Microbiologia Produselor Lactate Probiotice

CUPRINS

REZUMAT………………………………………………………………………………………………………………..3

OBIECTIVUL LUCRĂRII……………………………………………………………………………………….. 4

I. STUDIU DOCUMENTAR……………………………………………………………………………………………5

CAPITOLUL 1…………………………………………………………………………………………………………..5

1.1. Introducere………………………………………………………………………………………………………….. 5

Scopul fabricării produselor lactate………………………………………………………………………….6

CAPITOLUL 2. ISTORIA ȘI TAXONOMIA PROBIOTICELOR…………………………7

2.1. Istoria probioticelor………………………………………………………………………………………………..7

2.2. Taxonomia microorganismelor probiotice ………………………………………………………………..8

2.2.1. Genul Lactobacillus………………………………………………………………………………………….9

2.2.2. Genul Bifidobacterium………………………………………………………………………………………9

2.3. Bacteriile probiotice și rolul lor …………………………………………………………………………….10

2.4. Probioticele și sănătatea………………………………………………………………………………………..12

CAPITOLUL 3. MICROBIOLOGIA PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE………14

3.1. Microbiota produselor lactate probiotice…………………………………………………………………14

3.2. Culturi starter de microorganisme selecționate utilizate pentru obținerea produselor lactate probiotice ……………………………………………………………………………………………………….14

3.3. Procese microbiologice implicate în obținerea produselor lactate……………………………….15

3.4. Valoarea nutrițională și dietetică a produselor lactate probiotice………………………………..16

3.5. Sortimente de produse lactate probiotice…………………………………………………………………17

3.6. Microbiota și procesele microbiologice specifice iaurtului………………………………………..18

3.7. Conservabilitatea produselor lactate probiotice………………………………………………………..20

3.8. Defecte de natură microbiologică ale produselor lactate acide și probiotice…………………20

3.8.1. Defecte de consistență și aspect………………………………………………………………………..20

3.8.2. Defecte de gust și miros…………………………………………………………………………………..21

3.9. Riscul patogen și toxicogen al produselor lactate probiotice………………………………………21

3.10. Măsuri de preîntâmpinare a defectelor microbiologice și a riscului patogen și toxicogen al produselor lactate probiotice…………………………………………………………………………………….22

3.11. Controlul microbiologic și norme de calitate ale produselor lactate probiotice…………..23

3.11.1. Controlul microbiologic al produselor lactate probiotice……………………………………23

3.11.2. Normele de calitate microbiologică pentru produsele lactate probiotice……………….24

PARTEA EXPERIMENTALĂ………………………………………………………………………………….26

CAPITOLUL 4…………………………………………………………………………………………………………26

MATERIALE ȘI METODE ÎN CERCETAREA PROPUSĂ …………………………………….26

4.1. Obiect…………………………………………………………………………………………………………………26

4.2. Determinarea bifidobacteriilor……………………………………………………………………………….26

4.2.1. Aspect macroscopic………………………………………………………………………………………..27

4.2.2 Aspect microscopic………………………………………………………………………………………….27

4.2.3 Principiul metodei……………………………………………………………………………………………28

4.2.4 Materiale și aparatura necesară………………………………………………………………………….28

4.2.5 Prepararea diluantului, mediului de cultură și a soluțiilor folosite………………………….29

4.2.6 Prelevarea probei și modul de lucru……………………………………………………………………30

4.3 Determinarea lactobacililor…………………………………………………………………………………….32

4.3.1. Aspect macroscopic………………………………………………………………………………………..32

4.3.2 Aspect microscopic………………………………………………………………………………………….33

4.2.3 Principiul metodei……………………………………………………………………………………………33

4.2.4 Materiale și aparatura necesară…………………………………………………………………………33

4.3.5 Prepararea diluantului și a mediului de cultură……………………………………………………34

4.3.6 Modul de lucru………………………………………………………………………………………………..34

4.4. Stabilirea viabilității bifidobacteriilor și lactobacililor în iaurturile analizate……………….36

4.4.1 Rezultate și discuții …………………………………………………………………………………………36

4.4.2 Concluzii ……………………………………………………………………………………………………….48

BIBLIOGRAFIE ……………………………………………………………………………………………………..49

REZUMAT

Un rol important în realizarea unei alimentații raționale și dietetice revine laptelui și produselor derivate folosite ca atare sau preparate cu alte alimente.

Laptele este unul din alimentele de bază în nutriția noastră deoarece conține toate substanțele hrănitoare necesare creșterii, dezvoltării și funcționării normale a organismului.

Procesarea laptelui în produse lactate acide conferă laptelui câteva proprietăți noi, de mare însemnătate și anume: creșterea valorii alimentare, biologice, înzestrarea lor cu proprietăți dietetice și terapeutice.

Fie că suntem specialiști în domeniu, fie că suntem doar simpli consumatori ai produselor probiotice, ne este tuturor binecunoscută importanța unei microflore intestinale echilibrate și a unei alimentații sănătoase. Microflora intestinală este cea care, acționând aproape ca un organ al corpului omenesc, ne facilitează digestia anumitor alimente, având un rol important în metabolism, reglează – încă de la naștere – sistemul imunitar și inhibă dezvoltarea anumitor

bacterii patogene în intestin. De asemenea, a fost demonstrat importantul rol pe care anumite bacterii probiotice îl joacă în mecanismele reglării colesterolului sangvin sau a inhibării dezvoltării anumitor tipuri de celule canceroase.

Știm, așadar, că microflora intestinală, în special cea probiotică, este benefică. Știm, de asemenea, că această microfloră poate fi scoasă din starea ei de echilibru biologic de anumiți factori, cum ar fi stările generale patogene ale organismului sau consumul unor antibiotice cu spectru larg, dar și de o alimentație dezordonată și neechilibrată. Soluția oferită încă de la începutul secolului XX de Metchinikov, a fost suplimentarea alimentației cu bacterii vii, care sunt prezente în alimente precum lactatele fermentate. Nu s-a cunoscut însă, pentru o destul de lungă perioadă de timp, faptul că majoritatea bacteriilor benefice intestinului uman nu au capacitatea de a trece, păstrându-și viabilitatea, prin sucurile gastrice.

Bacteriile considerate la ora actuală ca fiind probiotice se confruntă, mai mult sau mai puțin, cu aceeași barieră și anume capacitatea lor de a-și menține viabilitatea la trecerea prin stomac și intestinul subțire (Elli et al 2006). În acest sens, un număr semnificativ de studii genetice au fost desfășurate pentru obținerea unei bacterii probiotice „perfecte”.

Sunt cunoscute, de asemenea, cercetările efectuate în acest domeniu de Saarella M. (Saarella, 2008) și de întreaga sa echipă de la VTT Finlanda, cu privire la menținerea și îmbunătățirea viabilității bacteriilor probiotice.

OBIECTIVUL LUCRĂRII

Având în vedere stadiul dezvoltării actuale a cercetării în domeniu, ne propunem să evaluăm mai multe tipuri de iaurt probiotic – DANONE din punct de vedere al viabilității bifidobacteriilor și lactobacililor (bacteriile probiotice prezente în iaurt).

Iaurtul probiotic Activia conține fermentul Bifidus Actiregularis, care a fost selectat în urmă cu aproximativ 30 de ani dintr-un produs lactat tradițional și este utilizat exclusiv de Danone. Numeroasele studii clinice au demonstrat în mod repetat că bacteriile Bifidus Actiregularis reușesc să traverseze bariera gastrică acidă și ajung vii în flora intestinală, în cantități mari. Toți acești fermenți activi din iaurt contribuie la menținerea sau refacerea florei intestinale, al cărei echilibru este extrem de important pentru sănătatea organismului. Se cunoaște de asemenea la ora actuală faptul că viabilitatea microorganismelor din produsele lactate acide scade odată cu trecerea timpului, și că, după un anumit număr de zile de la data fabricației, produsul, deși încă aflat în standardele de siguranță alimentară, nu mai conține un număr suficient de bacterii probiotice viabile.

Astfel, obiectivul central al prezentei lucrări, poate fi formulat ca fiind evaluarea viabilității bifidobacteriilor și lactobacililor în iaurturile probiotice – DANONE, din punct de vedere al impactului benefic pe care îl au asupra sănătății consumatorilor.

Bibliografia care stă la baza lucrării ne va ajuta pe tot parcursul desfășurării experimentelor să nu ne îndepărtăm de obiectivele propuse.

STUDIU DOCUMENTAR

CAPITOLUL 1.

INTRODUCERE

Laptele și produsele lactate sunt unele dintre cele mai importante alimente destinate atât pentru hrana omului cât i pentru hrana animalelor. Laptele este de asemenea o materie primă foarte importantă pentru industria alimentar, pentru obinerea unei game diversificate de produse lactate.

Laptele ca aliment este indispensabil în hrana omului și a tuturor mamiferelor n primul stadiu de viaă, constituind singurul aliment n acea perioad a vieii.

Laptele conține n principal: apă, grăsimi, glucide, proteine, vitamine, săruri minerale, este sursă de energie, foarte puține alimente putând furniza cumulat aceste elemente.

n cadrul componentelor laptelui, proteinele ocup un loc preponderent, având un rol important în menținerea funcțiilor organismului. Ele se găsesc în lapte în proporții optime și conțin toți aminoacizii esențiali. Pentru noii născuți, laptele este unicul aliment care le poate furniza elementele nutritive necesare pentru supraviețuire. Substanțele minerale sunt complexe și echilibrate, cu rol important n compoziția laptelui, și a valorii nutritive a acestuia. Sărurile de sodiu și potasiu, fac parte din protoplasma diferitelor țesuturi. Sărurile de sodiu, sunt importante, pentru că mențin presiunea osmotică a lichidelor fiziologice, și influențează ritmicitatea bătăilor inimii. Cantitatea de fosfor din lapte este egală cu cea din carne, însă calciul se găsește cu mult mai mult în lapte decât în carne. Conținutul de fosfor este de 90 mg. %, iar calciul 125 mg. %. Raportul calciu /fosfor este de 1/4 supraunităi. Acest lucru face posibilă utilizarea maximă a acestor dou elemente de către organism în prezența vitaminei D.

Laptele este singurul aliment de origine animală în constituția căruia predomină bazele faă de acizi, având un efect alcalinizant, concurând la pătrunderea calciului în organism.

Laptele este o sursă importantă de vitamine. Un litru de lapte acoperă nevoile zilnice a 75 % din necesarul de riboflavonă și 25 % din necesarul de vitamine A i B, 16 % din vitamina C i acid nicotinic. Este o sursă apreciabilă și de vitamina D și B12.

De asemenea laptele este sărac în anumite elemente cum sunt: fier, cupru, mangan. Având în vedere valoarea alimentară a laptelui, studiul componentelor sale prezintă o importanță deosebită, mai ales în ceea ce privește laptele folosit pentru obținerea produselor din lapte.

În consecință, din cele mai vechi timpuri, s-au căutat metode de conservare a laptelui sub diverse forme și în condiții convenabile.

SCOPUL FABRICĂRII PRODUSELOR LACTATE

Scopul fabricării produselor lactate este:

mărirea conservabilității laptelui;

obținerea de produse noi cu o valoare alimentară mai ridicată.

La fabricarea produselor lactate se utilizează diferite tipuri de biotehnologii care presupun utilizarea de microorganisme a căror activitate și dezvoltare este modelată, coordonată și controlată în cadrul unor operații tehnologice.

Pentru obținerea de produse lactate se utilizează, în condiții industriale, ca materie primă laptele pasteurizat, care nu prezintă în microbiota proprie microorganisme patogene și la care au fost înlăturate total sau în cea mai mare parte microorganismele care ar putea produce alterări sau interferențe în procesele dirijate.

Pentru a se obține o repetabilitate a calității produselor fabricate, în biotehnologiile de fabricație se utilizează maiele de culturi de microorganisme selecționate (culturi starter selecționate). Microorganismele sunt utilizate pentru a produce transformarea unor componente ale laptelui în principal prin procese de fermentație (fermentație lactică), dar și prin procese de proteoliză și lipoliză.

CAPITOLUL 2. ISTORIA ȘI TAXONOMIA PROBIOTICELOR

2.1. ISTORIA PROBIOTICELOR

Sintagma de „microorganisme benefice” a apărut cu mai mult de 100 de ani în urmă și a fost atribuită speciei Lactobacillus bulgaricus. În anul 1907, Stamen Grigorov, un student la medicină în Geneva, de origine bulgară, a descris pentru prima dată microorganismul cu numele de Lactobacillus bulgaricus. Studiind obiceiurile alimentare ale bulgarilor, renumiți pentru viața lungă și rezistența lor, savantul de origine rusă Eli Metchnikoff a reușit să coreleze longevitatea acestora cu un consum crescut de iaurt. El a fost primul savant care a făcut o observație stiințifică asupra anumitor specii de bacterii, studiind și locuitorii din Caucaz care, pe lângă iaurt consumau un alt produs din lapte fermentat cunoscut drept kefir. E. Metchnikoff, profesor la Institutul Pasteur din Paris și laureat al Premiului Nobel pentru Fiziologie și Medicina în 1908, spunea despre bacteriile lactice: “Dependența dintre bacteriile lactice intestinale și hrană face posibilă aplicarea unor metode de modificare a florei intestinale prin înlocuirea bacteriilor răufăcătoare cu cele binefăcătoare”. Acesta a sugerat că bacteriile din iaurt previn și anihilează infecțiile bacteriene intestinale și emite ipoteza că un consum regulat de iaurt prelungește viața. Bacteriile lactice produceau acizi în urma metabolismului microbian, iar efectul era o scădere a pH-ului intestinal, ceea ce stopa proliferarea diferitelor specii bacteriene proteolitice. În acest fel începe popularizarea iaurtului în Europa ca aliment funcțional, cu beneficii pentru sănătate. Oricum, producerea, consumul și calitățile binefăcătoare ale iaurtuluiși a altor lactate fermentate natural erau bine-cunoscute de populațiile din Orientul Mijlociu și Asia cu aproximativ 5000 de ani în urmă. Un exemplu referitor la calitățile terapeutice este redat în secolul XVII, când Sultanul Suleyman Magnificul (1494-1566) a trimis un medic de la Curtea sa să-i prescrie iaurt și să-l trateze pe regele Francis I al Franței (1494-1547) care suferea de diaree severă (Hume E, 2011). În aceeași perioadă, medicul francez pediatru Henry Tissier (1906) de la Institutul Pasteur a observat la copiii pe care-i trata de diaree că prezentau în fecale un număr mic de bacterii în formă de Y. La copiii sănătoși, aceste bacterii erau prezente în număr mult mai mare. Medicul francez a sugerat că ar trebui administrat acest tip de bacterii și copiilor care prezentau diaree, în vederea echilibrării florei intestinale. Doctorul H. Tissier a izolat bacteria Bifidobacterium, care este specia dominantă a florei inetstinale la copiii hrăniți cu lapte matern și a numit-o Bifidus bacillum communis. Între primul și al doilea război mondial au fost descoperite antibioticele, așa că a fost abandonată ipoteza lui E. Metchnikoff. Ea a fost reluată ulterior în anii ‘30 în Japonia de către Yakutt, unde a cunoscut o continuă dezvoltare. În țările din Vestul Europei, teoriile emise de Metchnikoff nu s-au mai dezvoltat până în anul 1964.

În anul 1965, Stilwell și Lilly introduc termenul „probiotic”, termen care definește „substanțele produse de microorganisme care susțin creșterea altor microorganisme”. „Probiotic” în limba greacă înseamnă „pentru viață”, în opoziție cu „antibiotic”, care înseamnă împotriva vieții. În 1974 Parker devinește probioticele ca fiind „organismele și substanțele care contribuie la echilibrul microbian intestinal” (Parker RB, 1974). În 1989 Fuller R. a redefinit termenul ca „supliment alimentar microbian viu cu efecte benefice asupra gazdei prin îmbunătățirea echilibrului intestinal” (Fuller., 1989). Havennar și Huis (1992) au propus o definiție asemănătoare cultura bacteriană viabilă, unică sau mixtă, care administrată oamenilor sau animalelor, are efecte benefice asupra florei indigene. Ultima definiție dată probioticelor a fost de către cercetătorii Guarner și Schaafsma (1998) „microorganisme vii, care consumate în cantități adecvate, conferă un efect pozitziv asupra sănătății gazdei”. În anul 2001 a fost publicat un raport comun al Food and Agriculture Organization of The United Nations (FAO) și al World Health Organization (WHO) referitor la calitățile terapeutice și proprietățile nutriționale al alimentelor care conțin specii de bacterii lactice, unde sunt definite probioticele ca fiind „organisme vii care administrate în cantități adecvate conferă beneficii pentru sănătatea gazdei” (WHO, 2001).

TAXONOMIA MICROORGANISMELOR PROBIOTICE

Termenul de taxonomie, însemnând categorisire în limba greacă, poate fi privit ca un demers pentru a pune ordine în natură (clasificarea respectiv sistematizarea unor domenii reale). Ierarhia taxonomică se bazează pe unitatea numită specii. Speciile sunt grupate apoi într-un Gen, genurile într-o Familie, familiile într-o Ordine, ordinea într-o Clasă, și clasele într-un Domeniu. Trei domenii de viață au fost descrise cuprinzând toate organismele vii, două pentru procariote, Archaea și bacterii, și unul pentru eucariote. În domeniul Eukarya, există patru subdomenii , de asemenea, recunoscute, de exemplu, Protista, Ciuperci, Animalia, Plantae. Tulpinile de probiotice sunt definite ca subculturi de miliarde de celule aproape identice în mod ideal, derivate din aceeași celulă mamă. Tulpinile de probiotice descrise până la momentul actual se împart în 2 grupuri diferite de microorganisme, și anume bacterii și ciuperci. Ordinele taxonomice pentru microorganisme sunt specii, gen, familie, ordine, clasă, încrengătură, și domeniu. Cu excepția domeniului, acestea sunt rar folosite. [36,186].

2.2.1. Genul Lactobacillus

Genul Lactobacillus aparține LAB (bacterii lactice), o definiție care grupează speciile de bacterii Gram-pozitive, neformatoare de spori, catalazo-negative care produc acid lactic, ca produs final principal de fermentare a carbohidraților. Catalaza este o enzimă ce se găsește în aproape toate organismele vii, care sunt expuse la oxigen, descompunând peroxidul de hidrogen în apă și oxigen.

Având în vedere compoziția de bază a ADN-ului genomic, prezintă de obicei, un conținut de GC (guanină și citozină) între 32 și 51 mol%. Conținutul de guanină-citozină este procentul acestor baze azotate în molecula de ADN , dacă ne referim la toate cele 4 baze diferite inclusiv adenina și timina. Bazat pe schema taxonomică a procariotelor genul Lactobacillus aparține încrengăturii Firmicutes, clasa Bacili, ordinul Lactobacillales, familia Lactobacillaceae cu rudele sale cele mai apropiate, fiind grupate în cadrul aceleiași familii, reprezentate de Paralactobacillus genurile și Pediococcus. În anul 2009 , genul Lactobacillus cuprindea 116 de specii valabile, ceea ce face, genul cel mai numeros din ordinul Lactobacillales. Au mai fost descrise și alte specii (Lactobacillus tucceti, farraginis Lactobacillus, și Parafarraginis Lactobacillus, Lactobacillus secaliphilus fiind în curs de validare.[36]

2.2.2. Genul Bifidobacterium

Bifidobacteriile sunt bacterii Gram-pozitive în forme de tije ramificate polimorfe, care apar singure, în lanțuri sau grupuri. Au diverse forme, inclusiv tije scurte, curbate, bifurcate. Numele lor provine de la observația că acestea există de multe ori într-o formă de Y sau bifidoforme. Nu formează spori, sunt non motile, și non filamentoase. Sunt anaerobe și chemoorganotrofice, având un tip fermentativ de metabolism. Produc acid, dar nu și gaz dintr-o varietate de carbohidrați. Sunt catalazo-negative, cu unele excepții, cum ar fi Bifidobacterium indicum și Bifidobacterium asteroides atunci când cresc în prezența aerului. Conținutul GC genomic variază de la 42 la 67% mol.

Bifidobacteriile degradează hexozele folosind o cale metabolică unică menționată ca și calea fructoza-6-fosfat, de asemenea cunoscută sub numele de șunt bifid. Genul Bifidobacterium aparține încrengăturii Actinobacteria, clasa Actinobacteria subclasa Actinobacteridae, ordinul Bifidobacteriales, familia Bifidobacteriaceae. Următoarele genuri, nu sunt genuri care fac parte din această familie, dar sunt considerate probiotice și includ Aeriscardovia, Falcivibrio, Gardnerella, Parascardovia, și Scardovia. În anul 2009, 30 de specii de Bifidobacterium au fost izolate, validate, și identificate [36,186].

BACTERIILE PROBIOTICE ȘI ROLUL LOR

Bacteriile probiotice sunt comercializate în produsele  fermentate, iar produsele lactate sunt principalii purtători ai probioticelor.

În momentul în care sunt adăugate probiotice la produsele fermentate, trebuie să se țină seama de anumiți factori care ar putea influența capacitatea probioticelor de supraviețuire în produs și să devină active în momentul intrării în contact cu tractusul intestinal al consumatorului.

Acești factori includ:

starea fiziologică a organismelor probiotice adăugate (indiferent dacă celulele provin din faza de creștere logaritmică sau staționară);

condițiile fizice de depozitare ale produsului (temperatura);

compoziția chimică a produsului căruia îi sunt adăugate probioticele (aciditate, conținutul de carbohidrat disponibil, sursa de azot, conținutul de minerale, activitatea apei, și conținutul de oxigen);

posibilele interacțiuni ale probioticelor cu culturile starter ( producerea de bacteriocine, antagonism și sinergism).

Interacțiunile probioticelor atât cu matrița alimentului cât și cu cultura starter pot fi mai intense când  probioticele sunt utilizate ca și cultură starter.

Japonezii au lansat primele iaurturi cu bifidobacterii, în 1977 (Morinaga) și 1978 (Yakult).

Bacteriile probiotice utilizate în produsele comerciale din prezent sunt principalii reprezentanți ai genurilor Lactobacillus și Bifidobacterium. Speciile de lactobacili din care s-au izolat legături de probiotice sunt L acidophilus, L. johnsonii, L. casei, L. rhamnosus, L. gasseri și L. reuteri. Tipurile de bifidobacterii sunt : Bifidobacterium bifidum. B. Longum și Bifidobacterium infantis.

Bifidobacteriile au fost descoperite de către Henry Tissier (1900) în fecalele sugarilor alăptați la sân, dar mai pot fi întâlnite în cavitatea bucală, tractusul unor animale, în mierea de albine. Reprezentantul bifidobacteriilor a fost denumit initial Bacillus bifidus communis.

Bifidobacteriile sunt unele dintre cele mai importante bacterii probiotice. Bifidobacteriile reprezintă aproximativ 80% din flora intestinală a sugarilor alimentați la sân. La vârsta adultă, numărul bifidobacteriilor scade, așadar este recomandat să favorizăm funcționarea florei intestinale prin aportul zilnic de alimente probiotice.

Există și un motiv tehnologic pentru care produsele lactate sunt utilizate ca purtători ai probioticelor: majoritatea acestor produse au fost deja optimizate la extinderea supravițuirii unor organisme în timpul fermentației.

Astfel, tehnologia actuală poate fi relativ ușor adaptată pentru a garanta supraviețuirea suficientă a bacteriilor probiotice adăugate. Cu toate acestea trebuie menționat faptul că alte produse fermentate pot servi ca și purtători ai organismelor probiotice, dar puține astfel de produse se găsesc pe piață. Pe lângă proprietățile lor clinice și dorite asupra sănătății, probioticele trebuie să întrunească câteva cerințe de bază pentru dezvoltarea pieții produselor probiotice. Cea mai importantă cerință este ca bacteriile probiotice să supraviețuiască în număr suficient în produs , să fie asigurată stabilitatea lor fizică și genetică în timpul depozitării  produsului, și de asemeena ca proprietățile lor esențiale care  exprimă beneficiile aduse sănătății după consumarea acestora să se mențină în timpul fabricării și păstrării produsului.

În plus, probioticele nu trebuie să prezinte efecte adverse asupra gustului și aromei produsului  și nu trebuie să intensifice  acidifierea pe parcursul vieții de raft a produsului. În final, ar trebui să existe metode prin care să se identifice tipurile de probiotice nesigure. Pentru a exploata la maxim proprietățile funcționale ale bacteriilor probiotice, procesele de obținere a produselor lactate trebuie modificate pentru a întruni cerințele probioticelor. Când aceasta nu este posibil, trebuie testate alte tipuri de bacterii, sau în caz extrem trebuie dezvoltate alte produse noi. Cum toate produsele lactate acide conțin bacterii vii , produsele probiotice trebuie păstrate în spații răcoroase. Aceasta este necesară atât pentru a garanta rata mare de supraviețuire a organismelor probiotice și pentru a asigura stabilitate suficientă produsului. Mai mult însă, datorită faptului că tractul intestinal este considerat a fi mediul înconjurător natural al bacteriilor probiotice, trebuie luat în considerare și conținutul de oxigen, potențialul redox și activitatea apei din mediul respectiv. Microorganismele active interacționează intens cu mediul transformând compușii mediului în produși metabolici.

De aceea,compoziția chimică a produselor lactate este de o importanță majoră pentru activitatea metabolică a microorganismelor. Variabilele esențiale sunt tipul și cantitatea de carbohidrați disponibili, gradul de hidroliză a proteinelor laptelui  (care determină posibilitatea apariției de amino-acizi), și compoziția și gradul de hidroliză  al lipidelor din lapte (care determină posibilitatea apariției acizilor grași cu catenă scurtă ). Pe de altă parte, proprietățile proteolitice și lipolitice ale probioticelor pot fi importante pentru degradarea ulterioară a proteinelor din lapte. Aceste două proprietăți pot avea efecte considerabile asupra gustului și aromei produselor lactate.

Un aspect major al procesului de obținere a produselor lactate este interacțiunea între probiotice și organismele starter. Deși se cunosc puține informații despre această interacțiune, sunt bine stabilite atât efectele sinergistice cât și antagonice între diferitele organisme starter. De exemplu, cultura clasică pentru iaurt este caracterizată printr-o protosimbioză între Streptococcus thermophilus și Lactobacillus delbrueckii subspecia bulgaricus.  Foarte important de reținut, antagonismul este cauzat de bacteriocine, care sunt peptide sau proteine ce manifestă proprietăți antibiotice. Capacitatea de a produce bacteriocine este adesea văzută ca o proprietate dorită a probioticelor, oricum antagonismul la culturile starter și vice versa poate fi un factor limitativ pentru combinăriile starterelor și probioticelor.

Intensitatea interacțiunilor  dintre probiotice și matrița alimentului și organismele starter depinde în mare măsură de timpul la care sunt adăugate probioticele produsului, dacă acestea sunt prezente în timpul fermentației sau sunt adăugate după aceasta. În cazul din urmă, interacțiunile pot fi minime deoarece adăugarea poate surveni chiar inainte  sau imediat după racirea la 8°C iar activitatea metabolică a starterelor și probioticelor este este drastic redusă la aceste temperaturi.

PROBIOTICELE ȘI SĂNĂTATEA

Probioticele sunt considerate ca promotoare ale sănătății, totuși mecanismele de suport nu au fost încă explicate. Există studii referitoare la modul în care acționează probioticele:

producerea de substanțe inhibitorii (acizi organici, hidrogen peroxid și bacteriocine inhibitorii atât pentru gram pozitivi cât și pentru gram negativi);

blocarea situsurilor de adezivitate (probioticele și bacteriile patogenice sunt în competiție, probioticele aderă de suprafața celulelor epiteliale ocupând zonele de adezivitate);

competiția pentru nutrienți (deși nu există studii in vivo probioticele inhibă patogenii prin consumul nutrienților necesari pentru agenții patogeni);

stimularea imunității (specifice și nespecifice prin anumite componente specifice ale peretelui celular);

degradarea receptorului toxinic pe mucoasa intestinală, exemplu Streptomyces boulardi protejează gazda împotriva infecției intestinale cu Clostridium difficile; alte mecanisme presupun supresia producției de toxine, reducerea pH-lui intestinal, atenuarea virulenței;

supresia substanțelor carcinogenice prin legare, blocare sau îndepărtare;

modificarea pH-lui intestinal cu consecințe de alterare a activității microflorei și a solubilității biliare [36,186];

scăderea nivelelor serice de colesterol [18,164].

Totuși mecanismul de acțiune al probioticelor nu este pe deplin elucidat, iar o mică parte din cantitatea de probiotice ingerată rămâne vie. Pentru a rămâne în viață, probioticele trebuie să reziste acțiunii acidității din stomac, să treacă de intestinul subțire ca, mai apoi să ajungă în colon. Cercetările au arătat că bacteriile probiotice nu aderă la peretele intestinal, ci ele se dezvoltă pe parcursul tractului gastrointestinal.

CAPITOLUL 3. MICROBIOLOGIA PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

3.1. MICROBIOTA PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

Produsele lactate probiotice sunt produse lactate acide, sau culturi selecționate de microorganisme care conțin culturi vii de bifidobacterii sau culturi vii asociate de bifidobacterii și bacterii lactice.

Produsele lactate acide se obțin din lapte pasteurizat. Prin pasteurizare laptele și-a îmbunătățit proprietățile de mediu de cultură pentru bacteriile lactice prin:

distrugerea sistemului lactoperoxidazic prin inactivarea lactat-peroxidazei;

prin eliminarea oxigenului și formarea unor compuși cu acțiune reducătoare (eliberarea de grupări -SH).

Temperatura de pasteurizare duce de asemenea la denaturarea proteinelor serice și asocierea lor cu K-cazeina micelelor de cazeină, care favorizează obținerea unui coagul mai fin care reține mai bine zerul.

Pentru a putea fi utilizat în fabricarea produselor lactate acide laptele trebuie să se încadreze în categoria II la proba de reducere cu substanțe colorante, adică decolorarea la utilizarea albastrului de metilen să se realizeze după minimum 3 ore.

Nu este permisă utilizarea de lapte mamitic sau care conține antibiotice și peste 4*105 leucocite/ml.

3.2. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME SELECȚIONATE UTILIZATE PENTRU OBȚINEREA PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

În fabricarea produselor lactate probiotice se utilizează culturi starter de microorganisme selecționate sub formă lichidă, uscată (liofilizată) sau congelată. Se utilizează atât culturi singulare, dar mai ales culturi mixte.

Cultura starter concentrată sub formă lichidă sau uscată, livrată fabricii de produse lactate acide de laboratoare de specialitate, va fi activată în laboratorul de culturi pure al fabricii. Activarea se va face prin pasaje succesive în care inoculul se însămânțează în cantități din ce în ce mai mari de lapte, pentru a se obține maiaua primară, maiaua secundară, maiaua terțiară și în final maiaua de producție, cu care se va însămânța laptele destinat fabricării produsului finit.

Inocularea se realizează în lapte pasteurizat și răcit la temperatura optimă de activitate a microorganismelor din cultura utilizată. Incubarea se realizează de asemenea în condiții termice optime diferențiate în funcție de componența microorganismelor din cultură. După termostatare cultura se răcește la 1-2°C pentru a favoriza acumularea de substanțe de aromă. Fiecare pasaj presupune utilizarea unei cantități mai mici de inocul și un timp mai scurt de incubare, întrucât a avut deja loc o activare a microorganismelor în pasajul anterior. Pasajele se realizează zilnic. Maiaua de producție va fi utilizată la însămânțarea laptelui destinat obținerii produsului finit. Ea trebuie să aibă caracteristicile senzoriale, fizico-chimice și microbiologice specifice produsului finit care urmează a fi fabricat și să fie obținută în cantitate suficientă pentru inocularea șarjei de producție, calitate stabilită în urma unui control zilnic.

Cultura folosită la fabricarea iaurturilor Activia este concentrată și congelată, pentru inoculare directă și conține următorii fermenți: Bifidobacterium lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, and Lactococcus lactis. Timpul total de așteptare din momentul scoaterii culturii din congelator până în momentul preluării fermentului de către lapte, este recomandat a fi: 15 min. Culturile congelate pot fi stocate la -45 °C, timp de 12 luni de la data producției.

3.3. PROCESE MICROBIOLOGICE IMPLICATE ÎN OBȚINEREA PRODUSELOR LACTATE

Fermentația lactică, în urma căreia se obțin aceste produse, poate să apară în laptele crud spontan, sub acțiunea bacteriilor lactice din microbiota proprie cu care laptele a fost contaminat secundar.

În industrie, fermentația lactică are loc în mod dirijat, utilizându-se culturi starter singulare sau mixte de bacterii lactice selecționate.

Diferite sortimente de produsele lactate acide se obțin utilizând procese microbiologice homofermentative, sau heterofermentative produse de bacterii lactice care produc exclusiv fermentație lactică (Ex. iaurtul, sana, biogurtul, etc.). Aceste produse prezintă un coagul dens, fără bule de gaz, cu gust acid dat de acumularea de acid lactic.

Prin fermentație lactică lactoza este transformată în acid lactic prin procese homofermentative. Acidul lactic se acumulează în produs în proporție de 0,7-0,9% în cazul fermentației realizate de streptococi și de 0,9-2% în cazul fermentației lactice realizate de lactobacili. Acidul lactic produs determină coagularea cu formare de coagul omogen, cu textură fermă și gust acrișor. Prin fermentarea lactozei prin procese heterofermentative se

produce acid lactic dar și acid acetic și alcool etilic. Prin fermentarea citratului din lapte se obține diacetil, acetoină și CO2.

3.4. VALOAREA NUTRIȚIONALĂ ȘI DIETETICĂ A PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

Valoarea nutrițională este dată de acumularea unor produși cu valoare nutrițională mai mare.

Valoarea biologică este dată de digestibilitatea și biodisponibilitatea nutrienților acumulați în urma transformărilor componentelor inițiale din lapte sub acțiunea metabolică a microorganismelor.

Proprietățile terapeutice ale produselor lactate acide sunt condiționate de conținutul lor în acid lactic și în bacterii lactice vii, cât și prin conținutul în substanțe bacteriostatice și bactericide și de vitamine.

Microbiota intestinală determină degradarea unor componente alimentare (Exp. hidroliza amidonului, fermentarea polizaharidelor neamidonoase la acizi grași volatili, degradarea proteinelor la aminoacizi, amine, amoniac, fenol, crezol, scatoli, indoli, hidrogenarea acizilor grași polinesaturați, trasformarea acizilor biliari, producerea de agliconi, formarea unor produși toxici cu potențial cancerigen) (Banu și colab. 2000).

Prezența bacteriilor lactice și a bifidobacteriilor în stare vie conferă acestor produse valoare dietetică. Lactobacillus acidiphillus se integrează cel mai armonios în microbiota intestinală a omului. Are o acțiune antagonică cu bacteriile de putrefacție și bacteriile patogene din intestin.

Bacteriile lactice și bifidobacteriile inhibă proliferarea bacteriilor de putrefacție și a celor patogene prin antagonismul lor față de acestea (producerea de acizi organici și scăderea pH-ului), produc H202 și substanțe antimicrobiene. De asemenea stimulează sistemul imunitar, produc vitamine din grupul B (Exp. tiamină, riboflavină, vitamină Bi2) și K, îmbunătățesc utilizarea lactozei și inhibă formarea unor substanțe toxice (Exp. nitroazamine), contribuie la diminuarea colesterolului, îmbunătățesc digestibilitatea unor nutrienți și măresc biodisponibilitatea lor (Exp. a lactozei prin aportul suplimentar de (3-galactozidază). Efectul sanogen se manifestă prin inhibarea dezvoltării bacteriilor producătoare de enzime care convertesc substanțele precancerigene în substanțe cancerigene, prin degradarea nitrozaminelor.

Cele mai frecvente bacterii patogene cu efecte negative asupra sănătății tractusului intestinal al omului sunt Escherichia coli, care determină putrefacția intestinală cu acumularea de substanțe toxice cu potențial cancerigen, Veillonella care determină de asemenea apariția în intestin de substanțe cancerigene, Staphylococcus aureus, care produc toxine. Toxine produc și Clostridium perfringens, Proteus și Pseudomonas, care au de asemenea patogenitate și produc putrefacție intestinală.

Valoarea nutrițională a produselor lactate fermentate de către bacteriile lactice în asociație cu bifidobacteriile este conferită de asimilabilitatea mai bună a nutrienților din aceste produse. Proteinele și lipidele sunt parțial hidrolizate astfel încât sunt mai ușor asimilate. Lactoza este transformată parțial în acid lactic și parțial în galactoză și glucoză.

Produsele conțin vitamine sintetizate de microorganisme în timpul fermentației (acid nicotinic, acid folic, vitamină C, vitamină B12).

Biodisponibilitatea calciului și a fierului este îmbunătățită întrucât acestea sunt ionizate sub acțiunea acidului lactic.

3.5. SORTIMENTE DE PRODUSE LACTATE PROBIOTICE

Toate sortimentele de produse lactate acide se obțin în urma fermentației lactice. Sortimentul este dat de specia sau speciile de microorganisme utilizate în fabricație și de condițiile de desfășurare ale procesului fermentativ.

Există de asemenea numeroase sortimente de produse probiotice-simbiotice destinate consumului uman (sugarilor, copiilor și adolescenților, adulților), furajării animalelor sau produse farmaceutice de suplimentare a alimentației. Aceste produse pot fi obținute numai pe bază de bacterii lactice și/sau bifidobacterii. Sortimentele variază în funcție de speciile de microorganisme utilizate (Hughes și Hoover 1991, Ishibaschi și Shimamura 1993).

Activia este marca de iaurt cu cea mai extinsă ofertă de produse, acoperind diversele nevoi și preferințe ale consumatorilor. Activia este cel mai consumat iaurt probiotic din lume. Consumatorii de Activia trăiesc în 75 de țări de pe 5 continente. Gama Activia cuprinde în România produse variate pe gustul tuturor: iaurt simplu, iaurturi cu cereale integrale și fructe, iaurturi de băut cu sau fără fructe, gama Activia Mic dejun, cu topper de cereale, cât și iaurturi dietetice cu fructe, cu 0% grăsime, conținut redus de zaharuri și îndulcitori. Produs în fabrica din București, Activia se exportă cu succes și în alte 6 țări din Europa de Sud Est. Prin varietatea profilurilor nutriționale, iaurturile Activia sunt adecvate oricărui moment de consum (mic dejun, on the go, desert sau gustare între mese, ori după o cină ușoară) și sunt ușor de integrat chiar și în diete speciale, cum sunt regimurile hipocalorice, hipolipidice sau hipoglucidice.

3.6. MICROBIOTA ȘI PROCESELE MICROBIOLOGICE SPECIFICE IAURTULUI

Iaurtul este un produs lactat acid care se poate obține din lapte integral, din lapte concentrat sau din lapte degresat pasteurizat și răcit la 45°C, care se inoculează în proporție de 3% cu o cultură starter mixtă de Streptococcus salivarius ssp. thennophyllus și Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus. Se fabrică cel mai frecvent din lapte de vacă.

În fabricarea iaurtului, între cele două microorganisme se realizează o relație de simbioză. Inițial se dezvoltă streptococul care pregătește mediul pentru lactobacil prin eliminarea oxigenului care ar putea duce la formarea de H202. Laptele destinat fabricării iaurtului nu trebuie să fie agitat pentru a se evita includerea oxigenului care ar strica condițiile de microaerofilie pentru lactobacil și ar deveni toxic pentru streptococ. Un adaos exogen de catalază va schimba de asemenea producție de acid lactic de către streptococi. Streptococul favorizează dezvoltarea lactobacilului și prin producerea de acid formic și C02.

Pe de altă parte, lactobacilul, care se dezvoltă mai târziu, anihilează influența oxigenului prin intermediul manganului intracelular care înlocuiește acțiunea superoxid- dismutazei. De asemenea el pune în libertate o serie de aminoacizi, prin hidroliza cazeinei, cu influență pozitivă asupra dezvoltării streptococului. Streptococcul produce acid formic care stimulează activitatea lactobacilului. În plus, ambele specii de bacterii lactice folosite în fabricarea iaurtului participă la formarea substanțelor de aromă. Cele două microorganisme se găsesc în proporții egale în maiaua de iaurt. Aceste bacterii simbiotice fermentează lactoza cu formare de acid lactic și participă la formarea aromei specifice produsului. Streptococul produce diacetil, iar lactobacilul produce acetaldehidă și alți produși secundari care contribuie la aroma plăcută, caracteristică iaurtului maturat. Streptococcul este mai competitiv la subtratul trofic decât lactobacilul care este și mai sensibil la antibiotice.

În scopul îmbunătățirii aromei se pot utiliza și alte culturi starter (Exp. Lactobacillus acidophillus și Lactobacillus bifidus).

Termostatarea iaurtului se realizează la o temperatură de 42-45°C, maxim 3 ore, pentru a se obține aciditatea dorită de 80-90°T, ceea ce corespunde unui conținut de acid lactic de 0,9-l,1 % și un pH= 4,65-4,7. Cantitatea de bacterii lactice la finele fermentației trebuie să fie de cca. 5*108celule/g.

Respectarea temperaturii de fermentare este obligatorie pentru a se asigura calitatea produsului. Temperaturi ridicate favorizează dezvoltarea excesivă a lactobacilului care duce la obținerea unui iaurt acru cu aromă slabă. Temperaturi mai scăzute determină proliferarea excesivă a streptococilor care duce la obținerea aromei dar o aciditate prea slabă care dă un gust fad. Momentul final al fermentației se poate aprecia prin aspectul coagulului care trebuie să fie compact, fără zer eliminat, și nu trebuie să se desprindă de pereții ambalajului.

Răcirea produsului se face până la 3-4°C, temperatură la care se menține până în momentul livrării, iar depozitarea în condiții de refrigerare.

Iaurtul este un produs cu valoare nutritivă, dietetică și antibiotică. Conține toate elementele nutritive ale laptelui, dar sub o formă mai ușor asimilabilă datorită modificărilor ce au loc în cursul realizării tehnologiei de fabricație. Finețea particulelor de coagul din iaurt mărește suprafața de contact cu sucurile gastrice, devenind astfel mai ușor digerabile. Conținutul în aminoacizi, vitamine, enzime, substanțe imunizante, cât și conținutul în celule de Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus vii îi conferă acestuia valoare dietetică. Bacteriile lactice conținute au o acțiune antimicrobiană față de diferite bacterii patogene (Exp. tifice, paratifice, brucele, enterococi, bacterii coliforme, bacilul tuberculozei).

Iaurtul se fabrică în diferite variante (Exp. iaurt cu coagul fluid, iaurt cu fructe, lactofruct), care utilizează însă aceleași principii tehnologice.

3.7. CONSERVABILITATEA PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

Produsele lactate acide sunt produse cu o conservabilitate mai ridicată decât laptele întrucât conțin acid lactic rezultat din fermentație. Acidul lactic determină coagularea proteinelor din lapte, asigurând gustul specific și inhibă totodată dezvoltarea bacteriilor de putrefacție datorită pH-ului scăzut (4-4,5). Întrucât majoritatea lor conțin bacterii lactice vii, stabilitatea și conservabilitatea produsului este limitată.

Pentru prelungirea conservabilității aceste produse trebuie obligatoriu depozitate în condiții de refrigerare.

3.8. DEFECTE DE NATURĂ MICROBIOLOGICĂ ALE PRODUSELOR LACTATE ACIDE ȘI PROBIOTICE

Produsele lactate acide și produsele probiotice-simbiotice fermentate și nefermentate pot suferi o serie de transformări sub acțiunea microbiotei de fabricație sau a microbiotei de infecție care să ducă la modificarea caracteristicilor organoleptice, fizico-chimice, cât și a proprietăților nutriționale și dietetice ale acestor produse. Aceste modificări determină o serie de defecte care depreciază calitatea produsului.

3.8.1. Defecte de consistență și aspect

Consistența moale este un defect care apare la utilizarea unor maiele îmbătrânite, insuficient de active sau atacate de bacteriofagi.

Separare de zer și coagul grunjos se datorează reducerii activității streptococilor și unei fermentații depășite.

Consistența filantă, mucilaginoasă apare ca urmare a dezvoltării unor microorganisme de infecție cu caracter filant, care produc polizaharide (Exp. Lactobacillus acidophillus).

Apariția de bule de gaz în masa coagulului este o consecință a dezvoltării în coagul a bacteriilor coliforme și a drojdiilor, care apar ca microorganisme de infecție în cazul nerespectării condițiilor de igienă sau al nerespectării condițiilor de pasteurizare.

3.8.2. Defecte de gust și miros

Gustul prea acru apare la produsele lactate acide în cazul în care se prelungește procesul de fermentare și se ajunge la un conținut prea ridicat în acid lactic.

Gustul și mirosul de amoniac apare în cazul dezvoltării bacteriilor de putrefacție care descompun substanțele proteice până la amoniac și hidrogen sulfurat.

Gustul rânced poate apărea ca urmare a activității lipolitice a unor microorganisme. Procesul de lipoliză este favorizat de prezența sărurilor de cupru și fier, a oxigenului și a luminii.

Gustid nespecific este un defect însoțit de o cantitate mare de gaze în coagul fiind o consecință a dezvoltării bacteriilor coliforme în produs.

3.9. RISCUL PATOGEN ȘI TOXICOGEN AL PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

Produsele lactate probiotice se fabrică exclusiv din lapte pasteurizat astfel încât, în cazul unei pasteurizări corecte materia primă destinată produselor nu prezintă risc patogen și toxicogen.

În cazul unei pasteurizări defectuoase pot supraviețui bacterii patogene dar ele sunt inhibate sau chiar distruse de aciditatea produselor, astfel încât riscul lor devine minor.

Brucelele, stafilococii, leptospirele, Escherichia coli, Clostridium botulinum sunt distruse de aciditatea produselor.

Clostridium perfringens sunt distruși după 3-15 zile în aceste produse. Ricketsiile nu supraviețuiesc mai mult de 24 de ore, iar salmonelele mai mult de 2 ore.

Staphylococcus aureus nu produce enterotoxină datorită acidității, iar celulele sunt distruse și de apa oxigenată produsă de bacteriile lactice. Toxiinfecția stafilococică prezintă risc pentru consumator în cazul unei recontaminări în timpul fabricării produsului, când consumul lui se realizează imediat întrucât în acest caz nu apar modificări de gust perceptibile.

Enteropatiile produse de Escherichia coli se întâlnesc mai rar în laptele cu maturare scurtă, agentul patogen fiind distrus de aciditatea acumulată în timpul fermentării.

Bacillus cereus este transmis mai ales prin produsele lactate acide, întrucât agentul patogen nu este distrus prin pasteurizarea materiei prime și nici prin aciditatea rezultată în urma fermentării sau prin inactivarea sa în timpul unei maturări îndelungate.

3.10. MĂSURI DE PREÎNTÂMPINARE A DEFECTELOR MICROBIOLOGICE ȘI A RISCULUI PATOGEN ȘI TOXICOGEN AL PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

Pentru asigurarea inocuității și salubrității produsului finit, pe parcursul lanțului de producție trebuie luate o serie de măsuri de diminuare (prin distrugere) sau prevenire a proliferării microorganismelor.

Diminuarea încărcării microbiologice se realizează prin aplicarea unor regimuri adecvate de tratamente termice sau atermice asupra materiei prime și prin aplicarea unor măsuri de sterilizare fizică sau chimică a mediului de producție (încăperi, utilaje, ambalaje, personal) prin care se distruge sau se diminuează încărcarea cu microorganisme.

Prevenirea proliferării se realizează prin asigurarea unor condiții fizico-chimice defavorabile dezvoltării microorganismelor în produs. Se asigură astfel conservabilitatea produsului, respectiv siguranță în consum chiar și după parcurgerea lanțului de desfacere. Din acest punct de vedere trebuie ținut seama că prezența unor microorganisme în stare vie în produsul finit vor determina procese microbiologice în perioada de depozitare și vor prolifera numeric.

Pentru asigurarea unei calități microbiologice adecvate produselor lactate acide și probiotice, astfel încât acestea să prezinte siguranță în consum, se impune respectarea igienei tehnologice. Eficiența igienei tehnologice depinde de gradul inițial de încărcare cu microorganisme a laptelui materie primă și de stabilirea și respectarea unor reguli de igienă a spațiilor de producție, a procesului de producției și a personalului de operare, prin care să se asigure calitatea microbiologică produsului finit. Regulile de igienă tehnologică trebuie să se țină seama de:

modul de transmitere al microorganismelor în lanțul de producție;

posibilitățile și factorii care favorizează vehicularea sau răspândirea microorganismelor;

posibilitățile și punctele de contaminare posibilă cu microorganisme pe parcursul lanțului de producție.

În respectarea măsurilor sanitare de la nivelul întreprinderilor de prelucrare și desfacere a produselor lactate trebuie să se aibă în vedere mai ales următoarele măsuri:

Efectuarea unui control sanitar riguros al materiei prime, a produselor finite, cât și a personalului;

Prelucrarea igienică a laptelui și conservarea produselor finite rezultate la temperaturi joase în lanț frigorific continuu;

Evitarea recontaminării secundare a produselor lactate după tratamentul termic prin nerespectarea igienei tehnologice.

3.11. CONTROLUL MICROBIOLOGIC ȘI NORME DE CALITATE ALE PRODUSELOR LACTATE PROBIOTICE

3.11.1. Controlul microbiologic al produselor lactate probiotice

Produsele lactate acide și probiotice se analizează în scop igienico-sanitar, astfel încât să nu fie admise în consum produse predispuse unei alterări rapide, sau cu o încărcătură patogenă sau potențial patogenă, care să producă îmbolnăviri consumatorilor. În acest scop se analizează indicatorii microbiologici igienico-sanitari și microorganisme patogene potențial existente în lapte. Având valoare dietetică este important a se realiza și o analiză microbiologică în scop sanogen.

Pentru aprecierea calității microbiolgice a produselor lactate acide, este necesar ca acestea să fie supuse unui control microbiologic.

Pentru analiza probele de produse lactate se păstrează la temperaturi de refrigerare (4-6°C) și se analizează într-un interval de maximum 4 ore de la recoltare.

Controlul microbiologic în scop igienico-sanitar se efectuează utilizând metode de analiză indirecte (culturale) de evidențiere a prezenței și conținutului de microorganisme indicatori sanitari și microorganisme patogene. Pentru probele culturale probele se suspendă în soluție de ser fiziologic steril și se efectuează următoarele analize:

Determinarea numărului probabil de bacterii coliforme (SR ISO 5541/1 sau SR ISO 5541/2 sau STAS 6349/4), și de Escherichia coli (SR ISO 11866 STAS 6349/4) ,care permite identificarea stării de contaminare intestinală a produsului fiind indicatorul igienico-sanitar de bază în apreciere calității microbiologice a produsului;

Determinarea prezenței enterococilor ca indicator sanitar, pe considerentul că enterococii, spre deosebire de coliformi, sunt mai puțin sensibili la acțiunea factorilor de mediu și au origine fecală;

Determinarea prezenței bacteriilor patogene permite identificarea speciilor de bacterii patogene (Staphylococcus aureus (STAS 6349/12), Listeria monocytogenes (SR ISO 10560), Salmonella (SR ISO 6785 STAS 6349/11), Sighella, Bacillus cereus (STAS 6349/9), etc.) care pot fi transmise consumatorilor prin intermediul produselor lactate acide contaminate;

Determinarea numărului total de germeni (SR ISO 6610 STAS 6349/3) nu se realizează în mod obișnuit deoarece microbiota produselor este formată în mod normal numai din bacterii lactice care au contribuit la realizarea produsului. Ea se practică numai la produsele obținute utilizând culturi starter mixte pentru a vedea proporția de microorganisme vii în produs, sau a determina cauza unor defecte de consistență sau gust.

Controlul microbiologic în scop sanogen presupune:

Examen direct microscopic pe frotiuri colorate Gram pentru determinarea diferitelor grupe de microorganisme (Exp. lactobacili, streptococi, determinarea raportului streptococi/lactobacili);

Examen cultural pentru identificarea:

încărcării totale cu bacterii lactice – prin incubarea la temperaturi diferențiate;

evidențierea streptococilor – în acest scop probele se cultivă pe mediu zer-lactoză cu incubare la 40°C până la apariția coloniilor albastre punctiforme;

Lactobacilii se determină prin diferența din numărul total.

3.11.2 Normele de calitate microbiologică pentru produsele lactate probiotice

Normele de calitate microbiologică pentru produsele lactate acide și probiotice sunt stabilite de standardele de produs. Produsele lactate trebuie să conțină bacterii lactice vii.

Iaurtul trebuie să prezinte un raport streptococi/lactobacili=l/2. Numărul de streptococi trebuie să fie de 2x108celule/ml, iar de lactobacili de 4×108 celule/ml;

Pentru a prezenta salubritate, produsele lactate acide trebuie să prezinte următoarele valori ale indicatorilor igienico-sanitari.

Produse lactate acide (iaurt, lapte bătut, etc):

Iaurt cu fructe:

PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL 4.

MATERIALE ȘI METODE ÎN CERCETAREA PROPUSĂ

OBIECT

Diferite specii de bacterii lactice sunt prezente în produsele lactate fermentate. În iaurturile probiotice predomină în general genurile: Lactobacillus și Bifidobacterium. Pentru a le număra, selectivitatea mediilor de cultură depinde și de germenii prezenți în produs.

Obiectul lucrării constă în evaluarea viabilității lactobacililor și bifidobacteriilor până la DLC+2 (data limită de consum + două zile), în diferite tipuri de iaurturi probiotice – DANONE (iaurt natur, iaurt cu fructe).

Fig 4.1 (www.danone.ro)

DETERMINAREA BIFIDOBACTERIILOR

Bifidobacteriile fermentează glucoza cu formare de acid lactic L (+) si acid acetic (raport acid lactic: acid acetic = 3:2). Produc cantități mici de acid formic și etanol. Bifidobacteriile sunt catalazo-negative, nu reduc nitrații la nitriți, nu formează indol și nu lichefiază gelatina.

În compoziția pereților celulari intră și peptido-glucanii. Se dezvoltă optim la pH= 6,5-7,0, dar nu se dezvoltă bine la pH=4,5-5,0 și la pH= 8,0-8,5.

Bacil G+, care nu produce gaz, cu o morfologie bifidă. Morfologia este variabilă potrivit speciilor și aspectul bifid nu este constant (capacitatea de a se separa în două la extremitățile bastonașului). Este o celulă extrem de polimorfă, imobilă, nesporulată, anaerobă (unele specii pot tolera oxigenul, doar în prezență de CO2) și în general catalază negativă. Aceeași colonie pe placă poate evolua de la un aspect transparent la opac, dar și mărimea coloniei poate evolua. Temperatura optimă de creștere este de 37-41°C.

4.2.1. Aspect macroscopic

Colonii de culoare albă, lenticulare sau rotunde, parțial cu formă de stea sau trilobate cu diametrul de 1-4 mm pe mediu de MRS. Au miros de acid acetic.

Fig. 4.2.1

4.2.2. Aspect microscopic: (examinare cu obiectul cu imersie, iluminare cu contrast de fază, mărire x 100) – bastonașe sau forme foarte variate, în mod obișnuit curbate și ramificate, așezate izolat, în perechi, în V, în lanțuri, palisade (ca scândurile unui gard), uneori se dezvoltă forme cocoide.

Fig 4.2.2

4.2.3. Principiul metodei

Inocularea de diluții decimale apropiate în plăci Petri, prin omogenizare cu MRS Agar care conține antioxigen și antibiotic.

Incubare în anaerobioză (>10% CO2 și <1% O2), la 37±2°C, pentru 5 zile (120±3 ore). Antibioticul inhibă creșterea majorității bacteriilor lactice folosite în mod obișnuit la produsele lactate fermentate.

Datorită selectivității demonstrate a suplimentului cu antibiotic care se adaugă în mediu, pe acesta nu se mai dezvoltă bacteriile tipice ale iaurtului (Streptococcus thermophillus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) culturile mezofile (Lactococcus lactis), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei și Lactobacillus rhamnossus.

Această metodă se aplică produselor lactate proaspete și culturilor starter unde Bifidobacterium este prezent și viabil și în alte amestecuri cu alte bacterii lactice.

Verificarea se face prin examen microscopic, folosindu-se colorația Gram, colorația cu albastru de metilen.

4.2.4. Materiale și aparatura necesară

-eprubete;

-cutii Petri sterile;

-pipete sterile;

-factori de anaerobioză: 1 plic de AnaeroGen AN 25 și un indicator anaerobic BR 55;

-termostat reglat la 37°C;

-baie de apă reglată la 47°C;

-vortex (pentru omogenizarea diluțiilor);

-vas de anaerobioză (închis ermetic);

-counter (aparat pentru numărarea coloniilor);

-microscop.

4.2.5. Prepararea diluantului, a mediului de cultură și a soluțiilor folosite

PREPARARE DILUANT: Sare de triptonă cisteinizată ( Tryptone sel cysteinee):

Se dizolvă 9,5 g pulbere sare de triptonă și 0,3 g cisteină (clorhidrat de L-cisteină) în 1000 ml apă distilată;

Se ajustează pH-ul la 7±0,1 la 25°C;

Se repartizează în eprubete;

Se sterilizează la autoclav la 121°C, 20 min;

Se păstrează la 4-10°C, ferit de lumină, timp de o lună.

SOLUȚIA ANTIOXIGEN

Se dizolvă 1,5 g clorhidrat de L-cisteină în 50 ml apă distilată;

Se sterilizează prin filtrare (filtru de 0,45μm);

Se păstrează timp de 15 zile la 4°C.

SOLUȚIA DE ANTIBIOTIC

Se dizolvă 0,025 g dicloxacilină în 50 ml apă distilată;

Se sterilizează prin filtrare (seringă sterilă cu filtru de 0,22μm);

Înainte de utilizare se face o diluție 1/10 în sare de triptonă cisteinizată;

Se păstrează timp de 15 zile la 4°C.

Fig 4.2.3

PREPARARE MEDIU DE CULTURĂ – MRSN (GELOSE DE MAN, ROGOSA et SHARPE):

Se dizolvă 70,3 g pulbere MRS Agar în 1000 ml apă distilată prin fierbere lentă și amestecare;

Se ajustează pH-ul înainte de sterilizare cu NaOH, astfel încât după sterilizare să fie 6,4±0,2 la 25°C;

Se repartizează în flacoane;

Se sterilizează în autoclav la 121°C, 15 minute;

Se conservă maxim o lună, la întuneric și la rece (0-5°C);

Înainte de utilizare se adaugă 1 ml soluție anti-oxigen și 1 ml soluție 1/10 de antibiotic (1 ml la 100 ml mediu).

Mediul MRS nu este un mediu în întregime selectiv. Este foarte sensibil, la tratamentele termice.

4.2.6 Prelevarea probei și modul de lucru

PRELEVAREA PROBEI:

Fiecare produs analizat s-a omogenizat bine cu ajutorul unei pipete sterile;

Pentru prepararea primei diluții se va preleva exact 1 ml produs (iaurt), care se transvazează în mod aseptic intr-o eprubetă cu 9 ml diluant;

Aceasta este diluția 1/10 sau dil. -1;

Se vortexează câteva secunde.

MOD DE LUCRU:

Se omogenizează ușor proba cu ajutorul unei eprubete sterile, care apoi se schimbă;

Se fac diluții decimale (10-7);

Diluantul și proba vor avea temperatura camerei;

Se prelevează 1 ml probă cu o pipetă cu vârf steril și se introduce într-o eprubetă cu 9 ml sare de triptonă cisteinizată. Aceasta este diluția primară 10-1;

Se agită bine pe omogenizator (vortex);

Se transferă cu pipeta (cu un alt vârf steril) 1 ml diluție primară în altă eprubetă ce conține 9 ml sare de triptonă cisteinizată, realizându-se astfel diluția 10-2;

Se agită bine pe omogenizator;

Se repetă aceste operații cu soluție de diluare sare de triptonă cisteinizată până la realizarea diluțiilor 10-6 și 10-7;

Se aleg câte două plăci Petri pentru fiecare diluție și se marchează – codul probei, diluția de inoculat;

Se inoculează câte 1 ml din diluțiile 10-6 și 10-7(din fiecare diluție s-a inoculat câte 1 ml – în două placi Petri);

Dacă este necesar se ajustează pH-ul mediului cu NaOH până la valoarea 6,4 -6,6;

Se toarnă mediul MRS Neutru (topit și răcit la 45-50°C) + cysteina + dicloxacilin (1 ml soluție anti-oxigen și 1 ml soluție 1/10 de antibiotic – la 100 ml mediu);

Antibioticul inhibă creșterea majorității bacteriilor lactice folosite în mod obișnuit la produsele lactate fermentate;

Se amestecă omogenatul cu mediul de cultură prin mișcări circulare lente, în sensul acelor de ceasornic și invers, iar după solidificare plăcile Petri se pun într-un recipient de anaerobioză împreună cu factorii de anaerobioza (1 plic de Anaerogen+1 indicator de anaerobioză). Se închide imediat capacul vasului;

Fig 4.2.4

Acest recipient se introduce într-un incubator reglat la temperatura de 37°± 2°C, timp de 120±3 ore;

Exprimarea rezultatului se face în U.F.C/ml produs sau U.F.C/g produs.

4.3 DETERMINAREA LACTOBACILILOR

Bacili lacici: Bacterii Gram pozitive, de formă bacilară, dispuse izolat, în perechi sau în lanțuri, nesporulate și necapsulate, aerobe și facultativ anaerobe, catalazo- și oxidazo-negative, de obicei imobile, homo sau heterofermentative.

4.3.1 Aspect macroscopic – Lactobacillus bulgaricus: Microorganisme termofile ce formează pe mediu MRSA colonii lenticulare, adeseori în formă de stea, cu diametrul între 1 și 3 mm.

Fig 4.3.1

4.3.2 Aspect microscopic: Pe frotiu apar ca bastonașe în general scurte, dar uneori de formă alungită. Nu sunt sporulați, sunt Gram+, imobili, catalazo negativi.

4.3.3 Principiul metodei

Însămânțarea unei cantități determinate din eșantionul de analizat în profunzimea unui mediu de cultură (MRSA), turnat în plăci Petri.

Incubarea timp de 6 zile, la 40°C, în atmosferă de CO2.

Calculul numărului de unități formatoare de colonii (UFC).

Verificarea se face prin examen microscopic, folosindu-se colorația Gram, colorația cu albastru de metilen.

4.3.4 Materiale și aparatura necesară

-eprubete;

-cutii Petri sterile;

-pipete sterile;

-factori pentru mediul de incubare: 1 plic de CO2;

-termostat reglat la 40°C;

-baie de apă reglată la 47°C;

-vortex (pentru omogenizarea diluțiilor);

-vas de incubare (închis ermetic);

-counter (aparat pentru numărarea coloniilor);

-microscop.

4.3.5 Prepararea diluantului și a mediului de cultură

DILUANTUL folosit este același ca și la bifidobacterii și anume: Sare de triptonă cisteinizată ( Tryptone sel cysteinee). Acest diluant este specific produselor lactate cu bifidobacterii.

MEDIU DE CULTURĂ MRS acid (GELOSE DE MAN, ROGOSA et SHARPE):

Se dizolvă 70,3 g mediu în 1000 ml apă distilată; se încălzește lent și se agită până la completă dizolvare;

Se ajustează pH-ul înainte de sterilizare cu acid acetic glacial astfel încât după sterilizare să fie 4,9±0,2 la 25°C;

Se repartizează în flacoane;

Se sterilizează în autoclav la 121°C, 15 minute;

Se conservă maxim o lună, la întuneric și la rece (0-5°C).

4.3.6 Mod de lucru

Se prelevează 1 ml probă cu o pipetă cu vârf steril și se introduce într-o eprubetă cu 9 ml sare de triptonă cisteinizată; Aceasta este diluția primară 10-1;

Diluantul și proba vor avea temperatura camerei;

Se agită bine pe omogenizator;

Se transferă cu pipeta (cu un alt vârf steril) 1 ml diluție primară în altă eprubetă ce conține 9 ml sare de triptonă cisteinizată, realizându-se astfel diluția 10-2.

Se agită bine pe omogenizator;

Se repetă aceste operații cu soluție de diluare sare de triptonă cisteinizată până la realizarea diluțiilor 10-4 și 10-5.

Se aleg câte două plăci Petri pentru fiecare diluție și se marchează – codul probei, diluția de inoculat;

Fig 4.3.2

Se inoculează câte 1 ml din diluțiile 10-4 și 10-5 (din fiecare diluție s-a inoculat câte 1 ml – în două placi Petri);

Se verifică pH-ul mediului care trebuie să fie 4,9±0,2;

Se toarnă mediul MRS acid (topit și răcit la 45-50°C);

Se amestecă omogenatul cu mediul de cultură prin mișcări circulare lente, în sensul acelor de ceasornic și invers, iar după solidificare plăcile Petri se pun într-un recipient în mediu de CO2 (1 plic de CO2). Se închide imediat capacul vasului;

Acest recipient se introduce într-un incubator reglat la temperatura de 40°± 2°C, timp de 144±3 ore;

Exprimarea rezultatului se face în U.F.C/ml produs sau U.F.C/g produs.

4.4 STABILIREA VIABILITĂȚII BIFIDOBACTERIILOR ȘI LACTOBACILILOR ÎN IAURTURILE ANALIZATE

Investigațiile pentru stabilirea calității produselor, viabilității bifidobacteriilor și lactobacililor s-au efectuat pe 5 tipuri de iaurturi – DANONE și anume:

Activia musli căpsuni;

Activia musli piersici;

Activia fructe de pădure cereale;

Activia de băut natur;

Activia natur (iaurt ferm);

Au fost prelevate câte 14 probe de iaurt pentru fiecare sortiment, din câte un lot (probele au fost prelevate din mijlocul lotului respectiv) și au fost preincubate la temperatura de 4°C, în vederea efectuării analizelor.

Analizele s-au efectuat astfel: pe fiecare tip de produs s-a analizat o probă, din șapte în șapte zile, începând de la Z+1 (timpul de carantină pentru eliberare microbiologică: 24h) până la DLC+2 (data limită de consum la care s-a adăugat încă două zile). Determinarea bifidobacteriilor și lactobacililor pe fiecare sortiment de iaurt s-a făcut în același timp (în aceeași perioadă).

4.4.1 Rezultate și discuții

Evaluarea numerică a bifidobacteriilor a fost reprezentată grafic (în figurile de mai jos) la diluțiile -6 și -7 pentru fiecare sortiment de iaurt analizat.

S-a observat că după o perioadă de 3 săptămâni mai mult de jumătate din Bifidobacterii au fost viabile iar numărul celulelor a fost cu mult peste >>3.4x10e7 UFC/ g.

Fig. 4.4.1. Influenta perioadei de depozitare a produsului …………..asupra viabilitatii

Fig. 4.4.2

Fig. 4.4.3

Fig. 4.4.4

Fig. 4.4.5

Fig. 4.4.6

Fig. 4.4.7

Fig. 4.4.8

Fig. 4.4.9

Fig. 4.4.10

Evaluarea numerică a lactobacililor a fost reprezentată grafic (în figurile de mai jos) la diluțiile -4 și -5 pentru fiecare sortiment de iaurt analizat.

S-a observat că după o perioadă de 3 săptămâni Lactobacili au fost viabili iar numărul celulelor a fost cu mult peste >> 10e6 UFC/ g, și de asemenea mult mai rezistenți decât bifidobacteriile.

Fig. 4.4.11

Fig. 4.4.12

Fig. 4.4.13

Fig. 4.4.14

Fig. 4.4.15

Fig. 4.4.16

Fig. 4.4.17

Fig. 4.4.18

Fig. 4.4.19

Fig. 4.4.20

Am urmărit de altfel și evoluția pH-ului, la Activia natur, deoarece evoluția pH-ului influențează în mod negativ viabilitatea bifidobacteriilor și a lactobacililor.

Fig. 4.4.21

Fig. 4.4.

În vederea stabilirii rolului benefic al iaurturilor probiotice, în raport cu calitatea și starea igienicã a laptelui folosit, s-a evidențiat capacitatea de menținere a bifidobacteriilor și lactobacililor, pe întreaga perioadă de valabilitate a produselor lactate analizate și supraviețuirea ca celule viabile.

Bifidobacteriile, s-au dovedit mai puțin rezistente la mediul acid comparativ cu lactobacilii.

4.4.2. Concluzii

Iaurtul Activia contine bacterii lactice vii, care imbunatatesc digestia lactozei din produs la persoanele care au dificultati in a digera lactoza si calciu care contribuie la functionarea normala a enzimelor digestive.

Pe lângă proprietățile lor clinice și dorite asupra sănătății, iaurturile probiotice trebuie să întrunească câteva cerințe de bază pentru dezvoltarea pieții produselor probiotice. Cea mai importantă cerință este ca bacteriile probiotice analizate (Bifidobacterium și Lactobacillus) să supravițuiască în număr suficient în produs, să fie asigurată stabilitatea lor fizică și genetică în timpul depozitării  produsului, și de asemenea ca proprietățile lor esențiale care  exprimă beneficiile aduse sănătății după consumarea acestora, să se mențină în timpul fabricării și păstrării produsului.

În plus, probioticele nu trebuie să prezinte efecte adverse asupra gustului și aromei produsului  și nu trebuie să intensifice  acidifierea pe parcursul vieții de raft a produsului. Produsele probiotice trebuie păstrate în spații răcoroase (în condiții de refrigerare). Aceasta este necesară atât pentru a garanta rata mare de supraviețuire a organismelor probiotice și pentru a asigura stabilitate suficientă produsului. Mai mult însă, datorită faptului că tractul intestinal este considerat a fi mediul înconjurător natural al bacteriilor probiotice, trebuie luat în considerare și conținutul de oxigen, potențialul redox și activitatea apei din mediul respectiv. Microorganismele active interacționează intens cu mediul transformând compușii mediului în produși metabolici. Starea fiziologică  a probioticelor adăugate poate avea o importanță considerabilă. Această stare depinde foarte mult de timpul de îmbogățire al culturii (atît în faza de creștere logaritmică cât și în cea staționară). O variabilă importantă este producerea de acid lactic și reducerea concomitentă a pH-ului în timpul fermentației, ce survine în urma inhibiției organismelor probiotice. Starea fiziologică a probioticelor este de o deosebită importanță când se ia în considerare modul în care se sfârșește fermentația.

Câteva studii au arătat că bacteriile din faza logaritmică sunt mai susceptibile la stresul înconjurător decât acelea din faza staționară.

BIBLIOGRAFIE

Akshat Talwalkar and Kaila Kailasapathy, (2004), The Role of Oxygen in the Viability of Probiotic Bacteria with Reference to L. acidophilus and Bifidobacterium spp., Centre for Advanced Food Research, University of Western Sydney, Curr. Issues Intest. Microbiol. 5: 1-8;

Ali, F. S.; Saad O. A.O and Salwa,A .G. Hussein, (2013), Probiotic stability of yoghurts during refrigerated storage, Department of Agricultural Microbiology, Faculty of Agriculture – Minia Univ. Minia Egypt, Egypt. Acad. J. Biolog. Sci., 5(2): 9-19, ISSN: 2090-0872;

Analie Lourens-Hattingh, Bennie C. Viljoen, (2001), Yoghurt as probiotic carrier food, International Dairy Journal 11 (2001) 1–17;

Ayla Sener Mumcu1, Ayhan Temiz, (2014), Effects of prebiotics on growth and acidifying activity of probiotic bacteria, GIDA 39 (2): 71-77;

A. Zinedine and M. Faid, (2007), Isolation and Characterization of Strains of Bifidobacteria with Probiotic Proprieties In vitro, World Journal of Dairy & Food Sciences 2 (1): 28-34, ISSN 1817-308X, IDOSI Publications;

B. Biavati, M. Vescovo, S. Torriani, V. Bottazzi, (2000), Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications, Annals of Microbiology, 50, 117-131;

Carlos Ricardo Soccol, Luciana Porto de Souza Vandenberghe, Michele Rigon Spier ,Adriane Bianchi Pedroni Medeiros, Caroline Tiemi Yamaguishi, Juliano De Dea Lindner, Ashok Pandey and Vanete Thomaz-Soccol, (2010), The Potential of Probiotics: A Review, Food Technol. Biotechnol 48 (4) 413–434, ISSN 1330-9862;

Carmen Nicolescu, (2005), Microbiologia produselor alimentare de origine animală, Editura Biblioteca Târgoviște;

C.L. Puneeth Kumar, Y. Sushma Saroja, D.J. Mukesh Kumar and 2P.T. Kalaichelvan, (2012), Bifidobacteria for Life Betterment, World Applied Sciences Journal 17 (11): 1454-1465, ISSN 1818-4952, IDOSI Publications;

Comparison of Common Probiotic Products, (July 2012), PL Detail-Document #280707;

Danielle Cristina Guimarães da Silva, Danilo Florisvaldo Brugnera and Luiz Ronaldo de Abreu, (2013), Quantification of lactic acid bacteria and bifidobacteria in goat milk based yoghurts with added water-soluble soy extract, African Journal of Food Science, Vol. 7(10), pp. 392-398, ISSN 1996-0794 Academic Journals;

Denis Roy, (2005), Technological aspects related to the use of bifidobacteria in dairy products, Le Lait, 2005, 85 (1-2), pp.39-56;

F. Canganella, D. Giontella, M.L. Nespica, S. Massa, L.D. Trovatelli, (2000), Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium infantis in yogurts manufactured from cowmilk and soymilk during storage at two temperatures, Annals of Microbiology, 50, 43-53;

Florentina Matei, (2011), Microbiologie aplicată, Editura Printech București;

Francesca Bottacini, Marco Ventura, Douwe van Sinderen, Mary O’Connell Motherway, (2014), Diversity, ecology and intestinal function of bifidobacteria, Bottacini et al. Microbial Cell Factories 2014, 13 (Suppl 1):S4, http://www.microbialcellfactories.com/content/13/S1/S4;

F. Tabatabaie and A. Mortazavi, (2008), Influence of Lactulose on the Survival of Probiotic Strains in Yoghurt, World Applied Sciences Journal 3 (1): 88-90, ISSN 1818-4952, IDOSI Publications;

Gerald W. Tannock, (1999), Identification of Lactobacilli and Bifidobacteria, Department of Microbiology, University of Otago, Current Issues Molec. Biol. 1(1): 53-64;

Istikhar Hussain, Attiq-ur-Rahman and Nigel Atkinson, (2009), Quality Comparison of Probiotic and Natural Yogurt, Pakistan Journal of Nutrition 8 (1): 9-12, ISSN 1680-5194;

Kamila Goderska, Jacek Nowak, Zbigniew Czarnecki, (2008), Comparison of the growth of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum species in media supplemented with selected saccharides including prebiotics, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 7(2), 5-20;

Lucia Debeleac, M.C. Popescu-Drânda, (2003), Microbiologie, Editura Medicală Amaltea;

L. Yilmaz-Ersan and E. Kurdal, (2014), The Production of Set-Type-Bio-Yoghurt with Commercial Probiotic Culture, International Journal of Chemical Engineering and Applications, Vol. 5, No. 5;

Madhu, M.Shiva Prakash and Neetu, (2013), Yoghurt is excellent vehicle for travelling probiotics to public health, INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD AND NUTRITIONAL SCIENCES, Vol.2, Iss.1, Jan-Mar 2013, ISSN 2320-7876, www.ijfans.com;

Mahboobeh Mehrabani, Sayyed Mohammad Hossein Ghaderian, Zohreh Khodaii, (2014), Important Features of Probiotic Microorganisms in Pharmaceutical and Dairy Products, Int J Entric Pathog, 1(2): 53-62;

Mary Ellen Sanders (Chair), Glenn Gibson, Harsharnjit S. Gill, Francisco Guarner, (2007), Probiotics:Their Potential to Impact Human Health, Issue Paper, Number 36;

Miloud Hadadji and Ahmed Bensoltane, (March 2006), Growth and lactic acid production by Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus in goat’s milk, African Journal of Biotechnology Vol. 5 (6), pp. 505-509, 15, ISSN 1684–5315;

Mikkel Jungersen, Anette Wind, Eric Johansen, Jeffrey E. Christensen, Birgitte Stuer-Lauridsen and Dorte Eskesen, (2014), The Science behind the Probiotic Strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, Microorganisms 2014, 2, 92-110, ISSN 2076-2607;

M.Z. Hoque, F. Akter, K.M. Hossain, M.S.M. Rahman, M.M. Billah and K.M.D. Islam, (2010), Isolation, Identification and Analysis of Probiotic Properties of Lactobacillus Spp. From Selective Regional Yoghurts, World Journal of Dairy & Food Sciences 5 (1): 39-46, ISSN 1817-308X, IDOSI Publications;

Stephanie L. Irvine, Sharareh Hekmat, (2011), Evaluation of Sensory Properties of Probiotic Yogurt Containing Food Products with Prebiotic Fibres in Mwanza, Tanzania, Food and Nutrition Sciences, 2, 434-439, http://www.SciRP.org/journal/fns;

Waldemar Gustaw, Monika Kordowska-Wiater, Justyna Kozioł, (2011), The influence of selected prebiotics on the growth of lactic acid bacteria for bio-yoghurt production, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 10(4), 455-466, ISSN 1644-0730 (print) ISSN 1889-9594 (online);

Wei-Shung Hong1 and Ming-Ju Chen, (2007), Rapid Identification of Bifidobacteria in Dairy Products by Gene-targeted Species-specific PCR Technique and DGGE, Asian-Aust. J. Anim. Sci. Vol. 20, No. 12 : 1887 – 1894, www.ajas.info;

W. Tungrugsasut1, C. Wiwat, V. Srisukh, K. Thoophaew, and P. Tippawat, Probiotic Frozen Yogurt, (2012), Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences 2012; 39 (3-4), 24-31;

Zahra Hassanzadeh-Rostami1, Seyed Mohammad Mazloomi, Samane Rahmdel, Asma Kazemi, (2014), Mixtures of soy- and cow’s milk as potential probiotic food carriers, Journal of Biology and Today's World, ISSN 2322-3308;

Z. Denkova and A. Krastanov, (2012), Development of New Products: Probiotics and Probiotic Foods, Chapter 4;