Microbiota Telurica Parametru Calitativ AL Mediului

MICROBIOTA TELURICĂ-PARAMETRU CALITATIV AL MEDIULUI

Introducere

Solul este considerat interfața dintre scoarța terestră, atmosferă, hidrosferă, biosferă, la nivelul său desfășurându-se un permanent schimb de substanță și energie care asigură perpetuarea vieții la nivel terestru.

Noțiunea de calitatea solului este relativ recent introdusă în terminologia ingineriei mediului și integrează fertilitatea și productivitatea acestuia alături de alte elemente care se referă la starea de poluare a solului, starea sanitară a solului și disponibilitatea lui pentru anumite folosințe. Evaluarea calității solului implică măsurarea unor proprietăți sau însușiri ale solului care servesc ca indicatori sensibili la modificarea funcțiilor solului rezultate din utilizarea și managementul resurselor de sol.

Microorganismele sunt foarte răspândite în natură, orice colț din natură fiind populat de aceste viețuitoare. Răspândirea lor în natură variază în funcție de mai mulți factori, mai importanți fiind cei fizici, chimici, precum și interelațiile ce se stabilesc între diferitele categorii de viețuitoare dintr-un ecosistem. Microorganismele sunt dependente de factori precum: substanțele nutritive disponibile sau sursa de astfel de substanțe, temperatură, reacția substratului etc. Toate aceste condiții sunt reunite în sol, motiv pentru care solul conține o bogată microfloră, el reprezentând rezervorul principal pentru microflora din alte medii: aer, apă.

Prezenta lucrare se bazează în special pe studierea fenomenelor microbiologice în care sunt implicate bacteriile cu răsunet asupra circuitului azotului în natură. Motivul alegerii acestei categorii de microorganisme din multitudinea claselor existente la nivelul solului este acela că azotul reprezintă elementul chimic esențial pentru asigurarea fertilității solului, parametru calitativ de o deosebită importanță pentru domeniul socio-economic.

Pe lângă aceasta sunt prezentate o serie de măsuri de prevenire a degradării solului, chiar cu exemplificarea acestor noțiuni aplicate asupra unei plantații de viță de vie. Se urmărește în cadrul studiului variația numerică și a activității enzimatice a microbiotei telurice din plantația de viță de vie, cu respectarea normelor agriculturii preventive, deci cu protejarea calității solului.

Capitolul I. SOLUL – COMPONENT ESENȚIAL AL ECOSISTEMELOR TERESTRE

1.1 Conceptul de calitate a solului – ca mediu natural regenerabil sau neregenerabil

Pedosfera (solul) – este partea superioară a litosferei cu grosimi de cca. 5m, se prezintă ca un strat afânat, care conține în proporții diferite elemente minerale, elemente organice, organisme vii. Însușirea specifică a solului este fertilitatea, adică capacitatea lui de a susține realizarea unei anumite biomase vegetale.

Solul face legătura dintre regnul mineral și regnul vegetal, situându-se în poziția de granița dintre neviu și viu și este format din diverse tipuri de materii având la bază constituenți organici sau anorganici în diverse stadii de organizare. Reprezintă mediul de creștere, multiplicare și degradare a plantelor, asigurând din toate aceste puncte de vedere suportul fizic , chimic și biologic. Solul servește ca și rezervor de aer, apă și substanțe nutritive dar și ca suport fizic pentru ancorarea rădăcinilor plantelor asigurând totodată reciclarea materiei organice.

Procesele implicate în formarea solului sunt îndelungate , graduale, continue, fiind rezultatul efectelor factorilor ambientali asupra litosferei. V.V.Dokuceaev spune că sub denumirea de sol se regăsesc „orizonturile superioare ale rocilor, (independent de felul lor ) modificate în mod natural de acțiunea simultană a apei, aerului și diverselor microorganisme vii și moarte.”. Prin această definiție se face net distincția între sol și piatra nefertilă, prin fertilitatea solului înțelegându-se comportamentul său față de apă, substanțe minerale, azot și fiind o caracteristică ce se dezvoltă treptat, ca urmare a unor procese de eroziune complexe. În funcție de modul de acțiune al celorlalți factori de mediu (climatul zonei, vegetația, relieful, vârsta solului, natura rocii mamă) asupra rocilor-mamă, se pot forma diferite tipuri de sol cu însușiri și origini istorice diferite.

Solul este considerat interfața dintre scoarța terestră, atmosferă, hidrosferă, biosferă, la nivelul său desfășurându-se un permanent schimb de substanță și energie care asigură perpetuarea vieții la nivel terestru. Dintrre multiplele roluri ale solului, importante sunt cel ecologic (este un component esențial al ecosistemelor naturale, fiind un habitat biologic, un tampon pentru schimbările climatice bruște, filtru de protecție și depurare împotriva patogenilor), cel socio-economic (prin marea diversitate a materiilor prime furnizate și prin capacitatea de recirculare a unor elemente esențiale vieții), cel tehnico-industrial ( reprezintă substratul fizic de dezvoltare a activităților antropice) și nu în ultimul rând cel energetic ( prin acumularea și transferul de energie și materii energetice).

Conceptul de calitate a solului este o noțiune relativ recent introdusă în terminologia specifică ingineriei mediului, definiția care se pliază cel mai bine pe principalele funcții ale solului fiind cea dată de Doran și Parkin (1994) și anume, “capacitatea de a funcționa în interiorul granițelor unui ecosistem pentru susținerea productivității biologice, menținerea calității mediului și asigurarea sănătății viețuitoarelor și habitatului”. Noțiunea este relativ ambiguă, având în vedere multiplele moduri de abordare a acesteia: agricultorii înțeleg prin calitatea solului productivitatea, fertilitatea, gradul de exploatare și profitul obținut, silvicultorii atribuie noțiunea altor indicatori precum suportul, biodiversitatea, rezistența, geografii suprapun semnificația noțiunii cu integrarea armonioasă în peisajul geografic, iar cei care se ocupă de problema de mediu sunt adepții definiției dată de Doran și Parkin.

Esența noțiunii de calitate a mediului constă în integrarea deopotrivă a însușirilor native și a însușirilor dobândite în urma intervențiilor antropice. Acestea din urmă apar ca urmare a utilizării în mod irațional și iresponsabil a măsurilor antropice, afectând nu numai calitatea mediului, ci și sănătatea acestuia.

Rezistența și reziliența sunt caracteristici care definesc calitatea unui sol, fiind noțiuni complet diferite. Dacă prin rezistență se înțelege capacitatea de a se opune acțiunilor care tind să îi modifică structura și funcțiile (de exemplu: capacitatea de tamponare a ploilor acide), reziliența presupune capacitatea de refacere și viteza de refacere a proprietăților solului după ce asupra sa au acționat o serie de factori perturbatori.

Așadar, noțiunea de calitate a solului integrează fertilitatea și productivitatea acestuia alături de alte elemente care se referă la starea de poluare a solului, starea sanitară a solului și disponibilitatea lui pentru anumite folosințe.

Evaluarea calității solului implică măsurarea unor proprietăți sau însușiri ale solului care servesc ca indicatori sensibili la modificarea funcțiilor solului rezultate din utilizarea și managementul resurselor de sol (Seybold și colab., 1998; Karlen și colab., 1997).

Toate aceste funcții pot fi îndeplinite în condițiile existenței unor însușiri fizice, chimice și biologice ale solului care pot fi supuse unor măsurători.

1.2 Parametri și indicatori de caracterizare a calității solurilor agricole

1.2.1.Parametrii fizici ai solului

Parametrii fizici ai solului depind de dimensiunea particulelor componente ale solului. De regulă, dimensiunea particulelor peste 2 mm încadrează respectivul tip de sol în categoria pietriș sau piatră, particule între 0,05 și 2mm sunt regăsite în nisipuri, între 0,002 și 0,05 în nămoluri, iar sub 0,002 se regăsesc în argilă sau lut. Aceste particule ocupă mai mult de jumătate din volumul solului, restul fiind reprezentat de apă și aer care se găsesc în spațiul poros. Densitatea masei solului este definită ca și măsură pentru volumul de sol uscat, reflectând totodată și volumul spațiului poros al solului respectiv. Solurile nisipoase au particule cu dimensiuni relativ omogene, în timp ce argilele sau solurile nămoloase prezintă particulele sub formă de agregate. Stabilitatea agregatelor telurice depinde de componenta organică a solului și de natura produselor microbiene. Agregarea particulelor de sol reprezintă un factor vital pentru creșterea plantelor, având în vedre faptul că transportul aerului, apei și transferul de energie se realizează la nivelul porozităților solului.

Temperatura solului este un factor foarte variabil ( variază cu intensitatea luminii solare, lungimea zilei, variațiile sezoniere, cantitatea de precipitații, culoarea și textura solului) , dar care influențează deosebit de mult creșterea plantelor.

O altă caracteristică a solului este reprezentată de tendința de formare a crustelor prin desicare, cu efect dăunător asupra plantării și germinării semințelor de plante.

Alți factori fizici cu influență asupra creșterii plantelor sunt pH-ul și capacitatea de menținere a umidității.

Apa prezentă la nivelul solului se poate încadra în una din cele trei categorii: gravitațională, capilară sau higroscopică. După ploi sau irigații, apa gravitațională ajunge la nivelul solului. Din aceasta, excesul va fi drenat către profunzime, la nivelul porilor solului reținându-se apa capilară. Apa higroscopică este reprezentată de fracțiunea de apă absorbită de solul uscat în condițiile unei atmosfere cu un grad ridicat de umiditate. De reținut în ceea ce privește efectul apei asupra microorganismelor telurice este faptul că fungii sunt mai puțin sensibili la modificările în conținutul de apă decât bacteriile.

Retenția apei este dependentă de porozitatea solului și de acțiunea de capilaritate a particulelor de sol, iar pH-ul este influențat strict de compoziția chimică a solului, motiv pentru care va fi prezentat în detaliu la secțiunea de parametrii chimici ai solului. Solurile cu un pH acid sau alcalin nu sunt favorabile creșterii plantelor. Solurile acide au un conținut crescut de : aluminiu, fier, mangan, cupru și zinc cu efect toxic asupra plantelor. În solurile alcaline, elementele mai sus enumerate sunt deficitare, iar plantele prezintă tulburări de creștere datorate acestora. Solurile neutre sunt favorabile culturilor prin conținutul lor în microorganisme capabile să convertească formele organice de azot, fosfor și sulf în forme anorganice care pot fi absorbite de plante.

Capacitatea de menținere a umidității solului este dictată de porozitatea, deci de structura solului, dar cantitatea de apă ce este disponibilă pentru plante depinde și de tensiunea de aspirație a apei pe suprafața particulelor solului. Apa este disponibilă rădăcinilor plantelor la o tensiune de aspirație mai mare de 4-4,2. Se explică astfel de ce apa din solurile nămoloase nu este la fel de facil utilizată ca cea din solurile nisipoase, în ciuda saturării cu apă a solului. Mai mult decât atât, solurile nisipoase permit un transport mult mai facil al apei prin capilaritate decât restul solurilor.

Nivelul de aerare al solului este strâns legat de conținutul în apă al acestuia. Un sol este suficient aerat dacă porii cu conținut de aer reprezintă mai mult de 10 % din volum.

Modificările de temperatură produc modificări la nivelul reacțiilor fiziologice ale microorganismelor, modificând totodată caracteristicile solului ca mediu de viață. Prin scăderi ale temperaturii solului , prin denaturări termice ale proteinelor microorganismelor telurice sau prin alterări ale permeabilității membranei celulare a microorganismelor apare o depleție a numărului acestora la nivelul solului. Acest lucru nu este general valabil pentru toate microorganismele telurice, unele dintre acestea dobândind de-a lungul timpului adevărate mijloace de supraviețuire în condiții de mediu vitreg ( de exemplu: termostabilitatea mai mezintă tulburări de creștere datorate acestora. Solurile neutre sunt favorabile culturilor prin conținutul lor în microorganisme capabile să convertească formele organice de azot, fosfor și sulf în forme anorganice care pot fi absorbite de plante.

Capacitatea de menținere a umidității solului este dictată de porozitatea, deci de structura solului, dar cantitatea de apă ce este disponibilă pentru plante depinde și de tensiunea de aspirație a apei pe suprafața particulelor solului. Apa este disponibilă rădăcinilor plantelor la o tensiune de aspirație mai mare de 4-4,2. Se explică astfel de ce apa din solurile nămoloase nu este la fel de facil utilizată ca cea din solurile nisipoase, în ciuda saturării cu apă a solului. Mai mult decât atât, solurile nisipoase permit un transport mult mai facil al apei prin capilaritate decât restul solurilor.

Nivelul de aerare al solului este strâns legat de conținutul în apă al acestuia. Un sol este suficient aerat dacă porii cu conținut de aer reprezintă mai mult de 10 % din volum.

Modificările de temperatură produc modificări la nivelul reacțiilor fiziologice ale microorganismelor, modificând totodată caracteristicile solului ca mediu de viață. Prin scăderi ale temperaturii solului , prin denaturări termice ale proteinelor microorganismelor telurice sau prin alterări ale permeabilității membranei celulare a microorganismelor apare o depleție a numărului acestora la nivelul solului. Acest lucru nu este general valabil pentru toate microorganismele telurice, unele dintre acestea dobândind de-a lungul timpului adevărate mijloace de supraviețuire în condiții de mediu vitreg ( de exemplu: termostabilitatea mai mare a germenilor termofili față de cei mezofili, capacitatea unor germeni psihrofili de desfășurare a activității sub punctul de înghețare).

Ca indicatori fizici ai calității solului pot fi determinate:

Densitatea aparentă

Porozitatea capacitatea de reținere a aerului

Rezistența la penetrare

Măsurători de stabilitate a agregatelor

Capacitatea de reținere a apei

1.2.2 Parametrii chimici ai solului

Solul reprezintă mediul din care plantele își procură substanțele nutritive. Aceste nutriente sunt reprezentate de substanțe anorganice de tipul: carbon, hidrogen, oxigen, azot, fosfor, sulf, potasiu, calciu, magneziu, fier, mangan, zinc, cupru, molibden, bor, clor. Din aceste 16 elemente chimice, fierul , cuprul, molibdenul, borul și clorul sunt considerate micronutrienți datorită necesarului scăyut din acestea pentru creșterea plantelor, iar celelalte sunt considerate macronutrienți datorită aportului mare necesar plantelor.

Principalele surse de materiale anorganice din sol sunt sursele organice, fracțiunea de argilă și derivații din rocile de la baza formării solului. Aceste componente vor fi mai întâi solubilizate în apă, apoi transferate în sistemul radicular al plantelor.

Materia organică supusă procesului de descompunere este sursă de azot, fosfor și sulf. Mineralele anorganice care provin din roca-mamă sunt transformate în forme accesibile plantelor prin procesul de descompunere minerală. Fracțiunea de argilă aduce suplimentar minerale secundare diferite de cele provenite din roca de bază și substanțe amorfe. Printre acestea se numără hidroxizii de fier și aluminiu, caolinul, montmorillonitul și illitul. Fracțiunea de argilă din sol acționează asemenea unui anion uriaș la nivelul căruia se absorb cationii, funcționând asemenea unui rezervor de ioni care pot fi supuși transferului. Transferul de cationi sau proprietatea solului de a realiza astfel de schimburi reprezintă baza fertilității solului și prin acesta, sursa de nutriție pentru plante. Ionii supuși schimburilor sunt: hidrogenul, calciul, magneziul, potasiul, sodiul, amoniul, manganul, zincul, cuprul și aluminiul.

La nivelul solului se întâlnesc deopotrivă anioni și cationi care sunt în permanență supuși transferului sol-plantă și plantă-sol care se produce la nivelul soluțiilor coloidale din sol. Se poate vorbi depre o particularitate a azotului, potasiului și fosforului în ceea ce privește schimburile de substanțe minerale de la nivelul solului. A fost aproximat că o importantă fracțiune a azotului de la nivelurile superficiale sau profunde ale solului nu sunt supuse schimburilor. Proprietatea solului de a reține ionii de amoniu poartă numele de fixare a amoniului, mecanismul fiind de o deosebită complexitate și având ca și scop substituirea altor cationi din sol, cum ar fi Ca, Mg, Na. Fixarea fosforului se produce printr-un mecanism similar, fiind acumulat sub forma unor compuși insolubili în asociere cu fierul , aluminiul, calciul, ca și fosfați sau ca apatită. Situația poate fi remediată prin adminstrare de fertilizatori cu fosfor, suplimentat cu materie organică. Prin descompunerea materiei organice se formează citrați, tartrați, acetați, oxalați, malați, malonați și alți anioni organici care eliberează fosforul.

Gazele predominante de la nivelul solului sunt azotul, oxigenul și dioxidul de carbon. Conținutul în dioxid de carbon al solului este de până la 10 ori mai mare decât cel al atmosferei (0,031 % din volum). Aceasta se datorează proceselor de respirație a microorganismelor telurice și se însoțeste de consumarea oxigenului, concentrația în oxigen a solului fiind mai mică decât cea atmosferică. În condiții de extremă anaeorobioză, în sol se pot acumula substanțe toxice precum: etan, metan, hidrogen sulfurat, cianați, acid butiric, acizi grași cu efect dăunător asupra plantelor (spre exemplu, culturile de orez se dezvoltă în general în condiții anoxice, fiind un excelent mediu pentru microorganismele metanogenice; metanul, pe lângă efectul de seră de care se face responsabil, participă alături de dioxidul de carbon și oxidul nitros la reacții chimice cu rol în degradarea stratului de ozon protectiv).

Ph-ul solului este definit ca logaritm cu semn schimbat a concentrației de protoni din extractul apos sau în KCl al solului, reflectând aciditatea sau alcalinitatea acestuia. Capacitatea de tamponare a solului este dependentă de tipul de sol și determină totodată pH-ul solului. Acesta poate varia între 3 și 10 în funcție de tipul solului, dar cele cu cantități mari de substanțe organice sau anorganice au de regulă o capacitate de neutralizare ridicată datorită conținutului ridicat de cationi. De exemplu, solurile podzolice au un pH scăzut, în timp ce cele calcaroase și alcaline au valori ridicate datorită conținutului mare de baze de sodiu sau potasiu, acizi slabi sau bicarbonați. Ph-ul solului determină deopotrivă conținutul în minerale disponibile transferului și compoziția microbiană. Solurile alcaline prezintă o mare disponibilitate pentru potasiu, magneziu, calciu, mangan, cupru și aluminiu, în timp ce solurile cu pH acid favorizează solubilitatea carbonaților, fosfaților și sulfaților. În general, fungii trăiesc la un pH acid (sub 5,5), iar bacteriile fixatoare de azot preferă solurile cu un pH neutru. De asemenea, plantele prezintă în funcție de apartenența la o anumită specie soluri cu pH-uri diferite.

Ca și indicatori chimici ai calității solului pot fi enumerați:

pH-ul (definește pragul de activitate chimică și biologică)

concentrația de N, P, K (definesc accesibilitatea nutrienților pentru plante)

materia organică (definește stabilitatea structurală și fertilitatea)

determinările contaminanților sau poluanților în cazul în care se pune problema unor poluări sau contaminări ale solului

1.2.3 Parametrii biologici ai solului

Solul reprezintă mediul de existență pentru foarte multe viețuitoare, variate ca formă, dimensiuni, apartenență sistematică sau activitate biochimică, între ele stabilindu-se relații deosebit de complexe.

Organismele de la nivelul solurilor exercită o influență fie directă, fie indirectă asupra tuturor proceselor desfășurate la nivelul solului : descompunerea resturilor materiale vegetale sau animale, transformarea sau fixarea nutrienților, capacitatea de reținere a apei, schimburile de gaze, formarea și stabilizarea solului, sinteza de noi compuși organici, degradarea substanțelor poluante sau contaminante.

Microorganismele din sol sunt reprezentate de bacterii (eubacterii, actinomicete, cianobacterii), microfungi, alge și protozoare. În 1925 și apoi în 1949, Winogradsky a propus o împărțire pe criterii ecologice a microorganismelor din sol în două categorii: autohtone și alohtone. Microorganismele autohtone repreyintă cea mai mare parte din microbiotă și sunt caracteristice unui anumit tip de sol. Aceste microorganisme desfășoară o activitate continuă dar lentă, fiind utilizatoare ale nutrienților existenși în mod natural în sol. Nu sunt dependente de alte surse nutritive exogene iar numărul lor nu fluctuează semnificativ. În rândul acestora se înscriu bacteriile, incluzând și actinomicetele, ascomicetele, basidiomicetele. Microorganismele alohtone au o activitate periodică, intermitentă. Sunt organisme care utilizează substraturi organice din exteriorul solului, deci ușor utilizabile.

Microorganismele din sol desfășoară o intensă activitate la procesele care au loc în sol, sub influența lor producându-se descompunerea diverselor substanțe organice rezultate din resturile vegetale și animale, dar și formarea de novo a unor substanțe organice. Urmărind activitatea vitală a acestor microorganisme se ajunge la concluzia că regimul biochimic al solului este determinat aproape în totalitate de activitatea microbiologică.

Ca generalitate, microorganismele din sol își desfășoară activitatea în două direcții, și anume: procese de degradare și procese de sinteză. Prin procesele de descompunere de la nivelul solului se produc pe de o parte produși finali de tipul dioxidului de carbon, apă, amoniac, și pe de altă parte substanțe humice. La rândul lor, aceste substanțe, reintrând în circuitul materiei în natură, vor fi utilizate pentru sinteza de noi substanțe organice. Având în vedere că diferența dintre sol și rocă este reprezentată de fertilitate, aceasta devine proprietatea cea mai importantă, care depinde de cantitatea de substanțe organice din sol.

Pe de altă parte, procesele de sinteză (fixarea azotului molecular și humificarea), care creează în sol o rezervă de substanțe nutritive, mai ales sub formă organică, care influențează starea fizico-chimică și fertilitatea solului. Aceste procese devin esențiale pentru cunoașterea disponibilității unui anumit tip de sol, precum și pentru aprecierea calității solului.

Pentru cunoașterea activității microbiotei telurice se urmăresc anumite direcții și anume:

studierea frecvenței și activității microbiotei în ceea ce privește circuitul principalelor elemente sursă pentru materia organică

studierea echilibrului între grupele ecofiziologice de microorganisme și modificările acestuia sub influența factorilor legați de cultivare

studierea unor eventuale dezechilibre în ceea ce privește starea microbiotei și relația lor cu gradul de fertilitate al solului

Principalul factor care limitează dezvoltarea bacteriilor în sol este lipsa unei surse de energie convenabilă ( Clark, 1967), excepție făcând doar puține bacterii și protozoare flagelate care conțin pigmenți asimilatori. Din punct de vedere al modului de producere a hranei, microorganismele sunt autotrofe ( își sintetizează hrana singure, prin reducerea CO2) și heterotrofe ( folosesc ca sursă de energie energia chimică înmagazinată în substanță organică).

Dintre microorganismele autotrofe, cele care sunt capabile de fotosinteză sunt: bacteriile sulfuroase verzi, purpurii, nesulfuroase purpurii, sulfobacteriile, iar cele chimiotrofe sunt reprezentate de bacteriile nitrificatoare, fiind clasa cea mai importantă din punct de vedre agricol. Microorganismele heterotrofe sunt cele mai numeroase, utilizând ca sursă de enrgie glucide, grăsimi, acizi organici, pentru care au nevoie de o compoziție enzimatică specifică. De interes deosebit pentru studierea activității enzimatice a microbiotei solului sunt: metabolismul glucozei, al acizilor organici, al amidonului, al celulozelor și hemicelulozelor, al pectinelor și ligninelor.

Metabolizarea glucozei presupune desfășurarea unui lanț lung de procese, energia produsă fiind reținută sub forma compușilor macroergici – AMP, ADP, ATP. Atunci când nevoile energetice o cer, are loc scindarea moleculelor de ATP, cu formare de ADP și AMP și eliberarea energiei corespunzătoare.

Acizii organici din sol apar în urma acțiunii microorganismelor care degradează resturile vegetale și animale, acumulîndu-se de regulă cantități mari de acid formic și acetic. Aceștia sunt relativ rapid metabolizați, cu excepția acizilor grași cu lanț lung.

Metabolismul amidonului este predominat de activitatea genului Clostridium, iar celuloza este degradată sub acțiunea Celvibrio, Cellulomonas, Cytophaga, Plyangium, Sporocytophaga, ciuperci – ascomicete, basidiomicete, actinomicete. Un rol important pentru calitatea nutrițională a solului îl are metabolismul ligninelor, realizată în general de basidiomicete și fungi, fiind a doua sursă de carbon în natură (25-30%).

Ca și indicatori biologici în ceea ce privește calitatea solului de reținut sunt:

conținutul, compoziția și varietatea microbiotei

activitatea microbiană

activitatea enzimatică a microbiotei

1.3 Măsuri si politici de protecție a solului

Modificările cantitative și calitative ale caracteristicilor fizice, chimice și biologice ale solului, implicit ale indicatorilor de calitate ai solului enumerați mai sus sunt cunoscute sub denumirea generală de poluare a solului. Definiția acesteia cuprinde orice acțiune care are ca rezultat reducerea capacității bioproductive și alterarea funcționării normale a solului ca mediu de viață pentru plante.

Poluarea solului poate produce dezechilibre în ceea ce privește conținutul și activitatea microbiotei indiferent de tipul activității poluante ( industrială, agricolă, urbană) și indiferent de nivelul la care acestea acționează: fizică, chimică, biologică, radioactivă.

Agricultura prin supraexploatarea sistemelor naturale reprezintă cauza apariției unor efecte nefavorabile solului cum ar fi: eroziunea și alunecarea solului (defrișări masive, pășunat excesiv, practici agricole inadecvate), salinizarea ( datorată sistemelor de irigare inadecvată), acidifierea (utilizarea îngrășămintelor azotoase, ploi acide) , băltirea (defrișări iraționale, lucrări agricole inadecvate), formarea crustei ( ca urmare a incendierii resturilor vegetale ), compactarea solului (lucrări agricole mecanizate), reducerea cantității de materie organică și minerale (utilizarea excesivă a îngrășămintelor cu azot, potasiu, ploi torențiale).

Industrializarea accelarată este răspunzătoare de alterarea calității solului prin lucrări de excavare ce modifică structura naturală a acestuia, cantitățile mari de deșeuri industriale rezultate și prin dezvoltarea amplă a municipalităților care aduc odată cu ele deșeuri urbane și un grad ridicat de impermeabilizare a solului.

Toate aceste acțiuni antropice prezentate mai sus au avut ca efect dereglarea unui complex echilibru ce ar trebui să se găsească între factorii biotici și abiotici ai solului. Actualmente, restabilirea acestui echilibru a devenit o preocupare majoră întrucît este esențială menținerea și chiar îmbunătățirea fertilității solului pentru asigurarea calității vieții la nivel mondial. Măsurile de protecția mediului vizează două direcții, și anume: îmbunătățirea funciară și prevenirea, combaterea poluării solului. Se insistă asupra dezvoltării unor tehnici și practici agricole în conformitate cu normele tehnice de protecție a calității solului.

Productivitatea solului poate fi eminemente crescută prin lucrări cum ar fi:

prevenirea eroziunii solurilor

prevenirea daunelor realizate de ape asupra solului ( diguri, desecări, drenaje, regularizarea cursurilor de apă)

irigațiile eficientizate ( captarea apei din surse nepoluate, transportul apei, distribuirea acesteia urmată de colectarea și evacuarea surplusului de apă)

ameliorarea unor parametrii ai terenurilor nefertile ( accidentate, sărăturate, acide)

utilizarea mașinilor multioperaționale în lucrările agricole

desfășurarea lucrărilor agricole în condiții de umiditate corespunzătoare

efectuarea studiilor agrochimice pentru fiecare unitate de producție și stabilirea științifică a tratamentelor și lucrărilor necesare de către instituțiile de specialitate autorizate în acest scop

ameliorarea acidității solurilor prin aplicare de amendamente calcice conform instrucțiunilor

folosirea îngrășămintelor, amendamentelor și pesticidelor aprobate, în doze recomandate

Capitolul II. MICROBIOTA TELURICA – DEFINITORIE PENTRU REALIZAREA CIRCUITULUI AZOTULUI ÎN NATURĂ

2.1 Circuitul azotului în natură

În natură, organismele vii sunt implicate în permanență în sinteza de compuși celulari proprii pentru a obține energia necesară desfășurării funcțiilor vitale, pe baza elementelor preluate din sol, apă, atmosferă. Astfel, datorită acțiunii plantelor, animalelor și microorganismelor diferite elemente biogene sunt supuse transformării repetate din formă anorganică în formă organică și invers, într-un circuit în care microorganismele în funcție de condițiile biologice ale solului au un rol esențial. Transformările diferitelor elemente chimice nu se produce în mod izolat, ci realizează cicluri perfect articulate între ele.

Cea mai mare rezervă de azot din natură este reprezentată de azotul molecular atmosferic , un grup de microorganisme fiind specialiyzate în integrarea acestuia în sinteze proteice, introducându-l în circuitul materiei în natură. Procesul are de o deosebită importanță pentru fertilitatea solului.

Prima fază în circulația ayotului în natură este fixarea biologică, proces prin care azotul molecular atmosferic este introdus sub formă organică în circuitul materiei în natură, sub acțiunea microorganismelor fixatoare de N ( Ayotobacter, Rhiyobium, Clostridium pasteurianum etc). Pe lângă această sursă de azot, în sol mai există azot proteic din degradarea resturilor vegetale sau animale, care supuse acțiunii microflorei proteolitice de putrefacție, apoi a microflorei amonificatoare (amonifierea reprezintă a doua etapă a ciclului), azotul este eliberat sub formă de amoniac. O parte din acest amoniac se degajă în atmosferă, de unde este readus la nivelul solului prin precipitații. Amoniacul din sol poate fi utilizat de microbiotă pentru sinteze organice proprii sau poate intra în cea de-a treia fază a ciclului azotat prin procesul de nitrificare. Astfel, amoniacul este transformat inițial în nitriți ( sub acțiunea nitritbacteriilor), apoi în nitrați (sub acțiunea nitratbacteriilor). Nitriții și nitrații de la nivelul solului mai pot proveni din oxidarea azotului atmosferic sub acțiunea descărcărilor electrice și a razelor UV, fiind aduși de precipitații. Nitrații sunt folosiți de sistemul radicular al plantelor terestre sau de plantele acvatice dacă ajunge din nou în mediul acvatic. O parte din azotul nitric din sol poate fi pierdut sub formă de nitriți, amoniac sau chiar azot atmosferic prin acțiunea microorganismelor de denitrificare. Astfel, spre deosebire de fazele anterioare ale ciclului azotului, denitrificarea reprezintă un fenomen dăunător calității mediului, favorizând sărăcirea solului în substanțe azotate asimilabile de plante.

Așadar, principalele transformări ale azotului în natură sunt rezultatul microbiotei prin care se realizează fie trecerea azotului organic din resturile materiale în forma anorganică, fie prin trecerea azotului atmosferic în forma organică, asimilabilă.

Figura 1. Circuitul azotului în natură (după Florkin)

2.2 Fixarea biologică a azotului atmosferic

Aceasta reprezintă etapa esențială din ciclul azotului în natură întrucât în lipsa acesteia rezervele de N combinat din sol ar dispărea. Se află sub stricta coordonare a microorganismelor solului, acest aspect fiind demonstrat încă din 1888, când Berthelot a realizat un experiment cu două tipuri de sol, unul sterilizat și altul nesteril, de grădină, care a fost menținut în două recipiente câteva zile în condiții de temperatură și umiditate, fără să se dezvolte vreo plantă în recipiente. Rezultatul a constat în faptul că în solul steril nu s-a acumulat N, spre deosebire de cel steril și, mai mult decât atât, după amestecarea solului steril cu sol nesteril, acesta a devenit capabil să fixeze azot atmosferic. S-a ajuns astfel la concluzia că responsabile de fenomenul acumulării de N la nivelul solului sunt microorganismele telurice.

Acest fenomen de captare și fixare a azotului atmosferic este întâlnit la o serie de microorganisme din sol, și anume:

bacterii libere aerobe: Azotobacter sp.,Beijerinckia sp.;

bacterii libere anaerobe: Clostridium pasteurianum;

bacterii simbiotice din nodozitățile leguminoaselor: Rhizobium leguminosarum;

bacterii fotosintetizante: Rhodospirilum rubrum;

bacterii oligonitrofile- trăiesc pe medii sărace în azot: Bacillus, Pseudomonas, Bacterium;

bacterii banale ca Aerobacter, B. Asterosporus;

alge din genul Nostoc.

Fixarea aerobă a azotului molecular

Fixarea aerobă a azotului atmosferic se face de către microorganisme aparținând genurilor Azotobacter și Beijerinckia. Genul Azotobacter este reprezentat din germeni gram negativi, fiind răspândiți la nivelul ecosistemelor acvatice, dar mai ales în solurile cultivate și bogate în humus.

Deși caracterizate de rezistență, lipsesc în solurile acide, podzolice, mlăștinoase, turboase. Genul cuprinde o mulțime de specii, reprezentativă fiind Azotobacter chroococcum, cu aspecte morfologice definitorii și un ciclu de diviziune specific.

Pe mediile de cultură tulbură mediul, formează la suprafață un văl gros sau formează colonii lucitoare care cu timpul devin negre. Temperatura optimă de dezvoltare este de 28 C, la un pH de 7,6 fiind foarte sensibil la aciditate. Este un germen strict aerob, pentru fiecare gram de glucoză oxidată fixând aproximativ 20 mg azot. Așadar, pentru a se dezvolta și desfășura rolul de fixator de azot, acest gen are nevoie de oxigen și o sursă de carbon, ce poate fi glucoză, hexoze sau compuși organici de tipul alcoolilor sau acizilor.

Fixarea anaerobă azotului molecular

Este realizată de specia Clostridium Pasteurianum , foarte răspândită în sol, bacil gram pozitiv care se dezvoltă optim la 20-30 C, pH între 8,9- 7,3. Poate fixa azot dacă este cultivată într-un mediu cu hidrocarbonați pe ca îi va fermenta cu producere de acid butiric, iar cu energia produsă din fermentarea glucidelor va fixa azotul atmosferic. Fixează de regulă 3mg de azot atmosferic la 1 g glucoză fermentată. Astfel, dezvolatarea Clostridium pasteurianum este bine conturată în solurile cu resturi vegetale și animale care prin descompunere generează substanțe carbonate organice. Acest tip de fixare azotului are rol esențial în mediile anaerobe cum ar fi: soluri puțin aerate, invadate de ape, orezării, mlaștini, bazine de apă, unde C. Pasteurianum este singurul fixator de azot.

Fixarea simbiotică a azotului molecular

Microorganismele simbiotice, aparținând genului Rhizobium, trăiesc în nodozitățile de pe rădăcinile leguminoaselor. Există diferite specii de Rhizobium, în funcție de planta leguminoasă cu care dezvoltă relație de simbioză: R. Leguminosarum, R. Trifolii, R. Japonicum, R.phaseoli, R.lupini, R. Meliloti. Activitatea acestora este diferită în funcție de infecțiozitatea microorganismului și de capacitatea de a fixa azot. Nodozitățile se formează în urma infectării rădăcinilor plantelor cu una din speciile de Rhizobium, pe baza unui fenomen de chemotactism, acestea putând fi eficiente (conțin un pigment roșu numit leghemoglobină și la nivelul lor se produce fixarea azotului) și ineficiente, cu o activitate de fixare mai redusă. Se pare că simbioza plante-bacterii are ca substrat schimbul de materie dintre acestea și anume: bacteria utilizează substanțele glucidice produse de plante pentru a-și procura energia necesară fixării azotului, iar bacteriile fixează azotul favorizând producerea de aminoacizi necesari sintezei proteice a leguminoaselor. Prin această relație de simbioză, leguminoasele devin independente de necesitatea de a se dezvolta numai pe soluri bogate în substanțe azotate.

Fixarea biologică a azotului atmosferic de către microorganisme este un proces vital pentru toate viețuitoarele de pe Pământ întrucât deși azotul este în cantități foarte mari pe suprafața terestră, se află într-o formă inaccesibilă formelor de viață. Prin procesul de fixare biologică, azotul atmosferic este introdus în circuitul natural prin care se asigură în permanență necesarul de azot anorganic din sol care în lipsa acestui proces s-ar epuiza rapid.

Studiile arată că fără aport de îngrățăminte organice bacteriile fixatoare de azot dau 20-50 kg de azot la hectar în cursul unei perioade de vegetație, iar după introducerea îngrășpmintelor organice activitatea fixatoare se accentuează intens.

2.3 Amonificarea

Amonificarea poate fi definită ca procesul biologic prin care se eliberează în sol amoniac ca urmare a acțiunii microflorei solului asupra moleculelor aminate rezultate din descompunerea substanțelor proteice.

Substanțele care conțin azot de la nivelul solului sunt reprezentate de rezervele humice , de compuși rezultați în urma fixării biologice a azotului molecular și de produși aminați proveniți din descompunerea resturilor organice. Procesul de amonificare presupune transformarea tuturor acestor compușu în forma minerală și mai apoi sub formă de amoniac. Pentru ca amonificarea să fie posibilă, este necesară itițial hidrolizarea sub acțiune bacteriană a substanțelor proteice. Astfel, proteinele trec prin fazele intermediare până la stadiul de aminoacizi, care vor fi apoi supuși la nivelul citoplasmei bacteriene procesului de dezaminare, cu formare de amoniac și acid organic corespunzător aminoacidului. Procesele de dezaminare sunt de diferite tipuri: hidrolitică, hidrolitică asociată cu decarboxilare, reducătoare, reducătoare asociată cu decarboxilare, oxidativă cu decarboxilare, cu desaturare. Pe lângă amoniac , așa cum am spus mai sus, se formează și acizi organici: acetic, formic, propionic, butiric, valerianic care, în funcție de condițiile de mediu și de microbiota responsabilă de tipul solului respectiv, pot fi complet metabolizați, acumulați, transformați în alcooli sau reduși.

Principalul rezultant din procesul de amonificare, amoniacul, poate urma mai multe căi de utilizare: poate fi refolosit ca atare de o serie de microorganisme, poate fi supus unor modificări suplimentare (nitrați, nitriți), se poate acumula ca atare în sol ( soluri acide) sau se poate evapora.

Microorganismele capabile de reacția de amonificare sunt de mai multe tipuri:

Bacili sporulați: B. mycoides, B. mesentericus, B. megaterium, B.subtilis, B.sporogenes, B. perfringens;

Bacili nesporulați: Proteus vulgaris, B. fluorescens, B. prodigiosum, E. Coli;

Coci: Sarcina lutea ;

Actinomicete: până la acest nivel producerea de amoniac este intensă.

Mucegaiuri :la intrarea acestora în acțiune, cantitatea de amoniac începe să scadă probabil datorită faptului că mucegaiurile folosesc amoniac pentru sintezele proprii.

2.4 Nitrificarea

Nitrificarea constă în transformarea sărurilor de amoniac rezultate din faza anterioară în nitrați, aceștia fiind formele cele mai accesibile plantelor verzi. În același timp, sub această formă, azotul poate fi supus risipirii sale, nitrații fiind forme foarte solubile, care pot fi spălate de ploaie, pot fi reduse la amoniac sau chiar la azot molecular prin denitrificare. Procesul se desfășoară în două etape: faza de nitritare, finalizată cu formare de nitriți și fază de nitratare, finalizată cu formare de nitrați. Se pare că cele două populații de microorganisme implicate sunt în strânsă legătură, dat fiind faptul că în sol nu se poate surprinde stadiul de nitrit, spre deosebire de cercetările de laborator care descriu constant acest stadiu. Nitratbacteriile acționează rapid asupra nitrților formați, nepermițând acumularea lor pentru a împiedică efectul lor toxic asupra plantelor. Reacțiile de oxidare ce au loc sub acțiunea bacteriilor nitrificatoare sunt generatoare de energie care va fi utilizată de aceste microorganisme să își sintetizeze materia organică proprie pornind de la CO2 și apă. Așadar, ele sunt bacterii chimiosintetizante, obligatoriu aerobe, răspândite în toate tipurile de sol în care se găsesc amoniac sau nitriți și o sursă de carbon mineral din CO2 sau carbonați.

Nitritbacteriile : Nitrosomonas europaea, N.oligocarbogenes, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosocystis,Nitrosogloea sunt cele implicate în oxidarea sărurilor amoniacale în nitriți, trecând prin fazele intermediare de: hidroxilamină, dihidroxiamină, nitrit.

Nitratbacteriile : Nitrobacter vinogradskii, N.agilis, Nitrocystis, Bactoderma alba, B. rosea, Microderma minutissima, M.vacuolata realizează oxidarea nitriților la nitrați.

Per ansamblu, nitrificarea reprezintă procesul prin care substanțele azotate sunt transformate într-o fază asimilabilă plantelor, numărul agenților bacterieni nitrificatori fiind direct proporțional cu gradul de fertilitate a solului respectiv. Dat fiind faptul că aceste bacterii sunt strict aerobe, se înțelege de ce solurile lucrate, bine aerate au o mai mare fertilitate față de cele înțelenite.

Tipuri diferite de sol vor prezenta grade diferite ale activității de nitrificare. De exemplu, podzolurile, cu excepția celor bogate în humus carbonatat, această activitate este foarte redusă, în timp ce solurile turboase, amendatate cu calcar prezintă o intensă activitate. O activitate superioară a bacteriilor nitrificatoare s-a observat în primii 20 de cm de la suprafața solului, precum și în solurile saturate cu baze. În zonele de pustiu și stepă, aerația și umiditatea reprezintă factori limitatori ai dezvoltării microbiotei nitrificatoare care necesită un anume grad de umiditate , respectiv mediu oxigenat corespunzător. Dintre efectele negative ale procesului de nitrificare, de reținut este solubilizarea excesivă a azotului sub formă de nitrați, putând fi spălați de apele pluviale în cantități importante.

2.5 Denitrificarea

Denitrificarea este ultima etapă a circuitului azotului în natură și presupune întoarcerea azotului molecular în atmosferă. Nitrații formați la nivelul solului sub acțiunea microorganismelor nitrificatoare pot urma diferite căi: utilizare de plante, asimilare de microorganismele telurice, spălare de apele pluviale sau reducere prin fenomenul de denitrificare prin acțiunea unor microorganisme, cu formare de azot molecular, amoniac sau stadii intermediare (nitriți, acid hiponitros). Este un proces care necesită condiții de anaerobioză, de aceea este mai intens în solurile saturate cu apă și profunde, unde sunt disponibile anumite microorganisme:

Bacterii denitrificatoare propriu-zise care au capacitatea de a transforma nitrații direct în azot molecular: Achromobacter severinii ( B.denitrificans), B.denitrificans agilis, B.nitroxus, B. Stutzerii etc.

Bacterii cu capacitatea de a transforma nitrații în nitriți, foarte răspândite în microflora banală a solului: B.megaterium, E. Coli, Ps.aeruginosa etc.

Bacterii sulfuroase: Thiobacillus denitrificans.

Există multiple puncte de vedere în ceea ce privește efectul benefic sau dăunător al acestui ultim pas al circuitului azotului în natură. Transformarea nitraților în azot molecular care poate fi supus evaporării este considerată realmente o pierdere de substanțe minerale din solul respectiv. Pe de altă parte, azotul gazos poate fi preluat de fixatorii anaerobi de azot din genul Clostridium. Formarea de amoniac este favorabilă pentru unele microorganisme care îl folosesc ca atare pentru sintezele proprii, iar formele intermediare ca nitriții sunt preluate de bacteriile nitratformatoare și oxidate la nitrați.

Condițiile principale care stau la baza pierderii de azot sunt: slaba ventilație a solului, umiditatea în exces, prezența în sol a unor substanțe organice lipsite de azot. La solurile cultivate, întrunirea concomitentă a acestor condiții este dificil de realizat. De exemplu, cernoziomurile, deși au condiții de pH, temperatură, umiditate, substrat microbiotic care să favorizeze denitrificarea, datorită lipsei de substanță organică neazotată, procesul de denitrificare nu este foarte accelerat.

2.6 Variațiile și importanța microbiotei telurice

Microorganismele sunt foarte răspândite în natură, dar datorită tipurilor de sol diferite în funcție de modul de formare și de compoziția actuală fizico-chimică, microbiota diferitelor ecosisteme are o compoziție variată, atât cantitativ, cât și calitativ. Pe de altă parte, microbiota solului este supusă unor variați produse de condiții de mediu cum ar fi: temperatură, anotimp, lucrări agricole, adaos de substanțe de îngrășare.

S-a observat o creștere netă a numărului de microorganisme telurice primăvara, determinată de valori termice atmosferice ridicate față de sezonul rece, dar și toamna, datorită îmbogățirii solului cu substanțe nutritive prin căderea plantelor și moartea anuală a plantelor. Alternanța în funcție de anotimp a gradului de umiditate este în legătură cu biodisponibilitatea substanțelor organice pentru microorganisme, care se pare că este mai mare în perioadele umede.

Lucrările agricole sunt relativ importante pentru răspândirea microorganismelor la nivelul solului întrucât asigură pe de o parte oxigenul necesar, iar pe de altă parte se asigură o răspândire uniformă a microorganismelor prin procedeele de mărunțire și împrăștiere a resturilor materiale organice.

Aportul de substanțe de îngrășare are un efect diferit în funcție de natura acestora: îngrășămintele de proveniență animală îmbogățesc solul în substanțe minerale și organice, crescând cu până 25% numărul de microorganisme telurice prin aportul de microfloră proprie. Această îmbogățire a microbiotei va persista până la completa metabolizare a materiei organice, respectiv preluarea substanțelor rezultate de microflora autohtonă. Îngrășămintele vegetale au un astfel de efect mai atenuat. O altă influență pregnantă asupra microbiotei o are tipul de cultură vegetală de pe solul respectiv.

Având în vedere cele expuse mai sus, putem spune despre fracțiunea de microorganisme prezentă la nivelul solului că este practic indispensabilă supraviețuirii ecosistemului. Microorganismele au un important rol în formarea structurii fizice a solului, posibil în procesul de agregare a solului, dar mai ales în asigurarea unei mineralizări corespunzătoare a solului. Pe lângă aceste roluri, se conturează aportul adus de bacteriile fixatoare de azot care asigură mare parte din rezerva organică de azot de la nivelul solului. Astfel, microorganismele solului participă permanent la transformarea formă minerală-formă organică a diferitelor elemente chimice de bază.

Microorganismele solului au o importanță esențială în nutriția azotată a plantelor, activitate care se desfășoară în mare parte la nivelul rizosferei și în cadrul relațiilor simbiotice dintre bacteriile din nodozități și leguminoase. În urma studiilor s-a dovedit strânsa legătură dintre capacitatea de metabolizare a azotului de la nivelul solului atribuită microbiotei și gradul de fertilitate a respectivului tip de sol.

Capitolul III. PRINCIPIILE DE BAZĂ PRIVIND PRELEVAREA PROBELOR DE SOL SI EFECTUAREA ANALIZELOR MICROBIOLOGICE

3.1. Recoltarea probelor de sol pentru analize biologice

Probele de sol se recoltează cu ajutorul unui burghiu pentru a se preleva cantități egale de sol pentru fiecare probă.

Adâncimea de la care se face recoltarea depinde de parametrul urmărit în determinările biochimice, dar și de condițiile meteoro-climatice care pot determina migrarea diferiților compuși chimici. Astfel, azotul se dizolvă complet în apă și migrează în straturile de la suprafața solului, iar sărurile de amoniu în urma ploilor abundente, prin solubilizare migrează la o adîncime de 45-60 cm sau chiar mai mult. Spre deosebire de compușii azotați, fosforul și potasiul sunt greu solubili în apă, deci nu migrează ca urmare a modificării cantității de precipitații și se vor găsi la adâncimea de recoltare standard de 0-20 cm. Pentru măsurarea conținutului de azotat din sol, probele de sol se recomandă a se preleva la temperaturi sub 10 C pentru că la această temperatură procesul de mineralizare este minim. Probele de sol pentru analiza oricărui alt element pot fi prelevate în orice perioadă a anului. Pentru obținerea unei probe reprezentative de sol este necesară recoltarea de sub-probe. Acestea se recoltează în formă de tablă de șah, într-un număr de minim 20 de sub-probe pe câmp. Se sfătuiește să fie evitate porțiunile neunifrome (gropi, depresiuni, margini, brazde moarte, suprafețe diferite ca textură sau culoare față de majoritatea câmpurilor) ale suprafeței sau cele prelucrate cu ierbicide sau îngrășăminte.

În general, probele de sol se recoltează de la 15 cm adâncime, fiind transferate în recipiente sterile. Pentru fiecare probă se prelevează 3-5 mostre care se omogenizează. Din materialul omogenizat se rețin 10-25 g de sol pentru proba reprezentativă. Pentru prelevare de probe de la alte adâncimi se utilizează un burghiu corespunzător.

Important pentru procesul recoltării solului este sterilizarea recipientelor de recoltare care asigură dezvoltarea unei culturi în condiții aseptice. Sterilizarea se poate realiza pe baza căldurii uscate, căldurii umede ( vapori de apă sub presiune din autoclav), prin substanțe chimice sau prin radiații. Recipientele se sterilizează prin păstrarea lor timp de 15 minute la temperatura de 121 C în autoclav, iar sterilizarea mediilor de cultură se realizează prin menținerea lor timp de 20 de minute în aceleași condiții. Sterilizarea la rece constă în utilizarea unor filtre din celulozo-acetat, celulozo-nitrat sau policarbonat cu pori de dimensiuni foarte mici (0,4-0,2 microni) care pot reține microorganismele nedorite. Alături de aceste metode de sterilizare, ca și modalități adjuvante pentru asigurarea asepsiei în cercetarea microorganismelor se mai utilizează hotele cu flux laminar, dezinfectanți, radiații UV.

Pentru recoltarea corespunzătoare este necesară o trusă pedologică de teren:

Acid clorhidric-pentru identificarea carbonaților

Clorură de bariu-pentru identificarea sulfaților

Azotat de argint pentru identificarea carbonatului da Na

Fenolftaleina 1% pentru identificarea carbonatului de Na

Fericianură de K 5% pentru identificarea Fe bivalent

Salicilat de Na 5% pentru determinarea pH –ului

pH-metru

Eprubete, pâlnie, hârtie de filtru, cuțit, șpaclu, ruletă, pungi, cilindri, bidoane, etichete

Lopată, sondă pedologică, ciocan, altimetru, clinometru.

3.2. Prelucrarea probelor de sol

Păstrarea și prelucrarea probelor de sol sunt etape care pot influența profund rezultatele analizelor microbiologice. O păstrare îndelungată a probelor de sol nu este indicată pentru asigurarea unui răspuns veridic al analizelor bacteriologice. Toate sub-probele vor fi omogenizate într-un recipient de plastic steril. Din întreaga cantitate se rețin maxim 500g care se supun uscării în aer liber sau se mențin la frigider timp de maxim 24 de h.

La frigider pot fi menținute probele care vor fi analizate în ceea ce privește unii indicatori care se modifica în timp cum ar fi: azotul, amoniacul, nitrații, nitriții, umiditatea. Uscarea la aer poate fi aplicate probelor care se analizează pentru poluanții anorganici sau de altă natură, mai persistenți în mediu.

Uscarea în aer liber presupune presărarea solului într-un strat de maxim 1cm grosime pe o suprafață de polietilenă sau aluminiu și menținerea lui astfel o naumită perioadă. Nu este indicată folosirea cuptoarelor cu microunde saau a altor cuptoare. Esența acestei etape constă în stoparea activității bacteriologice și formarea sărurilor de amoniu anterior analizelor microbiologice.           

În timpul transportului, probele de sol trebuie să fie ferite de razele solare și să fie însoțite de o fișă de recoltare care cuprinde: data de recoltare, numele și calitatea celui care a recoltat proba, localizarea regiunii din care s-a făcut recoltarea, scopul analizei, precipitațiile atmosferice dela data și locul recoltării, felul poluării la care se suspectează că ar fi fost expus solul.

3.3. Efectuarea suspensiilor – diluții de sol

În studierea plăcilor Petri, este determinat numărul unităților formatoare de colonii. Tehnica diluțiilor seriate constă în diluarea progresivă a unui extract inițial, în vederea obținerii unui număr din ce în ce mai mic de colonii pe plăcile Petri. După incubarea plăcilor care au fost însămânțate cu diluțiile seriate, se începe numărătoarea de colonii. Plăcile cu colonii între 25 și 250 sunt potrivite pentru realizarea numerotării. Astfel, populația microbiană din proba originală de sol poate fi apreciată numeric. De exemplu, dacă pe placa în care a fost inoculată diluția 1: 1000 000, în cantitate de 0,01 mL, calculul de microorganisme totale este: Bacteria( unități formatoare de colonii)=232 colonii/(0,001 mL X 10-6 )= 2,32 X 10 6

Ca materiale necesare realizării diluțiilor enumerăm: 99mL apă sterilă într-o sticlă, pipetă sau picărător calibrat, plăci Petri cu mediu agar solid steril, tijă de omogenizare și răspândire (ansă) , alcool, sursă de foc.

Experimentul debutează cu obținerea unei probe de sol. Pentru prepararea unei diluții 1:100, peste 1 gram din proba de sol finală se adaugă 99 mL de apă sterilă. Se amestecă foarte bine cele două componente. Se asigură etanșeizarea completă a recipientelor în timpul manevrelor pentru a preveni contaminarea externă. Pentru obținerea unei diluții 1:10 000, se pipetează 1 mL din diluția 1:100 într-un alt recipient cu 99 mL apă sterilă. Amestecarea riguroasă a componentelor se poate face prin pipetarea și eliberarea repetată a conținutului recipientului. Pentru prepararea unei diluții 1:1000 000 se repetă acțiunea: 1 mL din diluția anterioară se pune în 99 mL apă sterilă dintr-un recipient steril, se omogenizează.

Figura 2. Realizarea diluțiilor seriate

Sursa: www.sigmaaldrich.com

Utilizând o pipetă supusă anterior sterilizării, se iau din fiecare diluție câte 0,5 mL și se pun pe suprafața mediului agar din 3 cutii Petri diferite. Ansa metalică cu care se va face însămânțarea propriu-zisă se sterilizează, fiind trecută inițial prin alcool, apoi flambată până ce alcoolul se evaporă în totalitate. Ansa este lăsată să se racească. După răcire, ansa este folosită pentru răspândirea picăturii din diluție pipetată pe suprafața mediului. Plăcile astfel însămânțate sunt supuse incubării în condiții de temperatură și umiditatea favorabile, timp de 24-48 h. după incubare, sunt selectate plăcile cu număr corespunzător ( între 25 și 250 ), se numără coloniile formate și numărul de bacterii dintr-un gram de sol. 

Metodele de diluție a solului și a numărătoarea pe placă sunt cele mai utilizate metode în ceea ce privește izolarea și cuantificarea microorganismelor solului. Diluții corespunzătoare din sol sunt introduse pe un mediu solid caracteristic. Pentru a împiedica creșterea bacteriilor sau a fungilor pe mediile respenctive sunt încorporate în mediul de agar solid fie streptomicină, fie roz-bengal. Bacteriile termofilice, deci cele capabile de a tolera temperaturi înalte, sunt izolate prin incubarea plăcilor cu diluții cultivate la temperaturi de 55-60 C.

Însămânțarea culturilor bacteriene se poate face și după metoda de epuizare a încărcăturii ansei, în care un fir din metal inoxidabil, platină sau nichel-crom de forma unei anse este utilizat pentru a recolta din diluția respectivă un inocul. Inițial ansa este sterilizată, se recoltează cu aceasta inoculul. Acesta va fi însămânțat ( prin mișcări de dute-vino ale ansei încărcate) , inițial în primele două cadrane (I și II) ale plăcii Petri împărțită în prealabil în patru cadrane. După însămânțarea celor două, printr-o mișcare de rotație cu 90 , placa Petri se întoarce cu următoarele două cadrane (II și III) în partea de sus; se repetă aceeași mișcare de dute-vino cu ansa încărcată cu inoculul inițial. Se repetă mișcarea până se ajunge cu ansa la ultimul cadran. Scopul acestei manevre este de a creea diluții seriate din inoculul inițial. Placa Petri se pune apoi la incubat într-o cameră sterilă. Metoda este favorabilă pentru obținerea unor colonii ce provin dintr-o singură bacterie, deși inoculul inițial reprezintă o mixtură de diferiți germeni. Dezavantajul metodei este acela că unele microorganisme, în timpul producerii suspensiei de sol, rămân aderente de suprafața particulelor de sol, în ciuda mișcărilor energice de agitare a solului. Pentru a preveni acest dezavantaj, o cantitate mică de sol (0,005-0,01 g de sol ) este poziționată direct într-o cutie Petri sterilă, este mărunțită fin cu ajutorul unui ac, iar peste aceasta este turnată o cantitate de agar topit și răcit.

Winogradsky și Beijerinck au descoperit metoda îmbogățirii mediului de cultură pentru a obține rezultate mai bune în culturile microorganismelor telurice, având la bază criteriul selecției naturale. S-a descoperit că la inocularea unei soluții heterogene din punct de vedere al compoziției microbiene, microorganismele care sunt adaptate condițiilor oferite de mediul de inoculare vor începe să prolifereze, inhibând restul tipurilor de microorganisme. Astfel, se pot obține culturi microbiene țintite, doar prin manipularea conținutului mediului de cultură.

Metodele de determinare a numărului de microorganisme de la nivelul solului sunt multiple:

Metoda numărului cel mai probabil-este metoda mai sus prezentată, realizată pe baza diluțiilor seriate;

Directa observare la microscop-folosește camerele de numărare. Se numără microorganismele prezente într-o cantitate de inocul cunoscută, apoi se raportează la 1 gram de sol. Pot fi utilizate colorații vitale pentru a diferenția microorganismele viabile de cele nonviabile sau de artefacte. Microscopia electronică permite numărătoarea automată de microorganisme;

Turbiditatea (densitatea optică)- turbiditatea unui mediu lichid creată de multiplicarea bacteriană poate fi măsurată de un spectrofotometru. Absorbanța probei este dependentă de numărul celulelor, forma și mărimea, fiind măsura utilizată pentru cuantificarea ratei de multiplicare bacteriene;

Activitatea metabolică- este o modalitate indirectă de a cuantifica rata de multiplicare bacteriană, și anume, prin determinarea concentrației de metabolit al unei populații bacteriei care este direct proporțională cu numărul de bacterii prezente în mediu. Exemple de metaboliți: CO2, acizi organici.

3.4. Evaluarea grupelor ecologice de microorganisme implicate în circuitul azotului în natură

3.4.1. Determinarea microflorei fixatoare de azot

Așa cum am prezentat și mai sus, interacțiunile dintre plante și microorganismele rizosferei sunt multiple, compușii pe bază de carbon eliberați de rădăcinile plantelor stând la baza dezvoltării a numeroase specii de microorgnisme. Cele mai multe plante interacționează cu microorganismele în vederea obținerii unor elemente minralede tipul azot sau fosfor. Simbioza cu bacteriile fixatoare de azot este bine cunoscută, constând în interacțiunea bacteriilor cu rădăcinile leguminoaselor în vederea formării de noduli fixatori de azot. Reducerea azotului atmosferic la amoniac în nodulul simbiotic de la nivelul rădăcinii este realizat de complexul de enzime nitrogenaze. Cele mai importante astfel de simbioze sunt descrise între rădăcinile de leguminoase și speciile de microorganisme Rhizobium spp. și Bradyrhizobium spp. Aceste două specii sunt cele mai studiate la nivel mondial datorită ușurinței de obținere a culturilor microbiologice.

Bacteriile fixatoare de azot pot fi izolate direct din nodulii de la nivelul rădăcinilor plantei gazdă sau din sol, folosind mediu de cultură selectiv cu extract din drojdii obținut cu manitol (YEM). Albastrul de bromtimol este utilizat ca indicator pentru detectarea multiplicării bacteriilor fixatoare de azot. Indicatorul producerii de acid este considerată formarea unui halou galbel în jurul coloniilor bacteriene colorate în albastru.

Alberton a fost printre primii care a determinat caracteristicile morfo-fiziologice ale microorganismelor din specia Rhizobium. Speciile au fost crescute pe extract de drojdie-manitol agar, iar caracterizarea morfologică s-a realizat pe baza unor colorații Gram. Alte metode de studiu al acestor microorganisme țin de domeniul ingineriei genetice și biologiei moleculare și constau în: studierea informației genetice codificată de ADN-ul ribozomal și a proteinelor codificate de această informație genetică ( prin PCR- RFLP). Pentru determinarea bacteriilor fixatoare de azot, se recomandă ca probele de sol să fie prelevate din zone care au avut cultivate în antecedente pe suprafața lor plante leguminoase, de la o adâncime de 10-15 cm. Se realizează inițial culturi din inoculul obținut din proba de sol, apoi, prin selectarea coloniilor cu aspecte sugestive pentru Rhizobium se obțin culturi pure dintr-o singură specie bacteriană. Izolarea Rhizobium s-a realizat pe mediu YMA (10 g manitol, 0,2 g MgSO4·7H2O, 0,1 g NaCl, 0,5 g K2HPO4, 0,2 g CaCl2·2H2O, 0,01 g FeCl2·6H2O, 1 g extract d drojdie, 20 g agar, 1 L apă distilată, 25 μg/ml albastru de bromtimol, pH = 6,7 – 7). Mediile însămânțate au fost menținute 7 zile la 28 C. Prin observația microscopică în colorația Gram și analiza macroscopică a culturilor s-a putut realiza caracterizarea morfologică a culturilor pure ( formă, contur, aspect, pigmentare, textură).

3.4.2. Determinarea microflorei amonificatoare

Flora amonificatoare realizează mineralizarea aminoacizilor, peptidelor și a altor substanțe organice prin formare de NH3, CO2, H2O. Formarea de amoniac la nivelul culturilor este monitorizată cu ajutorul reactivului Nessler.

Se realizează diluții seriate din extractul de sol obținut inițial, acestea se însămânțează într-un mediu în care asparaginaza reprezintă unica sursă de carbon și azot, se incubează 7 zile la 28 C. Se monitorizează apoi cantitatea de amoniac produsă în mediu în funcție de intensitatea reacției cu reactivul Nessler. Procesul de amonificare este puternic influențat de factori precum: pH, oxigen, temperatură, umiditate, concentrație de substanțe, prezența anumitor ioni. În testul pentru determinarea cantității de amoniac produs, reactivul Nessler (tetraiodomarcurat potasic) reacționează cu amoniacul prezent în probă ( în condișii de pH alcalin) și formează un compus de culoare galbenă. Având în vedere că modificarea colorimetrică este direct proporțională cu concentrația de amoniac, modificările se pot măsura spectrofotometric.

2K2HgI4 +NH3 + 3KOH Hg2OINH2+ 7KI +2H2O

3.4.3. Determinarea microflorei nitrificatoare

Prezența bacteriilor producătoare de nitrat sau nitriți nu este net separată. Pentru determinarea celor două categorii de bacterii se utilizează două medii elective lichide, câte un mililitru pentru fiecare tub, în fiecare tub fiind însămânțată câte un din diluțiile obținute.

Pentru cercetarea nitrat bacteriilor, mediul va fi suplimentat cu sulfat de amoniu ((NH4)2SO4), iar pentru studierea nitritbacteriilor se va adăuga NO2Na. Se incubează 3 săptămâni la 28 C. Prezența nitriților este testată cu ajutorul unui reactiv sulfuric de difenilamină, iar cea a nitraților prin monitorizarea conținutului de uree în mediu sulfuric.

Sărurile de amoniu care rezultă din l- procesul de amonificare disociază în ioni de amoniu ai acizilor respectivi (C-, HCO-3 , SO4 -2, HPO4-2), care sunt supuși ulterior proceselor de oxidare și schimburi cu ionii atașați de coloid. Procesele la care sunt supuși ionii de amoniu și amoniacul formează fenomenul de denitrificare. Organismele care oxidează ionii de amoniu la acid nitric poartă numele de nitrit bacterii, iar microorganismele care oxidează azotiții în azotați poartă numele de nitratbacterii.

Bacteriile nitrificatoare pot fi autotrofe sau heterotrofe. Factorii care influențează nitrificarea sunt: umiditatea, temperatura și în special substratul de amoniac și ioni de amoniu. Concentrația de bacterii nitrificatoare dintr-o cultură de microorganisme este revelată în funcție de intensitatea reacției nitriților și nitraților cu reactivul difenilamină sulfurică, iar în cazul bacteriilor producătoare de nitrați de prezența ureei în mediul sulfuric. Nitrații oxidează difenilamina într-un compus chinolic de culoare albastră.

3.4.4. Determinarea microflorei denitrificatoare

Denitrificarea este ultima verigă din lanțul ce formează circuitul azotului în natură. Este un proces ce constă în reducerea nitraților la nitriți și poate fi cuantificat de-a lungul timpului prin monitorizarea nivelurilor de nitrți și nitriți din cadrul unei probe biologice. Numărul microorganismelor implicate în denitrificare este cuantificat prin dispariția nitrților de-a lungul timpului, cu ajutorul reactivului pe bază de difenilamină în mediu sulfuric. Proba de examinat este reprezentată de diluțiile seriate obținute din proba de sol realizate într-un mediu de sol în care azotul se găsește sub formă de nitrați (NO3K). Sunt incubate la 300 C și sunt menținute timp de 3 săptămâni. Rezultatele sunt obținute prin compararea cu probele de control care nu au fost însămânțate cu diluții din sol.

Rezultatele se interpretează în funcție de grupul de microorganisme studiat. De exemplu, microflora totală a unei probe de sol se evaluează în zilele de incubație 3, 5 și 7. Microorganismele amonificatoare și denitrificatoare sunt studiate după zilele 3 ,5 ,7 ,10 ,12 ,15 de incubație, iar nitrit și nitrat bacteriile devin disponibile studiului după 20 de zile de incubație.

În ceea ce privește microflora de denitrificare, se poate spune că, cu cât diluția din proba de sol realizată în mediul cu sursă de azotați este mai mare cu atât așteptarea noastră ca reacția de determinare a nitraților să fie mai intensă. Precizăm că aceste diferențe vor fi percepute și cuantificate prin măsurători spectrofotometrice.

Capitolul IV. REZULTATE PRIVIND EVOLUTIA PARAMETRILOR MICROBIOLOGICI AI SOLULUI DIN PLANTAȚIILE DE VIȚĂ DE VIE

Pentru realizarea prezentului studiu am analizat din punct de vedere al parametrilor microbiologici ai solului, o plantație de viță de vie din împrejurimile orașului Calafat, județul Dolj. Evoluția acestor parametri a fost studiată pe parcursul anilor 2013, 2014, 2015 și urmărește în mod mai amănunțit influența unor factori precum: lucrări de fertilizare și amendatare ale solului, lucrări agricole ale solului, influența administrării de substanțe fitofarmaceutice. Pentru o mai bună înțelegere a fenomenelor de la fața locului, consider necesare prezentarea unei succinte decrieri a condițiilor geo-pedologice ale zonei precum și a lucrărilor și tratamentelor realizate în cadrul podgoriei.

4.1 Condiții geo-pedologice

Dispus la o altitudine cuprinsă între 30 și 300 m față de nivelul mării, regiunea este considerată o zonă de câmpie, fiind una dintre zonele dunărene ale țării. Orașul Calafat este dispus în cadrul Câmpiei Române și anume, la extremitatea sud-vestică. Din punct de vedere al climei, regiunea pe care se află plantația de viță de vie al cărei sol l-am analizat, aparține zonei climatice temperate, dar cu ușoare influențe mediteraneene. Media anuală în această regiune este de aproximativ 10-11 C. Verile sunt foarte calde, precipitații reduse sub formă de averse, iar iernile sunt relativ blânde, cu fenomene de încălzire datorate influențelor mediteraneene. Dintre lunile de vară, cea mai călduroasă este luna iulie, cu o medie a maximelor de aproximativ 23 C, iar temperatura maximă absolută înregistrată în ultimul secol este de 41,5 C Anual, în această regiune îngheață aproximativ 83 zile. Valoarea medie anuală a precipitațiilor regiunii este destul de ridicată, aproximativ 580mm/an, iar stratul de zăpadă durează îîn medie cca 35 zile pe an.

Schimbările climatice au atins cu o oarecare gravitate și această regiune a țării, în mare parte fiind datorate activităților antropice desfășurate local și național. Ploile acide, efectul de seră, creșterea concentrației de ozon troposferic, acumularea de precursori ai ozonului, alternanța dintre perioadele de secetă și inundații, perioadele prelungite de secetă sunt fenomene care au intrat în normalitatea aspectelor climatice ale zonei.

Din punct de vedere geologic, zona este caracterizată de un sol fertil, propice pentru lucrările agricole. Deși fragmentat de luncă, dune de nisip și terase, solul predominant în zonă este reprezentat de cernoziom, la care se adaugă mici suprafețe de teren nisipos, cu o fertilitate mai redusă din punct de vedere agricol. În ciuda calității suficient de bune pentru dezvoltarea agriculturii, zona a devenit în ultimul sfert de secol ținta acțiunilor nefaste rezultate din antropizarea activităților, dar și a tendinței de deșertificare, tendință care de altfel a afectat întregul județ Dolj.

4.2 Lucrări și tratamente efectuate în cadrul plantației de viță de vie

Plantația a fost înființată în urmă cu 5 ani, pe o suprafață de teren de 2 hectare , pe care anterior au fost cultivate specii cerealiere: grâu, porumb, ovăz. Premergător plantării viței de vie, terenul a fost nivelat cu grapa de discuri, desfundat ( mobilizare pe o adâncime de 50 cm cu 6 luni înainte de plantare), fertilizat cu gunoi de grajd și îngrășăminte chimice cu fosfor și potasiu.
lucrările de plantare de la nivelul terenului au fost relizate manual, la începutul lunii aprilie, la o temperatură de 10 C. De- a lungul anilor, lucrările de întreținere au fost realizate atât manual cât și mecanizat.

4.3 Dependența numărului și a activității microorganismelor de lucrările agricole ale solului

Anterior realizării lucrărilor agricole ale solului desfășurate în sezonul de primăvară s-a descoperit o acumulare a microorganismelor în straturile superficiale ale solului ( primii 10 cm). Pe măsura realizării lucrărilor de întreținere și analizării straturilor mai profunde de sol s-a observat distribuție mai uniformă, o nivelare a activității microorganismelor la nivelul solului și nu în ultimul rând o sporire numerică a acestora (tabel 1).

Tabel 1. Variația numerică a bacteriilor și ciupercilor în funcție de lucrarea solului

Dintre speciile care sunt întâlnite cu o mai mare frecvență la nivelul solurilor lucrate, de reținut este Bacillus megatherium, cu o importantă activitate de mobilizare a nutrienților din sol, mineralizarea humusului, deci, în ansamblu, de creștere a biodisponibilității solului respectiv și a calității acestuia. Se observă, de asemenea o creștere a numărului total de microorganisme fungice în cadrul solului care a suferit lucrările de întreținere.

În cadrul plantației descrise, în anul 2013, lucrările de bază (aratul) ale solului au fost realizate toamna, în timp ce în 2015, acestea au fost realizate primăvara. Prin recoltarea probelor de sol atât în 2013, cât și în 2015, în timpul lunii martie, s-a observat efectul benefic al acțivității lucrărilor agricole realizate toamna, nu numai în ceea ce privește numărul total de microorganisme , dar și în ceea ce privește procesele de nitrificare. Probele recoltate vara, după tasarea terenului și scăderea umidității solului, evidențiază o intensă afectare a numărului de microorganisme de la nivelul solului.

Un alt parametru care se pare că influențează profund distribuția microflorei solului este reprezentat de adâncimea la care sunt realizate lucrările de îngrijire. Prin arătura superficială este stimulată pe termen scurt proliferarea microorganismelor de suprafață, însă mult mai benefică pe termen lung este lucrarea executată la o adâncime mai mare, mai ales dacă este suplimentată cu administrare de îngrățăminte organo-minerale. Mai ales procesele de nitrificare și amonificare de la nivelul solului sunt influențate pozitiv ( probele de sol au fost analizate conform metodelor de lucru descrise la capitolul 3). Cauza producerii acestei diferențe constă în faptul că lucrările realizate la o mai mare adâncime determină o mai bună aerare a solului care asigură pe de o parte, germinarea formelor de bacterii sporulate, iar pe de altă parte proliferarea microorganismelor celulolitice, acestea fiind germeni de aerație avansată. Prin analizarea probelor de sol în anul 2014, după efectuarea lucrării de afânare a solului din lunile martie-aprilie, am observat ca numărul de microorganisme față de proba de sol recoltată după realizarea arăturii de toamnă nu diferă semnificativ, desprinzând de aici concluzia că reafânarea unui sol care deja are o aerație bună este ineficientă.

Un alt parametru al carui răsunet asupra încărcăturii microbiologice a solului din plantație a fost studiat este apa, aceasta fiind principalul component al celulelor bacteriene, reprezentând, așadar, elementul esențial pentru toate procesele de creștere și multiplicare bacteriană. Au fost studiate variațiile numerice ale microorganismelor din sol de-a lungul unei perioade de o săptămână în care s-au înregistrat precipitații abundente, precipitații care au survenit după o perioadă de secetă de aproximativ două luni. S-a observat o diminuare a numărului microorganismelor la umiditate scăzută ( mai puțin de 10% ), deci anterior perioadei ploioase. Se pare că moarte microorganismelor la umidități scăzute variază și în funcție de durata perioadei sectoase, nivelul uscării, tipul microorganismelor implicate și tipul de sol ( de exemplu, uscăciunea este tolerată cu o mai mare ușurință în solurile argiloase, situație care evident nu este cea a plantației studiate întrucât tipul de sol predominant în cazul de față este cernoziomul). După instalarea ploilor, microorganismele telurice au înregistrat o creștere numerică exponențială până la înregistrarea unei umidități a solului de aproximativ 60% din capacitatea câmpului, după care înregistrează o scădere numerică, inițial mai puțin accentuată, apoi mai evidentă. Acest aspect este rezultatul creării unor condiții de anaerobioză accentuată care împiedică nu numai desfășurarea fiziologică a activității microbiene, ci și multiplicarea bacteriană (grafic 2). De remarcat este faptul că microorganismele amonificatoare sunt capabile de a-și desfășura activitatea atât în condiții de uscăciune, precum și de umiditate corespunzătoare, în timp ce speciile fixatoare de azot atmosferic și cele nitrificatoare necesită valori ale umidității cuprinse între 50 și 70 % din capacitatea de câmp.

4.4 Influența lucrărilor de fertilizare și amendatare asupra microorganismelor telurice

Este bine cunoscut efectul pozitiv al îngrășămintelor și amendamentelor în ceea ce privește capacitatea productivă a solului. Solul plantației analizate a suferit de- a lungul perioadei studiului suplimentarea atât cu îngrășăminte naturale, cât și fertilizare minerală.

Gunoiul de grajd fermentat în condiții corespunzătoare, verificat din punct de vedere bacteriologic, a fost utilizat pentru fertilizare în cantitate de aproximativ 10t/ha, fiind administrat în primăvara anului 2013, anterior realizării lucrărilor de mărunțire a solului. Cunoaștem calitățile gunoiului de grajd pentru fertilizare: sursă de nutrienți care supuși acțiunii florei de descompunere generează CO2, suplimentarea solului cu humus în forme ușor asimilabile, îmbunătățește structura solului, crește capacitatea de reținere a apei, aduce un surplus de microorganisme și stimulează activitatea celor preexistente.

În perioada imediată îngropării sub brazdă a gunoiului de grajd, s-a observat o creștere aproape dublă a numărului total de microorganisme telurice, mai ales al celor fixatoare de azot (Azotobacter sp. și Clostridium pasteurianum) și al celor celulolitice. Sunt stimulate inclusiv speciile fungice. Aplicarea îngrășământului natural și-a dovedit eficiența nu numai în ceea ce privește multiplicarea bacteriană și fungică, ci și în legătură cu activitatea enzimatică a acestora. Reacțiile de cuantificare a proceselor de nitrificare și amonificare au devenit intens pozitive după administrarea gunoiului de grajd.

Fertilizarea minerală este practicată la scară largă pentru atenuarea relației de concurență ce se dezvoltă între plantele de cultură și microorganismele din sol asupra asimilării elementelor nutritive, îndeosebi a azotului. Acest fenomen este mai evident când solul dispune de o cantitate redusă de azot nitric sau când plantația respectivă primește un adaos de material organic energetic. Azotul anorganic din îngrășămintele minerale este accesibil plantelor în această formă o scurtă perioadă de timp, trece apoi sub formă organică sub influența microorganismelor, fiind apoi remineralizat. Se concluzionează de aici că disponibilitatea pentr plantele de cultură a azotului administrat o dată cu fertilizarea minerală este aproape strict dependentă de procesele de humificare și mineralizare desfășurate de microorganisme. Se cunoaște faptul că plantele preferă cu primordialitate azotul mineral din compoziția naturală a solului. Astfel, pentru utilizarea resurselor oferite de mineralizarea artificială, sunt necesare procese de nitrificare intense care să pună la dispoziția plantelor azotul nitric necesar.

La plantația de viță de vie studiată a fost administrat în primăvara anului 2015 un îngrășământ mineral complex cu conținut cunoscut de azot și pentaoxid de fosfor, în cantitate de 200kg/ha , anterior lucrării de bază de mărunțire a solului, manual, prin împrăștierea uniformă pe toată suprafața culturii. Rezultatele microbiologice ale solului care au fost realizate în perioada imediat următoare, au fost pe măsura așteptărilor. Numărul bacteriilor din rizosferă s-a mărit considerabil (creștere cu aproximativ 30%) și s-a observat o stimulare a activității respiratorii a microflorei, precum și cea celulolitică. În ceea ce privește microflora implicată în circuitul azotului, s-a observat o accelerare a proceselor de nitrificare și amonificare de la nivelul solului. Dintre bacteriile cu o ascensiune numerică impresionantă enumerăm Bacillus megaterium și Bacillus subtilis. Explicația pentru implicarea fosforului în activitatea microbiană telurică este aceea că prin stimularea proceselor respiratorii, stimulează procesele de nitrificare și amonificare. Astfel, administrarea combinată a celor două surse minerale: azot și pentaoxidul de fosfor, este absolut favorabilă pentru culturi. Pe de altă parte, utilizarea compușilor pe bază de fosfor este strict dependentă de microbiota rizosferei, bacteriile de aici având un rol deosebit pentru solubilizarea acestora.

4.3. Rezultate și discuții.

4.3.1. Dinamica fixatorilor aerobi în solurile viticole

Analiza rezultatelor obținute în urma însămânțării celor trei probe de sol recoltate în luna martie 2014 arată că numărul fixatorilor aerobi, liberi se mențim la același ordin de mărime (zeci și sute bacterii/ g sol uscat) în toate probele analizate dar la valori mai scăzute față de luna noiembrie 2013.

Astfel, numărul lor variază între 18,4 – 34,7 bacterii/g sol uscat (la 7 zile) și 308 – 347 bacterii/g de sol uscat (la 15 zile). Această creștere numerică a bacteriilor se datorește creșterii temperaturii solului și aerului din perioada primăverii, variație consemnată si în literatura de specialitate (Zarnea, 1994) ca fiind hotărâtoare pentru microflora solului.Din datele obținute rezultă că în luna noiembrie numărul fixatorilor de azot aerobi este de ordinul zecilor și sutelor de bacterii pe grame sol uscat, cu variație de la o probă de sol la alta ( tabel 4.1). Cea mai intensă fixare de azot molecular atmosferic are loc în solul I (sol cu pH neutru) unde numărul de bacterii variază între 11,7 (la șapte zile) și 195 bacterii pe grame sol uscat (la 15 zile), respectiv 3,548 și 7, 607 log2 din numărul de microorganisme.Numărul cel mai mic de bacterii fixatoare de azot libere, aerobe este întâlnit în solul III (sol cu pH slab acid) la care numărul de bacterii variază între 0-4,6 bacterii / grame sol uscat.Diferența dintre numărul fixatorilor aerobi la cele trei probe de sol este explicabilă deoarece este bine cunoscut faptul că numărul acestor bacterii variază mult în funcție de tipul de sol care oferă condiții diferite de dezvoltare pentru aceste bacterii ( pH, umiditate, prezența unor factori toxici, conținutul în calciu și fosfor, etc.). S-a constatat că pH-ul solului poate influența diferit dezvoltarea diferitelor specii și tulpini. Reacția solului prezintă o mare importanță pentru dezvoltarea speciilor genului Azotobacter. Scăderea pH-ului sub șase influențează considerabil densitatea Azotobacterului din sol.

În cazul probelor analizate se poate aprecia că solurile cu o reacție aproape de neutralitate (sol I) sunt optime dezvoltării Azotobacterului, fapt concretizat în numărul mult mai mare de fixatori găsiți în urma analizelor efectuate.

În luna august 2013 se înregistrează o creștere a numărului de fixatori anaerobi în toate cele cinci probe de sol analizate ( la 15 zile). În schimb la șapte zile nu au fost puse în evidență la niciuna din probe.

Tabel 4.1

Dinamica germenilor fixatori de azot aerobi in probele de sol viticol

Figura 4.1. Dinamica sezonieră a germenilor fixatori de azot aerobi – la 7 zile

Figura 4.2. Dinamica sezonieră a germenilor fixatori de azot aerobi – la 15 zile

4.3.2. Dinamica fixatorilor anaerobi în solurile viticole

Datele obținute indică diferențe foarte mari în numărul fixatorilor anaerobi (Clostridium pasteurianum) / g sol uscat în cele trei perioade în care s-a făcut prelevarea ( tabel 4.2.). Astfel, in luna martie se înregistrează o scădere a numărului de fixatori anaerobi mai ales în solurile II si III. In luna noiembrie în cele trei probe de sol examinate numărul anaerobilor variază între 305 și 180.000 bacterii/ g sol uscat. Numărul cel mai mare de fixatori liberi anaerobi s-a obținut în solu III. Se remarcă faptul că în luna noiembrie fixarea azotului atmosferic în sol se realizează mai mult pe seama fixatorilor anaerobi. Numărul acestora este mult mai mare în comparație cu numărul fixatorilor aerobi si dintre toate probele analizate în aceeași perioada a anului. Fixarea anaerobă a azotului atmosferic vine să completeze deficitul în activitatea aerobilor care se găsesc într-un număr mai mic. Scăderea însă cea mai accentuată a numărului de bacterii se observă în luna august 2013, când la 7 zile nu au putut fi puse în evidența în nici una din probe, iar la 15 zile numărul lor scade aproape la jumătate față de luna martie. Atribuim această scădere secetei care s-a manifestat în luna august, care a creat condiții nefavorabile dezvoltării microorganismelor în general și celor fixatoare de azot în special. Speciile genului Clostridium sunt răspândite și în solurile viticole afânate, aerisite, soluri în care ele intervin in metabioza cu diferite specii aerobe care consumă oxigenul din sol. Această metabioză este avantajoasă, deoarece bacteriile aerobe consumând oxigenul din imediata apropiere a Clostridiilor nu consumă și hidrogenul molecular, care este strict necesar vieții acestuia. Clostridium, fixând azotul atmosferic îl redă parțial în formă combinată în mediul ambiant, ceea ce îmbunătățește condițiile de existență a bacteriilor aerobe. Toleranțe față de oxigen și metabioza cu bacteriile aerobe fac din Clostridium un fixator de azot mai răspândit decât Azotobacter.Azotobacter chroococcum fixeaza azotul liber din atmosfera pe baza resurselor energetice existente in sol, contracareaza microorganismele patogene din sol, mobilizeaza fosfatii, asimileaza si valorifica exudatele radiculare si sintetizeaza fitohormoni.Asadar , efectul stimulator nu este doar o consecinta a fixarii de azot atmosferic , ci si a sintezei de compusi antibacterieni, antifungici, stimulatori de crestere (auxine, gibereline, citochinine, siderofori si fitohormoni ).

Dinamica germenilor fixatori de azot anaerobi in probele de sol viticol

Tabel 4.2

Figura 4.3. Dinamica sezonieră a germenilor fixatori de azot anaerobi – la 7 zile

Figura 4.4. Dinamica sezonieră a germenilor fixatori de azot anaerobi – la 15 zile

4.3.3. Dinamica microorganismelor amonificatoare în solurile viticole

Amonificarea este procesul prin care substanțele organice cu azot sunt descompuse de către microorganisme până la amoniac. Acest proces este realizat de către microorganismele heterotrofe, dar în primul rând de câtre bacteriile amonificatoare și apoi de către alte grupe sistematice.

Din rezultatele consemnate în tabelul 4.3. reiese că dintre grupele ecologice de microorganisme care participă la realizarea circuitului azotului în sol, cel al amonificatorilor este cel mai bine reprezentat.

Luând de asemenea în considerație faptul ca microflora amonificatoare reflectă în realitate microflora totală, rezultatele prezentate se referă de fapt la încărcarea microbiană heterotrofă totală a probelor de sol recoltate.

Numărul microorganismelor amonificatoare în cele trei probe de sol variază între 254 · 108 – 265 · 108 bacterii /g sol uscat în martie, între 282 · 108 – 295 · 108 bacterii în noiembrie și 265·106 – 292 ·106 în august. Nu sunt diferențe semnificative în numărul de amonificatori între perioadele toamnă + primăvară (noiembrie și martie); pe timpul verii scăderea ușoară a numărului acestor microorganisme se poate atribui în primul rând variației sezoniere, vara numărul de microorganisme scade întotdeauna și în al doilea rând secetei din perioada respectivă și poate unor eventuale dezechilibre ecologice.

Literatura de specialitate consemnează suficiente date cu privire la scăderea numărului de microorganisme sub influența pesticidelor. Exista deci o variație sezonieră a acestei microflore amonificatoare, variație consemnată în toată literatura de specialitate pentru microflora solului în general, care menționează o creștere semnificativă a microorganismelor din sol toamna și primăvara.

În cazul probelor analizate de sol viticol, creșterea numerică a amonificatorilor în luma noiembrie se datorează acumulării unei cantități mai mari de materie organică, iar în martie, lună de primăvară creșterea se datorează creșterii temperaturii solului și aerului.

Număr microorganisme amonificatoare/g sol uscat

Tabel 4.3.

Figura 4.5. Dinamica organismelor amonificatoare

Amonificarea reprezintă, așadar, prima faza in derularea circuitului azotului, ca proces de degradare a substantelor proteice vegetale si animale de catre organismele proteolitice:

– specii bacteriene aerobe: Bacillus subtilis, B.cereus, B.mesentericus, B.megaterium, B.anthracis, Pseudomonas fluorescens, Sarcina lutea;

– specii bacteriene anaerobe: Clostridium putrificum, Cl.sporogenes, Cl.tetani, Cl.perfringens;

– specii bacteriene facultativ anaerobe: Proteus vulgaris;

– ciuperci amonificatoare din genurile: Thricoderma, Oidium, Monilia, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Botrytis.

Amonificatori deosebit de activi sunt Proteus vulgaris, Bacillus mycoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida si Clostridium putrificum.

Descompunerea insasi este realizata de ectoenzime (proteaze, in cazul proteinelor, proteinaze, in cazul peptidelor, peptidaze) prin decarboxilarea aminoacizilor sau prin dezaminarea reducatoare sau oxidativa si scindarea grupelor amino, azotul aminic trecand in azot amoniacal.

Procesul de amonificare s-a dovedit mai intens in special in perioada cu temperaturi optime pentru metabolismul bacteriilor amonificatoare, de 25-30oC, cand si incorporarile repetate de material organic in sol par sa favorizeze efectul de activare a bacteriilor – priming effect.

4.3.4. Dinamica microorganismelor nitrificatoare în solurile viticole

Nitrificarea eate un proces microbiolgic direct corelat cu productivitatea solului, un indiciu important în aprecierea fertilității lui și mult influențat de factorii de mediu: umiditate, temperatură, pH, aerare, etc.

Amoniacul produs prin procesul de amonificare se acumuleaza doar in solurile acide sau slab aerate. In general, amoniacul sufera in continuare procesele de oxidare la azot nitric, prin procesul de nitrificare, sub incidenta bacteriilor nitrificatoare strict aerobe, reunite in familia Nitrobacteraceae. L.Pasteur mentiona pentru prima data in anul 1864 ca azotatii se formeaza prin actiunea bacteriilor din sol.

Procesul nitrificarii se desfasoara etapizat, de catre doua grupe de bacterii ce actioneaza metabolic, grupa nitrit- (genurile Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosospira, autotrofe si aerobe) si grupa nitrat-bacteriilor (genul Nitrobacter), cu precadere in straturile superficiale de sol, bine aerisite, pana la 20 cm adancime.

Din determinările microbiologice obținute pe probele de sol viticol se constata ca intensitatea nitrificarii, cu formare de azotati accesibili vitei de vie este maxima primavara și toamna. Astfel, probele prelevate în luna noiembrie 2013 indică pentru bacteriile nitroase, respectiv cele care oxidează amoniacul la azotit valori ale acestora care oscilează între 265 – 449 bacterii / g sol uscat, iar pentru bacteriile nitrice, cele care oxidează mai departe azotitul la azotat, valori între 35 – 1840 bacterii / g sol uscat.

Ca și procesul de amonificare, cel de nitrificare este supus unor condiții ecologice locale (pH, umiditate, aerare etc.). Analizele efectuate în luna martie 2014 evidențiază faptul că valorile microflorei nitrificatoare sunt ușor crescute față de luna noiembrie. Valoric aceasta variază între 254 – 480 bacterii g / sol uscat în cazul bacteriilor nitroase și între 265 – 150.000 bacteri / sol uscat în cazul bacteriilor nitrice.

În schimb, în luna august se observă o scădere a numărului bacteriilor nitrificatoare. Astfel, numărul de bacterii nitroase este între 236 – 294 bacterii g / sol uscat, iar al bacteriilor nitrice între 65 – 246 bacterii g / sol uscat. Aceasta scădere se poate pune pe seama condițiilor climaterice (temperaturi ridicate, de 35° C, umiditate ) din luna august, dar mai ales pe seama stării de întreținere diferită a plantațiilor viticole luate ăn studiu. Oxidarea microbiologică a amoniacului este strans dependenta, de asemenea, de reactia solului (pH optim = 6,7 – 7,8, la pH < 5 se opreste), de umiditate (optim de 40 – 70%) si de temperatura (25 – 35oC). Scaderea temperaturii sub 5 – 100C determina, de asemenea, blocarea procesului de transformare a amoniacului in nitrati.

Variația numărului de microorganisme nitrificatoare

Tabel 4.4.

Figura 4.5. Dinamica nitritbacteriilor la 20 de zile

Figura 4.5. Dinamica nitratbacteriilor la 20 de zile

4.3.5. Dinamica microorganismelor denitrificatoare în solurile viticole

Utilizarea nitraților care se formează în sol este multiplă. Partea cea mai mare este consumată de plantele superioare. O parte este levigată, iar altă parte este transformată de microorganismele din sol.

Denitrificarea este un alt proces important din circuitul azotului în sol, ca proces de respiratie realizat pe calea unei reduceri dezasimilatorii, prin care speciile bacteriene facultative (Aerobacter aerogenes) si obligate (Micrococcus denitrificans, Bacterium denitrificans, Vibrio denitrificans etc) utilizeaza nitratii sau alti compusi oxigenati ai azotului mineral ca acceptori finali de hidrogen.

Procesul de denitrificare determinat de microflora specifică în probele de sol prelevate în lunile august, noiembrie și martie este consemnat în tabelul 4.5.

Din analiza datelor înscrise în tabel, cât și pe baza graficelor de activitate biologică trasate, se desprind următoarele aspecte:

în luna noiembrie citirea finală de la 21 de zile după însămânțarea probelor evidențiază faptul ca microflora denitrificatoare în toate cele trei probe de sol este bine reprezentată și oscilează între 165 · 105 – 194 · 105 bacterii / g sol uscat.

în luna martie, microflora denitrificatoare este prezentă la valori destul de apropiate de cele consemnate în noiembrie fiind cuprinsă între 157 · 105 – 171 · 105.

în luna august, microflora este prezentă în toate probele de sol cercetate dar la valori mai mici, numărul de germeni denitrificatori este cuprins între 1.830.000 – 1.950.000 bacterii / g sol uscat.

Nr. microorganisme denitrificatoare /g sol uscat

Tabel 4.5

Procesul de denitrificare este, așasar, favorizat de umiditate, prin efectul antagonist al apei fata de aer, dar chiar la un continut egal de oxigen, denitrificarea crescând atunci când solul este umed, prin împiedicarea liberei circulații a aerului in sol.

Figura 4.6. Dinamica organismelor denifricatoare la 21 zile

Concluzii și recomandări

1. Importanța prezenței microorganismelor în sol este dată de faptul că:

protozoarele limitează numărul altor organisme, stimulează activitățile de fixare a azotului molecular, descompun activ celuloza, descompun humusul.

ciupercile au rol în celobioliza și ligninoliza resturilor vegetale; condiționează interrelațiile între microorganismele din sol și între plantele superioare; condiționează proprietățile humusului.

algele mineralizează sau humifică substanța minerală; rol în procesul de pedogeneză; îmbogățesc solul cu oxigen rezultat din fotosinteză.

virusurile influențează capacitatea humusului și a argilelor de a absorbi și imobiliza particulele virale .

2. Microflora totală a solului , sub incidența sistemelor de întreținere aplicate prezintă variații sezoniere, fiind influențată pozitiv de sistemele biologic și manual, diminuîndu-se în cazul utilizării monoculturii prin dezerbare chimică.

3. Microflora telurică este inflentata diferit de sistemele de intretinere:

• bacteriile amonificatoare sunt stimulate de înierbarea naturală.

• bacteriile nitrificatoare acționează cel mai intens în producerea de azotați accesibili vitei de vie în cazul întreținerii biologice și manuala a solului;

• bacteriile denitrificatoare prezintă activitate redusă în toate variantele studiate de întreținere a solului;

• fixarea aerobă bacteriană a azotului molecular atmosferic este puternic reprezentată numeric în varianta înierbată natural

• fixarea anaerobă bacteriană a azotului molecular atmosferic profită de prezența unei cantități suplimentare de materie organică în varianta înierbată natural, unde realizează simbioze asociative în spațiul rizosferic .

4. Prezentarea singulară a rezultatelor numerice privind microflora telurică este suficientă doar pentru o caracterizare biologică a unui tip de sol, doar la un moment dat; aceasta constatare trebuie imbinata, insa, cu parametrii calitativi pedologici si agrochimici, pentru evaluarea starii de fertilitate a unui sol.

5. Determinarile propuse se bazeaza pe reducerea in put-urilor mecanice si chimice, pe reevaluarea rolului florei microbiene din exploatatiile viticole, intr-o optica ce vizeaza o productie de calitate, o diminuare a costurilor si o respectare a mediului inconjurator.

Bibliografie

Muller G. -„Biologia solului" , Ed. Agosilvică , București 1965.

Papacostea P.-„Biologia solului" , Ed. Științifică și Enciclopedică ,

București 1967.

Popa Daniela, Coyne Mark (SUA), – Soil Microbiology. The life beneath your feet, Instant Publisher.com, U.S.A., 2007

Ștefanic Gh.-„Microbiologia solului" , Universitatea de Științe agricole ,

București 1990.

Ștefanic Gh.-„Metode de analiză enzimatică și chimică a solului, București

1993 , Reprografia USAMV-București.

Stefanic Gh.Sandoiu D.I,Gheorghita Niculina – ’’Biologia Solurilor Agricole, Ed.Elisavaros Bucuresti, 2006.

Zarnea G. -„Tratat de microbiologie generală" , voi. 5 , Ed. Academiei

Române , București 1994.

Florea N. (2003) – Degradarea,protecția și ameliorarea solurilor și

terenurtilor,București

Florea N.,P.Ignat (2007) – Despre calitatea solului și evaluarea acesteia.

Gheorghiță Niculina (2006) – Fertilitatea solului,o noțiune perimată? Stiința Solului

CATHERINE DE SILGUY,( 1994)- L agriculture biologique

www.wikipedia.com

www.anpm.ro

www.scrigroup.com

www.icpa.ro

www.regie-live.ro

Concluzii

Cercetările realizate în cadru prezentei lucrări atât în domeniul teoretic cât și în cel practic și rezultatele obținute permit formularea unor concluzii generale:

Solul reprezintă elementul de legătura dintre regnul mineral și regnul vegetal, situându-se în poziția de granița dintre neviu și viu. Fiind format din numeroase substanțe organice și anorganice , reprezintă mediul de creștere, multiplicare și degradare a plantelor, asigurând din toate aceste puncte de vedere suportul fizic , chimic și biologic.

Esența noțiunii de calitate a mediului constă în integrarea deopotrivă a însușirilor native (capacitatea de a funcționa în interiorul granițelor unui ecosistem pentru susținerea productivității biologice, menținerea calității mediului și asigurarea sănătății viețuitoarelor și habitatului) și a însușirilor dobândite în urma intervențiilor antropice.

Alături de parametrii fizici și chimici, parametrii biologici sunt definitorii pentru caracterizarea unui tip de sol , având în vedere faptul că solul reprezintă mediul de existență pentru foarte multe viețuitoare, variate ca formă, dimensiuni, apartenență sistematică sau activitate biochimică, între ele stabilindu-se relații deosebit de complexe.

Deosebit de importantă pentru caracterizarea solului din punct de vedere calitativ este evaluarea microbiotei implicată în realizarea circuitului azotului în natură, incluzând aici microflora fixatoare de azot, amonificatoare, nitrificatoare și denitrificatoare.

În cadrul cercetării practice a fost studiată o plantație de viță de vie, atât din punctul de vedere al condițiilor naturale ( poziție geografică și condiții oferite de aceasta), cât și din punctul de vedere al lucrărilor antropice realizate la nivelul ei.

A fost studiată influența lucrărilor agricole de aerare a solului, a umidității relative, precum și a administrării de substanțe fertilizatoare naturale și industriale, asupra numărului de microorganisme de la nivelul solului, a activității lor enzimatice și asupra calității generale a plantației. Rezultatele prezentate vizează atât efectul acestora asupra microbiotei în general, dar în special asupra microorganismelor cu rol în realizarea circuitului azotului în natură.

Rezultatele obținute sugerează faptul că măsurile de îngrijire a solului plantației și a plantației în general urmăresc menținerea unui raport beneficiu pe termen scurt/ beneficiu pe termen scurt la o valoare care să asigure calitatea solului ca factor indispensabil obținerii unei culturi profitabile.

BIBLIOGRAFIE

G. Zarnea, Microbiologie, EDP, București, 1963;

Popa Aurel, Popa Daniela, Microbiologie, Craiova 1997;

Fedorov M. V., Microbiologia solului, Editura agrosilvică de stat, 1957;

Ardelean A., Mohan Gh., Experimentul biologic, Ed. Victor Babeș, 2008;

Subba Rao, Soil microbiology, Science publishers, 2001;

Allen, Experiments in soil microbiology, 1949;

Administrația Națională de Meteorologie, 2008, Clima României, Editura Academiei Române, București;

Borlan Z., Hera C., 1973, Metode de apreciere a stării de fertilitate a solului în vederea folosirii raționale a îngrășămintelor, Editura Ceres, București;

Dincă D., 1982, Asolamentele agriculturii moderne, Editura Ceres, București;

Kandeler E., 2007, Physiological and biochemical methods ;

Neacșu P., Olteanu I., Olteanu E.G., 2000, Ecologie și protecția juridică a mediului, Editura Universitaria, Craiova;

BIBLIOGRAFIE

G. Zarnea, Microbiologie, EDP, București, 1963;

Popa Aurel, Popa Daniela, Microbiologie, Craiova 1997;

Fedorov M. V., Microbiologia solului, Editura agrosilvică de stat, 1957;

Ardelean A., Mohan Gh., Experimentul biologic, Ed. Victor Babeș, 2008;

Subba Rao, Soil microbiology, Science publishers, 2001;

Allen, Experiments in soil microbiology, 1949;

Administrația Națională de Meteorologie, 2008, Clima României, Editura Academiei Române, București;

Borlan Z., Hera C., 1973, Metode de apreciere a stării de fertilitate a solului în vederea folosirii raționale a îngrășămintelor, Editura Ceres, București;

Dincă D., 1982, Asolamentele agriculturii moderne, Editura Ceres, București;

Kandeler E., 2007, Physiological and biochemical methods ;

Neacșu P., Olteanu I., Olteanu E.G., 2000, Ecologie și protecția juridică a mediului, Editura Universitaria, Craiova;