Microflora Solului Si Calitatea Mediului. Studiu de Caz Dinamica Parametrilor Microbiologici Ai Solului Viticol

Motto:

“Bogăția cea mai de preț cu care a fost dăruită o națiune este pământul.

Pământul este binecuvântat cu o caracteristică unică și deosebit de valoroasă, fertilitatea.”

"….În afara iubirii aproapelui, omul trebuie să iubească natura, inclusiv florile, păsările și copacii, fiecare părticică din mediul natural pe care-l distrugem în mod constant. Pe lângă contractul moral cu Dumnezeu, pe lângă contractul moral încheiat cu oamenii, trebuie acum să încheiem un contract moral și politic cu natura, cu acest Pământ căruia îi datorăm existența noastră și care ne dă viață. ……PĂMÂNTUL ARE SUFLET ."

[NUME_REDACTAT]

CUPRINS

INTRODUCERE

Rolul important exercitat de către microorganisme pentru sol și plante este pe deplin demonstrat de numeroase cercetări.

Diferite specii de microorganisme realizează în sol un sistem ecologic echilibrat prin adaptarea reciprocă a speciilor componente și a ansamblului viu la condițiile abiotice ale mediului.

Speciile micropopulației solului alcătuiesc o biocenoză, în care stabilitatea se observă doar ca un moment trecător. Multiplele transformări de substanță duc în cele din urmă la realizarea unora sau mai multor cicluri trofice, care reprezintă elementul de legătură dintre speciile care populează solul, precum și dintre ansamblul lor și mediul abiotic. In diferitele momente ale vieții solului pot exista specii dominante care imprimă caracteristici generale ale circuitului materiei și energiei în ecosisteme, ceea ce reprezintă un factor important de autoreglare.

In sol există spori ai unor microbi patogeni, microorganisme patogene, care prin metabolismul lor nu influențează cu nimic biologia solului. Se consideră că numai microorganismele care își petrec în sol faza vegetativă de dezvoltare și în condiții favorabile execută procese ce influențează particularitățile fizico-chimice, biologice și agricole ale solului, făcând parte integrantă din sistemul biologic al solului. In ansamblu, microorganismelor din sol le sunt specifice două categorii de procese biologice: de degradare, prin care se eliberează din materia organică substanțe minerale accesibile plantelor; procese de sinteză, care crează în sol o rezervă de substanțe nutritive, mai cu seamă sub formă organică, ceea ce influențează starea fizio-chimică și fertilitatea solului. Cunoașterea profundă a acestor procese și dirijarea lor rațională pot contribui la îmbunătățirea condițiilor din sol și deci la ridicarea producției agricole.

Studiul participării microorganismelor la cele mai complexe procese pedologice se axează în principal pe următoarele direcții de cercetare:

cunoașterea cât mai completă a stării biologice a solului, prin studiul comparativ al activității microflorei generale și a grupelor fiziologice de microorganisme, fiecare cu funcții bine determinate;

studiul echilibrului dinamic stabilit între grupele fiziologice de microorganisme și oscilațiile pe care le suferă acest echilibru în procesele naturale de formare a solului și cursul transformării acestuia , sub influența diferiților factori legați de cultivare.

In ansamblu, prin cunoașterea și menținerea sub control a biologiei solului sub dublu aspect, momentan și evolutiv, este posibilă compararea diferitelor orizonturi ale unui sol, diferitelor soluri, constatarea unui eventual dezechilibru, stabilirea raporturilor posibile între microfloră și fertilitate precum și atribuirea termenului de calitate biologică a solului, strâns dependentă de activitatea microorganismelor din sol.

Aprecierea oportunității sau inoportunității efectuării analizelor microbiologice ale solului este motivată de existența problemelor metodologice specifice (dimensiuni, heterogenitate populațională, existența unor forme stresate), care complică studiul microflorei telurice.

Scopul lucrării de față vizează prezentarea influenței diferitelor sisteme de întreținere a solului viticol asupra parametrilor microbiologici, pornind de la formularea următoarelor obiective majore:

surprinderea modificărilor calitative ale microflorei totale din solul viticol sub influența diferitelor sisteme de întreținere a solului

dinamica grupelor fiziologice de microorganisme implicate în realizarea ciclului biochimic al azotului în solul viticol.

CAPITOLUL 1

Solul – dimensiune a mediului înconjurător

Starea naturală a solului. Alcătuirea generală a solului.

Pornind de la premiza că starea naturală a unui sol poate fi cuantificată ca reprezentând: STAREA DE SANATATE A SOLULUI = CALITATEA SOLULUI (chimică si biologică) = FERTILITATEA SOLULUI

se poate aprecia într-o manieră generală că principalele componente ale stării de sănătate a solului sunt:

1.FERTILITATEA reflectarea potențialului agronomic în directa țcorelatie cu activitatea biologică a solului de a răspunde la cerințele plantei cultivate;

2.STAREA SANITARĂ (senso lato) prezența sau absența organismelor dăunatoare, a germenilor patogeni (ciuperci, bacterii), a buruienilor;

3.EXTERNALITĂȚILE impactul funcționalității solului asupra

mediului înconjurator (emisii de gaze cu efect de sera: N2O, CH4; contaminarea apelor cu nitrati; poluarea apelor de suprafață);

4.REZILIEREA sensibilitatea solului la acțiunile antropice și aptitudinea acestuia de a reveni la starea inițială (acțiunea pesticidelor asupra activității biologice a solului; diversitatea funcțională inferioară diversității populaționale).

O apreciere pertinentă a fiecăruia dintre componentele amintite presupune, în mod evident, identificarea celor mai reprezentativi indicatori, aplicarea unor metodologii exacte, dar și o interpretare precisă a acestor măsurători. În acest sens, pe tărâmul științific, în ciuda progreselor tehnice înregistrate, există încă destule lacune conceptuale și metodologice.

Un lucru este însă cert: starea de calitate a unui sol cultivat este rezultanta unui ansamblu de factori de mediu (tip de sol, climat) și factori antropici (sisteme de cultură, practici de cultivare).

Astfel, studierea parametrilor biotici si biochimici ai solului prezintă importanța vitală în evaluarea efectelor exercitate de către factorii antropici asupra potențialului de fertilitate a solului, în scopul evidențierii și recomandării celor mai indicate itinerarii tehnologice, menite să contribuie la conservarea "patrimoniului SOL", în sensul practicării unei "agriculturi durabile".

Pentru a atinge însă aceste scopuri de maximă importanță pentru domeniul agricol, rămâne stabilirea unei metodologii cât mai complexe, de evaluare a potențialului de fertilitate a unui sol.

După o lungă perioadă de cercetare privind dinamica microflorei, activitățile biotice, enzimele acumulate și compararea acestora cu parametri agrochimici, se propune o definire a fertilității solului în concept biologic, în concordanță cu definiția formulată de Gh. Ștefanic (1990, 1994): "Fertilitatea este o însușire fundamentală a solului, care rezulăa prin activitatea vitală a micropopulației, a rădăcinilor plantelor, a enzimelor acumulate și a proceselor chimice generatoare de biomasă, humus, săruri minerale și substanțe biologic active, nivelul fertilității fiind legat de nivelul potențial al proceselor de bioacumulare și mineralizare, acesta depinzând de programul și condițiile evoluției subsistemului ecologic și de influențele antropice”.

Alcătuirea generală a solului.

In alcătuirea solului intră trei părți: partea solidă (minerală și organică), partea lichidă sau soluția solului și partea gazoasă sau aerul din sol.

Partea minerală a solului deține ponderea cea mai mare (circa 90-95% în greutate). Ea provine din rocile pe care s-a format solul prin transformarea acestora sub influența variațiilor termice, a apei, a vântului și a organismelor.

In urma proceselor de dezagregare rezultă roci afânate, alcătuite din fragmente și particule de diferite dimensiuni. Alternarea este procesul complex de modificare chimică a mineralelor și rocilor, care se manifestă printr-o serie de procese simple de hidratare, dizolvare, hidroliză, carbonatări și oxidoreducere.

Rezultatul alterării constă în faptul că o parte din elementele minerale de nutriție a plantelor trec în forme asimilabile, îndeosebi săruri minerale, în același timp însă iau naștere și compuși minerali complecși de natura celor care intră în alcătuirea argilelor.

Partea organică a solului deține un procent mai mic decît cea minerală (circa 5-10% în greutate) având o importanță esențială în formarea, evoluția și proprietățile solului, fiind reprezentată de resturile vegetale și animale netransformate sau transformate sub acțiunea microorganismelor.

Humusul este principalul constituent al părții organice din sol, alcătuit din compuși de resintetizare biochimică a produselor finale de descompunere a materiei organice.

Partea lichidă sau soluția solului este reprezentată prin apa din sol, cu substanțele minerale și organice în stare de dispersie ionică, moleculară sau coloidală. Este importantă deoarece conține elemente nutritive în formă accesibilă plantelor și microorganismelor, adică sub formă de săruri solubile care disociază în cationi și anioni.

In urma proceselor de reținere, pe suprafața particulelor coloidale ale fazei solide se crează o rezervă de elemente nutritive absorbite, care se eliberează în soluție pe măsura consumării lor de către organismele vii.

Compoziția soluției solului este variabilă depinzând de condițiile climatice, de activitatea microorganismelor etc. In ceea ce privește soluția solului, pentru dezvoltarea microorganismelor, o importanță deosebită o prezintă activitatea osmotică a fazei lichide.

Partea gazoasă a solului-aerul din sol ocupă toate spațiile lăsate libere de către apă. Compoziția aerului din sol se deosebește de cea a aerului atmosferic prin raportul cantitativ între gazele conținute, oxigenul găsindu-se în cantitate mai mică decât în atmosferă, datorită faptului că este consumat în activitatea microorganismelor și în respirația rădăcinilor plantelor superioare.

Procentul de C02 în aerul din sol este cel puțin de 10 ori mai mare decât aerul atmosferic (0,15-0,65 % în sol față de 0,03 în atmosferă) datorită eliberării lui sub acțiunea de descompunere exercitată de microorganisme asupra substanțelor organice.

Cantitatea de azot din aerul solului variază puțin. Consumul de azot molecular din aerul solului este foarte scăzut, el fiind folosit numai de către unele microorganisme azotofixatoare. In unele soluri, în special în cele mlăștinoase, în aerul solului se pot întâlni produse gazoase ale metabolismului bacterian, ca: NH3, CH4, H2S, H2.

Majoritatea microorganismelor se dezvoltă optim la un pH apropiat de neutru (pH=7); foarte puternic acide (pH=4,5); puternic acide (pH=4,5-5,5); acide (pH=5,5-6); slab acide (pH=6-6,8); neutre (pH=6,8-7,2); alcaline (pH=7,2-7,8); puternic alcaline (pH=8,5).

Fiecare tip de sol are o reacție oarecum caracteristică pe care și-o menține datorită capacității de tamponare determinată, în principal, de complexul coloidal al solului respectiv.

1.2. Formarea solului

Incepe imediat ce roca ia contact cu mediul extern, cu agenții geologici și, în special, cu acțiunea organismelor vii. Caracteristica principală a solificării constă în acumularea materiei organice și a humusului, determinând capacitatea de reținere a substanțelor nutritive. Elementele chimice eliberate în urma alterării tind să fie (levigate) spre stratele adânci de roci dezagregate și alterate.

Organismele vii (în principal, plantele și microorganismele) se opun acestui proces, ducând la reținerea și chiar acumularea substanțelor minerale în partea superioară a solului sub formă de materie organică și de humus.

In toate solurile se desfășoară procesul de alterare a unor minerale primare și chiar a unora secundare, paralel cu formarea altor minerale secundare caracteristice, descompunerea resturilor vegetale și animale și sinteza acizilor hunici, levigarea paralel cu bioacumularea, acumularea și pierderea apei (prin evaporarea și transpirația plantelor), absorbția energiei solare și încălzirea solului paralel cu iradierea acestei energii.

Diversitatea solurilor de pe glob este dată de intensitatea deosebită cu care se desfășoară procesele amintite în diferitele condiții fizico-geografice și la diferitele adâncimi ale stratului dezagregat al rocii inițiale.

Pe această cale se diferențiază pe adâncimea solului orizonturi caracterizate prin proprietăți specifice. Intervenția organismelor vii asupra rocii dezagregate, pe de o parte, marchează începutul procesului de solificare, iar pe de altă parte, aduce modificări esențiale în marele circuit geologic în natură.

1.3. Compoziția chimică a solului

Solul este mediul în care se dezvoltă și acționează organismele vii și particularitățile lui se vor reflecta în viața acestora și invers. Solul, prin particularitățile constituenților săi influențează simțitor activitatea biologică și prin aceasta propria sa evoluție.

Pentru înțelegerea raporturilor între organisme și sol, o importanță deosebită prezintă cunoașterea compoziției chimice a solului în comparație cu aceea a litosferei. Se poate constata acumularea în sol a unor elemente biogene esențiale, cum sunt, în primul rând, carbonul (în litosferă 0,22%, iar în soluri până la 4,6%) și azotul (în litosferă inexistent,în soluri până la 1,5%). De asemenea, în solurile proprii agriculturii se acumulează cantități importante da magneziu, potasiu și alte elemente chimice inerte dezvoltării vieții, care în litosferă există în cantități cu totul insuficiente. Toate elementele chimice existente în sol se distribuie între cele trei părți ale solului, solidă, lichidă și gazoasă, care împreună constituie un sistem microeterogen, organomineral, polidispers, structurat și poros.

1.4. Morfologia solurilor

Levigarea si acumularea humusului duc la diferențierea profilelor de sol în orizonturi si suborizonturi. Levigarea împarte patura de sol în orizonturi distincte. Principalele orizonturi ale solului sunt: A, B, C, D. Acestora li se adaugă la unele soluri si orizonturile G, S, etc.

Orizontul A este orizontul superior al solului în care se dezvolta cea mai mare parte a sistemului radicular al plantelor. Acest orizont se caracterizează prin acumularea humusului si a majorității substanțelor nutritive. Creează condiții optime pentru dezvoltarea microorganismelor aerobe (bacterii si ciuperci).

Orizontul B este orizontul de acumulare a argilei si a sesquioxizilor migrați din orizontul A, mai ales când acesta este mai puternic acidifiat. Este relativ sărac în substanțe nutritive. In el își desfășoară activitatea atât microorganismele aerobe cât și anaerobe.

Orizontul C este orizontul inferior al solului, de acumulare a sărurilor și în special a carbonaților spălați din orizonturile superioare. Este orizontul care se apropie cel mai mult de caracterele rocii inițiale de care se deosebește numai prin mare bogăție în carbonați și prin culoarea mai albicioasă. Microorganismele nu au condiții bune de dezvoltare, de aceea ele populează în număr extrem de mic acest orizont.

Orizontul D reprezintă roca pe care s-a format solul.

Orizontul G (orizontul de glei) este orizontul specific solurilor hidromorfe (formate sub influența unui exces de umiditate). Orizontul G are aspectul marmorat, pestriț.

Orizontul S – orizont de săruri solubile, se întâlnește ca orizont distinct numai la solurile sărăturoase, unde sărurile solubile (cloruri, sulfați) se găsesc pe întreg sau aproape pe întreg profitul de sol.

Din cauza salinității puternice, numai plantele superioare (plante halofite) si numai unele microorganisme se pot adapta si dezvolta pe astfel de soluri. Nu toate orizonturile menționate se găsesc obligatoriu în orice profil de sol.

1.5. Principalele tipuri de sol de pe glob

Tipurile de sol sunt o rezultantă a condițiilor variate de geneză din diferite regiuni si zone geografice ale globului. Ca soluri zonale pot fi menționate: solul de tundră, podzolul, solurile de pădure, cernoziomul (solul cenușiu de semidesert), iar ca soluri intrazonale mai importante sunt lăcovistile si sărăturile.

Solurile de tundră sunt soluri turboase sau turbo-gleizate, cu o grosime redusă din cauza stratului veșnic înghețat la mici adâncimi (30-80cm). Resturile vegetale acumulate sunt numai parțial humificate sub formă de turbă sau humus turbos. In aceste soluri s-au semnalat bacterii heterotrofe sporulate ca Clostridium caproicum, Clostridium sporogenes si un grup nesporulat reprezentat prin genul Cillobacterium.

Podzolul este un sol acid care se formează in condițiile climatului temperat, rece si umed, cu o vegetație de conifere sau făgete. Humificarea resturilor organice este efectuată in principal de către ciuperci. Principala activitate microbiana este efectuata de Cytuphaga, Micrococcus, Mycrobacteriaceae. S-au mai semnalat Clostidium si bacterii ureolitice.

Cele mai caracteristice specii fungice pentru solurile podzolice sunt: Mucor rammaniamus, Penicillium nigricans, P. roqueforti, Trichoderma viride, Absintia orchidis, Mortierella alpina, etc.

Solurile de pădure, brune, brune-roscate sau cenușii sunt solurile care se formează in condițiile pădurilor de foioase si corespund diferitelor nuanțe ale climatului temperat. Sunt soluri slab acide, deoarece procesul de acidifiere este mai puțin avansat ca la podzoluri. Humusul este format din acizi fulvici și acizi humici. In solurile de pădure, abundența microflorei variază după tipul de humus.

Cernoziomul este un sol cu reacție neutră sau aproape neutră, care se formează in condițiile fitoclimatice ale stepelor temperate. Microflora acestui sol este foarte abundentă, fiind reprezentata prin toate grupele de microorganisme care executa cele mai variate procese biochimice. Este un sol bogat in humus, cu un grad ridicat de saturare în baze, cu structura glomerulară, de aceea este un sol cu o fertilitate ridicată.

Seroziomul-solul cenușiu-este solul zonal al deserturilor și semideșerturilor. Este un tip de sol foarte puțin evoluat, cu profil scurt și slab diferențiat în ceea ce privește orizonturile. Cantitatea redusă în masa organică și intensa mineralizare prin acțiunea microorganismelor ca si prin procese de oxidare explica cantitatea mică de humus, care nu reușește să dea solului decât culoarea cenușie.

Repartiția pe verticală a microorganismelor în aceste soluri este caracteristică și anume frecvența lor maxima este situată între 30 si 60 cm. In seroziomurile nelucrate, lipsesc fixatorii de azot molecular nesimbiotici. Sunt prezente toate grupele fiziologice de microorganisme legate de ciclurile carbonului si azotului.

Dintre bacterii se pot cita: Clostridium, Bacillus, Achromobacter, Actinomyces, Pseudomonas, Chrombacterium, dintre ciuperci: Aspergillus, Mucor, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus etc. Dintre alge: Chlorophyceales-cele mai răspândite. Protozoarele reprezentate in special prin ciliate, flagelate si amoebe.

Lăcoviștea -este un sol local, intrazonal, care se formează in condițiile unui exces permanent sau temporar de umiditate.

Ca o consecință a umidității excesive resturile organice ale vegetației hidrofite se humifica anaerob cu formare de humus brun-vinetiu, cu miros de balta specific dolinelor eutrofe, alcaline din zona de stepa-silvostepa. In zona rece, unde la excesul local de umiditate se adaugă și o temperatura scăzuta, se acumulează humus turbos caracteristic tinoavelor sau turbăriilor acide oligotrofe.

Săraturile-se formează in condițiile în care apa freatică mineralizată se afla la mica adâncime (pana la 3m). Apa este încărcata cu diferite săruri in soluție (cloruri, sulfați, carbonați) printre care și săruri de sodiu (Na, Cl; Na22 SO4; Na2CO3) nocive pentru plante.

CAPITOLUL 2

Microorganismele – parte integrantă a solului

2.1. Incărcătura microbiană a solului

Solul constituie un mediu de existență pentru foarte multe viețuitoare, diferite ca formă, îdimensiuni, apartenență sistematică sau activitate biochimică. Observații indelungate făcute asupra solului, folosirea mijloacelor moderne puse la indemână de tehnica de mărire a imaginilor, din ce in ce mai perfecționate, au dat omului posibilitatea de a cunoaște lumea microorganismelor, mult mai felurită și importanța pentru sol. Microorganismele din sol aparțin atât regnului animal cât și celui vegetal. Microfauna solului este reprezentata în primul rând de protozoare; microflora solului constituie elementul cel mai important pentru viața solului și este reprezentată de: alge, ciuperci microscopice, bacterii, actinomycetele.

Studiul microflorei solurilor se bazează , în esență, pe cercetarea activității acesteia în ansamblu și nu pe studiul microorganismelor izolate, în culturi pure. Tocmai în acest sens, S. N. Winogradschy arată că: „Metoda de analiză a activității reale a microorganismelor în natură trebuie să se bazeze nu pe cunoașterea speciilor izolate în afara mediului natural, ci pe reacțiile întregii comunități microbiene în sânul acestui mediu.”

2.1.1. Protozoarele din sol ([NUME_REDACTAT])

In sol, în afară de reprezentanții monocelulari care aparțin regnului animal se mai găsesc și microorganisme monocelulare care aparțin regnului animal și care poarta numele generic de protozoare. Acestea sunt organisme unicelulare la care se cunoaște un ciclu evolutiv bine stabilit si care reprezintă organisme complete si independente. Celula unui protozoar se compune din protoplasmă, în care se găsesc diferite incluziuni granulare, condriozomii, precum si diferite substanțe nutritive si de rezerva. Tot în protoplasmă se găsesc totdeauna unul sau mai mulți nuclei cu forme și stucturi diferite. Protoplasma protozoarelor, cu o consistență semilichidă, are o reacție aproape neutră. Coeficientul de vâscozitate este ceva mai mare decât al unei soluții de albumina. In cazul când temperatura scade, vâscozitatea crește. Protoplasma este dotată cu o permeabilitate selectivă, proprietate care rezultă din însușirile ei coloidale submicroscopice, adică ale macromoleculelor proteice. Ca substanțe de rezervă descoperite in celulele de protozoare se pot cita: amidonul, paraamidonul, glicogenul, leucozina, grăsimi si substanțe proteice de rezervă cum este volutina. Toate aceste substanțe de rezervă variază mult în funcție de condițiile în care are loc dezvoltarea protozoarelor. După o creștere până la o anumită limită, celula de protozoare trece la procesul de inmulțire.Cel mai frecvent tip de multiplicare este modul de înmulțire asexuat, în care celula se împarte in doua părți aproximativ egale si apar doua celule fiice identice. In condiții nefavorabile protozoarele pot secreta in jurul corpului lor o membrană specială si pot trece in chisturi de repaus. Dintre factorii care condiționează închistarea protozoarelor din sol se pot cita: modificările de temperatură, o cantitate insuficientă de substanțe nutritive, concentrația sărurilor solubile, conținutul de umezeală și de oxigen, acumularea in mediu a unor produși de metabolism nocivi, precum și alți factori nefavorabili. La revenirea condițiilor favorabile, chisturile germinează sub influența substanțelor organice de pe substrat. In sol protozoarele sunt reprezentate printr-un număr mare de grupe. [NUME_REDACTAT] cuprinde patru clase: Sarcodina, Mastigophora (Flagelata), Infusoria (Ciliata), Sporozoa. [NUME_REDACTAT] se caracterizează prin emiterea de pseudopode ca organite de deplasare. Reprezentanți: Negleria gruberi, Amoeba verrucosa, Amoeba proteus, Arcella vulgaris, Difflugia pyriforma, Euglipha. [NUME_REDACTAT] (Flagelata), intre reprezentanții acestei clase in sol se găsesc atât forme autotrofe cat si forme heterotrofe. Dintre flagelatele autotrofe din sol sunt importante următoarele ordine: Chrysomonadida, Cryptomonadida, Dinoflagelata, Chloromonadida, Euglenida si Phytomonadida. [NUME_REDACTAT] (Ciliata) acestei clase îi aparțin protozoare care se mișcă cu ajutorul a numeroși cili.

Ca forme răspândite în sol se cunosc: Paramecium, Balantiophorus, Colpoda, Balantidium, Pleurotricha, Ganostomum, Vorticella.

Răspândirea și importanța protozoarelor în procesele din sol:

Ca și în cazul algelor, rolul din sol este oarecum secundar. Protozoarele sunt mai răspâdite în sol în straturile superioare (15-20 cm). Sub 30 cm, numărul lor trece rareori de câteva sute pe gramul de sol, iar la adâncimi mai mari, fie nu se găsesc deloc, fie că numărul lor este foarte mic. Protozoarele pot fi și la adâncimi de 60-80 cm. Este stabilit că orice tip de sol, indiferent de localizarea geografică, conține protozoare. Posibilitatea protozoarelor de a se răspândi în toate solurile se datorează marii lor adaptabilității și capacității de a se închista. Răspândirea protozoarelor în sol este influențată în mare măsură și de starea de prelucrare a solului. Dacă în nisipurile din unele pustiuri se por găsi numai 100-300 de celule pe gramul de sol, în terenurile cu culturi agricole ajung până la 40000 sau chiar 60000 pe gramul de sol. Protozoarele sunt foarte frecvente în solurile cultivate și mai cu seamă în rizosferă, unde bacteriile sunt mult mai abundente. Numărul protozoarelor din sol este influențat și de reacția solului. Astfel, protozoarele se dezvoltă bine în solurile cu alcanilitate mică, și foarte slab, pe cele acide. Multe protozoare aparținând diferitelor grupuri și genuri amoebele, ciliatele și flagelatele, se hrănesc exclusiv cu bacterii. Modul de viață al răpitorilor din sol duce la micșorarea numărului de bacterii, ceea ce practic ar dăuna fertilității solului. Această problemă are două aspecte: pe de o parte, numărul de bacterii din sol scade realmente, ele fiind consumate de protozoare. Pe de altă parte, protozoarele sunt foarte sensibile la variațiile condițiilor de mediu și moartea masivă în anumite momente creează în sol o rezervă importantă de substanță organică pe baza căreia se dezvoltă bacteriile. Protozoarele, în special indirect dar și direct, sunt capabile să exercite o acțiune favorabilă asupra solului.

Rolul protozoarelor în sol nu este stabilit cu precizie, acțiunea lor cea mai cunoscută fiind limitarea numărului altor microorganisme. A fost descrisă și stimularea activității de fixare a azotului molecular de către Azotobacter, în prezența protozoarului ciliat [NUME_REDACTAT]. Unele protozoare descompun activ celuloza. Din această categorie fac parte cele care trăiesc în simbioză cu termitele.Tot lor li se atribuie și un oarecare rol în descompunerea humusului.

2.1.2. Bacteriile din sol

Bacteriile sunt cele mai răspândite microorganisme din sol și activitatea lor este cea mai impotrantă în comparație cu a celorlalte microorganisme dar datorită dimensiunilor foarte mici ale celulelor, biomasa bacteriană este probabil mai mică decât jumătate din masa totală a microorganismelor prezente în sol. In general, în solurile curate predomină bacteriile aerobe și ciupercile. In schimb, în solurile lipsite total sau parțial de oxigen, aproape toate transformările chimice și biologice sunt executate de bacteriile anaerobe sau parțial anaerobe. Răspandirea bacteriilor în soluri se datorește marii lor capacități de adaptare. In primul rând, bacteriile pot folosi substanțe nutritive foarte variate, o parte din ele având și capacitatea de a utiliza azotul atmosferic.

Bacteriile sunt organisme unicelulare. Indivizii activează mai mult sau mai puțin independent, deși uneori ei sunt grupați în mici colonii. Ca formă exterioară se disting trei tiputi de bază: formă sferică, care cuprinde bacterii, denumite coci; formă de bastonaș drept, în care intră bacilii; formă de bastonaș curbat care cuprinde două specii de germeni, și anume, vibrioni când curba nu depășește un semicerc și spirili, când prezintă mai multe curburi.

Celula bacteriană posedă o protoplasma înconjurată de o membrană. In protoplasma există diferite incluziuni, vacuole și corpuscule cromatice, care în animite stadii de dezvoltare se aglomerează, sugerând un nucleu. Membrana celulară a bacteriilor este subțire, incoloră și numai la formele mari se poate distinge la microscop. Invelișul extern, peretele celular, este relativ rigid, puțin colorabil, menținând forma și dimensiunile celulei bacteriene. Compoziția lui chimică este în linii generale cunoscută și variază de la o specie la alta. Astfel la Bacterium xylinum este format din celuloză, la Bacterium tumefaciens, din hemiceluloză. Celulele anumitor specii de bacterii pot fi înconjurate de o capsulă micilaginoasă a cărei compoziție chimică diferă după specii. Protoplasma celulei bacteriene este constituită dintr-un complex coloidal lipo-proteic cu îmbibație limitată în care faza dispersantă este apa, iar faza dispersată este formată din particule de natură chimică variată. In celulele tinere, protoplasma este optic uniformă, iar mai târziu apar vacuole ușor observabile pe viu. In citoplasmă există răspândit difuz acidul ribonucleic, mai abundent la celulele tinere.Tot în citoplasmă există și corpusculi de substanță nucleară (cromatină, ADN) și incluziuni de substanțe de rezervă, ca metacromatină, lipide, glicogen, săruri minerale, sulf etc. In general, substanța nucleară se găsește în stare difuză sau fin granulată în citoplasmă. Uneori, această substanță se aglomerează într-un singur corpuscul numit nucloid, deoarece nu posedă structurile caracteristice nucleilor adăvărați: membrană, cromozomi, nucleoli. Cilii sunt organite cu ajutorul cărora se realizează deplasarea activă a bacteriilor. După ultimele cercetări, cilii sunt formați din filamente fine spiralizate în jurul unui filament central. Acest ansamblu se leagă de un corpuscul bazal, situat sub membrana celulară despre care se presupune că reprezintă centrul motor al cilului. Lungimea cililor bacterieni variază după specie.

Sporii: rolul lor, ca forme de rezistență, a fost sesizat de L. Pasteur. In prezent, la bacterii sunt cunoscute trei categorii de spori care diferă după calitățile de rezistență, după rol și geneza lor, și anume: endosporii, artrosporii, microciștii. Dintre bacterii, endosporii sunt caracteristici mai ales bacililor, fiind obligați la genul Clostridium și facultativi la genul Bacillus.Sporogeneza era considerată ca mijloc de conservare a speciei. Pe de altă parte, se constată că în celulele bacteriene, supuse la condiții nefavorabile, nu se formează spori, ceea ce contrazice acesta concepție. Așadar, sporogeneza este o funcție biologică normală, care se desfășoară numai în condiții normale de existență, iar sporii, datorită structurii lor particulare care le imprimă o mare rezistență la acțiunea agenților fizici și o mare impermeabilitate la agenți chimici, reprezintă și o formă de conservare a speciei.

In general, ciclul de dezvoltere al bacteriilor se compune din două faze: creșterea și multiplicarea. In condiții favorabile de nutriție, acest ciclu se repetă, ducând la mărirea numărului de celule bacteriene în mediu. In aceste condiții, în protoplasma bacteriană au loc procese interne de neoformare a substanței de constituție pe baza cărora celulele cresc. Această creștere continuă până la atingerea unei limite, când survine diviziunea celulară.

Sistematica bacteriilor din sol: In prezent, sistematica bacteriilor ia în considerație concomitent caracterele morfologice, fiziologice și de sporulație. [NUME_REDACTAT] și Krasilnikov, bacteriile se incadrează în filumul Protophyta, clasa Schizoycetes, cu mai multe ordine.

1. [NUME_REDACTAT]. Acest ordin cuprinde specii în general cu celulele subțiri (curbate sau spiralate, rigide, rareori în perechi sau în lanțuri ). Unele specii sunt răspândite în sol și ape puțin adânci. Sunt și specii parazite. Cuprinde genuri ca: Thiosarcina, Thiodictyon, Thiospirilum, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Chlorebium, Chlorochromatium, Nitrosomonae, Nitrosococcus, Nitrobaccter, Methanomonas, [NUME_REDACTAT],Thiobacillus, Thiovolum, Thiospira, Thiobacterium, Azotomonas, Acetobacter, Pseudomonas, Photobacterium, Mycoplasma, Caulobacter, Gallionella, Siderophacus, Nevskia, Siderocapsa, Sideromonas, Ferribacterium, Ochrobium, Ferrobacilius, Desulfovibrio, Vibrio, Cellvibrio, Cellfalcicula, Myconostoc.

2. [NUME_REDACTAT]. Cuprinde forme bacteriene de apă dulce și marină. Genuri principale: Leoptothrix, Toxothrix, Crenothrix, Clonothrix.

3. [NUME_REDACTAT]. Include specii cu celule simple, rigide. Genuri: Azotobacter, Rizobium, Chromobacterium, Agrobacterium, Achromobacter, Beneckeo, Micrococcus, Sarcina, Streptococus, Lactobacillus, Leuconostoc, Cibobacterium, Bacillus, Clostridium.

4. [NUME_REDACTAT]. Cuprinde microorganisme unicelulare, filamentoase cu miceliu ramificat. Genuri: Mycobacterium, Mycococcus, Actinoplanes, Streptosporangium

5. [NUME_REDACTAT]. Sunt sulfobacterii care trăiesc în ape dulci cu sau fără H2S și pe materii organice în descompunere. Genuri principale: Beggiatoa, Thioplaco, Thiothrix, Leucothrix.

6. [NUME_REDACTAT]. Multe specii au fost descrise fiind izolate din băligarul de ierbivore, unde descompun celuloza, dar s-a constatat că aceleași specii se găsesc și în microflora solului. Genuri: Cytoplasma, Archangium, Stelangium, Orangium, Polyangium, Synangium, Podangium, Chondromyces, Myxococcus, Chondrococcus, Angiococcus, Sporocytophaga.

2.1.3. Ciupercile din sol ([NUME_REDACTAT])

Ciupercile microfite constituie o componentă foarte importantă a microflorei solului în care s-au identificat 137 de genuri cu circa 800 de specii. Frecvența lor variază între 8000 și un milion de indivizi pe gramul de sol. Sunt microorganisme heterotrofe, saprofite sau parazite. Suportă un PH mai scăzut decât bacteriile și actinimicetele. Numărul lor crește până la PH=4 (optim) după care scade simțitor. Descompun energetic numeroase substanțe organice și invadează litiera solurilor de pădure, în special a pădurilor de rășinoase în care PH este mai scăzut. Un rol important îl au ciupercile de micoriză, în majoritate Basidiomycetes, care înlocuind perii radiculari, asigură arborilor nutriția minerală și absorbția apei. Unele ciuperci produc substanțe antibiotice participând la antagonismul microbian și reglarea echilibrului biologic al solului. Aparatul vegetetiv este un tal variat constituit, a cărui complexitate structurală crește pe măsura evoluției filogenetice. Astfel, la Archimycetes, talul este gimnoplast lipsit de membrană, la Plasmodiophoraceae este un plasmodiu (o asociație de gimnoplasți), adică o masă protoplasmatică plurinucleată lipsită de perete celular. [NUME_REDACTAT], talul este un dermatoplast, adică o celulă cu membrană, protoplasma și nucleu, iar Phycomycetes este nu sifonoplast format din filamente ramificate, neseparate. La restul ciupercilor talul este un miceliu constituit din filamente pluricelulare separate, denumite hife. Miceliul poate fi de două tipuri: filamentos, în special la Ascomycetes și unele Basidiomycetes; masiv, la majoritatea basidiomycetelor.

In general, miceliile se reproduc prin diferite tipuri de spori, elemente adesea unicelulare capabile de a supraviețui în condiții care distrug miceliul.

[NUME_REDACTAT] cuprinde patru clase: Archimycetes , Phycomycetes, Acomycetes,Basidiomycetes.

1. [NUME_REDACTAT]

Este alcătuită din ciuperci primitive al căror tal este un gimnoplast și uneori un plasmodiu. Cuprinde numeroase specii fitopatogene.

2. [NUME_REDACTAT]

Include specii saprofite (obligate sau facultative), precum și specii parazite saprofite (obligate sau facultative), răspândite în ape și soluri umede. Aparatul vegetativ este nu sifonoplast prevăzut uneori cu rizoizi care se fixează pe substrat. [NUME_REDACTAT] cuprinde mai multe ordine cu specii în general parazite. Prezintă interes ordinul Mucorales format din specii exclusiv terestre și saprofite.

3. [NUME_REDACTAT]

Ciupercile din acesta clasă sunt mai evoluate. Talul este reprezentat printr-un filament pluricelular. Interesează familiile: Endomycetaceae și Sacchromycetaceae.

Dintre acestea microorganismele din familia Endomycetaceae sunt acelea care îndeplinesc procese de descompunere a numeroși compuși organici.Cea mai importantă și răspândită este familia Aspergillaceae, care cuprinde mucegaiuri saprofite și numai rareori parazite. [NUME_REDACTAT] cuprinde specii răspândite în sol și pe produse alimentare.Un alt gen este Penicillium. Speciile acestor genuri prezintă importanță atât pentru sol cât și în microbiologia industrială. Astfel pe lângă fabricarea penicilinei din [NUME_REDACTAT], în industria brânzeturilor se utilizează Penicillium roqueforti. Aspergillus niger se folosește pentru fabricarea acidului citric prin fermentarea zahărului, iar Aspergillus oryzae, care posedă o amilază foarte energică, este utilizat pentru hidroliza amidonului în industria băuturilor spirtoase.

4. [NUME_REDACTAT]

Cuprinde cele mai evoluate ciuperci dintre care o parte saprofite, unele formează micorize la diverse plante, iar altele sunt parazite. Din ordinul Hymenomycetales cea mai importantă este familia Polyporaceae și mai cu seamă genurile Boletus și Merulius. Astfel, din genul Boletus, speciile Boletus elegans formează micoriză la zadă. B. luteus la pin și molid, B. scaber la mesteacăn, B. versipellis la plopi. Rprezentanții genului Merulius și mai cu seamă specia Merulius lacrymans sunt capabili de a descompune lignina lemnului mort. Pe lemnul atacat de M. lacrymans, cunoscut sub numele de "ciuperca de casă", se formează un miceliu păstos, la început albicios api cenușiu și cafeniu. In ordinul Gasteromycetales intră numeroase specii de micoriză dintre care cea mai importantă este Rhizopogon. Fungii imperfecți sunt un grup de eterogen de ciuperci. Miceliul este pluricelular septat. Cele mai frecvente forme din sol aparțin ordinului Hiphomycetales și mai cu seamă familiei Mucedinaceae. Din această familie o parte din genuri participă la unele transformări ale substanțelor organice. [NUME_REDACTAT] cu specia Monilia candida produce o fermentație alcoolică foarte lentă a zaharurilor (în timp de două săptămâni formează abia 1% alcool) se dezvoltă în medii zaharate producând mită masă vie. [NUME_REDACTAT] cuprinde numeroase specii saprofite și unele parazite, care pot ataca plantele lipsite de vigoare. Atacă și distrug resturile organice bogate în zaharuri solubile. [NUME_REDACTAT] include specii saprofite care descompun numeroase resturi organice. [NUME_REDACTAT] cu specia Trichoderma linorum prin activitatea ei îmbunătățește simțitor structura solului, deoarece descompune energic celuloza și lignina, îmbogățind partea organică coloidală a solului. Din familia Dematiaceae mai importantă este specia Cladosporium herbarum care acționează ca agent celulozoic. Poate ataca fibrele de bumbac producând daune. Din familia Tuberculariceae se poate cita genul Fusarium care cuprinde în majoritate specii saprofite ce descomoun numeroase substanțe organice din sol. Puține specii parazite atacă rădăcina, astipând vasele conducătoare și producând vestejirea plantelor.Din ordinul Sphaeropsidales numai familia Sphaericidaceae are reprezentanți importanți pentru microflora solului. Astfel, din genul Phoma cea mai importantă este specia phoma ragicis, capabilă de a fixa azot molecular în simbioză cu rădăcinile plantelor.

Răspândirea ciupercilor și importanța lor în biologia solului

Majoritatea ciupercilor se dezvoltă în orizonturi superioare ale solului, la adâncime de 4-5 cm, cum sunt speciile de Aspergillus, Penicillium, Mucor, care se găsesc din abundență în litiera solului de pădure. Unele specii ca, Trichoderma, se dezvoltă în stratele mai adânci ale solului, chiar sub 1 m adâncime. In general frecvența ciupercilor scade sub 20 cm adâncime din cauza dispariției progresive a aerului și substanțelor nutritive. Rolul ciupercilor în sol depinde de propietățile fiziologice, cum sunt intensitatea și viteza dezvoltării vegetative legate de particularitățile sporulării, de longevitatea miceliului și organelor de reproducere, de existența formelor rezistente, de metabolism și de activitatea antibiotică. Asupra stucturii solului, acționează în special ciupercile filamentoase. La suprafața particulelor aderă particule fine de sol formându-se agregate peroase, relativ stabile.La acestea se adaugă acțiunea bacteriilor care, după atacul hifelor și autoliza lor, eliberează substanțe mucilaginoase de culoare închisă care agregă particulele de argilă formând agregate argilo-humice. Acizii organici (citric, tartric, oxalic), eliberați de unele ciuperci, pot solubiliza fierul și aluminiul, transportându-le în orizontul B al solului, ceea ce ușurează podzolirea. In cursul descompunerii resturilor organice din sol se pare că prima fază este executată de ciuperci, după care bacteriile atacă miceliul fungic. Această situație este caracteristică în solurile acide și afânate , în timp ce solurile neutre, alcaline favorizează dezvoltarea bacteriilor. In proteoliza fungică se degajează mai mult azot decât în protoliza bacteriană, deoarece cerințele energetice ale ciupercilor sunt cu mult mai mari decât cerințele față de azot în comparație cu bacteriile, iar excesul de azot se eliberează sub formă de amoniac. De aceea și cantitatea de CO2 eliberată de ciuperci este mai mare decât cea degajată de bacterii în unul și același sol. Activitatea biochimică a ciupercilor este deosebit de importantă în celulozoliza și ligninoliza resturilor vegetale. Cele mai active ciuperci celulozolitice sunt Basidiomycetes (genuri ca: Polyporus, Merulius, Coniophora, Plurotus etc.). [NUME_REDACTAT] sunt ligniolitice genuri ca: Chaetomium,Trichoderma, Cladosporium și Fusarium. In solurile acide microflora celulozică eate compusă în special din specii de Penicillium și mai cu seamă de Trichoderma, care este activă și la PH=2-2,5. Ligninoliza fungică este atribuită în cea mai mare parte ciupercilor filamentoase sau basidiomycetelor superioare. Ciupercile prin marea lor capacitate de creștere și multiplicare asimilează cantități importante de azot mineral din sol. Astfel, pentru 30 de părți de celoloză descompusă, din care în protoplasma se asimilează și o parte de azot mineral, care în acest fel este temporar imobilizat. Apoi prin mineralizare, acest azot va fi redat treptat plantelor.

Din toate acestea reiese rolul imprtant și multilateral al ciupercilor în biologia solurilor. Prin funcția lor antibiotică condiționează interrelatiile între microorganismele din sol, precum și între acestea și plantele superioare. Prin conținutul lor în carbon și azot și prin acțiunea lor fiziologică și biochimică condiționează proprietățile humusului și prin aceasta proprietățile generale ale solului.

2.1.4. AlgeIe din sol

Algele existente în sol aparțin la patru phyllumuri: Cynophyta, Bacilloriophyta, Chlorophyta și Heterocontae.

1. [NUME_REDACTAT]

Sunt plante unicelulare sau grupate în colonii alcătuite din indivizi de aceeași vârstă, numite cenobii. Colonia iși poate divide celulele intr-o singură direcție, devenind un filament, în două direcții devenind o membrană, sau în trei direcții formând un corp masiv. Aceste plante inferioare, datorită faptului că se înmulțesc prin diviziune, se numesc Schizophyceae și cuprind organisme vegetale care nu au în celulele lor o diferențiere clară în citoplasmă, nucleu și cromatofori. Celula algelor este formată dintr-o membrană dublă și un conținut celular. Membrana internă este o peliculă subțire de natură pectică și celulozică, iar cea externă, mai groasă, este alcătuită din substanțe pectice mucilaginoase care se pot umfla foarte mult în prezența apei. Această pătură gelatinoasă poate forma o teacă comună în jurul cenobiului. In protoplast se deosebesc două zone, una externă-cromoplasma, de obicei colorată, și una internă, necolorată. Schizophyceaele sunt autotrofe. Produsul de asimilație nu este amidonul ci glicogenul și glicoproteidele.Algele albastre sunt răspândite pe suprafața pământului, în locuri umede, în ape stătătoare, în ape termale, suportând temperaturi de până la +87° C (Phormidium laminosum). Având o mare adaptibilitate, populează și soluri foarte sărace, ca solurile de pustiuri și semipustiuri și de asemenea sunt primele organisme care populează roca dezagregată, la începutul procesului de solidificare. Alături de ele se dezvoltă variate bacterii, printe care un loc deosebit îl ocupă bacteriile fixatoare de azot molecular, mai cu seamă în mucilagiile secretate de membranele celulare ale acestor alge.

[NUME_REDACTAT]: celulule sunt izolate și se înmulțesc prin diviziune.Trăiesc pe stânci sau pe ziduri umede și se prezintă ca o masă gelatinoasă. Dintre genurile principale amintim Gloeocapsa (trăiește pe suprafața umedă a solului), Chroococcus (se dezvoltă intens pe solul umed, acoperindu-1 cu o peliculă neagră-albăstruie ).

[NUME_REDACTAT], cu genurile: Oscillatoria, Lyngbia, Phormidium. Speciile genului Phormidium sunt răspândite mai cu seamă în apele dulci, iar unele (Ph. autumnale) pot intra în compoziția florei solurilor umede.

[NUME_REDACTAT] este reprezentată tipic prin genul Nostoc. Speciile genului nostoc sunt răspândite în soluri și mai cu seamă în câmpurile de orez. Importanța practică a unor specii de de Nostoc constă în capacitatea lor de a fixa molecula de azot molecular așa cum este, de exemplu, specia Nostoc muscorum. [NUME_REDACTAT] cu specia Anabaema variabilis poate fixa azot molecular.

[NUME_REDACTAT] este reprezentată prin genul Rivularia care cuprinde specii răspândite în apele dulci și marine precum și pe suprafața solurilor umede.

2.[NUME_REDACTAT] (Diatomaee)

Acest grup de plante cuprinde organisme unicelulare izolate sau colonii. Unele specii sunt fixate de suport printr-o masă sau pedicel gelatinos, altele sunt învelite în tuburi gelatinoase sau înglobate într-o substanță gelatinoasă. Foarte caracteristică pentru diatomaee este membrana celulară de natură pectică impregnată cu bioxid de siliciu, alcătuid o carapace în jurul conținutului celular. Din clasa Pennatae, menționăm trei genuri care se întâlnesc destul de frecvent în compoziția microflorei solului. [NUME_REDACTAT], Navicula și Nitzschia.

3.[NUME_REDACTAT]

Alge verzi alcătuiesc una din cele mai mari grupări de alge și cuprinde organismele vegetale microscopice unicelulare sau pluricelulare. Talul este vizibil cu ochiul liber. Sunt foarte variate ca formă, majoritatea trăind în apele dulci și marine. Unele s-au adaptat la viața terestră fiind destul de răspândite în sol. Celula unei alge verzi moleculare prezintă la exterior o membrană de natură celulozică cu tendința de gelificare, alteori este de natură pectică și se poate impregna cu carbonat de calciu. Nucleul poate fi simplu sau multiplu și unele cazuri nu se deosebește de structura nucleului plantelor superioare. Unele alge verzi posedă flagele cu ajutorul cărora se pot deplasa.

Dintre algele verzi cu viață terestră mai frecvent întâlnite în mijlocul solului sunt familia Chlamydomonadinaceae care are ca gen principal Chlamidomonas. Aceste alge se dezvoltă mai ales primăvara pe soluri umede argiloase imprimând solului o culoare verde.

[NUME_REDACTAT] este reprezentată prin genul Chlorococcum răspândit în apă, pe coaja arborilor cât și pe solurile umede.

[NUME_REDACTAT], cuprinde genurile Chlorella și Scenedesmus.

[NUME_REDACTAT] este reprezentată prin genul Wothrix.

[NUME_REDACTAT] cuprinde genul Vaucheria. Se dezvoltă în bazinele de apă și pe suprafața solurilor umede și umbrite.

4.[NUME_REDACTAT]

Cuprinde algr caracterizate prin celulu gigante, filamentoase sau tubuloase, plurinucleate. Reprezentantul tipic al acestei clase este Botrydium granulatum. Această algă este alcătuită dintr-o celulă mare, vizibilă cu ochiul liber, care conține numeroși nuclei (structură acelulară) și cromatofori galbeni vezui.

Răspândirea și rolul algelor în sol

Importanța algelor este mai mică decât a celorlalte grupe de microorganisme (bacterii și ciuperci ), dar prin biomasa lor, care poate fi destul de importantă, ele condiționează în sol numeroase procese biologice. In sol algele sunt răspândite atât pe suprafață cât și în profunzime. Algele care trăiesc până la câțiva centimetri adâncime se hrănesc autotrof acumulând o cantitate importantă de substanță organică care poate fi ușor mineralizată de către alte microormanisme heterotrofe (bacterii, ciperci).

Există și alege care trăiesc la adâncime cu mod de nutriție diferit heterotrof. Substanța organică sintetizată din ele poate fi mineralizată sau poate fi humificată. In mod direct s-a stabilit capacitatea unor alge albastre de afixa azot atmosferic, ca Rivuloria și altele, se dezvoltă simbiotic bacterii fixatoare de azot, ca Azotobacter și Clostridium. O influență importantă a algelor în sol este îmbogățirea acestuia cu oxigen rezultat din fotosinteză. Acest fapt este deosebit de important în solurile mlăștinoase, deoarece crează condiții favorabile dezvoltării unor plante ale căror rădăcini nu prezintă adaptări pentru viața anaerobă. Totodată, acest oxigen favorizează dezvoltarea microorganismelor aerobe din sol, ceea ce duce la intensificarea procesului de mineralizare.

Datorită aceste activități, precum și datorită biomasei care poate intra în procesele de humiflcare îndeplinesc un rol important în procesele de pedogeneză. Algele albastre sunt primele organisme care populează suprafața stâncilor goale, iat în roca dezagregată crează primele premise ale dezvoltării frtilității, și anume acumularea de rezerve nutritive sub formă de substanță organică mineralizată.

2.1.5. [NUME_REDACTAT] sol există și o foarte importantă populație de actinomycete. Acestea sunt microorganisme care fac trecerea între bacterii și ciuperci, foarte asemănătoare acestora din urmă dar cu miceliul ramificat format din hife mult mai subțri. Inmulțirea lor se face prin fragmentarea miceliului, fie prin formarea unor organe speciale de fructificare, rezultate prin ștangularea apicală a unor hife. Actinomycetele sunt microorganisme aerobe sau facultativ aerobe. Sunt heterotrofe, dar au posibilități practic nelimitate de a ataca substanțe organice din cele mai variate și mai greu de utilizat (hidrocarburi, cauciuc, mase plastice, etc.)

Ca sursă de azot actinomycetele folosesc nitrații, sărurile de amoniu, urea, carbonații. Folosec cu precădere în nutriție proteinele și peptonele ca și unii aminoacizi.

In sol participă activ la mineralizarea unor resturi vegetale. Descompun intens hemicelulozele îndeosebi manoza, xiloza și pectina.

Actinomycetele sunt cele mai active organisme producătoare de antibiotice cunoscute până în prezent, contribuind astfel în oarecare musură la echilibrul microbian al solului.

2.1.6. Virusurile din sol

In afară de grupele de microorganisme prezente în natură (inclusiv în soluri) există o categorie de agenți vii de dimensiuni submicroscopice a căror dezvoltare se realizează numai prin parazitism pe gazde corespunzătoare. In lipsa gazdei specifice, activitatea vitală a particulelor este slabă sau chiar inexistentă și în primul rând este exclusă multiplicarea. Virușii parazitează și provoacă boli la plante, animale și microorganisme.

Virusurile care atacă microorganisme se numesc bacteriofagi și respectiv actinofogi. Virușii sunt incluși în ordinul Virales, din clasa Microtatobiotes dinfilumul Protophyta. Din sol s-au izolat bacteriofagi specifici pentru bacterii ca: Aerobacter, Agrobacterium, Arthrobacterium, Pseodomonas, Rizobium, Streptomyces, Azotobacter, Nocardia.

Morfologic, bacteriofagii se prezintă ca niște corpusculi mici submicroscopici care trec prin filtrele bacteriene. Bacteriofagii posedă un "cap" de apriximativ 50×100 milimicroni și o coadă de aproximativ 100×25 milimicroni. Coada reprezintă un punct de atașare la suprafața bacteriei care cu ajutorul unei enzime perforează peretele celulei bacteriene. O proprietate interesantă a bacterifagilor este capacitatea lor de a trăi în unele celule bacteriene tară a provoca o liză evidentă dar eliberând spre exterior noi particule virale. Astfel de bacteriofagi sunt numiți bacteriofagi temperali, iar celulele care îi portă se numesc lizogene. In legătură cu lizogema apare și transducția, adică proprietatea virușilor de a transmite o parte din materialul ereditar al unei celule lizogene la alte gazde noi.Importanța bacteriofagilor din sol constă în acea că influențează într-o măsură oarecare ecologia bacteriilor-gazde în sensul că distrug rasele de bacterii lizosensibile. Răspândirea și importanța virușilor din sol sunt influențate de capacitatea humusului și a argilelor de a absorbi și imobiliza particulele virale. Astfel este cunoscut că solurile argiloase și bogate în humus absorb cantități mai mari de particule virale decât solurile nisipoase. Prin acesta alcătuirea generală a solurilor influențează respândirea și intensitatea bolilor virotice ale plantelor superioare.S-au executat studii intense asupra legăturii între bacteriofagii speciilor de Rhizobium și producți plantelor leguminoase. Rhizobiofagii sunt destul de larg răspândiți în majoritatea solurilor de pe glob și în special în cele cultivate cu leguminoase, densitatea maximă fiind în rizosfera apropiată de rădăcini.

Răspândirea rhizobiofagilor nu este influențată de sol. Lizei fagice din nodozități i s-a atribuit un rol în transferul azotului fixat, din nodizitate spre planta-gazdă. Rhizobiofagii ar putea determina o scădere a recoltei prin acea că ar permire predominarea raselor neeficiente de Rhizobium.

Figura 2.1. Aspecte microscopice ale microorganismelor din sol

2.2.Aspecte privind stimularea activității microorganismelor din sol

2.2.1.Importanța organismelor din sol pentru evoluția solurilor.

Una dintre cele mai importante însușiri ale solurilor prin care acestea diferă de materialul parental , este capacitatea de a înmagazina substanțele nutritive și apa necesară creșterii plantelor. Această însușire se bazează pe activitatea unui mare număr de viețuitoare din soluri , care participă într-o măsură considerabilă la punerea în libertate a substanțelor nutritive pentru plante , din mineralele rocii-mamă . De asemenea, organismele solului sunt singurele capabile să mineralizeze resturile vegetale și animale , adică să le reducă la compuși micromoleculari sau să sintetizeze și să acumuleze în sol substanțe orgenice stabile , așa numite humice . W.Latsch împarte procesele de formare a solului în trei categorii:

1. Procese de descompunere (dezagregarea ,descompunerea substanțelor organice);

2. Procese de sinteză (formarea de minerale argiloase, formarea humusului).

3. Procese de deplasare (amestecarea solului, deplasarea prin infiltrație).

Procesele descompunerii și sintezei organice și amestecarea solului sunt rezultatul

activității organismelor din sol, însă și dezagregarea mineralelor se produce, în mare parte prin intermediul reacțiilor biochimice. Prin evoluția solului se înțelege și calea de fomare a anumitor insușiri tipice sub influența factorilor de formare a solului: climă, vegetație, apă, rocă, relief, om, timp. Solul suferă o evoluție permanentă de la origine și până în prezent . Caracteriticile acestei evoluții sunt stadiile de dezvoltare, în care solul se găsește în ehilibru cu factorii care acționează asupra lui. In funcție de condițiile mediului înconjurător , această evoluție va decurge diferit , realizându-se mai devreme sau mai târziu un anumit echilibru .

2.2.2.Influența vieții în sol prin măsuri culturale.

Toate măsurile de cultură care se execută în timpul gospodăririi solurilor își ating scopul numai în cazul în care acestea influențează în mod favorabil factorii biologici ai mediului înconjurător în interesul producției vegetale . Măsurile luate vor influența și fertilizarea și dezvoltarea solului . In cazul aplicării măsurilor ameliorative , lucrărilor solului, fertilizării și măsurilor fitotehnice planificate și executate nu trebuie să aibă în vedere numai capacitatea de producție obținută ci să se țină seama și de asigurarea și completarea în conținu a bazelor naturale ale fertilității solului. Drept caracteristici deosebit de importante trebuie socotite în acest caz , un regim favorabil de apă , structură buna a solului și o aprovizionare cu substanțe humice calitativ superioare.Măsurile culturale trebuie să favorizeze pe cât posibil desfășurarea vieții din sol și să țină seama de întrebuințarea celorlalte însușiri fizice și chimice ale solului , deoarece acești factori influențează în mod complex capacitatea de producție actuală și potențială a solului. Factorii de creștere , conținutul de apă și substanțe nutritive din sol , oferiți de natură , deseori nu stau în acelaș timp și în cantitatea dorită la dispoziția plantelor de cultură. Metode care urmăresc o echilibrare a umidității și a substanțelor nutritive prin îmbunătățirea solului și a rotației culturilor , sunt mai eficiente și mai economice Toate măsurile care modifică raporturile biologice și biochimice din sol, înfluențeză totdeauna , întreaga biodinamică a solului. Cercetări pentru verificarea interrelațiilor directe dintre lucrările agricole și condițiile pedobiologice au fost efectuate într-o măsură foarte redusă pe turbării și în special pe turbării joase . primele stadii de turbificare par să depindă în mod predominant de activitatea microorganismelor , în stadiile ulterioare rolul precumpănitor avâdu-1 procesele chimice de polimerizare și condensare . Introducerea în cultură a turbăriilor oligotrofe influențează nu numai însușirile lor chimice și fizice , ci ca urmare a modificării reacției , condițiilor de aerisire și mobilitate a apei , precum și a conținutului de substanțe nutritive, au loc de asemenea transformări biologice profunde .

2.2.3.Influența culturii plantelor furajere asupra vieții din sol .

Se manifestă atât în culturi pure cât și în amestec , precum și influența , resturilor vegetale ale plantelor furajere asupra culturii următoare și asupra ogorului negru , atât din punct de vedere pedobiologic cât și în ceea ce privește producțiile. Testele efectuate pe perioadele de timp au arătat că la o cultură oarecare de bacterii , ciperci și animale din sol este dirijat de la perioadă la perioadă de schimbările intervenite în ceea ce privește umiditatea și temperatura solului. La testele efectuate pe specii de plante și grupe de plante s-a constatat că activitatea biologică din sol nu este dirijată numai de factorii de umiditate și temperatură ci și de speciile de plante furajere cultivate. Resturile vegetative ale diferitelor specii de plante furajere, cultivate timp de 2 ani, exercită o influență specifică asupra conținutului de bacterii, ciuperci și animale din sol timp de mai mulți ani. Se constată influența specifică a plantelor furajere asupra numărului de bacterii , ciuperci și animale în rizosfera intimă și îndepărtată a solului în diferite anotimpuri în comparație cu solul unei variante experimentale necultivate , adică neinfluențată de plantele futajere . După cum era de așteptat , amestecul leguminoase-graminee a prezentat valorile cele mai ridicate .

2.2.4.Asolamentele.

Plantele de cultură pot să dea producții maxime în mod conținu numai dacă sunt cultivate într-un asolament în care aceiași specie de plantă nu revine prea repede pe același loc. Caracteristica asolamentului în concepția actuală constă în aceea că pe teren nu se practică numai alternanța de specii , ca de exemplu alternanța între grâu de primăvară și grâu de toamnă, ci are loc alternanța rațională între cereale și alte culturi necerealiere. Printre criteriile cele mai importante de alcătuire a asolamentelor, se numără și acela ca una din grupele de plante să exercite o acțiune pozitivă asupra solului, a biologiei și fertilității, prin culturi prăsitoare, combaterea buruienilor, umbrirea solului și economisirea apei . Păioasele înrăutățesc în general însușirile solului . Ele sunt considerate ca premergătoare mai puțin bune. De aceea , se recomandă ca într-un asolament să urmeze cât mai rar posibil cereale după cereale. Diferitele rezultate din experiențele cu asolamente au arătat că la sfârșitul unei rotații, a unei verigi din asolament, sau câteodată chiar în timpul vegetației unei plante cultivate în cadrul asolamentului se pot obține rezultate pedobiologice care corespund concepțiilor generale, în sensul că asolamentul, veriga asolamentului sau specia introdusă cu cea mai mare producție de rădăcini, respectiv cu cea mai mare cantitate de resturi vegetale, au prezentat o dinamică pedobiologică corespunzătoare. Măsurile de cultură luate ca: dezmiriștirea , fertilizarea și însămânțarea culturii este posibil să influențeze într-o măsură mare structura, temperatura și umiditatea solului.

2.2.5.Problema oboselii solului și a influenței pesticidelor asupra vieții in sol.

S-a constatat scăderea producției agricole după cultivarea repetată și intensivă a unor anumite plante de cultură. Deoarece oboseala solului poate fi observată de multe ori și pe soluri aprovizionate cu substanțe nutritive, s-a presupus că acest fenomen este produs de protozoare , care printr-o înmulțire exagerată consumă bacteria din sol și distrug echilibrul biologic al solului , producând astfel diminuarea fertilității lui. O altă ipoteză după care oboseala solului ar fi produsă de lipsa microelementelor din sol , nu a putut să se mențină , s-a dovedit că în cazul unei sterilizări parțiale nu se modifică conținutul de microelemente din sol, în schimb este imediat înlăturată oboseala solului. O mare răspâdire o are ipoteza că fenomenele de oboseală a solului au la bază cauze bioedafice.Este posibil ca substanțele inhibatoare cu acțiune fiziologic-nutritivă produse de microflora solului specifică diferitelor specii de plante verzi să se acumuleze în sol în cantități mari astfel incât să perecliteze în mare măsură creșterea plantelor respective , în cazul cultivării lor repetate . Este posibil ca oboseala solului să fie produsă de bacteriile și ciupercile fitopatogene a căror dezvoltare este stimulată de monocultură. S-a reușit chiar ca prin inocularea solului cu așa numitele organisme "inhibatoare" cum sunt de exemplu Pseudomonas fluorescens, P.aerugonosa, P.tumefaciens și tulpini de Fusarium să producă artificial oboseala unui sol parțial sterilizat .într-un sol sănătos și fertil predomină o populație microbiologică stabilă și bine echilibrată . Orice deranjare a acesteia, produsă de măsurile culturale sau de influența factorilor din mediul înconjurător duce la o modificare a echilibrului biologic inițial din sol .

Repartizarea bacteriilor în diferite tipuri de sol

Tabelul nr.2.1.

Principalele categorii de microorganisme prezente în sol

Tabelul nr.2.2.

CAPITOLUL 3

Implicarea microorganismelor în circuitul azotului în natură

3.1. Azotul, element biogen esențial

Azotul este un element biogen esențial deoarece intră în compoziția proteinelor și a altor substanțe organice de importanță deosebită pentru toate organismele vii. În totalitatea organismelor vii, animale și vegetale, azotul este înmagazinat numai în proporție de 0,036% din totalul azotului. Azotul este foarte răspândit în natură, găsindu-se în cantități variabile în toate mediile naturale. Rezervele de azot ale plantei sunt distribuite în cinci compartimente:

a) Rocile primare dețin 97,8% din azot sub formă de N2, care participă foarte puțin la circuit (prin activitatea vulcanică și eliminarea de gaze)

b) Rocile sedimentare conțin 0,2% din cantitatea totală de azot

c) Sedimentele din adâncul mărilor și oceanelor ocupă un procent neînsemnat din cantitatea totală de azot și se formează prin depunerea compușilor organici. Se apreciază că prin activitatea microorganismelor se recuperează 5 x 106 t/an sub formă de compuși anorganici solubili, dar depunerile animale depășesc cantitatea recuperată, ceea ce semnifică scoaterea lui din circuitul natural a acestei cantități de compuși cu azot.

d) Cea mai importantă rezervă planetară de azot o constituie atmosfera, în care azotul ocupă circa 75% din greutate și 78% din volumul total al acesteia. Dar azotul molecular nu poate fi utilizat de plantele verzi, ci numai de unele microorganisme dotate cu un echipament enzimatic specializat în acest scop. Aceste microorganisme numite fixatoare de azot molecular pot fi libere și simbionte, aerobe și anaerobe.

e) Rezerva de azot din sol și apă: cea mai mare parte se găsește în humus, în organismele vegetale și animalele moarte care returnează de fapt solului azotul absorbit sub formă de azotați și săruri de amoniu de către plantele verzi. Azotul din sol mai provine din excrete și se găsește sub formă de NO3¯, NO2¯, NH4+ precum și în organismele vii.

Azotul din sol și apă este cel mai dinamic. Mobilitatea sa este conferită atât de ritmicitatea schimbării formelor sale de existență cât și de diversitatea conversiilor pe care le suferă, factorul determinant al trecerii azotului dintr-o formă chimică în alta fiind microorganismele. Prin procesul de fixare biologică sunt introduse în sol cantități foarte mari de azot. Prin urmare fixarea azotului molecular are în natură și mai ales în practica agricolă, o importanță foarte mare. Plantele iau azotul din soluția solului sub formă de ioni de NO3¯, NO2¯, NH4+. Azotul participă în plantă la compoziția substanțelor proteice, a acizilor nucleici, a clorofilei, a unor vitamine și fermenți și a unor substanțe anorganice. Cantitatea de azot variază cu specia, vârsta și organul cercetat. Cercetările au dovedit că lipsa azotului poate duce la profunde modificări la plante. Cloroplastele sunt mai sărace în proteine și clorofilă, înfrățirea cerealelor este mai slabă, dar acestea sunt mai bogate în amidon și lipide. Datorită lipsei azotului din sol se observă o deplasare a substanțelor azotoase din țesuturile bătrâne în organele tinere în creștere, ceea ce duce la moartea prematură a frunzelor bătrâne și a mugurilor. Conținutul în azot total în sol variază în funcție de numeroși factori printre care esențiali sunt: conținutul de humus și raportul C:N. Pentru cele mai multe soluri cultivate conținutul de azot în stratul arabil este cuprins între 0,1-0,3% (procente ce corespund cantității de 3-9000 kg azot/ha). Solurile cu multe substanțe organice au un procent de azot de până la 3%. Cea mai mare parte a azotului în sol se găsește sub formă de combinații organice. Formele anorganice de azot din sol aparțin unor compuși ca: săruri de amoniu, nitrați, nitriți. De asemenea se întâlnesc formele gazoase ale azotului: N2O, NO, NO2 etc. Azotul amoniacal se găsește mai rar în solurile cultivate unde, datorită microorganismelor nitrificatoare este rapid transformat în forme nitrice. Azotul din nitriți este repede oxidat de către bacterii în nitrați. Concentrația de nitrați din sol este variabilă, depinzând de următorii factori: umiditate, aerație, plante de cultură, capacitate de mineralizare și mobilizare a solului. Majoritatea azotului din sol se găsește sub formă de aminoacizi. Unele combinații ale azotului se pot găsi sub formă de nucleopeptide și de acid teicoic a căror proveniență o constituie peretele bacterian. Aproximativ 5-10% din azotul total organic se găsește sub formă de zaharuri aminate, originea acestora fiind atribuită microorganismelor care pot secreta acești compuși sub formă de polizaharide, antibiotice, mucopeptide etc. În acizii huminici ai solului, azotul organic este prins în proporție de 50-60% din cantitatea totală.

3.2. Principalele etape ale circuitului azotului în natură

Datorită unor procese biologice, între azotul organic și cel anorganic din sol există o permanentă tendință de echilibrare. Azotul accesibil din sol atât pentru microorganisme cât și pentru plantele superioare este controlat de două procese opuse: mineralizarea și imobilizarea. Este cunoscut faptul că activitatea microorganismelor capabile să descompună substanța organică a solului este de obicei maximă în perioada în care plantele de cultură nu manifestă o absorbție maximă a acesteia. Ca urmare, în sol se eliberează cantități mai mari de azot nitric, care, în condițiile unor precipitații abundente pot fi cu ușurință antrenate cu apa în profunzimea solului. Pentru combaterea acestor fenomene nedorite se folosesc o serie de substanțe inhibitoare, capabile să regleze eliberarea azotului din compușii organici din sol în funcție de nevoile plantelor. Imobilizarea biologică a azotului are loc în celula microorganismelor și trece prin stadiul formării aminoacizilor și apoi al formării proteinei microbiene. Cercetările au arătat că imobilizarea biologică are loc în cursul a 45 de zile, perioadă în care azotul mineral introdus poate fi întâlnit în toate fracțiunile organice (azot aminic, amidic, hexozaminic). Totalitatea transformărilor pe care le suferă azotul în atmosferă, dintre care cele mai importante sunt de natură microbiană, constituie ciclul azotului. Circuitul azotului în natură cuprinde etapele:

Fixarea azotului atmosferic

[NUME_REDACTAT]

Denitrificarea

3.2.1. Fixarea azotului atmosferic

Fixarea azotului atmosferic prin intermediul microorganismelor este o verigă importantă în circuitul biologic al azotului. Făcând abstracție de cantități mici de azot molecular care devin accesibile plantelor pe cale fizico-chimică, prin fixarea lor în sol în cursul descărcărilor electrice și cu apele de precipitații, cea mai mare parte a azotului atmosferic ar rămâne nefolosită dacă nu ar exista microorganismele fixatoare de azot.

Cercetările au dus la izolarea și descrierea a numeroase genuri de bacterii fixatoare de azot ce se pot clasifica în două mari grupe, după modul lor de viață:

A. Microorganisme simbiotice care fixează azotul molecular în nodozitățile plantelor leguminoase (genul Rhizobium) sau neleguminoase (genul Frankia).

B. Microorganisme libere care pot fi aerobe și anaerobe

1. Dintre microorganismele libere aerobe, cele mai importante aparțin genurilor:

Azotobacter cu speciile Azotobacter chroococcum, Azotobacter vinelandii, Azotobacter agilis

Beijerinchia care este omologul tropical al genului Azotobacter, cu următoarele specii: Beijerinchia indica, Beijerinchia mobilis

Derxia răspândită în solurile tropicale din India și Brazilia cu speciile Derxia gummosa, Derxia indica

Alte bacterii libere fixatoare de azot aparțin genurilor Azomonas, Pseudomonas, [NUME_REDACTAT] cuprind genuri fixatoare de azot ca Nostoc, Rivularia

2. Microorganismele fixatoare de azot libere, anaerobe sunt reprezentate de genurile:

Clostridium cu speciile Clostridium pasteurianum, Clostridium butyrieum, Clostridium acetobutyricum

Desulfovibrio cu specia Desulfovibrio desulfuricans

Rhodospirillum cu specia Rhodospirillum rubrum

Cea mai interesantă interrelație dintre microorganisme și plante este simbioza Rhizobium-leguminoase, realizată la nivelul nodozităților de pe rădăcinile acestei familii de pe plante. Trebuie menționată și existența unor nodozități false în care nu se găsesc bacterii simbiotice asemănătoare celor de azot molecular, ci sunt parazite aparținând speciei Agrobacterium tumefaciens. De asemenea apar pe rădăcini nodozități provocate de un nematod mic Heterodera radicicola patogen pentru plante.

[NUME_REDACTAT]-leguminoase prezintă un caracter net beneficiar pentru planta gazdă, care utilizează pentru nevoile proprii azotul atmosferic fixat de Rhizobium iar bacteriile întâlnesc un mediu nutritiv favorabil.

Nodozitățile active se caracterizează printr-o zonă centrală bine dezvoltată constituită din celule parenchimatoase pline cu bacteroizi și conținând leghemoglobină. Corelația strânsă între volumul acestei zone și cantitatea de azot fixat, precum și lipsa la nodozitățile ineficiente demonstrează că ea reprezintă sediul fixării, localizarea precisă fiind celulele bacteroide și membrana care le înconjoară. Procesul de fixare a azotului molecular reclamă o sursă de energie, o sursă reducătoare și un echipament enzimatic specific. Aceste condiții sunt asigurate de către plantă prin produșii de fotosinteză care servesc ca sursă reducătoare și de energie precum și de bacterie care dispune de echipamentul enzimatic adecvat. Acesta se compune dintr-un complex de enzime cu activitate hidrogenazică și nitrogenazică, activatoare a azotului molecular. Sistemul enzimatic nitrogenazic este format din două componente proteice diferite care funcționează asociat într-un ciclu catalitic:

Componente I cu masa moleculară cuprinsă între 200-250.000 daltoni în funcție de specia fixatoare de azot este un tetramer alcătuit din protomeri identici (Rhizobium) sau de două tipuri, conținând 17-32 atomi Fe, 18-28 atomi de S și 2 atomi de Mo. Atomii de molibden sunt legați de proteină prin intermediul unui cofactor de dimensiuni reduse care constituie centrul activ al enzimei. Cunoscută sub denumirea ca molibdoferodoxina, proteina Mo-Fe, pe baza unor studii recente este considerată ca enzimă propriu-zisă, deci dinitrogenaza, deoarece leagă și reduce N2 și alte substrate. Este extrem de sensibilă la acțiunea O2.

Componenta II, cu masă moleculară de 55-60.000 daltoni, este formată din doi protomeri identici, 4 atomi de Fe și grupări cu sulf. Considerată ca substrat enzimatic care se asociază și se disociază cu dinitrogenaza la fiecare tu al ciclului catalitic este denumită azoferedoxina, proteina-Fe sau dinitrogenaz-reductaza.

Acest sistem enzimatic prezintă următoarea particularitate: nici unul din componenții săi nu sunt activi decât prin cuplarea lor tranzitorie. Sinteza sistemului enzimatic nitrogenazic este guvernată de un grup de gene, denumite gene nif a căror mod de organizare nu este complet elucidat la toate microorganismele fixatoare de azot. Concomitent se elaborează în nodozitate un pigment roșu numit leghemoglobină. Este singura hemoglobină din regnul vegetal având structură asemănătoare mioglobinei din țesutul muscular. LegHb fixează o mare cantitate de O2 și participă printr-un proces de difuzie facilitată în transferul acestuia de la exteriorul nodozităților la bacteroizi ca oxilegHb. Datorită unei capacități foarte slabe de disociere a O2 liber, acesta este menținut la nivelul bacteroizilor într-o concentrație foarte scăzută, în limite care permit menținerea metabolismului oxidativ și producerea de ATP în lanțul respirator bacterian, dar în același timp suficient de mică pentru a asigura protejarea nitrogenazei (N2azei) de inactivare. Reacția chimică globală de fixare a azotului este aceeași, indiferent dacă se obține în industria chimică sau în celula bacteriană și constă în ruperea triplei legături din molecula de azot și legarea a 3 hidrogeni de fiecare parte atom de azot.

Datorită marii stabilități, energia necesară pentru activare este foarte mare. Reducerea fiecărei molecule de azot, in vivo, este asociată cu consumul a 6-15 ATP iar după Brill (1980) chiar 21-25 ATP, după reacția:

N2 + 3H2 + (6-15)ATP 2NH3 + (6-15)ADP + (6-15)[NUME_REDACTAT] reducătoare poate fi reprezentată de acidul piruvic, acidul α-cetoglutaric sau H2. Astfel acidul piruvic furnizează electronii pentru reducerea feredoxinei și constituie sursa de energie necesară sintezei ATP. Electronii furnizți de piruvat nu reduc în mod direct nitrogenaza, ci sunt transferați unui transportor intermediar, ferodoxina (Fd), iar în lipsa acesteia, flavodoxinei (Fld) care are același rol.

Ferodoxina sau flavodoxina transferă electronii proveniți de la piruvat inițial la componentul II (azoferredoxina), care reacționează cu ATP și cedează electronii componentului I, la nivelul căruia are loc reducerea efectivă a N2 la NH3.

Reducerea N2 la NH3 este însoțită întotdeauna de formarea de H2, deoarece o parte din electronii furnizați de substratul reducător nu sunt destinați reducerii N2, ci formează H2 prin reducerea H+ din cytosol (2H+ + 2e¯ → H2). Producerea de H2 apare ca o expresie a competiției pentru electroni între situsul activ al N2azei și H+ din citosol, ceea ce amplifică mult consumul energetic (4 moli ATP → 1 moleculă H2). Reacția de formare a H2 este catalizată de hidrogenază care la microorganismele fixatoare de N2 libere funcționează bidirecțional, reciclând H2 și redirijând electronii spre N2ază.

Amoniacul rezultat va intra în reacție cu acizii α-cetonici, formând acizii aminici. Microorganismele folosesc patru căi principale de încorporare a NH3 în compușii organici:

3). Reacția catalizată de aspartază, din care rezultă aspartatul

4). Reacția catalizată de glutamin-sintetază (GS) care necesită ATP și se formează glutamina

Intensitatea procesului de fixare a N2 în natură depinde de numeroase condiții, dintre care două au o importanță deosebită: absența azotului combinat și o sursă de carbon asimilabilă. Dacă în sol se găsesc compuși de azot mineral, microorganismele îl vor folosi cu prioritate, caz în care potențialul de fixare va scădea simțitor. Această situație nu survine când sunt cantități mici de azot mineral în sol, deoarece microorganismele minerale vor fi concurate de alte microorganisme autotrofe. Nivelul azotului accesibil pentru bacteriile fixatoare vor imobiliza rapid azotul existent, iar surplusul de material energetic servește fixatorilor de azot. Nu trebuie neglijat nici rolul plantelor care prin sistemul radicular consumă compușii minerali de azot.

3.2.2. [NUME_REDACTAT] mai mare parte a azotului din orizonturile superficiale ale solului se prezintă sub formă de azot în combinații organice. El provine din proteinele animale sau vegetale, din biomasa microbiană, din excretele animale. În climatul temperat, o rezervă majoră de azot organic este asociată cu humusul și aceasta este accesibilă organismelor vii numai după ce a a fost mineralizată printr-un proces foarte lent. Extractele sau hidrolizatele de sol conțin practic toți aminoacizii existenți, legați în diferite combinații organice și în cantități mici (2-400 ppb) ca aminoacizi liberi, glucide aminate (glucozamine, galactozamine), baze nucleice purinice și pirirmidinice etc. Aminoacizii legați reprezintă 20-50% din azotul total din humus, iar azotul din glucidele aminate 5-10%. Mineralizarea azotului organic din sol este un proces esențial în ciclul acestui element în natură, deoarece asigură conversia la forme anorganice, mai mobile, utilizate de plante, ca și microorganisme. În sens larg, procesul de amonificare evoluează în două etape succesive:

A. Etape nespecifică

Etape nespecifică, de proteoliză este efectuată de microorganisme heterotrofe banale: Pseudomonas sp., Arthrobacter sp., Bacillus thermoproteolyticus, Proteus species, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Clostridium, Flavobacterium sau de fungi ca Aspergilius, Mucor, Penicillium, Alternaria etc. Cărora li se adaugă efectul proteinazelor de origine animală sau vegetală. În cursul acestei faze, compușii organici cu structură complexă sunt hidrolizați la molecule care pot pătrunde în celule, fiind utilizate de alte microorganisme, sau sunt degradate în continuare în etapa specifică de amonificare. Enzimele implicate aparțin la două grupuri majore:

Proteinazele sunt endopeptidaze care atacă lanțul polipeptidic în interior clivându-l la peptide cu diferite mărimi. Unele proteinaze sunt nespecifice și scindează aleatoriu legăturile peptidice, iar altele sunt specifice, în sensul că recunosc numai anumite resturi de aminoacizi și hidrolizează legăturile petidice din vecinătatea lor. Specificitatea are uneori caracter de grup (se manisfestă față de aminoacizi bazici, aromatici, etc.).

Peptidazele sunt exopeptidaze și acționează la capătul N-terminal (aminopeptidaze) sau hidrolizează peptidele la nivelul C-terminal (carboxipeptidaze).

Ambele tipuri de enzime eliberează di sau tripeptide care sub acțiunea di sau tripeptidazelor eliberează aminoacizii liberi ce pot fi transportați intracelular. Acest proces interesează însă numai o mică fracțiune din rezerva de azot organic care este, în general, persistentă datorită rezistenței la degradare.

Două ipoteze, ce nu se exclud reciproc, pot explica această rezistență:

1). Legarea proteinelor de constituienți neproteici ai humusului, ca de exemplu complexele ligninoproteice rezistente la degradare

2). Înglobarea proteinelor în rețeaua cristalină a argilelor minerale.

În plus, enzimele extracelulare, fiind ele însele proteine sunt absorbite pe diferiți compuși din sol și făcute mai puțin active.

B. Etapa specifică

Această etapă, determinată de microorganismele din sol, asigură degradarea în continuare a compușilor rezultați di etapa premergătoare de proteoliză și a celor rezultați din hidroliza acizilor nucleici, precum și a ureei, acidului uric, glucidelor aminate etc. si conversia lor în amoniac. În sens strict amonificarea este reprezentată de procesul de eliberare a amoniacului, prin acțiunea microorganismelor asupra moleculelor rezultate din descompunerea proteinelor, a acizilor nucleici etc. În acest sens, producerea și eliberarea de amoniac prin acțiunea microorganismelor de putrefacție nu este un proces de amonificare. Ea se realizează prin mecanisme diferite, încă incomplet elucidate, în funcție de natura microorganismelor implicate și de condițiile de mediu. Ele au însă, totdeauna amoniacul ca produs final. Au fost descrise mai multe căi metabolice de dezaminare, ca de exemplu:

Dezaminarea oxidativă descrisă la Preoteus sp., Pseudominas aeriginosa, Escherichia coli, Aspergillus niger ș.a. evoluează după reacția:

Dezaminarea reductivă, caracteristică aproape exclusiv bacteriilor anaerobe (Clostridium sp.) urmează calea:

Dezaminarea desaturantă, descrisă la Escherichia coli, Proteus sp., Clostridium sp., Neurospora, evoluează după reacția:

Dezaminarea prin deshidratare, descrisă la Escherichia coli și Neurospora crassa, urmează mai multe reacții cplate:

Amoniacul format fiind volatil, este parțial eliberat în atmosferă, unde ar putea diminua riscul ploilor acide. Durata rezistenței în atmosferă este foarte scurtă, de câteva zile, timp în care amoniacul poate fi expus unor transformări fotochimice sau poate reacționa direct cu oxizii sulfului pentru a produce sulfat de amoniu. Aceștia pot reveni pe sol sau în mări și oceane odată cu ploile sau prin depuneri de particule. Cantitatea de azot amoniacal prezent în precipitații pe plan global, este apreciată la 38-85 milioane tone/an. O altă parte din amoniacul format este adsorbit temporar pe complexele argilo-humice sau, cea mai mare parte, convertit în condiții de aerobioză la NH4+, care este oxidat la nitriți și ulterior la nitrați, forma cea mai accesibilă plantelor și multor microorganisme. Procesul de amonificare evoluează lent. Ritmul și randamentul său sunt evidențiate de cantitatea de azot amoniacal ce rămâne în sol la sfârșitul procesului.Amonificarea evoluează în condiții optime în straturile superficiale ale solului bine structurate și aerate, cu umiditate potrivită, la PH apropiat de neutralitate. Randamentul este optim la temperatura de 30ºC, dar limitele la care se realizează sunt mult mai largi (2-40ºC). În solurile acide, viteza amonificării este redusă, dar randamentul este maxim, datorită capacității acestor soluri de a fixa amoniacul rezultat pe complexele argilo-humice.În solurile foarte alcaline, randamentul este foarte mic, deoarece amoniacul rămas liber este degajat. Amonificarea este influențată și de raportul cantitativ dintre carbon și azot în sol (normal C/N = 15-20). Prezența unui excedent de substanțe cu carbon (ca de exemplu, în cazul încorporării de paie ca îngrășământ verde fără asocierea cu substanțe minerale azotate) are efect negativ asupra randamentului amonificării.

a) Amonificarea acizilor nucleici

Este un proces complex cu o evoluție asemănătoare celei a proteinelor. În faza nespecifică, acizii nucleici proveniți din celulele vegetale, animale și din microorganisme sunt clivați la fragmente mici și în final la mononucleotide individuale. Degradarea este efectuată de ribonucleaze, dezoxiribonucleaze, nucleozidaze etc. sintetizate de bacterii din genurile: Achromobacter, Bacillus, Clostridium, Streptomyces sau de microfungi: Aspergillus, Penicillium. În etapa următoare purinele și pirimidinele neutilizate de alte microorganisme sunt degradate de bacterii din genurile Clostridium, Corynebacterium, Micrococcus, Pseudomonas etc. până la stadiul de uree care apoi suferă procesul de amonificare.

b) Amonificarea ureei

Ureea din sol provine din excreții din metabolismul microorganismelor și din degradarea bazelor purinice și pirimidinice. Se apreciază că microorganismele pot transforma la amoniac în mai puțin de o săptămână 200-400 ppm azot ureic, la temperatura de 10ºC. Conversia este mai rapidă la temperaturi mai mari (37ºC). În cazuri, ritmul conversiei la amoniac este mai rapid decât cel al nitrificării, astfel încât amoniacul produs este pierdut prin volatilizare în atmosferă sau acumulat, după adsorbție prealabilă, în sol. Hidroliza ureei este realizată de un grup numeros de microorganisme capabile să producă enzima urează. Ele includ genurile: Achromobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas, o serie de actinomicete și microfungi filamentoși. Lor li se adaugă grupul numit al urobacteriilor, caracterizate prin rezistență la concentrații mari de uree și pH alcalin și prin capacitatea de a elibera cantități mari de amoniac. Din grupul urobacteriilor fac parte o serie de bacterii, unele cu statut taxonomic discutabil, ca Bacillus probatus, Urobacillus pasteurii, Bacillus freudenreichii și unii coci ca Sarcina ureae, Micrococcus ureae, Plenosarcina ureae. Conversia ureei la amoniac decurge după reacțiile:

Activitatea amonificatoare a urobacteriilor este foarte importantă, deoarece ureea conține 47% azot, care altfel ar rămâne neutilizat de plante iar cantitatea anuală de uree eliminată în natură este foarte mare, atingând zeci de milioane de tone pe an (se apreciază că populația umană a globului elimină în 24 de ore cca. 15000 tone de azot ureic, iar toate celelalte animale 1500 tone).

c). Amonificarea cianamidei de calciu

Cianamida de calciu este un îngrășământ sintetic a cărui biodegradare se face în două faze succesive: prima este hidroliza cianamidei în uree, iar a doua este hidroliza ureei după ecuațiile:

Amoniacul produs în sol, o parte din el se transformă prin nitrificare în anioni de azotat, altă parte este utilizată de microorganisme pentru sintezele acizilor aminici proprii, o altă parte este absorbită de plantele verzi, o parte este stabilizată pe substanța organică a solului, o parte este adsorbită de mineralele argiloase din sol iar o altă parte se volatilizează ca amoniac gazos, pierderile de amoniac prin levigare sunt infime.

3.2.3. [NUME_REDACTAT] nu constituie o etapă a mineralizării propriu-zise ci consecutivă acesteia. Ea are însă o importanță practică deosebită prin faptul că plantele beneficiază de surse suplimentare de azot necesare nutriției. În afară de amoniacul de origine biologică, în sol se mai acumulează amoniacul și de origine nebiologică eliberat de pe argile sau adus de îngrășămintele amoniacale. Când condițiile ecologice sunt favorabile, amoniacul poate fi oxidat pe cale biologică. Nitrificarea este procesul de oxidare a amoniacului într-o primă etapă de nitriți și printr-o oxidare ulterioară la nitrați. Microorganismele participante la acest proces se numesc nitrificatoare și pot fi autotrofe sau heterotrofe.

A. Nitrificarea autotrofă

Este realizată de organisme care folosesc ca sursă de carbon bioxidul de carbon și carbonații, iar ca sursă de azot și energie amoniacul și respectiv nitriții. Procesul are loc în două etape succesive:

a). Nitritarea este prima etapă de oxidare a amoniacului în nitriți și este realizată de specii ale genurilor: Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosocystis. Același fenomen poate avea loc nu numai pe calea unei oxidări directe ci și pe calea unei dehidrogenări:

NH4+ + 3/2O2 → NO2¯ + 2H2O + 2H+ + 63,8 kcal

b). Nitratarea este a doua etapă de oxidare a nitriților în nitrați sub acțiunea speciilor Nitrobacter, Nitrospira, Nitrocystis, după reacția globală:

B. Nitrificarea heterotrofă

Există însă și nitrificatori heterotrofi care oxidează amoniacul din sol cu participarea unor hidroxamați sintetizați în sol de câteva microorganisme. Mecanismul biologic al nitrificării heterotrofe, deși insuficient cunoscut, este total diferit de cel al nitrificării autotrofe. Specii ale genurilor Achromobacter, Corynebacterium, Agrobacterium produc nitriți din oxinele unor acizi organici. De asemeni, specii ca Aspergillus flavus și Artrobacter globiformis produc din amoniac sau din alți compuși amoniacali, nitriți și nitrați.

Produsul final al nitrificării este azotul nitric din care :

cea mai mare parte este absorbită de plantele verzi

o parte din ele se pierde prin levigare

o parte se pierde prin denitrificare

o parte este utilizată ca sursă de azot de către microorganisme

Până în prezent nitrificarea a fost considerată ca fiind realizată în exclusivitate de bacterii chemolitoautrofe. În prezent s-a stabilit că o serie de bacterii și fungi nelitotrofi sunt capabile de a oxida NH4+. Spre deosebire de nitrificarea autotrofă, acest proces heterotrof pare independent de creșterea microbiană. Rata nitrificării produsă de organismele heterotrofe e mult mai mică decât cea a organismelor nitrificatoare chemolito-autotrofe. În plus au fost identificate și microorganisme metilotrofe (bacterii care oxidează metanul) care oxidează NH4+la NO2¯ când sunt crescute în culturi puse pe medii diferite. Oxidarea NH4+la NO2¯ de către metilotrofe este considerată a fi un exemplu de „cooxidare” prin care un microorganism poate oxida un compus dar nu-l poate utiliza ca unică sursă de carbon.Cu toate că producția de nitrat realizată de microorganismele nitrificatoare heterotrofe este neglijabilă, procesul explică producerea de nitrat în solurile acide unde dezvoltarea organismelor nitrificatoare litotrofe este inhibată. Densitatea bacteriilor denitrificatoare în sol este între 10³ și 105 celule/g sol. În medii cu conținut în NH4+, ca mlaștinile, densitatea crește la 107-108 bacterii/g sol. Prezența oxigenului reprezintă exigența obligatorie pentru toate speciile de bacterii nitrificatoare. Reacțiile încetează imediat în absența lui sau se desfășoară într-un ritm încetinit pe măsură ce tensiunea O2 scade. Bacteriile nitrificatoare se dezvoltă cel mai bine la pH = 7,5 – 8, dar cresc în natură și în condiții suboptimale (pH = 6). Temperatura optimă de dezvoltare este de 25 – 30ºC, iar limitele sunt de 5 – 40ºC. În sol, umiditatea acționează indirect asupra nitrificării, datorită faptului că afectează gradul de aerare, care se știe că este invers proporțional față de gradul de umiditate. În condiții normale, randamentul nitrificării este direct corelat cu cantitatea de NH4+ din mediu. Transformând NH4+la NO2¯ și NO3¯ , ele determină o schimbare de sarcină electrică de la pozitivă la negativă. Ionii încărcați pozitiv tind să fie legați de particulele de argilă încărcate negativ, în timp ce cei pozitivi migrează liber în apa din sol. În felul acesta, nitrificarea reprezintă un proces de mobilizare a azotului în habitatele terestre. Procesul de nitrificare are și o serie de consecințe negative :

1.Reprezintă o pierdere a formelor de azot fixat din sol, cu consecințe negative asupra nutriției plantelor.

2.Nitritul reacționează cu compuși aminați din apa freatică formând nitrozamine cancerigene.

3.Nitratul netoxic, ser ce poate fi redus la nitriți de către microorganisme din sistemul digestiv, determinând fenomene toxice consecutive combinării lor cu hemoglobina.

3.2.4 [NUME_REDACTAT] de denitrificare este în momentul de față insuficient precizat. Astfel, în sens larg, denitrificarea reprezintă mecanismul respirator prin care unele microorganisme numite denitrificatoare substituie nitratul oxigenului și-l folosesc ca acceptor final de electroni pentru reacțiile oxidative producătoare de energie. Bacteriile denitrificatoare formează un grup biochimic și toxonomic heterogen, care reunește peste 75 de genuri diferite. Unele sunt autotrofe și se dezvoltă în prezența CO2 și a H sau a compușilor reduși ai sulfului, iar cele mai multe heterotrofe. Principalele bacterii denitrificatoare aparțin genurilor Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Azospirillum, iar Thiobacillus denitrificans este o specie autotrofă și oxidează sulful pe seama nitraților pe care-i reduce la N2. Procesul de denitrificare se realizează în aerobioză, dar contrar concepțiilor mai vechi nici o bacterie denitrificatoare nu este strict anaerobă. Ceva mai mult, ele pot utiliza O2 ca acceptor final de electroni și preferă chiar respirația aerobă, dacă aceasta este posibilă. Cresc în anaerobioză pe medii care conțin NO2¯, NO3¯ și O2 . Biochimia denitrificării este foarte complexă și până în prezent în parte neelucidată. Este un proces multienzimatic determinat de activitatea enzimelor nitrat reductaze, nitrit reductaze, oxidnitricreductază și oxidnitros reductază care realizează secvența de reacții:

2NO3¯ → 2NO2¯ → 2NO → N2O → N2

Simultan cu denitrificarea are loc oxidarea substanțelor organice chimice care decurge din instabilitatea nitraților în sol. Dacă denitrificarea biologică este un proces anaerob, denitrificarea chimica este aerobă. În creșterea sau diminuarea stocului de azot din sol, intervin așadar procese biologice chimice și fizice care trebuie luate în considerație în bilanțul general al circuitului de azot. Denitrificarea se intensifică în solurile cu umiditate crescută, deoarece umiditatea în exces intensifică eliminarea aerului și se reduce în solurile bine aerate și la un pH mai mic de 7. În ce privește compoziția solului, intensitatea procesului este direct corelată cu cantitatea de carbon organic din sol și cu disponibilitatea acestuia. În general denitrificarea este un proces dăunător deoarece diminuează cantitatea de azot asimilabil din sol.

În general între pierderile și câștigurile de azot există un echilibru dinamic care asigură menținerea și perpetuarea vieții pe pământ.

CAPITOLUL 4

Cuantificarea microorganismelor din sol

4.1.Generalități privind metodica de cercetare și interpretare a microorganismelor din sol și a activității lor

S-a arătat în repetate rânduri că solul reprezintă o unitate formată pe de o parte din microorganisme pe de altă parte din substanța minerală și cea organică moartă . Faptul acesta impune ca la analiza și caracterizarea amănunțită a proprietăților sale să nu fie necesară numai aplicarea metodelor fizice și chimice de lucru ci și a celor biologice . în decursul anilor s-au încetățenit forte multe metode fizice și chimice de cercetare . In cadrul celei mai recente ramuri științifice a științei solului-biologia solului , încă nu se poate vorbi de existența unei metodologii unitare în cercetarea și interpretarea unui anumit caracter biologic .

Acest capitol nu este destinat unei descrieri ample a metodelor de lucru mai cunoscute din domeniul biologiei solului, ci unei aprecieri a procedeelor de cercetare mai importante. Metodele de cercetare pot fi împărțite în două grupe mari :directe și indirecte . La cercetarea unei probleme se aplică de multe ori ambele procedee , unul succedându-1 pe celălalt sau se folosește o combinație corespunzătoare obiectivului urmărit.

In cazul metodelor directe, microorganismele se cercetează fie în stare vie , în biotopul natural fie moarte , în stare fixată . în cazul metodelor indirecte microorganismele se desprind din biotopul lor natural și se studiază vii sau moarte după un tratament prealabil special. Activitatea poate fi cercetată și în spațiul vital , natural , neperturbat , sau în stare izolată în condiții artificiale. Orice procedeu folosit pentru elucidarea unor probleme de biologia solului implică anumite neajunsuri cu privire la metodica de cercetare , care deseori nu au numai un caracter tehnico-metodic. Ele rezultă în parte din faptul că niciodată procesele din sol sau dintr-un mediu artificial nu pot fi cercetate toate deodată și în dinamica lor. In practica experimentală se aplică metode uzuale de lucru cu care se determină doar procese izolate care în realitate au loc într-o interdependență cu celelalte procese necunoscute celui care efctuază experiența. Unele tratamente speciale și principii metodice importante s-au preluat din practica botanicii, zoologiei, respectiv medicinii și s-a adaptat obiectivelor urmărite în biologia solului. Procedele de sterilizare și colorare reprezintă tehnici auxiliare metodice deosebit de utile pentru lucrările efectuate în domeniul biologiei solului .De obicei, se preferă sterilizarea prin căldură uscată sau umedă deci așa-numita colorare intensivă .Anumite proprietăți ale organismelor pot fi identificate prin testarea rezistenței la acizi sau a colorației gram . Pentru cultivarea microorganismelor solului se întrebuințează vasele de sticlă, utilizate și în microbiologia generală precum și alte preparate auxiliare. In cadrul diferitelor metode de determinare din domeniul biologiei solului se aplică de asemenea tehnica microscopiei, cu un microscop obișnuit. Totuși în ultimul timp s-a impus utilizarea stereomicroscopului. Se utilizează microscopul electronic, care oferă posibilități aproape nelimitate de mărire (fotografii până la 1:50000 cu posibilități de mărire ulterioară până la 1:300000).

4.2. Tehnici experimentale în domeniul biologiei solului

4.2.1. Locul de muncă

Rezolvarea eficientă a eventualelor probleme este determinată și de anumite condiții de spațiu. Multe neajunsuri supărătoare pot fi prevenite dacă se acordă atenția cuvenită condițiilor de iluminare bună și de puritate microbiologică a aerului în camerele de lucru . O atenție deosebită se va acorda posibilităților de a distruge germenii din mediul înconjurător. Această cerință se satisface cel mai ușor prin procurarea unui mobilier fără suprafețe aspre muchii și crăpături , care se curăță ușor. Mesele de lucru, destinate pregătirii preparatelor și efectuării lucrărilor la microscop, se vor așeza pe cât posibil de-a lungul ferestrelor. Pentru efectuarea unor lucrări într-un mediu steril s-au impus încăperile cu pardoseală de piatră, pereți si mese cu faianță . Ferestrele trebuie prevăzute cu garnituri de cauciuc pentru a permite închiderea etanșă. Mediile de cultură necesare pentru cultivarea bacteriilor și ciupercilor din sol se prepară cel mai bine într-o încăpere destinată acestui scop. Tot în acesta încăpere se efectuează și celelalte lucrări de sterilizare. În laboratorul de inoculare a culturilor se pot realiza și menține constante diferite temperaturi cu ajutorul termostatelor. în spălătorul prevăzut cu pardoseală de piatră și pereți de faianță sau vopsiți în ulei , chiuvetele sau căzile se căptușesc cu cauciuc sau plumb , pentru a preveni spargerea sticlelor . Automatele pentru apă caldă și grătarele mari pentru scurgerea apei ușurează spălarea , relativ complicată a vaselor de cultură și a celorlalte unelte de laborator .

4.2.2.Aparate de lucru și auxiliare

Pentru lucrările din domeniul biologie solului se folosesc pe lângă instalațiile speciale , aparate utilizate în microbiologia generală și în pedologie . Unul din aparatele cele mai importante este microscopul. Acesta se folosește la cercetarea bacteriilor , ciupercilor , algelor și protozoarelor solului . Microscopul este de asemenea indispensabil pentru observarea caracterelor necesare identificării reprezentanților mezofaunei solului (nematode, acarieni). În cazul unor măriri foarte mari , obiectul și obiectivul se unesc cu un lichid (ulei de imersie ) al cărui indice de refracție se apropie de acela al sticlei . S-a mai arătat că pentru observarea preparatelor la microscop se mai folosesc diferite dispozitive auxiliare . Astfel în cazul observațiilor cu ajutorul câmpului întunecat, pentru devierea părților centrale ale fasciculului luminos se folosește condensatorul cu câmp întunecat . Procedeul cu contrast de fază oferă o imagine bine contrastată. Primul procedeu presupune utilizarea unui șurub micromagnetic, cel de al doilea mai utilizat, a unui micrometru ocular , etalonat cu ajutorul unui micrometru obiectiv. In practica experimentală a biologiei solului sunt indispensabile aparatele de sterilizare cu etuva , sterilizatorul de joasă tensiune și autoclavul . în etuvă , încălzită cu gaze sau curent electric , se sterilizează de obicei aparate auxiliare de sticlă sau metal timp de 1-2 ore la temperaturi de 140-160 ° C . Pentru obiectele care intră în contact direct cu solul se recomandă sterilizarea repetată de 2-3 ori în decurs de 24 de ore . Dat fiind faptul că într-o etuvă răspândirea uniformă a căldurii este împiedicată de numărul mare de vase de sticlă și cutii de tablă se recomandă să se încerce orice aparat nou încărcat , controlând la ce temperatură și în ce timp se obține sterilizarea completă. Sterilizatorul cu presiune joasă este un alt aparat indispensabil . Căldura umedă , adică apa fierbinte și vaporii de apă saturați au la aceiași temperatură un efect de sterilizare mult mai eficient decât căldura uscată și în consecință tratamentul timp de 1 oră la 100°C s-a arătat , în cele mai multe cazuri corespunzător. Autoclavul este un cazan de presiune cu pereți dubli, în a căror parte exterioară apa ajunge la fiert . Cu ajutorul autoclavului se sterilizează extracte de sol, medii de cultură, materiale lichide și solide. Materialul care suportă o încălzire prea mare sau cele care conțin germeni atât de rezistenți, încât o singură sterilizare nu asigură distrugerea totală a acestora , se vor supune unei sterilizări fracționate , prin repetarea tratamentului timp de mai multe zile și menținerea lor în timpul nopții la o temperatură de incubare potrivită .Sporii cu capacitatea de germinare pot germina și sunt distruși la sterilizarea următoare . Lichidele care nu pot fi nici încălzite , nici tratate chimic , se sterilizează prin filtrare . Lichidul cu conținutul de germeni se presează sau se aspiră cu ajutorul unei trompe de apă sau pompe de vid cu ulei, printr-un filtru de membrană , sticlă , azbest sau diatomit care reține germenii . Astfel filtrele Berkefeld N sau W și filtrele de sticlă G5 [NUME_REDACTAT] rețin bacteriile . Incubatoarele sau termostatele sunt apreciate ca deosebit de importante pentru cultura microbilor la anumite temperaturi. Un laborator trebuie dotat deasemenea cu o instalație de distilare cu debit mare și unul sau două răcitoare , precum și o pompă de vid cu ulei. Centrifuga, utilajul auxiliar pentru microfotografii și aparatele și instalațiile speciale completează și întregesc instalațiile unui laborator. Aparatele principale și auxiliare, îndeosebi vasele de cultură se confecționează din sticlă și trebuie fierte înainte de prima utilizare într-o soluție de HC1 3% pentru a prevenii eliberarea de ioni alcalini și apoi cu apă și apă distilată. Se folosește sticlăria de laborator Jena 20. Vasele de cultură se închid ori cu vată, ori cu capace neșlefuite. Baloanele de sticlă asigură o evaporație mai redusă . Alte vase speciale : vasele Freudenreich, Chamberland, Roux; capsule Kolle , vasele de cultură Jena , capsulele Petri au cea mai largă răspândire. Unelte auxiliare simple din sticlă se pot confecționa cu mijloace proprii în laborator: spatule, pipete, capilare.

4.3. Metodica de cercetare și interpretare a microflorei solului

4.3.1.Recoltarea probelor în câmp

Recoltarea probelor în câmp poate fi executată abia când, în interesul unei etichetări precise a variantelor experienței s-au precizat criteriile referitoare la numărul și volumul probelor de sol destinate cercetării . Speciile de organisme destinate cercetării, densitatea naturală de populare și uniformitatea lor în stațiunea respectivă reprezintă factori hotărâtori . Numărul de probe luate zilnic trebuie să varieze în funcție de obiectivul ce urmează a fi caracterizat și care poate fi densitatea de populare într-un anumit interval de timp , sau dinamica înmulțirii într-o perioadă de timp bine delimitată . Probele trebuie recoltate zilnic și apoi prelucrate , este neindicat să se recolteze săptămânal sau la intervale de timp mai mari probe puține dar voluminoase. Adâncimea de recoltare-două criterii sunt hotărâtoare pentru aceste aprecieri ;pe de o parte grosimea orizontului de sol , biologic activ și pe de altă parte determinarea adancimii celei mai populate . Pe solurile cultivate și în condiții ecologice din [NUME_REDACTAT] adâncimea cea mai populată a solului se întâlnește la 4-8 cm . Grosimea stratului activ din solurile de pădure depinde de condițiile edafice naturale ; stratul cel mai populat se află între 2-4 cm . Repartiția microorganismelor din sol în rizosfera intimă sau îndepărtată a plantelor superioare se determină prin săparea , curățirea și mărunțirea rădăcinilor în scopul izolării microorganismelor .

4.3.2.Lucrări premergătoare în laborator

Lucrările premergătoare cuprind între altele următoarele operații : sterilizarea vaselor Erlenmeyer , necesare prelucrării probelor , pregătirea vaselor și a pipetelor , a apei sterile pentru obținerea diluțiilor precum și a mediilor nutritive necesare culturii microorganismelor, în cantități corespunzătoare prelucrării ulterioare a probelor de sol. în practica experimentală o importanță deosebită pentru obținerea rapidă a unor diluții o are un aparat mecanic și steril de decantare . Diluția necesară este determinată de numărul de germeni ce se bănuiește că există in proba lucrată. în cazul solurilor nisipoase ușoare și la aplicarea tehnicii plăcilor turnate după Koch, determinarea cantitativă a ciupercilor se face la o diluție de 1:1000 iar a bacteriilor la o diluție de 1:100 000 . Pentru solurile nisipoase se recomandă o diluție de 1:1 mii, dacă determinarea bacteriilor se face direct prin numărare .

Prin diluție optimă se înțelege acea diluție la care în cazul determinării cantitative a bacteriilor apar cea 100 de colonii într-o capsulă Petri , iar îa cazul ciupercilor , 25 de colonii. Analiza microscopică a suspensiilor de sol se efectueză la diluția cea mai mare în cazul metodelor de cercetare directe . In cazul metodelor indirecte , la cantitatea de diluție inrodusă în capsulele Petri se adaugă medii nutritive pentru cultura germenilor vii din sol . Mediile de cultură trebuie să conțină atâta umiditate incât să fie izotone cu celulele microbiene cultivate .

Mediile de cultură se grupează după compoziția lor chimică și după scopul de utilizare . Pentru prepararea mediilor nutritive naturale se folosesc produse naturale animale sau vegetale . Mediile nutritive sintetice conțin numai substanțe chimice bine definite . După utilitate se împart în :medii nutritive generale sau colective (bulion nutritiv , biomalțul) .Soluțiilor nutritive lichide li se adaugă substanțe suport speciale (gelatină , agar , acid silicic , etc ) sau alte substanțe suport (turbă de Sphagnum).

4.3.3.Metode directe pentru cercetarea cantitativă și calitativă a microorganismelor solului

Pentru cercetarea microorganismelor solului se aplică atât metode directe cât și indirecte . Mulți autori au colaborat la introducerea și perfecționarea metodelor directe de cercetare . Printre tehnicile cele mai simple-procedeul propus de H.[NUME_REDACTAT] prepară un extract din de sol din 1 parte sol și 5-10 părți soluție fixatoare (0,15 g gelatină dizolvată în 1000 ml apă fierbinte ) pe care apoi îl agită timp de un minut ; după sedimentare , depune 0,1 ml din acest extract pe 1 cm2 al unei lame . Preparatul este apoi colorat , fixat , spălat și uscat Bacteriile colorate roz-pal sau roșu se analizează apoi la microscop . S.Vinogradski (1924) a perfecționat metoda în vederea îndepărtării particulelor minerale ale solului, care stânjenesc lucrările la microscop , propunând centrifugarea repetată și acoperirea preparatului uscat cu o peliculă subțire de agar. N.Holodnîi și G.Rossi au elaborat independent unul de celălalt un procedeu care permite cercetarea proceselor în mediul neperturbat. In stațiunea cercetată se efectuează cu ajutorul unui cuțit steril, o mică groapă. Se răzuiește apoi un perete al gropii, pe care se aplică o lamă pregătită și sterilizată , groapa umplându-se din nou cu sol . După 3-4 săptămâni se extrage lama fără a se perturba solul aderent și flora sa . Se curăță partea dorsală a lamei, se fixează la flacără , se spală cu apă distilată și se colorează după tehnica anterioară . Rezultate valoroase s-au obținut prin combinări realizate de K.Wallhăuser a metodelor lui N.Holodnîi și S.Strugger. Tehnica constă în pulverizarea plăcilor Holodnîi , scoase din sol , cu un strat de agar subțire , colorat cu portocaliu de acridină , diluat 1:10000.

Pe lângă aceste metode directe de cercetare, destinate în primul rând analizei calitative a florei solului și a interrelațiilor existente în mediul natural, s-au făcut eforturi și pentru realizarea determinărilor cantitative exacte .

4.3.4. Metode indirecte pentru cercetarea cantitativă și calitativă a microorganismelor solului

Prin metodele indirecte nu se studiază microorganismele din sol, ci descendenții acestora cultivați pe medii nutritive naturale sau sintetice în condiții artificiale. Cauza principală care face necesară aplicarea metodelor indirecte constă în faptul că în cazul cercetării directe organismele se distrug, ceea ce le face inaccesibile unei cercetări ulterioare . Un mare neajuns al metodelor indirecte de cercetare îl constituie , faptul că în condiții optime de mediu pe care le oferă mediile colective de cultură , dezvoltarea anumitor microorganisme este inhibată. Metodele indirecte pentru cercetarea cantitativă și calitativă a microorganismelor aplicate în domeniul microbiologiei solului se bazează pe tehnicile propuse de R.Koch (1881) pentru cultivarea microorganismelor pe medii naturale și artificiale de cultură.

4.3.4.1.Procedeul plăcilor turnate ale lui [NUME_REDACTAT] se aplică feacvent pentru determinarea numărului total de bacterii din probele de sol. După ce se stabilește diluția cea mai convenabilă se trece 1 ml din această diluție într-o cutie Petri. Apoi se adaugă un mediu nutritiv cu agar topit care are o temperatură de 50°C ; se omogenizează prin mișcarea plăcii în diferite sensuri, apoi se lasă suspensia de sol amestecat cu mediul nutritiv să se solidifice. Pentru caracterizarea numărului total de bacterii al unei experiențe de cămp se prepară zilnic în decursul unei anumite perioade, din fiecare probă mixtă de sol de pe o parcelă cel puțin 4 plăci paralele . Se întrebuințează întotdeauna un mediu nutritiv neselectiv. In vederea măririi preciziei determinării numărului de germeni se întrebuințează două sau trei medii nutritive cu compoziție variată; se recomandă utilizarea unui mediu nutritiv natural și unul sintetic. Pentru determinarea numărului total de bacterii, se întrebuințează următoarele medii nutritive generale naturale sau sintetice .

Agar nutritiv după Muller și Steinweg.

-3,0 g NaCl -20,0 g agar

-10,0 g peptonă -1000,0ml bulion

-2,0 g Na2HPO4

Mediul cu glicerina și peptonă după Hirte .

-20,00 g glicerina -0,25 g MgSO4

-2,50 g peptonă -0,01 g FeSO4

-1,00 g K2HPO4 -20,00 g agar

-0,04 g CaCO3 -1000,00 ml apă de conductă

-3,00 g NaCl

Reacția unui mediu nutritiv poate suprima creșterea bacteriilor nedorite pe plăcile cu culturi; pH-ul mediilor nutritive destinate cultivării de ciuperci se fixează la 4,5-5,5. Un mare neajuns al plăcilor turnate a lui Koch constă în faptul că nu dă nici-un fel de informații asupra coloniilor de ciuperci provenite din spori și a celor provenite din fragmente de hife. Un alt neajuns al metodei constă în faptul că mediile neselective de cultură nu asigură decât o dezvoltare cu totul necorespunzătoare a diferitelor basidiomicete , fapt evidențiat îndeosebi când se lucrează cu probe de sol de pădure unde aceste ciuperci participă și la formarea micorizei .

Microflora totală a unui sol în funcție de mediile de cultură utilizate

(număr germeni x 106/g sol) Tabelul nr. 4.1.

4.3.4.2. Metoda diluțiilor

Se bazează pe medii nutritive lichide, reprezintă o altă metodă indirectă de determinare a numărului de germeni. Metoda se utilizează mai puțin pentru determinarea numărului de germeni al unei probe de sol și mai mult pentru determinarea numărului de bacterii aparținânnd unei grupe fiziologice de sol, respectiv pentru izolarea și cultivarea grupelor specifice de bacterii. Tehnica metodei: suspensia de sol se diluează într-atât , încât transformând părți egale din aceasta într-o soluție nutritivă sterilă, după incubare, în unele tuburi să se mai producă o dezvoltare iar în altele nu . Metoda indusă de L.Hiltner și K.Stormer reprezintă o combinare a procesului de diluție folosit în metoda plăcilor turnate a lui Koch și a unei soluții nutritive alese pentru organisme specifice. Citirea se realizează după incubare. Diluția la care într-o jumătate din vase se mai poate detecta o reacție pozitivă permite, după un calcul, să se determine numărul de germeni, valorile limită probabile pentru fiecare probă de sol.

4.4. Considerații asupra metodelor de apreciere cantitativă a microorganismelor din sol

4.4.1. Metode de microscopie directă

Metodele de microscopie directă grupează diferitele procedee prin care se face numărătoarea microorganismelor dintr-o probă de sol, cu ajutorul examenului microscopic, urmată de raportarea lor la gramul de sol. Tehnica preconizată de Conn recomandă examenul direct al solului, montat pe lamă într-o soluție foarte diluată de gelatină și colorat cu un colorant acid , cu acid fenic ca mordant. Vinogradski prin modificarea adusă în 1924 , preferă drept colorant eritrozina 1% , fenicată 5% , care are avantajul de a diferenția mai net corpii microbieni de restul preparatului. Frotiurile executate ce ansa calibrată , sunt examinate cu ocular cu rețea , cu 100 câmpuri vizuale , iar numărul găsit se raportează la gramul de sol. Metoda are drept inconvenient principal faptul că particulele minerale foarte refringente jenează observația și dau preparatului o grosime prea mare pentru a fi observat cu imersia ; de asemenea dă cirfre cu mult superioare celorlalte metode. Metodele directe de examinare a microflorei "in situ" de tipul amprentelor de sol în diferitele lor variante au semnificația unor fotografii ale peisajului microbian și dau indicații asupra aranjării spațiale a germenilor din sol și asupra conexiunilor din sol cu substanțele organice, au o valoare mai puțin decât relativă pentru o apreciere obiectivă. Modificările aduse de Ghermanov, Steponov și alții nu reușesc să îndepărteze inconvenientele metodelor clasice, inclusiv aportul germenilor exogeni din substanțele folosite ca adeziv. Metoda cunoscută a lui [NUME_REDACTAT] în care se include un volum cunoscut de suspensie din sol în geloză și se colorează cu o soluție acetică de albastru de metil, corectă ca principiu, prezintă dificultăți în momentul numărătorii prin aceea că: nu diferențiază geremenii morți de cei vii; nu deosebește germenii de fragmentele organo-minerale, mai ales în cazul celor amorfe și subțiri; este destul de laborioasă; gradul de dispersiune al suspensiilor este greu de apreciat fiind variabil de la o determinare la alta ; alături de elemente bine dispersate și ușor de indentificat, se întâlnesc grămezi de dimensiuni mari la care aderă bacterii mai mult sau mai puțin vizibile; în plus, aceste metode nu permit numărarea germenilor aderenți sau incluși în particule și a celor din microcolonii .

Microscopia cu fluorescentă introdusă de Strugger în 1943atenuează în mare măsură inconvenientul principal al numărătorii directe în lumina albă , prin faptul că germenii vii colorați cu unule substanțe fluorescente emit o lumină diferită de cei morți. Astfel -fluorocromul- respectiv acredin-orangeul are proprietatea de a colora în verde strălucitor germenii vii și în roșu închis pe cei morți și particule de sol.

4.4.2.Determinarea numărului de germeni viabili

Determinarea numărului de germeni viabili se bazează pe metoda originală a lui Lister a diluțiilor până la extincție și constă în efectuarea unei serii de diluții -suspensii de sol, însămâțate după aceea pe medii lichide sau pe medii solide în plăci. Insămânțarea mediilor lichide se face cu un volum fix de inoculări pentru fiecare suspensie-diluție. Pentru mediile solide, majoritatea autorilor preferă însămânțări prin etalare pe suprafața mediului însămâțarea cu suspensii-diluții prin încorporare în mediul lichefiat cu toate dificultățile legate uneori de citirea rezultatelor. în cazul mediilor lichide calculul numărului total de germeni se face cu ajutorul tabelelor lui McCardy sau Fisher, iar raportarea se face la un gram de sol uscat. Durata timpului de incubație este variabilă, între 5-20 zile, iar temperatura 20-30° C în funcție de autor. Rezultatele acestei metode sunt dominate de participarea largă a unor factori variabili. Importanța diluției se datorează simlplicității, rapidității și generalității aplicațiilor sale. Diluția de sol nu reprezintă însă o simplă diviziune a probei de sol în unități din ce în ce mai mici , proporțional cu gradul de diluție, ci o disociere a solului, interesid atât textura cât și microstructura lui. Influența microstructurii solului este evidentă în special în cazul folosirii unei singure pipete în cursul diluțiilor, datorită fenomenului de absorbție la peretele pipetei care produc un efect de "trainage" al germenilor dintr-o diluție în alta cu atât mai mare cu cât solul este mai alcalin și în rapor cu cantitatea de humus. Augier și Lavergne (1958) au studiat tropismul complexelor bacterio-agilo-humice pentru pereții pipetelor și au arătat că acesta variază în funcție de natura pedologica a solului. Pentru studiul microflorei totale a solului a fost folosită o gama întreagă de medii de cultura, bulionul de carne obișnuit, peptonat și mediu agarizat , pană la medii cu diferite substanțe organice complexe ca: albumina de ou, cazeină, extractul de drojdie, etc. Astăzi, cei mai mulți cercetători, păstrând mediile artificiale își îndreaptă atenția spre un mediu folosit chiar de la începuturile microbiologiei solului: extractul apos de sol ca atare este solidificat cu agar. Superioritatea acestui mediu este mai evidentă dacă rezultatele se citesc după 14 zile de la incubare , din cauza dezvoltării lente și dimensiunilor mici ale coloniilor lor.

CAPITOLUL 5.

Evoluția parametrilor microbiologici în solul viticol

5.1.Scopul lucrării și obiectivele propuse

Considerând că ameliorarea și conservarea stării de fertilitate a solului reprezintă premiza practicării unei agriculturi ecologice, devine imperios necesară stabilirea de noi ecotehnologii, care să permită menținerea și perpetuarea stării de favorabilitate a solului. Fertilitatea rămâne principala însușire a solului care determină longevitatea plantațiilor și nivelul calitativ-cantitativ al producției. In contextul aplicării unei viticulturi intensive, există riscul degradării solului, depășirii consumurilor energetice, inducerii unor efecte secundare poluante și unor dezechilibre biocenotice; toate acestea converg spre diminuarea stării de fertilitate și scăderea eficienței economice a exploatării viticole.

Pornind de la aceste considerente se constată că literatura de specialitate, deși oferă numeroase informații privind aplicarea sistemelor de întreținere a solului în plantațiile viticole, acestea sunt fragmentate, în majoritatea cazurilor unilaterale.

Astfel, în lucrarea de față tematica de cercetare abordată vizează prezentarea influenței diferitelor sisteme de întreținere a solului asupra parametrilor microbiologici al solului viticol. Aprecierea oportunității sau inoportunității efectuării analizelor microbiologice ale solului este motivată de existența problemelor metodologice specifice (dimensiuni, heterogenitate populațională, existența unor forme stresate), care complică studiul microflorei telurice. Lucrarea de față a avut drept obiective majore:

suprinderea modificărilor calitative ale microflorei totale din solul viticol sub influența diferitelor sisteme de întreținere a solului.

dinamica grupelor fiziologice de microorganisme implicate în realizarea ciclului biochimic al azotului în solul viticol.

5.2. Material si metodă

Probele de sol au fost recoltate în perioada 2014-2015 din gospodăria personală, din localitatea Coșoveni județul Dolj , plantație viticolă inființată acum 4 ani cu soiuri hibride de viță de vie, în care s-au aplicat sisteme diferite de întreținere a solului, respectiv:

-V1 manual – varianta martor, întreținută permanent prin executarea manuală a lucrărilor de mobilizare a solului – prașile manuale.

-V2 chimic – varianta întreținută total prin dezerbare chimică, prin aplicarea erbicidului Pantera 40EC care se aplică postemergent, pentru buruieni monocotile anuale și perene.

-V3 biologic – varianta întreținută total prin înierbare naturală a solului cu flora spontană menținută sub formă de gazon prin cosiri repetate.

Recoltarea probelor de sol pentru analize biologice

Studierea microorganismelor în ecosisteme naturale in situ întâmpină o serie de dificultăți tehnice insurmontabile, corelate cu lipsa de cunoștiințe suficiente privind creștere lor în natură, constrângerile și interacțiunile la care sunt expuse în timp și în spațiu. De aceea recoltarea probelor este considerată ca fiind prima dificultate majoră în studiul comunităților naturale de microorganisme, deoarece presupune îndepărtarea acestora din mediul natural. Alegerea probelor reprezentative trebuie să țină seama de variabilitatea temporală și spațială a distribuției microorganismelor în natură, să reflecte diversitatea lor, și pe cât posibil, densitatea lor în întregul ecosistem din care sunt preluate. Mărimea și numărul probelor recoltate reprezintă un alt factor important. Riscurile de eroare sunt minimalizate prin prelucrarea unor probe complexe obținute prin amestecul unor probe individuale. Datorită heterogenității și particularităților microorganismelor (creștere sub formă de agregate sau microcolonii niciodată uniform sau aleatoriu), obținerea unor probe reproductibile este practic imposibilă, semnificația determinării având doar valoare de „instantaneu fotografic" al prezenței și densității microorganismelor în momentul examinării în spațiul analizat, foarte diferit de zonele imediat adiacente. In ceea ce privește aplicarea metodelor de cultivare prin însămânțarea suspensiilor diluate de sol pe medii de cultură solidificate, valoarea ecologică a acestora este foarte limitată , mai ales în studiile sinecologice cantitative, dând astfel dreptate anumitor autori, care consideră că aceste tehnici duc la „o totală pierdere de timp și acumulare de date inutile"; această afirmație este foarte motivată deoarece: solul reprezintă un mediu extrem de favorabil pentru dezvoltarea unei imense heterogenități populaționale; este aproape imposibil de găsit un mediu de cultură atât de selectiv încât să permită dezvoltarea unei singure specii. Mediile de cultură folosite în mod uzual satisfac exigențele de dezvoltare ale unui număr limitat de microorganisme. Ca urmare, numărul coloniilor crescute pe aceste medii este cu câteva ordine de mărime mai mic decât cel real al bacteriilor active, deci total nerelevant. Microorganismele „înfometate" sunt adesea mult mai apropiate de condiția naturală decât cele „supraalimentate" deci culturile de laborator (G.Zamea, 1994). Rezultatele analizelor microbiologice de sol, de multe ori neconcludente, au la origine, în principal, neglijarea modului de recoltare a probelor de sol și a condițiilor lor .

In cadrul tematicii abordate s-a considerat că, datorită marii variabilități a condițiilor de sol (umiditate, aerație, temperatură, intervenții antropice), o analiză biologică a solului , imediat după recoltarea sa, este nefolositoare. Este necesară o condiționare prealabilă a probelor de sol. Astfel, probele au fost prelevate cu sonda canelată, pe adâncimea de 0-20 cm, cu o densitate de 20 de recoltării din toate repetițiile de câmp. Acestea se amestecă/ ,formând o probă medie (pe varianta experimentală). Probele cu o umiditate cuprinsă între 15-17% (naturală sau corectată artificial) sunt trecute printr-o sită de 2-2,5 mm și păstrate în pungi de plastic (care permit schimbul de gaze, dar nu lasă vaporii de apă să iasă), la temperatura camerei, timp de 3-4 săptămâni. In acest timp activitățile vitale (biotice și enzimatice) devin relativ constante, într-un echilibru caracteristic umidității, aerației și materialului energetic și plastic al solului studiat. Pentru determinarea activității microbiologice a solului s-au utilizat următoarele metode :

-determinarea microflorei totale – pentru numărarea bacteriilor din sol s-a folosit un mediu larg utilizat -extractul de sol fertil-un mediu nutritiv sărac, dar care, pentru câteva zile, timp necesar pentru apariția coloniilor bacteriene, oferă condițiile necesare majorității speciilor bacteriene, fără discriminare;

-determinarea bacteriilor amonifîcatoare – prin metoda diluțiilor zecimale însămâțate în mediu salin (NaCl + peptonă + apă distilată), la care se adaugă asparagină și se evidențiază amoniacul format cu ajutorul reactivului Nessler.

-soluție salină standard 50 ml

-asparagină 0,2 g

-soliție de oligoelemente 1 ml

-apă distilată 950 ml

Lecturarea rezultatelor s-a făcut la cinci zile de la însământarea probelor. Se prelevează steril, cu o pipetă câte I ml din fiecare tub, începând cu diluția cea mai mare și prelevatele se pun în eprubeta de hemoliză. Se adaugă câte 2 picături de reactiv Nessler. Tuburile pozitive au o tulbureală galben-oranj. Tuburile negative, la fel ca și tuburile martor, rămân incolore.

-determinarea bacteriilor nitrifîcatoare – izolare și cultivarea nitritbacteriilor pe medii selective (NaCl, MgSO4, MgCO4, (NM4)2SO4, fosfat dipotasic); pentru nitratbecterii se folosesc aceleași medii, numai că sulfatul de amoniu este înlociut cu nitrat potasiu. Evidențiarea prezenței nitratilor se face cu difenil amină sulfurică. Se repartizează fiecare mediu în tuburi de hemoliză câte 1 ml de tub. După sterilizare se însămânțează câte trei tuburi de diluție cu 0,5 ml suspensie de fiecare tub. Se incubează 20 zile la termostat la 28 ° C.

Lecturarea rezultatelor:

– bacteriile nitroase – prezența nitraților sau nitriților

se determină astfel: se golesc tuburile, aproape complet, încât sa conțină doar 1—2 picături de mediu, se adaugă în fiecare tub câte 10 picături de acid sulfuric și 10 picături de difenilamină sulfurică. Tuburile pozitive prezintă o tentă albastră, mai intensă la concentrații mari. Citirea se face deasemenea față de un martor neînsămânțat.

– bacteriile nitrice – prezența nitraților se evidențiază ca și în cazul bacteriilor nitroase cu acid sulfuric și difenilamină câte 10 picături după ce în prealabil s-au adăugat în fiecare tub câte 10 mg uree pentru eliminarea nitriților restanți. Prezența nitraților se traduce prin aceeași colorație albastră.

-determinarea bacteriilor denitrificatoare – prin metoda diluțiilor însămânțate pe medii selective (NaNO3 , fosfat monopotasic , dipotasic ,CaCl2 , NaCl, MgSO4 , FeCl3), evidențiere cu difenil amină sulfurică ;

-determinarea bacteriilor fixatoare de azot aerobe

– prin metode însămânțării soluției pe mediu selectiv:

– soluție salină standard 50 ml

– manitol 10 g

– extract de sol 10 ml

– soluție de oligoelemente 1 ml

– carbonat de caliciu 0,5 g

– apă distilată 950 ml

Mediul este repartizat în tuburi. însămânțarea s-a făcut cu suspensie-diluții de sol, un ml pentru fiecare tub, câte trei tuburi pentru fiecare diluție. Termostatarea se face la 28°C. Se apreciază cultura, în special de Azobacter, prin formarea unui voal brunificat la suprafața mediului de cultură. Citirile s-au făcut la 7 și 15 zile. Pentru microorganismele anaerobe fixatoare de azot s-a însămânțat cu suspensii-diluții de sol un mediu cu compoziția:

-soluție salină standard 50 ml

– H2KPO4 0,75 ml

-NaOHn/10 33 ml

-glucosă 10 g

– extract de sol 10 ml

– soluție de oligoelemente 1 ml

– apă distilată 950 ml

[NUME_REDACTAT] mediul s-a repartizat în eprubete, câte 10 ml și s-a introdus apoi în câte un tub Durham. însămânțarea s-a făcut din aceleași suspensii – diluții de sol, câte 1 ml pentru fiecare tub câte trei tuburi pentru fiecare diluție. Termostatarea la 28°C se face timp de 7 și 15 zile. Aprecierea culturii se face printr-o degajare gazoasă, prezența gazului fiind evidentă în micile tuburi DURHAM.

-determinarea bacteriilor fixatoare de azot atmosferic anaerobe prin metoda însămânțării în mediu lichid fără azot, prevăzut cu tuburi la capete a gazului, de tip Durham .

5.3.Rezultate și discuții

Multă vreme, în viticultură au fost neglijate problemele legate de identificare microorganismelor solului, a proceselor vitale și enzimatice care se desfășoară în sol, precum și a interacțiunii dintre ele. Insuficienta cunoaștere a acestor procese și legi a condus la numeroase intervenții antropice, soldate cu degradarea solului (Gh.Ștefanic, I.D.Săndoiu, 1994). Ca urmare , în ultimele decenii am asistat la un ritm accelerat de mineralizare a materie organice din solurile viticole în condițiile luării în cultură a unor soluri sărace în humus, a unei fertilizări unilaterale, fără încorporarea îngrășamintelor organice sau a resturilor vegetale, cu efectuarea unor lucrări ale solului la adâncimi prea mari.

S-a demonstrat, fără echivoc, necesitatea de a lua în considerare două aspecte fundamentale pentru înțelegerea ecologiei asociațiilor de microorganisme ale solului, și anume :

1. Aprecierea cantitativă a biomasei care formează baza lanțurilor trofice ;

2. Activitatea metabolică și potențialul de creștere și multiplicare, care, pe plan global, reprezintă forța motrice a ciclurilor biochimice .

Câteva probleme specifice complică însă studiul comunităților de microorganisme în mediul lor natural : dimensiunile micrometrice sau milimetrice ale microorganismelor grupate în microhabitate, în condiții fizico-chimice foarte diferite de macrohabitatul înconjurător; heterogenitatea populațiilor microbiene frecvent atașate de diferite substanțe sub formă de agregate sau microcolonii greu de dispersat; existența unor forme stresate, cu capacitate de multiplicare adesea blocată; viteza activităților fiziologice mai mică decât potențialul fiziologic demonstrat în laborator. Luând în considerare cele amintite, rezultatele mai puțin satisfăcătoare, uneori descurajante, obținute prin metodele de investigare microbiologică a solului au la origine:

-neglijarea modului de recoltare a probelor de sol, a condiționării lor, superficialitate în alegerea metodelor și a variantelor experimentale;

-greșeli legate de necunoașterea profundă a vieții solului, proceselor vitale și enzimatice, a condițiilor ecologice de desfășurare a metabolismului microbian;

-prezentarea unor rezultate din cercetări întâmplătoare, neaprofundate, necorelate cu alte fenomene paralele.

Considerând drept un preambul aceste aprecieri pertinente asupra oportunității sau inoportunității efectuării analizelor microbiologice ale solului, în continuare este prezentată influența sistemelor de întreținere clasice asupra principalilor parametrii microbiologici ai unui sol viticol dintr-o plantație personală. S-a pus accent pe surprinderea modificărilor cantitative ale microflorei totale și ale microorganismelor implicate în realizarea ciclului biogeochimic al azotului. Analizele microbiologice efectuate în cadrul experimentului au vizat în special activitatea microorganismelor implicate în derularea principalului circuit biogeochimic, respectiv circuitul azotului în sol. Dacă plantele superioare ar fi capabile să-și extragă azotul necesar direct din atmosferă, atunci, conform cu calculele lui D.Feher (1953) citat de G.Miiller (1965), la o necesitate de 100 Kg/ha, ele ar putea trăi aproximativ 800.000 de ani folosind stratul de aer existent deasupra acestei suprafețe. Cea mai mare parte a azotului care participă în circuitul biologic se află, însă, în compuși organici cu azot, de origine vegetală sau animală din sol (proteine, aminoacizi etc), care sunt transformați de către microorganisme în cursul mineralizării în compuși organici (NH3, NO2, NO3), preluați din nou de plantele autotrofe. Ca și în cazul carbonului, bacteriile și ciupercile sunt cele care determină menținerea circuitului biologic al elementului, făcând posibilă pe această cale viața pe Pământ. Prima fază în derularea acestui circuit este reprezentată de amonificare, ca proces de degradare a substanțelor proteice vegetale și animale de către organismele proteolitice:

-specii bacteriene aerobe: Bacillus subtilis, B.cereus, B.mesentericus, B.magaterium. B.anthracis, Pseudomonas fluorescens, Sarcina lutea;

-specii bacteriene anaerobe: Clostridium putrificum, CI. Sporogenes. CI. Tetani, CI. Perfrigens;

-specii bacteriene facultativ anaerobe: Thricoderma, Odium, Monilia, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Botrytis.

Amonifîcatori deosebit de activi sunt Proteus vulgaris, Bacillus mycoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida și Clostridium putrificum.

Descompunerea însăși este realizată de ectoenzime (proteaze, în cazul proteinelor, proteinaze, în cazul peptidelor, peptidaze) prin decarboxilarea aminoacizilor sau prin dezaminarea reducătoare sau oxidativă și scindarea grupelor amino, azotul aminic trecând în azot amoniacal. Prin aplicarea sistemelor diferite de întreținere a solului viticol (variante clasice), se constată că procesul de amonificare s-a dovedit mai intens la variantele înierbate natural, în special în perioada cu temperaturi optime pentru metabolismul bacteriilor amonificatoare, de 25-30° C, respectiv luna august, (tabelul 5.1., figura 5.1.) perioadă când și încorporările repetate de material organic în sol par să favorizeze efectul de activare a bacteriilor – priming effect.

Figura nr.5.1. Dinamica microflorei amonificatoare

Amoniacul produs prin procesul de amonificare se acumulează doar în solurile acide sau slab aerate. In general, amoniacul suferă în continuare procesele de oxidare la azot nitric, prin procesul de nitrificare, sub incidența bacteriilor nitrificatoare stric aerobe, reunite în familia Nitrobacteraceae. L.Pasteur menționa pentru prima dată în anul 1864 că azotații se formează prin acțiunea bacteriilor din sol.

Procesul nitrificării se desfășoară etapizat, de către două grupe de bacterii ce acționează metabolic, grupa nitrit (genurile Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosospira, autrofe și aerobe ) și grupa nitrat-bacteriilor (genul Nitrobacter), cu precădere în straturile superficiale de sol, bine aerisite, până la 20 cm adâncime .

Se constată că intensitatea nitrificării este maximă cu forme de azotați accesibili viței de vie în cazul întreținerii biologice și mecanice a solului. La întreținerea prin erbicidare, microorganismele nitrificatoare sunt mai reduse ca număr, având în vedere și gradul de compactare a solului, reducerea apovizionării cu oxigen și deci, inhibarea parțială a nitrificării (tabelele 5.2., 5.3 și Figurile 5.2, 5.3).

Oxidarea microbiologică a amoniacului este strâns dependentă, de asemenea, de reacția solului (pH optim = 6,7 – 7,8 , la pH<5 se oprește), de umiditate (optim de 40 – 70%) și de temperatură (25 – 35° C).

Se observă astfel , că la două momente din perioada de vegetație , nitrificarea este mai intensă în luna august.

Temperatura optimă pentru activitatea bacteriilor nitrificatoare este cuprinsă între 25 și 35° C. Nitrificarea încetează aproape complet când temperatura depășește pragul termic de 45° C .

Scăderea temperaturii sub 5-10° C determină , de asemenea , blocarea procesului de transformare a amoniacului în nitrați.

Figura 5.3. Dinamica bacteriilor nitrice

Denitrificarea , ca proces de respirație realizat pe calea unei reduceri dezasimilatorii , prin care speciile bacteriene facultative (Aerobacter aerogenes) și obligate (Micrococcus denitrificans; Vibrio denitrificans etc.) utilizează nitrații sau alți complecși oxigenați ai azotului mineral ca acceptori finali de hidrogen , este slab reprezentată la toate variantele de întreținere a solului (tabel.nr.5.4., Figura 5.4.).

Aceasta demonstrează că la momentul efectuării determinărilor avea loc un metabolism microbian preponderent de acumulare de azot nitric.

Activitatea denitrificatoare este redusă datorită umidității scăzute a solului din perioada de vegetație . Este știut că acest proces este favorizat de umiditate, prin efectul antagonist al apei față de aer, dar chiar la un conținut egal de oxigen denitrifîcarea crește când solul este umed prin împiedicarea liberei circulații a aerului în sol.

Fixarea aerobă a azotului molecular atmosferic este atribuită în principal, speciei bacteriene Azobacter chroococcum, precum și altor genuri, cum ar fi : Azomonas, Beijerinckia, Derxia, datorită nitrogenazei conținute de acestea, ca enzimă ce catalizează reducerea N2 la NH3.

Sunt puternic reprezentate numeric în cazul întreținerii biologice totale a solului viticol, în luna august (tabelul 5.5., Figura 5.5), în dependență de temperatură, umiditate, pH.

Figura 5.4. Dinamica bacteriilor denitrificatoare

Figura 5.5. Dinamica bacteriilor aerobe fixatoare de azot molecular

Figura 5.6. Dinamica bacteriilor anaerobe fixatoare de azot molecular

Fixarea anaerobă a azotului molecular atmosferic de către cea mai importantă bacterie heterotrofa, nesimbiontă, anaerobă, Clostridium pasteurianum profită de prezența unei cantități suplimentare de materie organică în varianta întreținută biologic, ca resurse nutritive , realizând un fel de simbioze asociative în spațiul rizosferic . De altfel, randamentul fixării azotului de către Clostridium pasteurianum este maxim în cazul sistemelor ce include înierbarea naturală și datorită coexistenței cu bacteriile celulozolitice anaerobe, care își găsesc aici substratul necesar declanșării unui metabolism intens .

Rezultatele prezentate privind evaluarea cantitativă a microflorei solului (numărul de microorganisme) nu sunt suficiente pentru a permite o caracterizare biologică a acestui tip de sol. Se impune completarea acestor informații, prin corelarea cu determinările calitative, care ar viza respirația solului și activitatea enzimatică, ca un corolar al potențialului biologic al oricărui tip de sol (Popa D., 2007).

Se observă de asemenea că microflora totală prezintă variații în funcție de momentul determinării (Tabel 5.6., Figura 5.7.) fiind influențată pozitiv de sistemele de întreținere biologic și manual, diminuîndu-se ușor în cazul utilizării nonculturii prin dezerbare chimică; aceasta demonstrează că prezența unei cantități sporite de materie organică și elemente minerale în sol activează favorabil metabolismul microbian prin microhabitatul creat la nivelul solului.

Variația microflorei totale a solului – germeni/g sol

Tabel 5.6.

Compoziția calitativă și abundența microflorei solului determină specificul activității biologice din sol, acesta depinzând de o multitudine de factori: tipul de sol, vegetația, umiditatea, temperatura, pH-ul, anotimpul, zona geografică, caracteristicile de lucrare a solului. Microflora solului, alături de enzimele acumulate vor desăvârși mineralizarea și în același timp și spațiu vor înfăptui procesul de organizare autohton și înnoitor, din sol. In strânsă dependență de prezența materiei organice în sol și a elementelor minerale a evoluat și microflora solului, a cărei abundență și compoziție determină specificul activității biologice din sol. De asemenea, în corelație cu condițiile pedoclimatice, microflora totală a solului prezintă oscilații sezoniere, primăvara și toamna predominând programele solului (ca sistem deschis) de mineralizare parțială a humusului nou format dar și programele abiotice de policondensare și hidrofobizare, ce vor asigura cimentarea noilor agregate fizice ale solului. Intreținerea solului antrenează schimbări în gradul de înburuienare și apovizionare cu apă a solului, aceste schimbări având o influență considerabilă asupra microflorei telurice (Figurile 5,8, 5.9, 5.10). In strânsă dependență de activitatea factorilor de mediu (temperatură, pp, pH) se observă că activitatea microflorei solului, indiferent de sistemul de întreținere aplicat este mai intensă primăvara și toamna. Căile de acțiune ale erbicidelor asupra microflorei solului impun concentrarea cunoștiințelor actuale privind efectul erbicidelor asupra organismelor fixatoare de azot nesimbiotice și simbiotice, a respirației, mineralizării substanțelor organice și a proceselor enzimatice.

Figura 5.7. Variația microflorei totale a solului (mai 2014 – martie 2015)

Figura 5.8. Variația microflorei totale a solului – varianta V1 – manual

Figura 5.9. Variatia microflorei totale a solului – varianta V2 – chimic

Figura 5.10. Variația microflorei totale a solului – varianta V3 – biologic

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

Importanța prezenței microorganismelor în sol este dată de faptul că:

protozoarele limitează numărul altor organisme, stimulează activitățile de fixare a azotului molecular, descompun activ celuloza, descompun humusul.

ciupercile au rol în celobioliza și ligninoliza resturilor vegetale; condiționează interrelațiile între microorganismele din sol și între plantele superioare; condiționează proprietățile humusului.

algele mineralizează sau humifică substanța minerală; au rol în procesul de pedogeneză; îmbogățesc solul cu oxigen rezultat din fotosinteză.

virusurile influențează capacitatea de absorbție a humusului și a argilelor, prin imobilizarea particulelor virale.

Microflora totală a solului, sub incidența sistemelor de întreținere aplicate prezintă variații sezoniere, fiind influențată pozitiv de sistemele biologic și manual, diminuîndu-se în cazul utilizării monoculturii prin dezerbare chimică.

Microflora telurică este influențată diferit de sistemele de întreținere:

bacteriile amonificatoare sunt stimulate de înierbarea naturală.

bacteriile nitrificatoare acționează cel mai intens în producerea de azotați accesibili viței de vie în cazul întreținerii biologice și manuale a solului;

bacteriile denitrificatoare prezintă activitate redusă în toate variantele studiate de întreținere a solului viticol;

fixarea aerobă bacteriană a azotului molecular atmosferic este puternic reprezentată numeric în varianta înierbată natural;

fixarea anaerobă bacteriană a azotului molecular atmosferic profită de prezența unei cantități suplimentare de materie organică în varianta înierbată natural, unde realizează simbioze asociative în spațiul rizosferic.

Prezentarea singulară a rezultatelor numerice privind microflora telurică este insuficientă pentru caracterizarea biologică a unui tip de sol; trebuie îmbinată cu parametrii calitativi pedologici și agrochimici, pentru evaluarea stării de fertilitate a unui sol. Determinările propuse se bazează pe reducerea in-put-urilor mecanice și chimice, pe reevaluarea rolului florei microbiene din exploatațiile viticole, într-o optică ce vizează o producție de calitate, o diminuare a costurilor și o tehnologie prietenoasă cu mediul înconjurător.

[NUME_REDACTAT] L., K Stormer – [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], Berlin,1903

Koch, R., 1881 [NUME_REDACTAT] von pathogenen Organismen. Mitth. a. d. Kaiserl. Gesundheitsampte 1: 1-48. Cited in Milestones in Microbiology: 1556 to 1940, translated and edited by Thomas D. Brock, ASM Press. 1998

[NUME_REDACTAT]., Gavrilă L. – Biologia microorganismelor fixatoare de azot, Ed. CERES, București, 1989

Muller G. -„Biologia solului" , Ed. Agosilvică , București 1965.

Papacostea P.- „Biologia solului", Ed. Științifică și Enciclopedică,București 1967.

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] (SUA), – [NUME_REDACTAT]. The life beneath your feet, [NUME_REDACTAT].com, U.S.A., 2007

[NUME_REDACTAT]. – „Microbiologia solului", Universitatea de Științe agricole,București 1990.

[NUME_REDACTAT]. – „Metode de analiză enzimatică și chimică a solului, București, 1993, Reprografia USAMV-București.

[NUME_REDACTAT]., Săndoiu D.I, [NUME_REDACTAT] – ’’[NUME_REDACTAT] Agricole, Ed.[NUME_REDACTAT], 2006.

Zarnea G. – „Tratat de microbiologie generală", vol. 5, Ed. [NUME_REDACTAT], București 1994.

http://www.cyf-medical-distribution.ro/library/Biblioteca%20digitala%20veterinara/Microbiologie.doc