii in vitro

Cultura unei plante in vitro încă din momentul înființări ei trebuie să țină cont de scopul pentru care se înființează și de importanță biologica și economică a speciei. Amintim următoarele scopuri ale tehnicii de micropropagare a unor specii in vitro:

Înființarea unei culturi in vitro în scop didactic, pe lângă licee de profil (de biologie, silvicultură, agricultură, horticultură), care sunt laboratoare demonstrative de dimensiune și capacitate mică, cu dotare sumară, pentru o instruire primară a elevilor în domeniul biotehnologiilor. Elevii pot urmării capacitatea plantei (organe, țesuturi, celule din plantă) de a se multiplica, până la obținerea unor noi plante, plecând de la un explant detașat din planta mamă, dar și alte culturii primare. Operațiunile care se desfășoară în scop didactic și care sunt simple, demonstrate pe înțelesul elevului.

Înființarea unei culturi in vitro în scopul cercetării, care se desfășoară în laboratoarul de fiziologie a plantelor din facultățile cu profil (biologie, horticultură, agricultură, silvicultură, protecția mediului) și care urmăresc unele aspecte de profunzime ale biotehnologiilor vegetale cum ar fi fenomene de morfologie, de organogeneză, embriogeneză, calusogeneză etc. in vitro, la nivelul celulei sau a țesutului speciei de plante de interes, pentru fiecare cercetător sau student care aplică metoda. Operațiunile în acest caz pot fi simple, manuale dar și semi-automatizate (cum ar fi de expl. porționarea mediului în flacoane cu ajutorul unui pistol automat, sau alte operații).

Înființarea unor culturi industriale in vitro. În acest caz cere un protocol de operații specific industrial pentru asigurarea unui număr mare de plante ex vitro, culturi elită, în câmp, pentru obținerea de producții superioare (la speciile pomicole, legumicole, viticole etc.) sau de plante cu calități valoroase sub aspectul culorii, a portului etc. (la speciile floricole și a arbuștii ornamentali). Operațiunile care se pot mecanizate sau robotizate, iar etapele premergătoare culturii in vitro propriu-zise (spălarea și dezinfecția sticlăriei, porționarea mediului în flacoane etc.) necesită dotări de profil și o specializare corespunzătoare a personalului. Tipul de cultură industrială in vitro cere uneori și alte operațiuni specifice cum ar fi: termoterapia, testarea fitosanitară (virusologică și bacteriologică) a materialului obținut in vitro.

Culturi in vitro înființate în scopul conservării speciilor de plante din flora spontană aflate în pericol de extincție. În acest caz dotările sunt cele dintr-un laborator de cercetare, dar necesită operațiunea specială de testare genetică a plantelor obținute in vitro și analiza numărului de cromozomi a speciei (pentru a urmări dacă nu s-au produs mutații), esențial pentru o specie din flora spontană.

La cel din urmă punct este necesară analiza capacității de aclimatizare a plantelor ex vitro pentru asigurarea supraviețuirii lor în ariile protejate, în zonele de origine a speciilor și în final asigurarea reconstrucției ecologice a acestor zone sau arii.

7.1. Etapele micromultiplicării speciilor de plantelor in vitro

Principalele operațiuni în procesul de micromultiplicare a unei specii vegetale in vitro sunt operațiunile preliminare culturii in vitro, înființarea propriu-zisă a culturii și a subculturii plantulelor obținute pentru multiplicarea prin microbutășirea in vitro a lor în scopul creșterii ratei de înmulțire, aclimatizarea plantulelor pentru înființarea de culturi elită în spații protejate sau în câmp. Toate operațiile amintite sunt etape care se desfășoară în condiții nesterile sau sterile fie, în funcție de specificul operației și care necesită alte sub-operații comune metodei de micromultiplicare a plantelor in vitro.

A. Operațiuni preliminare înființării unei culturi in vitro. Sunt operațiuni care se desfășoară în condiții nesterile și le grupăm astfel:

Operațiuni aplicate plantei-mamă donatoare de explante. Inițial se face o selecție a plantelor mamă din care se recoltează explantele; apoi se înființează o cultură de plante-mamă elită, care se poate păstra în spații protejate, unde primește îngrijirile necesare (lucrări agrotehice și tratamente fitosanitare (acestea din urmă dacă sunt necesare). Este esențială menținerea plantelor mamă într-un mediu controlat eco-fiziologic pentru a putea depăși primul moment foarte important, acela de recoltare a țesuturilor și a tipurilor de explante pe care dorim să le inoculăm. Sunt situații când este necesară aplicarea unui tratament termic, termoterapia pentru a stopa înmulțirea virușilor și răspândirea lor în țesuturile plantei (plantele mamă la ghivece sunt plasate in camerele de termoterapie). Planele mamă selecționate care au nevoie de termoterapie sunt păstrate în vase speciale (cu pereți dubli prin care circulă agentul frigorific care ajunge la nivelul sistemului radicular) și care asigură pe durata termoterapiei și o anumită temperatură la nivelul rădăcinii.

Bulbi, rizomi, tuberculi, marcote, lăstari donatori de butași, muguri donatori de meristeme, boboci florali, corzi de viță de vie sau de pomi fructiferi etc., considerați organe sau țesuturi de rezervă donatoare de explante, trebuie să treacă printr-o fază de repaus vegetal (perioadă de latență). Latența este ciclul natural pe care-l parcurg obligatoriu plantele în condițiile unui climat temperat continental, pentru a-și putea desfășura ciclul biologic (până la diferențierea organelor de rezervă și reproducere). Faza de repaus (de latență) se manifestă printr-o diminuare a funcțiunilor organelor și țesuturilor, fază care trebuie depășită în momentul inițierii unei culturi in vitro. Pentru a nu avea loc degradarea parțială sau totală a țesuturilor, a calității și viabilității materialului biologic, s-a urmărit periodic starea termică și hidrică la nivelul țesuturilor aflate în repaus (latență).

Operațiunea de recoltare și sterilizare a materialului vegetal. Se recoltează inițial lăstari din planta mamă în funcție de tipul de inocul pe care dorim să-l prelevăm, care se secționează în părți mai mici. De exemplu de la frunze după sterilizare în funcție de specie și natura țesutului se secționează: porțiune de limb, vârf, nervură și margine frunză, teacă.

Operațiunea de secționare și dimensionarea tipului de explant pe care dorim să-l incubăm in vitro: la țesutul meristematic, se recurge la stereomicroscop pentru a dimensiona la cca. 0,2-0,3 cmØ, din vârful de creștere principal (axilar) sau lateral. Selectarea calitativă a materialului vegetal joacă rol decisiv în cultura in vitro asigurând micro-multiplicare, obținere de calus, de suspensii celulare, plante libere de viruși (meristem de dimensiune foarte mică de ordinul milimetrilor cultivat in vitro).

Operațiunea de preparare a mediilor de cultură și sterilizarea acestora. Prepararea mediului urmărește rețeta de mediu proprie speciei, sau a unui anumit tip de explant, operațiunea desfășurându-se după scopul experimentului (regenerare, multiplicare, caulogeneză, calusogeneză etc.).

Tabel 23. Etapele operațiunilor preliminare înființării unei culturi in vitro

Sterilizarea mediului de cultura se face prin autoclavarea lui și apoi introducerea substanțelor care își pierd calitățile prin autoclavare (vitamine, FeEDTA, hormoni) prin filtru Milipore la boxă. Tabelul 23 prezintă operațiunile preliminare înființării unei culturi in vitro și caracteristicile operațiilor.

B. Înființarea propriu-zisă a unei culturi in vitro urmărește desfășurarea în condiții sterile a operațiilor care stau la baza micropropagării plantelor. Suboperațiile ce trebuie făcute sunt: inocularea propriu-zisă a explantului, urmat de perioada de incubare și creștere in vitro; trierea materialului în funcție de valoarea lui (dacă este înrădăcinat, viguros, etc.); testarea virusologică a lor etc. Acestea aplicate plantulelor obținute in vitro pot urma diferite căi în evoluția lor, unele desfășurându-se in vitro, iar altele ex vitro (tabelul 24).

Tabel 24 Căile în evoluție a culturilor de plante obținute in vitro

C. Subcultura plantulelor obținute in vitro pentru secționarea minibutășilor. Minibutășirea se face la intervale regulate de timp, în subcultură, natura butașilor joacă rol decisiv, ca și viteza de creștere a țesuturilor și evoluția inoculilor. Subculturile se aplică nu numai atunci când dorim să multiplicăm o plantulă formată in vitro, dar și în cazuri nedorite de apariție a necrozelor la nivelul plantulei, emanarea unor fenoli, creșterea exagerată a părții foliale a noilor plantule, scăderea nivelului mediului de cultură. În acestea cazuri se impune salvarea plantulelor prin subcultura lor. Subcultura se aplică și atunci când dorim să obținem alte tipuri de culturi: calus, sau țesut regenerare de plante, fiind necesare măsuri de alegere a compoziției de mediu adecvat scopului urmărit.

D. Aclimatizarea ex vitro a neo-plantulelor obținute in vitro. Etapa urmărește atât prin cultura primară cât și prin subcultura plantulelor, obținerea unei rate de aclimatizare de peste 75-85%, pentru a fie considerată eficientă și avantajoasă pentru înființarea de culturi elită (în liber sau spațiu protejat) .

8. Morfo-fiziologia țesuturilor vegetale cultivate in vitro

Capacitatea regenerativă a explantelor vegetale cultivate in vitro este diferită, în funcție de natura lor. Aceste porțiuni din planta-mamă de diferite dimensiuni, chiar celule sau țesuturi nediferențiate, se vor readapta noilor condiții in vitro, vor relua activitatea metabolică și uneori vor desfășura din nou ciclul normal de viață în condițiile controlate, cu totul noi.

Capacitatea de reluare a ciclului de viață (regenerare și diferențiere) și a explantelor cultivate in vitro depinde de o mulțime de factori dintre care natura speciei corelată cu compoziția mediului aseptic, care trebuie conceput în așa fel ca să conțină nutrienți de care specia are nevoie în condiții normale de viață.

Cea mai mare capacitate de dediferențiere și regenerativă in vitro și care se manifestă rapid este întâlnită la țesuturile meristematice, lipsa acestora fac ca procesele de diferențiere să fie lente, de lungă durată sau chiar să lipsească.

8.1. Dediferențierea și regenerarea in vitro

Modul de manifestare a explantelor sau a țesuturilor, depinde de interrelația dintre mediul lor natural de viață, existentă încă din perioada în care erau integrate în structurile proprii (la locul de origine), moștenirea genetică a plantei și a țesutului, sunt factori esențiali care influențează direct reacția de manifestare a plantei, țesutului sau celulei. Regenerarea in vitro însă depind nu numai de starea fiziologică a celulelor, de rezerva endogenă de nutrienți și de fitohormoni, ci și de anumite componente genetice și energetice, care răspund la stimulii exogeni (cum sunt adausul de fitohormoni și alte substanțe suplimentare), deblocând impulsurile interne sau externe.

Interrelația explantelor cultivate in vitro cu factorii exogeni se manifestă cu o particularitate diferită ducând la diferențe fiziologice, biochimice și chiar genetice. După dediferențierea celulară și regenerarea de noi celule in vitroevoluția poate fi dirijată spre:

formarea de culturi de celule sau suspensii celule in vitro;

diferențierea de țesut calusal in vitro (agregate de celule nediferențiate);

inducerea unor procese de morfogeneză și organogeneză in vitro.

Dediferențierea in vitro are loc în prezența stimulilor hormonali care deblochează factorii endogeni implicați în creșterea, dezvoltarea și multiplicarea celulei vegetale. Dacă acești factori hormonali lipsesc, se instalează necroza, țesutul se sclerozează, apar țesuturi cu celule îmbătrânite devreme, moarte și care împiedică alimentarea celulelor vii și dediferențierea lor. La nivelul acestor țesuturi modificate, procesele din celulă funcționează defectuos, fiind afectată respirația și nutriția țesutului și chiar fotosinteza. Ca orice țesut din plantă și celulele dediferențiate in vitro se manifestată diferit în funcție de specie, condițiile de cultură, natura explantului și a țesutului, scopul urmărit etc.

Asemănarea dintre fenomenele care au loc la nivelul celulelor diferențiate morfologic in vitro și cele care au loc la nivelul plantei întregi în condiții naturale de viață este mare atunci când se aplică înmulțirea vegetativă clasică la plantele din natură (prin butașire, marcotaj, porțiunea din organele de rezervă: bulb, rizom, tubero-bulb etc.) . Și în cazul înmulțirii clasice a plantelor, o porțiune din plantă este dislocată și stimulată pentru a se reface prin diferențierea sistemului radicular și a celorlalte organe.

Există o acțiune concertată determinată de o mulțime de factori de mediu și stimulenți pentru a declanșa o dezvoltare autonomă a țesutului desprins din planta inițială și asigurarea declanșării procesului de totipotență la nivelul celulei speciei cultivate in vitro. Putem afirma cu certitudine că la nivelul țesuturilor și celulelor cultivate in vitro procesele de diferențiere a celulei vegetale se declanșează mai facil și mai repede decât în condițiile naturale, clasice de viață, datorită faptului că procesul poate fi controlat.

Capacitatea de diferențiere celulară se manifestată diferit in vitro și se poate desfășura în etape (faze) pe care le prezentăm în tabelul 25.

Tabel 25 Etapele de diferențiere a celulelor vegetale in vitro

Regenerarea in vitro este caracteristică doar anumitor tipuri de țesuturi care manifestă în întregime totipotențialitatea in vitro. Aceste țesuturi sunt meristemoizi, conuri de creștere diferențiate in vitro cu funcțiile morfologice și care conțin celule cu anumite caracteristici, tipice celulelor meristematice și a embrionilor imaturi (peretele celular subțire, nucleul mărit, citoplansma densă și vacuole mici). Tipurile de țesuturi sau inoculi nu răspund în același mod culturii in vitro, de aceea specialiștii urmăresc să găsirea acelui tip de explant care să determine creșterea celulelor la orice valoare a factorilor din mediu, dar și să găsească cele mai eficiente metode pentru diferențierea celulei și inducerea morfogenezei la nivelul meristemoizilor. Majoritatea speciilor au un număr mic de meristemoizi, plasați neuniform la suprafața țesutului diferențiat in vitro, iar morfofuncționarea lor depinde de: natura țesutului, vârsta organelor donatoare de explante, condițiile de incubare in vitro. Capacitatea țesuturilor de a-și manifesta totipotența depinde de vârsta plantei donatoare: cu cât este mai tânără, manifestarea totipotenței este mai mare. La conținutul în meristemoizi poate fi îmbunătățit prin selecționarea lor la anumite intervale de timp pentru micromultiplicare (apexuri, butași, meristeme etc.).

Fenomenul de creștere a celulelor in vitro este dependent de factorii de mediu pe care explantul îi solicită de la incubare până la organizarea completă. Lumina și intensitatea ei sunt factori determinanți în inducerea organogenezei in vitro, stabilindu-se că un regim de 16 ore de iluminare zilnică determină dezvoltarea optimă a tipurilor de explante. Temperatura in vitro se corelează cu nevoile naturale ale speciei și cu perioada de latență, administrată pentru stimularea ciclului de viață a plantei.

Tabel 26. Țesuturile și organele regenerate in vitro și manifestarea lor

Gradul de manifestare a capacității in vitro are loc prin diferențierea diferitelor tipuri de țesuturi. Tabelul 26 prezintă tipurile de organe și țesuturi regenerate in vitro, caracteristicile și manifestarea acestor organe .

Pentru reușita unei culturi in vitro se aplică și se practică tratamente, metode și proceduri care favorizează diferențierea celulelor și a țesuturilor incubate în acest regim controlat. Amintim în principal, tratamentele termice aplicate plantelor-mamă și proceduri de juvenilizare a țesuturilor. Tratamentul termic aplicat plantelor-mamă constă în păstrarea acestora un timp la o temperatură de 5oC, sau în funcție de natura speciei în apă încălzită la 30oC, timp de cca. 40 ore, în scopul eliminării agenților contaminați cu germeni. Există o relație strânsă între localizarea explantului, organului, gradul de contaminare cu germeni fitopatogeni și condițiile ecologice de viață ale plantei mamă. Sunt unele cazuri nedorite, când avem infecții în interiorul țesutului, în vasele conducătoare: cele mai contaminate țesuturi sunt întâlnite la organele din apropierea solului sau la cele subterane. Se pot utiliza metode care se aplică înaintea inoculări cum ar fi: aplicarea unor soluții de fitohormoni sau a un regim de iluminare aplicat plantelor, cu rol de a impulsiona sau stimula benefică (atât tratamentul termic cât și pe cel luminos). Tratamentele măresc capacitatea de regenerare și multiplicare a țesutului in vitro, urmat de o evoluție favorabilă.

Juvenilizarea țesutului procedeu aplicat în scopul lăstăririi plantei, formarea de drajonii din care se desprind organe (coletul tulpinii sau trunchiului la arbori, sau decopertarea rădăcinilor). Lăstarii tineri sunt favorabili diferențierii unor plante in vitro. Îmbătrânirea naturală este un proces care se instalează în timp, nu numai cronologic, ci și datorită factorilor climatici care duc la maturarea precoce a organelor și chiar a plantei, la senescență, la stoparea ireversibilă a proceselor de creștere a celulelor. Plantele tinere și porțiunile din plantă sunt țesuturi valoroase care se dezvoltarea, creșterea și multiplică in vitro.

După inocularea și multiplicare se declanșează procesul de creștere a celulelor, comun organismelor vii, în acel moment se presupune că are loc extensia pereților celulei și mărirea volumului ei. Această extensie a peretelui celulei și creșterea în volum se desfășoară în etape, ireversibil până în momentul când ajung la dimensiunea filogeniei speciei.

Capacitatea morfofuncțională a explantelor, țesuturilor și celulelor vegetale cultivate in vitro, depinde de anumiți factori legați în principal de originea și proveniența explantelor, cum ar fi cei specificați în tabel 27.

Tabel 27 Caracteristicile și proveniența explantelor sau a țesuturilor ce se inoculează

Celula vegetală în mediu natural sau in vitro are același grad de creștere și multiplicare. In vitro creșterea începe în momentul în care este inițiat procesul regenerativ manifestat prin:

multiplicarea celulei (la celule la care se declanșează mitoza);

dediferențierea țesuturilor cu funcțiuni morfologice (nu celule meristematice);

sau declanșarea ambelor procese (multiplicare și dediferențiere), în anumite momente ale regenerării țesuturilor sau celulelor in vitro.

Creșterea dată de manifestarea celulelor poate ajunge la un anumit nivel al diferențierii morfo-structurale, mediu aseptic asigurând nutriția asemănătoare plantei cu cea din mediul natural de viață, cu modificări firești ale taliei plantelor, adaptată spațiului mic din vasul de cultură, hrănirea fiind fotomixotrofă (heterotrofă sau mixotrofă). Este foarte importantă menținerea stării juvenile a celulelor, evitarea diferențierii de conglomerate de țesuturi și celule, având în vedere stimularea multiplicării lor prin diferențierea de țesuturi meristematice și inducerea organogenezei.Starea fiziologică a țesutului detașat de la plantă din natură sau de la plantă obținută in vitro, este dată de turgescența celulelor sau a țesuturilor, stare care asigură eficiența desfășurării proceselor vitale din plantă. Deshidratarea materialului vegetal apare în momentul secționării: pentru menținerea turgescenței materialului vegetal (explantului) trebuie să se țină cont de:

Momentul optim de prelevare a materialului vegetal, dimensiunea lui și rapiditatea cu care țesutul este trecut în noul mediu de viață.

Fenofaza și stadiul de dezvoltare vegetativă, dată de sezonul de prelevare.

Reducerea traumei aplicate țesutului în momentul în care este manipulat (secționat și dimensionat), pentru inocularea propriu-zisă in vitro.

Corelarea tuturor condițiilor amintite cu factorii de mediu de care are nevoie specia pentru o stare fiziologică optimă.

Morfogeneza țesuturilor și celulelor cultivare in vitro depinde încă de o mulțime de alți factori. Mereu se pune întrebarea în ce măsură morfogeneza celulelor și țesuturilor cultivate in vitro este influențată de anumiți componenți ai mediului de cultură (expl. complexul ionic), pentru condițiile controlate in vitro sunt esențiali următorii factori:

• Aportul endogen și exogen de fitohormoni, care pot stimula sau inhiba morfogeneza;

• Săruri minerale din mediu, sursa de azot pentru stimularea embriogenezei somatice;

• Compușii organici, cu precădere aportul de aminoacizi;

• Gazele dezvoltate în mediu: natura și concentrația O2, CO2 a etilenei;

• Natura și concentrația glucidelor din mediu de cultură;

• Factorii de mediu (temperatura, lumina, umiditatea), esențiali în condițiile in vitro;

• Starea fitopatologică a țesuturilor afectează evoluția explantelor in vitro;

• Implicațiile unor adausuri suplimentare în mediu (extracte naturale, cărbune, etc.).

8.1.1. Diferențierea de țesut calusal in vitro (calusogeneza)

Obținerea de calus sau procesul de calusogenezăeste întâlnit la țesuturile sau inoculii vegetali cultivați in vitro. Dar fenomenul dediferențierea calusului in vitro este întâlnită la țesutul calusal tânăr dar și la alte tipuri de calus cum este cel tumoral sau habituat. Pentru diferențierea și formarea in vitro a calusului este necesar în prealabil un mediu solid, fie folosind agar, fie un mediu lichid la care se aplică punți (suporturi) solide sterile (din hârtie de filtru, din lufa etc.), pentru susținerea calusului la suprafața mediului, deoarece este în permanentă creștere. Țesutul calusal poate fi indus in vitro pe medii cu conținut în auxina 2.4D, sau pentru evoluția calusului se pot folosi și alte auxine și citochinine în doză mai mare. După o perioadă de cultură in vitro în masa de celule nediferențiate are loc spontan o citodiferențiere care în timp duce la formarea unor conuri meristematice pe masa de calus, cu evoluție spre organogeneză sau embriogeneză. La această evoluție contribuie în special compoziția mediului de cultură, prezența unor fitohormoni de creștere implicați în procesele de organogeneză și embriogeneză, care în final duce la formarea organelor și a plantulelor. Deci și țesutul calusal se dovedește a fi o cale favorabilă de multiplicare cu o rată sporită (datorită numărului mare de celule din țesut) a unor specii de plante de interes.

Calusul poate intra însă și într-o stare de nediferențiere sau slabă diferențiere celulară, numită și fază de remanență. În acest caz el proliferează fără a produce morfogeneză, chiar dacă inițial calusul a fost morfogen. Până în acest moment nu există o explicație științifică a lipsei de reacție a acestui țesut în direcția generării de organe (rădăcini, tulpini) sau embrioni somatici. Există și țesut calusal de tip tumoral și habitual: cel tumoral conține alături de celule diferențiate și celule nediferențiate morfofiziologic, nematurizate, iar microorganismele fitopatogene conținute au probabil capacitatea de a provoca reprogramarea genetică a celulelor: cel habituat este și el în declin, dar este în mare parte un țesut omogen pe care apar formațiuni regenerative. Prin stimularea citogenetică și morfologică la calusului tumoral se cercetează posibilitatea de normalizare a funcției celulelor acestui calus și se caută explicații privind procesele de declin a capacității morfologice și de diferențiere a acestui tip de calus.

Pentru menținerea calității țesutului periodic, masa de calus obținută in vitro trebuie fragmentată și subcultivată pe medii proaspete, cu aport diferit și proaspăt de fitohormoni, pentru întinerirea și evitarea apariției senescenței la nivelul celulelor calusului și pentru intrarea în normalitate funcțională a țesutului (citogenetică și morfogenetică). Subcultura periodică a masei de calus în condiții îmbunătățite de mediu are ca scop:

inducerea și stimularea diferențierii de conuri de creștere (meristemoizi), pentru obținerea de noi plantule „via-calus”, scop important în micromultiplicarea in vitro a speciilor mai ales a celor periclitate cu extincția;

găsirea mediului corespunzător asigurării proliferării masive a calusului, în vederea obținerii de biomasă pentru extragerea proprietăților active ale plantei;

inițierea suspensiilor celulare în mediu lichid proaspăt și îmbunătățit pentru asigurarea unei cantități sporite a biomasei.

8.2. Organogeneza la nivelul explantelor cultivate in vitro

Organogeneza in vitro la plante este un proces dependent de un complex de factori cu rol în fiecare fază a ciclului de viață al lor. În aceste noi condiții, țesutul sau explantul are nevoie de anumite cerințe fiziologice pentru a parcurge fiecare fază în evoluție. Un rol esențial îl deține aportul endogen de nutrienți și de fitohormoni. La plantele superioare aportul endogen și exogen se declanșează doar în prezența unui complex de nutrienți minerali, la lumină și în condițiile unei temperaturi optime caracteristică speciei. Existența acestor factori la parametrii optimi, declanșează reacția țesutului spre regenerarea și organogeneza in vitro.

Inducerea organogenezei in vitro se poate realiza numai prin asigurarea necesarului de nutrienți și a factorilor de mediu la valori optime, corelați cu aportul endogen de hormoni, iar în funcție de acest aport sunt suplimentați factorii exogeni (adăugați în mediu de cultură) anumiți fitohormoni. Procesul este dependent de natura plantei, de capacitatea de reacție a țesutului, cunoscut fiind că genotipul și chiar tipurile de explante au reacție diferită in vitro.

Putem conclude că bogăția endogenă în hormoni și nutrienți a țesutului inoculat sunt condiții esențiale în declanșarea procesului de morfogeneză in vitro, iar asocierea lor cu operațiuni de selecție a inoculului, se face în funcție de genotip, starea fiziologică a plantei mamă, originea și natura ei (în general cu ecologia plantei), factori decisivi în declanșarea proceselor morfologice și inducerea proceselor organogene la țesuturile cultivate in vitro.

8.2.1. Rizogeneza și caulogeneza in vitro

Rizogenezaeste procesul care are loc la nivelul inoculilor cultivați in vitro și a cărui inducere depinde de factorii hormonali endogeni auxinici implicați în declanșarea formării rădăcinilor. Explantul detașat din plantă este comparat de specialiștii cu un minibutaș cultivat in vitro, care deși foarte mic poate transmite în totalitate mesajele sau impulsurile primite (ca și în cazul butașului dintr-o cultură clasică). Minibutașul desprins de la planta mamă este lipsit de stimuli rizogeni, fiind dependent de prezența auxinelor din mediul. In vitro, evoluția minibutașului depinde în mare măsură de compoziția mediului de cultură.

Organe cultivate in vitro (muguri, boboci florali, frunze), chiar după detașarea de planta mamă, un timp sintetizează endogenic anumiți compuși hormonali. Datorită dimensiunii foarte mici a explantului, de cele mai multe ori mesajele sau stimulii primiți de la țesuturile detașate sunt diminuate sau chiar lipsesc (cum de altfel devine lipsă întregul complex de hormoni rizogeni). În acest moment intervine zestrea genetică a speciei care în dependență de vârsta plantei donatoare de explante și de starea fiziologică a țesutului și celulelor componente ale inoculului, se implică în evoluția viitoare a lui.

În subcultura explantelor detașate de la plantule obținute in vitro, se remarcă o capacitate redusă de înrădăcinare, de diferențiere a rădăcinilor. Cauza acestui fenomen de pierdere a capacității de înrădăcinare în subcultură a minibutașului și de nediferențiere a sistemului radicular, nu este cunoscută. Se ridică problema găsirii posibilităților de inducere, redobândire și păstrare a acestei capacități, a unui stimul nou care declanșează formarea rădăcinilor. La speciile lemnoase problema inducerii rizogenezei in vitro este dificilă și reală, de aceea printre procedeele aplicate explantelor lemnoase este pretratamentul auxinic (bine cunoscut și frecvent aplicat), administrându-se cea mai eficientă auxină și în doză mărită, cum ar fi de exemplu cca. 2.0-2.5 mgl/AIB, considerată doza și auxina cea mai eficientă.

Rizogeneza ca și întregul proces de organogeneză in vitro, se declanșează prin acțiunea unor factori aflați în corelație, și care induc declanșarea mesajului implicat în stimularea formării rădăcinilor. Factorii endogeni au rol esențial, dar nu numai aportul endogenic de fitohormoni se implică în acest proces, ci un complex mai larg determinat de prezența unor aminoacizi, acizi nucleici, proteine etc. care interacționează. Locul de formare a rădăcinilor este la pol (polul radicular), așa cum zona de generare a lăstarilor și mugurilor este polul opus (foliar), dar adăugarea fitohormonilor în doză mare poate perturba polaritatea. Auxina în doză moderată stimulează înrădăcinarea, dar sunt situații când procesul se declanșează și în lipsa lor, această reacție are lor și în funcție de specie, nu numai cu sprijinul auxinelor endogene.

Caulogeneza sau formarea de muguri vegetativi și de tulpinițe, este stimulată de două grupe de fitohormoni, citochinine și auxine, dar și de raportul dintre concentrația și natura acestora, deci de concentrația citohininelor și auxinelor și de natura lor. Acest lucru îi asigură o bună compoziție a mediului de cultură, care este conceput și în funcție de specie și de tipul de explant pe care îl cultivăm in vitro. Succesul procesului de caulogeneză in vitro este dat însă de asigurarea echilibrului dintre fitohormonii endogeni și adausul suplimentar de fitohormoni din mediu de cultură, ne existând o regulă legată de concentrația de fitohormoni, în special a citochininelor, în vederea declanșării caulogenezei.

Țesutul calusal evoluează spre diferențierea de muguri vegetativi în măsură mai mare, dacă după formarea calusului (pe mediu cu 2,4D) este stimulată diferențierea de embrioizi sau conuri de crește pe suprafața calusului, prin repasări succesive pe medii proaspete cu o balanță hormonală îmbunătățită în citrochinine și redusă în auxine.

Factorii de mediu externi în corelație cu tipul de explant inoculat, dar asociat și cu juvenilizarea țesutului, induc diferențierea de muguri vegetativi stimulând rata de multiplicare in vitro.

Nu se cunosc rezultate care să ateste faptul că procesul de caulogeneza depinde de fotoperioadă, însă se știe că majoritatea speciilor de plante superioare, declanșează acest proces in vitro numai la lumină.

Explantele detașate din inflorescență, după inoculare se păstrează cca. 5-6 zile la întuneric pentru declanșarea inducției florală, după care se constată diferențierea de țesut calusal, foarte rar de mugurași vegetativi și în acest caz numai la anumite specii. După perioada de întuneric, explantele se scot la lumină se pasează pe medii proaspete și îmbunătățite cu citochinine, pentru stimularea diferențierii de muguri vegetativi, sau pe medii proaspete cu 2,4D pentru îmbunătățirea proliferării calusului.

Un alt factor de mediu favorabil declanșării caulogenezei este temperatura, care pentru țesuturile vegetale trebuie să se situeze în jur de 25oC (optim pentru declanșarea morfogenezei in vitro).

Planșe 1-4. Planșa 1(foto. 1,2,3). Calus regenerativ de Arnica montana L in vitro

Foto. 1. pe mediu Murashige-Skoog cu benziladenină (BAP)

Foto. 2 și Foto. 3. cu caracteristici tipice generate pe mediu MS cu adaos de Zeatină

Planșa 2. Calus regeneratic de Rosmarinus oficinalis in vitro.

Planșa 3. Regenerativ plante de Lavanda angustifolia in vitro (Foto. 1-4)

2.

3. 4.

Foto 1,2,3,4. din calus pe MS+2mg/lglicină+1.0mg/lAIA+1.5mg/lBAP

(Lavanda angustifolia )

Planșa 4. Regenerarea de plante in vitro din calus de Dianthus calizonus pe MS+ 2.0mg/l Z+0ANA (foto.1 și 2) și spiculifolius MS+2mg/lBP+0.5mg/l AIB(foto 3, 4, 5, 6)

2.

3. 4.

5. 6.

ANEXA I. Compușii chimici din mediile de cultură

ANEXA II. Medii frecvent folosite. Autorii rețetelor de mediu

MS = Murashige- Skoog; G5 = Gamborg; W = White; LM = Llyon and MoCown; VW = Vacin and Went, Km = Kudson modified; M = Mitra et all.; NN = Nitsch and Nitsch LS=Linsmaie- Skoog; SH = Shench – Hidelbrandt

BIBLIOGRAFIE

Agud E., Savatti M., Zăpârțan M., 2008, "The Growth Hormones Involved in the In Vitro Tuberisation of Some Potato Cultivars", în : Analele Univ. Oradea, Fasci.: Prote. Med.,vol.XIII, Ed. Univ. Oradea, 1-5.

Agud E., 2009, "The in vitro multiplication of Eba potato cultivar", in : Agricultura, anul XVIII, NR.3-4 (71-72), Ed. ACADEMICPRES, Cluj-Napoca, pp.33-38.

Agud E., Zăpârțan M., Savatti M., Cap Z., 2009, "The Effect of the Photoperiod and of the Dose of Sucrose from the Environment Over some Potatoes Varieties Cultivated in Vitro", în : Anal. Univ. Oradea, Fascic: Prot. Mediu.,vol.XIV, Intern. Sym. "Risk factors for enviro. and food safety&Natur. resources and sustainable devel.", Ed. Univ. Oradea, 1-5.

Agud, E., Zăpârțan M., Savatti M., 2009, "The in vitro Regenerative Capacity of the Potato cultivars Ostara, Desiree and Eba Meristem", in : Agricultura – revistă de știin. și prac. agricolă, XVIII, nr. 1-2(69-70), Ed. ACADEMICPRES, Cluj, 51- 58.

Agud E., Zăpârțan M., Cap Z., 2010, "The in vitro tuberisation at the potato Desiree variety in mediums with phloroglucinol", "Res. Jour. of Agric. Sci." Agropri, Timișoara, 191-196.

Agud Eliza, Zăpârțan M., Timofte A., 2010, "In vitro regeneration and multiplication of the apical and nodal meristem derived from some potato cultivars", Bulletin of Univ. of agric sciences and veterinary medicine, V. 67 (1-2), Ed. ACADEMICPRES, Cluj, 351-358.

Agud E., Cap Z.,Zăpârțan M., 2010, "The aspects concerning in vitro tuberring at the potatoe varieti", în: Anal Univ. Oradea, Fas: Prot. Mediu.,vol.XV, Ed. Univ Oradea, 7-13.

Agud E., 2011"The role of natural extracts in the in vitro culture of Solanum tuberosum L. variety", în: Anal Univ. Oradea, Fas.: Protec. Mediu.,vol.XVI A, Ed. Univ Oradea, 1-8.

Agud E, 2011,"Economical methods of in vitro tuberization at Solanum Tuberosum L Variety", în: Analele Univ. Oradea, Fas.: Protec. Mediu,vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea, 1-6.

Agud, E., 2014, "Vulnerable and protected endemic species from the protected areas of Bihor County. Their conservation through in vitro multiplication", Internati. Symp. "Risk factors for environment and food safety" & "Natural resources and sustainable development", în: Anal Univ. Oradea, Fasc: Prot Mediu,vol.XXII, Ed. Univ. Oradea;

Agud E. M., Laslo, V. Zăpârțan, M., 2015, „In vitro reaction the Majorana hortensis Moen species depending on the nature of the cytochinin and the explant” în: Analale Univ. din Oradea, Fasci. Protecția Mediului, Vol. XXV, 145-154.

Agud, E., and Laslo, V., 2018, Caulogeneza, multiplicarea și calusogeneza in vitro la Pelargonium radula (Cav.) L'Hér., sub tipar în: Analale Univ. Oradea, Fasci. Prot. Mediu.

Agud E., Zăpârțan M., Timofte A., 2010, "In vitro regeneration and multiplication of the apical and nodal meristem derived from some potato cultivars", Bulletin of Univ. of agricultural sciences and veterinary medicine Cluj-Napoca, volume 67 (1-2), Ed. ACADEMICPRES, Cluj, 351-358.

Anderson,W.,1984, Primula micropropagation multiples sp. Pl. Primroses, V. 42, 2: 21-23.

Badea, M., Săndulescu, D., 2001, Biotehnologii, Ed. Fundația BIOTECH, Buc.

Bajaj, Y., 1986, In vitro preservation of genetic resources, IAEA-SM-282/66 Vienna.

Bavaru A., Godeanu S., Butnaru G și Bogdan A., 2007, Diversitatea și ocrotirea naturii, Ed. Academiei Române. București.

Berca, M. 1998, Teoria gestionării mediului și a resurselor naturale., Ed., Grand București.

Bleahu M., 2004, Arca lui Noe în sec. XXI. Ariile protejate, Ed. Național, București.

R. Blându, I. Holobiuc, 2008, Conservarea ex situ a speciilor de plante din lista roșie a plantelor superioare în România, în: al XVI-lea Simpoz Nați. de Cult. de Țesuturi și Cel. Vegetale, Clu,, Ed. Risoprint, 153-168.

Bhojwani, S.S. Razdan, M.K., 1983, Plant Tissue Culture: Teory and Practice (Elsevier, Amsterdam).

Boșcaiu, N., Coldea G., Horeanu C, 1994, Lista roșie a plantelor vasculare dispărute, periclitate, vulnerabile și rare din Flora României. Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38 (1).

Botnariu N., 2005, Evoluția sistemelor supraindividuale, Ed. Acad. Ro., București.

Boxus, P,Quoirin, M., Laine, JM., 1977, Large scale propagation of strawberry plants from tissue culture. Applied and Fundamental aspects of plant cell, tissue and Organ Culture, J. Reiner and YPS Bajaj, eds. Springer Verlan, NY, 130-143.

Bradshaw A. D., 1990, The reclamation og derelict land and the ecology pf ecosistems. In: Jordan, Gilipin, Aber (e.). Restaura Ecolog: A Symthetic Approach to Ecolog Res., Cambridge, UnivPress.

Bryant D., Nelson D., Tangley L., 1997, The Last Frontier Dorests: Ecosystems and Economies on rhe Edge. Word Resurces Institut, Washington.

Buia Al., Péterfi St., 1965, BOTANICA agricolă, vol. I. Morfolo., Ed. Agro-Silvică, Buc.

Butenko, R., Kucko, AA., 1980, Physiological aspects of procurement cultivation and hybridization of isolated protoplasts, Sov. Pl. Physiol., 26.

Cachiță, CD., 1980, Înmulțirea meristematică a orhideaelor și cercetarea modificării activității peroxidazice în protocormul de Cymbidium sub influența acidului β indolil butiric și a procainei. În: Contrib. Bot., Univ. Babeș-Bolyai, Cluj, Grădina Bot., 219-229.

Cachiță CD., Zăpârțan, M., Achim, Fl., Cristea, V., and grigoraș, St., 1985, Morfogenesis at the level of explants consisting of flowers buds, Evol. and adapta. II, Cluj, 205-213.

Cachiță, D.1987, Metode in vitro la plantele de cultură, „Baze teoretice și practice, Editura CERES, București.

Cachiță., D.. Deliu, C. Racosz L., 2004, Tratat de biotehnologie vegetală, Vol. I., Ed. Dacia, Cluj

Cachiță., D.. Ardeleanu, A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetală, V. II., Ed. Dacia, Cluj.

Catană, C. 2005, Biotehnologii celulare, Ed. RISOPRINT, Cluj-Napoca, 2005, 48-55.

Cassells, A.C., Gahan, P.B., 2006, Dictionary og Pl. Tiss. Cult., The Haworth Press, NY.

Ciobotaru, V., Socolescu, V. M. 2004,Poluarea și protecția mediului” Ed. Economică, Buc.

Damiano, C., 1980, Planning and guilding a tissue culture laboratory, in: Proceding of the Conference on Nursery production of fruit planta though tissue – application and feasibility, Ed. Zimmerman, RH., Beltsville-Maryland, USA, Science and Education.

Davies, DR., 1980, Rapid propagation of rose in vitro. Scientia Horticulture 13: 385-389

Dihoru, Ghe., Alexandrina, Dihoru, 1994, Plante rare, periclitate și endemice din flora României – Lista roșie. Acta Bot. Hort. București,173-197.

Dihoru G, Negreanu, G, 2009, Cartea roșie a plantelor vasculare din România, Ed. Academiei România.

Dihoru G., Pârvu, C., 1987, Plante endemice în flora României, Ed. CERES, București.

Dixan, R.A., 1985, Isolation and mainteance of callus and cell suspension cultures. In Plant Cell Cult. A Practi Approach (Dixon, eds.), IRL, Press, Oxford and Washington, DC,1-20.

Deliu C., Zăpârțan M., Tămaș M., 1994, In vitro regeneration, multiplication and obtainance of callus at GINKO BILOBA L., Al IV-lea Simp. de Biofarm și Farmaco., 22-23 sept. Cluj.

Dobrotă C., 2013, Fiziologia plantelor, Vol 2., Ed. RISOPRINT, Cluj-Napoca.

F. Engelman, 1997, In vitro conservation methods, in: Callow, J. A., Ford-Lloyd, B. V., Newbury, H. J., (eds.) Biotechnology and Plant genetic Resources, 119-16.

Evans, D.A., Sharp, W.R., Ammirato, P.V. Yamada, Y., (eds), Handbook of Plant Cell Culture, 1983, vol.I: Techniques for Propagation and Breeding (Macmillan, New York).

Fay, F. 1992, Conserv. of rare and endanger pl. using in vitro metho, In vitro Cell. Dev. Biol., 28.

Forman R. T., 1995, Land Mosaics: The Ecology of Landscapes and regions, Cambridge UnivPress.

Gagik, S-S., Selecyion of Media for Tissue and Cell Culture, 1-12, in: Jain, S.M., Haggman, H (eds.,), Protocols for Microp. of Woody Trees and Fruits, ed. Springer (2007).

Gahan, P.B., 2007a, Adventitious regeneration. In George, F.F., Hall. M.A.,, De Klerk, G-J., (Eds), Plant Prop. by Tissue Culture. 3rd Edition: Volume I. The Background Springer.

Gahan, P.N., 2007b. Totipotency and the cell cycle, in: Jain, S.M., Haggman, H (eds.,), Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, ed. Springer.

Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, K., 1968, Nutrient reguirements of suspension cultures of soybean root cell. Exp. Cell Res. 50, 151-158.

Gaspar, T et all., 1996, Plants hormones and plant growth regulators in plant tissue, In vitro Cell., dev. Biol., Plants 32:272-289.

Genkov, T., Soneva, P. Ivanova, I., 1997. Effect of cytokines active phenylurea derivates on shoot multiplic. peroxidase and superoxid dedismutase activities of in vitro cult. carnation, Bulg. J. Pl. Phy., 21.

George, E.F., Putlock, D.J.M., Geotge, H.J., 1987, Plant Culture Media, vol.I; Formulation and Uses (Exegetics Limited, Westbury, Wiltshire, England).

Gurdon, P.B., 1974, The Controlof of Gene Expression in Animal Develop.. Clarendon Press, Oxford.

Halmágyi A., Keul A., 2007, Conservarea resurselor genetice vegetale, Ed. Todesco, Cluj.

Heller, R.,1953, Recherches sur la nutritionminerale des tissues vegetaux cultives, in vitro. Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 14, 1-223.

Hussey, G., 1976, Totipotency in tissue culture explants and callus of some members of the Liliacae, Iridaceae, and Amarylidaceae. Jn. Exp. Bot. 216: 253-262.

Jin, S.M., Haggman, H (eds.,)2007, Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, Editura. Springer.

Johnson N. C., 1995, Biodiversity in the Balance. Approaches to Setting Geographic Conserv. Priorities. Biodiversity Support Program Corporate Press. Landover, Maryland.

De Langhe, E.A.L., 1984, The rol of in vitro techniyues in germoplasm conserv., în: Crop Genetic resour: Conserv. and Eval. Editors Holden, J.H.W., Williams, J.T., Lond,131-137.

De Klerk,,2002, Rooting of microcutings: theory and practice. In vitro Cell., Dev., Biol., Plants 38:415-422.

Kyte, L.1987, Plant from test tubes, An Introduc to Microprop, TIMBER PRESS, Portland, Oregon, 36-58.

Laslo V., Zăpârțan M., Keul, A., Timofte A., Vicas S., Bara C., Agud E., Bals C., 2010, "Capacity of in vitro regeneration of the apical and nodal tissue detached from the variety of grape-wine Fetească Neagră": Bull. of Univ. of agric. Scie. and veterinary medicine Cluj, vol. 67, Ed. ACADEMICPRES, Cluj, 388-395.

Laslo V., Zăpârțan M., Vicaș S., Agud E., 2011, "Use of nodal explants in vitro micro-propagation of Mentha Piperita L. ", în: Analele Univ. Oradea, Fasci: Pr. M,vol. XVI A, Ed. Univ. Oradea, pp.243-247.

Laslo V., Zăpârțan M., Agud E., 2011, "In vitro conservation of certain endangered and rare species of Romanian spontaneons flora", în: Anal. Univ. Oradea, Fasc : Pr. Medi,vol.XVI, Ed. Univ, 247-252.

Laslo V., Vicaș S., Zăpârțan M, Agud E, 2011"In vitro micropropagation of Caleus Blumei Benth species", Anal. Univ. Oradea, Fas. Prot Med., XVI B, Ed. Univ. Oradea, 253-259.

Laslo V., Vicaș S., Agud E., Zăpârțan M., 2011 " Methods of conservation of the plant germplasm. In vitro techniques", în: Anal. Univ. Oradea, Fasci. Pr Mediului,vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea, 697-708.

Laslo, V., 2013, BIOTEHNOLOGIILE VEGETALE și aplicațiile lor, Ed. Univ.Oradea.

Linsmaier, E.M., Skoog, F., 1965, Organic Growth factor requirements of tabacco tissue culture. Physuol. Plant. 18, 100-127.

Mann C.C., Plummer M. L., 1993, The high cost of biodiversity, Science 294;

Manoleli D., Găldeanu N., Cogălniceanu D., Nistor M., 2004, Raport de evaluare tematică privind implementarea CNDB. Ed. Focus Multimedia, București.

Margara, J., 1982, Bases de la multiplication végétatve. Le méristèmes et l ̕organofenèsie., INRA., Versailles.

McCullouch, Steven M., and Bruce A., Briggs, 1982, Preparation of plants for micropropagation. Proc. Int. Plant. Prop. Soc., 32: 297-303.

Miller K., Allegreti M.H., Johnson N., Jonsson B., 1995, Measures for Conservation of Biodiversity and sustainable use of its components:, in: Heywood W.H., (Ed.) Global Biodiv Asses. Cambridge Univ Press.

Mittermeier R.A., Myers M., Gil P.R., și Mittermeier G.,1999, Hotspots, Earth’s Richest and Most Endangered Terrestrial Ecoregions, Agrupación Sierra Madre, S.C., Mexico.

Mooney H. A., 1995, Biodiversity and ecosystem functioning basic principles 275-325, in: Heywood W.H., (Ed.) Global Biodiversity Assessment. Cambridge Univ. Press.

Morel, G., Muller, JF., 1974, La culture in vitro du meristem apical de la pomme de terre. CR., Acad., Sc. Paris 258: 5250-5252.

Murasgige T., Skoog, F., 1962 A revised medium for rapid growth and bio-assay with tabacco tissue culture, Psyiol. PLANT., 15: 473-497.

Opriș., T., 1990, Plante unice în peisajul rămânesc, Ed. Sport-Turism, București, 1990.

Panfil, D., 1980, Cultura de meristeme in vitro, Revista nr. 3 Horticultura, București.

Pollard, J.W., Walker J.M.,(eds.),1990, Plant Cell and Tissue Culture., Methods in Molecular Biology, vol. 6, Ed. Humana Press, Clifton, New Jersey.

Pop C.L., 2009, Ecologie și conservarea biodiversității, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Pierik,R.,1990, Rejuven. and microprop. Newsl. Inst. Ass. Plant Tiss. Cult. nr. 62, 11-21.

Primack R.,1998 „Essentials of Consevation Biology”, second ed., Sinauer Associates, Sunderland MA.

Primack R. Drayton, B.,1997,The experimental ecology of reintroduction, Plant Talk 11, Oct., 513-519.

Primack, R.H., 2001, „Conservarea diversității biologice”, Ed. tehnică, Buc. (traducere).

Rakosy L.,2004, Izolarea și cultura protoplastelor vegetale, în: Trat de biot veget, Vol. I Ed. Dacia, Cluj – Napoca, 362-422.

Raicu, P., Badea, M., 1985, Culturi celulare și biotehnologiile moderne, Ed. Ș. și E. Buc.

Reagan H., Colyvan M., Burgman M. 1999, A proposal for fuzzy International Union for Conservation of Nature (IUCN) categories and criteria, Biological Conserv. 92-2000;

Scott J. M., Csuti B., Davis F.,1991, Cap analiysis : An aplication of GIS for wildlife species. In Decker, Krasny, Goff, Smith și Cross (eds.)., Challenges in the Conservation of Biological Resources: A Practitioner’s Guide, pg. 167-179. Westview Press, Boulder.

Soran, V., Bândiu C., Munteanu D., 1993, Criteria for establishment of minimal and optimal areas of an effective constancy of forest ecosystems , Rev. Pădurilor, 108.

Schenk, R.U., Hildebrandt, A.C., 1972, Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures, Can. J. Bot. 50, 199-204.

Shepard, F.W., 1980, Mutant selection and plant regeneration from potato mesophyll protoplasts, In: Emergent techniques for the genetic improvement of crops, UnivPress, Minneapolis.

Shepard, J.F., 1982, The regeneration of potato plants from leaf-cell protoplasts, Scientific American, 246.

Street, HE. 1977, Plant Tissue and Cell Culture, in: Botanical Monographs. Vol II. Ed., Blackwell scientific publ., Oxford, London, Edinburgh, Melbourne.

Ștefan, N., Oprea, A., 2007, Botanica sistematică, Ed. Universității. Ioan Cuza, Iași.

Steward, F.C., 1970 From cultured cells to whole plnts: the induction ad control of their growth and differentiation. Proc. R. Soc., B. 175.

Steward, FC., Krikorian AD., 1981. Plants, Chemicals and Growth. Academic Press.

Vădineanu A., 1998. Dezvoltarea durabilă. Vol. I Teorie și practică. Ed. Univ. București.

Zăpârțan M., 1991, The in vitro reaction Superfreesia cultivars as a function of medium composition and culture conditions. Studia Universitatis, Univ. Babaș-Bolyai (Cluj-Napoca), Biologia, XXXVI, 1, 15-21.

Zăpârțan M., 1993,. Factors implied in the in vitro tuberi-zation of certain potato cultivars. în Programul și rezultatele lucrărilor Sesiunii științifice a secției de biologie, 28-29 mai., Cluj.

Zăpârțan, M., 1994, The conservation of some rare and protected plants from Romania using in vitro methodes, in: VIII-th Internati. Congres of Pl. Tiss. and Cell, Cult., Firenze.

Zăpârțan, 1995-1996, Rolul culturilor de țesuturi în conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, În: Contribuții Botanice, Cluj-Napoca.

Zăpârțan, M., Keul, A., Buzașiu, O., 2007, „Stimularea formării bulbilor in vitro la specii din familia Liliacese, în scopul înmulțirii rapide”. Simpozion de Culturi de Țesuturi și Celule, „Vitroculturile la cormofite, modele experimentale în cercetările de biologie” Ediutra Bion.

Zăpîrțan, M., 2001, Conservarea florei spontane prin înmulțire in vitro”, Ed. ALC Media Group, Cluj.

Zăpârțan M., Keul A., 2002, „ In vitro multiplication and callus induction of Syringa josikaea Jacq. endemic taxa from Romanian flora, în Contribuții Botanice, XXXVII, Grădina – Botanică „Alexandru Borza” Cluj.

Wang, PJ., Charles A., !991, Micropropagation through meristem culture. In: Biotechno in Agriculture and Forestry, Vol., 17. High – Tech and Microprop. I. Ed. Bajaj, Springer-Verlag, Berlin, 32-52.

Western D., Wright R. M., Strum S. C. (eds.), 1994, Natural Connections: Perspectives in Community-Based Conservation, Islland Press, Washington, D.C.

White, P.R., 1963, A Hanbook of Plant Tissue Culture (Jacques Cottell, Pennsylvania).

Wetherell, D., 1982, Introduction to in vitro propag. Avery Pub. Grup Inc., Wayne, NJ.

*** IUCN: International Union for the Conservation of Nature;

***Unired Nation Environm Progr; WWF: World Wildlife; Fund Soci. for Ecol Restaur, 1999;

*** RSR, T. Săvulescu, (ed.),Flora României, Vol. XIII (1974);

*** Encyclopédie universelle des 15.000 de plantes, 1999, Editor Christopher Brickell, en association avec la Royal Hort. Soc., Editura LAROUSSE-BORDAS,

PARTEA III.

CONSERVAREA și MICROPROPAGAREA in vitro a unor grupe de specii

Cunoașterea avantajelor, importanței culturilor de țesuturi și a metodei de micropropagare in vitro la plante este de actualitate și interes. Aplicabilitatea și etapele tehnicii, trebuie cunoscute și respectate: amintind avantajele, dar și a impedimentele cultura in vitro. Considerăm că trebuie respectate câteva sfaturi de care să ținem cont:

Pregătirea unui mediu aseptic complex care să asigure nutriția heterotrofă a țesutului (organ, porțiuni din organ, meristem, calus, celule etc.), cere prezența și adăugarea sursei de carbon organic accesibilă plantei.

Stimularea proceselor fiziologice la explantele detașate de la planta mamă cultivate in vitro, pentru regenerarea, creșterea, multiplicarea etc. la plante, este posibilă prin adăugarea în mediu a fitohormonilor, aplicate după concentrația și natura acestora.

Asigurarea unei sterilizări perfecte pe toată perioada de desfășurare a procesului de multiplicare a plantelor in vitro asigură succesul culturii și se face prin:

sterilizarea mediului de cultură aseptic prin autoclavare;

dezinfectarea flacoanelor de cultură și a vaselor de preparare a mediului;

sterilizarea materialului vegetal din care se detașează explantul;

sterilizarea apei pentru clătirea materialului vegetal și a sticlăriei;

dezinfecția hotei prin ștergere cu alcool și după caz flambare;

dezinfecția instrumentarului prin etuvare, introducere în alcool și flambare (operații desfășurate pe tot timpul inoculării la hota sterilă).

Controlul factorilor de mediu din camera de creștere (temperatură, lumină, umiditate): menținerea lor la valori optime, funcție de cerințele speciei și de scop.

Domeniile de aplicare a culturilor de țesuturi sunt: agricultura, horticultura, silvicultura, farmacia, industria alimentară și ușoară etc. În horticultură sunt folosite în special pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase; în agricultură, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei etc, în farmacie, pentru extragerea metaboliților secundari din calus (pentru obținerea medicamentelor), ca și în alte domenii. Sunt numeroase aplicații practice: în ameliorarea speciilor (expl. la cartof, experimentat de noi); multiplicarea genotipurilor valoroase; propagarea stocurilor de plante libere de viroze; conservarea resurselor genetice etc.. Variabilitatea somaclonală manifestată la plante in vitro, a putut fi folosită în obținerea de genotipuri valoroase.

Avantajele tehnicii de micromultiplicare in vitro sunt multiple, dar obținerea unor noi plante la standarde de calitate este esențială. Amintim următoarele avantaje:

Este o metodă care în cca. 6 luni poate duce la obținerea a peste un milion de plante identice cu planta mamă pe care dorim să o înmulțim (funcție de specie);

Asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi, clone, pornind de la o porțiune mică de țesut de ordinul milimetrilor sau celulă.

Tehnica necesită spații mici de cultură, valorificând spațiul din dotarea laborator, prin posibilitățile de creștere a culturilor pe verticală (3 – 4 nivele).

Metoda poate asigura obținerea material liber de viroze, dacă se inițiază cultura din țesut meristematic (apical sau caulinar) foarte mic, de cca. 0,5mmØ.

Plantulele multiplicate se pot menține în colecții in vitro, în laborator, conservându-le până la aclimatizarea sau comercializarea lor prestabilit.

Țesutul generativ(polen, antere) poate la plante haploide (cu „n” cromozomi).

Culturile de țesuturi pot asigura obținerea semințelor artificiale.

Prin fecundare in vitro, rezultă hibrizi interspecifici, care clasic nu se pot obține.

Tehnica in vitro poate duce la obținerea de plante rezistente la stres, boli, dăunători, la condiții meteo extreme (temperaturi extreme, furtuni etc.).

Cultura in vitro face posibilă obținerea de plante crescute pe rădăcini proprii, evitând astfel operația de grefare sau altoire.

La unele specii tehnica in vitro poate asigura multiplicarea clonală a unui portaltoi care nu înrădăcinează în cultură clasică.

Reușita culturi in vitro depinde de unele impedimente și dotări economico-administrativ care poate compromite evoluția culturii. Astfel, redăm mai jos unele dintre acestea:

Laboratorul necesită unele dotări minime: se recurge la readaptarea unui tip de laborator existent deja (de biologie, fiziologie, chimie, etc.), din centre de cercetare, Universitate, folosind aparatura și transformând utilitățile: dacă nu dispunem de clădire și de aparatură, investițiile sunt mari și nu se pot amortiza repede.

Pregătirea personalului tehnic de laborator trebuie specializat în manipularea țesutului vegetal, în cunoașterea naturii și reacției substanțelor din mediul.

Apar impedimente la procurarea fitohormonilor: sunt scumpi, ceea ce ridică prețul de cost al materialului (a plantelor, tuberculilor) obținut in vitro. Apoi impedimente datorate biologiei speciei cultivate in vitro: poate interveni caracterul recalcitrant al ei sau al soiului, manifestat prin lipsă de reacție la noile condiții de cultura in vitro.

Condițiile in vitro pot induce mutații, manifestate prin modificări ale caracteristicilor soiului sau speciei, nedorite de amelioratorii de plante.

Majoritatea studiilor efectuate în domeniul culturilor vegetale in vitro au servit la elucidarea mai multor aspecte legate de regenerarea, creșterea, organogeneza, embriogeneza somatică ș.a., a unor structuri tisulare sau tipuri celulare, în funcție de compoziția mediului de cultură și de condițiile ecofiziologice din camera de creștere. Există, însă, numeroase necunoscute create de factori implicați în morfogeneză in vitro (la nivel celular și molecular), precum și legate de transmiterea informației genetice nou dobândite.

9. Obiective și realizări în micropropagare in vitro la Solanum tuberosum L

Obținerea mini-tuberculilor la soiurile de cartof este principalul scop al înmulțirii in vitro a speciei. Fenomenul tuberizării in vitro la soiurile de cartofi autohtone și străine, conservate in vitro are în vedere extinderea în cultură a soiurilor respective. Diferențierea de tuberculi in vitro a fost urmărită în funcție de: momentul din an când s-a inițiat cultura, starea plantei mame donatoare de explante (vârsta, vigurozitatea, starea fitosanitară etc.), natura și compoziția mediului: găsirea unei formul de mediu cât mai avantajoasă (din punct de vedere a componentelor hormonale), folosind doze mici sau înlocuirea fitohormonilor cu extracte naturale și alte adausuri suplimentare: toate face tehnica avantajoasă, asigurâng preț de cost scăzut în obținerea materialului săditor (tuberculilor) Solanum tuberosum L.

Exemplificăm prin prezentăm fazele de micropropagare in vitro a soiurilor de Solanum tuberosum L (fig. 34), etape ale tehnicii din momentul inoculării explantelor (meristem, lăstar, minibutaș etc.) până în momentul tuberizării și a recoltării minituberculilor obținuți in vitro.

Fig. 34. Schema privind fazele de micopropagare (multiplicare)la Solanum tubrrodum L

Pentru înmulțirea clasică a plantelor, în general se folosesc semințe sau porțiuni mari din plantă (butași, marcote, bulbi etc.). La înmulțirea plantelor in vitro se utilizează explante (inoculi), constând din țesut meristematic, celule, organe din plantă, porțiuni de organe etc, care în condiții de cultură normală, nu ar reuși să crească, ne având capabilitatea de asigurare a nutriției proprii (să sintetizeze singure substanțele nutritive necesare). Morfogeneză și organogeneză in vitro se realizează sub influența factorilor endogeni și exogeni: conținutul endogen și adausul enzimatic au rol de reglare a regenerării in vitro (natura fitohormonilor și concentrația lor au implicație în organogeneză).

9. 1. Utilizarea culturilor in vitro în multiplicarea și ameliorarea cartofului

Acest subcapitol prezintă o sinteză a rezultatele experiențelor efectuate la specia Solanum tuberosum L, luând în studiu compartiv, evoluția in vitro a unor soiuri și cultivari străin și autohtoni de cartof. Observațiile ne-au permis să stabilim care este rezultatul multiplicării și creării de variații in vitro la cartof, să stabilim rolul și utilitatea culturilor in vitro în ameliorarea cartofului și să facem comparația privind favorabilitatea metodei pentru ambele categorii de cultivari (autohtoni și străini). S-au urmărit aspecte de regenerare și multiplicare la cartof (în funcție de soi), microtuberizarea in vitro și determinarea diversitǎții genetice și alte aspecte:

îmbunǎtǎțirea tehnologiilor de micropropagare in vitro a cartofului;

interacțiunea balanței hormonale asupra formǎrii plantulelor de cartof in vitro, a hormonilor principali (esențiali): AIB, AIA,, K, BAP, etc.;

compoziția mediile de culturǎ în raport cu cerințele nutritive ale explantelor de cartof ;

inducerea variației somaclonale in vitro la cartof;

obținerea de micro- și mini-tuberculi de cartof in vitro (material săditor);

determinarea diversitǎții genetice a cultivarelor de cartof.

Plantele mamǎ aparținând fiecărui soi de cartof au fost alese după caracteristicile de autenticitate, tipicitate și starea de sănătate pentru a nu influența negativ cultura. Tuberculii au fost forțati să lăstărească (la căldură și întuneric), din care s-au detașat lăstarii tineri, muguri dorminzi din bulbi și vîrfuri de creștere (apexuri) care s-au sterilizat conform tabel 28.

Tabel 28. Rolul agenților dezinfectanți asupra explantelor provenite de la donatori diferiți

Procentul cel mai mare de explante viabile s-a înregistrat la doza de 5% după 20 de minute de imersie în soluții. Procentul este 81-99% la hipocloritul de calciu, 92-96% la hipocloritul de sodiu, 80- 98% și cel mai bun la tratamentul cu hipoclorit de calciu + tween (92-96%). Tipul, concentrația și durata de acțiune a agenților sterilizanți asupra organelor au efect diferit. Hipocloritului de calciu sau sodiu + tween20 în concentrație de 5-10%, au dat rezultate bune. Cele mai eficiente combinații dovedindu-se hipocloritul de calciu + tween20 în concentrație de 5% cu o duratǎ a tratamentului de 20 de minute (tabel 28).

Tabel 29. Compoziția mediilor pentru cultura meristemului de cartof

(MS-după Murashige – Skoog(1962); MS1/2 cu macro și microelementele înjumătățite; K – chinetina; 2iP – izo-pentil adenina; Z – zeatina; AIB – acid indolil butiric; ANA – acid naftil acetic; AIA-acid indolil acetic)

Mediille de cultură aseptice. Pentru cultura meristemului in vitro de cartof s-a utilizat mediul de bazǎ MS, cu fitohormoni în concentrații diferite, balanța hormonală alesasă în funcție de starea fiziologicǎ a donorului din momentul explantǎrii țesuturilor (perioada din an).

9.1.1. Înmulțirea și conservarea in vitro a unor soiuri autohtone și străine de cartof

Cartoful este o plantă autogamă cu posibilități de multiplicare vegetativă. Tehnica in vitro asigură multiplicarea și stimularea tuberizării in vitro. Pe parcursul experimentelor materialul biologic utilizat a fost meristem recoltat de la patru soiuri, Ostara, Desirée, Christian, Roclas și patru populații locale: Mǎdǎraș, Miercurea Ciuc, Tușnad și Lunca de Jos (8 genotipuri), iar incidental soiul Eba. Aplicarea tehnicilor in vitro reprezintǎ o cale sigurǎ și rapidǎ pentru crearea de noi genotipuri superioare de cartof și multiplicarea acestora.

Un prim experiment la cele 8 genotipuri amintite a urmărit efectul balanței hormonale adăugată în mediul de bază MS: aleasă în așa fel încât să cuprinde citochininele: K și BAP, în aceiași concentrație (1.0mg/l) și următoarele auxien: AIB și AIA și ANA în concentrație de 0.5 mgl/l (tabel 30), deci aceleași concentrații dar tipuri diferite de hormoni.

Tabel 30. Influența AIB (0.5mg/l) asupra evoluției meristemului la cele 8 soiuri de cartof cultivate in vitro (% regenerare, calusare, înrădăcinare, organogeneză – după 35 zile)

Reacția meristemului in vitro după cca. 40 de zile, redă procentul de plante regenerate, % calusare, % înrădăcinare și valoarea organogenezei. Interacțiunea dintre hormonii utilizați și concentrația lor la înmulțirea in vitro a cultivarilor de cartof determinǎ diferențe semnificative privind rata de formare a plantulelor și a minituberculilor. S-a urmărit efectul separat al fiecărui fitohormon în mediul MS, pentru a vedea evoluția țesutului (după o lună de cultură in vitro, cca. 35 zile). Tabelul 30 prezintă evoluția meristemului de cartof la cele 8 soiuri sub influența AIB -0.5mg/l, care a influențat rizogeneza: la Ostara 32%, la Desirée 26%, iar la soiurile autohtone înrădăcinarea se situează între 24 % (la Tușnad) și cca. 21% -22% la celelalte. Cea mai mare capacitate de regenerare se obține la Desirée peste 75% (dar și la celelalte soiuri străine valorile sunt bune). La cele autohtone regenearea este sitută la toate între 70-60%. Calusarea, organogeneza și multiplicarea are loc numai în prezenta AIB.

Fig. 35. Influența acidului β-indolilbutiric (AIB) asupra soiurilor de cartoff autohtone obținute din meristem, pe mediu Murashige-Skoog: I= % regenerare; II= % calus; III = % înrăsăcinare; IV = % organogeneză.

(după cca. 35 zile)

Figura 35 redă soiurile autohtone și străine, valorile procentuale obținute sub influența AIB la cele 8 genotipuri de cartof. Înrădăcinarea la toate soiurile atinge procente uniforme de 31- 25- 22% (mai ridicate la cele străine). Pentru obținerea unor rezultate bune remarcabile trebuie introdusă în mediu o balanță hormonală echilibrată, formată dintr-o citochinină și o auxină, așa cum au demonstrat unele rezultate obținute la tuberizarea cartofului in vitro.

O altă auxină analizată, singură în mediu, a fost acidul β-indolilacetic (AIA)- 0.5 mg/l, care a favorizeazat rizogeneza, dar existând și diferențiere datorată biologiei soiurilor de cartof. Înrădăcinarea sub influența auxinei-AIA are loc într-un procent cuprins între 47-13% cu diferențe funcție de soi: cele mai bune procente se obțin la Desirée 47,0%, Christian 44,0% (autohton) și Ostara 26,0%,: valori procentuale prezentate în tabel 31.

Tabel 31. Influența AIA (0.5mg/l) asupra evoluției meristemului la cele 8 soiuri de cartof cultivate in vitro (% regenerare, calusare, înrădăcinare, organogeneză)

Dintre populațiile locale, sub influența AIA, se remarcă soiul Mǎdǎraș cu capacitate de regenerare de 67%, apoi Tușnad (63%) și Miercurea Ciuc (60%): soiurile străine ating valori ceva mai ridicate, Ostara 70% regenerare și Desirée peste 68%. Figura 36 redă influența auxinei AIA asupra genotipurilor de cartof, înrădăcinarea atinge valori peste 42% la populația autohtonă Mădăraș, iar la cele străine Desirée peste 47% (diferențe mici).

Fig. 36 Influența acidului α-indolilacetic (AIA) asupra mersistemul soiurilor autohtone și străine de cartof pe mediu de bază MS (Murashige-Skoog): I = % regenerare; II = % calus;

III = % înrădăcinare; IV = % organogeneză (după cca. 35 zile)

Putem afirma că doar o auxină în mediu (în acest caz AIA) fără alți fitohormoni stimulează doar înrădăcinarea în funcție de încărcătura biologică a populației de cartof (fie autohtonă, fie străină), fără a se semnala multiplicarea (organogeneza).

Tabel 32. Influența ANA- α-naftilacetic (0.5mg/l) asupra evoluției meristemului la cele 8 soiuri de cartof cultivate in vitro (% regenerare, calusare, înrădăcinare, organogeneză)

O altă auxină experimentată în mediul MS a fost acidului α-naftilacetic (ANA), în concentrație de 0.5 mg/l. Valorile procentuale ale evoluției meristemului la cele 8 genotipuri de cartof sunt prezentate în tabel 32. ANA se pare că favorizeazǎ pe lângǎ rizogenezǎ și calusogeneza 23-41% (diferențiere calus) la populațiile autohtone și 23-56% la cele străine (în funcție de soi). La toți parametri analizați sub influența ANA s-au remarcat soiul Ostara (57%, înrădăcinare, 56% calusare și 40% regenerare), apoi Christian urmat de Desirée: populația autohtonă Mădăraș atinge 49-45% regenerare și înrădăcinare (fig. 37). La aplicarea doar a auxinei, valoarea organogenezei și multiplicării in vitro este scăzută (din lipsa citochininelor).

Fig. 37 Influența acidului α-indolilacetic (ANA) asupra mersistemul soiurilor autohtone și străine de cartof pe mediu de bază MS (Murashige-Skoog): I = % regenerare; II = % calus;

III = % înrădăcinare; IV = % organogeneză (după cca. 35 zile)

În paralel s-a analizat și influența citochininelor: kinetină (K ) și benzilaminopurină (BAP) în mediul MS aplicate fără auxină, valorile procentuale (regenerare, calusare, înrădăcinare și multiplicare) fiind redate în tabel 33 (pentru K) și tabel 34 (pentru BAP).

Tabel 33. Influența K- 1.0mg/l asupra evoluției meristemului la cele 8 soiuri de cartof cultivate in vitro (% regenerare, calusare, înrădăcinare, organogeneză)

Influența Kinetine – 1.0mg/l la genotipurile de cartofi străine și autohtone se manifestă astfel: regenerarea este cuprinse între 42 -47% cu diferențe mici între soiuri: difernețierea de calus este între 25-35% (ușor mai ridicat la cele străine): iar organogeneza-muntiplicare atinge valori între 33- 45%, la soiurile autohtone și 41-48% la cele străine (tabel 33). În acest caz se simte lipsa auxine în mediu prin procentul de înrădăcinare redus (între 0,2 și 1,2%).

A.

B

Fig. 38 Influența kinetiei (K) asupra mersistemul soiurilor autohtone (A.)și străine (B.)de cartof pe mediu de bază MS (Murashige-Skoog): I = % regenerare; II = % calus; III = % înrădăcinare;

IV = % organogeneză (după cca. 35 zile)

Figurile 38A și B prezintă influența pe care o are chinetina (K) în mediul de bază MS asupra meristemului apical detașat de la soiurilor de cartofi experimentate. Putem afirma că prezența K în mediu (chiar singură) a favorizat valorile procentuale ale regenerării, calusării și organogene- multiplicarea, cu diferențe funcție de parametru, de natura și originea populațiilor (fig. 38A și B). În schimb rizogeneza este foarte slabă cuprinsă între 0,2 – 1,2% , fapt care certifică lipsa fitohormonului auxină din mediul de cultură. Dintre soiurile autohtone soiul Mădăraș atinge valori mai ridicate, 45% regenerare 33% calusare și 45,6% organigeneză – multiplicare (fig. 38A), înrădăcinarea fiind nesemnificativă. O altă citochinină experimentată la cele 8 genotipuri de cartofi autohtone și străine a fost BAP, aplicată în concentrație moderată de 1.0mg/l. Valorile procentuale ale parametrilor analizați după 45 de zile de cultură a meristemului de cartof sunt perzentate în tabel 34.

Tabel 34. Influența BAP- benzilaminopurinei (1.0mg/l) asupra evoluției meristemului la cele 8 soiuri de cartof cultivate in vitro (% regenerare, calusare, înrădăcinare, organogeneză)

Tabelul 34 prezintă efect superior a prezenței BAP în mediu MS față de prezența K. La soiurile autohtone regenerarea cea mai bună s-a obținut la populația Miercurea Ciuc (peste 74%), iar la celelate soiuri între 56-66%: calusarea atinge aceleași procente 16,8-17,8 %: iar organogeneza – multiplicarea între 27- 36%. Înrădăcinarea și în acest caz este slabă. La soiurile străine BAP-ul are efect uniform și anume: regenerarea are loc 58-56%; calusare 21-18%, iar organogeneza-multiplicarea între 37-38% (cu diferențe mici între soiuri). Înrădăcinarea este redusă: cuprinsă între 0,8-3,2% la soiurile autohtone și 1,2 – 4,2% la cele străine (superioară). Este posibil ca rezerva de auxină endogenă din soiurile de cartof să fie scăzută și este absolut necesar adausul de auxină sintetică pentru a stimula procesul rizogenezei. Această afirmație este susținută atât de experimentul în care în mediu există doar K sau BAP.

A.

B.

Fig. 39. Influența BAP (benzilaminopurina) asupra mersistemului soiurilor de cartof autohtone (A.) și străine (B.) pe mediu MS (Murashige-Skoog): I = % regenerare; II = % calus;

III = % înrădăcinare; IV = % organogeneză/ multiplicare (după cca. 35 zile)

Figura 39A redă influența BAP la soiurile auhtohtone, din care constatăm că regenerarea la toate depășește 62% (la Miercurea Ciuc chiar 75%), iar multiplicarea (IV) între 18- 27%, la soiul Mădăraș până la 36,6% (Soi autohton care dovedește cea mai bună reacție in vitro). Rezultate privind regenerarea meristemului de cartof in vitro sunt aceleași la aproximativ la toate soiurile străine (sub influența BAP): Ostara 56-66%, Desirée 51-66% (Fig. 39B), multiplicarea este între 37 – 38,6% (cu diferențe mici între soiuri). Efectul BAP asupra sistemului radicular la ambele categorii de soiuri este nesemnificativ: 1-3% la autohtone și 1-4% la străine. BAP-1.0mg/l în mediul MS are efect asupra organogenezei și calusogenezei mai bun decât K. Din fig 39 constatăm că BAP nu determină diferențieri genotipice mari privind caulogeneza la genotipurile de cartof. Rezultatele ne permit următoarele concluzii:

Interacțiunea dintre hormonii din mediu și concentrația acestora la soiurile de cartof determinǎ diferențe semnificative privind multiplicarea (diferențierea de plantule).

Auxina în mediul MS (fie AIB, AIA sau ANA) fără alți fitohormoni stimulează fenomenul înrădăcinării doar în funcție de încărcătura biologică a soiului de cartof..

K în mediu-1.0mg/l, a favorizat regenerării la 48-41%, calusarea la 26-34%, multiplicarea la 34-48%: valori care variază în funcție de natura și originea populației.

BAP în mediul are efect superior K stimulând în procent mai mare diferențierea și multiplicarea in vitro a țesutului meristematic la toate cele 8 genotipuri de cartof.

Se pare că rezerva de auxină endogenă este scăzută la soiurile de cartof și se poate activa doar în prezența și a altor adausuri naturale sau sintetice de fitohormoni: sunt necesare extracte naturale din plante bogate în auxină, pentru a stimula tuberizarea.

Nu este favorabilă folosirea unui sigur hormon (fie din clasa auxinelor, fie a citochininelor) deoarece influențează unilateral evoluția soiurilor de cartof..

După 45 de zile de cultură in vitro, la soiurile de cartof apar și minituberculii mai ales (la fiecare soi cu diferențe mici), la variantele cu citochinine (BAP și K).

Un alte experiment demn de semnala este cel aplicat la trei souri de cartof: Desirée, Ostara și Eba, la care s-a urmărit reacția in vitro a apexului de 0.5cm Ø (vâr de creștere desprins din bulb în condiții de lăstărire forțată), alcătuindu-se variante cu citochinine în concentrație de 0.5 și 1.0mg/l (K, BAP și Z) și o doză mică de auxina (ANA-0.01 mg/l).

Tabel 35. Capacitatea de regenerare in vitro a mersitemului apical la soiurile de cartof

Desirée, Ostara și Eba (după 50 de zile)

Variantele sunt prezentate în tabel 35 (alături de procentul de regenerare a meristemului). S-a urmărit capacitatea de regenerare și tuberizare in vitro a meristemului celor trei soiuri (Desirée, Ostara și Eba ) după 50 de zile de incubare in vitro.

Fig. 40. Procent de regenerare a soiurilor de cartof Desirée, Ostara și Eba cultivat in vitro

(după 50 zile)

Capacitățile regenerative in vitro la cele trei soiuri de cartof Desirée, Ostara și Eba sunt prezentate grafic în Fig. 40, care redă diferențele dintre soiuri. Desirée atinge cea mai mare capacitate de regenerare, valori mai ales în prezența BAP și Z – 1.0mg/l, de 80-95% (mai mare pe Z). La Ostara valorile sunt mai ceva mici 70-85%, pe ambele citochinine. La Eba valorile procentuale sunt și mai mici 60-70%: Eba are reacție in vitro inferioară celorlalte soiuri: deci remarcăm regenerare bună pe martor (MS), cu diferențe în funcție de soi.

Tabel 36. Evoluția meristemului apical a soiurilor de cartof Desirée, Ostara și Eba cultivat in vitro (după 45 zile)

După 50 de zile de cultură in vitro s-a urmărit și media valorică a numărului de plantule diferențiate din mersitem, procentul de tuberizare și numărul de tuberculi obținuți pe pantulă la cele trei soiuri de cartof: medii valorice prezentate în tabel 36.

Media numărului de plantule regenerate/meristem diferă în funcție de soi: Desirée ajunge la 22-25 plante/expl. pe mediile cu Z (S5 – S6): Ostara la 20 de plante/meristem (pe Z), iar la Eba mai mic 16-18plantule/mersitem. Pe celelalte variante media numărului de plante este la jumătate, iar la martor abia 2 plante/țesut.

Procentul de tuberizare in vitro este de asemenea diferit funcție de soi și variantă. Procentele cele mai mari se obțin pe mediile cu Zeatină (variantele S5 – S6) și sunt: 95% la Desirée, 70-89% la Ostara și 66-75% la Eba (pe celelalte variante valorile sunt inferioare). Număril de tuberculi diferențiați/plantă la Desirée ajunge la 12-14 minituberculi pe mediu cu Zeatină: pe același mediu la Ostara cca. 18-20 iar Eba abia 8-9 tuberculi. Poziția minituberculilor diferențiați pe noua plantulă este atât la nivelul nodurilor, la baza rădăcinilor dar și pe mediu de cultură, inițial cu un diametru de 3-4mmØ, cu creștere în timp.

B.

C.

Fig. 41. Evoluția meristemului apical la soiurile de cartof Desirée (A), Ostara(B) și Eba (C) cultivate in vitro (după 45 zile)

Figura 41 (A, B, C) prezintă valorile medii și procentuale ale numărului de plantule diferențiate/meriste și a numărului de minituberculi/plantă (% tuberizare). Soiul Desirée (Fig. 41A) înregistrează o curbă în creștere în funcție de parametru și cele mai bune valori. La soiul Ostara (Fig. 41B) curba are aceiași formă dar valori inferioare, iar la Eba (Fig. 41C) forma curbei se menține, dar cu valori medii și procentuale și mai mici. Diferențele între soiuri sunt semnalate și în alte exeperiențe intreprinse de noi.

S-a urmărit diferențierea de rădăcini în prezența ANA (acidul β-naftil acetic): o medie 14 răd./neopl. la Desirée, 8-10 la Ostara și 7-10 la Eba. La subcultura in vitro se cere cunoașterea evoluției soiurilor la nivelul culturilor primare. S-a evidențiat apoi capacitatea diferențiatǎ a cultivarilor de a rǎspunde culturii in vitro mai ales la soiurile omologate. În urma analizei rezultatelor la cele trei soiuri de cartof, conchidem următoarele:

Fitohormonii prezenți în mediul de cultură orienteazǎ procesele de dezvoltare a țesutului vegetal in vitro. O valoare echilibrată a raportului auxinǎ/citochininǎ favorizeazǎ multiplicarea și tuberizarea in vitro în funcție de soiul de cartof.

Mediul de culturǎ MS-1962 corespunde cerințelor nutritive ale cartofului, cu adăugarea în MS a unei surse de azot organic (glutamina) și de fosfor (NaH2PO4), la pH=5,8 – 6,5.

În procesul de multiplicare in vitro a cartofului trebuie individualizată reacția, în sensul cǎ fiecare cultivar are reacție proprie fațǎ de balanța hormonalǎ din mediu, fiecare soi este individualizat pentru o anumitǎ compoziție a mediilui.

Regenerare, multiplicare și tuberizare in vitro s-a semnalat numai pe medii cu fitohormoni, funcție de concentrația și natura lor (vezi tabel 35, 36; fig. 40 și 41A,B,C).

O altă preocuparea a constat în obținerea de calus in vitro la soiurile de cartof și stimularea diferențierii de plantule din țesutul calusal obținut. Calusul diferențiază odatǎ cu avansarea în subculturǎ dar și în anumite condiții de cultură in vitro (compoziția mediului, factorii de climă, din perioada incubării etc.). La acest țesut poate apărea fenomenul de senectute (îmbătrânire), manifestat prin proliferare din ce în ce mai scǎzutǎ. Cele mai bune rezultate în formarea calusului la cartof s-au obținut pe următorul mediu: MS + 2,4D – 4,0 mg/l + AIA- 2,2 mg/l + BAP 4 mg/l. Din calusul s-au diferențiat direct minituberculi de diferite mărimi, evoluție dependentă de perioada din an când s-a format calusul, soi și originea lui.

Tabelul 37 redă diferențierea calusului din două tipuri de explante de cartof (disc de limb folia foliar și segment din pețiol). S-a urmărit frecveța formării calusului, funcție de natura tesutului: rezultatele cele mai bune obținându-se la soiul Desirée, nu numai la diferențierea calusului ci și la alte aspecte de caulogeneză. Discuri de limb foliar de cartof pe MS, calusează în funcție de soi: 36% la Desirée; 33% la Ostara și 13% la Christian, pe mediu cu 2,4D -4,0 mg/l + ANA – 2,2 mg/l + BAP – 4 mg/l, experimentat de noi.

Tabel 37 Inducerea calusul la cartof funcție de genotip și tip de inocul (% după 6 săptămâni)

Fig. 42 Procent de calusare la soiurile de cartof (Desire. Ostara și Christian) din limb foliar și segment de pețiol

Valorile calusului diferențiat din segment de pețiol sunt inferioare limbului foliar: la Desirée este de 7%, la Ostara de 4% și la Christian de 7%. Fig. 42 prezintă valorile procentuale ale masei de calus obținută la soiuri de cartof experimentate (din disuri din limbul foliar și segmentul de pețiol): valori raportate la un număr de 50 de eșantioane din fiecare soi. Calusurile inițiate manifestǎ o puternicǎ interdependențǎ dată de natura explantului, genotip, natura și concentrația fitohormonilor din mediu, de capacitatea morfogeneticǎ a calusului, de adausurile suplimentare, extractele naturale introduse în mediu etc..

Tabelul 38 prezintă regenerarea de plante din calus la cele teri soiuri in funcție de tipul de explant. Sigurul soi care a înregistrat bună proliferare a calusului a fost Desirée din explant de limb foliar: procentul de regenerare de plantule dupǎ subculturǎ este de 8,6-27,2%, urmat de Christian cu 1,2-2,4%. Segmentul de pețiolul are evoluție slabă: Desirèe este singurul soi care înregistrează 3,3% regenerare din pețiol.

Tabel 38. Regenerarea de plante din calus la cultivarii de cartof: Desirée, Ostara, Christian

S-a urmărit inducerea variației clonale in vitro prin culturǎ de calus și s-a stabilit că apariția variației clonale depinde de genotipul de cartof, de tipul de explant, de mediul de culturǎ și de prezența regulatorilor de creștere. Atât în generarea de calus, cât și în comportamentul acestuia în subculturǎ, precum și în caulogenezǎ, combinația hormonalǎ formată din 4 mg/l 2,4D + 2,2 mg/l ANA + 2 mg/l BAP adăugată în mediul MS (1962) este cea mai eficientă. Plantulele obținute in vitro au manifestat o variabilitate crescutǎ. Limbul foliar a regenerat plante in vitro 63%, iar din pețiol 60% plante, cu un aspect normal. Plantele înrǎdǎcinate au fost plantate în serǎ, obținându-se dupǎ 4 luni de la plantare minituberculi la soiul Desirée: soiul a prezentat un numǎr de tuberculi de culoare albǎ (cunoscut fiind că Desirée are tuberculii roșii). Apariția tuberculilor albi poate fi mutații care apar în cazul culturilor in vitro datorită componentelor din mediu și condițiilor de cultură.

Tabel 39. Obținerea de minituberculi la plantulele regenerate din calus la soiul Desirée

Tabelul 39 prezintă obținerea de minituberculi din disc de limb foliar și segment de pețiol, rezultând somaclone cu tuberculi albi și roșii. Plantele regenerate din calus obținut din limb foliar au produs 26 somaclone cu tuberculi albi și doar 3 somaclone la cele provenite din pețiol au prezentat tuberculi albi. Somaclone cu tuberculi roșii a fost semnificativ mai mare: la calusul obținut din discul de limb foliar cca. 34 somaclone, iar din segment de pețiol 57 de seomaclone. Dupǎ circa o lunǎ de la plantarea în serǎ a materialului testat s-a efectuat al doilea control ELISA, constatându-se o stare fitosanitarǎ corespunzǎtoare.

Un experiment a constat în stimularea diferențierii de minituberculi in vitro pentru asigurarea materialului săditor (tuberculi) la Solanum tuberosum L și care a constitui scopul major al cercetării. Microtuberizarea reprezintǎ după unii autori faza tranzitorie între multiplicarea in vitro a materialului sǎnǎtos și înmulțirea in vivo. Pentru microtuberizarea in vitro pot fi utilizați toți microbutașii (liberi sau nu de viroze), segmentați cu un nod. Prelevarea nodurilor din tulpinițele plantulelor obținute in vitro, s-a realizat pe etajele tulpinale superioare spre inferioare, existând diferențe privind numǎrul microtuberculilor la etajul superior.

Tabel 40. Influența mediului asupra tuberizării la soiul de cartof Desirée (după cca. 60 de zile)

Tabelul 40 prezintă varantele de mediu care au avut experimentate în tuberizarea in vitro a soiurilor Desirèe, Ostara, Christian. Soiul Deirèe s-a dovedit cel mai bun, fapt pentru care îl prezentăm amănunțit. Pe V3 (MS + AIB 0.1 mg/l + K 0.1 mg/l + GA3 0.1 mg/l+ 80g/l zaharoză) soiuri Desirée a tuberizat 89%, rezultând tuberculi cu cea mai mare greutate (cca. 0,86 g/mini-tubercu). Deci soiul Desireé a avut cea mai bună reacție urmat de Ostara și apoi de Christian (soiul autohton). Mediul de bază a fost după MS -1962, microtuberizarea fiind favorizată și de prezența unei doze de 80 g/l zahǎr + kinetinǎ K – 0,1 mg/l + AIB – 0.1 mg/l + GA3 -0.1mg/l (V3), care a dus la diferențierea de minituberculi în funcție de soiul de cartof. Tabelul 40 redă și valorile procentuale ale plantelor de cartof Desitée care au diferențiat minituberculi și greutatea media a acestora minituberculi. La celelalte două soiuri Deoarece valorile la Ostara și Christian sunt mult inferioare (și pe V3) reprezentarea grafică nu este necesară. Procentul de plante obținute în vitro care au prezentat capacitate de diferențierea de mini-tuberculi la Desirée este situat între 56% până la 89%, în funcție de compoziția mediului de cultură (vezi Fig. 43).

Fig. 43. Plante care au diferențiat mini-tuberculi la soiul de cartof Desirée (%):

Media greutății mini-tuberculilor la soiul Desirée atinge 0.40 -0,48g/mini-tubercul (sub o jumătate de gram) pe mediile V1 (MS + 1.5 mg/l AIB + 1.0mg/l K + 60 g/l zaharozǎ) și V2 (MS + 1.0 mg/l AIB + 0.5mg/l K + 80 g/l zaharozǎ). Valoare dublă a mediei greutății peste 0.88 gr./mini-tubercul (aproape un gram) se înregistrează pe V3 (MS + K – 0,1 mg/l + AIB – 0.1 mg/l + GA3 -0.1mg/l), în prezența giberelinei – GA3 (vezi fig. 44).

Fig. 44. Greutatea medie a mini-tuberculilor soiului de cartof Desirée (G=grame/mini-tub.)

Putem concluziona că dintre cele trei soiuri experimentate Desirée și în acest experiment a dovedit cea mai bună reacție in vitro.

Mediul de bază MS a determinat diferențiere de mini-tuberizarea în prezența unei doze de 80 g/l zahǎr + K – 0,1 mg/l + AIB – 0.1 mg/l + GA3 -0.1mg/l (V3): a dus la diferențierea de mini-tuberculi la peste 89% din plante cu greutate de cca.1 gram.

Combinația hormonală din varianta V3 în doze moderate chiar mici (0.1mg/l) este benefică mini-tuberizării in vitro: prezența giberelinei stimulează minituberizarea.

Diferențele între genotipuri (soiuri) în procesul de tuberizare există: Desirée, Ostara și Christian, evidențiazǎ similitudine comportamentalǎ. La Desirée și Ostara pentru formarea microtuberculilor/plantǎ, este nevoie de 1,5-1,6 inoculi pentru diferențierea in vitro a unui singur tubercul; la Christian, care are o capacitate mai redusǎ de tuberizare sunt necesari 2,3 inoculi pentru formarea unui minitubercul.

Soiul Desirée a manifestat reacția cea mai bună și putem considera acest soi ca fiind un soi test privind generarea mini-tuberculilor in vitro.

Prezenței acidului giberelic (GA3 + K + AIB-0.1mg/l) în aceiași doză mică, ca și combinație de fitohormoni favorizează diferențierea de mini-tuberculi la cartof in vitro, reacție explicată prin faptul că giberelina (GA3) este implicată în scoaterea din repaus a unor specii bulboase și stimularea formării bulbilor și tubero-bulbilor

Au fost urmăriți factorii implicați în regenerarea la cartof și în diferențierea de mituberculi in vitro, cu ar fi: temperatura, umiditatea, componentele de mediu, adausurile sulimentare, efectul fotoperioadei etc., cu stabilirea rolului fiecărui factor analizat asupra evoluției in vitro a soiurilor de cartof. Controlul periodic al factorilor cu rol în multiplicarea și tuberizarea cartofului, a asigurat obținerea unui material săditor corespunzător la soiurile cultivate in vitro, stabilindu-se natura factorilor implicați în inducerea tuberizării in vitro.

Materialul de inițierea a fost explant apical (meristem apical) detașat din tuberculi maturi de la soiurile Desirée, Ostara și Eba, după lăstărire în condiții forțate (un plus de căldură și o perioadă de întuneric). S-a studiat efectul fotoperioadei și a anumitor doze de zaharoză din mediu, cca. șase variante de medii cu diferite adausuri hormonale (V0 – V6 ). Tabelul 41 prezintă compoziția mediilor experimentate, cu observații asupra evoluției, după 40 și 80 de zile in vitro. S-a analizat efectul fotoperioadei, 18 ore lumină/zi, asupra procesului de micro-tuberizare + MS + 6/ 8/10g/l zaharozǎ + 1,0mg/l Z + 0,5 mg/l AIB (V4, V5, V6) .

Tabel 41. Medii MS cu concentrație diferită de zaharoză și fotoperioadă de 18ore/zi experimentatela cartot (MS = Murashige-Skoog (1962); Z – zeatine; AIB – acid indolilbutiric

Primele măsurători și observații asupra evoluției apexului in vitro s-au făcut după 40 de zile de cultură in vitro și redate în fig. 45, doar la primele două soiuri (Desiree și Ostara), deoarece soiul Eba a înregistrat rezultate nesemnificative după această perioadă de 40 zile (considerată prea mică).

Fig. 45. Rolul fotoperioadei și a unor doze sporite de zaharoză asupra mini-tuberizării soiurilor de cartof Desirée și Ostara in vitro (după 40 de zile)

Putem aprecia faptul că la soiurile Desiree și Ostara, după 40 zile de cultută in vitro procentul de regenerare și diferențierea de mini-tuberizarea atinge valori satisfăcătoare și că doza de 8 sau 10g/l zaharoză adăugată în MS + 1.0mg/l Z + 0.5mg/l AIB (V5) a favorizat fenomenul tuberizării, fiind cea mai bună variantă la ambele soiuri (Fig. 45).

Dar timpul de incubație nu este suficient de aceia am făcut observații după 80 zile de incubare in vitro: la Desirée procentul de regenerare ajunge până la 80 -100% pe variantele cu zaharoză dar și cu amestec fitohormonal (Z-1.0mgl/+0.5mg/lAIB). Adausul de zaharoză în mediu stimulează regenerarea apexului in vitro, pe V2 (MS+8g/l zaharoză) chiar și în lipsa fitohormonilor. Însă diferențierea de mini-tuberculi are loc doar pe mediu cu fitohormoni și ajungând la 100% (MS+8g/l zaharoză+1.0mg/lZ+ 0.5mg/lAIB (V5). Pe dozele mari de zaharoză regenerarea este ceva mai scăzută (Fig. 46), iar în lipsa hormonilor tuberizarea este mică (8-30%), sau lipsește (Vo), deci este necesară prezența citochininelor în mediu MS pentru obținerea unui procent bun de tuberizare in vitro.

Fig. 46 Rolul fotoperioadei și dozele sporite de zaharoză asupra regenerării și tuberizării soiului Desirée in vitro (după 80 de zile)

Evoluția soiului Ostara este prezentată în fig. 47 și scoate în evidență efectul dozelor suplimentare de zaharoză în mediul MS: cele mai bune valori la Ostara după 80 zile sunt: 90% regenerare și 80% mini-tuberizare pe V5 (8g/lzaharoză+ 1.0mg/l Z + 0.5mg/l AIB. Parametrii analizați la Ostara ating valori inferioară față de cele ale soiul Desirée: diferențele în evoluția acestor două soiuri au fost semnalată și cu prilejul altor experimente.

Fig. 47. Rolul fotoperioadei și a unor doze de zaharoză asupra regenerării și tuberizării soiul de cartof Ostara cultivat in vitro (după 80 de zile)

Al treilea soiul Eba, abia după 80 de zile de cultură in vitro a înregistrat valori ceva mai bune. Fotoperioada influențează pozitiv procentul de regenerare la acest soi: pe V5 regenerare cel mai mare de peste 45%. La doza de 10g/l zaharoză, apare vitrificarea țesutului ceea ce frânează tuberizarea in vitro la Eba: procentul bun de tuberizare la acest soi se obține tot pe V5 – 50% și V4 – 32% . La cartof sunt cunoscute studii de înlocuire a zaharozei din mediu (cu miere, fructoză), cu rezultate bune (în funcție de natura înlocuitorului și doza folosită).

Putem concluziona că microtuberculii rezultați asigură regenerarea de plante normale:

La Desirée și Ostara s-a demonstrat efectul compoziției mediului asupra diferențierii in vitro a minituberculilor de cartof pe un mediu MS + 8 /10g/l zaharoză.

Adausul suplimentar de zahăr în mediu MS poate asigură un procent bun la regenerare și tuberizare in vitro: la Desirée între 50-100%, pe adaos de zaharoză + Z -1.0mg/l + 0.5mg/lAIB: la Ostara 40-90% regenerare și 40-80% minituberizare (în funcție de variantă). Fotoperioada + 8g/l zaharozǎ + combinația hormonală este mediul bun.

La Eba valorile sunt la jumătate față de celelalte soiuri. Pe V6 cu doza mare de zaharoză, procentul de tuberizare este mic (cca. 18%), ia pe unele plantule apare vitrificarea, fenomen care în timp frânează dezvoltarea și creșterea tuberculilor.

S-au obținut rezultate remarcabile în funcție de soi. Recomandăm asocierea fotoperioadei + 8g/l zaharoză +hormoni în doze moderate pentru tuberizarea în vitro.

Tuberizarea in vitro este o metodǎ eficace de obținere într-un timp scurt a materialului săditor: reduce timpul de producere a seminței de cartof. Obținerea lor pe medii simple fără hormoni, cu doze mici, sau cu adausuri suplimentare și extracte naturale, fac metoda economică. Înlocuirea fitohormonilor cu extracte naturale (germeni de porumb, dovlec etc.) cu proprietăți stimulatoare (datoriă fitihormonilor naturali) este o metodă benefică în inducerea minituberizării in vitro a genotipurilor de cartofi. Toate studiile de-a lungul a zece ani privind multiplicarea și ameliorarea in vitro la cartof (străin sau autohton) a plecat de la ideea că Solanum tuberosum L este a doua specie economică din lume, ca importanță și asigură alimentația a unei populații mare de pe Glob, iar în alimentația poporului român, are o importanță primordială.

La aceleași trei soiuri (Ostara, Desireé și Eba), s-a urmărit media numărului de mini-tuberculi diferențiați/meristem, în funcție de epoca de prelevare a meristemului și compoziția mediului. S-a stabilit superioritatea soiului Desireé privind reacția in vitro (regenerare, multiplicare și tuberizare): Ostara atinge valori bune, iar Eba satisfăcătoare. Astfel s-a stabilit rolul fitohormonilor în evoluția meristemului de cartof in vitro:

1. citochininele sunt absolut necesare în mediul de cultură pentru regenerării și tuberizării in vitro la cartof cu diferențe în funcție de natura și doza aplicată (BAR/ Z – 1.5 mg/l);

2. balanța hormonală care a stimulat diferențierea celui mai mare număr de tuberculi in vitro a fost: Z/2iP/BAP-1.5/2.0mg + AIB/ANA/AIA -0.5mg/l: cu o medie de 9-10 mini-tuberculi /explant la Desireé, 4-5 la Ostara și doar 2 la Eba.

Soiurile Ostara și Eba, s-au cercetat și separat urmărindu-se efectul fotoperioadei și a concentrației de zaharoză (6, 8, 10g/l zaharoză) + 1,0 mg/lZ + 0,5 mg/ AIB. Varianta cu 8g/l zaharoză + 1mg/l Z + 0,5mg/AIB(V5) a stimulat tuberizarea până la 70-80% la Ostara și cca. 35% la Eba (și în acest caz s-a constat reacția inferioară la Ostara și Eba față de Desirée). Recomandăm fotoperioadei + 8g/l zaharoză + fitohormoni pentru minituberizare in vitro.

Alte studii privind obținerea materialului săditor – tuberculii de cartofi in vitro- confirmă evoluția superioară a soiului Desirée. Astfel, am recurs la cultura apexului în alte condiții, pe MS cu adaos de Phloroglucinol un fitohormoni din grupa 1,3,5 – trihydroxibenzen cu formula [C8C3(OH)3 •2H2O] folosit pentru stimularea regenerării unor țesuturi vegetale in vitro. Este cunoscut că citochininelor pot induce tuberizarea in vitro, singure sau în combinație cu o auxină. S-a recurs la compararea efectului citochininelor + phloroglucinol (100/ 200mg/l), folosit singur sau + BAP /Z /2iP – 0.5mg/l + ANA-0.5mg/l.

După 2 luni de cultură in vitro doza de 100 mg/l Ph. s-a dovedit cea mai bună. În literatură nu s-a găsit nimic legat de implicația phloroglucinolului la cartof și am recurs la repetarea experimentul, folosind doza mică în variantele următoare:

Co= MS; C1= MS+100mg/l Ph.; C2 = MS+ 100mg/Ph + 0.5mg/lBAP + 0.5mg/lANA; C3 = MS + 100mg/Ph + 0.5mg/l2iP + 0.5mg/lANA; C4 = MS + 100mg/Ph + 0.5mg/l Z +0.5mg/lANA. După 2 luni de cultură in vitro, procentul de regenerare a apexului și media numărului de tuberculi diferențiați/plantă sunt cele din Fig. 48, 49 și 50.

Capacitatea regenerativă in vitro a apexului de cartof la Desirée pe medii cu phloroglucinol (Ph.) prezentată în fig. 48 este de 100% în prezența BAP (C2) sau Z (C4). Pe mediul cu 2iP regenerarea este inferioară, 70%, iar pe mediul numai cu Ph (C1) este 60%. Pe martor (Co) regenerarea ajunge la cca. 50% și cu un aspect neuniform al plantulelor.

Procentul de tuberizare in vitro la Desirée (Fig. 49) atinge la 99% pe mediu cu Ph + Zeatină (C4), urmat de 2iP(C3) cu regenerare la 90%. În prezența BAP (C2) tuberizarea este bună (cca.70%) dar inferioară Z și 2iP-ului. Pe mediu numai cu Ph. tuberizarea este 29%: dar în combinație cu Zeatina, determină procentul cel mai mare în evoluție.

Fig. 48 Capacitatea regenerativă in vitro a apexului de cartof (Desirée) după 2 luni

Fig. 49 Capacitatea tuberizare in vitro a apexului de cartof (Desirée) după 2 luni

Fig. 50. Media numărului de tuberculi diferențiat/plantă la soiul de cartof Desirée cultivat in vitro (după 2 luni)

Media numărului de mini-tuberculi/explant, pe mediu cu Zeatinei, ajunge la 10 tuberculi/explant (C4) urmat de C3 și C2: iar pe mediu numai cu Ph numărul este mic și neuniform. Media ceva mai mare s-a fost obținută pe variantele cu phloroglucinol doar în prezența Z (Fig. 50): după 60 de zile de cultură in vitro mini-tuberculii ajung la un diametru de 4-5mm. Timpul de tuberizare este de peste două luni, iar locul de formare a minitubercilor este de-a lungul tulpinilor (în zona nodurilor), la baza plantelor, sau sau pe mediu. Putem afirma că floroglucinolul în prezența citochininelor determină o regenerare in vitro a cartofului de 100%, manifestat în funcție de natura lor: în prezența Z sau a 2iP, stimulează organogeneza rezultând cca 40 plantule /apex, bine organizate.

S-au inițiat experiențe de înlocuire a fitohormonilor din mediu cu extracte naturale din plante, la cultura apexului (soiurile Desirée și Ostara) pe MS + extract de germeni de porumb(Ep) și dovleac (Ed) în concentrație de – 3 sau 5g / l, cu următoarele formulele de mediu: Vo = MS1/2 – martor; V1 = MS + 1.0mg/lBAP+0.5mg/l AIA; V2 = MS + 3g/l Ep.; V3 = MS + 5g/l Ep.; V4 = MS+ 3g/l Ed.; V5 = MS + 5g/l Ed. . După cca. 50 de zile de cultură in vitro, țesuturile apicale cultivate pe medii cu concentrația mare din ambele extracte (V3 și V5) tuberizează 55-70% la Desirée (Fig. 51) și 45-55% la Ostara (Fig. 52), procente înregistrate în funcție de soi și de concentrația extractului.

Implicația extractelor naturale sintetizate de la diferite specii cu proprietăți stimulatoare s-a experimentat la o mulțime de specii cu rezultate remarcabil și pot asigura o tehnologie de multiplicare in vitro economic, prin înlocuirea fitohormonilor cu aceste extracte. Extractul din germeni de porumb (Ep) a înlocuit fitohormonii din mediu cu succes obținându-se organogeneza și multiplicarea in vitro la unele specii floricole, dar și în regenerarea și multiplicarea in vitro a țesuturilor detașate de la specii din flora spontană, în ideea conservării și menținerea în colecții in vitro, (expl. Leontopodiu, Dianthus etc.).

La soiul Desirée după 50 de zile de cultură in vitro, capacitatea regenerativă a apexului ajunge la 60 și 100%, în funcție de extractului și concentrația lui, în timp ce pe proba martor are loc o regenerare de abia 25%. Din fig. 51 constatăm că procentul cel mai mare de regenerare se obține pe doza mare de Ep. 5g/l (de 100%) iar pe extract de dovleac, Ed. 5g/l de 95%. La varianta cu fitohormoni regenerarea este de peste 80% (V1), ne gândim la înlocuirea fitohormonilor din mediu pentru avantajul economic. Procentul de tuberizare in vitro la Desirée, pe mediile cu extracte ajunge la 52-66% (pe doza de 5g/l) stimulând cca. 66% tuberizare. Pe mediu doar cu citochinină și auxină V1 (MS+1.omg/lBAP+0.5mg/lAIA), tuberizarea este de 45%, poate și datorită faptului că observațiile s-au făcut cu 8-10 zile mai devreme (Fig. 51): deci extractele naturale pot grăbi evoluția țesuturilor cultivate in vitro.

Fig. 51. Regenerarea și tuberizarea in vitro la soiul de cartof Desirée pe medii cu extracte naturale (după 50 zile)

La Ostara și în acest caz valorile parametrilor sunt inferioare lui Desirée Regenerarea in vitro la Ostara pe mediile cu extracte naturale (Ep ori Ed.) atinge la 77-90% pe mediile cu extracte și 72% pe mediu numai cu fitohormoni (V1), iar pe martor este abia de 11%. La acest soi regenerarea pe doze mari de extracte este superioară, între 90-86%.

Fig. 52. Regenerarea și tuberizarea in vitro la soiul de cartof Ostara pe medii cu extracte

Procentul de tuberizare in vitro la Ostara pe mediile cu extracte este de 40-55%, iar pe varianta cu fitohormoni de 31%. Este confirmată inferioritatea soiului Ostara față de Desirée și în prezența extractelor naturale (vezi fig. 52). Rezultatele depind de soi, de natura și concentrația extractului. În prezența extractelor naturale sunt absente fenomenele nedorite ca: vitrificarea și necroza, care apar destul de frecvent în prezența unor fitohormoni chimici. Recomandăm înlocuirea hormonilor din mediul de cultură ( sunt scumpi și greu de găsit), cu extracte naturale din germeni de porumb sau dovleac în doză de 5 g/l.

S-a urmărit comportamentul in vitro a unor soiuri de cartof ameliorate în țara, în Depresiunea Ciuc: Christian și Roclas, în comparație cu soiurile străine Desirée și Ostara. Experimentul s-a inițiat toamna timpuriu (septembrie-octombrie), din tuberculi care nu au parcurs perioada de vernalizare naturală. Perioada este aleasă pentru a evidenția necesitatea vernalizării și a unei anumite perioade de cultură a cartofului in vitro. Lăstari cu 1-2 noduri (minibutaș) sau inoculat pe MS1/2 (MB) cu variantele: Co = MS ½; C1= MS ½ + 5g/l C (cărbune vegetal); C2= MS ½ + 0.5mg/l BAP + 0.5mg/l ANA; C3 = MS ½ + 0.5mg/l K +0.5mg/l ANA. Inițial doza mică de fitohormoni a favorizat regenerarea și tuberizarea in vitro.

Fig. 53. Evoluția in vitro a explantului nodal de la soiul Christian(după două lună)

Soiurile autohtone s-au comporta in vitro foarte diferit sub aspectul procentul de regenerare: Christian atinge 51-60% regenerare pe mediile cu fitohormoni (C2 și C3), superioară pe mediu cu K. (C3): pe martor (Co) este 20%, iar în prezența cărbunelui (C1) 30%. Mini-tuberculii diferențiază doar pe mediile cu fitohormoni 24 – 30% (procent bun pe mediu cu K-C3). Din fig. 53 se remarcăm valori duble pe mediile cu fitohormoni, 5-8 mini-tuberculi/explant (Christian atinge valori apropiate de soiurile străine).

Regenerarea și tuberizarea in vitro la Roclas este inferioară soiului Christian: pe mediile fără hormoni regenerarea este de 5-10%, iar cu hormoni de 30-34% (de trei ori mai mare). La Roclas apar tuberculi puțini și sporadic, 1-2 tuberculi (doar 18-20% tuberizare – fig. 54).

Fig. 54. Evoluția in vitro a explantului nodal de la soiul Roclas (după două lună)

Dintre soiurile străine Ostara are evoluție apropiată de Christian: valorile procentuale sunt prezentate în fig. 55. Regenerarea in vitro la acest soi străin ajunge la 50-61%, în prezența fitohormonilor (C2 și C3), superioare pe K.(C3), iar tuberizare 22-30%. Constatăm deci asemănare în evoluția acestui soi străin cu soiul autohton Roclas, deși putem afirma că în alte condiții regenerare la soiul Ostara este superioară valoric.

Fig. 55. Evoluția in vitro a explantului nodal de la soiul Ostara (după două lună)

Dintre cele patru soiuri de cartof cultivate in vitro, soiul Desirée a dovedit evoluția cea mai bună (Fig. 56): chiar pe mediile fără fitohormoni regenerare este de până la 40%, iar cu hormoni 79-65% . Tuberizarea in vitro este superioară: 68% pe mediu cu K (C3=Co + 0.5mg/l K +0.5mg/l ANA) și 40% pe medii cu BAP (C2 = Co + 0.5mg/l BAP + 0.5mg/l ANA).

Fig. 56. Evoluția in vitro a explantului nodal de la soiul Desirée (după două lună)

Parametrul care ne-a interesat la toate experimentele și soiurile a fost obținerea tuberculilor in vitro șa cartof și stabilirea valorii soiurilor autohtone, comparativ cu cele străine. Cele autohtone sunt cunoscute pentru valoarea lor ameliorativă și agro-fitotehnică. Tubercizarea in vitro la Christian, Roclas (autohtone) și Désirée. Ostara (străine) este reprezentată în Fig. 57. Observăm superioritatea lui Desirée (indiferent de condițiile de cultură). Ostara are tuberizare ca și Christian (cca. 10%). Tuberizare slabă înregistrează Roclas, 18-20% pe mediile cu fitohormoni și nici o tuberizare la cele fără hormoni.

Fig. 57. Procentul de tuberizare diferențiați in vitro la cele patru soiuri (după o lună)

Dintre cele patru soiuri multiplicate in vitro, soiul românesc Christian a dovedit reacția cea mai bună la tuberizarea in vitro, în prezența fitohormonilor în doze moderate. Putem concluziona că la soiurile Christian, Roclas, Ostara și Desirée prezența cărbunelui vegetal și a balanței hormonale (după două luni de incubare in vitro) a fost benefică regenerării in vitro. Tuberizarea s-a semnalat doar pe mediul cu fitohormoni (variantele C2 și C3). Perioada din an când s-a făcut inocularea nu a fost bine aleasă, dar adăugarea unor hormoni în doze mai mari pot, induce organogeneza și în această perioadă, ca și alegerea unui timp de incubare in vitro mai mare. Reducerea perioadei de obținere a materialului săditor in vitro, s-a realizat, dar în mică măsură (numărul de minituberculi fiind mai reduc decât pe medii cu citochinine și perioadă mai lungă de incubare), trebuie găsit factorul care poate induce tuberizarea și în aceste condiții. Recomandăm tratamentul plantei mamă cu perioade de temperaturi scăzute (în repaus), necesară cartofului și schimbarea perioadei de inițiere a cultuii in vitro.

Într-un alt experiment aplicat la soiurile sus amintite a urmărit tuberizarea in vitro pe mediul MS: cele mai bune rezultate s-au obținut la soiul Christian pe MS + 1.0mg/lBAP + 0.5mg/l AIB, cu organizarea completă a plantulelor obținute in vitro .

Efectul regulatorilor de creștere, în combinație cu doze de zaharoză suplimentate în mediul MS s-a analizat comparativ la soiul autohton Christian și străin Désirée. Christian a tuberizat între 15% până la 68%, dar neuniform: Désirée însă a tuberizeazat uniform pe toate variantele peste 80 %. Surplusul de zaharoza și regulatorii de creștere au influențat de asemenea dimensiunea tuberculilor. Mediul cu: 10g/l zaharoză + 1,0 mg / l Zeatin (Z) + 0,5 mg / l acid β-indolilacetic (AIB), a dat cel mai mare procent de tuberizare și cea mai mare dimensiune a tuberculilor. Cele două soiuri au evoluție bună, diferențe existând în faptul că soiul Christian tuberizează neuniform (pe un explant este o medie de 15%, iar pe un altul până la 65-68%), pe când soiul străin Desirée tuberizează uniform (cca. 80%). Neuniformitatea în evoluție s-ar putea datora și naturii explantului și dimensiunii neuniforme a lui.

Amintim studiul privind momentul din an când s-a inițiat experimentul considerat favorabil prelevării și culturii in vitro a meristemului de cartof, pentru obținerea celui mai mare procent de mini-tuberculi in vitroși asigurarea materialului săditor la soiurile de cartof. S-au ales trei perioade din an diferite (iarna, toamna, începutul primăverii) pentru cultura meristemului de cartof in vitro:

1. sfârșitul lunii decembrie (momentul declanșarea creșterii luminii- solstițiu de iarnă),

2. octombrie (perioadă de repaus vegetativ),

3. început de martie (înaintea echinocțiului de primăvară: intrarea în vegetație a

speciei): după 100 de zile de cultură in vitro concluzionăm următoarele:

a. Perioada favorabilă s-a dovedit a fi începutul lui martie când procentul de regenerare și tuberizare ajunge la 50 – 95%, dependent de prezența unor fitohormoni în mediul și de concentrația acestora (zeatina – Z, benziladenină – BAP sau giberelina – GA3).

b. Octombrie se pare nefavorabilă regenerării și tuberizării in vitro: un procent redus de regenerare, obținut într-o perioadă mai îndelungată: nici una din combinațiile hormonale nu a avut capacitatea de a scoate meristemul de cartof din repausul natural.

c. Sfârșitul lui decembrie coincide cu începutul creșterii zilei lumină și momentul ieșirii din repaus a cartofului (ca și la alte specii): perioadă stimulată de prezența citochininelor (Z/ BAP), obținând evoluție favorabile de 55-65% regenerare și tuberizare la cartofului in vitro.

Obținerea materialului de plantare (tuberculi de cartof) prin culturi mersitemului de diferite mărimi in vitro s-a devenit favorabilă înlăturării unor fenomenele nedorit, cum ar fi "degradare ecologică" și „degradarea prin îmbătrânire” , care apar la cultura clasică a cartofului și care duce la formarea de plante cu grade diferite de degenerare. Cercetătorii din domeniul ameliorării cartofului, susțin că înlăturarea degradării prin îmbătrânire se poate realiza prin întinerirea clonei de cartof. Metoda de înmulțire in vitro poate asigura această întinerire și înlătura fenomenul nedorite. În practica de producere a tuberculilor de cartof pentru consum, trebuie luate în considerare cerințele față de factorii climatici mai ales la soiurile locale dar și la cultivari aclimatizați din alte zone. Sub aspect degradării cartofului s-a experimentat soiul francez ”Santé” inițiindu-se o cultură in vitro pentru a urmări apariția fenomenului de „degradare ecologică” (la acest soi a fost semnalat fenomenul frecvent), dar a fost semnalat și la cultura clasică a unor soiuri de cartof ameliorate atât la noi în țară cât și în alte țări. Pentru a putea stabili cauzele fenomenului s-a cultivat in vitro ceva mai târziu (sfârșitul lui mai) pentru a observa dacă fenomenul apare și momentul apariției lui. Reacția soiului Santé a fost studiată după 25, 30, 60 și 90 de zile de cultură in vitro. După mai puțin de o lună (cca. 25zile), tuberizarea a fost de abia 4-10% pe toate variantele (cu 1 tubercul mici, de cca.1mm Ø): după 60 și 90 zile de cultură in vitro, s-a obținut tuberizare, între 50% – 80% (cu 4-8 tuberculi/explant). În toată perioada experimentului nu s-a constatat apariția de tuberculi cu aspect de îmbătrânire, senescentă. Deși mici, tuberculii aveau culoare caracteristică, netezi, uniformi ca mărime și aspect. Procentul de regenerare in vitro a soiului „Santé” a crescut la 100%, pe mediu MS +2mg/l 2iP+1.0mg.l AIA .

Experimentele la cartof au la bază și ideea conservării in vitro a soiurilor și populațiilor de cartof ameliorate în țară, fie din motive economice, fie ținând cont de faptul că soiurile autohtone sunt mult mai bine adaptate la clima noastră, mai rezistente la condițiile nefavorabile, semnalate din ce în ce mai des (seceta, inundați, fenomene meteo extreme, atac de boli si dăunători). Astfel, s-au studiate in vitro trei soiuri de cartof ameliorat în țară la Institutul de Cercetare a cartofilor Stupini – Brașov (în jurul anilor ̕ 80): Mureșan, Super și Caty. Reacția in vitro depinzând de soi și de mediul de cultură: metoda putând asigura material vegetal pentru înmulțire și conserva in vitro populațiile și soiurile autohtone. Este modul de a menține în cultură unele colecții de cartofi românești de interes, folosite în ameliorarea speciei Solanum tuberosum. Mureșan a dovedit cea mai bună reacție in vitro, regenerând 80%, pe mediu MS cu BAP, mini-tuberculii ajungând la 0,5 – 0,6 cmØ. Soiurilor Super și Caty au reacție inferioară soiului Mureșan, regenerând in vitro cca. 50% la Super și 22% la Caty. Soiurile de cartofi ameliorate la Brașov-Stupini au o reacție foarte diferită, manifestată în funcție de varietate și inferioară soiurile ameliorate în Harghita.

Deși cu evoluție inferioară, soiurile autohtone au o anumită valoare genetică, foarte importantă pentru cultura cartofului în spațiul geografic românesc, importante pentru lucrările de ameliorare, pentru rezistența soiurilor la boli și dăunători, și pentru capacitatea de adaptare la clima din zonele premontane din țară, destul de aspră.

În urma numărului mare de experiențe inițiate in vitro la specia Solanum tuberosum L și la un număr considerabil de soiuri, s-a putut stabili un protocol de lucru privind formarea in vitro a mini-tuberculilor de cartofi, pornind de la țesutul apical (apex) detașat din mugurii obținuți prin încolțirea forțată a tuberculilor de cartofi maturi, inițiat la un număr mai mare de soiuri și autohtoni și străini (Désirée, Ostara, Eba, Cristian, Muresan, Super și Caty). Astfel:

1. procentul de minituberizare in vitro la unele dintre aceste soiuri a fost de cca. 45%, după 2 luni și de cca. 85% după cca.3 luni (pe medii cu fitohormoni): valori dependente de soi, natura și doza fitohormonilor;

2. citokininele favorizează tuberizarea in vitro: zeatina în funcție de concentrație și soi determină formarea celui mai mare procent de tuberculi, de până la 98%;

3. reacția soiurile in vitro este foarte diferită: cele străine Désirée, Ostara ating cea mai bună capacitate de regenerare in vitro: la celelalte autohtone (Cristian, Muresan, Super și Caty) procentul de regenerarea de tuberculide cartofi este doar la jumătate;

4. se recomandă suplimentarea mediul MS cu citokinine pentru stimularea formării tuberculilor din țesut apical (care asigură calitatea superioară): procentul de tuberculi formați depinde de natura citokininei și soi. În concluzie, doza de 1 mg / l Z ori BAP și 0,5mg/l AIB are cel mai bun efect asupra tuberizării, cu rezultate în funcție de soi și doza de fitohormoni.

La soiurile de cartof înmulțite in vitro s-a stabilit capacitatea de aclimatizare la trecerea ex vitro a mini-tuberculilor obținuți in vitro. La soiuri autohtone: Mureșan, Super și Caty. procentul de aclimatizare a fost de cca. 80%, dependent în principal de mărimea mini-tuberculilor, dar și de agrotehnica aplicată la plantarea în seră sau răsadnițe.

Capacitatea de aclimatizare a materialul săditor – tuberculi – obținut in vitro după aproximativ 3 luni de cultură ex vitro depinde: • De respectarea etapelor de aclimatizare, • De soi sau de populația de cartofi, capacitatea de adaptare și evoluția la condițiile ex vitro, • De pregătirea încă in vitro printru trecerea la lumină suplimentară, • De sterilizarea solului împotriva agenților patogeni (antifungic), pentru asigurarea nutriției bune, • De diametrul tuberculilor diferențiați in vitro.

Privind aclimatizarea ex vitro putem conclude că s-a putut realiza prin transferul direct a tuberculilor în seră, sau solarii. Aclimatizarea depinde de felul cum sunt respectate etapele preliminare transferului (plantării) și de genotip sau populația de cartof. Astfel:

1. Tuberculii scoși din condițiile in vitro trebuie protejați de lumina directă o săptămână.

2. Procentul de aclimatizare la transferul ex vitro este asigurat de un diametru bun al mini-tuberculilor, mai mare de 1 cmØ, iar în cazul plantelor fără tuberculi de valoarea sistemului radicular.

3. Capacitatea mai mare de adaptare a soiurilor autohtone, se datorează faptului că acestea sunt ameliorate în condițiile climatului temperat-continental din țară. Desirée s-au adaptat în procent de 70-80% : pierderi de 20%: soiul autohton Super 95- 98% și pierderi 5%.

4. Un rol important în aclimatizare îl are amestecul de sol: recomandăm un substrat ușor și nutritiv ( amestec de turbă și mraniță), dezinfectat prealabil împotriva agenților din sol.

5. Pentru a ajuta evoluția mini-tuberculilor și multiplicarea lor în primă fază de plantare în pământ, se poate aplica un tratament auxinic după plantare (cu 200ppm/l AIB/ANA/AIA).

6. În timpul aclimatizării (în seră, solar) se aplică două tratamente: unul pentru îmbunătățirea nutriției și un alt tratament antifungic împotriva ciupercilor și bacteriilor.

Materialul obținut corespunde calității și poate fi plantat în câmp, sau comercializat, asigurând un schimb intern și extern de material săditor valoros.

Aclimatizarea ex vitro a tuberculilor la soiurile autohtone (Mureșan, Super, Caty) scoate în evidență capacitatea de adaptarea bună de 70-90% (PLANȘA I.).

Aclimatizarea și conservare in vitro a acestor soiuri depinde de natura soiului și condițiile agrotehnice (densitate/mp a minituberculilor).

Producția de minituberculi dupǎ 100 de zile de la plantarea în serǎ a plantulelor a fost influențatǎ atât de densitatea de plantare cât și de genotip. La o densitate de 200 plante/mp, numǎrul total de minituberculi a fost mai mare decât în cazul densitǎții de 100 plante/mp. În medie la 200 plante/mp se obțin 307,6 minituberculi fațǎ de 237,7 la densitatea de 100 plante/mp, cunoscut fiind importanța acestui element agrotehnic pentru cultura speciei.

PLANȘA I. Aspecte de plante de cartor și tuberculi diferențiați in vtro

Inițierea micropropagării in vitro la cartof (Solanum tuberosum L)

Ostara Desirée

Roclas Eba

Mureșan Super

Christian Christian – aclimatizat

Ostara Desirée

Multiplicarea in vitro la cartof (imagine din laborator)

Minibutășire

Minibutășirea in masă (metodă de obținerea a materialului săditor)

Minibutași în evoluție Plantulă regenersată din minibutaș

Plantule de cartof regenerate din minibutași (cu îngroșări pe rădăcini=tuberculi)

Tuberculi de cartof diferențiați in vitro Minituberculi diferențiați in vitro

(la baza plantulelor) (la bază și pe noduri)

Tuberculi detașați de la plante de cartof din in vitro

Aspect general privind mini-tuberculi obținuți in vitro la soiul Desirée

(după cca. 3,5 – 4, 0 luni)

SUS: Plante de cartof diferențiate in vitro: JOS: Plante de cartof aclimatizate în seră.

Aspectul unor plante de cartof cu tuberculii diferențiați in vitro

Plantule de cartof la ghiveci, formate din tuberculi diferențiați

in vitro și aclimatizate în seră rece

10. Micropropagarea in vitro a unor specii de plante. Generalități

Se cunosc multe consecințe ale dispariției speciilor de plante spontane: micșorarea habitatului, diminuarea rezervelor naturale, degenerarea mediului, scăderea potențialului biologic al populațiilor de plante etc. Pe Glob dispariția speciilor s-a intensificat, fiind de la 100 până la 1000 de ori mai mare (20-30% din flora mondială este în declin, una din 8 specii de plante este amenințată cu extincția) Activitatea antropică este considerată principala cauză a dispariției unor specii de plante, amenințând biodiversitatea lumii vii. Extincția unui număr mare de specii a înregistrat o rată de peste 99%. Implicarea omului în ecosistem în scopul folosirii lui a dus la simplificarea ecosistemului, la ecosisteme in care se practica momocultura.Aceste ecosisteme au un grad ridicat de vulnerabilitate la apariția speciilor invazive în terenurile agricole, la atacul agentilor fitopatogeni si al daunatorilor. Toate au efecte nedorite, speciile invazive și dăunătorii se dezvoltă foarte repede devenind rezistente la tratamentul cu erbicide, insecticide.

S-a căutat unele soluții pozitive de contracararea efectelor negative prin:

1.crearea de zone ocrotite prin diversificarea suprafețelor naturale ocrotite;

2. cercetări de sprijin al biodiversității actuale ;

3.păstrarea unor medii de viață;

4.refacerea controlată a ecosistemelor forestiere prin programe speciale;

5. păstrarea florei și faunei prin redresarea ecologică a ecosistemelor

6.trecerea la o agricultură biologică, pentru reducerea impactului substanțelor chimice de sinteză asupra produselor agricole, a ecosistemului.

Multe specii periclitate sunt menținute în starea în care se găsesc și astăzi, în ariile protejate cu valoare remarcabilă, cu programe de conservare și regulament de funcționare care interzice orice activitate care poate duce la degradarea și modificarea peisajului, a echilibrului ecologic. Speciile amenințate sunt incluse în programe de restaurare in situ, cu măsuri de conservare ex situ, într-un program de minimă protecție cu planuri: de monitorizare a habitatelor speciilor, de recuperare a speciilor și chiar de conservare ex situ.

Ne-a preocupat Rezervația Naturală Munții Apuseni, în care sunt descrise cca. 1000 plante superioare (relicte glaciare și terțiare, endemite carpatice) și specii rare pentru flora României. În România pe lângă ariile protejate sunt elaborate și reactualizate periodic listele roșii și cărțile roșii cu speciile de plante aflat în diferite stadii de periclitare, din flora spontană a țării, care evaluează starea florei, elaborate de specialiști – botaniști – care au contribuit la stabilirea ariilor și la inițierea conservării speciilor din aceste zone.

Preocupările de salvare a speciilor aflate în pericol au condus la apariția sozologiei, știința salvării organismelor periclitate. Ea propune masuri pentru conservarea, înmulțirea și prevenirea fenomenului ecofilaxie, masuri adoptate de Statele lumii prin diferite organisme. Cartea roșie cuprinde o mulțime de monografii ale speciilor cu anumit statut sozologic, ordonate alfabetic, cu numele latin. Se estimează că în ultimii 50 de ani au dispărut cca. 300.000 specii, iar între 20-40% din flora mondială este în declin, factorul antropic făcând ca una din 8 specii de plante să fie amenințată cu stingerea. Fiecare taxon a fost evaluat după ultimele categorii IUCN, existând preocupări mai ales pentru taxonii rari cu populații mici pe glob despre care nu sunt suficiente informații. Treptele sozologice după IUCN sunt prezentate în ANEXA I.

Strategiile de monitorizare și planurile de acțiune, trebuie abordate concomitent la nivel global, regional (UE), local, național. Monitorizare la nivel de individ se realizează prin conservarea ariilor protejate: in situ, realizată în mod concret prin conservarea ecosistemelor, a sanctuarelor pentru specii protejate, bănci de gene in situ etc. Ex situ, prin colecții de organisme vii (Grădini botanice, zoologice, programe de reproducere în captivitate), bănci de gene ex situ (de semințe, polen, ovule, spermă, embrioni, culturi microbiene, culturi de țesuturi și celule). Un sistem de conservare pornește de la un inventar amănunțit, cu care se pune în evidentă frecvența găsirii anumitor specii, se elaborează Liste Roșii, Roz și Albastre: criteriile de includere în Listele Roșii sunt toate reglementate pe plan internațional.

Avantajele metodei de cultură in vitro constă în faptul că pentru inițierea culturii este necesară o singură plantă, o sămânță sau un singur explant (apex, boboc, porțiune din frunză, tulpină etc.), astfel plantele din natură nu sunt afectate în urma recoltării materialului din locul de origine. Conservarea florei spontane prin înmulțirea in vitro, este de interes pentru Institutele de cercetări, cele de învățământ superior, Grădini Botanice etc. S-a inițiat micropropagarea in vitro a unor endemite și rarități din Gilău-Muntele Mare și cu grade diferite de vulnerabilitate din Piatra Craiului. Conservarea prin tehnici in vitro la plante s-a extins și la speciile bulboase și la alte elemente botanice vulnerabile. Specia Narcissus poeticus din rezervația comunei Alparia (Bihor), prezentă în poiana cu narcise, de unde publicul vizitator până nu demult o cules planta cu bulb cu tot, s-a conservat și înmulțit prin tehnica in vitro .

Metoda de conservarea in vitro se poate număra printre cele mai eficiente moduri de conservare a biodiversității plantelor, alături de: protejarea habitatelor, comunităților și ecosistemelor sănătoase, crearea de arii protejate care să funcționeze după un management efectiv și prin măsuri de conservare a zonelor (ariilor) din afara celor protejate prin lege, acțiuni cu rol de restaurare, reconstrucția comunităților și care populează habitatele degradate.

10.1. Conservarea prin micropropagare in vitro a unor specii spontane

Informațiile privind starea sozologică a speciilor este accesibila din listele și cărțile roșii, care cuprind speciile periclitate din întreaga țară, elemente endemice foarte valoroase sau unele unicate. Conservarea speciilor vulnerabile prin metode in vitro prezintă un mare interes și capătă amploare fiind experimentată inițial la speciile horticole dar și la elementele botanice din flora spontană. Avantajele metodei sunt numeroase, insistăm asupra faptului că pentru inițierea culturii este necesară o singură plantă, o sămânță, un singur explant, astfel plantele (și așa puține), nu vor fi afectate prin recoltarea lor din locul de origine. Cercetările privind tehnicile in vitro la speciile periclitate în scopul conservării lor au fost aplicate la un număr mare de specii din flora sălbatică a țării, la taxoni care se înmulțesc greu prin metoda clasică și la endemite amenințate cu extincția. Declinul biodiversității a făcut ca în ultimii 25 de ani, să fie introduse în lista roșie cca. 8.300 de specii noi de plante periclitate, habitatele naturale datorită activității omului au scăzut puternic, apreciindu-se că mai bine de 50% din specii au dispărut în aceste ultime trei decenii.

Ne-am propus să urmărim unele aspecte legate de conservarea resurselor vegetale prin încetinire sau chiar stoparea distrugerii diversității plantelor, pornind de la cele două moduri de conservare a plantelor:

in situ, cu felurite forme de conservare a resurselor în condițiile propriului areal al speciei liber sau protejat;

ex situ, prin tehnici neconvenționale de multiplicare și conservare in vitro. S-a insistat asupra metodei prezentând un protocol al înmulțirii: de la alegerea materialului vegetal, la compoziția mediului, a condițiile de creștere in vitro și de aclimatizare ex vitro.

Metoda ex situ se realizează în afara habitatelor naturale, pentru realizarea colecțiilor de plante prin metode tradiționale și moderne de conservare. Pentru speciile periclitate au fost inițiate studii în vederea elaborării unor protocoale de multiplicare (etape) și menținerii in vitro a culturii. Conservarea in vitro este legată de reacția diferitelor specii, de slaba viabilitate, de contaminarea endogenă etc.. Metodele de conservare ex situ, tradiționale sau moderne sunt prezentate în ANEXA IV. Cele tradiționale au contribuit la conservarea patrimoniului vegetal dar au devenit insuficiente, nu au putut cuprinde toată diversitatea, ducând la pierderea unor specii mai puțin rezistente (uneori imposibil de recuperat), născându-se astfel nevoia aplicării metodele neconvenționale. Metoda ex situ urmărește refacerea unor populații de specii amenințate, prin măsuri luate într-o altfel de ambianță ecologică, decât cea din habitatul natural.

Condițiile de cultura in vitro pot acționa ca factor traumatizant, si pot induce variabilitate somaclonală. CBD susține cercetări în ecologie, sistematică, taxonomie etc., stabilind protocoale de conservare a speciilor. Tehnica in vitro are două faze: A) inițierea culturii in vitro; B) dirijarea culturii în funcție de metoda aplicată. Metoda în funcție de durata conservării se realizează prin:

conservarea pe o perioadă scurtă de timp (2-3 luni);

conservarea pe o perioadă medie de câteva luni la 3-4 ani;

conservarea pe termen lung (crioconservarea) prin stocarea țesutului vegetal la frig, în azot lichid (la -196oC).

Deși uneori contestată, metoda a dovedit că pentru unele specii este singura cale de conservarea (semințele recalcitrante, materialului obținut in vitro), urmărind creșterea și dezvoltarea plantelor in vitro, stabilind etapele organogenezei (caulogeneză, rizogeneză etc.). Organogeneza in vitro este dependentă de specie, mediu, tipul și natura explantului, faza fiziologică în care se află țesutul (vârsta plantei mamă) și perioada din an când se face prelevarea. Alegerea plantei donatoare, asigură succesul culturii in vitro: noi am folosit plante provenite din arealul lor de răspândire de la care s-au desprins explantele dorite.

Mediile de cultură aseptice, se aleg în funcție de natură speciei, de starea fiziologică a materialului vegetal și de scopul urmărit. Mediile sunt concepute după diferiți autori, cu balanțe hormonale echilibrate, în funcție de specie. Pentru germinarea semințelor in vitro s-a folosește mediul MS1/2 (cu microelemente și macroelemente înjumătățite). Adausul de fitohormoni face tehnica costisitoare (se folosește numai la nevoie): s-a încercat înlocuirea hormonilor cu extracte naturale, 1-3-5 mg/l extract naturale (din germeni de porumb care substituie în mediu zeatina, și altele extracte). Explantele după inoculare sunt păstrate la condițiile camerei de creștere, 8 ore întuneric și 16 ore lumină, intensitatea luminii variind în funcție de specie și scopul urmărit: temperatură de 25șC- 27șC, iar umiditatea atmosferică 50%-100%. Materialul obținut in vitro trebuie să depășească un prag dificil, aclimatizarea (ex vitro). Supraviețuirea în liber sau în arealele de unde a provenit specia, este scopul final al metode, aclimatizarea presupunând anumite trepte care să asigure condiții optime de viață speciei.

10.1.1. Conservarea in vitro a unor specii periclitate din județul Bihor

Am studiat unele specii din ariile protejate ele RPNMA, cele aparținătoare județului Bihor, unde există peste 64 de zone protejate, rezervații naturale și monumente ale naturii stabilite până la data de 1 mai 2007, toate întinse pe 30.867 ha. din care cca. 30.545 ha. aparțin Parcului Natural Munții Apuseni. Rezervațiile și monumentele sunt: botanice, paleontologice, speologice, zoologice, geologice și mixte. Arii protejate din județ sunt grupate astfel:

Arii care adăpostesc și protejează elementul botanic (ANEXA II);

Ariile mixte (botanice, faunistice, paleontologice, geologice etc.);

Arii umede din județul Bihor;

Rarităților floristice cu valoare de patrimoniu, ornamentale și situri de importantă

comunitară (ANEXA III).

În ANEXA II. prezintă valoarea cantitativă a speciilor și structura situ-urilor, unele sunt elemente botanice rare (întinse pe 2 – 15 ha., în funcție de tipul de element botanic), vegetația autentică, cu specii endemice din Carpați, rare, multe chiar protejate au dispărut. Amintim „Pădurea cu narcise” din Alparea (Oșorhei) și Gurbediu (Tinca), care se întind pe cca. 1 ha, ocrotite din 1971, specie vulnerabilă și aflată în atenție pentru conservare in vitro.

ANEXA III. redă raritățile floristice din ariile protejate ale județului Bihor: denumirea populară, localitatea, gradul de vulnerabilitate, teritorii care cuprind asociații de plante cu valoare estetico-peisagistă, păstrate integral, denumite „Rezervații peisagistice”. Dintre specii cercetate în scopul înmulții și conservării in vitro din RNMA amintim: Campanula rotundifolia ssp. Polymorpha (clopoțel) din Muntele Șes (SCI), VU = vulnerabilă; Dianthus spiculifolius (serotinus) Transilvanicus (garofița, CP= critic periclitată); Drosera rotundifolia Hayne (plantă insectivoră, CP); și Narcissus poeticus, VU și CP, întinsă pe două arii, Com. Oșorhei sat. Alparia și Tinca sat Gurbediu (3 ha). Remarcăm în anexă. poziționarea ariei protejate Muntele Șes (SIC) din care s-au ales speciile. Factorul antropic și cei de mediu acționează asupra plantelor și uneori fac ca acestea să supraviețuiască echilibrându-se reciproc, dacă unul din factori devine predominant poate avantaja sau nu populațiile și astfel unele devin rare sau vulnerabile, apărând nevoia de protecție a acestora.

Cultura in vitro a speciilor rare și periclitate asigură înmulțirea acestora și repopularea ariilor sau habitatelor din care provin speciile. Dianthus spiculifolius Schur. (Fam. Caryophyllaceae), provine din ariile protejate Valea Galbenei și Piatra Bulzului, situ-ri comunitare din Bihor, specie critic periclitată (CR). Conservarea in vitro a avut ca scop protejarea garofiței din flora spontană a României, raritate floristică și plantă decorativă localizată în câteva sit-uri (Anexa III). Semnalată în flora României în 1953, se găsește sporadic în câteva puncte din Transilvania, de-a lungul râului Someș și a altor râuri. Geoelement cu statut sozologic de plantă critic periclitată, cu importanță științifică, endemit daco-pontic cu areal restrâns și populații foarte sărace, protejată acolo unde se găsește în rezervații (exp. Râpa Roșie) și conservată ex situ, în grădini botanice, bănci de gene. Habitatul ei este de interes comunitar, conservat in situ, prin monitorizarea vulnerabilității ei pe perimetrul sit-ului și la presiunea antropică (turism, exploatarea economică).

Activitatea de conservare prin metode neconvenționale in vitro prezintă interes la speciile din flora spontană. Metoda are avantajul că pentru a obține câteva sute de exemplare se poate pleca de o singură plantă, o sămânță, un singur explant, tehnicile s-au aplicat la un număr mare de specii: biotehnologiilor vegetale dovedindu-și eficiența la specii care se înmulțesc prin metoda clasică cu dificultate. Unele speciile din Bihor și județele învecinate au fost conservate in vitro, amintim Masivul Piatra Craiului, specii rare, periclitate, vulnerabile și endemice de Dianthus din Gilău, Masivul Muntele Mare.

Materialul vegetal folosit pentru înmulțirea in vitro a speciei Dianthus spiculifolius a fost țesut meristematic – apex, cules din aria protejată, dintr-o singură plantă, replantată în ghiveci în seră rece (plantă mamă donatoare de explante): se poate preleva o singură inflorescențe sau lăstar, fără a afecta planta, operație care trebuie făcută în ziua experimentului sau cu o zi înainte, pentru păstrarea proprietăților țesutului. După sterilizarea lăstarului s-a detașat apexul care a fost inoculat pe mediul de bază MS, cu variantele prezentate în tabel 42.

Tabel 42. Formule de mediu utilizate pentru înmulțirea in vitro a speciei Dianthus din aria Muntele Șes (AIB = acid indolil butiric; BAP = benzil adenină; Z = zeatină)

După inoculare flacoanele s-au păstrat în camera de creștere, la intensitate luminoasă de 16ore lumină din 24 de ore, temperatură de 260C și umiditate 80%. Lumina și intensitatea ei variază în funcție de scopul urmărit și natura speciei (lumină fluorescentă difuză cu intensitate de 2-10 klux în funcție de etapa de dezvoltarea a plantulelor). La specii care au nevoie de alt regim de lumină, temperatură, umiditate, se folosesc dulapuri climatizate reglabile.

Tabel 43 Media parametrilor analizați la apexul de Dianthus spiculifolius cultivat

in vitro (după 50 zile)

După cca. 50 zile de cultură in vitro s-au făcut abservații asupra: procentul de regenerare, multiplicare, înrădăcinare și aclimatizare, media numărul de plantule diferențiate dintr-un explant. Perioada din an când s-a inițiat experimentul a fost martie-aprilie, iar durata incubării țesuturilor in vitro cca. 50 de zile. Tabelul 43 cuprinde media numărului de plantule diferențiate, procentul de regenerare, multiplicare și aclimatizare. Procesul de regenerare in vitro a țesutului detașat de la specia Dianthus spiculifolius, urmează ciclul biologic natural, influențat de condițiile de cultură, perioada din an când se desfășoară experimentul și natura speciei. Pentru cultura in vitro s-a dovedit că sunt favorabile aceleași perioade amintite. Țesutul apical are capacitate de-a regenera in vitro de cca. 95%: dar, pe un mediu cu Z (V3) multiplicarea ajunge până la100%.

Fig. 58. Procentul parametrilor anlaizați la Dianthus cultivat in vitro (după cca. 50 zile)

Figura 58 prezintă comparativ procentele de regenerare, multiplicare, înrădăcinare și aclimatizare: remarcăm valori ridicate pe mediile cu BAP și Z (V2 și V3) și diferențe funcție de natura lor. Pe zeatină (Z) valorile sunt superioare: 98% regenerare și 100% multiplicare (recomandând doze moderate). Aclimatizarea ex vitro este analizată în raport cu valoarea sistemului radicular; cu cât este mai viguros și procentul de aclimatizare este mai mare. Cel mai bun procent de înrădăcinare de 23%-25% are loc tot pe V2/V3(BAP/Z-1.0mg/l + 0.5 mg/lAIB), cu peste 50%. Constatăm o relație direct proporțională la prezența auxinei AIB –0,5mg/l (implicată în formarea rădăcinilor) și valoarea sistemului radicular. Prezența celor două tipuri de hormoni (citochinine + auxine) duce la formarea unui sistem radicular viguros și la procentul superior de aclimatizare, fapt certificat la specia Dianthuis spiculifoliul ( în alte experimente) și la alte specii economice sau ornamentale.

Fig. 59 Media numărului de plante/ apex la cele trei variante

Numărului de plantule diferențiate este situat între 16-30 plantule/apex (Fig. 59), media depinde de prezența citochininelor în mediu și de natura lor. Conservarea prin înmulțire in vitro a speciilor din flora spontană, asigurând obținerea unui număr mare de plantule într-un timp relativ scurt, identice fenotipic și genotipic cu planta mamă, dintr-un singur explant (o singură plantă mamă, o sămânță, o frunză, un apex, un meristem, o celulă etc.,), fără a fi afectate plantele din natură și așa puține. Multiplicarea in vitro a speciei Dianthus spiculifolius este determinată de prezența Z și BA în doză moderată (1mg/l): poate fi mai mare + o doză mică de auxină (AIB-0,5mg/l). Evoluția apexului de Dianthus poate fi urmărită în Planșa II (Foto. 1 – 5), pe variante.

Planșa II (Foto. 1 – 5), pe variante

Foto. 1.

Foto. 2 Foto. 3

Foto. 4 Foto 5.

PLANȘA I: Evoluția speciei Dianthus spiculifolius Schur in vitro cu aspecte de multiplicare, înrădăcinare și diferențiere de plante in vitro din calus.

Foto. 1. Miltiplicarea și înrădăcinarea speciei Dianthus pe mediul MS + 0.5mg/lAIB + 1.0mg/lZ (V3); Foto. 2. Multiplicarea și înrădăcinarea la Dianthus pe mediul MS+0.5mg/lAIB + 1.0mg/lBAP +825mg/l NH4NO3 (V2); Foto. 3, 4 și 5 Obținerea de calus pe un mediu exclusiv cu 2,4 Diclofenoxiacetiv (pe MS cu 2,4D) și regenerarea de plante din calusul de Dianthus diferențiat, pe medii cu citochinină (Z) și auxină (AIB) : mediul MS +0.5mg/l AIB + 2.0mg/lg/lZ.

Drosera rotundifolia Huds. Este un geoelement cu polulații sărace, critic periclitată cu extincția (CR). În România este întâlnită numai în Transilvania, în Munții Gilău, Muntele Mare, Izvoarele Șoimului în mlaștinile din RNMA, unde sunt relicte glaciare: însă și aici au devenit rare în urma amenajării pășunilor. Arealul speciei se restrânge în SE Europei, iar în România sunt concentrate în M-ții Gilău și împrejurimi, ca elemente izolate și în alte zone ale RNMA. Insectivorele sunt rarități botanice conservată in situ, în Carp. Occidentali, grădini botanice prin aclimatizare în cultură controlată periodic, iar gemoplasma stocată în bănci de gene.

Sunt numeroase cercetările privind conservarea in vitro a unor taxoni de Drosera (rotundifolia, anglica, intermedia), folosind ca material de inițiere a culturii in vitro semințe din Grădini Botanice (București, Cluj, Iași), sau material vegetal (diferite părți din plantă) din RNMA (M-ții Gilău), ori din exemplare de pe teren cum este Drosera intermedia Hayne, conservată și înmulțită in vitro din inflorescență (boboc floral), proveniți din Masivului Piatra Craiului (M-ții Gilău), ariile protejate ale RNMA, aferente județului Bihor.

Tabel 44 Mediile pentru înmulțirea in vitro a speciei Drosera rotundifolia Huds. (MS = Murashige-Skoog; ANA = acid α naftil acetic; BA = benzil adenină; Z = zeatină: CV =cărbune vegetal)

Drosera rotundifolia Huds., provine din aria protejată Muntele Șes (SCI= sit de importanță comunitară) din RNMA. Materialul vegetal a constat din boboc floral tânăr și mic ca dimensiune (0,3-0,4mm Ø), de la plante mature de pe teren și cultivat pe mediu MS cu variantele din tabel 44 (doze moderate, chiar mici de fitohormoni și adausuri suplimentare pentru a obține avantajos noile plane. Variantele experimentate: Vo = MS1/2; V1 = MS + 3g/l CV+ 825mg/l NH4NO3; V2 = MS +0,5mg/l ANA+1mg/ lBA; V3 = MS + 0,5mg/l ANA+1mg/l Z , urmărind evoluția in vitro, via boboc floral. Inoculii s-au păstrat în condițiile camerei de creștere la 26oC, umiditate 85%, o durată a luminii de 16ore lumină din 24 de ore, intensitatea a variat în funcție de natura țesutului (la bobocul floral se administrează 3-4-5zile întuneric, după inoculare pentru a favoriza inducția florală); lumină fluorescentă difuză cu intensitate de 2-10 klux în funcție de etapa de dezvoltarea a plantulelor, regim favorabil speciilor de Drosera pentru inducerea organogenezei.

Drosera intermedia din aceiași arie protejată, pe variantele cu doze mari de citochinice (2-5mg/l) a diferențiat calus embriogen, care subcultivat a generat plantule, deci via-calus, metodă este mai îndelungată. Pe unele variante calusul a manifestat o stagnare: s-a precultivat pe alt mediu pentru regenerare plantule. La Drosera rotundifolia in vitro am recurs la un experiment mai simplu, folosind medii de cultură cu doze moderate de fitohormoni care au favorizat micromultiplicare in vitro via – explant. După 60 de zile de la cultura in vitro a bobocului de Drosera rotundifolia Huds. pe variantele din tabel: capacitatea regenerativă (%), media numărului de plante/explant, procentul de înrădăcinare, multiplicare și de aclimatizare ex vitro sunt parametrii prezentați în tabel 45, în raport cu varianta de mediu.

Tabel 45 Valorile parametrilor analizați după 60 de zile de cultură in vitro

Remarcăm evoluția bobocului de Drosera rotundifolia Huds. și diferențele dintre parametrii în figura 60. Regenerarea bună in vitro se obține în prezența BAP și Z (V2 și V3) de 85% – 100%: la martor MS1/2 (Vo) regenerarea este de 25%, iar pe V2 cu cărbune și NH4NO3 este de 45%. Evoluția sistemul radicular este redată comparativ, care în prezența auxinei ANA-0,5mg/l, ajunge la 30 – 35%. Multiplicare ajunge la 100% pe V2, V3,: 50% pe V1 și 2% pe Vo.

Fig. 60 Procent de regenerare, înrădăcinare și multiplicare a bobocului de Drosera in vitro

Media numărului de plantule ajunge la 25 – 35 /explant pe variantele cu citochinine (V2 și V3) și cca. 2 – 8 plantule/explant la cele fără hormoni (Vo și V1), figura 61 redă media numărului de plantule de Drosera formate pe cele trei variante de mediu (Foto. 2, 3).

Fig. 61 Media numărului de plantule de Drosera rotundifolia regenerate in vitro din boboc

Procentul de aclimatizare este de cca. 20 – 30% pe variantele de control (Vo și V1): procentul și numărul de înrădăcinare mai mic s-a simțit în capacitatea de adaptare ex vitro. Figura 62 redă procentul de aclimatizarea care este direct proporțional cu valoarea sistemului radicular: ajunge pe V2 și V3 la 45-50%, dublu față de martor (Foto.4).

Fig. 62 Procent de aclimatizare ex vitro a plantulelor de drosera diferențiate in vitro

Pentru multiplicarea in vitro a Droserei recomandăm mediul MS + 1 mg/l (Z ori BAP) și auxină 0,5mg/l (V3), pe care formează un număr mare de plantule complet organizate, bine înrădăcinate, cu aclimatizare până la 50%. Valoare plantulelor pe Vo, sub raportul configurației, plantele sunt complet formate (foto 1), fără multiplicare (2pl/explant și 2răd./pl.).

Foto. 1 Plante de drosera complet formate (Vo) Foto. 2 Regenerarea in vitro pe V1.

Foto. 3 Plante multiplicate și conformate in vitro Foto. 4 Plantule de drosera aclimatizate

Putem conclude că micromultiplicarea in vitro a speciei Drosera rotundifolia Huds. via boboc, face posibilă obținerea de plantule pe medii cu doze echilibrate de fitohormoni. Evoluția bobocului de drosera este favorizată de prezența citochininelor în mediul MS 1mg/l(BA/Z) + 0,5mg/lANA (V2 șiV3): pe Vo și V1 fără hormoni evoluția este bună. În ideea reconstrucției ariei de unde provine specia, tehnica asigură obținerea plantulelor de Drosera rotundifolia via-explant, pe medii cu doze echilibrate de fitohormoni, sau chiar pe medii lipsite de fitohormoni pentru obține plantulelor la un preț de cost scăzut, prin această tehnică a mciropropagării in vitro. Mediile au stimulat obținerea de plante de Drosera complet conformate, cu rozeta de frunze, rouă pe frunze și inflorescența diferențiată. (Plantula Foto. 1), este o plantă complet conformată, cu sistem radicular viguros care poate rezista ex vitro.

Un alt studiu a urmărit conservate ex situ a speciei Narcissus poëticus L din aria protejată „Pădurea cu narcise din Alparea (com Oșorhei)”, vulnerabilă (VU) conservată prin înmulțire in vitro. Sunt plante cu bulbi, cca. 40 de specii spontane (în genul Narcissus) răspândite în Sudul Europei, Caucaz și Asia până în China, Japonia. Plante cu flori, port elegant, cu valoare decorativă, cultivate în parcuri și grădini. Sub formă subspontană este răspândită în jud., Cluj, Bihor, Alba etc., ca formă subspontană, spontan se găsește în arii protejate numite „poiene cu narcise”. Specie cu largă amplitudine ecologică la sol, tolerantă la Ph și cerințe moderate la căldură (4,5oC-7,5oC). Se înmulțește prin bulbi și înflorește în aprilie-mai, diversitatea biologică a narcisei este permanent afectată (50% din specii au dispărut în ultimii 20 ani). CBD (Haga), a stabilit strategii de conservare a patrimoniului vegetal, stabilind importanța conservării ex situ a biodiversității Terrei.

Narcisa albă este o plantă meliferă, medicinală, ornamentală, cu o tehnologie tipică: plantată în toamna (septembrie), înflorește în aprilie, după uscarea florii, organul de înmulțire, bulbul, intră în repaus până toamna. Obținerea bulbilor floriferi, necesită parcurgerea unei perioade de temperaturi scăzute, etapa de vernalizare , obligatorie pentru procesul de creștere și pentru inducția florală, perioadă care poate fi substituită prin tratament cu frig sau cu fitihormoni implicați în diferențierea bobocilor florali (GA3). Tratamentul cu giberelină (GA3) a înlocuit temperaturile scăzute și a intervenit în întreruperea repausul, injectată în bulbii giberelina – GA3, a substituit frigul, a stimulat inducția florală într-o perioadă alta, decât cea de înflorire normală.

Înmulțire clasică a bulboaselor spontane are unele neajunsuri: metoda de înmulțire in vitro poate asigura înmulțirea speciilor spontane făcând legătura între clasic și modern, completându-se. Inițial metoda in vitro era considerată doar o cale de multiplicare rapidă a speciilor, în timp devine însă o cale sigură de conservare a resurselor vegetale.

Bulbificarea in vitro este superioară dacă se utilizează ca explant bobocului juvenil inflorescență tânără), capacitatea de bulbificare ajungând la procent remarcabil. La obținerea cartofilor in vitro rol important îl are perioada din an când se face prelevarea, soi și balanța hormonală, prezența citochininelor, pentru obținerea materialului săditor la un preț de cost scăzut . La acestă specie materialul vegetal de înmulțirea in vitro, a constat dintr-o secțiune longitudinală de solz detașată din bulbul, cu o porțiune de disc (discul este zona cu cea mai mare capacitate de proliferare), inoculate cu secțiunea de disc etanș pe mediu de cultură. Aceste explante au indus diferențierea de bulbili in vitro la bulboase ca: Fritillaria și Lilium, obținând-se o cantitate mare de bulbili. Mediile pentru cultura in vitro a specia Narcissus poëticus au fost după Heller (He) și Gamborg (B5), trei variante pentru mediu de bază He și B5 (tabel 46). Bulbii maturi s-au tratat cu frig în scopul substituirii perioadei de vernalizare, deci înainte de inoculare cu 3-4oC cca. 3,5 luni, apoi s-au dezinfectat și s-a secționat longitudinal solz cu porțiune de disc (de 0,4-0,6cm).

Tabel 46 Variantele de mediu pentru cultura in vitro a din bulbului de Narcissus poëticus L

(MB = Heller (He); MD=Gamborg (B5); MS+ Murashige-Skoog vitamine; BAP = benzilaminopurină; AIB = acid βindolil butiriv; 2.4D = acid 2,4 diclorfenoxiacetic )

Citochininele în doză de 1,0 – 2,0 mg/l s-au dovedit eficiente în tuberizarea in vitro a unor soiuri de cartof, în scopul obținerii unui material săditor calitativ și cantitativ superior: o concentrați de auxină mică 0,5mg/lAIB cu o doză medie de citochinină, favorizează sistemul radicular, vigurozitatea plantelor, iar la bulboase diferențierea bulbililor in vitro

Tabel 47. Capacitatea regenerativă (%) și evoluția explantului din bulb de Narcissus poëticus in vitro

După inoculare pe mediu, explantul s-a menținut la întuneric cca. 4-5 zile, cu efect asupra activității auxinelor din mediu și din țesut, efect benefic asupra diferențierii de bulbili in vitro. După cca 3-4 luni de la inocularea in vitro s-a urmărit evoluția solzului cu disc de narcisă în funcție de compoziția mediilor. Evoluția in vitro este prezentată în tabelul 47 (procent regenerare, media numărului de bulbili și calusogeneză). Capacitatea regenerativă ajungând la 40-50% (Fig. 63), iar bulbificarea este intensificată ducând la formarea a 3-4 bulbili/explant. Iar calusul format după 3,5 – 4 luni, pe B3 ajungând la 2-4cmØ.

Fig. 63 Capacitatea regenerativă după 3-4 luni de tratament cu frig la 3-4oC

Evoluția explantului de Narcissus, după cca 4 luni de cultură in vitro, relevă capacitatea regenerativă superioară pe mediului de bază G5, comparativ cu He (Fig. 63). BAP-1,0-2,0mg/l atât pe mediu de bază He. (H1, H2), cât și pe B5 (B1 și B2) stimulează capacitate regenerativă cu diferențe nesemnificative: valori ușor mai mari pe Gamborg (B5).

Fig. 64 Media numărul de bulbi regenerați in vitro din solz cu disc de

la specia Narcissus poëticus L,

Media numărului de bulbili diferențiați din solz cu disc de Narcissus poëticus L ajunge la 1-4 bulbili/ explant: pe mediul de bază Gamborg (B5) înregistrează valori duble, iar pe mediu cu doză mare de BAP (2,0mg/l), media numărului de bulbili depășește 4 bulbili/explant. Diferențierea de țesut calusal in vitro pe mediile cu He +2,4D – 8mg/l + 1,0mg/lBAP (Heller) atingând un diametrul a masei de calus de 0,5-1,0cm, pe G5 masa ajungând la un volum mai mult de dublu 2 – 4 cmØ. Pentru diferențiere de calus recomandăm doză mai mare de citochinină (până la 5,0 mg/lBAP).

În concluzie menționăm rolul și necesitatea tratamentului cu frig aplicat explantelor din bulb (perioada de vernalizare) și apoi inocularea in vitro. După inoculare este nesesară menținerea explantelor la întuneric (cca. 5-7 zile) în scopul stimularea inducției florale, diferențierii organelor de reproducere sau înmulțire (bulbili). Tratamentul cu frig la specia Narcissus poëticus L, este implicat în reducerea sau chiar eliminarea repausul profund al speciei. Tratamentul cu temperaturi de 2-3oC aplicat trei-patru luni, stimulează capacitatea regenerativă, care poate ajunge la peste 50%, cu diferențierea de cca. 3-4 bulbili/explant.

Recomandăm multiplicarea in vitro a speciei Narcissus poëticus L, după parcurgerea perioadei normale de vernalizare a bulbilori donatori de explant (vernalizare, naturală sau forțată prin trecerea iernii în sol sau tratament cu frig), de asemenea folosirea altor tipuri de fitohormoni și doze mai ridicate de citochinine: pentru diferențierea microbulbilor in vitro și regenerarea de plantule via-explant și pentru proliferarea și înmulțirea via-calus a speciei de Narcissus poëticus L.

Foto. 1-6. Fazele în diferențierea de bulbili de Narcissus poëticus L in vitro, după 2, 3 și 4 luni de cultură in vitro și pretratament cu frig (temperaturi de 3-4oC)

S-a cercetat in vitro specia Campanula rotundifolia L. (syn. carpatica L) din M-ții Carpați, geo-element dacic cu populații sărace, periclitată cu stingerea. Endemit ancestral dacic cu populații puține în Carpați, semnalată la noi în 1923 de botanistul Borza și descrisă de Moraru cu 40 de ani mai târziu (1964). Întâlnită în Transilvania (Cluj, Bihor și Maramureș), perenă cu subspecii (rotundifolia, carpatica, romanica) semnalate în studiile de floră vernală și conservată în Grădini Botanice (carpatica prezintă și interes horticol). Protecția naturii la noi s-a bazat pe rezervații naturale care adăpostesc toate tipurile de arii (botanice, zoologice, mixte și arii umede). De interes pentru noi au fost arii de protecție a elementelor botanice sărace, periclitate și endemite cu valoare botanică specială pentru țară. Este important pentru rezervațiile biogenice protecția genofondului țării, care se sprijină pe cărțile și listele roșii ale plantelor superioare, care sunt actualizate periodic, privind starea sozologică a fiecărei specii. Harta 1 prezintă punctele de răspândirea speciei Campanula carpatica L în României unde este conservată in situ (în Parcul M-ții Măcini, Canalul Hârșova etc.). Pentru conservare ex situ prin înmulțire in vitro se apelează la exemplare corect determinate botanic, sănătoase și tinere, din ariile unde se află specia, sau din colecțiile Grădinilor Botanice, folosind un singur exemplar (de la care se poate utiliza toate părțile plantei) sau semințe.

Harta 1. României cu ariile de răspândire a speciei Campanula rotundifolia L. (syn. Carpatica)

Metodele de conservare la plante țin cont de cauzele natural sau antropice care au adus specia într-un punct critic de supraviețuire, consecințe care trebuie înlăturate: de aceia conservarea resurselor genetice vegetale in situ sau ex situ, își poate aduce propriul aport la salvarea speciilor periclitate cu extincția . Biotehnologiile vegetale la început au avut ca scop clonarea in vitro a speciilor importante (cartof, plante perene furaje etc.), abia mai târziu sunt utilizate și în conservarea resurselor vegetale în multe țări de pe Glob. Prin aplicarea acestei tehnici se invoca acțiunea traumatică a metodei asupra țesutului plantei, inducerea mutagenezei și apariția variațiilor somaclonale in vitro datorate unor factori ca: balanța hormonală, subculturile, starea fiziologică a plantei mamă donatoare de explante etc.. Pentru preîntâmpinarea apariției acestor fenomene nedorite s-a căutat folosirea unor medii simple sau foarte simple cu adaos de fitohormoni în concentrație mică, sau chiar înlocuirea acestora cu extracte naturale din plante, cu efect asemănător fitohormonilor asupra diferențierii celulei vegetale. S-a elaborarea un protocol de lucru (etape ale micropropagării in vitro) care să asigure obținerea unor plante in vitro complet conformate capabile să se aclimatizeze ex vitro și să asigure în final, repopularea ariilor de origine, unde speciile sunt în pericol cu dispariția.

Tabel 48. Compoziția mediilor de pentru multiplicarea in vitro a specie Campanula rotundifolia L (SH = Shenk-Hildebrandt, 1972; MS = vitamine Murashige-Skoog, 1962; AIB = acid β indolil butiric; 2iP= 2 izopentladenină; BAP = benzilaminopurină)

În experiențele inițiate de noi la Campanula rotundifolia L s-au folosit boboci foarte tineri, care după sterilizare s-au secționat în două formând un explant mic de cca. 0,5 cmØ și s-au inoculat pe mediul de bază Shenk-Hildebrandt (SH-1972) + vitamine după Murashige-Skoog, (MS – 1962) în variantele din tabel 48, cu diferite doze de fitohormoni: o variantă de control (Mt) cu macro., micro. și vitaminele la jumătate și variante cu o auxină în doze mici sau echilibrate (0.5/1.0mg/l) și o citochinină, 2iP/BAP în doză mică și mare (0,5/2,0mg/l), care au încercat să stabilească care concentrație favori organogeneza, caulogeneza, etc, cunoscând faptul că evoluția in vitro depinde de natura și concentrația fitohormonilor.

Tabel 49. Evoluția in vitro a explantului de bonoc de Campanula (după 50 de zile)

După 50 de zile de cultura in vitro a bobocului s-a analizat media numărului de plantule diferențiate/explant, numărul de rădăcini/explant, procentul de regenerare, multiplicare și înrădăcinare in vitro a speciei Campanula (tabel49). Capacitatea de regenerare și multiplicare in vitro (%) este redată în fig. 65 și depinde de prezența sau absența fitohormonilor: atinge 12 % pe Mt. și peste 85% pe cele cu fitohormoni (V3 și V 4). Pe V1 și V2 depinde de concentrația de AIB și 2iP sau BAP: pe dozele mici regenerare este de 45-70% (pe V1 și V2), iar pe variantele cu BAP în ambele concentrații între 80-88% (pe V3 și V4).

Fig. 65 Regenerare și multiplicare in vitro (%) a bobocului de Campanula (după 50 zile)

Procentul de multiplicare in vitro a bobocului de campanula pe cele cinci variante, este superior în prezența concentrației mari de citochinine (2.0mg/l – 2iP/BAP, V2 și V4), multiplicarea fiind între 70-83%.

Fig. 66. Media numărului de plante/boboc diferențiate in vitro la Campanula (după 50 zile)

Din fig. 65 observăm că pe mediile cu doză 0.5mg/l auxină, procentul de multiplicare este de 15% (în prezența 2iP) și 47% (a BAP). Privind regenerarea și multiplicarea explantului de boboc de Campanula in vitro putem stabili efectul favorabil a MB, după SH + vit. MS + BAP și 2iP (2.0m/l). Doză de 2 mg/l citochinine este benefică în multiplicare in vitro a bobocului de Campanula, obținându-se plante complet conformate.

Media numărului de plante diferențiate dintr-un explant (boboc) de asemenea atinge valori în funcție de concentrația de citochininelor și natura acestora. Diferențele între cele două citochinine privind media numărului de plante sunt evidente (fig. 66): pe mediul cu 2iP (V2 = MB+1.0mg/l AIB +2,0mg/l 2iP) se obțin cca. 15 plantule/boboc, în prezența BAP în aceiași concentrație (V4 = MB +1.0mg/l AIB +2,0mg/l BAP) media este dublă (31 plantule/boboc). Fig. 67 redă media la toate variantele: pe Mt , V1 și V3, fără hormoni și cu doze mici de citochinine, media este de 1/2,5 /7.0 plantule/explante, valorile în funcție de natura citochininei (BAP înregistrând număr dublu de plante/explant față de 2iP).

Fig. 67 Media numărului de rădăcini/plantă diferențiate in vitro la Campanula (după 50 zile)

La plantule de Campanula diferentiate in vitro s-a urmărit și media numărului de rădăcini/plantulă (Fig. 67), care depinde de prezența auxine AIB și concentrația ei. Efectul favorabil al concentrației mari de 1.0mg/l de AIB este evident: între 9-8-16 rădăcini/plantulă: numărul de 16, 8 rădăcini/plantulă se înregistrează pe V4 (MB + 1.0mg/l AIB +2,0mg/l BAP).

Fig. 68 Procent de plantule înrădăcinate in vitro (după 50 zile)

Figura 68 redă procentul de plantule înrădăcinate in vitro după cca. 50 de zile de cultură in vitro: variantele cu dozele cele mai mari de fitohormoni ating cel mai mare procent de înrădăcinare: pe V2 (MB+1.0mg/l AIB +2,0mg/l 2iP) cca 70% din plantele înrădăcinează in vitro, iar pe V4 (MB+1.0mg/l AIB +2,0mg/l BAP) peste 90% înrădăcinare și plante viguroase, efect favorizat datorat dozelor mari de fitohormoni (AIB +BAP). În concluzie, micorpropagare in vitro a speciilor spontane asigură obținerea unui număr mare de plante în timp relativ scurt identice fenotipic și genotipic cu planta mamă. La Campanula concluzionăm că: Regenerarea și multiplicarea este favorizată de mediului de bază și de prezența BAP /2iP- 2.0mg/l, procentului de multiplicare ajungând la 70-83%. Media numărului de plante/ explant depinde de prezența citochininei în doză mare (2mg/l), BAP are efect dublu față de 2iP. Pentru înrădăcinarea in vitro este necesară o auxină în doză de 1 mg/l (MB+ 1.0mg/l AIB +2,0mg/l BAP), care duce la 70-92% plante înrădăcinate, favorabile aclimatizării ex vitro.

Photo.1-4 Boboci de Campanula regenerați și multiplicați in vitro (după 50 de zile)

Medii de cultură folosite pentru înmulțirea și conservarea in vitro a speciilor experimentate sunt prezentate în ANEXA V.

Concluzii și recomandări generale privind tehnica in vitro. Cercetările au dovedit că speciile spontane rare, periclitate și vulnerabile se pretează la înmulțirea și conservarea in vitro, în scopul extinderii lor în areale de origine. Reușita culturii in vitro depinde de natura specie, de capacitatea ei de adaptare, de tipul de țesut și capacitatea lui de a relua metabolismul. În înmulțirea și conservarea in vitro a speciilor de plante din flora spontană s-a stabilit un protocol de lucru, etape experimentale care au dus la concluziile de mai jos:

10.2. Înmulțirea in vitro a unor specii de importanță economică

(medicinale, aromate și condimente)

Folosirea plantelor cu valoare medicinală și a condimentelor în spațiul Carpato-Dunăreano-Pontic are o anume vechime și tradiție. T. Săvulescu (1924), considera că „botanica populară pe spațiul nostru s-a născut o dată cu poporul, a evoluat cu el și într-însa se răsfrânge trecutul, istoria, îndeletnicirile, suferințele și bucuriile poporului”. Medicina populară prin bogăția ei, deosebește plantele considerate ca având proprietăți „tămăduitoare-magice”, recoltarea, conservarea și utilizarea lor urmând un ritual complex. Resursele genetice se conservă prin înmulțire in vitro, metodă care poate ameliora incapacitatea unor plante de a lega semințe în condiții nefavorabile de climă. Noi am experimentat: măgheranu (oreganul), rosmarinul și lavanda, cele mai folosite condimente și medicinale Arnica montana L.

Majorana hortensis Moench. (fam. Lamiaceae), sinonim Origanum majorana L, cunoascută și apreciată încă din antichitate pentru uleiurile volatile, amare, tanin și alți compuși chimici. Herba Majoranae este folosită proaspătă sau uscată, conținutul compușilor și a uleiurilor aromate ajunge la 0,7-3,5%: proprietățile fito-farmaceutice sunt antiseptice, stomacale etc.. La noi este cunoscută și apreciată ca și condiment alimentar, în bucătărie, industria alimentară și cosmetică (parfumerie). Are origine mediteraneană unde se comportă ca o specie perenă, cu propriile particularități ecologice. Vestul țării noastre este favorabil culturii magheranului (Neamț, Câmpia Române etc.), unde necesită o tehnologie de cultură specifică: semănatul se face direct în câmp în aprilie, s-au prin răsad care se produce în sere și răsadnițe. Produsul final din plantele din câmp depinde de momentul optim de dezvoltare, de înflorire: recoltarea se face la 30-25oC, se ambalează și depozitează corespunzător până la obținerea produsului finit. Specia este recalcitrantă la înmulțire vegetativă, iar un procent mare din semințele sunt șiștave, înmulțirea in vitro fiind o soluție salvatoare.

Cultura in vitro la Majorana hortensis Moench a urmărit efectul diferitelor citochinine în combinație cu o auxină pentru stimularea regenerării și multiplicării țesutului apical și nodal. Variantele cu mediul de bază MS sunt următoarele: Mt (martor) = MS; V1 = Mt + 1.0 mg/l 2iP + 0.5 mg/l AIB; V2 = Mt + 1.0 mg/l K + 0.5 mg/l AIB; V3 = Mt +1.0 mg/lBA + 0.5 mg/l AIB; V4 = Mt + 1.0mg/l TDZ + 0.5mg/l AIB; V5 = Mt + 6.0 mg/l 2,4D + 0.5mg/l BA.

Tabel 50 Valorile parametrilor la Majorana (după 45 de cultură in vitro a nodului și apexului

După 45 de zile de cultură in vitro s-a urmărit capacitatea regenerativă (%), multiplicarea apexului și a nodului (diferențierea de plantule/explant) în prezența a patru citochinine, dar și obținerea de calus în prezența a 2,4D (V5). Tabelul 50 prezintă capacitatea de regenerare și micropropagare (diferențierea de plantule) în funcție de natura citochininei și a explantului (după 45 de zile). Apexului de măgheran are o evoluție bună și uniformă pe V3 și V1: procentul de regenerare pe mediul cu BAP (V3) este 90%, iar pe cel cu 2iP (V1) este 75%:, cu 4-5 plantule diferențiate/apex, bine înrădăcinate. Nodului in vitro pe aceleași variante are evoluție bună, dar inferioară apexului: pe V3 regenerează 80%, cu cca. 3 plantule/nod de 3cm, înrădăcinate; pe V1 regenerează 60% și cu aceiași număr de plantule/nod.

Fig. 69. Media numărului de plantule și rădăcini din apex la Majorana (după 45 de zile)

Media numărului de plantule/apex și a rădăcinilor/plantulă este redată în fig. 69, remarcându-se V3 (Mt +1.0 mg/lBA + 0.5 mg/l AIB) și V1 (Mt + 1.0 mg/l 2iP + 0.5 mg/l AIB).

Fig. 70 Diferențierea de neo- plantule și rădăcini din nod la Majorana (după 45 de zile)

Evoluția nodului este redată în fig. 70, din care rezultă cele mai bune valori tot la V3 și V1, dar și pe V2. Remarcăm evoluția slabă pe V4, cu TDZ (50% din explante necrozate), ca și lipsa reacției in vitro pe V5. Credem că doza prea mică de BAP nu poate induce diferențierea țesutului calusal. Procentul de regenerare de plante din apex atinge valoare cea mai mare tot în prezența BA (V3), cca. 90% (Fig. 71 A), iar la nod tot pe V3, la 70% (Fig. 71 B). Evoluția regenerării este încă odată în plus efectul naturii citochininei în doze moderate și a auxinei în doză mică, dar și a tipului de țesut (apex, nod) asupra capacității regenerative in vitro.

A. B.

Fig. 71. Regenerarea (%) la apex (A) și la nod (B) de Majorana in vitro pe medii cu 2iP și BAP

Putem conclude că: evoluția apexului și a nodului de Majorana hortensis Moench pe medii cu citochinine în aceiași doză (1.0mg/l) și o doză mică de auxină (0,5mg/lAIB), înregistrează diferențe în funcție de natura citochininei și de tipul de țesut. Cele mai bune rezultate se obțin la apex în prezența BAP (V3) și 2iP (V1), cu evoluție uniformă pe toate explantele (foto 1 și 2): multiplicarea ajunge la cca. 90%. Nodal înregistrează valori apropiate, ceva mai mici: cu regenerarea de 80% și obținerea a cca. 3 plantule/nod de cca. 3cm cu rădăcini mici (0,5cm). Recomandăm pentru obținerea de calus, mărirea dozei de citochinină până la 6 mg/lBAP + 6mg/l2,4D. Pentru multiplicarea speciei folosirea BAP ori 2iP(1mg/l) + AIB (0,5mg/l) și renunțarea la TDZ, care inhibă evoluția in vitro a țesutului apical și nodal de majorana.

Foto. 1 și 2 Evoluția uniformă a explantului din apex și nod de Majorana hortensis

pe mediu cu benzilaminoprină – BA (după 45 de zile pe V3)

Foto 3 Valoarea uniformă a sistemului radicular la Majorana pe V3 și V1

(după 45 de zile de cultură in vitro)

O altă specie experimentată este Rosmarinus officinalis L. (fam. Labiate), cultivată pentru Herba rosmarini planta întreagă, dar și pentru masa de frunze Folium rosmarini (care asigură uleiul volatil de mare calitate cu miros specific). Plantă cu prorietățile fito-farmaceutice și conținutul în ulei volatil (bogat în acid rosmarinic, flavone, hidrocarburi, alcooli, vitamine etc.), cu acțiune bacteriostatică, coleretică etc.. În medicina veche empirică se folosea ca gastrointestinal, analgezic, în reumatism și nevralgii. Lăstarii sunt întrebuințați ca adaus aromatic pentru unele preparate din carne, condiment foarte apreciat. Are origine mediteraneeană numărându-se printre speciile ameliorate în condițiile de climă din țara noastră, dar care întâmpină greutăți la înrădăcinare în condiții clasice. Rosmarinul s-a extins în spațiile peisagiste ca specie ornamentală, prețuită pentru parfumul și culoare florilor, care au capacitatea de-a conserva în timp aceste calități. Dar în principal rămâne apreciată, cultivată și extinsă pentru principiile active pe care le conține: uleiuri volatile, taninuri, saponozide etc. și pentru vastele acțiuni terapeutice. Aplicarea biotehnologiilor s-au dovedit benefice, înmulțită in vitro a făcut posibilă extinderea și ameliorarea ei în cultură, dar și pentru biomasă cu proprietăți fito-terapeutice.

Înmulțirea in vitro a speciei Rosmarinus ofiicinalis L a fost gândită în primul rând pentru obținerea unui număr mare de plante la un preț de cost scăzut, prin aplicarea unei tehnologii avantajoase, folosind medii simple (medii de bază sau cu adaus de fitohormoni în concentrații mici de 0,2mg/l până la 0,3 mg/l). Pe lângă mediile simple cu doze reduse de fitohormoni, pentru obținerea culturilor economicoase in vitro sunt cunoscute tehnicile de înlocuire totală sau parțială a fitohormonilor cu extracte naturale. Tehnologiile avantajoase sunt aplicate și la alte specii de interes economic cu succes și sunt introduse în cultură pentru obținerea materialului săditor. Biotehnologiile au aplicabilitate în lucrările de ameliorare la specii de cultură sau ornamentale, cu extindere și la cele medicinale (fito-farmaceutice). Pe lângă scopul ameliorativ, înmulțire in vitro urmărește și posibilitățile de conservare a resurselor genetice, a speciilor cu valoare medicinală și a germoplasmei, inițiind cercetări pentru găsirea celei mai favorabile și mai avantajoase metode de conservare in vitro a unor plante, mai ales a speciilor de plante periclitate cu extincția.

Înmulțire in vitro a speciei Rosmarinus officinalis L., s-a inițiat în luna martie urmărind capacitatea de multiplicare in vitro a țesutului apical, apex, pe mediul MS (Murashige-Skoog) cu aport scăzut de fitohormoni, în următoarele variante: Mt = MS;

V1 = Mt + 0.2 mg/l BA + 0.3 mg/l AIA (pentru regenerarea și multiplicare);

V2 = Mt + 8.0 mg/l 2,4D (pentru inițiere calus). Țesutul apical a dovedit o capacitate de regenerare și multiplicare superioară altor explante, eficient la înmulțirea in vitro a speciilor de interes economic și la unele soiuri de cartof ameliorate în țară. Micromultiplicarea in vitro la plante poate fi asigură și de alte tipuri de țesuturi: la unele specii medicinale și aromate nodul a dovedit capacitate de regenerare mai mare decât apexul, în funcție de balanța hormonală din mediu și concentrația substanțelor cu rol în inducerea organogenezei in vitro.

Observațiile s-au făcut după 45 de zile, după care are loc regenerarea in vitro și multiplicare pe V1 și regenerare calus pe V2. Regenerarea in vitro din apexului de rosmarin are loc pe mediu MS + 0,2mg/l BA+0,3mg/lAIA, obținându-se și multiplicarea speciei pe medii economicoase cu doze mici de fitohormoni. Regenerarea de calus friabil sau regenerativ are loc pe MS cu auxină 8-10mg/l 2,4D și citochinină 5,0 până la 8,0 mg/l BA.

Tabel 51 Evoluția in vitro a apexului de Rosmarin officinalis (după 45 de zile)

Tabelul 51 redă media valorilor parametrilor analizați: % regenerare, medie numărului de plante/apex și a numărului de rădăcini/plantă și aprecieri privind evoluția fiecărei variante. Capacitatea regenerativă a apexului de Rosmarinus officinalis L, după 45 de zile de cultură in vitro pe mediile experimentate (cu aport redus de fitohormoni și cu conținut în 2,4D) este prezentată în fig. 72. Regenerare pe V1 ajunge la peste 90%, iar pe Mt (mediul de bază MS) regenerarea este de 48%.. Reacție asemănătoare avem și la obținerea de plantule in vitro, multiplicare. Fig. 73 prezintă media numărului de plante de rosmarin/ explant, din care desprindem faptul că specia răspunde favorabil la dozele mici și echilibrate de fitohormoni, recomandând inițierea și înmulțirea speciei de Rosmarinus officinalis in vitro pe medii economicoase cu balanță hormonală echilibrată.

Fig. 72. Capcitatea regenerativă in vitro a apexului de Rosmarinus officinalis L (% după 45 zile)

Fig. 73. Media procentuală a numărului de plantule/explant la Rosmarinus officinalis L(după 45 zile)

Putem concluziona că după 45 de zile de cultură in vitro evoluția apexului de Rosmarin este bună, manifestată în funcție de compoziția mediului. Multiplicarea are loc doar pe V1 (Mt + 0.2 mg/l BA + 0.3 mg/l AIA), cu regenerarea apexului in vitro până la 90%, dar și multiplicare țesutului apical până la10-15 plantule/apex, lungi de 1,5-5,0cm. Pe V2 apexul generează o masă de calus de cca. 1,0cm Ø de culoare verde oliv, tare, care se recomandă pasat pe un mediu proaspăt pentru friabilizare. Pe martor (MS) regenerarea este mai slabă, totuși ajunge la cca. 48%, fără multiplicare cu diferențiere a unei singure plantule. Recomandăm cultura in vitro a țestului apical de rosmarin, timp de 45 de zile: pentru multiplicare și regenerare pe mediu cu o balanță hormonală redusă (V1), iar pentru regenerarea de calus friabil sau regenerativ recomandăm doze ridicate de auxină- 2,,,4 diclorfenoxiacetic (8-10mg/l2,4D) și de citochinină (5,0-8,0mg/l BAP).

B.

Foto 1. A Evoluția apexului de Rosmarin pe martor (Mt = MS); 1.B. diferențierea calusului de Rosmarins officinalis pe V2 = Mt + 8,0mg/l 2,4D (după 45 de zile)

Foto. 2. Evoluția explantului de Rosmarinus officinalis pe mediu MS varianta

V1 = Mt + 0.2 mg/l BAP + 0.3 mg/l AIA

Lavandula angustifolia Miller. sinonim Lavandula officinalis L, popular levănțică (fam. Lavandulae), este o altă specie experimentată, cunoscută încă din Antichitate (pentru parfumul de lavandă), specie meliferă, medicinală, care valorifică terenurile erodate (fitoameliorativă). Originară și răspândită în Europa Meridională, în sudul Franței, Spaniei, Italiei, în flora spontană a Munților Alpi. La noi este semiarbust de cultură cu durată mare de viață (cca. 30ani), remarcat prin coloritul frunzelor de un verde-cenușiu și a florilor liliachii cu înflorire de durată : zonele favorabile din țara noastră sunt, Câmpia Timișului, a Olteniei, Bărăganului, Subcarpații de curbură și Meridionali, Țara Bârsei. În ecologia speciei este de reținută cerința ridicată la temperatură de la germinație (10-12oC), până la maturitate și înflorire (10-12oC). Cerințele pentru umiditate sunt reduse, dar ridicate pentru lumină, fiind factorul care ajută la sintetizarea uleiului eteric (la lumină directă acesta crește chiar și de trei ori), în condiții de lumină sunt favorizate formarea unei tufe mari și inflorescențe cu flori numeroase. Preferă solurile bogate în calciu, suportă bine seceta, având cerințe ridicate față de apă, mai ales în timpul germinației, dar și după plantare și înainte de înflorire. Înmulțirea în zona de origine se face prin semințe, dar este bine cunoscută și înmulțirea vegetativă prin butași recoltați în perioada de repaus. Hibrizii de Lavandula angustifolia au semințele sterile și se înmulțesc numai prin butași, fiind bine cunoscută ca și plantă ornamentală folosită solitar sau în rabat, în grup cu alte specii floristice, frecvent întâlnită și foarte decorativă în parcuri, grădini, stâncării. Specie meliferă cu largă perioadă de înflorire și cu importanță terapeutică, în medicina umană, veterinară, cosmetică. Inflorescențele conțin uleiuri eterice până la 1,4%, importante fito-terapeutică, normalizând funcțiile cardiace prin reglarea stării de excitabilitate a organismului), în uz extern ca emulsie reduce senzația de durere, elimină toxinele din organism, recomandate în migrene, afecțiuni cardiace, răceli, gripe, stări febrile etc. Principiile active ale uleiului: ușor sedativ, în insomniile, spasmolitic, stimulent digestiv.Avantajul micropropagării și înmulțiri in vitro a speciilor de plante a făcut posibilă conservarea unor resurse genetice și chiar stabilirea unor metode speciale de conservare a resurselor genetice.

Cultura in vitro a speciei Lavandula angustifolia Miller., s-a inițiat în luna aprilie din apex de vârf (meristem apical ) 0,2 – 0,3mm și boboc tânăr detașat din inflorescență. Experiențe anterioare la alte specii au stabilit că și alte tipuri de țesuturi cultivate in vitro au capacitate de regenerare, manifestat în funcție de natura speciei și compoziția mediului. Astfel, la Menta piperita explantul nodal a evoluat in vitro în funcție de balanța hormonală din mediu și de aportul suplimentar de substanțe cu rol în inducerea organogenezei și multiplicării in vitro . Mediile de cultură experimentate la apexul de lavanda a avut la bază Murashige and Skoog, 1962 (MS) cu un adaus de aminoacid – glicina. Glicina în experimentele inițiate la cartof a avut efect în stimularea formării organelor de înmulțire. Variantele experimentate la lavandă au fost: Mt = MS + 2 mg/l glicină ; V1 = Mt + 1.0 mg/l AIA + 1.5 mg/l BAP; V2 = Mt + 1.0 mg/l AIB + 1.5 mg/l BAP; V3 = Mt +1.0 mg/l ANA + 1.5 mg/l BAP. Urmărind variantele constatăm aceiași concentrație de BAP alături de auxine (AIB; AIA, ANA) pentru a stabili evoluția apexului și a bobocului de lavandă în prezența glicinei.

Tabel 52. Reacția in vitro a țesutului apical și a bobocului de lavanda pe medii cu glicină (3 luni)

Observațiile s-au făcut după 3 luni de cultură in vitro, valorile medii fiind prezentate comparativ la cele două explante (tabel 52). Evoluția apexului pe V1 și V2 este asemănătoare (pe V2 valori ceva mai mari): pe V3 evoluția este uniformă cu diferențierea unei mase de calus cu Ø cât flaconul, care nu a evoluat spre regenerare și s-a pasat pe medii proaspete. De-a lungul experimentelor s-a stabilit că regenerare de plante din calus este favorizată de mediul Mt+ 2,0 mg/lBAP + 0,5 mg/lAIB (V2), iar regenerare de calus friabil pentru suspensie este favorizată de mediu MS + 8mg/l 2,4D + 5mg/l BAP. Procentul de regenerare in vitro a explantelor din apex și boboc de Lavandula (după 3 luni) este prezentat în fig. 74. Bobocul are evoluție ceva mai bună, generează un număr mai mare de plantule/boboc până la 6 plantule (număr dublu) de 2- 2,5 cm lungime (pe V1 și V2), cu un manșon de calus la bază care inhibă formarea rădăcinilor. Pe V3 se formează o masă de calus de diametrul flaconului cca. 5 cmØ. Explantele au reacție asemănătoare, formarea rădăcinilor este inhibată (și după repetarea experimentului).

Fig. 74 Procent de regenerare din apex și boboc de Lavandula angustifolia Mill. (după 3 luni)

Putem concluziona că țesuturile de Lavandula angustifolia Miller. cultivate in vitro ne-au ajutat să stabilim rolul glicina în mediu de cultură, dacă întârzie sau inhibă acțiunea auxinelor, în cazul speciei noastre inhibă diferențierea rădăcinilor (proces stimulat de auxine).

Glicina stimulează diferențierea un calus regenerativ de 0,5 cmø (Foto. 1) cu capacitate de diferențiere de plantule (pe Mt., V2 și V3), iar cu AIB formează masă mare de calus ( 4-5cmø), care după încă cca. 20 de zile are capacitate regenerativă (Foto. 2 și 3).

Remarcăm apariția necrozei la calus (Foto. 4) și recomandăm pasarea lui la 20 zile pe un mediu cu 2,4D și BAP (doză mai mare), pentru mărirea capacității regenerative.

Glicina la specia Lavanda angustifolia inhibă efectul celor trei auxinelor (AIB, ANA, AIA), cunoscut fiind efectul acestora în înrădăcinare. Plantulele neînrădăcinate pot fi minibutășite pe MS fără aminoacid cu AIB sau ANA: va stimula înrădăcinarea în cca. 14 zile, iar cu citochinină-0,5mg/l multiplicarea. Recomandăm menținerea aminoacidului (glicină) în mediu dar în doză mai mare decât cea de auxină.

Foto. 1 – evoluția pe V1 (Mt+1mg/lAIA+1,5mg/BAP)

Foto. 2 – Mt (MS+2mg/l glicină) Foto. 3 – V2 (Mt+1mg/lAIB+1,5mg/BAP)

Foto. 4 – V2, după încă o lună (deci după 3 luni

Dintre speciile medicinale de interes pentru noi a fost Arnica montana L. Răspândită din Carpați până în regiunea subalpină: vegetează în Europa din Antichitate, fiind încă de atunci folosită în medicina tradițională, în sănătatea oamenilor și animalelor. Specie bine adaptată de la climatul temperat la cel boreal rece și umed, preferă soluri cu pH-ul 5,0-7,2, se înmulțește prin semințe, dar în unele regiuni datorită unor condiții meteorologice extreme și a poluării nu leagă semințe. Înfloresc în iunie-iulie, florile (Arnice flos) se recoltează în plină înflorire, păstrându-se prin uscare la umbră, sau la 40-50oC. Uleiul din arnica conține arnidiol, carotenoizi etc. (3.8%). Rizomul conțin uleiuri volatile cca. 1,5%, semisolide și parfumate: folosit ca ceai, tinctură, unguente, etc. pentru afecțiuni cardiace, rănilor, inflamațiilor etc.. Încă nepericlitată cu dispariția, dar recoltată masiv, impune unele măsuri de conservare.

S-a urmărit înmulțirea speciei in vitro și capacitatea țesutului de Arnica de a diferenția calus pentru asigurarea biomasei din care se va putea extrage agentul fitofarmaceutic. Micropropagare in vitro este utilizată în înmulțirea unor specii care datorită unor condiții nefavorabile nu se pot înmulții prin metode clasice. Conservare prin înmulțire in vitro, a dovedit capacitate bună de regenerare a apexului de Arnica montana L in vitro, cu procent de multiplicare și regenerare de peste 80%, metodă poate ameliora incapacitatea unor plante de a lega semințe (chiar la arnica). Țesutul apical de Arnica montana L, cultivat in vitro a dovedit capacitate bună de regenerare, iar conținutul redus de fitohormoni în mediu, se știe că a favorizat regenerarea și multiplicarea la multe specii (la unele aromate cu obținerea de calus in vitro). Diferențierea de calus a evidențiat rolul concentrației și naturii fitohormonilor: eficiențe pentru obținerea de calus fiind dozele mai mari (BAP – 2mg/l + 2,4D – 5mg/l).

Apexul s-a detașat de la plante obținute prin germinația semințelor in vitro pe MS1/2, urmărindu-se multiplicarea in vitro pe mediu fără fitohormoni (Vo), sau cu concentrații mică, V1 (1.0mg/lBAP+0.5mg/lAIB) și diferențierea de calus pe MS cu trei citochinine + 2,4D (V2, V3 și V4), prezentate în tabel 55. Pentru obținerea de calus s-a folosit apex cu primul nod aferent, pentru un bun contact cu mediu. S-a urmărit: găsirea celor mai bune condiții pentru regenerarea și multiplicarea plantelor de Arnica, folosind medii simple sau cu balanță hormonală echilibrată; apoi diferențierea de calusal și găsirea celui mai bun mediu pentru obținere de biomasa cu principi active. Obținerea de calus la Arnica a demonstrat că BAP și 2,4D favorizat diferențierea în funcție doză, biomasa dovedind calități biochimice superioare. Tabelul 53 redă valorile privind regenerarea și multiplicarea plantelor și diferențiere de calus pe cele trei citochinine (2.0mg/l BAP, Z și K) + 1.5mg/l2,4D. Acidul β-indolil butiric (AIB) de-a lungul experiențelor noastre s-a dovedit cea mai eficientă dintre auxine, în diferențierea sistemului radicular, iar 2,4D în diferențierea calusului.

Tabel 53. Mediile de cultură folosite pentru evoluția apexului de Arnica montana L in vitro: MS = mediu de bază Murashige-Skoog; BAP= benzil-amino-purină; Z= zeatine; K= kinetine; AIB = β- indolil butiric acid; 2,4D – 2.4 diclorfenoxi acid

Regenerarea și multiplicarea plantelor de Arnica montana L. in vitro. Parametrii analizați exprimați în procente (regenerare, multiplicare, înrădăcinare, aclimatizare) și media numărului de neo-plantule/ apex sunt prezentate în tabelul 54. Pe ambele medii are loc regenerare, însă pe mediu cu fitohormoni (V1) este dublă și semnalăm și multiplicare. Înrădăcinarea este slabă în lipsa fitohormonilor pe Vo (2 răd/neo-plantulă) și foarte bună în prezența lor (V1), peste 10 rădăcini/ neo-plantulă, datorată mai ales prezenței acidului β-indolil butiric (AIB), aclimatizarea depinzând de valoarea rădăcinilor (Foto. 1,2,3).

Tabel 54. Valorile medii ale parametrilor privind regenerarea, multiplicarea și înrădăcinarea in vitro a plantulelor de Arnica montana L (după cca. 2 luni)

Capacitatea de regenerare și multiplicare a țestului apical (exprimate în procente) este prezentată grafic în fig. 75, din care remarcăm valori superioare la toți parametrii pe mediu V1 (MS+1.0mg/lZ+0.5mg/lAIB), comparativ cu cel fără fitohormoni Vo (MS). Este evidenția efectul acidului β indolil acetic (AIB-0.5mg/l) asupra evoluției sistemului radicular cunoscut fiind efectul acestei auxine asupra diferențierii rădăcinilor la o mulțime de plante și țesuturi cultivate in vitro. chiar și la apexul de Arnica montana L detașat de la plante din natură.

Fig. 75. Capacitatea regenerativă și de multiplicare in vitro la apexului de Arnica montana L

Diferențierea de țesut calusal de Arnica montana L in vitro. În obiectivul stabilit am urmărit obținerea masei de calus pe medii cu citochinine diferite (BAP, Z, K) în aceiași concentrație de 2.0mg/l și auxina 2,4D în concentrație de 1.0mg/l. Evoluția apexului de Arnica montana L în scopul diferențierii țesutului calusal (după 3 luni) este prezentată în tabel 55.

Tabel 55. Evoluția calusul de Arnica montana L diferențiat in vitro (după 3 luni)

Citochininele favorizează evoluția calusului, funcție de natura lor: pe mediu cu BAP (V2) se dezvoltă un calus friabil, moale de culoare verzui albicioasă (Foto. 4 și 6), pentru suspensii celulare. Pe mediul cu Z (V3) calusul este de consistență tare, culoare verde intens (Foto. 5,7 și 8), cu valoare regenerativ-embriogenă, foarte bună (foto. 3,7,8). În schimb pe mediu cu K (V4) evoluția calusului deficitară (necroză, emanație de fenoli), care duce stagnarea creșterii (Foto. 9): țesutul trebuie repasat mai repede pe un mediu proaspăt. Diametrul calusului obținut pe cele trei variante (V1, V2 și V4) este redat în figura 76 din care se remarcă diametrul cel mai mare pe V3(cu Z), aproape dublu față de V2 și aproape de trei ori față de cel obținut pe V4 (cu K).

Fig. 76 Diametrul masei de calus (cm) diferențiat in vitro din apex de Arnica (după 3 luni)

În urma experimentelor la Arnica Montana L cultivate in vitro putem concluziona:

Regenerarea și multiplicarea plantelor de Arnica are loc din țesut apical cu valori în funcție de compoziția mediului și numai în prezența BAP (1.0mg/l):

Diferențierea sistem radicular are loc în prezenta auxinei – AIB (0.5mg/l).

Apex a stimulat diferențierea calusului în prezența Z (zeatinei) V3 = MS+2.0mg/l Z+1.5mg/l 2,4D, de 2.30cmØ și o greutate a biomasei de ±2.55gr – proaspătă, și de ±0.90gr – uscată.

Pe mediile cu BAP (V2 ) și K (V4), valorile calusul sunt inferioare (Tabel 56). Recomandăm mediul V3 (poate doze și mai mari), cu repasarea calusului pentru regenerare la timp, pe medii proaspete.

ANEXA VI. cuprinde tipurile de țesuturi sau explante (apex. Nod, boboc floral) foloste în regenerarea, multiplicare sau diferențierea de calus la speciile experimentate: mediile de cultură care au dat cele mai bune rezultate, cu prezentarea rezultate procentuale obținute la fiecare specie: capacitate regenerativă, multiplicare și calusare (%), diferențiere de calus (natura calus, % de diferențiere și diametriul Ø). Speciile experimentate au fost: Majorana hortensis Moench., Rosmarinus officinalis L, Lavandandula officinalis L. și Arnica montana L. explane foloaite apex, nod, boboc, recoltat de la plante din natură: prezentarea rezultate obținute în funcție de compoziția mediilor, tipul de ezplant și specie.

Foto. 1. Foto. 2.

Foto. 3 Foto. 4

Foto. 5 Foto. 6

Foto. 7 Foto. 8

Foto. 9

Explicația figurilor: Foto. 1 – regenerare plante de Arnica montana L in vitro, pe medii cu sau fără fitohormoni; Foto.2 – regenerare și multiplicare; Foto.3 – multiplicare, doar pe medii cu fitohormoni; Foto. 4 și 6 – calus regenerativ diferențiat pe V2 (pe mediu cu BAP+2,4D, doze echilibrate); Foto. 5, 7 și 8 – calus regenerativ tipic, diferențiat pe V3 (pe mediu cu Zeatină + 2,4D, doze echilibrate); Foto. 9 – calus regenerativ diferențiat pe mediu V4 (cu Kinetină- K), cu calități instabile (apariția de necroză), dar regenerativ: cu valori inferioare celorlalte variante cu Zeatină (Z) și Benzilaminopurină (BAP)

ANEXE Partea III. Tabele

ANEXA I. Treptele sozologice după IUCN

ANEXA II. Rezervații cu valoare botanică din județul Bihor

ANEXA III. Rarități floristice din arii protejate ale județului Bihor (Sit SCI)

ANEXA IV. Metode de consnervare a materialul vegetal ex situ

ANEXA V. Cele mai bune medii și rezultate la specii din flora spontană cultivate in vitro

ANEXA VI. Cele mai bune medii și rezultate la speciile aromate, condimente, medicinale

BIBLIOGRAFIE

Agud E., Savatti M., Zăpârțan M., 2008, "The Growth Hormones Involved in the In Vitro Tuberisation of Some Potato Cultivars", în : Analele Univ. Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XIII, Ed. Univ. din Oradea, 1-5.

Agud E., 2009, "The in vitro multiplication of Eba potato cultivar", În: Agricultura, revistǎ de științǎ și practicǎ agricolǎ, an XVIII, nr. 3-4, Ed. AcademicPres Cluj-Napoca, pp.33-38.

Agud E., Zăpârțan M., Savatti M. 2009, "The in vitro Regenerative Capacity of the Potato Cultivars Ostara, Desirée and Eba Meristem", în: Agricultura – revistǎ de științǎ și practicǎ agricolǎ, anul XVIII, nr. 1-2, Ed. AcademicPress Cluj-Napoca, 51- 58.

Agud E., Zăpârțan M., Savatti M. Cap Z.,2009, "The Effect of the Photoperiod and of the Dose of Sucrose from the Environment Over some Potatoes Varieties Cultivated In Vitro", În: Analele Univ. Oradea, Fascicula: Protecția Mediului, vol. XIV, Ed. Univ. Oradea, 1-5.

Agud E., Cap Z., Zăpârțan M., 2010, "The aspects concerning in vitro tuberring at the potatoe varieties",: Analele Univ., Fasci.: Protec. Mediu., vol.XV, Ed. Univ. Oradea, 7-13.

Agud E., Zăpârțan M., Cap Z., 2010, "The in vitro tuberisation at the potato Desiree variety in mediums with phloroglucinol", in : "Research Journal of Agricultural Science" Vol.42(2)1-341(2010), Agroprint Editorial, Timișoara, 191-196.

Agud E., Zăpârțan M., Timofte A., 2010 – "In vitro regeneration and multiplication of the apical and nodal meristem derived from some potato cultivars", in : Bulletin of University of agricultural sciences and veterinary medicine Cluj-Napoca, volume 67 (1-2), Ed. ACADEMICPRES, Cluj-Napoca, 351-358.

Agud E., 2011, "Economical methods of in vitro tuberization at Solanum Tuberosum L Variety", în: Anale Univ., Fascic.: Protec. Mediu.,vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea, 1-6.

Agud E., 2011, "The role of natural extracts in the in vitro culture of Solanum tuberosum L. variety", în: Analele Univ. din Oradea, Fascicola: Protecția Mediului, vol. XVI A, Editura Univ. Oradea, 1-8.

Agud E., 2012, "In Vitro Tuberization in Some Potato Cultivars (Christian, Roclas, Ostara and Desiree)", în: Analele Univ. din Oradea, Fascicula : Protecția Mediu.,vol.XVIII A, Ed. Univ. Oradea, 225-231.

Agud E., 2012, "Effects of Growth Regulator and Sucrose Concentration for in Vitro Development of Solanum Tuberosun L, Cultivars" , în: Analele Univ. din Oradea, Fascicula: Protecția Mediu., vol.XVIII A, Ed. Univ. din Oradea, 231-237.

Agud, E., Laslo V., Zăpârțan M., 2013, Factors with diferentiated implication in the in vitro minituberizațion at some potato varieties (Solanum tuberosum L.), în: Book., UAB-B.E.N.A. Int. Cong. Environm. Engineering and Sustainab. Develop., Alba-Iulia, 169-170.

Agud E., Zăpârțan M., Savatti M., Laslo V., 2013, "The Influence of the Moment of Sampling of Potato Meristem over the In Vitro Regeneration and Differentiation Capacity", in : Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Animal Science and Biotechnologies, Vol. 70, Nr. 1, Electronic, 104-109.

Agud E., Zăpârțan M., Laslo V., – 2013,"In vitro reaction and ex vitro acclimatization of some autochthonous varieties of Solanum Tuberosum L. (Muresan, Super, Caty)", în: Analele Univ. Oradea, Fascicula: Protecția Mediului,vol.XXI, Ed. Univ. Oradea, 525-532.

Agud E., Zăpârțan M., Laslo V., 2013, "Ex vitro acclimatization and conservation of the plant material obtained in vitro at some foreign and autochthonous varieties of Solanum L.", Rev. Natural Resourc. and Sustaina. Develop. Vol 5, Ed. Univ. Oradea, 293-300.

Agud E., 2014, " Campanula rotundifolia L. species endangeres with extinction, conserved through in vitro techniques ", în: Analele Univ. Oradea, Fascicula: Protecția Mediului, vol. XXIII, Ed. Univ. Oradea, 565-577.

Agud E., 2014, "Vulnerable and protected endemic species from the protected areas of Bihor County, their conservation through in vitro multiplication", în: Analele Univ. din Oradea, Fascicula: Protecția Mediului,vol.XXIII, Ed. Univ. din Oradea, 553-565.

Agud E., 2014, " In vitro conservation and multiplication of Dianthus spiculifolius specia deriving from the protected areas of Valea Galbenei and Piatra Bulzului, specie critically endangered (CR) ", în Analele Univ. din Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XXIII, Anul 19, Ed. Universității din Oradea, 835-844.

Agud E., 2015, " Multiplicarea in vitro a unor taxoni din ariile protejate ale județului Bihot, critic perclitate cu extincția (Drosera rotundifolia)" în Social Science Electronic Publishing Impactul transformărilor socio-economice și tehnologice la nivel national, european si mondial;2/2015, Vol. 2, Romanian Acad. – Instit. for World Economy.

Agud E., Laslo V., Zăpârțan M., 2015, "In vitro reaction of the Majorana hortensis Moench species depending on the nature of the cytokinin and the explant", în Analele Univ. din Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XXV, Ed. Univ. din Oradea, 145-154.

Agud E. M., Laslo V., Zăpârțan M, 2015, " Reaction of Explants from Lavanda Angustifolia Miller, Cultured in vitro on the Purpose of Multiplication and Callus Differentiation": Nat. Resources and Sustainable Development, vol. 5 Univ. of Oradea Publishing House,7-14.

Agud Eliza, 2018, "Tratament with low temperatures applied to the bulbs of Narcisus poeticus L for the stimulation of the in vitro regeneration and bulbification" , in : Natural Resources and Sustainable Development, vol. 8, Univ. of Oradea Publishing House, 49-58.

Alexan M., Bojor O., Crăciun F., 1992, "Flora medicinală a României", Ed. CERES, Buc.

Ardelean M., Botez C., Savatti M., Tămaș E., Savatti M. jr., Sestraș R., Müllre M., 1995, "Impactul biotehnologiilor moderne asupra creării de noi soiuri de plante de culturǎ", Bul. USAMV, Cluj, A-H, 49/2.

Ardelean M., Sestraș R., Cordea M., 2002, "Tehnicǎ experimentalǎ horticolǎ", Ed. AcademicPres, USAMV, Cluj-Napoca.

Badea E., Raicu P., 1984, "Diferențierea și regenerarea plantelor în culturi de celule și țesuturi", În: Culturi de celule și țesuturi vegetale, Aplicații în agriculturǎ, Ed. Ceres, Buc.

Badea E., Săndulescu D., 2001, "Biotehnologii vegetale", Fundația Biotech., Buc.

Bajaj, Y., 1983a, "In vitro production of haploids", In: Handbook of Plant Cell Culture, vol. I, Techniques for Propagation and Breeding, MacMillan, New York.

Bajaj Y. 1986, "In vitro preservation of genetic resources", IAEA-SM-282/66 Vienna.

Bavaru A., Godeanu S., Butnaru G și Bogdan A., 2007, "Diversitatea și ocrotirea naturii", Editura Academiei Române București.

Bigot C., 1980, "Quelques aspects de la néoformation spontanée de bourgeons", In : La multiplication végétative des plantes supérieures, Paris.

Bojor O., Alexan M, 1983, "Plantele medicinale și aromate de la A la Z", Ed. Recoop, Buc.

Boșcaiu N., Coldea G., Horeanu C., 1994, "Lista roșie a plantelor vasculare dispărute, periclitate, vulnerabile și rare din Flora României". Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38 (1), Buc.

Botez C., Ardeleanu M. Savatti M., 1995, "Noi orientǎri ale cercetǎrii fundamentale și aplicative în genetica și ameliorarea plantelor", Bul. USAMV A-H, 48.

Butiuc, K.A, Zăpârțan M., 1996,"Influence of natural maize extract upon the organogenesis in vitro in some flowery species", Iliev I., Zhelei, P., Aleksandrov, P (eds). IPPS in Bulgaria – Sec. Scientific Confer. Sheek and Share Ed. Sofia.

Butiuc A., Zăpârțan M. Borza T., 1996, "The influence of citokinins on induction and growth of minitubers obtained in vitro in Desiree potato cultivar", În. Univ. Oradea, Fas. Biol. Tom III, 82-90.

Butiuc-Keul A., Cheregi O., Zăpârțan M., Deliu, C., 2003, "Influence of Growth Regulators of in vitro Regeneration and Multiplication of Aprricot", Contribuții Botanice, XXXVIII, 2003, Grădina Botanică a UBB, Cluj-Napoca, 69-76.

Cachiță D, 1987, "Metode in vitro la plantele de cultură, Bazele teoretice și practice", Ed. CERES, București.

Cachița Cosma D., Ardeleanu A. Crăciun C., 1997, "Actualitate și pespective în bioteh. vegetale", Ed. V. Goldiș, Arad.

Cachiță Cosma D., Sand C., 2000, "Biotehnologie vegetalǎ", vol. I, Ed. Mira Design, Sibiu.

Cachiță Cosma D., Deliu C., Racoși-Tican L., Ardelean A., 2004, "Tratat de Biotehnologii vegetale", Vol. I, Ed. Dacia Cluj-Napoca.

Cachiță Cosma, D., Ardeleanu A., 2009, "Tratat de Biotehnologii vegetale", Vol. II, Ed. Dacia Cluj-Napoca.

Catană C., 2005, "Biotehnologii celulare", Ed. RISOPRINT, Cluj-Napoca, 48-55.

Ciocîrlan V., 1988, "Flora ilustrată a României", Ed. CERES, vol II., 331.

Coldea, Ghe., Fărcaș, S., Ciobanu, M., Hurdu, B., Ursu, T., 2008, Diversitatea floristică și fitocenotică a principalelor situri protejate din P.N.M. Apuseni………..?????

Crăciun F., Bojor M., Alexan M., 1977 "Farmacia naturii", II, Ed. CERES, Buc., 70-74.

Cristea V., Denaeyer S., Herremans J.P., Goia I., 1996, "Ocrotirea naturii și Protecția Mediului în România", Ed. Univ. Press., Cluj-Napoca, 365.

Cristea V., Denaeyer S., 2004, "De la Biodiversitate la OGM-uri", Ed. EIKON, Colecția UNIVERSITAS, seria BIOLOGIE, Cluj – Napoca.

Cristea V., Miclăuș M., Pușcaș M., Halmagyi A., 2004, "The micropropagation of some endemic or rare taxa from Gilău, M-le Mare massif" Contrib. Bot., XXXIX,Cluj, 201-209.

Cristea V., 2010, "Culturi in vitro fotoautotrofe la speciile de Dianthus endemice și periclitate din România", Ed. Todesco, Cluj – Napoca.

Deliu C., Deliu M., Zăpârțan M., Ispas G., 1993 – 1994, "Producția de alcaloizi protoberberinici în culturi de suspensii celulare și în celule de Berberis parviflora imobilizate", în: Contrib, botanice, Grădina Botanică a Univ. Babeș-Bolyai, Cluj, 139-144.

Deliu C., Zăpârțan M., Tămaș M., 1994, "In vitro regeneration, multiplication and the obtainance of callus at Gingko biloba L.", în: al IV-lea Simpozion de Biofarmacie și Biofarmacocinetică, UMF Cluj-Napoca, 219.

De Langhe E., 1984, "The rol of in vitro tehniques in germoplasm conservation". In: Holden, JHW., Williams, JT., (eds), Crop Genetic Resources: Conservation and Evaluation, Allen and Unwin, London.

Dihoru Ghe., Dihoru A., 1994, "Plante rare, periclitate și endemice din flora României – Lista roșie", Acta Bot. Hort. București, 173-197.

Dihoru G., Negreanu G., 2009, "Cartea roșie a plantelor vasculare din România", Ed. Academiei Române București.

Engelman F., 1997, "In vitro conservation methods", in: Callow, J. A., Ford-Lloyd, B. V., Newbury, H. J., (eds.) Biotechnology and Plant genetic Resources, 119-161.

Fay M.F., 1992, "Conservarea of rare and endagered plants using in vitro methods", In vitro cell. Dev. Biol., 28, 1-4.

Farusworth E., (Author), Sahotra S. (Editor), 2008, "Conservation and management of rare plant species", in: Encyc. of Earth. Eds. Culter J. Cleveland (Wash., D.C., Environmental Inform. Coalition, Nati. Council for Sci. and the Enviro.).Publi. in the Encyc of Earth August 28, 2007; Retrieved January, 2008.

Godeanu S., Paraschiv G., 2005, "Compendiu de lucrări în ecologia aplicată", Ed. Bucura Mond. București.

Halmágyi A., Butiuc-Keul A., 2007, "Conservarea resurselor genetice vegetale", Ed. Tedesco, Cluj-Napoca.

Ianoși S., 2002, "Cultura cartofului pentru consum", Ed. „Phoenix” București.

Iliescu A. F., 2008, "Cultura arborilor și arbuștilor ornamentali", Editura. CERES.

Jain S. M., 2001, "Tissue culture – derived variation in crop improvement", Editura, Euphytica, 118, 153-166.

Larkin PJ., Scowcogt WR., 1981, "Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant improvement", Reso. Appl. Genet., 60, 197-214.

Laslo V., 2004, "Micromultiplicarea la cais", Ed. Univ. din Oradea.

Laslo V., Vicaș S., Agud E., Zăpârțan M., 2011, "Methods of conservation of the plant germplasm. In vitro techniques", în: Analele Univ. Oradea, Fascicula: Protecția Mediului, vol. XVI B, Ed. Univ. Oradea, 697-708.

Laslo V., Zăpârțan M., Agud E., 2011, "In vitro conservation of certain endangered and rare species of Romanian spontaneons flora", în: Analele Univ. din Oradea, Fascicula: Protecția Mediului,vol.XVI A, Ed. Univ. din Oradea, 247-252.

Laslo V., 2013, "Biotehnologiile vegetale și aplicațiile lor” Ed. Univ. din Oradea.

Laslo V., Zăpârțan M., Agud E., 2013, "The in vitro reaction of the Drosera intermedia Hayne species, a critically endangered species of Romanian flora", în: Analele Univ. din Oradea, Fascicula : Protecția Mediului,vol.XXI, Ed. Univ. din Oradea, 631-640.

Laslo V., Agud E., Zăpârțan M., 2014, "Rate of in vitro differentiation of minitubers in the "Sante"potato variety depending on time of sampling and medium composition",în: Anal Univ. Oradea, Fasciola: Protecția Mediului, vol. XXIII, Ed. Univ. Oradea, 681-688.

Laslo V., Agud E., Zăpârțan M., 2015, "The regenerative and in vitro multiplication capacity of apical tissue of Rosmarinus officinalis L. on mediums with low hormones content", An. Univ. Oradea, Fascic. Protec. Mediu.,vol. XXIV, Ed. Univ. Oradea, 171-180.

Maior M.C., Cadar L., Rakosy-Tican L., 2005, "Studii privind conservarea in vitro a unor specii de Solanum, în absența fitohormonilor", În: al XIV-lea Simpozion Nați. de Culturi și Celule Vegetale, Ed. Alma Mater Sibiu.

Milică C.I., 1983 "Aplicarea regulatorilor de creștere în culturile horticole", Sinteza nr. 734, București,104 – 112.

Morar G., 1999, "Producerea și înmulțirea cartofului de sămânță", Ed. Risoprint, Cluj.

Munteanu L. S., Borcean I, Axinte M., Roman Gh. Vol I- 2001 și II – 2003, "Fitotehnie", Editura Ion Ionescu de la Brad, Iași.

Munteanu L. S., Tăma M., Munteanu S., Muntean L., Duda M.M., Vârban D.I., Florian, S., 2007, "Tratat de plante medicinale, și spontane", Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

Munteanu L.S., Cernea S., Morar G., Duda M.M., Vârban D.I., Munteanu S., 2008, "FITOTEHNIE", Editura „AcademicPres”, Cluj-Napoca.

Murashige T. Skoog F., 1962, "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture", In: Physiol. Plant., 15, 374-497.

Neamțu G., Irimie F., 1992, "Fitohormoni de creștere", Ed. CERES, București, 45 – 101.

Nazadt L. (coord), 1993, "Plante medicinale și condimente – principii active și întrebuințări", Ed. Aquila, București.

Olteanu M., Negreanu G., Popescu A., Roman N., Dihoru. G., Sandală V., Mihăilescu S., 1994, "Lista roșie a plantelor superioare din România, Studii Sinteze Documentații de Ecologie", Academia Română, Instit. de Biol. București., 16-31.

Opriș T., 1990, "Plante unice în peisajul românesc", Editura Sport-Turism, București.

Orton T.J., 1984, "Somaclonal variation theoretical and practical considerations", In: Gustafson (Ed.) Gene Manipulation in Plant Improvement, Pl. Press. New York.

Păun E., Mihalea A., Dumitrescu A., Verzea M., Cojocariu O., 1986, 1988, "Tratat de plante medicinale și aromatice cultivate", Vol. I și II, Ed. CERES, București.

Pârvu C., 2002-2004, "Enciclopedia plantelor, plante din flora Românie", Vol. I., Ed. Tehnică București,154 – 156.

Pârvu C., 2004, "Enciclopedia plantelor din flora României", Vol. II, Ed. Tehnică. București, Vol III, 557-565;

Pârvu C., 2004, "Enciclopedia plantelor- plante din flora României", Vol. III, Ed. Thenică. București, pp. 496-503.

Pop C. L., 2009, "Ecologie și conservarea biodiversității”, Ed. Risoprint, Cluj – Napoca.

Primack R. H., 2002, "Conservarea diversității biologice”, Ed. tehnică, Buc. (traducere).

Puia I., Sora S., Carlier L., Rotar I., Vlahova, M., 2001, "Agroecosisteme și ecodezvoltare", Ed. AcdemicPress USMV.

Raicu P, Badea E, 1986, "Cultura de celule și biotehnologiile moderne", Ed. Știin. și Encicl.

Raicu P, Badea E., 1990, "Biotehnologii moderne", Ed. Tehnicǎ București.

Ristoiu T, Ristoiu D., 2003, "Ecologie – aplicată", Ed. Univ. TehnicePress, Cluj-Napoca.

Roman V, Morar G, Robu T, Ștefan M., Tabără V., Axinte A., Borcean I., Cernea S., 2012, "FITOTEHNIE", Vol. 2. Plante tehnice, medicinale și aromate, Ed. Univ, Buc., 375-377.

Sarasan V., Cripps R., Ramsay MM., Atherton C., McMichen M., Prendergast G., Rowntree J.., 2006, "Conserv. in vitro of threstened plants – progress în the past decade", In vitro Cel. and Develop. Biol. – Plant, 42, 206-214.

Sarasan V., et all., 2006, "Conservarea in vitro of threated plants-progress in the past decade", In vitro culture and decelopmental Biol., Plant, 42, 91-97.

Săvulescu T., (ed.), 1966, "Flora României", Vol. XI , 427-435.

Săvulescu T., (ed.)., "Flora, R.P.R.", de la Vol. I – 1952., Vol. XIII-1974.

Sârbu I., Chifu T., 2003, "Lista roșie a plantelor vasculare din Moldova", Memoriile Secțiunea Științifică, Acadademia Română, 4 (24), 131-151.

Sârbu A. (coord.), 2007, "Arii speciale pentru protecția și conservarea plantelor din România", Ed. Victor, B. Victor, București.

Schenk R, Hidebrandt A, 1972, "Medium and techniques for education growth of monocotyledonous and dicocotyledonous plant cell cultures", Can., Ju., Bot., 50, 199-204.

Shepard F.W., 1980, "Mutant selection and plant regeneration from potato mesophyll protoplasts", In: Emergent techniques for the genetic improvement of crops, Univ. MinneapolisPress, Minneapolis.

Sonea V., Palade L., Iliescu A.F., 1987, "Arhitectură peisajeră", Ed. Didactică și pedagogică, București, 28-36.

Shepard F.W., 1980, "Mutant selection and plant regeneration from potato mesophyll protoplasts", In: Emergent techniques for the genetic improvement of crops, Univ. MinnapolisPress, Minneapolis.

Täuber F., 1980, "Preocupări pentru conservarea florei autohtone", Rev. Ocro. Nat. și Med. Înconju., 2.

Tampsett A.A., 1980, "Advancing and retarding flowering of narcissus Grand Soleil", in: Acra Hort., 109, 57-63.

Toniuc N., Olteanu M., Romanca G., Zamfir, U, 1992, "List of protected areas in România "(1932-1991), Ocrotirea Naturii și Mediului, Înconjurător, 31, 1: 123-133.

Toniuc N., Purcelean L., Boșcaiu N., 1994, "Rezervații biogenetice și importanța lor pentru conservarea genofondului", Ocrotirea Nat. și Med. Înconjurător, 38: 2: 107-113.

Woodon W.R., Russel MA., 2003, "The role of biotechnology in agriculture today and future", AgroTimișoara.

Withers LA., 1990b, "Tissue culture in the conservation of plant genetic resources", International workshop on tissuew culture for the conservation of biodiversity and plant genetic resources, Kuala-Lumpur, 1-25.

Yamagishi M., 1993, "Effects of in vitro culture temperature and cold treatment on breakage of dormancy in bulblets of Lilium japon.", Bull., RIAR, Ishikawa Agr. Coll., 3.

Zăpârțan M., 1990, "Low Temperatures Replaced by Giberellin (GA3) for Blooming Enhancement in certaine Bulb-Rooted Plants", în: Contri. Bot., G.- Botanică a Univ. Cluj.

Zăpârțan M., 1994, "The conservation of some rare and protected plants from Romania using in vitro methodes", in: VIII-th International Congres of Plants Tissue and Cell, Culture, Firenze. June 12-17, 44.

Zăpârțan M., 1994, "Conservation of endemic, rare and endangered species in the Romania flora using in vitro methods", in: Proceeding of the 8-th national Symp. of Industrial Microbiology and Biotehnology, București.

Zăpârțan M., Deliu C., Tămaș M., Ispas G., 1994, "Cercetări privind regenerarea in vitro multiplicarea și obținerea de calus la Arnica montana L. Analiza chimică a biomasei, in Al IV-lea Simp. de Biofarmacie și Farmacocinetică, UMF Cluj-Napoca, 219.

Zăpârțan M, 1995, "Specii endemice rare și ocrotite conservate prin tehnici de cultură in vitro (Dianthus spiculifolius Schur.)", Anuarul Univ. Oradea, Biologie II, 42-49.

Zăpârțan M., 1995-1996, "Rolul culturilor de țesuturi în conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură", În: Contribuții Botanice, Cluj-Napoca.

Zăpârțan M., 1996a, "Rolul culturii de țesuturi in conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură", în: Contribuții Botanice, 1995-1996, 217-221.

Zăpârțan M., 1996b, "Conservarea of Leontopodium alpinum using in vitro techniques in Romania", in: Bot. Garden Microprop. New (Kew), 2. 26-29.

Zăpârțan M., 1997, "Fritillaria meleagris (L), specie rară și vulnerabilă conservată prin tehnici de cultură in vitro": Cachiță, Ardelean, Crăciun (eds.), Ed. Vasile Goldiș, 162-166.

Zăpârțan M., Deliu C., 2001, "Studies of in vitro regeneration and multiplication of Arnica montana L", in: Contribuții Botanice, XXXVI, Grădina Botanică din Cluj-Napoca.

Zăpârțan M., 2001, "Conservarea florei spontane prin înmulțire in vitro", Editura AlMedia Group, Cluj- Napoca.

Zăpârțan M., Laslo V., Agud E., 2014, "Ariile protejate, formă de conservare a biodiveristății", Editura EIKON/ CARTEA ROMÂNEASCĂ, Cluj – Napoca.

*** Encyclopédie universelle des 15.000 de plantes, 2000, Christopher Brickell, en association avec la Royal Hortic. Soci(eds.), Ed. LAROUSSE-BORDAS, imprim. Germania iulie, 142- 144.

*** Enciclopedia ilustrată a florilor și florei sălbatice, 2008, Ed. Aquila’93, Oradea (trad. Balaj)

*** BOTANICA , 1997, Encyclopédie de botanique et d`horitculture, plus de 10.000 plantes du monde entier (Ed. Könemann) Cologne, 120 -122; 184-186; 592-595.

*** Conferința ONU de la Rio de Janeiro, 1992: Convenția biodiverstsității; Rețeaua ecologică „Natura 2000” .

***IBPGR (Intern. Broard for Plant genetic resources),1986, Design, planning and operation of in vitro genebanks, IBPGR, Rome: IUCN, 2006: Internati. Union for the Conser of Nature.

***Legea nr. 5/2000 privind aprobarea planului de amenajare a teritoriului național.

*** WWF: World Wildlife.*** Lista Roșie UICN (http://www.iucnredlist.org) .

***2007Planul de management al Parc Natural Apuseni.20PNAp%2030.11.2007.doc.

*** http://www.iucnredlist.org/info/2007RL_Stats_Table%202.pdf

***http://www.capdd-bihor.org/downloads/PNAP/1.%20Plan%20de%20

***(http://www.natureserve.org/aboutUs/PressReleases/IUCN_Red_List_release.pdf). ***(http://www.bgci.org.uk/files/7/0/global_strategy.pdf).

GLOSAR

Abiotic = mediu de viață a plantei determinat de factorii abiotici (omul, poluarea, seceta, factori climatici extremi).

Acid abscisic = fitohormon implicată în dormanță și în mișcările stomatelor.

Acizi nucleici = substanță din celula vie responsabilă de transmiterea informației genetice (ADN, ARN).

Aclimatizare = fenomenul de adaptare a plantelor la un spectru larg al intensității luminoase.

Adaptare = găsirea condițiilor de supraviețuire a unui organism (planta) în condiții noi de mediu, altele față de cele în care s-a obținut organismul (cu acordarea sprijinului).

ADN = acid dezoxiribonucleic, lanț de molecule din celule care prin mesajul lor controlează funcțiunea celulelor.

Aminoacid = acid alcătuit din gruparea: amino liberă NH2 și gruparea carboxil COOH, cu rol de proteină la plante.

Agar = solidificant, polizaharid extras din algele roșii.

Alcaloizi = produsi naturali (nonpectinici) ai metabolismului secundar.

Alelopatie = interacțiune chimică între plante sau între plante și microorganisme.

Amidon = prezent în plastide, un polimer al glucozei.

Antociani = pigmenți ai flavonelor de diferite culori.

Apex = meristem apical, extremitatea unui organ.

ARN = acid ribonucleic: matrice pentru sinteza de proteine.

Aseptic = steril, liber de microorganisme.

Axilar = mugur axilar, situat la axila frunzei sau a țesuturilor.

Autoclavare = sterilizarea materialelor prin autoclav, aparat care funcționează xu aburi sub presiune.

Auxine = fitohormoni naturali sau sintetici întâlniți în plante, implicați în alungirea celulei și în tropism.

Bancă de gene = colecție formată din germoplasmă (semințele unor specii), celule, țesuturi, organe.

Biodiversitate = multitudinea (diversitatea) florei și faunei din natură.

Biomasă = masă de celule produse din organismul viu al plantei din care se extrage metaboliții secundare și alte substanțe.

Biotehnologii = Metodă care folosește sistemele biologice din lumea vie.

Calus = țesut care se formează pe o zona vătămată a unui organ: in vitro este o înmulțire haotică de celule cu creștere neorganizată.

Calusogeneză = procesul prin care se diferențiază calusul.

Caulogeneză = procesul de diferențiere a mugurilor și tulpinilor.

Celulă = unitate mică structurală a unui organism viu.

Celuloză = polizaharid care asigură structura microfibrelor peretelui celulei vegetale.

Ciclu celular = proces moro-fiziologic și biochimic care are loc într-o celulă.

Circadian = ritmul înregistrat în perioada de 2 de ore.

Citochinine = fitohormoni naturali și sintetici cu rol împotriva îmbătrânirii țesutului (senescenței) și în diviziunea celulară.

Clonă = celule, țesuturi sau plante identice genotipic.

Clonare = proces de producere a clonei (grup de celule) identice cu genitorul (strămoșul).

Cloroplaste = organit de formă lenticulară sau plană în care are loc fotosinteza (mai exact la nivelul pigmenți din interiorul ei).

Conservare in situ = conservarea în ecosistem a resurselor genetice naturale, habitatul lor.

Conservare ex situ = conservarea plantelor în afara habitatului de origine a viații natirale.

Conservare in vitro =înmulțirea plantelor din țesuturi sau explante (celule, organe, porțiune din organe etc.) în condiții controlate de mediu in vitro (reglarea la optim a temperaturii, luminii, umidității etc.).

Cormofite = plante superioare.

Creșterea = procesul de mărire în lungime sau volum a dimensiunii celulelor.

Cultură primară = rezultă din prelevarea directă a explantului (meristem, țesut, celulă. Organ și porțiune din organ etc) in vitro.

Cultivar = soi sau varietate cultivată obținută artificial prin tehnica de ameliorare.

Cultură = în scop de înmulțire și creștere a țesuturilor, celulelor etc. pe medii artificiale.

Dediferențierea celulară = procesul de destabilizare și deviere a etapelor de dezvoltare la plante.

Dezvoltare = parcurgerea etapelor de la stadiul de sămânță la formarea de noi semințe: sau de la un organ până la formarea plantei și ajungerea la senescență.

Diferențierea = pierderea progresiv a caracterelor morfologice(caracterul celulei embrionare).

Diversitate biologică = varietatea organismelor din ecosistem sau dintr-un complex ecologic: dintre specii sau specii și ecosistem.

Dezinfectare = proces de omorâre a microorganismelor din țesuturi, prealabil cultivării in vitro.

Ecologie = știința care studiază relația dintre organism și mediul abiotic de viață.

Ecosistem = sistem unitar format din interacțiunea organismului cu mediu.

Embriogeneza = procesul de dezvoltare a embrionului seminței pornind de la zigot.

Embrion = organizarea în primele stadii de dezvoltare.

Endogen = existent în interiorul organismului sau al celulei (opus exogenului).

Endosperm = țesut din sămânță unde sunt depozitate substanțele organice.

Etilena = fitohormon cu rol în coacerea fructelor.

Etiolare = creșterea anormală a plantei din lipsă de lumină (îngălbenire și alungire).

Evoluție = schimbarea eredității speciei în timp mai lung: fenomen cunoscut și la apariția unei noi specii.

Exogen = apărut din intervenții externe (opus endogenului).

Expansiune = proces reversibil sau ireversibil de mărire a dimensiunii celulei vegetale.

Explant = fragment dintr-un organ, detașat de la locul lui de origine, inoculat și cultivat pe medii aseptice.

Extracte naturale = substanțe organice extrase din plante, cu proprietăți stimulatoare care pot înlocui fitohormonii din mediu.

Factori de creștere = substanțe cu rol în stimularea creșterii noilor țesuturi (explante).

Fenoli = substanțe ale metabolismului secundar cu rol în mecanismul defensiv (întâlniți atât la plante cât și la animale).

Fenotip = trăsăturile vizibile ale unui organism.

Fitocrom = fotoreceptor implicat în procesele creșterii și dezvoltării (la radiațiile roșii).

Fitohormoni = hormoni ai plantelor (naturali sau sintetici), substanțe organice naturale sau chimice care induc sau modifică controlat creșterea.

Fitomere = unitatea de dezvoltare formate din două sau mai multe frunze, nodurile internodiile aferente și muguri axilari (se formează din meristemul apical caulinar repetitiv, în condiții de mediu favorabile).

Flavonoizi = compuși fenolici, pigmenți roșii, albastrii, galbeni etc.

Fotomorfogeneza = procesul de dezvoltare a plantelor sub influența luminii și transformarea biochimică a semnalului luminos cu intensificarea proceselor creșterii și dezvoltării.

Fotoperiodism = reacția plantelor la diferențele de lumină dintre zi și noapte.

Fotoautotrofă = cultură a explantelor vegetale care trăiesc in vitro în lipsa sursei de glucide din mediu și are loc la nivelul inoculilor cu cloroplaste și îmbogățite cu CO2 și suplimentarea intensității luminii.

Fotoperioadă = perioada de lumină necesară plantei pentru a supraviețui zilnic.

Fotosinteză = proces caracteristic plantelor verzi prin care sintetizează substanțele organice din CO2 și apă, substanțele neorganice fiind absorbite de pigmentul clorofilian prin lumină.

Friabilitate = tendința celulelor de a se separa unele de altele.

Genă = secvență din molecula de ADN care conține informația genetică.

Geotropism = creșterea asimetrică a plantelor sub acțiunea forței gravitaționale.

Germinația = hibridarea semințelor, urmată de procesul creșterii embrionului.

Germoplasmă = material genetic care formează baza fizică, moștenită din generații în generații.

Gibereline = fitohormoni naturali sau sintetici, în principal cu rol în germinația semințelor și în determinarea sexului florii.

Habitat = locul geografic unde o specie își are originea.

Hibrid = organism rezultat din încrucișarea a doi taxoni diferiți.

Hibrid somatic = celulă mononucleată: rezultată din copulația celulelor somatice rezultate din părinți diferiți.

„in vitro„ = „în sticlă”, termen utilizat pentru un proces care se desfășoară în steril.

„in vivo” = „în viață”, termen pentru definirea oricărui proces care are loc în organism.

Implant = fragment dintr-un organism introdus sau grefat într-un alt organism.

Incubare = timpul de la inoculare până la creșterea plantei in vitro.

Inducerea = provocarea unui proces care are ca rezultat producerea unui fenomen scontat.

Inducție florală = procesul de stimulare a diferențierii a organelor florale și a florii.

Infradian = ritm de creștere și dezvoltare cu perioadă mai mare de 29 de ore.

Inoculare = operațiunea de implantarea unui organ, țesut, celulă etc „in vitro”.

Macroelemente = necesare plantei în cantități mai mari: (H. C. O – nu sunt considerate macro – se formează din apă și CO2): N, F, P, Ca, Mg, S, Si.

Mediu de bază = mediu care conține compușii organici și anorganici dar fără fitohormoni.

Meristeme = zone subterminale din plante caracterizate printr-o accelerată diviziune celulară: țesturi tinere care pot prolifera și se găsesc la toate categoriile de țesuturi.

Metabolism = proces biochimic care susține o celulă sau organism viu.

Micorize = asociații formate între rădăcinile plantelor și fungii din sol: întâlnită la toate gimnospermele, la 83% dicotiledonate și 79% monocotiledonate.

Microelemente = necesare plantelor în cantitate mică: Cl, Fe, B, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo.

Micromultiplicare = înmulțirea in vitro prin țesuturi mici (minibutași).

Minitubercul = tubercul foarte mic generat in vitro.

Morfogeneză = dezvoltarea formei organismului.

Multiplicare = proces de înmulțire a celulelor, de reproducere (sexuat și asexuat).

Multiplicare vegetativă = înmulțire asexuată.

Mutație = Schimbarea eredității genetice.

Necroză =decolorarea și în final tumefierea țesuturilor.

Nod = partea îngroșată de pe tulpină din care se dezvoltă frunzele.

Nucleu = structură a celulei eucariote învelită într-o membrană ce conține material genetic.

Nutrienți = substanțe adăugate în organism pentru a asigura creșterea și dezvoltarea.

Nutriție autotrofă = plantele care își produc singure substanțele organice.

Nutriție chemoautotrofe = plante care își produc substanțele organice din cele minerale folosind energia din oxidarea unor substanțe minerale.

Nutriție heterotrofă = organisme care folosesc carbonul din organisme moarte (plante și animale), numită nutriție saprofită, sau din organisme vii = nutriție parazită.

Nutriție fotoautotrofe = plantele care își produc substanșele organice prin procesul fotosintezei, folosind energia luminoasă.

Organ = țesut sau grup de țesuturi cu morfo-funcționalitate specifică.

Organism = sistem viu individualizat al unei plante, animal etc. cu proprietăți fizico – biologice performante.

Organogeneza= formarea de organe (frunze, tulpini, rădăcini).

Partenocarpia = formarea fructelor fără semințe în urma administrării auxinei la înflorire (frecvent la: tomate, pepene, vinetem pomii fructiferi, vița de vie etc.).

Pasaj = transfer de țesuturi sau celule in vitro pe un mediu proaspăt, modificat în funcție de scopul urmărit și specie.

Peduncul = tulpinița unei flori sau inflorescențe.

Perioadă de repaus = perioada inactivă în ciclul de viață a plantei: etapă obligatorie, pentru unele specii (expl. bulboase).

Pețiol = codița frunzei.

Pigmenți = sunt structuri specializate, capabile să recepteze radiația solară (sunt de trei feluri: clorofilieni, carotenoizi și ficobilini).

Plantulă = tulpină și chiar plantă nouă regenerată in vitro.

Prelevare = desprinderea unui țesut, celulă organ, porțiune din organul unei plante pentru cultura in vitro.

Proliferare celulară = înmulțirea celulelor prin diviziune repetată.

Promeristem = meristem tânăr încă nediferențiat fiziologic (meristemoizi).

Propagare = înmulțirea plantelor dintr-un propagul in vitro.

Propagul = explant = porțiune din organismul plantei (celulă, țesut, nod, frunză etc.) folosite pentru cultura in vitro.

Protocol = etapele în desfășurarea unui experiment.

Protoplast = celulă fără perete celular (înlăturat chimic sau enzimatic), celule vii delimitate la exterior de plasmalemă.

Rata de creștere = creșterea în greutate a țestului într-o anumită perioadă de timp: zi, săptămână, lună.

Regenerare in vitro = posibilitatea unui țesut sau organ izolat cultivat in vitro de a forma noi indivizi, organisme, plante.

Repicare = metodă de transfer sau transplant a unui țesut, organ, porțiune din organ etc. pe medii aseptice proaspete.

Regulator de creștere = substanțe chimice sau naturale care stimulează creșterea și dezvoltarea plantelor. adăugate în concentrației diferite.

Reproducere = intervenția a doi indivizi în înmulțirea plantei.

Reproducere sexuată = cu participarea celor doi gameți, mascul și femel.

Reproducere asexuată = diviziunea mitotică, înmugurirea, spori, înmulțirea vegetativă etc.

Ritm = repetarea unor fenomene din plante la o anume intervale egale de timp.

Rizogeneză = diferențierea și dezvoltarea sistemului radicular (de rădăcini).

Sămânță = rezultat al încrucișării dintre doi parteneri.

Senescență = proces de degradare a componentelor celulare care moartea celulei, țesutului și a plantei.

Simbioza = asociere într-un parteneriat care asigură beneficii organismelor: la plante asocierea cunoscută este între o plantă superioară și un microorganism (fungi sau bacterii).

Soi = vezi cultivar.

Specie endemică = specii care se găsesc numai într-un areal de pe Glob.

Specie periclitată cu extincția = pe cale de dispariție: supusă pericolului cauzat de factorul uman și climatici extremi.

Stres abiotic =provocat de factori ca: poluarea, factori de climă extremisecetă: secetă etc.

Stres biotic = provocat de de factorii biotici: viruși, bacterii, buruieni, ciuperci și dăunători.

Stereomicroscop = microscop binocular care mărește de 10 – 20 de ori.

Sterilizare = asepsizare = metodă de eliminare a microorganismelor din țesutul vegetal.

Subcultură = repasarea țesuturilor sau a noilor plantule din in vitro pe medii proaspete.

Substrat de creștere = substanțe organice sintetizate de plante cu rol în creștere și dezvoltare.

Substrat de cultură = amestec din diferite tipuri de sol, pentru cultura ex vitro a plantelor regenerare in vitro: prealabil dezinfectat.

Temperatura mediului ambiental = gradele de temperatură ale aerului dintr-un spațiu.

Termoperiodism = răspuns al plantelor la alternanța de temperatură.

Timp de subcultură = intervalul de timp necesar unui țesut sau organ vegetal detașat din planta mamă pentru a evolua in vitro.

Totipotență = capacitatea celulelor și țesuturilor vegetale detașate din organismul plantelor superioare, de a forma plante noi, complet organizate.

Transplant = țesut viu plasat după nevoie și scop.

Transplantare = grefarea unei celule, țesut sau organ în altă partea corpului sau în alt mediu sau organism (altul față de cel din care s-a desprins).

Transpirație = eliminarea apei sub formă de vapori de pe suprafața unor organe (frunza).

Ultradian = este ritmul în dezvoltare și creștere cu durată sub 20 ore.

Varietate = la plante, apare la generații la care se disting mai multe caracteristici noi și la care se constată menținerea în timp.

Variație genetică = indivizi diferențiați genetic.

Variație somaclonală = variație manifestată la plantele obținute in vitro.

Vernalizare = nevoia de temperaturi scăzute la unele plante pentru desăvârșirea ciclului de viață.

Vitrificare = sticlozitate = hiperhidrie, apare la țesutul vegetal cultivat in vitro la contact cu execesul de umiditate și la doze prea mari de fitohormoni (în special citochinine).

Zigot = celulă formată din doi gameți ( mai exact oosfera fecundată).

Rezumat

Micropropagarea plantelor in vitro s-a bazat pe teoria lui Haberland (1902-1922), după care celula (unitatea lumii vii), sau țesutul vegetal, detașat din organismul întreg funcționează ca un „organism primitiv” deoarece conține informația genetică necesară regenerării unui nou organism, identic cu planta mamă de la care s-au detașat țesuturile sau celulele pentru înmulțirea in vitro. Capacitatea unei mici unități dintr-un întreg de a regenera in vitro întregul (organismul complet conformat), are la bază teoria totipotenței celulei vegetale, care se realizează numai în anumite condiții. Morel și Martin (1952), bazându-se pe această teorie, au cultivat țesutul meristematic caulinar pe medii aseptice, obținând in vitro plante sănătoase, libere de viruși, cu o rată de înmulțire mare, superioară celei obținute prin metoda clasică.

Cercetările de început din domeniul biotehnologiilor (unele eșuate), au fost analizate amănunțit de către specialiști, iar odată cu intrarea în epoca actuală (după 1960) s-au elaborat tehnici eficiente de regenerare și cultivare a țesutului vegetal pe mediu controlat, stabilind exact faptul că stimularea capacității de regenerare in vitro a celulei sau țesutului pe mediu aseptic și reușita tehnicii sunt date de condiții esențiale de care trebuie să se țină cont: starea fiziologică a țesutului: sunt necesare țesuturi tinere (nu țesuturi diferențiate funcțional), care au capacitate mare de regenerare; compoziția mediului aseptic, care are în conținut, fitohormoni (substanțe stimulatoare ale creșterii) și sursa de carbon (zaharoza ori glucoză).

În Romania există preocupări legate de biotehnologiile vegetale, în toate domeniile, de peste 50 de ani: culturi de celule și suspensii celulare, culturi de protoplaste, studii de embriogeneză somatică etc., dar și de micropropagarea in vitro a unor plante de interes biologic, economic, ornamental, etc. Specialiștii români au elaborat lucrări de valoare care de-a lungul timpului au stat la baza multor cercetări în acest domeniu, dând posibilitatea noilor generații de cercetători de a compara ceea cea au obținut în domeniul micropropagării in vitro (în experiențele lor), cu realizările de început din domeniu. Studiile acestora au constituit și pentru mine un imbold și model în cercetare dar și în elaborarea acestei lucrări.

Am conceput lucrarea pe înțelesul celor ce doresc să se inițieze în aceste domenii, gândindu-mă la nevoia lor de a-și completa cunoștințele din domeniul biologiei și al fiziologiei plantelor (majoritatea lor nu a absolvit un liceu de științe ale biologiei sau ale agriculturii și poate au unele nelămuriri în domeniu). Prin completarea acestor cunoștințe de biologia plantei cu aspecte ale micropropagării in vitro, familiarizarea cu avantajele dar și neajunsurile tehnicii și difuzarea realizărilor obținute de noi în domeniu, am încercat să realizez un tablou complet al microînmulțirii in vitro.

Laboratorul de biotehnologii vegetale al Facultății de Protecția Mediului a Universității din Oradea este relativ tânăr, dar are preocupări moderne și de interes. Eu mă opresc doar asupra cercetărilor de micropropagare in vitro, domeniu important, deoarece este o primă etapă în cadrul biotehnologiilor vegetale. Majoritatea lucrărilor pornesc de la materialul regenerat in vitro (plantulă, calus, etc.) și procedează la diferite experiențe de testare a implicațiilor unor substanțe (fitohormoni, extracte naturale etc.) în evoluția unor plante cultivate in vitro; de verificare a calităților unor soiuri nou ameliorate prin urmărirea reacției lor in vitro (calități care se pot testa cel mai bine prin acest tip de cultură). Sunt doar câteva aspecte care în abordarea lor au la bază materialul multiplicat in vitro și în același timp observațiile noastre pe care am vrut să le prezint într-o lucrare privind principalele rezultate ale cercetărilor noastre, contribuția la multiplicarea unor specii de origine diferită: din flora spontană și cultivată (condimente, aromate, medicinale). De asemenea, am dorit să fac o sinteză a rezultatelor obținute din cercetările legate de comportamentul și capacitatea de mini-tuberizare in vitro a unor soiuri de cartof autohtone și străine, raportându-mă la lucrările de micropropagare in vitro din țară și străinătate.

Lucrarea cuprinde trei părți. Prima parte prezintă aspecte de nutriția plantelor superioare (elementele minerale necesare plantelor, absorbția și funcțiile lor în metabolismul plantei), noțiuni legate de procesul de creștere și dezvoltarea a plantelor (ciclul lor de viață), de rolul fitohormonilor, exogeni și endogeni, în regenerare și multiplicare unor specii in vitro. Am considerat că este necesar să dezvolt câteva noțiuni de bază și să ofer informații despre înmulțirea plantelor superioare (prin sămânță și vegetativă) precum și prin țesut formativ (meristematic).

Partea a doua se întinde pe un spațiu mai larg deoarece cuprinde pe lângă aspecte concrete de micropropagare și totipotența celulei sau țesuturilor vegetale izolate și aspecte de organizare a laboratorului. Am prezentat amenajarea laboratorului de micropropagare (partea sterilă și nesterilă, cu componentele lor), prepararea mediilor aseptice, componentele mediului și etapele de preparare, aspecte legate de modul de sterilizare a vaselor, apei, mediului și a materialului vegetal, selecționarea plantei – mamă donatoare de țesuturi și explante pentru cultura in vitro (tipurile de explante pe care le detașăm din planta-mamă :apex, meristem, porțiuni din plantă, din rădăcină și bulb), cu urmărirea evoluției lor. De asemenea am descris operațiunile aplicate inoculilor (incizarea, inocularea propriu-zisă, opturarea) și condițiile de incubare a flacoanelor cu inoculi, date de factorii din camera de creștere: temperatura, lumina, umiditate, dar și de natura speciei și a explantului. Această parte s-a încheiat cu prezentarea etapelor micropropagării (protocolul de lucru), a proceselor de diferențiere și regenerarea in vitro, de calusogeneza, organogeneza la nivelul explantelor cultivate in vitro (rizogeneza, caulogeneza) și a observațiilor asupra acestor procese, concluzionând dacă au răspuns sau nu scopului urmărit.

Partea a treia „Conservarea și micropropagarea in vitro a unor grupe de specii” cuprinde o sinteză a rezultatelor obținute în cercetarea unor soiuri de cartof și a unor specii din flora spontană, specii aromate, condimente etc. și o prezentare a unor observații legate de utilizarea culturilor in vitro în multiplicarea și ameliorarea cartofului și în înmulțirea și conservarea in vitro a unor soiuri autohtone și străine de cartof (obținerea materialului săditor in vitro – tuberculii – prin tehnici mai puțin costisitoare). Conservarea in vitro a unor specii spontane, a fost și este în continuare un obiectiv de cercetare, care se bazează pe informațiile date de „Cărțile roșii ale plantelor superioare din flora spontană a țării”, privind starea florei autohtone, elaborate de un număr mare de cercetători. Aceste „liste și cărți” sunt actualizate periodic cu noi informații legate de starea florei spontane din Romania. Am prezentat înmulțirea in vitro a unor specii de importanță economică (medicinale, aromate, etc.), prin rezultate în mare parte publicate, dar ale căror date le-am sintetizat și reinterpretat (citând autorii), considerând că în acest fel rezultatele sunt mai ușor puse la îndemâna celor dornici de a ști care este preocuparea noastră.

Prezentarea laboratorului am gândit-o și prin prisma utilității și necesității de a fi prezentat și făcut cunoscut în principal studenților, apoi specialiștilor din domeniu și nu numai, oricărui elev de la clasele primare până la terminarea liceului, sau unor persoane din producție care doresc să vadă concret cum se lucrează într-un laborator de micropropagare, sau ghidării unor delegații care vizitează facultatea. Lucrarea are cca. 228 pagini, tabele schematice, fotografii și grafice, sperând astfel că am adus o contribuție la cunoașterea acestui domeniu al biotehnologiilor vegetale.

Dr. Eliza Maria AGUD

Summary

In vitro micro propagation of plants based on Heberland’s theory (1902-1922), according to whom the cell (the unity of the living world) or the vegetal tissue, detached from the body, functions as a “primitive organism” because it contains the genetic information necessary for the regeneration of a new organism, identical with the mother plant from which the tissues or the cells were detached for the in vitro multiplication. The capacity of a small unity of the whole to regenerate in vitro the whole (the completely conformed organism) is based on the theory of the totipotency of the vegetal cell which is accomplished only in certain conditions. Starting from this theory, Morel and Martin (1952) cultivated the meristematic caulinar tissue on aseptic mediums, obtaining in vitro healthy plants, free of viruses, with a high multiplication rate, superior to the one obtained through the classical method.

Early research in the field of biotechnologies (some failed) were thoroughly analysed by the specialists, and once entered in the actual era (after 1960) there were elaborated efficient techniques of regeneration and cultivation of the vegetal tissue on a controlled medium, establishing the fact that the stimulation of the in vitro regeneration capacity of the cell or tissue on an aseptic medium and the success of the technique are given by the essential conditions that must be considered: the physiological state of the tissue; young tissues (and not tissues functionally differentiated) are necessary, with a great regeneration capacity; the composition of the aseptic medium which is composed of phytohormones and the carbon source (sucrose or glucose).

In Romania there are concerns related to vegetal biotechnologies from over 50 years, in all fields: cell cultures and cell suspensions, protoplast cultures, somatic embryogenesis studies, etc., and also related to the in vitro micro propagation of plants of biological, economical, ornamental interest, etc. Romanian specialists elaborated valuable works which over time stood at the basis of many research in the field, giving the possibility for the new generation of researchers to compare what they obtained (during their experiments) in the field of in vitro micro propagation with the early accomplishments in the field. Their studies represented for me too an impulse and a model in my research and also in the elaboration of this work.

I conceived this work in the meaning of those who wish to get initiated in this field, thinking about their need to complete their knowledge in the field of biology and plant physiology (many of whom did not graduate from a biology science high school or from a high school of agriculture science and maybe have some questions in the field). By completing this knowledge of plant biology with aspects of in vitro micro propagation, by familiarizing with the advantages but also with the shortcomings of the technique, by disseminating the achievements in the field, I tried to accomplish a complete picture of the in vitro micro multiplication.

The plant biotechnology lab of the Faculty of Environmental Protection of Oradea University is relatively young, but it has modern and interesting concerns. I only stopped on the research of in vitro micro propagation, an important field, because they it represents a first stage of the vegetal biotechnologies. The majority of works start from the material regenerated in vitro (plantlet, callus, etc.) and proceed to different experiments of testing the implications of some substances (phytohormones, natural extracts, etc.) in the evolution of some plants cultivated in vitro; of verifying the qualities of some new ameliorated soils by following their in vitro reaction (qualities that can be best tested through this type of culture). These are only a few aspects which are based on the material multiplied in vitro and, at the same time, our observations that I wanted to present in a paper concerning the main results of our research, the contribution to the multiplication of some species of different origin: from the spontaneous and cultivated flora (spices, aromatic, medicinal). Also, I desired to make a synthesis of the results obtained from the research related to the behaviour and capacity of in vitro mini-rooting of some autochthonous and foreign potato varieties, referring to the works of in vitro micro propagation works in the country and abroad.

The work has three parts. The first part presents aspects related to the nutrition of superior plants (mineral elements necessary to plants, the absorption and their functions in the plant’s metabolism), notions related to the growth process and development of the plants (their cycle of life), to the role of exogenous and endogenous phytohormones for the in vitro regeneration and multiplication of some species. I considered that it was necessary to develop a few basic notions and to offer information about the multiplication of the superior plants (through seed and vegetative) and also through formative (meristematic) tissue.

The second part is the largest because it encompasses both concrete aspects related to micro propagation and to the cellular or to the isolated vegetal tissues totipotency and also aspects related to the organization of the lab. I presented the setting up of the micro propagation lab (sterile and unsterile part, with their components), the preparing of the aseptic mediums, the components of the medium and the preparation stages, aspects related to the way of sterilization of vessels, of water, environment and vegetal material, the cutting of the plant – mother donating tissues and explants for the in vitro culture (types of explants that we detach from the mother-plant: apex, meristem, parts of the plant, of the root and bulb), with the following of their evolution. I also described the operations applied (incising, inoculation, closing) and the conditions for the incubation of the bottles given by the factors from the growth chamber: temperature, light, humidity, and also by the nature of the specie and of the explant. This part concluded with the presentation of the stages of micro propagation (the working protocol), of the processes of in vitro differentiation and regeneration, of callusogenesis and organogenesis at the level of the explants cultivated in vitro (caulogenesis), and of the observations on these processes, concluding weather they responded or not to the followed purpose.

The third part “In vitro conservation and micro propagation of some groups of species” encompass a synthesis of the results obtained in the research of some potato varieties and of some species of spontaneous flora, aromatic species, spices, etc., and a presentation of the observations related to the use of in vitro cultures for the multiplication and amelioration of the potato and for the in vitro multiplication and conservation of some foreign and domestic varieties of potato (obtaining the planting material in vitro – tubers – through less expensive techniques). In vitro conservation of some spontaneous species, was and still represents a research objective which is based on the information given by the “Red book of the superior plants from the country’s spontaneous flora”, concerning the state of the autochthonous flora, elaborated by a great number of researchers. Those “lists of books” are periodically updated with new information related to the state of the spontaneous flora of Romania. Then, I presented in vitro multiplication of some species of economic importance (medicinal, aromatic etc.), through results that are most of them published, but whose data I synthesized and reinterpreted (quoting the authors), considering that hence the results are much easily accessible to the one who desire to know more about our concerns.

The presentation of the lab was thought through the angle of its use and of the need to present it mainly to the students and then to the specialists in the field and not only, but to any pupil from the primary school to the high school, or to some people who desire to see the work in a micro propagation lab, or in order to represent a guide for the delegations which visit the faculty. The paper has about 228 pages. It also has schematic tables, pictures and graphics, in the hope of bringing our contribution to the knowledge in the field of vegetal biotechnologies.

PhD. Eliza Maria AGUD