Microbiologie Generala 1 2 Bio [309413]
[anonimizat] • 2018
© Copyright 2018
Toate drepturile rezervate. Nici o parte din această lucrare nu poate fi reprodusă sub nici o formă, [anonimizat]-o [anonimizat], [anonimizat].
[anonimizat]:
Prof. dr. [anonimizat]. dr. [anonimizat]-[anonimizat].3, 400372 Cluj-Napoca
Tel. 0264-596384
Fax. 0264-593792
E-mail: eap@usamvcluj.[anonimizat] – este fundamentală pentru desăvârșirea profilului unui biolog.
Lucrarea de față răspunde exigențelor de a reda, într-o [anonimizat].
[anonimizat], reprezentând un punct de plecare pentru înțelegerea tuturor proceselor microbiologice care au loc în plantă și ecosistemele terestre și acvatice.
Dată fiind specificitatea domeniului se abordează atât elemente de microbiologie generală precum: [anonimizat]: [anonimizat]. Se alocă un spațiu considerabil metodelor de utilizare a [anonimizat], monitorizarea ecosistemelor acvatice și modelarea dinamicilor resurselor microbiene în ecosisteme.
Autorii
CUPRINS
CUVÂNT ÎNAINTE 3
1. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE 9
1.1 Organizarea laboratorului 9
1.2 Dotarea laboratorului 10
1.3 Norme specifice în laboratoarele de microbiologie 14
2 METODE DE STERILIZARE ÎN MICROBIOLOGIE 17
2.1 Sterilizarea prin agenți fizici 17
2.1.1 Sterilizarea prin căldură 17
2.1.2 Sterilizarea prin filtrare 24
2.1.3 Sterilizarea prin raze (radiații) ultraviolete 26
2.1.4 Sterilizarea prin ultrasunete 27
2.2 Sterilizarea prin agenți chimici 27
3 TEHNICI DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR 35
3.1 Mediul de cultură ca substrat nutritiv 35
3.2 Clasificarea mediilor de cultură 39
3.3 Factorii care influențează dezvoltarea culturilor microbiene 41
3.3.1 Temperatura 41
3.3.2 pH-ul 44
3.3.3 Nivelul oxigenului 45
4 TEHNICI DE ÎNSĂMÂNȚARE A MEDIILOR DE CULTURĂ 49
4.1 Însămânțarea pe medii cu agar înclinat 50
4.2 Însămânțarea pe medii lichide 55
4.3 Însămânțarea prin înțepare 57
4.4 Însămânțarea în plăci Petri 57
5 STUDIUL CARACTERELOR CULTURALE ALE MICROORGANISMELOR ȘI IZOLAREA ÎN CULTURI PURE 65
5.1 Studiul caracterelor culturale ale microorganismelor 65
5.2 Metoda diluțiilor seriale 68
5.3 Metoda diseminării pe suprafața mediului 72
6 EXAMENUL MICROSCOPIC AL CARACTERELOR MORFOLOGICE ȘI TINCTORIALE ALE MICROORGANISMELOR 79
6.1 Examenul microorganismelor în preparate proaspete 79
6.2 Examinarea microorganismelor în preparate de durată 83
6.2.1 Colorarea simplă 84
6.2.2 Colorarea Gram sau colorarea diferențială 89
6.2.3 Colorări speciale 94
7 METODE DE CUANTIFICARE A CELULELOR MICROBIENE 105
7.1 Metoda culturilor în plăci Petri 105
7.2 Determinarea celui mai probabil număr de microorganisme 109
7.3 Metode estimative de determinare a numărului de celule 114
8 DETERMINAREA RESPIRAȚIEI SOLULUI ȘI A BIOMASEI MICROBIENE 117
8.1 Metoda respirației indusă de substrat 118
8.2 Metoda prin fumigare-extracție 119
9 SIMBIOZE MICORIZIENE VEZICULAR-ARBUSCULARE 125
9.1 Taxonomia fungilor micorizieni vezicular-arbusculari 126
9.2 Determinarea nivelului de colonizare a sistemelor radiculare 128
9.3 Extracția și analiza sporilor micorizieni 135
10 MICROBIOLOGIA SOLULUI – IZOLAREA MICROORGANISMELOR DIN RIZOSFERĂ 143
10.1 Rizosfera plantelor de cultură 143
10.2 Selecția și izolarea microflorei din sol. 153
11 CIRCUITUL MICROBIAN AL CARBONULUI – TRANSFORMĂRI ALE MATERIEI ORGANICE ÎN ECOSISTEME 161
12 MICROORGANISME IMPLICATE ÎN CIRCUITUL AZOTULUI 167
12.1 Procese de amonificare 168
12.2 Procese de nitrificare 173
12.3 Procese de denitrificare 175
13 FIXAREA SIMBIOTICĂ ȘI NESIMBIOTICĂ A AZOTULUI 179
13.1 Bacterii fixatoare de azot non-simbiotic 179
13.2 Cianobacterii fixatoare de azot 185
13.3 Studiul bacteriilor fixatoare de azot în mod simbiotic 193
14 ROLUL MICROORGANISMELOR ÎN CREȘTEREA ȘI DEZVOLTAREA PLANTELOR 205
15 REACȚIA MICROORGANISMELOR LA INPUTURI ȘI PERTURBĂRI 211
16 DIVERSITATEA MICROBIANĂ A ECOSISTEMELOR ACVATICE 225
16.1 Microflora apelor 226
16.2 Microflora patogenă și dăunătoare a apei 227
17 DIVERSITATEA MICROBIANĂ A ECOSISTEMELOR TERESTRE 235
17.1 Bacterii și actinomicete 235
17.2 Fungi 240
17.3 Alge 243
18 MONITORIZAREA MICROBIANĂ A ECOSISTEMELOR 247
18.1 Conceptul de bioindicator 247
18.2 Analiza perturbărilor cu ajutorul biondicatorilor 248
18.3 Prognoza stres-urilor și a efectelor toxice 253
18.4 Evaluarea ecotoxicității 254
18.5 Indicatori microbiologici generali 257
18.6 Indicatori microbieni ai calității aerului 261
18.7 Algele ca indicatori în biomonitorizarea ecosistemelor acvatice 265
18.8 Indici specifici pentru lacuri și lacuri de acumulare 271
19 BIOPREPARATE MICROBIENE – ROL ÎN CREȘTEREA ȘI DEZVOLTAREA PLANTELOR 275
20 FERMENTAȚII 281
20.1 FERMENTAȚIA ALCOOLICĂ 281
20.2 FERMENTAȚIA LACTICĂ 289
20.3 FERMENTAȚIA ACETICĂ 294
BIBLIOGRAFIE 301
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
Microbiologia este o știință care se ocupă cu structura, funcția și utilizările organismelor microscopice, cum ar fi virusuri, bacterii, ciuperci, alge și protozoare, fiind o ramură specializată a științelor vieții. Microorganismele există peste tot în jurul nostru și joacă un rol vital în ecologia vieții pe Pământ.
Destinația laboratorului pe care îl descriem este adaptată cerințelor microbiologiei agricole, servind pentru activitățile didactice și de cercetare.
Organizarea laboratorului
Echipamentele și racordurile la rețele sunt poziționate astfel încât să creeze un flux continuu al instrumentarului de laborator și al mediilor de cultură cu un minim de manipulare.
Orientarea optimă a laboratorului de microbiologie este către nord sau nord-est, încăperile fiind protejate de lumina solară prin jaluzele, storuri sau rulouri. Pereții vor fi acoperiți cu faianță sau produse lavabile, iar pardoseala cu gresie, linoleum sau vopsea epoxidică pentru a ușura spălarea și dezinfectarea.
Mesele de lucru vor fi conectate la rețeaua de curent, gaz, apă și canalizare, fiind acoperite cu faianță, sticlă sau material plastic, pentru a fi ușor curățate și dezinfectate. Celelalte elemente de mobilier vor fi compuse din dulapuri simple (metal sau lemn) și scaune rotative, cu înălțimea reglabilă.
Sterilizarea aerului din încăperi se va face cu raze ultraviolete.
Dotarea laboratorului
Microbiologia necesită, ca și în toate celelalte științe, o serie de echipamente de bază: instrumente și aparatură specifice, sticlărie de laborator, etc. În cele ce urmează se prezintă o listă de cerințe necesare unui microbiolog în laboratorul său pentru examinare microscopica, izolarea sau cultivarea și identificarea unui microorganism, precum și pentru studiul structurii, funcției și aplicațiilor la care se pretează.
Aparatura de laborator (fig. 1.):
Becuri de gaz Bunsen – utilizate pentru sterilizarea anselor, încălzirea mediilor de cultură, efectuarea frotiurilor;
Microscoape și ulei de imersie;
Aparat pentru distilarea apei;
Hote cu flux laminar – este utilizată pentru a reduce pericolul de infecție pe durata lucrului cu microorganisme infecțioase și pentru a preveni contaminarea materialelor sterile;
Baie de apă – pentru menținerea în stare lichidă a anumitor medii de cultură, respectiv pentru sterilizare prin pasteurizare și tindalizarea unor medii de cultură ușor degradabile la temperaturi ridicate;
Aparate pentru vid;
Aparate pentru filtrare;
Agitator mecanic – pentru omogenizarea mediilor de cultură și suspensiilor microbiene;
Balanțe analitice și tehnice;
Centrifugă – destinată limpezirii unor suspensii de particule de sol sau la concentrarea microorganismelor dintr-o suspensie;
Etuve – pentru sterilizarea prin căldură uscată a unei părți din sticlăria de laborator și a instrumentelor metalice.
Autoclav pentru sterilizarea prin căldură umedă;
Preparator medii de cultură și dozator automat;
pH-metru – necesar pentru corectarea reacției mediilor de cultură;
Frigidere și congelatoare – pentru păstrarea și conservarea mediilor de cultură, respectiv a unor culturi de microorganisme;
Termostate – pentru cultivarea microorganismelor.
Instrumente și materiale de laborator (fig. 2.):
Anse cu fir de platină, crom-nichel sau nichelină;
Recipiente cu capac pentru păstrarea până la sterilizare a materialelor infectate;
Coșuri metalice pentru introducerea în autoclav a materialelor și sticlăriei destinate sterilizării;
Instrumente metalice: bisturie, cleme, pensete, linguri metalice, spatule etc.;
Lămpi cu alcool – pentru prepararea frotiurilor;
Lupe cu diferite puteri de mărire;
Termometre de tipuri și scări de temperatură diferite;
Stative pentru eprubete;
Cutii pentru preparate microscopice;
Trepiede și suporturi pentru pâlnii, biurete și uscarea sticlăriei;
Sticlărie de laborator (fig. 3.):
Plăci Petri și sticle Roux;
Baloane Erlenmayer;
Lame și lamele pentru microscopie;
Lame cu godeu – pentru vizualizarea la microscop în “picătură suspendată” ;
Tuburi de fermentare Durham;
Pahare și pâlnii de diverse mărimi;
Biurete gradate;
Pipete gradate;
Flacoane picurătoare pentru agenți de colorare;
Sticle cu dop filetat pentru reactivi;
Mojare și pistiluri din porțelan;
Eprubete de diferite dimensiuni;
Cilindri gradați;
Exicatoare – pentru realizarea unor spații cu vid.
Norme specifice în laboratoarele de microbiologie
Există câteva reguli care trebuie respectate pentru finalizarea cu succes a exercițiului de laborator, siguranța personală și confortul de alte persoane care lucrează în laborator:
Purtați întotdeauna un halat de laborator curat și dezinfectat înainte de intrarea în laborator pentru protejarea hainelor de contaminare sau de colorări accidentale cu diferite soluții. Pentru anumite lucrări speciale se vor utiliza mănuși, ochelari sau măști.
Este necesară spălarea mâinilor cu apă și săpun și dezinfectarea cu alcool înainte și după terminarea lucrului în laborator.
Este interzis să se mănânce și să se consume lichide în laborator.
Este recomandată prinderea părului lung, pentru evitarea contaminării culturilor.
Înainte și după fiecare perioadă petrecută în laborator este necesară curățarea mesei de lucru cu un dezinfectant.
Pe masa de lucru se vor ține doar echipamentul de laborator și caietele de lucrări practice.
În cazul vărsării unei culturi microbiene este obligatorie dezinfectarea suprafeței de lucru. Toate culturilor microbiene vor fi tratate ca fiind potențial patogene.
Se interzice lăsarea deschisă a echipamentelor cu flacără în cazul în care nu sunt folosite.
Deșeurile de hârtie și sticlăria contaminată se vor depozita în recipiente speciale, prevăzute pentru aceste acțiuni.
Tuburile și eprubetele cu culturi microbiene se vor păstra într-o poziție verticală, într-un suport sau coș.
Înainte de începerea experimentelor este necesară familiarizarea cu cerințele specifice ale acestora.
Toate plăcile Petri, eprubetele și culturile se vor eticheta în mod corespunzător înainte de începerea experimentelor.
Microscopul se păstrează curat pe tot parcursul experimentelor, fiind curățat după fiecare etapă de utilizare.
Este interzisă folosirea telefonului pe toată perioada desfășurării lucrărilor de laborator.
În caz de accidente se acordă primul ajutor și se anunță medicul.
METODE DE STERILIZARE ÎN MICROBIOLOGIE
Microorganismele s-au adaptat la marea diversitate a habitatelor pe care Pământul le oferă, fiind prezente chiar și în condiții severe de temperatură, umiditate, presiune și lumină. Pentru microorganismele care, în mod normal, sunt rezistente la astfel de condiții fizice extreme, încercările de sterilizare pe care le vom face vor avea un efect redus. Din fericire, marea majoritate a microorganismelor care trebuie sterilizate nu sunt adaptate la astfel de extreme și controlul se face cu ușurință prin schimbări bruște în mediul la care sunt expuse. Cel mai proeminent dintre agenții fizici de sterilizare este căldura. Alți agenți mai puțin utilizați pe scară largă sunt radiațiile, filtrarea și undele ultrasonice. Din categoria agenților chimici fac parte substanțele cu acțiune antiseptică sau dezinfectantă.
Sterilizarea prin agenți fizici
Sterilizarea prin căldură
Căldura este cel mai fiabil și, în general, preferat, agent de sterilizare, reușind să ajungă la organisme care pot fi protejate de acțiunea agenților chimici sau a radiațiilor. Sterilizarea poate fi efectuată fie prin căldură uscată, fie prin căldură umedă. Acțiunea letală a căldurii se datorează în mare măsură denaturării proteinelor microbiene și acizilor nucleici, respectiv a labilității membranelor.
Temperaturile ridicate (peste nivelul maxim admis de microorganisme) au un efect antimicrobian, spre deosebire de temperaturile scăzute (sub nivelul minim) care tind să aibă efecte inhibitoare sau microbiostatice. Cele două forme fizice ale căldurii utilizate în sterilizare sunt: umedă și uscată. Căldură umedă este folosită sub formă de apă caldă, apă fiartă sau abur (apă vaporizată). În practică, de obicei, temperatura de sterilizare cu căldură umedă variază de la 60° până la . Căldură uscată este reprezentată de aer cald cu un conținut scăzut de umiditate, în practică temperatura variind de la până la câteva mii de grade Celsius.
Căldura uscată nu este folosită pe scară largă, comparativ cu căldura umedă (abur), dar are o serie de aplicații importante în sterilizare. Temperaturile și timpii utilizați în sterilizarea pe bază de căldură uscată variază în funcție de specificul metodei și sunt, în general, mai mari decât la sterilizarea prin căldură umedă.
Incinerarea în flacără este, probabil, cea mai exigentă metodă dintre toate tratamentele termice. Flacăra unui Bec de gaz Bunsen atinge , la punctul cel mai ridicat, în timp ce furnalele/incineratoarele funcționează la temperaturi de 800° – . Prin expunerea directă la o astfel de căldură orice materie se aprinde, atât microorganismele cât și substanțele fiind reduse la cenușă și gaze.
Incinerarea probelor microbiene de pe anse și ace de însămânțare cu ajutorul unui Bec Bunsen este o practică foarte comună în laboratorul de microbiologie. Această metodă este rapidă și eficientă, dar este, de asemenea, limitată la ustensilele de metal și sticlă rezistente la căldură. Pentru sterilizarea anselor și acelor de însămânțare se pot utiliza incineratoare (fig. 4.).
Etuvele (fig. 4.) oferă un alt mijloc de sterilizare bazat pe expunerea la căldură uscată. Acest tip de aparatură este, de obicei electric (ocazional pe gaz) și este compus dintr-o serie de bobine, care radiază căldură într-un compartiment închis. Transferul de căldură la materialele supuse sterilizării se face prin circularea aerului încălzit în compartimentul etuvei.
Sterilizarea necesită expunerea la 150° – , timp de 2 până la 4 ore, ceea ce asigură o încălzire completă a materialelor și distrugerea sporilor.
Etuvele sunt folosite pentru instrumentele care nu se sterilizează bine cu căldură umedă. Instrumentele adecvate pentru sterilizarea în etuvă sunt din sticlă, metalice, iar substanțele pot fi pulberi sau uleiuri prin care aburul nu pătrunde suficient de bine.
Această metodă nu este potrivită pentru materiale plastice, bumbac și hârtie, care pot arde la temperaturi ridicate, sau în cazul soluțiilor, care se usucă. O altă limitare este timpul necesar procesului.
Căldura umedă. Există patru metode de sterilizare cu ajutorul căldurii umede: a) fierbere; b) pasteurizare; c) tindalizare (sterilizare intermitentă) și d) autoclavare (abur sub presiune).
Fierberea este folosită în mod curent pentru sterilizarea instrumentelor metalice. Instrumentele sunt ținute în apă la timp de 30 de minute, asigurând distrugerea unui segment mare de microorganisme. Pentru creșterea temperaturii de fierbere a apei se poate adăuga borax, temperatura ajungând la și împiedicând astfel ruginirea obiectelor sterilizate. Speciile rezistente la temperaturi peste , nu pot fi distruse prin această metodă. Dezavantajul metodei este perioada redusă de sterilitate pe care o asigură, existând posibilitatea de recontaminare a instrumentelor imediat după scoaterea din apă.
Pasteurizarea este o tehnică de sterilizare bazată pe aplicarea căldurii asupra lichidelor pentru distrugerea microorganismelor, dar păstrând nealterați principii activi ai lichidelor. Pasteurizarea poate fi:
– joasă la 60 – , timp de 30 de minute;
– medie la 70 – , timp de 10-20 de minute;
– înaltă la 89 – , câteva secunde.
Este o metodă incompletă deoarece nu distruge sporii, însă răcirea bruscă împiedică germinarea acestora. Se aplică, în general, unor produse alimentare (lapte, bere, sucuri etc.).
Tindalizarea este o metodă de sterilizare intermitentă destinată substanțelor care nu pot rezista la temperaturile ridicate din autoclav. Metoda constă în încălzirea substanțelor destinate sterilizării, câte o oră pe zi, la temperaturi între 56 – într-o baie de apă, timp de trei zile succesiv. Explicația eficienței metodei este aceea că treptat rezistența sporilor, sub influența căldurii, cedează, sau că formele vegetative sunt distruse după ce sporii au germinat în intervalul celor trei zile.
Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune (autoclavarea).
Această metodă este cel mai des folosită fiind cea mai eficientă, realizând o sterilizare completă. În condiții normale temperatura aburilor de apă nu depășește , de aceea principiul metodei se bazează pe creșterea temperaturii aburului prin presurizare într-o incintă închisă.
Acest fenomen se explică prin principiul fizic care guvernează comportamentul gazelor sub presiune. Atunci când un gaz este comprimat, temperatura acestuia crește direct proporțional cu creșterea presiunii.
Când presiunea crește până la 1/2 atmosfere, temperatura va fi de , la 1 atmosferă va fi de , iar la 2 atmosfere temperatura va atinge un nivel de . Distrugerea microorganismelor nu este provocată de presiunea ridicată, ci de temperatura ridicată pe care aceasta o produce.
Aparatul folosit pentru sterilizarea prin vapori sub presiune se numește autoclav. Planul constructiv al acestuia este: un cazan cu pereți groși, rezistenți la presiuni de 3-4 atmosfere, acoperit la partea superioară de un capac care se închide cu ajutorul unor șuruburi speciale (buloane) și etanșeizarea se realizează cu o garnitură de cauciuc.
Construcția aparatului mai include o rețea complexă de supape, traductoare de presiune și temperatură, conducte de reglare și măsurare a presiunii, respectiv conducte pentru introducerea aburului în incintă.
Modul de funcționare al autoclavului
Materialul care urmează să fie autoclavat este plasat pe suporturile din incintă și se fixează bine capacul cu supapa în poziția deschis; în partea inferioară a incintei apa este fiartă (prin intermediul unui element electric intern, sau prin încălzire externă cu gaz) și aburul este evacuat, printr-un ventil din capac, până când tot aerul a fost scos din incintă. În acest punct se închide supapa. Prin continuarea încălzirii apa începe să se vaporizeze, presiunea și temperatura aburului ajungând la nivelul determinat prin reglarea supapei de evacuare a aburului și care va menține presiunea și temperatura necesară a aburului în incintă.
Calitatea aburului este importantă pentru o sterilizare eficientă. Dacă aerul este prezent în timpul operației de autoclavare, temperatura ce corespunde unei anumite presiuni va fi mai mică decât ar fi în absența completă a aerului, astfel, aerul trebuie să fie complet eliminat din incintă, și tot spațiul liber din aceasta trebuie să fie umplut cu abur saturat, la temperatura și presiunea necesară. Aburul saturat este aburul care deține maximum de vapori de apă pentru temperatura și presiunea sa. Aburul saturat efectuează un transfer de căldură optim, deoarece oferă o cantitate mare de căldură latentă când condensează pe obiecte din incinta autoclavului în timpul perioadei de pre-sterilizare (perioada de încălzire a apei). Corelația între presiune și temperatura vaporilor este prezentată în tabelul 1.
La sfârșitul ciclului de sterilizare supapa de admisie a aburului este închisă (sau se închide automat); autoclavul este lăsat să se răcească încet, sau aburul din interiorul incintei poate fi lăsat să scape prin supapa de ieșire, până ce presiunea în incintă este egală cu cea a atmosferei – moment în care capacul poate fi deschis în condiții de siguranță. Când se sterilizează sticle cu lichid, temperatura și presiunea din incintă trebuie lăsate să scadă încet pentru a preveni fierberea și, în consecință, pierderea conținutului și/sau deteriorarea sticlelor. Uneori, un vid parțial este permis să se formeze în incintă, în timpul condensării aburului, acest lucru fiind avantajos, deoarece materialele din incintă sunt supuse unui proces de uscare.
Tabelul 1
Corelația dintre presiunea aburului și temperatura vaporilor
În autoclav se sterilizează culturile care nu mai sunt necesare, sticlăria de laborator, obiectele de cauciuc, aparatele de filtrat din sticlă, porțelan sau metal, mediile de cultură, unele soluții și apa distilată.
Monitorizarea periodică a autoclavării este importantă, pentru controlul procesului fiind utilizate diferite metode de testare:
teste chimice – sunt utilizate substanțe cu punct de topire constant care se introduc în tuburi de sticlă închise la extremități. Substanțele pot fi: acidul oxalic (), benzonaftolul (), floarea de sulf (), chinina () sau acidul benzoic ();
teste biologice – sunt utilizate bacterii sporulate (Bacillus anthracis, Bacillus stearotermophilus, Clostridium botulinum) care după sterilizare se însămânțează pe medii de cultură. În cazul unei bune funcționări a autoclavului, germenii au fost distruși și nu mai cresc pe mediile însămânțate;
teste fizice – sunt utilizate termometre înregistratoare foarte exacte.
Sterilizarea prin filtrare
Filtrarea (fig. 5.) este o metodă eficientă de a elimina microorganismele din aer și lichide. În practică, un fluid este trecut printr-un filtru cu deschideri suficient de mari pentru trecerea fluidului, dar prea mic pentru a permite trecerea microorganismelor. Filtrarea este influențată de vâscozitatea, temperatura și pH-ul soluțiilor, dar și de încărcătura electrică a particulelor și a filtrului. Această metodă se aplică pentru sterilizarea anumitor lichide care se degradează ușor sub acțiunea temperaturilor ridicate.
Din punct de vedere constructiv există mai multe tipuri de filtre:
Filtrele Chamberland – sunt realizate din porțelan, au forma unor lumânări și sunt închise la capătul inferior. La extremitatea liberă au o porțiune impermeabilă din porțelan smălțuit sau sunt prevăzute cu o tetină smălțuită.
Porii filtrelor se notează cu litera L urmată de o cifră de la 1 la 7, L1 fiind filtrul cel mai grosier.
Filtrele Berkefeld sunt fabricate din pământ de infuzorii sau kiselgur. În funcție de dimensiunea porilor, sunt notate cu: W – filtre cu pori mari, V – filtre cu pori medii, N – filtre cu pori intermediari.
Aceste filtre pot fi utilizate în mod repetat, dar trebuie curățate și sterilizate după fiecare utilizare.
Filtrele Seitz sunt constituite din plăci de azbest (sau azbest și celuloză) montate între recipientul cu proba și recipientul de colectare a fluidului filtrat. În funcție de capacitatea de rețienre, sunt notate cu: EK – cu dimensiuni care rețin bacteriile, dar permit trecerea virusurilor, EK1 – cu dimensiuni intermediare, EK2 – cu dimensiuni care rețin și virusurile mari.
Membranele filtrante sunt filtre subțiri din materiale precum: nitroceluloza (colodiu), acetat de celuloză, nylon, policarbonat, politetrafluoretilenă (PTFE, Teflon), sau poliviniliden; dimensiunile porilor – variază între 0,45 microni până la 0,22 microni. (Filtrarea prin membrane cu astfel de pori mici este adesea menționată ca ultrafiltrare). Porii pot fi sinuoși (membrane de tip Gelman- sau Millipore-) sau cilindrici (membrane Nuclepore).
Sterilizarea prin raze (radiații) ultraviolete
Din prisma sterilizării, radiațiile sunt definite ca energia emisă în urma activităților atomice și dispersată la viteză mare prin materie și spațiu. Radiațiile ultraviolete acționează foarte bine asupra formelor vegetative ale majorității microorganismelor, dar au o acțiune slabă asupra sporilor. Efectul de sterilizare apare în urma absorbției specifice a razelor de către anumite grupe moleculare, acestea fiind profund alterate.
Acest tip de sterilizare este utilizat pentru substanțele care se degradează repede prin aplicarea altor metode. O potențială utilizare este pentru sterilizare hotelor cu flux laminar sau a încăperilor, respectiv a apei potabile și a unor medii de cultură (fig. 6.).
Sterilizarea prin ultrasunete
Metoda se bazează pe efectul de perturbare al celulelor de către sunetele de înaltă frecvență (fig. 6.). Aceste frecvențe variază de la 15.000 la mai mult de 200.000 de Hz pe secundă (de la supersonice la ultrasunete). Inducerea de vibrații pe baza ultrasunetelor provoacă schimbări de presiune și creează puncte de turbulențe intense care pot provoca spargerea celulelor din imediata apropiere. Pe lângă efectul perturbator, căldura produsă de valurile sonice (până la ) contribuie la acțiunea de sterilizare.
Sterilizarea prin agenți chimici
În laboratorul de microbiologie sterilizarea se poate efectua și prin folosirea unor substanțe chimice a căror acțiune poate împiedica dezvoltarea microorganismelor într-un mediu de cultură (bacteriostatice sau fungistatice – acțiune dezinfectantă) sau distrugerea lor completă (bactericide, fungicide – acțiune antiseptică).
Alegerea și utilizarea adecvată a agenților chimici cu efect sterilizant este o preocupare constantă în domeniul microbiologiei. Deși practicile actuale de sterilizare chimică variază foarte mult, au fost identificate unele calități de dorit ale agenților chimici:
(1) o acțiune rapidă chiar și în concentrații scăzute;
(2) solubilitatea în apă sau alcool și stabilitatea pe termen lung;
(3) acțiune antimicrobiană cu spectru larg;
(4) penetrarea suprafețelor inerte pentru susținerea acțiunii cumulative sau persistente;
(5) rezistența la inactivare în prezența materiei organice;
(6) lipsa proprietăților corozive sau de colorare;
(7) un preț redus și disponibilitate ridicată.
Din păcate, puțini agenți chimici au efect antiseptic, majoritatea având un efect dezinfectant reducând numărul de microorganisme la un nivel de siguranță sau eliminând formele vegetative ale acestora.
Tipuri de dezinfectanți și substanțe antiseptice:
Alcoolii acționează în mod eficient asupra membranei celulare, dezorganizează structura lipidelor și pot denatura proteinele.
Alcoolii au avantajul unei acțiuni urmate de o evaporare rapidă, fără a lăsa reziduuri.
Cei mai utilizați alcooli sunt alcoolul etilic și izopropilic, în concentrații de 70-90%. Alcoolul etilic pur este mai puțin eficient decât soluțiile apoase (alcool etilic amestecat cu apă), deoarece denaturarea necesită apă. Alcoolul izopropilic este ușor superior alcoolului etilic ca antiseptic și dezinfectant. În plus, este mai puțin volatil și mai puțin costisitor.
Fenolii acționează asupra membranei celulare. În concentrații mari, membranele celulare sunt afectate rapid, iar proteinele inactivate, în concentrații mai mici, au efect de inactivare asupra anumitor sisteme enzimatice critice. Spectrul de acțiune este larg, dar din păcate, toxicitatea ridicată face ca utilizarea acestor substanțe să fie redusă.
Halogenii, în special iodul și clorul, sunt agenți chimici eficienți, atât singuri cât și sub formă de compuși anorganici sau organici.
Iodul (I2) este unul dintre cele mai vechi și mai eficiente antiseptice. Afectează sinteza proteinelor și alterează membranele celulare prin formarea complexelor cu aminoacizi și acizi grași nesaturați.
Clorul (Cl2) și unii derivați ai acestui element (hipocloriții – OCl și cloraminele – NH2Cl) formează un grup de dezinfectanți utilizați pe scară largă. Acidul hipocloros este un agent oxidant puternic care întrerupe funcționarea sistemului enzimatic celular, fiind cea mai eficientă formă a clorului, deoarece este neutră din punct de vedere al sarcinii electrice și difuzează la fel de rapid ca apa prin pereții celulari.
Dezavantajele halogenilor sunt date de proprietățile de corodare a metalului și de colorare a maselor plastice, toxicitatea în cazul ingestiei și faptul că sunt iritanți pentru piele și ochi.
Aldehidele se numără printre cei mai eficienți agenți antimicrobieni. Mecanismul efectului se bazează pe capacitatea de a forma legături cu grupările sulfhidrice și aminice din proteine, rezultând inactivarea proteinelor.
Cele mai cunoscute aldehide sunt Formaldehida și Glutaraldehida.
Formaldehida sub formă de gaz este un dezinfectant excelent. Cu toate acestea este mai des întâlnită sub formă de formalină (soluție de 37% formaldehidă gaz). Acționează asupra celulelor vegetative, asupra fungilor, virusurilor și sporilor.
Glutaraldehida este mai puțin iritantă și mai eficientă ca agent antimicrobian decât formaldehida. Soluția de Glutaraldehidă 2% are efect bactericid în 10 minute, dar efectul sporicid este obținut numai după 3 până la 10 ore.
Agenții oxidanți – peroxidul de hidrogen (H2O2).
Peroxidul de hidrogen se folosește în concentrație de 3% ca și antiseptic. Este un agent oxidant puternic, care se descompune rapid în apă și oxigen. Este util în sterilizarea suprafețelor și încăperilor.
Compușii cuaternari de amoniu sunt incluși în categoria agenților surfactanți, fiind definiți de gruparea NH4 pe care o prezintă în compoziția chimică. Acțiunea lor constă în modificarea permeabilității celulare și pierderea de către celule a constituenților citoplasmatici. Au un efect bun asupra bacteriilor, fungilor și chiar al sporilor. Au avantajul de a fi buni dezinfectați pentru suprafețe, cu o acțiune rapidă și netoxică, dar sunt ineficienți împotriva unor virusuri și spori, iar eficiența depinde de durata de contact.
Sărurile metalelor grele, în special argintul, mercurul și cuprul, au o mare activitate antimicrobiană. Eficiența este dată de capacitatea ionilor de metal de a se combina cu grupările sulfhidrice din proteinele celulare, rezultând denaturarea acestora.
Coloranții, derivați ai trifenilmetanului (exemplu: violet de gențiana sau albastrul de metilen), în concentrații mici pot inhiba sinteza peretelui celular.
Aplicații practice
Obiective:
Se va exersa sterilizarea prin flambare și ardere la roșu, pregătirea instrumentarului metalic și a sticlăriei pentru sterilizare prin autoclavare și căldură uscată. Se va exersa sterilizarea prin filtrare a unor soluții.
EVALUARE
De ce este necesar controlul microbian și care sunt principalii factori care stabilesc selectarea unui anumit agent antimicrobian?
Care sunt modurile de inhibare sau distrugere a microorganismelor de către agenții antimicrobieni?
Ce diferențe există între sterilizare și dezinfecție?
Care este cea mai simplă metodă de a inhiba sau a distruge microorganismele?
Notițe și observații:
Ce efect are căldura uscată comparativ cu cea umedă asupra microorganismelor?
Ultrasunetele și radiațiile sunt metode eficiente de sterilizare? Detaliați.
Halogenii acționează în mod eficient în sterilizarea microorganismelor?
Care sunt metodele cu cel mai puternic efect în controlul microbian?
Notițe și observații:
TEHNICI DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR
În microbiologie mediul este definit astfel: orice preparat lichid sau solid făcut special pentru creșterea, depozitarea sau transportul microorganismelor. Mediile de creștere pentru microorganisme pot fi folosite pentru inițierea unei culturi, pentru înmulțire, sau pentru teste de identificare (aflarea identității unui anumit organism pe baza caracteristicilor de creștere într-un mediu sau în mai multe medii de cultură).
Mediul de cultură ca substrat nutritiv
Cerințele nutriționale ale microorganismelor pot varia de la câțiva compuși anorganici foarte simpli, la o listă complexă de compuși anorganici și organici specifici. Din această cauză, mediile de cultură sunt extrem de variate în ceea ce privește conținutul de elemente nutritive, unele dintre ele fiind special concepute pentru anumite categorii de microorganisme.
Cultivarea microorganismelor depinde de o serie de factori:
disponibilitatea substanțelor nutritive adecvate;
disponibilitatea oxigenului sau al altor gaze;
umiditate și temperatură potrivite;
un pH adecvat;
sterilitatea mediului de cultură.
Pe lângă factorii fizici, un mediu de cultură satisfăcător trebuie să pună la dispoziție microorganismelor surse de:
Apă
Carbon
Azot
Energie
Elemente minerale
Vitamine
Apa. Protoplasma este constituită din 70% până la 85% apă. Apa dintr-un organism unicelular este aflată într-un flux continuu cu apa din mediul în care își duce viața, iar moleculele trec liber din celulă în exterior și din exterior în celulă. În acest mod este creat un sistem de intrare a elementelor nutritive și evacuarea în exterior a secrețiilor și excrețiilor. Toate reacțiile enzimatice și chimice din celulă au loc doar în prezența unei cantități adecvate de apă. Alături de cantitatea suficientă de apă este necesară și o calitate ridicată a acestei ape. Apa de la robinet poate conține concentrații ridicate de ioni de calciu și magneziu, sau fosfați insolubili ai acestor elemente care pot precipita în prezența peptonelor sau a bulionului de carne. Din aceste motiv, este folosită apa distilată la prepararea mediilor de cultură.
Carbonul. Organismele sunt împărțite în două grupuri din perspectiva necesarului pentru carbon.
Microorganismele care pot utiliza carbonul din dioxidul de carbon (CO2) pentru sinteza tuturor compușilor celulari sunt numite autotrofe. Reprezentative sunt bacteriile sulfuroase și nesulfuroase purpurii, sulfobacteriile, ferobacteriile și bacteriile nitrificatoare. Mediile de cultură necesare pentru cultivarea acestei categorii de microorganisme sunt constituite numai din compuși anorganici.
Cealaltă categorie de microorganisme sunt cele dependente de unul sau mai mulți compuși organici pentru asigurarea necesarului de carbon, acestea fiind numite heterotrofe. În plus față de sursele organice de carbon, heterotrofele depind și de existența dioxidului de carbon. În cazul în care acest gaz este complet exclus din mediul lor, creșterea le este mult întârziată. În această categorie intră numeroși saprofiți (bacteriile de fermentație și putrefacție) precum și unele bacterii care pot fi patogene (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, Corynebacterium diphteriae, Salmonella spp. etc.).
Azotul. Este un element esențial care intră în alcătuirea unor macromolecule, proteine și acizi nucleici. Microorganismele autotrofe pot utiliza sursele anorganice de azot, în timp ce heterotrofelor le sunt necesari amino-acizi sau proteine pentru a-și putea satisface necesarul de azot.
Energia (fig.7). Din punct de vederea al cerințelor față de energie microorganismele dotate cu pigmenți capabili să utilizeze energia solară în metabolismul celular sunt denumite fotoautotrofe. Cele mai reprezentative sunt cianobacteriile și algele. În componența mediilor de cultură pentru aceste microorganisme nu sunt incluse componente cu rol de furnizare a energiei.
Microorganismele care nu au capacitatea de a utiliza energia solară, dar sunt capabile să oxideze substanțele anorganice simple pentru obținerea energiei sunt denumite chemoautotrofe (autotrofe chemosintetizatoare). Cele mai reprezentative sunt genurile Nitrobacter, Nitrosomonas, Thiothrix. Substanțele de care au nevoie aceste microorganisme sunt nitrați, nitriți sau sulfuri.
Cea mai mare parte a bacteriilor fac însă parte din categoria chemoheterotrofelor, ceea ce presupune utilizarea unei surse organice de energie, cum ar fi glucoza sau amino-acizii.
Un număr redus de bacterii sunt considerate fotoheterotrofe deoarece dețin pigmenții necesari pentru utilizarea energiei solare, însă necesită o sursă de carbon provenită dintr-un compus organic.
Fig. 7. Diferențierea microorganismelor în funcție de cerințele față de energie
Elemente minerale. Toate microorganismele au nevoie de câteva elemente minerale pentru o creștere normală, cum ar fi sodiul, potasiul, calciul, magneziul, manganul, fierul, zincul, fosforul și cobaltul. În cazul bacteriilor, cerințele față de elementele minerale este foarte redus.
Clasificarea mediilor de cultură
Din punct de vedere al provenienței, mediile de cultură pot fi:
De origine naturală: vegetale (cartof, morcov), animală (lapte, bilă), mediul de extract de sol;
Artificiale sau sintetice (apa peptonată, bulionul nutritiv, geloza, gelatina).
Din punct de vedere al complexității compoziției, mediile de cultură pot fi:
Simple, utilizate în mod uzual pentru cultivarea celor mai multe microorganisme (apa peptonată, bulionul, geloza, gelatina, extractul de sol);
Complexe, utilizate pentru izolarea sau creșterea microorganismelor care nu se dezvoltă pe mediile simple. Aceste medii conțin o sursă de carbon, cu rolul de a intensifica rata de creștere a microorganismelor.
Din punct de vedere al scopului pentru care sunt întrebuițate, mediile de cultură pot fi:
Medii speciale, care permit izolarea anumitor microorganisme dintr-o populație mixtă, pun în evidență anumite caracteristici metabolice ale microorganismelor sau ajută la caracterizarea și identificarea bacteriilor.
Medii de îmbogățire, conțin anumiți factori de creștere care sunt capabili să favorizeze dezvoltarea anumitor specii microbiene aflate în concentrații reduse în produse cu floră asociată (ex. mediile Müller-Kauffmann, Leifson, Chapman etc.)
Medii selective, conțin substanțe cu efect bacteriostatic asupra unor grupe de bacterii, dar permit creșterea altora, facilitând izolarea bacteriilor (ex. mediile Istrati-Meitert, Levine, Endo, Löwenstein etc.)
Mediile diferențiale sunt destinate diferențierii grupelor de microorganisme pe baza unor caractere morfologice și biochimice. Diferențierea apare ca variații în mărimea, culoarea coloniilor sau modificări ale mediului din jurul coloniilor. Aceste variații provin în urma reacției microorganismelor la diferiți compuși ai mediului de cultură (ex. mediile Hins, Drigalski, Fergussen, Clark-Lubs, EMB – eozină și albastru de metilen, Manitol sare agar, MacConkey-agar).
Pentru solidificarea mediilor de cultură se poate utiliza:
Agar-agarul – este un polizaharid obținut din alge ale genului Gelidium, lipsit de valoare nutritivă. În stare purificată se prezintă sub formă de pulbere sau fibre, fiind adăugat în mediile de cultură în proporție de 0,5 – 2,0 %. Fibrele tăiate în bucăți se lichefiază în apă fierbinte 80- și constituie un lichid vâscos care se solidifică la 40-. Concentrații mai reduse de agar (< 0,5 %) sunt folosite la crearea mediilor de cultură semisolide.
Gelatina – este extrasă din țesuturi colagenice. În mediile de cultură este utilizată în concentrații de 12-15 %. Lichefierea are loc la temperaturi de peste , gelificând apoi lent la temperaturi sub . Dezavantajul acestui agent de solidificare este că poate fi folosit ca nutrient de către microorganismele cu activitate proteolitică, pierzându-și în acest fel proprietățile de gel.
Factorii care influențează dezvoltarea culturilor microbiene
Creșterea microorganismelor este condiționată în mare măsură de natura chimică și fizică a mediului în care sunt cultivate. Înțelegerea influenței mediului ajută la controlul creșterii microorganismelor și studiul distribuției ecologice a acestora. Cei mai importanți dintre acești factori sunt temperatura, pH-ul și nivelul oxigenului. Acești factori pot fi manipulați și pentru obținerea efectelor de inhibare sau încetinire a creșterii microorganismelor nedorite.
Temperatura
Temperatura mediului afectează profund microorganismele. Acestea sunt deosebit de sensibile deoarece sunt, de obicei, unicelulare iar temperatura lor variază în funcție de cea a mediului extern. Din aceste motive, temperatura celulelor microbiene reflectă direct temperatura din mediul exterior direct.
Reacțiile catalizate enzimatic sunt extrem de sensibile la temperatură, în acest fel fiind afectată creșterea. La temperaturi joase o creștere a temperaturii mărește rata de creștere din cauza vitezei reacțiilor chimice care se va dubla aproximativ la fiecare creștere a temperaturii . Deoarece rata fiecărei reacții crește, metabolismul este mai activ la temperaturi mai ridicate, iar microorganismele vor crește mai repede.
Temperaturile ridicate dăunează microorganismelor prin denaturarea enzimelor, și a anumitor proteine. Membranele microbiene sunt, de asemenea, perturbate de temperaturile extreme. Astfel, cu toate că enzimele funcționale operează mai rapid la temperaturi mai ridicate, microorganismele pot fi afectate în așa măsură încât creșterea este inhibată.
La temperaturi foarte scăzute, membranele suferă un proces de solidificare și enzime își încetinesc funcționarea. Atunci când microorganismele sunt supuse temperaturilor mai ridicate decât cele optime, atât funcțiile cât și structura lor celulară sunt afectate. Dacă temperaturile sunt sub nivelul optim, sunt afectate funcțiile, dar nu neapărat și compoziția chimică și structura celulelor.
Din punct de vedere al necesităților față de temperatură, microorganismele pot fi clasificate în:
Psyhrofile – microorganisme care au o temperatură optimă de creștere sub , dar se dezvoltă bine și la . Temperatura maximă este de . Cei mai mulți reprezentanți ai acestei clase fac parte din genurile de bacterii Pseudomonas, Vibrio, Alcaligenes, Bacillus, Arthrobacter, Moritella, Photobacterium, și Shewanella. Enzimele, sistemul de transport precum și mecanismele de sintetizare ale proteinelor acestor microorganisme funcționează bine la temperaturi reduse. Membranele celulare au în componență niveluri ridicate de acizi grași nesaturați, nefiind afectate de temperaturile scăzute. La o creștere a temperaturii peste valoarea de este afectată membrana celulară și apar scurgeri ale constituenților celulari.
Psyhrotrofe sau psyhrofile facultative – sunt microorganismele capabile să crească la temperaturi de 0-, chiar dacă optimul de creștere este între 20-, iar maximul de aproximativ . Fungii și bacteriile din această clasă sunt responsabile de alterarea produselor alimentare refrigerate.
Mezofile – sunt microorganisme a căror temperatură optimă de creștere variază între 20-. Temperatura minimă de creștere este situată în jurul valorilor de 15-, iar peste apare inabilitatea de creștere. Majoritatea microorganismelor sunt încadrate în această categorie, aproape toți patogenii umani fiind considerați mezofili din cauza adaptării la un mediu cu o temperatură de .
Termofile – sunt microorganisme capabile să crească la temperaturi de peste . Temperatura minimă de creștere este în jurul valorii de , iar optimul este între 55-. Marea majoritate sunt procariote, dar există și unele alge și fungi care aparțin acestei clase. Termofilele se pot dezvolta într-o mulțime de habitate, inclusiv containere de compost, căpițe de fân sau izvoare termale. Diferența față de mezofile este dată de existența în componența celulelor microorganismelor termofile a enzimelor stabile termic și a sistemelor de sinteză a proteinelor capabile să funcționeze la temperaturi ridicate. Lipidele din membranele lor sunt, de asemenea, mai saturate decât cele ale mezofilelor și au puncte de topire mai ridicate.
Hypertermofile – sunt microorganisme capabile să crească la temperaturi de peste , iar unele au temperatura maximă peste . Valoarea minimă a temperaturii sub care apare inabilitatea de creștere este de . Pyrococcus abyssi (optimum ) și Pyrodictium occultum (optimum ) sunt două specii hypertermofile identificate în zonele fierbinți ale fundului mării.
pH-ul
Fiecare specie are un interval definit al pH-ului în care creșterea are loc, respectiv o valoare optimă pentru asigurarea creșterii în cele mai bune condiții. Microorganismele acidofile au un pH optim de creștere între 0 – 5,5; neutrofilele între 5,5 – 8,0; iar alcalofilele preferă un pH de 8,5 – 11,5. Alcalofilele extreme au o creștere optima la un pH=10 sau mai mare. În general, diferitele grupuri de microorganisme au preferințe caracteristice pentru pH. Cele mai multe bacterii sunt neutrofile, creșterea având loc în intervalul de pH 4 – 9, cu un optim de 6,5 – 7,5; iar ciupercile, mucegaiurile și drojdiile preferă mediile ușor acide cu un pH cuprins între 4 și 6.
Deoarece mediile de cultură neutre sau aproape neutre sunt cele mai avantajoase, pH-ul se ajustează frecvent la valoarea 7. Ajustarea pH-ului se face cu soluții 1N de hidroxid de sodiu sau acid clorhidric.
Nivelul oxigenului
Din punct de vederea al abilității de utilizare a oxigenului atmosferic, microorganismele manifestă o mare diversitate. Această diversitate se datorează diferențelor dintre sistemele enzimatice biooxidative prezente la nivelul fiecărei specii. În funcție de necesitatea pentru oxigen, microorganismele pot fi clasificate astfel:
Aerobe – solicită prezența oxigenului atmosferic pentru creștere și dezvoltare, datorită conținutului bogat în enzime de tipul citocromoxidazelor. Acest tip de microorganisme se dezvoltă la suprafața mediilor de cultură, formând pelicule sau membrane de diferite consistențe.
Microareofile – necesită un nivel de oxigen sub 2-10% pentru creștere. Valoarea de 20% a oxigenului din atmosferă provoacă moartea celulelor.
Facultative anaerobe – sunt microorganisme care nu au nevoie de oxigen pentru creștere, dar în prezența acestuia creșterea este intensificată.
Aerotolerante anaerobe – sunt microorganisme capabile să ignore prezența oxigenului, creșterea desfășurându-se în mod identic indiferent de prezența sau absența acestui gaz.
Anaerobe obligate – se dezvoltă în absența oxigenului atmosferic, deoarece prezența acestui gaz duce la formarea unor produși finali de metabolism toxici (ex. peroxizi sau radicali liberi de oxigen).
În laborator, nevoia de oxigen a microorganismelor poate fi determinată prin cultivarea acestora în eprubete cu medii de cultură solide. După incubare, distribuția creșterii indică microorganismele care au nevoie de oxigen (fig. 8.). Aerobele se dezvoltă la suprafața mediului și au creșterea limitată între partea superioară a mediului și profunzimea acestuia. Microaerofilele cresc ușor sub suprafața mediului, în timp ce facultativ anaerobele vor crește în profunzimea mediului.
Fig. 8. Creșterea microorganismelor pe baza răspunsului la oxigen
EVALUARE
Care sunt elementele nutritive necesare unui mediu de cultură?
Ce rol are apa în creșterea și dezvoltarea microorganismelor?
Ce rol are carbonul în creșterea și dezvoltarea microorganismelor?
Clasificați microorganismele în funcție de cerințele față de energie?
Notițe și observații:
Câte tipuri de microorganisme există pe baza cerințelor față de temperatură?
Câte tipuri de microorganisme există pe baza cerințelor față de oxigen?
Care sunt principalele diferențe între mediile de cultură din perspective scopului pentru care sunt întrebuințate?
Ce substanțe se utilizează în mod uzual pentru solidificarea mediilor de cultură și care sunt diferențele între acestea?
Notițe și observații:
TEHNICI DE ÎNSĂMÂNȚARE A MEDIILOR DE CULTURĂ
În general, în laborator microorganismele sunt crescute în culturi pe medii lichide sau medii solide. Însămânțarea unei culturi presupune trecerea unei cantități de microorganisme pe un mediu de cultură. Scopul acestui proces este de identificare a microorganismelor și de examinare a caracterelor culturale, morfologice și biochimice ale acestora.
Operațiunea de însămânțare se execută în condiții aseptice, în hota cu flux laminar, instrumentele fiind sterilizate la flacără.
Instrumentele folosite pentru însămânțare sunt ansele de însămânțare și pipetele Pasteur. Ansele sunt formate dintr-un fir de platină (nichelină) îndoit în formă de buclă la extremitatea superioară și montate pe un mâner de metal sau ebonită (fig. 9.).
Una dintre cele mai importante probleme în laboratorul de microbiologie este menținerea în stoc a culturilor pure pe o perioadă lungă de timp. În mod ideal, acest aspect necesită o tehnică ce minimizează necesitatea reînsămânțării culturilor. Aceasta se realizează prin stocarea culturilor într-o stare de latență, fie prin refrigerare fie prin desicare.
Reînsămânțarea culturilor pure (trecerea acestora pe un mediu proaspăt) este necesară în cazul culturilor vechi, pentru asigurarea sursei de hrană epuizată în timpul dezvoltării. De asemenea, în timpul creșterii, microorganismele lasă în mediu diferiți metaboliți care pot împiedica creșterea lor mai departe, aspect care face necesară reîmprospătarea mediului.
Condiția esențială în pasarea culturilor este de păstrare a purității culturii, prin evitarea infectării mediului în timpul manipulării. Din acest motiv este recomandată flambarea gurii recipientelor și a instrumentelor înainte și după fiecare însămânțare.
În cazul instrumentelor, după sterilizare atât ansele cât și pipetele Pasteur, sunt lăsate să se răcească pentru a nu distruge microorganismele ce se manipulează.
Însămânțarea pe medii cu agar înclinat
Însămânțarea bacteriilor se face, cel mai frecvent, în eprubete cu agar înclinat. Obținerea acestui tip de mediu de cultură se face prin lăsarea la răcit a eprubetelor cu agar, după lichefiere pe baia marină, într-o poziție înclinată.
Procedura de însămânțare se derulează astfel:
1. Se etichetează eprubeta care urmează a fi inoculată cu data, numele persoanei care execută procedura și denumirea microorganismului.
.
2. Se agită ușor tubul de cultură primară, cu scopul de a aranja bacteriile într-o suspensie uniformă.
3. Se așează eprubeta conținând cultura stoc și eprubeta care urmează să fie inoculată în palma mâinii stângi, și se fixează cu degetul mare. Eprubetele sunt apoi separate pentru a forma un V în mână. Acestea trebuie ținute în unghi, astfel încât capetele deschise să nu fie în poziție verticală și expuse direct contaminanților din aerul laboratorului.
4. Cu mâna dreaptă, de obicei, se sterilizează ansa de însămânțare prin ardere la roșu în flacăra becului de gaz.
5. Folosind aceeași mână care ține ansa de însămânțare, se scot capacele de la cele două eprubete, se țin între degete, iar gura eprubetelor se trece scurt prin flacăra becului de gaz. Se va evita încălzirea prea mare a gurii eprubetelor.
6. Ansa se introduce în eprubeta cu cultura stoc și se recoltează o mică cantitate dintr-o colonie. Ansa este trecută apoi repede în cealaltă eprubetă, fiind evitată atingerea marginilor și pereților eprubetei.
Însămânțarea se face prin trasarea de zigzag-uri pe suprafața agarului.
7. După inoculare se îndepărtează ansa de însămânțare, se flambează gurile eprubetelor la flacăra becului de gaz și se pun capacele.
8. Se sterilizează ansa de însămânțare prin ardere la roșu în flacăra becului de gaz și se așează în stativ.
Însămânțarea pe medii lichide
În cazul culturilor de microorganisme lichide însămânțarea se face cu ajutorul pipetei Pasteur. Pipeta se flambează, i se rupe vârful și se introduce în flaconul de cultură. Se iau câteva picături din acest material, care se introduc apoi în profunzimea mediului lichid din flaconul ce se însămânțează. După însămânțare pipeta se introduce într-un vas cu dezinfectant. Prelevarea de inocul din culturile cultivate pe mediu solid se face cu ansa, fiind prelevată o porțiune de colonie. Suspensionarea inoculului în mediul de cultură se face prin agitarea ansei.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
TEHNICI DE ÎNSĂMÂNȚARE A MEDIILOR DE CULTURĂ
Însămânțarea pe medii cu agar înclinat
Însămânțarea pe medii lichide
Examinați eprubetele cu culturi microbiene și evaluați distribuția microorganismelor pe mediile de cultură și culoare coloniilor. Desenați ceea ce ați observat și completați tabelul de mai sus.
Însămânțarea prin înțepare
Este o tehnică aplicată pentru cultura microorganismelor anaerobe sau pentru determinarea unor caractere de creștere. Însămânțarea se face cu firul ansei, acesta se încarcă cu germeni și apoi se introduce în profunzimea mediului (fig. 10.).
Fig. 10. Însămânțarea mediilor de cultură prin înțepare
Însămânțarea în plăci Petri
Această metodă utilizează medii de cultură solide distribuite în plăci Petri. Însămânțarea se poate face atât înainte cât și după solidificarea mediului.
Înainte de solidificarea mediului însămânțarea se face cu pipeta Pasteur. Se pipetează o cantitate mică din cultura microbiană și se pune în placa Petri, după care se toarnă mediul de cultură, omogenizând mediul prin rotirea cu atenție a plăcii (fig. ), b)).
Însămânțarea pe mediile solidificate se realizează cu ajutorul ansei prin trasarea de striuri pe suprafața mediului. Se poate trasa un striu zigzag sau mai multe striuri pentru obținerea de colonii izolate (fig. 12.).
Fig. 12. Însămânțarea în striuriAplicații practice
Obiective:
Însămânțarea plăcilor Petri prin trasare de striuri pentru obținerea de colonii izolate, însămânțarea mediilor solide și lichide din eprubete.
Materiale necesare:
Culturi microbiene – Plăci Petri cu medii de cultură solide, eprubete cu agar drept și agar înclinat, eprubete cu medii de cultură lichide;
Anse;
Bec de gaz;
Procedura de obținere a coloniilor izolate:
Se sterilizează ansa și se recoltează o cantitate mică din colonia care urmează să fie însămânțată;
Se trasează câteva striuri paralele pe suprafața mediului de cultură (fig. 13., pasul 1);
Se sterilizează ansa în flacăra becului de gaz, iar după răcire, se trasează linii paralele pornind din zona inoculată (fig. 13., pasul 2);
Se sterilizează ansa din nou și se continuă trasarea liniilor paralele pornind din zona inoculată anterior. Înainte de fiecare dintre pașii 3-5 este necesară sterilizarea ansei de însămânțare (fig. 13., pașii 3-5).
Fig. 13. Obținerea coloniilor izolate
Documentație de laborator
Nume:
Data:
TEHNICI DE ÎNSĂMÂNȚARE A MEDIILOR DE CULTURĂ
Însămânțarea în plăci Petri
Examinați plăcile Petri cu culturi microbiene, evaluați distribuția microorganismelor pe mediile de cultură și culoarea coloniilor. Desenați ceea ce ați observat și completați tabelul de mai sus.
EVALUARE
Care este rolul înființării culturilor microbiene?
Care este scopul sterilizării instrumentelor utilizate în însămânțarea microorganismelor?
Ce diferențe există între tipurile de însămânțare a culturilor microbiene?
Când se face reînsămânțarea culturilor pure?
Notițe și observații:
De ce se folosește ansa în loc de acul de însămânțare pentru a transfera materialul microbian în plăcile Petri?
Explicați de ce trebuie evitată atingerea pereților eprubetelor în timpul procesului de însămânțare
Care sunt principalele surse și procese de contaminare a culturilor microbiene în timpul procesului de însămânțare?
Notițe și observații:
STUDIUL CARACTERELOR CULTURALE ALE MICROORGANISMELOR ȘI IZOLAREA ÎN CULTURI PURE
Studiul caracterelor culturale ale microorganismelor
Microorganismele cultivate în medii lichide afișează o varietate de caracteristici a creșterii. Aceste caracteristici sunt foarte utile în procesul de identificare și diferențiere a formelor de variabilitate (fig.14.).
Gradul de turbiditate este o caracteristică optică ce poate fi determinată pe baza cantității de lumină ce străbate mediul de cultură. Culturile opace nu permit străbaterea luminii, cele care permit o trecere parțială sunt numite translucide, iar cele care permit trecerea luminii în totalitate sunt transparente. Când microorganismele sunt fin dispersate în mediul de cultură produc o turbiditate uniformă, în timp ce organizarea în agregate produce o turbiditate floculantă.
Unele microorganisme plutesc la suprafața mediului de cultură și formează o peliculă (sau membrană) subțire sau groasă, netedă sau cu încrețituri. Alte microorganisme aderă la pereții eprubetei și formează în partea superioară a mediului un inel.
Formarea de sedimente (depozite) este o altă caracteristică a culturilor în medii lichide. Sedimentele pot fi granulare, vâscoase sau pulverulente, discrete sau abundente, omogenizabile sau sub formă de floculații și greu omogenizabile prin agitare.
Pe mediile de cultură solide microorganismele se dezvoltă sub formă de colonii. Coloniile sunt populații celulare rezultate din creșterea și multiplicarea unei singure celule însămânțate pe un mediu de cultură.
Culoarea, dimensiunea, forma și textura creșterii microorganismelor sunt determinate de structura genetică ale acestora. Cu toate acestea, expresia genetică a organismelor este, de asemenea, în mare măsură influențată de factorii de mediu, incluzând în această categorie substanțele nutritive, temperatura și timpul de incubare.
Caracterizarea morfologică a coloniilor se face pe baza:
formei coloniei: punctiformă, rotundă, filamentoasă, amoeboidă, cutanată, neregulată (fig. 15.);
profilului coloniei: plat, pelicular, convex, hemisferic, umbonat, conic, crateriform, bombat, cu protuberanțe neregulate (fig. 15.);
aspectului marginii coloniei: întreagă, ondulată, lobată, dințată, filamentoasă, buclată (fig. 15.);
textura coloniei: lucioasă, mată, mucoidă, granuloasă;
consistența coloniei: vâscoasă, mucilaginoasă, uscată;
culoarea coloniei, respectiv transparența sau opacitatea;
suprafața coloniei: netedă sau rugoasă.
Fig. 15. Caracterizarea morfologică a coloniilor
Pe mediile de cultură cu agar înclinat tehnica de însămânțare constă în trasarea unei linii zigzag de-a lungul mediului. În acest caz forma poate fi: filiformă, arborescentă, perlată, echinulată, difuză sau rizoidă (fig. 16.).
Fig. 16. Forma coloniilor pe medii cu agar înclinat
Diversitatea mediilor ocupate de microorganisme în natură face ca asociațiile în care acestea își duc viața să fie foarte heterogene, amestecul de specii variind ca număr în funcție de specificul mediului natural.
Din acest considerent, studiul unui anumit microorganism poate fi efectuat numai după izolarea acestuia într-o cultură pură, provenită dintr-o singură specie sau tulpină. În acest fel se pot studia caracterele culturale, morfologice, fiziologice, serologice, genetice și proprietățile specifice ale fiecărui microorganism.
Cele mai uzuale metode de izolare a microorganismelor sunt cea a diluțiilor succesive în medii solide și cea a diseminării pe suprafața mediului.
Metoda diluțiilor seriale
Materialul inițial conținând microorganisme este diluat de câteva ori în apă sterilă, utilizând de obicei coeficientul de diluare 10, pentru a reduce populația microbiană suficient pentru obținerea de colonii separate când se efectuează însămânțarea pe mediile de cultură.
Apa sterilă este repartizată în eprubete sterile, în fiecare fiind turnată o cantitate de 9 ml. Se adaugă 1 ml din suspensia inițială în prima eprubetă, fiind obținută diluția de 1:10. Suspensia de 1:10 se amestecă cu ajutorul pipetei, apoi se ia cu aceeași pipetă o cantitate de 1 ml din suspensia obținută și se transferă în cea de-a doua eprubetă. Prin amestecare se obține diluția de 1:100, iar repetarea pașilor face posibilă obținerea diluțiilor de 1:1000, 1:10000, 1:100000 etc.
Din diluțiile obținute se fac însămânțări pe mediu solid turnat în eprubete sau plăci Petri (fig. 17.).
Fig. 17. Tehnica preparării diluțiilor seriale și izolarea microorganismelor în culturi pure
Aplicații practice
Obiective:
Examinarea caracterelor culturale ale coloniilor formate în plăci Petri, obținute în urma diluării seriale.
Materiale necesare:
Eprubete cu mixuri microbiene;
Eprubete cu apă distilată sterilă;
Anse;
Bec de gaz;
Pipete;
Plăci Petri cu mediu de cultură;
Procedura de lucru
Se etichetează trei plăci Petri cu numere de la 1 la 3, numele celui care face însămânțarea și data;
Se inoculează eprubetele cu apa distilată sterilă, conform schemei din fig. 14., pentru obținerea diluțiilor seriale 10-1, 10-2 și 10-3;
Se însămânțează plăcile Petri cu câte 1 ml din diluțiile obținute;
Se incubează plăcile întoarse la 30 – 37șC, timp de 24-48 ore;
Se examinează coloniile formate și se trec rezultatele în documentația de laborator.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
STUDIUL CARACTERELOR CULTURALE ȘI IZOLAREA MICROORGANISMELOR ÎN CULTURI PURE
Metoda diluțiilor seriale
Examinați plăcile Petri cu culturi microbiene și evaluați distribuția și numărul coloniilor la suprafața mediului de cultură. Repetați analiza pentru coloniile dezvoltate în profunzimea mediului de cultură. Completați rezultatele în tabel.
Metoda diseminării pe suprafața mediului
Ansa sterilă este încărcată cu materialul pentru diseminare și se mișcă în striuri pe suprafața mediului de cultură până la epuizarea completă a materialului. Dezvoltarea unui număr redus de colonii pe suprafața ultimului sector face posibilă izolarea acestora și trecerea pe alte medii de cultură, pentru studiu (Fig. 18.).
Fig. 18. Tehnica izolării microorganismelor prin diseminare pe suprafața mediului
Aplicații practice
Obiective:
Examinarea caracterelor culturale ale coloniilor formate în plăci Petri, însămânțate prin dispersarea materialului microbian la suprafața mediului de cultură.
Materiale necesare:
Eprubete cu culturi pure și mixuri microbiene;
Anse;
Bec de gaz;
Pipete;
Plăci Petri cu mediu de cultură;
Liniar.
Procedura de lucru
Se etichetează trei plăci Petri cu numere de la 1 la 3, numele celui care face însămânțarea și data;
Se transferă pe plăcile Petri o cantitate a câte 0.1 ml inocul microbian, iar diseminarea se face pe toată suprafața folosind o ansă Drigalski, fără a atinge marginile plăcii;
Se incubează plăcile întoarse la 30șC, timp de 24-48 ore;
Se examinează coloniile formate și se trec rezultatele în documentația de laborator.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
STUDIUL CARACTERELOR CULTURALE ȘI IZOLAREA MICROORGANISMELOR ÎN CULTURI PURE
Metoda diseminării pe suprafața mediului
Examinați plăcile Petri cu culturi microbiene și evaluați distribuția și numărul coloniilor la suprafața mediului de cultură. Repetați analiza pentru coloniile dezvoltate în profunzimea mediului de cultură. Completați rezultatele în tabel.
EVALUARE
Ce sunt coloniile microbiene?
Care sunt semnele de creștere a microorganismelor în mediile lichide?
Care sunt parametrii utilizați în caracterizarea morfologică a culturilor microbiene în plăci Petri?
Când se impune utilizarea metodei diluțiilor seriale?
Notițe și observații:
Descrieți câteva forme tipice a culturilor microbiene.
În tehnica diseminării pe suprafață, cum sunt răspândite microorganismele pentru a forma colonii individuale?
În ce zone ale plăcilor Petri vor fi concentrate microorganismele și în ce zone vor fi mai reduse ca număr în urma diseminării pe suprafața mediului?
Ce rol are gradul de turbiditate în descrierea culturilor microbiene în medii lichide?
Notițe și observații:
Ce caracteristici au sedimentele formate în culturile în medii lichide?
Descrieți câteva diferențe între coloniile de fungi și cele bacteriene pe mediile de cultură solide.
Notițe și observații:
EXAMENUL MICROSCOPIC AL CARACTERELOR MORFOLOGICE ȘI TINCTORIALE ALE MICROORGANISMELOR
Celulele microbiene au dimensiuni reduse, din acest motiv examinarea caracteristicilor acestui grup de microorganisme se poate face numai cu ajutorul microscopului.
Examinarea microscopică a microorganismelor se poate face când acestea sunt în preparate proaspete, într-o suspensie de ser fiziologic, sau frotiuri fixate și colorate pentru a îmbunătăți contrastul (preparate de durată). Structurile bacteriene specifice, cum ar fi capsula, sporii și cilii pot fi colorați pentru a pune în evidență anumite particularități fiziologice.
Examenul microorganismelor în preparate proaspete
Observarea microscopică a unui preparat lamă-lamelă reprezintă examinarea directă a unei suspensii de germeni vii într-o picătură de soluție salina fiziologică sau mediu de cultura lichid. Pentru executarea acestui tip de preparat se ia cu pipeta Pasteur o picătură din suspensia de germeni, se depune pe mijlocul unei lame degresate si se acoperă cu o lamelă (fig. 19.).
Fig. 19. Realizarea unui preparat lamă-lamelă
Examenul microscopic al preparatului se efectuează cu un obiectiv uscat (x40) și este utilă pentru evidențierea morfologiei microorganismelor (fig. 20.).
Un caz special de observare a bacteriilor este utilizarea preparatelor în picătură suspendată. Acest tip de preparate necesită lame special excavate sau inele de sticlă lipite pe lame obișnuite.
Fig. 21. Evidențierea celulelor vii de cele moarte la drojdii
După amestecarea suspensiei de germeni se depune o picătură din aceasta pe suprafața lamelei. Se ia lama cu godeu sau inel și se așează deasupra lamelei în așa fel încât picătura de suspensie să fie în centrul concavității de pe lamă. Se întoarce lama la 180 ° și se examinează la microscop cu obiectivul uscat.
Prin adăugarea pe lamă a unei picături de colorant vital (albastru de metilen sau roșu neutru) se pot evidenția celulele moarte, care se vor colora mai intens, de cele vii (fig. 21.).
Aplicații practice
Obiective:
Evidențierea la microscop a celulelor moarte de cele viabile în preparate lamă-lamelă prin colorare cu un colorant vital.
Materiale necesare:
Culturi de drojdii;
Reactivi – albastru de metilen (0.02%) și roșu neutru (0.02%);
Anse și pipete;
Bec de gaz;
Lame și lamele pentru microscop.
Se va pune o picătură de suspensie microbiană pe lamă și se va adăuga o picătură de colorant vital, apoi se va omogeniza preparatul. Examinarea se va face cu obiectivele de 10x, 20x și 40x.
Examinarea microorganismelor în preparate de durată
Preparatele de durată sunt preparate uscate, fixate și colorate efectuate din diferite produse sau culturi de microorganisme. Această tehnică permite punerea în evidență a caracterelor morfologice și tinctoriale, respectiv a formațiunilor celulare (fig. 22.).
Avantajele preparatelor uscate sunt durata mai mare de păstrare, eliminarea pericolului de contaminare și facilitatea examinării microscopice cu ajutorul obiectivelor cu putere mare.
Frotiurile sunt lame de microscop pe care a fost etalat material microbian. Tehnica executării acestui tip de preparate presupune parcurgerea a patru etape distincte:
Etalarea suspensiei microbiene – constă în întinderea într-un strat cât mai subțire a materialului microbian în centrul lamei, pe o suprafață de aproximativ 2cm2;
Uscarea – se face la temperatura camerei sau în termostat;
Fixarea – este procesul prin care structurile interne și externe ale celulelor microorganismelor sunt păstrate și fixate în mod identic cu aspectul celulelor vii. În timpul procesului enzimele sunt inactivate, fiind eliminat riscul de perturbare al morfologiei celulelor, și sunt întărite structurile celulare astfel încât acestea să nu se schimbe în timpul colorării și observării. Cel mai adesea fixarea se face la flacăra unei lămpi de alcool sau bec de gaz, timp de 5-10 secunde, la o temperatură care poate fi suportată de pielea de pe dosul palmei, obținându-se aderarea microorganismelor la suprafața lamei. Pentru fixare se pot folosi și substanțe chimice (alcool etilic, metilic, amestec de alcooli cu acetonă sau eter), preparatele fiind imersate în soluțiile fixatoare timp de 10-20 de minute;
Colorarea – este procesul prin care se pun în evidență unele detalii morfologice, ca: dimensiunile, conturul, capsula, cilii, sporii, nucleul granulațiile, respectiv afinitățile tinctoriale ale microorganismelor. În funcție de metoda de realizare colorarea poate fi simplă, compusă sau specială.
Fig. 22. Cele mai comune forme a bacteriilor
Colorarea simplă
Această tehnică presupune utilizarea unui singur colorant, de obicei albastru de metilen, violet de gențiana sau fucsină.
Pentru colorare frotiul este acoperit cu câteva picături de colorant, care se mențin pe lamă timp de 1-2 minute. Urmează spălarea lamei cu apă de la robinet, iar lama este lăsată la uscat la aer până la evaporarea completă a apei. În urma acestui proces bacteriile apar colorate în albastru, în cazul folosirii albastrului de metilen, în roșu la folosirea fucsinei și violet pentru violetul de gențiana.
Examinarea la microscop se face cu obiectivul de imersie, fiind evaluată forma și modul de agregare al celulelor.
Aplicații practice
Obiective:
Examinarea la microscop a frotiurilor realizate după metoda de colorare simplă. Se vor nota forma, modul de grupare și culoarea celulelor, pentru stabilirea caracteristicilor morfologice.
Materiale necesare:
Culturi bacteriene;
Reactivi – albastru de metilen, fucsină, violet de gențiana;
Ulei de imersie;
Anse;
Bec de gaz;
Lame de microscop.
Procedura de lucru
Se etichetează lamele cu denumirea bacteriilor și a coloranților utilizați;
Materialul microbian este etalat cu ajutorul ansei pe suprafața lamei;
Lamele se usucă la temperatura camerei după care se trec prin flacăra becului de gaz pentru fixarea termică a preparatului;
Pe fiecare lamă fixată se aplică un singur colorant și se lasă să acționeze 20 până la 30 de secunde;
Excesul de colorant se îndepărtează prin spălare cu apă, lamele fiind apoi uscate între două foi de hârtie sugativă;
Examinarea preparatului la microscop se face după adăugarea uleiului de imersie cu obiectivul de 100x;
Rezultatele sunt completate în documentația de laborator.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
EXAMENUL MICROSCOPIC AL CARACTERELOR MORFOLOGICE ȘI TINCTORIALE ALE MICROORGANISMELOR
Colorarea simplă
Examinați la microscop frotiurile preparate, completați desenele și rezultatele în tabel.
Colorarea Gram sau colorarea diferențială
Procedurile de colorare diferențială ajută la separarea bacteriilor în grupuri distincte, pe baza proprietăților de colorare. Dezvoltată în 1884 de către medicul danez Christian Gram acest tip de colorare constituie o primă etapă în identificarea bacteriilor. Conform acestei metode bacteriile se împart în două grupe distincte: Gram pozitive (G+) și gram negative (G-). Bacteriile care își păstrează culoarea violet și după decolorarea cu alcool-acetonă poartă numele de bacterii Gram pozitive. Bacteriile care pierd primul colorant în urma decolorării, dar se recolorează cu cel de-al doilea colorant (fucsină sau safranină) și au în final culoarea roșie, poartă numele de bacterii Gram negative.
Reprezentative pentru bacteriile Gram pozitive sunt genurile Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Diplococcus, Corynebacterium, Clostridium, Lactobacillus, iar pentru bacteriile Gram negative sunt reprezentative genurile Escherichia, Brucella, Salmonella, Pseudomonas, Pasteurella.
Pentru colorarea diferențială este necesară parcurgerea următoarelor etape (fig.23.):
Colorarea primară – frotiul uscat și fixat este acoperit cu violet de gențiana sau cristal violet. Colorantul este ținut 1-2 minute, apoi spălat cu apă de la robinet. Examinarea microscopică indică o colorare în violet a celulelor.
Mordansarea – frotiul se acoperă cu soluție Lugol care se ține 4-5 minute, iodul din acest reactiv servind ca mordant (fixator de culoare). Rolul iodului este de a crește interacțiunea dintre celule și colorant, astfel încât colorarea celulelor este intensificată.
Decolorarea – denumită și diferențiere, corespunde etapei de acoperire a frotiului cu alcool-acetonă 1/10 lama fiind înclinată pentru a ușura acțiunea decolorantului. Decolorarea se face timp de 15-20 de secunde, până ce frotiul devine alburiu și culoarea nu mai trece în soluție. Se spală cu apă de la robinet pentru oprirea acțiunii decolorantului. Bacteriile Gram pozitive își păstrează culoarea dată de cristalul violet sau violet de gențiana, în timp ce bacteriile Gram negative își pierd culoarea și devin incolore.
Recolorarea – este etapa în care se adaugă al doilea colorant, fucsină sau safranină, acest colorant acționând numai asupra celulelor care au pierdut primul colorant în urma decolorării. Frotiul este acoperit cu colorant timp de 1-2 minute, după care se spală cu apă, se usucă și se examinează la microscop cu obiectivul de imersie.
Fig. 23. Etapele colorării GramAplicații practice
Obiective:
Examinarea la microscop a frotiurilor realizate după metoda de colorare Gram. Se vor nota morfologia, modul de grupare, culoarea celulelor și reacția gram.
Materiale necesare:
Culturi microbiene;
Reactivi –violet de gențiana, soluție Lugol, alcool-acetonă, fucsină sau safranină;
Ulei de imersie;
Anse;
Bec de gaz;
Lame de microscop.
Procedura de lucru
Se etichetează lamele cu denumirea bacteriilor;
Se prepară un frotiu urmând pașii descriși la colorarea simplă;
Pe fiecare lamă fixată se aplică cristalul violet și se lasă să acționeze 30 de secunde. Excesul de colorant se îndepărtează prin clătire cu apă timp de 5 secunde;
Frotiul este acoperit cu soluție Lugol, timpul de acțiune al soluției fiind de 1 minut. Acțiunea mordantului este oprită prin clătire cu apă timp de 5 secunde;
Decolorarea se face cu soluția de alcool-acetonă, timp de 15-20 secunde, urmată de clătirea lamei cu apă timp de 5 secunde;
Recolorarea se face cu fucsină (sau safranină), timp de 1-2 minute, excesul de colorant fiind îndepărtat prin spălare cu apă timp de 5 secunde;
Uscarea frotiului se face cu hârtie de sugativă;
Se aplică uleiul de imersie, iar frotiurile se analizează la microscop;
Rezultatele sunt completate în documentația de laborator.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
EXAMENUL MICROSCOPIC AL CARACTERELOR MORFOLOGICE ȘI TINCTORIALE ALE MICROORGANISMELOR
Colorarea Gram
Examinați la microscop frotiurile preparate, completați desenele și rezultatele în tabel.
Colorări speciale
Studiul structurilor specifice ale microorganismelor la microscopul optic a implicat identificarea unor procedee speciale de colorare pentru evidențierea sporilor, capsulei, cililor, nucleului etc.
Colorarea sporilor
Unele specii de bacterii, de exemplu speciile anaerobe ale genului Clostridium și Bacillus, sunt capabile să producă structuri extrem de rezistente numite spori.
În perioadele cu condiții de mediu nefavorabile dezvoltarea sporilor are loc în interiorul celulelor vegetative ale bacteriilor, de aici și denumirea de endospori. În cazul în care condițiile de mediu se mențin neprielnice, celulele vegetative degenerează și pun în libertate endosporii, care devin structuri independente și vor fi numiți spori.
Morfologia și localizarea sporilor sunt caracteristici valoroase în identificarea speciilor de bacterii. Cu toate acestea capacitatea sporilor de a supraviețui perioade lungi de timp în medii nefavorabile face ca procesul de colorare și punere în evidență să fie dificil.
Endosporii nu reacționează la majoritatea coloranților, dar odată colorați rezistă foarte bine la procesul de decolorare. Colorarea primară se realizează cu verde de malachit, un colorant foarte puternic și capabil să penetreze învelișul sporal. Pentru a intensifica acțiunea colorantului este necesară aplicarea căldurii. După această etapă celulele vegetative și sporii apar de culoare verde.
Decolorarea se face prin spălare cu apă de la robinet, funcționalitatea procedurii fiind asigurată de proprietatea sporilor de a păstra colorația primară și a celulei vegetative de a o pierde.
Recolorarea se face cu safranină, acest colorant acționând ușor asupra celulei vegetative, iar rezultatul final prezintă sporii colorați în verde și celulele vegetative colorate în roz (fig. 24.).
Aplicații practice
Obiective:
Examinarea la microscop a frotiurilor realizate din culturi bacteriene sporogene. Se vor nota culoarea sporilor și a celulei vegetative, respectiv amplasarea sporilor.
Materiale necesare:
Culturi microbiene;
Reactivi – safranină, verde malachit;
Ulei de imersie;
Anse;
Bec de gaz;
Lame de microscop.
Procedura de lucru
Etalarea materialului microbian;
Uscarea frotiului al temperatura camerei;
Fixarea termică a frotiului
Acoperirea frotiului cu soluție verde de malahit și încălzirea acestuia pe o plită pentru 2-3 minute (până la apariția vaporilor);
Răcirea frotiului și clătirea cu apă de robinet;
Recolorarea cu safranină (30 de secunde) urmată de clătirea cu apă de la robinet;
Uscarea frotiului între 2 foi de hârtie sugativă
Examinarea microscopică a preparatului cu ulei de imersie;
Completarea rezultatelor în documentația de laborator.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
EXAMENUL MICROSCOPIC AL CARACTERELOR MORFOLOGICE ȘI TINCTORIALE ALE MICROORGANISMELOR
Colorarea sporilor
Examinați la microscop frotiurile preparate, completați desenele și rezultatele în tabel.
Colorarea capsulei, a cililor și flagelilor
Capsula se prezintă ca o rețea compusă din polizaharide care învelește și aderă la peretele celular al unor bacterii. Colorarea acestei structuri este dificilă prin folosirea tehnicilor uzuale, deoarece materialul capsular este solubil în apă și poate fi îndepărtat prin spălare puternică. Fixarea nu se poate face nici prin căldură, deoarece apare contracția peretelui celular și în jurul celulei se formează o zonă neclară.
Colorarea capsulei se poate face prin mai multe metode, din care prezentăm colorarea cu albastru de metilen Löffler, colorarea Giemsa și colorarea cu cristal violet. Colorarea cu albastru de metilen presupune acoperirea frotiului cu această soluție și lăsarea colorantului să acționeze timp de 2-5 minute. Urmează spălarea colorantului cu apă de la robinet, uscarea frotiului și examenul microscopic cu obiectivul de imersie. Capsula se va colora în roz, în timp ce corpul bacterian va avea o culoare albastră.
Soluția Giemsa se aplică pe frotiurile uscate, dar nefixate, timpul de menținere al colorantului fiind de 1 minut. După acest interval este adăugată o cantitate egală de apă distilată și se omogenizează ușor. Această soluție se menține timp de 5 minute pe lamă. Se îndepărtează colorantul prin spălare cu apă de la robinet și apoi se usucă. Capsula se colorează în nuanțe de violet-roz, în timp ce corpul bacteriilor va apărea într-o nuanță de violet închis.
În cazul colorării cu cristal violet frotiul, fără să fie fixat, se acoperă cu soluția de colorare timp de 5-7 minute. Colorația celulei și a capsulei după acest interval va fi violet închis. Etapa de decolorare presupune folosirea sulfatului de cupru, care va schimba culoarea capsulei în albastru-violet și a corpului microbian în albastru închis.
Colorare cililor și flagelilor oferă informații taxonomice valoroase bazate pe prezența și modelul de distribuție a acestora. Cilii și flagelii sunt formațiuni filamentoase foarte fragile și subțiri, având rol în locomoția microorganismelor. Dimensiunile reduse, aproximativ 10 – 30 nm în diametru, face ca observarea acestor structuri să fie posibilă doar la microscop.
Afinitatea scăzută pentru coloranți impune folosirea unui mordant pentru obținerea unei bune colorări. După metoda Leifson, soluția de colorare conține clorură de sodiu 1.5%, soluție de tanin 3% și fucsină bazică 1.2%. Timpul de acțiune al colorantului este de 20-30 minute, după acest interval lama se spală, se usucă și se examinează la microscop. Colorația cililor este roșu sau roz, iar a celulei roz-pal.
Aplicații practice
Obiective:
Examinarea la microscop a frotiurilor realizate din culturi bacteriene pentru evidențierea capsulei și a cililor. Se vor nota culoarea capsulei și a celulei vegetative, respectiv poziția, numărul și culoarea cililor.
Materiale necesare:
Culturi microbiene tinere;
Reactivi – soluție Giemsa, soluție de colorant Leifson, violet de gențiana, sulfat de cupru 20%;
Ulei de imersie;
Anse;
Bec de gaz;
Lame de microscop.
EVALUARE
Care sunt etapele de preparare a unui frotiu?
Care este scopul fixării termice?
Ce scop are colorarea simplă?
Descrieți diferențele între colorarea simplă și colorarea compusă.
Notițe și observații:
Enumerați etapele colorării Gram și numiți reactivii utilizați.
Descrieți scopul și importanța colorării Gram în evaluarea bacteriilor?
Care sunt cele mai comune forme de bacterii?
Ce rol au endosporii în ciclul de viață al bacteriilor?
Notițe și observații:
De ce este necesară căldura în colorarea endosporilor
Precizați motivul pentru care căldura este exclusă din procesul de colorare a capsulei.
Precizați motivul pentru care cilii și flagelii sunt dificil de colorat.
Notițe și observații:
METODE DE CUANTIFICARE A CELULELOR MICROBIENE
Cuantificarea numărului de celule microbiene dintr-un anumit mediu este necesară în caracterizarea densității unei populații și a estimării numărului de celule dintr-un eșantion.
Metodele directe de cuantificare presupun numărarea celulelor viabile și stabilirea numărului total al acestor celule la nivelul unei probe. Extinderea numărătorii, cu ajutorul microscopului, și la celulele neviabile (moarte) are ca rezultat cuantificarea cu precizie a numărului total de celule la nivelul eșantionului.
Alături de metodele directe, se pot utiliza o serie de metode estimative pentru determinarea numărului de celule. Prima etapă presupune numărarea din plăci (celulele viabile), la microscop (numărul total de celule) sau determinarea celui mai probabil număr de germeni. Etapa de estimare se face pe baza corelațiilor stabilite la nivelul eșantionului analizat, rezultatul indicând numărul total de celule.
Estimarea numărului de celule se mai poate face pe baza turbidității, activității metabolice și a masei uscate a microorganismelor din probele eșantion.
Metoda culturilor în plăci Petri
Metoda se bazează pe determinarea unităților formatoare de colonii (UFC), respectiv a numărului de celule viabile. Procedura implică numărarea coloniilor formate pe medii solide în urma însămânțării în plăci Petri. Bacteriile formează pe suprafața mediului de cultură colonii izolate, vizibile cu ochiul liber.
Pentru evitarea aglomerării celulelor și formarea de colonii izolate se utilizează metoda diluțiilor seriale. Coeficientul de diluție este 10, suspensiile obținute din proba inițială sunt transferate pe mediile de cultură și apoi puse la incubat.
Pentru cuantificarea UFC sunt alese doar plăcile Petri pe care s-au dezvoltat un număr de 30-300 colonii/placă. Numărarea UFC pornește de la premisa că fiecare colonie este fondată în urma înmulțirii unei singure celule viabile. Pe baza numărului total de UFC obținut și factorul de diluție al plăcii respective se poate calcula numărul inițial de microorganisme prezente în probă:
ex. La o diluție de 10-6 au fost identificate 60 de colonii, în acest caz numărul de UFC din proba inițială va fi de:
UFC = 60 x 106 = 60.000.000 UFC/ml probă.
Procedura de realizare a diluțiilor este alcătuită din următoarele etape:
etichetarea eprubetelor care urmează să fie folosite și umplerea acestora cu 9 ml apă sterilă sau mediu de cultură;
cu o pipetă sterilă se ia 1 ml din proba inițială și se introduce în prima eprubetă, obținându-se astfel diluția de 1/10 (10-1);
se omogenizează soluția obținută și se ia cu o pipetă gradată sterilă 1 ml ce va fi introdus în următoarea eprubetă, obținându-se diluția de 1/100 (10-2);
procesul se repetă până la obținerea diluției de 1/10.000.000 (10-7).
Cu diluțiile astfel obținute se fac însămânțări în plăci Petri, câte 1 ml din fiecare diluție fiind introdus în câte o placă Petri. În fiecare placă Petri se toarnă apoi mediul de cultură lichefiat prin încălzire la și se omogenizează printr-o rotire ușoară a plăcii Petri. Se lasă mediul să se solidifice, după care se pune în termostat la 25 – , timp de 24 sau 48 de ore.
Coloniile apărute în acest interval se numără cu ajutorul unei lupe sau cu numărătoarele de colonii (fig. 25.).
Fig. 25. Numărarea automată a coloniilor (Sistemul Scan 1200)
Aplicații practice
Obiective:
Determinarea numărului de microorganisme din proba studiată cu ajutorul diluțiilor decimale. Se va cuantifica numărul de unități formatoare de colonii prin numărarea coloniilor de pe plăcile Petri și se va determina numărul total de microorganisme din eșantionul inițial.
Materiale necesare:
Cultură microbiană sau probă de sol;
Mediu de cultură solid;
Plăci Petri sterile;
Pipete și eprubete sterile;
Apă sterilă;
Baie de apă.
Fluxul de lucru presupune etichetarea eprubetelor și plăcilor Petri, realizarea diluțiilor decimale până la 10-7, lichefierea mediului de cultură pe baie de apă până la , transferul a câte 1 ml din fiecare diluție în plăcile Petri, adăugarea mediului de cultură lichefiat în plăci, punerea la incubat în termostat a plăcilor însămânțate timp de 24 sau 48 de ore la o temperatură de .
Determinarea numărului de microorganisme se face în urma numărării coloniilor formate pe plăcile incubate și integrarea în formula:
număr de colonii x factor de diluție = număr de celule / ml.
Determinarea celui mai probabil număr de microorganisme
Este o metodă pentru determinarea numărului aproximativ de celule dintr-un eșantion. Se obțin rezultate bune în cazul bacteriilor din anumite grupe fiziologice (nitrificatoare, denitrificatoare, celulolitice etc.) dar se poate aplica cu succes și în determinarea microflorei totale. Se aplică metoda diluțiilor decimale, dar însămânțarea se face în eprubete pe medii lichide. Volumul de inocul destinat însămânțării este de 1 ml, fiind însămânțate 5 eprubete la care se adaugă un martor (Mt) format tot din 5 eprubete neînsămânțate (fig. 26.).
Perioada de incubare este de 24 sau 48 de ore, interval după care sunt citite probele. Se consideră probe pozitive acele eprubete al căror conținut a devenit opalescent. Prelucrarea rezultatelor se face cu ajutorul unui tabel statistic (tabelul 2.), determinând cel mai probabil număr de bacterii dintr-un mililitru sau gram din materialul studiat.
Pentru interpretarea rezultatelor se aleg trei diluții succesive, care nu au toate eprubetele pozitive. Valorile P1, P2 și P3 din tabel corespunde numărului de eprubete găsite pozitive. Cifra obținută la intersecția celor trei valori se va înmulți cu valoarea inversă a celei de-a doua diluții, din seria celor trei alese pentru interpretare, obținând astfel numărul de bacterii/ 1 ml sau gram de probă.
Metoda este avantajoasă în cazul microorganismelor cu mobilitate mare și care nu formează colonii pe medii solide. Avantajele apar și în cazul probelor care conțin un număr redus de microorganisme și care nu oferă informații suficiente cu privire la mărimea populației.
Fig. 26. Protocol de lucru în obținerea diluțiilor decimale
Tabelul 2.
Numerele cele mai probabile (după Alexander, 1965)
Aplicații practice
Obiective:
Determinarea numărului probabil de celule viabile cu ajutorul diluțiilor decimale și prin însămânțare pe medii lichide.
Materiale necesare:
Mediu de cultură lichid;
Probă de sol sau cultură microbiană;
Eprubete și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Realizarea diluțiilor decimale din materialul destinat studiului;
Însămânțarea a câte 5 eprubete/diluție cu 1 ml de inocul;
Incubarea eprubetelor însămânțate pentru 24-48 de ore la ;
Citirea probelor pozitive al căror conținut este opalescent;
Alegerea a trei diluții succesive și interpretarea rezultatelor pe baza tabelului lui Alexander (tabelul 2.).
Documentație de laborator
Nume:
Data:
METODE DE CUANTIFICARE A CELULELOR MICROBIENE
Determinarea celui mai probabil număr de microorganisme
Examinați eprubetele incubate și completați rezultatele în tabel.
Metode estimative de determinare a numărului de celule
Microorganismele anaerobe sau microaerofile cresc în profunzimea mediilor de cultură lichide dând mediului un aspect opalescent. Măsurarea acestei opalescențe sau a turbidității se face cu ajutorul spectofotometrului și reprezintă o funcție de creștere a celulelor microorganismelor. Această metodă de numărare microbiană se bazează pe corelația dintre turbiditatea observată și modificările numărului de celule microbiene. Densitatea optică (DO) sau curbele turbidimetrice pot fi folosite pentru estimarea numărului de celule microbiene pentru valorile observate. Acest lucru se realizează prin corelarea turbidității a diferite concentrații ale unei anumite specii de microorganisme într-un mediu lichid cu metodele de cuantificare bazate pe microscopie sau determinarea numărului de microorganisme în plăci.
Procentul de lumină reflectată este invers proporțional cu numărul de bacterii, respectiv cu cât procentul de lumină reflectată este mai mare, cu atât mai redus este numărul de microorganisme din eșantionul analizat.
O altă metodă estimativă se bazează pe analiza activității metabolice a unei culturi. Prin cuantificarea consumului de substrat energetic și formarea produșilor metabolici, se poate estima dimensiunea masei de microorganisme.
Prin uscarea culturilor se poate calcula masa uscată a celulelor, metoda fiind utilă pentru estimarea microorganismelor filamentoase. Calcularea masei uscate a celulelor presupune separarea acestora din mediu prin procedee fizice, cum ar fi filtrarea sau centrifugarea. Sedimentul rezultat în urma acestor procedee este uscat și prin cântărire se determină masa uscată.
EVALUARE
Care sunt metodele de cuantificare a celulelor microbiene?
Descrieți metoda de cuantificare a unităților formatoare de colonii.
De ce este necesară diluarea unor probe înainte de însămânțarea în plăci Petri?
Descrieți metoda de determinare a celui mai probabil număr de germeni pentru microorganismele cu mobilitate mare.
Notițe și observații:
Ce număr de colonii trebuie să conțină o placă Petri pentru a fi utilă în cuantificarea unităților formatoare de colonii?
Enumerați metodele estimative de determinare a numărului de celule.
Descrieți metoda de determinare a numărului de celule pe baza turbidității.
Notițe și observații:
DETERMINAREA RESPIRAȚIEI SOLULUI ȘI A BIOMASEI MICROBIENE
Modul de funcționare a comunităților microbiene din sol imprimă calitatea acestui substrat, microorganismele fiind implicate în toate procesele survenite la nivelul ecosistemelor. Viteza rapidă de reacție a microorganismelor chiar și la stimuli cu intensități reduse fac ca acestea să indice cu fidelitate modificările din mediu.
Dintre indicatorii globali, se poate utiliza biomasa microbiană sau respirația solului, în timp ce la nivel local se poate utiliza activitatea enzimatică a microorganismelor.
Respirația solului reprezintă cantitatea de CO2 rezultată la suprafața solului în urma proceselor respiratorii. Aproximativ jumătate din respirația solului se datorează activității comunităților microbiene heterotrofe capabile să utilizeze substraturile organice. O dată cu oxidarea substanțelor organice până la CO2 are loc și reciclarea carbonului în ecosisteme. Respirația solului oferă date particulare cu privire la modul de folosință a terenurilor, fiind în același timp și un bun indicator al toxicității produsă de pesticide și metale grele.
Biomasa microbiană este un alt parametru de monitorizare a calității solurilor, bazat pe cantitatea de CO2 eliberată de microorganisme. Biomasa microbiană este corelată cu fertilitatea solului, conținutul de materie organică, rata de descompunere și mineralizare a azotului, structura și stabilitatea solului.
Metoda respirației indusă de substrat
Metoda se bazează pe stimularea respirației datorită tratării cu concentrații crescătoare de glucoză până la atingerea ratei maxime de respirație, pe baza acestei valori putând fi estimată biomasa activă. Temperatura necesară experimentului este de 22±1șC, iar umiditatea solului să fie egală cu cea existentă în teren.
Pentru sol este necesară determinarea proprietăților fizice – analiză granulometrică și conținut de apă, și a proprietăților chimice – pH (în KCl sau CaCl2) și conținut de materie organică.
Materiale necesare
Mojar;
Mixer;
Analizor de gaz în IR sau gaz cromatograf;
Sol;
Pudră fină de D-glucoză;
Nisip fin de cuarț sau pudră de talc.
Procedura de lucru
Glucoza se mojarează împreună cu nisip de cuarț (1:6) sau cu pudra de talc (1:5) și se amestecă cu solul. Se pregătește o serie cel puțin 5 probe cu concentrații crescătoare de glucoză, mărimea probei de sol depinzând de cantitatea de sol. Pentru solul arabil, concentrațiile de glucoză sunt cuprinse în intervalul 500 – 6000 mg/kg.
Pentru determinarea concentrației optime de glucoză, se măsoară rata de degajare a CO2 din fiecare probă, pe o perioadă de cel puțin 6 ore, în fiecare oră. Din datele înregistrate se determină concentrația de glucoză la care se observă degajarea maximă de CO2.
Se consideră că, atâta timp cât producția de CO2 rămâne constantă, aceasta este datorată microorganismelor aerobe existente inițial în proba de sol. Valoarea medie a cantității de CO2 înregistrată în primele ore este folosită pentru a estima biomasa microorganismelor din proba de sol utilizând ecuația:
x = 40,04y + 0.37
în care x este biomasa microbiană exprimată în μg C/g sol, iar y este producția inițială medie de CO2 exprimată în ml CO2/g sol/oră.
Metoda prin fumigare-extracție
Metoda se bazează pe eliberarea materiei organice de origine microbiană în sol, în urma lizei celulelor datorită fumigării. Pe parcursul a 24 ore necesare acestei proceduri, fumigarea cu cloroform nu afectează materia organică nevie a solului.
Carbonul organic este extras în sulfat de potasiu (0,5 mol/l) atât din probe fumigate cât și din probe nefumigate, diferența fiind utilizată pentru determinarea carbonului de origine microbiană.
Conținutul de apă al probelor de sol trebuie să fie mai mare de 30% din capacitatea de reținere a apei (Ca). Acest considerent este necesar pentru asigurarea unei distribuții uniforme a cloroformului și eficiența fumigării.
Materiale necesare
Fumigare – extracție
Incubator,
Exsicator,
Hârtie de filtru,
Vase Petri,
Pahare de sticlă,
Flacoane de polietilenă,
Instalație de vid,
Agitator,
Congelator,
Probe de sol,
Granule antispumante,
Lubrifiant siliconic cu viscozitate medie,
Cloroform fără etanol,
Soluție de sulfat de potasiu (K2SO4=0,5 mol/l),
Calce sodată (var sodat).
Analiza spectrometrică
Analizor automat de carbon – cu detecție IR sau sistem în flux continuu cu detecție colorimetrică,
Persulfat de potasiu (K2S2O8),
Acid fosforic (H2PO4),
Polifosfat de sodiu [(NaPO3)n] – extra pur,
Reactiv cu persulfat de potasiu – obținut prin dizolvarea a 20 g persulfat de potasiu în 900 ml apă distilată, acidifiat la pH=2 cu acid fosforic și adus la un volum final de 1000 ml cu apă distilată,
Reactiv cu polifosfat de sodiu – obținut prin dizolvarea a 50 g polifosfat în 900 ml apă distilată, acidifiat la pH=2 cu acid fosforic și adus la un volum final de 1000 ml cu apă distilată.
Fumigarea
Pentru procesul de fumigare, se tapetează exsicatorul cu hârtie de filtru umectată. Probele de sol umed se cântăresc la o masă echivalentă cu 25 – 50 g sol uscat, în vase Petri sau pahare de sticlă. Se introduc în exsicator cel puțin 3 probe împreună cu un pahar cu 25 ml cloroform fără etanol, câteva granule antispumante și un pahar cu calce sodată.
Aerul se elimină din exsicator până când cloroformul începe să fiarbă intens timp de aproximativ 2 minute. În această fază, se închide robinetul exsicatorului și se incubeaă la întuneric la 22±2șC timp de 22-24 h.
Raportul dintre masa de sol și extractant este de 1:4, pentru solurile cu un conținut de maximum 20% materie organică. Peste această valoare se crește gradual raportul până la maximum 1:30 pentru solurile cu 95% materie organică (ex. stratul de litieră). După încheierea fumigării, se îndepărtează din exsicator paharul cu cloroform și hârtia de filtru. Vaporii de cloroform se scot prin evacuarea repetată a aerului din exsicator, apoi se introduc 3 probe de sol nefumigate, în vase de polietilenă, cu o masă uscată de 50g.
Extracția
Pentru extracția carbonului organic, se transferă cantitativ solul în flacoane de polietilenă și se adaugă sulfat de potasiu până la obținerea raportului sol:extractant = 1:4, cu excepția solurilor cu o cantitate de materie organică mai mare de 20%. Flacoanele se agită pe un agitator orizontal la 200r/min timp de 30 minute sau cu un agitator rotativ la 60 r/mi, timp de 45 minute. Extractele se filtrează printr-o hârtie de filtru cutată. În cazul în care analiza nu se face imediat, extractele sunt depozitate în congelator la temperaturi de -15șC până la -20șC.
Determinarea carbonului din biomasa microbiană prin analiza spectrometrică a carbonului
În prezența persulfatului de potasiu (K2S2O8) carbonul organic extractibil din sol este oxidat la dioxid de carbon și este măsurat prin metode de spectrometrie în infraroșu (IR) sau ultraviolet (UV).
Se amestecă 5 ml extract de sol în sulfat de potasiu cu 5 ml reactiv polifosfat de sodiu. Reactivul persulfat de potasiu este introdus automat în camera de oxidare în UV, unde oxidarea la CO2 este activată de lumina UV. Dioxidul de carbon rezultat este măsurat prin absorbție în IR sau detectare spectrofotometrică UV.
Calculul rezultatelor se face cu ajutorul ecuației:
C(µg / g sol uscat) = (V∙DV-B∙DB)∙(Pk/Dw+Sw)
V – C(µg/ml) din probă;
B – C(µg/ml) din blanc;
DV – diluția probei cu polifosfat de sodiu (ml);
DB – diluția blancului cu polifosfat de sodiu (ml);
Pk – masa extractantului (g);
Dw – masa uscată a probei (g);
Sw – conținutul de apă din sol (g/g sol uscat).
Biomasa microbiană se calculează cu ajutorul ecuației:
Bc = Ec / kEC
EC =(masa carbonului organic extras din solurile fumigate) – (masa carbonului organic extras din solurile nefumigate);
kEC = 0,45.
EVALUARE
Descrieți metoda respirației induse de substrat.
Descrieți metoda fumigării.
Comparați cele 2 metode determinare a biomasei microbiene.
Notițe și observații:
SIMBIOZE MICORIZIENE VEZICULAR-ARBUSCULARE
Fungii micorizieni vezicular-arbusculari s-au impus în ultima perioadă ca subiect de maximă importanță în studiile de microbiologia solului ca urmare a modului de viață arhaic, abilitatea ridicată de a forma asociații simbiotice cu peste 85% din plantele vii și potențialul de a fi utilizați ca biofertilizatori pentru sporirea producțiilor rezultate din ecosistemele agricole și silvice.
Din punct de vedere al dependenței față de plante, fungii vezicular-arbusculari sunt simbionți obligați și se pot multiplica doar pe rădăcinile unei plante gazdă, pe perioada de existență a parteneriatului simbiotic ciuperca având acces la un flux direct și relativ constant de carbohidrați (în special glucoză și sucroză) produși de plantă.
Translocarea carbohidraților are loc de obicei din frunze către sistemul radicular și apoi direct partenerului fungal, planta primind în schimb acces la extinderea în sol și capacitatea mare de absorbție a miceliului ciupercii, sporindu-și astfel suprafața de absorbție a nutrienților. Astfel, mișcarea carbohidraților, produși în timpul fotosintezei, se face de la planta gazdă (partenerul autotrof) la ciuperca simbiontă (partenerul heterotrof), iar în cazul absorbției elementelor nutritive din sol, transferul are o direcție inversă, de la ciupercă la planta gazdă.
Contribuția fungilor vezicular-arbusculari la asimilarea nutrienților este absorbția elementelor nutritive (în special fosfor) din sol, cu ajutorul hifelor extraradiculare – în special din acele porțiuni de sol la care planta nu a avut acces, ciuperca fiind capabilă să producă extracelular fosfataze pentru mineralizarea fosforului organic. Hifele ciupercii acționează similar cu perișorii absorbanți de pe rădăcina plantei. În urma comparării diametrului perișorilor absorbanți (5-20 µm) cu cel al hifelor ciupercii (3-7 µm) perișorii absorbanți ar avea câștig de cauză, dar comparând lungimea și densitatea hifelor ciupercii cu cea a perișorilor absorbanți – ciuperca ar ieși în avantaj, deoarece depășește posibilitățile de extindere ale plantei cu 10 până la 100 de ori mai mult.
Microelementele sunt necesare plantelor în cantități mici dar au o importanță deosebită pentru o creștere și o dezvoltare optimă fiind componente ale enzimelor, pigmenților și ale unor molecule biologice esențiale. Fungii vezicular-arbusculari ușurează accesul la elementele cum sunt cuprul, zincul, magneziul, cobaltul și manganul, majoritatea fiind ioni puțin mobili. În mod secundar, asimilează aceste elemente și le depozitează ceea ce duce la o scădere a toxicității lor pentru plantă.
La plante, limitările în ceea ce privește absorbția microelementelor sunt cauzate de rata de difuzie a acestora în sol, în jurul rădăcinilor. De aceea rolul fungilor micorizieni este de a le aduce mai aproape de zona în care rădăcinile plantei sunt active. Același fenomen apare și în cazul macroelementelor – azot, potasiu, sulf – ciuperca încercând să satisfacă cerințele plantei și să evite, în același timp, formarea unor zone de epuizare în jurul rădăcinilor, sporind în același timp rezistența plantelor la condiții de stres hidric.
Taxonomia fungilor micorizieni vezicular-arbusculari
Cea mai recentă taxonomie a încrengăturii Glomeromycota, în care sunt încadrați fungii vezicular-arbusculari, cuprinde 4 ordine, 10 familii și 19 de genuri (tabelul 3), la care se adaugă o serie de specii în curs de clasificare.
Tabelul 3.
Clasificarea fungilor vezicular-arbusculari
Dificultățile în cultivarea fungilor vezicular-arbusculari și a identificării stadiilor de vegetație a diferiților taxoni din sol sau rădăcini a însemnat că, până nu demult, clasificarea s-a bazat aproape în întregime pe dezvoltarea și structura pereților sporilor. Aceștia pot fi colectați din aproape orice tip de sol și folosiți pentru înființarea culturilor cu diferite plante gazdă (culturi în vase de vegetație) pentru analize sau ca inocul pentru experimente ulterioare. Multe culturi au fost înființate pornind de la un singur spor pentru a avea certitudinea că este cultivată o singură specie. În consecință, izolatele obținute prin această metodă au o bază genetică mult mai restrânsă decât speciile pe care le reprezintă.
Determinarea nivelului de colonizare a sistemelor radiculare
Pentru analizarea microscopică a fungilor vezicular-arbusculari și determinarea nivelului de colonizare al unui sistem radicular este nevoie de o colorare prealabilă a rădăcinilor care să evidențieze structurile produse de fungi față de celulele cortexului radicular.
Metoda de colorare a rădăcinilor presupune parcurgerea a 4 etape distincte:
Etapa de curățare – rădăcinile sunt imersate timp de 10 – 15 minute (în funcție de specia de la care au fost colectate) într-o soluție de 10% NaOH (hidroxid de sodiu) preparată cu apă fiartă;
Etapa de clătire – rădăcinile se clătesc de câteva ori cu apă distilată;
Etapa de colorare – presupune fierberea rădăcinilor timp de 10 – 15 minute într-o soluție de 5% cerneală (albastră, neagră sau roșie) și 5% oțet alb (provenit din oțet alimentar cu 9% acid acetic) preparată cu apă fiartă;
Etapa de decolorare – în funcție de tipul cernelii folosite rădăcinile sunt clătite timp de 10-20 de minute cu apă distilată sau timp de 3 minute cu oțet pur.
Estimarea colonizării micoriziene se face pe baza notelor acordate în funcție de dezvoltarea miceliului intraradicular și abundența arbusculilor, conform cu schema din fig. 27.
Fig. 27. Estimarea colonizării micoriziene
Parametrii colonizării se calculează pe baza următoarelor formule:
Frecvența colonizării micoriziene în sistemul radicular
Intensitatea colonizării micoriziene în sistemul radicular
(n = numărul de fragmente; 5, 4, 3, 2, 1 – încadrarea fragmentelor în clase)
Intensitatea colonizării micoriziene în fragmentele de rădăcină
Abundența arbusculilor în părțile micorizate ale fragmentelor de rădăcină
(i A3, i A2, i A1 sunt procentele de micorizare, notate cu A3, A2 și A1 și se calculează pe baza formulei:
Abundența arbusculilor în sistemul radicular
Pentru a crea o imagine cât mai completă asupra stării de colonizare micoriziană a fost creat un indice sintetic denumit grad de colonizare micoriziană:
Gc = (F*I ) / 100
Aplicații practice
Estimarea nivelului de colonizare a sistemelor radiculare
Obiective:
Evaluarea nivelului de colonizare micoriziană de la un moment dat în rădăcinile plantelor superioare.
Materiale
Rădăcini proaspete de plante;
Recipiente pentru imersarea și spălarea rădăcinilor în apă;
Hidroxid de sodiu;
Cerneală de diferite culori;
Apă distilată;
Plăci Petri;
Pensete și bisturie;
Lame și lamele de microscop.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
STUDIUL SIMBIOZELOR MICORIZIENE VEZICULAR-ARBUSCULARE
Determinarea nivelului de colonizare a sistemelor radiculare
Completați tabelul cu datele obținute în urma vizualizării rădăcinilor la microscop, pe baza schemelor prezentate anterior și efectuați calculele necesare determinării nivelului de colonizare radiculară.
Frecvența colonizării micoriziene în sistemul radicular
F % =
Intensitatea colonizării micoriziene în sistemul radicular
I % =
Intensitatea colonizării micoriziene în fragmentele de rădăcină
i % =
Abundența arbusculilor în părțile micorizate ale fragmentelor de rădăcină
a % =
Abundența arbusculilor în sistemul radicular
A % =
Gradul de colonizare
Gc %
Extracția și analiza sporilor micorizieni
Sporii reprezintă cea mai bună sursă de inocul fiind și singurele propagule cu ajutorul cărora se pot identifica speciile de ciuperci vezicular-arbusculare. Cea mai utilizată metodă de extragere a sporilor este trecerea prin site și decantarea, sporii colectați din teren fiind, de obicei, inoculați în culturi capcană – iar noua generație de spori este folosită pentru stabilirea speciilor din care fac parte.
Există trei tipuri de structuri care apar în perioada de germinare a sporilor: glob de germinație – Acaulospora (fig. 28-29), scut de germinație – Scutellospora, Racocetra, Dentiscutata, Claroideoglomus și unele specii de Pacispora (fig. 30-31), respectiv perete de germinare – specia Dentiscutata nigra, în unele cazuri germinarea având loc prin tuburi de germinare sau recreșterea hifelor de care sunt atașați sporii (fig. 32.).
Fig. 28. Glob de germinație la Acaulospora koskei și A. scrobiculata
Densitatea sporilor este extrem de variabilă, în unele habitate nu se găsesc în fiecare sezon, dar chiar și în perioada de maximum numărul sporilor nu depășește 1-5/gram de sol de pădure, până la 120 spori /gram sol agricol și aproximativ 4 spori/gram sol nisipos.
Pe medii de cultură (sol sau agar), în urma germinării, sporii produc cantități mici de miceliu presimbiotic, dar acest miceliu nu este capabil să utilizeze resursele nutritive pe care mediul de cultură i le pune la dispoziție și în absența rădăcinilor sau a exsudatelor radiculare, metabolismul este redus, în final survenind moartea.
Fig. 29. Glob de germinație la Acaulospora scrobiculata
Fig. 30. Scut de germinație la Scutellospora scutata
Fig. 30. Scut de germinație la Dentiscutata erythropa și Racocetra castanea
Fig. 31. Tuburi de germinare la Gigaspora decipiens și G. rosea
Germinarea poate fi relaționată cu perioada de repaus a sporilor, de aceea condițiile de păstrare optime – în sol uscat sau la temperaturi scăzute – cresc procentul de germinare. Alături de perioada de repaus, stabilirea condițiilor optime influențează germinarea. Variațiile de pH, temperatura maximă de germinare, efectul concentrației de fosfor și a celorlalte elemente nutritive, metalele grele (Zn, Mn și Cd), acizii organici și o gamă de zaharuri pot avea un efect inhibitor asupra germinației sporilor.
Sporii unor specii (Acaulospora laevis și Glomus caledonium) sunt adaptați supraviețuirii în cazul în care etapa de germinare nu este urmată de colonizarea rădăcinilor și stabilirea unei relații simbiotice. Alte specii sunt capabile să producă o generație nouă de tuburi de germinație dacă primele au fost tăiate sau distruse, să reînceapă o diviziune nucleară pentru înlocuirea nucleilor care au migrat în stadiile inițiale ale creșterii.
Per ansamblu, sporii apar ca fiind bine adaptați pentru rolul de unitate infecțioasă (capabilă de inițiere a colonizării). Sunt capabili să supraviețuiască un timp îndelungat în sol, au capacitatea de a germina repetat în absența rădăcinilor, menținându-și activitatea metabolică la un nivel redus. În prezența rădăcinilor și a exsudatelor radiculare stimulante, schimbările metabolice implică o creșterea a ramificării, extinderii hifale și a contactului cu rădăcina. Anastomoza hifelor între miceliile presimbiotice alăturate produce micelii de mai mari dimensiuni; astfel sunt mărite șansele de a intercepta rădăcinile adecvate, inițierea colonizării și accesarea proviziilor de zaharuri.
Aplicații practice
Extracția din sol sau culturi capcană și analiza sporilor micorizieni
Obiective:
Determinarea producției de spori micorizieni în culturi capcană (sau teren), colectarea lor din probele de sol și identificarea structurilor formate.
Materiale
Probe de sol cu rădăcini de plante;
Recipiente pentru spălarea probelor de sol în apă;
Zahăr (sucroză);
Sită cu diametrul porilor < 45 µm și sită cu diametrul porilor > 700 µm;
Centrifugă;
Plăci Petri;
Pensete și siringi de plastic;
Lame și lamele de microscop;
Reactivi PVLG (polyvinyl-lacto-glicerol) și Melzer
Procedura de lucru
Se spală solul prin cele două site într-un jet de apă;
Se recoltează rădăcinile care au rămas pe sita cu diametrul porilor < 700 µm și se utilizează pentru evaluarea nivelului de colonizare;
Se spală într-un recipient conținutul rămas pe sita cu diametrul cel mai mic al porilor;
Se agită conținutul recipientului și se transferă rapid în eprubete pentru centrifugă, până la umplerea a jumătate de eprubetă;
Se injectează o cantitate, egală cu cea din eprubetă, de soluție de sucroză 60 % în partea inferioară a eprubetei;
Se centrifughează la 3000 rotații timp de 2 minute;
Se colectează sporii prinși între stratul de lichid decantat și cel de sucroză, coborând spre baza eprubetei pentru a colecta sporii de dimensiuni mai mari;
Sporii astfel obținuți sunt trecuți pe o sită curată cu dimensiuni < 45 µm pentru a fi spălați de soluția de zahăr;
Sporii curați se analizează la un stereo microscop într-un vas Petri sau la microscop, în urma colorării cu reactiv PVLG sau Melzer.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
STUDIUL SIMBIOZELOR MICORIZIENE VEZICULAR-ARBUSCULARE
Extracția și analiza sporilor micorizieni
Completați tabelul cu datele obținute în urma vizualizării sporilor la microscop, pe baza informațiilor prezentate.
EVALUARE
Care sunt metodele de analiză a colonizării micoriziene vezicular-arbusculare?
Descrieți metoda de colorare a rădăcinilor.
Descrieți metoda de colectare a sporilor micorizieni.
Enumerați tipurile de germinare a sporilor fungilor micorizieni.
Notițe și observații:
MICROBIOLOGIA SOLULUI – IZOLAREA MICROORGANISMELOR DIN RIZOSFERĂ
Rizosfera plantelor de cultură
Rizosfera este regiunea din imediata apropiere a rădăcinilor, unde activitatea microorganismelor are o influență puternică asupra sistemului radicular al plantelor, dar poate fi definită, în același timp, și ca zona de câțiva milimetrii unde populația microbiană a solului este expusă direct influenței exsudatelor radiculare produse de plante (fig. 33.).
Numărul de microorganisme este mult mai ridicat în solul rizosferic decât în cel arizosferic, fiind influențate și de pH, umiditate, temperatură, pe lângă substanțele excretate de plante.
Fig. 33. Rizosfera
Pentru izolarea microorganismelor din rizosferă, se prepară suspensii prin amestecarea rădăcinilor de plante cu apă sterilă, suspensiile obținute constituind probele inițiale din care se execută diluțiile seriale. Pentru cuantificarea coloniilor dezvoltate de bacterii, fungi și actinomicete se inoculează câte 1 ml din fiecare diluție pe medii de cultură.
În funcție de scopul experimentului, măsurarea gradienților rizosferei este nu întotdeauna necesară,dar sunt necesare investigații asupra dinamicii proceselor rizosferei cu ajutorul cărora se stabilesc gradienții rizosferei.
Separând rizosfera de rădăcinile adiacente folosind tehnici convenționale cum ar fi periajul, agitarea și uscare este o sarcină dificilă, care aproape in mod inevitabil duce la rezultate experimentale deteriorate sau incomplete. Tocmai pentru a evita aceste rezultate s-au conceput metode experimentale care au ca și scop separarea straturilor de sol de la distanțe definite din rădăcină.
Acestea includ desene sau modele rizobox (cutii plane), sistemele – soilpackets și studiul rizosferei. Aceste tehnici utilizează în mod obișnuit plase poroase și membrane pentru a separa solul de rădăcină. În cazul sistemelor de cutii plane, rădăcină se dezvoltă pe suprafața care restricționează membranele. În funcție de lățimea ochiurilor, firele de rădăcină pot sau nu să crească în compartimentul sol.
Sisteme cu incinte închise. Metodele prezentate în această secțiune permit diferențierea vizuală a solului vrac și zonele rizosferei și / sau observarea dezvoltării structurii rădăcinii prin ferestre acrilice. Două sisteme – cutii dimensionale (2D) umplute cu agar de exemplu , nu pot scoate in evidență dinamica creșterii rădăcinii răsadului si dezvoltarea acesteia.
Sistemele "Hohenheim" de tip rizobox și rizotron sunt la fel ca și sistemele cutii plane de creștere cu o fereastră acrilică în partea de jos. Cutiile sunt fixate în timpul creșterii, la un unghi de aproximativ 35°- 45°.
Dezvoltarea de rădăcini geotropic pozitive în creștere poate fi observată prin ferestrele acrilice. Sistemele pot fi echipate cu cupe de aspirație micro pentru colectarea de soluție vrac și rizosferă, senzori micro pentru măsurători de pH și redox, tije cu ajutorul cărora se observă reflectometria pentru măsurarea conținutului de apă.
În mod alternativ fereastra acrilică poate fi îndepărtată pentru a colecta sol sau părți ale rizosferei pentru analize chimice sau pentru aplicarea indicatorilor de colorare pentru vizualizarea rădăcinii sau pentru inducerea modificărilor pH-ului (fig. 34.).
Fig. 34. Sisteme de tip incintă închisă
Contribuția in explorarea rizosferei. Sistemele de tip rizobox reprezintă sisteme simple care permit investigații la nivel de rădăcină . În funcție de scopul experimentului acesta poate fi un avantaj în comparație cu alte sisteme de livrare ale regiunilor apicale și bazale, deoarece pot fi investigate separat. Cu toate acestea, numai o cantitate limitată de sol rizosferic poate fi colectat limitând gama de parametric pentru analiza chimică.
Sisteme de creștere hidroponice. Plantele sunt cultivate în soluție nutritivă aerată, care pot fi ajustate la condițiile necesare creșterii (starea nutrițională, pH-ul, poluanți, etc.). Cultivarea în condiții sterile este posibilă (fig. 35.).
Pentru stabilizarea pH-ului, de obicei soluțiile tampon de substanțe chimice sunt adăugate la soluție (de exemplu, MES – acid 2-morfolinoetansulfonic). Pentru a menține condiții alcaline, a fost stabilită o metodă de titrare automatizată. De obicei, plantele sunt pre-cultivate în materiale fără sol (de exemplu, perlit sau amestecuri de perlit și vermiculit). Utilizarea recipientelor din plastic cu volum mic permite efectuarea unui număr mare de experimente paralele cu un număr mare de plante individuale.
Fig. 35. Sistem hidroponic
O aplicație specifică este cultura în condiții aeropone, în cazul în care sunt nutrienți translocați la rădăcinile plantelor printr-o ceață. Acest sistemul permite o creștere rapidă a rădăcinii și firele de rădăcină, care pot fi ușor colectate pentru analize ulterioare.
Contribuția în explorarea rizosferei. Sistemele hidroponice pot fi utilizate pentru răsaduri cât și pentru plante mature. De asemenea, utilizarea pe termen scurt și pe termen lung este posibilă iar condițiile sterile pot fi realizate, dacă este necesar.
Elongația rădăcinii. Monitorizarea directă a elongației rădăcinii se poate face prin tehnica șanțului de perete, folosind ferestre de observare ale rădăcinii sau prin utilizarea rizotroanelor sau minirizotroanelor. Monitorizarea indirectă a elongației rădăcinii se poate face prin imagistica, prin rezonanța magnetică sau radiografia cu neutroni.
Tehnica șanțului de perete este utilă în special pentru examinarea rădăcinilor grosiere, dar a fost de asemenea utilizată pentru studierea creșterii rădăcinii și distribuției spațiale în domeniu, cu hărți orizontale și verticale (metoda profil de perete).
Tehnica rădăcină-fereastră presupune o sticlă de 6 până la 8 mm grosime transparentă sau o placă de plexiglas presată pe profilul de sol pentru investigarea dezvoltării morfologice a rădăcinilor precum și modificările fenologice și durata de viață sau mortalitatea de rădăcini individuale.
Ferestre rădăcină și profilele de sol sunt adecvate pentru studierea sistemului de rădăcină întreg și pentru a descrie modelele de distribuție spațială a rădăcinilor, în ceea ce privește, de asemenea, la condițiile locale de sol.
Separarea solului și rizosferei prin agitare și / sau spălarea sistemului radicular
Prelevarea de probe prin extracție și agitare a sistemului radicular este cea mai ușoară metodă de utilizat. Cu toate că este cea mai folosită metodă, descrieri detaliate nu prea există.
Rezultatele metodei sunt, în general, nu foarte bine definite, deoarece textura solului și umiditatea reală a solului influențează puternic cantitatea de sol aderat la rădăcină la scoaterea acesteia din sol.
Acești parametri au, de asemenea, o influența asupra cantității de sol, care se încadrează în jos atunci când tremura sistemul radicular ,precum și cu privire la cantitatea de sol care rămâne lipit de rădăcini chiar și după procedura de agitare.
Tehnica straturilor de sol înghețat. Tehnicile de feliere subțire au nevoie de sisteme de creștere speciale care să permită dezvoltarea unui covoraș de rădăcină la interfața cu solul.
O modificare a acestei metode pentru studiile firelor de rădăcină este că tăierea în felii subțiri se face după ce solul este înghețat în azot lichid, pentru a evita întinderea atunci când solul este feliat cu un microtom.
Depinde de configurația experimentală,care dintre cele două metode este mai favorabilă. Un microtom de congelare are avantaje, atunci când sistemele mici de creștere și solurile cu conținut de argilă mai mare sunt folosite.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul rizosferei plantelor de cultură.
Materiale necesare:
Mediu de cultură și apă distilată sterile;
Probă de sol rizosferic;
Eprubete, plăci Petri și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Se separă solul rizosferic de pe câteva rădăcini și se colectează într-o placă Petri;
Se adaugă 1 g de sol în 10 ml de apă distilată sterilă și se notează eprubeta ca fiind proba brută;
Se diluează serial proba brută prin transferarea unui volum de 1 ml de soluție în 9 ml apă distilată sterilă;
Se prepară diluții până la 10-6;
Se transferă câte 1 ml din fiecare suspensie în plăcile Petri;
Peste suspensie se adaugă în fiecare placă Petri câte 15 ml de mediu de cultură, separat pe fiecare grupă de microorganisme: pentru bacterii se vor utiliza diluțiile 10-4 până la 10-7, pentru actinomicete – diluțiile de la 10-3 la 10-6, iar pentru fungi – diluțiile 10-2 la 10-5;
Se incubează plăcile în poziție inversată timp de 24-48 ore, la o temperatură de 37˚C – pentru bacterii, și 2-6 zile la 27˚C – pentru fungi.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
Izolarea microorganismelor din rizosferă
Observați plăcile Petri incubate și completați rezultatele în tabel.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul rizosferei plantelor de cultură.
Se vor construi sisteme de monitorizare a parametrilor de rizosferă conform metodelor de tip incintă închisă, a sistemelor de creștere hidroponice și a celor pentru vizualizarea elongației rădăcinii.
Selecția și izolarea microflorei din sol.
Microorganismele din sol sunt deosebit de importante pentru ecologia oricărui ecosistem, acționând direct asupra structurii și fertilității prin activitatea lor metabolică. Numărul de microorganisme prezente la un moment dat în sol este direct proporțional cu nivelul sursei de carbon destinată energiei proceselor metabolice, cele mai bine reprezentate fiind bacteriile datorită dimensiunii și biomasei reduse.
Populațiile de actinomicete sunt de 10 ori mai reduse decât cele bacteriene, dar dimensiunea mai mare a indivizilor face ca biomasa să fie aproximativ aceeași cu cea a bacteriilor.
Dominația în sol, în special în solurile neperturbate, este atribuită populaților de fungi, având o biomasă și o dimensiune mult mai ridicată decât bacteriile și actinomicetele.
Izolarea microorganismelor dintr-o probă de sol se bazează pe ipoteza formării unei noi colonii pornind de la fiecare microorganism viabil în urma transferului pe medii de cultură, iar numărul de colonii formate oferă valoarea dimensiunii populațiilor din proba analizată.
În procedura de izolare a microorganismelor din sol se utilizează metoda diluțiilor seriale (fig. 36), fiind necesară diluarea unei cantități de 10g de sol în 90 ml apă sterilă, ceea ce va reprezenta diluția de 10-1. Diluțiile de 10-2 până la 10-7 se obțin transferând câte 1 ml din diluția anterioară într-un volum de 9 ml apă sterilă. După obținerea tuturor diluțiilor, se transferă o cantitate de 0.1 ml soluție în plăci Petri, iar apoi se adaugă câte 15 ml de mediu de cultură steril în fiecare placă.
Selectarea diluțiilor se face în funcție de categoria de microorganisme, pentru fungi fiind utile diluțiile de la 10-2 la 10-5, 10-3 până la 10-6 pentru actinomicete și 10-4 până la 10-7 pentru bacterii (fig. 36.).
Plăcile inoculate se incubează într-o poziție inversată timp de 3 până la 7 zile, la o temperatură de 25˚C.
Fig. 36. Izolarea microorganismelor din sol
După trecerea termenului de incubare, se numără coloniile formate în plăcile Petri, rezultatele fiind raportate la diluțiile corespunzătoare fiecărei plăci, conform formulei, și transformate în spori sau număr de celule / gram de probă.
Factorul de diluție reprezintă valoarea inversă a diluției:
Ex: Diluția 10-2 = factor de diluție 102.
Aplicații practice
Obiective:
Izolarea microorganismelor din sol.
Materiale necesare:
Mediu de cultură și soluție de NaCl 0,85%;
Probă de sol;
Eprubete, plăci Petri și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Se colectează probele de sol din teren, din mai multe locuri, pentru a obține o probă omogenă;
Se etichetează eprubete cu câte 90ml soluție NaCl 0,85% sterilă cu numere de la 1 la 7, iar o serie de plăci Petri cu numărul diluției care urmează să fie însămânțată: 10-2 – trei plăci, 10-3 – șase plăci, 10-4 și 10-5 – nouă plăci, 10-6 – șase plăci, respectiv 10-7 – trei plăci;
Se adaugă 10g de sol uscat în eprubeta etichetată cu numărul 1 și se amestecă până la obținerea unei suspensii uniforme;
Se transferă 1 ml de suspensie în eprubeta etichetată cu numărul 2, amestecându-se până la omogenizarea suspensiei, continuând procedura până la finalizarea tuturor diluțiilor;
Se transferă câte 0.1 ml din fiecare suspensie în plăcile Petri corespunzătoare diluțiilor obținute;
Peste suspensie se adaugă în fiecare placă Petri câte 15 ml de mediu de cultură, separat pe fiecare grupă de microorganisme: pentru bacterii se vor utiliza diluțiile 10-4 până la 10-7, pentru actinomicete – diluțiile de la 10-3 la 10-6, iar pentru fungi – diluțiile 10-2 la 10-5;
Se incubează plăcile în poziție inversată timp de 2-7 zile, la o temperatură de 25˚C.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
Izolarea microorganismelor din sol
Examinați plăcile Petri incubate și completați rezultatele în tabel.
EVALUARE
Descrieți metoda de izolare a microorganismelor din sol.
Care sunt diluțiile necesare pentru izolarea bacteriilor, fungilor și actinomicetelor?
Care sunt populațiile cele mai importante de microorganisme din sol și care sunt mai abundente?
Criterii de selecție a diluțiilor pentru izolarea microorganismelor din sol.
Ce este rizosfera?
Descrieți metoda de izolare a microorganismelor din rizosferă.
Notițe și observații:
CIRCUITUL MICROBIAN AL CARBONULUI – TRANSFORMĂRI ALE MATERIEI ORGANICE ÎN ECOSISTEME
Diversitatea largă a organismelor are trăiesc pe Terra a constituit o fascinație și o preocupare constantă a cercetătorilor din domeniul ecologiei. În general, cercetările privind înțelegerea funcționării comunităților ecologice și descifrarea tiparelor diversității s-au axat pe studii la suprafața solului, fără a conecta componentele subterane cu cele supraterane. În acest moment informația științifică este redusă la o serie de ecosisteme specifice și un număr redus de grupuri funcționale, biodiversitatea solului fiind prea puțin explorată, cauza acestor lacune fiind dificultatea studierii comunităților din sol.
Interfața sol-rădăcini de plante este un habitat unic, exudatele radiculare stimulând instalarea unor grupuri microbiene active. Interacțiunile și capacitatea de colonizare a microorganismelor acționează fie spre stimularea creșterii plantelor sau dimpotrivă, în lipsa filtrului de rizosferă, spre perturbare concomitent cu instalarea patogenilor. Cerința pentru soluții nutritive din rizosferă conduce la apariția competiției pentru colonizarea microbiană a acestei zone, odată cu mobilizarea puternică a nutrienților și apariția limitărilor nutriționale.
Limitările majore în explorarea structurii și funcționalității populațiilor din rizosferă se datorează în special lipsei tehnicilor in situ de analiză a populațiilor la scară redusă sau observarea activității la nivel celular. În contrast cu cunoștințele referitoare la macroorganisme, zonarea biogeografică a comunităților microbiene se datorează în special condițiilor edafice și în special pH-ului, la acestea adăugându-se și depozitele rizosferice create de plante în sol aspect care favorizează instalarea grupurilor funcționale microbiene specializate. Evaluarea comportamentului microorganismelor în rizosferă este o necesitate pentru înțelegerea funcționalității și echilibrului ecosistemelor, conectarea nivelului diversității supra- și subterane în ecosistemele de pajiști, odată cu descoperirea direcției gradientului semnalelor și nutriției în interfața plantă-sol.
În solurile ecosistemelor din zonele temperate, limitările nutriționale ale grupurilor microbiene se datorează în special azotului, amino-acizii jucând un rol important în procesele metabolice ale microorganismelor, evaluarea amprentei amino-acizilor fiind un indicator al nivelului biodiversității. Conversia ecosistemelor și managementul aplicat suprafețelor modifică structura comunităților microbiene, chiar și în condiții de control al tehnologiilor aplicate. Fertilizarea cu fosfor corelată cu speciile existente în ecosistem stabilesc structura comunităților microbiene, în timp ce fertilizarea îndelungată cu azot modifică dominanța în comunitate de la fungi la bacterii. Întreruperea managementului aplicat conduce la o modificare a dominanței fungilor în comunitatea microbiană din sol. Toate aceste aspecte impun identificarea potențialului activității microbiene din rizosferă și stabilirea unor sisteme de manageriere a suprafețelor eficiente din perspectivă ecologică.
Circuitul intern al elementelor în ecosistemelor periale susține fertilitatea naturală a solului, clima acționând spre limitarea activităților microflorei și faunei. Compensarea cu fertilizări organice a nutrienților îndepărtați din ecosistem prin producție conduce la introducerea în ecosistem a unei materii organice cu grade diferite de descompunere. Recircularea nutrienților este procesul microbian principal în sol, în special mineralizarea carbonului organic printr-o varietate de procese de respirație și fermentație poate conduce la pierderi ridicate în atmosferă în cazul aplicării unor tehnologii de întreținere improprii.
Materia organică introdusă post-recoltare în ecosistem, alături de resturile vegetale, reprezintă o sursă nutritivă complexă necesară completării proceselor metabolice microbiene, în primul an fiind degradate aproximativ 70% din cuantumul total al resturilor vegetale în solurile din zonele temperate. Compostul și gunoiul de grajd eliberează în atmosferă compuși volatili – acizi grași, fenoli, indoli, acetonă, alcooli, cetone, aldehide, sulfuri și esteri, cu rol de semnal în sol pentru începerea colonizării micoriziene, stoparea activității enzimatice fungice și reglarea capacității de competiție între grupurile microbiene. Capacitatea de descompunerea microbiană este mai redusă pentru compușii proteici, lipidici și aromatici datorită lipsei enzimelor extracelulare specializate sau a mecanismelor de absorbție la nivel celular.
Strategia de reacție a microorganismele din sol la limitările impuse de disponibilitatea substrat este canalizată fie spre o afinitate redusă față de substrat (concomitent cu proliferarea populațională), fie utilizarea eficientă a substraturilor și cu o creștere populațională redusă. În ecosistemele montane, comunitățile microbiene trăiesc în condiții de mix al substraturilor, ceea ce implică o flexibilitate metabolică crescută și o capacitate de competiției ridicată a indivizilor.
Celuloza este cel mai comun substrat organic în natură, sintetizată de plante și microorganisme, în ordinea importanței fiind urmată de hemiceluloză și chitină, degradarea fiind un proces extracelular aerob (cu eliberare de CO2) și anaerob (cu eliberare de CO2 și CH4) cu ajutorul celulazelor excretate de bacterii și fungi. Zaharurile sunt descompuse fie pe cale glicolitică în condiții aeorbe de bacteriile de fermentație fie în mod altenativ prin sistemul Entner–Doudoroff. Lipidele sunt hidrolizate de lipaze în mono- și digliceride, glicerol și acizi grași, iar hidrocarburile sunt degradate aerob în mod direct până la alcani ciclici și anaerob concomitent cu procesele de denitrificare, reducerea sulfaților și metanogeneza. Compușii aromatici sunt supuși degradării bacteriene aerobe prin reacții de hidroxilare iar anaerob în timpul proceselor de reducere a nitraților și fermentare, lignina și compușii humici fiind descompuși doar în prezența oxigenului – anaerobioza acționând ca un conservant.
Evoluția microorganismelor în sol a condus la apariția unui număr ridicat de modalități ale fixării CO2 în mod autotrof, cel mai vechi sistem fiind ciclul 3-hidroxipropionat prezent la bacteriile verzi nesulfuroase și la reprezentanții aerobi ai grupului Archaea. Bacteriile autotrofe fixatoare de CO2 obligate nu sunt capabile de utilizarea altor compuși organici, în timp ce la autotrofele facultative fixarea CO2 este stopată în prezența altor substrate organice disponibile pentru descompunere metabolică. Singurele microorganisme capabile de utilizarea surselor de carbon organic concomitent cu fixarea CO2 sunt mixotrofele. Fotoautotrofele facultative utilizează în mod preferențial substratele organice ca sursă de carbon dar sunt capabile de fixarea CO2 în condițiile disponibilității în exces a echivalenților reducători în sol.
Cantitatea ridicată de materie organică, porozitatea și particulele solului ecosistemelor montane, în special a pajiștilor, oferă un habitat complex pentru co-existența unui număr ridicat de grupuri funcționale, cu un număr ridicat de indivizi capabili de exploatarea resurselor. Succesiunea activității microorganismelor este datorată în special condițiilor climatice și nutriționale, cu stadii de latență suprapuse peste proliferări puternice, eliberând în sol produși de metabolism în schimbul consumului de energie.
Aplicații practice
Obiective:
Estimarea humusului din sol și gunoi de grajd.
Materiale necesare:
Soluție de extracție (44,6 g pirofosfat de Na și 4 g NaOH / 1 l apă) ;
Gunoi de grajd și probe de sol expus la biomasa vegetală;
Recipiente de sticlă.
Procedura de lucru:
Se ia o cantitate de 20 g sol sau gunoi de grajd și se adaugă în 100 ml soluție de extracție;
Se agită recipientele și se lasă la decantare timp de 18 ore;
Se filtrează soluția prin hârtie de filtru – resturile rămase la suprafața filtrului alcătuiesc humine, iar filtratul este humusul;
Pentru înlăturarea sodiului se pune proba de humus în hârtie de copt și se lasă într-un flux de apă timp de 24 ore;
Se măsoară volumul observat, apoi se pune o cantitate de 10 ml într-un pahar în etuvă la 70șC;
Rezultatele exprimă procentul de humus din 10 ml soluție și se raportează la proba inițială.
EVALUARE
Descrieți dinamica transformării substanțelor în sol relaționat la metabolismul microbian.
Care sunt factorii care afectează transformarea materiei în sol?
Notițe și observații:
MICROORGANISME IMPLICATE ÎN CIRCUITUL AZOTULUI
Ciclul azotului în natură implică un număr ridicat de procese și organisme, responsabile de transformarea azotului într-o formă asimilabilă și pus la dispoziția plantelor (fig. 37.). Din punct de vedere chimic, azotul este un element esențial în sinteza proteinelor funcționale și structurale ale tuturor organismelor vii.
În sistemele agricole, nivelul de azot existent în sol este corelat puternic cu productivitatea, acest aspect sporind în special importanța acordată microorganismelor capabile de conversia azotului în forme inaccesibile plantelor și care pot conduce la pierderea fertilității solului.
Fig. 37. Schema ciclului azotului în natură
Procese de amonificare
Procesul de producere a amoniacului din compuși organici poartă numele de amonificare, la acest proces participând majoritatea populațiilor bacteriene din sol.
În această etapă de transformare a azotului, proteinele sunt descompuse în amino-acizi, care la rândul lor sunt supuși unui proces de de-aminare pentru a putea elibera moleculele de amoniac în momentul morții organismelor vii. Alături de amoniac, pe parcursul procesului de amonificare sunt produși și acizi nucleici, uree sau acid uric.
Amonificarea este caracteristică populațiilor bacteriene de Bacillus, Clostridium, Proteus, Pseudomonas, și Streptomyces, acestea purtând numele de bacterii amonificatoare (fig. 38 – 41.).
Fig. 38. Bacillus subtilis
Fig. 39. Proteus sp.
Fig. 40. Pseudomonas sp.
Fig. 41. Streptomyces sp.
Aplicații practice
Obiective:
Demonstrarea procesului de amonificare.
Materiale necesare:
Bulion peptonat;
Probă de sol;
Anse;
Eprubete;
Reactiv Nessler;
Plăci cu cavități pentru teste rapide;
Albastru de brom-timol;
Scală de interpretare a pH-ului.
Procedura de lucru:
Se cântăresc 0,1 grame de sol;
Se pune bulion peptonat în două eprubete;
Se adaugă solul într-una dintre eprubetele cu bulion peptonat;
Se etichetează eprubeta și se incubează la temperatura camerei cu capacul ușor desfăcut, timp de o săptămână;
La încheierea perioadei de incubare se pune o picătură de reactiv Nessler într-una din cavitățile plăci de teste rapide (fig. 39.);
Se transferă o picătură de bulion inoculat peste reactivul Nessler;
Se transferă o picătură de bulion neinoculat într-o altă cavitate, peste reactiv Nessler;
Se verifică pH-ul fiecărei eprubete prin transfer în alte două cavități, peste care se va adăuga albastru de brom-timol, fiind comparate cu scala de interpretare.
Interpretarea rezultatelor:
Nici o culoare – nu există amoniac în probă (-);
Culoare portocaliu pal – cantități reduse de amoniac (+);
Portocaliu – cantități medii de amoniac (++);
Precipitat maro – cantități ridicate de amoniac (+++).
Se compară rezultatele obținute cu eprubeta neinoculată.
Testarea puterii de amonificare:
Documentație de laborator
Nume:
Data:
TRANSFORMĂRI BIOLOGICE ALE AZOTULUI ÎN SOL
Procesele de amonificare
Observați culoarea de pe placa de testare și treceți rezultatele în tabel.
Procese de nitrificare
Unele microorganisme sunt capabile de utilizarea nitraților ca acceptori de electroni (agenți oxidanți care acceptă electroni în reacțiile redox) și să metabolizeze substanțele organice în lipsa oxigenului, proces denumit nitrificare, iar în urma acestuia fiind eliberați în sol nitrați cu solubilitate ridicată și care sunt ușor de asimilat de către bacteriile fotoautotrofe, alge și plante pentru a fi convertiți în amino-acizii necesari creării propriilor enzime și protoplasmă (fig. 42.).
Microorganismele responsabile de procesul de nitrificare sunt bacteriile chemoautotrofe din genurile Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrococcus și Nitrosococcus (fig. 43 – 44), procesul având loc în prezența oxigenului, deci este mai puternic în solurile bine aerate.
Fig. 42. Diagrama procesului de Nitrificare
În sol există o serie de microorganisme heterotrofe capabile să producă nitrați și nitriți, dar în cantități reduse iar aportul lor la nivel global este insignifiant, principalele microorganisme care sunt implicate în aceste reacții fiind bacteriile din genurile Nitrosomonas și Nitrobacter, Gram negative și care se dezvoltă cel mai bine pe medii de cultură anorganice.
Fig. 43. Nitrobacter sp.
Fig. 44. Nitrosomonas sp.
Procese de denitrificare
O serie de microorganisme sunt capabile să utilizeze nitrații ca acceptori de electroni și să metabolizeze substanțele organice în lipsa oxigenului, pe parcursul acestui proces nitrații fiind reduși la nitriți, apoi la oxid de azot și în final la azot molecular.
Procesul provoacă pierderi de fertilitate în solurile în care este prezent pe baza difuziei azotului molecular în atmosferă și poartă denumirea de denitrificare.
Bacteriile responsabile pentru denitrificarea solurilor fac parte din genurile Alcaligenes, Bacillus, Paracoccus și Pseudomonas (fig. 45 – 48.), frecvente în solurile cu exces de umiditate, cu o aerare deficitară.
Fig. 45. Alcaligenes sp.
Fig. 46. Bacillus sp.
Fig. 47. Paracoccus denitrificans
Fig. 48. Pseudomonas stutzeri și P. aeruginosa.
Aplicații practice
Obiective:
Demonstrarea procesului de denitrificare.
Materiale necesare:
Bulion nitrat – pentru evidențierea reducerii nitaților;
Probă de sol;
Eprubete;
Tuburi Durham.
Procedura de lucru:
Se cântăresc 0,1 grame de sol și se adaugă într-o eprubetă conținând bulion nitrat (bulion pentru formarea azotului gazos);
Se incubează timp de o săptămână la temperatura camerei cu capacul slab strâns;
După perioada de incubare se verifică producerea de azot gazos;.
Rezultatele se compară cu o eprubetă de control neinoculată.
EVALUARE
Care sunt principalele microorganisme implicate în procesul de nitrificare?
Care sunt principalele microorganisme implicate în procesul de amonificare?
Care sunt principalele microorganisme implicate în procesul de denitrificare?
Descrieți procesul de nitrificare.
Notițe și observații:
FIXAREA SIMBIOTICĂ ȘI NESIMBIOTICĂ A AZOTULUI
Bacterii fixatoare de azot non-simbiotic
Fixarea nesimbiotică a azotului este un proces complex, prezent în orice ecosistem terestru, având loc la suprafața plantelor și în frunze, pe substratul organic mort de la suprafața solului și în sol, iar resursa atmosferică pusă la dispoziția microorganismelor implicate în acest proces fiind practic nelimitată.
De-a lungul evoluției, fixarea nesimbiotică a azotului a devenit o sursă critică de azot, în special în ecosistemele cu un număr redus de plante capabile de asociere cu microorganismele pentru o fixare simbiotică.
Cel mai reprezentativ gen de bacterii capabile de fixarea nesimbiotică a azotului este Azotobacter, în sol fiind mai des întâlnite speciile A. chroococcum, A. agilis, A. paspali și A. vinelandii. Azotul atmosferic este transformat de aceste bacterii în amoniac, o formă accesibilă plantelor ca sursă de azot, pe lângă azot mai fiind capabile să producă și polizaharide.
Alături de Azotobacter, au fost identificate și o serie de bacterii din genurile Beijerinckia, Derxia, Azomonas, Bacillus, Clostridium, Desulfovibrio, Chlorobium, Rhodopseudomonas și Rhodospirillum (fig. 49 – 52.).
Fig. 49. Azotobacter sp.
Fig. 50. Rhodopseudomonas sp.
Fig. 51. Chlorobium sp.
Fig. 52. Rhodospirillum sp.
Aplicații practice
Obiective:
Izolarea bacteriilor fixatoare de azot non-simbiotic din sol.
Materiale necesare:
Probă de sol;
Mediu de cultură cu manitol și Ashby;
Apă distilată;
Anse pentru inoculare;
Eprubete, plăci Petri și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Se prepară 50 ml bulion manitol fără azot;
Se inoculează 1 ml de sol fin cernut;
Mediul inoculat se incubează timp de 7 zile la temperatura camerei;
La suprafața mediului se va observa apariția unei pelicule;
Se transferă o cantitate redusă din peliculă pe o placă Petri cu mediu manitol agar steril;
Placa însămânțată este incubată timp de 3 zile la temperatura camerei, în poziție inversată.
Rezultate și observații:
Speciile de Azotobacter și Azomonas produc colonii apoase și pigmenți de culoare maro, negru sau incolori.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
MICROBIOLOGIA SOLURILOR
Bacterii fixatoare de azot non-simbiotic
Observați plăcile Petri incubate, efectuați preparate microscopice și completați rezultatele în tabel.
Cianobacterii fixatoare de azot
Fixarea nesimbiotică a azotului este întâlnită în ecosisteme și la cianobacterii (bacterii fototrofe) capabile și de producerea oxigenului prin procese de fotosinteză. O caracteristică aparte a cianobacteriilor este dată de sensibilitatea ridicată față de oxigen a nitrogenazei (enzima responsabilă de fixarea azotului), iar din acest motiv cele două procese nu pot avea loc concomitent în celulele cianobacteriene.
Unele tulpini filamentoase de cianobacterii au evoluat spre producerea unor celule terminale diferențiate, morfologic distincte, specializate în fixarea azotului – numite heterociști (fig. 53.). Acest tip de evoluție permite filamentelor care conțin heterociști să beneficieze atât de procesul de fixare fotosintetică a dioxidului de carbon (în celulele vegetative) cât și de fixarea anaerobă a azotului atmosferic (în heterociști).
Fig. 53. Heterociști
Mai cunoscute sunt genurile Nostoc, Anabaena, Aulosira, Cylindrospermum și Trichodesmium (fig. 54 – 58.).
Fig. 54. Nostoc sp.
Fig. 55. Anabaena sp.
Fig. 56. Aulosira sp.
Fig. 57. Cylindrospermum sp.
Fig. 58. Trichodesmium sp.
Aplicații practice
Obiective:
Izolarea cianobacteriilor din apă și sol.
Materiale necesare:
Probă de sol;
Pipete sterile (10 ml);
Pahare Erlenmeyer (250 ml);
Cameră de creștere iluminată;
Ace de însămânțare;
Bec de gaz;
Apă distilată sterilă
Mediu de cultură pentru cianobacterii steril.
Procedura de lucru:
Se diluează în apă distilată sterilă proba de sol / apă pentru obținerea diluțiilor 10-2 până la 10-7;
Se adaugă câte 1 ml în pahare Erlenmeyer, peste 20 ml mediu steril;
Se incubează paharele la o temperatură de 30˚C±1˚C pentru o perioadă de 2-3 săptămâni, cu un regim al luminii alternativ de 12 ore de iluminare cu 12 ore de întuneric;
După formarea coloniilor individuale la suprafața mediului se transferă o parte dintre ele pe agar înclinat și se incubează în același mod.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
MICROBIOLOGIA SOLURILOR
Izolarea cianobacteriilor fixatoare de azot
Observați la microscop coloniile de cianobacterii obținute în urma incubării, comparați imaginile cu diagrama cianobacteriilor și completați rezultatele în tabel.
EVALUARE
Care sunt cele mai importante microorganisme fixatoare de azot nesimbiotic?
Descrieți procesul de fixare nesimbiotică a azotului.
Care sunt adaptările cianobacteriilor pentru procesul de fixare nesimbiotică a azotului?
Studiul bacteriilor fixatoare de azot în mod simbiotic
Fixarea simbiotică a azotului în plante are loc atât în nodozitățile radiculare leguminoaselor cât și în nodozitățile dezvoltate pe rădăcinile altor plante. Bacteriile care formează rizobii sunt obiectul celor mai intense studii cu privire la fixarea azotului în mod simbiotic fiind direct implicate în managementul nivelului de fertilitate al solurilor destinate culturilor agricole.
Taxonomia actuală a bacteriilor capabile să formeze rizobii cuprinde 13 genuri cu un număr variabil de specii capabile de nodulare:
Rhizobium (49 specii),
Mesorhizobium (21 specii),
Ensifer (Sinorhizobium obs. – 17 specii),
Bradyrhizobium (9 specii),
Burkholderia (7 specii),
Phyllobacterium (3 specii),
Microvirga (3 specii),
Azorhizobium (2 specii),
Ochrobactrum (2 specii),
Methylobacterium (1 specie),
Cupriavidus (1 specie),
Devosia (1 specie),
Shinella (1 specie).
Numărul mare de specii capabile să formeze rizobii stabilește genurile Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer și Bradyrhizobium (fig. 60 – 62.) ca fiind de cea mai mare importanță în managementul aplicat al sporirii nivelului de fertilitate al solului în mod natural, studiile efectuate asupra celorlalte genuri urmând să propună noi direcții spre creșterea eficienței fixării azotului atmosferic.
Fig. 60. Rhizobium sp.
Fig. 61. Ensifer sp.
Fig. 62. Bradyrhizobium sp.
Aplicații practice
Izolarea bacteriilor fixatoare de azot
Obiective – Bacteriile fixatoare de azot pot fi izolate fie în urma colectării nodozităților crescute în mod natural pe rădăcinile leguminoaselor cultivate în câmp, fie prin inducerea formării de nodozități, în condiții controlate, în urma inoculării semințelor de leguminoase cu suspensie de sol.
Materiale:
Ustensile pentru recoltarea monoliților de sol;
Recipiente pentru imersarea monoliților în apă și site pentru recoltarea nodozităților;
Etanol (95%);
Soluție dezinfectantă;
Apă sterilă;
Eprubete;
Baghete de sticlă;
Plăci Petri cu mediu de cultură YEMA (Agar manitol cu extract de drojdii) steril.
Procedura:
1. Se recoltează monoliți de sol și plante de diametru în jurul tulpinii și pe o adâncime de .
2. Monolitul se extrage din sol și se îndepărtează cu grijă solul de pe rădăcini, fără a se detașa rădăcinile secundare. Procedura se poate ușura prin imersarea monolitului în apă și lăsarea solului să decanteze la baza recipientului. Cu ajutorul unei site se pot colecta nodozitățile care se detașează de rădăcini.
3. Nodozitățile recoltate se imersează în etanol (95%) timp de 10-15 secunde, apoi în dezinfectant pentru o perioadă de 3-4 minute.
4. După dezinfectare nodozitățile se spală cu apă sterilă cel puțin 5 minute.
5. Se zdrobește fiecare nodozitate în eprubetă cu o baghetă de sticlă sterilă, apoi se adaugă apă sterilă pentru producerea unei suspensii. Din fiecare eprubetă se transferă o picătură de suspensie în plăcile cu mediu YEMA (Agar manitol cu extract de drojdii).
6. Se trasează striuri la suprafața mediului de cultură, obținându-se astfel o diluare progresivă a suspensiei în mediu.
7. Se incubează plăcile cu capacul în jos la o temperatură de 25-. Observarea culturilor se face zilnic până la apariția coloniilor bacteriene tipice.
8. Se fac frotiuri după metoda de colorare Gram și se analizează la microscop, pentru evaluarea celulelor bacteriene.
9. Se recoltează inocul bacterian din coloniile tipice izolate și se reînsămânțează în plăci cu mediu de cultură proaspăt pentru obținerea culturilor pure. În cazul apariției unui număr mare de colonii tipice, este indicată însămânțarea de plăci Petri cu inocul din fiecare colonie.
10. Se inoculează plante cu material microbian provenit din fiecare cultură pură, pentru confirmarea abilității de formare a nodozităților.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
STUDIUL BACTERIILOR FIXATOARE DE AZOT
Izolarea bacteriilor fixatoare de azot
Completați tabelul cu caracteristicile morfologice ale celulelor vizualizate la microscop și datele obținute în urma recoltării rizobiilor de pe rădăcinile plantelor leguminoase.
Aplicații practice
Cuantificarea bacteriilor fixatoare de azot
Obiective – Cuantificarea infectării plantelor (denumită și tehnica celui mai probabil număr – CMPN) este o tehnică utilizată pentru determinarea bacteriilor viabile în prezența altor microorganisme. Metoda este utilizată în determinarea calității inoculului produs din material provenit din culturi nesterile.
Procedura de determinare a CMPN se bazează pe răspunsul pozitiv/negativ al plantelor gazdă la formarea rizobiilor în urma inoculării cu material microbian provenit din diluții consecutive ale materialului inițial. Metoda se bazează pe o serie de ipoteze:
O singură celulă bacteriană inoculată pe rădăcina unei plante gazdă specifice, într-un mediu lichid fără azot, va provoca formarea nodozităților;
Procesul de nodulare este o dovadă a infectivității bacteriilor;
Validarea testului este demonstrată de absența nodozităților de pe rădăcinile plantelor neinoculate;
Absența nodozităților pe rădăcinile de plante inoculate dovedește absența bacteriilor capabile de nodulare.
Materiale
Pungi de germinare cu hârtie de filtru;
Semințe de leguminoase sănătoase, dezinfectate;
Etanol (95%) și dezinfectant;
Soluție nutritivă de creștere a plantelor fără azot – sterilă;
Soluție tampon sterilă;
Blender;
Cameră de creștere a plantelor cu mediu controlat ( ziua și noaptea, bine iluminată și cu umiditate relativă de 65% – 70%).
Procedura
1. În fiecare pungă de germinare se introduc câte 30 ml de mediu nutritiv.
2. Se plasează în mod aseptic câte 15 – 20 semințe dezinfectate în deschizătura fiecărei pungi și se incubează la , la întuneric, timp de 2 zile, până radiculele ajung la 0.5- lungime.
3. Se prepară diluția de 10- probei de sol: de sol + 90 ml soluție tampon, apoi se amestecă în blender aproximativ 2 minute la 12.600 rpm. Pentru diluția de 10-2 se transferă 10 ml din soluția obținută într-un recipient cu 90 ml soluție tampon. Aceste diluția au rolul de a reduce numărul de bacterii, deoarece în solurile cultivate cu plante leguminoase numărul de bacterii fixatoare de azot/g de sol poate atinge valoarea de 104.
4. Se prepară o nouă soluție din 4.0 ml de soluție tampon și 1.0 soluție obținută în pasul anterior, nivelul de diluare fiind de 1:5. Din cei 5.0 ml rezultați se inoculează 4 pungi de germinare cu câte 1.0 ml soluție. Peste soluția rămasă se adaugă 4.0 ml de soluție tampon și se obține o diluție de 1:25. Procesul este continuat de 4 ori, până la obținerea unei diluții de 1:15625. După obținerea ultimei diluții se inoculează toți cei 5.0 ml de soluție în 5 pungi de germinare.
5. La fiecare set de 4 pungi inoculate se adaugă câte o pungă neinoculată care va servi ca martor la interpretarea rezultatelor.
6. Pungile de germinare sunt plasate în camera de creștere, examinarea pentru prezența/absența nodozităților fiind făcută după 3 săptămâni (plante cu creștere rapidă) sau 4 săptămâni (plante cu creștere lentă).
7. Rezultatele se trec în documentația de laborator folosind semnul “+” pentru prezență și semnul “–” pentru absența nodozităților. Se va obține un cod de 6 cifre, care se va interpreta n funcție de valorile identificate în tabelul cu CMPN (tabelul 4.).
Tabelul 4
Cel mai probabil număr de bacterii fixatoare de azot
Documentație de laborator
Nume:
Data:
STUDIUL BACTERIILOR FIXATOARE DE AZOT
Cuantificarea bacteriilor fixatoare de azot
Completați tabelul cu rezultatele obținute în urma evaluării prezenței/absenței rizobiilor pe rădăcinile plantelor leguminoase.
Cu ajutorul tabelului CMPN (tabelul 6) efectuați calculele necesare determinării numărului probabil de bacterii din proba inițială.
EVALUARE
Care sunt genurile mai importante de bacterii capabile de fixarea azotului atmosferic?
Cum se face verificarea capacității bacteriilor, provenite din natură, de a produce nodozități?
Care sunt ipotezele ce stau la baza determinării celui mai probabil număr de bacterii fixatoare de azot dintr-o probă?
Ce mediu de cultură se folosește pentru evidențierea bacteriilor fixatoare de azot?
Notițe și observații:
ROLUL MICROORGANISMELOR ÎN CREȘTEREA ȘI DEZVOLTAREA PLANTELOR
Microorganismele din sol au rolul de a transforma continuu resursele nutritive și de a le transloca, atât către alte grupe funcționale microbiene cât și către plante. În acest sens, microorganismele joacă un rol deosebit de important în solubilizarea și disponibilizarea nutrienților necesari creșterii și dezvoltării plantelor. Din punct de vedere microbiologic, un sol “sănătos și fertil” este un sol caracterizat de o dinamică puternică a microflorei, iar un agroecosistem fertil este caracterizat de un sol cu o dinamică orientată spre stimularea dezvoltării plantelor de cultură. Comunitatea microbiană din sol este dominată în general de bacterii și fungi, cu biomase de 1500 kg/ha bacterii, 3500 kg/ga fungi și 10-1000 kg/ha alge.
Pentru bacteriile din rizosfera plantelor de cultură, rădăcinile oferă o zonă pentru proliferare exportând produși diverși ai metabolismului. La rândul lor, bacteriile excretă o serie de metaboliți care stimulează dezvoltarea plantelor. Acest fenomen este mult mai puternic în condițiile unui sol cu populații reduse de patogeni, rizobacteriile exprimându-și mult mai puternic rolul de promovatori ai creșterii. În cazul tulpinilor non-patogene de Pythium, sunt excretați stimulatori de germinare a semințelor de graminee, procentul de germinație fiind mai ridicat decât în absența microorganismului. Abilitatea de a fixa azotul este prezentă atât la bacteriile simbionte cât și la cele non-simbionte, iar efectul este vizibil în creșterea plantelor în condiții superioare de nutriție. Nutrienții slab solubili, dar restrictivi în creșterea plantelor, sunt solubilizați ca urmare a activității microbiene, în special sideroforii bacterieni, ceea ce stimulează creșterea plantelor prin translocarea către zona de rizosferă.
Un alt mecanism de stimulare a creșterii implică modularea mecanismelor de reglare a plantei prin producerea de hormoni cu acțiune fitostimulatoare. O gamă largă de bacterii sunt capabile de producerea auxinelor, sinteza giberelinelor și citochininelor (tabelul 5.). O reducere a capacității bacteriene de a produce acid indol-acetic se transpune în pierderea a 70% din potențialul de stimulare a creșterii plantelor. Cele mai cunoscute și eficiente bacterii în promovarea creșterii plantelor fac parte din genurile Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Frankia, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia și Thiobacillus.
Tabelul 5.
Mecanismele bacteriene de stimulare a creșterii plantelor
Răspunsul plantelor la prezența microorganismelor benefice în rizosferă este de își ramifica puternic rădăcina, oferind o suprafață mai mare instalării și proliferării acestora. Azospirillum brasilense are capacitatea de a produce auxine în prezența rădăcinilor de grâu, cu un rezultat pozitiv în creșterea acestei plante. Producerea și exportul în rizosferă de către plante a acidului 1-aminociclopropan-1carboxilat stimulează activitatea deaminazei rizobacteriilor (Pseudomonas și Bacillus), utilizarea acestui produs ca sursă de carbon și retransmiterea metaboliților secundari către plante. În acest fel se reduce fenomenul de bioacumulare a acidului AAC și menținerea unei creșteri optime a plantei.
Modul de acțiune al microorganismelor promovatoare a creșterii plantelor este unul deosebit de complex și trebuie privit atât ca segment specific cât și ca model global, urmărind o serie de aspecte:
mecanismul de stimulare a creșterii plantelor și suprimarea patogenilor;
însușirile implicate în colonizarea rădăcinilor;
rolul microorganismelor promovatoare în interacțiunile microbiene din sol;
baza moleculară și biochimică în reducerea/suprimarea patogenilor și a colonizării rădăcinii;
descoperirea de tulpini și însușiri microbiene noi;
răspunsul patogenilor la inocularea cu promovatori ai creșterii;
analiza riscurilor datorate inoculării;
producerea și dezvoltarea de noi biopreparate;
performanța și eficiența biopreparatelor.
Un alt grup important în stimularea creșterii plantelor sunt micorizele de tip vezicular-arbuscular, care acționează ca simbionți în rădăcinile plantelor. Miceliul produs de micorize are rolul de a explora și extrage soluții nutritive din solul aflat la distanțe mai mari decât cele accesibile rădăcinilor plantelor și transferul către rădăcinile pe care le colonizează. Un alt rol deosebit de important este cel de solubilizare a fosforului, asigurând o bună parte din necesarul plantei pentru acest macroelement. Alături de transferul fosforului, micorizele vezicular-arbusculare transferă soluții complexe cu N, Zn, Mg și Ca către rădăcinile plantelor. Azotul poate fi preluat de fungi atât în formă anorganică (NH4+ sau NO3-) cât și sub formă de amino-acizi.
Un avantaj al implicării microorganismelor în procesele de creștere a plantelor provine din capacitatea de dezvoltare a unui sistem cometabolic, evoluând spre tulpini adaptate stres-urilor locale – climatice și nutriționale. În general, microorganismele din zonele agricole dinamice și intensivizate sunt mult mai tolerante la elementele toxice provenite din activitățile agronomice, reușind pe lângă stimularea creșterii să îi ofere și o protecție suplimentară plantei cu care intră în contact. La nivelul rădăcinii gramineelor pot acționa diferite specii de Trichoderma sau Neotyphodium, cu rol atât de simbionți cât și de protecție față de stres-urile chimice din sol.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul microorganismelor cu rol în procesele de creștere și dezvoltare a plantelor.
Materiale necesare:
articole științifice referitoare la procesele de promovare a creșterii plantelor;
baze de date cu rezultate experimentale asupra creșterii plantelor ca urmare a activității microorganismelor.
Studenții vor întocmi proiecte comparative asupra bacteriilor și fungilor implicați în creșterea și dezvoltarea plantelor de cultură.
EVALUARE
Descrieți modul de acțiune al bacteriilor asupra creșterii plantelor.
Identificați fungi capabili de stimularea creșterii plantelor.
Descrieți diferențele de localizare și rol dintre microorganismele simbionte și non-simbionte.
Notițe și observații:
REACȚIA MICROORGANISMELOR LA INPUTURI ȘI PERTURBĂRI
Agricultura sustenabilă are ca scop maximizarea producțiilor la unitatea de suprafață, menținerea calității la valori ridicate și reducerea impactului de mediu concomitent cu evitarea perturbării fertilității naturale a solurilor. Un sistem sustenabil de agricultură are capacitatea de integrare în complex a unei componente organice sau extensive, cu rol în reducerea acumulării de nutrienți, limitarea pesticidelor și a fertilizanților minerali la dozele optime și cu un minim impact de mediu (fig. 63). Acest tip de management utilizează microorganisme, ca înlocuitor la segmentul de management chimic redus, cu rol în promovarea creșterii plantelor și biocontrol. Conceptele de înlocuire a unor segmente de management cu alternative microbiene se înscriu în contextul actual al solurilor agricole depreciate de o expunere îndelungată la presiunea substanțelor pesticide și a fertilizărilor necontrolate.
Fig. 63. Circuitul poluanților în mediu
Utilizarea pe scară largă a xenobioticelor în agricultură a contribuit la îmbunătățirea calității producției și menținerea costurilor de producție la un nivel acceptabil. Dar managementul chimic aplicat solurilor agricole a condus și la apariția în nișa ecologică unor grupe microbiene cu activitate descompunătoare specifică. Din acest considerent, integrarea grupelor microbiene cu capacitate și specificitate ridicate pentru substanțele pesticide reprezintă o tehnică de reducere a riscurilor de mediu și menținerea costurilor de producție.
Evoluția microorganismelor pe parcursul a peste 3,5 miliarde de ani a stimulat apariția unei game extensive de enzime, căi de transformare și mecanisme de control a substanțelor din mediu. Acest aspect, transpus peste necesitatea evaluării și reducerii reziduurilor de pesticide rezultate din activitățile agricole, a condus la testarea și identificarea de microorganisme capabile de descompunerea substanțelor dăunătoare mediului. Dintre microorganisme, genul Pseudomonas a oferit primele tulpini și specii capabile de descompunere a compușilor pe bază de clor, în prezent existând o întreagă industrie destinată bioremedierii microbiene a reziduurilor. La Agrobacterium tumefaciens au fost identificate gene de rezistență la glifosat și bromoxinil, ceea ce a condus la utilizarea acestei specii ca donor de gene pentru crearea de plante rezistente la erbicide.
Intrarea pesticidelor în sistemul solului are loc prin aplicare directă, cu mașinile de tratamente și prin scurgere de pe plante, prin difuzia eoliană sau transport sub formă de aerosoli în urma volatilizării. Cantități însemnate de substanțe pesticide sunt transferate în sol prin activitățile de curățare a mașinilor și prin ambalajele care le-au conținut. Odată ajunse în sol, aceste substanțe sunt supuse unor procese de degradare biologice microbiene, cu rezultat în descompunerea totală a compusului.
Căile de acțiune a pesticidelor în sistemul sol-plantă-microfloră sunt separate în 3 segmente ale rizosferei:
Rizosfere (sol) – definită ca zona din sol influențată de rădăcini prin eliberarea de produși metabolici ce afectează activitatea microbiană;
Rizoplanul – suprafața radiculară ce include particulele de sol aderate la rădăcini și colonizate de o bogată floră microbiană;
Țesuturi radiculare – pe care microorganismele endofite sunt capabile să le colonizeze.
Una dintre căile secundare de descompunere a pesticidelor de către microorganisme este cometabolismul – definit ca oxidarea substraturilor ce nu sunt necesare creșterii de către microorganisme în timpul creșterii pe un tip de substrat carbonic specific sau a unei surse de energie.
Dintre pesticide, erbicidele reprezintă o categorie aparte de substanțe, având rolul de a afecta plantele și fiind mai puțin studiate ca efect asupra comunităților microbiene. Mecanismele principale ale procesului de descompunere sunt de tip enzimatic (tabelul .6).
Tabelul 6.
Clasificarea activităților microbiene implicate în procesul de descompunere a erbicidelor (după Corn, 2012).
În condițiile în care microorganismele nu pot utiliza erbicidele ca sursă de energie, crește dependența acestora față de sursele de carbon accesibile cu rezultat direct în metabolismul general. Pe baza tipului de descompunere microbiană, rata metabolismului poate fi modificată fie prin creșterea dozei de erbicid fie prin adaosul unei surse de carbon. Astfel se poate evidenția cometabolismul microbian, ca formă metabolică în condițiile în care erbicidul are valori mai reduse decât alte surse de carbon. Acest fenomen face ca pe parcursul proceselor cometabolice să nu apară adaptări specifice microbiene și rata de descompunere a erbicidelor să rămână constantă. Dacă fenomenele de adaptare microbiană la substanțele din formula unui anumit tip de erbicid aplicat la sol devin vizibile în populația microbiană, rata de descompunere a acestuia va crește, concomitent cu reducerea eficienței.
Rata de descompunere microbiană a erbicidelor este un proces cu dependență ridicată față de:
disponibilitatea substanței pentru microorganism sau existența unui sistem enzimatic capabil de degradare;
dimensiunea populațiilor microbiene și a sistemelor enzimatice;
viteza metabolică a populațiilor microbiene și a sistemelor enzimatice.
factorii edafici: pH, conținutul de materie organică, raportul apă/aer, aprovizionarea cu nutrienți, temperatura.
O parte din moleculele erbicidului pot fi încorporate în celula microbiană, ceea ce conduce la o degradare a compuslui și o reintegrare în circuitul materiei după moartea microorganismului. Reacțiile de degradare microbiană a erbicidelor necesită implicarea sistemelor enzimatice și acțiunea în complex cu enzime specifice produse de microorganisme. Procesele de alterare a moleculelor de erbicide sunt:
dehalogenarea – îndepărtarea atomilor de clor, bor și alți halogeni;
dezalchilare – cu îndepărtarea lanțurilor organice laterale;
hidroliză – îndepărtarea amidelor și esterilor;
beta oxidare – ruperea unităților de carbon în grupări de câte 2 atomi;
hidroxilarea nucleelor aromatice – adăugarea grupării hidroxil (-OH) la nucleele aromatice;
separarea nucleelor aromatice – ruperea structurii nucleului aromatic;
reducere – adiționarea hidrogenului la grupările NO2 în condiții anaerobe.
Regimul termic și hidric sunt componente critice pentru funcționarea metabolismului microbian. La temperaturi de 4-5șC majoritatea microorganismelor au o rată a metabolismului, cu un optim la 23 – 33șC. în lipsa apei, marea majoritate a comunității microbiene se află în stadiu de latență sau își încetează activitatea și mor. Moleculele de erbicid rămân active în solurile reci, uscate sau neaerate, datorită slabei activități microbiene.
Cele mai performante specii de microorganisme capabile de descompunerea erbicidelor în sol sunt încadrate în genurile Arthrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Actinomycetes, Mycoplana, Agrobacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Flavobacterium, Nocardia și Trichoderma. Concomitent cu creșterea dozei de erbicid, se reduce activitatea microorganismelor fixatoare de azot simbiotic, activitatea nitrogenazei și chiar inhibarea sintezei ATP. În schimb, la doze ridicate de erbicid, crește activitatea actinomicetelor și a fungilor.
Un al doilea grup important de xenobiotice utilizate în agricultură sunt insecticidele, cu rol în reducerea populațiilor de insecte dăunătoare. Acest tip de substanțe se pot acumula în sol în cantități ridicate, afectând atât sirect cât și indirect activitatea enzimatică și caracterele fiziologice a populațiilor microbiene și producând o reducere a fertilității naturale a solului (tabelul 7).
Tabelul 7.
Impactul insecticidelor asupra microflorei solului
(după Ahmad și colab, 2011)
Dintre microorganismele cu toleranță ridicată la insecticidele organofosforice sunt mai cunoscute cele aparținând gennurilor Pseudomonas și Flavobacterium, acestea având plasmide capabile de degradarea organofosfaților. Alte microroganisme cu rezistență ridicată și stimulate în urma aplicării insecticidelor sunt încadrate în genurile Streptomyces, Nocardia (zona de rizosferă), iar Bacillus, Escherichia, Flavobacterium, Micromionospora, Penicillium, Aspergillus, Trichoderma – cresc ca număr la aplicarea produselor pe bază de phorate, și Bacillus, Corynebacterium, Flavobacterium, Aspergillus, Phytophthora – sunt stimulate de aplicarea carbofuran-ului.
La polul opus, microorganismele din genurile Staphylococcus, Micrococcus, Fusarium, Humicola, Rhizopus – scad ca număr sub influența phorate-ului, iar Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Klebsiella, Fusarium, Humicola, Rhizopus – își reduc populația în condiții de tratamente cu carbofuran.
Insecticidele pe bază de diazinon produc o creștere locală a NH4+-N în primele 90 de zile de la aplicare, dar sunt responsabile și de reducerea NO3—N, perioada de 15-60 zile de la aplicare, respectiv o reducere a NO2—N în intervalul 1-30 zile de la aplicare. Produsele pe bază de imidacloprid stimulează în perioada 15-90 zile producerea de NO3—N și declinul producerii NH4+-N și NO2—N, respectiv a activității nitratreductazei. Tratamentele la sămânță cu lindan, în intervalul 15-90 zile de la aplicare, stimulează o creștere semnificativă a NH4+-N și NO2—N, respectiv a activității nitratreductazei și reducerea producției de NO3—N.
Fungicidele sunt substanțe cu largă utilizare în tehnicile deprotecția plantelor, ce afectează direct componenta fungică a solului și indirect o gamă largă de microorganisme. Efectul acestui tip de xenobiotice are un spectru larg, atât în funcție de zona din sol explorată de microorganisme cât și de căile metabolice specifice acestora (tabelul 8):
Tabelul 8.
Modul de acțiune și efectul fungicidelor asupra florei microbiene
(după Yang și colab., 2011)
Compușii substanțelor fungicide pota avea un efect complex asupra microrganismelor din grupe nevizate la aplicarea tratamentelor. Efectul acestor substanțe este important ca urmare a răspunsului microbian prin reducerea activității de promovare a creșterii plantelor și reducerea producțiilor potențiale.
Complexitatea comunității microbiene din sol face ca prognoza riscurilor și efectelor aplicării substanțelor de protecția plantelor să fie dificilă. Dar, în același timp, posedă un potențial ridicat de integrare în măsurile complexe de reducere a efectelor pe termen lung asupra mediului și a diversdității ecosistemelor.
Aplicații practice
Obiective:
Analiza efectului substanțelor de protecția plantelor asupra microorganismelor din sol și a potențialului de biodegradare microbiană.
Segmente vizate:
potențial de mineralizare și metabolizare a pesticidelor cu producere de CO2;
Studenții vor accesa baze de date internaționale pentru analiza potențialului mcrobian de descompunere a pesticidelor.
Se vor instala și analiza experiențe în mediu controlat, în vase de vegetație, pentru urmărirea reacției microorganismelor din rizosfera plantelor de cultură la pesticide.
Exp 1. Izolarea bacteriilor capabile de degradarea acidului 2,4-Diclorofenoxiacetic.
Materiale necesare:
Perioada 1 de testare:
Sol pe care s-a aplicat 2,4-D (soluție 1%) – 500µg 2,4-D/g sol uscat;
Recipiente de plastic;
Pipete sterile de 1 ml;
Plăci Petri indicator cu 2,4-D (cantități la 1 l apă distilată – 112 mg MgSO4 · 7H2O, 5 mg ZnSO4 · 7H2O, 2.5 mg Na2MoO4 · 2H2O, 218 mg K2HPO4, 14 mg CaCl2 · 2H2O, 0.22 mg FeCl3 · 6H2O, 0.5 g NH4Cl, 500 mg 2,4-D, 80 mg eozină B, 13 mg albastru de metilen, 20 g agar purificat).
Procedura de lucru:
Se adaugă câte 150 g sol în fiecare recipient de plastic;
Solul se aduce la umiditatea dorită, în recipientele pentru testul de descompunere soluția apoasă conținând 2,4-D;
Se pun capace pe recipiente, lăsând aerul să intre în cantități reduse pentru a nu pierde umiditatea și se incubează la 25șC sau temperatura camerei timp de o săptămână;
Se prepară diluții seriale de 10-1, 10-2 și 10-3 din proba martor netratată care se vor transfera pe mediile din plăcile indicator;
Se incubează plăcile timp de o săptămână la 25șC și se va obține estimarea populațiilor inițiale capabile de degradarea 2,4-D.
Perioada 2 de testare:
Plăcile indicator 2,4-D din prima perioadă;
Recipientele de plastic cu sol din prima perioadă;
Recipiente de monitorizare de 5 ml cu mediu de cultură, 2,4-D și coloranți;
Pipete sterile de 1 ml;
Eprubete pentru diluții seriale cu 9 ml apă;
Plăci Petri indicator cu 2,4-D (cantități la 1 l apă distilată – 112 mg MgSO4 · 7H2O, 5 mg ZnSO4 · 7H2O, 2.5 mg Na2MoO4 · 2H2O, 218 mg K2HPO4, 14 mg CaCl2 · 2H2O, 0.22 mg FeCl3 · 6H2O, 0.5 g NH4Cl, 500 mg 2,4-D, 80 mg eozină B, 13 mg albastru de metilen, 20 g agar purificat).
Procedura de lucru:
Se aduce solul la umiditatea inițială;
Se ia câte o cantitate de 0,5 g sol din recipientele de testare și se adaugă în recipientele de monitorizare, urmate de incubarea timp de 2-3 săptămâni. O modificare a culorii ndică prezența descompunătorilor de 2,4-D;
Se prepară diluții seriale de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 și se însămânțează pe plăcile indicator de 2,4-D;
Se incubează plăcile timp de o săptămână la 25șC;
Se examinează plăcile și se numără coloniile închise la culoare pentru a calcula media microrganismelor capabile dedegradarea 2,4-D.
Perioadele 3, 4 și 5
Se utilizează plăcile indicatro din perioada anterioară și se reia procedura de însămânțare – se utilizează plcăile cu 30-200 colonii;
EVALUARE
Denumiți cele 3 componente ale rizosferei în relație cu pesticidele.
Descrieți modul de acțiune al erbicidelor asupra microorganismelor.
Care este nivelul de afectare al bacteriilor de către fungicide?
Care este nivelul de afectare al bacteriilor de către insecticide?
Notițe și observații:
DIVERSITATEA MICROBIANĂ A ECOSISTEMELOR ACVATICE
În natură nu există apă pură, ea va conține întotdeauna alături de atomii de hidrogen și oxigen care o definesc ca moleculă chimică, și atomi ai altor substanțe organice sau anorganice sau chiar microorganisme vii. Menținerea purității apei în ecosistemele naturale se referă la menținerea stabilității conținutului de săruri si gaze, de organisme si microorganisme sub nivelul la care acestea pot deveni dăunătoare sănătății.
În țările dezvoltate s-au implementat măsuri corespunzătoare de igienă și s-au instalat rețele moderne, de maxima securitate pentru distribuția apei, aspect care a condus la dispariția epidemiilor de holeră, dizenterie bacilară, febră tifoidă și paratifoidă.
Cu toate acestea modificările climatice actuale și tehnologia în curs de dezvoltare au condus, în unele țări, la apariția unor noi probleme de ordin microbiologic:
diversificarea contaminaților – apa este contaminată cu virusuri, protozoare și helminți. Acești agenți ajung în apă în urma neaplicării tratamentelor de dezinfecție sau aplicarea lor incorectă, iar uneori din incidentele tehnologice cum ar fi inter-comunicarea între rețelele de ape curate și cele uzate.
existența în apa destinata consumului uman a microorganismelor patogene de origine fecală.
prezența microorganismelor de alterare care pot modifica mirosul și gustul apei prin dezvoltare masivă și activitatea asupra conductelor.
Microflora apelor
Cantitatea de microorganisme prezente în apă variază în funcție de caracteristicile fizico-chimice ale acesteia. În general, apele din natură sunt rareori absolut sterile, existând chiar și în izvoarele termale o serie de microorganisme termofile. Cele mai răspândite microorganisme în ecosistemele acvatice sunt bacteriile, algele și protozoarele.
Cilii și flagelii asigură circulația microorganismelor pe distanțe reduse, iar pe distanțe mari transportul este efectuat în mod pasiv, odată cu mișcarea apei datorită curenților.
Componentele microflorei acvatice sunt reprezentate de microorganismele indigene, specifice locului de unde provine apa și o microfloră adăugată. Microflora indigenă este constituită din microorganismele prezente în solul de suprafața și în cel de adâncime. Microorganismele adăugate la microflora indigenă creează deseori probleme deosebite pentru potabilitate, prezența lor datorându-se ploilor si ninsorilor căzute direct în sursa de apă. Poluarea cu microorganisme apare în urma antrenării acestora odată cu particulele din aer. Apa de ploaie și ninsoare se contaminează și în urma contactului cu solul pe care cad, iar în această stare pot ajunge în sursele de apă destinate consumului uman.
Sursele de apă pot fi poluate cu ape uzate sau cu apă din rețeaua de canalizare, acest fenomen având o incidență crescută în aglomerările umane și animale, în aceste areale germenii patogeni având o pondere mult mai ridicată.
Microflora patogenă și dăunătoare a apei
Microflora patogenă a apei este reprezentată de microorganisme provenite atât din flora indigenă, cât și din cea adăugată. Unele microorganisme provin din solul de suprafață și aparțin de obicei genurilor Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacterium, Chromobacterium, Acinetobacter și Serratia (fig. 64 – 69.). Sunt microorganisme saprofite și prin descompunerea substanțelor organice din apă pot provoca modificări de miros și gust al apei.
Fig. 64. Micrococcus luteus
Fig. 65. Pseudomonas fluorescens
Fig. 66. Flavobacterium odoratum
Fig. 67. Chromobacterium violaceum
Fig. 68. Acinetobacter baumannii
Fig. 69. Serratia marcescens
Apele pot conține ca microfloră indigenă și o serie de bacterii autohtone capabile să reziste să se multiplice și în lipsa materiilor organice, ele fiind oligotrofe sau autotrofe. În condiții favorabile, aceste bacterii pot produce alterări specifice ale apei, fiind împărțite în două categorii importante: bacterii feruginoase și bacterii sulfuroase.
Bacterii feruginoase – sunt microorganisme care intervin în procesul de oxidare a ionilor feroși în ioni ferici. Genurile reprezentative sunt Sphaerotilus, Clonothrix, Crenothrix, Leptothrix, Gallionella și unii membri din Thiobacillus (fig. 70 – 73.).
Bacteriile din genurile Sphaerotilus și Leptothrix sunt cel mai frecvent întâlnite în ape. Sunt capabile să oxideze atât ionii feroși cât și compușii de mangan, iar ca încadrare taxonomică fac parte din ordinul Burkholderiales. Sunt bacterii înconjurate de o teacă impregnată sau nu cu oxid de fier sau mangan și nu formează spori. Teaca poate sa prezinte ramificații false, foarte scurte. Se găsesc frecvent în canalele cu apă stagnantă, unde proliferează foarte bine. În urma activității metabolice elimina oxigenul din mediu și creează o atmosferă anaerobă, aspect care favorizează procesul de descompunere a materiilor organice și apariția mirosurilor și gusturilor grețoase.
Bacteriile feruginoase pot forma depozite mucilaginoase și de consistență vâscoasă în apele provenite din surse sau foraje adânci și care conțin în mod natural fier dizolvat (fig. 70 – 73.). Depozitele pot atinge grosimi de în canale și cisterne, fiind impregnate cu hidrat feric. În zonele unde aceste bacterii sunt prezente, apa devine tulbure, colorată în roșu și degajă un miros dezagreabil ca urmare a proceselor de descompunere, iar gustul apei este neplăcut.
Fig. 70. Sphaerotilus natans
Fig. 71. Clonothrix fusca
Fig. 72. Leptothrix spp.
Fig. 73. Gallionella ferruginea
Bacteriile sulfuroase sunt agenții biologici majori ai proceselor naturale de reducere și oxidare a sulfului, fiind răspunzătoare de fenomenele de coroziune a metalelor feroase. Dintre exponenții acestui tip de bacterii, mai importanți sunt membri genului Desulfovibrio, responsabili de reducerea sulfaților, din solurile cu exces de umiditate și canalizări, la hidrogen sulfurat, un gaz cu miros de ou stricat, Thiothrix comun în izvoarele sulfuroase și în sistemele de canalizare, respectiv Sulfolobus, prezent în izvoarele termale bogate în sulf și care este responsabil de transformarea hidrogenului sulfurat în sulf elementar (fig. 74 – 75). Coroziunea pe care o produc reprezintă o transformare sau o distrugere a materialelor metalice preparate industrial și pe care le readuc la starea lor naturala sub forma de oxizi, sulfuri și carbonați. Coroziunea este un fenomen amplificat în canalele metalice prin care este efectuat transportul apei sau în instalațiile de încălzire a apei. În urma procesului de corodare se formează deseori pustule sau noduli pe suprafața metalelor.
Fenomenul de corodare în mediu anaerob este menținut de bacteriile care reduc sulfații datorită unei acțiuni depolarizante la nivelul suprafețelor metalice, acestea având rolul de catod. În urma acestui proces rezultă o serie de subproduse ale metabolismului: sulfura de fier, hidroxidul feros sau hidroxidul feric. Produsele de oxidare asociate sau nu cu depozite de bacterii feruginoase vor tinde sa formeze noduli duri și compacți.
Fig. 74. Thiothrix sp.
Fig. 75. Sulfolobus sp.
Alături de aceste microorganisme, în ape pot fi prezente o multitudine de clase de agenți patogeni excretați odată cu materiile fecale și care sunt capabili de a iniția infecții. Există patogeni bacterieni, inclusiv bacteriile enterice și acvatice, virusuri enterice și protozoare enterice, care sunt estrem de rezistente în mediul acvatic și la cei mai mulți dezinfectanți. Doza de agenți virali și protozoare necesară producerii unei infecții este mai redusă decât la bacterii, intervalul fiind de la unu la zece unități infecțioase (tabelul 9.).
Tabelul 9.
Agenți patogeni din apă
EVALUARE
Care sunt probleme de ordin microbiologic ale apei potabile în contextul actual de dezvoltare?
Descrieți sursele de poluare microbiană a apelor.
Care sunt principalele genuri de bacterii patogene provenite din sol?
Numiți principalele genuri de bacterii feruginoase și sulfuroase care pot produce alterări ale apei.
Notițe și observații:
DIVERSITATEA MICROBIANĂ A ECOSISTEMELOR TERESTRE
Bacterii și actinomicete
Microorganismelor din solurile agricole sunt implicate ca factori cheie în transformarea materiei și disponibilizarea acesteia pentru plante. Diversitatea microbiană este mare atât la nivel de caractere de grup – bacterii, actinomicete, fungi, alge – cât și la nivel de procese pe care le desfășoară (tabelul 10.).
Tabelul 11.
Caracteristicile bacteriilor, actinomicetelor și fungilor din sol
Bacteriile din solul agroecosistemelor sunt considerate a fi cele mai abundente microorganisme din acest areal, cu o diversitate ridicată, cu cerințe specifice pentru oxigen și pentru substrat: pot fi autotrofe sau heterotrofe, aerobe, anaerobe sau facultativ anaerobe. În cadrul acestui grup microbian s-a dezvoltat un segment de microorganisme filamentoase cunoscut ca actinomicete. Atât bacteriile cât și actinomicetele sunt cunoscute pentru importanța în circuitul nutrienților și descompunerea contaminanților organici. În plus, sunt regăsite în interacțiune cu plantele ca microorganisme de rizosferă în jurul rădăcinilor acestora. O parte din populațiile existente în sol sunt patogene pentru plante (Agrobacterium tumefaciens) și om (Clostridium perfringens sau Bacillus anthracis). La suprafața mediilor de cultură cu agar, bacteriile formează colonii vâscoase, variind de la colonii lipsite de culoare la culori puternice cu tentă portocalie, galbenă sau roz. La polul opus, actinomicetele au o creștere filamentoasă ceea ce le diferențiază vizual de bacterii, cu colonii albicioase, tari și ferme puțin rezistente la presiune și care se rup ușor.
Actinomicetele sunt mult mai rezistente la stres-urile hidrice, având un avantaj ecologic asupra bacteriilor în special în zonele aride, pe soluri uscate și alcaline. Din acest considerent prin uscarea solului înainte de cultivare pe medii de cultură se poate reduce apariția bacteriilor în plăcile Petri. Pentru eliminarea fungilor se poate utiliza cyclohexanimidă.
Analiza microorganismelor din sol poate fi atât cantitativă cât și calitativă. Din punct de vedere calitativ testele se axează asupra caracteristicilor microorganismelor decât asupra numărului lor. Pentru obținerea de culturi pure este nevoie de o primă etapă de însămânțare, urmată de o a doua însămânțare a microorganismelor din fiecare colonie de interes pe un nou mediu de cultură cu scopul de produce izolate. Pentru bacterii se fac teste de sensibilitate la antibiotice, aceste microorganisme având o plajă mare de rezistență la acest tip de substanțe. Rezistența la antibiotice și modul de reacție a bacteriilor la antibiotice poate fi evaluată prin măsurarea zonei de inhibiție formată pe plăcile cu discuri cu antibiotice. După o perioadă de incubare se poate observa gradientul antibioticului în mediul de cultură și zona de proliferare a bacteriilor în afara sferei de influență a antibioticului. Spectrul de acțiune al antibioticelor se poate manifesta atât la nivel de proteine bacteriene cât și la nivelul sintezei acizilor nucleici (tabelul 12.).
Tabelul 12.
Acțiunea celor mai comune antibiotice asupra bacteriilor
Bacteriile cultivabile pe medii de cultură sunt prezente în număr de 107 – 108 / g sol, în timp ce întreaga populați bacteriană atinge valori de 1010 indivizi / g sol, iar diversitatea lor / g sol poate atinge valori de peste 10000 de specii. Actinomicetele sunt prezente în sol cu valori în general mai reduse decât bacteriile cu cel puțin unul-două ordine de magnitudine. Genurile bacteriene și de actinomicete dominante sunt Arthrobater, Streptomyces, Pseudomonas și Bacillus (tabelul 13.).
Tabelul 13.
Bacterii și actinomicete dominante în sol
Cultivarea pe medii a bacteriilor din probe cu microfloră asociată este dominată de filumurile Bacteroidetes, Proteobacteria și Actinobacteria. În schimb, o analiză la nivel de cultură monospecifică arată o dominanță a filumurilor Actinobacteria, Proteobacteria (în special Alphaproteobacteria și Deltaproteobacteria, cu un nivel mai redus al Gammaproteobacteria), respectiv Acidobacteria și Bacteroidetes. Aceste aspecte indică o capacitate diferită de competiție în întreaga comunitate microbiană a fiecărei specii și un potențial mai ridicat de cultivare a Actinobacteriilor pe medii în culturi monospecifice.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul diversității bacteriilor și actinomicetelor din sol.
Materiale necesare:
Mediu de cultură și apă distilată sterile;
Probe de sol incubate la temperatura camerei o săptămână;
Eprubete, plăci Petri și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Se adaugă 10 g de sol în 95 ml de apă distilată sterilă și se mixează bine pentru omogenizare;
Se diluează serial proba omogenizată prin transferarea unui volum de 1 ml de soluție în 9 ml apă distilată sterilă;
Se prepară diluții până la 10-5;
Pentru bacterii se transferă câte 0,1 ml din diluțiile 10-3 la 10-5 în plăci Petri cu agar și extract peptonat de drojdii; pentru actinomicete se transferă câte 0,1 ml din diluțiile 10-2 la 10-4 în plăci Petri cu mediu glicerol-cazeină.
Se incubează plăcile în poziție întoarsă pentru o săptămână.
Fungi
Ciupercile sunt organisme heterotrofe eucariote și, cu excepția drojdiilor, aerobe. Sunt abundente în sol și au un rol important în circuitul nutrienților și descompunerea materiei organice și a contaminanților organici, unele specii fiind capabile de degradarea nucleelor aromatice. Solul conține în general câteva milioane de fungi/g ceea ce impune o diluare a probelor în vederea analizei diversității fungale din agroecosisteme. Pentru evaluarea numărului acestor microorganisme în sol, se consideră că fiecare colonie provine dintr-o celulă, ceea ce conduce la o numărare a potențialului existent de unități formatoare de colonii și raportarea la solul uscat. În solurile fertile se consideră că există un număr de 106 propagule fungale – spori, hife sau fragmente de hife.
Dimensiunea de 2-10 µm a hifelor fungale și capacitatea de expansiune și explorare a unei porțiuni mai mari de sol face ca aceste microorganisme să domine solurile și să activeze ca regulatori ai circuitului materiei. Drojdiile stimulează procesele de fermentație în sol, având o activitate anaerobă și dețin valori ale populației de 103 / g sol. Orizonturile preferate de fungi sunt A și O, numărul lor descrescând odată cu profunzimea profilului de sol, iar localizarea celor mai mulți indivizi este în zona de rizosferă.
Ca și componente a biologiei solului fungii au capacitatea de a degrada în special materia organică, atât substanțele simple (zaharuri) cât și complexe (lignină, celuloză), procesele de descompunere crescând concomitent cu scăderea pH-ului. Cele mai comune genuri de fungi din sol sunt Penicillium și Aspergillus, pe lângă descompunerea realizată ajutând la structurarea solului prin legarea fizică a particulelor în miceliu.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul diversității fungilor din sol.
Materiale necesare:
Mediu de cultură și apă distilată sterile;
Probe de sol incubate la temperatura camerei o săptămână;
Eprubete, plăci Petri și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Se adaugă 10 g de sol în 95 ml de apă distilată sterilă și se mixează bine pentru omogenizare;
Se diluează serial proba omogenizată prin transferarea unui volum de 1 ml de soluție în 9 ml apă distilată sterilă;
Se prepară diluții până la 10-4, iar pentru solurile foarte fertile se poate merge cu diluția până la 10-5;
Se transferă câte 1 ml din diluții în plăci Petri cu mediu Roz bengal – streptomicină agar.
Se incubează plăcile în poziție întoarsă pentru o săptămână.
Se notează doar plăcile Petri cu mai mult de 10 colonii și se fac preparate microscopice pentru identificarea fungilor.
Fructificațiile celor mai comune genuri de fungi în sol
Alge
Algele sunt microorganisme fototrofe tipice, localizate în areale cu conținut ridicat de CO2 ca sursă de carbon și acces la energia luminoasă, în sol fiind localizate la suprafață. O serie de specii pot supraviețui și la adâncimi de 1 m în sol, având capacitatea de a crește atât heterotrof cât și fotoautotrof. Populațiile de alge din sol au valori de 5000 – 10000 indivizi/g sol, dar în zonele cu exces de umiditate pot prolifera până la valori de câteva milioane/g sol.
Colonizarea algelor este mai vizibilă la suprafața solului în zone lipsite de materie organică transformată de alte microorganisme, preferând biomasa brută. Metabolismul în sol se poate desfășura pe 2 căi – pe baza metabolizării carbonului obținut prin fotosinteză și eliberarea în sol a acidului carbonic, ceea ce ajută la creșterea umidității în particulele de sol înconjurătoare, sau prin producerea de polizaharide extracelulare care ajută la agregarea particulelor de sol.
Spre deosebire de celelalte grupe microbiene, algele au variații mari sezoniere, cu populații mai mari în sezonul de primăvară și toamnă. Acest fenomen se datorează stres-ului provocat de lipsa apei (vara) și temperatura scăzută (iarna).
În sol sunt răspândite 4 grupe principale: algele verzi (Chlamydomonas – în special soluri acide), diatomee (Navicula – soluri alcaline și neutre), alge galben-verzi (Botrydiopsis) și roșii (Prophydium), respectiv cianobacterii (Nostoc și Anabaena – rol în formarea solului și fixarea azotului). Solurile temperate au următoarea structură populațională numerică: alge verzi > diatomee > cianobacterii > alge galben-verzi, în timp ce în solurile tropicale sunt predominante cianobacteriile.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul diversității algelor din sol.
Materiale necesare:
Mediu de cultură și apă distilată sterile;
Probe de sol incubate la temperatura camerei o săptămână;
Eprubete, plăci Petri și pipete sterile.
Procedura de lucru:
Se adaugă 1 cm3 de sol în vasele Petri și se umezește cu apă distilată și se incubează timp de o săptămână la temperatura camerei în condiții de lumină naturală sau artificială;
Se toarnă 20 ml mediu de cultură în vasele Petri, solidificat cu 1% agar;
Se șpreiază suspensia de sol la suprafața mediului de cultură sau se inoculează cu acul de însămânțare sau
Se inoculează medii lichide (60-100 ml) în vase de 250 ml;
Se fac preparate microscopice continuu din vasele incubate fără mediu de cultură și cele cu mediu de cultură.
EVALUARE
Notați diferențele de formă și dimensiune a bacteriilor din sol.
Notați diferențele de formă și dimensiune a bacteriilor din sol.
Notați uniformitatea coloniilor bacteriene pe mediile de cultură și prezența contaminanților.
Care sunt asemănările dintre bacterii și actinomicete?
Notițe și observații:
Care este influența pH-ului asupra fungilor din sol?
Care sunt diferențele majore dintre populațiile de fungi din sol?
Care este influența pH-ului asupra algelor din sol?
Care sunt diferențele majore dintre populațiile de alge din sol?
Notițe și observații:
MONITORIZAREA MICROBIANĂ A ECOSISTEMELOR
Conceptul de bioindicator
Ecosistemele naturale sunt sisteme dinamice aflate constant sub presiunea unui număr ridicat de factori biotici și abiotici, a căror acțiune conduce la apariția de fluctuații la nivelul speciilor și populațiilor. Reacția specifică a organismelor la presiunile externe conduce la reorganizarea ecosistemelor, cu modificări calitative și cantitative importante și dificil de prognozat. Conceptul de bioindicator a fost creat ca bază de selecție a speciilor cu potențial ridicat în aprecierea și semnalarea transformării ecosistemelor, reacția la contaminanți și stres-uri abiotice prognozând stadiile secundare ale evoluției unui întreg sistem biologic (fig. 56).
În biologia tradițională conservaționistă, bioindicatorii sunt instrumente de analiză a alterării și fragmentării habitatelor, care alături de modificările climatice acționează la o scară spațio-temporală. Corelarea informațiilor inițiale referitoare la dimensiunea și funcțiile unei populații a perturbărilor externe cuantificabile pot oferi informații asupra stabilității temporale și menținerii limitelor spațiale a ecosistemului nativ.
Sistemele interdisciplinare de prognoză și analiză a perturbărilor identifică și dezvoltă noi direcții de evaluare a organizării complexe a ecosistemelor, indicatorii nou dezvoltați având o performanță ridicată numai în condițiile respectării unui set de reguli:
adaptabilitate ridicată și fidelitate;
nivel ridicat de integrare transdisciplinară;
capacitate de cuantificare a segmentelor de perturbare analizate.
Bioindicatorii și biomonitorizarea sunt metode simple și eficiente de observare a impactului factorilor externi asupra ecosistemelor sau analiza comparativă a arealelor poluate cu cele nepoluate. Situațiile în care bioindicatorii au grad mare de aplicabilitate sunt grupate astfel:
paleo-ecosisteme unde factorii de mediu nu pot fi măsurați – ecosisteme asupra cărora acțiunea climei s-a manifestat în trecut, iar metodele de biomonitorizare reconstruiesc virtual condițiile inițiale;
ecosisteme intensive unde factorii monitorizați sunt greu de măsurat – pesticidele, reziduurile de pesticide și efluenții toxici complecși;
ecosistemele complexe cu factori de mediu ușor măsurabili, dar dificil de interpretat – evaluarea rezultatelor implică o analiză calitativă a modificărilor și are o semnificație ecologică semnificativă.
Analiza perturbărilor cu ajutorul biondicatorilor
Din perspectivă ecologică – bioindicatorii sunt organisme capabile de reflectarea calității mediului și cu răspuns rapid în urma expunerii la stres-uri. Abordarea integrativă a perturbărilor ia în calcul atât complexitatea cât și dinamica speciilor selectate ca bioindicatori, corelați cu presiunea factorilor externi (fig. 76.). Analiza efectului se poate efectua activ și pasiv, în funcție de cerințele testelor de biomonitorizare. Analiza activă presupune expunerea intenționată a organismelor cultivate la un stres extern, pe o perioadă stabilită de timp. Această aplicație are avantajul de a dezvolta modele specifice, cu o fidelitate ridicată și cu potențial integrativ sporit. Analiza pasivă implică o serie de comparații evolutive ale unor ecosisteme existente în natură, pe o perioadă lungă de timp, cu rol în identificarea deviațiilor populaționale și a organizării comunităților.
Fig. 76. Inter-relații la nivel de ecosistem datorită presiunii poluanților.
Din punct de vedere practic, bioindicatorii pot fi grupați în trei clase:
Organisme utilizate în bioteste (bioindicatori de mediu) – oferă indicii cantitative asupra efectului ecologic al poluanților;
Specii indicator (bioindicatori ai diversității) – sunt organisme a căror prezență/absență într-un ecosistem, metabolism și organizare celulară indică stres-urile antropice, în special cele rezultate în urma activităților industriale;
Specii de monitorizare (bioindicatori ecologici) – organisme care acumulează la nivel celular substanțe xenobiotice, reacție de perturbare a proceselor fiziologice și biochimice intracelulare, modificări morfologice microscopice.
Subdivizarea bioindicatorilor poate fi făcută la nivel de reacție la perturbări sau la nivel de acumulare:
Bioindicatori de reacție – au răspuns rapid, observabil și măsurabil, la stres-urile chimice datorat unei rezistențe sistemice reduse și unui potențial scăzut de adaptare;
Bioindicatori de acumulare – au un răspuns lent la stres-urile externe, acumulând elementele toxice pe o perioadă lungă de timp datorită unei rezistențe ridicate la efectul toxic.
Pe baza scopului selecție, bioindicatorii pot fi grupați în 3 clase:
Bioindicatori de conformitate – analizează însușirile și caracteristicile descriptive a unei specii la nivel de populație, comunitate sau ecosistem și evaluează sustenabilitatea la nivelul întregii comunități sau ecosistem;
Bioindicatori de diagnoză – evaluează puterea de presiune a factorilor externi prin analiza modificărilor survenite la nivelul de individ;
Bioindicatori de avertizare – se concentrează pe răspunsul rapid și sensibilitatea indivizilor la modificările survenite în mediu.
La nivel de ecosistem, bioindicatorii sunt integrați în modele descriptive de răspuns la stres, de tipul PSIR – presiune-status-impact-răspuns. Indicatorul de presiune (P) descrie intensitatea activităților umane care produc modificări ale calitative și cantitative într-un ecosistem. Indicatorul de status (S) descrie cantitativ și calitativ situația actuală a unui ecosistem. Indicatorul de impact (I) descrie influența statusului actual asupra funcționării ecosistemului. Indicatorul de răspuns (R) descrie nivelul la care sunt afectate funcționarea și utilizarea ecosistemului.
Selecția bioindicatorilor este un proces ce ia în calcul capacitatea reprezentativă a unui organism pentru evaluarea unei probe aleatorii, relevanța pentru ipotezele testate și compatibilitatea cu criteriile teoretice (tabelul 14).
Într-un model ideal, un bioindicator ar trebui să îndeplinească toate criteriile, dar acest aspect nu este valabil pentru o singură specie ceea ce determină utilizarea unui set de specii indicator în tehnicile de biomonitorizare. Speciile indicator trebuie să dețină o specificitate și o fidelitate ridicate, valoarea indicator fiind egală cu procentul în are o singură specie îndeplinește aceste criterii în cadrul unui grup particular de ecosisteme.
Tabelul 14.
Procesul de selecție a bioindicatorilor
Prognoza stres-urilor și a efectelor toxice
Dezvoltarea și implementarea de instrumente biologice pentru tehnicile de prognoză trebuie să fie în concordanță cu descrierea structurii și funcțiilor unui ecosistem și să dețină capacitatea de a evalua acțiunea interferențelor toxice. Parametrii cuantificabili în descrierea efectelor toxice se pot analiza în condiții de laborator și fac referire la dinamica populațională, din perspectiva ratei de supraviețuire, a creșterii, comportamentului și dezvoltării indivizilor și coloniilor. Restricționarea testelor la câte o singură specie permite testarea și modelarea factorilor abiotici (TșC, pH, disponibilitatea apei) în mod similar cu condițiile naturale și interconectarea rezultatelor în sisteme matriceale complexe pentru a descrie un efect larg asupra ecosistemului (tabelul 15.).
Ecosistemele acvatice au servit drept standard pentru crearea de modele integrative pentru biomonitorizare. Analiza prezenței, distribuției și abundenței unei specii poate fi relaționată cu nivelul și efectul poluanților și comparată cu un ecosistem nealterat. Prognoza efectului contaminării unui ecosistem se bazează pe o abordare integrativă a informațiilor chimice și biologice și produce modele specifice cu referire la:
stabilirea relației funcționale dintre expunerea la o anumită concentrație și efectul acesteia;
modelarea răspunsului biologic în urma unei expuneri îndelungate;
identificarea componentelor ecotoxicologice în probe contaminate cu complexe de substanțe;
calcularea efectului combinat al mixturilor de poluanți;
înțelegerea acțiunii ecotoxice;
prezicerea activității biologice relaționat la structura compușilor.
Tabelul 15.
Nivelul de organizare biologică și specificitatea interferențelor toxice
Evaluarea ecotoxicității
Testele de ecotoxicitate sunt experimente de tip biologic, efectuate asupra unui număr ridicat de specii în prezența substanțelor chimice în probe prelevate din mediu. Au rolul de a evalua riscurile potențiale ale unor noi substanțe chimice apărute în mediu, dar și de a monitoriza calitatea momentană a unui mediu (efluenți, sedimente, probe de sol și apă). Variabilele luate în calcul reprezintă parametri biologici, măsurați sau observați, capabili de modificări în timp real și cu răspunsuri diferite la presiunea indusă experimental. Testele se desfășoară în condițiile descrise de principiile Practicii de Laborator Corecte, utilizând standardele internaționale acceptate de comunitățile științifice (OECD, CEN, ISO).
Standardele europene stabilesc ca fiind necesară testarea nivelelor inferioare de contaminare/toxicitate pentru monitorizarea probelor din mediu. Diluția minimă lipsită de efect este considerată cel mai util test de evaluare a toxicității. Proveniența poluanților este un instrument de calibrare a testelor de toxicitate și de corelare cu potențialul de intervenție în ecosistem (tabelul 16.).
Tabelul 16.
Proveniența poluanților în ecosisteme
Alături de acest tip de teste, este necesară asigurarea unei baze de date cu informații specifice fiecărei specii: fiziologie, elemente de genetică și comportament; aceste informații susțin varietatea răspunsului diferitor specii la un anumit contaminant și generează modele complexe de evaluare a perturbărilor.
În abordările de evaluare a toxicității sunt preferate specii aflate în poziții diferite în cadrul lanțurilor trofice, pentru ecosistemele acvatice fiind preferate algele din genurile Scenedesmus și Chlorella. În condițiile actuale de extindere a poluării și la nivel terestru, speciile din aceste ecosisteme intră din ce în ce mai puternic în tehnicile de analiză a ecotoxicității.
Analiza ecotoxicității la nivel de organism. Testele de acest tip se desfășoară pe perioade: scurte de timp, vizând fie dozele letale sau care induc stări de latență ale unui compus sau perioade lungi de expunere, cu vizarea efectelor asupra reproducerii, creșterii sau proceselor fiziologice. Aceste teste se desfășoară în condiții de laborator și necesită o calibrare ulterioară obținerii rezultatelor pentru a putea modela răspunsul la nivel de ecosistem. Pentru ecosistemele acvatice, durata unui teste este de 72 de ore, iar comparația se face cu probe necontaminate de apă. Pentru testele care implică utilizarea algelor este necesară simularea condițiilor de lumină existente în medul lor natural, ceea ce conduce la obținerea de rezultate comparabile cu dezvoltarea naturală a acestor microorganisme.
Indicatori microbiologici generali
Microorganismele posedă caracteristica unică de a fi invizibile cu ochiul liber, având dimensiuni de 0,2 – 200 µm. Repartiția globală a acestor organisme microscopice este la nivelul fiecărui ecosistem datorită adaptării evolutive la orice mediu de viață. Cel mai complex și abundent grup microbian este cel al bacteriilor, cu o capacitate ridicată de metabolizare și utilizare a unei varietăți ridicate de substraturi (tabelul 17.).
Tabelul 17.
Metabolismul bacterian
Algele și cianobacteriile (fitoplancton) sunt principalii producători primari de biomasă din ecosistemele acvatice, fiind la rândul lor descompuse de procesele efectuate de bacterii. Metabolizarea fitoplanctonului la nivel bacterian (producători secundari) reprezintă o producție de aproximativ 20% din cea primară. Densitatea bacteriilor din ecosistemele marine este menținută de restricțiile naturale ale ecosistemului și protozoare la un nivel de aproximativ 1.000.000 / ml, iar bacterivorele au densități populaționale de câte mii de indivizi / ml.
În ecosistemele terestre producătorii primari de biomasă sunt plantele superioare, eliberând energie și carbon în sol prin rădăcini și biomasă vegetală moartă. Descompunătorii primari în aceste ecosisteme sunt bacteriile și fungii, stând la baza lanțului trofic ca hrană pentru protozoare și nematozi.
Poziția cheie a microorganismelor în lanțul trofic, dimensiunile reduse și raportul ridicat suprafață/volum face ca acestea să posede o afinitate ridicată pentru concentrații reduse a substraturilor prezente în ecosistem. Din acest considerent sunt deosebit de sensibile și răspund rapid la apariția stres-urilor de mediu sau a contaminanților, chiar și la concentrații mici. Un alt avantaj al microorganismelor ca bioindicatori este diversitatea genetică ridicată, cu diferențe mari între populațiile microbiene ce compun o comunitate. Un alt avantaj al utilizării microorganismelor este abundența ridicată raportată la dimensiunea redusă ceea ce constituie o rezolvare a problemei scării geometrice și raportarea rezultatelor direct la nivelul probele recoltate.
Analiza riscurilor poluării este corelată cu concentrația compușilor xenobiotici și poate fi utilizată în prognoza riscurilor de poluare. La nivel de laborator este testată toxicitatea substanțelor pure, cu efecte directe asupra unei populații, în timp ce monitorizarea efectului de lungă durată se face în condiții de teren și ia în considerare și ansamblul întregii comunități microbiene. Alături de aceste tehnici de modelare, pentru un întreg ecosistem se mai ia în calcul și apariția stres-urilor datorate eutrofizării, secetei, acidificării sau impactului managementului uman. Efectul direct al modificărilor de mediu includ reducerea biodiversității, respectiv modificarea funcțiilor vitale relaționate la utilizarea și conversia nutrienților, ceea ce necesită selectarea unor indicatori cu sensibilitate ridicată față de cele mai reduse modificări.
În general, rezultatele activității de monitorizare a indicatorilor microbieni fac referire la biomasa, activitatea și diversitatea microbiană. Cele mai performante tehnici de monitorizare sunt dezvoltate pentru bacterii, acestea având o pondere ridicată în orice tip de ecosistem: sol, apă și sedimente. Până în acest moment au fost utilizați cu succes numărul de bacterii coliforme (total și fecali) pentru analiza calității și contaminării apei. Pentru eutrofizare se preferă indicii oferiți de alge și cianobacterii: număr în probe de apă și abundență relativă a speciilor, procesul de fotosinteză și respirație.
Determinarea cantității de biomasă microbiană. Are la bază tehnicile de cultivare pe medii de cultură și microscopia directă cu analiză a imaginilor captate. Oferă indicii asupra numărului total de celule (UFC), biomasa și caracteristicile morfologice alunei comunități microbiene. Numărul total de celule și volumul celular se poate utiliza în calcularea biomasei totale:
F = 1,3 x 10-13 g C µm-3 – pentru biomasa fungală
B = 3,1 x 10-13 g C µm-3 – pentru biomasa bacteriană.
Protozoarele sunt calculate ca cel mai probabil număr, pe baza metodei diluțiilor seriale, numărul fiind estimat până la o diluție din care lipsesc aceste microorganisme.
Determinarea activității microbiene. Pentru acest tip de aplicație se preferă metoda respirației indusă de substrat (SIR), oferind indicii asupra evoluției cantității de CO2 pe o perioada de timp de monitorizare a unei specii în condiții de adaos a unui substrat.
O altă metodă este adaptată pentru determinarea potențialului de mineralizare a azotului și carbonului în sol, pe o perioadă de 6 săptămâni, prin incubare la 20șC și la o capacitate de reținere a apei în sol de 50%. Mineralizarea azotului este calculată ca diferență între concentrația observată în prima săptămână și ultima de incubare. Carbonul mineralizat se calculează ca evoluție a CO2 (respirația) între prima și ultima săptămână.
Determinarea amprentei biochimice a comunității microbiene. Metoda se bazează pe analiza acizilor grași fosfolipidici (PLFA) și oferă structura grupurilor dominante într-o comunitate microbiană, dar fără a detalia nivelul de specie. Avantajul metodei este sensibilitatea ridicată la poluanți, tip de sol, vegetație, climat și management, dar este necesară corelarea cu alte metode pentru extrapolarea rezultatelor.
Determinarea toleranței comunității la poluarea indusă. Este o metodă de evaluare a creșterii toleranței unei comunități microbiene în urma expunerii la contaminanți. Mecanismul evolutiv al adaptării microorganismelor se poate manifesta la nivel fiziologic sau genetic, populațiile sensibile dispărând din comunitate, în timp ce spațiul liber din nișa ecologică este recolonizat de specii tolerante.
Avantajele metodei față de metodele clasice de evaluare a poluării sunt:
observarea efectul clară a efectului poluantului prin evaluarea indicilor de diversitate sau de densitate populațională;
integrarea la nivel biologic a evaluării riscului și analiza răspunsului unei întregi comunități;
corelarea prezenței poluantului cu efectul ecologic, concomitent cu reducerea sensibilității comunității microbiene la anumite doze de poluant.
Indicatori microbieni ai calității aerului
Încă din cele mai vechi perioade s-a conștientizat legătura dintre aer, ca vector de transmitere și bolilele ce afectau populația umană. Cu toate acestea, până în secolul XVII și inventarea microscopului optic, această ceonexiune nu a putut fi demonstrată. Duă acest moment au putut fi identificate microorganismele pe care aerul le poate transporta: bacterii, drojdii, spori ai ciupercilor, alge și chiar și protozoare. Studiile efectuate în zonele urbane au evidențiat un potențial ridicat de contaminare a zonelor rezidențiale, cu valori de zeci de ori mai mari față de cele observate în arealele naturale cu diversitate microbiană ridicată. Separat pe tipuri de activități conmponenta microbiană este mai crescută în atmosfera zonelor cu utilaje în activitate, zonele cu număr ridicat de persoane (clădiri de birouri, spații de lucru) și în încăperi necurățate. Microorganismele cu ponderea cea mai ridicată de apariție în aerul din mediul extern fac parte din grupul fungilor și bacteriilor.
Normele sanitare impun existența unui număr maxim de microorganisme ca fiind admisibile la un volum de 1m3 aer (tabelul 18.), diferențiat pe categorii de folosință a spațiilor.
Sporii ciupercilor sunt prezenți în atmosferă pe tot parcursul anului, cu valori mai ridicate în zonele cu aglomerări urbane. Estimarea concentrație sporilor se face fie prin captare pe medii de cultură, cu numărarea coloniilor formate și identificarea speciilor (fig. 77 a), fie prin utilizarea capcanelor volumetrice și captarea sporilor pe lame de microscop (fig. 77 b). Analiza sporilor și a micellilor dezvoltate de ciuperci se face la microscop eficientizând identificarea potențialilor contaminanți (tabelul 12.). Variațiile climatice sezoniere și cele continue nocturne/diurne sunt principalii factori care influențează concentrația sporilor în atmosferă. Activitățile de recoltare a ierbii, cerealelor păioase în completare la temperatura și umiditatea mediului ambiant pot crește puternic nivelul sporilor în atmosferă, iar vântul să disemineze pe suprafețe mari acești contaminanți.
Spre deosebire de fungi, dimensiunea mai redusă a bacteriilor face ca procedurile de detecție în atmosferă să fie mult mai dificile. Numărul de bacterii culturabile purtate de aer variază puternic în funcție de climă, pe intervale scurte de timp fiind evidențiate fluctuații foarte mari între areale geografice distanțate spațial. Un număr mai ridicat de bacterii este prezent în atmosferă în timpul serii în special în zonele urbane, cu o preponderență a bacteriilor gram pozitive G+ (tabelul 19.).
Fig. 77. Captarea sporilor: a) pe medii de cultură; b) cu capcane volumetrice.
Tabelul 18
Numărul maxim de contaminanți microbieni în atmosferă
Tabelul 19
Cele mai întâlnite specii de microorganisme întâlnite în atmosferă
Algele ca indicatori în biomonitorizarea ecosistemelor acvatice
Algele sunt considerate cei mai vechi indicatori ai calității apei, la începutul secolului XX fiind creată și denumirea de "organisme saprobe". Saprobitatea poate fi definită ca intensitatea activității heterotrofe, ceea ce exclude din acest tip de analiză influența organismelor fotoautotrofe.
Utilizarea algelor ca bioindicatori presupune cunoașterea cerințelor față de una sau mai multe variabile de mediu. Acest aspect este corelat cu prezența/absența, biomasa și creșterea algelor într-un ecosistem considerat contaminat sau afecta de poluare. O extindere a conceptului face referire la capacitatea acestor microorganisme de a acumula substanțele poluante, ceea ce este extrem de util în analiza nivelului de contaminare. În acest mod se poate defini nivelul de afectare a unui ecosistem acvatic ca valoare peste care nu mai poate absorbi și stresul produs de contaminare.
Evaluarea în teren a calității ecosistemelor acvatice se referă de obicei la algele din fitoplancton sau perifiton. Colectarea algelor din fitoplancton se poate face ușor prin prelevarea apei de la suprafață. Algele din fitobentos și perifiton se prelevează prin răzuirea suprafețelor de care sunt atașate.
În acest moment, estimarea calității râurilor și lacurilor pe baza structurii fitoplanctonului și perifitonului este integrată ca măsură în Directiva Cadru pentru Apă 2000/60/CE și permite utilizarea acestui tip de tehnici biologice.
Algele din fitoplancton sunt indicatori ușor de detecta a modificărilor de lungă durată în râuri. Grupul dominant în aceste ecosisteme sunt diatomeele pe tot parcursul anului, în timp ce co-dominantele apar condiționat de modificările climatice: algele verzi și Cryptophyceae – vizibile în special vara; reducerea fluxului de apă produce o proliferarea de scurtă durată a cianobacteriilor. Sistemul tradițional de analiză a claselor trofice în râuri pe baza fitoplanctonului se bazează pe concentrația de clorofilă-a în perioda de creștere – Martie-Octombrie (tabelul 20.). Se pot utiliza atât date medii cât și extremele minime și maxime pentru procesele de modelare a răspunsului ecosistemului la contaminanți.
Tabelul 20.
Caracterizarea trofică a ecosistemelor acvatice pe baza fitoplanctonului
Algele din fitobentos constituie o serie de indicatori performanți în analiza cursurilor de apă curgătoare, fiind prezente în perifitonul acestor ecosisteme. Analiza conglomeratelor de alge se face prin colectare pe transecte a materialului instalat fie pe roci aparținând mediului natural fie pe substraturi artificiale. În principiu, selecția unei specii ca bioindicator se poate face ținând cont de limitele sale ecologice și de prezența/absența în ecosistem (tabelul 21.). Speciile cu proliferare puternică în condiții cunoscute sunt un nivel superior de bioindicatori.
Cea mai utilizată categorie de alge în procesele de biomonitorizare este cea a diatomeelor, pentru care au fost create tehnici de analiză complexe cu integrarea efectului salinității, acidității, valorii pH-ului, concentrația ionilor de Al, carbonul organic dizolvat și substanțele humice.
Tabelul 21.
Indicatori de analiză a ecosistemelor acvatice
Unul dintre cei mai performanți indici în analiza impactului nutrienților asupra diatomeelor este cel de troficitate al diatomeelor (TDI):
TDIss =
unde: TDISS = indicele de troficitate al diatomeelor; Yi = abundența relativă a speciilor i=1 – n în zona de prelevare; TDIi = indice bazat pe necesarul de fosfor sau fosfor și azot al speciilor 1 – n; Wi = ponderea i=1 – n pentru speciile i=1 – n.
Utilizarea indicelui TDI poate conduce la obținerea de evaluări direcționate atât spre condițiile de troficitate prezente într-o apă curgătoare cât și cu privire la cantitatea de nutrienți existentă în spațiul ocupat de ecosistem (tabelul 22).
Tabelul 22.
Interpretarea indicelui de troficitate al diatomeelor și relaționarea la condițiile de troficitate și nutriție din ecosistem
Diferențierea râurilor în funcție de nivelul de saprobitate este utilă în evaluarea potențialului de autopurificare a ecosistemului relaționat la poluarea existentă. Fiecare nivel este caracterizat de o concentrație particulară de oxigen, materie organică și nivel de mineralizare a substanțelor: zone polisaprobe – puternic poluate cu materie organică, cu dezvoltare puternică a bacteriilor descompunătoare, o rată ridicată de consum a oxigenului, producere de amoniu și hidrogen sulfurat; zone α-mezosaprobe – cu procese puternice de oxidare și consum a oxigenului, fără producere de hidrogen sulfurat, dar cu începerea proceselor de oxidare a amoniacului; zone β-mezosaprobe – cu conținut ridicat de oxigen dizolvat, consum redus de oxigen, mineralizare a materiei organice, acumulare ridicată de produși ai proceselor de mineralizare; zone oligosaprobe – caracterizate de încheierea tuturor proceselor de mineralizare, conținutul de oxigen dizolvat este ridicat iar consumul aproape de zero – cu divizare în α-oligosaprobe – cu număr ridicat de specii și activitate puternică respectiv β-oligosaprobe – cu număr moderat de specii și activitate redusă.
Integrarea indicilor la nivel de comunitate a condus la o separare a speciilor de alge în funcție de cerințele pentru nutrienți și toleranța la poluare:
specii în mare majoritate tolerante (mt) – care se pot reproduce în condiții polisaprobe;
specii cu toleranță ridicată (tr) – apar la nivelul α-mezo-polisabrob;
specii tolerante (t) – capabile de tolerarea condițiilor α-mezosaprobe;
specii sensibile (s) – sensibile la poluare, dar tolerează condițiile α-mezosaprobe;
specii cu sensibilitate ridicată (sr) – evită o saprobitate mai mare de nivelul β-mezosaprobic;
specii oligotrofe (ol) – indică prezența unor concentrații reduse de nutrienți;
specii eutrofe (eu) – cu preferințe pentru nivele ridicate de nutrienți.
Pe baza acestui sistem integrativ, se poate analiza troficitatea și poluarea la nivelul unui întreg ecosistem:
Indici specifici pentru lacuri și lacuri de acumulare
Raportul Chlorococcaceae – Desmidaceae – este util în evaluarea nivelului de troficitate al lacurilor:
Interpretarea se face pe baza următoarei scale:
Q < 1 (0.2-0.7) – lacuri oligotrofe
Q ≥ 1 (1-3) – lacuri eutrofizate
Q ≥ 3 (până la 14) – lacuri hipertrofizate.
Indici sintetici – propuși de Nygaard
Indicele Myxophyceae:
Indicele de diatomee:
Indicele de euglenoficee:
Indice compus:
Interpretarea nievelului trofic se face pe baza următoarei scale:
Raportul speciilor eutrofe/oligotrofe – E/O:
Indicele este util în special în ecosistemele cu eutrofizare puternică.
Clasificarea calitativă pe baza speciilor se referă la utilizarea biomasei anumitor specii indicator pentru evaluarea troficității. Lacurile cu o biomasă de 0,01 – 0,50 mg/l sunt considerate oligotrofe, iar cele cu o valoare de peste 2,5 mg/l eutrofe (tabelul 24.).
Tabelul 24.
Algele ca indicatori ai nivelului trofic
BIOPREPARATE MICROBIENE – ROL ÎN CREȘTEREA ȘI DEZVOLTAREA PLANTELOR
Rizosfera este o zonă de influențare a sistemului radicular al plantelor de către microorganisme cu proprietăți fizice, chimice și biologice diferite față de cele aflate în zonele de sol neexplorate de rădăcini. O caracteristică a rizosferei este sensibilitatea microflorei la specia prezentă în ecosistem, iar ca răspuns este vizibilă o creștere a dimensiunii populațiilor pe măsura creșterii și dezvoltării plantelor și producerii de exudate radiculare și biomasă vegetală. Un număr ridicat de microorganisme posedă capacitatea de a se integra într-un sistem complex de funcționare și parteneriat cu rizosfera plantelor.
Aplicarea biopreparatelor microbiene a devenit o tehnică prezentă în agroecosisteme, începând cu câte va decade în urmă. Studiile din ultimii ani au demonstrat efectul benefic al microorganismelor prin stimularea creșterii rezistenței la presiunea climatică și tehnologică, prin creșterea transferului de nutrienți către plante și prin suprimarea efectului patogenilor sau chiar a prezenței lor în rizosferă.
Utilizarea pe scară largă a doar a fertilizanților de sinteză sau a îngrășămintelor exclusiv organice poate conduce la o modificare a dinamicii microbiene a solului spre procese cu potențial redus în stimularea creșterii plantelor. În aceste condiții aplicarea, ca metodă de susținere a fertilizării, a biopreparatelor cu microorganisme active are un potențial ridicat de creștere a stabilității agroecosistemului și o menținere sau chiar sporire a producțiilor obținute. Utilizarea bacteriilor și a fungilor micorizieni în preparate cu microfloră activă se înscrie în aceste direcții agronomice, cu rezultate benefice asupra dezvoltării plantelor.
Primele activități de utilizare a biopreparatelor microbiene au avut ca scop reducerea sau stoparea patogenilor și promovarea microorganismelor din produsele active ca agenți de biocontrol. Inocularea ulterioară a plantelor cu bacterii rizosferice benefice sau fungi micorizieni a condus la o creștere a dezvoltării plantelor, o utilizare mai eficientă a resurselor din sol și inputuri externe și cu o finalitate în obținerea de producții superioare. Inoculul microbian poate fi compus dintr-o singură specie sau un consorțiu microbian, din bacterii sau fungi, respectiv o combinație activă a acestora.
Biopreparatele bacteriene pot conține specii capabile de nodulare în prezența leguminoaselor ceea ce, raportat la numărul mare de specii existente la nivel mondial, se poate transpune în soluții specifice pentru fiecare tip de leguminoasă cultivată. Bacteriile fixatoare de N în mod liber sunt mult mai numeroase în sol și activează bine în rizosfera plantelor de cultură, aducând cantități importante din acest element în rizosferă. Din acest considerent, aplicabilitatea, în special la culturile de cereale este ridicată și se poate transpune în biopreparate monospecifice sau consorții microbiene complexe. Un număr mare de specii pot reduce prezența patogenilor și pot fi integrate la nivel de rizosferă atât ca biopreparat de biocontrol, cât și în consorții alături de fixatorii de azot, în special cei non-simbiotici. Exemple în aceste direcții sunt genurile Rhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Ensifer – pentru simbionți, Azospirillum, Azotobacter, Azomonas, Derxia – ca fixatori non-simbiotici, respectiv Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens, Streptomyces albus – ca stimulatori de creștere.
Biopreparatele pe bază de complexe micoriziene sunt formulate de obicei ca și consorții cu multiple specii, mai cunoscute fiind Glomus aggregatum, G. etunicatum, G. clarum, G. deserticola, G. intraradices, G. monosporus, G. mosseae, Gigaspora margarita, și Paraglomus brasilianum, Funneliformis sp. (endomicorize), respectiv Pisolithus tinctorius., Rhizopogon amylpogon, R. fulvigleba, R. luteolus, R. villosullus, Lacarria laccata, Scleroderma cepa, S. citrinum (ectomicorize).
Un nou segment dezvoltat în tehnologiile de inoculare microbiană a solurilor agricole este cel de utilizare a algelor atât ca produse microbiene active cât și sub formă de pulbere ca fitostimulatori. În ultima perioadă s-a încercat o condiționare și integrare a algelor ca specii sinergice în biopreparatele bacteriene, ca efectori sinergici. O zonă nou explorată în solurile agricole este cea a crustei biologice, însemnând stratul fin de microorganisme active de la suprafața solului dominat în special de alge. Inocularea solului cu specii eficiente în producerea de metaboliți utili plantelor și microflorei benefice din rizosferă face ca algele să devină o oportunitate pentru agricultura durabilă și sustenabilă. Speciile mai des utilizate în acest tip de biopreparate sunt Dunaliella sp., Haematococcus sp., Spirulina sp., Chlorella sp., Nostoc sp. și Anabaena sp..
Aplicații practice
Utilizarea biopreparatelor în agricultură.
Obiective:
Analiza creșterii plantelor ca urmare a inoculării solului cu biopreparate microbiene active.
Materiale
Vase de vegetație;
Biopreparate microbiene pe bază de bacterii, micorize și consorții complexe;
Semințe de cereale și leguminoase.
Procedura de lucru:
Se vor instala culturi comparative în mediu controlat și se va evalua germinarea plantelor, creșterea și dezvoltarea în condiții de inoculare și neinoculare, arhitectura radiculară, dependența față de simbioză.
Se vor întocmi proiecte pe baza rezultatelor obținute și se vor analiza comparativ cu rezultate științifice obținute la nivel internațional.
EVALUARE
Care sunt tipurile de biopreparate utilizate în agricultură?
Descrieți diferențele dintre biopreparatele monospecifice și consorțiile microbiene.
Denumiți cele mai utilizate specii micoriziene pentru bioprepaarte.
Explicați motivul integrării algelor în biopreparate microbiene pentru agricultură.
Notițe și observații:
FERMENTAȚII
FERMENTAȚIA ALCOOLICĂ
Fermentația alcoolică este un proces în care anumite zaharuri (ex. glucoza) sunt descompuse în alcool și dioxid de carbon prin acțiunea diferitelor drojdii, mucegaiuri, sau bacterii asupra substratelor de carbohidrați, dintre care unele nu fermentează dar pot fi hidrolizate în substanțe fermentabile.
În urma acestui proces se degajă energie, în majoritate sub formă de energie calorică.
Reacția generală a fermentației alcoolice este
C6H12O6 = 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP (118 KJ/mol)
În funcție de condiții și de microorganism, în urma fermentației rezultă o serie de produși secundari: acetaldehidă, acid lactic, acid acetic, acid succinic, glicerină etc.
Microorganismele reprezentative pentru procesul de fermentație sunt drojdiile (levurile), cele mai cunoscute aparținând genului Saccharomyces. Adaptarea drojdiilor la medii cu conținut bogat în zaharuri face ca acestea să fie larg răspândite în natură. Pot fi întâlnite și saprofit în nectarul florilor sau în fructele aflate în faza de descompunere. În sol se găsesc doar ca spori, deci nu într-un stadiu activ ci de conservare.
Unele dintre specii aparținând familiei Saccharomycetaceae (Saccharomyces cerevisiae, S. oviformis, S. carlsbergensis) sunt importante din punct de vedere industrial, fiind implicate în procesul de fermentare al mustului (fig. 78.). Dar există și o serie de drojdii aparținând aceleiași familii care nu produc fermentații utile și produc boli ale vinului – Pichia membranifaciens (fig.79.), Hansenula anomala.
Creșterea drojdiilor în laborator, în mediu lichid, le imprimă acestor microorganisme o dezvoltare variată. Unele formează o peliculă cu aspect nisipos, iar altele un văl tipic de grosimi diferite. Pe medii solide iau diferite forme și aspecte, iar culoarea lor poate fi albă, gălbuie, roz, maronie etc.
Din punct de vedere sistematic majoritatea drojdiilor fac parte din subîncrengătura Ascomycotina, iar unele din subîncrengătura Deuteromycotina. Sunt ciuperci microscopice unicelulare, cu formă variind de la sferică până la ovală, alungită sau apiculată și cu dimensiuni între 7.2 x 5.6 µm.
Înmulțirea se face de obicei prin înmugurire, iar în anumite cazuri prin sciziparitate (similar cu bacteriile). În momentul încetării procesului de înmugurire, celula vegetativă se transformă în ască ce conține de regulă patru sau mai rar opt ascospori.
Fig. 78. Saccharomyces cerevisiae
Fig. 79. Pichia membranifaciens
Dintre ciupercile microscopice existente și active în sol, în condiții strict anaerobe sau aerobe, reprezentanții genurilor Mucor, Rhizopus, Aspergillus și Penicillium sunt capabili să fermenteze hidrații de carbon din fructele și frunzele căzute pe sol. Dintre bacterii, specia Bacillus macerans este capabilă de activitate fermentativă.
Aplicații practice
Obiective:
Pentru studiul fermentației alcoolice în laborator se vor evidenția produșii de reacție ai procesului: dioxidul de carbon și alcoolul etilic. Se va aprecia activitatea metabolică a drojdiilor și se vor realiza preparate native și fixe pentru evidențierea caracteristicilor morfologice.
Materiale necesare:
Soluții de fermentație proaspătă;
Flacoane Erlenmeyer cu dop de cauciuc prevăzut cu tub recurbat;
Eprubete;
Pipete;
Pahare Berzelius;
Tuburi de fermentație Einhorn;
Termostat;
Soluție de Ca(OH)2;
Soluție de NaOH 20%;
Baie de apă cu termostat;
Iod metalic;
Lame și lamele.
Aprecierea activității metabolice a drojdiilor
Aprecierea gradului de înmugurire – se execută un preparat umed din suspensia pentru studiu. Se determină numărul total de celule și cel de celule înmugurite din 5 sau 10 câmpuri microscopice, apoi se face media corespunzătoare unui singur câmp și se raportează la stadiul cultivării.
Diferențierea celulelor moarte de cele vii – se amestecă o suspensie de celule cu o soluție diluată de albastru de metilen. Se lasă un timp de 3-5 minute, după care se efectuează un preparat umed. La microscop se vor observa celulele vii necolorate, în timp ce celulele moarte vor avea culoarea albastră (fig. 80.). Colorația diferențiată se datorează capacității celulelor vii de a transforma colorantul într-un compus incolor, în timp ce în celulele moarte acesta rămâne neschimbat.
Fig. 80. Diferențierea celulelor vii de cele moarte
Punerea în evidență a dioxidului de carbon
Evidențierea CO2 eliberat – soluția de fermentație (cirac 50 ml) se introduce într-un flacon Erlenmeyer. Flaconul se închide etanș cu un dop de cauciuc prevăzut cu un tub de sticlă curbat în forma literei S. Capătul tubului de sticlă se introduce într-un pahar Berzelius cu apă, iar la extremitate i se va atașa o eprubetă răsturnată plină cu apă.
Se menține soluția de fermentare la o temperatură de 30-, iar în urma procesului de fermentare se va degaja CO2, care se va acumula în eprubetă și va elimina treptat apa. Evidențierea CO2 se face prin adăugarea unei soluții de Ca(OH)2 în eprubetă și care va reacționa cu dioxidul formând un precipitat alb (CaCO3).
Determinarea cantității de CO2 degajată – în două tuburi sunt introduse o soluție de fermentație cu glucoză 10%, respectiv o soluție de fermentație cu zaharoză 10%. Se pun ambele tuburi în termostat la o temperatură de pentru 30 de minute. După acest timp tuburile se scot și se citește pe gradație volumul de CO2 degajat în urma fermentației.
Punerea în evidență a alcoolului etilic
Reacția cu iodul metalic – este un procedeu care se bazează pe reacția iodului cu alcoolul etilic. Într-o eprubetă se introduc 5ml de soluție de fermentație peste care se adaugă un volum identic de NaOH 20% (hidroxid de sodiu), apoi se încălzește la . Se adaugă câteva cristale de iod metalic, continuând încălzirea. Prezența alcoolului etilic rezultat din fermentație determină formarea iodoformului, un praf galben cu miros specific puternic.
Reacția cu bicromatul de potasiu – se bazează pe reacția dintre acidul sulfuric, alcoolul etilic și bicromatul de potasiu. Într-o eprubetă se pun câțiva mililitri soluție de fermentare, câteva cristale de bicromat de potasiu și câteva picături de acid sulfuric concentrat. Ca urmare a reducerii cromului, culoarea galbenă a bicromatului de potasiu devine verde și se formează aldehida acetică, cu miros caracteristic.
Morfologia drojdiilor implicate în fermentația alcoolică – se realizează frotiuri colorate după metoda Gram și se studiază la microscop cu obiectivul de imersie.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
FERMENTAȚIILE
10.1. Fermentația alcoolică
Apreciați activitatea metabolică a drojdiilor și completați tabelul cu caracteristicile morfologice ale celulelor vizualizate la microscop
FERMENTAȚIA LACTICĂ
Fermentația lactică este procesul anaerob de transformare al substanțelor organice în acid lactic pe baza activității enzimatice a bacteriilor.
Alte grupe de microorganisme, drojdii și mucegaiuri, produc cantități reduse de acid lactic, dar nu sunt considerate microorganisme lactice tipice.
Acidul lactic rezultat în urma acestui tip de fermentație este un produs foarte util în medicină, industria alimentară, a pielăriei sau ca mordant în industria textilă.
Procesul de fermentație se desfășoară în mai multe etape, în primă fază fiind scindată molecula de lactoză în glucoză, apoi transformată în acid lactic:
C6H12O6 = 2CH3-CHOH-COOH
După modul de degradare al substratului și natura produșilor finali din fermentație, bacteriile lactice pot fi împărțite în două grupuri:
Homofermentative – care transformă substanțele glucidice cu un randament mai mare de 85%, și produc pe lângă acest compus și cantități reduse de dioxid de carbon și acid acetic. Reprezentative pentru acest grup sunt Lactobacillus delbrueckii (ssp. delbrueckii, lactis, bulgaricus), Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus acidi lactici, Streptococcus lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus etc (fig. 81 – 82.);
Heterofermentative – care produc acid lactic în proporție de 50% și o serie de produși secundari, cum ar fi: glicerină, manitol, alcool etilic, acid acetic, acetonă, dioxid de carbon. Reprezentative pentru acest grup sunt: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus bifidum, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Leuconostoc citrovorus, Leuconostoc paracitrovorum etc (fig. 83.).
În industria lactatelor sunt utilizate speciile care au capacitatea de a produce acid lactic în cantități mari.
Fig. 81. Bacterii lactice homofermentative – Lactobacillus bulgaricus
Fig. 82. Bacterii lactice homofermentative – Pediococcus sp.
Fig. 83. Bacterii lactice heterofermentative – Leuconostoc sp.
Aplicații practice
Obiective:
Studiul morfologiei bacteriilor implicate în procesul de fermentație lactică și punerea în evidență a acidului lactic rezultat în urma acestui proces.
Materiale necesare:
Lapte fermentat;
Eprubete;
Pipete gradate;
Acid sulfuric 10%;
Soluție de permanganat de potasiu 2% (KMnO4);
Hârtie de filtru;
Soluție amoniacală de azotat de argint;
Lame și lamele.
Evidențierea acidului lactic – într-o eprubetă se introduc 10 ml acid lactic (zer de lapte fermentat), apoi se adaugă 1 ml acid sulfuric 10% și se încălzește până la fierbere. Se adaugă câteva picături de permanganat de potasiu 2%. În urma reacției chimice care are loc acidul acetic se transformă în aldehidă acetică. Evidențierea aldehidei se face prin acoperirea eprubetei cu o hârtie de filtru îmbibată într-o soluție amoniacală de azotat de argint, încălzindu-se în continuare. Prin evaporare aldehida acetică va ajunge la hârtia de filtru, care se va înnegri prin depunerea unei pulberi fine de argint metalic. Morfologia bacteriilor implicate în fermentația lactică – se realizează frotiuri colorate după metoda Gram și se studiază la microscop cu obiectivul de imersie.
Documentație de laborator
Nume:
Data:
FERMENTAȚIIILE
Fermentația alcoolică
Completați tabelul cu caracteristicile morfologice ale celulelor vizualizate la microscop
FERMENTAȚIA ACETICĂ
Fermentația acetică este un proces de oxidare a alcoolului etilic în acid acetic, în condiții aerobe. Termenul este arbitrar, deoarece fermentația apare, de obicei, în lipsa oxigenului atmosferic, deci în condiții anaerobe. Din punct de vedere al funcționării procesului, fermentația acetică este privită ca un exemplu de oxidare incompletă, deoarece nu se produce dioxid de carbon.
Bacteriile responsabile de acest proces sunt aerobe obligate și formează membrane prin aglomerarea la suprafața lichidului de fermentație (fig. 85.). În mod similar cu procesul de respirație și în fermentația acetică are loc o oxidare, dar spre deosebire de respirație produsul final nu este dioxidul de carbon ci acidul acetic, care mai conține energie pentru a fi oxidat în continuare. Din acest motiv se explică eliberarea unei cantități reduse de energie în condițiile unui consum mare de materie primă.
Reacția simplificată a procesului de fermentație acetică este:
CH3-CH2-OH + O2 = CH3-COOH +H2O +117 cal
Bacteriile acetice sunt prezente în mod natural pe suprafața fructelor (mere, struguri, citrice), astfel încât la extragerea sucului vor trece automat în acesta. Din acest motiv prin menținerea în condiții improprii a băuturilor alcoolice sau a sucurilor proaspete este determinată începerea procesului de fermentație acetică.
Bacteriile responsabile de fermentația acetică fac parte din genul Acetobacter. Speciile reprezentative sunt: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter xilinum, Acetobacter oxydans, Acetobacter suboxidans, Acetobacter viniaceti, Acetobacter orleanense, Acetobacter acetigenum, Acetobacter schuetzenbachii.
Utilitatea acidului acetic se regăsește în industria medicamentelor (ex. acidul acetilsalicilic – aspirina), industria alimentară, în obținerea acetatului de celuloză și a poliacetatului de vinil, iar esterii acestui acid își găsesc întrebuințări în industria parfumurilor.
Fig. 85. Formațiune membranoasă la suprafața lichidului de fermentație
Aplicații practice
Obiective:
Evidențierea acidului acetic pentru studiul fermentației acetice în condiții de laborator. Acest aspect imprimă necesitatea creării unor condiții de anaerobioză pe un mediu fermentabil (vin, bere, sucuri de fructe), prin fermentarea acestui mediu fiind obținut alcool.
Lichidul de fermentație va fi reprezentat de vin sau bere, slab alcoolice, ținute la termostat în flacoane, timp de 2-3 zile și la o temperatură de .
Se vor studia membranele formate de coloniile bacteriene la suprafața lichidului și acidul acetic din lichid.
Materiale necesare:
Lichid de fermentație – bere sau vin;
Eprubete;
Alcool etilic;
Acid sulfuric concentrat;
Clorură de fier 5% (FeCl3);
Lame și lamele pentru microscop.
Reacția de formarea a esterului acetico-etilic – într-o eprubetă se introduc 4-5 ml lichid de fermentație peste care se adaugă 0.5 ml alcool etilic 96% și 2-3 ml acid sulfuric concentrat. Prin încălzire se formează esterul acetico-etilic cu miros caracteristic de pere.
Reacția cu FeCl3 – se introduc în eprubetă 3-4 ml soluție de fermentare peste care se adaugă câteva picături de clorură de fier și apoi se încălzește soluția obținută. Se va observa apariția unei colorații roșu-închis dată de formarea acetatului de fier.
Studiul bacteriilor acetice – se vor executa preparate native colorate cu iod, pentru studiul membranelor formate de bacteriile acetice și frotiuri colorate după metoda Gram (fig. 61.).
Acetobacter aceti formează membrane vâscoase, A. pasteurianum formează membrane netede, uscate, A. xilinum formează membrane pieloase, groase de 2-, A. ranceum formează membrane subțiri mucilaginoase.
Prin colorare cu iod se pot diferenția speciile Acetobacter pasteurianum și A. kützingianum (colorație albastră a membranei celulare) de speciile A. aceti și A. ranceum (colorație galbenă a membranei celulare).
Documentație de laborator
Nume:
Data:
FERMENTAȚIILE
Fermentația acetică
Completați tabelul cu caracteristicile morfologice ale celulelor vizualizate la microscop
EVALUARE
Care sunt cele mai întâlnite procese de fermentație și unde sunt utilizate?
Ce microorganisme pot fi implicate în procesul de fermentație alcoolică?
Descrieți procesul de fermentație alcoolică.
Definiți fermentația lactică și industria în care este utilizată.
Notețe și observații:
Enumerați microorganismele implicate în fermentația lactică și faceți o clasificare în funcție de randament.
Descrieți fermentația acetică.
Denumiți principalele specii implicate în fermentația acetică.
Notețe și observații:
BIBLIOGRAFIE
Ahmad I., F. Ahmad, J. Pichtel (Eds.), 2011, Microbes and microbial technology: agricultural and environmental applications. Springer Science & Business Media.
Alef K., P. Nannipieri, 1995, Methods in applied soil microbiology and biochemistry. Academic press.
Aneja K. R., 2003, Experiments in Microbiology, Plant pathology and Biotechnology, (4th Edition), Ed. New Age International, New Delhi, ISBN 812241494x.
Armon R. H., O. Hänninen (Eds.), 2015, Environmental Indicators. Springer.
Artiola J., I. L. Pepper, M. L. Brusseau, 2004, Environmental monitoring and characterization. Academic Press.
Atlas R. M., 2010, Handbook of microbiological media, (4th Edition), Ed. CRC Press, ISBN 978-1-4398-0406-3.
Bakker P. A., J. M. Raaijmakers, G. Bloemberg, M. Höfte, P. Lemanceau, B. M. Cooke (Eds.), 2010, New perspectives and approaches in plant growth-promoting rhizobacteria research. Springer Science & Business Media.
Bending G. D., M. S. Rodriguez-Cruz, S. D. Lincoln, 2007, Fungicide impacts on microbial communities in soils with contrasting management histories. Chemosphere, 69(1), 82-88.
Benson, H. J., 2002, Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology, (8th Edition), Ed. McGraw-Hill College.
Bisen P. S., 2014, Laboratory protocols in applied life sciences. CRC Press.
Black G. Jacquelyn, 2012, Microbiology: principles and explorations, (8th Edition), Ed. John Wiley & Sons, Inc., ISBN 978-0-470-54109-8.
Bloem J., D. W. Hopkins, A. Benedetti (Eds.), 2005, Microbiological methods for assessing soil quality. CABI.
Büchs W., 2003, Biodiversity and agri-environmental indicators—general scopes and skills with special reference to the habitat level. Agriculture, Ecosystems & Environment, 98(1), 35-78.
Cardon Z. G., J. L. Whitbeck (Eds.), 2011, The rhizosphere: an ecological perspective. Academic press.
Carter M. R., E. G. Gregorich (eds.), 2008, Soil Sampling and Method of Analysis, 2nd Edition, CRC Press, ISBN 978-0-8493-3586-0
Chesworth, W. (Ed.), 2008, Encyclopedia of soil science (Vol. 207). Berlin: Springer.
Cork D. J., J. P Krueger, 1991, Microbial transformations of herbicides and pesticides. Advances in applied microbiology, 36, 1-66.
Corn M., 2012, Handbook of hazardous materials. Academic Press.
Cowan M. K., 2011, Microbiology : A Systems Approach, (3rd Edition), Ed. McGraw-Hill Higher Education, ISBN 0-07-352252-X .
Dighton J., J. A. Krumins (Eds.), 2014, Interactions in Soil: Promoting Plant Growth (Vol. 1). Springer.
Goldman E., L. H. Green, 2008, Practical Handbook of Microbiology, (2nd Edition), Ed. CRC Press, ISBN 978-0-8493-9365-5.
González P. F., M. Landajo, M. J. Presno, 2014, The Driving Forces of Change in Environmental Indicators. Lecture Notes in Energy, 25.
Gupta V. K., M. G. Tuhoy, 2013, Laboratory Protocols in Fungal Biology – Current Methods in Fungal Biology. Springer.
Harley J. P.; Prescott L. M., 2001, Laboratory Exercises In Microbiology, (4th Edition) Ed. McGraw-Hill College.
Hayward S. F., J. Majeres, 2002, Index of leading environmental indicators. Pacific Research Institute for Public Policy.
Ian L. P., P. G Charles, 2004, Environmental Microbiology. A Laboratory Manual. Elsevier Academic Press
Jeffery S., C. Gardi, A. Jones, L. Montanarella, L. Marmo, L. Miko, K. Ritz, G. Peres, J. Römbke, W. H. van der Putten (eds.), 2010, European Atlas of Soil Biodiversity. European Commission, Publications Office of the European Union, Luxembourg.
König H., G. Unden and J. Fröhlich (eds.), 2009, Biology of Microorganisms on grapes, in must and in wine, Ed. Springer-Verlag.
Kubicek, C. P., I. S. Druzhinina (Eds.), 2007, Environmental and microbial relationships (Vol. 4). Springer Science & Business Media.
Leboffe M. J., B. E. Pierce, Photographic Atlas for the Microbiology Laboratory, (4th Edition), Ed. Morton Publishing Company, Englewood, ISBN 978-089582-872-9.
Leboffe M. J., B. E. Pierce, D. Ferguson (Ed.), 2012, Microbiology: Laboratory Theory & Application, (2nd Edition), Ed. Morton Publishing Company, ISBN 0895829479.
Markert B. A., A. M. Breure, H. G. Zechmeister (Eds.), 2003, Bioindicators & biomonitors: principles, concepts, and applications (Vol. 6). Gulf Professional Publishing.
Matsumura F. (Ed.), 2012, Biodegradation of pesticides. Springer Science & Business Media.
Milosevic, M. A., M. M. Govedarica, 2002, Effect of herbicides on microbiological properties of soil. Zbornik Matice srpske za prirodne nauke (Serbia and Montenegro).
Monaco, T. J., S. C. Weller, F. M. Ashton, 2002, Weed science: principles and practices. John Wiley & Sons.
Newman M. C., W. H. Clements, 2007, Ecotoxicology: a comprehensive treatment. CRC Press.
O'Malley M., 2014, Philosophy of microbiology. Cambridge University Press.
Page V., R. C. Le Bayon, U. Feller, 2006, Partitioning of zinc, cadmium, manganese and cobalt in wheat (Triticum aestivum) and lupin (Lupinus albus) and further release into the soil. Environmental and experimental Botany, 58(1), 269-278.
Paul E. A. (Ed.), 2007, Soil microbiology, ecology, and biochemistry, (3rd Edition), Oxford: Academic Press.
Paulsen I. T., A. J. Holmes, 2014, Environmental microbiology: methods and protocols.
Pepper I. L., C. P. Gerba, J. W. Brendecke, 1995, Environmental microbiology: a laboratory manual (Vol. 15). New York: Academic Press.
Pepper I.L., C.P. Gerba, 2004, Environmental Microbiology A Laboratory Manual, (2nd Edition), Ed. Elsevier Academic Press.
Pollack R. A., Lorraine Findlay, W. Mondschein, R. R. Modesto, 2008, Laboratory Exercises in Microbiology, (3rd Edition), Ed. John Wiley & Sons, Inc, ISBN 978-0-470-13392-7.
Pommerville J. C., 2011, Alcamo's Laboratory Fundamentals of Microbiology, (9th Edition), Ed. Jones & Bartlett Publishers, ISBN 978-0-7637-9557-3.
Pop R., 2006, Microbiologie generală. Aplicații practice. Ed. Todesco Cluj-Napoca, ISBN 973-7695-16-x.
Potapova M., D. F. Charles, 2007, Diatom metrics for monitoring eutrophication in rivers of the United States. Ecological indicators, 7(1), 48-70.
Prescott L. M., 2002, Microbiology, (5th Edition), Ed. McGraw-Hill College. ISBN 0-07-282905-2.
Prisecaru M., I. Stoica, D. Răducanu, 2015, Microbiologie generală, Ed. Alma Mater, Bacău.
Querol A., G. Fleet (Eds.), 2006, Yeasts in Food and Beverages, Ed. Springer-Verlag, ISBN 3-540-28388-9.
Radosevich S. R., J. S. Holt, C. M. Ghersa, 2007, Ecology of weeds and invasive plants: relationship to agriculture and natural resource management. John Wiley & Sons.
Reitner J., V. Thiel (Eds.), 2011, Encyclopedia of Geobiology, Springer, ISBN: 978-1-4020-9211-4 (Print) 978-1-4020-9212-1 (Online)
Roberts T. R., D. H. Hutson, 1998, Metabolic pathways of agrochemicals: insecticides and fungicides (Part-2). Royal Society of Chemistry.
Roberts T. R., D. H. Hutson, 1998, Metabolic pathways of agrochemicals: herbicides and plant growth regulators (Part-1). Royal Society of Chemistry.
Rosa C. A., G. Péter (Eds.), 2006, Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts, Springer-Verlag.
Schaechter, M. ed., 2004, Desk encyclopedia of microbiology, Ed. Elsevier Academic Press, ISBN 0-12-621361-5.
Schaechter, M. ed., 2009, Encyclopedia of Microbiology, (3rd Edition), Ed. Elsevier Academic Press, ISBN: 978-0-12-373944-5.
Schinner F., R. Ohlinger, E. Kandeler, R. Margesin, 1996, Methods in soil biology. Springer.
Schjønning P., S. Elmholt, B. T. Christensen (Eds.), 2003, Managing soil quality: challenges in modern agriculture. CABI.
Shaffer M. J., L. Ma, S. Hansen (Eds.), 2001, Modeling carbon and nitrogen dynamics for soil management. CRC Press.
Sharma. P. D., 2007, Microbiology, (2nd Edition), Rastogi Publications, ISBN 81-7133-855-0.
Singleton P., D. Sainsbury, 2006, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, (3rd Edition), Ed. John Wiley & Sons Ltd., ISBN: 0-470-03545-5.
Stoian V., R. Vidican, 2013, Microbiologie: îndrumător de lucrări practice, Ed. Risoprint, România, ISBN 978-973-53-1082-0
Talaro K. P., A. Talaro, 2001, Foundations in Microbiology, (4th Edition), Ed. McGraw-Hill College.
Tomkiel M., J. Wyszkowska, J. Kucharski, M A. Baćmaga, A. Borowik, 2014, Response of microorganisms and enzymes to soil contamination with the herbicide Successor T 550 SE. Environment Protection Engineering, 40(4).
Tortora G. J., B. R. Funke, Christine L. Case, 2012, Microbiology: An Introduction, (11th Edition), Ed. Benjamin-Cummings Publishing Company.
Ulea E., F. D. Lipșa, 2011, Îndrumător practic de microbiologie, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iași, ISBN 978-973-147-107-5.
Velu R. K., 2013, Microbiological research in agroecosystem management. Springer.
Vidican R., 2007, Microbiologie, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, ISBN 978-973-751-469-1.
Vidican R., V. Stoian, 2014, Elemente de biologie și microbiologie, Ed. Risoprint, ISBN 978-973-53-1332-6
Willey M. J., L. M. Sherwood, C. J. Woolverton, 2007, Prescott, Harley, and Klein’s microbiology, (7th Edition), Ed. McGraw-Hill College. ISBN 978–0–07–299291–5.
Yang C., C. Hamel, V. Vujanovic, Y. Gan, 2011, Fungicide: modes of action and possible impact on nontarget microorganisms. ISRN Ecology, 2011.
Zimbro M. J., D. A. Power, 2009, Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media, Ed. Becton, Dickinson and Company.
Zourob M., S. Elwary, A. P. Turner (Eds.)., 2008, Principles of bacterial detection: biosensors, recognition receptors and microsystems. Springer Science & Business Media.
***Site-uri web:
galleryhip.com
ijs.sgmjournals.org
odertal.rosemarie-roeder.de
visualsunlimited.photoshelter.com
web.mst.edu
www.analiticlaboratory.ro
www.angelfire.com
www.argos-tech.com
www.asissludge.com
www.atcc.org
www.bacteriainphotos.com
www.biology.clc.uc.edu
www.biology200.gsu.edu
www.bioweb.uwlax.edu
www.bkyeast.wordpress.com
www.boundless.com
www.canbioprot.ro
www.ccos.ch
www.classconnection.s3.amazonaws.com/
www.condalab.com
www.denstoredanske.dk
www.directindustry.com
www.drbhavdeep.com
www.dreamstime.com
www.drinstruments.com
www.edusanjalmicro.blogspot.com
www.elsevier.es
www.eolabs.com/
www.eurekabrewing.wordpress.com
www.faculty.ccbcmd.edu
www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm
www.fedito.indonetwork.co.id
www.flashcardmachine.com
www.foodnetworksolution.com
www.foodsafety.asn.au
www.galleryhip.com
www.globescientific.com
www.hiox.org
www.ijs.sgmjournals.org
www.indiamart.com
www.inspq.qc.ca
www.inst.bact.wisc.edu
www.inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=book&type=user&func=toc&book_id=3
www.intechopen.com
www.iota-dental.com
www.keepourfoodsafe.org
www.kelcroft.com.hk
www.kombuchafuel.com
www.labquality.be/
www.labscientificequipments.com
www.labsource.co.uk
www.lacienciaysusdemonios.com
www.latodis-med.com
www.liamed.ro
www.lindagrashoff.com
www.matsutek.com
www.medicine-material.com
www.medisal.ro
www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/2871-eosin-methylene-blue
www.microbiologyonline.org.uk
www.mikrobiyoloji.org
www.mikroskopie-forum.de
www.millipore.com
www.moldbacterialabs.com
www.mvm.pitt.edu
www.newscientist.com
www.ngwa.org/Documents/ClipCopy/Iron-Bacteria.pdf
www.nirvoratagroup.com
www.nouvalmed.ro
www.npr.org
www.nuffieldfoundation.org
www.odertal.rosemarie-roeder.de
www.ostrowskiness.com/
www.oxoid.com
www.phys.ksu.edu
www.picsearch.com
www.plantguild.com
www.rapidmicrobiology.com
www.rapidonline.com
www.retroscope.eu
www.ruf.rice.edu
www.s489.photobucket.com
www.salonequipmentonline.co.uk
www.sciencefirst.com
www.scienceprofonline.org
www.seas.harvard.edu
www.sepadin.ro
www.set-revue.fr
www.shutterstock.com
www.skywatcher.ro
www.smccd.edu/
www.stendal-partner.com
www.student.ccbcmd.edu
www.studyblue.com
www.swarthmore.edu
www.talboys.com
www.tehnologijahrane.com
www.textbookofbacteriology.net
www.thepanamanews.com
www.topac.com/
www.trentu.ca
www.veegee.com
www.visualsunlimited.photoshelter.com
www.ctahr.hawaii.edu
www.inspection.gc.ca
www.kimchitech.co.kr
www.slu.se
www.allposters.com
www.thewellnessadvantage.us
www.dwscientific.co.uk
www.indiasendangered.com
www.bkyeast.files.wordpress.com/
www.bacmap.wishartlab.com
www2.victoriacollege.edu
www2c.cdc.gov
http://www.canna-uk.com
http://37.media.tumblr.com
http://standardsingenomics.org
http://remf.dartmouth.edu
www.reefcentral.com
www.fytoplankton.cz
microscopy-uk.org.uk
katiebarott.com
www.pinterest.com
www.bashanfoundation.org
http://www.oecd.org/
https://harmonicarts.ca/
http://www.algaebase.org/
http://www.algaebase.org/
http://protist.i.hosei.ac.jp/
www.insad.pl
www.just4growers.com
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Microbiologie Generala 1 2 Bio [309413] (ID: 309413)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.