Metode Histochimice de Detectare a Fierului In Tesuturi – Semnificatii Clinice

Metode histochimice de detectare a fierului în țesuturi – semnificații clinice

Cuprins

Fierul este un element esențial vieții, el fiind necesar unei mari varietăți de molecule pentru menținerea structurii normale, dar și pentru realizarea unei multitudini de procese celulare, de la generarea de energie și replicarea ADN, la transportul oxigenului și protecția împotriva stresului oxidativ. Cu toate acestea, concentrația și distribuția sa în organism trebuie atent controlate datorită efectului toxic pe care o cantitate prea mare de fier o poate avea asupra celulelor.

Deși mecanismele moleculare de asimilare, transport și stocare a fierului sunt departe de a fi pe deplin elucidate, o mai bună înțelegere a acestor procese a făcut ca fierulsă devină un factor important în patologie. Cantitățile normale de fier asigură o activitate metabolică necesară funcționării corecte a celulelor și organelor, iar neîncadrarea în aceste limite normale face ca organismul să fie predispus la o serie întreagă de maladii, printre care se numără și cancerul.

Cancerul mamar este cauza principală a morții printre femei, factorii de risc incluzând istoricul familiei, menarha timpurie, nuliparitatea, prima naștere la o vârstă înaintată, menopauza întârziată, obezitatea, lipsa activității fizice, prezența unei tumori mamare benigne, utilizarea contraceptivelor orale sau expunerea la radiații ionizante. În ceea ce privește cancerul prostatic și cerebral, factorii care cresc apariția lor sunt înaintarea în vârstă, istoricul familiei, dar și factorii de mediu.

În acest studiu am încercat să demonstrăm prezența unei legături între cantitatea de fier prezentă la nivelul tumorilor mamare, prostatice și cerebrale și gradul de avansare al acestora, corelând depozitele de fier cu diferiți factori ce pot influența și apariția și dezvoltarea cancerului.

II. Aspecte teoretice

II.1. Metabolismul și formele de depozitare ale fierului în organism

II.1.1. Considerente generale

Fierul este al patrulea cel mai abundent metal din scoarța terestră și cel mai abundent metal tranzițional . El este un micronutrient indispensabil metabolismului și proliferării celulelor.În alimentație, acesta se găsește în două forme, fie în componența hemului, prezent în produsele din carne, fie sub formă de fier neasociat hemului, prezent în legume, fructe, sau semințe. În corpul unui adult se găsesc în medie 3-5 g de fier. Dintre acestea, aproximativ 65-70 % sunt prezente în structura hemoglobinei, 20% constituie rezerva de fier prezentă la nivelul macrofagelor și hepatocitelor, iar restul de 10-15% acționează pe post de co-factor pentru numeroase proteine, respectiv enzime. Aceste forme ale fierului nu sunt statice, existând un continuu flux între ele. Acest flux necesită un sistem de transport care să reușească să mențină fierul într-o formă redox inactivă și solubilă și, în același timp, ușor accesibilă celulelor.

II.1.1.1. Transferina

Transferina (Tf)este cea mai importantă proteină extracelulară capabilă să lege și să transporte fierul prin sânge la organe și țesuturi. Ea este proteină bilobală produsă majoritar de ficat, fiind alcătuită dintr-un singur lanț polipeptidic. Acești lobi par să fi apărut prin duplicarea unei gene, ei fiind separați printr-o scurtă regiune de tip loop. Fiecare lob prezintă câte un situs de legare reversibilă al fierului cu o mare afinitate pentru ionul feric (Fig. II.1.1). Situsurile sunt plasate în regiunile amino terminală, respectiv carboxil terminală. Legarea ionului feric la transferină este asociată cu legarea unui anion, în general bicarbonatul , pe post de ion sinergetic și face ca proteina să sufere o modificare conformațională și să treacă din forma ,,deschisă” apo în forma ,,închisă” holo în care ionii ferici sunt plasați în interiorul fiecărui lob. Ea este capabilă să lege doi ioni de fier per moleculă, situsurile de legătură fiind formate din patru liganzi – doi aparținând proteinei și doi carbonatului. Ionii ferici sunt puternic legați la moleculele de transferină, constanta de legătură fiind de 1028 . Acest aspect face ca fierul să fie menținut într-o formă solubilă, incapabilă de a participa la reacții redox, astfel încât ei să poată fi cu ușurință transportațiprin organism . În celule, Fe3+ este eliberat de transferină prin protonarea ionilor carbonat în urma instalării unui mediu acid.

Transferina este una dintre cele mai abundente proteine din plasmă, fiind prezentă în concentrație de 2-4 mg/mL la oameni. În condiții normale, doar 30% din situsurile de legare ale transferinei din sânge sunt ocupate.Astfel este oferit un exces de situsuri de legare care ajută la menținerea nivelului foarte scăzut de fier liber, potențial toxic .

II.1.1.2. Propritățile chimice și importanța fierului în organism

Importanța fierului în sistemele biologice constă tocmai în abilitatea sa de a exista în două stări de oxidare diferite – Fe2+ (ionul feros) și Fe3+(ionul feric). Acest lucru îi permite să joace rolul de co-factor în reacțiile de transfer de electroni și să participe la metabolismul energetic (exemplu : aconitaza, succinat dehidrogenaza, NADH dehidrogenaza, citocromii a, b și c) , să participe la sinteza neurotransmițătorilor, fiind co-factor pentru tirozin – hidroxilaza și triptofan – hidroxilaza, să participe la sinteza de mielină prin permiterea biosintezei lipidelor și a colesterolului, să participe la transportul și depozitarea oxigenului de către hemoglobină sau mioglobină, la diverse reacții enzimatice implicate în sinteza de ADN (exemplu: ribonucleotid reductaza), să fie implicat în metabolismul lipidelor, a glucozei sau îndepărtarea radicalilor liberi, având rol antioxidant sau pro-oxidant (exemplu: catalaza, peroxidaza, myeloperoxidaza, lactoferitina). Mai mult decât atât, fierul este important pentru adaptarea și răspunsul la hipoxie printr-un proces dependent de fier (modificările dependente de fier ale factorului inductibil prin hipoxie 1α (HIF – 1α) de către propil hidrolaza).Fierul este un element esențial în dezvoltarea creierului, un deficit al acestui element ducând adesea la înapoiere mintală.Totodată, această proprietate a fierului poate cauza o generare de specii reactive de oxigen sau nitrogen (ROS sau RNS). Ei rezultă în urma reacțiilor Fenton sau Heber – Weiss în prezența peroxidului de hidrogen (H2O2) sau a ionului superoxid (O2- ):

reacția Fenton : Fe2+ + H2O2 → HO· + OH- + Fe3+

reacția Heber – Weiss: Fe3+ + O2 → Fe2+ + O2-

Fe2+ + H2O2 → HO· + OH- + Fe3+

Hemoglobina este cea mai abundentă și importantă proteină a celulelor roșii, dar odată eliberată din eritrocite ea devine toxică datorită proprietăților oxidative ale hemului . Fierul legat de hem poate cataliza formarea de radicali, în mare parte prin formarea intermediarilor oxoferil:

Heme-Fe2+-O2 → Heme-Fe4+-OH·+O2+ OH-

Heme-Fe4+-OH +ROOH → Heme-Fe3+ + ROO·+O2H2-

În plus, Fe2+ poate acționa ca un reactant pentru generarea radicalilor liberi prin interacția directă cu oxigenul și formarea de intermediari feril (Fe2+-O), sau perferil (Fe2+-O2):

Fe2+ + H2O2 → Fe2+-O + H2O

Fe2+ + O2 → Fe2+-O2 → Fe3+-O2-· → Fe3+ + O2-·

ROS și RNS, incluzând superoxidul (O2−), oxidul nitric (NO), peroxinitritul (ONOO−), peroxidul de hidrogen (H2O2), și radicalii hidroxil (HO·) sunt molecule înalt reactive ce sunt considerate potențiali dăunători ai celulelor și țesuturilor, chiar dacă la concentrații mici pot acționa ca un mesager secundar, ca un mediator în activarea celulară, sau pot fi implicate în reglarea genică. Pentru a controla producerea de ROS și RNS, celulele și-au construit un set de enzime cu efect antioxidant și detoxifiant precum superoxid dismutaza, catalaza, și glutation peroxidaza.O creștere a concentrațiilor de ROS și RNS peste capacitatea antioxidantă a organismului, condiție numită stres oxidativ (sau nitrosativ), este cauza numeroaselor boli când activitatea antioxidanților endogeni precum superoxid dismutaza, glutationul (GSH) și catalaza este nu mai este suficientă .

HO· este o molecula hiperreactivă capabilă să oxideze molecule importante din punct de vedere biologic cum ar fi lipidele membranare, ADN-ul, proteinele, sau carbohidrații, cauzând moarte celulară prin necroză sau apoptoză, sau inițierea carcinogenezei. Datorită acestei reactivități crescute a radicalilor hidroxil, localizarea fierului în țesuturi este critică în dezvoltarea leziunilor, membranele biologice fiind permeabile pentru substratul reacției Fenton, peroxidul de hidrogen. Pentru a preveni răspândirea ionilor de fier activi din punct de vedere catalitic, organismele au dezvoltat două sisteme menite să mențină fierul într-o formă netoxică: transportul fierului cu ajutorul transferinei și stocarea acestuia cu ajutorul feritinei și a hemosiderinei.

Un alt motiv pentru care conținutul de fier al organismului trebuie atent controlat este faptul că rezistența la infecții este rezultatul unei bătălii dată între gazdă și bacterii. Astfel, bacteriile reușesc să se dezvolte rapid și să formeze biofilme mult mai eficient atunci când au o sursă de fier. Din aceste motive, indivizii ce au o cantitate mai mare de fier în organism sunt mai susceptibili la o serie de patogeni localizați la nivelul sângelui sau intracelular. Legătura între fier și imunitatea este evidențiată de cel puțin două proteine cheie în metabolismul fierului care au omologi cu rol în autoapărarea de patogeni. Transferina este strâns legată de lactoferină, o proteină capabilă sa lege fierul prezentă la nivelul neutrofilelor și a secrețiilor epiteliale . La nivelul intestinului, fierul este absorbit cu ajutorul DMT1, numit și Nramp2 (Natural- Resistance – Associated Macrophage Proteine 2) datorită legăturii pe care acesta o are cu Nramp1, un transportor de cationi divaleți de la nivelul vacuolelor fagocitare ale macrofagelor .

II.1.2. Absorbția celulară a fierului

Homeostazia fierului este controlată prin absorbția sa din alimente. Absorbția fierului este un proces ce se petrece în mai multe etape, implicând asimilarea și transportul acestuia din lumenul intestinal prin membrana celulelor apicale ale vililor și transferul acestuia în afara enterocitelor prin membrana latero-bazală pentru a ajunge în plasmă. Ea se petrece în cea mai mare măsură în duoden . Corpul nu are un mecanism eficient de excreție a fierului și de aceea reglarea absorbției acestuia din alimentație joacă un rol critic în menținerea homeostaziei acestui micronutrient. Absorbția sa este influiențată de mai mulți factori, precum: forma fierului (fierul hemic este cel mai repede absorbit), componentele alimentelor (acidul ascorbic promovează absorbția fierului nehemic, componentele care formează complexe insolubile – fosfații, acidul fitic, tanina – prevenind-o), cantitatea de fier din organism (absorbția este crescută în cazul unui deficit de fier), caracteristicile genetice (anumite condiții patologice induc o absorbție mult mai mare a fierului) .

II.1.2.1.Ciclul Tf/TfR1

Deși există mai multe metode de asimilare a fierului legat de transferină, cea mai bine caracterizată este cea care implica receptorul 1 pentru transferină (TfR1). Astfel, fierul din sânge legat de transferină este distribuit celulelor cu ajutorul TfR1 . Acest receptor este exprimat în majoritatea celulelor corpului, celulele cu necesități ridicate de fier, precum eritrocite în curs de dezvoltare, prezentând un număr mult mai mare de receptori. TfR1 este o glicoproteină transmembranară ce conține 2 subunități identice legate prin punți disulfurice. Fiecare subunitate prezintă o regiune extracelulară mare care poate lega o moleculă de transferină, un domeniu transmembranar unic și un domeniu citoplasmatic la capătul N-terminal format din 21 de aminoacizi ce asigura includerea complexului TfR1-Tf în vezicule .

Domeniul extracelular al receptorului 1 pentru transferină (TfR1) are o afinitate crescută pentru transferina diferică, deși poate lega atât transferină monoferică, cât și apo-transferină. Legarea transferinei la TfR1 are ca rezultat endocitoza mediată de receptor alcomplexului (Fig. II.1.2). Endosomul rezultat este acidifiat la pH ~5,5 de o pompă de protoni, ceea ce induce o modificare conformațională la nivelul legăturii dintre transferină și TfR1, având rezultat eliberarea ionilor de fier. Fierul este apoi transportat prin membrana endosomală în citosol de ZIP14 , înalt exprimat în ficat și mai puțin în splină, timus și leucocite , sau de transportorul 1 de ioni divalenți (DMT1), care realizează doar transportul ionilor feroși. Așadar, ionii ferici vor fi supuși unor procese de reducere înainte de a pătrunde în citoplasmă, realizate de feric reductazele endozomale (lizozomale) , cum ar fi STEAP3 (Six-Transmmbrane Epithelial Antigen of the Prostate 3), ferireductaza majora din ciclul eritroid Tf/TfR1. DMT1 este capabil să realizeze transportul și a altor ioni metalici, cum ar fi zincul, curpul, cobaltul, cadmiul sau plumbul, printr-un mecanism ce are nevoie de protoni . În momentul în care fierul a fost eliberat în citoplasmă, complexul apo-transferina -TfR1 este întors în membrana plasmatică. La pH-ul scăzut din endosom, afinitatea TfR1 pentru apo-transferină este mult mai mare decât cea de la pH fiziologic, ceea ce explică de ce cele două proteine rămân strâns legate în timp ce endosomul se deplasează spre suprafața membranei. Transferina este apoi eliberată în circulație, lasând receptorul liber și pregătit să reia acest ciclu.

Fierul legat de transferină (TBI) este, în unele celule cum ar fi eritrocitele imature, asimilat exclusiv prin căi metabolice ce implică receptorul 1 pentru transferină (TfR1) – asimilarea prin afinitate ridicată. Cu toate acestea, unele celule (enterocitele sau hepatocitele), sunt capabile să utilizeze și alte căi – asimilarea prin afinitate scăzută , cea mai bine cunoscută fiind aceea care implică receptorul 2 pentru transferină (TfR2) . Acest omolog al TfR1 este exprimat predominant în hepatocite, având un rol major supraîncărcarea ficatului cu fier , fierul asimilat de acesta rămânând intracelular sub formă de corpuri multiveziculare. Față de TfR1, activitatea TfR2 nu este reglată în conformitate cu cantitatea de fier prezentă în organism, expresia sa fiind reglată de saturarea transferinei în fier. TfR2 este cel mai probabil un modulator al transcripției hepcidinului.

II.1.2.2. Asimilarea fierului nelegat de transferină

În anumite condiții patologice, fierul poate fi preluat de celule și sub formă liberă, independent de transferină, sub formă de feritină, de hem legat de hemopexină sau de hemoglobină legată de haptoglobină. Fierului independent de transferină (NTBI) este, cel mai probabil, chelatat de molecule organice, cum ar fi citratul, cantități mici putându-se lega de proteine, cum ar fi albumina. Modul în care NTBI își croiește drum prin membrana plasmatică este neelucidat, dar se presupune că ar fi implicate următoarele proteine: DMT1; SFT (Stimulator of Fe Transport) – caracteristic leucemiei acute eritroblastice; ZIP14 – transportă NTBI în eritrocite; canalele de calciu dependente de voltaj de tip L – la nivelul miocitelor .

II.1.3. Exportul fierului din celule

Exportul fierului din celule într-o manieră controlată este crucială pentru reglarea homeostaziei corpului și este realizat de feroportină (Fpn1). Acest pas este important mai ales la nivelul enterocitelor din duoden, acolo unde absorbția fierului este strâns corelată cu exportul acestuia, și la nivelul macrofagelor care eliberează fierul rezultat în urma degradării eritrocitelor. Dacă aceste două procese nu se desfășoară normal, poate apărea o deficiență în fier, soldată cu o scădere drastică a conținutului în fier din plasmă, caz în care biosinteza celulelor roșii este compromisă. În cazul în care cantitatea de fier eliberată este prea mare, excesul de fier saturează transferina din sânge, ceea ce duce la o acumulare a fierului în țesuturi.

II.1.3.1. Feroportina 1

La mamifere, singura proteină cunoscută capabilă să realizeze exportul fierului prin membrana plasmatică este feroportina 1 (Fpn1) – o proteină transmembranară . Ea este prezentă în majoritatea tipurilor celulare, exprimându-se în număr mai mare în celulele care exportă cantități mari de fier, cum ar fi enterocitele sau macrofagele. Feroportina este prezentă și în bariera placentară unde probabil joacă un rol esențial în transferul fierului către fetus .

Feroportina 1 exportă fierul sub formă de ion feros. Astfel, este necesară o etapa de oxidare a fierului înainte ca acesta să poată fi eliberat în sânge, etapă esențială ce permite legarea imediată a acestuia la transferină. În majoritatea țesuturilor, acest pas este realizat de o feroxidază citoplasmatică care conține cupru – ceruloplasmina și omoloaga sa membranară hefastina (HEPH) (Fig. II.1.2).

Ceruloplasmina se găsește atât în formă solubilă în circulație, cât și legată de glicofosfatidilinozitol (GPI) din membranele plasmatice ale anumitor celule, prezente mai ales la nivelul sistemului nervos. Pentru ca eliberarea fierului să fie posibilă este necesară o interacție directă între ceruloplasmină și feroportina 1. În absența ceruloplasminei, fierul rămâne legat de feroportina 1, proteina fiind ulterior supusă degradării. Există dovezi ale unei interacții tranzitorii între ceruloplasmină și transferină, ceea ce sugerează că ceruloplasmina are atât funcție de feroxidază, cât și rolul de a direcționa fierul la transferină.

În timp ce ceruloplasmina, atât în stare liberă, cât și legată de GPI, este suficientă pentru a realiza eliberarea fierului în majoritatea țesuturilor, unele celule necesită feroxidaze specializate. La nivelul enterocitelor, acest rol este realizat de omologul ceruloplasminei asociat de memembrană – hefastina. Ea conține un domeniu extracelular, care este asemănător în proporție de 50% cu ceruloplasmina, atașat de un domeniu transmembranar unic și o coadă citoplasmatică. Îndepărtarea acestei proteine duce la acumularea fierului în enterocite și la apariția anemiei datorită scăderii ratei de absorbție a fierului, ceea ce indică faptul că ceruloplasmina din sânge nu este capabilă să compenseze lipsa hefastinei .

II. 1. 4.Transportul intracelular, utilizarea de mitocondrie și formele de depozitare ale fierului

În interiorul celulelor fierul este transportat cu ajutorul chaperonelor (capabile să transporte și zincul și cuprul), cele mai cunoscute fiind PCBP (Poly(rC)-binding protein) 1 și 2, ce au capacitatea să faciliteze legarea fierului la feritină . Odată ajuns în citoplasmă, fierul este inclus în diverse proteine a căror funcție este dependentă de prezența acestui element chimic, sau este stocat în feritină.

Fierul din organism este împărțit în două mari categorii în funcție de structura sa chimică și de metabolism: fierul nehemic și fierul hemic (Tabel II.1.1). Cele mai mari cantități de fier din organism se găsesc în eritrocite sub forma de hemoglobină, 20-25 mg de fier fiind necesare zilnic pentru sinteza acesteia , dar și în celulele fagocitice (macrofage, microglia) sub forma de feritină sau hemosiderină.. Splina și ficatul sunt organele care conțin cea mai mare cantitate de feritină și hemosiderină..

II.1.4.1. Metabolismul fierului la nivelul mitocondriei

Un metabolism intens al fierului are loc la nivelul mitocondriei. Încorporarea fierului în structura hemului, dar și în structura proteinelor ce prezintă centre Fe-S are loc la nivelul acestui organit. Atât hemul, cât și proteinele cu fier și sulf sunt implicate în transferul electronilor în cadrul reacțiilor de fosforilare oxidativă și în cadrul ciclului acizilor tricarboxilici de la nivelul mitocondriei.

Fierul trebuie să străbată membrana mitocondrială, importul realizându-se de mitoferină (Mfrn), proteină localizată în membrana mitocondrială internă. Mfrn este exprimată predominant la nivelul precursorilor eritroizi, dar omologul său, Mfrn 2 (65% aminoacizi identici) este prezent la nivelul tuturor tipurilor celulare. Proteinele care realizează exportul hemului și a proteinelor ce prezintă centre Fe-S din organite este ABCB10 (ATP-binding cassette subfamily B member 10), respectiv ABCB7 . Frataxina este o proteină capabilă să lege fierul și joacă un rol esențial în asamblarea proteinelor ce prezintă centre Fe-S, iar ferochelataza este responsabilă de ultimul pas al sintezei hemului, adăugând ionul de fier inelului protoporfirinic .

II.1.4.2. Hemul și hemoglobina

Hemul are în structură protoporfirina IX și Fe2+. Inserarea ionului feros în inelul protoporfirinic este catalizată de ferochelatază din mitocondrie și definește ultimul pas în sinteza hemului. Acesta este apoi transportat în citosol pentru a fi încorporat în hemoproteine, cele mai abundente fiind hemoglobina și mioglobina, pe lângă oxigenazele, peroxidazele, nitric oxid sintetazele, sau guanilat ciclazele .

Hemoglobina (Hb), proteina responsabilă pentru transportul oxigenului și a dioxidului de carbon prin sânge,conține o parte proteică, globina, și o parte prostetică, hemul -conferă culoarea roșie a hemoglobinei, citocromilor și catalazei. Fiecare dintre cele patru subunități ale hemoglobinei leagă necovalent câte o grupare hem. În structura hemului, Fe2+formează a șase legături coordinative: patru sunt stabilite cu atomi de azot din structura protoporfirinei IX, cea de-a cincea este realizată cu un rest de histidină din structura globinei, iar a șasea poziție poate fi liberă sau poate fi ocupată de oxigen. Evidențierea histochimică a ionului feros este posibilă doar dacă se rup legăturile strânse din moleculele de hem .

II.1.4.3. Proteinele ce prezină centre Fe-S

Proteinele ce prezintă centre Fe-S joacă un rol deosebit în transportul electronilor și cataliză . Fierul prezent în structura proteinelor cu centre Fe-S este legat de atomii de sulf prin legături covalente coordinative – [2Fe-2S], [3Fe-3S],[4Fe-4S] – și poate exista atât în formă redusă, cât și în formă oxidată. Pentru eliberarea fierului din structura proteinelor cu sulf este necesară o depliere a acestora, realizată de obicei prin denaturare. Aceste proteine sunt implicate în ciclul acidului citric, în fosforilarea oxidativă, sau în alte procese metabolice esențiale .

Pe lângă acestea mai există și proteine care funcționează cu molecule de fier legate coordinativ de alte grupări decât sulful, lipsite de hem, cum ar fi lipoxigenazele, aminoacid hidrozilazele, enzimele care scad rata sintezei de ADN, sau ribonucleotid reductazele .

Fierul este depozitat sub formă de feritină și hemosiderină. Feritina este forma de depozitare ce apare în cazul unui metabolism normal al fierului, în timp ce hemosiderina apare în celulele suprasaturate în fier (macrofagele din splină sau măduvă osoasă, macrofagele care au fagocitat debriuri tisulare sau eritrocite extravazate). Hemosiderina se formează în lizozomi prin procesarea proteolitică a feritinei sau independent de aceasta.

II.1.4.4. Feritina

Feritina, proteina intracelulară găsită în majoritatea organismelor vii, este capabilă să stocheze și să elibereze fierul într-o manieră controlată . Ea este prezentă în majoritatea țesuturilor ca o proteină citosolică, dar mici cantități se găsesc și în ser. Feritina constă într-un înveliș proteic alcătuit din 2 subunități (H și L) ce se dispun în jurul unei cavități centrale , proteina fiind alcătuită din 24 de subunități peptidice. Lantul H are acțiune peroxidazică

Feritina poate stoca până la 4500 de atomi de fier sub formă de ferihidrită (5FeIII2O3·9H2O), magnetită (FeIII2FeIIO4) sau hematită (FeIII2O3). Moleculele de feritină incluse în lizozomi sunt degradate de proteaze, iar fierul este eliberat datorită mediului acid prezent în lizozomi.

II.1.4.5. Hemosiderina

Fierul poate fi sechestrat în masele de hemosiderină ale fagolizozomilor, unde este prezent într-o formă similară miezului de ferihidridă al feritinei. Hemosiderina (Fig. II.1.3) este, cel mai probabil, un complex heterogen format din feritină, feritină denaturată și alte componente . Fierul găsit în masele de hemosiderină este foarte puțin disponibil atunci când organismul are nevoie. Astfel, complexul proteină – fier inițial – feritina – poate fi încorporat de fagolizozomi pentru a forma granulele de hemosiderină (Fig. II.1.3) care poate fi detectat ca un pigment auriu și refractil pe secțiunile colorate cu Hematoxilină și Eozină .

II.1.5. Reglarea transportului de fier ◊ la nivel celular

II.1.5.1. Sistemul IRE/IRP

Celulele sunt capabile să controleze cantitatea de fier pe care o asimilează prin simpla reglarea post-transcripțională realizatăcu ajutorul unor proteine reglatoare (IRPs – Iron Regulatory Proteins) care se leagă la anumite situsuri specifice de la nivelul ARN-ului mesager(IREs – Iron-Responsive Elements). Astfel, atunci când rezervele de fier ale celulei sunt scăzute, proteinele reglatoare 1 și 2 legate la nivelul regiunii 3’-UTR (3’- Untranslated Region) a ARN-ului mesager care codifică pentru TfR1 și DMT1 stabilizează transcripulși îl protejează de acțiunea endonucleazelor, inducând astfel o creștere a numărului de TfR1 și DMT1 (Fig. II.1.4). Pe de altă parte, proteinele reglatoare legate la regiunea 5’-URT a ARN-ului mesager care codifică pentru feritină și feroportina 1 împiedică atașarea ribozomilor, deci și translația feritinei și a feroportinei 1 (Fig.II.1.4.). În caz contrar, atunci când celula este saturata în ioni de fier, scade cantitatea de proteine reglatoare, și deci și randamentul de transcriere al TfR1 și DMT1, în timp ce transferina și feroportina 1 ajută la stocarea fierului în exces și la eliberarea lui în circulație.

II.1.5.2. Reglarea transcripțională

Nu toate proteinele necesare metabolismului fierului sunt reglate prin sistemul IRE/IRP, expresia genelorputând fi reglată de o serie de alți factori, cum ar fi hipoxia sau citokinele proinflamatorii. De exemplu, expresia DCYTB de la nivelul enterocitelor este mărită în cazul unui deficit în fier, dar ARNm al său nu conține regiuni IRE. De asemenea, reglarea transcripțională cu ajutorul fierului a fost evidențiată în cazul genelor pentru TfR1 și feritinei, dar efectul este mult mai mic.

II.1.5.3. Alternarea localizării subcelulare

Modificarea localizării proteinelor membranare implicate în transportul fierului este un mecanism important în reglarea metabolismului celular, fiind mult mai rapid decât cele anterioare. De exemplu, DMT1 rămâne la nivelul membranei enterocitelor atâta timp cât organismul ale nevoie de fier. Ca urmare, dacă exportul fierului scade, iar cantitatea de fier din celule crește, DMT1 este rapid mutat în interiorul celulei. Fpn poate fi rapid îndepărtat din membrana latero-bazală cu ajutorul hepcidinului, iar TfR2 este stabilizat în prezenta diferic-Tf și ajută la reciclarea endosomului .

◊ la nivel sistemic

II.1.5.4. Hepcidinul și reglarea exportului de fier

Datorită faptului că situsurile de absorbție, reciclare, stocare și utilizare ale fierului sunt situate la depărtare în corp , interacția acestora se realizează la nivel sistemic și este mediată de un hormon peptidic, hepcidinul (expresie a genei HAMP – hepcidin antimicrobial peptide). În timpul studiilor de natură antimicrobiană ale diferitelor fluide corporale, a fost izolat acest peptid din urina umană, numele pe care îl poartă derivând de la locul de sinteză (ficatul, hep-) și de la acțiunea antimicrobiană (-cidin) .

Acest peptid cu acțiune antimicrobiană este sintetizat în special de hepatocite, circulat prin plasmă și excretat prin urnină. Hepcidinul se leagă de feroportina 1, generând degradarea proteinei la nivelul proteasomului. Hepcidinul legat de proteină este degradată odată cu aceasta deoarece se pare că cele două molecule sunt legate covalent prin intermediul punților disulfurice. Astfel el este cel mai puternic reglator al absorbției fierului din alimentație și al eliberării lui din macrofage . Cele mai importante ținte ale hepcidinului sunt enterocitele, macrofagele și hepatocitele (Fig. II.1.5) .

Hepcidinul are un efect inhibitor asupra eliberării fierului. Creșterea producției de hepcidin duce la degradarea Fpn1 mult mai repede decât acesta este sintetizat, consecința fiindblocarea atât absorbția fierului, cât și reciclarea lui. Atunci când cantitatea de hepcidin scade, absorbția de fier crește, iar fierul stocat la nivelul macrofagelor este eliberat în sânge.

Toți factorii implicați în reglarea absorbției fierului (rezervele de fier, eritropoieza, hemoglobina, cantitatea de oxigen, inflamația) sunt implicați și în reglarea expresiei hepcidinului ce are loc în alte tipuri celulare. Cel mai probabil, celulele Kupffer sau cele sinusoidale sunt cele care ,,simt” nivelul de fier al organismului și o comunică hepatocitelor . HFE, TfR2 și HJV sunt proteine membranare de la nivelul hepatocitelor care influențează expresia hepcidinului (Fig. II.1.5). HJV își exercită efectul prin intermediul BMP (proteine morfogeneticeosoase),acesta fiind considerată principala cale de reglare a expresiei hepcidinului. Cum își exercită efectul HFE și TfR2 nu este încă clar, dar se cunoaște influența transferinei diferice din circulație este importantă .

II.1.6. Transportul fierului în celulele specializate

Deși mecanismele descrise mai sus sunt comune tuturor tipurilor celulare, eritrocitele, macrofagele și hepatocitele sunt celulele specializate în menținerea homeostaziei fierului. Unele sunt specializate în a transfera fierul rapid, altele în a-l stoca, iar altele, cum ar fi precursori eritroizi, utilizează fierul pentru un singur scop, cum ar fi sinteza hemului .

II.1.6.1. Enterocitele intestinale

Funcția de absorbție a fierului este atribuită enterocitelor de la nivelul vililor maturi din duoden și jejun. În alimentație, fierul se găsește preponderent sub formă de ion feric și trebuie redus înainte de a fi transferat prin epiteliul intestinal . Reducerea este realizată cel mai probabil de vitamina C, histidină, cisteină, DCYTB (citocromul b duodenal) – reductaza de la nivelul membranei intestinale – sau de STEAP2.Odată redus, fierul este transportat în interiorul enterocitelor cu ajutorul DMT1 (Fig. II.1.6). La nivelul criptelor duodenale se găsește și hemocromatoza (HFE), o proteină care formează complexe cu β2-microglobulina și TfR1. HFE reduce atât afinitatea TfR1 pentru transferină, cât și absorbția fierului, datorită reducerii ratei de eliberare a fierului legat de transferină .

Absorbția intestinală a hemului este mult mai mare decât cea a fierului liber, asimilarea putându-se realiza prin pinocitoza, cu ajutorul un receptor pentru fier prezent la nivelul mucoasei duodenale, sau cu o proteina care transporta hemul (Heme-Carrier protein-1), proteină a cărei funcție principală este absorbția folatului.Odată pătruns în celulă, fierul separat de hem prin funcția exercitată de o hem oxigenază urmează aceeași cale metabolică ca și fierul liber de hem (Fig. II.1.6).Totuși, recent s-a pus în evidență o proteină capabilă să exporte hemul, FLVCR (feline leukemia virus subgrup c receptor) fiind prezent la nivelul duodenului.

II.1.6.2. Macrofagele și rolul lor

La oameni, aproximativ 2 · 1011 eritrocite îmbătrânite sau nefuncționale sunt îndepărtate din circulație în fiecare zi de macrofagele din splină, ficat sau măduva osoasă, fierul fiind reciclat și reîntors în plasmă. Fagocitoza eritrocitelor de celulele reticuloendoteliale din ficat sau splina contribuie la biodisponibilitatea fierului pentru întreg organismul . Ca urmare, cea mai mare cantitate a fierului din plasmă este asigurată de macrofagele capabile să îl recicleze și nu de absorbția intestinală .

Enzimele hidrolitice din macrofage degradează eritrocitele și eliberează hemoglobina. Digestia proteolitică a hemoglobinei separă hemul de globină. Globina este degradată la aminoacizi care pot fi reutilizați la sinteza proteinelor. Degradarea hemului duce la eliberarea fierului (acțiune realizată de o hem-oxigenaza) care poate fi reutilizat, o moleculă de monoxid de carbon care poate fi utilizată în căi de semnalizare, și o moleculă de biliverină care va fi convertit la bilirubină – antioxidant important în cazul stresului oxidativ . Similar enterocitelor, fierul eliberat din structura hemoglobinei poate fi stocat cu ajutorul feritinei sau a hemosiderinei, sau poate fi eliberat în circulatie, în funcție de necesitățile organismului pentru a ajunge în măduva osoasă, acolo unde va fi reîncorporat în noi celule roșii sau alte celule care îl necesită .

II.2. Problemele provocate de metabolismul anormal al fierului care pot fi identificate prin metode histochimice

II.2.1. Considerente generale

Înțelegerea metabolismului fierului are astăzi o importanță ce nu se limitează doar la înțelegerea eritropoiezei și a cerințelor nutriționale, reprezentând un factor important în patologie, cardiologie, oncologie, bolile neurale și infecțioase. Cantitățile normale de fier asigură o activitate metabolică necesară funcționării corecte a sistemului imunitar, iar neîncadrarea în aceste limite normale face ca organismul să fie predispus la o serie întreagă de maladii. Cantitatea de fier necesară unui organism depinde atât de factori genetici, cât și de factori de mediu. Indivizii ce prezintă mutații ale genelor ce codifică pentru proteinele implicate în metabolismul fierului au nevoie de cantități diferite de fier . Deficiența de fier poate duce la anemie, anemia inflamatorie și excesul de fier fiind cele mai comune probleme provocate de un metaboliem anormal al fierului .

II.2.2. Deficiența de fier

Deficiența de fier și anemia rezultată în urma acesteia afectează o mare parte a populației globului , întâlnindu-se la preșcolari cu o frecvență de 47%, la femei cu o frecvență de 30%, iar la femeile însărcinate cu o frecvență de 41%. Consecințele clinice ale deficienței de fier includ deficiențe ale sistemului nervos central cum ar fi tulburările cognitive, scăderea capacității fizice, oboseala cronică, probleme cu sarcina, scăderea imunității, probleme gastrointestinale, incapacitatea de reglare a temperaturii corpului într-un mediu rece. Deficiența de fier poate fi detectată prin analize biochimice ce măsoară hemoglobina, feritina și receptorii solubili pentru transferină din sânge . În cazul unei deficiențe de fier, cantitatea de feritină din sânge este redusă, iar în cazul unei biopsii de măduvă osoasă se obține o colorație histochimică specifică pentru fier mai slabă .

II.2.3. Anemia inflamatorie

Anemia inflamatorie este frecvent întâlnită la persoanele ce suferă de boli autoimune, sau infecții datorită reținerii fierului în celulele sistemului reticuloendotelial. Ea se datorează unei dereglări în procesul de utilizare al fierului chiar dacă organismul nu prezintă nici deficit, nici exces de fier. Anemia inflamatorie este rezultatul creșterii expresiei genelor ce codifică pentru hepcidin indusă de citokinele inflamatorii. Astfel se consideră că gazda scade disponibilitatea fierului pentru diferiți patogeni. Infecțiile cronice, prezența unor condiții inflamatorii, bolile autoimune sau neoplazia sunt posibile motive de instalare a anemiei inflamatorii .

II.2.4. Excesul de fier

Cauza principală a excesului de fier este absorbția unei cantități prea mari de fier din alimentație. În cazul unui exces de fier transferina este saturată, iar restul fierului este prezent nelegat de transferină (NTBI) . Excesul de fier atât sub formă legată de transferină (TBI), cât și NTBI este stocat în organe și țesuturi și poate provoca o serie de boli precum bolile de inimă, diabet, artrită, cancer, ciroză, impotență sau sterilitate , indivizii putând prezenta o cantitate totală de fier mai mare de până la 5-10 ori decât cea normală . Prin urmare, cele mai afectate organe sunt: ficatul (ciroza), inima (cardiomiopatie), pancreasul (diabet), tegumentul (pigmentare), articulațiile (poliartropatie), gonadele (hipotiroidism, hipogonadism hipogonadotropic) excesul de fier putând provoca numeroaselor maladii degenerative precum hemocromatoza, boala Alzheimer, boala Parkinson, scleroza multiplă, ataxia Friedreich, boala Huntington, sindromul Hallervorden-Spatz, degenerarea retinei .

II.2.4.1. Acumularea fierului în ficat

Ficatul este principalul organ de stocare al fierului, iar excesul de fier duce la formarea de radicali liberi și la peroxidarea lipidică care pot provoca degradări tisulare și ciroză sau carcinom hepatocelular . Creșterea cantității de specii reactive de oxigen (ROS) în ficat este influențată de consumul de alcool, fierul și alcoolul interacționând pentru a duce la leziuni hepatice grave .

Distribuția depozitelor de fier :

Supraîncărcarea parenchimatică cu fier este legată de hiperabsorbția intestinală de fier. Astfel, fierul ajunge la ficat prin vena port-hepatică, fiind depozitat în hepatocite sub formă de granule fine la polul biliar al celulelor. El este distribuit în lobul în cantități descrescătoare de la zona periportală la cea centrolobulară.

Supraîncărcarea mezenchimatică cu fier este reprezentată de depozite de fier în celulele Kupffer și/sau macrofagele portale. Aceste celule sunt fie izolate, fie grupate, fără sistematizare lobulară.

Supraîncărcarea mixtă cu fier prezintă caracteristicile histologice ale ambelor tipuri prezentate anterior și corespunde unei situații complexe sau unor depozite masive de fier.

Sinteza hepcidinului în hepatocite este reglată de cantitatea de fier legat de transferină care este asimilată sau de nivelul de sinteză al proteinelor HFE, TfR2 sau HJV și de aceea mutații ale acestor gene duc la supraîncărcarea ficatului cu fier.Deoarece expresia HFE se realizează predominant în macrofagele și celulele sinusoidale ale ficatului, detecția fierului poate avea loc în aceste tipuri celulare și comunicată hepatocitelor pentru ca acestea să își poată regla expresia hepcidinului. Astfel, fie dacă mecanismul de detecție, fie cel de comunicare sunt afectate, și expresia hepcidinului este afectată .

Formele ereditare ale hemocromatozei (Tabel II.2.1)

a) Hemocromatoza ereditară (HH) de tipul 1 (Tabel II.2.1) este cea mai comună formă, fiind o maladie autozomală recesivă ce duce la supraîncărcarea cu fier și disfuncția organelor. 90-95% dintre indivizii afectați sunt homozigoți și prezintă mutații ale genei HFE prezentă pe cromozomul 6 , la nivelul căreia restul de tirozină din poziție 282 este înlocuită cu un rest de cisteină (C282Y). O altă mutație poate fi reprezentată de substituția restului de aspartat din poziția 63 cu un rest de histidină (H63D), însă ea duce doar la o creștere a cantității de fier, rar provocând supraîncărcare în absența mutației C282Y. Doar 1-5% dintre indivizi sunt heterozigoți pentru ambele mutații . Proteina HFE se leagă de receptorul pentru transferină și reduce afinitatea acestuia pentru TBI. Astfel, o proteină mutantă nu se poate lega eficient de receptorul pentru transferină. , lipsa acestei proteine absorbția intestinală a unor cantități mult mai mari de fier decât ar fi necesar .

b) Hemocromatoza juvenilă este o maladie autozomală recesiva ce rezultă în urma mutației genei HJV de pe cromozomul 1 (codifică pentru hemojuvelină) sau a genei HAMP de pe cromozomul 19 (codifică pentru hepcidin) și care duce la supraîncărcarea cu fier în același mod ca și în cazul HH . Ea este o formă severă de hemocromatoză în care deteriorarea organelor sau chiar moartea pot surveni până la vârsta de 30 de ani în specialdatorită insuficienței cardiace.

c) Hemocromatoza de tip 3 este o boală autozomală recesivă ce rezultă în urma mutațiilor la nivelul receptorului 2 pentru transferină localizată pe cromozomul 7q22. Tipurile 1 și 3 sunt boli autozomale recesive și duc la depozite parenchimatice de fier ce pot provoca deteriorarea organelor precum ficatul, inima sau glandele endocrine .

Înainte ca testele genetice să fie folosite în diagnostic, hemocromatoza se diagnostica exclusiv prin teste histochimice . Din punct de vedere histochimic, hemocromatoza de tip 1, 2 și 3 sunt destul de similare datorită patofiziologiei comune ce constă într-o dereglare în sinteza hepcidinului, a cărei severitate este legată de gradul de supraîncărcare cu fier. La începutul manifestării acestor maladii, fierul este distribuit corespunzător unei supraîncărcări parenchimatice tipice, urmând ca pe parcurs depozitele de fier să crească și să provoace apariția sideronecrozei care va duce la activarea macrofagelor. Astfel se dezvoltă fibroza și are loc redistribuirea fierului în celulele nonparenchimatice. Ciroza și cancerul hepatic, în special carcinomul hepatocelular, diabetul și pigmentarea pielii sunt cele mai frecvente complicații ale acestor maladii genetice .

d) Hemocromatoza de tip 4 este o boală autozomală dominantă cauzată de mutația genei pentru feroportină (IREG1, MTP1, SLC11A3) prezentă pe cromozomul 2 . Această formă de hemocromatoză este caracterizată prin depozite timpurii de fier în celulele Kupffer și macrofagele splenice . Rar depozitele de fier sunt prezente în celulele parenchimatice, forma mezenchimatică ce poate duce până la fibroză sau ciroză fiind cea mai frecventă .

Alte boli ereditare precum f) aceruloplasmanemia, g) atransferinanemia, h) supraîncărcarea cu fier neonatală, sau i) hemocromatoza autozomală dominantă se întâlnesc extrem de rar. Aceruloplasmanemia duce la diabet și boli neurodegenerative datorită mutației în gena ceruloplasminei ce duce la neexprimarea acesteia. Lipsa ceruloplasminei reduce activitatea ferooxidazei din plasmă și eliberarea fierului, cauzând acumularea sa în ficat, pancreas și creier. Depozitele de fier sunt prezente predominant în celulele parenchimatice, dezvoltarea cirozei fiind puțin probabilă chiar și în cazurile de supraîncărcare foarte grave . Atransferinanemia se caracterizează prin lipsa transferinei din plasmă. Indivizii pot efectua absorbția fierului, dar celulele precursoare eritroide nu pot utiliza fierul nelegat de transferină (NTBI). Excesul de NTBI este depozitat în ficat, pancreas și inimă, iar eliberarea sa se produce în cantități foarte mici datorită lipsei transferinei. Acești indivizi necesită infuzie de transferină pentru a supraviețui .

Supraîncărcarea cu fier dobândită (Tabel II.2.1.)

Anemie ce duce la supraîncărcare cu fier

Datorită unei eritropoieze ineficiente ce poate apărea în cazul talasemiei, a anemieisideroblastice, sau a anumitor sindroame mielodisplasice, măduva eritroidă hiperplastică poate stimula creșterea absorbției fierului până în situația în care poate duce la supraîncărcarea organismului deoarece există o strânsă legătură între rata eritropoiezei și absorbția fierului .

Supraîncărcarea cu fier prin transfuzie

Fiecare unitate de sânge conține 200-250 mg de fier. Transfuzia repetată de sânge este necesară în cazul indivizilor ce prezintă β-talasemie, insuficiență a măduvei osoase, sau siclemie . Depozitele de fier se găsesc inițial în celulele Kupffer sau macrofagele portale pentru ca apoi, cu trecerea timpului, să fie redistribuite și celulelor parenchimatice, ducând astfel la un model mixt și heterogen .

Supraîncărcarea cu fier datorită bolilor cronice de ficat

O creștere a depozitelor de fier la nivelul ficatului apare în cazul cirozei neasociată cu hemocromatoza. Ea este frecventă în cazul bolilor de ficat provocate de alcool, hepatitelor cronice virale sau steatopatitei nonalcoolice. În cazul cirozei, sinteza transferinei este redusă, iar cantitatea de NTBI din plasmă este mare, ceea ce poate contribui la formarea de depozite hepatice de fier . În acest caz, depozitele de fier se găsesc în hepatocite, predominant în zonele periportale .

Hepatita C este frecvent asociată cu supraîncărcarea ficatului cu fier, hepcidinul jucând un rol esențial în acest caz deoarece ea este proteina care inițiază degradarea feroportinei în enterocitele duodenale și macrofage, ducând la blocarea absorbției fierului și reciclarea sa. Virusul hepatitei C are efect direct asupra sintezei hepcidinului , depozite hepatice de fier fiind prezente la 35%-56% dintre indivizii infectați. Modelul histologic este de tip mezenchimal, prezentând frecvent depozite la nivelul celulelor endoteliale. Excesul de fier duce de cele mai multe ori la schimbări necrotico-inflamatorii .

În cazul bolii Wilson, supraîncărcarea cu fier de tip mixt este prezentă, mecanismul său fiind multifactorial, incluzând cantitățile scăzute de ceruloplasmină din sânge, hemoliza, schimbări necrotico-inflamatorii și ciroza .

II.2.4.2. Acumularea fierului în miocard

Inima, alături ficat și organele endocrine, este principalul organ afectat de excesul de fier , datorită faptului că prezintă o rată mare de producere a ionului superoxid și a peroxidului de hidrogen în urma activității mitocondriilor . Insuficiența cardiacă provocată de excesul de fier poate apărea fie din cauza transfuziilor de sânge repetate necesare în cazul talasemiei, fie din cauza hemocromatozei ereditare , fiind principala cauză a morții pacienților ce au nevoie de transfuzii repetate de sânge . Cardiomiopatia provocată de excesul de fier este definită prin prezența unor disfuncții sistolice sau diastolice .

Depozitarea fierului în inimă este un proces mult mai lent decât cel care se petrece în ficat și depinde de creșterea cantității de fier din sânge. În cazul supraîncărcării cu fier, transferina este saturată, iar NTBI din sânge intră în miocitele cardice sub formă feroasă cu ajutorul canalelor de calciu de tip L. Canalele de calciu de tip L sunt proteinele implicate în principal în transportul ionilor de calciu, dar pot transporta și alte metale divalente precum fierul sau zincul. Fierul este apoi legat de feritină și transportat la lizozom pentru stocarea sa pe termen lung .

Depozitele patologice de fier apar inițial în epicard și se extind ulterior în miocard, respectiv endocard, disfuncțiile diastolice apărând mult mai rapid decât cele sistolice . Mai mult decât atât, disfuncții ale mitocondriei pot apărea în cazul cardiomiopatiei provocate de excesul de fier , dar și afectarea transportului ionilor de calciu și a cuplării excitație-contracție care pot avea ca rezultat disfuncții ventriculare sistolice și diastolice .

În cazul analizelor histochimice, depozitele de fier din inimăsunt neuniforme, astfel încât adesea pot apărea rezultate fals negative. Totuși depozitele de fier sunt puse în evidență tot prin metoda Perls, analiza cantitativă bazându-se pe numărul de miocite ce conțin astfel de depozite. Într-o biopsie provenită de la un individ complet sănătos, depozitele de fier nu sunt prezente deloc, în timp ce în cazul unei supraîncărcări, fierul este prezent în sarcoplasmă, mai ales în zona perinucleară .

II.2.4.3. Acumularea fierului în creier

Creierul are o mare nevoie de fier datorită consumului său mare de energie, fiind implicat în sinteza de ATP, în respirația celulară, dar și pentru funcționarea și dezvoltarea sa normală – sinteza/degradarea neurotransmițătorilor și formarea mielinei . Concentrația cea mai mare de fier se întâlnește la naștere, pentru ca apoi să scadă treptat. Absorbția maximă de fier se realizează în timpul dezvoltării creierului, atunci când se realizează mielinizarea sau când are loc sinteza de neurotransmițători .

Orice dereglare a homeostaziei fierului poate duce la acumularea fierului care poate fi implicată în boli ale sistemului nervos central (SNC). Microgliile, celulele gliale care protejează neuronii de agenții patogeni și de acumularea deseurilor celulare , sunt implicate și în reglarea homeostaziei fierului în creier, fiind cele care depozitează fierul sub formă de feritină. În creierul în dezvoltare, microgliile amoeboide (AMC) se colorează puternic prin colorațiile specifice pentru fier, ceea ce susține faptul că fierul eliberat de acestea este sursa majoră de fier pentru oligodendrocite în procesul de mielinizare.Acumularea fierului în diferite regiuni ale creierului este frecventă în cazul bolilor neurodegenerative. Astfel, un metabolism anormal al fierului în organism poate conduce la boli de tipul:

a) Boala Alzheimer este o afecțiune degenerativă a creierului care apare mai ales la persoane în vârstă, fără un remediu cunoscut, producând o deteriorare din ce în ce mai accentuată a funcțiilor de cunoaștere ale creierului. Cantitatea de fier crește înaintea formării leuziunilor patologice ceea ce susține ideea că stresul oxidativ poate juca un rol esențial în instalarea bolii Alzheimer . Studiile imunohistochimice au demonstrat prezența feritinei în microglia activată și în plăcile senile , dar și expresia melanotransferinei la nivelul microgliilor care favorizează sechestrarea fierului . Depozitele de fier reglează expresia melanoproteinazelor matriceale, care sunt implicate în procesul de neuroinflamație .

b)Boala Parkinson este o afecțiune neurodegenerativă caracterizată prin pierderea neuronilor dopaminergici din substanța nigra.  Deoarece zona afectată joacă un rol important în controlul mișcărilor, pacienții prezintă gesturi rigide, sacadate și incontrolabile, tremor și instabilitate posturală. Datorită acumulărilor anormale de fier în această zonă, în special în neuronii care conțin neuromelanină, stresul oxidativ este considerat un factor important ce influiențează progresul acestei maladii.

c)Scleroza multiplă este o afecțiune neuroinflamatorie ce duce la demielinizare, acumulările de fier fiind prezente în acest caz în vasele de sânge, în microglia reactivă, macrofage și neuroni. Aceste acumulări de fier în microglie duc la producerea de citokine inflamatorii ce pot provoca leziuni la nivelul oligodendrocitelor .

d)Dustrugerea substanțeialbe paraventriculare la copii este o afecțiune comună ce rezultă în urma unei hipotoxicități din perioada perinatală ce duce la deficiențe neurale pe termen lung cum ar fi retardul mintal, deficiențe de vedere, pierderea auzilui sau epilepsie. Această afecțiune este dată de deteriorarea substanței albe paraventriculare, moartea oligodendrocitelor, axoni degenerați, activarea microgliei sau astroglicoliza . Ca urmare a atacului hipotoxic creșe cantitatea de fier din microglie , dar și expresia receptorului pentru transferină , ceea ce duce la secreția citokinelor pro-inflamatorii și producerea de radicali liberi.

e)Sindromul Hallervorden-Spatz este o maladie caracterizată prin disfuncții extrapiramidale, tulburări emoționale și demență. În acest caz, depozite considerabile de fier sunt prezente în ganglionii bazali, celulele nervoase sunt degenerate, iar celulele gliale se găsesc în număr foarte mare .

II.2.4.4. Efectul fierului asupra pancreasului

Diabetul apare frecvent la pacienții ce prezintă supraîncărcare cu fier, dar și la cei cu ciroza . La indivizii cu diabet, a căror pancreas produce insulină în cantități insuficiente (diabet de tipul 1) sau a căror celule nu răspund corespunzător la insulina (diabetul de tip 2), glucoza se acumulează în sânge și trece în urină, fiind astfel eliminată din organism. În acest mod organismul își pierde principala sursă de energie deși aceasta se găsește în sânge în cantități considerabile. Instalarea și progresul diabetului este pus și pe seama unui metabolism anormal al metalelor tranziționale, printre care se numără și fierul .

Supraîncărcarea cu fier reprezintă un factor de risc pentru diabetici, ducând la rezistenta la acțiunea insulinei și deficitul de secreție al insulinei . Hiperglicemia și diabetul se pot instala datorită acumulărilor de fier din ficat ce duc la rezistența la insulină, iar acumulările din celulele β pancreatice duc la distrugerea celulelor și la secreția unor cantități insuficiente de insulină. Hiperglicemia și hiperlipidemia apărute în cazul diabeticilor fac ca organele și țesuturile să fie mult mai susceptibile la stresul oxidativ. Mai mult decât atât, complicațiile de genul bolilor macrovasculare (neuropatia, retinopatia, nefropatia, cardiomiopatia) și disfuncțiilor vasculare (hipertensiunea și arterioscleroza) pot apărea la pacienții diabetici ce prezintă cantități mari de fier în organism. Stresul oxidativ poate cauza moartea celulelor β, ducând la apariția diabetului de tip 1 și stresului oxidativ cronic la nivelul ficatului, mușchilor .

II.2.4.5. Efectul fierului asupra articulațiilor

Artropatia apare la 25-50% din indivizii cu supraîncărcare cu fier. Ea este în general simetrică și poliarticulară, pacienții prezentând dureri cronice, rigiditate articulară, creștere osoasă sau inflamație .

II.2.4.6. Efectul fierului asupra hipofizei

Hipodonadismul este o afecțiune caracterizată printr-o insuficiență a funcționarii gonadelor (tipul 1), a hipofizei (tipul 2) sau a hipotalamusului (tipul 3). Hipogonadismul de tipul 2 (hipodonadismul hipogonadal) apare frecvent în cazul pacienților ce prezintă talasemie majoră și necesită transfuzii de sânge, depozitele de fier de la nivelul hipofizei apărând chiar din prima decadă a vieții . Toxicitatea fierului asupra lobului anterior al adenohipofizei are ca rezultat scăderea sintezei hormonului luteinizant (LH) și a hormonului foliculo-stimulator (FSH) . FSH-ul stimulează la femei dezvoltarea foliculului ovarian și secreția de hormoni estrogeni, iar la bărbați stimulează spermatogeneza. LH-ul stimulează la femei ovulația, formarea corpului galben, și secreția de estrogen și progesteron, iar la bărbați stimulează secreția de testosteron .

II.2.4.7. Efectul fierului asupra gonadelor

Spermatogeneza, care are loc aproape de membrana bazală a tubilor seminiferi, unde spermatogoniile fie se divid, dând naștere la alte celule germinale, fie suferă procesul de diferențiere, migrând spre lumenul tubilor seminiferi. Acesta este un proces dependent de fier, deoarece dezvoltarea celulelor germinale masculine se realizează prin meioze repetate ce presupune sinteza de ADN, creșterea celulară și mitocondriogeneză. Celulele germinale masculine prezintă de timpuriu TfR1 și ferintină, ceea ce indică o asimilație și o depozitare activă a fierului. Pentru ca fierul periferic să ajungă la nivelul celulelor germinale trebuie să treacă prin peretele capilarelor, prin sau printre celulele endoteliale, prin membrana bazală a tubilor seminiferi, si prin celulele Sertoli. Analiza histochimică a fierului pune în evidență faptul că ionul feric nu este distribuit egal la nivelul testiculului, acumulându-se majoritar în interstițiu, iar la nivelul celulelor Sertoli în apropierea domeniului bazo-lateral din jurul spermatocitelor primare. Variațiile cantităților de fier de la acest nivel sunt foarte mici chiar și în cazul unui exces de mare de fier în organism deoarece membrana bazală a tubilor seminiferi și celulele mieloide peritubulare crează o barieră cu rol protector. .

La nivelul ovarelor, cantitățile excesive de fier induc disfuncții ovariene, o creștere a speciilor reactive de oxigen și un mecanism enzimatic antioxidant scăzut având ca efect îmbătrânirea foliculară .

II.2.4.8. Depozitele de fier din tegument

Deși fierul este prezent în mod normal în tegument deoarece exfolierea celulelor epidermale este unul dintre puținele metode de eliminare a lui din organism , excesul de fier poate fi responsabil de hiperpigmentare, acompaniată de acumularea hemosiderinei în tegument, aceasta apărând frecvent în cazul indivizilor ce suferă de hemocromatoză. Astfel, excesul de ion feric este stocat sub formă de hemosiderină, markerul histochimic al excesului de fier din piele.

Pentru diagnostic, sunt folosite biopsiile cutanate din orice zonă a corpului, hiperpigmentată sau nu. La un individ sănătos, depozitele de fier sunt prezente doar în jurul glandelor apocrine, nu și în jurul celor merocrine. În urma examinărilor histochimice, hiperpigmentarea apare ca o creștere a cantității de melanină din stratul bazal, iar hemosiderina este vizibilă sub formă de granule (siderozomi) de culoare maro închis pe preparatele colorate cu Hematoxilină-Eozină și albastre pe preparatele colorate prin metoda Perls. Siderozomii pot fi găsiți și în macrofagele dermale, dar și în interstițiul dintre fibrele de colagen ale dermei .

II.2.4.9. Fierul și cancerul

Toate celulele mamiferelor necesită fier, iar multe dintre proteinele implicate în homeostazia lui sunt prezente și în țesuturile periferice de tipul țesutului mamar sau a prostatei . Căile de asimilare, eflux, depozitare și reglare ale fierului sunt perturbate în cazul cancerului . Legătura dintre fier și cancer este dată de o reprogramare a metabolismului acestui micronutrient care, în final, duce la o acumulare a sa în țesutul tumoral, sau în celulele micromediului .

Prezența unor cantități mari de fier în organism este asociată cu un factor de risc ridicat pentru instalarea cancerului , multe tipuri de cancer fiind asociate cu necesități mai mari de fie, probabil datorită rolului său pe post de co-factor pentru proteinele esențiale creșterii și proliferării celulare . Pe de altă parte, studiile au arătat că saturarea transferinei cu fier joacă un rol definitoriu în instalarea cancerului, fierul contribuind atât la inițierea tumorii prin degradarea ADN-ului cu ajutorul ROS, cât și la creșterea acesteia . Stresul oxidativ indus de fier poate bloca anumite mecanisme cu rol de protecție ale celulelor, fierul putând influența carcinogeneza aflată atât în primele stadii, cât și pe cea avansată, fiind un element esențial pentru toate tipurile celulare , ducând până la pierderea funcției supresorilor tumorali și expresia oncogenelor .Cantitățile relativ scăzute de ROS contribuie la proliferarea celulară, în timp ce cantități puțin mai mari decât acestea pot duce la apoptoză. Cantitățile extrem de mari duc la necroză. În cazul celulelortumorale, procesele ce controlează cantitățile de fier și ROS din celule sunt alterate, ceea ce poate face ca celulele sa fie mult mai proliferative . Mai mult, ROS joacă un rol important în cazul celulelor stem și progenitoare, reglând autoreînnoirea și diferențierea . În plus, celulele tumorale sunt deficiente în enzime antioxidante, ceea ce le face vulnerabile la stresul oxidativ. Ca urmare, o potențială strategie terapeutică poate fi modularea cantităților de ROS în celulele canceroase pentru a induce moartea celulară selectivă .

Deși majoritatea datelor susțin faptul că depozitele de fier prezente în mod constant în organism cresc riscul apariției cancerului și pot fi utilizate drept etalon pentru diagnosticare , există studii care susțin faptul că nu există nicio legătură între gradul de expunere al țesutului la fier și dezvoltarea cancerului,, .

Majoritatea celulelor canceroase reușesc să crească influxul de fier, supraexprimând proteinele implicate în absorbția fierului de tipul TfR1, Steap, sau lipocalina 2, și subexprimând proteinele implicate în efluxul fierului de tipul feroportinei . Câteva exemple ale alterării metabolismului fierului indusă de cancer sunt:

Transferina. Unele celule canceroase sunt capabile să sintetizeze factori transferin-like, ce pot favoriza proliferarea celulară și creșterea tumorală în zonele puțin vascularizate, acționând ca un factor de creștere autocrin .

Receptorul 1 pentru transferină.Expresia TfR1 este mult mai mare în cazul multiplelor tipuri de cancer, cum ar fi cel mamar, leucemia, limfoamele, cancerul de plămâni, fierul având rol în proliferarea celulară și sinteza ADN. De asemenea, lipocalina 2 (LCN 2), proteină implicată în căi alternative de asimilare ale fierului ce leagă sideroforii (catecolul este o moleculă capabilă să lege fierul și are proprietăți de siferofori) și ii transportă prin sânge sub formă de complexe LCN2-catecol, este supraexprimată în cazul cancerului mamar, de plămâni, sau pancreatic, ceea ce favorizează proliferarea celulară și creșterea angiogenezei.

Feritina. Deși indivizii ce prezintă cancer nu prezintă obligatoriu și depozite mari de fier, nivelul de feritină din ser este crescut în cazul anumitor tipuri de cancer . Subexprimarea și supraexprimarea feritinei pot contribui la supraviețuirea celulelor tumorale: subexprimarea contribuie la creșterea cantităților de fier disponibile, în timp ce supraexprimarea ajută la supraviețuirea celulelor țesutului conjunctiv și a celulelor inflamatorii ce crează micromediul tumoral , promovând angiogeneza datorită rolului său în depozitarea fierului și detoxifierea celulară . Celulele inflamatorii, în special limfocitele și macrofagele, sunt capabile să secrete feritina ca răspuns la citokinele pro-inflamatorii, feritina extracelulară stimulând proliferarea celulelor canceroase în cazul cancerului mamar .

IRPs. Și proteinele implicate în reglarea metabolismului fierului sunt importante în cancer. De exemplu, supraexprimarea IRP1 reduce creșterea tumorii, în timp ce supraexprimarea IRP2 o promovează .

Hepcidinul și feroportina. Celulele tumorale cresc cantitățile de fier disponibile din punct de vedere metabolic nu doar prin creșterea cantității de fier asimilate și scăderea depozitelor, dar și prin scăderea exportului, feroportina și hepcidin fiind molecule importante în acest scop. Feroportina, de exemplu, nu este exprimată doar în țesuturile implicate în reglarea homeostaziei fierului, dar și în țesutul glandular mamar, în timp ce hepcidinul este secretată și de celulele epiteliale ale acestor glande . În cazul cancerului mamar, feroportina este subexprimată, iar hepcidinul supraexprimată acest lucru jucând un rol important nu doar în creșterea tumorilor primare, dar și în metastază.

HIF. Activitatea HIF este crescută în cazul tumorilor, supraexprimarea HIFα fiind frecvent asociată cu creșterea tumorală. HIF1 induce expresia TfR1, crescând absorbția fierului, a HO-1, care degradează hemul, a ceruloplasminei, care oxidează fierul, în timp ce HIF2 promovează absorbția sistemică a fierului, inducând expresia feroportinei, a DMT1 și a DCYTB în eritrocite. Astfel, activarea HIF poate contribui la acumularea fierului în tumori. .

Implicarea fierului în procese legate de replicarea ADN, menținerea integrității genomului, și reglarea epigenetică contribuie la inițierea tumorii. Celulele care conțin cantități insuficiente de fier rămân în faza G1 a ciclului celular, acolo unde are loc sinteza ADN, dar și progresia celulelor în faza S este dependentă de fier . Ribonucleotid reductaza catalizează conversia ribonucleotidelor la deoxiribonucleotide. Această enzimă este esențială pentru viabilitatea celulară, activitatea sa catalitică fiind dependentă de fier și de capacitatea mitocondriei de a sintetiza proteine ce conțin centre Fe-S. O biogeneză defectivă a acestor complexe contribuie și la instabilitatea genomului, inhibând activitatea enzimelor implicate în repararea și recombinarea ADN-ului . În aceste condiții, celulele tumorale pot rămâne viabile prin menținerea glicolizei anaerobe, dar sunt incapabile sa sintetizeze ADN, să prezinte activitate aconitazică mitocondrială, sau să transporte electroni cu ajutorul oxidoreductazelor mitocondriale .

În cazul cancerului mamar, fierul are un rol definitoriu datorită interacției pe care acesta o stabilește cu estrogenul . Estrogenul este important pentru dezvoltarea sistemului reproducător, o dereglare a metabolismului fierului ducând automat la modificări ale efectelor estrogenului. Efectele sale sunt mediate prin intermediul receptorilor pentru estrogen α și β, inducând astfel modificări genomice (asigura activarea sau represia genelor pentru receptorul pentru progesteron, pentru catepsina D, pentru cmyc, pentru ciclina D1, ș.a.) și non-genomice asupra celulelor epiteliale mamare . În procesele de transformare malignă, ROS formați datorită excesului de fier pot induce modificări la nivelul estrogenului. Astfel, prin adăugarea grupării hidroxil el este transformat în catecol estrogen, unul din factorii carcinogenezei hormonale .

II.3. Metode de detectare a fierului în țesuturi

Investigațiile de bază care să pună în evidență cantitatea de fier totală din organism sunt cele biochimice și cuprind dozarea feritinei din ser (<200ng/ml pentru femeile sănătoase și <30ng/ml pentru bărbații sănătoși) și determinarea gradului de saturare a acesteia(<55% pentru pacienții sănătoși), pe lângă hemoleucograma completă (CBC), electroforeza hemoglobinei, investigarea funcțiilor ficatului, a organelor endocrine. De asemenea, testele genetice sunt necesare pentru identificarea maladiilor ereditare . Cu ajutorul tomografiei computerizate (CT) se pot pune în evidență depozitele de fier, dar sensibilitatea acestei metode este scăzută, depozitele mici fiind greu de identificat. Investigația prin RMN este singura metodă neinvazivă ce permite evaluarea cantitativă a fierului din multiple organe sau țesuturi.Excesul de fier din organism se poate pune în evidență și cu ajutorul biopsiile de măduvă osoasă sau de ficat . Fierul este dificil de identificat cu ajutorul colorațiilor normale, în mod normal biopsiile fiind supuse pe lângă colorației hematoxilină-eozină și unei colorații specifice pentru fier .

În studiile întocmite pe modele experimentale și clinice ale maladiilor în care degenerarea celulară provocată de fier este prezentă, vizualizarea histochimică a țesuturilor ajută la înțelegerea și estimarea contribuției acestui element chimic la generarea de leziuni tisulare.Istoricul detecției histochimice a firului nehemic începe în 1867 când Perls a utilizat ferocianura de potasiu și HCl pentru a vizualiza acestuia în țesuturi. În anul următor, Quincke a pus în evidență fierul cu sulfură de amoniu. Ulterior, au apărut atât modificări ale acestor colorații, cât și altele noi, nevoia de vizualizare a fierului de la nivel celular și subcelular, dar și detecția stării de oxidare a acestuia crescând odată cu încercările de înțelegere a metabolismului fierului în condiții fiziologice și patologice .

Fierul biologic a fost clasificat în fier ,,mascat” și ,,nemascat” în funcție de disponibilitatea sala punerea în evidență cu ajutorul metodelor histochimice. Tratamentul țesuturilor cu oxidanți puternici este necesar pentru eliberarea fierului ,,mascat”, în timp ce fierul ,,nemascat” este eliberat cu ajutorul soluțiilor acide. Astfel, punerea în evidență a fierului nehemic se realizează la un pH scăzut, utilizând soluții diluate de HCl, acid acetic, sau acid tricloroacetic, ceea ce permite vizualizarea ionilor liberi de Fe2+ și Fe3+ prin metodele Perls sau Turnbull.

II.3.1. Metoda Perls

Deși este foarte veche, metoda Perls continuă să fie cea mai utilizată la punerea în evidență a fierului nehemic datorită specificității sale față de fier, simplicității procedurii și a costului scăzut. Rezultatul acestei metode depinde de formarea albastrului de Prusia insolubil prin tratarea țesuturilor cu ferocianură. Atât feritina, cât și hemosiderina pot fi vizualizate histochimic cu ajutorul reacției Perls. Feritina dispersată în citosol duce la o colorație albastră difuză a citoplasmei, în timp ce granulele albastre închis se datorează depozitării împreună a feritinei și hemosiderinei în structuri numite siderozomi .

Perls (1867) a introdus albastrul de Berlin (albastru Prusian) pentru a pune în evidență fierul prezent în țesuturile și organele prelevate din autopsii. El a tratat țesuturile cu ferocianură de potasiu și apoi a adăugat mici cantități de HCl. Astfel, fierul (III) asociat cu bazele organice cu masa moleculară mică este eliberat în soluții acide pentru a reacționa cu ferocianura, [FeII(CN)6]4-, pentru a forma albastrul Prusian:

4Fe3+ + 3 [FeII(CN)6]4- →FeIII4[FeII(CN)6]3 ∙ xH2O ( x = 14-16)

(Albastru de Prussia)

sau

4Fe3+ +[FeII(CN)6]4- + K+→KFeIII[FeII(CN)6]

(așa numitul Albatru de Prusia ,,solubil”).

Albastrul de Prusia nu este stabil la valori mari de pH (>7.0) deoarece ionii hidroxid îl descompun la oxid feric, hidroxid feric și ion ferocianura:

FeIII4[FeII(CN)6]3 + 8HO- → 4FeIIIO(OH) + 3[FeII(CN)6]54- + 4H+

(Oxid feric)

și

KFeIII[FeII(CN)6] + 3HO- → FeIII(OH)3 + K[FeII(CN)6]3-

(Hidroxid feric)

Astfel se formează un precipitat maro, FeO(OH) sau Fe(OH)3. Încorporarea Ni2+ în albastrul Prusian îmbunătățește rezistența la atacul alcalin prin imersarea într-o soluție de sare de nichel, unii ioni de fier fiind înlocuți cu Ni2+, formând un precipitat a cărui nuanță tinde către un albastru mai verzui.

Ionul ferocianură și ionul feros produc un precipitat alb (sarea lui Everitt):

Fe2+ + K4[FeII(CN)6] → K2FeII[FeII(CN)6] + 2K+

(sarea lui Everitt)

Sarea lui Everitt se oxidează ușor în aer sau în soluție apoasă ducând la formarea albastrului de Prusia. Acest lucru indică faptul că metoda Perls poate colora atât Fe(III), cât și Fe(II), deși inițial se credea că această metodă este specifică pentru Fe(III). De asemenea, ionul ferocianura poate forma precipitate insolubile cu numeroase metale altele decât fierul la diferite valori de pH. Astfel, Cu2+ formează un precipitat brun, iar Zn2+ un precipitat alb. Aceste precipitate pot fi diferențiate de albastrul Prusian cu ajutorul variațiilor de culoare. Mai mult, ele nu catalizează polimerizarea oxidativă DAB a H2O2.

II.3.2. Metoda Turnbull

Metoda Turnbull utilizează fericianura în loc de ferocianura prezentă în metoda Perls. Această colorație depinde de formarea unui precipitat albastru insolubil – albastru Turnbull – format prin interacția dintre ionul fericianură și Fe2+.Inițial, această metodă era utilizată după tratarea țesuturilor în prealabil cu (NH4)S care reduce Pr-FeIII la Pr-FeII (Pr = proteine), deoarece se credea că fierul este prezent în țesuturi majoritar sub formă de ion feric. Această idee se datora imposibilității demonstrării prezenței Fe2+ prin colorația Turnbull probabil pentru că Fe2+ este rapid oxidat în prezența aerului sau în soluții apoase. Ulterior s-a demonstrat că reducerea ionului feric de către (NH4)S este incompletă: țesuturile apar pozitive la colorația Perls chiar și după tratamentul cu (NH4)S .

Albastrul Turnbull se obține prin reacția Fe2+ cu [FeIII(CN)6]3-:

3Fe2+ + 2[FeIII(CN)6]3- → FeII3[FeIII(CN)6]2

(albastru Turnbull)

Pe de altă parte, atunci când soluții de Fe3+ și [FeIII(CN)6]3- se amestecă, se formează o soluție maro (fericianura ferică) care nu disociază sau precipită:

Fe3+ + [FeIII(CN)6]3- → FeIII[FeIII(CN)6]

(fericianura ferică)

Fericianura ferică este un oxidant puternic și reacționează cu agenții reducători din țesuturi precum acidul ascorbic, melanina, lipofuscina, sau proteine care prezintă grupări tiol (-SH). Datorită faptului că potențialul redox standard al Fe3+ (E○=+0,711V) este mai mare decât cel al [FeIII(CN)6]3- (E○= +0,36V), FeIII este redus la FeII:

FeIII[FeIII(CN)6] + K + Pr-SH → KFeII[FeIII(CN)6] + 1/2Pr-S-S-Pr + H+

Produsul intermediar de reacție este KFeII[FeIII(CN)6]1/2FeIII[FeIII(CN)6]1/2. Acest compus este verde albăstrui (verde de Berlin) și poate fi oxidat în final la albastru de Prusia. Acest aspect sugerează faptul că, în prezența anumitor agenți reducători din țesuturi, metoda Turnbull poate colora și ionii Fe3+ eliberați din țesut. Totuși, ferocianura ferică este solubilă, iar micile cantități generate în țesuturi se pierd în timpul tratamentului. Mai mult decât atât, colorația prin metoda Turnbull poate fi inhibată prin tratamente în prealabil cu un chelator de metale divalente, 2,2’- dipiridil . Acest aspect susține faptul că metoda este specifică pentru ionii Fe(II) și nu colorează ionii Fe(III) .

II.3.3. Perfuzia in vivo – metodele Perls și Turnbull

Au fost dezvoltate metode cu o mare sensibilitate de punere în evidență a fierului nehemic prin tehnici histochimice întreprinse pe animale: perfuzia – metodele Perls și Turnbull . Meguro și colab. (2008) au arătat că această metodă depinde de formarea in vivo a albastrului de Prusia, respectiv Turnbull, înlăturând posibilitatea schimbării stării de oxidare a fierului prostmortem, sau oxidarea ionului feros din timpul tratamentului țesutului. În mod special, metoda Turnbull a pus în evidență prezența Fe(II) în lizozomi, și reducerea Fe(III) la Fe(II) în creierele ce prezentau ischemie și în cazul leziunilor gastrice induse. De asemenea, această metodă permite vizualizărea fierului catalitic disponibil la diferite valori ale pH-ului prin schimbarea pH-ului soluțiilor Perls sau Turnbull: fiziologic (7,4), acid (6,5 +/-0,3), endozomal (4,5 +/-0,2) și fagolizozomal (5,2-5,6). Dezavantajul perfuziei – Perls este acela că poate colora și anumiți ioni feroși, în timp ce reacția din perfuzia – Turnbull este diminuată de tratamentul în prealabil cu chelatorul de metale divalente 2,2’-dipiridil .

După anestezierea indivizilor, acestora li se perfuzează în aorta ascendentă tampon fosfat ce conține heparină, urmat de ferocianură de potasiu 1% pentru colorația Perls, sau fericianura de potasiu pentru colorația Turnbull, și de soluție 4% de paraformaldehidă. Țesuturile sunt apoi deshidratate și incluse în parafină .

II.3.4. Intensificara reacțiilor Perls și Turnbull

Albastrul de Prusia și albastrul Turnbull sunt substanțe redox active, fiind capabile să oxideze sau să reducă H2O2 care este descompusă la H2O și O:

FeIII4[FeII(CN)6]3+ ½H2O2 → FeII4[FeII(CN)6]3+ H+ + O (oxidarea H2O2)

FeII4[FeII(CN)6]3 + ½H2O2 → FeIII4[FeII(CN)6]3+ HO- (reducerea H2O2)

FeIII4[FeII(CN)6]3+ H2O2 → H2O+ O

Prin punerea la dispoziție a unui acceptor de oxigen (cromogeni) se pot intensifica reacțiile Perls și Turnbull. Printre aceștia se numără 3,3’- diamninobenzidina (DAB), fenilhidrazina HCl, ș.a.,ei fiind utilizați și la detectarea fierului redox activ.

II.3.4.1. Intensificarea cu DAB pentru metodele Perls și Turnbull

Metoda depinde de degradarea oxidativă/reductivă a H2O2 cuplată cu polimerizarea oxidativă a DAB. Produsul acestei reacții (precipitat maro închis) este intensificat prin adăugarea CoCl2 la soluția de DAB/H2O2. CoCl2 transformă produsul reacției DAB din maro în negru deoarece, cel mai probabil, amina aromatică reprezintă un situs de legătura pentru Co2+.

II.3.4.2. Intensificarea post-DAB pentru metodele Perls și Turnbull

Depozitelor de DAB polimerizat (pDAB) pot fi ulterior intensificate mai ales în cazul studiilor de microscopie electronică: depozitele pDAB acționează ca un agent reducător slab, reacționând cu fericianura ferică. În prezența pDAB, FeIII[FeIII(CN)6] este redus la FeII[FeIII(CN)6] (albastru Turnbull). Ionii metalici precum Au3+ (E○ = +1,5V) și Ag+ (E○ = +0,8V) pot fi utilizați în locul FeII[FeIII(CN)6], Au3+ fiind cel mai bine încorporat în pDAB. OsO4 (E○ = +0,64V) poate fi folosit la intensificarea post-DAB, dar micile cantități de pDAB nu se pot diferenția de colorarea fondului pe care OsO4 o provoacă. Astfel, sărurile de Ag sunt cel mai des utilizate datorită caracteristicilor chimice ale reacției care face ca argintul să fie rapid redus, iar reacția să fie accelerată .

II.3.5. Metoda Leuco Patent blue V – pentru hemoglobină.

După fixarea țesuturilor cu formaldehidă,secțiunile se colorează cu soluția Patent blue(soluție apoasă Patent blue V 1% 25 ml, pudră de zinc 2,5 g și acid acetic glacial 0,5 ml se amestecă bine, se filtrează și se depozitează la frigider la 3-6○C maxim o săptămână). Astfel, hemoglobin peroxidaza (eritrocitele și neutrofilele) se colorează în albastru. Acestă metodă poate pune în evidență activitatea peroxidazei și din alte celule sanguine, mai ales de la nivelul lizozomilor și a leucocitelor polimorfonucleare, inclusiv precursorii lor.

II.3.5. Fixarea țesutului

Fixarea țesuturilor pentru punerea în evidență a fierului nehemic trebuie să se desfășoare în substanțe tampon care să asigure o valoarea a pH-ului de 7 pentru a ne asigura că sunt prezente ambele forme ionice. Astfel, această etapă se poate realiza cu ajutorul soluțiilor de 10% formaldehidă, 4% paraformaldehidă (pentru microscopia optică), sau 4% paraformaldehidă + 0,1-1,5% glutaraldehidă (pentru microscopia electronică) în 0,01M tampon fosfat sau cacodilat (pH 7,4). Pentru țesuturile incluse în parafină este recomandată deshidratarea țesuturilor cu etanol înaintea fixării . Fixarea țesuturilor se poate face și prin congelarea și stocarea lor la -80○C .

II.3.6. Agenți oxidanți puternici sunt necesari pentru eliberarea fierului hemic

Fierul hemic este legat de cei patru atomi de azot ai inelului protoporfirinic, hemul fiind, la rândul său, asociat cu părțile proteice ale proteinelor cu ajutorul inelului imidazol al histidinei (hemogrobină și mioglobină) sau a grupărilor tiol ale cisteinei (citocrom P-405) prin legături covalente coordinative. Fierul hemic este considerat a fi ,,mascat” deoarece nu poate fi pus în evidență cu ajutorul colorației Perls, el nefiind eliberat prin tratarea țesuturilor cu HCl, acid acetic, sau acid tricloracetic deoarece aceste substanțe nu au caracter oxidant precum acidul sulfuric sau nitric .

Fierul a fost eliberat din transferină și feredoxină prin tratament cu soluție 10% de acid tricloracetic, lucru care nu s-a întâmplat și în cazul mioglobinei. Tratamentul omogenatului tisular cu 1M HCl și acid tricloracetic 10% și incubarea lui la 95○C pentru 1h a dus la eliberarea la mai puțin de 2% din fierul din hemoglobină și mioglobină și la eliberarea în proporție de 100% a fierului din feritină. Mai mult decât atât, deferoxamina nu eliberează fierul hemic, deși îl poate elibera pe cel din feritină și hemosiderină. Fierul hemic a putut fi pus în evidență prin metoda Perls după tratarea țesutului cu gaz de peroxidisulfat de amoniu ((NH4)2S2O8) la 30○C pentru 12h, sulfat de amoniu puternic alcalin, (NH4)2S, sau NH4HS pentru câteva zile sau soluție de H2O2 30% pentru o scurtă perioadă de timp.

III. Materiale și metode

III.1. Proba biologică

În vederea detectării fierului în țesuturi patologice s-au recoltat fragmente de glandă mamară patologică de la câine (Tabelul III.1), fragmente de prostată de la pacienți umani prezentând adenocarcinom(ADK – Adenocarcinom) și/sau hiperplazie prostatică benignă (BPH – Benign Prostatic Hyperplasia) (Tabelul III.2) fragmente de creier uman de la indivizi cu astrocitom și glioblastom (Tabelul III.3).Probele martor au fost reprezentate de glandă mamară normală de câine și prostată normală recoltată în urma autopsiei.

III.2. Prelucrarea histologică

Fragmentele de țesut au fost fixate cu fixator Bouin, deshidratate prin trecerea lor prin concentrații crescătoare de alcool etilic (70%, 95% și 100%), clarificate în toluen și incluse în parafină. S-au realizat secțiuni de 6 µm la microtomul rotator (microTec, Micros Austria).

III.3. Colorații histologice și histochimice

III.3.1.Metoda de colorare Albastru Alcian – Hematoxilină – Eozină

Pentru caracterizarea structurală a probelor de țesut s-a realizat colorația Albastru Alcian – Hematoxilină – Eozină pH 2,5.Secțiunile au fost deparafinate prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen (5 minute/baie), rehidratate în alcool etilic de concentrații descrescătoare (100%, 95% și 70%) (5 minute/baie), spălate de 2 ori în apă distilată și colorate cu Albastru Alcian, pH 2,5, 30 de minute. Ulterior au fost spălate cu o soluție de 3% acid acetic glacial, spălate cu apă de robinet 3 minute și cu apă distilată 1 minut și colorate cu Hematoxilină 10 minute. Secțiunile au fost apoi spălate cu apă de robinet (5 băi, 2 minute/baie), colorate cu soluție de Eozină 1%, spălate din nou cu apă de robinet (5 băi; 2 minute/baie) și apă distilată (2 minute/baie) și deshidratate în băi cu concentrații crescătoare de etanol (70%, 95% și 100%) (5 minute/baie), clarificate prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen (5 minute/baie), și montate în Balsam de Canada.

Rezultatele colorației: mucopolizaharidele acide se colorează în albastru, nucleii se colorează în violet, iar citoplasma și fibrele de colagen în roz.

III.3.2.Detectarea histochimică a fierului.

Pentru detectarea histochimică a fierului în țesut s-au utilizat două metode: a) metoda Perls pentru evidențierea Fe3+ și b) metoda Turnbull pentru evidențierea Fe2+.

Metoda Perls.

Secțiunile de țesut au fost deparafinate prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen (5 minute/baie), rehidratate în alcool etilic de concentrații descrescătoare (100%, 95% și 70%) (5 minute/baie), spălate de 2 ori în apă distilată și incubate 30 de minute într-o soluție preparată extemporaneu de ferocianură de potasiu 2%: 100 ml apă distilată, 2 g K4[Fe(CN)6]∙3H2O, 2ml HCl concentrat. După spălareasecțiunilor de 4 ori în apă distilată, nucleii au fost contrastați cu hematoxilină pentru 5 minute. Secțiunile clătite de 2 ori în apă distilată au fost deshidratate în băi cu concentrații crescătoare de etanol (70%, 95% și 100%) (5 minute/baie), clarificate prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen (5 minute/baie), și montate în Balsam de Canada.

Rezultatele colorației: Ionii Fe3+ prezenți în feritină și hemosiderină se colorează în albastru. Nucleii se colorează în violet.

Metoda Turnbull.

Secțiunile de țesut au fost deparafinate prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen (3 minute/baie), rehidratate în alcool etilic de concentrații descrescătoare (100%, 95% și 70%) (5 minute/baie), spălate de 2 ori în apă distilată și incubate 30 de minute într-o soluție preparată extemporaneu de fericianură de potasiu 2%: 100 ml apă distilată, 2 g K3[Fe(CN)6]∙3H2O, 2ml HCl concentrat. După spălarea secțiunilor de 4 ori în apă distilată, nucleii au fost contrastați cu hematoxilină pentru 5 minute. Secțiunile clătite de 2 ori în apă distilată au fost deshidratate în băi cu concentrații crescătoare de etanol (70%, 95% și 100%) (5 minute/baie), clarificate prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen (5 minute/baie), și montate în Balsam de Canada.

Rezultate: Ionii Fe2+ se colorează în albastru. Nucleii se colorează în violet.

III.4. Analiza microscopică

Secțiunile de țesut au fost examinate la microscopul optic DAFFODIL MC100, Micros Austria. S-au realizat fotografii microscopice cuun aparat foto Canon PowerShot A620.

IV.Rezultate și discuții

IV.1. Glanda mamară

a. Analiza histologică și histopatologică

Din punct de vedere anatomic și histologic, glanda mamară este o glandă cutanată a cărei unitate secretoare este acinul, alcătuit din celule epiteliale secretoare. La periferia structurilor glandulare se găsesccelule mioepiteliale.Acinii sunt conectați printr-un sistem de canale care converg spre mamelon(Santos, et al., 2010). Canaleleconțin două straturi de celule epiteliale: un strat intern, constituit din celule epitelialecubice, care se pot transforma în celule secretoare în timpul lactației și un strat contractil exterior format din celule mioepiteliale fixate pe o membrană bazală (Hassiotou & Geddes, 2013). Acinii sunt formați în general dintr-un singur strat de celule cubice sau cilindrice, în funcție de activitatea lor (Sorenmo, et al., 2011). Acinii și canalele nu sunt structuri statice, ele răspunzând la schimbările hormonale din timpul ciclului menstrual, sarcinii și lactației, dar și la cele ce survin odată cu înaintarea în vârstă, schimbarea dietei sau condițiilor de mediu(Greaves, 2009). Componenta epitelială a glandei mamare este susținută de țesut conjunctiv, țesut adipos, vase de sânge, nervi, vase limfatice, macrofage, mastocite, și limfocite (Sorenmo, et al., 2011).Deși în majoritatea cazurilor cancerul mamar apare la nivelul canalelor, el se poate dezvolta și la nivelul lobulilor, sau a mamelonului (Torti & Torti, 2013), având o dezvoltare lentă într-o gazdă imunocompententă, dar și abilitatea de metastazare pulmonară (Freitas, et al., 2007).

La naștere, glanda mamară nu este complet dezvoltată, dezvoltarea sa finală survenind la pubertate când trece prin procese morfogenetice controlate hormonal , pentru ca la parturiție să ajungă o structură complexă formată din lobuli, acini și canale excretoare. Ea este un indicator al funcțiilor axului hipotalamo-hipofizo-gonadal, astfel încât evaluarea histologică a acesteia oferă informații cu privire la componentele ce modulează această activitate. Creșterea, diferențierea și funcțiile glandei mamare sunt sub controlul hormonilor de tipul estrogenului, progesteronului, prolactinei, hormonului de creștere, insulinei, catecolaminelor și ACTH-ul .

Analizele histologice și histopatologice s-au realizat pe secțiuni colorate cu Hematoxilină-Eozină-Albastru pH 2,5. Glanda mamară normală s-a caracterizat histologic prin prezența lobulilor, despărțiți de cantități considerabile de țesut conjunctiv interlobular. Fiecare lobul este alcătuit din acini, lipsiți de secreție, despărțiți de cantități mici de țesut conjunctiv intalobular. Acinii sunt conectați între ei printr-un sistem de canale interlobulare și intralobulare. Mucopolizaharidele (colorate în albastru) au fost prezențe în cantități foarte reduse (Fig. IV.1.și Fig. IV.8.).

Analizele histopatologice ale celor nouă tumori de glandă mamară canină au evidențiat modificări la nivelul țesutului conjunctiv, a acinilor și a canalelor excretoare (Fig.IV.2.). La nivelul țesutului conjunctiv au fost puse în evidență mucopolizaharidele (colorate în albastru) (Fig. IV.3.), formațiuni condroide (Fig. IV.4.), dar și alte anomalii (Fig. IV.5.). La nivelul acinilor și canalelora fost prezentăproliferarea celulară, dar și hipertrofierea canalelor (Fig. IV.6.și IV.7.).

Toți indivizii bolnavi, indiferent de rasă, vârstă, sau sterilitate au prezentat cantități remarcabile de glicozaminoglicani (mucopolizaharide acide), majoritar la nivelul țesutului conjunctiv din jurul infiltrațiilor neoplazice (Fig IV.3.E și F). Stroma interlobulară este invadată de celule neoplazice neuniforme din punct de vedere al formei și marimii (Fig. IV.3.D). Aceste depozite mari de mucopolizaharide acide prezente în stroma din jurul tumorilor este un produs al fibroblastelor peritumorale, și nu un produs al celulelor canceroase .

Constituienții matrixului extracelular sunt implicați în mecanismele celulare și moleculare ale cancerului, afectând adeziune, migrarea, potențialul invaziv și metastatic al celulelor. Glicozaminoglicanii (mucopolizaharidele acide) sunt heteropolizaharide naturale cu sarcină negativă, prezente în toate țesuturile mamaliene. Ei sunt compuși din unități dizaharidice repetate, constituite din N-acetil hexozamine și acid uronic. Glicozaminoglicanii joacă un rol esențial atât în condiții fiziologice, cât și patologice, fiind molecule cheie ce au efecte asupra proprietăților și funcțiilor celulare, acționând direct asupra receptorilor celulari sau interacționând cu citokine sau factori de creștere implicați în dezvoltarea și progresia cancerului.

Glicozaminoglicanii sunt implicați în cascadele de semnalizare, reglarea angiogenezei, invazia și metastazarea celulelor maligne, reglând procese de bază de tipul proliferării, recunoașterii, modulării adeziunii, sau comunicării celulă-celulă. Pe lângă a fi structuri cu rol de suport, glicozaminoglicanii formează legături între mediul intracelular și cel extracelular, fiind implicați în semnalizarea intracelulară. Ei acționează ca receptori, co-receptori, fiind implicați și în schimbările ce au loc în timpul proceselor de transformare maligne . De asemenea, trombocitele se asociază celulelor tumorale printr-un proces dependent de glicozaminoglicani, având un rol important în facilitarea instalării metastazei printr-un proces dependent de selectine .Glicozaminoglicanii prezenți în cancerele mamare pot acționa pe post de liganzi pentru selectine (lectine dependente de calciu implicate în traficul celulelor imune), promovând metastaza . Invadarea țesutului conjunctiv de către celulele tumorale este însoțită de depolimeralizarea mucopolizaharidelor acide, proces realizat de enzimele mucolitice .

Prezența glicozaminoglicanilor la acest nivel este, probabil, un mecanism de apărare al țesutului conjunctiv față de celulele tumorale, creșterea proliferării fibroblastelor și a mastocitelor fiind asociate cu creșterea producției de mucopolizaharide acide.

Patru din cei 9 indivizi bolnavi au prezentat formațiuni condroide (Fig. VI.4.), și anume exemplarele de Airedale Terrier, Shnauzer, Ciobănesc German și Husky Siberian. Astfel, două probe au provenit de la indivizi sterilizați de 14 și 18 ani, iar două probe au provenit de la indivizi nesterilizați de 9 și 11 ani. Acest aspect sugerează că apariția țesutului cartilaginos asociat carcinoamelor mamare nu depinde de prezența sau absența sistemului reproducător.

Carcinomul anaplastic este cel mai malign dintre carcinoamele mamare, celulele neoplazice fiind reprezentate de condrocite. Condrocitele sunt individualizate în mici lacune – condroplaste – , putând fi rotunde, ovale sau poligonale, cu un diametru de 15-17 µm, și o cantitate moderată de citoplasmă eozinofilă. Nucleii sunt rotunzi sau ovali și prezintă 2-3 nucleoli cu dimensiuni variabile (Fig. IV.1.3). Anizokarioza și anizocitoza sunt severe, iar mitozele sunt comune. Carcinomul anaplastic induce un răspuns desmoplasic al gazdei cu proliferarea miofibroblastelor, celulelor plasmatice, mastocitelor, ocazional fiind prezente și neutrofile, eozinofile, sau macrofage .

Fluidul interstițiar, derivat din plasma sanguină, provine din capilarele care tind să devină hiperpermeabile datorită secrețiilor de factorul endotelial de creștere de către celulele tumorale și stromale . El poate fi considerat un element cheie al creșterii tumorale, putând furniza fier și alte substanțe nutritive celulelor tumorale, dar și celulelor inflamatorii și stromale .

În cazul probelor prelevate de la indivizii ce prezentau tumori mamare, acinii și canalelea cinci dintre cei nouă indivizi prezintaucelule proliferative (Fig. IV.6. și IV.7.).

Carcinomul ductal este un neoplasm ce prezintă diferențiere la nivelul canalelor interlobulare. Ariile focale sau multifocale de diferențiere scvamoasă și de keratinizare pot fi prezente, împreună cu granulele intracitoplasmatice de keratohialină .

b. Detectarea histochimică a fierului

b. Detectarea histochimică a fierului

Analiza histochimică a evidențiat prezența fierului doar în glandele mamare tumorale. Glanda mamară normală nu a prezentat un rezultat pozitiv al reacțiilor Perls sau Turnbull, structura sa histologică fiind cea tipică (Fig. IV.8.).

Cu ajutorul colorației Perls s-au pus în evidență depozitele de fier în tumorile mamare la toți cei nouă indivizi bolnavi (Fig. IV.9.). Fierul nehemic pus în evidență cu ajutorul metodei Perls poate fi fier depozitat sub formă de transferină sau hemosiderină (Fig. IV.10.), fier legat de trasnferină, fier din structura enzimelor, fonduri de fier cu masă moleculară mică

Cinci din cei nouă indivizi au prezentat depozite de ion Fe3+ la nivelul structurilor glandulare (Fig. IV.11.). Opt indivizi au prezentat depozite extracelulare de fier la nivelul țesutului conjunctiv, alcătuit în principal din fibroblaste, celule mononucleate și mastocite, ce susține celulele epiteliale (Fig. IV.12.). În țesutul conjunctiv periglandular, fierul a fost detectat și sub formă de depozite intracelulare asociate macrofagelor la 5 dintre indivizii bolnavi (Fig. IV.13.). Prin urmare, cinci din cei 10 indivizi au prezentat depozite de fier atât la nivelul țesutului glandular, cât și la nivelul țesutului conjunctiv periglandular.

Colorația Turnbull nu a dat rezultate pozitive pentru nicio probă ceea ce poate indica faptul că Fe2+ a fost oxidat în timpul tratamentelor tisulare necesare pentru evaluarea histochimică.

Asemănător studiilor anterioare realizate pe alte tipuri de cancer , cantitatea de fier prezentă în probele patologice nu a fost corelată cu vârsta, sau sterilitatea indivizilor. În cazul indivizilor nesterilizați, depozitele de fier au putut fi identificate atât la indivizii care au avut pui, cât și la cei care nu au avut pui, diferența fiind aceea că acestea au fost prezente cu precădere la nivelul structurilor glandulare în primul caz, respectiv la nivelul țesutului conjunctiv în cel de-al doilea caz.

Tumorile mamare prezintă mari depozite de ion feros necesar pentru supraviețuirea celulelor canceroase. Carcinomul mamar poate prezenta, pe lângă celule epiteliale și stromale aberante, vase de sânge (Fig.IV.1.10.), fibroblaste activate, macrofage, limfocite și leucocite. Fierul este necesar pentru proliferarea, metabolismul și desfășurarea activităților acestor tipuri celulare: fibroblastele necesită fier pentru biosinteza colagenului , macrofagele îl utilizează pentru activitatea NADPH oxidazei, a peroxidazei și a catalazei, iar mastocitele îl utilizează la hidroxilarea triptofanului .

Studiile anterioare au arătat că celulele normale și cele neoplazice diferă nu doar prin mecanismul lor de a obține fierul, dar și prin modalitățile de depozitare ale acestuia, cele din urmă folosind mult mai mult fier pentru propriul metabolism și depozitând mult mai puțin comparativ cu celulele normale .

Deși anumite studii infirmă acest lucru , de regulă, cantitatea de fier din serul sanguin este direct proporțională cu cantitatea de fier din depozite, crescând riscul apariției cancerului, aceasta fiind mult mai mare în cazul cancerului mamar, ovarian, de prostată, testicular, pancreatic, sau hepatocelular . De asemenea, în cazul indivizilor ce prezintă cancer mamar, cantitatea de feritină din ser este corelată cu gradul de avansare al cancerului , deși încă nu s-a găsit o legătura directă între fier și cancerul mamar .

Prezența fierului în celulele țesutului conjunctiv, în special în macrofage, susține faptul că gazda încearcă să priveze celulele tumorale de fier . Astfel, celulele neoplazice rămân viabile prin menținerea glicolizei anaerobe, bazându-se în foarte puține cazuri pe fosforilarea oxidativă .

IV.2. Prostata

Structura histologică

Prostata este alcătuită din structuri glandulare și țesut conjunctiv. Structurile glandulare reprezintă regiunea terminală, tubulară, a glandelor tubulo-acinoase ce provin din uretră. Ele conțin două straturi de celule: stratul extern este format din celule cubice, iar cel intern format din celule epiteliale cilindrice ce au o secreție mucoasă.. Țesutul conjunctiv de tip fibro-muscular ce protejează și separă glandele constituie aproximativ jumătate din volumul prostatei (Bostwick, et al., 2004).

Interacțiile dintre componenta epitelială și cea conjunctiva sunt extrem de importante în patologia tumorilor prostatice, ele având rol în creștere, invazie și metastază. În cadrul studiilor realizate pe șoareci și șobolani, testosteronul și estradiolul induc transformarea malignă doar în prezența fibroblastelor/miofibroblastelor asociate tumorilor. Supraexprimarea proteinelor caracteristice țesutului conjunctiv (osteonectinei, timidin fosforilaza, colagenul de tip III și IV) este legată de agresivitatea tumorilor.

Detectarea histochimică a fierului

Cu ajutorul colorației Perls s-au pus în evidență depozitele de fier ale tumorilor prostatice. Unsprezece dintre cei treizeci și opt de indivizi bolnavi au prezentat depozite de fier la nivelul prostatei. Toți unsprezece au fost diagnosticați cu adenocarcinom, șase prezentând și hiperplazie prostatică benignă, iar unul prezentând și carcinom urotelial. La niciunul dintre indivizii care au prezentat doar BPH nu au fost prezente depozitele de fier (Fig. IV.14.).

Aceste depozite de fier, considerabil mai mici în cazul tumorilor de prostată, comparativ cu cele mamare, au fost prezente preponderent la nivelul țesutului conjunctiv, doi indivizi prezentând depozite de fier la nivelul țesutului glandular degenerat (Fig. IV.15.), cantitatea de fier nefiind corelată cu vârsta pacienților. Frecvent, la nivelul structurilor glandulare este prezentun coloid bogat în fier (Fig. IV.15.B.).S-a observat prezența glandelor hipertrofiate în care celulele epiteliale au suferit apoptoza și au fost eliminate în lumen. În citoplasma acestor celule au fost evidențiate depozite de fier (Fig. IV.16.).

Hiperplazia prostatică benignă (BPH – Benign prostatic hyperplasia) survine frecvent la bărbații înaintați în vârstă. Mecanismul de apariție al acestei afecțiuni este probabil legat de acumularea de dihidrotestosteron în prostată . La nivel microscopic, BHP constă în noduli prezenți la nivelul glandelor și a țesutului conjunctiv, în proliferarea remarcabilă a celulelor gladulare .

Adenocarcinomul prostatic (ADK – Adenocarcinoma) este cea mai cunoscută formă de cancer la bărbații învârstă, având a doua cea mai mare rată a mortalității, după cancerul de plămâni . Cancerul de prostată se poate detecta cu ajutorul antigenului specific prostatic (PSA) – glicoproteină produsă exclusiv de celulele glandulare ale prostatei ale cărei valori normale din sânge este de maxim 4ng/mL . Deși PSA este considerat a fi un indicator al cancerului prostatic, fierul depozitat la nivelul prostatei a fost prezent atât la indivizi ce au prezentat o valoare a PSA-ului mare (20, 17,5, 11,64), cât și la cei cu o valoare a PSA-ului apropiată de cea normală (4,5, 5, 5,4). Totuși, s-a observat o corelare faptul că în cazul indivizilor cu o valoare a PSA-ului ridicată, depozitele de fier au fost de dimensiuni mai mari, preponderent sub formă de hemosiderină (Fig. IV.17.).

Evidențiind rolul ferului și la nivelul prostatei, un studiu recent ce a analizat probe de țesut prelevate post-prostatectomie de la 40 de bărbați a demonstrat faptul că o concentrație scăzută de fier la nivelul prostatei este asociată, în cele mai multe cazuri, cu o creștere a valorii PSA post-prostatectomie.

Deoarece gradul de diferențiere al tumorii influențează puternic, dar nu proporțional, cantitatea de PSA din sânge, pentru caracterizarea (în special din punct de vedere histologic) a cancerului prostatic se utilizează și scorul Gleason, cancerul cu un scor Gleason mai mare fiind mai agresiv . În cazul de față, șapte din cei unsprezece pacienți au prezentat un scor Gleason de 7, unul de 4, unul de 5 și unul de 8 (Fig. IV.2.18.). S-a observat o corelare direct proporțională a cantității de fier cu scorul Gleason.

Microscopic, ADK constă în structuri glandulare slab diferențiate mici așezate spate în spate, înconjurate, sau nu, de cantități foarte reduse de țesut conjunctiv. De asemenea, pot fi prezente fibre nervoase dispersate printre glande. Celulele glandulare au nuclei rotunzi, hipercromatici, cu un singur nucleol, mitoza fiind prezentă (Fig.IV.2.19.). Ca și în cazul cancerului mamar, și la nivelul prostatei afectate de cancer sunt prezente adesea macrofagele, însoțite, de obicei, de eritrocite extravasculare, care probabil intervin în privarea celulelor canceroase de fier (Fig. IV.2.20.).

Până în prezent nu s-a realizat o corelație între prezența fierului (depozitat la acest nivel datorită modificărilor apărute la nivelul celulelor) în țesuturile tumorale și gradul de diferențiere al tumorilor prostatice Totuși, studii experimentale destul de recente au arătat rolul ROS în dezvoltarea cancerului prostatic datorită efectului pe care acestea le au asupra ADN-ului . De asemenea, în dezvoltarea cancerului prostatic hepcidinul pare să joace un rol crucial: fiind secretat de celulele prostatei în cantități anormale, el crește gradul de reținere intracelulară a fierului și formarea depozitelor de fier, promovând supraviețuirea celulelor canceroase .

IV.3. Tumorile cerebrale – Astrocitomul și Glioblastomul.

Cu ajutorul colorației Perls s-au pus în evidență depozitele de fier în tumorilor cerebrale. Ele au fost prezente atât în probele de astrocitom, cât și în cele glioblastom (Fig. IV.21). Cantitatea și depozitele de fier detectate la acest nivel au fost mult inferioare celor de la nivelul tumorilor mamare, sau de prostată. De asemenea, fierul a fost detectat și în tumorile generate în creierul de șoarece prin injectarea de celule stem nervoase și tumorale (Fig.IV.22.). În creierul de embrion de șoarece fierul a fost absent.

Cantitatea de fier de la nivelul neuronilor a fost mult mai mică comparativ cu cea prezentă la nivelul celulelor gliale. Studiile anterioare au arătat faptul că neuronii sechestrează fierul preponderent la nivelul lizozomilor . Depozitele de fier de la nivelul celulelor gliale, în special de la nivelul astrocitelor, sunt considerate a proteja fibrele nervoase mielinizate de stresul oxidativ, în timp ce cele de la nivelul oligodentrocitelor sunt importante în procesul de mielinizare și în metabolismul neuronilor și a celulelor gliale .

Imagini recente de rezonanță magnetică nucleară au demonstrat o acumulare progresivă a fierului în creier odată cu înaintarea în vârstă . Acestea s-ar putea explica prin alterarea funcției celulelor endoteliale ce intră în alcătuirea barierei hemato-encefalice datorată creșterii cantității de colesterol odată cu vârsta, și, respectiv a ROS care distrug membrana lipidică, permițând pătrunderea fierlui .

S-a demonstrat faptul că fierul influențează proprietățile fiziologice ale microgliei , fiind implicat în progresia bolilor neurodegenerative fie prin catalizarea formării radicalilor liberi, fie prin formarea de produși solubili toxici precum citokinele .

V. Concluzii

Fierul este utilizat din ce în ce mai des la evaluarea diferitelor tumori, el putând contribui la apariția tumorilor, dar și la creșterea lor. Înțelegerea proceselor moleculare ce au loc în menținerea homeostaziei fierului, dar și a modificărilor ce survin în cazul diferitelor tipuri de tumori, pot fi un beneficiu atât pentru analiză, cât și pentru terapia împotriva cancerului.

Indiferent de tipul de țesut, carcinogeneza și transformările maligne pot fi puse pe seama stresului oxidativ cauzat de fier ce poate duce la degradarea ADN-unui, ulterior contribuind la dezvoltarea tumorilor. De asemenea, expunerea celulelor la cantități mari de fier poate cauza și moartea celulară, în timp ce un stres oxidativ moderat, dar constant, poate fi tolerat de celule și poate duce la instabilitate genetică.

Acest studiu a demonstrat existența unei legături între prezența celulelor tumorale și a depozitelor de fier concretizată prin faptul că fierul intracelular prezent în cantități mari asigură activitatea proteinelor dependente de fier și proliferarea celulară.

Am observat faptul că, indiferent de originea țesutului tumoral și indiferent de specie, depozitele de fier au fost prezente în cantități semnificativ mai mari în tumorile maligne, aspect care poate susține folosirea acestor reacții histochimice în laboratoarele clinice pentru diagnosticare și stabilirea gradului de avansare a tumorii.

De asemenea, alături de specroforometria de rezonanță magnetică, aceste reacții pot ajuta la detectarea timpurie a depozitelor de fier și la prevenirea apariției tumorilor maligne ce se poate datora stresului oxidativ apărut datorită fierului. Mai mult decât atât, el poate reprezenta o referință pentru studiile ulterioare de evidențiere a rolului fierului în apariția și dezvoltarea diferitelor tipuri de tumori, precum și pentru dezvoltarea de remedii pentru cancer mai accesibile și mai eficiente.