Metodica Experimentala la Ora de Chimiedoc

=== Metodica experimentala la ora de Chimie ===

Capitolul 4

METODICA EXPERIMENTALĂ

4.1. Materiale folosite la prepararea nanotransportorilor lipidici

Pentru prepararea gamei de produse cosmetice obținute prin încapsularea principiilor bioactive în nanostructuri lipidice solide s-au folosit următoarele tipuri de materiale: lipide solide, surfactanți, principii active naturale și reactivi pentru analizele fizico-chimice utilizate pentru caracterizarea nanostructurilor lipidice.

4.1.1. Lipide solide

Pentru a obține o capacitate ridicată de încorporare a principiului activ și pentru a evita expulzarea acestuia în timpul stocării, s-a utilizat un amestec de lipide cu structuri cât mai diferite. Cu cât structura matricii lipidice este mai dezordonată, cu atât mai mare este capacitatea de încorporare a principiului activ, deoarece acesta se localizează între catenele acizilor grași. Astfel, la formarea fazei lipidice s-au utilizat următoarele tipuri de lipide, cunoscute ca fiind bine tolerate de organism și prezentând bune caracteristici de biodegradabilitate:

Palmitat de cetil – n-Hexadecil Palmitat (CP), 95%, proveniență Acros Organics, USA. Este un ester derivat din alcool cetilic și acizi grași saturați cu masă moleculară mare, printre care în mare parte acid palmitic. Varianta comercializată are aspect de pelete de ceară alb-gălbuie. Punctul de topire al CP este 54 oC. Datorită proprietăților sale este utilizat în industria farmaceutică și cosmetică în procesul tehnologic de obținere a cremelor, loțiunilor, rujurilor. Structura chimică a palmitatului de cetil este următoarea:

Fig. 4.1. Structura chimică a palmitatului de cetil

Monostearat de glicerol (GS) – Cutina GMS, proveniență Cognis GmbH. Se comercializează sub formă de pulbere (fulgi). Punctul de topire al stearatului de glicerol este între 58-64 oC. Datorită caracteristicilor sale date de consistența sa, este utilizat ca agent emolient și de întărire în produse farmaceutice și cosmetice; aditiv alimentar pentru îngroșare, emulsifiere; agent antiaglomerant și conservant; strat protector pentru pulberi higroscopice; lubrifiant pentru rășini. Structura chimică a monostearatului de glicerol este următoarea:

Fig. 4.2. Structura chimică a monostearatului de glicerol

Ceara de albine (BW) utilizată pentru acest studiu provine de la firma APIMONDIA –Romania. Ceara de albine este o substanță de culoare galbenă, cu miros plăcut, caracteristic. Este compusă din: hidrocarburi 14%, monoesteri 35%, diesteri 14%, triesteri 3%, monoesteri hidroxilați 4%, hidroxipoliesteri 8%, acizi esterici 1%, acizi poliesterici 2%, acizi liberi 12%, alcooli liberi 1%, compuși neidentificați 6% [ Tulloch, AP, (1980) Journal Bee World, „Beeswax-composition and analysis”, vol. 61, no.2, pp. 47-62].

Acidul azelaic (Aaz) 98% (C9H16O4) a fost obținut de la firma ESPERIS – Italia. S-a demonstrat că acidul azelaic este eficient în tratarea acneei. Cremele conținând 20% acid azelaic, utilizate timp de 8 săptămâni reduc cu 96% numărul de bacterii propionice și stafilococii de pe suprafața pielii. [Kt Holland, Ra Bojar, Antimicrobial effects of azelaic acid, Journal of Dermatological Treatment, 1993, Vol. 4, No. 1, pp.8-11, Adele Sparavigna, Beatrice Tenconi, Ileana De Ponti, Laura La Penna, An Innovative approach to the topical treatment of acnee, Clin. Cosmet. Investig Dermatol., 2015, 8, pp. 179-185.]

Fig. 4.3. Structura chimică a acidului azelaic

4.1.2. Uleiuri vegetale

La realizarea părții experimentale au fost folosite șapte tipuri de uleiuri vegetale furnizate de la firma HOFIGAL. Cele șapte tipuri de uleiuri vegetale utilizate sunt:

Uleiul de cânepă

Uleiul de cânepă furnizează acizii grași esențiali în menținerea sănătății și a flexibilității membranelor celulare, cu rezultate bune în tratarea multor afecțiuni alergice și inflamatorii, întărește metabolismul celular. Terpenele aflate în compoziția uleiului de cânepă au efecte antiinflamatorii, vitamina E se găsește sub variantele de alpha-tocoferol și gamma-tocoferol. Este un ulei uscat, hidratant, regenerator și întărește bariera hidro-lipidică a pielii fiind foarte bună utilizarea acestuia în creme [11]. Datorită proprietăților antiinflamatoare uleiul de cânepă ameliorează simptomele dermatitelor atopice de tipul eczeme, psoriazis și acnee.

Uleiul de șofrănel

Acest tip de ulei conține componente nutritive esențiale precum: substanțe proteice, săruri minerale, acid linoleic conjugat, vitamina E (antioxidant care contribuie la scăderea stresului oxidativ al celulelor și la păstrarea integrității membranelor celulare), vitamina K, dar și o cantitate mică de colină. De fapt, uleiul de șofrănel, un produs natural și ușor asimibabil, este o sursă bogată de acid linoleic conjugat. În uz-extern uleiul de șofrănel este recomandat pentru tenul acneic, are efecte benefice asupra tenului cuperozic, previne apariția ridurilor, hidratează tenul matur, deshidratat și stimulează producția de colagen, având efect emolient [21].

Uleiul de măceșe

Uleiul din semințele de măceșe este un remediu excelent pentru numeroase boli, se obține prin presare la rece, are o culoare maronie-verzuie, gust ușor amar și miros caracteristic [30].

Uleiul de amarant

Uleiul de amarant promovează elasticitatea pielii, reduce ridurile și are proprietăți calmante. De asemenea, protejează împotriva efectelor dăunătoare ale radicalilor liberi și ajută la regenerarea celulelor [14].

Uleiul de cătină

Datorită conținutului bogat în vitamina E uleiul de cătină conferă produselor cosmetice în care este folosit proprietăți regenerante, de întinerire, nutritive. Aplicat pe piele acesta are efecte de filtrare a razelor ultraviolete și a altor tipuri de radiații cu efecte nocive asupra tenului, și combate îmbătrânirea prematură a epidermei prin efectul antioxidant asupra radicalilor liberi [24].

Uleiul de armurariu

Uleiul de armurariu este considerat o sursă bogată în vitamina E naturală și a derivaților ei [17]. El mai conține și un tip special de flavonoizi, flavolignanii care contribuie la potențialul antioxidant al uleiului cu rol în protecția și regenerarea pielii. Este recomandat în special pentru produsele cosmetice și farmaceutice pentru piele sensibilă și iritată cum ar fi pielea nou născuților, copiilor, persoanelor care suferă de eczeme atopice, psoriazis, acnee, etc. [18].

Uleiul de negrilică

Uleiul de negrilică conține o serie de principii active și acizi grași polinesaturati care determină efectele benefice asupra pielii uscate, sensibile și iritate, acțiune calmantă, revitalizantă, antiinflamatoare și mai ales imunostimulatoare. Este util pentru pielea acneică fiind purifiant, antiseptic și antiinflamator. Ajută în caz de micoze și diverse iritații cutanate [27].

4.1.3. Surfactanți

Pentru stabilizarea nanoparticulelor lipidice și pentru a preveni agregarea acestora în timpul stocării, la formarea fazei apoase s-a utilizat un amestec de surfactanți ionici și neionici.

Drept surfactant ionic s-a utilizat lecitina L–Fosfatidilcolina, Sigma Aldrich Chemie GmbH. Prin utilizarea acesteia la amestecul de agenți tensioactivi neionici, se crează o modificare de suprafață care permite stabilizarea electrostatică a particulelor coloidale, mai ales atunci când sinteza este efectuată în mediu apos. Structura chimică a lecitinei este următoarea:

Fig.4.4. Structura chimică a lecitinei

Ca surfactanți neionici s-au utilizat:

Polioxietilen sorbitan monolaurat – Tween 20, achiziționat de la firma Merck, Germania.

Fig.4.5. Structura chimică a polioxietilen sorbitan monolaureatului

Deoarece s-a demonstrat că utilizarea agenților tensioactivi neionici, în special copolimerii bloc de polietilenă și polipropilen-glicol conduc la o împiedicare sterică mai bună, ceea ce determină creșterea stabilității, s-a utilizat drept co-surfactant Synperonic PE/F68 (copolimer bloc al polietilenei cu polipropilen glicol), Sigma Aldrich Chemie GmbH. Structura chimică a copolimerului bloc Synperonic este următoarea:

Fig.4.6. Structura chimică a copolimerului bloc synperonic PE/F68

4.1.4. Extracte vegetale

Extractele vegetale utilizate pentru realizarea părții experimentale a acestei teze de doctorat au fost achiziționate de la firma HOFIGAL. S-au folosit trei tipuri de extracte vegetale obținute în diferite tipuri de uleiuri. Acestea sunt:

Extract uleios de crăițe

– în ulei de cânepă;

– în ulei de amarant.

Extract uleios de morcov

– în ulei de armurariu;

– în ulei de șofrănel;

– în ulei de cătină.

Extract uleios de gălbenele

– în ulei de negrilică;

– în ulei de măceșe.

4.1.5. Reactivi

Pentru măsurarea capacității antioxidante prin chemiluminescență au fost utilizați următorii reactivi:

Tris[Hidroximetil]aminometan (Luminol), Sigma Aldrich Chemie GmbH;

Dimetilsulfoxid, Merck, Germania;

Peroxid de hidrogen, Merck, Germania;

Tampon TRIS HCl pentru reglarea pH-ului;

Etanol, puritate HPLC, Sigma Aldrich Chemie GmbH;

Metanol, puritate HPLC, Sigma Aldrich Chemie GmbH.

4.2. Obținerea nanotransportorilor lipidici pe bază de uleiuri vegetale, liberi și încărcați cu diferite extracte vegetale

Metoda de sinteză a NLC

Pentru obținerea unei game variate de nanotransportori lipidici pe bază de uleiuri vegetale, capabile să co-încapsuleze extractele uleioase vegetale selectate în cercetare, s-a utilizat o metodă de sinteză în fază apoasă ce evită utilizarea solvenților organici. NLC-urile ce încapsulează cantități variabile de extract vegetal sunt preparate utilizând o metodă combinată de emulsionare în topitură cu omogenizarea cu grad înalt de forfecare (HSH) și omogenizare la presiune ridicată (HPH).

Tehnica omogenizării cu grad înalt de forfecare (HSH) utilizează un omogenizator cu stator-rotator în care sunt dezvoltate forțe de forfecare. Tehnica omogenizării la presiune înaltă-HPH (APV 2000 Lab omogenizator) folosește omogenizarea la presiune înaltă (8 cicluri de omogenizare la 600 barr, timp de 196 secunde).

Experimentele de sinteză au implicat inițial elaborarea și testarea mai multor sisteme formate din amestecuri de surfactanți și lipide, cu scopul obținerii unor sisteme optimizate care vor fi avute în vedere pentru încapsularea ulterioară a extractelor vegetale. În aceste cercetări preliminare s-au testat diferite rapoarte masice între amestecurile de surfactant și cele lipidice și s-a urmărit eficiența acestora prin determinarea diametrelor medii ale particulelor lipidice solide dispersate în apă.

Metodologia experimentală de sinteză a nanostructurilor lipidice

Modul de lucru aplicat pentru sinteza dispersilor de tip NLC, (fără conținut de extracte uleioase vegetale (NLC libere) și sisteme NLC ce co-încapsulează extracte uleioase vegetale (NLC –CE)) conform schemei din figura 4.7, a implicat într-o etapa inițială, formarea a două sisteme distincte, la o temperatură ce depășește cu 10 °C temperatura de topire a amestecurilor lipidice complexe.

Fig. 4.7. Procedeul de sinteză a NLC încărcate cu principiu activ

Pentru obținerea acestor nanostructuri se prepară separat 2 faze la temperatura de 80-85oC, o faza apoasă care constă dintr-un amestec de 2,5 g surfactanți (Tween 20 : Poloxamer : Lecitină = 70:15:15) și apă dublu distilată și o fază lipidică (10g), formată dintr-un amestec de lipide solide (GM, BW) și ulei vegetal. Se cântăresc cele 2 lipide solide, se topesc la o temperatură cu 10oC mai mare decât p.t. al acestora. Se introduc între 1 si 3g extract uleios vegetal (ex: extract de morcov în TO, SO sau SBO). Se menține la t ~ 80oC timp de 5 min. Topitura lipidică se introduce rapid în faza apoasă, se agită energic manual, după care se menține 15 min. la t~80oC sub agitare magnetică.

Pre-emulsia formată este supusă unei etape de omogenizare cu grad înalt de forfecare mare, prin aplicarea a 12000 rpm timp de 1 minut și ulterior unei omogenizări la presiune înaltă (8 cicluri de omogenizare la 600 barr, timp de 196 secunde).

Nanoemulsiile obținute sunt răcite la temperatura camerei (sub agitare magnetică) pentru a obține dispersiile apoase de transportori lipidici nanostructurați (NLCs) încărcați cu diferitele principii active. Pentru obținerea NLC-libere, se înlocuiesc cele 1 ÷ 3g extract uleios vegetal, cu ulei vegetal simplu (fără extract de morcov). Au fost obținute astfel diferiți nanotransportori lipidici liberi și încărcați cu extracte vegetale sub formă de pulbere alb-gălbuie, care au fost ulterior supuse caracterizărilor fizico-chimice specifice nanoparticulelor încărcate cu compuși activi.

4.3. Tehnici de caracterizare și metode de calcul utilizate pentru învestigarea structurală și a proprietăților specifice a NLC-urilor sintetizate

4.3.1. Spectroscopia de corelație fotonică

Dimensiunea particulelor, indicele de polidispersitate și potențialul zeta pentru dispersiile de NLC au fost evaluate prin tehnica de împrăștiere dinamică a luminii (DLS dynamic light scattering).

Această metodă cunoscută și sub denumirea de PCS (Photon Correlation Spectroscopy – Spectroscopia de corelare a fotonilor), măsoară fluctuația intensității luminii împrăștiate provocată de mișcarea particulelor. Metoda acoperă un domeniu al dimensiunilor de la 0,6 nm pȃnă la 600 nm, ceea ce înseamnă că este o metodă adecvată pentru caracterizarea nanoparticulelor.

Măsurătorile au fost efectuate cu un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Marea Britanie), la un unghi de împrăștiere de 90o și temperatura de 25oC. Toate probele au fost diluate înainte de măsurare cu apă deionizată până s-a obținut o intensitate corespunzătoare. Pentru fiecare probă au fost realizate câte trei măsuratori. Acești parametrii au fost evaluați imediat după obținerea lor.

4.3.2. Microscopie electronică de transmisie

Morfologia NLC încărcate cu diferite substanțe active a fost studiată prin microscopie cu transmisie electronică (TEM) utilizȃnd un microscop Philips 208 S (Olanda). După ce proba a fost diluată în raport de 1:50 cu apă bidistilată, o picătură din soluția de dispersie NLC rezultată a fost plasată pe o grilă de cupru acoperită cu carbon și se asteaptă timp de 15 minute înainte ca proba să fie vizualizată și captată imaginea.

4.3.3. Determinarea potențialului electrocinetic

Suprafața particulelor în suspensii dezvoltă o sarcină datorată ionizării grupărilor de suprafață sau absorbției de ioni care depinde de chimia suprafeței particulelor și de mediul din jurul acestor particule. Sarcina de suprafață generează un potențial în jurul particulei, care este cel mai înalt aproape de suprafață și scade cu distanța în mediu. PZ este potențialul electric al unei particule în suspensie. Particula plasată într-un câmp electric, se va deplasa cu o viteză caracteristică.

Dispozitivul utilizat măsoară mișcarea electroforetică a particulelor încărcate sub un câmp electric aplicat cu ajutorul împrăștierii electroforetice a luminii (ELS). Valoarea măsurată este apoi transformată în potențialul zeta folosind ecuația Helmholtz – Smoluchowski introdusă în software-ul aparatului. Potențialul zeta a fost măsurat folosind o soluție diluată corespunzător nanoparticulelor cu un câmp electric aplicat de 16 V/cm.

Diluțiile se efectuează cu apă distilată ajustată la o conductivitate de 50 μS/cm prin adăugarea de clorură de sodiu 0,9% (m/v). Valorile raportate sunt media a trei măsurători.

4.3.4. Calorimetria de scanare diferențială

Analiza termică a fost utilizată pentru a investiga posibilele modificări de cristalinitate în matricea lipidică. Termogramele au fost înregistrate cu un calorimetru cu scanare diferențială (DSC) Jupiter, STA 449C (Netzsch). Probele au fost încălzite cu 3o C/min, într-un interval de temperatură cuprins între 30 și 100° C. Pentru măsurători a fost utilizat un creuzet de Al2O3.

4.3.5. Spectroscopia UV-VIS

Eficiența încorporării componentei bioactive în matricea lipidică de gliceril monostearat și cetil palmitat în probele liofilizate ce conțin Tween 20, Lecitină și Synperonic PE (ca surfactant, respectiv cosurfactant), a fost determinată utilizȃnd spectroscopia UV-VIS. Formula de calcul este următoarea [130]:

(4.1)

în care: CCA teoretic = concentrația de compus activ calculată teoretic;

CCA neinglobat = concentrația de compus activ măsurată, rămasă neânglobată în matricea lipidică.

4.3.6. Spectrometria de absorbție în infraroșu cu transformata Fourier (FTIR)

Pentru a obține informații complete cu privire la structura componentă a materialelor (aflate în orice stare de agregare – solidă, lichidă sau gazoasă) se folosește spectroscopia de absorbție în infraroșu (IR) și spectroscopia Raman. Cele două metode sunt complementare și dau rezultate complete referitor la modurile vibraționale ale moleculelor.

Pentru obținerea spectrelor FT-IR asupra probelor liofilizate de NLC s-a utilizat un spectrofotometru FT-IR 620, Jasco, în vederea observării modificărilor structurale ale acestora. Au fost preparate pastile cu bromură de potasiu și o anumită cantitate din fiecare probă.

4.3.7. Determinarea in vitro a activitatii antimicrobiene

Activitatea antimicrobiană a unor probe sintetizate a fost testată în vitro față de microbi patogeni umani (specii patogene sau condiționat patogene).

4.3.8. Teste in vitro de evaluare a citotoxicității

Testul MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) se bazează pe studiul activității dehidrogenazelor, fiind un indice al integrității celulare/mitocondriale. Această metodă colorimetrică cantitativă se bazează pe reducerea compusului colorat galben MTT la un formazan albastru închis.

Suspensia celulară de fibroblaste de șoarece NCTC clona L929 (provenită din Colecția Europeană de Culturi Celulare – ECACC) a fost însămânțată în plăci de cultură cu 24 de godeuri, la o densitate celulară de 5×104 celule/godeu. Celulele au fost cultivate pentru 24 de ore, în mediul de cultură MEM (Minimum Essential Media) cu 10% ser fetal, apoi mediul de cultură a fost schimbat cu mediu proaspăt în care s-au adăugat probele de analizat, în diferite concentrații. După 24, 48, respectiv 72 de ore, mediul de cultură a fost îndepărtat și celulele spălate cu tampon fosfat salin (PBS) 0,2 M, pH 7,4, în fiecare godeu adaugându-se apoi 500 l de soluție de lucru MTT. După 3 ore de incubare la 37C, în atmosferă cu 5% CO2, celulele au fost spălate cu PBS și s-a adaugat 500 l de acid isopropilic. După o incubare de 15 minute și agitare ușoară la temperatura camerei, absorbanța a fost măsurată la 570 nm la un cititor de plăci Mithas LB 940, Berthold Technologies. Rezultatele au fost raportate ca și procente de viabilitate în funcție de proba control (celule incubate fără probe) considerate viabile 100%. Toate probele au fost testate în triplicat.

4.3.9. Studii in vitro de eliberare controlată a principiilor active a carotenoizilor din sitemele NLC

Studiul de eliberare in vitro a principiului activ din nanotransportorii lipidici preparați a fost realizat folosind sistemul de celule de difuzie Franz (25 mm în diametru, Hanson Research Corporation, SUA), pe o perioadă de 24 ore. Celula de difuzie Franz constă dintr-o cameră donor și una receptor, între care a fost poziționată o membrană de celuloză (Teknokroma, Spania), cu dimensiunea medie a porilor de 0,45 m. Experimentele au fost efectuate în condiții de imersie, pentru a garanta că toată cantitatea de principiu activ, a fost solubilizată în mediu.

Pentru experimentele in vitro, o cantitate de aproximativ 0,3 mg de liofilizat de NLC încărcat cu principiu activ a fost plasată în compartimentul donator.

Fluidul receptor (6 mL), a constat dintr-o soluție tampon fosfat salină (pH = 5,5): etanol, în raport de 7/3. Fluidul din spațiul receptor a fost supus agitării pe toată durata experimentului. Temperatura a fost menținută la 35oC, printr-un sistem recirculator de apă. Înaintea debutului propriuzis al experimentului de eliberere, membranele celulozice se plasează 12 ore în soluția tampon.

La intervale de timp specificate, 1000 L din mediu receptor au fost colectate și a fost adăugat același volum de soluție proaspătă de tampon fosfat. Concentrația de principiu activ încapsulat a fost analizată prin UV-VIS, utilizând tehnica descrisă la punctul 4.3.5.

4.3.10. Evaluarea in vitro a activității antioxidante

Activitatea antioxidantă a NLC încărcate cu principiu activ a fost determinată prin tehnica chemiluminescenței (CL) utilizȃnd un chemiluminometru Turner Design TD 20/20, USA. S-a utilizat un amestec de luminol și apă oxigenată (H2O2) ca sistem generator de specii reactive (radicali liberi), într-o soluție tampon TRIS-HCl, la un pH = 8,6. Luminolul (o hidrazidă ciclică) a fost utilizat ca substanță amplificatoare care emite lumina atunci cȃnd este oxidat și transformat în ion aminoftalat excitat, în prezența unor specii de oxidare, cum ar fi ionul superoxid (∙O2-), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxil (∙OH) și oxigenul singlet (1O2). Luminolul crește sensibilitatea de detecție a speciilor active de oxigen în probă [131]. Drept sistem generator pentru radicalii liberi s-a utilizat H2O2 în soluție tampon Tris-HCl (pH = 8.6). Probele au fost supuse ultrasonării timp de 15 min. Activitatea antioxidantă a soluțiilor a fost calculată utilizȃnd relația:

(4.2)

în care:

– I0 = intensitatea semnalului martorului la t = 5s;

– Is = intensitatea semnalului probei la t = 5s.

4.3.11. Testarea in vitro a acțiunii anti-acneice

4.3.12. Teste in vitro și in vivo de evaluare a activității anti-inflamatoare