Metode Rapide de Detectare a Enterotoxinelor Stafilococice In Probe Clinice

INTRODUCERE

Toxiinfecțiile alimentare (TIA) reprezintă o preocupare majoră de sănătate publică, microorganismele sau toxinele elaborate de acestea constituind o amenințare prin potențialul patogen, ușurința de propagare și prin posibilitatea de utilizare în scopuri de bioagresiune. Lista patogenilor implicați în producerea TIA se extinde în fiecare an, numeroase specii (bacteriene, virusuri, paraziți și prioni) fiind identificate în ultimele trei decenii. Nu numai patogenitatea recunoscută a acestora, dar și capacitatea lor de adaptare și strategiile de supraviețuire în alimente sunt îngrijorătoare.

Toxiinfecțiile alimentare stafilococice sunt determinate de ingestia enterotoxinelor preformate în alimente de către anumite tulpini de stafilococi, cel mai frecvent din specia Staphylococcus aureus și reprezintă una dintre cele mai frecvente forme ale toxinozelor alimentare. În general se raportează doar izbucnirile ce implică un număr mare de persoane, diagnosticul prezumptiv bazându-se pe simptomatologia clinică.

Incidența TIA stafilococice variază de la țară la țară, în raport de zona geografică, obiceiuri culinare, standardul de igienă alimentară și gradul de educație sanitară a populației, în special a celei care lucrează în domeniul alimentației publice. CDC estimează că în SUA se înregistrează anual un număr de 76 de milioane de cazuri, mai mult de 300.000 de pacienți necesită spitalizare și aproximativ 5.000 de decese se datorează toxiinfecțiilor alimentare, dar incidența reală a acestor afecțiuni este necunoscută, datorită dificultăților de diagnosticare, fiind în general subraportate.

În Europa, Autoritatea Europeana pentru Siguranța Alimentelor (EFSA) a raportat în 2012, un număr de 5364 de focare de toxiinfecții alimentare, ce au afectat 55.453 de persoane și au provocat 41 de decese. Dintre acestea, 346 de focare au fost cauzate de Staphylococcus spp. (EFSA Journal 2014). În România etiologia stafilococică ocupă locul al doilea în etiologia TIA conform rapoartelor anuale ale Institutului Național de Sănătate Publică, București.

Situația actuală și existența unui număr mic de studii cu reprezentativitate națională despre caracteristicile focarelor de TIA stafilococice, m-au determinat să prezint în această lucrare, aspecte actuale privind caracterizarea fenotipică și genotipică a tulpinilor de S. aureus asociate focarelor de TIA primite în perioada 2009- 2013 în cadrul Laboratorului Național de Referință pentru Infecții Nosocomiale și Rezistență la Antibiotice din Instiutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie și Imunologie ”Cantacuzino” și să realizez o prezentare succintă a metodelor de detectare a enterotoxinelor stafilococice având ca elemente de noutate utilizarea biosenzorilor cu rezonanță plasmonică de suprafață (SPR) și a tehnicilor ce utilizează spectrometria de masă (MALDI-TOF) pentru detectarea enterotoxinelor stafilococice în diverse medii de cultură și alimente.

SCOPUL GENERAL

Importanța alegerii temei

Caracterizarea focarelor de toxiinfecții alimentare stafilococice este dependentă de izolarea tulpinilor de stafilococi și detectarea enterotoxinelor stafilococice iar variabilitatea acestor parametri cum ar fi distrugerea stafilococilor prin tratament termic sau lipsa disponibilității anticorpilor împotriva tuturor enterotoxinelor stafilococice, duce, destul de frecvent la subdiagnosticarea focarelor de toxiinfecții alimentare stafilococice.

Cercetări recente au evidențiat faptul că procesul de formare al enterotoxinelor stafilococice, în alimente, este total diferit de cel din mediile de cultură, implicând mecanisme de semnalizare moleculară (quorum sensing). Această descoperire evidențiază importanța cunoașterii modului în care factorii de mediu afectează expresia enterotoxinelor în scopul elaborării de noi strategii pentru îmbunătățirea siguranței alimentare. De asemenea, trebuie reevaluate metodele tradiționale de estimare a riscurilor microbiene din diverse matrici alimentare, întrucât nu mai există o corelație directă între cantitatea de S. aureus izolată din alimente și nivelul de toxină produsă iar înțelegerea corelațiilor între creșterea bacterienă și expresia virulenței condiționate și reglate de factorii de mediu vor genera noi abordări pentru prevenirea și controlul toxiinfecțiilor alimentare în viitor.

Până în prezent, au fost descrise mai mult de 20 de enterotoxine stafilococice: enterotoxinele stafilococice "clasice": SEA- SEE, frecvent implicate în etiologia toxiinfecțiilor alimentare și enterotoxinele "noi" descrise: SEG- SEX, identificate frecvent la tulpini de S. aureus izolate atât din alimente cât și din diverse produse patologice și ale căror funcții nu sunt încă pe deplin înțelese. Toate aceste enterotoxine exprimă o puternică activitate superantigenică iar unele dintre acestea posedă activitate emetică, reprezentând un potențial pericol pentru consumatori.

Sistemul de sănatate publică are un rol critic în prevenirea și controlul focarelor de toxiinfecții alimentare ce presupune o supreveghere activă atât la nivel local cât și național, fiind dependent de o colaborare strânsă între clinicieni, medici de laborator și epidemiologi. Pentru exercitarea acestui rol este necesar să existe metodologii clare, selective și specifice referitoare atât la siguranța alimentară ("farm – to- table") cât și pentru supravegherea înbolnăvirilor umane.

La nivelul Centrului European de Control al Bolilor Transmisibile (ECDC) s-a constituit o rețea, din care România face parte, pentru diagnosticul, controlul și supravegherea toxiinfecțiilor alimentare și care monitorizează incidența cazurilor de TIA pe baza unui diagnostic puternic documentat, accentuîndu-se astfel, necesitatea introducerii metodelor moleculare de diagnostic în strategia de supraveghere, justificată prin faptul că diagnosticul prin metode microbiologice clasice, de multe ori, eșuează.

De aceea, în scopul de a caracteriza și defini un focar de toxiinfecție alimentară stafilococică, am prezentat, în această lucrare, o abordare integrată de la detecția genelor la detecția proteinelor, folosind combinația de metode bazate pe teste imunoenzimatice, biosenzori (SPR), metode moleculare (PCR, real time- PCR) și abordări proteomice (spectrometrie de masă- MALDI-TOF) ce ar putea oferi un suport etiologic eficient activităților de investigare epidemiologică atât la nivel național cât și pentru o activitate susținută în sistemul de alertă european.

PARTEA GENERALĂ

Genul Staphylococcus

Genul Staphylococcus face parte din familia Staphylococcaceae, ordinul Bacillales, clasa Bacilli, încengătura Firmicutes, fiind coci Gram pozitivi (fig.1), aerobi, facultativi anaerobi ( exceptie S. aureus subspecia anaerobius și S. saccharolyticus), imobili, nesporulați, catalazo – pozitivi, ce se dispun sub formă de chiochine. Aceste microorganisme sunt ubiqiutare, se pot găsi în aer, praf, suprafețe, apă și colonizează tegumentele și mucoasele oamenilor și animalelor (Kloos and Schleifer 1975).

Fig.1 Aspectul S. aureus în colorația Gram (http://www.microbes-edu.org)

Până în prezent au fost descrise peste 70 de specii și subspecii ale Genului Staphylococcus(http://www.dsmz.de/bacterial-diversity/prokaryotic-nomenclature-up-to-date/prokariotic-nomenclature-up-to-date.html). Mai mult de jumătate dintre aceste specii aparțin microbiotei comensale la om (S. aureus și alte specii coagulazo- negative: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. cohnii, S. xylosus- (Kloos and Schleifer 1975), S. capitis, S. warneri, S. hominis, S. simulans, S. saccharolyticus, S. auricularis – (Schleifer, Geyer et al. 1983), S. caprae – (Devriese, Vlaminck et al. 1983), în timp ce alte specii au fost găsite doar la animale (S. hyicus, S. delphini, S. felis, S. schleiferi subspecia coagulans, S. lutrae (Hennekinne, De Buyser et al. 2012). Aceste microorganisme sunt rezistente la condițiile nefavorabile de mediu putând rezista chiar luni de zile în condiții ostile. O caracteristică particulară a stafilococilor este, de asemenea, capacitatea acestora de a crește în medii hipersaline (6,5% NaCl- (Vos, Behrendt et al. 2009, Hennekinne, Ostyn et al. 2010).

Speciile genului sunt împărțite în funcție de capacitatea lor de a produce coagulază în doua grupuri: speciile coagulazo- pozitive- S. aureus, S. intermedius, S. schleiferi subsp. coagulans, S. delphini, S. hyicus , S. lutrae (Devriese and Hommez 1978, Foster, Ross et al. 1997) și specii coagulazo- negative ce cuprind majoritatea speciilor.

Toxiinfecțiile alimentare stafilococice sunt printre cele mai frecvente toxinoze alimentare, fiind determinate de ingestia toxinelor produse de tulpini enterotoxigene de stafilococi (Genigeorgis 1989, Hennekinne et al. 2012).

1-2 Staphylococus aureus (S. aureus)

S. aureus este cel mai important patogen uman care, deși face parte frecvent din microbiota normală, la om și animale, poate determina o gamă variată de infecții cu severitate variabilă, atât comunitare cât și nosocomiale: foliculite, furuncule, impetigo, abcese, infecții ale plăgilor, endocardite, osteomielite, pneumonii, septicemii cât și afectiuni determinate de toxinele pe care le eliberează- epidermoliza buloasă stafilococică, sindromul de șoc toxico-septic stafilococic și toxinfecții alimentare stafilococice (Howe 1966). Această varietate de manifestări clinice se explică prin numărul mare de factori de virulență pe care fiecare tulpină de S. aureus îi secretă (Le Loir, Baron et al. 2003).

În cadrul speciei S. aureus au fost descrise două subspecii S. aureus subsp. aureus (Rosenbach, 1884) și S. aureus subsp. anaerobius (de la Fuente and Suarez 1985). Subspecia anaerobius a fost izolată din abcese de la ovine și are caracteristici speciale (creștere în condiții anaerobe, este catalază negativă ) însă frecvența acestei subspecii este redusă, aproape toate tulpinile aparținând subspeciei aureus.

Factorii ce predispun la infecții grave (Musher, Lamm et al. 1994) cu S. aureus sunt:

Defecte congenitale ( Sindromul Wiskott- Aldrich, sindromul Down’s) sau dobândite (diabet zaharat, artrită reumatoidă) ale chemotaxiei

Defecte ale opsonizării în hipogamaglobulinemii congenitale sau dobândite sau deficiențe al fracțiunilor complementului(C3 și C5)

Defecte ale mecanismelor de fagocitoză intracelulară prin absența peroxizilor (LGC, LLC)

Leziuni ale pielii (arsuri, eczeme, incizii chirurgicale)

Prezența corpilor străini (suturi, dispozitive protetice)

Infecții cu alți agenți, în special virusuri (virusul gripal)

Alte afecțiuni cronice (neoplasme, alcoolism, afecțiuni cardiace)

Administrarea terapeutică sau profilactică de antibiotice

Aproximativ 30- 50% din populație este purtătoare de S. aureus la nivel nazo- faringian fără a avea vreo simptomatologie iar cei mai mulți nou-născuți se colonizează în prima săptămână de viață (Dancer and Noble 1991). Se estimează că până la 20% dintre indivizii speciei umane sunt purtători permanenți de stafilocococ, acest lucru depinzând de particularitățile anumitor structuri de suprafată ale celulei gazdă și anume antigenele majore de histocompatibilitate, identice la om cu antigenele leucocitate, desemnate cu inițialele HLA (Human Leucocyte Antigens) (Wertheim, van Leeuwen et al. 2005). În relație cu aceleași structuri, până la 60% dintre indivizi pot fi purtători intermitenți de stafilococ, în timp ce 20 % dintre indivizi nu vor fi niciodată purtători.

Principalele caracteristici ale S. aureus sunt rezumate mai jos:

microorganism aerob facultativ anaerob, termosensibil, necesită temperaturi de creștere între 6 și 46 ° C (optim la 37 ° C),

se dezvoltă la un pH între 4 și 9,8

poate supraviețui în produsele alimentare deshidratate și /sau congelate,

tolerează o concentrație de sare (NaCl ) ridicată (până la 20 %), precum și o activitate a apei redusă aw ( 0,83).

prezintă necesități nutritive în aminoacizi și vitamine, creșterea sa putând fi inhibată de prezența florei competitive din produsele alimentare.

rolul său patogen în toxiinfecțiile alimentare este legat de secreția de proteine cu proprietăți neurotoxice la om: enterotoxinele stafilococice.

1-3 Stafilococii coagulazo- negativi (SCN)

Deși inițial doar S. aureus era considerat patogen și se distingea de celelalte specii prin prezența proteinei A, producerea de coagulază și fermentarea manitolului (Pfaller and Herwaldt 1988,Vos, Behrendt et al. 2009) izolarea din ce în ce mai frecvent a speciilor de stafilococi coagulazo-negativi (ex. Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus) din infecții nosocomiale grave sau din infecții la animale (ex. S. cromogenes, S. simulans, S. xylosus) a crescut interesul și pentru cercetarea acestor specii (Podkowik, Park et al. 2013).

Aceste specii de stafilococi coagulazo-negativi, ce reprezintă componenta majoră a florei bacteriene normale, au fost asociate cu infecții nosocomiale, în special la pacienții imunodeprimați (cancer, post-transplant, nou- născuți prematuri), la cei internați în anumite secții cu risc crescut- ATI sau la pacienți cu dispozitive protetice (Vasconcelos, Pereira et al. 2011); un rol important revine, în aceste cazuri, laboratoarelor clinice și clinicienilor pentru a face diferența între o simplă contaminare și o tulpină extrem de patogenă (Kleeman, Bannerman et al. 1993, Cunha, Eisenstein et al. 2006). Totuși, un număr din ce în ce mai mare de factori de virulență, ca, de altfel și diferiți determinanți ai rezistenței la antibiotice au fost detectați în genomul SCN, inițial fiind descriși doar la S. aureus (Park, Fox et al. 2011).

Se consideră că, stafilococii coagulazo-negativi fac parte din flora alimentară ”positive food flora” cu largi aplicații în industria alimentară, datorită impactului pozitiv asupra proceselor fermentative și asupra caracteristicilor organoleptice pe care le imprimă produselor, fiind folosiți frecvent ca și componenți al cărnii și brânzeturilor (Irlinger 2008). Încă din anii 1950 sunt studii ce indică posibilitatea ca aceste specii de SCN să producă enterotoxine (Breckinridge and Bergdoll 1971), iar cercetările din ultimii ani confirmă abilitatea SCN de a produce enterotoxine (Zell, Resch et al. 2008) fiind pusă în evidență, în genomul SCN utilizați în procesele alimentare sau asociați cu infecții la om, o secvență omologă cu cea răspunzătoare de producerea de enterotoxine la S. aureus (Weir, Jones et al. 2007).

1-4 Factorii de virulentă

Speciile genului Staphylococcus secretă numerosi factori de virulență responsabili de invazia și infecția gazdei: capsula polizaharidică, peptidoglicanii și acizii teichoici, proteina A, enzime: catalaza, coagulaza, clumping factor, fibrinolizina, hialuronidaza, lipaze, nucleaze, fosfodiesteraze, β- lactamaze, stafilokinaze și diverse toxine: hemolizine- α, β, γ, δ, leukocidine, exfoliatine, enterotoxine, toxina sindromului de șoc toxico-septic 1 – TSST-1. Unele dintre genele codante ale acestor factori sunt transportate de elemente genetice mobile (MGE) ca fagi, plasmide sau insule de patogenitate (Yamaguchi, Hayashi et al. 2000;Yoshizawa, Sakurada et al. 2000).

Coagulaza reprezintă unul dintre cei mai importanți factori de virulența ai speciilor de S. aureus (Karahan and Cetinkaya 2007). Această enzimă ce se găsește sub două forme- forma liberă sau cea legată de peretele celular, se leagă de protrombină devenind enzimatic activă și catalizează conversia fibrinogenului în fibrină, având drept urmare acoperirea peretelui celular cu fibrină ceea ce face ca bacteria să devină rezistentă la opsonizare și fogocitoză. Producerea coagulazei este criteriul principal folosit în laboratoarele de microbiologie pentru diferențierea între speciile de S. aureus și cele coagulazo-negative. S-au descris numeroase forme alelice ale acestei enzime, fiecare izolat de S. aureus producând una sau mai multe variante ale acestei enzime (Schwarzkopf 1995) codificate de gena coa.

Totalitatea genelor acestei specii bacteriene, asa numitul “pan- genom” (Grumann, Nubel et al. 2014) codifică pentru o mare varietate de proteine structurale sau extracelulare ce acționează ca factori de virulență (Foster 2005) astfel:

mediază aderența la țesuturile lezate, la diverse matrici extracelulare și pe suprafața celulelor gazdă (Foster and Hook 1998),

facilitează diseminarea în țesuturi și distrugerea acestora,

promovează absorbția fierului (Skaar and Schneewind 2004),

se leagă de diverse proteine pentru a se sustrage acțiunii răspunsului imun, inclusive acțiunii fagocitelor,

determină liza celulelor gazdă

modulează răspunsul imun înnăscut și adaptativ

Cei mai mulți factori de virulență aparțin secretomului (proteine secretate) (Kusch and Engelmann 2014), ce include adezine legate covalent (matrix surface components recogniz-ing matrix molecules – MSCRMMs) sau necovalent la suprafața celulei (secretable expanded repertoire adhesive molecules– SERAM), proteine ce acționează ca toxine și superantigene și proteine ce funcționează ca enzime responsabile de răspândirea infecției și evitarea răspunsului imun.

Cu excepția sindroamelor toxemice, patogeneza S. aureus este rezultatul acțiunii combinate a diferiților factori de virulență asociați celulei bacteriene și extracelulari. Genele codante pentru majoritatea toxinelor secretate de S. aureus sunt situate la nivelul elementelor genetice mobile ceea ce determină o heterogenitate accentuată a profilelor toxice exprimate de diverse tulpini, hemolizinele și enterotoxina stafilococică X sunt codificate de gene cromozomale (Wilson, Seo et al. 2011).

Fig. 2 Factorii de patogenitate la S. aureus (Lowy, 2008) A Proteine structurale și exoproteine. B, C Secțiuni transversale la nivelul peretelui celular.

S. aureus produce o varietate largă de toxine și proteine ce inactivează celulele sistemului imunitar prin eliberarea de citokine mediată de superantigene sau prin citotoxicitate directă, în cazul acțiunii hemolizinelor. Majoritatea tulpinilor secretă un grup de citotoxine ce include 4 hemolizine distincte antigenic (α, β, γ și δ). Unele tulpini produc una sau câteva exoproteine suplimentare, reprezentate de toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1), enterotoxinele stafilococice (SEA- SElX), exfoliatinele (Dumitrescu, Boisset et al. 2007) și leucocidina Panton –Valentine (Gillet, Issartel et al. 2002). Funcția principală a toxinelor este de a inhiba răspunsul imun al gazdei față de S. aureus, dar fiecare toxină exercită și funcții biologice specifice, responsabile de manifestări clinice particulare.

1-5 Enterotoxinele stafilococice

1-5-1 Structură

Până în prezent au fost descrise peste 20 de enterotoxine stafilococice care sunt proteine simple, globulare, cu mase moleculare între 19-29 kDa, cu structură și secvență a aminoacizilor asemănătoare între ele (tabelul 1) ce fac parte din familia superantigenelor alături de exotoxinele pirogenice streptococice.

Primele cercetări asupra structurii enterotoxinelor implicate în producerea toxiinfecțiilor alimentare datează din anii 1950, Bergdoll reușind purificarea enterotoxinei B în 1959. Huang și Bergdoll în 1970 (Bergdoll, Chu et al. 1965; Huang and Bergdoll 1970) descriu secvența peptidelor caracteristică enterotoxinei B, Schmidt și Spero în 1983 (Schmidt and Spero 1983) identifică structura SEC1 iar în 1987 Huang și colaboratorii evidențiază structura enterotoxinei stafilococice A(Le Loir, Baron et al. 2003). Enterotoxina stafilococică C prezintă mai multe variante (SEC1, SEC2, SEC3, SECbovin, SECovine, SECcaprin și SECcanin) pe baza diferențelor în activitatea superantigenică și în funcție de activitatea specifică asupra gazdei (Bergdoll, Borja et al. 1965); (Marr, Lyon et al. 1993).

Tabelul 1. Procente de identitate a secvenței aminoacizilor la diferite enterotoxine stafilococice –(Jarraud, Peyrat et al. 2001)

O proporție de 15% din secvența enterotoxinelor este conservată, enterotoxinele stafilococice fiind grupate după anumite particularități structurale. Astfel, până la descoperirea enterotoxinelor G și I, erau descrise 2 grupe mari de enterotoxine: una continând SEB și enterotoxinele C (cu variante), iar alta conținând două subgrupe: SEA/SEE, cu similaritate 84% si SED/SEH, care au o similaritate mai îndepărtată. Procentul de similaritate a secvenței de aminoacizi variază de la 15,5 % ( între SEB și SEK ) până la 81 % ( între SEA și SEE ), ceea ce, poate cauza lipsei de specificitate a instrumentelor utilizate pentru detectarea lor.

Recent, pe baza secvenței aminoacizilor au fost împărțite în patru (sau cinci) grupe filogenetice după unii autori (Thomas, Chou et al. 2007); (Ono, Omoe et al. 2008); (Larkin, Carman et al. 2009), la acestea adăugându-se în 2011 enterotoxina SElX (Wilson, Seo et al. 2011) ce prezintă anumite proprietăți comune (fig.3 ):

pot determina emeză sau anumite manifestări gastro-intestinale la primate,

au activitate superantigenică (Papageorgiou, Plano et al. 2000),

rezistă la căldură și la digestia cu pepsină și tripsină (Li, Hu et al. 2011);

prezintă structură și secvență a aminoacizilor asemănătoare între ele (Dinges, Orwin et al. 2000).

Fig. 3 Arborele filogenetic al enterotoxine stafilococice și proteinelor enterotoxin-like (Wilson, Seo et al. 2011)

Studiile cromatografice au relevant structura tridimensională a acestor toxine ( fig.4 ). În 1995 Swaminathan et al. (Swaminathan, Furey et al. 1995) a descris structura cristalografică a enterotoxinei stafilococice B. Forma moleculelor enterotoxinelor stafilococice este elipsoidală și conțin două domenii inegale. Structura secundară este un amestec de componente α- helix și β (în foie plisată). Domeniul A conține atât grupări amino cât și carboxi- terminale ca și structuri β. Terminațiile amino acoperă marginea structurii β formând o structură laxă. Interfața dintre domeniul A și B este evidențiat de un set de elice α ce formează o adâncitură în partea din spate a moleculei și o mică cavitate în partea de sus. Domeniul B se asociază cu legarea de carbohidrații sau acizii nucleici ai altor proteine. Regiunea internă β buclată este intens hidrofobică iar suprafața externă este acoperită de reziduuri hidrofilice. Legătura disufidică caracteristică enterotoxinelor stafilococice este situată la capătul domeniului B la partea opusă structurii α- helicoidale, ceea ce duce la formarea unei bucle flexibile a cărei lungime este variabilă la enterotoxine. Deși există anumite diferențe in structura enterotoxinelor, similaritățile sunt remarcabile (Hu and Nakane 2014).

Enterotoxinele stafilococice sunt secretate în timpul fazei de creștere logaritmică sau în perioada de tranziție de la faza de creștere exponențială la faza staționară (Derzelle, Dilasser et al. 2009). Sunt proteine bogate în aminoacizi bazici: lizină, acid aspartic, acid glutamic, tirozină (Le Loir, Baron et al. 2003); (Orwin, Fitzgerald et al. 2003). Majoritatea enterotoxinelor prezintă două reziduuri de cisteină și 3 reziduuri de triptofan. Cele două reziduuri de cisteină formează un radical de cistină la mijlocul lanțului polipeptidic, ceea ce duce la buclarea acestuia. Bucla cistinică este o structură care prezintă importanță în conferirea activității emetice, dar numai în asociere cu o regiune adiacentă (Mauff, Rohrig et al. 1983).

Fig. 4 Structura tridimensională a diverselor enterotoxine stafilococice

SEA: (Schad, Zaitseva et al. 1995); SEB: (Papageorgiou, Tranter et al. 1998); SEG: (Fernandez, Cho et al. 2011);SEH: (Hakansson, Petersson et al. 2000); http://www.ebi.ac.uk/ebisearch/search.ebi?db=macromolecularStructures&t=%22staphylococcal+enterotoxin%22&request

Enterotoxinele sunt proteine extrem de stabile, solubile în apă și soluții saline, rezistente la factorii de mediu ce pot distruge S. aureus (tratament termic, pH scăzut) și la actiunea enzimelor proteolitice: pepsină, tripsină, renină și papaină (Argudin, Mendoza et al. 2010), păstrîndu-și însă activitatea în tubul digestiv, după ingestia alimentelor contaminate. Cu toate acestea , SEB și SEC au putut fi hidrolizate prin digestia cu tripsină la nivelul punții disulfidice. SEB poate fi distrusă de pepsină la pH = 2, dar este rezistentă la valori ale pH-ului mai mari, condițiile întâlnite de obicei în stomac, după ingestia de alimente (Reiser, Robbins et al. 1983).

Enterotoxinele sunt, de asemenea, termorezistente fiind mult mai rezistente în aliment decât în mediile de cultură artificiale, dar pot fi inactivate prin tratament termic, mai ales dacă se găsesc în concentrații mici (Reiser, Robbins et al. 1983). Tratamentele termice în mediu acid duc la pierderea activității imunologice prin degradarea aminoacizilor și în consecință și la pierderea activității biologice. Cu toate acestea , în 1995, Bennett a demonstrat prin teste in vivo pe pisoi că SEA și SED, deși și-au pierdut activitatea imunologică după tratament termic, și-au păstrat activitatea toxică.Ca urmare, este dificil de estimat impactul tratamentului termic asupra activității enterotoxinelor (Schwabe, Notermans et al. 1990), acesta depinzând de tipul enterotoxinei și de concentația sa în matricea alimentară. În unele cazuri, inactivarea termică este spontan reversibilă, în pH alcalin sau prin tratare cu uree (Akhtar, Park et al. 1996).

În general , aceste date arată că enterotoxinele sunt reziste la condițiile de mediu care distrug cu ușurință bacteria S. aureus ( tratament termic, pH acid ) (Schelin, Wallin-Carlquist et al. 2011)

Astfel, în cazul unor produse alimentare tratate termic, numai detectarea enterotoxinelor va permite caracterizarea finală a unei izbucniri de toxiinfecție alimentare. Prin urmare, este important să existe metode adaptate și optimizate în laboratoare pentru detectarea acestui tip de toxine.

1-5-2 Nomenclatură

Mai mult de 20 de enterotoxine au fost descrise până în prezent astfel încât Comitetul Internațional pentru Nomenclatura Superantigenelor Stafilococice a propus în 2004, împărțirea lor în funcție de activitatea emetică asupra primatelor (Lina, Bohach et al. 2004) în: enterotoxine stafilococice SE (SEA -SEE, SEG-SEI, SER – SET) și proteine asemănătoare enterotoxinelor stafilococice (staphylococcal enterotoxins like – SEl) fără activitate emetică la primate (SElL și SElQ- (Orwin, Leung et al. 2001); (Orwin, Fitzgerald et al. 2003) sau a căror activitate nu a fost încă testată (SElJ, SElK, SElM – SElP, SElU, SElU- SElX).

SE și SEl au fost tradițional împărțite în enterotoxine "clasice" (SEA- SEE) și tipuri noi de enterotoxine (SEG – SElX). Toxinele nou descoperite cu asemănare mai mare de 90% în secvența aminoacizilor față de toxinele existente se consideră subtipuri și se notează cu un număr sau se mai numesc variante.

Până în prezent au fost descrise 23 entități antigenic distincte, excluzând variantele, împărțite astfel:

enterotoxinele clasice: SEA, SEB, SEC (cu variantele SEC1, SEC2, SEC3, SEC ovin și SEC bovin), SED și SEE- raportate frecvent ca agenți cauzali ai toxiinfecțiilor alimentare stafilococice (Bergdoll, Borja et al. 1971), (Balaban and Rasooly 2000)

tipuri noi de enterotoxine stafilococice (SEG, SEH, SEI- (Munson, Tremaine et al. 1998); (Su and Wong 1995), SER, SES, SET- (Omoe, Hu et al. 2003); (Ono, Omoe et al. 2008)

enterotoxine asemănătoare enterotoxinelor stafilococice SE-like (SElJ, SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP, SElQ, SElU, SElU2, SElV și SElX ) (Thomas, Jarraud et al. 2006), (Jarraud, Peyrat et al. 2001), (Omoe, Imanishi et al. 2005), (Ono, Omoe et al. 2008), (Orwin, Fitzgerald et al. 2003), (Wilson, Seo et al. 2011), (Hu and Nakane 2014).

TSST-1deși inițial a fost descrisă ca SEF, ulterior a fost exclusă, nedemonstrându-i-se activitatea emetică (Bergdoll, Crass et al. 1981), (Reiser, Robbins et al. 1983).

Studii recente (Omoe, Hu et al. 2013) au demonstrat potențialul emetic al toxinelor asemănătoare enterotoxinelor stafilococice SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP și SElQ asupra unei specii de primate (cynomolgus monkeys). Acestea au determinat vărsături la maimuțe la doze de 100 μg/kg ceea ce sugerează că pot avea un rol important în producerea toxiinfecțiilor alimentare stafilococice și de asemenea, prin demonstrarea capacității emetice, se sugerează schimbarea denumirii lor din proteine enterotoxin- like în enterotoxine stafilococice.

1-5-3 Mod de acțiune

1-5-3-1 Activitatea superantigenică

Enterotoxinele stafilococice fac parte din categoria superantigenelor alături de exotoxinele pirogenice streptococice și toxina sindromului de șoc toxic stafilococic (TSST-1)(Balaban and Rasooly 2000), determinând după pătrunderea lor în organismul uman, o activare nespecifică a mai multor clone de limfocite T, urmată de eliberarea unor cantități foarte mari de molecule cu acțiune proinflamatoare: IL2,TNFß, ITF. Mecanismul de acțiune al superantigenelor a fost descoperit de Bernhard Fleischer și Hubert Schrezenmeier și descris pentru prima dată în 1988 (Fleischer and Schrezenmeier 1988). Efectele acestui fenomen pot îmbrăca aspecte dramatice, mergând până la tabloul de șoc toxic (Dinges, Orwin et al. 2000), (Le Loir, Baron et al. 2003). Mecanismul de activare a limfocitelor de către superantigene este nespecific și spre deosebire de antigenele clasice acestea nu au nevoie să fie procesate de celulele prezentatoare de antigen (APC).

Superantigenele pot lega direct anumite regiuni V din lanțul β al receptorilor celulelor T (TCR) în combinație cu complexul major de histocompatibilitate MHC clasa II de pe suprafața celulei prezentatoare de antigen (fig.5) (Lina, Bohach et al. 2004); (Yagi, Uchiyama et al. 1994), ceea ce are ca rezultat activarea policlonală a limfocitelor.

Fig. 5 Interacțiunea SE cu TCR și cu moleculele CMH clasa II (Pinchuk, Beswick et al. 2010)

Regiunile V implicate în realizarea activării sunt caracteristice fiecărui tip de enterotoxină (Fields, Malchiodi et al. 1996); (Labrecque, Thibodeau et al. 1994). Se estimează că o concentrație de câteva picograme de enterotoxine stafilococice poate stimula nespecific pînă la 50% din limfocitele T. Această activare masivă a limfocitelor T determină o secreție anormală de citokine proinflamatorii și o proliferare clonală a acestora. Concentrații mari de citokine proinflamatorii ca interleukina- 2(IL-2), interferon-γ (IFN- γ) și al factorului de necroză tumorală (TNF-α) pot determina apariția simptomelor bolii caracterizată prin debut rapid cu febră mare, transvazare a lichidelor interstițiale și disfuncții multi-organice caracteristice unui sindrom de șoc toxic. Bruschețea și amplitudinea eliberării de citokine determină severitatea și evoluția bolii (Fraser and Proft 2008). După proliferarea clonală, multe limfocite T activate sunt supuse apoptozei celulare induse rezultând o deleție clonală a limfocitelor T, iar limfocitele T supraviețuitoare devin anergice. Studiile recente demonstrează că aceste celule sunt fenotipic și funcțional analoage limfocitelor T reglatorii imunosupresive (Taylor and Llewelyn 2010). Deși efectul imunosupresiv al infecțiilor stafilococice nu se aplică întregului organism, se presupune că acesta poate facilita colonizarea locală a gazdei cu patogeni (Fraser and Proft 2008). În plus, alte sudii arată că stimularea pe termen lung de către superantigenele stafilococice induce dezvoltarea limfocitelor T reglatorii CD4+CD25+ la oameni, rozătoare și bovine capabile să suprime răspunsurile proliferării limfocitelor T (Seo, Lee et al. 2007) sugerând că imunomodularea indusă de superantigenele stafilococice are un rol important în producerea bolii stafilococice.

Proprietățile superantigenice ale enterotoxinelor stafilococice au stat la baza folosirii filtratului celular de S. aureus, ce conține enterotoxina C, în terapia cu succes a cancerului, în China timp de mai bine de 10 ani. Studii recente au investigat componentele active ale acestui produs iar pentru dezvoltarea de noi medicamente anti- cancer s-a propus folosirea de proteine recombinate purificate ale enterotoxinelor M și N ( rSEM și rSEN ) (Pan, Ding et al. 2007).

1-5-3-2 Activitatea emetică

Superantigenicitatea și activitatea emetică sunt două funcții separate ale enterotoxinelor, localizate în domenii diferite ale proteinelor (Hovde, Marr et al. 1994); (Dinges, Orwin et al. 2000). Mecanismul activității emetice este diferit de cel superantigenic, dar mult mai puțin cunoscut. El a putut fi demonstrat și măsurat prin capacitatea de a produce vărsături după administrare orală la maimuțe din specia Macaca mulatta (Normann, Jaeger et al. 1969), (Stiles and Denniston 1971).

S-a demonstrat că administrarea intragastrică a enterotoxinelor SEA și SEB determină un răspuns emetic și modificări gastro-intestinale la diverse specii de Macaca (Reck, Scheuber et al. 1988). Deși maimuțele sunt considerate modelul animal primordial, datorită considerentelor etice și costurilor ridicate s- a renunțat la utilizarea lor pentru investigarea efectelor acestor toxine.

Câinii (Prohaska, Kocandrle et al. 1966), porcii (Taylor, Schlunz et al. 1982) sau purcelușii (van Gessel, Mani et al. 2004) au fost utilizați pentru reproducerea afecțiunilor produse de enterotoxinele stafilococice.

S-a demonstrat că enterotoxinele stafilococice stimulează nervul vag al viscerelor abdominale ce transmit semnalul centrului vomei din creier (Sugiyama and Hayama 1965), (Hu, Zhu et al. 2007).

O altă ipoteză referitoare la mecanismele patogenezei toxinozei stafilococice are în vedere posibilitatea existenței unui efect direct asupra epiteliului intestinal stimulând peristaltismul intestinal, producând modificări de tip inflamator cu mucoase hiperemice, infiltrate cu PMN, exsudate mucopurulente la nivel duodenal, leziunile cele mai severe fiind localizate la nivelul stomacului și intestinului subțire (Hu, Zhu et al. 2007).

Spre deosebire de bine-cunoscutele manifestări clinice, fiziopatologia acestor simptome este doar parțial înțeleasă. Examinarea endoscopică a pacienților cu toxiinfecții alimentare stafilococice a arătat leziuni gastro-intestinale acute cu hiperemie neuniformă a mucoasei, edem localizat, iritația musculaturii, eroziuni, peteșii și exudate purulente (Palmer 1951), observându-se un influx de polimorfonucleare în lamina propria și la nivelul epiteliului. Enterotoxinele pot penetra mucoasa intestinală și astfel pot avea acces la țesuturile imune locale și sistemice. Una dintre ipoteze este că sistemul imun local activat de către enterotoxine ar putea fi responsabil pentru modificările gastro-intestinale observate, precum și de activarea celulelor Mast. Eliberarea mediatorilor inflamației (histamina si leucotriene) și a peptidei neuroenterice (substanța P) ca urmare a activării de către enterotoxinele stafilococice, ar putea fi, de asemenea, implicate în producerea modificărilor de le nivel intestinal (Shanahan, Denburg et al. 1985).

Eliberarea de histamină este, de asemenea, asociată și cu alte tipuri de intoxicații alimentare, dar rămâne de demonstrat dacă sinteza acestor mediatori este indusă direct sau indirect de către SE. Diareea în intoxicația alimentară stafilococică se poate datora inhibării reabsorbției apei și electroliților în intestinul subțire de către enterotoxinele stafilococice, după cum se observă atât in vitro cât și in vivo pe model animal. Activitățile emetice ale enterotoxinelor stafilococice și ale toxinelor asociate nu sunt echivalente.

TSST-1 nu are activitate emetică, probabil din cauza sensibilității sale față de enzimele digestive. Alte SE, cum ar fi SEI și SElL sunt slab emetice sau chiar nu au activitate emetică, acestor toxine lipsindu-le bucla disulfidică caracteristică în partea de sus a domeniului B ceea ce explică lipsa activității emetice. Studiile asupra diverselor mutații în structura SE nu au arătat nici o legătură între reducerea proliferării limfocitelor T și vărsături cu toate că cercetările care disociază activarea monocitelor de producerea emezei nu sunt foarte extinse (Harris, Hufnagle et al. 1993; Harris and Betley 1995).

1-5-4 Localizarea genelor ce codifică enterotoxinele stafilococice

Majoritatea enterotoxinele stafilococice sunt codificate de gene situate pe elemente genetice mobile (Tabel 3):

plasmide (seb, sed, sej, ser, ses, set- (Bayles and Iandolo 1989); (Omoe, Hu et al. 2003), (Ono, Omoe et al. 2008); (Shalita, Hertman et al. 1977); (Zhang, Iandolo et al. 1998),

profagi (Betley and Mekalanos 1985); (Coleman, Sullivan et al. 1989); (Couch, Soltis et al. 1988),

insule de patogenitate (SaPIs- seb, sec, seg, she, sei, sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq)

dar și la nivelul ADN-ul cromozomal în apropierea casetei stafilococice ce codifică rezistența la meticilină (SCC- mec) (Novick 2003; Schmidt and Hensel 2004). Localizarea pe plasmide sau pe insulele de patogenitate este dependentă de originea tulpinii (Fitzgerald, Monday et al. 2001).

Grupul de gene pentru enterotoxine (enterotoxin gene cluster- egc) codifică pentru enterotoxinele SEG, SEI, SElM, SElN, SElO fiind descris de Jarraud în 2001 (Jarraud, Peyrat et al. 2001).Operonul egc conține și două pseudogene: ϕent1 și ϕent2 și se găsește frecvent la tulpinile de S. aureus izolate din probe clinice și alimente (Argudin, Mendoza et al. 2010). Genele acestui cluster sunt orientate în tandem și de obicei, se coexprimă (Blaiotta, Fusco et al. 2006). Locusul egc poate fi prezent la tulpini de S. aureus din diverse prelevate, în forma sa completă sau incompletă- atunci când lipsesc una sau mai multe gene (Thomas, Chou et al. 2007).

Până în prezent au fost descrise patru subtipuri diferite (Vicosa, Le Loir et al. 2013) ale acestui cluster (fig. 6):

egc1conținând selo, selm, seli, Ψent1, Ψent2, seln, seg;

egc2 conținând selo, selm, seli, selu, seln, seg;

egc3 conținând selov, selmv, seliv, seluv, selnv, segv

egc4 conținând sel,, selv, selu2, seln, seg

Fig.6 Alcătuirea subtipurilor clusterului egc (Argudin, Mendoza et al. 2010)

Aceste elemente genetice mobile (tabel 2) permit transferul orizontal al determinanților virulenței și rezistenței între tulpini și sunt responsabile de gradul ridicat de variabilitate al acestora (Shafer and Iandolo 1978).

Tabelul 2. Localizarea genelor codificând enterotoxinele stafilococice și proteinele enterotoxin-like – după (Hu and Nakane 2014) (Argudin, Mendoza et al. 2010); Sato'o et al., 2012, modificat

*egc = enterotoxin gene cluster (grupul de gene pentru enterotoxine)

1-5-5 Reglarea producerii de enterotoxine stafilococice

Sistemul agr (accessory gene regulator) este cel mai cunoscut și studiat locus ce cuprinde un grup de gene cu activitate quorum sensing ce regelează expresia mai multor factori de virulență.

Quorum sensing se referă la un mecanism de comunicare între bacterii prin intermediul căruia o bacterie poate percepe densitatea populațională într-un mediu, mecanism important pentru speciile genului Staphylococcus ce explică expresia factorilor de virulență doar în anumite faze ale creșterii bacteriene. Similar majorității factorilor de virulență ai S. aureus, producția de enterotoxine este de asemenea, coordonată de sistemul agr (Shopsin, Mathema et al. 2003), (Novick and Jiang 2003).

Acest sistem a fost secvențiat și clonat astfel încât se știe că este compus din doi operoni diferiți( Fig.7) și cuprinde cel puțin cinci gene: agrA, agrB, agrC, agrD și gena codantă pentru hemolizina delta (hld) (Peng, Novick et al. 1988) fiind controlat de doi promotori P2 și P3.

Operonul al cărui promoter este P2conține patru gene: agrA, agrB, agrC, agrD iar cel controlat de P3 conține doar gena hld. La nivelul locusului agr, doi promotori cu orientări opuse P2, respectiv P3 sintetizează două transcriptaze RNAII și RNA III. agrD secretă o componentă semnal iar agrA codifică un activator tranzitor. Sistemul semnal generat de agr este autoindus prin intermediul unei peptide auto-induse (AIP) codată de către agrD. Cele două componente principale secretate sunt denumite RNAII (agrA, agrB, agrC, agrD) și RNA III (hld). RNAIII actionează primul pentru inițierea transcrierii factorilor de virulență, agrC reprezintă semnalul receptor iar agrA este reglatorul răspunsului. Aceste gene sunt responsabile pentru producerea RNA III, principalul efector al răspunsului mediat de sistemul agr (Balaban and Novick 1995). RNA III cuprinde 510 nucleotide ce sunt responsabile pentru transcripția genelor pentru mai mulți factori de virulență (ex. toxine extracelulare, enzime și proteine de la suprafața celulară exprimate de S. aureus).

Sinteza RNA III începe atunci când concentrația polipeptidelor auto-induse atinge un anumit prag ce se detectează de obicei, la trecerea de la faza de creștere exponențială la faza staționară.În schimb, RNA II cuprinde patru gene agr (agrB, agrD, agrC și agrA) aranjate la nivelul unui singur operon. Acestea conlucrează pentru a induce sinteza RNA III.

În afara rolului reglator, RNA III este un ARNm ce codifică producția hemolizinei delta la stafilococi (Tegmark, Morfeldt et al. 1998), la S. aureus este un polipeptid format din 44 aminoacizi în timp ce la S. epidermidis conține doar 26 de aminoacizi.

Fig.7 Structura și funcția sistemului agr (Vasconcelos, Pereira et al. 2011)

Tulpinile de S. aureus pot fi impărțite în patru tipuri agr pe baza specificității între peptidele auto-induse și semnalul receptor (agrC) (Mayville, Ji et al. 1999). Tulpinile de stafilococi aparținând unui anumit grup agr sunt capabile să activeze răspunsul numai la bacteriile din același grup.

SarA este un factor de transcripție necesar expresiei RNA III ce stimulează, de asemenea, expresia anumitor gene fară interferența sistemului agr (Dunman, Murphy et al. 2001) în timp ce rot este principalul factor de transcripție pentru hla și alte exoproteine (McNamara, Milligan-Monroe et al. 2000).

Interacțiunea tuturor acestor sisteme demonstrează complexitatea reglării genelor accesorii la S. aureus. Au loc interacțiuni între aceste sisteme, amplificând sau diminuând semnalele și are loc o competiție pentru a reglarea expresiei unei gene prin evenimente de feedback pozitiv sau negativ. De exemplu, sistemul agr crește expresia alfa-hemolizinei în timp ce sistemul arlRS scade expresia aceleiași gene

În cazul enterotoxinelor, acestea fiind codificate de diverse elemente genetice, majoritatea mobile, nu toate sunt controlate de sistemul agr, astfel seb, sec și sed sunt agr dependente în timp ce genele sea și sej sunt agr-independente (Le Loir, Baron et al. 2003).

Sistemul reglator agr este principalul mecanism de control a expresiei factorilor de virulență ai S. aureus (Peng, Novick et al. 1988); (Vasconcelos, Pereira et al. 2011) iar activitatea acestuia este strâns legată de sistemul reglator accesor stafilococic sar (staphylococcal accessory regulator), divizat în sarA, sarS, sarT and sarR (Cheung, Koomey et al. 1992); (Ruzin, Lindsay et al. 2001) și de sistemul rot (repressor of toxins) (McNamara, Milligan-Monroe et al. 2000) ce poate influența în mod direct producția de enterotoxine. Însă, expresia majorității enterotoxinelor este controlată de sistemul agr.

Mai sunt descrise de asemenea, sistemele reglatorii saeRS, σB (sigma-B), arlRS și srrAB (Throup, Zappacosta et al. 2001); (Yarwood, McCormick et al. 2001).

1-5-5-1 Enterotoxinele clasice (SEA-SEE)

I Enterotoxinele codate de profagi (SEA și SEE)

Gena codanta pentru enterotoxina A se află la nivelul unui bacteriofag temperat, bacteriofagul se inserează la nivelul cromozomului bacterian ca și profag și se comportă ca și genomul bacterian, totuși în condiții nefavorabile de mediu (ex. anumite condiții de păstrare a alimentelor), profagul se replică odată cu genomul fagic și se eliberează noi bacteriofagi(Wallin-Carlquist, Cao et al. 2010; Wallin-Carlquist, Marta et al. 2010).

Există cel puțin șase tulpini de S. aureus al căror genom a fost secvențiat complet și care conțin profagi purtători ai genei sea: Φ252B, ΦMu3, ΦMu50A, ΦNM3, ΦSa3ms și ΦSa3mw, fiecare purtând frecvent gene codante pentru enterotoxina A, stafilokinaza și un inhibitor al complementului; s-a demonstrat, de asemenea că transcripția genei sea este legată într-o anumită măsură de ciclul de viață al profagului codant pentru SEA, spre deosebire de alte gene codante ale enetrotoxinelor stafilococice ce nu sunt situate la nivelul profagilor, cum ar fi seb, sec și sed (Goerke, Pantucek et al. 2009).

Gena see este situată la nivelul unui fag defectiv și spre deosebire de gena sea, expresia acesteia nu pare să fie afectată de fazele creșterii bacteriene (Derzelle, Dilasser et al. 2009).

II Enterotoxinele reglate de sistemul agr (seb, sec și sed)

Gena seb se găsește la nivelul unei insule de patogenitate (SaPI3), în timp ce genele codante ale enterotoxinei C și ale variantelor sale (C1, C3, C bovin), sunt situate la nivelul SaPI4, SaPIn1/m1și respectiv SaPIbov (Novick, Christie et al. 2010).

Gena sed este situată pe un plasmid de 27.6 kb pIB485 la tulpinile de S. aureus (Marta, Wallin-Carlquist et al. 2011). În ciuda faptului că sunt codificate de elemente genetice diferite, expresia genelor seb, sec și sed este optimă în momentul traziției de la faza exponențială la faza staționară iar conform pattern-ului specific proteinelor codificate de gene reglate de sistemul agr, genele seb și sec, localizate la nivelul insulelor de patogenitate (SaPI) sunt supuse unui control mult mai drastic decât gena plasmidică sed (Derzelle, Dilasser et al. 2009).

1-5-5-2 Enterotoxinele non- clasice (SEG–SElV)

Referitor la reglarea productiei enterotoxinelor noi descrise, studiile arată că expresia majorității genelor codante ale acestora nu sunt controlate de sistemul agr (Derzelle, Dilasser et al. 2009).

Transcripția genelor seh, ser și sel crește în faza post- exponențială, fapt explicabil prin posibila implicare a sistemului agr. S- a demonstrate că ARNm codant pentru seh este supus unui control mai drastic decât cel pentru ser și sel, iar activarea seh are loc mai devreme în ciclul de creștere decât genele codante ale enterotoxinelor clasice seb și sed controlate de sistemul agr, studiile arătând că producția maximă de SHE are loc la sfârșitul fazei exponențiale în timp ce SEB este produs mai ales în timpul fazei staționare (Sakai, Ihara et al. 2008); (Derzelle, Dilasser et al. 2009).

Nivelul transcripțional al celorlalte gene fie rămâne neschimbat în timpul creșterii bacteriene (sej, sek, seq, sep) sau descrește ușor după perioada de creștere exponențială (seg, sei, sem, sen, seo, seu). Majoritatea genelor care au un nivel nemodificat în timpul creșterii sunt codificate de fagi și probabil sunt reglate de procesele ce guvernează lizogenizarea, în schimb cele care scad ușor sunt codate de operonul egc (Pocsfalvi, Cacace et al. 2008).

Este încă neelucidat rolul acestor noi enterotoxine în producerea toxiinfecțiilor alimentare iar pâna în prezent doar SHE, SEG și SEI au fost detectate în alimente implicate în producerea unor astfel de izbucniri (Ikeda, Tamate et al. 2005).

1-6 Toxiinfecțiile alimentare (TIA) stafilococice

În România, Centrul Național de Supraveghere și Control a Bolilor Transmisibile din cadrul Institutului Național de Sănătate Publică, București a elaborat în 2011 metodologia pentru supravegherea focarelor de toxiinfecții alimentare cu scopul de a cunoaște incidența și caracteristicile focarelor din țara noastră și pentru elaborarea unui plan de măsuri de control și prevenire a acestor focare. Ghidul s-a raportat la cadrul legislativ national și european în vigoare astfel :

Legislatia romaneasca:

HG 589/2007 privind stabilirea metodologiei de raportare și de colectare a datelor pentru supravegherea bolilor transmisibile.

Ordin nr. 772/68/859/442 din 8 august 2005 al Ministrului agriculturii, pădurilor și dezvoltării rurale, președintele Autorității Naționale Sanitare Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor, Ministrului Sănătății si președintele Autorității Naționale pentru Protecția Consumatorilor pentru aprobarea Normei privind Sistemul rapid de alertă pentru alimente și furaje

Ordin MS Nr. 1069 din 31 august 2006 privind aprobarea componenței personalului desemnat din cadrul Ministerului Sănătății Publice și al Inspecțiilor Sanitare de stat județene și a municipiului București să participe la Sistemul rapid de alertă pentru alimente și furaje

Ordinul Ministrului Sănătății și al președintelui Casei Naționale de Asigurări de Sănătate nr. 1.591/1.110/2010 privind derularea Programelor Naționale de Sănătate pentru anul 2011- 2012, Programului Național de Monitorizare a factorilor determinanti din mediul de viață si muncă, Subprogramul 2 privind protejarea sănătății publice prin prevenirea îmbolnăvirilor asociate factorilor de risc alimentari și de nutriție , care are ca obiectiv: “protejarea sănătății și prevenirea îmbolnăvirilor asociate factorilor de risc alimentari” și ca activitate – Elaborarea metodologiilor de supraveghere la nivel național a sănătății în relație cu alimentul, pentru implementarea legislatiei în vigoare și pentru realizarea sintezelor naționale pct. C: „Rolul alimentului în izbucnirile de toxiinfecții alimentare din România”.

Ordinul MS nr. 824/2006 Normele privind organizarea și funcționarea Inspecției Sanitare de Stat

Ordinul MS nr.976/1998 pentru aprobarea Normelor de igiena privind producția, prelucrarea, depozitarea, păstrarea, transportul și desfacerea alimentelor

Ordinul MS 883/2005 privind aprobarea Metodologiei de alertă precoce si răspuns rapid în domeniul bolilor transmisibile prevede necesitatea investigării cu laboratorul a cazurilor de „diaree acută” care fac obiectul raportului de alertă.

Ordinul MS 1078/2010 privind aprobarea regulamentului de organizare și funcționare a Direcțiilor de Sănătate Publică județene și a municipiului București.

Legislatia europeana:

Decizia Comisiei Europene 2119/98/EC modificată prin Decizia Comisiei Europene 2007/875/CE, care stabilește necesitatea constituirii unei rețele europene de supraveghere a bolilor transmisibile, inclusiv a toxiinfecțiilor alimentare.

Toxiinfecțiile alimentare (TIA) cuprind un grup mare de îmbolnăviri, care apar sporadic sau epidemic, determinate întotdeauna de consumul alimentelor contaminate cu microorganisme patogene și/sau toxinele acestora. TIA presupune ingerarea unui aliment contaminat în care patogenii sau produsele lor metabolice toxice s-au multiplicat realizând concentrații foarte mari, pe de o parte, iar pe de altă parte, consumul alimentului în cantități relativ mari (ISP București- TIA).

Definițiile de caz furnizate de aceeași instituție, în ” Metodologie supraveghere TIA- 2011” sunt următoarele:

caz izolat/sporadic – persoană care prezintă semne clinice de boală apărută după consumul unui aliment contaminat, fără legatură epidemiologică cu alte cazuri. Este rar, adesea face parte dintr-un focar încă neidentificat.

focar de TIA: grup de 3 sau mai multe persoane care prezintă simptome clinice asemănătoare în urma consumului aceluiași aliment contaminat.

caz confirmat este definit ca: orice persoană care întrunește criteriile clinice (simptomatologie digestivă și/sau neurologică însoțită sau nu de simptome cardiovasculare) și de laborator (izolarea aceluiași agent patogen din materii fecale, lichid de vărsătură sau sânge și, respectiv, din alimentul consumat)

Toxiinfecțiile alimentare stafilococice sunt intoxicații rezultate în urma consumului de alimente ce conțin o cantitate suficientă de enterotoxine preformate (Argudin, Mendoza et al. 2010), (Dinges, Orwin et al. 2000), (Le Loir, Baron et al. 2003) produse de tulpini enterotoxigene de stafilococi coagulazo-pozitivi, în special Staphylococcus aureus (Hennekinne, Ostyn et al. 2010), și foarte rar de alte specii de stafilococi coagulazo-negativi cum ar fi Staphylococcus intermedius (Genigeorgis 1989).

Simptomele acestei toxiinfecții au un debut brusc la 2-8 h de la ingestia alimentelor contaminate și sunt reprezentate de: greață, vărsături abundente, crampe abdominale cu sau fără diaree (Balaban and Rasooly 2000), (Murray 2005) și pot fi determinate de cantități foarte mici de enterotoxine (20-100 nanograme).

Aceste enterotoxine au proprietatea de a rezista la condițiile de mediu ce distrug de obicei bacteria ( tratament termic, pH scăzut ) și la activitatea proteolitică a enzimelor digestive, astfel explicându-se activitatea lor la nivelul tractului digestiv (Mauff, Rohrig et al. 1983).

Aceaste afecțiuni sunt de obicei auto- limitante, simptomele dispărând la 24-48 h de la debut. Sunt raportate rare cazuri cu evoluție severă care să necesite spitalizare, în special la copii, bătrâni sau persoane cu imunitatea deprimată (Murray 2005).

Incidența reală a acestei afecțiuni este probabil subestimată cel mai probabil datorită subdiagnosticării cazurilor, neraportării focarelor cu număr mic de cazuri, recoltării necorespunzătoare a probelor sau datorită diagnosticului de laborator incorect.

Cinci condiții trebuie să fie îndeplinite pentru a induce o izbucnire de TIA stafilococică (Hennekinne, De Buyser et al. 2012):

1-o sursă care să conțină stafilococi enterotoxigeni: materii prime, purtători sănătoși sau infectați

2- transferul stafilococilor de la sursă la aliment: ustensile de bucătărie insuficient curățate datorită unor practici de igienă precare

3- alimente cu proprietăți fizico-chimice favorabile dezvoltării S. aureus și toxinogenezei

4- temperatură optimă de dezvoltare a bacteriilor și/ sau timp suficient pentru producerea toxinelor

5- ingestia alimentului conținând o cantitate suficientă de toxină care să provoace simptomatologia caracteristică.

1-6-1 Istoric

Prima descriere a unei toxiinfecții alimentare determinată de consumul de brânză contaminată cu stafilococi, datează din 1884 și a fost realizată de către Vaughan și Sternberg, Michigan (SUA) (Hennekinne, De Buyser et al. 2012). Ulterior, în 1894, Denys a atribuit prezenței stafilococilor piogeni, simptomele caracteristice unei intoxicații apărute într-un episod familial, determinat de consumul de carne de la o vacă ce prezenta un sindrom febril determinat de o mastită iar în 1907, Owen a izolat stafilococi din carnea de vită uscată ce a fost cauza unui focar de toxiinfecție alimentară (Dack 1937).

Ulterior, dovada implicării stafilococilor în toxiinfecțiile alimentare a fost adusă de Barber în anul 1914, ce a descoperit că laptele provenit de la o vacă cu mastită, păstrat nerefrigerat a cauzat boala, Barber fiind primul autor ce a corelat intoxicația alimentară cu o toxină produsă de stafilococi.

În afara focarelor familiale sunt descrise, de asemenea, izbucniri ce implică un număr mare de persoane: în 1922, Baerthlein a raportat, în timpul Primului Război Mondial, un focar de 2000 de soldați din armata germană cu simptomatologie caracteristică toxiinfecțiilor alimentare stafilococice: debut la 2-3 ore de la consumul unor cârnați, cu simptome de gastroenterită severă ”asemănătoare holerei” ce au necesitat îngrijiri medicale și cu consecințe militare grave (Hennekinne, De Buyser et al. 2012).

În 1930, Dack, descriind un focar de 11 indivizi ce au consumat un desert, a folosit pentru prima dată termenul de “enterotoxină” și a subliniat faptul că aceasta este produsă de o tulpină de "Staphylococcus galben hemolitic". Filtrate celulare ale acestei tulpini au fost administrate intravenos la iepuri și oral la trei voluntari umani. Iepurele a murit după ce a prezentat inițial scaune diareice apoase iar cei trei voluntari au prezentat greață, un sindrom pseudo-gripal și vomă la 3 ore de la ingestie. În același an, Jordan a arătat că diverse tulpini de stafilococi produc o substanță care după ce este purificată și administrată oral, determină patologie gastro-intestinală (Hennekinne, De Buyser et al. 2012).

Câțiva ani mai târziu, în 1934, Jordan și Burrows au descris nouă izbucniri legate de prezența stafilococilor în resturile alimentare iar Dolman (Dolman 1934) a explicat că:

” substanța ce determină toxiinfecția alimentară este probabil produsă doar de câteva tulpini de stafilococi și că acestă substanță este un metabolit special a cărei formare și excreție sunt favorizate de condițiile de mediu din laborator cum ar fi mediul semi-solid și procentul crescut de dioxid de carbon din atmosferă, condiții ce favorizează creșterea abundentă și creșterea permeabilității celulare”.

Denison, în 1936, a descris unul dintre cele mai bine documentate cazuri de izbucniri de toxiinfecție alimentară stafilococică (Denison 1936) ce a afectat 122 elevi de liceu ce consumaseră un desert cu smântână. Tabloul clinic descris a fost reprezentat de:

– greață apărută la 2-4 ore de la ingestia alimentului incriminat,

– crampe abdominale severe urmate de episoade de vărsături ce au apărut la 5-20 minute interval și care au continuat timp de 1-8 ore,

– diareea (1-7 scaune apoase) a început odată cu vărsăturile și a continuat timp de câteva ore

– nici unul dintre elevi nu a prezentat febră,

– manifestările generale descrise au fost: tahicardia, transpirațiile reci și o stare de prostrație, cefalee și mialgii prezentate de majoritatea elevilor, unii dintre ei au prezentat o stare de deshidratare severă,

– simptomele au persistat 1-8 ore,

– recuperarea a fost completă în 1-2 zile.

Simptomatologia toxiinfecțiilor alimentare stafilococice a fost studiată intens și de personalul spacializat al armatei SUA în cadrul unui focar de 400-600 de cazuri descris de către DeLay (1944).

Alte episoade de toxiinfecții alimentare au fost semnalate după sfârșitul celui de-al doilea Război Mondial, ex. Brink și Van Metter (1960) au descris un focar de aproximativ 1100 de persoane ce consumaseră sandwichuri cu șuncă depozitate în condiții necorespunzătoare.

În țara noastră Nestorescu și Popovici (Nestorescu, Popovici et al. 1970) au raportat o incidență a toxiinfecțiilor alimentare stafilococice de 17% din totalul izbucnirilor semnalate până în 1950 iar Ieniștea și col. (1957) o incidență de 13% printre izbucnirile apărute între anii 1950-1956 (Alexenco Ecaterina- teza de doctorat – 1965). În două izbucniri studiate de Combiescu, Nestorescu, Popovici și Nicolescu morbiditatea a fost de 38% și respectiv 18,2% iar în cele studiate de Cornelson (1951) și Stămbuloiu de 76% și respectiv 40% (Bărzoi, Meica, Neguț, 1999), cercetări referitoare la toxiinfecțiile alimentare stafilococice fiind raportate de Codiță și col. (Codita 1985).

1-6-2 Situația actuală

În Europa, Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentelor (EFSA) a raportat în 2011 un număr de 5.550 de focare de toxiinfecții alimentare ce au afectat aproape 49.000 de persoane și au cauzat 46 de decese. Dintre acestea 293 de focare au fost determinate de Staphylococcus spp. și de toxine bacteriene (produse de specii de Bacillus, Clostridium și Staphylococcus).

Conform raportului din 2014 al aceluiași organism despre situația din anul 2012 și pe baza raportărilor primite din 52 de țări participante, membre ale Uniunii Europene, inclusiv Romania, cele 5364 de focare raportate au afectat 55453 de persoane, 346 de focare având etiologie stafilococică și au afectat 497 de persoane, 88 de persoane necesitând spitalizare dar nefiind înregistrat nici un deces (EFSA report, 2014).

În SUA se estimează că în fiecare an, toxiinfecțiile alimentare afectează 6-80 milioane de persoane, deteminând 325.000 de spitalizări, până la 9.000 de decese și costuri de aproximativ 50-80 bilioane de dolari USD (Scharff 2012) reflectate în costuri de spitaliazare, scăderea productivității și implicit a calității vieții. Se estimează că toxiinfecțiile alimentare stafilococice ar cauza 241.000 de îmbolnăviri/an în SUA iar fiecare caz ar necesita 695$ ceea ce face ca toxiinfecțiile alimentare să fie recunoscute de Institutul de Medicină din SUA ca una dintre prioritați ”high priority”

În China, între 2008-2010 au fost raportate 371 de focare de toxiinfecții alimentare ce au implicat 20.062de indivizi și care au determinat 41 de decese iar între 2003 și 2007 au fost raportate 94 de focare de toxiinfecții alimentare stafilococice ce au implicat 2.223 de persoane și care au necesitat 1.186 de spitalizări (Yan, Wang et al. 2012).

În țara noastră, conform ultimelor raportări ale Institutului National de Sănătate Publică, București, incidența toxiinfecțiilor alimentare stafilococice variază astfel:

2010- 27,6%

2011- 4,31%

iar în anii 2012 și 2013 o incidență în jur de 10%, Staphylococcus aureus ocupând poziția a doua în etiologia toxiinfecțiilor, după Salmonella spp. (www.insp.gov.ro/cnscbt metodologii – Rapoarte anuale 2011, 2012, 2013).

1-6-3 Noțiuni de epidemiologie

Rezervoare și mijloace de contaminare

Staphylococcus aureus face parte din microbiota tegumentelor și mucoaselor la mamifere și păsări astfel încât poate fi diseminată în mediu și poate supraviețui pentru perioade lungi de timp (Hennekinne, Ostyn et al. 2010), chiar și în condiții mai puțin favorabile.

Au fost descrise mai multe biotipuri izolate de la diverse gazde (umană, păsări de curte, bovine, ovine/ caprine) care demonstrează marea lor capacitate de adaptare. Pentru încadrarea în aceste biotipuri se folosesc patru teste biochimice (staphylokinaza, producerea de β hemolizină, coagularea plasmei bovine și creșterea pe cristal- violet agar) conform schemei descrise de Devriese (Devriese, Nzuambe et al. 1984). Totuși multe tulpini nu pot fi încadrate în aceste biotipuri strict legate de gazdă și aparțin unor biotipuri non- specifice (nonhost-specific- NHS biotypes) sau sunt asociate cu mai multe gazde. Această schemă de biotipare a fost folosită cu success în estimarea originii microorganismelor din diverse produse alimentare (Devriese, Schleifer et al. 1985), (Rosec, Guiraud et al. 1997) sau în investigații epidemiologice ale focarelor de toxiinfecții alimentare (Hennekinne, Kerouanton et al. 2003), dar în prezent testele moleculare sunt utilizate din ce în ce mai des pentru a analiza sursa contaminării (animale sau umane) în cazul unei izbucniri epidemice (Chiou, Wei et al. 2000), (Ostyn, De Buyser et al. 2010).

Întrucât portajul la nivel tegumentar și/ sau nazal de S. aureus poate ajunge la 50- 60% în comunitate (Kluytmans and Wertheim 2005), persoanele ce manipulează alimentele și care sunt purtătoare de tulpini enterotoxigene de S. aureus sunt considerate principala sursă a contaminării.

Contaminarea se datorează atât unei manipulări incorecte a alimentelor procesate, igienei deficitare cât și unui managementul defectuos în cadrul fermelor (Argudin, Mendoza et al. 2010) (ex. păstrarea laptelui în condiții ce permit multiplicarea stafilococilor și producerea de enterotoxine).

Indivizii bolnavi sau purtătorii sănătoși reprezintă sursa cea mai importantă de contaminare a alimentelor. Infecțiile cutanate, furunculele, panarițiile, piodermitele, eczemele, tăieturile infectate și alte leziuni supurative deschise ca și infecțiile căilor respiratorii și digestive superioare (corize, laringite, faringite) sunt deseori cauzate de S. aureus care se elimină în mediul extern și poate contamina alimentele prin contact direct, tuse, strănut sau prin simpla expirare.

Purtătorii nazo-faringieni reprezintă sursa cea mai frecventă de contaminare a alimentelor deoarece ei nu se cunosc și trebuie depistați prin teste de screening, care de regulă, la producătorii și manipulatorii de alimente din unitățile specializate se execută la intervale foarte mari de timp sau numai în cadrul unor anchete epidemiologice. Personalul care gătește în gospodăriile proprii nu este inclus în asemenea controale decât în cazul apariției unor îmbolnăviri prin consum de alimente. De asemenea, indivizii pot fi purtători de stafilococi la nivelul tractului digestiv și pot contamina alimentele prin fecale (Codita 1985), Bărzoi, Meica, Neguț, 1999).

Animalele bolnave sau purtătoare de stafilococi reprezintă, de asemenea, o sursă importantă de contaminare a alimentelor, dar această sursă are o semnificație mult mai mică în producerea TIA decât omul.

S. aureus poate fi prezent în produsele de origine animală, poate contamina laptele de origine bovină sau ovină, mai ales dacă animalele prezintă mastite, chiar la nivel subclinic (Endo, Yamada et al. 2003). Aceste vaci elimină prin lapte, în timpul bolii și mult timp după aceea, cantități foarte mari de stafilococi iar laptele lor reprezintă un real pericol pentru sănătatea publică. Cazul celor doi copii menționați de Bergdoll (Bergdoll 1989), decedați în urma consumului de lapte provenit de la o capră cu mastită este destul de concludent.

O altă cauză posibilă a existenței unui număr mare de stafilococi în lapte este, în afară de mai sus amintita sursa -excreția de la animalele bolnave, prin manipularea incorectă și în timpul procesării laptelui crud (Peles, Wagner et al. 2007).

Fooladi et al. (2010) a raportat un procent de 32% din produsele lactate contaminate cu S. aureus în timp ce Algero et al. (2007), analizând 172 eșantioane de produse alimentare, inclusiv lapte, brânză proaspătă, brânză telemea, înghețată, iaurt, și produse fast-food ( sandwich-uri) într-o piață din Brazilia a raportat 26 (15,1%) de probe contaminate cu S. aureus. În 2008, Rall et al. a găsit un procent de 70,4% din probele de lapte de bovine crud și pasteurizat contaminat cu S. aureus în timp ce Dastmalchi Saee et al. (2009) evaluând 370 probe de lapte de vacă și folosind metode fenotipice și moleculare (PCR) au raportat contaminarea a 58 de probe (15,67%) cu S. aureus.Prezența acestui microorganism și după pasteurizare se poate datora ineficienței procedeului termic (Rall, Vieira et al. 2008).

Dintre speciile de stafilococi coagulazo-negativi cel mai frecvent izolate din probe de lapte provenite de la animale cu mastită au fost: S.chromogenes și S.simulans așa cum se arată într-un studiu efectuat în SUA, (Matthews, Oliver et al. 1991) în Germania fiind raportate aceleași specii S. chromogenes (33%) și S. simulans (23%) (Luthje and Schwarz 2006).

Speciile S. hyicus, S. epidermidis și S. haemolyticus au fost izolate în diverse probe (Devriese and De Keyser 1980); (Jarp 1991) (Aarestrup, Andersen et al. 1995); (Chaffer, Leitner et al. 1999); (Luthje and Schwarz 2006) în timp ce S. warneri, S. sciuri și S. xylosus sunt destul de rar izolate din produsele lactate (Rather, Davis et al. 1986); (Waage, Mork et al. 1999); (Luthje and Schwarz 2006). Într-un studiu din 2011 desfășurat în Portugalia, Soares et al. (Soares, Marques et al. 2011) a raportat izolarea într-un procent de 14,3% a speciei S.epidermidis ce contamina produsele lactate iar Cunha et al. (2006) a raportat că specia S.epidermidis a fost izolată din alimente în Brazilia, într-un procent de 40% .

Aerul, particulele de praf sau suprafețele pot contribui, de asemenea, la transferul S. aureus pe suprafața alimentelor (Codita 1985). Astfel, ustensilele de bucătărie, insuficient protejate și curățate, pot oferi condiții de vehiculare și contaminare cu diferiți germeni și prin urmare și cu stafilococi.

Alimentele frecvent incriminate în producerea toxiinfecțiilor alimentare stafilococice variază de la o țară la alta, probabil datorită obiceiurilor alimentare diferite (Le Loir, Baron et al. 2003), totuși cele mai frecvent raportate sunt: carnea și produsele din carne, ouă și produse din ouă, lapte și produse din lapte, produse de patiserie și prăjituri umplute cu cremă, înghețată, salate, ciuperci și diverse umpluri pentru sandwich, pește și produse din pește, produsele sărate, ex. șunca au fost de asemenea raportate ca fiind implicate în producerea TIA stafilococice.

Prezența S. aureus în aliment permite multiplicarea rapidă a acestor microorganisme prin expunerea la o temperatură favorabilă (Schelin, Wallin-Carlquist et al. 2011). Toxigeneza este amplificată de următorii factori: medii/ alimente cu conținut proteic ridicat, pH neutru, absența florei de inhibiție.

Prezența glucozei in mediile de cultivare are un rol stimulator asupra multiplicării stafilococilor, dar aceasta nu trebuie adăugată în cantitate mare (0,2%), producția de toxină fiind maximă după epuizarea glucozei din mediu, când aciditatea mediului începe să fie tamponată de alți produși metabolici din mediu (Bărzoi, Neguț, 1999). În afara compoziției mediilor de cultură, multiplicarea și producerea de enterotoxine de către S. aureus mai este influențată și de temperatură, valoarea aw, pH (tabel 3).

S. aureus se poate multiplică la valori ale temperaturii cuprinse între 10°C și 48°C, cu un optimum între 35-37°C (Schelin, 2011). S- a observat că elaborarea de SEB are loc în cantitate mai mică la16 °C (10-20 µg/ ml), față de cea produsă la 37 °C (340 µg/ ml), la densități microbiene egale.

Majoritatea tulpinilor de stafilococi cresc la valori ale pH între 4 și 10 cu un optim între 6 și 7, valoarea pH- ului la care o tulpină crește depinde de tipul de mediu, concentrația de NaCl, mărimea inoculului și atmosfera de incubare. Producerea optimă a SEB s-a constatat la pH7-7,5, la un pH de 6 și 8 aceasta scăzând în mod considerabil. În 1983 Smith et al. (Smith, Benedict et al. 1983) au demonstrat că în condiții aerobe pH minim pentru multiplicare și toxinogeneză a fost de 4, în timp ce în condiții anaerobe s-a situate între 4,6 și 5,3. Producerea enterotoxinelor în alimente depinde de pH-ul lor. Nivelele de pH sunt mai restrictive pentru producerea enterotoxinelor decât pentru multiplicarea bacteriei. SEA, SEB, SEC și SED pot fi produse în multe alimente cu pH 5,5-6,6 dar nu și în cele cu pH 5.

Spre deosebire de alți patogeni alimentari, S. aureus se poate dezvolta la valori ale aw cuprinse între 0,86 și 0,99 în condiții aerobe (Smith, Benedict et al. 1983). Enterotoxinele SEA și SED sunt produse la valori ale aw ce permit creșterea S. aureus, în timp ce enterotoxinele SEB și SEC sunt foarte sensibile la scăderea valorii acestui parametru, acestea fiind produse la o valoare a aw de 0,93 (Shebuski, Vilhelmsson et al. 2000). Thota et al. (1973) a evidențiat faptul că enterotoxina SEE a fost produsă într-un mediu cu un conținut de 10% NaCl (echivalentul aw de 0,92) (Ewald and Notermans 1988).

1-6-4 Enterotoxine implicate in producerea TIA

Dintre enterotoxinele clasice, enterotoxina A este cea mai frecvent descrisă ca fiind implicată în producerea TIA probabil și din cauza rezistenței sale extraordinare la acțiunea enzimelor proteolitice (Balaban and Rasooly 2000); (Argudin, Mendoza et al. 2010).

Studiile referitoare la analiza tulpinilor izolate din focare de TIA în Asia în perioada 2001-2003 au demonstrat, că sea a fost gena cea mai frecvent implicată, urmată de genele seb și sec (Chiang, Liao et al. 2008). În Coreea, aproximativ 90% dintre tulpinile izolate din TIA sunt raportate ca purtatoare ale genei sea (Cha, Lee et al. 2006).

În Japonia, enterotoxina A a fost cel mai frecvent implicată în producerea TIA (Shimizu, Fujita et al. 2000). În anul 2000, un focar de peste 1000 persoane a fost determinat de consumul de produse lactate conținând enterotoxina A (Asao, Kumeda et al. 2003) iar în anul 2009 un alt focar descris de Kitamoto et al. (Kitamoto, Kito et al. 2009) a fost declanșat de enterotoxinele A și C.

Enterotoxinele clasice B, C și D sunt descrise ca fiind implicate în producerea toxiinfecțiilor alimentare (Kerouanton, Hennekinne et al. 2007); enterotoxina stafilococică B fiind studiată și pentru potențialul său de a fi utilizată ca armă biologică (Ler, Lee et al. 2006).

În SUA a fost descris un focar familial ce a afectat trei membri ai unei familii ce consumaseră salată de varză contaminată cu enterotoxina C produsă de o tulpină comunitară de S. aureus rezistent la meticilină de la un purtător asimptomatic din sectorul alimentar ce manipulase acest aliment (Jones, Kellum et al. 2002).

De asemenea, s-a demonstrat că enterotoxina D, în cantități mici, poate produce toxiinfecții alimentare iar enterotoxina E a fost implicată mai rar în producerea TIA. Totuși, la sfârșitul anului 2009, șase focare de TIA din Franța (Pinchuk, Beswick et al. 2010) au fost cauzate de SEE din brânză produsă din lapte nepasteurizat. Această enterotoxină a fost de asemenea asociată cu TIA în SUA și UK (Ostyn, De Buyser et al. 2010).

Dintre enterotoxinele noi a căror capacitate emetică a fost demonstrată doar SEG, SHE și SEI au fost asociate cu focare de TIA (Chen, Chiou et al. 2004), (Ikeda, Tamate et al. 2005).

Spre deosebire de enterotoxinele clasice, rolul celorlalte enterotoxine și al proteinelor enterotoxin- like nu este încă pe deplin înțeles, deși ultimele studii arată că acestea pot avea un rol important în producerea TIA(Coldea, 2015); multe cercetări arătând prezența doar a genelor codante pentru aceste enterotoxine la tulpini de S. aureus izolate din focare de TIA (Omoe, Hu et al. 2013).

McLauchlin (McLauchlin, Narayanan et al. 2000) a arătat în cazul a 23 de tulpini de S. aureus implicate în producerea unui focar de toxiinfectie alimentară în UK absența genelor codante pentru enterotoxinele clasice, în schimb, prezența uneia sau mai multor gene codante pentru enterotoxinele noi descoperite sau pentru proteinele enterotoxin-like ex: seg, seh, sei sau selj. Acest lucru sugerează faptul că rolul acestora nu poate fi ignorat.

Prezența genelor grupate în clusterul egc a fost relatată de mulți cercetători la izolate de S. aureus din focare de TIA (Martin, Fueyo et al. 2004); (Jorgensen, Mork et al. 2005) ; Bania (Bania, Dabrowska et al. 2006).

De asemenea, există raportări multiple despre potențialul enterotoxigen al speciilor de stafilococi coagulazo- negativi: S. epidermidis, S. xylosus, S. cohnii, S. haemolyticus, S. hominis, S. intermedius (da Cunha Mde, Calsolari et al. 2007), genele frecvent evidențiate fiind sea, seb și sec.

1-6-5 Impactul factorilor de mediu asupra producerii enterotoxinelor stafilococice

Toxiinfecțiile alimentare stafilococice sunt adesea asociate cu multiplicarea S. aureus în alimente bogate în proteine​​ (carne și produse lactate), aceste produse reprezentând matrici foarte complexe, în ceea ce privește conținutul microbian, concentrația de sare, pH, conținutul de substanțe nutritive, disponibilitatea oxigenului și a temperaturii (Valero, Perez-Rodriguez et al. 2009).

De obicei, multiplicarea S. aureus în alimente este asociată cu producerea de enterotoxine dar studiile efectuate de Wallin-Carlquist (Wallin-Carlquist, Cao et al. 2010) au demonstrat producerea toxinelor in culturi celulare non-replicative.

Mai multe studii s-au efectuat pentru a identifica parametrii cheie ce influențează scăderea sau creșterea producerii de enterotoxine stafilococice în medii artificiale sau în diverse alimente. Concluziile acestora au fost că reglarea producției de enterotoxine este plurifactorială, existând o strânsă corelație între factorii de mediu și factorii genetici așa cum reiese din tabelul 4 (Schelin, Wallin-Carlquist et al. 2011).

Producerea enterotoxinelor necesită perioade lungi de incubare (20 h) iar expresia acestora este influențată de o multitudine de factori: pH, temperatură, concentrația în diversele substanțe nutritive ale substratului (tabel 3).

Tabel 3. Factorii ce influențează multiplicarea S. aureus și formarea enterotoxinelor (Schelin, Wallin-Carlquist et al. 2011)

1-7 Rezistența la antibiotice la tulpinile enterotoxigene de S. aureus

Rezistența la antimicrobiene (AMR) este o preocupare majoră de sănătate publică, determinând creșterea morbidității, a riscului de deces și a costurilor spitalizării, putându-ne întoarce în timp în era pre-antibiotice. Apariția rezistenței este îngrijorătoare și explicabilă prin utilizarea irațională a antibioticelor în scop profilactic sau terapeutic și prin utilizarea antibioticelor ca promotori de creștere în agricultură și/ sau aquacultură.

Lanțul alimentar reprezintă un element important în transmiterea rezistenței la antibiotice fie ca urmare a resturilor de antibiotice din produsele alimentare, fie prin transferul de microorganisme rezistente sau prin ingestia de tulpini rezistente ale microflorei alimentare originale și transferul rezistenței la microorganismele patogene (Fig.8).

Măsura interzicerii utilizării antibioticelor ca promotori de creștere în Europa a fost aprobată în 2006 și se tinde spre o extindere a colaborării interdisciplinare legate de sănătatea oamenilor, animalelor și mediului conform conceptul "One Health" astfel:

În 2005 – OMS, Organizația Agriculturii și Alimentelor (FAO) și Organizația Mondială pentru Sănătatea Animalelor (OIE) conlucrează în studiul AMR,

În 2008 – în cadrul OMS se creează un grup consultativ privind supravegherea integrată a rezistentei la antimicrobiene pentru minimizarea efectului negativ asupra sănătății publice, a rezistenței la antibiotice asociate cu utilizarea de antibiotice în hrana animalelor ( OMS Europa, 2011)

În 2012, Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentelor (EFSA) recomandă o monitorizare atentă a prevalenței MRSA la animale și în lanțul alimentar.

Fig.8 Transferul microorganismelor rezistente la antibiotice (WHO, 2011)

Determinanții rezistenței la S. aureus sunt situați pe elemente genetice mobile, în special plasmide, transpozomi, iar rezistența la meticilină și la alți compuși β- lactamici (MRSA), se datorează unei mari familii de inserții cromozomale ce aparțin unei insule cromozomale, descrisă ca insulă de rezistență. Insulele de patogenitate (SaPIs) și caseta cromozomală ce conține insulele de rezistență la meticilină (SCCmecs) reprezintă cele mai bine caracterizate elemente genetice mobile, responsabile pentru tranferul orizontal al superantigenelor și al anumitor determinanți ai rezistenței. Este un lucru remarcabil cum SaPIs poartă doar determinanți superantigenici iar SCCmec doar determinanți ai rezistenței (Ortega et al., 2010).

Mai mulți cercetători au analizat prevalența genelor codante ale enterotoxinelor la tulpini sensibile și rezistente de S. aureus. Astfel, Sila et al. (2009) a găsit 7 gene mai frecvent izolate la tulpinile de MRSA: sea, seb, sed, seg, sei, sej și eta ce codifică pentru enterotoxinele A, B, D, G, I, J și pentru exfoliatina A, față de tulpinile de MSSA la care s-au izolat mai frecvent următoarele gene: pvl, tst și sec, genele codante pentru leukocidina Panton-Valentine, TSST-1 și enterotoxina C. Totuși rolul și sursa contaminării alimentelor este încă neclară deoarece există prea puține rapoarte despre prezența și posibila sursă a MRSA în produsele alimentare.

Implicarea MRSA în producerea toxiinfecțiilor alimentare stafilococice a fost raportată pentru prima dată de către Jones (Jones, Kellum et al. 2002) care a descris un focar familial apărut după consumul de salată de varză contaminată de un purtător asimptomatic ce a manipulat hrana. Simptomele gastro-intestinale caracteristice au fost produse de o tulpină comunitară de MRSA producătoare de enterotoxină C, izolată în coprocultura celor 3 membri ai familiei afectate, din alimentul suspectat și din exsudatul nazal al persoanei ce a manipulat hrana.

Într-un alt studiu desfășurat în Franța, Kerouanton (Kerouanton, Hennekinne et al. 2007) a raportat 2 tulpini de MRSA din 33 izolate testate, dar studiile despre implicarea MRSA în producerea TIA stafilococice sunt totuși puține.

1-8 Rolul potențial al enterotoxinelor stafilococice ca agenți de bioterorism

Enterotoxina stafilococică B este recunoscută ca agent potențial de bioagresiune, facând parte din categoria B a agenților de bioterorism conform clasificării propuse de CDC. Această clasă cuprinde agenți cu anumite caracteristici ( www.emergency.cdc.gov/agent/agentlist.asp.)

sunt ușor de diseminat

determină rate medii de morbiditate și rate scăzute de mortalitate

sunt dificil de diagnosticat/identificat în stadiile inițiale necesitând o îmbunătățire specifică a capacității de diagnostic și întărirea sistemelor de supraveghere

În timpul Războiului Rece, SEB se găsea în depozitele armatei SUA, beneficiind de un interes particular, datorită ușurinței de obținerea a acestei toxine (din supernatantul de cultură al tulpinilor de S. aureus producătoare de SEB), stabilității acesteia și posibilității de utilizare sub formă aerosolizabilă. Cantități foarte mici de enterotoxină (0.004 μg/kg) pot provoca simptome debilitante iar o doză de 0.02 μg/kg poate fi chiar letală (Weng, Komisar et al. 1997). Modelul animal pentru studiul afecțiunilor poduse de administrarea SEB pe cale inhalatorie este reprezentat de specia Macaca mulatta dar sunt descrise și efectele asupra oamenilor prin expunere accidentală a personalului din laborator.

Inhalarea SEB determină dificultate în respirație și dureri retrosternale ce apar la câteva ore post-expunere. Expunerea la doze mari, poate determina însă simptomatologie severă: febră asociată sau nu cu mialgii, edem pulmonar, sindrom de detresă respiratorie acută sau șoc toxico- septic (Rajagopalan, Smart et al. 2006) astfel fiind descrisă situația în care primatele imunizate cu microsfere conținând SEB, au dezvoltat sindrom de șoc toxic la 48 de ore după expunere.

În cadrul Programului “Offensive Biological Warfare Program” (Rusnak, Kortepeter et al. 2004), (http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol10no9/04-0250.htm) au avut loc trei expuneri accidentale ale personalului din laboratoare la aerosoli cu SEB, astfel:

în 1963, nouă persoane au fost expuse la aerosoli conținând SEB, prin deteriorarea unui dispozitiv folosit în laborator pentru aerosolizare; două dintre acestea au prezentat febră, cefalee și manifestări gastro-intestinale, care însă au dispărut după 72 de ore.

într-un alt incident, ce a avut loc tot în anul 1963, persistența enterotoxinei în blana maimuțelor a fost explicația apariției manifestărilor clinice la cinci din cele șapte persoane dintr-un laborator în care se desfășurau experimente. Simptomele prezentate de cei cinci au fost: febră, tuse uscată, dispnee, dureri retrosternale, diaree și vărsături, patru dintre acestea necesitând spitalizare.

cel de-al treilea incident din cadrul acestui program a avut loc în 1964, fiind expuse 15 persoane, 10 dintre acestea prezentând aceleași manifestări clinice ca și în incidentele anterioare, 9 necesitând spitalizare. Evoluția acestor cazuri a fost favorabilă cu dispariția simptomelor în 3-5 zile.

Dintre modalitățile de bioagresiune, calea aeriană (prin aerosoli) este considerată cea mai eficientă cale de dispersie, calea digestivă, preponderent alimentară sau prin apa de băut, fiind considerată a doua cale majoră de diseminare.

Chiar dacă se presupune că arealul teoretic este mult mai restrâns în ceea ce priveste calea digestivă, alimentul crează, totuși, ipotetic, premisele unei agresiuni de mare amploare. Astfel, într-un studiu desfășurat între 1900-2001, Wiser și col. (Codiță, Neguț, POSTDRU, 2013) semnalează că din 82 de acte criminale și bioteroriste, 28 au fost induse prin alimente sau apă de băut și doar 2 prin diseminare de aerosoli (Wiser, Balicer et al. 2007).

Nu există tratament specific în cazul folosirii SEB ca agent de bioagresiune ci doar tratament simptomatic și de reechilibrare hidroelectrolitică iar în cazurile severe, monitorizare în unități de terapie intensivă și, dacă este necesar, asistare respiratorie mecanică.

În pofida faptului că, riscul de mortalitate prin expunere la SEB este destul de scăzut, încă din 1960 se studiază modalități de obținere a unor vaccinuri eficiente care să asigure titruri protectoare de anticorpi anti- enterotoxină B. Astfel în SUA, în 1960 a fost dezvoltat un vaccin ce conținea enterotoxină B inactivată prin tratare cu formalină cu eficacitate dovedită în studiile in vivo, pe model animal, dar care nu a fost aprobată pentru uz uman. Au mai fost dezvoltate variante pentru administrare subcutanată și 30 de ani mai târziu o variantă cu administrare intramusculară, ambele asigurând un răspuns protector și fără efecte adverse majore (Silverman, Moore et al. 1969), (Tseng, Komisar et al. 1995). Varianta de vaccin cu administrare intranazală a indus însă, un răspuns slab din partea organismului. Din 2003, sunt raportate încercări de dezvoltare a unor vaccinuri folosind proteine recombinate care să nu exprime capacitatea toxică dar să fie suficient de imunogene astfel încât să asigure titruri eficiente de anticorpi anti-enterotoxină B (Boles, Pitt et al. 2003).

1-9 Metode de detectare a enterotoxinelor stafilococice

Diagnosticul toxiinfecției alimentare stafilococice (Hennekinne, Ostyn et al. 2010) este confirmat în cazul în care este îndeplinită cel puțin una dintre următoarele condiții:

detectarea a cel puțin 105 UFC S. aureus/g aliment

detectarea enterotoxinelor stafilococice în aliment suspectat și/sau

izolarea aceleiași tulpini de S. aureus atât de la pacient cât și din alimentul incriminat.

În unele cazuri, confirmarea etiologiei stafilococice a unei izbucniri epidemice poate fi dificilă, existând două probleme majore: (1) tulpinile de S. aureus sunt sensibile la acțiunea temperaturii, ceea ce face imposibilă recuperarea acestora din aliment și/sau detectarea genelor codante ale enterotoxinelor în aceste situații și (2) metodele de detectare disponibile în prezent nu pot fi aplicate pentru toate enterotoxinele descrise.

Detectarea enterotoxinelor stafilococice – proteine termo-rezistente și rezistente la acțiune enzimelor proteolitice poate fi realizată prin mai multe metode: teste in vivo, pe animale, teste imunologice, biosenzori, teste de biologie moleculară sau metode ce au la bază abordări proteomice.

1-9-1 Testele in vivo

Se bazează pe capacitatea unui extract din alimentul suspect de a induce simptome gastro-intestinale la animale și/ sau se referă la dovedirea activității superantigenice în culturi celulare.

În trecut, activitatea emetică a fost studiată la primate sau prin administare intra-peritoneală la pisoi (Surgalla, Bergdoll et al. 1953), (Bergdoll 1989), dar considerentele etice și costurile mari, au dus la folosirea în studiile recente a unei specii de șoricei Suncus murinus (Hu, Omoe et al. 2003). Simptomele caracteristice TIA stafilococice apar, la această specie, după ingestia unei cantități de aproximativ 200µg, o doză mult mai mare decât cea necesară producerii unei simptomatologii la om, ceea ce face să nu fie o metodă tocmai potrivită pentru caracterizarea unui focar de TIA.

Studii recente demonstrază capacitatea superantigenică a enterotoxinei A (Hawryluk and Hirshfield 2002) prin inducerea unui răspuns citotoxic asupra limfocitelor T, acest test detectând enterotoxina A în concentrații picomolare. Schaeffer a semnalat încă din 1970 efectele care pot fi obținute prin inocularea enterotoxinei B pe culturi celulare: intestin de embrion uman, HeLa, HEp-2, Chang liver, KB, celule L și o cultură primară de fibroblaști umani (Schaeffer 1970). Efectul citopatic al SEB pe culturi de celule este exprimat complet numai dacă se utilizează medii suplimentate cu ser uman. Toxicitatea este redusă în medii suplimentate cu ser de cal și nulă în medii suplimentate cu ser fetal de vițel. Este o citotoxicitate reversibilă, care apare după 8 ore de cultivare. Metoda este greu standardizabilă, dar poate fi utilizată pentru scopuri de cercetare.

1-9-2 Metode imunologice

După anul 1951, anul primei purificări parțiale, enterotoxinele au putut fi depistate prin metode imunologice. Astfel, au fost folosite următoarele metode clasice:

difuzia simplă în tub, macrometoda- Surgalla 1952 (Surgalla, Bergdoll et al. 1952)

dubla difuzie Quchterlony (micrometoda)- Wadsworth 1957 (Wadsworth 1957)

difuzie simplă în tub capilar- Fung 1971 (Fung and Wagner 1971)

electroimunodifuzia- Laurell (istoric)

metode radioimunoenzimatice – RIA (istoric)

hemaglutinarea (istoric)

precipitare în câmp electric – imunelectroforeza (istoric)

Casman et al. a descris o metodă semi-cantitativă de detectare a enterotoxinelor stafilococice în diverse matrici alimentare, folosind imunodifuzia în agar, cu o limită de detecție de 100 ng/ ml de extract (Casman, Bennett et al. 1969); ulterior au fost dezvoltate și alte variante ale acestei tehnici pentru detectarea enterotoxinelor în supernatantul de cultură (Robbins, Gould et al. 1974); (Meyer and Palmieri 1980), dar acestea nu s-au dovedit sensibile pentru folosirea în diverse matrici alimentare. Aceste metode erau destul de laborioase și au fost abandonate în favoarea unor metode mult mai sensibile, totuși Asociația Comunităților Analitice (AOAC) din SUA recomandă această metodă ca una de referință.

Metodele radioimunoenzimatice au permis detecția unor cantități foarte mici de enterotoxine (< 1ng / g aliment) (Miller, Reiser et al. 1978); (Janin and Wodak 1983), fiind foarte sensibile, dar sunt metode care comportă riscuri atât pentru personalul de laborator cât și pentru mediul ambiant prin folosirea componentelor radiomarcate (ex. I125) ceea ce a dus la abandonarea acestora.

În scopul detectării concentrațiilor scăzute de enterotoxine din extractele alimentare și pentru a reduce problemele de securitate deteminate de testele radioimunoenzimatice, au fost dezvoltate tehnici imunochimice ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (Freed, Evenson et al. 1982), (Kauffman 1980), (Notermans, Verjans et al. 1978).

Metodele imunoenzimatice ce utilizează anticorpi anti-enterotoxine policlonali sau monoclonali sunt cele mai utilizate metode de detectare a enterotoxinelor stafilococice.

Există mai multe kit-uri comerciale ce permit detectarea enterotoxinelor stafilococice, disponibile în acest moment pe piață (tabelul 4) și care au la bază două principii de acțiune:

teste imunoenzimatice (EIA) cu variantele ELISA și ELFA și

teste de latex aglutinare pasivă inversată (RPLA)

Tabel 4. Principalele caracteristici ale truselor comerciale ce folosesc metode imunologice.

Dezavantajele metodelor imunologice sunt generate de faptul că nu sunt foarte specifice și sensibile putând genera rezultate fals positive, mai ales dacă se folosesc pentru detecție din matrici alimentare. De asemenea, este bine cunoscut faptul că, unele proteine, așa cum este cazul proteinei A stafilococice, pot interfera cu fragmentul Fc al imunoglobulinelor G de la mai multe specii animale (șoarece sau iepure, dar nu cu cele de la șobolan sau capră), alte interferențe fiind asociate cu enzimele endogene, cum ar fi fosfataza alcalină sau lacto-peroxidaza. Pentru dezvoltarea unei astfel de tehnici este nevoie de toxină purificată în vederea obținerii anticorpilor specifici, această toxină fiind destul de dificil de obținut și foarte costisitoare.

Până acum câțiva ani erau disponibili doar anticorpi împotriva enterotoxinelor clasice A, B, C, D și E, în ultimul timp dezvoltându-se și anticorpi împotriva enterotoxinelor G, H și I (Schlievert and Case 2007), celelalte enterotoxine descrise neputând fi detectate cu ajutorul metodelor imunologice. Însă, indiferent de metoda de detectare folosită și din cauza faptului că în alimente se găsesc doar cantități foarte mici de toxine, o etapă esențială pentru obținerea unui rezultat corect, este cea de concentrare (Meyrand, Atrache et al. 1999), (Lapeyre, Maire et al. 2001). Dintre diversele metodologii descrise, doar extracția urmată de concentrarea prin dializă a fost aprobată de Uniunea Europeană (European Community, 2007) pentru extracția enterotoxinelor stafilococice din aliment.

Un alt impediment este reprezentat de faptul că doar în cazul kit-urilor TECRA și RPLA , rezultatele pot fi citite cu ochiul liber, celelalte (RIDASCREEN , TRANSIA și VIDAS) necesită dispozitive speciale (cititor).

De asemenea, trebuie menționat că unele kit-uri folosesc seruri monovalente ce permit detectarea și identificarea diferitelor tipuri de enterotoxine ( RIDASCREEN și RPLA ) iar celelalte folosesc doar seruri polivalente care detectează prezența enterotoxinelor A, B, C, D și E fără însă a le diferenția.

Avantajul major al acestor kit-uri este reprezentat de faptul că toate, au o limită de detecție foarte scăzută, permițând detectarea enterotoxinelor chiar în cantități mici. Cu toate acestea, limitele acestor metode sunt reprezentate de faptul că pot genera rezultate fals- negative prin pierderea enterotoxinelor în etapele de extracție, printr-o distribuție inegală a toxinelor în probe sau prin prezența unor toxine nedetectabile cu aceste kit-uri sau rezultate fals-pozitive prin interferențele cu elementele matricilor alimentare.

Recent, diferiți autori (Schotte, Langfeldt et al. 2002); (Khreich, Lamourette et al. 2008) au descris un sistem portabil de detectare rapidă a enterotoxinei stafilococice B ce are la bază o metodă imunocromatografică, cu aplicabilitate în cazul unei amenințări bioteroriste de contaminare a apei potabile dar care este mai greu aplicabilă pentru detecția enterotoxinelor din matrici alimentare.

O altă metodă de detecție rapidă este cea cu bile magnetice (Alefantis, Grewal et al. 2004), este o metodă optimizată tot pentru detectarea SEB, bazată pe utilizarea unui sistem competitiv de 2 anticorpi, dintre care un anticorp este legat de o bilă magnetică, iar altul este marcat cu un compus fluorocromic (fig. 9). Avantajele constau în reducerea timpului integral de execuție și interpretare a testului la 45 – 50 minute, creșterea sensibilității și specificității, simplitate și posibilitatea automatizării.

Fig. 9 Metoda fluorimetrică cu captare pe suport mobil (bile magnetice) (Alefantis, Grewal et al. 2004)

Metoda ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay = Test Imunoenzimatic cu Imunofluorescență ) (Jechorek and Johnson 2008) este utilizată curent în multe laboratoare cu ajutorul aparatului și reactivilor Vidas, respectiv Vidas staph enterotoxin II Biomerieux. Aceasta metodă este acceptată și certificată AOAC Research Industry și permite detectarea enterotoxinelor A, B, C, inclusiv a variantelor C1, C2, C3, D și E, putând detecta până la 0.25 ng toxină/g aliment. Este o metodă ELISA tip sandwich, în care anticorpul secundar este marcat cu un fluorocrom (fig. 10). Este o metodă recomandată pentru utilizare în industria alimentară.

Fig.10. Principiul tehnologiei ELFA VIDAS – www.biomerieux

Tehnologia ELFA folosește un procedeu nou de prelucrare a anticorpilor (fig.10), avand drept scop optimizarea detecției antigenului. Îndepartarea fragmentului Fc al anticorpului marcat enzimatic îmbunătățește semnificativ performanțele kit-ului. Sunt reduse posibilele interferențe cu matricea alimentelor și legăturile nespecifice cu alte microorganisme ce pot genera rezultate fals- pozitive și ca urmare determină creșterea specificității. Eliberarea celor două fragmente mici Fab ameliorează legarea anticorpilor și favorizează recunoașterea antigenului, ceea ce conferă reacției o sensibilitate înaltă.

Metoda RPLA (Reverse Passive Latex Agglutionation = Latexaglutinare Pasivă Inversată) utilizează anticorpi specifici anti-enterotoxină stafilococică cuplați pe particule latex, fiind disponibile truse pentru detecția enterotoxinelor clasice A-D sau A-E. Limita de detecție prin acestă metodă este de 1-2 ng enterotoxină/g extract alimentar sau /ml de filtrat celular. Particulele de latex aglutinează în prezența enterotoxinei corespunzătoare anticorpilor cu care sunt sensibilizate, rezultatul fiind vizibil prin formarea unei rețele (fig. 11)

Fig. 11. Criterii de interpretare a rezultatelor reacției de latexaglutinare pasivă inversată- cf. instrucțiunilor de utilizare ale trusei comerciale

1-9-3 Biosenzorii

Imunosenzorii constau din sisteme formate din substrate biologice imunologic active (imunoagenți = anticorpi, antigene, ADN) ce reprezintă receptorul imobilizat pe diferite tipuri de suporturi, un traducător de semnal și un circuit electronic de amplificare și detecție (fig. 12). Receptorul are rolul de a extrage din lichidele testate (ser, limfă, sânge, extracte lichide din alimente etc.) o singură substanță, respectiv analitul pentru care a fost conceput imunosenzorul.

Fig. 12. Principiul metodei cu imunosenzori (Long, Zhu et al. 2013)

Modificările ce au loc în biosenzor la reținerea analitului: modificarea grosimii unui strat, schimbarea indicelui de refracție, a temperaturii, modificări în absorbția luminii, creșterea sarcinii electrice, modificări de potențial electric sau de curent electric sunt înregistrate cu ajutorul unor traductori termici, optici (ex. rezonanță plasmonică de suprafață), optoelectronici, piezoelectrici (ex. cristale de cuarț), scanare de suprafață (ex. microscopie de forță atomică), electrochimici, biologici, etc.

Avantajele utilizării sistemelor tip biosenzor derivă din următoarele proprietăți:

pot analiza simultan probe complexe: prelevate biologice, prelevate alimentare sau ambientale

pot detecta simultan un numar mare de toxine

nu necesită etape laborioase de pregătire a probelor

sunt foarte rapide, oferind rezultate în timp real

prezintă sensibilitate și specificitate înaltă

ușor de utilizat

pot detecta cantități de enterotoxine de < 0.5 ng/ml

sunt utilizate în mod curent în industria alimentară, farmaceutică, chimie, mediu

În 1997, Hartveld et al. au utilizat cu succes o metodă de detectare a enterotoxinei B stafilococice utilizând imunosenzori cu cristale de cuarț piezoelectric de 20 MHz într-un sistem de injecție în flux. Detectarea imunologică se bazează pe o schemă competitivă utilizând anticorpi policlonali anti-SEB, autorii obținând optimizarea a trei parametri: rata de flux, timpul de incubare și concentrația anticorpilor. Principiul metodei constă în schimbarea frecvenței de rezonanță a cristalului după legarea antigenului. Ecuația de bază care descrie relația între frecvența de rezonanță a unui cristal oscilatoriu piezoelectric și masa depozitată pe suprafața cristalului a fost derivată de Sauerbrey, Stockridge si Lostis (cit. Kumar 2000). Limita de detecție a fost de 0.1 μg/ml, la concentrații de peste 10 μg/ml răspunsul biosenzorului fiind complet inhibat.

Imunosenzori tip Surface Plasmon Resonance (SPR)- Rezonanță Plasmonică de Suprafață

În 2000, Nedelkov (Nedelkov, Rasooly et al. 2000) raportează rezultate strict controlate obținute prin aplicarea unei metode care combină SPR cu spectrometria de masă. SPR este o metodă bazată pe detectarea diferențelor în atributele optice și de rezonanță ale materialului pe care sunt imobilizați anticorpii pentru a detecta direct legarea antigenului.

Principiul acestei metode (fig.13) constă în imobilizarea unei molecule (analit) de un ligand de pe suprafața chip-ului SPR. Această legare va determina modificarea indicelui de refracție ce este înregistrată ca unități de rezonanță (RU), permițând analizarea unei varietăți de constante termodinamice, cinetice sau de afinitate.

Fig.13. Principiul imunosenzorilor tip rezonanță plasmonică de suprafață (SPR) – www.rci.rutgers.edu/~longhu/Biacore/MolecularInteractionAnalysis

Biosenzorii tip SPR sunt folosiți pentru detectarea în timp real a enterotoxinelor stafilococice. Există studii despre folosirea acestora pentru detectarea enterotoxinelor A și B în mai puțin de 4 minute în matrici alimentare complexe (ex. hot dog, salată cartofi, lapte, ciuperci) fără ca acestea să influențe detecția, pragul de detecție prin această metodă fiind de 10-100 ng/g aliment (Slavik, Homola et al. 2002), (Homola, Dostalek et al. 2002), (Naimushin, Soelberg et al. 2002).

1-9-4 Metode de biologie moleculară

1-9-4-1 PCR (Polimerase Chain Reaction = Reacția de Polimerizare în Lanț)

Metodele bazate pe detecția cu ajutorul reacției de polimerizare în lanț a genelor codante pentru enterotoxinele stafilococice, sunt din ce în ce mai frecvent utilizate pentru caracterizarea tulpinilor de S. aureus implicate atât în producerea TIA cât și a diverselor afecțiuni specifice (foliculite, furuncule, impetigo, abcese, infecții ale plăgilor, endocardite, osteomielite, pneumonii, septicemii).

Abordarea PCR este o metodă specifică, extrem de sensibilă și rapidă, care poate oferi informații extrem de valoroase, astfel încât, determinarea profilului toxic al tulpinilor de S. aureus poate fi folosit cu succes alături de celelalte metode moleculare de tipizare: tipizarea pe baza polimorfismului genei codante a proteinei A stafilococice (spa typing), MLST, PFGE, etc.

Cu toate acestea, metodele PCR, folosite pentru caracterizarea unei izbucniri de toxiinfecție alimentară, prezintă două dezavantaje majore: în primul rând, este necesară izolarea tulpinilor implicate în producerea acestor afecțiuni, iar în al doilea rând, rezultatele obținute cu ajutorul acestei metode, ne informează doar despre prezența sau absența unei gene care codifică enterotoxinele dar nu oferă nici o informație cu privire la expresia acestor gene sau cantitatea de toxină produsă.

Există numeroase raportări despre utilizarea metodelor PCR pentru identificarea genelor pentru enterotoxinele stafilococice A, B, C, D, E, toxinele exfoliative și TSST-1 atât în varianta PCR simplex (Johnson, Tyler et al. 1991), (Becker, Roth et al. 1998), (Monday and Bohach 1999), (McLauchlin, Narayanan et al. 2000), (Atanassova, Meindl et al. 2001), (Tamarapu, McKillip et al. 2001), (Rosec and Gigaud 2002), (Ercolini, Blaiotta et al. 2004), (da Cunha Mde, Calsolari et al. 2007)etc. cât și în varianta PCR multiplex care poate detecta grupuri de gene pentru enterotoxine, uneori în combinație cu alte toxine (TSST-1, epidermolizine etc.) –(Monday and Bohach 1999)(sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, tst); Wang et al. (Wang, Chen et al. 2002) (multiplex sea, seb, sec, sed, see); Blaiotta et al., 2004 (Blaiotta, Ercolini et al. 2004)(SET1: sej, sei, seb, seq, ser, sed, sep, femA; SET2: sen, tst, sek, sea, sec, sem, femA; SET3: seo, she, see, seu, sel, seg, femA); Hwang et al., 2007 (Hwang, Kim et al. 2007)(SET 1: seb, sed, sei, sej, sep, seq,ser, femA; SET 2: sea, sec, sek, sem, sen, tst, femA; SET 3: see, seg, seh, sel, seo, seu, femA). În ultimii ani se folosește tot mai mult tehnica ADN- microarray pentru detecția simultană și deci, mult mai rapidă, a unui număr impresionant de gene (Sergeev, Volokhov et al. 2004). Indiferent de varianta folosită, metoda PCR, utilă pentru scopuri de cercetare, nu constituie o metodă de diagnostic suficient de rapid în situații de alertă microbiologică.

A fost descrisă și o altă metodă pentru detectia genelor codante ale enterotoxinelor clasice (A-D), mult mai rapidă, specifică și sensibilă bazată pe studiul acizilor nucleici prin amplificare izotermică în buclă LAMP ( loop-mediated isothermal amplification) (Notomi, Okayama et al. 2000), (Goto, Hayashidani et al. 2007). Această reacție necesită utilizarea a patru perechi de primeri ce recunosc șase regiuni distincte (F1, F2, F3, B1, B2 și B3) de pe ADN-ul țintă, se desfășoară la o temperatură constant între 60-65 °C, rezultatele fiind disponibile după 60 min. Produșii reacției pot fi detectați prin cuantificarea în timp real a turbidității determinate de formarea pirofosfatului de magneziu insolubil (Mori, Nagamine et al. 2001). Această metodă este mai avantajoasă decât metodele PCR clasic în ceea ce privește sensibilitatea și raportul cost-eficiență și oferă rezultate similare determinărilor în timp real (Real -Time PCR).

1-9-4-2 Real -Time PCR

Este o metodă cantitativă de detecție în timp real, cu nivel foarte înalt de rapiditate, sensibilitate și specificitate, care a fost aplicată pentru detectarea genelor sea-sej și seu (Letertre, Perelle et al. 2003), utilizând tehnica PCR 5’ (TaqMan), o metodă PCR bazată pe fluorescența pentru amplificarea și detecția simultană a ampliconilor specifici. Această metodă este lipsită de dezavantajele privind prelungirea timpului necesar obținerii rezultatelor și complexitatea ridicată a protocoalelor, presupuse de metodele utilizând transferul pe membrană sau analiza fragmentelor de restricție, singurul inconvenient ar fi legat de existența inhibitorilor reacției atunci cand această metodă se utilizează pentru detectarea enterotoxinelor stafilococice direct din aliment (Nakayama, Okayama et al. 2006). Limitele de detecție au variat între 100 și 400 copii pentru gena sea și 250 până la > 10 5 copii per reacție pentru genele sea-sej.

Pentru a îmbunătăți caracterizarea TIA stafilococice, eforturile recente au fost canalizate pentru determinarea genelor implicate frecvent în sinteza enterotoxinelor direct în aliment. Astfel, în urma unui episod masiv de TIA stafilococică, care a avut loc în iulie 2000 în Japonia și care a afectat mai mult de 13.000 de persoane, Ikeda și colab. a dezvoltat o metodologie în timp real prin care genele sea, seg, seh, și sei au putut fi detectate direct în alimentul incriminat (lapte praf degresat) fără ca tulpinile de S. aureus să fie recuperate prin cultivare pe medii de cultură artificiale (Ikeda, Tamate et al. 2005), (Ikeda, Tamate et al. 2005)

De asemenea, pentru evaluarea potențialului toxic al tulpinilor izolate din focare de TIA stafilococică, diverși autori au dezvoltat primeri pentru reacții PCR de revers- transcriere (RT-PCR) pentru genele codante ale enterotoxinelor (Lee, Moon et al. 2007), (Akineden, Hassan et al. 2008). Aceste abordări demonstrează posibila transcripție a ARNm a acestor gene, dar nu indică dacă aceste tulpini sunt capabile să producă în aliment cantități detectabile de toxină sau suficiente pentru inducerea simptomatologiei. De exemplu, Derzelle și colab. au dezvoltat o reacție RT-PCR pentru a demonstra expresia diverselor gene codante ale enterotoxinelor stafilococice, inclusiv a celor descoperite mai recent, în diversele faze ale creșterii bacteriene, în condiții optime de creștere (Derzelle, Dilasser et al. 2009). Într-un alt studiu, Duquenne și colab. au optimizat o metodă eficientă de extracție a ARN-ului bacterian din brânză și o reacție RT- PCR cantitativă (RT-qPCR), ceea ce reprezintă o metodă simplă, sensibilă și reproductibilă pentru evaluarea și cuantificarea expresiei genelor codante a enterotoxinelor stafilococice în timpul procesului de fabricație al brânzei (Duquenne, Fleurot et al. 2010).

1-9-4-3 Real-time immuno-PCR (qRT-iPCR)

Dezvoltată în 2007 la Institutul de Microbiologie Medicală din Munster de Fischer et al, (Fischer, von Eiff et al. 2007) pentru detectarea enterotoxinelor stafilococice A și B, reprezintă o particularizare a reacției iPCR propusă de Lindt et al. în 2005 și combină avantajele PCR în timp real cu cele ale metodelor imunologice. Metoda se bazează pe legarea covalentă a unui ADN reporter la anticorpii secundari de detecție. ADN reporter modificat a fost cuplat succesiv cu anticorpii secundari de detecție activați cu N-succinimidil-S-actil-tioacetat. Reacția qRT-iPCR a avut reproductibilitate înaltă și a permis detectarea unor cantități de 0,6 – 6 pg (4 – 40 mol/μl) de SEB, respectiv SEA. Dezvoltarea unui conjugat anticorp – ADN stabil oferă un instrument suplu, înalt sensibil și specific pentru diagnostic și cercetare, cu aplicabilitate largă pentru complexe antigen-anticorp preformate.

Fig. 14. Principiul reacției cantitative imuno-PCR (Fischer, von Eiff et al. 2007) pentru detecția enterotoxinei B și/sau TSST-1 stafilococice: antigenul este captat într-o placă cu godeuri pe care sunt imobilizați anticorpi de oaie policlonali antienterotoxină și este ulterior detectat cu ajutorul anticorpilor de iepure policlonali antienterotoxină; pentru detectarea complexului imun este utilizat un conjugat covalent anticorp-ADN; ADN raportor poate fi detectat printr-un real-time PCR SYBR green.

1-9-4-4 Metode combinate PCR – EIA

Becker (Becker, Roth et al. 1998) și Gilligan(Gilligan, Shipley et al. 2000) au dezvoltat în 1998, respectiv 2000, metode PCR – EIA/ ELISA pentru genele sea și seb care pot detecta între 50 și 100 pg de ADN. Este o metodă care combină reacția de polimerizare în lanț cu o metodă colorimetrică imunoenzimatică. Ambele variante au putut detecta sea sau seb la un nivel de 250 copii genice. O alternativă la metoda PCR-EIA colorimetrică a fost utilizată în 2004 de Aitichou (Aitichou, Henkens et al. 2004). Noutatea a constat în combinarea unui PCR cu primeri biotinilați cu hibridizarea cu o probă marcată cu fluoresceină și detectarea imunoenzimatică după introducerea în reacție a unui anticorp anti-fluoresceină conjugat cu peroxidaza din hrean, cu ajutorul unui detector electrochimic manual. Metoda a fost utilizată pentru sea și seb și a reușit să pună în evidență prezența a numai 16 copii genice. Sensibilitatea ambelor teste a fost de 100%, iar specificitatea de 96% pentru sea și 98% pentru seb.

1-9-5 Metode fizico-chimice

1-9-5-1 Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Din punct de vedere istoric, cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) a fost utilizată pentru purificarea enterotoxinelor stafilococice din supernatantul de cultură în vederea obținerii soluțiilor standard și soluțiilor imunogene. Astfel, în 1983 Williams și colab. (Williams, Wehr et al. 1983) au comparat diverse tehnici cromatografice (de excludere, de schimb ionic, fază inversă) pentru purificarea și caracterizarea enterotoxinei stafilococice B în vederea utilizării sale pentru teste imunologice.

Câțiva ani mai târziu, Strickler (Strickler, Neill et al. 1989) și Johansson (Johansson, Pettersson et al. 1990) au dezvoltat o metodă rapidă de purificare prin HPLC a SEB ce necesita două respectiv trei etape cromatografice succesive: o etapă de cromatografie în fază inversă, urmată de o etapă cromatografică de schimb de cationi și respectiv, două etape cromatografice de schimb de ioni urmate de o etapă de filtrare pe gel după verificarea prin electroforeză SDS PAGE și immunoblotting.

Dezavantajul major al acestor metode constă în utilizarea unor volume importante de supernatante de cultură (2,5 l).

Aceste metode ce utilizează HPLC s-au dovedit utile pentru purificarea toxinelor din supernatante de cultură dar nu sunt adecvate folosirii direct din aliment.

1-9-5-2 Abordări proteomice – Spectrometria de masă (MS)

Din cauza dificultăților în obținerea anticorpilor anti-enterotoxine noi, a apărut necesitatea dezvoltării de noi tehnici bazate pe abordări proteomice, o astfel de metodă fiind și spectrometria de masă (MS) ce permite detectarea și cuantificarea absolută atât a enterotoxinelor stafilococice clasice cât și a celor noi descrise chiar în matrici alimentare complexe, astfel încat, dezvoltarea abordărilor complementare analitice inclusiv prin metode fizico-chimice oferă o nouă perspectivă de caracterizare și investigare corectă a toxiinfecțiilor alimentare stafilococice (Dupuis, Hennekinne et al. 2008), (Hennekinne, Brun et al. 2009).

Fig. 15 Schema de detecție și cuantificare a SEA din matrice alimentară (brânză contaminată) utilizând spectrometria de masă (Hennekinne, Brun et al. 2009)

Această metodă este cea mai sensibilă tehnică disponibilă ce furnizează rezultate rapide, specifice și sigure, determinând greutatea moleculară (molecular weight) a compusilor chimici prin separarea ionilor moleculari în funcție de raportul masă/sarcină (mass- to- charge ratio m/z), devenind astfel, o tehnică indispensabilă și adecvată pentru analiza proteinelor ​​și amestecurilor de peptide.

În 2003, Nedelkov a descris o metodă realizată pentru detecția SEB direct din aliment(ciuperci conservate) cu ajutorul unui biosenzor BIA(Biomolecular interaction analysis) (Nedelkov and Nelson 2003) cuplat cu spectrometria de masă, limita de detecție a fost estimata la 1 ng / ml. Dezavantajul acestei metode este necesitatea de utilizare a unor echipamente specifice Biacore (GE Healthcare).

Dezvoltarea a două metode de ionizare: ionizarea de tip electrospray (ESI) și ionizarea prin desorbție din matrice asistată laser (MALDI) și utilizarea unui analizor de masă corespunzător, au revoluționat caracterizarea de biomolecule sintetice sau naturale. Având în vedere gama largă de metodologii disponibile, o singură tehnică de spectrometrie de masă nu poate fi folosită pentru toate proteinele, metoda MS necesitând astfel dezvoltarea unei serii de tehnici adecvate fiecărui scop.

În cazul alimentului, situația este complexă întrucât matricea poate conține mai multe proteine​​, lipide și multe alte specii moleculare care pot interfera cu detectarea toxinei vizate și pot influența cuantificarea. Pregătirea probelor rămâne un pas critic al analizei. Mai mulți autori au încercat să optimizeze acest proces, prin optimizarea parametrilor de digestie (Norrgran, Williams et al. 2009) sau prin adăugarea unei etape de purificare (Oeljeklaus, Meyer et al. 2009). Au fost dezvoltate, de asemenea, cu succes, strategii de încorporare a unui standard intern, marcat izotopic în probe.

Bernardo și colab., au dezvoltat tehnici bazate pe MS (Bernardo, Pakulat et al. 2002) prin cuplarea la sursa de ionizare MALDI a analizorului timpului de zbor (MALDI-TOF) pentru detectarea enterotoxinelor stafilococice, altele decât cele clasice, sau a altor factori de virulență ai S. aureus în supernatante de cultură sau în diverse soluții lichide (apă sau suc de mere). Callahan și colab.(Callahan, Shefcheck et al. 2006) au reușit să detecteze și să cuantifice SEB prin cromatografie lichidă cuplată cu detecție ESI / MS în suc de mere folosit ca model de matrice alimentară. Recent, Brun și colab. (Brun, Dupuis et al. 2007) au dezvoltat o abordare MS capabilă să efectueze o cuantificare absolută a SEA și TSST1 în probe de apă sau urină, ce a fost utilizată și pentru a efectua cuantificarea a SEA într-o probă de brânză.

O altă tehnică de abordare proteomică este Protein Microarray ce permite identificarea seturilor de proteine, fragmente proteice sau peptidice din probe biologice complexe, utilizând o matrice solidă specifică denumită chip de proteine. Cel mai frecvent format utilizat pentru chip-urile de protein microarray sunt cele bazate pe anticorpi imprimați pe suport de sticlă, anticorpii fiind utilizați ca și molecule de captură ce detectează analiții de interes din probele biologice pe baza specificității anticorpilor. Huelseweh (Huelseweh, Ehricht et al. 2006) a descris în 2006, un astfel de chip pentru detectarea simultană a mai multor agenți potențiali de bioagresiune, incluzând enterotoxina stafilococică B.

Utilizând multiplexarea prin tehnologia xMAP® Simonova a descris în 2012 (Simonova, Valyakina et al. 2012) o metodă ce permite detectarea enterotoxinei stafilococice B alături de alte 5 toxine, utilizând ca suport pentru imunodetecție, populații de microsfere cu adresă spectrală unică obținută prin marcarea cu concentrații precise de fluorocromi. Analiții din probă se vor lega la moleculele de captură fixate pe suprafața microsferelor. Ulterior, se introduc anticorpi biotinilați ce se leagă la alți epitopi; de biotină se leagă streptavidina- ficoeritrina, care va da un semnal fluorescent proporțional cu cantitatea de analit. În cadrul sistemului de citire Luminex® 200™, microsferele vor trece consecutiv prin fața a două fascicule laser, semnalele de emisie vor fi preluate și astfel se va identifica și cuantifica fiecare specie moleculară pe baza curbelor standard.

Fig. 16 Schema tehnologiei xMAP pentru identificarea enterotoxinei B stafilococice (Simonova, Valyakina et al. 2012)

Indiferent de metodele de detectare folosite, o caracterizare corectă și completă a focarelor de TIA stafilococice implică, de fapt, o combinarea a tehnicilor de microbiologie clasică cu cele imunologice și de biologie moleculară iar tehnicile cantitative bazate pe abordarea proteomică sau folosind biosenzori, furnizează informații extrem de valoroase și ar trebui să fie integrate cu succes în strategia de diagnostic TIA.

Aarestrup, F. M., J. K. Andersen, et al. (1995). "Lack of staphylococcal enterotoxin production among strains of Staphylococcus aureus from bovine mastitis in Denmark." Acta Vet Scand 36(2): 273-275.

Aitichou, M., R. Henkens, et al. (2004). "Detection of Staphylococcus aureus enterotoxin A and B genes with PCR-EIA and a hand-held electrochemical sensor." Mol Cell Probes 18(6): 373-377.

Akhtar, M., C. E. Park, et al. (1996). "Effect of urea treatment on recovery of staphylococcal enterotoxin A from heat-processed foods." Appl Environ Microbiol 62(9): 3274-3276.

Akineden, O., A. A. Hassan, et al. (2008). "Enterotoxigenic properties of Staphylococcus aureus isolated from goats' milk cheese." Int J Food Microbiol 124(2): 211-216.

Alefantis, T., P. Grewal, et al. (2004). "A rapid and sensitive magnetic bead-based immunoassay for the detection of staphylococcal enterotoxin B for high-through put screening." Mol Cell Probes 18(6): 379-382.

Altboum, Z., I. Hertman, et al. (1985). "Penicillinase plasmid-linked genetic determinants for enterotoxins B and C1 production in Staphylococcus aureus." Infect Immun 47(2): 514-521.

Argudin, M. A., M. C. Mendoza, et al. (2010). "Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins." Toxins (Basel) 2(7): 1751-1773.

Asao, T., Y. Kumeda, et al. (2003). "An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimation of enterotoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk." Epidemiol Infect 130(1): 33-40.

Atanassova, V., A. Meindl, et al. (2001). "Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins in raw pork and uncooked smoked ham–a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR." Int J Food Microbiol 68(1-2): 105-113.

Baird-Parker, A. C. (1971). "Symposium on microbial changes in foods. Factors affecting the production of bacterial food poisoning toxins." J Appl Bacteriol 34(1): 181-197.

Balaban, N. and R. P. Novick (1995). "Translation of RNAIII, the Staphylococcus aureus agr regulatory RNA molecule, can be activated by a 3'-end deletion." FEMS Microbiol Lett 133(1-2): 155-161.

Balaban, N. and A. Rasooly (2000). "Staphylococcal enterotoxins." Int J Food Microbiol 61(1): 1-10.

Bania, J., A. Dabrowska, et al. (2006). "Distribution of newly described enterotoxin-like genes in Staphylococcus aureus from food." Int J Food Microbiol 108(1): 36-41.

Barber, L. E. and R. H. Deibel (1972). "Effect of pH and oxygen tension on staphylococcal growth and enterotoxin formation in fermented sausage." Appl Microbiol 24(6): 891-898.

Bayles, K. W. and J. J. Iandolo (1989). "Genetic and molecular analyses of the gene encoding staphylococcal enterotoxin D." J Bacteriol 171(9): 4799-4806.

Becker, K., R. Roth, et al. (1998). "Rapid and specific detection of toxigenic Staphylococcus aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic shock syndrome toxin 1 gene." J Clin Microbiol 36(9): 2548-2553.

Belay, N. and A. Rasooly (2002). "Staphylococcus aureus growth and enterotoxin A production in an anaerobic environment." J Food Prot 65(1): 199-204.

Bergdoll, M. S. (1989). "Regulation and control of toxic shock syndrome toxin 1: overview." Rev Infect Dis 11 Suppl 1: S142-144.

Bergdoll, M. S., C. R. Borja, et al. (1965). "Identification of a new enterotoxin as enterotoxin C." J Bacteriol 90(5): 1481-1485.

Bergdoll, M. S., C. R. Borja, et al. (1971). "Identification of enterotoxin E." Infect Immun 4(5): 593-595.

Bergdoll, M. S., F. S. Chu, et al. (1965). "Staphylococcal enterotoxin B. 3. The physicochemical properties and the N- and C-terminal amino acid sequences." Arch Biochem Biophys 112(1): 104-110.

Bergdoll, M. S., B. A. Crass, et al. (1981). "A new staphylococcal enterotoxin, enterotoxin F, associated with toxic-shock-syndrome Staphylococcus aureus isolates." Lancet 1(8228): 1017-1021.

Bernardo, K., N. Pakulat, et al. (2002). "Identification and discrimination of Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry." Proteomics 2(6): 747-753.

Betley, M. J. and J. J. Mekalanos (1985). "Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phage." Science 229(4709): 185-187.

Betley, M. J. and J. J. Mekalanos (1988). "Nucleotide sequence of the type A staphylococcal enterotoxin gene." J Bacteriol 170(1): 34-41.

Blaiotta, G., D. Ercolini, et al. (2004). "PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp. strains isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seG and seI in S. aureus AB-8802." J Appl Microbiol 97(4): 719-730.

Blaiotta, G., V. Fusco, et al. (2006). "Biotyping of enterotoxigenic Staphylococcus aureus by enterotoxin gene cluster (egc) polymorphism and spa typing analyses." Appl Environ Microbiol 72(9): 6117-6123.

Bohach, G. A. and P. M. Schlievert (1989). "Conservation of the biologically active portions of staphylococcal enterotoxins C1 and C2." Infect Immun 57(7): 2249-2252.

Boles, J. W., M. L. Pitt, et al. (2003). "Generation of protective immunity by inactivated recombinant staphylococcal enterotoxin B vaccine in nonhuman primates and identification of correlates of immunity." Clin Immunol 108(1): 51-59.

Borst, D. W. and M. J. Betley (1994). "Promoter analysis of the staphylococcal enterotoxin A gene." J Biol Chem 269(3): 1883-1888.

Breckinridge, J. C. and M. S. Bergdoll (1971). "Outbreak of food-borne gastroenteritis due to a coagulase-negative enterotoxin-producing staphylococcus." N Engl J Med 284(10): 541-543.

Brun, V., A. Dupuis, et al. (2007). "Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics." Mol Cell Proteomics 6(12): 2139-2149.

Callahan, J. H., K. J. Shefcheck, et al. (2006). "Detection, confirmation, and quantification of staphylococcal enterotoxin B in food matrixes using liquid chromatography–mass spectrometry." Anal Chem 78(6): 1789-1800.

Casman, E. P., R. W. Bennett, et al. (1969). "The micro-slide gel double diffusion test for the detection and assay of staphylococcal enterotoxins." Health Lab Sci 6(4): 185-198.

Cha, J. O., J. K. Lee, et al. (2006). "Molecular analysis of Staphylococcus aureus isolates associated with staphylococcal food poisoning in South Korea." J Appl Microbiol 101(4): 864-871.

Chaffer, M., G. Leitner, et al. (1999). "Coagulase-negative staphylococci and mammary gland infections in cows." Zentralbl Veterinarmed B 46(10): 707-712.

Chen, T. R., C. S. Chiou, et al. (2004). "Use of novel PCR primers specific to the genes of staphylococcal enterotoxin G, H, I for the survey of Staphylococcus aureus strains isolated from food-poisoning cases and food samples in Taiwan." Int J Food Microbiol 92(2): 189-197.

Cheung, A. L., J. M. Koomey, et al. (1992). "Regulation of exoprotein expression in Staphylococcus aureus by a locus (sar) distinct from agr." Proc Natl Acad Sci U S A 89(14): 6462-6466.

Chiang, Y. C., W. W. Liao, et al. (2008). "PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan." Int J Food Microbiol 121(1): 66-73.

Chiou, C. S., H. L. Wei, et al. (2000). "Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and coagulase gene restriction profile analysis techniques in the molecular typing of Staphylococcus aureus." J Clin Microbiol 38(6): 2186-2190.

Codita, I. (1985). "[Staphylococcal enterotoxins]." Rev Ig Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol Pneumoftiziol Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 30(3): 223-240.

Coleman, D. C., D. J. Sullivan, et al. (1989). "Staphylococcus aureus bacteriophages mediating the simultaneous lysogenic conversion of beta-lysin, staphylokinase and enterotoxin A: molecular mechanism of triple conversion." J Gen Microbiol 135(6): 1679-1697.

Couch, J. L., M. T. Soltis, et al. (1988). "Cloning and nucleotide sequence of the type E staphylococcal enterotoxin gene." J Bacteriol 170(7): 2954-2960.

Cunha, B. A., L. E. Eisenstein, et al. (2006). "Pacemaker-induced Staphylococcus aureus mitral valve acute bacterial endocarditis complicated by persistent bacteremia from a coronary stent: Cure with prolonged/high-dose daptomycin without toxicity." Heart Lung 35(3): 207-211.

da Cunha Mde, L., R. A. Calsolari, et al. (2007). "Detection of enterotoxin and toxic shock syndrome toxin 1 genes in Staphylococcus, with emphasis on coagulase-negative staphylococci." Microbiol Immunol 51(4): 381-390.

Dack, G. M. (1937). "Staphylococci in Relation to Food Poisoning." Am J Public Health Nations Health 27(5): 440-443.

Dancer, S. J. and W. C. Noble (1991). "Nasal, axillary, and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women: identification of strains producing epidermolytic toxin." J Clin Pathol 44(8): 681-684.

de la Fuente, R. and G. Suarez (1985). "Respiratory deficient Staphylococcus aureus as the aetiological agent of "abscess disease"." Zentralbl Veterinarmed B 32(6): 397-406.

Denison, G. A. (1936). "Epidemiology and Symptomatology of Staphylococcus Food Poisoning : A Report of Recent Outbreaks." Am J Public Health Nations Health 26(12): 1168-1175.

Derzelle, S., F. Dilasser, et al. (2009). "Differential temporal expression of the staphylococcal enterotoxins genes during cell growth." Food Microbiol 26(8): 896-904.

Devriese, L. A. and H. De Keyser (1980). "Prevalence of different species of coagulase-negative staphylococci on teats and in milk samples from dairy cows." J Dairy Res 47(1): 155-158.

Devriese, L. A. and J. Hommez (1978). "Cross resistance between nitrofurans and 5-nitroimidazoles in aerobic and microaerophilic bacteria." Zentralbl Veterinarmed B 25(10): 849-852.

Devriese, L. A., D. Nzuambe, et al. (1984). "Identification and characterization of staphylococci isolated from cats." Vet Microbiol 9(3): 279-285.

Devriese, L. A., K. H. Schleifer, et al. (1985). "Identification of coagulase-negative staphylococci from farm animals." J Appl Bacteriol 58(1): 45-55.

Devriese, L. A., K. Vlaminck, et al. (1983). "Staphylococcus hyicus in skin lesions of horses." Equine Vet J 15(3): 263-265.

Diep, B. A., S. R. Gill, et al. (2006). "Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus." Lancet 367(9512): 731-739.

Dinges, M. M., P. M. Orwin, et al. (2000). "Exotoxins of Staphylococcus aureus." Clin Microbiol Rev 13(1): 16-34, table of contents.

Dolman, C. E. (1934). "Staphylococcus Antitoxic Serum in the Treatment of Acute Staphylococcal Infections and Toxaemias." Can Med Assoc J 31(2): 130-135.

Donnelly, C. B., J. E. Leslie, et al. (1968). "Production of enterotoxin A in milk." Appl Microbiol 16(6): 917-924.

Dumitrescu, O., S. Boisset, et al. (2007). "Effect of antibiotics on Staphylococcus aureus producing Panton-Valentine leukocidin." Antimicrob Agents Chemother 51(4): 1515-1519.

Dunman, P. M., E. Murphy, et al. (2001). "Transcription profiling-based identification of Staphylococcus aureus genes regulated by the agr and/or sarA loci." J Bacteriol 183(24): 7341-7353.

Dupuis, A., J. A. Hennekinne, et al. (2008). "Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) for improved investigation of staphylococcal food poisoning outbreaks." Proteomics 8(22): 4633-4636.

Duquenne, M., I. Fleurot, et al. (2010). "Tool for quantification of staphylococcal enterotoxin gene expression in cheese." Appl Environ Microbiol 76(5): 1367-1374.

Endo, Y., T. Yamada, et al. (2003). "Phage conversion of exfoliative toxin A in Staphylococcus aureus isolated from cows with mastitis." Vet Microbiol 96(1): 81-90.

Ercolini, D., G. Blaiotta, et al. (2004). "PCR-based detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making." J Appl Microbiol 96(5): 1090-1096.

Even, S., C. Charlier, et al. (2009). "Staphylococcus aureus virulence expression is impaired by Lactococcus lactis in mixed cultures." Appl Environ Microbiol 75(13): 4459-4472.

Ewald, S. and S. Notermans (1988). "Effect of water activity on growth and enterotoxin D production of Staphylococcus aureus." Int J Food Microbiol 6(1): 25-30.

Fernandez, M. M., S. Cho, et al. (2011). "Crystal structure of staphylococcal enterotoxin G (SEG) in complex with a mouse T-cell receptor {beta} chain." J Biol Chem 286(2): 1189-1195.

Fields, B. A., E. L. Malchiodi, et al. (1996). "Crystal structure of a T-cell receptor beta-chain complexed with a superantigen." Nature 384(6605): 188-192.

Fischer, A., C. von Eiff, et al. (2007). "A quantitative real-time immuno-PCR approach for detection of staphylococcal enterotoxins." J Mol Med (Berl) 85(5): 461-469.

Fitzgerald, J. R., S. R. Monday, et al. (2001). "Characterization of a putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens." J Bacteriol 183(1): 63-70.

Fleischer, B. and H. Schrezenmeier (1988). "T cell stimulation by staphylococcal enterotoxins. Clonally variable response and requirement for major histocompatibility complex class II molecules on accessory or target cells." J Exp Med 167(5): 1697-1707.

Foster, G., H. M. Ross, et al. (1997). "Staphylococcus lutrae sp. nov., a new coagulase-positive species isolated from otters." Int J Syst Bacteriol 47(3): 724-726.

Foster, T. J. (2005). "Immune evasion by staphylococci." Nat Rev Microbiol 3(12): 948-958.

Foster, T. J. and M. Hook (1998). "Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus." Trends Microbiol 6(12): 484-488.

Fraser, J. D. and T. Proft (2008). "The bacterial superantigen and superantigen-like proteins." Immunol Rev 225: 226-243.

Freed, R. C., M. L. Evenson, et al. (1982). "Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of staphylococcal enterotoxins in foods." Appl Environ Microbiol 44(6): 1349-1355.

Fung, D. Y. and J. Wagner (1971). "Capillary tube assay for staphylococcal enterotoxins A, B, and C." Appl Microbiol 21(3): 559-561.

Genigeorgis, C. and J. K. Kuo (1976). "Recovery of staphylococcal enterotoxin from foods by affinity chromatography." Appl Environ Microbiol 31(2): 274-279.

Genigeorgis, C. and W. W. Sadler (1966). "Characterization of strains of Staphylococcus aureus isolated from livers of commercially slaughtered poultry." Poult Sci 45(5): 973-980.

Genigeorgis, C. A. (1989). "Present state of knowledge on staphylococcal intoxication." Int J Food Microbiol 9(4): 327-360.

Gillet, Y., B. Issartel, et al. (2002). "Association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leukocidin and highly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients." Lancet 359(9308): 753-759.

Gilligan, K., M. Shipley, et al. (2000). "Identification of Staphylococcus aureus enterotoxins A and B genes by PCR-ELISA." Mol Cell Probes 14(2): 71-78.

Goerke, C., R. Pantucek, et al. (2009). "Diversity of prophages in dominant Staphylococcus aureus clonal lineages." J Bacteriol 191(11): 3462-3468.

Goto, M., H. Hayashidani, et al. (2007). "Rapid detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus harbouring genes for four classical enterotoxins, SEA, SEB, SEC and SED, by loop-mediated isothermal amplification assay." Lett Appl Microbiol 45(1): 100-107.

Grumann, D., U. Nubel, et al. (2014). "Staphylococcus aureus toxins–their functions and genetics." Infect Genet Evol 21: 583-592.

Hakansson, M., K. Petersson, et al. (2000). "The crystal structure of staphylococcal enterotoxin H: implications for binding properties to MHC class II and TcR molecules." J Mol Biol 302(3): 527-537.

Harris, T. O. and M. J. Betley (1995). "Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substitutions." Infect Immun 63(6): 2133-2140.

Harris, T. O., W. O. Hufnagle, et al. (1993). "Staphylococcal enterotoxin type A internal deletion mutants: serological activity and induction of T-cell proliferation." Infect Immun 61(5): 2059-2068.

Hawryluk, T. and I. Hirshfield (2002). "A superantigen bioassay to detect staphylococcal enterotoxin A." J Food Prot 65(7): 1183-1187.

Hennekinne, J. A., V. Brun, et al. (2009). "Innovative application of mass spectrometry for the characterization of staphylococcal enterotoxins involved in food poisoning outbreaks." Appl Environ Microbiol 75(3): 882-884.

Hennekinne, J. A., M. L. De Buyser, et al. (2012). "Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation." FEMS Microbiol Rev 36(4): 815-836.

Hennekinne, J. A., A. Kerouanton, et al. (2003). "Discrimination of Staphylococcus aureus biotypes by pulsed-field gel electrophoresis of DNA macro-restriction fragments." J Appl Microbiol 94(2): 321-329.

Hennekinne, J. A., A. Ostyn, et al. (2010). "How should staphylococcal food poisoning outbreaks be characterized?" Toxins (Basel) 2(8): 2106-2116.

Homola, J., J. Dostalek, et al. (2002). "Spectral surface plasmon resonance biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B in milk." Int J Food Microbiol 75(1-2): 61-69.

Hovde, C. J., S. P. Hackett, et al. (1990). "Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C3 gene: sequence comparison of all three type C staphylococcal enterotoxins." Mol Gen Genet 220(2): 329-333.

Hovde, C. J., J. C. Marr, et al. (1994). "Investigation of the role of the disulphide bond in the activity and structure of staphylococcal enterotoxin C1." Mol Microbiol 13(5): 897-909.

Howe, C. W. (1966). "Experimental studies on determinants of wound infection." Surg Gynecol Obstet 123(3): 507-514.

Hu, D. L. and A. Nakane (2014). "Mechanisms of staphylococcal enterotoxin-induced emesis." Eur J Pharmacol 722: 95-107.

Hu, D. L., K. Omoe, et al. (2003). "Induction of emetic response to staphylococcal enterotoxins in the house musk shrew (Suncus murinus)." Infect Immun 71(1): 567-570.

Hu, D. L., G. Zhu, et al. (2007). "Staphylococcal enterotoxin induces emesis through increasing serotonin release in intestine and it is downregulated by cannabinoid receptor 1." Cell Microbiol 9(9): 2267-2277.

Huang, I. Y. and M. S. Bergdoll (1970). "The primary structure of staphylococcal enterotoxin B. 3. The cyanogen bromide peptides of reduced and aminoethylated enterotoxin B, and the complete amino acid sequence." J Biol Chem 245(14): 3518-3525.

Huelseweh, B., R. Ehricht, et al. (2006). "A simple and rapid protein array based method for the simultaneous detection of biowarfare agents." Proteomics 6(10): 2972-2981.

Hwang, S. Y., S. H. Kim, et al. (2007). "Novel multiplex PCR for the detection of the Staphylococcus aureus superantigen and its application to raw meat isolates in Korea." Int J Food Microbiol 117(1): 99-105.

Ikeda, T., N. Tamate, et al. (2005). "Mass outbreak of food poisoning disease caused by small amounts of staphylococcal enterotoxins A and H." Appl Environ Microbiol 71(5): 2793-2795.

Ikeda, T., N. Tamate, et al. (2005). "Quantitative analysis of Staphylococcus aureus in skimmed milk powder by real-time PCR." J Vet Med Sci 67(10): 1037-1041.

Irlinger, F. (2008). "Safety assessment of dairy microorganisms: coagulase-negative staphylococci." Int J Food Microbiol 126(3): 302-310.

Janin, J. and S. J. Wodak (1983). "Structural domains in proteins and their role in the dynamics of protein function." Prog Biophys Mol Biol 42(1): 21-78.

Jarp, J. (1991). "Classification of coagulase-negative staphylococci isolated from bovine clinical and subclinical mastitis." Vet Microbiol 27(2): 151-158.

Jarraud, S., M. A. Peyrat, et al. (2001). "egc, a highly prevalent operon of enterotoxin gene, forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus." J Immunol 166(1): 669-677.

Javier Hernandez, F., E. Gomez-Lucia, et al. (1992). "Lack of growth of heat-shocked Staphylococcus aureus surviving cells in common media and enterotoxin release." Zentralbl Veterinarmed B 39(1): 65-68.

Jechorek, R. P. and R. L. Johnson (2008). "Evaluation of the VIDAS staph enterotoxin II (SET 2) immunoassay method for the detection of staphylococcal enterotoxins in selected foods: collaborative study." J AOAC Int 91(1): 164-173.

Johansson, H. J., T. N. Pettersson, et al. (1990). "Development of a chromatographic process for large-scale purification of staphylococcal enterotoxin B." J Chem Technol Biotechnol 49(3): 233-241.

Johnson, W. M., S. D. Tyler, et al. (1991). "Detection of genes for enterotoxins, exfoliative toxins, and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by the polymerase chain reaction." J Clin Microbiol 29(3): 426-430.

Jones, T. F., M. E. Kellum, et al. (2002). "An outbreak of community-acquired foodborne illness caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus." Emerg Infect Dis 8(1): 82-84.

Jorgensen, H. J., T. Mork, et al. (2005). "Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in bulk milk in Norway." J Appl Microbiol 99(1): 158-166.

Karahan, M. and B. Cetinkaya (2007). "Coagulase gene polymorphisms detected by PCR in Staphylococcus aureus isolated from subclinical bovine mastitis in Turkey." Vet J 174(2): 428-431.

Kauffman, P. E. (1980). "Enzyme immunoassay for staphylococcal enterotoxin A." J Assoc Off Anal Chem 63(5): 1138-1143.

Kerouanton, A., J. A. Hennekinne, et al. (2007). "Characterization of Staphylococcus aureus strains associated with food poisoning outbreaks in France." Int J Food Microbiol 115(3): 369-375.

Khreich, N., P. Lamourette, et al. (2008). "Detection of Staphylococcus enterotoxin B using fluorescent immunoliposomes as label for immunochromatographic testing." Anal Biochem 377(2): 182-188.

Kitamoto, M., K. Kito, et al. (2009). "Food poisoning by Staphylococcus aureus at a university festival." Jpn J Infect Dis 62(3): 242-243.

Kleeman, K. T., T. L. Bannerman, et al. (1993). "Species distribution of coagulase-negative staphylococcal isolates at a community hospital and implications for selection of staphylococcal identification procedures." J Clin Microbiol 31(5): 1318-1321.

Kloos, W. E. and K. H. Schleifer (1975). "Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species." J Clin Microbiol 1(1): 82-88.

Kluytmans, J. A. and H. F. Wertheim (2005). "Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections." Infection 33(1): 3-8.

Kuroda, M., T. Ohta, et al. (2001). "Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus." Lancet 357(9264): 1225-1240.

Kusch, H. and S. Engelmann (2014). "Secrets of the secretome in Staphylococcus aureus." Int J Med Microbiol 304(2): 133-141.

Labrecque, N., J. Thibodeau, et al. (1994). "T cell receptor-major histocompatibility complex class II interaction is required for the T cell response to bacterial superantigens." J Exp Med 180(5): 1921-1929.

Lapeyre, C., T. Maire, et al. (2001). "Enzyme immunoassay of staphylococcal enterotoxins in dairy products with cleanup and concentration by immunoaffinity column." J AOAC Int 84(5): 1587-1592.

Larkin, E. A., R. J. Carman, et al. (2009). "Staphylococcus aureus: the toxic presence of a pathogen extraordinaire." Curr Med Chem 16(30): 4003-4019.

Le Loir, Y., F. Baron, et al. (2003). "Staphylococcus aureus and food poisoning." Genet Mol Res 2(1): 63-76.

Lee, Y. D., B. Y. Moon, et al. (2007). "Expression of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus isolates based on mRNA analysis." J Microbiol Biotechnol 17(3): 461-467.

Ler, S. G., F. K. Lee, et al. (2006). "Trends in detection of warfare agents. Detection methods for ricin, staphylococcal enterotoxin B and T-2 toxin." J Chromatogr A 1133(1-2): 1-12.

Letertre, C., S. Perelle, et al. (2003). "A strategy based on 5' nuclease multiplex PCR to detect enterotoxin genes sea to sej of Staphylococcus aureus." Mol Cell Probes 17(5): 227-235.

Li, S. J., D. L. Hu, et al. (2011). "Superantigenic activity of toxic shock syndrome toxin-1 is resistant to heating and digestive enzymes." J Appl Microbiol 110(3): 729-736.

Lina, G., G. A. Bohach, et al. (2004). "Standard nomenclature for the superantigens expressed by Staphylococcus." J Infect Dis 189(12): 2334-2336.

Long, F., A. Zhu, et al. (2013). "Recent advances in optical biosensors for environmental monitoring and early warning." Sensors (Basel) 13(10): 13928-13948.

Luthje, P. and S. Schwarz (2006). "Antimicrobial resistance of coagulase-negative staphylococci from bovine subclinical mastitis with particular reference to macrolide-lincosamide resistance phenotypes and genotypes." J Antimicrob Chemother 57(5): 966-969.

Marr, J. C., J. D. Lyon, et al. (1993). "Characterization of novel type C staphylococcal enterotoxins: biological and evolutionary implications." Infect Immun 61(10): 4254-4262.

Marta, D., N. Wallin-Carlquist, et al. (2011). "Extended staphylococcal enterotoxin D expression in ham products." Food Microbiol 28(3): 617-620.

Martin, M. C., J. M. Fueyo, et al. (2004). "Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks." Int J Food Microbiol 94(3): 279-286.

Matthews, K. R., S. P. Oliver, et al. (1991). "Expression of glycocalyx by coagulase-negative Staphylococcus species isolated from bovine milk." J Appl Bacteriol 70(3): 227-232.

Mauff, G., I. Rohrig, et al. (1983). "Enterotoxigenicity of Staphylococcus aureus strains from clinical isolates." Eur J Clin Microbiol 2(4): 321-326.

Mayville, P., G. Ji, et al. (1999). "Structure-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactone peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence." Proc Natl Acad Sci U S A 96(4): 1218-1223.

McLauchlin, J., G. L. Narayanan, et al. (2000). "The detection of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction." J Food Prot 63(4): 479-488.

McNamara, P. J., K. C. Milligan-Monroe, et al. (2000). "Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus." J Bacteriol 182(11): 3197-3203.

Meyer, R. F. and M. J. Palmieri (1980). "Single radial immunodiffusion method for screening Staphylococcal isolates for enterotoxin." Appl Environ Microbiol 40(6): 1080-1085.

Meyrand, A., V. Atrache, et al. (1999). "Evaluation of an alternative extraction procedure for enterotoxin determination in dairy products." Lett Appl Microbiol 28(6): 411-415.

Miller, B. A., R. F. Reiser, et al. (1978). "Detection of staphylococcal enterotoxins A, B, C, D, and E in foods by radioimnunoassay, using staphyloccal cells containing protein A as immunoadsorbent." Appl Environ Microbiol 36(3): 421-426.

Monday, S. R. and G. A. Bohach (1999). "Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates." J Clin Microbiol 37(10): 3411-3414.

Mori, Y., K. Nagamine, et al. (2001). "Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation." Biochem Biophys Res Commun 289(1): 150-154.

Munson, S. H., M. T. Tremaine, et al. (1998). "Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus." Infect Immun 66(7): 3337-3348.

Murray, R. J. (2005). "Recognition and management of Staphylococcus aureus toxin-mediated disease." Intern Med J 35 Suppl 2: S106-119.

Musher, D. M., N. Lamm, et al. (1994). "The current spectrum of Staphylococcus aureus infection in a tertiary care hospital." Medicine (Baltimore) 73(4): 186-208.

Naimushin, A. N., S. D. Soelberg, et al. (2002). "Detection of Staphylococcus aureus enterotoxin B at femtomolar levels with a miniature integrated two-channel surface plasmon resonance (SPR) sensor." Biosens Bioelectron 17(6-7): 573-584.

Nakayama, A., A. Okayama, et al. (2006). "Development of a routine laboratory direct detection system of staphylococcal enterotoxin genes." J Med Microbiol 55(Pt 3): 273-277.

Nedelkov, D. and R. W. Nelson (2003). "Design and use of multi-affinity surfaces in biomolecular interaction analysis-mass spectrometry (BIA/MS): a step toward the design of SPR/MS arrays." J Mol Recognit 16(1): 15-19.

Nedelkov, D., A. Rasooly, et al. (2000). "Multitoxin biosensor-mass spectrometry analysis: a new approach for rapid, real-time, sensitive analysis of staphylococcal toxins in food." Int J Food Microbiol 60(1): 1-13.

Nestorescu, N., M. Popovici, et al. (1970). "[Studies of hospital infections caused by staphylocci and Salmonella in Rumania]." Arch Roum Pathol Exp Microbiol 29(4): 687-694.

Normann, S. J., R. F. Jaeger, et al. (1969). "Pathology of experimental enterotoxemia. The in vivo localization of staphylococcal enterotoxin B." Lab Invest 20(1): 17-25.

Norrgran, J., T. L. Williams, et al. (2009). "Optimization of digestion parameters for protein quantification." Anal Biochem 393(1): 48-55.

Notermans, S., W. J. van Leeuwen, et al. (1983). "Serum antibodies to enterotoxins produced by Staphylococcus aureus with special reference to enterotoxin F and toxic shock syndrome." J Clin Microbiol 18(5): 1055-1060.

Notermans, S., H. L. Verjans, et al. (1978). "Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of Staphylococcus aureus enterotoxin type B." Health Lab Sci 15(1): 28-31.

Notomi, T., H. Okayama, et al. (2000). "Loop-mediated isothermal amplification of DNA." Nucleic Acids Res 28(12): E63.

Novick, R. P. (2003). "Mobile genetic elements and bacterial toxinoses: the superantigen-encoding pathogenicity islands of Staphylococcus aureus." Plasmid 49(2): 93-105.

Novick, R. P., G. E. Christie, et al. (2010). "The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria." Nat Rev Microbiol 8(8): 541-551.

Novick, R. P. and D. Jiang (2003). "The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing." Microbiology 149(Pt 10): 2709-2717.

Oeljeklaus, S., H. E. Meyer, et al. (2009). "New dimensions in the study of protein complexes using quantitative mass spectrometry." FEBS Lett 583(11): 1674-1683.

Omoe, K., D. L. Hu, et al. (2013). "Emetic potentials of newly identified staphylococcal enterotoxin-like toxins." Infect Immun 81(10): 3627-3631.

Omoe, K., D. L. Hu, et al. (2003). "Identification and characterization of a new staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two kinds of plasmids." Infect Immun 71(10): 6088-6094.

Omoe, K., K. Imanishi, et al. (2005). "Characterization of novel staphylococcal enterotoxin-like toxin type P." Infect Immun 73(9): 5540-5546.

Omoe, K., K. Imanishi, et al. (2004). "Biological properties of staphylococcal enterotoxin-like toxin type R." Infect Immun 72(6): 3664-3667.

Ono, H. K., K. Omoe, et al. (2008). "Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T." Infect Immun 76(11): 4999-5005.

Orwin, P. M., J. R. Fitzgerald, et al. (2003). "Characterization of Staphylococcus aureus enterotoxin L." Infect Immun 71(5): 2916-2919.

Orwin, P. M., D. Y. Leung, et al. (2001). "Biochemical and biological properties of Staphylococcal enterotoxin K." Infect Immun 69(1): 360-366.

Ostyn, A., M. L. De Buyser, et al. (2010). "First evidence of a food poisoning outbreak due to staphylococcal enterotoxin type E, France, 2009." Euro Surveill 15(13).

Palmer, E. D. (1951). "The morphologic consequences of acute exogenous (Staphylococcic) gastroenteritis on the gastric mucosa." Gastroenterology 19(3): 462-475.

Pan, Y. Q., D. Ding, et al. (2007). "Expression and bioactivity analysis of Staphylococcal enterotoxin M and N." Protein Expr Purif 56(2): 286-292.

Papageorgiou, A. C., L. R. Plano, et al. (2000). "Structural similarities and differences in Staphylococcus aureus exfoliative toxins A and B as revealed by their crystal structures." Protein Sci 9(3): 610-618.

Papageorgiou, A. C., H. S. Tranter, et al. (1998). "Crystal structure of microbial superantigen staphylococcal enterotoxin B at 1.5 A resolution: implications for superantigen recognition by MHC class II molecules and T-cell receptors." J Mol Biol 277(1): 61-79.

Park, J. Y., L. K. Fox, et al. (2011). "Detection of classical and newly described staphylococcal superantigen genes in coagulase-negative staphylococci isolated from bovine intramammary infections." Vet Microbiol 147(1-2): 149-154.

Peles, F., M. Wagner, et al. (2007). "Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine milk in Hungary." Int J Food Microbiol 118(2): 186-193.

Peng, H. L., R. P. Novick, et al. (1988). "Cloning, characterization, and sequencing of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus." J Bacteriol 170(9): 4365-4372.

Pfaller, M. A. and L. A. Herwaldt (1988). "Laboratory, clinical, and epidemiological aspects of coagulase-negative staphylococci." Clin Microbiol Rev 1(3): 281-299.

Pinchuk, I. V., E. J. Beswick, et al. (2010). "Staphylococcal enterotoxins." Toxins (Basel) 2(8): 2177-2197.

Pocsfalvi, G., G. Cacace, et al. (2008). "Proteomic analysis of exoproteins expressed by enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains." Proteomics 8(12): 2462-2476.

Podkowik, M., J. Y. Park, et al. (2013). "Enterotoxigenic potential of coagulase-negative staphylococci." Int J Food Microbiol 163(1): 34-40.

Prohaska, J. V., V. Kocandrle, et al. (1966). "Hemodynamic changes in response to staphylococcal exotoxin and enterotoxin." Bull Soc Int Chir 25(6): 727-736.

Rajagopalan, G., M. K. Smart, et al. (2006). "Acute systemic immune activation following conjunctival exposure to staphylococcal enterotoxin B." Infect Immun 74(10): 6016-6019.

Rall, V. L., F. P. Vieira, et al. (2008). "PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk." Vet Microbiol 132(3-4): 408-413.

Rather, P. N., A. P. Davis, et al. (1986). "Slime production by bovine milk Staphylococcus aureus and identification of coagulase-negative staphylococcal isolates." J Clin Microbiol 23(5): 858-862.

Reck, B., P. H. Scheuber, et al. (1988). "Protection against the staphylococcal enterotoxin-induced intestinal disorder in the monkey by anti-idiotypic antibodies." Proc Natl Acad Sci U S A 85(9): 3170-3174.

Regassa, L. B., R. P. Novick, et al. (1992). "Glucose and nonmaintained pH decrease expression of the accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus." Infect Immun 60(8): 3381-3388.

Reiser, R. F., R. N. Robbins, et al. (1983). "Purification and some physicochemical properties of toxic-shock toxin." Biochemistry 22(16): 3907-3912.

Robbins, R., S. Gould, et al. (1974). "Detecting the enterotoxigenicity of Staphylococcus aureus strains." Appl Microbiol 28(6): 946-950.

Rosec, J. P. and O. Gigaud (2002). "Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France." Int J Food Microbiol 77(1-2): 61-70.

Rosec, J. P., J. P. Guiraud, et al. (1997). "Enterotoxin production by staphylococci isolated from foods in France." Int J Food Microbiol 35(3): 213-221.

Rusnak, J. M., M. Kortepeter, et al. (2004). "Laboratory exposures to staphylococcal enterotoxin B." Emerg Infect Dis 10(9): 1544-1549.

Ruzin, A., J. Lindsay, et al. (2001). "Molecular genetics of SaPI1–a mobile pathogenicity island in Staphylococcus aureus." Mol Microbiol 41(2): 365-377.

Sakai, F., H. Ihara, et al. (2008). "Characteristics of enterotoxin H-producing Staphylococcus aureus isolated from clinical cases and properties of the enterotoxin productivity." J Food Prot 71(9): 1855-1860.

Schad, E. M., I. Zaitseva, et al. (1995). "Crystal structure of the superantigen staphylococcal enterotoxin type A." EMBO J 14(14): 3292-3301.

Schaeffer, W. I. (1970). "Interaction of staphylococcal enterotoxin B with cell cultures I. Effect of serum and testing procedures." Infect Immun 1(5): 455-458.

Scharff, R. L. (2012). "Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States." J Food Prot 75(1): 123-131.

Schelin, J., N. Wallin-Carlquist, et al. (2011). "The formation of Staphylococcus aureus enterotoxin in food environments and advances in risk assessment." Virulence 2(6): 580-592.

Schleifer, K. H., U. Geyer, et al. (1983). "Elevation of Staphylococcus sciuri subsp. lentus (Kloos et al.) to Species Status: Staphylococcus lentus (Kloos et al.) comb. nov." Syst Appl Microbiol 4(3): 382-387.

Schlievert, P. M. and L. C. Case (2007). "Molecular analysis of staphylococcal superantigens." Methods Mol Biol 391: 113-126.

Schmidt, H. and M. Hensel (2004). "Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis." Clin Microbiol Rev 17(1): 14-56.

Schmidt, J. J. and L. Spero (1983). "The complete amino acid sequence of staphylococcal enterotoxin C1." J Biol Chem 258(10): 6300-6306.

Schotte, U., N. Langfeldt, et al. (2002). "Detection of staphylococcal enterotoxin B (SEB) by enzyme-linked immunosorbent assay and by a rapid hand-held assay." Clin Lab 48(7-8): 395-400.

Schwabe, M., S. Notermans, et al. (1990). "Inactivation of staphylococcal enterotoxins by heat and reactivation by high pH treatment." Int J Food Microbiol 10(1): 33-42.

Schwarzkopf, A. (1995). "[Coagulase gene polymorphism in Staphylococcus aureus–a new epidemiologic marker]." Immun Infekt 23(1): 9-14.

Seo, K. S., S. U. Lee, et al. (2007). "Long-term staphylococcal enterotoxin C1 exposure induces soluble factor-mediated immunosuppression by bovine CD4+ and CD8+ T cells." Infect Immun 75(1): 260-269.

Sergeev, N., D. Volokhov, et al. (2004). "Simultaneous analysis of multiple staphylococcal enterotoxin genes by an oligonucleotide microarray assay." J Clin Microbiol 42(5): 2134-2143.

Shafer, W. M. and J. J. Iandolo (1978). "Chromosomal locus for staphylococcal enterotoxin B." Infect Immun 20(1): 273-278.

Shafer, W. M. and J. J. Iandolo (1978). "Staphylococcal enterotoxin A: a chromosomal gene product." Appl Environ Microbiol 36(2): 389-391.

Shalita, Z., I. Hertman, et al. (1977). "Isolation and characterization of a plasmid involved with enterotoxin B production in Staphylococcus aureus." J Bacteriol 129(1): 317-325.

Shanahan, F., J. A. Denburg, et al. (1985). "Mast cell heterogeneity: effects of neuroenteric peptides on histamine release." J Immunol 135(2): 1331-1337.

Shebuski, J. R., O. Vilhelmsson, et al. (2000). "Effects of growth at low water activity on the thermal tolerance of Staphylococcus aureus." J Food Prot 63(9): 1277-1281.

Shimizu, A., M. Fujita, et al. (2000). "Characterization of Staphylococcus aureus coagulase type VII isolates from staphylococcal food poisoning outbreaks (1980-1995) in Tokyo, Japan, by pulsed-field gel electrophoresis." J Clin Microbiol 38(10): 3746-3749.

Shopsin, B., B. Mathema, et al. (2003). "Prevalence of agr specificity groups among Staphylococcus aureus strains colonizing children and their guardians." J Clin Microbiol 41(1): 456-459.

Silverman, S. J., G. T. Moore, et al. (1969). "Effect of formaldehyde on the immunogenicity of staphylococcal enterotoxin B for Macaca mulatta." J Bacteriol 98(2): 443-446.

Simonova, M. A., T. I. Valyakina, et al. (2012). "Development of xMAP assay for detection of six protein toxins." Anal Chem 84(15): 6326-6330.

Skaar, E. P. and O. Schneewind (2004). "Iron-regulated surface determinants (Isd) of Staphylococcus aureus: stealing iron from heme." Microbes Infect 6(4): 390-397.

Slavik, R., J. Homola, et al. (2002). "A miniature fiber optic surface plasmon resonance sensor for fast detection of Staphylococcal enterotoxin B." Biosens Bioelectron 17(6-7): 591-595.

Smith, J. L., R. C. Benedict, et al. (1983). "Heat injury in Staphylococcus aureus 196E: protection by metabolizable and non-metabolizable sugars and polyols." Appl Environ Microbiol 46(6): 1417-1419.

Soares, J. C., M. R. Marques, et al. (2011). "Biodiversity and characterization of Staphylococcus species isolated from a small manufacturing dairy plant in Portugal." Int J Food Microbiol 146(2): 123-129.

Stiles, J. W. and J. C. Denniston (1971). "Response of the rhesus monkey, Macaca mulatta, to continuously infused staphylococcal enterotoxin B." Lab Invest 25(6): 617-625.

Strickler, M. P., R. J. Neill, et al. (1989). "Rapid purification of staphylococcal enterotoxin B by high-pressure liquid chromatography." J Clin Microbiol 27(5): 1031-1035.

Su, Y. C. and A. C. Wong (1995). "Identification and purification of a new staphylococcal enterotoxin, H." Appl Environ Microbiol 61(4): 1438-1443.

Sugiyama, H. and T. Hayama (1965). "Abdominal viscera as site of emetic action for staphylococcal enterotoxin in the monkey." J Infect Dis 115(4): 330-336.

Surgalla, M. J., M. S. Bergdoll, et al. (1952). "Use of antigen-antibody reactions in agar to follow the progress of fractionation of antigenic mixtures: application to purification of staphylococcal enterotoxin." J Immunol 69(3): 357-365.

Surgalla, M. J., M. S. Bergdoll, et al. (1953). "Some observations on the assay of staphylococcal enterotoxin by the monkey-feeding test." J Lab Clin Med 41(5): 782-788.

Swaminathan, S., W. Furey, et al. (1995). "Residues defining V beta specificity in staphylococcal enterotoxins." Nat Struct Biol 2(8): 680-686.

Tamarapu, S., J. L. McKillip, et al. (2001). "Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy products." J Food Prot 64(5): 664-668.

Tatini, S. R., W. D. Wesala, et al. (1973). "Production of staphylococcal enterotoxin A in Blue, Brick, Mozzarella, and Swiss cheeses." J Dairy Sci 56(4): 429-435.

Taylor, A. L. and M. J. Llewelyn (2010). "Superantigen-induced proliferation of human CD4+CD25- T cells is followed by a switch to a functional regulatory phenotype." J Immunol 185(11): 6591-6598.

Taylor, S. L., L. R. Schlunz, et al. (1982). "Emetic action of staphylococcal enterotoxin A on weanling pigs." Infect Immun 36(3): 1263-1266.

Tegmark, K., E. Morfeldt, et al. (1998). "Regulation of agr-dependent virulence genes in Staphylococcus aureus by RNAIII from coagulase-negative staphylococci." J Bacteriol 180(12): 3181-3186.

Thomas, D., S. Chou, et al. (2007). "Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins." Chem Immunol Allergy 93: 24-41.

Thomas, D. Y., S. Jarraud, et al. (2006). "Staphylococcal enterotoxin-like toxins U2 and V, two new staphylococcal superantigens arising from recombination within the enterotoxin gene cluster." Infect Immun 74(8): 4724-4734.

Throup, J. P., F. Zappacosta, et al. (2001). "The srhSR gene pair from Staphylococcus aureus: genomic and proteomic approaches to the identification and characterization of gene function." Biochemistry 40(34): 10392-10401.

Troller, J. A. (1971). "Effect of water activity on enterotoxin B production and growth of Staphylococcus aureus." Appl Microbiol 21(3): 435-439.

Tseng, J., J. L. Komisar, et al. (1995). "Humoral immunity to aerosolized staphylococcal enterotoxin B (SEB), a superantigen, in monkeys vaccinated with SEB toxoid-containing microspheres." Infect Immun 63(8): 2880-2885.

Valero, A., F. Perez-Rodriguez, et al. (2009). "Modelling the growth boundaries of Staphylococcus aureus: Effect of temperature, pH and water activity." Int J Food Microbiol 133(1-2): 186-194.

van Gessel, Y. A., S. Mani, et al. (2004). "Functional piglet model for the clinical syndrome and postmortem findings induced by staphylococcal enterotoxin B." Exp Biol Med (Maywood) 229(10): 1061-1071.

Vasconcelos, N. G., V. C. Pereira, et al. (2011). "Molecular detection of enterotoxins E, G, H and I in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci isolated from clinical samples of newborns in Brazil." J Appl Microbiol 111(3): 749-762.

Vicosa, G. N., A. Le Loir, et al. (2013). "egc characterization of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates obtained from raw milk and cheese." Int J Food Microbiol 165(3): 227-230.

Vos, M. C., M. D. Behrendt, et al. (2009). "5 years of experience implementing a methicillin-resistant Staphylococcus aureus search and destroy policy at the largest university medical center in the Netherlands." Infect Control Hosp Epidemiol 30(10): 977-984.

Waage, S., T. Mork, et al. (1999). "Bacteria associated with clinical mastitis in dairy heifers." J Dairy Sci 82(4): 712-719.

Wadsworth, C. (1957). "A slide microtechnique for the analysis of immune precipitates in gel." Int Arch Allergy Appl Immunol 10(6): 355-360.

Wallin-Carlquist, N., R. Cao, et al. (2010). "Acetic acid increases the phage-encoded enterotoxin A expression in Staphylococcus aureus." BMC Microbiol 10: 147.

Wallin-Carlquist, N., D. Marta, et al. (2010). "Prolonged expression and production of Staphylococcus aureus enterotoxin A in processed pork meat." Int J Food Microbiol 141 Suppl 1: S69-74.

Wang, J. T., Y. C. Chen, et al. (2002). "Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Taiwan." Diagn Microbiol Infect Dis 42(3): 199-203.

Weir, D., C. Jones, et al. (2007). "Report of a strain of Staphylococcus caprae with the genes for enterotoxin A and enterotoxin-like toxin type P." J Clin Microbiol 45(10): 3476-3477.

Weng, C. F., J. L. Komisar, et al. (1997). "Immediate responses of leukocytes, cytokines and glucocorticoid hormones in the blood circulation of monkeys following challenge with aerosolized staphylococcal enterotoxin B." Int Immunol 9(12): 1825-1836.

Wertheim, H. F., W. B. van Leeuwen, et al. (2005). "Associations between Staphylococcus aureus Genotype, Infection, and In-Hospital Mortality: A Nested Case-Control Study." J Infect Dis 192(7): 1196-1200.

Williams, R. R., C. T. Wehr, et al. (1983). "High-performance liquid chromatography of staphylococcal enterotoxin B." J Chromatogr 266: 179-186.

Wilson, G. J., K. S. Seo, et al. (2011). "A novel core genome-encoded superantigen contributes to lethality of community-associated MRSA necrotizing pneumonia." PLoS Pathog 7(10): e1002271.

Wiser, I., R. D. Balicer, et al. (2007). "An update on smallpox vaccine candidates and their role in bioterrorism related vaccination strategies." Vaccine 25(6): 976-984.

Woodburn, M. J. and D. H. Strong (1960). "Survival of Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, and Streptococcus faecalis frozen in simplified food substrates." Appl Microbiol 8: 109-113.

Yagi, J., T. Uchiyama, et al. (1994). "Stimulator cell type influences the response of T cells to staphylococcal enterotoxins." J Immunol 152(3): 1154-1162.

Yamaguchi, T., T. Hayashi, et al. (2000). "Phage conversion of exfoliative toxin A production in Staphylococcus aureus." Mol Microbiol 38(4): 694-705.

Yan, X., B. Wang, et al. (2012). "Characterization of Staphylococcus aureus strains associated with food poisoning in Shenzhen, China." Appl Environ Microbiol 78(18): 6637-6642.

Yarwood, J. M., J. K. McCormick, et al. (2001). "Identification of a novel two-component regulatory system that acts in global regulation of virulence factors of Staphylococcus aureus." J Bacteriol 183(4): 1113-1123.

Yoshizawa, Y., J. Sakurada, et al. (2000). "An exfoliative toxin A-converting phage isolated from Staphylococcus aureus strain ZM." Microbiol Immunol 44(3): 189-191.

Zell, C., M. Resch, et al. (2008). "Characterization of toxin production of coagulase-negative staphylococci isolated from food and starter cultures." Int J Food Microbiol 127(3): 246-251.

Zhang, S., J. J. Iandolo, et al. (1998). "The enterotoxin D plasmid of Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej)." FEMS Microbiol Lett 168(2): 227-233.