METODE GLICOMICE MODERNE DE DEPISTARE ȘI ANALIZĂ A POTENȚIALILOR BIOMARKERI TUMORALI CEREBRALI PRIN [303595]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

“VICTOR BABEȘ” DIN TIMIȘOARA

MEDICINĂ GENERALĂ

Deparatmentul de Biochimie si Farmacologie

DOCTORAND: [anonimizat] 2017

CUPRINS

INTRODUCERE XVI

PARTEA GENERALĂ 1

1. ASPECTE BIOMEDICALE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ 1

1.1. CELULARITATE ȘI TUMORIGENEZA 1

1.2. TUMORI BENIGNE ALE CREIERULUI 7

1.2.1. EPIDEMIOLOGIE 8

1.2.2. CLASIFICARE 9

1.3. METASTAZE CEREBRALE 10

2. ASPECTE BIOCHIMICE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ 12

2.1. SPECTROMETRIA DE MASĂ 12

2.2 LIPIDE 13

2.3. GANGLIOZIDE 14

2.3.1. INTRODUCERE 14

2.3.2. STRUCTURA GANGLIOZIDELOR 15

2.3.3. NOMENCLATURA GANGLIOZIDELOR 20

2.3.3.1. Nomenclatura ionilor fragment folosită pentru a determinarea secvența gangliozidică 21

2.3.4. LOCALIZAREA GANGLIOZIDELOR ÎN ORGANISM 23

2.3.5. ANALIZA GANGLIOZIDELOR 24

2.3.6. BIOSINTEZA GANGLIOZIDELOR 25

2.3.6.1. Seria Gala 27

2.3.6.2. Gangliozide derivate din glucozilceramidă 28

2.3.7. DEGRADAREA GANGLIOZIDELOR 30

2.3.8. PATOBIOCHIMIE 32

2.3.8.1. Aspecte funcționale 33

2.4. PROTEINE 36

PARTEA SPECIFICĂ 37

3. MATERIALE ȘI METODE 37

3.1. REACTIVI ȘI MATERIALE DE LABORATOR 37

3.2. SELECTAREA ȘI DESCRIEREA MATERIALULUI DE LUCRU. ANALIZA AMESTECURILOR COMPLEXE DE GANGLIOZIDE EXTRASE DIN ȚESUT CEREBRAL 38

3.3. PLATFORME ANALITICE UTILIZATE 39

3.3.1. SPECTROMETRUL DE MASĂ NANOESI CUPLAT CU ROBOTUL NANOMATE PENTRU INFUZARE ȘI IONIZARE AUTOMATĂ 39

3.3.2. [anonimizat]-FLIGHT-QTOF 42

3.3.3. DISOCIEREA INDUSĂ PRIN CIOCNIRE ([anonimizat]) 44

3.3.4. DISOCIEREA INDUSĂ PRIN TRANSFER DE ELECTRONI ([anonimizat]) 44

3.4. PLATFORME INFORMATICE 45

4. REZULTATE ȘI DISCUȚII 47

4.1.[anonimizat], PRIN CHIP NANOESI HCT MS 47

4.1.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI 47

4.1.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE 48

4.1.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL 49

4.1.4. SCREENINGUL MS2 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL 56

4.1.5. CONCLUZII DE ETAPĂ 60

4.2. [anonimizat] 61

4.2.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI 61

4.2.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE 62

4.2.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM 65

4.2.4. SCREENINGUL MS/MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM 68

4.2.4. CONCLUZII DE ETAPĂ 73

4.3. STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL METASTAZEI CEREBRALE A [anonimizat], DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL PRIN CHIP NANOESI QTOF MS 75

4.3.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI 75

4.3.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE 76

4.3.3. SCREENINGUL MS1 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL 79

4.3.4. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI GD3 (D18:1/18:0) ASOCIATĂ CU METASTAZA CEREBRALĂ A ADENOCARCINOMULUI PULMONAR 90

4.3.5. ANALIZA CID MS/MS A [anonimizat]1 (D18:1/18:0) DIN PROBA DE ȚESUT CEREBRAL SĂNĂTOS 92

4.3.6. CONCLUZII DE ETAPĂ 94

4.4. SOFTWARE ORIGINAL GANGLIOBASE DE IDNTRIFICARE A GANAGLIOZIDELOR OBȚINUTE PRIN SCREENING-UL MS 96

4.5. STUDIU PILOT PENTRU TESTAREA FEZABILITĂȚII METODELOR DE SPECTROMETRIE DE MASĂ DEZVOLTATE PENTRU STUDIUL INTERACȚIUNILOR FUNCȚIONALE PROTEINE – GLICOCONJUGAȚI 102

4.5.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI 102

4.5.2. REACTIVI ȘI MATERIALE 103

4.5.3. TESTE DE INTERACȚIUNE ALE β-LG-Glc6 104

4.5.3.1. Interacțiunea β-LG-Glc6 în acetat de amoniu/acid formic 105

4.5.3.2. Interacțiunea β-LG-Glc6 în apă 110

4.5.4. CONCLUZII DE ETAPĂ 111

5. CONCLUZII ȘI CONTRIBUȚII PERSONALE 114

BIBIOGRAFIE 119

Anexe I

Lista lucrărilor științifice

I. Articole publicate „în extenso” în reviste de specialitate

1. Robu AC, Vukelić Ž, Schiopu C, Capitan F, Zamfir AD. Mass spectrometry of gangliosides in extracranial tumors: Application to adrenal neuroblastoma. Analytical biochemistry. 2016 Sep 15;509:1-1. Factor de impact (2016): 2,243; Număr de citări: 2

2. Capitan F, Robu AC, Schiopu C, Ilie C, Chait BT, Przybylski M, Zamfir AD. β-Lactoglobulin detected in human milk forms noncovalent complexes with maltooligosaccharides as revealed by chip-nanoelectrospray high-resolution tandem mass spectrometry. Amino acids. 2015 Nov 1;47(11):2399-407. Factor de impact (2015): 3,196

3. Schiopu C, Vukelić Ž, Capitan F, Kalanj‐Bognar S, Sisu E, Zamfir AD. Chip‐nanoelectrospray quadrupole time‐of‐flight tandem mass spectrometry of meningioma gangliosides: A preliminary study. Electrophoresis. 2012 Jul 1;33(12):1778-86. Factor de impact (2012): 3.261;

Număr de citări: 12

4. Zamfir AD, Serb A, Vukeli Ž, Flangea C, Schiopu C, Fabris D, Kalanj-Bognar S, Capitan F, Sisu E. Assessment of the molecular expression and structure of gangliosides in brain metastasis of lung adenocarcinoma by an advanced approach based on fully automated chip-nanoelectrospray mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2011 Dec 1;22(12):2145-59. Factor de impact (2011): 4,002;

Număr de citări: 23

5. Schiopu C, Flangea C, Capitan F, Serb A, Vukelić Ž, Kalanj-Bognar S, Sisu E, Przybylski M, Zamfir AD. Determination of ganglioside composition and structure in human brain hemangioma by chip-based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry. 2009 Dec 1;395(8):2465-77. Factor de impact (2009): 3.48;

Număr de citări: 28

II. Lucrări prezentate la conferințe științifice naționale și internaționale

1. Robu AC, Capitan F, Schiopu C, Chait BT, Zamfir AD. Assessment of the noncovalent interaction between β-lactoglobulin detected in human milk and maltooligosaccharides by chip-nanoelectrospray high resolution tandem mass spectrometry. 3rd Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countries Mass Spectrometry Conference MED MS III, June 28th- July 2nd 2015, Athens, Greece, Book of abstracts P3.08 pg.7

2. Pascariu M, Gruia A, Medeleanu M, Božin L, Șchiopu C, Șișu E. Anchimeric Assistance in Mass Spectrometry Fragmentation of Long Chain Glycoderivatives, Proceedings of The 20th International Symposium on Analytical and Environmental Problems, 22 septembrie 2014, Szeged, Ungaria, pag. 63-66;

3. Serb AF, Vukelic Z, Flangea C, Schiopu C, Sisu E, Zamfir AD – Investigation of Oligosaccharides from Biological Matrices Using Modern Mass Spectrometric Methods – A Preliminary Study- Zilele Academice Timisene, ed. XIII- Noi tendinte si strategii în chimia materialelor avansate cu relevantă în sisteme biologice, tehnică si protectia mediului 13-14 iunie 2013, Timisoara, Romania

4. C.Schiopu,F.Capitan,Z.Vukelic,E.Sisu,A.Zamfir – Deciphering the composition and structure of glicolipids in human meningioma by advanced mass spextrometry-Zilele Academice Timisene, ed. XIII-Sectiunea medicina, 23 Mai,2013,Timisoara,Romania

5. Flangea C, Schiopu C, Capitan F, Mosoarca C, Manea M, Sisu E, Zamfir A. A Novel Platform for Top-Down Proteomics: Chip-Based Nanoelectrospray Combined with Electron Transfer Dissociation Mass Spectrometry. Poster Presentation, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass Spectrometry Society-2012, Boob of abstracts ISBN 978-83-7712-064-4, pag.240, 4-7 March 2012, Poznan, Poland

6. Schiopu C, Capitan F, Serb A, Vukelić Ž, Sisu E, Zamfir A Molecular Expression and Structure of Gangliosides in Brain Metastasisof Lung Adenocarcinoma by NanoMate-QTOF MS and MS/MS. Poster Presentation, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass Spectrometry Society-2012, Boob of abstracts ISBN 978-83-7712-064-4, pag.240, 4-7 March 2012, Poznan, Poland

III. Referate de cercetare științifică prezentate pe parcursul doctoratului

Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al hemangiomului cerebral comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din punct de vedere structural, prin chip nanoESI HCT MS

Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al meningiomului cerebral din punct de vedere structural, prin chip nanoESI QTOF MS

Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al metastazei cerebrale a adenocarcinomului pulmonar, comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din punct de vedere structural prin chip nanoESI QTOF MS

Lista de abrevieri:

Ac – acetil/acetilare

ADN – acid dezoxiribonucleic

ARN – acid ribonucleic

Cer – ceramidă

CFH – cortex frontal cu hemangiom

CFN – cortex frontal normal (sănătos)

CID – disocieri induse prin ciocnire (collision-induced dissociation)

ECD – disocieri prin captură electronică (electron capture dissociation)

ESI – ionizare prin electropulverizare (electrospray ionization)

ETD – disocieri prin transfer de electroni (electron transfer dissociation)

Fuc – fucoză/fucozilare

Gal – galactoză

Gal – galactoză

GalNAc – N-acetilgalactozamină

Glc; G – glucoză

Glc6 – maltohexaoză

GSL – glicosfingolipidele

HCT MS – spectrometru de masă cu capcană ionică de mare capacitate (high capacity ion trap mass spectrometer)

HPTLC – cromatografia în strat subțire de înaltă performanță (high performance thin layer chromatography)

LM-HM – Low Mass-High Mass (domeniul de rezoluție)

m/z – raportul între masa moleculară și sarcina electrică a ionului

MetaADK – metastaza adenocarcinomului

MS – spectrometrie/spectrometru de masă (mass spectrometry/spectrometer)

MS/MS – spectrometrie de masă în tandem

MSn – fragmentare în stagii multiple

NanoESI – ionizare prin nanoelectropulverizare (nanoelectrospray)

Neu5Ac – acid N-acetil neuraminic

QTOF MS – spectrometru/spectrometrie de masă cuadrupolar cu timp de zbor (quadrupole time-of-flight mass spectrometer/spectrometry)

β-LG – Beta-lactoglobulină

Lista figurilor:

Lista tabelelor:

Mulțumiri

Se spune că atunci când se termină un drum, începe altul…De asemenea, se spune că atunci când finalizezi o lucrare sau duci la bun sfarșit un plan, e bine să nu uiți oamenii care te-au ajutat. În consecință, aflându-mă acum la finalul ciclului de studii doctorale, mă opresc câteva momente pentru a privi înapoi și pentru a mulțumi celor care au contribuit la finalizarea acestei teze de doctorat.

Mulțumesc mentorului meu, doamnei Prof. Univ. Dr. Alina Diana Zamfir, pentru cunoștiințele împărtășite și sprijinul oferit necondiționat cu antenție la detalii. Dânsa este omul care m-a orientat spre certetare și a vâzut în mine potențial, pe care, în timp și cu un mare talent didactic, a reușit să îl șlefuiască. La o laltă cu multitudinea de cunoștințe predate în plan științific, Doamna Profesor Zamfir mi-a învătat lecții de viață valoroase, pe care nu le poți învăța în școală. M-a învățat ofer și apoi să cer, să citesc mai mult ca să pot ridica ștacheta și, poate cel mai important, să respect ca să fiu respectat. Totodată, îi mulțumesc pentru faptul că mi-a oferit toată finanțarea necesară acestui studiu și pentru sprijinul inanciar oferit pentru deplasări la conferințe din numeroaselor granturi de cercetare obținute prin intermendiul UEFISCDI și în care dânsa a avut calitatea de director sau partener: PN-II-41001/2007, PN-II-ID-PCE-2011-3-0047, PN-II-IDPCE- 2011-3-0047, PN-II-PCCA-2011-142, PN-II-PCCA-2014-191.

Mulțumesc coordonatorului meu, domnului Prof. Univ. Dr. Șișu Eugen în primul rând pentru onoarea de a mă înscrie la doctorat, sub tutela Dânsului. Totodată, îi mulțumesc pentru răbdarea cu care m-a instruit și m-a sfătuit de fiecare dată când i-am cerut ajutorul. Îi sunt recunoscător pentru că a crezut în mine, m-a încurajat și nu m-a lăsat niciun moment să abandonez lupta.

Mulțumesc domnului Conf. Univ. Dr. Ioan Ovidiu Sîrbu pentru sfaturile prețioase, evaluarile pertinente și obiective, dar și pentru că mi-a ofeit o prietenie prețioasă și necondiționată.

Mulțumesc doamnei Prof. Univ. Dr. Zeljka Vukelić și Facultății de Medicină a Universității din Zagreb (Croația), pentru toate probele biologice puse la dispoziție în vederea realizării obiectivelor propuse la începutul acestiu amplu studiu.

Multumesc conducerii și colegilor Institutului Național de Cercetare-Dezvoltare în Electrochimie și Materie Condensată din Timișoara pentru căldura cu care m-au primit în colectiv și pentru ajutorul acordat în perioada doctoratului.

Multumesc domnului Dr. Ing. Andrei Lihu pentru ajutorul neprețuit pe care mi l-a acordat în dezvoltarea software-ului GanglioBase.

Multumesc soției mele și tuturor persoanelor apropiate din viața mea, care m-au ajutat de-a lungul timpului, oferindu-mi sprijin moral și insuflându-mi curajul de a merge mai departe și de a continua, în ciuda obstacolelor inerente.

Nu cred că există post-doc care să nu-și amintească cu nostalgie micile neajunsuri care eventual au condimentat etapa doctoratului. La sfârșit de etapă, îmi focusez atenția doar asupra lucrurilor pozitive, asupra cunoștințelor acumulate și a oamneilor minunați pe care am avut placerea și onoare să îi cunosc în toți acești ani.

Tuturor, vă mulțumesc din suflet!

INTRODUCERE

În ultimii 15 ani, progresele tehnologice majore au permis continuarea adâncirii cunoștiințelor la nivel molecular al matricilor vegetale și animale prin folosirea metodelor de analiză rapide, eficiente și ieftine.

Noutatea și importanța acestui studiu constă în primul rand în faptul că se înscrie în trendul general al caracterizării majorității constituenților, adică "om-ul" unui element dat (celulă, țesut, organ) ca de exemplu genele, a căror cercetare intensivă a condus la cartarea completă a genomului uman. În al doilea rând, mărimea seturilor de date experimentale a implicat utilizarea pe scara largă a programelor expert la interfața masină-utilizator, la timpi și viteze de procesare neînchipuite în precedentele decade. În al treilea rând, metodele "omics " (cu a noastră modestă contribuție în glicomică și lipidomică) devin din ce în ce mai targetate, conducând la direcții de cercetare independente ce se dezvoltă rapid precum genomul, transcriptomul, proteomul și metabolomul. Faptul că majoritatea cazurilor de degenerări maligne prezintă un anumit grad de heterogenitate intratumorală este larg acceptat [1]. Cu toate acestea, suntem încă departe de a înțelege pe deplin mecanismele de funcționalitate interdependente ale subpopulațiilor tumorale. Există structurile localizate la nivelul suprafeței externe a membranelor plasmatice care sunt responsabile de comunicarea și semnalizarea celulară, cu o distribuție largă în organism [1, 2].

Studiul în amănunt al componentelor membranare cum sunt glicosfingolipidele pot oferi detalii importante despre patologia tumorală. Detectarea unor noi tipuri de markeri tumorali joacă un rol important în diagnosticul clinic precoce, dar și în evaluarea tratamentului pentru pacienții cu anumite patologii tumorale. Dezavantajele tehnicilor convenționale de detectare a markerilor tumorali în ser conduc la o cerință urgentă pentru dezvoltarea unor metode noi, fiabile, cu consum scăzut de probă, de mare viteză și în timp real pentru screening-ul pe scară largă a bolilor neoplazice.

Glicosfingolipidele sialilate sau gangliozidele sunt în mod special abundente în creier, unde se regăsesc în substanța cenușie de aproximativ 5 ori mai des decât în substanța albă. În creierul uman adult, valorile variază de la 2 la 14 μg de acid sialic legat de lipide/mg de lipide​​ [1]. Acestea participă activ în diverse procese biologice responsabile pentru maturarea fetală, îmbătrânirea celulară, dar și în degenerările maligne [2]. Gangliozidele prezintă o diversitate și o complexitate structurală foarte mare, astfel, sunt necesare tehnici ultraperformante capabile să le identifice, să le izoleze și să le descifreze compoziția structurală. Una dintre cele mai fiabile tehnici, disponibilă astăzi pentru a îndeplini acest scop, este spectrometria de masă (MS). Capacitatea MS de a efectua bioanalize structurale de mare sensibilitate a crescut considerabil după dezvoltarea tehnicii de ionizare prin electrospray care permite detectarea și identificarea biopolimerilor de la produși metabolici cu structuri mici până la glicani, lipide, acizi nucleici, peptide și proteine cu mase moleculare ​​mari și/sau oricare dintre interacțiunile lor funcționale.

Importanța și actualitatea temei de cercetare este desprinsă din conceptul modern și inovativ al studiului în ansamblul său, dar și de metodele ultraperformante cu ajutorul cărora s-au efectuat analizele.

Introducerea recentă a tehnicilor de fragmentare bazate pe stagii multiple de MS (MSn), fie folosind disocierea indusă prin ciocnire (CID), transfer de electroni/captare/detașare (ETD, ECD, EDD) a oferit posibilitatea de a fragmenta specii ionice complexe și a dezvălui elementele lor structurale de mare finețe. În proteomică, glicomică, lipidomică și în studiul interacțiunilor noncovalente dintre biomolecule, nanoESI MS și MSn s-au dovedit a fi capabile de a fragmenta, identifica și caracteriza structural cantități mici (până la femto- și atomoli) de material biologic. În asociere cu metode de separare off-sau on-line, cum ar fi HPLC, nanoESI MS și MSn este capabilă de o analiză compozițională și structurală detaliată a speciilor individuale în amestecuri complexe precum cele extrase din probe de țesut prelevate de la subiecți umani. Dezvoltarea și rafinarea continuă a tehnicilor ESI MS, a culminat cu construirea de dispozitive de măsurare miniaturizate și automatizate pentru măsurători în regim high-throughput, bazate pe realizările nanotehnologiei în chipuri și robotică.

În combinație cu spectrometre de masă de înaltă rezoluție sau instrumente capabile de a efectua fragmentarea succesivă, în stagii multiple, chip-electrospray a demonstrat capacitatea sa unică de a oferi o caracterizare structurală a speciilor de gangliozide minore în amestecuri complexe, care s-au dovedit a reprezenta posibili biomarkeri valoroși.

Platformele miniaturizate, integrate care funcționează pe conceptul "lab-on-a-chip" sau sisteme de analiză micro-totale au fost introduse în spectrometria de masă ca tehnologii pentru sursa de ioni ESI. Având la dispoziție astfel de sisteme pentru livrarea și ionizarea robotizată a probei bazată pe chip, poate fi atinsă o creștere fără precedent a sensibilității, fiabilității și eficienței analizei, cu reducerea la minimum a volumului de probă și a manipulării.

Microfluidica pentru electrospray în combinație cu instrumente avansate de MS capabile de a efectua fragmentarea în mai multe stagii au fost introduse de către grupul din care fac parte și care este condus de doamna Prof. Dr. Zamfir.

Motivația acestui studiu a avut la bază ideea dezvoltării unei metode performante bazată pe MS pentru studiul gangliozidelor din diverse tumori cerebrale și de a găsi, izola și caracteriza unele structuri cu rol de biomarker specific pentru fiecare tip de tumoră în parte. Atât la nivel internațional cât și, mai ales la nivel național studiile de glicomică bazată pe chip electrospray MS sunt încă în fază incipientă, iar cele asupra gangliozidelor din tumori cerebrale umane care fac obiectivul acestiei teze și se înscriu în glicolipidomică, se număra printre primele din lume. Din 2006 pană în prezent, o parte din studiile demarate de acest grup s-au focusat pe studiul gangliozidelor [3-16], pentru determinarea expresiei și structurii gangliozidelor din diferite regiuni ale creierului normal și tumoral, de diferite vârste. Pe de altă parte, ca urmare a generării de către chip-MS a unui set mare de date și având în vedere complexitatea probei, procesarea informației relevante a devenit condiție obligatorie și indispensabilă pentru a îmbunătăți fiabilitatea rezultatului interpretării și de a face tehnologia mai rapidă și ușor de utilizat.

Plecând de la aceste premize obiectivul general al prezenței tezei de doctorat este funcționalizarea și optimizarea tehnicilor ultramoderne bazate pe spectrometrie de masă de înaltă rezoluție asociate cu metode de infuzie robotică, pentru detectarea și cartografierea unor structuri gangliozidice complexe de tip biomarker în diferite tumori cerebrale. De aici, obiectivele se ramifică și se etapizează căpătând un contur științific pentru fiecare activitate în parte. Astfel în această teză sunt incluse 3 studii care au avut ca scop cartarea gangliozidelor în tumori cerebrale în comparație cu țesut cerebral sănătos, un studiu privind interacțiunile necovalente proteo-zahardice și un studiu informatic ce are ca produs finit programul unic și original denumit GanglioBase.

Primul studiu are ca obiective următoarele:

Angrenarea platformei analitice bazată pe spectrometrie de masă cu capcană ionică de mare capacitate și ionizare prin electropulverizare (chip-nanoESI HCT MS) și optimizarea acesteia în scopul elucidării expresiei gangliozidelor într-o tumoră cerebrală benignă și anume hemangiom versus țesut cerebral sănătos;

Analiza gangliozidelor extase din hemangiom comparativ cu țesutul sănătos;

Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei unice GanglioBase

Interpretarea rezultatelor în corelație cu studiile științifice de literatură

Publicarea rezultatelor într-o revistă prestigioasă din domeniu [3]

Al doi-lea studiu fixează următoarele obiective:

Implicarea și optimizarea, de această dată, a unei alte platforme analitice bazată chip-nanoESI QTOF MS în scopul elucidării expresiei gangliozidelor într-o tumoră cerebral benignă și anume meningiom

Dezvoltarea și optimizarea platformei analitice bazată pe MS pentru studiul gangliozidelor din meningiom;

Analiza gangliozidelor extase din meningiom;

Investigarea detaliată a compoziției gangliozidelor, urmată de analiza de fragmentare a speciilor individuale regăsite în meningiom utilizând o metodă avansată de spectrometrie de masă bazată pe nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS

Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei Gangliobase și interpretarea rezultatelor obținute

Publicarea rezultatelor într-o revistă prestigioasă din domeniu [4]

Al trei-lea studiu își propune următoarele obiective:

Funcționalizarea platformei chip-nanoESI QTOF MS în vederea analizei compoziționale și structurale a expresiei gangliozidelor în metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar (metaADK) versus țesut cerebral sănătos;

Cartografierea gangliozidelor extase din metaADK comparativ cu țesut sănătos;

Analiza statistică a datelor obținute și interpretarea rezultatelor

Publicarea rezultatelor într-o revistă prestigioasă din domeniu [5]

Al patru-lea studiu, care s-a focusat pe interacțiunile necovalente proteo-zahardice și care trasează următoarele obiective:

Elaborarea unei metodologii inovatoare care să includă ionizarea complet automată bazată pe Chip nanoESI, cuplată cu spectrometrie de masă de înaltă rezoluție pe un instrument quadrupole time-of-flight (QTOF MS) în vederea evaluarea interacțiunilor necovalente dintre maltohexaoză (Glc6) și β-lactoglobulină;.

Să surprindă formarea complexului în soluție tampon de acetat de amoniu (pH 6,0) și apoi în apă pură.

Publicarea rezultatelor cercetării într-o revistă importantă [15]

Ultimul studiu este de fapt punerea în practică a unui concept informatic care să deservească nevoile impuse de cerințele actuale – analiza datelor obținute să fie precisă și să fie obținută într-un timp cât mai scurt. Desigur, și această etapă a solicitat timp, studiu individual și ajutor din partea unor specialiși. Cu toate acestea, rezultatul final a fost pe măsura așteptărilor și este acum folosit de rutină pentru identificarea structurilor gangliozidice oferite prin MS.

Cum am subliniat și în capitolul final al acestei teze, obiectivele au fost multe și îndrăznețe iar factorul timp nu a fost un aliat. Cu eforturi intense și susținute dar și cu un ajutor imens primit din partea mentorilor, a echipei de cercetare din care fac parte și a tuturor celor implicați în acest proiect, am reușit să îndeplinesc aceste obiective. Astfel, rezultatele acestei teze de doctorat se pot regăsi sub forma a 4 lucrări stiințifice ce fost publicate în jurnale ISI cu factor de impact ridicat și au fost apreciate la nivel național și internațional. Ca urmare, aceste 4 lucrări au colectat până în prezent un număr de 63 de citări, au fost prezentate la numeroase conferințe internaționale și au generat idei valoroase pentru cercetarea viitoare în acest domeniu.

Folosind una dintre cele mai moderne metode pe care medicina moleculară le are astăzi la dispoziție: ionizarea complet automată a probei printr-un robot NanoMate cuplat cu MS și fragmentare automată prin mai multe stagii MS (MSn) am putut colecta și valorifica date importante privind compoziția specifică de gangliozide, secvența de carbohidrați și structura ceramidei selectate. De asemenea, rezultatele prezentate în cadrul tezei au constituit un punct de plecare pentru desemnarea unui kit de biomarkeri specifici pentru diverse tipuri de tumori.

În final, aceste rezultate atestă fezabilitatea și eficiența acestor metode ce pot fi considerate sistemele ideale în acest sens, datorită faptului că sunt capabile să manipuleze volume de probă de ordinul nanolitrilor și oferă un randament sporit experimentelor, informații compoziționale și structurale precise la concentrații subpicomolare.

PARTEA GENERALĂ

1. ASPECTE BIOMEDICALE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ

Într-un context științific larg, viața poate fi definită ca fenomenul ce rezultă din interacțiunea reciprocă a particulelor de materie anorganică organizată în molecule, în interiorul celulelor [16].

1.1. CELULARITATE ȘI TUMORIGENEZA

“Întregul este mai mare decât suma părților sale”

Aristotel

Acest citat celebru al filozofului grec antic Aristotel poate să nu fie aplicabil în toate situațiile, dar cu siguranță se dovedește a fi adevărat în domeniul oncologiei.

Sistemele vii sunt structuri complexe, modulare și ierarhice. Într-adevăr, un organism multicelulular constă în molecule, cum ar fi acidul dezoxiribonucleic (ADN), acidul ribonucleic (ARN), proteinele, lipidele și o gama larga de alti metaboliți implicați în reacțiile chimice și structurile celulelor. Celulele sunt organizate în țesuturi care formează organe cu funcții specifice necesare pentru sănătatea organismului. Proprietățile sistemice apar la fiecare nivel, de exemplu homeostazia și răspunsul la stimuli într-o singură rețea intracelulară, metabolismul, creșterea, adaptarea, reproducerea într-o singură celulă. Informațiile care definesc un organism și capacitatea acestuia de a reacționa la mediul său sunt codificate în ADN și sunt exprimate diferențiat în spațiu și timp de-a lungul vieții. Studiile tipice în domeniul biologiei au folosit recent abordarea reductivistă și au atins aspecte specifice care folosesc una sau mai multe tipuri de molecule la scară mică, fiecare aruncând lumină doar asupra unei mici parți a acestor fenomene extrem de complexe [16]. Unele descoperiri au fost remarcabile, cum ar fi descifrarea structurii ADN-ului și mai târziu a modului în care informațiile genetice stocate în ADN sunt transcrise în ARN-ul mesager (mARN), apoi translatate în proteine, componente esențiale ale mașinilor celulare și ale motoarelor vieții. Acumularea unor astfel de cunoștințe asupra moleculelor și a mecanismelor a condus la abordarea "de jos în sus" în modelarea sistemelor biologice. Acest fapt a fost complementar viziunii "de sus în jos" a unui organism, ca sistem fiziologic care integrează informații din diferitele sale componente și interacțiunea lor cu mediul.

Având la îndemână acestea, împreună cu alte discipline cum ar fi imagistica, cercetarea farmaceutică și chemoinformatică, biblioteci ale compușilor, screening de mare viteză și date clinice [17, 18], se poate încerca acum descifrarea interacțiunilor dintre diferitele elemente ale unui sistem biologic – interactomica – pentru a înțelege comportamentul său pe mai multe nivele într-o manieră holistică, în țesuturi sănătoase, dar și în cele afectate de boală. Înțelegerea fiecărei componente a unui sistem complex izolat nu este suficientă pentru a caracteriza sistemul. Într-adevăr, proprietățile sistemului nu sunt definite numai prin adăugarea simplă a funcțiilor elementare, ci și prin interacțiunile dintre elemente [19, 20, 21].

Aceste proprietăți emergente sunt studiate prin implicarea rețelelor de interacțiuni dintre constituenți – genele, proteinele, liganzii și prin deslu;ireamecanismelor lor de reglare. Datorită numărului foarte mare de elemente din aceste rețele, un astfel de efort se bazează pe concepte definite în cadrul teoriei sistemelor complexe [22]. Genomica este studiul secvenței, structurii și conținutului genomului, în special a genelor și a numărului, structurii, funcției și organizării lor de-a lungul genomului. Genomica funcțională este studiul funcției genelor și reglarea expresiei lor la nivelul celulei, organului sau organismului, spațial și la momente diferite de timp și/sau starea de sănătate, prin descifrarea dinamicii transcrierii genetice, a translației și a interacțiilor proteină – proteină pe o scara largă a genomului, utilizand tehnologii cu performanță ridicată. Principalele instrumente experimentale utilizate pe scară largă pentru studiul epigeneticii (epigenomică) și a expresiei genice (transcriptomică) au implicat până în prezent microarray-uri și, mai recent, secvențierea de generație viitoare.

Celulele canceroase sunt celule aberante – cu alte cuvinte, ele nu mai răspund la multe dintre semnalele care controlează creșterea și moartea celulară. Celulele canceroase provin din țesuturi normale iar pe măsură ce cresc și se divid, deviază din ce în ce mai mult de la normalitate. În timp, aceste celule devin din ce în ce mai rezistente la controalele care mențin țesutul normal – și, ca rezultat, se divid mai rapid decât progenitorii lor și devin mai puțin dependențe de semnalele provenite din alte celule. Celulele canceroase evită chiar moartea celulară programată, în ciuda faptului că anomaliile lor multiple le-ar transforma, în mod obișnuit, în obiective principale pentru apoptoză. În stadiile tardive ale cancerului, celulele depășesc limitele normale ale țesuturilor și metastazează (se răspândesc) în diferite locuri din organism. În celulele normale, sute de gene controlează în mod complex procesul de diviziune celulară. Creșterea normală necesită un echilibru între activitatea acelor gene care promovează proliferarea celulelor și cele care o suprimă. Totodată, se bazează pe activitățile genelor care semnalează când celulele deteriorate trebuie supuse apoptozei [18].

Celulele devin maligne după ce mutațiile se acumulează în diferitele gene care controlează proliferarea celulară. Potrivit rezultatelor cercetărilor, majoritatea celulelor canceroase posedă 60 sau mai multe mutații [20, 21]. Provocarea pentru cercetători este de a identifica care dintre aceste mutații sunt responsabile pentru anumite tipuri de cancer. Diverse tipuri de cancere au diferite semnături mutaționale. Cu toate acestea, compararea stiintifica a mai multor tipuri de tumori a aratat ca anumite gene poasedă mutații în celulele canceroase mai des decat altele.

De exemplu, genele care promovează creșterea, cum ar fi gena pentru proteina semnalizatoare Ras, sunt printre cele mai frecvent mutante în celulele canceroase, devenind super-active și producătoare de celule care sunt prea puternic stimulate de receptorii de creștere. Unele chimioterapice lucrează pentru a contracara aceste mutații prin blocarea acțiunii proteinelor de semnalizare a creșterii. Astfel, medicamentul pentru cancer de sân Herceptin, blochează receptorii tirozin-kinazelor (RTK), iar medicamentul Gleevec blochează o kinază de semnalizare mutantă asociată cu leucemia mielogenă cronică [17]. Alte mutații legate de cancer inactivează genele care suprimă proliferarea celulelor sau cele care semnalează necesitatea apoptozei. Aceste gene, cunoscute sub numele de gene supresoare tumorale, funcționează în mod normal ca frâne pe proliferare, iar ambele copii în interiorul unei celule trebuie mutate pentru a avea loc divizarea necontrolată [21, 22]. Multe celule canceroase poartă două copii mutante ale genei care codifică p53, o proteină multifuncțională care sesizează în mod normal deteriorarea ADN-ului și acționează ca un factor de transcripție pentru genele de control. Mutațiile genetice se acumulează în timp ca urmare a unor evenimente independente. În consecință, calea spre malignitate implică mai mulți pași [23].

De fapt, mulți oameni de știință văd progresul cancerului ca un proces microevoluțional.

Figura 1. Microevoluția celulelor maligne, adaptare după [23] https://www.nature.com/scitable/content/microevolution-of-a-cancer-cell-14707728

O populație normală, sănătoasă de celule se poate schimba în timp, într-o populație de celule invazive, canceroase. Figura 1 prezintă cinci grupuri diferite de celule, care sunt etichetate astfel: aspect normal, hiperplazie, hiperplazie atipică, carcinom in situ și carcinom microinvaziv. Populația din partea stanga sus este reprezentată de celule de aspect normal. Acestea sunt dispuse într-un singur strat pentru a forma un inel închis, cu interiorul gol. În cea de-a doua populație – hiperplazia, un grup de celule pe partea stângă a inelului începe să se dividă și să crească la număr, formând un al doilea și al treilea strat de celule în interiorul inelului. În hiperplazia atipică, cele trei straturi de celule din partea stângă a inelului s-au extins pentru a forma o mică cantitate de celule (colorate purpuriu și albastru) cu proliferare rapidă. Celulele nu mai sunt organizate în rânduri, iar unele sunt chiar așezate una peste alta. În carcinomul in situ, masa mică de celule s-a extins și mai mult pentru a forma o populație densă de culoare albastru și violet, celule maligne care ocupă cea mai mare parte a spațiului din interiorul inelului de celule sanatoase normale. În populația de celule finală, forma microinvazivă, apare o ruptură în partea stângă a inelului de celule sănătoase, și mai multe celulele maligne maracte violet, sunt prezentate deversând din masa densă celulară.

Deși cancerul a fost studiat ca o boală cronică timp de mai multe decenii [24], unele studii foarte timpurii ale tumorilor mamare la șoarece au arătat că subpopulațiile celulare din diferite secțiuni ale aceleiași tumori variază prin ritmul de creștere, imunogenitate, răspunsul la medicament și capacitatea de metastazare, demonstrând astfel heterogenitate funcțională și fenotipică [25].

Există dovezi tot mai concludente ce atestă faptul că celulele canceroase se comportă ca și comunități, iar atenția tot mai mare se îndreaptă acum către comportamentul cooperativ al subclonelor, care pot influența progresia bolii. După cum era de așteptat, aceste interacțiuni pot adăuga un grad mai mare de complexitate intervențiilor terapeutice în tumorile heterogene, ceea ce duce adesea la un prognostic mai prost.

Aplicarea ipotezelor centrale ale lui Charles Darwin pentru dezvoltarea și progresia cancerului a fost inițial propusă formal de Nowell [26]. În teoria darwinistă clasică, diversitatea ereditară la nivel de populație oferă un substrat pentru adaptare și selecție, provocat de concurența pentru resursele de mediu limitate. Este adevărat că forțele de evoluție darwiniană acționează asupra fenotipurilor ereditare și nu a genotipurilor, dar pentru că variabilitatea fenotipică funcțională în mediul tumoral a fost dificil de studiat la pacienți, majoritatea studiilor de heterogenitate tumorală s-au concentrat mai degrabă pe heterogenitatea genetică decât pe cea fenotipică ce apare datorită forțelor de selecție ale mediului tumoral [25]. Heterogenitatea intratumorală a fost recunoscută ca o proprietate inerentă a multor tipuri de tumori murine încă din anii ‘70. Deși aceste constatări au fost inițial întâmpinate cu neîncredere și critici copleșitoare față de adepții principali ai ipotezelor legate de origine clonică a cancerului, foarte curând heterogenitatea tumorală a început să fie acceptată ca o parte a evoluției maligne.

Figura 2. Proprietăți unice de metastazare ale tumorilor heterogene (adaptare după [27])

Tumorile primare omogene sau cele constituite din populații non-cooperative pot avea o capacitate limitată de a forma metastaze în organele îndepărtate. Dimpotrivă, potențialul metastatic al tumorilor primare heterogene compuse din populațiile de celule canceroase cooperative (partea de jos) poate fi modificat în diferite moduri, mai ales dacă una dintre clone (albastru deschis) este un promotor de metastază non-celular autonomă care crește potențialul metastatic al populațiilor învecinate (Fig. 2) [27, 28, 29]. Leziunile metastatice rezultate pot fi monoclonale sau policlonale.

Din punct de vedere ipotetic, cooperarea clonală poate de asemenea să modifice potențialul metastatic al populațiilor individuale, astfel încât fiecare dintre ele să colonizeze diferite organe secundare.

O serie de mutații într-o celulă o determină să prolifereze mai mult decât celulele din imediata ei vecinătate. Deoarece grupul de celule divizate crește în timp, mutațiile ulterioare transformă hiperplazia atipică într-un carcinom. Răspândirea celulelor canceroase în alte țesuturi și organe (metastaze) apare atunci când celule canceroase se desprind de pe substrat și sunt capabile să călătorească cu ușurință spre locații noi [27].

Atunci când o mutație oferă unei celule maligne un avantaj de creștere, aceasta se poate replica mult mai rapid decât o celulă normală. De asemenea, descendenții ei pot depăși performanțele celulelor sănătoase în competiția pentru resurse. Mai târziu, o a doua mutație ar putea oferi celulei canceroase un alt avantaj reproductiv, care, la rândul său, își intensifică avantajul competitiv și mai mult. În cazul în care punctele de control cheie sunt pierdute sau dacă genele reparatorii sunt deteriorate, atunci rata acumulării daunelor crește și mai mult. Acest proces continuă cu fiecare nouă mutație care oferă asemenea beneficii și este o forță motrice în evoluția lucrurilor vii – nu doar a celulelor canceroase. În stadiile incipiente ale cancerului, tumorile sunt de obicei benigne și rămân limitate la țesutul normal. Pe măsură ce tumorile cresc și devin maligne, totuși, ele dobândesc capacitatea de a sparge aceste limite și de a invada țesuturile adiacente. Celulele canceroase invazive deseori secretă proteaze care le permit să degradeze matricea extracelulară la limita țesutului. Proteazele dau, de asemenea, celulelor canceroase capacitatea de a crea noi căi de trecere în țesuturi. De exemplu, ele pot rupe joncțiunile care unesc celulele, obținând astfel acces la noi teritorii [25].

1.2. TUMORI BENIGNE ALE CREIERULUI

O tumoră benignă este o masă de celule care nu are capacitatea de a invada țesutul vecin sau de a metastaza. De asemenea, tumorile benigne au în general o rată de creștere mai mică decât tumorile maligne iar celulele tumorale sunt de obicei mai diferențiate (celulele au caracteristici normale) [30-33]. Tumorile benigne sunt în mod obișnuit înconjurate de o suprafață exterioară (teacă fibroasă a țesutului conjunctiv) sau rămân pesuprafața epitelială [34]. Tumorile benigne sunt de cele mai multe ori compuse din celule care au o asemănare puternică cu tipul de celulă normală a organul lor de origine. Aceste tumori sunt denumite după celulă sau tipul de țesut din care provin, urmate de sufixul "-om" (dar nu carcinom, sarcom sau blastom, care sunt în general maligne). De exemplu, un lipom este o tumoră obișnuită benignă a celulelor grase (adipocite), iar o condroză este o tumoră benignă a celulelor care formează cartilagii (condrocite). Adenoamele sunt tumori benigne ale celulelor formatoare de glande și de obicei sunt menționate mai departe prin celula sau organul lor de origine, ca în adenomul hepatic (o tumoră benignă a hepatocitelor) [31].

Deseori cuvântul "benign" este utilizat pentru a defini tumorile considerate a fi non-viitoare sau non-agresive. Acest lucru nu este absolut corect în cazul tumorilor cerebrale, deoarece ele pot comprima țesutul cerebral și alte structuri din interiorul cutiei craniene și pot provoca complicații grave de sănătate, indiferent de clasificarea acestora. În interiorul comunității medicale, inclusiv al Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), s-a luat în considerare înlocuirea cuvâtului "benign" cu "non-malign" sau "inferior" pentru a defini tumorile care nu sunt agresive [35, 36].

O tumoră cerebrală reprezintă o creștere a celulelor anormale fie în interiorul sau în jurul structurii cerebrale. Termenii alternativi utilizați pentru a descrie tumorile includ leziunea sau proliferarea, iar acești termeni sunt adesea utilizați atunci când patologia unei tumori este necunoscută. Tumorile cerebrale sunt clasificate sau categorizate pentru a ajuta la identificarea originii, comportamentului și tipului lor. Tumorile cerebrale pot fi de natură primară sau secundară și sunt denumite benigne, non-maligne sau maligne. OMS clasifică tumorile cerebrale după originea celulară și după comportamentul celulelor, de la cel mai puțin la cel mai agresiv. Unele tipuri de tumori sunt atribuite unei clase pentru a indica ritmul lor de creștere și pentru a ajuta la prezicerea comportamentului.

1.2.1. EPIDEMIOLOGIE

Datele publicate de Central Brain Tumor Registry of the United States (CBTRUS) – Registrul Central al Tumorilor Creierului din Statele Unite au estimat un total de 43.800 de cazuri noi de tumori primare ale creierului și ale sistemului nervos central (malign și benign) diagnosticate în Statele Unite în ultima decadă [35]. De asemenea, au raportat o rată de incidență de 14,8 cazuri la 100.000 de persoane/an dintre care aproximativ jumătate sunt maligne, reprezentând aproximativ 7,4 cazuri la 100.000 de persoane/an. The American Cancer Society (Societatea Americană e Oncologie) a estimat că în Statele Unite au fost diagnosticate 18.500 de cazuri noi de tumori maligne ale creierului și ale sistemului nervos central, reprezentand un procent de aproximativ 1% din toate cazurile de cancer malign primar diagnosticate în acel an (CBTRUS 2005-2006).

Tumorile cerebrale primare sunt una dintre cele mai devastatoare boli cu care se confruntă medicina modernă. Deși sunt rare comparativ cu alte tipuri de cancer, ele reprezintă puțin mai mult de 1% din cancerele maligne primare (CBTRUS 2005-2006)

Multe tumori non-maligne sunt clasificate la gradul I sau II; Cu toate acestea, pot fi regăsite și tumori mixte.

1.2.2. CLASIFICARE

Potrivit OMS, tumorile cerebrale se încadrează astfel: [36]

Tumoră de Gradul I:

Creșterea lentă

Aparență aproape normală în sub microscop

Cel mai puțin malign

De obicei asociat cu supraviețuirea pe termen lung

Exemplu: Neuromul acustic (schwanomul vestibular), meningiom tipic

Tumoră de Gradul II:

Celule cu creștere relativ lentă

Aspect ușor anormal sub microscop

Pot invada țesuturile sănătoase din apropiere

Poate da recurență devenind o tumoră de grad mai înalt

Exemplu: meningiomul atipic

Tumoră de Gradul III:

Reproducerea activă a celulelor anormale

Aspect anormal sub microscop

Afectează țesuturile sănătoase din apropiere

Tumora tinde să reapară, adesea devenind o tumoră de grad mai înalt

Exemplu: astrocitom anaplazic

Tumoră de Gradul IV: Celule anormale care se reproduc rapid

Aspect foarte anormal sub microscop

Formează vase de sânge noi și capilare de neoformație pentru a menține o creștere rapidă Zone de celule moarte în centru (necroză)

Exemplu: glioblastomul multiform (GBM)

Distincția dintre tumorile benigne și cele maligne poate fi o provocare. Unele tumori benigne pot fi la fel de grave ca cele clasificate ca maligne dacă sunt inoperabile sau într-o locație inaccesibilă, cum ar fi trunchiul cerebral. În schimb, unele tumori maligne pot fi tratate cu succes. Există 120 de tipuri diferite de tumori cerebrale primare și deși fiecarui tip i se va atribui o anumită clasificare sau categorie, tumorile cerebrale sunt specifice fiecărui individ și, prin urmare, planurile de tratament vor varia, la fel ca semnele și simptomele

Semne și simptome comune cauzate de o tumoră cerebrală benignă:

Schimbări comportamentale

Modificări cognitive

Amețeli sau instabilitate

Vedere dublă sau încețoșată

Frecvente dureri de cap

Insuficiență auditivă

Greață și vărsături dimineața

Convulsii

Slăbiciune sau paralizie

1.3. METASTAZE CEREBRALE

Metastaza – originea etimologică a acestui cuvant provine din limba greacă și înseamnă literalmente " îndepărtare sau schimbare" – este una dintre stadiile terminale ale cancerului. În această etapă, celulele canceroase intră în fluxul sanguin sau în sistemul limfatic și călătoresc spre o nouă locație din corp, unde încep să se dividă și să pună fundația pentru tumori secundare. Nu toate celulele canceroase pot metastaza. Pentru a se răspândi în acest fel, celulele trebuie să aibă capacitatea de a penetra barierele normale ale corpului, astfel încât să poată intra și ieși din sânge sau vasele limfatice. Chiar și celulele canceroase care se deplasează metastatic se confruntă cu provocari atunci când incearcă să crească în zone noi.

Mutațiile genetice pot provoca cancer prin accelerarea ratelor de diviziune celulară sau prin inhibarea controalelor normale ale sistemului, cum ar fi stoparea ciclului celular sau moartea celulară programată. Pe masură ce o masă de celule canceroase crește, se poate transforma într-o tumoră. De asemenea, celulele canceroase pot să invadeze țesuturile vecine și, uneori, chiar să se desprindă și să se deplaseze în alte părți ale corpului, ducând la formarea de noi tumori la aceste locuri [37].

Spre deosebire de tumorile benigne, structura celulară a unei tumori cerebrale maligne este semnificativ diferită de cea a celulelor cerebrale normale. Tumorile maligne tind să crească mai repede și pot fi mai invazive decât tumorile benigne. Tumorile maligne pun în pericol viața pacienților.

Uneori, tumorile maligne ale creierului sunt denumite cancer cerebral, deși nu împărtășesc toate caracteristicile cancerului. În special, cancerul se caracterizează prin capacitatea de a se răspândi de la un organ la altul. Este foarte rar pentru o tumoră cerebrală primară să se răspândească dincolo de creier sau coloană vertebrală.

2. ASPECTE BIOCHIMICE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ

2.1. SPECTROMETRIA DE MASĂ

În domeniul biomedical, spectrometria de masă (MS) este utilizată pe scară largă pentru a studia proteinele (proteomica), metaboliții (metabolomica), lipidele (lipidomica) etc. Progresele tehnologice au condus, de asemenea, la dezvoltarea unor instrumente computaționale care să le gestioneze și să analizeze rezultatele [38].

Principiul de funcționare al MS se bazează pe ionizarea atomilor/moleculelor probei de analizat. Mai apoi, ionii astfel generați trec prin analizor unde sunt separati în funcție de raportul masă/sarcină. După ce au fost separați, ionii ajung la detector, unde se va determina valoarea raportului m/z și abundența relativă pentru fiecare ion. Computerul de care este conectat MS va înregistra datele provenind de la instrument și le va transforma în valori de masă și intensități ale semnalelor. Cu ajutorul acestor informații, este obținut un spectru, care poate fi reprezentat sub formă grafică sau tabelară. În cadrul spectrului de masa de tip grafic, semnalele ionilor sunt prezentate ca niște linii verticale aflate la valori m/z corespunzatoare și ale căror înaltime este proporțională cu intensitatile (abundențele) ionilor. Din motive practice, aceste abundente sunt recalculate în funcție de semnalul cel mai intens (numit și pic de bază), caruia i se atribuie intensitatea de 100%. Metodele de ionizare pot fi dure sau mai puțin dure. Ionizarea dură introduce o cantitate mare de energie în molecule, având ca rezultat fragmentarea și astfel, ajută la identificarea compusului, dar spectrele rezultate rareori conțin ionul molecular. Tehnica ionizării prin electrospray (ESI) utilizează tensiune ridicată pentru a dispersa și ioniza macromoleculele printr-o duză de pulverizare. Este moale (soft), limitează fragmentarea și produce ioni multipli încărcați, permițând detectarea compușilor mari la o valoare mai mică a masei/sarcină și, prin urmare, mărește domeniul (range-ul) de masă al analizorului. ESI MS este adesea cuplat cu LC/MS. Amestecurile care conțin molecule nevolatile pot fi, de asemenea, analizate prin bombardament rapid de atomi (FAB) și prin ionizare/desorbție cu laser de pe o matrice (MALDI).

MALDI este folosit pentru a analiza molecule extrem de mari, de până la 200.000 Da, adesea folosind analizoare ToF MS (Time-of-Flight – Timp de zbor). Spectrometria de masă cu ionizare cu desorbție laser la suprafață (SELDI-MS) separă subseturile de proteine ​​fixate pe o suprafață în funcție de proprietățile biofizice specifice. Astfel, analiza proteinelor, peptidelor și nucleotidelor poate fi efectuată cu ESI, SELDI, MALDI și FAB [39]. Există mai multe tipuri de analizoare. Într-un analizor de masă quadrupolar (QMS), ionii sunt deflectați prin câmpurile electrice oscilante pozitive și negative. Un triplu-QMS conține trei QMS unul după altul, în cazul în care primul QMS permite identificarea compușilor cunoscuți, a doua fragmentare și a treia identificarea fragmentelor, elucidând astfel structura compusului. Alte tipuri de analizoare includ capcana de ioni, ToF, Orbitrap și transformata fourier a frecventei de rezonanta din ciclotron (a ionilor) (FT-ICR) cu rezoluție și precizie în detectarea masei moleculare crescătoare. Ca o comparație, spectrometrele de masă de tip Orbitrap au un preț mai scăzut, sunt mai robuste și au o performanță mai mare decât cele de tip FT-ICR. Tandem-MS implică mai mulți pași de selecție a compusului utilizând MS. Metodele MS menționate mai sus variază în ceea ce privește capacitatea de producție, robustețea, sensibilitatea, selectivitatea și ușurința utilizării [39].

2.2 LIPIDE

Termenul de lipide descrie un grup larg de molecule cu caracter fie hidrofob fie amfifil, inclusiv acili grași, glicerolipide, glicerofosfolipide, lipide, steroli și sfingolipide care sunt larg distribuite și asociate cu o serie de funcții biologice, inclusiv componente structurale [40]. Lipidele joacă un rol important în semnalizare, stocarea energiei, proliferarea celulelor, migrația și apoptoza [41]. Ele sunt, de asemenea, principalele componente ale membranelor celulare, împreună cu proteinele membranare. Funcții importante în semnalizarea celulară sunt atribuite familiei sfingolipidelor cu subclasele majore ceramide și sfingozine. Aceste molecule au o mare importanță în reglarea permeabilității celulare, a apoptozei și a transformării celulare.

Acești compuși mențin astfel arhitectura celulară și mediază traficul membranar, permițând asamblarea mașinăriilor proteice, cum ar fi, de exemplu, în grupuri dinamice care adună proteine specifice în punți lipidice [42]. Lipidele sunt foarte diverse în ceea ce privește structura, proprietățile fizice și cantitatea lor. Scheletul de bază al sfingoidului este disponibil prin sinteza de novo din serină și un acizd gras cu lanț lung, acil-CoA, sau prin scindarea sfingomielinei [43]. Lipidomii, lipidele prezente în structurile biologice, sunt încă insuficient înțelese [44]. Lipidomul uman poate conține mii de specii [45], în timp ce doar 20% din toate lipidele au putut fi detectate cu tehnologiile existente [46]. Studiile ce privesc lipidomica țintesc să caracterizeze conținutul de lipide, localizarea și activitatea în celule și țesuturi [47].

Marea majoritate a lipidelor sunt extrase din celule și țesuturi lizate și analizate cu MS fie direct în metoda shotgun, adică lipidomică "de sus în jos" cu analizoare de înaltă rezoluție, cum ar fi Orbitrap, sau prin lipidomică de ”jos în sus”, prin LC-MS/MS, pentru a distinge lipidele cu un raport m/z identic [48]. Lipidele au fost, de asemenea, analizate cu MALDI IMS [49]. Datele MS brute de lipidomica pot fi analizate cu instrumente utilizate pentru metabolomică, cum ar fi XCMS [50] și MZmine 2 [51]. Lipidele sunt identificate și cuantificate utilizând prelucrarea datelor brute și analiza statistică, urmată de analiza și modelarea căilor [52]. Inițiativele majore ale lipidomicii includ "Strategia metabolitilor și a căilor lipidice" (LIPID MAPS), care a stabilit standarde și a permis o cuantificare absolută, mai degrabă decât relativă [53], și Mouse Macrophage Lipidome [54]. În viitor, lipidomica are ca scop determinarea profilului lipidic al unui sistem dat și integrarea acestor informații în genomică, transcriptomică și proteomică [55]. În ciuda progreselor considerabile în ceea ce privește dezvoltarea metodelor și a instrumentelor, acest lucru nu se realizează încă pentru glicosfingolipide. Datorită complexității structurale a glicosfingolipidomului, chiar și o analiză globală a glicosfingolipidelor este încă o provocare și nu este posibilă în cadrul activității analitice de rutină. Progrese promițătoare în domeniu includ cercetări care să coreleze profilurile subseturilor glicosfingolipidice cu bolile umane care abordează distribuția spațială a analiților, precum și extinderea activității analitice către speciile mai rare și cu potențial regulator [56].

2.3. GANGLIOZIDE

2.3.1. INTRODUCERE

Gangliozidele sunt glicosfingolipide care conțin acid sialic și sunt formate dintr-o parte hidrofobă, reprezentată de ceramidă situată la interior (adică în dublul strat lipidic) și un rest oligozaharidic hidrofil, orientat extracelular permițând interacționarea cu alte molecule extracelulare solubile [38]. Acestea apar mai ales pe suprafețele celulare ale celulelor neuronale, unde formează un model complex, dar se găsesc și în multe alte tipuri de celule. Împreună cu glicoproteinele și glicozaminoglicanii, glicosfingolipidele (GSL) sunt componente ale glicocalixului care acoperă suprafețele celulare eucariote. Gangliozidele conțin o bază sfingoidă și unul sau mai multe zaharuri [57]. Acizii sialici (Fig. 3) sunt zaharuri cu 9 atomi de carbon alcătuite biosintetic din N-acetilmanosamină și fosfoenolpiruvat. Cu o valoare medie pKA de aproximativ 2,6, ei sunt mai acizi decât majoritatea acizilor carboxilici și sunt încărcați negativ la cele mai multe valori fiziologice ale pH-ului. Numele de "gangliozidă" a fost folosit prima dată de biochimistul german Klenk (1896-1971) și atribuit unui grup de GSL acide pe care el le-a izolat din celulele ganglionare [58] și din creierul pacienților care au suferit de așa-numita tulburare amaurotică [59].

Acidul sialic (Fig. 3) a fost izolat pentru prima dată din mucina submaxilară în 1936 [60]. Structura sa a fost elucidată în anii '50 de diverse grupuri și s-a constatat că este identică cu cea a acidului N-acetilneuraminic izolat de Klenk și Faillard. Prima structură a unui gangliozid a fost elucidată în 1963 de către Kuhn și Wiegandt [61]. În 1962, Svennerholm a sugerat o nomenclatură a gangliozidelor cerebrale [62, 63]. Defectele biochimice care stau la baza bolilor cunoscute anterior ca idiopatie amaurotică, gangliozidoza GM1, Tay-Sachs și boala Sandhoff au fost identificate de Sandhoff și alții în anii ‘60.

Acidul N-acetil-α-neuraminic Acidul N-glicolil-α-neuraminic

(Neu5Ac) (Neu5Gc)

Figura 3. Acidul sialic

2.3.2. STRUCTURA GANGLIOZIDELOR

Structural, gangliozidele combină un glican și o porțiune lipidică și contribuie la formarea lipidomului și glicomului celular [64]. GSL, inclusiv gangliozidele, conțin o varietate mare de secvențe de carbohidrați [65]. Deși conțin resturi de carbohidrați de diferite structuri, legături și configurații anomere, numai un număr limitat de serii cu secvențe de carbohidrați caracteristice se găsesc în organismele vii (Tab. 1). Dintre acizii sialici, acidul N-acetilneuraminic este cel mai frecvent găsit la om, iar acidul N-glicolilneuraminic este abundent la multe alte specii [38].

Tabelul 1. Clase majore de glicosfingolipide

Au fost descriși mai mult de 50 de acizi sialici diferiți [66]. Aceștia pot fi O-acetilați în pozițiile 4, 7 sau 9 [67], dar și N-deacetilați, O-metilați, sulfatați sau modificați prin lactonizare [68]. Două sisteme de nomenclaturi de gangliozide sunt utilizate în prezent pentru a atribui nume structurilor corespunzătoare. Majoritatea cercetărilor preferă nomenclatura scurtă, conform Svennerholm, care a fost inițial bazată pe ordinea de migrație a gangliozidelor din seria ganglio în cromatografie lichidă [62]. Ulterior, a fost extinsă la alte structuri rădăcină. Sistemul IUPAC mai cuprinzător [69] este aplicat mai puțin frecvent.

Potrivit lui Svennerholm, o structură miez formată din zaharuri neutre definesc numele seriei respective, în care formele piranozice ale D-galactozei (Gal), D-N-Acetil-glucozaminei (GIcNAc), sau D-N-Acetylgalactosaminei (GalNAc) sunt atașate în ordinea definită și legate de lactozilceramidă (Galβ1,4Glcβ1Cer) sau β-galactozilceramidă (Galβ1Cer). Denumirile conțin informații despre serie ("G" = ganglio, "L" = lacto), numărul acizilor sialici ("A" = 0, "M" = 1, "D" = 2; , "Q" = 4, "P" = 5, "H" = 6, "S" = 7) și, indirect, numărul de carbohidrați neîncărcați. Inițial s-a presupus că acest număr nu poate depăși 5, astfel încât numele "gangliozidă GM1" indică faptul că această specie conține zaharuri neutre (5 – "1" = 4) din seria ganglio [38].

Această serie este definită de secvența Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4GlcCer. Acizii sialici pot fi atașați o dată, de două ori, sau de mai multe ori, în diferite poziții din cadrul structurilor de bază. Cel mai adesea, ele se găsesc legate în poziția α2,3 cu restul galactozil "interior" sau "exterior" și în poziția α2,8 cu alți acizi sialici. Gangliozida GM1 poartă o porțiune de acid sialic conectată la gruparea 3-OH a restului de galactozil în poziția II a gangliotetraozei (Fig. 4).

Figura 4. Structura chimică a gangliozidei GM1(a)

Gangliozide din seria ganglio pot fi, de asemenea, derivate din schema de biosinteză a gangliozidelor. În general, GGZ-urile din seria 0 nu conțin acizi sialici atașați de galactoză în poziția II, cei din seria a conțin unul, din seria b doi, iar cele din seria c poartă trei reziduuri de acid sialic. Cu toate acestea, GM1b și GD1c au numele "b" și "c", deși ambele sunt gangliozide din seria 0 (Fig. 5).

Un derivat modificat al GM2 care conține taurină în legătură amidică cu grupul carboxyl al acidului sialic a fost identificat în creierul pacienților cu boală Tay-Sachs [70]. Grupurile GSL de tip hibrid și gangliozidele cu modificări postglicozilare adaugă o complexitate suplimentară acestei clase de substanțe [71]. Majoritatea gangliozidelor găsite la mamiferele adulte aparțin seriilor ganglio, gala, lacto și neolacto. În timpul dezvoltării, se formează, de asemenea, gangliozide cu alte structuri de bază, cum ar fi antigenul embrionar SSEA-4, o gangliozidă din seria globo [72].

Figura. 5. Schema de biosinteză a gangliozidelor, adaptare după [73]

Figura 6 prezintă structura gangliozidei GQ1b, una dintre cele mai abundente gangliozide din creierul uman adulți (G = seria ganglio, Q = 4 acizii sialici, 5 – 1 = 4 reziduuri de carbohidrați neutri și seria b = 2 acizi sicilici atașați la galactoza internă).

Figura. 6. Structura chimică a gangliozidei GQ1b

Această clasă de gangliozide pot apărea în neuronii măduvei spinării [74, 75] și poate determina formarea de autoanticorpi, ca răspuns la diferitele forme de sindrom Guillain-Barr'e [76, 77] sau ale altor neuropatii [78]. La adulți, gangliozidele seriilor globo apar pe eritrocitele umane [79], în rinichi [80] și pe diferite celule stem [81]. De exemplu, SSEA-4 este exprimat în celulele stem mezenchimale derivate din sângele din cordonul ombilical [82]. Cu excepția echinodermelor (organisme marine de simetrie tipic pentadiale), gangliozidele sunt de obicei absente în organismele nevertebratelor. În neuronii de cultură, gangliozidele echinodermice prezintă activități neuritogene și inhibitoare ale creșterii. În acest sens, ele sunt mai puternice decât alte gangliozide [83, 84] și potențează efectul neuritogen al factorului de creștere al nervilor. Heterogeneitatea nu se găsește numai în partea glicanului, ci și în partea de ceramidă. Aceasta poate fi alcătuită din diferite baze sfingoide [85], sfinganină, sfingozină și fitosfingozină cu lungimi diferite ale lanțului, care pot fi modificate în continuare prin O-acetilare [86]. La animalele mai mari, sfingozinele C18- și C20- sunt cele mai abundente baze sfingoide ale gangliozidelor. Acizii grași aflați în porțiunea ceramidică a gangliozidelor sunt în mare parte saturați. Acizii grași α-hidroxilați [87] nu se găsesc atât de frecvent în gangliozidele cerebrale, dar sunt mai abundenți în gangliozidele din intestin, ficat, rinichi și în GM4. Pentru a specifica lipoforma unui gangliozid, se folosesc denumiri cum ar fi (d18:1/18:0) GM3 pentru un II3Neu5AcLacCer cu o sfingozină (d = dihidroxi, 1 = o legătură dublă, (18:0) rest de acid stearic în porțiunea de ceramidă.

Consecințele funcționale ale heterogenităților în componenta lipidică sunt în mare parte necunoscute, dar partea lipidică poate masca funcția receptorilor gangliozidici prin interacțiunea cu colesterolul membranar [88, 89]. Ca un alt exemplu, porțiunea ceramidică a GM1 dictează transportul retrograd al toxinei holerice legată la GM1. Secvențializarea gangliozidelor în ceea ce privește structurile glicanilor și ceramidelor este din ce în ce mai imoprtantă în analiza gangliozidelor.

2.3.3. NOMENCLATURA GANGLIOZIDELOR

Deși au fost încercate și alte alternative de denumire, nomenclatura dezvoltată de Svennerholm [90] (Tab. 2) este încă cel mai frecvent utilizată datorită raționalității, simplității sale și ușurinței de memorare.

Acest sistem prevede următoarele reguli de bază:

Tabelul2. Nomenclatura gangliozidelor conform sistemului Svennerholm

Comisia IUPAC-IUB a stabilit o nomenclatură mai detaliată și mai complexă a gangliozidelor [91] (Tab.3). Numerele romane I-IV indică poziția față de ceramidă a restului glucidic de care se leagă acidul sialic. Poziția grupării hidroxil a restului glucidic care formează legături α-glicozidice cu acidul sialic este indicată de către un corespondent în cifre arabe al numărului roman.

Tabelul 3. Nomenclatura gangliozidelor. Comparație între sistemul Svennerholm [90] și IUPAC-IUB [91]

2.3.3.1. Nomenclatura ionilor fragment folosită pentru a determinarea secvența gangliozidică

Pentru determinarea secvenței polizaharidice se utilizează convenția de notare stabilită de Domon și Costello [92]. Fiecare polizaharid este alcătuit dintr-un capăt reducător și unul nereducător, care poate fi legat de o proteină sau un lipid (Fig. 7). Partea neglucidică a lanțului polizaharidic este denumită aglicon. Fragmentele rezultate după scindarea acestor legături se notează cu Z și Y dacă conțin capătul reducător (agliconul) și cu B și C dacă conțin capătul nereducător. Se notează cu Zi, Yi fragmentele care conțin ceramida, respectiv cu B1, C1 fragmentele care conțin capătul nereducător. Fragmentelor Zi, Yi care aparțin secvenței oligozaharidice liniare celei mai lungi, primesc indicativul α, iar cele care conțin ramificația mai scurtă li se adaugă indicativul β. Fragmentele de inel se notează ca și în cazul glicoconjugaților cu Xi, dacă conțin ceramida și cu Ai, dacă conțin capătul oligozaharidic, însoțite de asemenea de indici prezentați mai sus. Atât în notația lui A cât și a lui X apar indici superiori care indică în dreptul cărei legături din heterociclu are loc scindarea. De exemplu 2,4A2 – această notație se interpretează astfel: fragmentul respectiv aparține capătului nereducător, legăturile dintre atomii de carbon numerotați cu 2 și 4 s-au scindat la nivelul celui de-al doilea zahar.

Figura 7. A, B, C. Nomenclatura scindărilor într-o secvență oligozaharidică (adaptare după [92])

2.3.4. LOCALIZAREA GANGLIOZIDELOR ÎN ORGANISM

În creier, expresia gangliozidelor se corelează cu neurogeneza, sinaptogeneza, transmitrea sinaptică și proliferarea celulară [93, 94]. În neuronii murini ai hipocampusului axonogeneza (dar nu și dendritogeneza) este însoțită de o creștere a sintezei gangliozidelor complexe și de o trecere de la seria a la seria b [95]. În țesuturile extraneurale, conținutul de gangliozide este de până la de două ori mai mic decât în ​​creier. Concentrațiile relativ ridicate de gangliozide din seria ganglio se găsesc în măduva osoasă, eritrocite, intestin, ficat, splină, testicul și rinichi. Gangliozidele celulare formează complexe cu tipare specific de glicani. Acestea nu sunt stabile în timp, ci se schimbă odată cu procesele fiziologice și patofiziologice, cum ar fi creșterea celulelor, diferențierea, transformarea virală, oncogeneza, embriogeneza [96, 97], lactația sau progresia tumorală [98]. Gangliozidele din seria ganglio se găsesc în special în sistemul nervos, unde contribuie la 10-12% din conținutul de lipide [99]. În timpul dezvoltării creierului, modelul gangliozidelor se modifică de la prevalența gangliozidelor simple GM3 și GD3 la cele mai complexe cum ar fi GD1a și GT1b [100]. Conținutul de gangliozide și compoziția creierului se schimbă și în timpul îmbătrânirii. În ciuda acestui fapt, concentrațiile GQ1b, GT1b și GD1b cresc cu vârsta în detrimentul GM1 și GD1a [101]. Există doar supoziții privind consecințele funcționale ale acestor schimbări [102].

Gangliozidele se găsesc, de asemenea, în ser. Aici se regăsesc în special GM3, GD3, GD1a, GM2, GT1b, sialilneolactotetraosilceramidă (Figura 9), GD1b și GQ1b, unde 98% dintre aceștia sunt transportate prin lipoproteine ​​serice, predominant prin LDL (66%), HDL (25%) și VLDL (7%) [103]. Celular, majoritatea gangliozidelor se află în membrana plasmatică [104]. Cu toate acestea, gangliozidele apar de asemenea în membranele organelare, cum ar fi mitocondriile, unde GD3 reglează apoptoza [105] și în nucleu, unde sunt implicate în echilibrul Ca2+ [106]. Gangliozidele ce contin acizii sialici O-acetilați apar în special în celulele și țesuturile în creștere și sunt considerate markeri oncofetali prezenți pe diferite tumori [107]. Ele servesc, de asemenea, ca receptori pentru virusurile gripale C sau coronavirusuri [108]. Un alt acid sialic modificat este acidul N-glicolilneuraminic (Neu5Gc). Cu excepția anumitor tumori și a fătului, acesta se găsește numai în cantități mici în țesuturile umane [109]. Determinarea gangliozidelor care conțin Neu5Gc și Neu5Ac este realizată fie prin tehnici clasice cromatografice combinate cu anticorpi marcați [110], fie prin tehnici de o mai mare sensibilitate – cromatografie cuplată cu ESI-MS [111]. O aplicație potențială este detectarea imunochimică a [Neu5Gc] GM3 ca biomarker al cancerului pulmonar cu celule nemodulate [112]. De asemenea, lactonele au fost detectate în diferite țesuturi, de exemplu, GD3 lactona în creierul de șoarece [113] și GD1b lactona în creierul uman [114].

Lactonele sunt mai imunogene decât gangliozidele [115] și se găsesc pe celulele tumorale, cum ar fi melanomul, ca antigeni asociați tumorii. Diferențele temporale și spațiale sunt de asemenea observate pentru partea lipidică a gangliozidului. În culturile de celule neuronale nediferențiate, gangliozidele cu sfingozină C20 sunt prezente doar în cantități mici, dar conținutul acestora crește odată cu debutul diferențierii celulelor [116]. În creierul de șobolan, fracțiunea de gangliozide care conțin sfingozină C20 crește odată cu vârsta [117] în cerebel [118] și creierul frontal.

Diferențele spațiale în ceea ce privește lungimea lanțului de bază a bazei sfingoidice au fost, de asemenea detectate la șoareci. În timp ce gangliozidele conținând specii C18 au fost distribuite uniform în creierul frontal, speciile C20 sunt selectiv localizate de-a lungul proiecțiilor hipocampului entorhinal [119]. Compoziția de bază a acidului gras și a bazei sfingoidice este de asemenea diferită între nervii senzoriali și motori umani [120].

2.3.5. ANALIZA GANGLIOZIDELOR

În prezent, analiza cantitativă și calitativă a gangliozidelor este întegrată în cadrul lipidomicii utilizând spectrometria de masă drept tehnologie cheie pentru analiza acestora [121]. În general, gangliozidele sunt izolate din țesuturi și fluide ale corpului prin extracție cu cloroform-metanol [122, 123]. Eficacitatea de extracție poate crește atunci când cantități mici de apă sunt adăugate în solventul de extracție [90] utilizând amestecul cloroform: metanol: apă (5: 5: 1) [124]. Atunci când extracția este urmată de repartitie, cum este protocolul dezvoltat de Folch et al. [125], gangliozide – în contrast cu majoritatea celorlalte clase de lipide – se separă în faza apoasă superioară. De acolo, ele pot fi izolate printr-o extracție în fază solidă și separate de GSL neutre prin cromatografie cu schimb de anioni [126], cum ar fi cu DEAE (dietilaminoetil) Sephadex [127]. O-acetilarea acizilor sialici și, de asemenea, lactonizarea gangliozidelor [128] sunt modificări care se pierd în condiții alcaline. Acestea sunt adesea aplicate pentru a îndepărta glicerofosfolipidele care conțin legături esterice cu acizi grași [129]. Dacă se doresc informații despre aceste modificări, gangliozidele din țesuturi pot fi determinate fără tratament alcalin, de exemplu, după extracția cloroform/metanol într-un raport de 1:2 și o etapă de partiție ulterioară [130]. Separarea gangliozidelor în funcție de compoziția lor de glicani se realizează prin cromatografie în strat subțire (TLC) [131] și prin HPLC și alte tehnici care pot fi cuplate cu spectrometria de masă [132].

Aceste cuplări facilitează identificarea lor prin spectrometrie de masă și sunt necesare pentru caracterizarea lor prin colorarea cu anticorpi adecvați [133, 134], lectine sau alte proteine [135]. Cuantificarea poate fi obținută prin colorare și densitometrie sau, dacă sunt disponibile substanțe standard adecvate, prin spectrometrie de masă. Deoarece căile de biosinteză generează heterogenități atât în ​​partea lipidică, cât și în cea a glicanului, analiza cuprinzătoare a gangliozidelor este o sarcină foarte solicitantă în cadrul lipidomicii [136]. În plus față de glicoforme care sunt, de asemenea, bine cunoscute din analiza glicoproteinei, "lipoformele" [137] devin tot mai importante pentru a înțelege metabolismul și funcția gangliozidelor. Au fost elaborate diferite protocoale de determinare a gangliozidelor prin spectrometrie de masă [136]. Ele se bazează în mare măsură pe spectrometria de masă prin electrospray ca tehnică de ionizare deși și ionizarea prin MALDI joacă un rol important. Metodele disponibile variază de la cele preanalitice la manipularea datelor bioinformatice și includ metode de imagistică utilizând MALDI și spectrometria de masă ionică secundară (SIMS) pentru a determina distribuția spațială a analiților [136]. În plus față de constituția lor, puțin se știe despre conformația gangliozidelor în mediul lor natural, legate de membrană.

2.3.6. BIOSINTEZA GANGLIOZIDELOR

Diversitatea glicanilor de pe suprafața celulară, inclusiv cea a gangliozidelor, este generată în aparatul Golgi [138], iar heterogenitățile din partea ceramidelor rezultă din biosinteza ceramidei lanivelul reticulul endoplasmatic (ER). Sinteza de novo a gangliozidelor poate fi diferențiată de procesele de salvare [139], în care se reciclează acizii sialici, zaharurile, acizii grași și bazele sfingoide. Ultimul proces poate predomina de departe în celule diferențiate.

Biosinteza gangliozidică începe cu formarea ceramidei la nivelul stratului citoplasmatic al membranei RE [140]. Prima etapă, condensarea L-serinei și a unui acid gras activat prin coenzima A (CoA) este catalizată de serinpalmitoiltransferaza piridoxal fosfat dependentă (SPT) [141]. Încorporarea L-serinei în GSL poate fi utilizată pentru a monitoriza biosinteza lor de novo, folosind L-serină radiomarcată în poziția 3 (carbonul din poziția 1 este pierdut ca dioxid de carbon). În creier, furnizarea externă de L-serină de către astrocite este esențială pentru biosinteza lipidelor neuronale și dezvoltarea creierului [142]. În concordanță cu această observație, rozătoarele modificate genetic cu deficit de fosfoglicerat dehidrogenază necesare pentru formarea de L-serină din D-glucoză prezintă niveluri ale gangliozidelor drastic reduse, defecte ale morfogenezei creierului și o durată de viață mult scăzută [143]. Următoarea etapă în biosinteza bazei sfingoide este reducerea dependentă de NADPH a 3-cetofinganinei la sfinganină cu 3-cetosfinganin-reductază, urmată de acilarea sfinganinei la dihidroceramide cu lungimi diferite ale lanțurilor [144]. Totodată, alte baze sfingoide sunt acilate cu N-aciltransferaze ale familiei lass. Lass 1 codifică ceramid-sintaza 1, care este exprimată în creier și implicată în formarea ancorei membranare a gangliozidelor. La șoareci, mutațiile spontane recesive din gena lass1 sunt asociate cu ataxie cerebelară și degenerare cu celule Purkinje [145]. Deși partea ceramidică a gangliozidelor cerebrale conține în majoritate acizi grași nehidroxilați, aparent toți membrii familiei lass sunt de asemenea capabili să transfere acizii grași di-hidroxi corespunzători [146]. Dihidroceramidele sunt dehidrogenate la ceramidă prin dihidroceramid-desaturaza des1, [147] sau hidroxilate la fitoceramide prin des2. Ceramida este precursorul comun al GSL și sfingomielinei și este transportat la aparatul Golgi, cel puțin parțial, prin intermediul unor proteine, mai precis, de proteina de transport CERT [148].

Sinteza GSL continuă prin transferul treptat al unităților de monozaharide activate de nucleotide, mai întâi pe ceramidă și apoi la GSL cu lanțuri crescătoare de glicani. Gangliozidele complexe și glicoformele GSL pe suprafețele celulare eucariote sunt generate numai de câteva enzime care acționează într-o cale biosintetică combinatorie [149]. Primele glicoziltransferaze implicate în biosinteza gangliozidelor au fost caracterizate în laboratoarele Roseman și Basu [150]. Conform numărului de acizi sialici conectați la restul galactozilic "intern", gangliozidele sunt clasificate în membrii seriei 0, a, b și c. Seria B de gangliozide conține secvența Neu5Acα2.8Neu5Ac, care de obicei nu se găsește în glicoproteine. Membrii mai vechi ai acestor subserii diferite pot fi formați prin acțiunea acelorași glicoziltransferaze, care au mai puțină specificitate decât cele care acționează inițial [151].

Glicozil și sialiltransferazele [152] din calea biosintetică a gangliozidelor sunt exprimate într-o celulă tip după un model dependent de dezvoltare. Tiparul gangliozidelor se schimbă în timpul dezvoltării creierului [153] aceste diferențe putând fi oservate comparativ, între diferite tipuri de celule neuronale [154]. În plus, modelele de gangliozide variază între diferitele tipuri de celule și se schimbă odată cu diferențierea acestora. GSLs inclusiv gangliozidele sunt formate prin biosinteză la membranele intracelulare de unde acestea sunt transportate în membrana plasmatică prin difuziune membranară [155]. O diferență principală între biosinteză gangliozidelor în aparatul Golgi și degradării acestora în compartimentul endolizozomal este aceea că, în timpul formării GSL, glicoziltransferaza legată de membrană interacționează cu substraturile glicolipidice ale acestora prin difuziune în două planuri dimensionale ale bi-stratului lipidic. Prin urmare, vitezele reacțiilor pot deveni independente de volumul de reacție și se supun cineticii enzimatice bidimensionale. Ca o consecință, glicoziltransferazele cărora le lipsește domeniul transmembranar pierd cea mai mare parte din activitatea lor față de substratele legate de membrană [156]. În timpul degradării în endozomi și lizozomi, glicozidazele sunt enzime solubile, iar substraturile sunt legate de membrană. În plus față de biosinteza gangliozidelor în aparatul Golgi, există, de asemenea, indicii de formare a gangliozidelor prin intermediul glicoziltransferazelor asociate membranei plasmatice [157].

2.3.6.1. Seria Gala

În clasa monoglicozilceramidelor, glucozilceramida (GlcCer) și galactozilceramida (GalCer), numite cerebrozide, resturile hexozil sunt prezente în configurația β-anomerică. GalCer-urile cu configurație alfa apar doar la organismele inferioare [158] și sunt foarte imunogene pentru mamifere [159]. Cele mai multe gangliozide sunt derivate biosintetic din GlcCer; numai gangliozidul GM4 este derivat din GalCer. Gangliozida GM4 este o componentă minoră a gangliozidelor creierului uman [160], unde este localizată în mielină [161]. Apare, de asemenea, în eritrocite, rinichi și intestin și este frecventă la unele specii de pești. Cu toate acestea, membrii cei mai des întâlniți în seria gala sunt GalCer și sulfatida (GalCer-3-sulfat) în oligodendrocite, celule Schwann, rinichi, testicul și intestin. Acestea sunt prezente în concentrații mari în straturile multilamelare ale mielinei, unde sunt necesare pentru aderența glială [162], aparent prin interacțiunea glucidică între sulfatidă și GalCer ale diferitelor straturi de mielină [163]. Lipidele mielinice conțin în cea mai mare parte acizi grași 2-hidroxi [164], prezenta lor în GSL din seria gala contribuind la interacțiunile glican-glican [165]. Spre deosebire de GalCer-sintaza, GlcCer-sintaza pare a fi dispensabila pentru oligodendrocite [166]. Etapele biosintezei GSL [167] din seria gala – formarea sulfatidei, digalactosilceramidei și gangliozidei GM4 au loc în lumenul aparatului Golgi [168]. Spre deosebire de cele mai multe glicoziltransferaze, care sunt proteine ​​transmembranare de tip II, galactoziltransferaza ceramidei este o proteină transmembranară tip I cu domeniul catalitic pe partea luminală a RE [169].

Conform datelor obținute în urma experimentelor pe peștii zebră și șoareci, se poate concluziona că GM4 poate fi formată acțiunea ST3Gal V, care poate să producă GM3 (Fig. 8). Formarea GM4 și GM3 pare să depindă de disponibilitatea precursorilor lor, GalCer și LacCer [170]. Se știe puțin despre funcția GM4, dar s-a demonstrat ca poate interacționa cu proteina din compozitia mielinei, prezintă proprietăți imunosupresoare și poate preveni encefalomielita alergică experimentală la cobai [171].

2.3.6.2. Gangliozide derivate din glucozilceramidă

Primul pas în biosinteza celor mai multe gangliozide este transferul unui rest de glucoză de la UDP-glucoză la ceramidă catalizată de UDP-glucoză: glucosiltransferaza [172]. Deși sintetazele GlcCer și GalCer catalizează reacții similare, cADN-urile lor nu prezintă nicio omologie de secvență. Glucosiltransferaza ceramidei este o proteină transmembranară de tip III. Formează dimeri sau oligomeri necovalenți [173] cu domeniile lor catalitice C-terminale în citosol [174]. Deoarece formarea GlcCer are loc pe fața citoplasmatică [175] și cea a LacCer pe situsul luminal al membranei Golgi [176], glucozilceramida trebuie translocată de-a lungul membranei. Aceasta este mediată de o flippază de identitate necunoscută: transportorii ABC, ABC-B1 și -C1, translocă analogii GlcCer cu lanț scurt prin membrana Golgi [177]. Translocarea transversală poate fi efectuată după transportul GlcCer de către proteina de transfer al lipidelor citoplasmatice FAPP2 fie la RE [178], unde aceasta ar putea fi translocată printr-o flippază ne caracterizată încă [179], fie prin aparatul Golgi [180].

Biosinteza gangliozidelor superioare are loc pe fața luminală a aparatului Golgi [181], astfel încât lanțurile de glicani sunt orientate extracitoplasmatic. LacCer este sintetizată prin intervenția galactoziltransferazei I, care transferă un rest de galactoză din galactoză-UDP la glucosilceramidă [182]. Alte resturi de carbohidrați sunt transferate treptat spre lanțurile de glicani.

LacCer și derivații săi sialilați, hematozidele (Fig. 8, 9) GM3, GD3 și GT3 servesc drept precursori pentru gangliosidele complexe ale seriilor 0-, a-, b-, și c-. Aceste serii diferite nu conțin nici un rest de acizi (seria 0), un rest acidic (a-serie), două resturi (din seria b) sau trei reziduuri de acizi saliți legați la poziția 3 a restului galactozil "intern". La creierul de mamifer adult, gangliozidele din seriile 0 și c se găsesc numai în cantități mici.

Figura 8. Structura chimică a gangliozidei GM3

Figura 9. Structura chimică a hematozidelor

În boala Parkinson, lipidele anionice și mai ales GM1 inhibă agregarea α-synucleinei la fibrili citotoxici [183]. Șoarecii cu deficit de ST8Sia I (GD3-sintază) nu sunt capabili să formeaze gangliozide GD3 și niciuna din seriea b. Ei au o durată normală de viață și nu au defecte detectabile de dezvoltare [183]. Când acești șoareci au fost încrucișați cu șoareci care poartă o genă întreruptă B4GalNT I, au rezultat șoareci dublu mutanți care exprimau numai gangliozida GM3 ca gangliozidă majoră. Acești șoareci ce posedă doar GM3, sunt extrem de susceptibili la stimuli auditivi, dezvoltă crize letale și afișează un fenotip de moarte subită [184]. Șoarecii dublu-knockout deficienți în B4GalNT I și ST3Gal V (GM3-sintază) nu sunt capabili să formeze niciun gangliozid din seria ganglio. Aceste animale sunt grav bolnave și prezintă nivele crescute de LacCer, LacCer-sulfat și doar urme de alte gangliozide care se regăsesc și în creierul normal [184].

2.3.7. DEGRADAREA GANGLIOZIDELOR

Degradarea constitutivă a gangliozidelor are loc în endozomi și lizozomi. În plus, sialidaza asociată membranei plasmatice Neu3 [185] poate degrada gangliozidele și este puternic exprimată în celulele melanomului [186]. Chiar și plicul nuclear conține sialidaze, cu Neu3 la interior și Neu1 în membrana nucleară exterioară [187]. Degradarea gangliozidelor lizozomale are loc după endocitoza unor părți ale membranei plasmatice la membranele intraendozomale, intralisozomale și agregatele lipidice asociate. Acest lucru necesită prezența glicozidazelor adecvate [188], cu un pH adecvat, în unele cazuri și a proteinelor responsabile de transferul lipidic dar și a unei compoziții adecvate a membranelor ce conțin gangliozide [189].

După cum s-a propus în 1992, în endozomii și lizozomii există două grupuri diferite de membrane [190, 191] (Fig. 10).

Figura 10 A. Polii lizozomali ai membranei (adaptare după [191])

Acestea diferă în ceea ce privește compoziția și funcția lipidelor dar și a proteinelor. În timp ce membrana luminală derivată din membrana plasmatică este degradată, membrana perimetrală este protejată prin diferite mijloace [192]. Aceast fapt asigură integritatea compartimentului, care poate fi eliminat în timpul apoptozei [192]. O lipidă marker care se găsește exclusiv în membranele luminale [193] este bis (monoacilglicero) fosfat (Fig. 10B), incorect denumit chimic și acid lizobisfosfatidic (LBPA). BMP joacă un rol cheie în degradarea membranei [194] și se formează din fosfatidilglicerol [195].

Datorită configurației sale, sn1 este degradată lent numai prin lipaze și persistă pe membranele interioare, unde poate ajunge până la 70% din totalul fosfolipidelor [196].

Figura 10 B. Bis (monoacilglicero) fosfat

Cu o valoare pKA estimată de aproximativ 2, BMP este încărcat negativ chiar și la pH lizosomal. Studiile in vitro arată că sunt necesare lipide încărcate negativ pentru legarea proteinelor lizozomale la membrane. Deși alte lipide încărcate negativ, cum ar fi dolichol fosfat sau fosfatidilinozitol, pot fi prezente pe membranele luminale, BMP pare a fi factorul cheie care distinge această membrană de schimb de membrana perimetrală. Pe de altă parte, membrana perimetrală a endozomilor și a lizozomilor prezintă o compoziție lipidică și proteică total diferită. Este protejată de un glicocalix format din proteine integrale membranare înalt N-glicozilate [197], iar gangliozida GM3 prezentă în această membrană este rezistentă la degradare [198]. Degradarea gangliozidelor începe cu acțiunea enzimelor care scindează unitățile de monozaharide situate la capătul nereducător al lanțurilor de glicani ai gangliozidelor. Acest lucru se întâmplă într-o manieră secvențială, ceea ce explică diferitele boli umane asociate cu defectele acestei căi.

Glicozidazele sunt enzime solubile și se găsesc în lumenul endozomilor și lizozomilor. Ca substraturi de glicozidază, GSL cu patru sau mai puține resturi carbohidrate necesită prezența suplimentară a glicoproteinelor lipidice mici de legare, fie proteina activatoare de GM2, fie una din cele patru sapozine A-D. Acestea acționează în parte ca proteine de transfer al lipidelor care extrag substraturile legate de membrană și le prezintă hidrolazelor. Acestea au diferite specificități și mecanisme de acțiune [199]. În cazul gangliozidelor, cel puțin proteina GM2-activatoare și sapozina-B participă la degradarea GM1, GM2 și GM3. Sapozina-A [200] și sapozina-B [201] extrag lipidele membranare mult mai bine din membranele care sunt bogate în BMP și sărace în colesterol. De asemenea, BMP mărește capacitatea activatorului GM2 de a solubiliza lipidele [202] și stimulează hidroliza membranei legate de GM1 prin GM1 β-galactozidază [203] și a gangliozidei GM2 cu β-hexosaminidaza A [202]. BMP stimulează, de asemenea, hidroliza sulfatidei renale cu seria ganglio-GS2 SM2 (sulfat de gangliotriaosilceramidă-II3) cu β-hexosaminidazele A și S în prezența activatorului GM2 [204]. Colesterolul, care este cunoscut pentru rolul său în stabilizarea bistraturilor lipidice, trebuie transportat din membranele intraendozomale la proteina NPC1 rezidentă în membrana perimetrală endozomală de către proteina NPC2. In vitro, acest transfer este puternic stimulat de BMP și puternic inhibat de sfingomielină [205].

2.3.8. PATOBIOCHIMIE

Degradarea gangliozidelor este afectată în gangliozidoze și secundar și în alte boli de stocare a sfingolipidelor [206]. Principiile care reglementează patogeneza [207] și terapia sfingolipidozelor [208] sunt valabile și pentru bolile de depozitare a gangliozidelor. Factorii cheie sunt activitatea reziduală a sistemului de degradare, care determină evoluția bolii [209] și expresia celulară specifică a materialului de stocare. Datorită expresiei celulare de tip specific a gangliozidelor, sistemul nervos central este în special afectat în gangliozidoze. În general, în sphingolipidoze, lipidele de stocare coprecipită alte substanțe hidrofobe prezente în compartimentul endolizozomial, lipide și proteine, ca produse de stocare secundară [206]. În boala Niemann-Pick, tipul C, care este un defect primar al transportului colesterolului endosomal, se observă o acumulare secundară de sfingomielină și de gangliozide, care are și relevanță terapeutică [210].

Depozitarea secundară a gangliozidelor GM2 și GM3 apare și în boala Hurler [211] (mucopolizaharidoza de tip I; deficiență de α-Liduronidază). Depozitarea lipidelor produce un fel de blocaj [212], care interferează cu transportul lipidic și funcția lizozomală. Substanțele primare și secundare depozitate pot afecta furnizarea de nutrienți prin intermediul sistemului endolizozomal. Pe modele experimentale de șoareci cu GM1 și GM2 gangliozidoză și boala Sandhoff, homeostazia fierului este afectată. La aceste animale, suplimentarea cu ioni fier au crescut speranța de viață cu aproape 40% [213]. Degradarea gangliozidelor este afectată în gangliozidoze. Într-o altă boală, galactosialidoza, defectul primar al carboxipeptidazei A (proteină protectoare), duce la o pierdere secundară a β-galactozidazei și a Neu1 sialidazei, însoțită de depozitarea GM1 [214]. Gangliozidoza este cauzată de defecte ale genelor care codifică glicozidazele sau a proteinelor responsabile de transferul lipidic care sunt necesare pentru degradarea lizozomală a gangliozidelor. Baza teoretică a abordărilor terapeutice în cazul gangliozidozelor este "teoria pragului" [215], care precizează că raportul afluxului de substrat în lizozomi și capacitatea de degradare determină evoluția bolilor. Ambii parametri pot fi abordați prin diferite moduri terapeutice [216].

În plus față de bolile moștenite, concentrațiile gangliozidelor pot fi de asemenea modificate în mai multe boli dobândite [217]. De exemplu, gangliozidele joacă roluri imoprtante în bolile neurologice cum ar fi boala Alzheimer [218], Parkinson sau boala Huntington [219]. În cancer, expresia gangliozidelor poate fi de asemenea modificată în celulele tumorale cu impact asupra semnalizării și a interacțiunilor tumoră-gazdă [220]. [Neu5Gc] GM3 [221], GD2, GD3, GM2 și fucosilGM1 sunt considerate antigene asociate tumorii [222] și sunt ținte pentru imunoterapie în cancer [223]. De asemenea, mai multe neuropatii, incluzând forme variate de sindrom Guillain-Barr'e și Miller-Fisher sunt cauzate de anticorpi serici împotriva gangliozidelor [224]. În trecut, gangliozide izolate din creierul bovin au fost investigate și apoi aplicate la subiecți umani pentru îmbunătățirea reparării neuronale și pentru tratamentul accidentului vascular cerebral [225]. De asemenea, a fost evaluată aplicarea directă a gangliozidei GM1 în creierul pacienților cu boala Alzheimer [226]. Inhibarea biosintezei gangliozidelor în tratamentul rezistenței la insulină [227], interferența legării microbiene la gangliozide [228] sau reducerea neurotoxicității cu Liga20 [229] au fost de asemenea procese studiate și prezentate în literatură.

2.3.8.1. Aspecte funcționale

O mulțime de funcții au fost atribuite gangliozelor de-a lungul timpului. În general, gangliozidele își mediază funcția prin interacțiunea cu molecule de legare extramembranare din afara celulei (interacțiunea "trans") sau prin influențarea proprietăților proteinelor de pe aceeași membrană (interacțiunea "cis") [230]. Interacțiunile "trans" se produc între partea glicanică a gangliozidelor pe de o parte iar pe alta, cu lectinele. De asemenea, gangliozidele contribuie la formarea " codului glicomic" de înaltă densitate al suprafețelor celulare. De exemplu, GM1 poate fi recunoscut de galectina-1 [231] și acizii sialici cuplati α2,3 sunt recunoscuți de lectinele Siglec-4, α2,6-sialozidele de Siglec-2 și α2,8 – sialozide de Siglec-7 [232]. De asemenea, interacțiunile carbohidrați-carbohidrați pot juca un rol important [165]. Deși interacțiunile dintre resturile individuale de carbohidrați sunt slabe, gruparea de gangliozide oferă posibilitatea interacțiunilor multivalente [165]. Se pare că GM3 situata pe membrana celulelor B16 ale melanomului de șoarece poate media adeziunea celulară la celulele limfomului L5178 de șoarece prin legarea la GA2 (gangliotriaosilceramida, GalNAcβ1,4Galβ1,4Glcβ1,1Cer) [233]. În sistemul nervos, gangliozidele acționează în mod "trans" cu glicoproteina MAG asociată cu mielina. MAG recunoaște NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc terminal de pe gangliozidele axonale, o interacțiune care este esențială pentru stabilitatea axon-mielină și regenerarea axonului [234]. Interacțiunile "Cis" se pot realiza printr-o interacțiune directă sau indirectă prin proprietățile membranare [235]. Astfel, gangliozidele influențează activitățile receptorilor tirozin kinazelor în membrana plasmatică, cum ar fi receptorii factorului de creștere a epidermului, factorul de creștere a nervilor și insulina și, prin urmare, semnalizarea celulară [235]. De exemplu, GM1 îmbunătățește activarea receptorului neurotrofinei TrkA într-o manieră "Cis" [236]. Deoarece caracterizarea microdomeniilor lipidice în celulele vii este dificilă, unele concluzii se pot trage din experimentele in vitro. Alt exemplu: GM3 inhibă autofosforilarea EGFR purificată reconstituită în proteolipozomii compozițiilor lipidice definite, dar nu și legarea EGF [237]. Există indicii că gangliozidele nu pot acționa numai într-o manieră autonomă, dar ar putea, de asemenea, să susțină formarea unor faze distincte de membrană, deși dezbaterea rămâne deschisă în ceea ce privește măsura prin care acest lucru operează in vivo. Se crede că gangliozidele nu sunt distribuite omogen pe suprafața celulară, ci segregă în domenii de membrană împreună cu proteine ancorate cu GPI, sfingomielină și colesterol. Astfel de "plute" (sau "pontoane") ar fi trebuit să fie statusul fiziologic al multor proteine membranare, deși nu au fost furnizate dovezi solide care să pledeze pentru existența lor. Gangliozidele joacă probabil încă multe roluri neexplorate pentru structura membranei [238]. Datorită grupărilor mari hidratate, ele stabilizează zonele membranare cu curbură pozitivă [239]. Mai multe rapoarte propun o poziționare a gangliozidelor și a altor GSL dimpreună cu proteine ancorate GPI și colesterol în platformele lipidice cunoscute sub denumirea de "plute" sau "pontoane" localizate pe fata externa a membranelor celulelor vii [240, 241, 242]. Din considerente termodinamice, este clar că proceduri precum extracția în prezența detergenților pot conduce la rezultate artificiale și nu sunt potrivite pentru caracterizarea acestor agregate [243]. Deși s-a demonstrat că tratamentul membranelor celulare cu detergenți, în timpul extractiei gangliozidelor, cauzează redistribuirea gangliozidelor și proteinelor ancorate cu GPI [244], aceste tehnici sunt încă aplicate și nu întotdeauna examinate critic. Experimentele facute pe celulele vii utilizând microscopia STED [245] și alte tehnici de vizualizare [246] indică o limită superioară a duratei de viață și a dimensiunilor acestor domenii situate la aproximativ 20 ms și 20 nm. În plus, acizii sialici și oligosialici prezenți pe gangliozide modulează densitatea de încărcare a suprafeței membranei, pH-ul la suprafața membranei și potențialul membranei [247]. În bistraturile lipidice, gangliozida GD1a poate crește excitabilitatea canalelor de sodiu dependente de tensiune [248].

Gangliozidele fiind produse genetice secundare, funcția lor poate fi analizată prin experimente knock-out, unde în celule, tesuturi sau organisme, sinteza sau degradarea lor este întreruptă de strategii genomice, posttranscripționale sau chimice. Au fost deosebit de valoroase experimentele pe șoarecii modificați genetic cu defecte în biosinteza gangliozidelor [249], care au relevat, de exemplu, rolul gangliozidelor în homeostazia calciului, repararea neurală sau bolile neurologice. De asemenea, investigațiile efectuate pe subiecți umani [250], mamifere modificate genetic [251] și alte organisme [252] au permis înțelegerea diferitelor aspecte ale metabolismului și transportului gangliozidelor. Sistemele in vitro, cum ar fi lipozomii sau monostratele planare, permit investigațiile dificil de realizat în celule. De exemplu, atunci când GM3 este încorporat în lipozomi, separarea fazelor în faze bogate în GM3 și sărace în GM3 se produce peste un anumit conținut GM3 [253]. În condiții experimentale, biosinteza gangliozidelor poate fi modulată prin inhibitori [254]. De asemenea, amplificarea biosintezei gangliozidelor poate fi utilizată chimic sau prin introducerea ADNc care codifică glicoziltransferaza în celulele de cultură [255]. Un enantiomer al inhibitorului de glucozilceramid-sintetaza D-threo-PDMP (PDMP = 1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol), Lthreo-PDMP, acționează ca amplificator al biosintezei gangliozidelor prin reglarea glicoziltransferazelor avînd ca rezultat creșterea neuronilor [256, 257]. În timp ce sistemele complexe precum celulele cultivate pot supraviețui fără GSL, ele sunt necesare pentru dezvoltarea organismelor multicelulare [258]. În ciuda dezvoltării rapide a instrumentelor analitice și biofizice, determinarea analitică a modului de organizare al gangliozidelor, rezoluția lor spațială și corelarea lor cu funcția rîmâne încă o provocare. Cu atât mai mult, o caracterizare convingătoare a domeniilor membranare care conțin gangliozide în celulele vii și a rolurilor lor la nivel celular ar constitui un progres considerabil în acest domeniu de cercetare, iar frontiera pană recent inexpugnabilă a interacțiunilor de suprafață constituie deja o țintă ce așteaptă să fie doborâtă.

2.4. PROTEINE

Proteinele sunt macromolecule construite prin concatenarea ordonata, conform informatiei codificate la nivel de ADN, respectiv ARNm, a mai multor specii de L-α-aminoacizi proteinogeni diferiți. Cu exceptia prolinei, toți aminoacizii proteogeni au caracteristici structurale comune, cum ar fi o grupare amino in pozitia α- fata de gruparea carboxil și un lanț lateral variabil [259]. Uneori proteinele conțin atașate grupuri non-peptidice, care pot fi numite grupuri protetice sau cofactori. Proteinele pot lucra împreună pentru a realiza o anumită funcție și adesea se asociază pentru a forma complexe proteice stabile. Diferitele proteine difera nu numai la nivelul secventei primare dar si la nivelul modului de impachetare primara, secundara si tertiara, cu efecte importante asupra interactiunii cu alte specii proteice sau alte tipuri de molecule, cum ar fi carbohidratii. Conceptul interactiunii carbohidrați – proteine se conformează principiului "lacăt-cheie" avansat de Emil Fisher încă din 1894 [260] pentru a ilustra complementaritatea/interactiunea specifica specifică dintre un glicozid și o enzimă. Apariția unor tehnici moderne de elucidare a structurii biomoleculelor a permis intelegerea detaliată a mecanismelor care guvernează fenomenul de recunoaștere moleculară, oferind o înțelegere aprofundată a bazelor fizico-chimice care stau la baza interacțiunii receptor-ligand.

Tehnicile recente de LC-MS produc seturi de date cu dimensiuni de pana la 100GB si pana la un milion de spectre, de unde pot fi identificate până la 8.000 de proteine [261]. Interacțiunile proteină-proteină și cascadele de semnalizare celulară sunt studiate în principal prin tehnici de microarray, cromatografia de imunoafinitate și spectrometria de masa (SM) [262]. SM presupune ionizarea speciilor proteice/peptidice si sortarea fragmentelor ionizate functie de raportul masa/incarcare urmata de prelucrarea spectrelor brute, filtrarea zgomotului de fond cu substracția liniei de bază, detectarea varfurilor si calibrarea și alinierea spectrelor.

Analiza unui spectru MS urmează patru etape distincte: (1) identificarea secvențelor de aminoacizi, a peptidelor și a proteinelor în Peptide-Spectrum Match (PSM), (2) detectarea, cuantificarea, adnotarea și alinierea caracteristicilor, (2) analiza semnificației peptidelor și a proteinelor, descoperirea și predicția de clasă și (4) integrarea datelor și analiza căii. Identificarea secvențelor de aminoacizi implică în principal interogarea bazelor de date ale spectrelor obținute experimental sau a spectrelor prezise din secvențe genomice folosind digestia în silico și raportarea PSM folosind cele mai bune scoruri.

PARTEA SPECIFICĂ

3. MATERIALE ȘI METODE

3.1. REACTIVI ȘI MATERIALE DE LABORATOR

Reactivii folosiți în acest studiu au avut un grad înalt de puritate analitică. Metanolul, cloroformul, acetonitrilul, etanolul au avut puritate de 99,9% și au fost achiziționati de la firma Merck (Darmstadt, Germania) și utilizați fără o purificare suplimentară. Soluțiile stoc ale probelor au fost păstrate în tuburi de plastic „Safe-Lock Tube” de 1.5 mL de la firma Eppendorf (Hamburg, Germania). Tot de aici au fost cumpărate și pipetele automate cu volume diferite, între 0.5-1000 μl, însoțite de tips-uri pentru pipetarea și infuzarea soluțiilor în spectrometrul de masă. Pentru pregătirea probelor s-a folosit apă distilată și deionizată. Probele solide au fost cântărite în prealabil folosind balanța analitică cu precizie de 0.001 g și interval de măsurare între 0.02-220g Kern Ew 220 de la firma Kern & Sohn (Balingen, Germania). Pentru dizolvare și omogenizare probele uscate au fost dizolvate în solvenți, iar ulterior diluțiile lor, au fost vortexate într-un aparat vortex cu o capacitate de până la 2500 rpm – Heidolph Reax Control (Schwabach, Germania). Toate soluțiile supuse screeningului MS au fost apoi centrifugate timp de 1,5 – 2 ore într-o centrifugă Roth cu 6 locașuri pentru tuburile Eppendorf și viteza de rotaâie de 6000 rpm (Carl Roth, Karlsruhe, Germania) respectiv în centrifuga SIGMA 2-16 de la firma Sartorius GmbH (Göttingen, Germania). Pentru concentrare sau uscare soluțiile au fost supuse liofilizării cu ajutorul unui evaporator SpeedVac Concentrator SPD 111V – 230 (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, SUA) atașat la o pompă de vid PC 2002 Vario cu CVC 2000 Controler (Vaccubrand, Wertheim, Germania). În urma procedurilor de extracție și purificare, probele de gangliozide pot avea un coținut crescut de săruri. Pentru eliminarea sărurilor, soluțiile probelor au fost dializate în apă folosind membrane de tip „cut off” de 500 Da, Micro Dispo Dialyze MWCO 500 (Holliston, Massachusetts, SUA). Până în momentul când au fost analizate prin MS, toate probele au fost păstrate în congelator la -20oC. Spectrometrul de masa utilizat a fost calibrat de fiecare dată înaintea efectuării măsurătorilor utilizând soluții standard de calibrare „tuning mix”. Pentru calibrare, s-a folosit un amestec standard de gangliozide extrase din creier bovin "Cronassial", disponibil comercial de la Laboratoarele Fidia (Abano Terme, Italia) și standardul de calibrare G2421A – Agilent Technologies (Santa Rosa, CA, Statele Unite ale Americii). Experimentele de tip chip nanoESI s-au desfășurat prin injectarea automată a probelor folosind robotul NanoMate prin intermediul chip-urilor de siliciu ce conțin 400 de orificii și care au fost procurate de la firma Advion Biosciences (Ithaca, NY, USA). Plăcile de microtitrare cu cele 96 de godeuri și placa-suport conținând vârfurile de infuzie a probelor au fost achiziționate de la firma Advion. Gazul de desolvatare (azotul) și gazele folosite pentru fragmentarea ionilor (heliul și argonul) au fost comandate de la firma Linde, Romania (grad de puritate 5.0, echivalent cu 99.999% vol). La experimentele de tip QTOF s-au folosit capilare de sticlă cu pereții interiori ce au formă de omega și care au fost achiziționate de la firma Analytik Vertrieb (Germania) și care, în prealabil au fost dimensionate și pregătite pentru infuzia probelor.

3.2. SELECTAREA ȘI DESCRIEREA MATERIALULUI DE LUCRU. ANALIZA AMESTECURILOR COMPLEXE DE GANGLIOZIDE EXTRASE DIN ȚESUT CEREBRAL

Amestecurile complexe de gangliozide native din probele de tumori cerebrale prelevate de la pacienți precum și cele de țesut cerebral sănatos au fost inițial extrase și purificate. Toate probele au fost obținute de la Universitatea de Medicină din Zagreb, Croatia în urma colaborării știintifice cu grupul de cercetare al Prof. Dr. Željka Vukelić. Toate experimentele au respectat cu strictețe codurile de etică în cercetarea biomedicală. Astfel, au fost respectate prevederile Legii nr. 206/2004 cu privire la conduita în cercetarea stiințifică, dezvoltare tehnologică și inovare.

Activitatile desfasurate in cadrul studiilor au respectat reglementarile internationale in domeniu precum si legislatia specifica a Uniunii Europene. Permisiunea pentru experimente ce implică subiecți umani în scopuri științifice a fost obținută din partea Comisiei de Etică a Facultății de Medicină din Zagreb, în cadrul Proiectului nr. 108120, finanțat de Ministerul Croat al Științei și Tehnologiei. Proba de hemangiom cerebral localizat în emisfera dreapta a cortexului cerebral frontal a fost obținută în timpul procedurii chirurgicale de extirpare a tumorii de la un pacient adult de sex masculin, în vârstă de 42 de ani. Mostra de țesut normal frontal cerebral cortical (NFC) de la un subiect de sex masculin de aceeași vârstă, decedat într-un accident de circulație, a fost disecat pentru a servi pentru comparație; această probă a fost

obținută de la Departamentul de Medicină Legală, Facultatea de Medicină, Zagreb, Croația. La fel s-a procedat și pentru celelalte probe, respectiv o probă de țesut cu meningiom și o probă de țesut conținând o tumoră metastatică a unui adenocarcinom pulmonar și corespondentul acesteia (țesut cerebral sănătos provenit de la un pacient de aceeași vârstă). Până la demararea procedurii de extracție a gangliozidelor, toate probele au fost cântărite și depozitate la -20°C. Ulterior, amestecurile native de gangliozide au fost extrase și purificate respectând protocoalele descrise anterior [263,264,9,6,3] în condiții identice, după metodele dezvoltate de Svennerholm și Fredman [90] și modificatede Vukelić et. al [265]. Înaintea procedurii de extracție a gangliozidelor, fiecare țesutul a fost omogenizat în apă rece (+1oC). Lipidele au fost extrase de două ori folosind un amestec de cloroform: metanol (raport volumetric 1: 2) urmat de partiție și repartiție prin adăugarea de cloroform, metanol și apă până la un raport volumetric final de 1: 1: 0,8. Fazele superioare care conțineau gangliozide au fost colectate. Extractul brut de gangliozid e fost purificat în mai multe etape: precipitarea complecșilor de proteine-sare au fost precipitați, etapă urmată de centrifugare; contaminanții cu greutate moleculară mică au fost îndepărtați prin gel filtrare pe coloană de Sephadex G-25 și mai apoi soluțiile au fost dializate în apă (au fost lăsate peste noapte la 4°C). În final, extractul pur a fost evaporat până la deshidratare completă folosind un evaporator SpeedVac (SPD 111V – 230, Thermo Electron, Asheville, NC, SUA) cuplat la o pompă de vid (PC 2002 Vario cu CVC 2000 controler, Vaccubrand, Wertheim, Germania). Probele uscate astfel obținute au fost cântărite și depozitate la -27o C până la efectuare analizelor prin MS.

3.3. PLATFORME ANALITICE UTILIZATE

3.3.1. SPECTROMETRUL DE MASĂ NANOESI CUPLAT CU ROBOTUL NANOMATE PENTRU INFUZARE ȘI IONIZARE AUTOMATĂ

Aparținând erei post-genomice, spectrometria de masa dobândește un avânt constant și este considerată una dintre cele mai puternice tehnici analitice de elucidare a compoziței și structurii moleculare din diverse matrici umane, cum este sangele, lichidul cefalorahidian, saliva, urina, lapte, precum și țesuturile sănătoase și patologice. În aceste studii elaborate în cadrul tezei de doctorat s-au folosit 2 tipuri de spectrometre de masă de înaltă performanță, ambele cuplate cu un robot NanoMate pentru automatizarea infuziilor.

În ultimii ani, chip nanoESI MS s-a dovedit a fi o tehnică de încredere, puternică și eficientă pentru cercetări din domeniul glicomicii. Această tehnică a fost dezvoltată, optimizată și aplicată în studiul amestecurilor glucidice și glicopeptidice extrase din diverse matrici biologice, normale și patologice (tumori cerebrale).

Astfel, pentru screeningul de masă al hemangiomului (și țesutului cerebral sănătos aferent) s-a folosit platforma nanoESI HCT MS, iar pentru pentru screeningul MS al meningiomului și al metastazei adenocarcinomului pulmonar (împreună cu țesutul cerebral sănătos corespondent) s-a folosit platforma nanoESI QTOF MS. Căteva experimente de spectrometrie de masă s-au derulat folosind un spectrometru de masă cu capcană ionică de mare capacitate (HCT Ultra PTM Discovery) de la firma Bruker Daltonics (Bremen, Germania) (Fig. 11). HCT MS cu disociere indusa prin ciocnire-CID, cu disociere prin transfer de electroni-ETD si kit de reactie cu transfer de protoni (PTR), kituri si software-ul corespunzator functionand pâna la MS11 in modul manualul si MS5 in cel automat de selectare si fragmentarea a ionilor a fost utilizat ca echipament principal pentru caracterizarea exhaustiva a gangliozidelor din țesut cerebral cu hemangiom și țesut cerebral sănătos. Astfel, am obținut date valoroase cu privire la compozitia si structura (secventa oligozaharidică, profil sialilare structura fragmentelor de lipide, caracterizarea modificarilor existente) acestor molecule. HCT este interfațat cu un computer pe care se rulează pachetul integrat Compass 1.2, incluzând modulele Hystar 3.2.37 și Esquire 6.1.512 pentru funcționalizarea aparatului și achiziționarea spectrelor de masă, a cromatogramelor și un software Data Analysis 3.4.179 pentru stocarea cromatogramelor, spectrelor dar și pentru procesarea datelor de MS.

Figura 11. Spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate HCT Ultra cuplat cu robotul NanoMate (indicat de săgeată în dreapta)

Rezoluția și precizie optimă în determinarea masei moleculare, viteza de achiziție, sensibilitatea înaltă (infuzia unei cantități de probă de ordinul zecilor de nL/min) și capacitatea ridicată de stocare a ionilor, precum și posibilitatea unică de a efectua stadii multiple de fragmentare reprezintă caracteristicile de performanță ale acestui spectrometru de masă. Încă o trăsătură importanată a spectrometrului de masă HCT Ultra este versatilitatea acestuia prin posibilitatea cuplajului cu diverse surse de infuzie.

Pentru infuzia automată bazată pe chip-nanoelectrospray s-a utilizat robotul NanoMate BiVersa care încorporează tehnologia ESI chip 400 (Advion Biosciences, Ithaca, NY, USA), controlat și manipulat prin software-ul ChipSoft 8.1.3 operând în Windows XP.

Robotul NanoMate a fost primul sistem din lume complet automat pentru pulverizara probelor prin ESI în MS. Robotul are încorporată o placă de microtitrare pentru probe cu 96 de godeuri și cu o placă-suport cu 96 vârfuri pentru pipeta conductivă care realizează aspirarea și infuzia probei. Un volum între 5-50 μL din soluția probei de lucru a fost încărcată pe placa de microtitrare cu 96 godeuri, după care robotul a fost programat să aspire volumul de probă necesar măsurătorii, urmat de 2 μl aer în vârful pipetei. După aspirare, proba a fost plasată pe fața cu orificii a microchipului de siliciu, apoi infuzată prin orificiul microchipului în MS. Cuplajul cu spectrometrul de masă HCT Ultra s-a realizat printr-un sistem de interfațare original realizat în cadrul laboratorului (Fig. 11). Astfel, sursa convențională de ionizare prin electrospray a MS a fost detașată și toate setările MS și conexiunile electrice au fost readaptate pentru funcționarea sistemului NanoMate într-un regim ESI, decuplat de MS. Robotul a fost pus pe trei suporturi ajustabile pe direcția O-xyz și conectat la conducta care furnizează azot spectrometrului. De asemenea, și poziția chipului pentru electrospray a fost ajustată respectând poziția contraelectrodului conic prin care se transferă probele. Electrosprayul a fost inițiat prin aplicarea unei tensiuni de 0.8 kV pe vârful pipetei conductive și a unei presiuni asupra tubului de infuzie de 0.6 p.s.i., ambii parametri fiind optimizați pentru a asigura ionizarea și transferul adecvat al speciilor ionice din probă în MS.

3.3.2. SPECTROMETRUL DE MASĂ HIBRID QUADRUPOLE TIME-OF-FLIGHT-QTOF

Pentru studiul gangliozidelor extrase din țesutul cerebral cu metastaza a adenocarcinomului pulmonar, țesutul cerebral sănătos folosit pentru comparație și țesutul cerebral cu meningiom s-a folosit MS cuadrupolar cu timp de zbor (QTOF) Micro (Micromass/Waters, Manchester, UK) (Fig. 12). Aceast tip de spectrometru hibrid MS/MS combină simplicitatea quadrupolului cu eficiența ridicată a analizorului cu timp de zbor (Time of Flight, TOF) cu accelerare ortogonală (QTOF). Punând laolaltă performanțele analitice ale acestui sistem cu capacitățile extraordinare de prelucrare a rezultatelor experimentale obținute (prin intermediul aplicației software dedicate MassLynx) rezultate au fost generate în cel mai scurt timp și la un nivel de precizie foarte ridicat. Capilarele de sticlă folosite pentru probele analizate cu ajutorul spectrometrului QTOF au fost aciziționate de la firma Analytik Vertrieb (Germania). Datorită formei de „omega” și a diametrului interior de numai 20-30 μm a pereților interni ai capilarelor, se evită formării bulelor de aer. Dimensionarea capilarelor s-a realizat cu ajutorului unui trăgător de capilare vertical cu filamentul în formă ”omega”, model 720 (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, SUA). Rolul său este de a încălzi capilarul de sticlă, care mai apoi se alungește și se rupe sub acțiunea unei greutăți atașate. Astfel se obțin două capilare cu vârf ascuțit și deschis. După ce se poziționează capilarul de sticlă pe firul metalic, se centreză față de contraelectrod pe axele Oxyz cu ajutorul dispozitivelor de reglare. Poziționarea acestuia se urmărește în timp real pe un monitor care transmite imaginile de la o cameră conectată la sursa de ionizare. Acest tip de MS înglobează două tipuri diferite de analizoare: analizorul cuadrupolar și un analizor cu timp de zbor. Combinând cele două analizoare în spectrometrul hibrid QTOF se crește performanța și putere de rezoluție a MS. Astfel, se obțin măsurători cu grad înalt de sensibilitate și exactitate în determinarea masei moleculare a speciilor prezente în probele analizate. În plus, spectrometrul QTOF este dotat și cu o cameră de ciocnire de tip hexapol (hexapole collision cell), care împreună cu analizorul cuadrupolar formează analizorul MS1. Fiind un sistem hibrid, spectrometrul de masă QTOF funcționează atât în modul MS, cât și în modul MS/MS. Acesta este conectat la un PC ce rulează programul MassLynx versiunea 4.1 ce controlează instrumental, achiziționează și prelucrează datele obținute. Totodată, cu ajutorul acestui program se poate selecta tehnica de analiză dorită: operarea în tehnica de detectie a ionilor negativi sau pozitivi (positive/negative ion mode), în funcție de felul de ionizare al probei selectate spre analiză. De asemenea, programul permite selecția modului de operare, MS sau MS/MS, precum și ajustarea unor parametri: tensiunea pe capilar sau pe contraelectrod, energiea de ciocnire, temperatura de desolvatare.

Figura 12. Spectrometrul de masă hibrid cuadrupolar cu timp de zbor, QTOF și sursa de ionizare prin nanoelectropulverizare (nanoelectrospray nanoESI)

3.3.3. DISOCIEREA INDUSĂ PRIN CIOCNIRE (COLLISION INDUCED DISSOCIATION-CID)

O caracteristică importantă a tehnicii de ionizare ESI o reprezintă posibilitatea de a genera ioni macromoleculari intacți în fază gazoasă, oferind informații prețioase referitoare la masa moleculară a compuților selectați. Experimentele efectuate pentru fragmentarea și elucidarea structurală a moleculelor selectate s-au realizat prin tehnica CID, procedeu în urma căruia ionii moleculari interacționează cu gaze inerte (heliu pentru HCT și argon pentru QTOF), realizându-se distribuția energiei vibraționale de-a lungul legăturilor covalente.

Pentru ca ionii precursori să ajungă metastabili, necesită o creștere a energiei lor interne. Acest fenomen poate fi realizat în urma activării lor prin ciocnire.

CID permite creșterea numărului de ioni precursori care se pot fragmenta în zona de reacție. Aceasta se desfășoară în doi pași ce cuprind: 1). ciocnirea ionului precursor cu moleculele gazului inert, în urma căreia se obține creșterea energiei interne a ionului și 2). disocierea unimoleculară a a ionului activat [266]. Atunci când energia internă a ionilor crește peste valoarea prag la care se produce scindarea unei anumite legături, are loc procesul de fragmentare ce duce la formarea cu precâdere a ionilor de tip B și Y. Dacă ne referim la valorile energiei de ciocnire aplicate, există CID la energii joase (low-energy CID sub 100 eV) și CID la energii înalte (high-energy CID și utilizează energii de accelerare aflate în domeniul keV). Deși CID este cea mai simplă tehnică de fragmentare, aceasta nu se aplică cu succes în cazul studiului modificărilor post-translaționale. Datorită faptului că aceste modificări sunt labile există riscul fragmentării în sursă sau poat apărea pierderi neutre de apă și amoniac.

3.3.4. DISOCIEREA INDUSĂ PRIN TRANSFER DE ELECTRONI (ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION – ETD)

Ionii precursori pot fi supuși fragmentării în urma unor reacții fizice sau chimice, în urma interacțiunii cu un gaz inert. Formarea ionilor de fragmentare se poate realiza nu numai in urma reacției de disociere induse prin coliziune CID, ci si in urma disocierilor prin captură electronică (Electron Capture Dissociation ECD) și prin transfer electronic (Electron Transfer Dissociation ETD). Folosind aceste reacții se poate determina structura moleculară exactă a ionului selectat, prin identificarea fragmentelor obtinute și elucidarea modului de legare a acestora. Totodată, se poate face distincție între izomeri sau se poate stabili exact poziția de legare a diferiților radicali (ex. fragmente de tip O-Acetil, OAc) din interiorul structurii analizate, uneori prin fragmentări de inel, cum se întamplă în cazul gangliozidelor.

Aplicate împreună sau alternativ ETD și/sau CID ar putea crește semnificativ acoperirea secvențelor și ar putea adăuga un plus de încredere identificării secvențelor peptidice/proteice și a caracterizării modificărilor post-tranzaționale ale acestora chiar și pe instrumente cu rezoluție redusă.

3.4. PLATFORME INFORMATICE

Odată cu introducerea cadrului dot NET, Microsoft a inclus un nou limbaj denumit C#. Limbajul de programare C# (pronunțat "C sharp") este conceput pentru a construi o varietate de aplicații care rulează pe .NET Framework. C# este proiectat să fie un limbaj de programare simplu, modern, cu scop general, orientat spre obiect dar și spre componente, împrumutând concepte-cheie din mai multe limbaje, mai ales Java. Multe inovații din C# permit dezvoltarea rapidă a aplicațiilor, păstrând în același timp expresivitatea și eleganța limbajelor în stilul C. Acest limbaj permite dezvoltarea de aplicații robuste, durabile care să deserveasă orice domeniu. La aceste trăsături generale se pot suplimenta și altele cum ar fi suportul pentru internaționalizare (utilizarea aplicațiilor în zone diferite ale globului unde se vorbesc limbi diferite), fără să necesite schimbări majore ale arhitecturii software-ului. În strânsă conexiune cu arhitectura .NET (.NET Framework) pe care funcționează, C# gestionează în mod automat memoria utilizată. Eliberarea memoriei ocupate (garbage collection) de către obiectele reziduale ale aplicației, este o facilitate remarcabilă a limbajului. Nu mai este necesar ca programatorul să decidă singur care este locul și momentul în care obiectele să fie casate, așa cum se procedează în C++. În C# se pot crea totodată aplicații pentru sisteme complexe ce rulează sub o mare varietate de sisteme de operare, dar și pentru sisteme dedicate (embeded systems). Acestea din urmă se întind pe o arie largă, de la dispozitive portabile cum ar fi ceasuri digitale, telefoane mobile, MP3 playere, până la dispozitive staționare ca semafoare de trafic, sau controlere pentru automatizarea producției. Din punct de vedere sintactic C# derivă din limbajul C++, dar include și influențe din alte limbaje, mai ales Java. Programarea orientată pe obiect are ca punct de plecare o serie de principii de bază de care am ținut cont la conceperea acestui program: 1. posibilitatea de reutilizare ulterioară a codului sursă, 2. posibilitatea de a fi actualizat cu ușurință, 3. încapsularea proprietăților și comportamentului obiectelor, 4. mentenabilitatea acestuia. Cu toate acestea, a fost destul de anevoios de elaborat un astfel de concept de software, datorită complexității și diversității rezultatelor generate. Totuși, avand cunoștințede bază despre acest limbaj informatic de programare și cu ajutorul unor ingineri specialiști în IT, am conceput un software cababil să ruleze o bază de date Access care să ușureze calculul rezulatelor generate prin MS. În primul rând am alcătuit o bază de date cu ajutorul programului Microsoft Excel 2007 care a conținut toate sturcturile teoretice de gangliozide, respectând anumite reguli chimice și nomenclatura acestora. A rezultat un fișier Excel cu peste 35000 de mase moleculare teoretice, iar programul poate genera mai mult de 150000 de structuri atribuite gangliozidelor.

Acest program este unic în lume, fiind special conceput pentru a se mula strict pe domeniul de studiu (glicosfingolipidomică) și activitate al grupului de cercetare din care fac parte.

4. REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1.STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL HEMANGIOMULUI CEREBRAL COMPARATIV CU ȚESUTUL CEREBRAL SĂNĂTOS, DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL, PRIN CHIP NANOESI HCT MS

4.1.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

În general, hemangiomul reprezintă o acumulare anormală, de obicei benignă, a vaselor sanguine la nivelul pielii sau organelor interne. Cauza exactă a acestei patologii nu încă pe deplin cunoscută. La nivel mondial, se depun eforturi pentru elucidarea cauzelor și implicit a dezvoltării unor platforme sigure și eficiente de detecție a tumorilor în stadii incipiente. MS este una dintre cele mai noi și promitatoare tehnici de analiză a structurilor chimice a glicosfingolipidelor cu rol de biomarker în patologia tumorală și nu numai [38].

Plecând de la aceste premize, cercetarea personală își propune să realizeze următoarele obiective:

Dezvoltarea și optimizarea platformei analitice bazată pe MS;

Analiza expresiei gangliozidelor în hemangiom versus țesut cerebral sănatos;

Mappingul gangliozidelor extase din hemangiom comparativ cu țesut cerebral sănătos;

Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei unice și originale Gangliobase 2.1 și interpretarea rezultatelor în corelație cu studiile științifice din domeniu.

Pentru acest studiu s-au selectat: 1). o probă de țesut tumoral provenit din lobul frontal cortical al unui subiect diagnosticat cu hemangiom cerebral (cortex frontal cu hemangiom – CFH); 2). o probă de țesut cerebral sănătos provenită de la un subiect de aceeași vârstă, decedat în urma unui accident rutier (cortex fronatal normal – CFN). După procesul de extragere și purificare a gangliozidelor din probele descrise mai sus aceste sunt supuse screeningului Chip-NanoESI HCT MS.

4.1.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE

Pentru analiza chip-nanoESI MS, soluția stoc a fiecărui extract nativ de gangliozide (aproximativ 0,5 mg/ml) a fost preparat prin dizolvarea materialului uscat în metanol pur stocat la -27°C. Alicoturile de lucru, la o concentrație de aproximativ 0,5 pmol/l (calculată pentru o masă moleculară medie a amestecului de gangliozide de aproximativ 2000) au fost obținute prin diluarea soluției stoc în metanol pur.

Analiza prin MS a probelor s-a efectuat utilizând sistemul complet automat bazat pe chip nanoelectrospray în combinație cu un analizorul cu capcană ionică de mare capacitate (Ultra HCT) de la Bruker Daltonics, Bremen, Germania. Toate spectrele de masă au fost obținute în intervalul de masă 100-3.000 m/z cu o viteză de scanare de 8000 m/z pe secundă.

Experimentele MS2 realizarea prin CID a folosit drept gaz de coliziune heliu. Pentru secvențializare MS în tandem, ionii precursori au fost selectați și izolați în intervalul 2u. Pentru o fragmentare optimă, cu grad de precizie crescut, pe toată secvența moleculară selectată, fiecare spectru de fragmentare a fost obținut prin acumularea scanărilor la amplitudini variabile ale semnalului RF, în intervalul 0.6 – 1.0 V.

Atribuirea unei compozitii specifice ionilor moleculari obtinuti a fost făcută prin calcularea masei moleculare exacte. Postulările legate de structura și legaturile chimice ale lanțurilor oligozaharidice s-au bazat pe informațiile obținute anterior [11] și pe principiile căii de biosinteză a gangliozidelor.

Desemnarea ionilor de fragmentare s-a realizat utilizand nomenclatura introdusă de Domon și Costello [92] și revizuită de Costello et al. [267]. Pentru ambele probe s-au folosit condiții identice de analiză și screening al amestecului nativ de gangliozide.

Pentru analiza prin MS a probelor, Robotul NanoMate a fost cuplat cu spectrometru de masa Ultra HCT printr-un sistem de montare la comanda, care permite poziționarea O-xyz a robotului respectând contraelectrodul HCT așa cum a fost descris anterior [3,6,268]. Poziția de electropulverizare a fost ajustată în raport cu conul de eșantionare pentru a realiza un transfer optim al speciilor ionice în MS. Robotul a fost programat să aspire de fiecare dată volumul întreg (câte 5 μL) din fiecare probă și apoi 2 μL de aer prin vârful pipetei și să pulverizeze proba pe partea anterioară a microchip-ului dotat cu 400 de orificii. Sistemul NanoMate HCT MS a fost setat pentru a opera în tehnica de detectie a ionilor negativi, demonstrată anterior ca fiind cea mai adecvată modalitate de ionizare pentru analiza gangliozidelor [6, 9, 268]. Pentru ambele probe, parametrii de ionizare prin chip electrospray au fost setați prin aplicarea unui voltaj inițial de -0.85 kV la vârful pipetei și o presiune a azotului de 0.60 p.s.i. Blocul sursei a fost menținut la o temperatura constanta de 200°C. Pentru a se preveni pe cât posibil apariția fragmentării ionilor în sursă, tensiunea pe capilar a fost de -0.30 V. Încălzirea blocului sursă a furnizat o desolvatare optimă a picăturilor generate fără a fi nevoie de gaz desolvatare. Pentru a preveni contaminarea încrucișată sau supraîncarcarea, vârful pipetei a fost schimbat cu unul nou după fiecare infuzie și analiză MS. Fiecare orificiu a avut un diametru intern de 2,5 μm și a asigurat un ritm de curgere de aproximativ 50 nL/min, în condițiile date. După setarea și aplicarea acestor parametri, s-a obținut un semnal ESI stabil pe tot parcursul măsurătorilor, atât pentru experimentele MS cât și pentru cele MS2. Ambele probe au fost supuse analizei prin MS. Atât parametri tehnici cât și condițiile de obținere a soluțiilor probelor au fost identice pentru ambele tipuri de țesuturi supuse screeningului.

4.1.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL

Amestecul de gangliozide purificate și extrase din țesutul cortical, lob frontal normal și hemangiom a fost supus screening-ului prin nanoESI chip MS prin tehnica de detectie a ionilor negativi, rezoluția și parametri instrumentali fiind identici pentru ambele probe. Spectrele obținute sunt prezentate în figurile 13 și 16, în timp ce identificarea structurilor gangliozidice sunt prezentate în tabelele 4 și respectiv 5. Examinarea comparativă a spectrelor obținute în condiții instrumentale identice au evidențiat, în primul rând, o diferență semnificativă a numărului structurilor de gangliozide exprimate în hemangiom (Tab. 4) față de țesutul normal (Tab. 5). Țesutul CFN pare să conțină o diversitate mai mare de structuri gangliozidice care diferă prin statusul lor de sialilare, prin structura porțiunii oligozaharidice, conținând atât lanțuri scurte, monosalilate (GM) cât și lanturi mari, polisialilate (până la GQ) și de asemenea prin prezența modificarilor prin atașamente periferice labile ale O-Ac și GalNAc.

Figura 13. Spectrul de masă (-)nanoESI chip HCT MS al amestecului nativ de gangliozide extrase din cortexul frontal cu hemangiom. Solvent: MeOH; concentrația probei: 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție: 0.5 min; Chip ESI: -0.85 kV; tensiunea pe capilar: -30 V [3]

Tabelul 4. Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectate în amestecul de gangliozide extrase din țesut cerebral cu hemangiom [3]

Dintr-un total de 29 de structuri identificate în proba de hemangiom, 13 sunt specii monosalilate de tip GM1, GM2, GM3 și GM4 și 13 sunt specii disialiate de tip GD1 și GD2 având în componență ceramide cu structură variabilă (Fig. 14 și Fig. 15). În spectrul din figura 13 s-au detectat numai două structuri GT gangliozide: un GT1 având compoziția ceramidei (d18:1/20:0) și un GT3 cu ceramidă (d18:1/25:1). Interesant, niciuna dintre aceste tipuri de gangliozide trisialilate nu a fost detectată în CFN, ceea ce arată că aceste componente sunt fie absente, fie exprimate în concentrații sub limitele de detecție ale instrumentului în CFN. Prin urmare, ele par să fie asociate mai degrabă cu CFH, decât cu CFN.

Figura 14. Distribuția procentuală a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din cortexul frontal cu hemangiom

Figura 15. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din cortexul frontal cu hemangiom

Conform studiilor anterioare, expresia gangliozidelor polisialilate este reglată într-un mod dependent de creștere și dezvoltare [269] și asociată cu tipul de stare normală/aberantă a țesutului cerebral. De exemplu, s-a raportat anterior că un conținut mai mic de specii sialilate a apărut în gliosarcom în comparație cu țesutul cerebral normal [130]. Constatările noastre actuale sunt în concordanță cu datele obținute prin analiza chip-ESI MS a gliosarcomului cerebral și susțin rolul sialilării în dezvoltarea și progresia tumorală. Spre deosebire de gliosarcomul investigat anterior [130], au fost observate două structuri gangliozidice modificate în amestecul de gangliozide extras din CFH. Conform calculului de masă, ionul [M-H] cu m/z 1,786,28 este compatibil cu o structură de O-Ac-GD2 (d18:1/23:0) în timp ce [M-H] cu m/z 1,216,44 corespunde O-Ac-GM4 (d18:0/29:0). Aceleași specii de O-Ac-GD2 (d18:1/23:0) au fost identificate și în țesutul normal al cortexului frontal, într-o abundență mai mare decât în CFH, dar nu au putut fi găsite în tumori maligne precum gliosarcomul [130], neindentificându-se variantele O-Ac-GD2. Acest lucru sugerează că structurile O-Ac-GD2 ar putea fi markeri pentru tumorile cerebrale benigne.

Figura 16. Spectrul de masă (-)nanoESI chip HCT MS al amestecului nativ de gangliozide extrase din cortexul frontal normal. Solvent: MeOH; concentrația probei: 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție: 0.5 min; Chip ESI: -0.85 kV; tensiunea pe capilar: -30 V [3]

Tabelul 5. Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectate în amestecul de gangliozide extrase din țesut cerebral sănătos [3]

Figura 17. Distribuția procentuală a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut cerebral sănătos

Figura 18. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut cerebral sănătos

Din cele 43 de specii distincte de gangliozide regăsite în proba de țesut cerebral sănătos, 13 sunt monosalilate, în timp ce 30 de structuri conțin mai mult de un fragment de acid sialic atașat la nucleul oligozaharidic (Fig. 17 și Fig. 18). Astfel, pe baza calculului exact al masei, s-au identificat 11 structuri di-, 14 tri- și 5 pentasalilate. Nouă din cele 14 gangliozide trisialilate prezintă sunt molecule de tip GT1 legat de structuri variate ale ceramidei. În cazul structurilor tetrasialilate, toate cele cinci sunt tetrasialotetroze (tip GQ1). Au fost descoperite trei tipuri de gangliozide acetilate semnificative din punct de vedere biologic și o specie modificată prin legarea GalNAc de o gangliozidă. Acestea reprezintă variantele O-acetilate ale GM4(d18:1/25:2) detectat ca un ion monodeprotonat simplu încărcat cu m/z 1153,96, GM3(d18:0/32:0) detectat de asemenea ca un ion monodeprotonat simplu încărcat cu m/z 1419,91, GD2(d18:1/23:0) corespunzând ionului monodeprotonat simplu încărcat cu m/z 1786,16 și GD1 modificat prin atașarea GalNAc(d:18:1/20:0) detectat ca ion dublu deprotonat cu m/z 1033,81.

Astfel, amestecul de gangliozide extras din CFH este în esență dominat de specii cu lanțuri scurte de oligozaharide și care prezintă un conținut global de acid sialic redus.

4.1.4. SCREENINGUL MS2 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL

Datorită faptului că structurile O-Ac-GD2 ar putea fi markeri pentru tumorile cerebrale benigne, ionul dublu încărcat la m/z 1077,00 care, conform calculului de masă corespunde speciei GT1(d18:0/20:0), a fost izolat și supus analizei de fragmentare prin CID MS2.

Spectrul de masă obținut este prezentat în figura 19a, în timp ce schema care ilustrează cele mai probabile căi de fragmentare, împreună cu desemnarea ionilor care susțin elucidarea structurii moleculei, este prezentată în figura 19b.

Figura 19. Fragmentarea MS a ionului [M−2H]2− at m/z 1,077.00 corespunzător speciei de gangliozide GT1(18:1/20:0) detectate în amestecul de gangliozide HFC. a) Spectrul de fragmentare (-) nanoESI- nanoESI chip HCT MS2; b) Schema de fragmentare corespunzătoare izomerului GT1c detectat în proba de hemangiom. CID la amplitudini ale semnalului RF variabile încadrate în intervalul 0,6-1,0 V. Timp de achiziție 0,5 min [3]

Așa cum este vizibil în figura 19, chiar și pentru astfel de ioni precursori de joasă intensitate, HCT CID MS2 prezintă un raport remarcabil semnal/zgomot și un nivel de zgomot de bază aproape nul. Această caracteristică benefică a fragmentării ionilor în analizorul HCT, fie prin CID, fie prin ETD, fie alternând CID/ETD, raportată adesea [6, 270], demonstrează creșterea sensibilității oferită de noua generație de MS cu capcană ionică cu si capacitate de stocare înaltă. Un aspect interesant îl dezvăluie spectrul din figura 3b și anume prezența izomerului GT1c mai puțin frecvent în amestecul de gangliozide extras din CFH. Cinci fragmente de ioni diferiți cu m/z 836,80; 998,80; 1017,80; 1034,00 și 1214,60, toți monodeprotonați, simplu încărcați, prezintă o structură ceramidică de tip (d18:0/20:0) a speciei GT1c susținută de ionul Z0- cu m/z 594,20. Conform calculului de masă, ionul cu m/z 836,80 corespunde elementului trisialo deshidratat care arată că trei resturi Neu5Ac sunt legate între ele, molecula putând avea constiuții diferite, specifice glicoformelor GT1c sau GT1d. Aceste două structuri sunt susținute și de ionii de la m/z 1017,80 alocați fragmentului Z2α/Y1-, m/z 998,80 alocați fragmentului Z2α/Y1 și m/z 1034,00 corespunzător fragmentului Z2a/Y1-, toate având compoziția (GalNeu5Ac3)-. Cu toate acestea, detectarea ionului Z2α/Y0 destul de abundent la m/z 1244,60 este o dovadă incontestabilă privind apariția izomerului GT1c. Acest ion, având compoziția (GlcGalNeu5Ac3)- demonstrează faptul că la unii dintre izomerii izolați și fragmentați simultan, elementul trisialo este cu siguranță conectat la restul galactozei interne, o constiutie corespunzatoare glicoformei GT1c.

Pe de altă parte, ionul de fragmentare cu m/z 906,40 desemnat ca Y2α/Y0/B1β- confirmă prezența speciilor GT1c și GT1b. Din cauza simetriei lanțului Gal-GalNAc-Gal, structurile corespunzătoare GT1a și GT1d nu pot fi discriminată prin ioni specifici de fragmentare. Cu toate acestea, apariția acestor izomeri nu poate fi exclusă. În consecință, presupunem că toți cei patru izomeri GT1a, GT1b, GT1c și GT1d sunt prezenți în amestecul nativ de gangliozide din hemangiom. Totuși, deoarece prezența GT1c este susținută de cel mai mare număr de ioni de fragmentare, am ales să ilustrăm în schema din figura 19b calea de fragmentare experimentată de ionul corespunzător acestui izomer. Pentru a confirma acest concept discutat mai sus, ionul sodiat monodeprotonat simplu încărcat, detectat în spectrul amestecului de gangliozide CFH la m/z 1886,20 a fost supus CID MS2 în condiții identice de fragmentare. Conform calculului de masă, acest ion corespunde unei structuri GD1 având aceeași structură ceramidică (d18:0/20:0) a GT1 analizata anterior, dar cu un rest mai puțin de Neu5Ac.

Spectrul CID MS2 este prezentat în figura 20a în timp ce schema de fragmentare corespunzătoare izomerului GD1b este prezentată în figura 20b. Elementul disialo detectat ca ion B2β la m/z 603,40 este o indicație puternică a prezenței izomerului GD1b (d18:0/20:0) în CFH. Această structură moleculară care prezintă acizii sialici legați la galactoza internă este de asemenea documentată de prezenta ionului de la m/z 1503,00 desemnat ca Z2α- (Na) având compoziția (Neu5Ac2GalGlcCer)-.

În mod similar, doar datorită faptului că nu s-a detectat niciun ion exclusiv de diagnostic pentru GD1a, prezența acestui tip de izomer nu poate fi exclusă. Aceste similarități în căile de fragmentare sugerează că GD1b (d18:0/20:0) ar fi putut fi supus transformării tumorale în GT1c (d18:0/20:0) prin alfa 2,6-sialiltransferaza care adaugă un acid sialic în timpul proceselor de modificare a țesutului.

Figura 20. Fragmentarea MS a ionului [M-2H + Na]- la m/z 1.886,20 corespunzător speciei de gangliozide GD1(18:1/20:0) detectate în amestecul de gangliozide HFC. a) Spectrul de fragmentare (-)nanoESI chip HCT MS2; b) Schema de fragmentare corespunzătoare izomerului GD1b. CID la amplitudini ale semnalului RF variabil în intervalul 0,6-1,0 V. Timp de achiziție 0,5 min [3]

4.1.5. CONCLUZII DE ETAPĂ

Conform cunoștințelor noastre, acesta este primul studiu preliminar al gangliozidelor într-o tumoră cerebrală de tip hemangiom definit din punct de vedere histopatologic. De asemenea, este pentru prima dată când s-a folosit metoda avansată de MS complet automatizată bazată pe chip-nanoESI cuplat direct la HCT și CID MS2 pentru mapping-ul gangliozidelor din hemangiomul cerebral. Compoziția gangliozidelor identificată în hemangiom a fost modificată în comparație cu cea din creierul uman normal. În timp ce în CFH prevalează gangliozidele monosalilate scurte, în CFN gangliozidele mono- și polisializate precum și componentele O-acetilate au fost regăsite ca specii dominante. Presupunem că acest model alterat în hemangiom față de țesutul sănătos folosit ca și control este rezultatul unei rate de biosinteză globală diferită, datorită modificării expresiei anumitor glicoziltransferaze. Cu toate acestea, în CFH, am reușit totuși să detectăm o specie O-Ac-GM4 și o specie O-Ac-GD2 și să corelam prezența O-Ac-GD2 cu caracterul benign al tumorii cerebrale investigate. În plus, o specie GT1 (d18:0/20:0) detectată ca ion de intensitate scăzută, părea a fi un alt marker găsit numai în CFH. Aplicând procedura CID MS2 pe ionul molecular corespunzător GT1 (d18:0/20:0), această tehnică a furnizat dovezi despre existența izomerului GT1c mai puțin obișnuit. Această trăsătură structurală interesantă a fost susținută și prin analiza CID MS2 a ionului GD1 (d18:0/20:0).

În cele din urmă, un aspect notabil este reproductibilitatea, viteza de lucru și sensibilitatea analizei. În aceleași condiții experimentale, metoda a oferit reproductibilitate aproape de 100%. Deoarece sistemul robotizat a pulverizat cu o viteză de 50 nL/min și luând în considerare o concentrație a probei de 0,5 pmol/pl, achiziționarea semnalului timp de 1,5 minute pentru un screening MS al CFH și a două screeninguri CID MS2 a dus la un consum de probă sub 40 fmoli. Din cunoștințele noastre, aceasta este cea mai mare sensibilitate raportată până în prezent în analiza gangliozidelor prin ESI MS. Aceste rezultate inițiale indică fezabilitatea metodelor MS ultrasensibile și precise pentru determinarea unei compoziții modificate a gangliozidelor cerebrale. Datorită sensibilității ridicate pentru detectarea și identificarea structurală a speciilor minore de carbohidrați în amestecurile complexe, viteza de analiză și alte avantaje demonstrate aici, nanoESI HCT MS și CID MSn bazate pe chip au potențialul de a fi introduse ca metode de diagnostic medical pentru analiza comparativă a structurilor și compoziției glicoconjugaților biologici omologi din țesuturi sau fluide ale corpului. Prin urmare, deja se acordă o atenție deosebită îmbunătățirii continue a sistemului, combinației on-line cu cromatografie lichidă și electroforeză capilară pentru punerea în aplicare în cadrul unor investigații clinice axate pe descoperirea unor markeri biochimici specifici pentru diagnosticarea precoce și terapia proliferărilor benigne și maligne.

4.2. STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL MENINGIOMULUI CEREBRAL DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL, PRIN CHIP NANOESI QTOF MS

4.2.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

Meningioamele sunt cel mai frecvente tipuri de tumori care provin din sistemul nervos central. Acest tip de tumoră se formează la nivelul meningelui cranio-spinal [271]. Aceste tumori au adesea o creștere lentă, 90% din ele fiind benigne. Adesea, meningioamele nu produc simptome și nu necesită tratament imediat, dar creșterea în dimensiune poate provoca probleme grave. În unele cazuri, o astfel de creștere poate fi fatală. Unele meningioame sunt clasificate ca fiind atipice. Acestea nu pot fi considerate clar benigne dar nici maligne, dar, în timp și în funcție de mai mulți factori, ele pot deveni maligne. Un număr mic de meningioame sunt maligne și tind să crească rapid. De asemenea, ele se pot răspândi în alte părți ale creierului și dincolo de acesta, adesea în plămâni.

Ca și în studiul hemangiomului, studiul de față urmărește să atingă următoarele obiective:

Dezvoltarea și optimizarea platformei analitice bazată pe MS pentru studiul gangliozidelor din meningiom;

Mappingul gangliozidelor extase din meningiom;

investigare detaliată a compoziției gangliozidelor, urmată de analiza de fragmentare a speciilor individuale regăsite în meningiom utilizând o metodă avansată de MS bazată pe nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS

Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei Gangliobase 2.1 și interpretarea rezultatelor în concordanță cu datele de literatură

Tumora a fost prelevată intraoperator, de la un pacient de sex masculin, în vârstă de 54 de ani, care în antecedente prezenta parestezie în brațul stâng și pierderea conștiinței. În urma efectuării tomografiei computerizate s-a detectat o leziune hiperdensă cu dimensiunile 52 × 41 × 33 mm în regiunea cerebrală parietală dreaptă. Conform examinării histopatologice a țesutului tumoral extirpat neurochirurgical, tumora a fost diagnosticată ca fiind meningiom angioblastic. La fel ca și în cazul celorlalte tumori studiate și ca urmare a colaborării cu Facultatea de Medicină din Zagreb, permisiune pentru experimente cu țesuturi umane în scopuri științifice a fost obținută din partea Comisiei de etică a universității. De asemenea s-a primit consimțământul informat al pacientului.

4.2.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE

Extracția gangliozidelor din țesutul cerebral cu meningiom s-a efectuat conform metodei Svennerholm și Fredman [90], modificată de Vukelic și colab. [265]. Pe scurt, țesutul de meningiom a fost cântărit și omogenizat în apă distilată rece pentru a obține un omogenat 10% (greutate/volum). S-au adăugat cloroform, metanol și apă (cloroform: metanol: apă în raport 1: 2: 0,75) pentru a se extrage lipidele. Extracția a fost efectuată de două ori. În continuare s-a efectuat partiția urmată de repartiție prin care în extract s-a adăugat cloroform, metanol și apă până la raportul de volum final 1: 1: 0,8 și au fost colectate faze superioare conținând gangliozide polare. Extractele brute de gangliozide au fost purificate în mai multe etape: precipitarea complecșilor de proteină-sare urmată de centrifugare; contaminanții cu masă moleculară scăzută au fost îndepărtați prin gel filtrare, pe coloană Sephadex G-25 și dializați în apă (peste noapte la 4°C).

După extracție și purificare, gangliozidele au fost evaporate până la deshidratarea completă și au fost cântărite. Au fost folosite părți de amestec nativ de gangliozide purificat atât pentru separarea HPTLC, cât și pentru analiza prin MS.

Pentru experimentele nanoESIchip-QTOF MS s-a preparat o soluție stoc de extract nativ de gangliozide dintr-o concentrație de aproximativ 0,5 mg/ml prin dizolvarea extractului uscat în metanol pur urmată de vortexare. Soluția stoc a fost depozitată la -27°C. Proba de lucru având o concentrație de aproximativ 2 pmol/L (calculată pentru o greutate moleculară medie a gangliozidelor de 2000) a fost obținută prin diluarea soluției stoc în metanol. Înainte de analiză, soluția probă/ metanol a fost centrifugată timp de 2 ore într-o centrifugă model Sigma 2-16 de la Sartorius (Gottingen, Germania). Supernatantul a fost colectat și supus analizei MS/MS (-) nanoESIchip-QTOF și CID MS/MS. Experimentele MS și CID MS/MS au fost efectuate pe un instrument QTOF Micro (QTOFTM Waters, Manchester, UK). Spectrometrul de masă QTOF MS este conectat la un PC care rulează software-ul MassLynx pentru a controla instrumentul, achiziționa și procesa date MS rezultate. Pentru toate achizițiile, instrumentul a fost reglat pentru înregistrarea datelor la o viteză de scanare de 2 scanări/s. Instrumentul a fost reglat pentru a funcționa în tehnica de detectie a ionilor negativi, deoarece gangliozidele, fiind molecule sialilate, se ionizează mai bine în modul ionilor negativi. Pentru o ionizare eficientă și o fragmentare minimă în sursă, tensiunea conului a variat în intervalul 30-60 V. Pentru toate experimentele, debitul gazului de desolvatare a fost setat la 50 L/h. Temperatura blocului sursă a fost setată la 100°C și păstrată la această valoare în timpul tuturor experimentelor. Analiza MS/MS a fost efectuată prin CID la energii de accelerare reduse a ionilor folosind argon ca gaz de coliziune, ionii fiind izolați într-o fereastră 2u.

Energia de coliziune și presiunea gazului au fost modificate treptat în timpul experimentelor MS/MS pentru a induce o disociere optimă și o acoperire înaltă a ionilor de fragmentare. Spectrul de ioni al produsului reprezintă o sumă de scanări combinate, achiziționate la o energie de coliziune variabilă în intervalul 30-80 eV (Elab). În modul ionilor negativi, proba a furnizat un spectru cu o acoperire mare a intervalului m/z scanat atât în MS, cât și în experimente MS/MS CID. Ionii corespunzători fragmentelor de carbohidrați au fost atribuiți conform nomenclaturii introduse de Domon și Costello [92], în timp ce ionii care au apărut ca o consecință a fragmentării ceramidelor au fost desemnați în acord cu nomenclatura stabilită de Ann și Adams [272]. Infuzia prin NanoESIchip a fost realizată utilizând un robot NanoMate 400 complet automatizat care încorporează tehnologia ESI Chip (Advion BioSciences, Ithaca, SUA). Robotul NanoMate a fost montat pe spectrometrul de masă QTOF, cu ajutorul unui suport comercial produs de Advion BioSciences. Acesta a fost controlat și manipulat de software-ul ChipSoft 8.1.1 care funcționează sub sistemul Windows. Pentru obținerea unui transfer optim al speciei ionice în MS, alinierea fină a cipului de electrospray în raport cu conul de eșantionare a fost realizată utilizând programul ChipSoft. Pentru a preveni orice contaminare, pentru toate experimentele a fost utilizată o placă de microtitrare acoperită cu sticlă. Cinci probe din soluțiile de lucru au fost încărcate pe placa cu 96 de godeuri. Robotul a fost programat să aspire întregul volum de probă, urmat de 2 μL de aer în vârful pipetei, pentru a preveni scurgerea eșantionului în timpul manipulării și apoi a livra mostra pe partea de intrare a microcipului. Fiecare orificiu (nozzle) are un diametru interior de 2,5 μm și în condițiile date a asiguratt un debit de circa 70 nL/min. Procesul NanoESI a fost inițiat prin aplicarea tensiunilor între 1,3-1,9 kV, o presiune de 0,3-0,8 psi iar tensiunea conului s-a situat în intervalul 30-60 V. După inițierea pulverizării, parametri de infuzie, cum ar fi tensiunea la vârful pipetei, tensiunea conului și debitul gazului de desolvare au fost optimizate în intervalele specificate pentru a spori pulverizarea stabilă, descompunerea adecvată a clusterelor analit/solvent, generarea de ioni multiplu încărcați și minimizarea fragmentării în sursă a reziduurilor instabile de Neu5Ac. După infuzarea probei și analiza MS, vârful pipetei a fost evacuat iar pentru fiecare probă s-a folosit un vârf și un orificiu nou, prevenind astfel orice contaminare încrucișată. Deviația masei moleculare nu depășește 20 ppm (părți per million), care este în intervalul normal pentru acest tip de instrument de o înaltă rezoluție și acuratețe.

4.2.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM

Ionii detectați, împreună cu atribuirea lor structurală pot fi observați în figura 21 și sunt enumerați în tabelul 6. Identificarea structurilor a fost efectuată prin calculul masei și pe baza cunoștințelor dobândite anterior despre acest tip de molecule și respectând căile de biosinteză.

Figura 21 . Spectrul de masa (-) nanoESI chip-QTOF MS al amestecului de gangliozide extrase din maningiomul angioblastic. Solvent: MeOH; concentrația probei 2 pmol /μL; timp de achiziție: 2 min; tensiunea pe capilar: 30-60 V [4]

Tabelul 6. Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectate în amestecul de gangliozide extrase din țesut de meningiom; d, baza dihidroxi sfingoidă; t, baza trihidroxi sfingoidă

Așadar, în urma screeningului MS s-a obținut un model bogat de ioni moleculari, demonstrând prezența unui număr mare și o diversitate neașteptată de glicoforme, unele din acestea continand ceramide mai puțin obișnuite pentru anumite componente. 33 de specii de gangliozide, au fost identificate, mai mult decât cele raportate până acum la alte cazuri de meningiom (Fig. 22). Evident, setul optimizat de condiții experimentale a permis detectarea gangliozidelor cu un grad ridicat de sensibilitate, fără a compromite ionizarea componentelor minore. Mai mult decât atât, este clar că folosind nanoESIchip MS, pierderea de ioni în sursă a fost evitată și timpul de screening MS a fost redus semnificativ. O altă caracteristică interesantă este expresia exclusivă a gangliozidelor cu lanțuri carbohidrate mai scurte, în special a celor cu conținut redus de acid sialic; NanoESIchip-QTOF MS nu a furnizat dovezi privind gangliozidele cu un grad crescut de sialilare (>2). Cu excepția GD2 identificat prin HPTLC, s-au detectat toate fracțunile indicate prin această metodă. În plus, a fost identificată și clasa GM4, care nu a fost obtinuta prin HPTLC. Conform valorilor m/z, toate speciile de gangliozide prezintă baze cu catenă lungă (LCBs) cu 18 atomi de carbon, în timp ce lungimea acidului gras variază de la C11 (pentru speciile asialo gangliozide) până la C25. Așa cum a fost anticipat, cel mai mare număr de ioni și câteva semnale, cum ar fi cele la m/z 1149.99, 1233.93 și 1261.91, care sunt printre cele mai intense din spectru, aparțin grupului GM3. Nouă ioni diferiti au fost atribuiti variantelor GM3; șase dintre aceștia au baze dihidroxi și trei baze sfingoide saturate trihidroxi și acizi grași cu C16, C18, C22 și C24 în ceramidele lor.

Figura 22. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut cerebral cu meningiom

Un consens similar între proporția mare de fracțiuni detectate de HPTLC și numărul speciilor exprimate este documentat și pentru GD1. S-au identificat structural șase gangliozide de tip GD1 care prezintă diferite structuri Cer. Surprinzător, nanoESIchip MS a dezvăluit o mare diversitate de glicoforme GM1 în țesutul de meningiom analizat. GM1 (d18:1/24:1) și/sau GM1 (d18:0/24:2) detectati ca [M-H]- la m/z 1626,23 și GM1 (d18:1/24:0) detectat ca [M-H]- la m/z 1628,22 au prezentat cea mai mare abundență în ceea ce privește ionizarea. De intensitate considerabilă sunt, de asemenea, semnalele la m/z 1598,40 corespunzătoare GM1 (d18:1/22:1), precum si cele de la m/z 1570,45 și m/z 1640,35 atribuite GM1 (d18:1/20:1) și GM1:1/25:1). În total, opt picuri care corespund la nouă structuri GM1 au fost identificate prin determinarea precisă a masei. Aceste constatări indică faptul că deși comparativ cu controlul ales, proporția globală a grupului GM1 este redusă drastic, diversitatea formelor GM1 exprimate este mai mare decât se aștepta. O discrepanță similară între proporția fracțiunii și numărul speciilor identificate este vizibilă și pentru clasa GM4. Această specie fiind în cantitate foarte mică nu a putut fi detectată prin HPTLC. Pe de altă parte, analiza MS a evidențiat cinci componente neutre de glicosfingolipide (asialo): patru specii LacCer care diferă prin compoziția ceramidelor și o specie GA2, toate vizibile în spectru ca ioni abundenți din punct de vedere al ionizării în intervalul (880-1050) m/z. Deși analiza HPTLC a indicat faptul că anumite gangliozide migrează în vecinătatea GD2, MS nu le-a confirmat prezența. Acest aspect necesită o clarificare suplimentară deoarece glicoformele GD2, care apar în creierul uman sănătos, au fost găsite și în gliosarcom [130], hemangiom [3] și metastază cerebrală a adenocarcinomului pulmonar, care va fi prezentat pe larg în subcapitolul următor [5].

4.2.4. SCREENINGUL MS/MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM

MS/MS s-a concentrat pe ionii cei mai abundenți, considerați de interes. Conform calculului de masă, compozițiile cele mai probabile ale ionilor la m/z 1626,23 și m/z 1628,22 sunt GM1 (d18:1/24:1) sau GM1 (d18:0/24:2) și GM1 (d18:1/24:0). Având în vedere valorile lor m/z apropiate, ionii la m/z 1626,23 și 1628,22 au fost izolați simultan în celula de coliziune prin setarea parametrilor de izolare HM și LM la 8 și, respectiv, 8. Spectrul ionilor de fragmentare este prezentat în figura 23 A, B și C.

Figura 23 A. Spectrul de masă (-)nanoESIchip-QTOF CID MS/MS al ionilor [M-H]− cu m/z 1626,23 și m/z 1628,22 detectați în amestecul nativ de gangliozide din meningiomul angioblastic, izolați și fragmentați simultan: m/z(60-660). Inserată: Schema de fragmentare a izomerului GM1b. Timp de achiziție 2 min; energie de coliziune 30-80 eV (Elab). Denumirea fragmentelor carbohidrate și ceramidelor este realizată conform nomenclaturii publicate [32] și [33]; ionii de fragmentare de diagnostic Y * și Z * pentru GM1(d18:1/24:1), ionii de fragmentare de diagnostic Y # și Z # pentru GM1 (d18:1/24:0); N.a., neatribuit [4]

Figura 23 B. Spectrul de masa (-)nanoESIchip-QTOF CID MS/MS al ionilor [M-H]− cu m/z 1626,23 și m/z 1628,22 detectati în amestecul naiv de gangliozide din meningiomul angioblastic, izolati și fragmentati simultan: m/z (680-1100). Timp de achiziție 2 min; energie de coliziune 30-80 eV (Elab) [4]

Figura 23 C.Spectrul de masă (-)nanoESIchip-QTOF CIDMS/MS al ionilor [M-H]− cu m/z 1626,23 și m/z 1628,22 detectati în amestecul nativ de gangliozide din meningiomul angioblastic, izolați și fragmentați simultan: m/z (1100-1700). Inserată: Schema de fragmentare a izomerului GM1a. Timp de achiziție 2 min; energie de coliziune 30-80 eV (Elab). Denumirea fragmentelor carbohidrate obținute și ceramidelor s-a facut conform nomenclaturii publicate [32] și [33]; ionii de fragmentare cu rol diagnostic Y * și Z * pentru GM1(d18:1/24:1), ionii de fragmentare cu rol diagnostic Y # și Z # pentru GM1 (d18:1/24:0); N.a., nealocat [4]

După cum se observă în spectrul din figura 23 pentru ambele specii, s-au generat ionii de fragmentare sialilați care sunt diagnostici pentru apariția izomerului GM1b. Astfel, ionii la m/z 1261,27 și m/z 1263,84 corespund fragmentelor Y2* și respectiv Y2#. Ei au o compoziție generală de Neu5AcGalGlcCer- și sunt caracteristici pentru locația Neu5Ac la galactoza internă. Totodată, pe lângă ionii rezultați în urma fragmentării scheletului zaharidic, s-au observat semnale care indică scindări interne ale ambelor ceramide. Aceste rezultate sunt compatibile cu o structură a izomerului GM1b (Fig. 23 A) pentru ambele specii fragmentate. În urma CID MS/MS s-a obținut un număr crescut de ioni de fragmentare utili pentru stabilirea secvenței monozaharidelor din ambele monosialotetraoze, precum și pentru caracterizarea părților lipidice. Pentru a distinge ionii Y și Z care conțin un aglicon diferit (Cer), se notează cu (#) pentru GM1 (d18:1/24:0) și cu (*) pentru GM1 (d18:1/24:0) sau GM1 (d18:0/24:2). Acești ioni au fost ușor de recunoscut datorită diferenței de 2u în masa lor. Este necesar a se sublinia faptul că energie de coliziune a fost ajustata astfel încat s-a reușit să se prevină desialilarea exhaustivă, care, datorită labilității Neu5Ac, apare în majoritatea experimentelor CID. Datorită simetriei lanțului Gal-GalNAc-Gal (Fig. ), prezența structurii GM1a nu a putut fi confirmată prin ioni de diagnostic specifici. Cu toate acestea, având în vedere incidența ridicată a GM1a în tumorile cerebrale și în creierul sănătos, prezența acestui izomer nu poate fi exclusă și este probabil prezent și în meningiom.

Figura 24 A și B.Schemele de fragmentare ale: (A) Cer (d18:1/24: 1) și (B) Cer (d18:1/24:0). Denumirea ionilor de fragmentare este în conformitate cu nomenclatura publicata [33], [4]

Ionii cu m/z 238,43 și 263,28 corespund fragmentelor de tip P și respectiv Q caracteristice pentru baza sfingoidă (d18:1) (Fig. 24 A și B). Deoarece nu s-au găsit semnale care să susțină o bază sfingoidă diferită, există o mare probabilitate ca cele două fragmente Cer să prezinte LCB-uri identice (d18:1). Ionii la m/z 350,13 și m/z 390,04 sunt diagnostici pentru un acid gras saturat C24 și corespund ionilor de fragmentare V# și, respectiv, T# (Fig. 24 B). Acești ioni sunt însoțiți de semnale la valori m/z mai mari de 2u, 348,21 și 388,12, provenind de la un acid gras mononesaturat C24 ca ioni de fragmentare V* și T* (fig. 4A). În consecință, specia GM1 la m/z 1626.23 este mult mai probabil să aibă structura ceramidei (d18:1/24:1).

4.2.4. CONCLUZII DE ETAPĂ

În aceast studiu s-a efectuat o investigație detaliată a compoziției gangliozidelor urmată de analiza prin fragmentare a speciilor individuale într-o probă de țesut cerebral cu meningiom utilizând o metodă avansată de MS bazată pe nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS, paltformă dezvoltat în laboratorul nostru. Analizele HPTLC și densitometrice au fost utilizate în mod complementar pentru a detecta profilul fracției gangliozidelor și pentru a evalua din punct de vedere cantitativ proporțiile acestora în meningiom. HPTLC și densitometria au indicat faptul că, cantitatea de gangliozide din această tumoră este de aproximativ 20 de ori mai mică decât în țesutul cerebral sănătos raportat anterior de noi. Deși profilul HPTLC a relevat doar șase fracții majore, MS nanoESIchip-QTOF a furnizat date despre 34 de specii diferite de gangliozide, numărul total de structuri identificate în acest eșantion particular de meningiom fiind semnificativ mai mare decât cel raportat anterior pentru meningioame. În comparație cu alte tumori, structurile identificate prezintă lanțuri oligozaharidice mai scurte, cu un grad de sialilare de până la doi. În meningiomul supus analizelor MS, nu s-au descoperit modificări de tip O-fucozilare, O-acetilare sau O-GalNAc utilizând MS chip-nanoESI așa cum s-au găsit în alte tumori cerebrale [130,3,5] sau în creiere afectate de tulburări neurodegenerative [6, 35 din meningiom]. În mod remarcabil, nanoESIchip MS a evidențiat faptul că, în ciuda procentului redus a fracțiunii GM1, un număr de opt ioni au rezultat prin fragmentarea a nouă glicoforme GM1. Pentru a elucida structura celor mai abundenti ioni, care, conform calculului de masă, corespund GM1 (d18:1/24:1) și GM1 (d18:1 /24:0) s-a efectuat fragmentarea simultană a acestor ioni prin CID MS/MS. Datele obținute au arătat că pentru fiecare GM1 (d18:1/24:1) și GM1 (d18:1/24:0), atât izomerii a cât și izomerii b sunt exprimați în meningiom. Aceste constatări legate de GM1 sugerează că, în afară de aceasta, speciile GM3 sunt în general recunoscute ca un marker incontestabil pentru acest tip de tumori. Cu atât mai mult, rolul GM1 justifică explorarea și examinarea lor în continuare din această privință. În plus, implicarea din punct de vedere fiziologic a variabilității relativ ridicate a structurilor ceramidei rămâne un aspect deschis dezbaterii și investigării. Din punct de vedere metodologic, acest studiu preliminar efectuat folosind un singur specimen de meningiom a demonstrat că nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS este metoda de elecție pentru analiza amestecurilor complexe de gangliozide extrase din acest tip de tumori. Rezultatele obținute ilustrează avantajele MS bazate pe microfluidica ultra-sensibilă în obținerea unei viziuni mai realiste a expresiei gangliozidelor din tumorile cerebrale, precum și în descoperirea de structuri minore care pot fi relevante ca biomarkeri și/sau ținte specific tumorale. Considerăm că acest concept general introdus aici va servi în mod benefic studiilor viitoare privind implementarea nanoESIchip MS pentru descoperirea biomarkerilor gangliozidici și detectarea timpurie a acestui tip de tumoră.

4.3. STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL METASTAZEI CEREBRALE A ADENOCARCINOMULUI PULMONAR, COMPARATIV CU ȚESUTUL CEREBRAL SĂNĂTOS, DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL PRIN CHIP NANOESI QTOF MS

4.3.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

Adenocarcinomul este o formă histologică comună a cancerului pulmonar care conține anumite caracteristici distincte ale țesutului malign din punct de vedere arhitectural, citologic sau molecular [273]. Carcinomul pulmonar cu celule mari, cea mai frecventă cauză a deceselor provocate de cancer în multe țări, prezintă un risc crescut de metastazare cerebrală atingând un procent de aproximativ la 44% din cazuri [274]. În comparație cu alte tipuri de cancer primar, unde răspândirea la distanță este de obicei o complicație ulterioară, cancerul pulmonar dezvoltă metastaze intracraniene relativ timpuriu și este adesea însoțit de simptome neurologice încă de la primul diagnostic [275].

Plecând de la aceste premize, cercetarea personală își propune să realizeze următoarele obiective:

Funcționalizarea platformei analitice bazată pe MS în vederea analizei compoziționale și structurale a expresiei gangliozidelor în metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonary (metaADK) versus țesut cerebral sănatos;

Cartografierea gangliozidelor extase din metaADK comparativ cu țesut sănătos;

Analiza statistică a datelor obținute și interpretarea rezultatelor

La trei ani după operația de eliminare a tumorii primare pulmonare, un pacient de sex masculin (73 de ani) prezintă simptome neurologice, cum ar fi dureri de cap în zona occipitală, amețeli, greață și coordonare defectuoasă. Prin tomografie computerizată a fost detectată o formațiune hiperdensă având dimensiunile estimate 40 × 40 × 20 mm în vermisul cerebelar. Îndepărtarea neurochirurgicală a masei tumorale și examinarea histopatologică a țesutului tumoral (Departamentul de Neurochirurgie, Spitalul Universitar, Zagreb, Croația) a evidențiat structuri glandulare și papilare căptușite cu celule epiteliale coloidale anaplazice, multe dintre ele manifestând activitate mitotică. Aceste constatări au confirmat diagnosticul de metastază cerebrală a adenocarcinomului pulmonar. Proba de cerebel uman sănătos care a servit drept control (bărbat de 79 de ani) a fost prelevat în timpul necropsiei de la un pacient decedat, fără patologii cerebrale. Aceasta a fost obținută de la Departamentul de Medicină Legală, Facultatea de Medicină, Universitatea din Zagreb, Croația. Probele de țesut utilizate pentru analizele biochimice au fost cântărite și depozitate la -20°C după îndepărtarea atentă a vaselor de sânge și a elementelor necrotice. Ulterior pregătirii probelor (extragerea și purificarea gangliozidelor) aceste sunt supuse analizei compoziționale și structurale prin Chip-NanoESI QTOF MS.

4.3.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE

Amestecurile de gangliozide izolate și purificate din metastazele cerebrale ale adenocarcinomului pulmonar și ale țesutului cerebral normal au fost analizate comparativ. Absorbanțele probelor și Neu5Ac utilizate ca standard într-o gamă de concentrații cunoscute au fost determinate la 580 nm; concentrațiile acidului sialic legat de gangliozide (GG-SA) au fost exprimate în micrograme GG-SA pe gram de țesut proaspăt. Analiza calitativă a fost efectuată prin separarea HPTLC a fracțiilor de gangliozide individuale pe plăcile HPTLC de sticlă (silicagel 60, 0,2 mm, 10 x 10 cm, Merck, Germania). Plăcile au fost introduse într-un sistem de solvenți conținând cloroform, metanol și soluție apoasă de CaCI2 (58: 40: 9, în raport volumetric). După uscare, placa a fost pulverizată cu reactiv resorcinolic și încălzită timp de 30-45 minute până când fracțiunile gangliozidice au apărut ca benzi albastre. În cele din urmă, fracțiile gangliozidice separate și vizualizate HPTLC au fost supuse scanării densitometrice (LKB 2202 Laser Ultrascan, LKB, Bromma, Suedia) la 580 nm, așa cum s-a descris anterior [276], permițând o cuantificare relativă a fracțiilor gangliozidice individuale, exprimată ca proporție relativă %) intr-o probă. MS a fost efectuată pe un spectrometru QTOF Micromass (Waters, Manchester, UK). Acesta este conectat la un calculator care rulează software-ul MassLynx pentru a controla instrumentul, achiziționa și procesa datele MS. Pentru toate achizițiile, instrumentul a fost reglat pentru înregistrarea datelor la o viteză de scanare de 2,1 scanări/s. Toate spectrele de masă au fost obținute în modul ionilor negativi, deoarece glicolipidele sialilate, cum ar fi gangliozidele, prezintă o ionizare crescută în acest mod de operare. Pentru o ionizare eficientă și o fragmentare minimă în sursă, tensiunea conului variază în intervalul 40-50 V. Pentru toate experimentele, debitul gazului de desolvatare a fost reglat în limita a 50 L/h în timp ce temperatura sursei de ioni a fost stabilită la 100°C și păstrate la această valoare în timpul întregului experiment. Tandemul MS/MS a fost efectuat prin CID la energii joase folosind argon ca gaz de coliziune. Pentru izolarea ionică, parametrii LM și HM au fost setați ambii la valoarea 10. Aceste valori au oferit un compromis corect între izolarea ionilor precursori și sensibilitatea la măsurare. Energia de coliziune și presiunea gazului au fost reajustate de mai multe ori în timpul experimentului MS/MS în curs de desfășurare pentru a induce o fragmentare optimă a speciilor de gangliozide. Spectrele ionilor de fragmentare obtinuți la o energie de coliziune variabilă într-o gamă de 40-70 eV (Elab). Toate spectrele de masă au fost calibrate folosind ca si calibrator un amestec nativ disponibil din comerț de gangliozide cerebrale bovine "Cronassial", de la Fidia Research Laboratories (Abano Terme, Italia). Proba comerciala standard a furnizat, prin tehnica de detectie a ionilor negativi, un spectru cu o acoperire ionică echitabilă a intervalului m/z scanat în atat in experimentele MS cât și CID MS/MS. Ionii fragmentelor de carbohidrați au fost atribuite conform nomenclaturii introduse de Domon și Costello [92], în timp ce ionii corespunzători fragmentării ceramidei au fost desemnați în acord cu nomenclatura Ann și Adams [272]. Infuzia prin Chip-nanoESI complet automatizat a fost efectuată pe un robot Nano-Mate 400 care încorporează tehnologia cu cip ESI (Advion BioSciences, Ithaca, NY, SUA) montat pe spectrometrul de masă QTOF. Robotul a fost controlat și manipulat de software-ul ChipSoft care funcționează în sistem Windows.

În urma analizei calitative prin HPTLC a probelor extrase se observa migrarea fractiunilor GM3, GM2 GT1b, GD1b, GD2, GD3 și GM1. Fracțiunea minoră suplimentară X1 cu proprietăți migratorii TLC a structurii monosialo-GG a fost observată numai prin scanare densitometrică (Figura 25).

Figura 25 a, b, c. Cromatografie în strat subțire de înaltă performanță a gangliozidelor extrase din (a) țesutul cerebral sănătos și (b) metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar; (C) cuantificarea densitometrică a fracțiilor de gangliozide din metastaza cerebrală a adenocarcinomului [5]

Proporțiile fracțiunilor gangliozidice individuale separate prin HPTLC, care s-au cuantificat prin analiza densitometrică, prezinta în mare măsură diferente între metastazele cerebrale (tabelul 1) și țesutul cerebral sanatos [263]. În proba obținută din metastazele cerebrale, fracția gangliozidică cu proprietăți de migrare corespunzatoare fracției GM3 a fost cea mai importantă, reprezentând 52,27% din conținutul total de gangliozide urmat de GM2 cu 34,81%, în timp ce proporțiile structurilor mai complexe (GM1, GD1a, GD1b, Și GT1b) au fost mai mici comparativ cu țesutul cerebral sanatos. Profilul caracteristic al gangliozidelor având GM3 și GM2 ca cele mai abundente fracțiuni seamănă profilele gangliozidelor din țesutul pulmonar sănătos și ale adenocarcinomului pulmonar, după cum s-a raportat anterior [277].

4.3.3. SCREENINGUL MS1 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL

Amestecurile de gangliozide native purificate și extrase din metastaza cerebrală de adenocarcinom pulmonar localizat în cerebel și din țesutul cerebral sanatos au fost supuse screeningului nanoESI QTOF MS utilizand conditii și parametri instrumentali identici. Fiecare spectru de masă a reprezentat suma a 20 de scanări, obținute în numai 1 minut.

Spectrele de masă obținute sunt prezentate în figurile 26 și respectiv 28, în timp ce ionii moleculari ai gangliozidelor detectați sunt enumerați în tabelele 7 și 8, împreună cu desemnarea structurală a acestora. În timp ce în spectrul de masa din proba de metastază cerebrală sunt prezenți numai ioni simplu încărcați, profilul MS al extractului gangliozidelor din proba de tesut cerebral sanatos este caracterizata prin prezența ionilor simplu, dublu și chiar triplu încărcați. Analiza comparativă a spectrelor din figurile 26 și 28, obținute în condiții experimentale identice, a evidențiat o diferență considerabilă în ceea ce privește numărul și tipul structurilor gangliozidice exprimate în metastazele cerebrale (Tab. 7) față de țesutul cerebral sănătos (Tab. 8)

Figura 26. Spectrul de masă (-) Chip-nanoESI QTOF MS al amestecului nativ de gangliozide izolate din metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar. Solvent: MeOH; Concentrația probei 2,5 pmol/μL; Timp de achiziție 1 min; Chip ESI: 1,5 kV; Tensiunea conului: 45 V [5]

Tabelul 7. Principalele specii de gangliozide și asialogangliozide extrse din proba de metastază cerebrală a unui adenocarcinom pulmonar, detectate prin analiza (−)chip-nanoESI QTOF MS a amestecului nativ complex

În contrast cu țesutul cerebral sănătos, în amestecul gangliozidelor extrase din metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar s-au detectat mai ales specii gangliozidice cu lanțuri oligozaharidice scurte și cu conținut redus de acid sialic. Mai mult de jumătate din totalul de 59 de ioni diferiți detectați și corespunzând celor 125 de structuri posibile din țesutul metastatic cerebral, reprezintă specii monosalilate de tip GM1, GM2, GM3 și GM4. Pe lângă numărul mare de componente monosalilate, sunt prezente opt specii asialo de tip GA1 și GA2 avand ceramide cu structură variabilă. GD1, GD2 și GD3, precum și GT1, GT2 și GT3 cu catene scurte de carbohidrati, care conțin diferite tipuri de ceramidă au fost de asemenea identificate în amestec.

Componentele gangliozidice modificate prin fucozilare sau O-acetilare au fost totodată detectate, dar ăn proporții diferite față de cele din țesutul cerebral sănătos; majoritatea gangliozidelor O-acetilate sunt specii monosialilate de GM3, precum și trisialilate GT3- și tip GT2- toate având lanțuri carbohidrate scurte, în timp ce structurile modificate prin fucozilare sunt specii monosialilate de tip GM3 și GM4, disialilate și trisialilate GD1 și GT3 care prezintă în structurile ceramidei heterogenitate mare.

Cei mai abundenți ionii simplu încarcați cu m/z 1150,17; 1168,01; 1515,29 și 1627,41 sunt atribuiți structurilor GA2(d18:0/22:0) sau GM3(d18:1/16:1); GM3(t18:0/16:0), ionul sodiat GD3 cu ceramida (d18:1/18:0) sau (d18:0/18:1); GM1 cu ceramida (d18:1/16:1) sau (d18:0/16:2) sau (d18:2/16:0); O-Ac-GD3(d18:0/18:0) și GD3 sodiat cu ceramida (d18:1/26:0) sau (d18:0/26:1); GM1 cu ceramida (d18:0/24:2) sau (d18:1/24:1) sau (d18:2/24:0).

Figura 27. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut cerebral cu metastază a adenocarrcinomului pulmonar

Figura 28. Spectrul de masă (-) Chip-nanoESI QTOF MS al amestecului nativ de gangliozide izolate din proba de cerebel sănătos. Solvent: MeOH; Concentrația probei 2,5 pmol/μL; Timp de achiziție 1 min; Chip ESI: 1,5 kV; Tensiunea pe capilar: 45 V [5]

Tabelul 8. Principalele specii de gangliozide și asialogangliozide extrse din proba de cerebel sănătos, detectate prin analiza (−)chip-nanoESI QTOF MS a amestecului nativ complex

S-a descoperit că țesutul cerebral sănătos conține o varietate mai mare de structuri gangliozidice care diferă prin gradul lor de sialilare, de la catene scurte, monosalilate (GM) la catene lungi de carbohidrați polisialilate (GH) și de asemenea lanțuri de gangliozide modificate cu O-acetil (O-Ac) si fucozil (Fuc) atașat. Speciile GM1 cu ceramida (d18:1/18:0) sau (d18:0/18:1), GM1 cu ceramida (d18:1/20:0) sau GM1(d18:0/20:1) si Fuc-GM1(d18:1/18:0) au fost detectati ca ioni abundenți simplu încărcați la m/z 1544,92, 1572,92 și, respectiv, 1690,95. Pe lângă aceste specii, ionii dublu încărcați foarte abundenți observați la m/z 917,44 și 931,45 sunt alocați structurilor GD1 disialilate cu ceramida (d18:1/18:0) sau (d18:0/18:1) și cu ceramida (d18:1/20:0) sau (d18:0/20:1). Aparent, proba de țesut cerebral sănătos este dominată de structuri mono-, di- și trisialilate. Astfel, 28 de semnale m/z distincte corespund celor 44 de specii posibile de tip GM, 44 de semnale m/z corespund la 63 de specii posibile de tip GD, iar 32 semnale m/z sunt atribuite la 59 de specii de tip GT (Fig. 29). Majoritatea acestor structuri au un nucleu tetrazaharidic și prezintă o heterogenitate ridicată în porțiunea de ceramidă. În plus, pot fi detectate șase posibile structuri tetrasialilate (GQ) și o singură specie asialo (GA). Se remarcă prezența unei specii GH2 hexasialilate având constitutia ceramidei (d18:0/24:1) sau (d18:1/24:0). Această specie a fost detectată ca [M-3H]3- la m/z 968,34 și nu s-a regăsit în proba de țesut patologic. S-au identificat și 18 specii de gangliozide modificate prin fucozilare, precum și 30 de variante posibile de gangliozide O-acetilate. Majoritatea structurilor fucozilate sunt de tip GM1 și GD1 cu compoziții diferite de acid gras și/sau bază sfingoidă în structura ceramidei. Spre deosebire de fucozilare, O-acetilarea a fost identificată pentru o varietate mai mare de glicoforme precum GM3, GM1, GD3, GD2, GD1, GT3, GT2, GT1 și GQ1, care diferă nu numai prin compoziția lanțului oligozaharid, ci și prin statusul lor de sialilare. Interesant este faptul că s-au detectat, de asemenea, patru variante posibile de specii modificate prin di-O-Ac. Acestea aparțin tipurilor GT2, GM1 și GM3.

Figura 29. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut cerebral sănătos

4.3.4. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI GD3 (D18:1/18:0) ASOCIATĂ CU METASTAZA CEREBRALĂ A ADENOCARCINOMULUI PULMONAR

Pentru a obține o caracterizare structurală completă a speciei GD3(d18:1/18:0) asociată cu metastazele cerebrale ale adenocarcinomului pulmonar, specia monodeprotonată de la m/z 1471,29 poate fi atribuită în urma calculului de masă la GD3(d18:1/18:0). Aceasta a fost izolată și supusă fragmentării utilizând CID la energii joase. Rezultatele MS/MS obținute sunt prezentate în figura 30, împreună cu o schemă care prezintă calea de fragmentare a ionilor precursori. Tehnica chip-nanoESI MS/MS a fost capabilă să ofere ioni de fragmentare utili pentru o desemnare exactă a întregii secvențe de carbohidrați a speciilor disialilate, precum și pentru caracterizarea structurală a porțiunii de ceramidă. Pierderea unui Neu5Ac terminal este evidențiată de prezența ionului de fragmentare Y3 abundent la m/z 1178,69 însoțit de forma corespunzătoare Z3 deshidratată la m/z 1160,67 și Y3-/CO2 la m/z 1134,62. Monodesialilarea ulterioară este documentată de fragmentul asialo Y2 la m/z 888,19 și de asemenea B1- (Neu5Ac-) la m/z 290,16, B2- (Neu5Ac2-) la m/z 581,24, B2-/CO2 la m/z 537,21, B2-/CO2/H2O la m/z 519,20 și C2- la m/z 599,26. Scindarea porțiunii de ceramidă a generat ionul Y0 simplu încărcat la m/z 564,00. Acest ion fragment împreună cu ionii simplu încărcați: Y1- la m/z 726,51 (GlcCer), contrapartea lui deshidratată Z1- la m/z 708,45, Y2- la m/z 888,45 (GalGlcCer) B3-/CO2 la m/z 700,26 și C3-/CO2 la m/z 717,22 caracterizează secvența de carbohidrați și confirmă structura ceramidei ca fiind (d18:1/18:0). Această structură a ceramidei este susținută și de ionii de fragmentare derivați din ceramidă la m/z 238,38; 265,40; 266,41; 282,28; 308,32 și 324,28 care pot fi atribuiți ionilor de tip P, Q, V, U, T și S (schema de fragmentare este inserată în figura 30).

Figura 30. Spectrul de masă (-) Chip-nanoESI QTOF MS al ionului simplu încarcat cu m/z 1471,29 care corespunde glicoformei GD3(d18:1/18:0) din amestecului nativ de gangliozide izolate din metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar. Timp de achiziție 1 min Inserat: schemele de fragmentare ale miezului oligozaharidic și porțiunii de ceramidă [5]

4.3.5. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI FUC-GM1 (D18:1/18:0) DIN PROBA DE ȚESUT CEREBRAL SĂNĂTOS

Figura 31 prezintă spectrul de fragmentare al ionului simplu încărcat cu m/z 1690.95 obținut prin analiza QTOF CID MS/MS, si care, conform calculului de masa, a fost atribuit speciei Fuc-GM1(d18:1/18:0). Pentru determinarea compoziției porțiunii oligozaharidice și a celei ceramidice, precum și pentru colectarea datelor specifice după determinarea situsului de atașare al Neu5Ac și Fuc, condițiile MS/MS au fost optimizate pentru a furniza cât mai multi ioni posibili. În consecință, spectrele din figura 31 prezintă un număr mare de ioni. Astfel, ionul Y1- corespunzător m/z 726,46 și omologul său deshidratat Z1- corespunzător m/z 708,47, Y2α- corespunzător m/z 1325,81 și Y3α- corespunzător m/z 1382,97 împreună cu Z3α- corespunzător m/z 1364,87 obținut după eliminarea apei corespunde structurii Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer-. Inevitabil, acești ioni abundenți sunt însoțiți de ionii derivați prin pierderea uneia sau a ambelor atașamente labile ale Fuc și Neu5Ac. Cu toate acestea, o comparație cu modelul de fragmentare al GM1(d18:1/18:0) din tesutul cerebral sanatos, obținut anterior [278] pe un instrument QTOF MS în condiții CID similare, indică faptul că în spectrul din figura 31 un număr de ioni deplasați cu Δm = 146u (masa restului de Fuc), sunt diagnostici pentru fucozilare. Gruparea Fuc atașată la galactoza internă (așa cum se observă în figura 32) a fost identificata și bine documentată de fragmentul Y3α- cu m/z 1382,97 și contrapartea lui deshidratată Z3α- corespunzător m/z 1364,87, Y2α- corespunzător m/z 1325,81, Y3α-/Y1β- corespunzător m/z 1091,80 care susțin secvența Gal-NAc-Gal(Fuc)-Glc-Cer- (d18:1/18:0) și Z3α- /Y1β- complement corespunzător m/z 1073,77. Atașamentul Fuc la galactoza internă este rezultatul acțiunii α1-2 sau α1-6 fucoziltransferazei [279]. S-au găsit, de asemenea, un număr de ioni de fragmentare diagnostici pentru localizarea fragmentului Neu5Ac legat la galactoza interna a scheletului oligozaharidic al monosialotetraozei legată de Cer (d18:1/18:0). Acestia sunt: Y2α- corespunzător m/z 1325,81 care susține secvența Neu5Ac-Gal(Fuc)-Glc-Cer- (d18:1/18:0), Y2α-/Y1γ- corespunzător m/z 1179,85 care susține secvența Neu5Ac-Gal-Glc-Cer (d18:1/18:0) împreună cu echivalentul său deshidratat Z2α-/Y1γ- corespunzător m/z 1161,83; Y3α- corespunzător m/z 1382.97, GalNAc -Gal(Fuc)(Neu5Ac)-Glc-Cer- (d18:1/18:0) împreună cu echivalentul său deshidratat Z3α- corespunzător m/z 1364,87. Aceste date oferă dovezi solide privind prezența izomerului structural GM1a în țesutul cerebral sănătos (Fig. 32). Pe lângă caracterizarea completă a secvenței oligozaharidice a moleculei GM1 și identificarea izomerului structural GM1a, fragmentarea MS/MS a furnizat date despre constituția (d18:1/18:0) a ceramidei, care este direct susținută de ionii Y0 și Z0 detectați la m/z 564,16 și, respectiv la m/z 546,06, precum și de prezența ionilor P, Q, V, U, T și S (schema de fragmentare corespunzatoare este inserată în figura 30).

Figura 31. Spectrul de masă (−)Chip-nanoESI QTOF CID MS/MS al ionului simplu încarcat cu m/z 1690,95 care corespunde structurii Fuc-GM1(d18:1/18:0) extras din țesutul cerebral sănătos [5]

Figura 32. Schema de fragmentare prin CID MS/MS a gangliozidei Fuc-GM1(d18:1/18:0) extrasă din țesutul cerebral sănătos [5]

4.3.6. CONCLUZII DE ETAPĂ

Combinând o metodă MS de înaltă performanță bazată pe chip-nanoESI cu HPTLC și scanare densitometrică, abordarea prezentă a permis detectarea și identificarea structurală a 125 de specii gangliozidice distincte posibile în metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar, precum și caracterizarea structurala a unei singure gangliozide din amestecul nativ complex. Analiza cromatografică și densitometrică a indicat o scădere de 14 ori a conținutului total de gangliozide în metastaza cerebrală față de tesutul cerebral sănătos analizat pentru comparatie. Compoziția gangliozidelor din proba de metastază cerebrala s-a dovedit a fi foarte modificată în comparație cu compoziția tesutului cerebral sănătos. Astfel, abundențele relative ale fracțiunilor GM3 și GM2 au fost mai mari de 22,5 și respectiv 5,5 ori, în timp ce fracțiunile GM1, GD1b și GT1b au prezentat abundențe relativ scăzute de 25,5, 17 și respectiv de 2,1 ori mai mici. Aceste rezultate sunt în concordanță cu datele din literatură care arată că GM3 a fost principala componentă a gangliozidelor în toate tumorile metastatice ale creierului uman de diferite origini precum si faptul ca procentul redus al gangliozidelor complexe, adică GM1, GD1b, GD1a și GT1b este comun pentru multe tipuri de celule transformate malign, în special pentru celulele tumorale metastatice [280]. În condiții experimentale identice, analiza MS a eșantionului de țesut normal față de cel metastatic a relevat, de asemenea, o variație vizibilă a profilului gangliozidelor. În timp ce metastazele cerebrale se caracterizează prin specii de gangliozide cu lanturi oligozaharidice scurte, cu conținut redus de acid sialic și cu prevalența glicoformelor de tip GM, țesutul cerebral sănătos este dominat de structuri mono- până la hexasialilate cu o abundenta mai mare a structurilor de tip GD și GT.

Reducerea conținutului total de gangliozide și a profilului modificat al acestora în metastazele cerebrale față de țesutul sănătos analizat ar putea fi rezultatul a ratei scăzute de biosinteză, datorită modificării expresiei anumitor glicozil și sialiltransferaze. O expresie crescută a sialiltransferazei I (GM3 sintaza) și II (GD3 sintaza) și o expresie redusă a galactoziltransferazei II ar putea, în parte, sa explice abundențele crescute ale GM3 și GD3 și abundențele scăzute ale GM1 și GD1b. Datele MS au indicat prezența în țesutul metastatic a mai multor specii monosialilate neobișnuite modificate prin fucozilare sau O-acetilare cum ar fi Fuc-GM4, Fuc-GM3, di-OAc-GM3 și O-Ac-GM3. Aceste specii au fost raportate anterior ca gangliozide asociate cu creierul fetal, care sunt doar componente minore ale creierului normal [263]. S-a raportat că GD3 (d18:1/18:0) ar putea spori proliferarea celulelor tumorale, invazia și metastazarea într-o varietate de tumori cerebrale, în special în gliom și neuroblastom [281]. GD3 influențează angiogeneza și metastazele tumorale prin stimularea eliberării VEGF din celulele tumorale [282], prin urmare caracterizarea sa structurală este de importanță biologică ridicată. Prin MS în tandem utilizând CID, nucleul oligozaharidic al speciei GD3(d18:1/18:0) asociat cu metastaza cerebrală a fost elucidat structural. În același timp, un număr de ioni de fragmentare ai Cer au permis, de asemenea, postularea compoziției porțiunii lipidice. Condițiile MS/MS optimizate au permis evaluarea structurală a Fuc-GM1(d18:1/18:0) detectată în tesutul sănătos. S-a descoperit că Fuc-GM1(d18:1/18:0) identificată este un izomer atipic care poartă restul labil de Fuc labil la molecula internă de Gal împreună cu un Neu5Ac atașat la aceeași monozaharidă. Cu toate acestea, prezența izomerului cu Fuc atașată la Gal externă a lanțului carbohidrat nu poate fi nici exclusă, nici demonstrată.

Datorită simetriei lanțului oligozaharidic, nu există nicio posibilitate de formare a ionilor de fragmentare diagnostici capabili să susțină fără echivoc atașamentul Fuc la Gal. Prin urmare, prezența acestui izomer nu poate fi exclusă, deși abordarea prezentă a permis o determinare lipsită de ambiguitate a localizării Fuc la Gal internă dezvoltata de platforma NanoMate în combinație cu fragmentarea în mai multe etape (MSn) pentru a se face o diferență între tipurile posibile de legături glicozidice (α-1-2) și (α-1-6). În cele din urmă, trebuie remarcat faptul că chip-nanoESI QTOF MS și CID MS/MS a fost capabil să furnizeze o caracterizare structurală și compozitionala a amestecurilor de gangliozide native din tumori cerebrale secundare, cu o viteză și o sensibilitate de analiză remarcabilă. Din punct de vedere al debitului furnizat de chip-nanoESI, care în condițiile aplicate a fost de aproximativ 100 nL/min, timpul de achiziție de 1 min la o concentrație de probă de numai 2,5 pmol/pL corespunde unui consum de 250 fmol de extract biologic. Astfel, un screening-ul MS urmat de CID MS/MS necesită doar 500 fmoli de material. Din toate aceste motive, platforma bioanalitică prezentată aici pentru determinarea markerilor moleculari de tip GSL din tumorile cerebrale are perspective reale de dezvoltare într-o metodă de rutină, ultrarapidă și sensibilă aplicabilă și altor tipuri de cancer.

4.4. SOFTWARE ORIGINAL GANGLIOBASE DE IDNTRIFICARE A GANAGLIOZIDELOR OBȚINUTE PRIN SCREENING-UL MS

Principiile de funcționare și definirea limbajul de programare C# au fost descrise la capitolul Materiale și metode, subcapitolul Platforme Informatice. În continuare voi prezenta programul GanglioBase, cu variantele sale, modul cum a fost conceput și avantajele funcționării acestuia.

Acest software a fost scris cu ajutorul programului Visual Studio 2013, Versiunea 12.0 și care folosește varianta 4.5.1 de .NET Framework. Microsoft Visual Studio este un mediu de dezvoltare integrat (integrated development environment – IDE) creat de Microsoft. Acesta poate fi folosit pentru a dezvolta aplicații tip consolă și aplicații cu interfață grafică pentru toate platformele suportate de Microsoft Windows (ex. NET Framework, Windows Mobile etc).

Datorită complexității structurale ale gangliozidelor, la o diferență extrem de mică de masă, pot exista mai multe structuri teoretice. Astfel, după generarea de către MS a spectrelor de masă ce conțin ionii detetați dintr-un amestec complex, este dificil și anevoios de calculat și desemnat fiecare structură în parte. Inițial am conceput o bază de date care să cuprindă cât mai multe structuri teoretice posibile respectând formulele, regulile de calcul în funcție de masele atomice ale elementelor componente și nomenclaturile gangliozidelor. În timp, această bază de date a cuprins peste 35000 de specii teoretice distincte, făcând procesul de desemnare și caracterizare a ionilor regasiți puțin mai ușor. Această bază de date pilot a fost alcătuită în Microsoft Office Excel 2003. Totuși, timpul de prelucrare analitică a spectrelor era destul de lung, chiar dacă datorită acestei baze de date desemnarea structurilor erau mai ușor de realizat. Atunci am început să ma documentez și să trasez un concept de aplicație capabilă să ruleze această bază de date nou creată.

Pentru a putea fi utilă, această aplicație trebuia să îndeplinească următoarele funcții: să citească o bază de date cu structuri teroretice, să conțină comanda de selectare a ionului în funcție de masa moleculară dată, să genereze toate variantele teoretice posibile pentru masa dată, cu o marja de eroare de +/- o unitate, să fie compactă și ușor de folosit, codul sursă al aplicației să rămână deschis pentru viitoarele îmbunătățiri, să poată fi instalată pe orice sistem de operare iar rezulatatele generate să fie de încedere. În Visual Studio, limbajul C#, fiecare aplicație nou creată este însoțită de un cod unic, denumit cod sursă. Pentru orice modificare ulterioară a programului, este important ca acest cod să nu fie închis (finalizat).

Figura 33. Print screen al bazei de date Access folosită de program

Figura 33 reprezintă prima bază de date în format Microsoft Office Access și care conținea doar 4 câmpuri și anume: ID-ul sau numărul de ordine al structurii, raportul masa/sarcina m/z, desemnarea ionului molecular și structura propriu zisă. Pe această bază s-a construit prima aplicație denumită generic „Cătălin” și care este prezentată în figura 34.

Figura 34. Print screen al interfațării primei variante de software

După indroducerea de către utilizator masei moleculare experimentale, această variantă a fost capabilă să caute în baza de date prezentată mai sus și să genereze toate variantele teoretice posibile, inclusiv ionul molecular și structura propusă. Pe parcurs, această variantă s-a dovedit utilă, dar doar până la o limită. Dintre minusurile acestei variante se pot aminti următoarele: 1). masa moleculară nu este afișată cu zecimale iar în spectrometria de masă (în special când se folosesc aparate cu rezoluție înaltă gen QTOF sau FTICR) diferențele de ordinul zecimalelor pot fi importante; 2). conținea doar 3 câmpuri, deci complexitatea reuzultatelor generate era redusă; 3). la instalarea acestei variante pe o altă unitate PC/laptop apareau erori de instalare/dezinstalare. Au mai existat 2 variante intermediare ale acestei aplicații dar fiecare cu plusurile și minusurile aferente.

După mai mulți ani de documentări și studiu în domeniul IT, dar și MS, necesitățile apărute în practică ne-au orientat spre varianta la zi a software-ului care îndelpinește cel mai bine cerințele actuale. În primul rând am actualizat baza de date adăugând câmpuri ce conțineau detalii despre starea de încărcare a ionilor (Fig. 33, Fig. 34), afișarea ionilor după tehnica de detectie a ionilor (negativi sau pozitivi) și combinații ale acestora. Pentru atestarea faptului că acest program este unic și original, figura 35 reprezintă un print screen din momentul scrierii programului (al codului sursă a programului).

Figura 35. Print screen din momentul scrierii programului (al codului sursă a programului)

Așa cum se poate observa din figura 36 A și B, principiul de operare al acestei aplicații s-a dorit a fi unul simplu, eficient și care poate fi folosit de rutină. Fiind conceput ca un fișier de tip .exe, după accesarea acestuia se deschide o fereastră de operare, iar utilizatorul poate introduce masa moleculară dorită în unul din cîmpurile libere. În figura 36 A, am încercuit primul câmp pentru a marca spațiul liber destinat introducerii masei moleculare. Pentru a prezenta modul de funcționare, am ales aleator ionul teoretic la m/z 2431 și am apasat butonul “Cauta!”. Programul a generat toate variantele teoretice posibile, cu două zecimale și cu o marjă prestabilită de +/- o unitate. Astfel se poate proceda pentru orice masă moleculară care apare pe spectrul de masă și despre care dorim să aflam detalii structurale.

Figura 36. A. Print screen al interfațării software-ului și exemplificarii modului de operare-1

Un alt exemplu este prezentat în figura 36 B, unde am ales opțiunea de căutare în funcție de starea de încârcare și de modul de ionizare, respectiv doar ion dublu încărcat, tehnica de detectie a ionilor negativi. Astfel am obținut stucturi teoretic posibile de gangliozide cu mase de aproximativ 3000 ceea ce reprezintă ionul de la 1500 dublu încărcat, tipul ionului molecular și structura posibilă (GP/GH).

Figura 36. B). Print screen al interfațării software-ului și exemplificarii modului de operare-2

În concluzie, această ultimă variantă de program s-a dovedit utilă și fiabilă, fiind testată de specialiști în domeniu și care i-au atribuit calificative excelente pentru modul de rulare și pentru rezultatele generate. Desigur, am gandit pe viitor o variantă care să ruleze în același timp și o altă bază de date separată care să conțină structurile posibile ale ceramidelor precum și posibilitățile de fragmentare ale gangliozidelor respectând nomenclaturile [92,153].

4.5. STUDIU PILOT PENTRU TESTAREA FEZABILITĂȚII METODELOR DE SPECTROMETRIE DE MASĂ DEZVOLTATE PENTRU STUDIUL INTERACȚIUNILOR FUNCȚIONALE PROTEINE – GLICOCONJUGAȚI

Alergia la proteinele laptelui de vacă apare și la sugarii exclusiv alăptați la sân dacă mama consuma lapte de vacă și/sau produse derivate. Aceasta este principala cauză a intoleranței alimentare în primele 6 luni de viață și este dependentă de alimentația mamei. β-Lactoglobulina (BLG) – o proteină prezentă în laptele de vacă este unul dintre cei mai agresivi alergeni pentru nou-născut și poate declanșa o imagine clinică complexă. Deoarece nu este disponibil un tratament profilactic, găsirea în prezent a unor liganzi capabili să lege β-LG și astfel sa-i reducă alergenitatea este în prezent subiectul cercetării. Studiile anterioare efectuate în acest domeniu [283, 284] au sugerat că unele clase de oligozaharide leagă β-LG și astfel, pot reduce alergenicitatea acesteia.

Acest studiu face parte dintr-un proiect mai amplu pe care grupul de cercetare din care fac parte îl desfășoară și care se va extinde în viitor. Studiul complecșilor biomoleculari au o importanță deosebită datorită diverselor roluri biologice pe care aceștia le pot îndeplini. Fie că este vorba de legaturi protetină-proteină sau proteina-zaharuri sau gangliozide, însemnătatea funcțională este demnă de a fi inclusă în studiu.

4.5.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

În cadrul acestui studiu a fost elaborată o metodologie inovatoare care cuprinde ionizarea complet automată bazată pe Chip nanoESI, cuplată cu spectrometrie de masă de înaltă rezoluție pe un instrument QTOF MS. Această platformă a fost utilizată pentru evaluarea interacțiunilor necovalente dintre maltohexaoză (Glc6) și beta-lactoglobulină – o proteină extrasă din laptele uman, după un aport deliberat de lapte de vacă. Experimentele au fost efectuate în modul pozitiv (+) ESI, utilizând prima dată soluții tampon de acetat de amoniu (pH 6,0) și apoi apă pură. În ambele cazuri, analiza MS a evidențiat formarea complexului β-LG-Glc6, care a fost caracterizat prin fragmentarea MS în tandem (MS/MS) în varianta top-down utilizând CID. Constatările noastre au un impact biomedical semnificativ, indicând faptul că Glc6 leagă β-LG în condiții care modelează mediul in vivo și, prin urmare, ar putea reprezenta un ligand, capabil să reducă alergenicitatea acestuia. În acest context, în studiul de față a fost imaginat un test inovator microfluidic – MS pentru caracterizarea interacțiunii necovalente dintre maltooligozaharide și β-lactoglobulina extrasă din laptele uman, în urma unui aport deliberat de lapte de vacă. Proteina a fost incubată cu Glc6 și posibilii produși de reacție au fost supuși unei analize compoziționale și structurale detaliate prin chip-nanoESI MS complet automatizat. Studiul MS al produșilor de reacție a evidențiat formarea unui complex necovalent β-LG -Glc6, care a fost caracterizat structural printr-un experiment de fragmentare top-down bazat pe CID (Fig. 37).

Figura 37. Reprezenatrea schematică a algoritmului de desfășurare a studiului interacției necovalente dintre β-LG și Glc6

4.5.2. REACTIVI ȘI MATERIALE

Acetatul de amoniu, acidul acetic și acidul formic de calitate analitică au fost achiziționate de la Merck, Darmstadt, Germania. Apa distilată și deionizată provenită din sistemele de apă Milli-Q, Millipore, Bedford, MA, SUA, a fost utilizată pentru prepararea soluțiilor. SpeedVac SPD 111 V-230 pentru concentrarea probelor a fost achiziționat de la Thermo Electron, Asheville, NC, SUA. Aparatul a fost cuplat la o pompă de vid PC 2002 Vario cu controler CVC 2000 de la Vaccubrand, Wertheim, Germania. Dializa a fost efectuată utilizând sisteme Micro DispoDialyzer de la Harvard Apparatus, Holliston, MA, SUA. Termomixerul utilizat pentru agitare a fost un Eppendorf Thermomixer de la Eppendorf, Hamburg, Germania, Glc6 (Mr 990.86) și β-LG standard (90%) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich Ltd. (St. Louis, MO, SUA) și utilizate fără purificare suplimentară. PH-ul a fost măsurat utilizând un pH-metru de la Mettler-Toledo, AG, Schwerzenbach, Elveția. Extragerea β-LG din laptele uman a fost efectuată urmând protocolul descris de Cohen și Chait [285] și Schneider și colab. [286]. Spectrometria de masă a fost efectuată în mod ion pozitiv pe un spectrometru de masă cuadrupolar cu timp de zbor (QTOF MS, Waters, Manchester, UK), controlat de software-ul MassLynx v. 4.1, cuplat la un robot NanoMate (Advion BioSciences, Norfolk, Marea Britanie) prin intermediul unui suport de montare special conceput. Chip-ul nanoESI utilizat prezintă 400 de orificii cu diametrul interior de 2,5 μm. Folosind software-ul ChipSoft, robotul a fost programat să aspire întregul volum de probă, urmat de 2 μL de aer pentru a împiedica scurgerea eșantionului în timpul manipulării. În cazul studiului interacțiunii β-LG-Glc6 folosind ca soluție tampon acetatul de amoniu/acid formic, Chip nanoESI a fost setat la 1,8 kV pe vârful pipetei, tensiunea conului de 40 V, cu o presiune a nebulizatorului de azot de 60 psi. Pentru desolvatarea optimă a picăturilor de probă, blocul sursă a fost menținut la 80°C. Fragmentarea de tip top-down a complexului format a fost efectuată prin CID la energie variabilă, folosind argonul drept gaz de coliziune. Nomenclatorul ionilor fragmentului oligozaharidic a urmat recomandările lui Domon și Costello [92]. În toate figurile sunt prezentate masele monoizotopice. Reproductibilitatea de rulare a experimentului în timpul funcționării a fost situată între 98 și 100%, în timp ce reproductibilitatea probă-probă a fost de aproape 95%.

4.5.3. TESTE DE INTERACȚIUNE ALE β-LG-Glc6

Solventul utilizat pentru studierea interacțiunilor necovalente a fost 10 mM acetat de amoniu apos, ajustat cu 98% acid formic la pH 6,0. Deși o concentrație ionică mai mare a influențat în mod pozitiv gradul de interacțiune, concentrația de 10 mM de acetat de amoniu la pH 6,0 s-a dovedit a fi un compromis corect între formarea complexului și cerințele impuse de ionizarea prin electrospray. Interacțiunea proteină-ligand (oligozaharidic) a fost efectuată, în condiții care să respecte mediul natural într-un termomixer Eppendorf, prin incubarea la 37°C a soluției β-LG în soluție tampon la o concentrație de 5 pmol μL-1 cu o soluție tampon de Glc6 la o concentrație de 10 pmol μL-1. S-au colectat alicote de 5 μL după 1, 5, 10, 15, 20, 25 și 30 de minute de incubare și s-au supus analizei MS. În urma unor serii de proceduri de optimizare, s-a constatat că stoichiometria de 1:2,5 Glc6: β-LG este cea mai potrivită atât pentru formarea completă, cât și pentru detectarea acesteia de către MS. Pentru a minimiza interferența în procesul de reacție în timpul procedurii de colectare, flaconul nu a fost îndepărtat din termomixer. Pentru analiza interacțiunii efectuată în apă pură, cele mai bune rezultate s-au obținut prin incubarea timp de 50 min la 37°C a 30 μL de soluție β-LG la o concentrație de 5 pmol uL-1 cu 6 μL de soluție Glc6 la o concentrație de 10 pmol-1.

4.5.3.1. Interacțiunea β-LG-Glc6 în acetat de amoniu/acid formic

β-LG extras și purificat din laptele uman după consumul de lapte de vacă a fost uscat și ulterior dizolvat în acetat de amoniu apos 10 mM, ajustat cu 98% acid formic (pH 6,0) până la o concentrație finală de 5 pmol μL-1. S-au încărcat 5 μL β-LG/soluție tampon în godeul plăcii de microtitrare a robotului NanoMate. Proba a fost infuzată automat în QTOF MS hibrid, prin intermediul chip-nanoESI în modul pozitiv. Spectrul, achiziționat în numai 2 minute, este prezentată în figura 38.

Figura 38. Spectrul de masă (+)Chip-nanoESI QTOF MS al BLG extras din laptele uman. Concentrație, 5 pmol μL-1 în 10 mM acetat de amoniu/acid formic, pH 6,0. Tensiunea NanoESI,1,8 kV; tensiunea aplicată conului 40 V; presiunea nebulizatorului 60 psi; timpul de achiziție, 2 min [15]

O evaluare detaliată a spectrului arată că soluția tampon de acetat de amoniu/acid formic la pH 6,0 a indus o ionizare corectă a β-LG. S-au detectat cinci semnale de intensitate ridicată, formând anvelopele specifice proteinei la m/z 2026,63; 2279,86; 2605,38; 3039,41 și 3647,00. Utilizând funcția de deconvoluție a software-ului MassLynx v. 4.1, semnalele au fost atribuite seriei de molecule β-LG protonate, de la [β-LG + 5H+]5+ până la [β-LG + 9H+]9+.

Conform calculului, masa moleculară monoizotopică determinată experimental (Mr) a β-LG din laptele uman este (18,230.50 ± 0,2) Da. După incubarea β-LG și Glc6, alicotele din masa de reacție au fost colectate la 1, 5 și 10 min. După 1 min, s-au colectat 5 μL și s-au încărcat direct pe placa robotului NanoMate. Spectrul MS, rezultat în urma achiziției timp de 2 minute în modul ion pozitiv, este prezentată în figura 39.

Figura 39. Spectrul de masă (+) Chip-nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β-LG-Glc6 după 1 min de incubare în soluție tampon la 37°C. Alte condiții de MS sunt identice cu cele din fig.38 [15]

Pe lângă anvelopa caracteristică diverselor stadii de protonare a β-LG (de la 5+ la 9+), spectrul de masă prezentat în figura 39 mai prezintă un semnal la m/z 2750,10. Acest m/z corespunde unuei mase moleculare de 19242,51 Da la o stare de încărcare 7+. Pe baza calculului, această valoare, sugerează un complex necovalent al β-LG cu Glc6 monosodiat si hexaprotonat. În screening-ul MS al Glc6, forma sodiată a Glc6 a fost găsită ca cel mai abundent ion la m/z 1013,85. Spectrul produșilor de reacție, colectați după 5 min de incubare, este prezentat în figura 40. În comparație cu spectrul din figura 39, se observă o singură diferență. Intensitatea semnalului ionic, care corespunde complexului β-LG cu Glc6, este mai mare decât cea a ionilor omologi.

Figura 40. Spectrul de masă (+)Chip-nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β-LG-Glc6 după 5 min de incubare în soluție tampon la 37°C. Alte condiții de MS sunt identice cu cele din fig.38 [15]

Acest fapt sugerează că, între min 1 și min 5, reacția a fost încă în desfășurare. Pe baza acestei remarci, s-a hotarat ca procesul sa fie monitorizat în continuare. Prin urmare, la 10 min după incubare, s-au colectat 5 μL și s-au supus screening-ului chip nanoESI QTOF MS în modul pozitiv și în condiții identice. Spectrul înregistrat este prezentat în figura 41.

În comparație cu celelalte două experimente, spectrul din figura 41 prezintă o intensitate mult mai mare a semnalului, corespunzând complexului necovalent la m/z 2750,09. Spectrele probelor colectate în continuare, până la 30 de minute cu un interval de timp de 5 minute, nu au prezentat modificări semnificative.

Figura 41. Spectrul de masă (+) Chip-nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β-LG-Glc6 după 10 min de incubare în soluție tampon la 37°C. Concentrație, 5 pmol μL-1 în apă la pH 7,0. Tensiunea NanoESI,1,9 kV; tensiunea aplicată conului 60 V; presiunea azotului 0,40 psi; presiunea nebulizatorului 60 psi; timpul de achiziție, 2 min [15]

Pentru a studia în detaliu complexul format al β-LG cu Glc6, ionul detectat la m/z = 2750,09 a fost izolat într-o fereastră de izolare de 2 u.a.m. și supus fragmentării prin CID, la energii variabile. În figura 42, este prezentată analiza top-down efectuată folosind ca precursor ionul corespunzător complexului detectat în proba colectată după 10 minute.

Fragmentarea în condiții identice ale aceluiași ion precursor după 1 și 5 min de reacție a condus la rezultate aproape identice. Inspectarea spectrului în figura 42 prezintă un număr de ioni de fragment diagnostic pentru complexul β-LG -Glc6 (Na).

Mai mult decât atât, modelul de fragmentare documentează faptul că au apărut două evenimente în cadrul aceluiași experiment: (1) scindarea legăturii necovalente β-LG -Glc6, susținută de [Glc6 + Na+]+ la m/z 1013.86 și seria de ioni la m/z 2026,65; 2279.86; 2605.42; 3039,46 și 3647,06, legate de diferite stări de încărcare ale proteinei, variind de la 5+ până la 9+; (2) secvențializarea Glc6 cu formarea ionilor produs în regiunea m/z joasă, fenomen caracteristic formei sodiate a Glc6 (inserată în figura 42). Pentru comparație, în figura 43, CID MS/MS a [Glc6 + Na+]+ detectat la m/z 1013,85 prin screening-ul MS al Glc solubil în soluția tampon este prezentat împreună cu schema de fragmentare. Evident, căile de fragmentare determinate experimental pentru [Glc6 + Na+]+ în cele două abordări sunt similare, ceea ce susține formarea complexului necovalent al β-LG cu Glc6.

Figura 42. Spectrul de masă (+)chip-nanoESI QTOF CID MS/MS (top-down) a [Complex + Na+ + 6H+]7+ detectat la m/z 2750,09, corespunzător complexului noncovalent β-LG-Glc6. Energie de coliziune variabilă, între 40-100 eV; timp de achiziție, 5 min; alte condiții nementionate ale MS sunt ca cele prezentate în fig. 38. Schema de fragmentare a Glc6 este inserată în partea de sus a spectrului [15]

Figura 43. Spectrul de masă (+)Chip-nanoESI QTOF CID MS/MS a [Glc6 + Na+]+

detectat la m/z 1013.85 prin screening-ul MS a lui Glc6 în buffer. Concentrație,10 pmol μL−1 in 10 mM acetat de amoniu/acid formic, pH 6.0. NanoESI voltaj, 1.8 kV; voltajul conului, 60 V; Energie de coliziune variabilă, între 40-100 eV; timp de achiziție, 2 min. Schema de fragmentare a Glc6 în buffer este inserată în partea de sus a spectrului [15]

4.5.3.2. Interacțiunea β-LG-Glc6 în apă

5 μL de probă conținând produsele de reacție β-LG-Glc6 au fost colectate la min 1, 5, 10 și 30 după incubare în apă și încărcate în godeurile plăcii de microtitrare a robotului NanoMate. În toate cele patru cazuri, analiza chip-nanoESI MS a dezvăluit numai caracteristicile de anvelopare ale β-LG cu stări de încărcare 5+ la 9+ ale ionilor moleculari. Din acest motiv, s-a extins timpul de observare, amestecul de reacție fiind monitorizat în continuare. În figura 44, este prezentat spectrul produselor de reacție colectate după 50 de minute de incubare. Pe lângă β-LG, spectrul din figura 44 prezintă un semnal la m/z 2750,12 care, conform calculului (ținand cont de starea sa de încarcare electrică), corespunde unuei mase moleculare de 19243,84 Da. Această valoare este atribuită complexului noncovalent al β-LG cu forma sodică a Glc6. Având în vedere această caracteristică a interacțiunii necovalente efectuate în apă, probele au fost colectate suplimentar până la 3 ore cu un interval de timp de 30 de minute între colecții. Analizele MS ale tuturor celorlalte probe nu au adus nicio diferență semnificativă.

Figura 44. Spectrul de masă (+)Chip-nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β-LG-Glc6 după 50 min de incubare în apă la 37°C. Alte condiții de MS sunt identice cu cele din fig. 38 [15]

4.5.4. CONCLUZII DE ETAPĂ

Literatura de specialitate [287,288] mentionează existența a doi izomeri β-LG în laptele de vacă: izomerul A de 18.363 Da și izomerul B, de 18.276 Da. Aceste valori ale masei moleculare au fost determinate prin mai multe metode cum ar fi ESI MS, electroforeză capilară și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) cuplată cu MS. Conform calculului bazat pe secvența de aminoacizi, β-LG are o masă moleculară de 18.400 Da [289,290]. O varianta având (18.230,50 ± 0,2) Da nu a fost niciodată raportată anterior.

Prin urmare, considerăm că proteina regăsită în laptele uman suferă modificări structurale. Acest aspect oferă perspective interesante pentru cercetarea ulterioară, cu scopul de a determina astfel de modificări prin ESI MS/MS fie prin abordări de tip bottom-up (de jos în sus) sau top-down (de sus în jos). Un rezultat interesant al testelor de interacțiune este că legarea necovalentă β-LG-Glc6 în acetat de amoniu/acid formic este un proces rapid, comparativ cu alte interacțiuni proteină-oligozaharidă studiate în aceeași soluție tampon [291]. În acetat de amoniu, complexul necovalent β-LG-Glc6 a fost format și detectat prin MS după doar 1 min de incubare.

Spectrele de masă ale produșilor de reacție colectate la fiecare 5 minute timp de o jumătate de oră au evidențiat o creștere semnificativă a abundenței ionului molecular corespunzător. Prin urmare, utilizarea robotului chip-nanoESI complet automatizat ce oferă randament și performanțe ridicate, a fost crucială pentru evaluarea produșilor de interacțiune aproape în timp real, fără a periclita condițiile de reacție. Într-un studiu anterior [291] privind analiza interacțiunii proteină-oligozaharidă, folosind analiza prin nanoESI QTOF MS au fost acumulate 2850 de scanări, echivalente cu aproape 100 de minute, pentru a se putea realiza fragmentarea prin CID MS/MS.

În experimentele noastre, având în vedere eficiența ridicată a ionizării oferite de chip-nanoESI, 2 minute pentru un spectru de masă de screening și 5 min pentru experimentul top-down au fost suficiente pentru o caracterizare completă a complexului necovalent. Un consum redus de probă și o viteză mare de analiză a permis investigarea proteinei prezentă în laptele uman într-o cantitate foarte mică. Pentru a imita mediul in vivo și a evalua dacă complexul ar putea fi format și detectat de ESI MS în astfel de condiții, în a doua fază a cercetării, soluția tampon de acetat de amoniu a fost înlocuit cu apă pură.

Remarcabil, complexul format poate fi detectat prin ESI MS la o valoare a pH-ului sub 7,0. Totuși, deoarece concentrația partenerilor de reacție și condițiile de incubare au fost aceleași ca și atunci când s-a folosit soluție tampon, în raport cu datele obținute folosind apă pură, putem concluziona următoarele: (1) așa cum s-a așteptat, β-LG extrasă din laptele uman și Glc6 prezintă un grad scazut de ionizare. Ca o consecință, în spectrul din figura 44 nu s-au format toate stările de încărcare ale β-LG vizibile în urma analizei acelorași parteneri în soluția tampon; în plus, ionii Glc6 nu sunt detectabili; (2) un raport semnal/zgomot mai mic a fost obținut în apă pură, comparativ cu tamponul acetat de amoniu; (3) procesul de formare a complexului necovalent este mult mai lent în apă. Complexul a fost detectat numai după 50 de minute de reacție, dar a rămas stabil pentru câteva ore; (4) ionii corespunzători β-LG-Glc6 prezintă o intensitate destul de scăzută, ceea ce a făcut ca rezultatele experimentului top-down să fie considerate mai puțin fiabile. Această caracteristică ar putea fi consecința ionizării reduse, a unei concentrații scăzute a complexului format în apă sau a ambelor.

Conform rezultatelor anterioare [292], chiar și urmele de β-LG în laptele uman provoacă alergii la unii sugari. De asemenea, sa demonstrat că unele clase de oligozaharide [284] determină reducerea alergenității β-LG.

Din acest punct de vedere, rezultatele experimentelor efectuate au o conotație biologică și clinică aparte. Datele noastre sugerează că, prin formarea unui complex noncovalent cu β-LG în condiții care să imite parametrii in vivo, Glc6 ar putea fi printre glicanii ce pot contribui la reducerea alergenității β-LG. Pe baza acestor constatări, pot fi efectuate studii clinice pentru testarea nivelului de alergenitate al complexului β-LG-Glc6.

5. CONCLUZII ȘI CONTRIBUȚII PERSONALE

Complexitatea și originalitatea acestei teze de doctorat se datorează faptului că aceasta reunește domenii importante de cercetare și anume medicina, biochimia, fizica și informatica. Încă de la început, fixarea obiectivelor s-a realizat într-o notă modernă, îndrăzneață și pragmatică totodată. Este dificil să realizezi lucruri mărețe, care au potențial de a ajunge modele de referință pentru proiecte de cercetare viitoare, fără o tehnologie performantă și o echipă solidă și unită care să sprijine aceste demersuri.

Având aceste cerințe minime și obligatorii asigurate, lucrarea de față se dorește a fi o contributie onesta la cercetarea fundamenală în sfera glicolipidomicii utilizand spectrometria de masă. O astfel de abordare plasează prezenta contribuție în categoria tezelor ce au la bază cercetarea fundamentală și este diferită de tot ce poate oferi cercetarea clinică, unde numarul cazurilor incluse în lot primează asupra rezultatelor obținute.

Astfel, această teză de doctorat a contribuit prin rezultatele sale la dezvoltarea și aplicarea în practică a două metode diferite de spectrometrie de masă, optimizate pentru screening-ul gangliozidelor extrase din tumori cerebrale și analizarea lor, comparativ cu cele extrase din țesut cerebral sănătos.

Prima metodă a utilizat un spectrometru de masă cu analizor cu capcană ionică de mare capacitate, HCT MS cuplat cu sistemul automat NanoMate de infuzie a probei prin chip, pentru screening-ul de masă al gangliozidelor extrase din hemangiom și din țesutului cerebral sănătos.

Cea de-a doua tehnică a avut la bază spectrometria de masă cu analizor cuadrupolar hibrid cu timp de zbor (QTOF MS), ionizare prin nanoESI și fragmentare prin CID MS/MS și a fost aplicată pentru analiza gangliozidelor extrase dintr-o probă de meningiom cerebral și dintr-o probă de metastază cerebral a unui adenocarcinom pulmonar (împreună cu țesutul cerebral sănătos corespondent). De asemenea, această metodă s-a aplicat și pentru studiul complecșilor proteo-zahardici și care a fost prezentat ca și subcapitol referitor la prespectivele viitoare de cercetare. Din rezultatele prezentate în această teză se desprind următoarele concluzii:

1). Cercetare de față a avut ca rezultat dezvoltarea unei metodologii moderne pentru investigarea expresiei și structurii gangliozidelor într-o tumoră benignă a creierului uman. La momentul publicării rezultatelor, acesta a fost primul studiu consacrat gangliozidelor dintr-un hemangiom cerebral.

2). Refreritor la aceeasi contributie, putem afirma că pentru prima dată s-a folosit metoda avansată de spectrometrie de masă complet automatizată bazată pe chip-nanoESI cuplat direct la HCT și CID MS2 pentru elucidarea gangliozidelor din hemangiom cerebral.

3). Modificarea compoziției gangliozidelor analizate din hemangiom în raport cu expresia gangliozidelor din creierul uman sănătos a fost relevantă prin următorul aspect: CFH afișează gangliozidele monosalilate scurte, în timp ce în CFN apar ca specii majore gangliozidele mono- și polisializate precum și componentele O-acetilate. Cu toate acestea, în proba de hemangiom s-a detectat o specie O-Ac-GM4 și o specie O-Ac-GD2. Astfel, prezența O-Ac-GD2 se poate asocia cu gradul redus de malignitate al tumorii cerebrale investigate.

4). Totodată, GT1 (d18:0/20:0) detectat ca un ion de intensitate scăzută, pare a fi un alt marker găsit doar în CFH și nu în cortexul sănătos.

5). Un aspect notabil este utilizarea metodelor MS ultrasensibile și precise pentru determinarea compozițiilor modificate ale gangliozidelor cerebrale aflate uneori sub limita de detecție a altor metode spectrometrice. De asemenea trebuie subliniată reproductibilitatea (aproape de 100%), viteza și sensibilitatea analizei, consumul unei cantități reduse de probă și nu în ultimul rând costul redus al uni analize.

6). NanoESI HCT MS și CID MSn bazate pe chip oferă posibilitatea de a fi introduse ca metode de diagnostic medical pentru analiza comparativă a structurilor și compoziției glicoconjugaților omologi și din alte țesuturi sau fluide ale organismului.

Cea de a doua direcție de cercetare a vizat investigarea în detaliu a compoziției gangliozidelor într-o probă de țesut cerebral cu meningiom urmată de analiza prin fragmentare a speciilor individuale utilizând o metodă avansată de spectrometrie de masă bazată pe nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS referitor la care se desprind urmatoarele concluzii

7). Prin MS nanoESIchip-QTOF se identifică un număr mult mai mare de structuri decât cele raportate anterior de literatura de specialitate. Astfel, acest studiu a furnizat date despre 34 de noi specii diferite de gangliozide, ceea ce depășește cu mult pe cele raportate anterior pentru meningioame.

8). În meningiomul studiat, comparativ cu alte tumori, structurile identificate prezintă lanțuri oligozaharidice mai scurte, cu un grad de sialilare nu mai mare de doi. Nu s-au descoperit modificări de O-fucozilarea, O-acetilarea sau O-GalNAc așa cum s-au găsit în hemangiom.

9). Pentru a elucida structura celor mai abundenti ioni, s-a efectuat fragmentarea simultană a acestor ioni prin CID MS/MS. Datele obținute în urma fragmentării au arătat că pentru fiecare GM1(d18:1/24:1) și GM1(d18:1/24:0), izomerii a cât și izomerii b sunt exprimați simultan.

10). Datele noastre sugerează că speciile GM1 și speciile GM3 pot fi în general recunoscute ca un marker incontestabili pentru acest tip de tumori. Cu atât mai mult, posibilul rol al GM1 justifică explorarea și examinarea lui în continuare (ținand cont de diversitatea relativ ridicată a ceramidelor din compozitia sa) urmand ca studiile viitoare sa certifice rolul prezumat.

11). Experimentele efectuate folosind un singur specimen de meningiom au demonstrat că nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS pot fi metodele de elecție pentru analiza amestecurilor complexe de gangliozide cu probleme majore de ionizare.

A treia directie de cercetare a fost legată de investigarea gangliozidelor din metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar, referitor la care se desprind urmatoarele concluzii:

12). Combinând MS de înaltă performanță bazată pe chip-nanoESI cu HPTLC și scanare densitometrică a fost posibilă detectarea și elucidarea structurală a 125 de specii distincte de gangliozide exprimate în metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar.

13). S-a constatat de asemenea o scădere de 14 ori a conținutului total de gangliozide în acest tip de metastază comparativ cu țesutul cerebral sănătos (compoziția gangliozidelor din proba de metaADK fiind evident modificată în comparație tesutul cerebral sănătos).

14). MetaADK este caracterizată de specii scurte de gangliozide cu conținut redus de acid sialic și cu prevalență de tip GM, în timp ce țesutul cerebral sănătos este dominat de structuri de la mono- până la hexasialilate cu o expresie mai mare a structurilor de tip GD și GT.

15). Datele MS au pus în evidență prezența în metaADK a mai multor specii monosialilate neobișnuit modificate prin fucozilare sau O-acetilare. Prin MS tandem utilizând CID, componenta oligozaharidica a speciei GD3(d18:1/18:0) asociată cu metastaza cerebrală a fost elucidată structural. În același timp, un număr de ioni amprentă pentru ceramidă au permis, descifrarea structurii componentei lipidice.

16). În cadrul experimentelor de analiza a gangliozidelor din metaADK s-a atins performanța ca screening-ul MS urmat de CID MS/MS să necesite doar 500 fmoli de material la un debit de aproximativ 100 nL/min, timpul de achiziție de 1 min, o concentrație de probă de numai 2,5 pmol/pl ceea ce corespunde la un consum de 250 fmol de extract biologic). Aceste date singure, fac din platforma bioanalitică utilizată o metodă de rutină, ultrarapidă și sensibilă aplicabilă altor tipuri de cancer și markeri moleculari.

A patra direcție de cercetare din cadrul tezei a constituit-o conceperea și elaborarea de programe aferente interpretărilor de date structurale furnizate de metodele și tehnicile de spectrometrie de masă, în acest sens concluzionând ca și contributii originale urmatoarele:

17). elaborarea și implementarea unui software original denumit GanglioBase, capabil să calculeze, analizeze și afișeze toate variantele structurale de gangliozide care corespund unui ion pseudomeolecular dat de utilizator. Avantajele utilizării sale sunt numeroase, cele mai importante fiind timpul redus de analiză a rezultatelor generate de MS și exactitatea acestora. Software-ul este de 3 ani la dispoziția tuturor cercetătorilor ce lucreaza țn lipidomică, glicomică și glicolipidomică.

O a cincea direcție de studiu a prilejuit-o analiza prin spectrometrie de masa a posibilității de formare a unor complecși necovalenți între proteine și oligozaharide, în particular între β-LG și Glc6 reținându-se urmatoarele contribuții:

18). Folosind platforma chip-nanoESI QTOF MS a fost pus în evidență complexul β-LG-Glc6 sub forma sa monosodiată și hexaprotonată; s-a pus în evidență complexul atât în soluție tampon cât și în soluție apoasă efectuându-se un studiu complet privind concentrația versus timpul de reacție. Pentru demonstarea existenței complexului în experimente de CID-MS au fost suficiente 2 minute pentru obținerea unui spectru de masă elocvent care să evidențieze complexul format și doar 5 min pentru experimentul top-down de caracterizare completă a complexului necovalent.

19). Ca urmare a întregii expertize dobândite de-a lungul studiilor de analiză a gangliozidelor și a complexelor necovalente se poate certifica faptul că chip-nanoESI QTOF MS și CID MS/MS a fost capabilă să furnizeze o caracterizare structurală și compozitionala completă cu o viteză și o sensibilitate de analiză remarcabilă și la un preț de cost redus. Dacă la aceste performanțe se adaugă un consum de consumabile extrem de redus, realizăm că utilizarea pe viitor, în cadrul unor trialuri clinice focusate pe detectarea unor markeri biochimici specifici pentru diagnosticul precoce al neoplaziilor, poate fi cheia spre succes în managementului acestor cazuri.

20). În ultimul timp se discută tot mai des conceptul de medicină personalizată și posibilitățile pe care aceasta le poate oferi pacienților. MS a fost utilizată în mod obișnuit în medicina de laborator, în special în contextul testelor toxicologice și al monitorizării terapeutice a medicamentelor. Cuantificarea medicamentelor din sânge pentru a personaliza dozarea în funcție de variabilele farmacocinetice individuale și verificarea conformității (monitorizarea terapeutică a medicamentelor) se face pentru un număr tot mai mare de compuși în special pentru bolile psihiatrice și infecțioase.

21). MS este o tehnică unică prin faptul că poate analiza direct orice moleculă biologică susceptibilă la ionizare. Evoluția tehnologică constantă a MS oferă beneficii cumulative din punct de vedere analitic (de exemplu, îmbunătățiri ale sensibilității și selectivității) dar și funcțional, avand ca rezultat potențial extinderea și implementarea acestei tehnici pentru a deservi un număr cât mai mare de specialități clinice medicale.

BIBIOGRAFIE

[1] Kraĉun I, Rösner H, Ćosović C, Stavljenić A. Topographical atlas of the gangliosides of the adult human brain. Journal of neurochemistry. 1984 Oct 1;43(4):979-89;

[2] Ono M, Hakomori S. Glycosylation defining cancer cell motility and invasiveness. Glycoconjugate journal. 2003 Feb 1;20(1):71-8;

[3] Schiopu C, Flangea C, Capitan F, Serb A, Vukelić Ž, Kalanj-Bognar S, Sisu E, Przybylski M, Zamfir AD. Determination of ganglioside composition and structure in human brain hemangioma by chip-based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry. 2009 Dec 1;395(8):2465-77;

[4] Schiopu C, Vukelić Ž, Capitan F, Kalanj‐Bognar S, Sisu E, Zamfir AD. Chip‐nanoelectrospray quadrupole time‐of‐flight tandem mass spectrometry of meningioma gangliosides: A preliminary study. Electrophoresis. 2012 Jul 1;33(12):1778-86;

[5] Zamfir AD, Serb A, Vukeli Ž, Flangea C, Schiopu C, Fabris D, Kalanj-Bognar S, Capitan F, Sisu E. Assessment of the molecular expression and structure of gangliosides in brain metastasis of lung adenocarcinoma by an advanced approach based on fully automated chip-nanoelectrospray mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2011 Dec 1;22(12):2145-59;

[6] Almeida R, Mosoarca C, Chirita M, Udrescu V, Dinca N, Vukelić Ž, Allen M, Zamfir AD. Coupling of fully automated chip-based electrospray ionization to high-capacity ion trap mass spectrometer for ganglioside analysis. Analytical biochemistry. 2008 Jul 1;378(1):43-52;

[7] Ghiulai RM, Sarbu M, Vukelić Ž, Ilie C, Zamfir AD. Early stage fetal neocortex exhibits a complex ganglioside profile as revealed by high resolution tandem mass spectrometry. Glycoconjugate journal. 2014 Apr 1;31(3):231-45;

[8] Mosoarca C, Ghiulai RM, Novaconi CR, Vukelić Ž, Chiriac A, Zamfir AD. Application of chip-based nanoelectrospray ion trap mass spectrometry to compositional and structural analysis of gangliosides in human fetal cerebellum. Analytical letters. 2011 Mar 29;44(6):1036-49;

[9] Serb A, Schiopu C, Flangea C, Vukelić Ž, Sisu E, Zagrean L, Zamfir AD. High-throughput analysis of gangliosides in defined regions of fetal brain by fully automated chip-based nanoelectrospray ionization multi-stage mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 2009 Aug;15(4):541-53;

[10] Sarbu M, Dehelean L, Munteanu CV, Vukelić Ž, Zamfir AD. Assessment of ganglioside age-related and topographic specificity in human brain by Orbitrap mass spectrometry. Analytical biochemistry. 2017 Mar 15;521:40-54.

[11] Serb AF, Sisu E, Vukelić Ž, Zamfir AD. Profiling and sequencing of gangliosides from human caudate nucleus by chip‐nanoelectrospray mass spectrometry. Journal of mass spectrometry. 2012 Dec 1;47(12):1561-70.

[12] Zamfir AD, Fabris D, Capitan F, Munteanu C, Vukelić Ž, Flangea C. Profiling and sequence analysis of gangliosides in human astrocytoma by high-resolution mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry. 2013 Sep 1;405(23):7321-35.

[13] Robu AC, Vukelić Ž, Schiopu C, Capitan F, Zamfir AD. Mass spectrometry of gangliosides in extracranial tumors: Application to adrenal neuroblastoma. Analytical biochemistry. 2016 Sep 15;509:1-1.

[14] Flangea C, Fabris D, Vukelić Ž, Zamfir AD. Mass spectrometry of gangliosides from human sensory and motor cortex. Australian Journal of Chemistry. 2013 Aug 14;66(7):781-90.

[15] Capitan F, Robu AC, Schiopu C, Ilie C, Chait BT, Przybylski M, Zamfir AD. β-Lactoglobulin detected in human milk forms noncovalent complexes with maltooligosaccharides as revealed by chip-nanoelectrospray high-resolution tandem mass spectrometry. Amino acids. 2015 Nov 1;47(11):2399-407.

[16] Gayon J, Malaterre C, Morange M, Raulin-Cerceau F, Tirard S. Defining life: conference proceedings. Origins of Life and Evolution of the Biosphere. 2010 Apr 1;40(2):119.

[17] Lowe JA, Jones P, Wilson DM. Network biology as a new approach to drug discovery. Current opinion in drug discovery & development. 2010 Sep;13(5):524-6;

[18] Pujol A, Mosca R, Farrés J, Aloy P. Unveiling the role of network and systems biology in drug discovery. Trends in pharmacological sciences. 2010 Mar 31;31(3):115-23.

[19] Auffray C, Imbeaud S, Roux-Rouquié M, Hood L. From functional genomics to systems biology: concepts and practices. Comptes rendus biologies. 2003 Nov 30;326(10):879-92.

[20] Van Regenmortel MH. Reductionism and complexity in molecular biology. EMBO reports. 2004 Nov 1;5(11):1016-20.;

[21] Boogerd F, Bruggeman FJ, Hofmeyr JH, Westerhoff HV, editors. Systems biology: philosophical foundations. Elsevier; 2007 Mar 20.

[22] Wolkenhauer O. Systems biology: The reincarnation of systems theory applied in biology?. Briefings in bioinformatics. 2001 Sep 1;2(3):258-70.

[23] https://www.nature.com/scitable/content/microevolution-of-a-cancer-cell-14707728

[24] Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 1976 Oct 1;194(4260):23-8.

[25] Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 1984, (44):2259–65

[26] Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 1990 Jan 3;82(1):4-7.

[27] Tabassum DP, Polyak K. Tumorigenesis: it takes a village. Nature Reviews. Cancer. 2015 Aug 1;15(8):473.

[28] Marusyk A, Tabassum DP, Altrock PM, Almendro V, Michor F, Polyak K. Non-cell autonomous tumor-growth driving supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 2014 Oct 2;514(7520):54.

[29] Calbo J, van Montfort E, Proost N, van Drunen E, Beverloo HB, Meuwissen R, Berns A. A functional role for tumor cell heterogeneity in a mouse model of small cell lung cancer. Cancer cell. 2011 Feb 15;19(2):244-56.

[30] Grant A, Waugh A. Ross Jand Wilson anatomy and physiology in health and illness. Edinburgh: Churchill Livingstone. Edition: 10th edition 2006, pp. 53–54. ISBN 0-443-10101-9

[31] Loda M, Mucci L, Mittelstadt ML, Van Hemelrijck M, Cotter MB. Pathology and Epidemiology of Cancer. Springer; 2016 Sep, ISBN 978-3-319-35151-3

[32], Silverstein LN,A Silverstein, VB Silverstein,. Cancer. Brookfield 2006, Conn: Twenty-First Century Books. pp. 11–12. ISBN 0-7613-2833-5

[33] Rubin R, Strayer DS, Rubin E, editors. Rubin's pathology: clinicopathologic foundations of medicine. Lippincott Williams & Wilkins; 2008,. pp. 138–139. ISBN 0-7817-9516-8.

[34] Martini FH, Nath JL, Bartholomew EF. Fundamentals of Anatomy and Physiology. 2001. Pentice Hall: New Jersey. 2015:538-57.

[35] Ray SK. Glioblastoma: Molecular Mechanisms of Pathogenesis and Current Therapeutic Strategies. Springer Science & Business Media; 2009 Oct 31, DOI 10.1007/978-1-4419-0410-2_2

[36] Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, Scheithauer BW, Kleihues P. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta neuropathologica. 2007 Aug 1;114(2):97-109.

[37] O’Connor CM, Adams JU, Fairman J. Essentials of cell biology. Cambridge, MA: NPG Education. 2010;1.

[38] Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al hemangiomului cerebral comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din punct de vedere structural, prin chip nanoESI HCT MS. Referat de cercetare științifică

[39] Dunn WB. Mass spectrometry in systems biology an introduction. Methods Enzymol. 2011 Jan 1;500:15-35.

[40] Wenk MR. The emerging field of lipidomics. Nat Rev Drug Discov. 2005 Jul 4(7):594-610

[41] Wymann MP, Schneiter R. Lipid signalling in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Feb 9(2):162–176

[42] van Meer G, Voelker DR, Feigenson GW. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Feb 9(2):112–124

[43] Susan PY. Sphingosine 1-phosphate signalling in mammalian cells. Biochemical Journal. 2000 Jul 15;349(2):385-402.

[44] Shevchenko A, Simons K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature reviews. Molecular cell biology. 2010 Aug 1;11(8):593-98

[45] Quehenberger O, Armando AM, Brown AH, Milne SB, Myers DS, Merrill AH, Bandyopadhyay S, Jones KN, Kelly S, Shaner RL, Sullards CM. Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma. Journal of lipid research. 2010 Nov 1;51(11):3299-305.

[46] Wishart DS, Knox C, Guo AC, Eisner R, Young N, Gautam B, Hau DD, Psychogios N, Dong E, Bouatra S, Mandal R. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic acids research. 2008 Oct 25;37(suppl_1):D603-10.

[47] Han X, Gross RW. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of lipid research. 2003 Jun 1;44(6):1071-9.

[48] Jung HR, Sylvänne T, Koistinen KM, Tarasov K, Kauhanen D, Ekroos K. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2011 Nov 30;1811(11):925-34.

[49] Chaurand P, Cornett DS, Angel PM, Caprioli RM. From whole-body sections down to cellular level, multiscale imaging of phospholipids by MALDI mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 2011 Feb 1;10(2):O110-004259.

[50] Nordström A, O'Maille G, Qin C, Siuzdak G. Nonlinear data alignment for UPLC− MS and HPLC− MS based metabolomics: quantitative analysis of endogenous and exogenous metabolites in human serum. Analytical chemistry. 2006 May 15;78(10):3289-95.

[51] Pluskal T, Castillo S, Villar-Briones A, Orešič M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 2010 Jul 23;11(1):395.

[52] Orešič M. Informatics and computational strategies for the study of lipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2011 Nov 30;1811(11):991-9.

[53] Schmelzer K, Fahy E, Subramaniam S, Dennis EA. The lipid maps initiative in lipidomics. Methods in enzymology. 2007 Dec 31;432:171-83.

[54] Dennis EA, Deems RA, Harkewicz R, Quehenberger O, Brown HA, Milne SB, Myers DS, Glass CK, Hardiman G, Reichart D, Merrill AH. A mouse macrophage lipidome. Journal of Biological Chemistry. 2010 Dec 17;285(51):39976-85.

[55] Do Yup Lee BP, Northen TR. Mass spectrometry–based metabolomics, analysis of metabolite-protein interactions, and imaging. Biotechniques. 2010 Aug;49(2):557.

[56] Farwanah H, Kolter T. Lipidomics of Glycosphingolipids. Metabolites. 2012 Feb 2, 2(1):134-64.

[57] Fahy E, Subramaniam S, Brown HA, Glass CK, Merrill AH, Murphy RC, Raetz CR, Russell DW, Seyama Y, Shaw W, Shimizu T. A comprehensive classification system for lipids. Journal of lipid research. 2005 May 1;46(5):839-62.

[58] Klenk E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden. Hoppe-Seyler´ s Zeitschrift für physiologische Chemie. 1942;273(1-2):76-86.

[59] Klenk E. Über die Ganglioside des Gehirns bei der infantilen amaurotischen Idiotie vom Typ Tay‐Sachs. European Journal of Inorganic Chemistry. 1942 Feb 10;75(12):1632-6.

[60] Blix G. Über die Kohlenhydratgruppen des Submaxillarismucins. Hoppe-Seyler´ s Zeitschrift für physiologische Chemie. 1936;240(1-2):43-54.

[61] Kuhn R, Wiegandt H. Die Konstitution der Ganglio‐N‐tetraose und des Gangliosids GI. European Journal of Inorganic Chemistry. 1963 Mar 1;96(3):866-80.

[62] Svennerholm L. Chromatographlc separation of human brain gangliosides. Journal of neurochemistry. 1963 Sep 1;10(9):613-23.

[63] Svennerholm L. The gangliosides. Journal of lipid research. 1964 Apr 1;5(2):145-55.

[64] Cohen M, Varki A. The sialome—far more than the sum of its parts. Omics: a journal of integrative biology. 2010 Aug 1;14(4):455-64.

[65] Robert K Y, Tsai YT, Ariga T, Yanagisawa M. Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides-an overview. Journal of oleo science. 2011;60(10):537-44.

[66] Angata T, Varki A. Chemical diversity in the sialic acids and related α-keto acids: an evolutionary perspective. Chemical reviews. 2002 Feb 13;102(2):439-70.

[67] Schauer R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current opinion in structural biology. 2009 Oct 31;19(5):507-14.

[68] Kohla G, Schauer R. Sialic acids in gangliosides: origin and function. Neuroglycobiology. 2005:133.

[69] Chester MA. Nomenclature of glycolipids (IUPAC Recommendations 1997). Pure and Applied Chemistry. 1997 Jan 1;69(12):2475-88.

[70] Li YT, Maskos K, Chou CW, Cole RB, Li SC. Presence of an unusual GM2 derivative, taurine-conjugated GM2, in Tay-Sachs brain. Journal of Biological Chemistry. 2003 Sep 12;278(37):35286-91.

[71] Zimmermann P, Sommer R, Bär T, Schmidt RR. Azidosphingosine glycosylation in glycosphingolipid synthesis. Journal of Carbohydrate Chemistry. 1988 May 1;7(2):435-52.

[72] Kannagi R, Cochran NA, Ishigami F, Hakomori SI, Andrews P, Knowles BB, Solter D. Stage-specific embryonic antigens (SSEA-3 and-4) are epitopes of a unique globo-series ganglioside isolated from human teratocarcinoma cells. The embo journal. 1983;2(12):2355-61

[73] Kolter T, Proia RL, Sandhoff K. Combinatorial ganglioside biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 2002 Jul 19;277(29):25859-62.

[74] Yoshino H, Ariga T, Suzuki A, Robert KY, Miyatake T. Identification of gangliosides recognized by IgG anti-GalNAc-GD1a antibodies in bovine spinal motor neurons and motor nerves. Brain research. 2008 Aug 28;1227:216-20.

[75] Kaida K, Sonoo M, Ogawa G, Kamakura K, Ueda-Sada M, Arita M, Motoyoshi K, Kusunoki S. GM1/GalNAc-GD1a complex A target for pure motor Guillain-Barré syndrome. Neurology. 2008 Nov 18;71(21):1683-90.

[76] Ang CW, Yuki N, Jacobs BC, Koga M, Van Doorn PA, Schmitz PI, Van Der Meché FG. Rapidly progressive, predominantly motor Guillain-Barré syndrome with anti-GalNAc-GD1a antibodies. Neurology. 1999 Dec 1;53(9):2122

[77] Yuki N, Hartung HP. Guillain–Barré syndrome. New England Journal of Medicine. 2012 Jun 14;366(24):2294-304.

[78] Yamazaki T, Suzuki M, Irie T, Watanabe T, Mikami H, Ono S. Amyotrophic lateral sclerosis associated with IgG anti-GalNAc-GD1a antibodies. Clinical neurology and neurosurgery. 2008 Jul 31;110(7):722-4.

[79] Levery SB, Salyan ME, Steele SJ, Kannagi R, Dasgupta S, Chien JL, Hogan EL, Vanhalbeek H, Hakomori SI. A revised structure for the disialosyl globo-series gangliosides of human erythrocytes and chicken skeletal muscle. Archives of biochemistry and biophysics. 1994 Jul 1;312(1):125-34.

[80] Stapleton AE, Stroud MR, Hakomori SI, Stamm WE. The globoseries glycosphingolipid sialosyl galactosyl globoside is found in urinary tract tissues and is a preferred binding receptor in vitro for uropathogenic Escherichia coli expressing pap-encoded adhesins. Infection and immunity. 1998 Aug 1;66(8):3856-61.

[81] Suila H, Pitkänen V, Hirvonen T, Heiskanen A, Anderson H, Laitinen A, Natunen S, Miller-Podraza H, Satomaa T, Natunen J, Laitinen S. Are globoseries glycosphingolipids SSEA-3 and-4 markers for stem cells derived from human umbilical cord blood?. Journal of molecular cell biology. 2010 Dec 12;3(2):99-107..

[82] Ghaderi D, Zhang M, Hurtado-Ziola N, Varki A. Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 2012 Jan 1;28(1):147-76..

[83] Kaneko M, Yamada K, Miyamoto T, Inagaki M, Higuchi R. Neuritogenic activity of gangliosides from echinoderms and their structure–activity relationship. Chemical and pharmaceutical bulletin. 2007;55(3):462-3..

[84] Kaneko M, Kisa F, Yamada K, Miyamoto T, Higuchi R. Structure of a New Neuritogenic‐Active Ganglioside from the Sea Cucumber Stichopus japonicus. European Journal of Organic Chemistry. 2003 Mar 1;2003(6):1004-8..

[85] Pruett ST, Bushnev A, Hagedorn K, Adiga M, Haynes CA, Sullards MC, Liotta DC, Merrill AH. Thematic Review Series: Sphingolipids. Biodiversity of sphingoid bases (“sphingosines”) and related amino alcohols. Journal of lipid research. 2008 Aug 1;49(8):1621-39..

[86] Dasgupta S, Levery SB, Hogan EL. 3-O-acetyl-sphingosine-series myelin glycolipids characterization of novel 3-O-acetyl-sphingosine galactosylceramide. Journal of lipid research. 2002 May 1;43(5):751-61..

[87] Hama H. Fatty acid 2-Hydroxylation in mammalian sphingolipid biology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2010 Apr 30;1801(4):405-14..

[88] Mahfoud R, Manis A, Binnington B, Ackerley C, Lingwood CA. A major fraction of glycosphingolipids in model and cellular cholesterol-containing membranes is undetectable by their binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 2010 Nov 12;285(46):36049-59..

[89] Lingwood CA, Manis A, Mahfoud R, Khan F, Binnington B, Mylvaganam M. New aspects of the regulation of glycosphingolipid receptor function. Chemistry and physics of lipids. 2010 Jan 31;163(1):27-35..

[90] Svennerholm L, Fredman P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1980 Jan 18;617(1):97-109.

[91] IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur J Biochem. 1998 257:293–98

[92] Domon B, Costello CE. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate journal. 1988 Dec 31;5(4):397-409.

[93] Rahmann H. Brain gangliosides and memory formation. Behavioural brain research. 1995 Jan 23;66(1):105-16..

[94] Wang B. Sialic acid is an essential nutrient for brain development and cognition. Annual review of nutrition. 2009 Aug 21;29:177-222..

[95] Hirschberg, K., Zisling, R., van Echten-Deckert, G. and Futerman, A.H., 1996. Ganglioside Synthesis during the development of neuronal polarity major changes occur during axonogenesis and axon elongation, but not during dendrite growth or synaptogenesis. Journal of Biological Chemistry, 271(25), pp.14876-14882.

[96] Yamashita T, Wada R, Sasaki T, Deng C, Bierfreund U, Sandhoff K, Proia RL. A vital role for glycosphingolipid synthesis during development and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999 Aug 3;96(16):9142-7..

[97] Kwak DH, Seo BB, Chang KT, Choo YK. Roles of gangliosides in mouse embryogenesis and embryonic stem cell differentiation. Experimental & molecular medicine. 2011 Jul 31;43(7):379.

[98] Hakomori SI. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingo (glyco) lipid metabolism. Cancer research. 1996 Dec 1;56(23):5309-18.

[99] Posse de Chaves E, Sipione S. Sphingolipids and gangliosides of the nervous system in membrane function and dysfunction. FEBS letters. 2010 May 3;584(9):1748-59.

[100] Robert KY, Nakatani Y, Yanagisawa M. The role of glycosphingolipid metabolism in the developing brain. Journal of lipid research. 2009 Apr 1;50(Supplement):S440-5.

[101] Segler-Stahl K, Webster JC, Brunngraber EG. Changes in the concentration and composition of human brain gangliosides with aging. Gerontology. 1983;29(3):161-8.

[102] Ando S. Neuronal dysfunction with aging and its amelioration. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 2012 Jun 11;88(6):266-82.

[103] Senn HJ, Orth M, Fitzke E, Wieland H, Gerok W. Gangliosides in normal human serum. The FEBS Journal. 1989 May 1;181(3):657-62.

[104] Miller-Podraza H, Bradley RM, Fishman PH. Biosynthesis and localization of gangliosides in cultured cells. Biochemistry. 1982 Jul;21(14):3260-5.

[105] Garofalo T, Tinari A, Matarrese P, Giammarioli AM, Manganelli V, Ciarlo L, Misasi R, Sorice M, Malorni W. Do mitochondria act as “cargo boats” in the journey of GD3 to the nucleus during apoptosis?. FEBS letters. 2007 Aug 21;581(21):3899-903.

[106] Ledeen R, Wu G. New findings on nuclear gangliosides: overview on metabolism and function. Journal of neurochemistry. 2011 Mar 1;116(5):714-20.

[107] Kohla G, Stockfleth E, Schauer R. Gangliosides with O-acetylated sialic acids in tumors of neuroectodermal origin. Neurochemical research. 2002 Aug 1;27(7):583-92.

[108] Schwegmann-Weßels C, Herrler G. Sialic acids as receptor determinants for coronaviruses. Glycoconjugate journal. 2006 Feb 27;23(1):51-8.

[109] Malykh YN, Schauer R, Shaw L. N-Glycolylneuraminic acid in human tumours. Biochimie. 2001 Jul 31;83(7):623-34.

[110] Diaz SL, Padler-Karavani V, Ghaderi D, Hurtado-Ziola N, Yu H, Chen X, Brinkman-Van der Linden EC, Varki A, Varki NM. Sensitive and specific detection of the non-human sialic Acid N-glycolylneuraminic acid in human tissues and biotherapeutic products. PLoS One. 2009 Jan 21;4(1):e4241.

[111] Zarei M, Müthing J, Peter-Katalinić J, Bindila L. Separation and identification of GM1b pathway Neu5Ac-and Neu5Gc gangliosides by on-line nanoHPLC-QToF MS and tandem MS: Toward glycolipidomics screening of animal cell lines. Glycobiology. 2009 Sep 30;20(1):118-26.

[112] Blanco R, Rengifo CE, Cedeño M, Frómeta M, Rengifo E, Carr A. Immunoreactivity of the 14F7 Mab (raised against N-glycolyl GM3 ganglioside) as a positive prognostic factor in non-small-cell lung cancer. Pathology research international. 2012 Feb 26;2012.

[113] Gross SK, Williams MA, McCluer RH. Alkali‐Labile, Sodium Borohydride‐Reducible Ganglioside Sialic Acid Residues in Brain. Journal of neurochemistry. 1980 Jun 1;34(6):1351-61.

[114] Riboni L, Sonnino S, Acquotti D, Malesci A, Ghidoni R, Egge H, Mingrino S, Tettamanti G. Natural occurrence of ganglioside lactones. Isolation and characterization of GD1b inner ester from adult human brain. Journal of Biological Chemistry. 1986 Jun 25;261(18):8514-9.

[115] Nores GA, Dohi T, Taniguchi M, Hakomori SI. Density-dependent recognition of cell surface GM3 by a certain anti-melanoma antibody, and GM3 lactone as a possible immunogen: requirements for tumor-associated antigen and immunogen. The Journal of Immunology. 1987 Nov 1;139(9):3171-6.

[116] Sonnino S, Chigorno V. Ganglioside molecular species containing C18-and C20-sphingosine in mammalian nervous tissues and neuronal cell cultures. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Biomembranes. 2000 Sep 18;1469(2):63-77.

[117] Palestini P, Masserini M, Fiorilli A, Calappi E, Tettamanti G. Age‐Related Changes in the Ceramide Composition of the Major Gangliosides Present in Rat Brain Subcellular Fractions Enriched in Plasma Membranes of Neuronal and Myelin Origin. Journal of neurochemistry. 1993 Sep 1;61(3):955-60.

[118] Valsecchi M, Palestini P, Chigorno V, Sonnino S, Tettamanti G. Changes in the Ganglioside Long‐Chain Base Composition of Rat Cerebellar Granule Cells During Differentiation and Aging in Culture. Journal of neurochemistry. 1993 Jan 1;60(1):193-6.

[119] Sugiura Y, Shimma S, Konishi Y, Yamada MK, Setou M. Imaging mass spectrometry technology and application on ganglioside study; visualization of age-dependent accumulation of C20-ganglioside molecular species in the mouse hippocampus. PLoS One. 2008 Sep 18;3(9):e3232.

[120] Ogawa‐Goto K, Funamoto N, Abe T, Nagashima K. Different ceramide compositions of gangliosides between human motor and sensory nerves. Journal of neurochemistry. 1990 Nov 1;55(5):1486-93.

[121] Farwanah H, Kolter T. Lipidomics of glycosphingolipids. Metabolites. 2012 Feb 2;2(1):134-64.

[122] Lacomba R, Salcedo J, Alegría A, Lagarda MJ, Barberá R, Matencio E. Determination of sialic acid and gangliosides in biological samples and dairy products: a review. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 2010 Jan 20;51(2):346-57.

[123] Wang WQ, Gustafson A. Ganglioside extraction from erythrocytes: a comparison study. Acta Chemica Scandinavica. 1995 Dec 1;49(12):929.

[124] Byrne MC, Sbaschnig-Agler M, Aquino DA, Sclafani JR, Ledeen RW. Procedure for isolation of gangliosides in high yield and purity: simultaneous isolation of neutral glycosphingolipids. Analytical biochemistry. 1985 Jul 1;148(1):163-73.

[125] Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J biol Chem. 1957 May 1;226(1):497-509.

[126] ] Manzi AE, Hayes BK. HPLC methods for the fractionation and analysis of negatively charged oligosaccharides and gangliosides. Current Protocols in Molecular Biology. 2001 May:17-21.

[127] Robert KY, Ledeen RW. Gangliosides of human, bovine, and rabbit plasma. Journal of lipid research. 1972 Sep 1;13(5):680-6.

[128] Riboni L, Sonnino S, Acquotti D, Malesci A, Ghidoni R, Egge H, Mingrino S, Tettamanti G. Natural occurrence of ganglioside lactones. Isolation and characterization of GD1b inner ester from adult human brain. Journal of Biological Chemistry. 1986 Jun 25;261(18):8514-9.

[129] Jiang X, Cheng H, Yang K, Gross RW, Han X. Alkaline methanolysis of lipid extracts extends shotgun lipidomics analyses to the low-abundance regime of cellular sphingolipids. Analytical biochemistry. 2007 Dec 15;371(2):135-45.

[130] Vukelić Ž, Kalanj-Bognar S, Froesch M, Bîndilă L, Radić B, Allen M, Peter-Katalinić J, Zamfir AD. Human gliosarcoma-associated ganglioside composition is complex and distinctive as evidenced by high-performance mass spectrometric determination and structural characterization. Glycobiology. 2007 Feb 9;17(5):504-15.

[131] Scandroglio F, Loberto N, Valsecchi M, Chigorno V, Prinetti A, Sonnino S, Thin layer chromatography of gangliosides, Glycoconjugate Journal, 2009 Nov 26, (8)961– 973

[132] Sisu E, Flangea C, Serb A, Rizzi A, Zamfir AD. High‐performance separation techniques hyphenated to mass spectrometry for ganglioside analysis. Electrophoresis. 2011 Jun 1;32(13):1591-609.

[133] T. Tai, I. Kawashima, and K. Ogura, “Anticarbohydrate antibodies,” in Comprehensive Glycoscience, J. P. Kamerling, J. P. Kamerling, G. J. Boons et al., Eds., vol. 3, pp. 765–783, Elsevier, Oxford, UK, 2007.

[134] Meisen I, Mormann M, Müthing J. Thin-layer chromatography, overlay technique and mass spectrometry: a versatile triad advancing glycosphingolipidomics. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2011 Nov 30;1811(11):875-96.

[135] Valdes‐Gonzalez T, Goto‐Inoue N, Hirano W, Ishiyama H, Hayasaka T, Setou M, Taki T. New approach for glyco‐and lipidomics–Molecular scanning of human brain gangliosides by TLC‐Blot and MALDI‐QIT‐TOF MS. Journal of neurochemistry. 2011 Mar 1;116(5):678-83.

[136] Gallala HD, Sandhoff K. Principles of microdomain formation in biological membranes-Are there lipid liquid ordered domains in living cellular membranes?. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2008 Jan 1;20(116):277-95.

[137] Levery SB. Glycosphingolipid structural analysis and glycosphingolipidomics. Methods in enzymology. 2005 Dec 31;405:300-69.

[138] Varki A. Evolutionary forces shaping the Golgi glycosylation machinery: why cell surface glycans are universal to living cells. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2011 Jun 1;3(6):a005462.

[139] Tettamanti G. Ganglioside/glycosphingolipid turnover: new concepts. Glycoconjugate journal. 2003 Jun 1;20(5):301-17.

[140] Merrill Jr AH. Sphingolipid and glycosphingolipid metabolic pathways in the era of sphingolipidomics. Chemical reviews. 2011 Sep 26;111(10):6387-422.

[141] Ikushiro H, Hayashi H. Mechanistic enzymology of serine palmitoyltransferase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 2011 Nov 30;1814(11):1474-80.

[142] Hirabayashi Y, Furuya S. Roles of l-serine and sphingolipid synthesis in brain development and neuronal survival. Progress in lipid research. 2008 May 31;47(3):188-203.

[143] Hirabayashi Y. A world of sphingolipids and glycolipids in the brain—Novel functions of simple lipids modified with glucose—. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 2012 Apr 11;88(4):129-43.

[144] Mullen TD, Hannun YA, Obeid LM. Ceramide synthases at the centre of sphingolipid metabolism and biology. Biochemical Journal. 2012 Feb 1;441(3):789-802.

[145] Zhao L, Spassieva SD, Jucius TJ, Shultz LD, Shick HE, Macklin WB, Hannun YA, Obeid LM, Ackerman SL. A deficiency of ceramide biosynthesis causes cerebellar purkinje cell neurodegeneration and lipofuscin accumulation. PLoS genetics. 2011 May 19;7(5):e1002063.

[146] Mizutani Y, Kihara A, Chiba H, Tojo H, Igarashi Y. 2-Hydroxy-ceramide synthesis by ceramide synthase family: enzymatic basis for the preference of FA chain length. Journal of lipid research. 2008 Nov 1;49(11):2356-64.

[147] Fabrias G, Muñoz-Olaya J, Cingolani F, Signorelli P, Casas J, Gagliostro V, Ghidoni R. Dihydroceramide desaturase and dihydrosphingolipids: debutant players in the sphingolipid arena. Progress in lipid research. 2012 Apr 30;51(2):82-94.

[148] Olayioye MA, Hausser A. Integration of non-vesicular and vesicular transport processes at the Golgi complex by the PKD–CERT network. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2012 Aug 31;1821(8):1096-103.

[149] Maccioni HJ, Quiroga R, Ferrari ML. Cellular and molecular biology of glycosphingolipid glycosylation. Journal of neurochemistry. 2011 May 1;117(4):589-602.

[150] Basu SC. The serendipity of ganglioside biosynthesis: pathway to CARS and HY-CARS glycosyltransferases. Glycobiology. 1991 Nov 1;1(5):469-75.

[151] Iber H, Zacharias C, Sandhoff K. The c-series gangliosides GT3, GT2 and GP1c are formed in rat liver Golgi by the same set of glycosyltransferases that catalyse the biosynthesis of asialo-, a-and b-series gangliosides. Glycobiology. 1992 Apr 1;2(2):137-42.

[152] Audry M, Jeanneau C, Imberty A, Harduin-Lepers A, Delannoy P, Breton C. Current trends in the structure–activity relationships of sialyltransferases. Glycobiology. 2010 Nov 22;21(6):716-26.

[153] Svennerholm L, Rynmark BM, Vilbergsson G, Fredman P, Gottfries J, Månsson JE, Percy A. Gangliosides in human fetal brain. Journal of neurochemistry. 1991 May 1;56(5):1763-8.

[154] Kotani M, Kawashima I, Ozawa H, Terashima T, Tai T. Differential distribution of major gangliosides in rat central nervous system detected by specific monoclonal antibodies. Glycobiology. 1993 Apr 1;3(2):137-46.

[155] Daniotti JL, Iglesias‐Bartolomé R. Metabolic pathways and intracellular trafficking of gangliosides. IUBMB life. 2011 Jul 1;63(7):513-20.

[156] Zhu G, Allende ML, Jaskiewicz E, Qian R, Darling DS, Worth CA, Colley KJ, Young Jr WW. Two soluble glycosyltransferases glycosylate less efficiently in vivo than their membrane bound counterparts. Glycobiology. 1998 Aug 1;8(8):831-40.

[157] Crespo PM, Demichelis VT, Daniotti JL. Neobiosynthesis of glycosphingolipids by plasma membrane-associated glycosyltransferases. Journal of Biological Chemistry. 2010 Sep 17;285(38):29179-90.

[158] Itonori S, Sugita M. Glycophylogenetic aspects of lower animals. Comprehensive Glycoscience. 2007;3:253-84.

[159] Banchet-Cadeddu A, Hénon E, Dauchez M, Renault JH, Monneaux F, Haudrechy A. The stimulating adventure of KRN 7000. Organic & biomolecular chemistry. 2011;9(9):3080-104.

[160] Kuhn R, Wiegandt H. Further gangliosides from the human brain. Zeitschrift fur Naturforschung. Teil B, Chemie, Biochemie, Biophysik, Biologie und verwandte Gebiete. 1964 Mar;19:256.

[161] Ledeen RW, Yu RK, Eng LF. Gangliosides of human myelin: sialosylgalactosylceramide (G7) as a major component. Journal of neurochemistry. 1973 Oct 1;21(4):829-39.

[162] Jackman N, Ishii A, Bansal R. Oligodendrocyte development and myelin biogenesis: parsing out the roles of glycosphingolipids. Physiology. 2009 Oct 1;24(5):290-7.

[163] Boggs JM, Gao W, Zhao J, Park HJ, Liu Y, Basu A. Participation of galactosylceramide and sulfatide in glycosynapses between oligodendrocyte or myelin membranes. FEBS letters. 2010 May 3;584(9):1771-8.

[164] Maldonado EN, Alderson NL, Monje PV, Wood PM, Hama H. FA2H is responsible for the formation of 2-hydroxy galactolipids in peripheral nervous system myelin. Journal of lipid research. 2008 Jan 1;49(1):153-61.

[165] Stewart RJ, Boggs JM. A carbohydrate-carbohydrate interaction between galactosylceramide-containing liposomes and cerebroside sulfate-containing liposomes: dependence on the glycolipid ceramide composition. Biochemistry. 1993 Oct;32(40):10666-74.

[166] Saadat L, Dupree JL, Kilkus J, Han X, Traka M, Proia RL, Dawson G, Popko B. Absence of oligodendroglial glucosylceramide synthesis does not result in CNS myelin abnormalities or alter the dysmyelinating phenotype of CGT‐deficient mice. Glia. 2010 Mar 1;58(4):391-8.

[167] Schulte S, Stoffel W. Ceramide UDPgalactosyltransferase from myelinating rat brain: purification, cloning, and expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1993 Nov 1;90(21):10265-9.

[168] Tennekoon G, Zaruba M, Wolinsky J. Topography of cerebroside sulfotransferase in Golgi-enriched vesicles from rat brain. The Journal of cell biology. 1983 Oct 1;97(4):1107-12.

[169] Sprong H, Kruithof B, Leijendekker R, Slot JW, van Meer G, van der Sluijs P. UDP-galactose: ceramide galactosyltransferase is a class I integral membrane protein of the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 1998 Oct 2;273(40):25880-8.

[170] Chisada SI, Yoshimura Y, Sakaguchi K, Uemura S, Go S, Ikeda K, Uchima H, Matsunaga N, Ogura K, Tai T, Okino N. Zebrafish and mouse α2, 3-sialyltransferases responsible for synthesizing GM4 ganglioside. Journal of Biological Chemistry. 2009 Oct 30;284(44):30534-46.

[171] Mullin BR, Patrick DH, Poore CM, Smith MT. Prevention of experimental allergic encephalomyelitis by ganglioside G M4. Brain research. 1984 Mar 26;296(1):174-6.

[172] P. Paul, Y. Kamisaka, D. L. Marks, and R. E. Pagano, “Purification and characterization of UDP-glucose:ceramide glucosyltransferase from rat liver Golgi membranes,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 271, no. 4, pp. 2287–2293, 1996

[173] Marks DL, Wu K, Paul P, Kamisaka Y, Watanabe R, Pagano RE. Oligomerization and topology of the Golgi membrane protein glucosylceramide synthase. Journal of Biological Chemistry. 1999 Jan 1;274(1):451-6.

[174] Marks DL, Dominguez M, Wu K, Pagano RE. Identification of Active Site Residues in Glucosylceramide Synthase A NUCLEOTIDE-BINDING/CATALYTIC MOTIF CONSERVED WITH PROCESSIVE β-GLYCOSYLTRANSFERASES. Journal of Biological Chemistry. 2001 Jul 13;276(28):26492-8.

[175] Coste H, Martel MB, Got R. Topology of glucosylceramide synthesis in Golgi membranes from porcine submaxillary glands. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1986 Jun 13;858(1):6-12.

[176] Lannert H, Bünning G, Jeckel D, Wieland FT. Lactosylceramide is synthesized in the lumen of the Golgi apparatus. FEBS letters. 1994 Mar 28;342(1):91-6.

[177] van Helvoort A, Smith AJ, Sprong H, Fritzsche I, Schinkel AH, Borst P, van Meer G. MDR1 P-glycoprotein is a lipid translocase of broad specificity, while MDR3 P-glycoprotein specifically translocates phosphatidylcholine. Cell. 1996 Nov 1;87(3):507-17.

[178] Halter D, Neumann S, van Dijk SM, Wolthoorn J, De Maziere AM, Vieira OV, Mattjus P, Klumperman J, van Meer G, Sprong H. Pre-and post-Golgi translocation of glucosylceramide in glycosphingolipid synthesis. J Cell Biol. 2007 Oct 8;179(1):101-15.

[179] Chalat M, Menon I, Turan Z, Menon AK. Reconstitution of Glucosylceramide Flip-Flop across Endoplasmic Reticulum IMPLICATIONS FOR MECHANISM OF GLYCOSPHINGOLIPID BIOSYNTHESIS. Journal of Biological Chemistry. 2012 May 4;287(19):15523-32.

[180] D'angelo G, Polishchuk E, Di Tullio G, Santoro M, Di Campli A, Godi A, West G, Bielawski J, Chia-Chen C, van der Spoel AC, Platt FM. Glycosphingolipid synthesis requires FAPP2 transfer of glucosylceramide. Nature. 2007 Sep 6;449(7158):62.

[181] Kolter T. Ganglioside biochemistry. ISRN biochemistry. 2012 Dec 19;2012

[182] Takizawa M, Nomura T, Wakisaka E, Yoshizuka N, Aoki J, Arai H, Inoue K, Hattori M, Matsuo N. cDNA cloning and expression of human lactosylceramide synthase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1999 May 18;1438(2):301-4.

[183] Martinez Z, Zhu M, Han S, Fink AL. GM1 specifically interacts with α-synuclein and inhibits fibrillation. Biochemistry. 2007 Feb 20;46(7):1868-77.

[184] Yamashita T, Wu YP, Sandhoff R, Werth N, Mizukami H, Ellis JM, Dupree JL, Geyer R, Sandhoff K, Proia RL. Interruption of ganglioside synthesis produces central nervous system degeneration and altered axon–glial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005 Feb 22;102(8):2725-30.

[185] Wang Y, Yamaguchi K, Wada T, Hata K, Zhao X, Fujimoto T, Miyagi T. A close association of the ganglioside-specific sialidase Neu3 with caveolin in membrane microdomains. Journal of Biological Chemistry. 2002 Jul 19;277(29):26252-9.

[186] Miyata M, Kambe M, Tajima O, Moriya S, Sawaki H, Hotta H, Kondo Y, Narimatsu H, Miyagi T, Furukawa K, Furukawa K. Membrane sialidase NEU3 is highly expressed in human melanoma cells promoting cell growth with minimal changes in the composition of gangliosides. Cancer science. 2011 Dec 1;102(12):2139-49.

[187] Wang J, Wu G, Miyagi T, Lu ZH, Ledeen RW. Sialidase occurs in both membranes of the nuclear envelope and hydrolyzes endogenous GD1a. Journal of neurochemistry. 2009 Oct 1;111(2):547-54.

[188] Ito M, Degradation of glycolipids, in Comprehensive Glycoscience, Eds., vol. 3, pp. 193–208, Elsevier, Oxford, UK, 2007

[189] Kolter T, Sandhoff K. Lysosomal degradation of membrane lipids. FEBS letters. 2010 May 3;584(9):1700-12.

[190] Fürst W, Sandhoff K. Activator proteins and topology of lysosomal sphingolipid catabolism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1992 Jun 5;1126(1):1-6.

[191] Rich JR, Cunningham AM, Gilbert M, Withers SG. Glycosphingolipid synthesis employing a combination of recombinant glycosyltransferases and an endoglycoceramidase glycosynthase. Chemical Communications. 2011;47(38):10806-8.

[192] Johansson AC, Appelqvist H, Nilsson C, Kågedal K, Roberg K, Öllinger K. Regulation of apoptosis-associated lysosomal membrane permeabilization. Apoptosis. 2010 May 1;15(5):527-40.

[193] Möbius W, Van Donselaar E, Ohno‐Iwashita Y, Shimada Y, Heijnen HF, Slot JW, Geuze HJ. Recycling compartments and the internal vesicles of multivesicular bodies harbor most of the cholesterol found in the endocytic pathway. Traffic. 2003 Apr 1;4(4):222-31.

[194] Gallala HD, Sandhoff K. Biological function of the cellular lipid BMP—BMP as a key activator for cholesterol sorting and membrane digestion. Neurochemical research. 2011 Sep 1;36(9):1594-600.

[195] Scherer M, Schmitz G. Metabolism, function and mass spectrometric analysis of bis (monoacylglycero) phosphate and cardiolipin. Chemistry and physics of lipids. 2011 Sep 30;164(6):556-62.

[196] Kobayashi T, Beuchat MH, Chevallier J, Makino A, Mayran N, Lebrand C, Cosson P, Kobayashi T, Gruenberg J. Separation and characterization of late endosomal membrane domains. Journal of Biological Chemistry. 2002 Aug 30;277(35):32157-64.

[197] Saftig P, Schröder B, Blanz J. Lysosomal membrane proteins: life between acid and neutral conditions.

[198] Henning R, Stoffel W. Glycosphingolipids in lysosomal membranes. Hoppe-Seyler´ s Zeitschrift für physiologische Chemie. 1973;354(2):760-70.

[199] Kolter T, Sandhoff K. Principles of lysosomal membrane digestion: stimulation of sphingolipid degradation by sphingolipid activator proteins and anionic lysosomal lipids. Annual review of cell and developmental biology. 2005 Oct 7;21.

[200] Locatelli-Hoops S, Remmel N, Klingenstein R, Breiden B, Rossocha M, Schoeniger M, Koenigs C, Saenger W, Sandhoff K. saposin a mobilizes lipids from low cholesterol and high bis (monoacylglycerol) phosphate-containing membranes patient variant saposin a lacks lipid extraction capacity. Journal of Biological Chemistry. 2006 Oct 27;281(43):32451-60.

[201] Remmel N, Locatelli‐Hoops S, Breiden B, Schwarzmann G, Sandhoff K. Saposin B mobilizes lipids from cholesterol‐poor and bis (monoacylglycero) phosphate‐rich membranes at acidic pH. The FEBS journal. 2007 Jul 1;274(13):3405-20.

[202] Werth N, Schuette CG, Wilkening G, Lemm T, Sandhoff K. Degradation of Membrane-bound Ganglioside GM2 by β-Hexosaminidase a stimulation by GM2 activator protein and lysosomal lipids. Journal of Biological Chemistry. 2001 Apr 20;276(16):12685-90.

[203] Wilkening G, Linke T, Uhlhorn-Dierks G, Sandhoff K. Degradation of Membrane-bound Ganglioside GM1 STIMULATION BY BIS (MONOACYLGLYCERO) PHOSPHATE AND THE ACTIVATOR PROTEINS SAP-B AND GM2-AP. Journal of Biological Chemistry. 2000 Nov 17;275(46):35814-9.

[204] . Sandhoff R, Hepbildikler ST, Jennemann R, Geyer R, Gieselmann V, Proia RL, Wiegandt H, Gröne HJ. Kidney sulfatides in mouse models of inherited glycosphingolipid disorders determination by nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 2002 Jun 7;277(23):20386-98.

[205] Abdul-Hammed M, Breiden B, Adebayo MA, Babalola JO, Schwarzmann G, Sandhoff K. Role of endosomal membrane lipids and NPC2 in cholesterol transfer and membrane fusion. Journal of lipid research. 2010 Jul 1;51(7):1747-60.

[206] Walkley SU, Vanier MT. Secondary lipid accumulation in lysosomal disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 2009 Apr 30;1793(4):726-36.

[207] Cox TM, Cachón‐González MB. The cellular pathology of lysosomal diseases. The Journal of pathology. 2012 Jan 1;226(2):241-54.

[208] Platt FM, Lachmann RH. Treating lysosomal storage disorders: current practice and future prospects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 2009 Apr 30;1793(4):737-45.

[209] Leinekugel P, Michel S, Conzelmann E, Sandhoff K. Quantitative correlation between the residual activity of β-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Human genetics. 1992 Mar 1;88(5):513-23.

[210] Zervas M, Somers KL, Thrall MA, Walkley SU. Critical role for glycosphingolipids in Niemann-Pick disease type C. Current Biology. 2001 Aug 21;11(16):1283-7.

[211] Campos D, Monaga M. Mucopolysaccharidosis type I: current knowledge on its pathophysiological mechanisms. Metabolic brain disease. 2012 Jun 1;27(2):121-9.

[212] Aridor M, Hannan LA. Traffic jams II: an update of diseases of intracellular transport. Traffic. 2002 Sep 1;3(11):781-90.

[213] Jeyakumar M, Williams I, Smith DA, Cox TM, Platt FM. Critical role of iron in the pathogenesis of the murine gangliosidoses. Neurobiology of disease. 2009 Jun 30;34(3):406-16.

[214] Settembre C, Fraldi A, Rubinsztein DC, Ballabio A. Lysosomal storage diseases as disorders of autophagy. Autophagy. 2008 Jan 1;4(1):113-4.

[215] Conzelmann E, Sandhoff K. Partial enzyme deficiencies: residual activities and the development of neurological disorders. Developmental neuroscience. 1983;6(1):58-71.

[216] Kolter T, Sandhoff K. Sphingolipid metabolism diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2006 Dec 31;1758(12):2057-79.

[217] Kolter T. A view on sphingolipids and disease. Chemistry and physics of lipids. 2011 Sep 30;164(6):590-606.

[218] Yanagisawa K. Pathological significance of ganglioside clusters in Alzheimer’s disease. Journal of neurochemistry. 2011 Mar 1;116(5):806-12.

[219] Robert KY, Tsai YT, Ariga T. Functional roles of gangliosides in neurodevelopment: an overview of recent advances. Neurochemical research. 2012 Jun 1;37(6):1230-44.

[220] Prinetti A, Prioni S, Loberto N, Aureli M, Nocco V, Illuzzi G, Mauri L, Valsecchi M, Chigorno V, Sonnino S. Aberrant Glycosphingolipid Expression and Membrane Organization in Tumor Cells: Consequences on Tumor–Host Interactions. InThe Molecular Immunology of Complex Carbohydrates-3 2011 (pp. 643-667). Springer US.

[221] Fernandez LE, Gabri MR, Guthmann MD, Gomez RE, Gold S, Fainboim L, Gomez DE, Alonso DF. NGcGM3 ganglioside: a privileged target for cancer vaccines. Clinical and Developmental Immunology. 2010 Oct 27;2010.

[222] Heimburg-Molinaro J, Lum M, Vijay G, Jain M, Almogren A, Rittenhouse-Olson K. Cancer vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine. 2011 Nov 8;29(48):8802-26.

[223] Durrant LG, Noble P, Spendlove I. Immunology in the clinic review series; focus on cancer: glycolipids as targets for tumour immunotherapy. Clinical & Experimental Immunology. 2012 Feb 1;167(2):206-15.

[224] Uncini A. A common mechanism and a new categorization for anti-ganglioside antibody-mediated neuropathies. Experimental neurology. 2012 Jun 30;235(2):513-6.

[225] Uncini A. A common mechanism and a new categorization for anti-ganglioside antibody-mediated neuropathies. Experimental neurology. 2012 Jun 30;235(2):513-6.

[226] Svennerholm L, Bråne G, Karlsson I, Lekman A, Ramström I, Wikkelsö C. Alzheimer disease–effect of continuous intracerebroventricular treatment with GM1 ganglioside and a systematic activation programme. Dementia and geriatric cognitive disorders. 2002;14(3):128-36.

[227] Inokuchi JI. Inhibition of ganglioside biosynthesis as a novel therapeutic approach in insulin resistance. InDiabetes-Perspectives in Drug Therapy 2011 (pp. 165-178). Springer Berlin Heidelberg.

[228] Thomas RJ. Receptor mimicry as novel therapeutic treatment for biothreat agents. Bioengineered bugs. 2010 Jan;1(1):17.

[229] Bachis A, Mocchetti I. Semisynthetic sphingoglycolipid LIGA20 is neuroprotective against human immunodeficiency virus‐gp120‐mediated apoptosis. Journal of neuroscience research. 2006 Apr 1;83(5):890-6.

[230] Todeschini AR, Hakomori SI. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 2008 Mar 31;1780(3):421-33.

[231] Kopitz J, von Reitzenstein C, Burchert M, Cantz M, Gabius HJ. Galectin-1 is a major receptor for ganglioside GM1, a product of the growth-controlling activity of a cell surface ganglioside sialidase, on human neuroblastoma cells in culture. Journal of Biological Chemistry. 1998 May 1;273(18):11205-11.

[232] Lopez PH, Schnaar RL. Gangliosides in cell recognition and membrane protein regulation. Current opinion in structural biology. 2009 Oct 31;19(5):549-57.

[233] Kojima N, Hakomori SI. Specific interaction between gangliotriaosylceramide (Gg3) and sialosyllactosylceramide (GM3) as a basis for specific cellular recognition between lymphoma and melanoma cells. Journal of Biological Chemistry. 1989 Dec 5;264(34):20159-62.

[234] Schnaar RL. Brain gangliosides in axon–myelin stability and axon regeneration. FEBS letters. 2010 May 3;584(9):1741-7.

[235] Inokuchi J, Kabayama K. Receptor modifications in glycobiology, in Comprehensive Glycoscience, Kamerling JP, Boons GJ, Lee YC, Suzuki A, Taniguchi N, Voragen AGJ, Eds., vol. 3, pp. 733–743, Elsevier, Oxford, UK, 2007

[236] Schnaar RL. Neural functions of glycolipids, in Comprehensive Glycoscience, Kamerling JP, Boons GJ, Lee YC, Suzuki A, Taniguchi N, Voragen AGJ, Eds., vol. 4, pp. 323–337, Elsevier, Oxford, UK, 2007

[237] Coskun Ü, Grzybek M, Drechsel D, Simons K. Regulation of human EGF receptor by lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011 May 31;108(22):9044-8.

[238] Cantù L, Del Favero E, Sonnino S, Prinetti A. Gangliosides and the multiscale modulation of membrane structure. Chemistry and physics of lipids. 2011 Nov 30;164(8):796-810.

[239] Sonnino S, Mauri L, Chigorno V, Prinetti A, Kudo T, Fujii T, Ikegami S, Inokuchi K, Takayama Y, Ikehara Y, Nishihara S. Gangliosides as components of lipid membrane domains. Glycobiology. 2007;17(10):1030.

[240] Lippincott-Schwartz J, Phair RD. Lipids and cholesterol as regulators of traffic in the endomembrane system. Annual review of biophysics. 2010 Jun 9;39:559-78.

[241] Simons K, Gerl MJ. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nature reviews. Molecular cell biology. 2010 Oct 1;11(10):688.

[242] Gallala HD, Sandhoff K. Principles of microdomain formation in biological membranes-Are there lipid liquid ordered domains in living cellular membranes?. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2008 Jan 1;20(116):277-95.

[243] Pike LJ. Rafts defined: a report on the Keystone Symposium on Lipid Rafts and Cell Function. Journal of lipid research. 2006 Jul 1;47(7):1597-8.

[244] Heffer-Lauc M, Lauc G, Nimrichter L, Fromholt SE, Schnaar RL. Membrane redistribution of gangliosides and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in brain tissue sections under conditions of lipid raft isolation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2005 Jan 5;1686(3):200-8.

[245] Eggeling C, Ringemann C, Medda R, Schwarzmann G, Sandhoff K, Polyakova S, Belov VN, Hein B, von Middendorff C, Schönle A, Hell SW. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 2009 Feb 26;457(7233):1159-62

[246] Brameshuber M, Weghuber J, Ruprecht V, Gombos I, Horváth I, Vigh L, Eckerstorfer P, Kiss E, Stockinger H, Schütz GJ. Imaging of mobile long-lived nanoplatforms in the live cell plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 2010 Dec 31;285(53):41765-71.

[247] Janas T, Janas T. Membrane oligo-and polysialic acids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2011 Dec 31;1808(12):2923-32.

[248] Salazar BC, Castaño S, Sánchez JC, Romero M, Recio-Pinto E. Ganglioside GD1a increases the excitability of voltage-dependent sodium channels. Brain research. 2004 Sep 24;1021(2):151-8.

[249] Furukawa K, Tajima O, Okuda T, Tokuda N, Furukawa K. Knockout mice and glycolipids. Comprehensive Glycoscience from Chemistry to Systems Biology. 2007:149-57.

[250] Xu YH, Barnes S, Sun Y, Grabowski GA. Multi-system disorders of glycosphingolipid and ganglioside metabolism. Journal of lipid research. 2010 Jul 1;51(7):1643-75.

[251] Sabourdy F, Kedjouar B, Sorli SC, Colié S, Milhas D, Salma Y, Levade T. Functions of sphingolipid metabolism in mammals—lessons from genetic defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2008 Apr 30;1781(4):145-83.

[252] Rao RP, Acharya JK. Sphingolipids and membrane biology as determined from genetic models. Prostaglandins & other lipid mediators. 2008 Feb 29;85(1):1-6.

[253] Matuoka S, Akiyama M, Yamada H, Tsuchihashi K, Gasa S. Phase behavior in multilamellar vesicles of DPPC containing ganglioside GM3 with a C18: 1 sphingoid base and a 24: 0 acyl chain (GM3 (18, 24) observed by X-ray diffraction. Chemistry and physics of lipids. 2003 Mar 31;123(1):19-29.

[254] Wennekes T, van den Berg RJ, Boot RG, van der Marel GA, Overkleeft HS, Aerts JM. Glycosphingolipids—nature, function, and pharmacological modulation. Angewandte Chemie International Edition. 2009 Nov 9;48(47):8848-69.

[255] Dong Y, Ikeda K, Hamamura K, Zhang Q, Kondo Y, Matsumoto Y, Ohmi Y, Yamauchi Y, Furukawa K, Taguchi R, Furukawa K. GM1/GD1b/GA1 synthase expression results in the reduced cancer phenotypes with modulation of composition and raft‐localization of gangliosides in a melanoma cell line. Cancer science. 2010 Sep 1;101(9):2039-47.

[256] Inokuchi JI. Neurotrophic and neuroprotective actions of an enhancer of ganglioside biosynthesis. International review of neurobiology. 2009 Dec 31;85:319-36.

[257] Wu G, Lu ZH, Xie X, Li L, Ledeen RW. Mutant NG108‐15 cells (NG‐CR72) deficient in GM1 synthase respond aberrantly to axonogenic stimuli and are vulnerable to calcium‐induced apoptosis: they are rescued with LIGA‐20. Journal of neurochemistry. 2001 Feb 1;76(3):690-702.

[258] Kolter T, Magin TM, Sandhoff K. Biomolecule function: no reliable prediction from cell culture. Traffic. 2000 Oct 1;1(10):803-4.

[259] Nelson DL, Cox MM (2005). Lehninger's Principles of Biochemistry (4th ed.). New York, New York: W. H. Freeman and Company

[260] Fischer E. Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. Ber. Dt. Chem. Ges. 1894;27:2985–2993

[261] Matthiesen R, Azevedo L, Amorim A, Carvalho AS. Discussion on common data analysis strategies used in MS‐based proteomics. Proteomics. 2011 Feb 1;11(4):604-19.

[262] Hutchins JR, Toyoda Y, Hegemann B, Poser I, Hériché JK, Sykora MM, Augsburg M, Hudecz O, Buschhorn BA, Bulkescher J, Conrad C. Systematic analysis of human protein complexes identifies chromosome segregation proteins. Science. 2010 Apr 30;328(5978):593-9.

[263] Zamfir A, Vukelić Ž, Bindila L, Peter-Katalinić J, Almeida R, Sterling A, Allen M. Fully-automated chip-based nanoelectrospray tandem mass spectrometry of gangliosides from human cerebellum. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2004 Nov 30;15(11):1649-57.

[264] Serb AF, Sisu E, Vukelić Ž, Zamfir AD. Profiling and sequencing of gangliosides from human caudate nucleus by chip‐nanoelectrospray mass spectrometry. Journal of mass spectrometry. 2012 Dec 1;47(12):1561-70.

[265] Vukelic Z, Metelmann W, Müthing J, Kos M, Peter-Katalinic J. Anencephaly: structural characterization of gangliosides in defined brain regions. Biological chemistry. 2001 Feb 12;382(2):259-74.

[266] De Hoffmann E, Stroobant V. Mass spectrometry: principles and applications. John Wiley & Sons; 2007 Oct 29.

[267] Costello CE, Juhasz P, Perreault H. New mass spectral approaches to ganglioside structure determinations. Progress in brain research. 1994 Dec 31;101:45-61.

[268] Serb A, Schiopu C, Flangea C, Sisu E, Zamfir AD. Top–down glycolipidomics: fragmentation analysis of ganglioside oligosaccharide core and ceramide moiety by chip‐nanoelectrospray collision‐induced dissociation MS2–MS6. Journal of mass spectrometry. 2009 Oct 1;44(10):1434-42.

[269] Saito M, Sugiyama K. Tissue-specific expression of c-series gangliosides in the extraneural system. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 2000 Mar 6;1474(1):88-92.;

[270] Serb A, Schiopu C, Flangea C, Vukelić Ž, Sisu E, Zagrean L, Zamfir AD. High-throughput analysis of gangliosides in defined regions of fetal brain by fully automated chip-based nanoelectrospray ionization multi-stage mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 2009 Aug;15(4):541-53..

[271] Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al meningiomului cerebral din punct de vedere structural, prin chip nanoESI QTOF MS. Referat de cercetare științifică

[272] Ann Q, Adams J. Structure determination of ceramides and neutral glycosphingolipids by collisional activation of [M+ Li]+ ions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 1992 Mar 1;3(3):260-3.

[273] Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al metastazei cerebrale a adenocarcinomului pulmonar, comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din punct de vedere structural prin chip nanoESI QTOF MS. Referat de cercetare științifică

[274] Sørensen JB, Hansen HH, Hansen M, Dombernowsky P. Brain metastases in adenocarcinoma of the lung: frequency, risk groups, and prognosis. Journal of Clinical Oncology. 1988 Sep;6(9):1474-80.

[275] Gow CH, Chien CR, Chang YL, Chiu YH, Kuo SH, Shih JY, Chang YC, Yu CJ, Yang CH, Yang PC. Radiotherapy in lung adenocarcinoma with brain metastases: effects of activating epidermal growth factor receptor mutations on clinical response. Clinical Cancer Research. 2008 Jan 1;14(1):162-8.

[276] Trbojević-Čepe M, Kračun I. Determination of gangliosides in human cerebrospinal fluid by high-performance thin-layer chromatography and direct densitometry. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 1990;28(11):863-72.

[277] Narasimhan RA, Murray RK. Neutral glycosphingolipids and gangliosides of human lung and lung tumours. Biochemical Journal. 1979 Apr 1;179(1):199-211.

[278] Metelmann W, Vukelić Ž, Peter‐Katalinić J. Nano‐electrospray ionization time‐of‐flight mass spectrometry of gangliosides from human brain tissue. Journal of mass spectrometry. 2001 Jan 1;36(1):21-9.

[279] Vukelić Ž, Zamfir AD, Bindila L, Froesch M, Peter-Katalinić J, Usuki S, Robert KY. Screening and sequencing of complex sialylated and sulfated glycosphingolipid mixtures by negative ion electrospray Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2005 Apr 30;16(4):571-80.

[280] Ruggieri S, Mugnai G, Mannini A, Calorini L, Fallani A, Barletta E, Mannori G, Cecconi O. Lipid characteristics in metastatic cells. Clinical and Experimental Metastasis. 1999 Jun 1;17(4):271-6.

[281] Petro KA, Schengrund CL. Membrane raft disruption promotes axonogenesis in n2a neuroblastoma cells. Neurochemical research. 2009 Jan 1;34(1):29-37.

[282] Koochekpour S, Merzak A, Pilkington GJ. Vascular endothelial growth factor production is stimulated by gangliosides and TGF-β isoforms in human glioma cells in vitro. Cancer letters. 1996 Apr 19;102(1-2):209-15.

[283] Bu G, Luo Y, Lu J, Zhang Y. Reduced antigenicity of β-lactoglobulin by conjugation with glucose through controlled Maillard reaction conditions. Food and agricultural immunology. 2010 Jun 1;21(2):143-56.

[284] Yoshida T, Sasahara Y, Miyakawa S, Hattori M. Reduced T cell response to β-lactoglobulin by conjugation with acidic oligosaccharides. Journal of agricultural and food chemistry. 2005 Aug 24;53(17):6851-7.

[285] Cohen SL, Chait BT. Mass spectrometry of whole proteins eluted from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis gels. Analytical biochemistry. 1997 May 1;247(2):257-67.

[286] Schneider SS, Aslebagh R, Wetie AG, Sturgeon SR, Darie CC, Arcaro KF. Using breast milk to assess breast cancer risk: the role of mass spectrometry-based proteomics. InAdvancements of Mass Spectrometry in Biomedical Research 2014 (pp. 399-408). Springer International Publishing.

[287] Ding X, Yang Y, Zhao S, Li Y, Wang Z. Analysis of α-lactalbumin, β-lactoglobulin A and B in whey protein powder, colostrum, raw milk, and infant formula by CE and LC. Dairy science & technology. 2011 Apr 1;91(2):213-25.

[288] Zsila F, Bikádi Z, Simonyi M. Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism, electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods. Biochemical pharmacology. 2002 Dec 1;64(11):1651-60.

[289] Rachagani S, Gupta ID, Gupta N, Gupta SC. Genotyping of β-Lactoglobulin gene by PCR-RFLP in Sahiwal and Tharparkar cattle breeds. BMC genetics. 2006 May 25;7(1):31.

[290] Ohtomo H, Konuma T, Utsunoiya H, Tsuge H, Ikeguchi M. Structure and stability of Gyuba, a β‐lactoglobulin chimera. Protein Science. 2011 Nov 1;20(11):1867-75.

[291] Cederkvist FH, Zamfir AD, Bahrke S, Eijsink VG, Sørlie M, Peter‐Katalinić J, Peter MG. Identification of a High‐Affinity‐Binding Oligosaccharide by (+) Nanoelectrospray Quadrupole Time‐of‐Flight Tandem Mass Spectrometry of a Noncovalent Enzyme–Ligand Complex. Angewandte Chemie International Edition. 2006 Apr 3;45(15):2429-34.

[292] Panel NS. Guidelines for the diagnosis and management of food allergy in the United States: report of the NIAID-sponsored expert panel. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010 Dec 31;126(6):S1-58.

Anexe