Metode Pentru Diagnosticul Sindromului Down

UNIVERSITATEA DIN BUCIURESTI

Facultatea de Biologie

Lucrare de Licenta:

Metode citogenetice si moleculare utilizate pentru diagnosticul Sindromului Down

Coordonator stiintific:

Conf. univ. dr. Cimponeriu Danut

Student:

Stancu Luciana

Bucuresti

2016

Cuprins

Introducere

Scopul lucrării, obiective generale si specifice…………………………………………………..

Partea teoretica

Bazele genetice ale testelor de diagnostic…………………………………………………

Organizarea materialului genetic……………………………………………………

Cariotipul uman si patologic………………………………………………………

Metode utilizate în diagnosticul Sindromului Down……………………………………..

Diagnosticul citogenetic………………………………………………………….

Citogenetică clasică în diagnostic-bandarea cromozomială………………

Citogenetică moleculară în diagnostic…………………………………

FISH-hibridizare fluorescentă in situ…………………………..

Diagnosticul molecular……………………………………………………………..

PCR(reacția de polimerizare în lanț)……………………………………

Partea experimentala

Materiale si metode de diagnostic…………………………………………………………

Metode citogenetice de diagnostic……………………………………………….

Tehnici citogenetice clasice si moleculare de diagnostic………………

Bandarea GTG……………………………………………………

Tehnici genetice moleculare de analiză…………………………………………….

Extractia si purificarea AND genomic……………………………………

Verificarea concentrației si puritații AND……………………………..

Amplificarea prin PCR…………………………………………………

Rezultate si discutii

Interpretarea rezultatelor obținute prin diagnostic citogenetic……………………………

Rezultate obținute pe baza cariotipului……………………………………………

Interpretarea rezultatelor obținute prin diagnostic molecular.……………………………

Rezultate obținute prin PCR………………………………………………………

Concluzii

Introducere

Metodele de diagnostic ale Sindromului Down sunt extrem de importante in ceea ce privește diagnosticul prenatal al acestei afecțiuni dar si testele genetice care stau la baza determinării modificărilor morfologice și fiziologice care afectează pacienții cu Sindrom Down.

În general, alterările materialului genetic au drept consecință apariția unor modificări structurale și fiziologice patogene păna la letale, care sunt descrise în marea lor majoritate, ca diferite sindroame cu impact social și individual major. Alterările materialului genetic se pot produce atât la nivelul unei singure gene, dar pot afecta chiar și cromozomi intregi.

Prin teste genetice se acoperă detectarea unor aberații care sunt cauzele unora dintre cele mai frecvente sindroame și anume, triploidia și aneuploidia dintre sindroamele cromozomiale numerice și respectiv o serie de aberații structurale. Sindromul Down (trisomia 21, SD) este cea mai frecventă maladie cauzată de o trisomie autozmală, anomalie cauzată de prezența cromozomului 21 în triplu exemplar. Cromozomul suplimentar, în majoritatea cazurilor, se datorează nondizjuncției, adică eșecului separării cromozomilor în timpul meiozei. În aproximativ 95% din cazuri nondizjunctia este maternă, aparând în perioada maturației ovocitului, în meioza reducțională. Iar singurul factor dovedit pâna în prezent că ar influența semnificativ nondijuncția cromozomilor autozomali acrocentrici este vârsta mamei.

Sindromul Down este una dintre cele mai “ușoare” anomalii cromozomale, astfel având o prevalența la naștere de 1/1800-1/1700. Prenatal Sindromul Down poate fi detectat prin teste de screening dar și prin amniocenteză, respectiv cariotipare. Postnatal Sindromul Down este detectat prin aspectele fiziologice ale nou-născutului, dar este necesară analiza cromozomală pentru confirmarea diagnosticului.

Cele mai utilizate metode de diagnostic ale Sindromului Down sunt metodele citogenetice clasice care cuprind cariotiparea prin bandare cromozomală si citogenetica moleculară cu tehnica FISH-hibridizare fluorescentă in situ. Prin testele de diagnostic molecular s-a realizează secvențierea genelor, astfel au fost indentificate 329 de gene în cromozomul 21. Indentificarea genelor este importantă în fiziopatologia maladiei dar si pentru imbunătațirea diagnosticului, prevenției si tratamentlui.

Scopul acestei lucrări este acela de a stabili cele mai eficiente metode de diagnostic al Sindromului Down, iar obiectivele principale sunt analiza citogenetică si moleculară a acestei anomalii cromozomiale si studiul unor polimorfisme ce caracterizează structura genetică a copiilor cu Sindrom Down. Scopul și obiectivele acestei lucrări sunt justificate de implicațiile economico-sociale: riscul mare de mortalitate prenatală, afecțiunile infantile determinarte de anomaliile cromozomiale- implicații ce impun perfecționarea metodelor de diagnostic al Sindromului Down.

Bazele genetice ale testelor de diagnostic

In funcție de rolul factorilor genetici în cauzalitatea bolilor umane, acestea au fost clasificate în trei categorii: boli ecologice-generate prin acțiunea factorilor de mediu (negenetice), boli multifactoriale-acțiunea combinată a factorilor de mediu și genetici, boli genetice-determinate de mutați, predominant. Dar trebuie clarificat faptul că în afară de afecțiunile traumatice, termenul “negenetic” este inadegvat, deoarece concepția și dezvoltarea unui individ depind de interacțiunea factorilor genetici și de mediu (Covic si colab., 2011).

Bolile genetice sunt afecțiuni determinate de mutații genetice și anomalii cromozomiale, dar genetica medicală se ocupă și de studiul bolilor multifactoriale. Astfel genetica umană a dobandit un rol din ce în ce mai important în medicina clinică avand rol important în înțelegerea celor mai multe boli majore, a diagnosticului și profilaxiei lor (Covic si colab., 2011).

Profilaxia bolilor genetice este ansamblul de măsuri medico-sanitare care se iau în considerare pentru prevenirea apariției și răspândirii acestor boli. Astfel de măsuri se aplică în vederea: indentificării și evitării cauzelor bolilor genetice, depistării persoanelor și familiilor cu risc genetic crescut, diadnosticării precoce a persoanelor afectate (Neagoș, 2013).

Profilaxia bolilor genetice poate fi primară sau secundară. Profilaxia primară are ca obieciv prevenirea apariței unor boli genetice la un organism care nu a fost încă afectat, prin două mecanisme: prevenția apariției mutațiilor si transmiterii lor, preîntâmpinarea apariției bolii la indivizii cu predispoziție genetică la boală. Profilaxia secundară are ca scop prevenirea recurenței bolii la un organism afectat anterior de boală, obiectiv realizat prin: screening si diagnostic prenatal (depistarea precoce a bolii) și screenin populațional sau familial (prevenirea manifestării bolii sau ale complicațiilor la un copil născut cu o boală genetică) (Neagoș, 2013).

Bolile genetice se deosebesc între ele prin tipul de modificări genetice, localizarea și acțiunea lor, astfel există cinci categorii de boli genetice: boli cromozomiale, boli monogenice (mendeliene sau moleculare), boli mitocondriale, boli multifactoriale si boli ale genomului celulelor somatice (Covic si colab., 2011).

Bolile cromozomiale sunt produse de modificări în numărul și structura cromozomilor, vizibile la microscop. Frecvența anomaliilor cromozomiale este estimată la 6‰ din nou-nascuți vii, dar pe baza datelor obținute cu tehnicile de marcaj în benzi si FISH, se apreciază că frecvența reală este de 9-10‰ nou născuți vii (Covic si colab., 2011).

Bolile monogenice sunt produse de mutația unei singure gene majore (din genomul nuclear) care codifică pentru o enzimă sau o proteină de structură și au o transmitere mendeliană. Incidența medie globală este de 10‰ nou-nascuți. În aproximativ 40% din bolile monogenice a fost indentificată si localizată gena implicată, astfel pentru aceste afecțiuni se folosește frecvent termenul de boli moleculare (Covic si colab., 2011) .

Bolile mitocondriale sunt un tip particular de boli monogenice produse de mutații în genomul mitocondrial fiid afectată producerea de energie în mușchi și nervi. Până în przent se cunosc 65 de boli mitocondriale rare (Covic si colab., 2011).

Bolile multifactoriale sunt determinate de intervenția unor factori ereditari în interacțiune cu factorii de mediu (Covic si colab., 2011). Astfel bolile multifactoriale sunt maladii comlpexe, relativ frecvente, cu o incidență totală medie ce depășește 50‰.

Bolile prin mutații somatice sunt produse prin efectul cumulativ al unor mutații somatice succesive, in gene diferite. În această categorie intră o mare parte a cancerelor, boli autoimune, și chiar procesu de îmbătrânire. Aceste boli nu se transmit la descendenți, se produc dupa concepție și sunt limitate la celulele somatice.

Testele de diagnostic genetic sunt utile în primul rând în diagnosticul prenatal. Diagnosticul prenatal este precedat de screening-ul prenatal care are funcția de a indentifica sarciniile cu risc, însă doar diagnosticul prenatal are atribuția de a certifica prezența sau abesnța unei anomalii fetale. Astfel prin diagnostic prenatal se pot indentifica in cursul sarcinii prezența unor afecțiuni ereditare sau anomalii congenitale (Neagoș, 2013).

Există anumite criterii în funcție de care se recomandă un diagnostic prenatal: vârsta mamei (risc pentru Sindrom Down), istoric familial pozitiv, semne de alarmă ecografice, rezultate pozitive în investigațiile de screening prenatal. În general, metodele de diagnostic prenatal sunt metode invazive. Anomaliile cromozomiale se pot indentifica prin amniocenteză, biopsia vilozitaților coriale, analiza celulelor fetale din sângele matern (Neagoș, 2013).

Bolile genetice prezintă o serie de caracteristici genetale, putând fi indentificate direct prin analiza la nivelul cromozomilor sau a ADN-ului genomic și indirect prin efectele primare (la nivelul proteinelor) sau secundare (la nivel celular) (Covic si colab., 2011).

Genetica medicala se ocupă de diagnosticul și îngrijirea pacienților cu boli genetice, precum și de familiile in cauză, prin: sfat genetic, diagnostic prenatal, screening neonatal sau diagnostic presimptomatic. Iar datorită implicațiilor sociale și progreselor din ultimele decenii in practica medicală , serviciile de genetică medicală ar trenuii sa devină o parte integrantă a strategiei de sănătate a fiecărei țări (Covic si colab., 2011).

În consultul și sfatul genetic o valoare deosebită pentru diagnosticul final o au testele genetice: analize cromozomiale, biochimice si testele ADN. Astfel diagnosticul cromozomial se poate efectua prin tehnici de citogenetică convențională sau prin tehnici de citogenetică moleculară ( FISH, M-FISH, CGH, microrețele de ADN). Iar prin diagnostic molecular se studiază ADN si ARN celular, urmărind indentificarea mutatiilor și polimorfismelor genetice implicate în producerea boliilor prin: hibridizare moleculară, metoda PCR, secvențiere ADN (Covic si colab., 2011).

Organizarea materialului genetic

Nucleul este centrul de comandă și control al tuturor activităților celulare, conținând aproximativ 99,5 % din toată cantitatea de AND a celulei. Din punct de vedere structural, nucleul deiferă in cele două faze ale ciclului celular: interfază și diviziune. Interfaza cuprinde patru etape: faza G1-presintetică (cromozomi despiralizați, monocromatidieni), faza S-sinteză AND (replicare semiconservativă), faza G2-postsintetică (cromozomi despiralizați, bicromatidieni). În fazele incipiente ale diviziunii, cromozomii se condensează și se spiralizează, devenind vizibili la microscopul optic. Iar în mitoză are loc dizjuncția cromatidiană, segregarea totală și egală a materialului genetic dublat in faza S. (Covic si colab., 2011).

La eucriote AND-ul este asociat cu proteine histonice si non-histonice rezultând un compex nucleo-proteic demumit cromatină. Fibra de cromatină fiind unitatea structurală a cromatinei. Ințeractiuniile dintre AND și proteine au un rol fundamental în organizarea supramoleculară a AND, dar și un rol funcțional în mecanismele complexe care reglează replicarea și expresia genelor. Fibra de cromatină are capacitate variabilă de condensare, astfel că, în timpul diviziunii celulare, cromozomii sunt mai lungi și mai subțiri în profază și telofază, și mai scurți și mai groși în metafază. Fibra de cromatină se pliază de-a lungul brațelor cromozomului și interdigitează în regiunea centromerică a cromozomului metafazic cu fibra de cromatină a cromatidei surori (Neagoș, 2013).

Cromatina există sub două forme morfo-funcționale distincte: eucromatina și heterocromatina. Eucromatina este activă din punt de vedere genetic, conținând in cea mai mare parte secvențe unice bogate în perechile de baze G-C și proteine nehistonice, replicându-se precoce la începutul fazei S. Eucromatina se condensează puțin, se colorează difuz și formează benzile G negative ale cromozomilor. Heterocromatina este inactivă genetic fiind alcătuita din mai multe secvențe repetitive de ADN în care predomină perechiile de baze A-T și histonele, replicându-se tardiv la sfârșitul fazei S. Heterocromatina este foarte condensată și se colorează intens, formând benzile G pozitive ale cromozomilor. Heterocromatina poate fi constitutivă sau facultativă, cea constitutivă este în permanență condensată și se găsește in regiunea centromerică și pericentromerică, pe brațul lung al cromozomului Y, pe brațele scurte ale cromozomilor acrocentrici și în constricțiile secundare ale cromozomilor 1, 9, și 16. Heterocromatina facultativă diferă de la celulă la celulă (ex. cromatina sexuală) și chiar la organisme diferite, fiind rezultatul unei heterocromatinizări diferențiate. (Covic si colab., 2011).

Proteinele histonice si non-histonice din structura fibrei de cromatină au rolul de a compacta genomul diploid (~2m lungime) în cromozomi ( lungime totală in metafază ~230 µm) și nucleu ( 10 µm diametru). În consecință, ADN-ul și histonele sunt supuse unor spiralizări multiple, rezultând un sistem ierarhizat al stărilor morfologice ale fibrei de cromatină:

-fibra de cromatină cu nucleozomi: diametru de 10-11 nm, care ia naștere prin construirea unui miez histonic (octamer proteic) din câte două molecule de histone H2A, H2B, H3 și H4, înfășurarea unei secvențe de ADN (146 pb), în jurul octanerului proteic, realizând 1 și ¾ tururi de spiră în jurul miezului rezultând o structura de nucleozom. Unirea nucleozomilor se face cu ajutorul unei secvențe de ADN linker și histona H1;

-fibra de cromatină cu solenoizi: diametru de 30 nm, se formează prin supraînfășurarea și gruparea a 6-7 nucleozomi la o rotație de 360°;

-fibra de cromatină cu bucle laterale: diametru de 300 nm, se formează prin fixarea solenoidului la nivelul situsurilor specifice de ancorare (SAR), de axul proteic nonhistonic longitudinal al cromozomului (scaffold), rezultând domenii cu bucle laterale atașate la matrixul proteic;

-cromozomul metafazic: diametru de 1400 nm, buclele laterale sunt supuse unei hipercondensări prin răsucirea în axul longitudinal al cromozomului a fibrei bucleiforme. Fibra bucleiformă se dispune spațial în rozete hexametrice legate prin ADN, o rotație completă a fibrei bucleiforme cuprinde aproximativ 30 de rozete hexametrice, care prin hipercondensare dau particularitățile morfo-structurale ale cromozomului metafazic.

Figura 1.0. Schema generala a organizarii cromatinei cu evidentierea principalelor nivele cunoscute de organizare (Campbell, et al.,Biology 2002)

Bibliografie

Daniela Neagoș, 2013, Genetica umana-notițe de curs, Editura All, București, pag. 118-123.

Covic M., Ștefănescu D., Sandovici I. et al, 2011, Genetică medicală-Ediția a II-a, Editura Polirom, București, pag. 333-342.

Surse imagini:

– Campbell, N.A., J.B. Reece (2002). Biology, Sixth Edition. Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings. 1250 pp- http://www.creeaza.com/referate/chimie/STRUCTURA-MOLECULARA-A-CROMOZO723.php