Metode Expermimentale de Evaluare a Actiunii Inflamatorii

Cap 1. Metode experimentale de evaluare a acțiunii inflamatorii

Cap. 1.1 Introducere

Inflamația este definită ca răspunsul țesuturilor organismelor mamifere la o vătămare cauzată de orice agent. Aceasta include două procese, în primă fază apare răspunsul inflamator urmat de vindecarea țesutului.

Inflamația este astfel procesul de apărare a organismului, ca răspuns la un stimul intern sau extern, apărut în urma lezării unui țesut, a unei infecții microbiene sau a altor factori nocivi. În urma acestui proces, are loc limitarea vătămării si accelerarea vindecării țesutului. De asemenea, inflamația este întâlnită în fiziopatologia a numeroase boli cronice.

Procesul inflamator apare la câteva minute de la declanșarea unui stimul corespunzător, în orice organism înzestrat cu o imunitate înăscută eficientă. Acest tip de imunitate este astfel principalul factor contribuitor al declanșării inflamației. În decursul acesteia are loc eliberarea de macrofage, limfocite, neutrofile, mastocite dar și de celule non-imune cum ar fi celule epiteliale, celule endoteliale și fibroblaști, care contribuie în aceeași măsura la instalarea inflamației.

Există două tipuri de inflamație, acută și cronică. Inflamația acută are o durată scurtă, reprezentând reacția timpurie a organismului, urmată, în general, rapid de vindecare. Inflamația cronică este definite ca un proces prelungit în care inflamația este acompaniată de distrugerea țesutului.

Inflamația poate fi acută, sub-acută sau cronică și are loc în trei etape. Inițial are loc creșterea permeabilității vasculare care duce la creșterea volumului de fluid în spațiul interstițial. Ulterior are loc infiltrarea leucocitelor din sânge în țesut, iar apoi apariția granulomului și începerea reparării țesutului.

Activitatea anti-inflamatorie a unor substanțe noi poate fi evaluată folosind metode pre-clinice de inducere a edemului descoperite anterior. Astel, au fost folosiți numeroși agenți pro-inflamatori cum ar fi: Carragenan, drojdie de bere, dextran, albumină din ou, kaolin, aerosol, ulei crotonic, bumbac.

Cap. 1.2 Metode in vivo

Inflamația este declanșată de afectarea țesutului în urma unei infecții bacteriene, activării imune sau în urma unei vătămări a organismului. Astfel au loc modificări fiziologice și biochimice la nivelul țesutului respectiv.

Răspunsul inflamator are loc în trei faze, mediate de mecanisme diferite:

tranzitorie caracterizată de vasodilatație locală și creșterea permeabilității capilare

fază subacută caracterizată de infiltrarea leucocitelor sși fagocitelor

fază cronică proliferativă în care apare degenerarea tisulară și fibroza.

În experimentele clinice se folosesc numeroase metode de evaluare a inflamației. În general, în studiile efectuate pe animale se preferă măsurarea directă a edemului, o metodă standardizată de determinare a volumului, motiv pentru care au fost descoperite mai multe metode de determinare cantitativă a edemului. În cazul inflamației induse de oxazolonă și de acidul crotonic la nivelul urechii, inflamația a fost măsurată prin diferența de greutate după excizarea urechii. După aplicarea locală a tetradecanoil acetat de forbol și a acidului arahidonic in urechea șoarecelui, edemul este măsurat prin schimbarea grosimii suprafeței auriculare. (N Shejawal et al., 2014)

Metode de testare a inflamației acute și subacute sunt:

eritem-UV pe porci guineea

inducerea inflamației subacute cu formol

permeabilitatea vasculară

inflamația urechii indusă de oxazolonă pe șoareci

inflamația urechii indusă de acid crotonic pe șoareci și șobolani

inflamația labei la șobolani(folosind diferite metode și iritanți de exemplu Carragenan, dextran, caolin)

fibroza pulmonară la șoareci indusă de bleomicină

modelul peritonitei la șoareci (migrarea macrofagelor)

Metode de testare a inflamației cornice sunt:

granulom indus prin folosirea bumbacului

granulom indus prin baghete de sticlă (Mitul Patel et al., 2012)

Au fost dezvoltate mai multe metode pentru măsurarea inflamației la nivelul labei animalului de experiență. Diferite substanțe cu efect proinflamator au fost injectate subplantar pentru declanșarea edemului:

0,1 mL 0,2% soluție Carrageenan

0,1 mL 0,25% latex de papaia

0,1 mL 2,5% suspensie pulbere de drojdie de bere (N Shejawal et al., 2014)

De-a lungul timpului numeroase dispozitive au fost descoperite și îmbunătățite pentru

determinarea volumul edemului la animalele de experiență. Măsurarea dorsoventrală a diametrului labei animalului a fost îmbunătățită ulterior de cercetători prin:

implementarea folosirii pletismometrului cu mercur,

metoda presiunii transduse,

metoda de conectare la un computer a unei balanțe analitice Mettler Delta Range cu o sensibilitate ridicată,

pletismometru Ugo Basile (N Shejawal et al., 2014)

Una dintre metodele de evaluare a inflamației este prin măsurarea permeabilității vasculare crescute, folosind colorant albastru Evans (Basile, Hanada, Sertie, & Oga, 1984; Wilhelm, Mill, Sparrow, Mackay, & Miles, 1958). Colorantul este introdus în cavitatea peritoneală, iar concentrarea lui este estimată folosind spectrofotometrul după inducerea inflamației.

Testul permeabilității vasculare

Permeabilitatea vasculară crește în timpul inflamației pentru a permite constituenților plasmei să ajungă la locul afectat. Testul este folosit pentru evaluarea acțiunii inhibitorii asupra creșterii permeabilității vasculare. În cazul vătămării unui țesut de orice factor, intern sau extern, sunt eliberate prostaglandine, leucotriene și histamină. Acest eveniment duce la dilatarea arteriolelor si venulelor, urmând extravazarea fluidului și proteinelor plasmatice cu apariția edemului.

Creșterea permeabilității poate fi determinată prin injectarea colorantului albastru Evans. Testul se realizează pe loturi de șobolani, iar ca substanță pro-inflamatoare se folosește acidul acetic 0,6 % intraperitoneal, injectat imediat înaintea colorantului.

După 30 minute, animalele au fost anesteziate și sacrificate. Abdomenul lor a fost tăiat și viscerele au fost expuse. Au fost colectate fluidele peritoneale, filtrate, volumul a fost adus la 10 mL cu ser fiziologic, iar apoi soluția a fost centrifugată. A fost determinată absorbanța supernatantului la 590 nm folosind un spectrofotometru, iar valoarea concentrației colorantului a fost comparată cu standardul. (Mitul Patel et al., 2012)

Se poate determina numărul leucocitelor și/sau cantitatea prostaglandinelor în exudatul colectat din cavitatea pleurală, după inducerea inflamației folosind substanțe precum Carragennan.( Panthong, Tassaneegakul, Kanjanapothi, Tantiwachwuttikul, & Reutrakul, 1989; Vinegar, Traux, & Selph, 1973)

Printre diferitele metode de determinare a inflamației s-a numărat estimarea volumului edemului prin măsurarea diametrului dorso-ventral al labei șobolanului de experiență Murayama, Mori, Bando, & Amiya, 1991; Tsurufuji, Ohuchi, Ishigura, & Miura, 1979), sau compararea greutăților membrelor excizate (prima dată introdusă de Winter, Risley, & Nuss, 1963, și apoi îmbunătățită de alți cercetători: Bhatt, Mehta, & Shrivastava, 1977; Chattapadhyay, Chattapadhyay, Roy, & Maitra, 1986; Andreadou, Rekka, Demopoulos, & Kourounaks, 1992).

Prin inserarea labei inflamate într-un tub cu fluid are loc creșterea nivelului fluidului, lucru ce poate conduce la determinarea volumului edemului. Metoda oferă o tehnică precisă și eficientă prin folosirea unui pletismometru cu apă (Milanino, 1988), în special în cazul în care se folosesc doi electrozi de platină scufundați într-o soluție de electrolit pentru a determina diferențele de nivel.

O altă metodă de determinare a inflamației este prin plasarea unui cilindru cu fluid pe o balanță digitală sensibilă și sunt comparate forțele necesare pentru a introduce laba în coloana de fluid , înainte și după inducerea edemului. (M. Fereidoni et al.,2000)

Pentru acestă metodă, un cilindru de sticlă deschis la partea superioară, cu un diametru intern de 2 cm și o înălțime de 5 cm a fost atașat de centrul unei cutii Petri, cu un diametru de 10 cm. Au fost umpluți cu mercur 4 cm din cilindru, iar deasupra a fost aplicat un capac pentru a evita evaporarea sau vărsarea acestuia. Cutia Petri a fost plasată pe o balanță digitală cu o sensibilitate potrivită, proporțională cu densitatea fluidului ( 0,1 și 0,01 dacă mercur și/sau apă au fost folosite). (M. Fereidoni et al.,2000)

Fig 1. Aparat de măsurare a edemului pe baza dezlocuirii mercurului

M. Fereidoni et al. 2000

Au fost efectuate teste de standardizare prin introducerea unor obiecte cu volume necunoscute în interiorul cilindrului cu mercur și au fost înregistrate valorile determinate de balanța digitală. Aceste valori au fost comparate cu cele teoretice, folosindu-se formula :

Atunci când o coloană lichidă este plasată pe o balanță, iar un obiect este inserat in aceasta cu o anumită forță (F), deplasarea lichidului devine o forță care se opune celei inițiale și acționează asupra obiectului, tinzând sa-l expulzeze. Fizic, forța de introducere a obiectului este egală cu greutatea volumului deplasat (w). La echilibru, V = W / p, deoarece la nivelul mării, fiecare kilogram de masă are aceeași greutate pe kilogram forță. Densitatea este specifică pentru fiecare lichid, astfel volumul părții inserate a obiectului poate fi calculat, principiu care stă la baza acestui instrument de măsurare a volumului edemului . Rezultatul testului de standardizare arată că metoda este corectă, iar rezultatele testelor experimentale arată că metoda este calificat pentru măsurarea exactă a volumului edemului. (M. Fereidoni et al.,2000)

Hidropletismometrul este o metodă rapidă și exactă, cu un principiu similar celui descris anterior, dar, ăn timpul determinărilor experimentale, proprietățile fluidului și a electroliților se pot modifica, lucru care necesită calibrare repetată.

Metoda pletismografică

Cea mai folosită metodă de măsurare a volumului edemului este prin inserarea labei

animalului de experiență într-un tub care conține fluid și analiza creșterii nivelului acestuia vizual sau înregistrarea digitală a acestuia. Modelul prezent de determinare a edemului a fost dezvoltat pe baza pletismografiei clasice și a presiunii hidrostatice a fluidului. În acest model, au fost folosite doua coloane deschise la partea superioară, conținând lichid deslocuibil, umplute până la un anumit semn în coloana A.

Un exemplu de astfel de aparat este format din coloane cu diametru interior diferit (0,5 cm, 1 cm și 1,5 cm), conectate de un tub cu un diametru intern de 0,25 cm. Coloana B este conectată la o balanță digitală care măsoară masa fluidului dezlocuit care este apoi convertit în volum (mL).

Fig. 2 Pletismometru cuplat cu o balanță digitală (N Shejawal et al., 2014)

Laba animalului este scufundată în coloana A până la semn. Tubul conector de sticlă deschis la ambele capete nu trebuie sa atingă interiorul peretelui coloanei B și este imersat în fluidul acestei coloane. După scufundare obiectului, fluidul este expulzat și forța rezultantă duce la dizlocarea unui volum specific din coloana A în coloana B. Volumul lichidului dezlocuit este specific volumului unui obiect. Formula de calcul pentru volumul dezlocuit este:

, unde

V = volumul edemului (mL)

W= masa măsurată pe balanța digital

= gravitație specifică

RVF= factor volumetric relativ,

, unde

sunt pătratele diametrului intern al coloanei A, respectiv B întrucât distribuția volumului de fluid în cele două coloane după inserare depinde de aria secțiunii transversal.

Pentru evaluarea acurateței metodei, un volum măsurat exact a fost introdus în coloana A și au fost înregistrate datele obținute pe balanța digital. Ținând cont de densitatea fluidului, rezultatele teoretice au fost comparate cu cele practice folosind formula menționată anterior, astfel determinându-se coeficientul de corelație.

Sensibilitatea metodei a fost determinată de formula

Reproductibilitatea a fost evaluat folosind un obiect de volum necunoscut introdus în coloana A și ulterior determinat volumul acestuia, procedeu repetat de 6 ori. Astfel s-a putut calcula deviația standard relative (%RSD). Acuratețea, sensibilitatea și reproductibilitatea au fost verificate pentru diferite combinații ale diametrelor interne ale coloanelor.

Cap 1.2.1 Metode experimentale de determinare a inflamației acute

Modele ale inflamației pe animale sunt folosite pentru a evalua producerea mediatorilor inflamatori la locul inflamației, proprietățile agenților antiinflamatori cum ar fi antiinflamatoarele non stereoidiene, dar și eficacitatea analgezicelor presupuse a elimins hipersenzitivitatea cutanată.

În ultimii ani a avut loc o creștere a numarului testelor pre-clinice atât in vitro cât si in vivo destinate descoperirii de noi substanțe cu acțiune antiinflamatorie. Astfel s-au folosit diverse metode pentru generarea inflamației de diverse tipuri și de evaluare a acesteia.

Modelul inflamației plantare cu Carragenan

O primă metodă folosită pentru inducerea inflamației a fost injectarea unui iritant clasic, Carrageenan. Acest model de inflamație clasică este de obicei utilizat pentru evaluarea acțiunii antiinflamatoarelor non-steroidiene și a inhibitorilor COX-2 selectivi. Astfel are loc activarea cascadei acidului arahidonic cu formarea principalilor mediatori ai inflamației, prostaglandine și tromboxani la nivelul sistemului nervos central care contribuie la severitatea răspunsului inflamator pentru acest model. După injectarea Carrageenanului, COX-2 este rapid indusă în coloana vertebrală și alte regiuni ale sistemului nervos central. Art 13

Dezvoltarea edemului indus de Carragenan este frecvent corelată cu etapa exudativă precoce a inflamației, care implică eliberarea de histamină și serotonină din mastocite și bazofile, și se caracterizează prin creșterea permeabilității vasculare. Ulterior are loc o eliberare a mediatorilor inflamației acute cum ar fi mieloperoxidaza și citokinelor ( IL-1β, IL-6, TNF- α) la locul respectiv. Neutrofilele, macrofagele și celulele endoteliale pot produce eliberarea de specii reactive de oxigen (SRO) și specii reactive de azot, care joacă un rol modulator în procesul inflamator. (Shivani Ghildiyal et al., 2013)

Administrarea unor inhibitori selectivi COX-2 scade nivelul de prostaglandine PGE2 din lichidul cerebrospinal și hiperalgezia. Studiile au demonstrat că administrarea intratecală de prostaglandine potențează inflamația indusă de Carrageenan, iar administrarea directă a acestora în creier cauzează hiperalgezie. Art 13

Animalele au fost introduse în cuști cu podea solidă cu o săptămână înainte de experiment pentru a se obișnui cu condițiile de mediu. A fost preferată folosirea talașului în locul peleților pentru a genera o suprafață mai moale după instalarea inflamației. Animalele au fost aclimatizate în condiții standard de lumina și temperatură cu acces la apă și mâncare pentru a evita eventualul impact al stresului asupra experimentului. Art 11

Inflamația a fost indusă prin injectarea subplantară a 0,1 mL Carrageenan 0,5-2% în ser fiziologic în talpa labei posterioare. Carrageenanul a fost dizolvat cu o zi înainte de experiment, omogenizat într-un mojar și conservat la întuneric la 4°C. Imediat înainte de experiment soluția a fost reomogenizată. Inflamația indusă de substanța proinflamatoare a fost comparată cu un lot de referință căruia i s-au administrat, în aceleași condiții, volumul echivalent de ser fiziologic. Labele animalelor au fost introduse în coloana A până la semnul desenat la nivelul articulației tibiotarsiene. (N Shejawal et al., 2014)

Fig. 3 Modalitatea de inserare a labei animalului de experiență în coloana A a pletismometrului http://www.stoeltingco.com/anymaze/pain/pain-analgesia/paw-volume.html

În cazul în care se folosesc noi loturi din agentul iritant, soluțiile trebuie titrate și comparate cu cele din lotul precedent pentru a genera același tip de inflamație. Deși o concentrație crescută de Carrageenan conduce la creșterea inflamației, răspunsul maxim în ceea ce privește edemul si hipersenzitivitatea ar fi greu de combătut. Acesta este motivul pentru care se dorește determinarea intervalului de concentrație optim pentru producerea inflamației, destinată in scopul testării acțiunii antiinflamatorii sau analgezică Art 11

Carrageenanul duce la apariția unei inflamații acute care devine maximă în 3-5 ore de la administrare și este diminuată după 24 ore (Winter et al., 1962; Otterness and Moore, 1988 ). Acest protocol se axează pe inducerea inflamației la șobolani, dar poate fi folosit cu ușurință și pentru soareci cu greutate mai mare de 20g prin folosirea unui volum injectabil mai mic.

Volumul labei animalelor a fost măsurat folosind un pletismometru cu apă înainte de inducerea edemului (timpul 0) și la 1,3,5,6,12 și 24 ore după acesta. Modificarea volumului labei posterioare a fost determinată prin diferența dintre volumul acesteia la un anumit moment de timp dupa injectarea Carrageenanului si volumul inițial (timpul 0). ART 12

În ceea ce privește un alt experiment, determinarea volumului labei s-a realizat prin măsurarea diametrului sau circumferinței înainte și după administrarea agentului inflamator. (Singh and Ghosh, 1968; Iadarola et al., 1988)

Injectarea Carrageenanului subcutanat a determinat apariția unei inflamații acute locale, descrisă de cele 5 semne caracteristice: hipersenzitivitate sau durere (dolor), roșeață (rubor), umflătură (tumor), căldură (calor), alterarea funcțiilor regiunii afectate (functio laesa).

Folosind modele de inflamație pe șobolani induse de Carrageenan, cercetătorii au demonstrat eficiența antiinflamatorului non-steroidian, indometacin, care a redus inflamația cu cel puțin 60%. (1–9 mg/kg, ip; Winter et al., 1962; Winter et al., 1968; Mirshafiey et al., 2005) și a atenuat hiperalgezia și alodinia (2–4 mg/kg, ip; Hargreaves et al., 1988; Tall et al., 2004; Zhang et al., 2004). Cu toate acestea, cele două componente ale inflamației, edemul si hipersenzitivitatea nu sunt dependente una de cealaltă. De exemplu, antagoniștii canalelor de calciu si glutamat pot duce la eliminarea hipersenzitivității, dar nu au efect asupra edemului. Art 11

Modelul bleomicinei în fibroza pulmonară

Bleomicina este un antibiotic chimioterapic, produs de bacteria “Streptomyces verticillus”. Este folosită în modele de fibroză pulmonară pe animale deoarece fibroza este una dintre cele mai intâlnite reacții adverse ale bleomicinei in tratamentul cancerului. Bleomicina joacă un rol important în tratamentul limfomului, carcinomului cu celule scuamoase, tumori ale celulelor germinale și a efuziunii pleurale maligne, când este injectat intrapleural. Ca și mod de acțiune, se crede ca acesta cauzează fisuri la nivelul ADN-ului celulelor tumorale și, astfel, întrerupe ciclul celular. Acest lucru are loc prin chelatarea ionilor metalici și reacția pseudoenzimelor formate cu oxigenul care în final duce la formarea radicalilor liberi. Are loc astfel apariția inflamației ca răspuns la toxicitatea pulmonară prezentă, activarea fibroblaștilor și ulterior a fibrozei. (Antje Moeller et al, 2009)

Bleomicina folosită pentru inducerea inflamației experimentale la animale a fost prima dată utilizată pe câini (Adamson & Bowden, 1974), hamsteri (Snider, Celli, Goldstein, O'Brien, & Lucey, 1978) și sobolani (Thrall, McCormick, Jack, McReynolds, & Ward, 1979). Administrarea acesteia a cauzat reacții inflamatorii si fibroză pe o perioadă scurtă de timp, în special în cazul administrării intratraheale. Inițial are loc creșterea nivelului citokinelor (IL-1, TNF- α, IL-6, interferon- γ) urmată de creșterea expresiei markerilor pro-fibrotici. (Antje Moeller et al, 2009)

Modelul bleomicinei are avantajul faptului că este ușor de studiat, accesibil și reproductibil. Acesta a contribuit la elucidarea rolului citokinelor, factorilor de creștere și a căilor de semnalizare implicate în fibroza pulmonară. (Antje Moeller et al, 2009)

Bleomicina a fost dizolvată în ser fiziologic și administrată subcutanat, oral, intravenos sau intraperitoneal în doză unică în funcție de greutate. Dacă s-a urmărit evaluarea acțiunii antiinflamatorii a unor compuși, aceștia au fost administrați in faza timpurie în timp ce pentru evaluarea acțiunii antifibrotice, administrările s-au făcut în timpul fazei fibrotice. (Antje Moeller et al, 2009).

Animalele au fost aclimatizate o săptămână înaintea experimentului în condiții bine determinate de lumină și temperatură, având la dispoziție mâncare și apă pentru a elimina efectul stresului asupra experimentului.

După sacrificarea animalelor la 7 zile de la administrare s-a efectuat analiza histologică, biochimică, determinându-se nivelul LDH (lactat dehidrogenaza), numărul neutrofilelor, limfocitelor, macrofagelor. Acestea au fost crescute semnificativ față de martor, doză dependent. În cazul animalelor sacrificare după 24 zile de la administrare s-a observat o scădere a nivelului parametrilor testați pâna la nivelul normal. (Soo Nam Kim et al, 2010).

Inflamația acută a urechii indusă de acid crotonic la șoareci

Acidul crotonic este un acid gras care induce inflamația în urma aplicării locale la nivelul urechii animalului de experiență. Inflamația produsă se datorează activării fosfolipazei A2, care eliberează acidul arahidonic din membrana celulară. Acidul arahidonic este apoi metabolizat la prostaglandine (PG), prostacicline și leucotriene.

Uleiul crotonic conține 12-o-tetracanoilforbol-13-acetat(TPA) și altți esteri de forbol, agenți iritanți. TPA este capabil de a activa protein kinaza C (CPK) care activează alte cascade enzimatice cum ar fi protein kinaza mitogen activată (MAPK) și fosfolipaza A2 (PLA2). Aceasta duce la eliberarea factorulu de activare a trombocitelor (FAT). Cascada acestor evenimente stimulează permeabilitatea vasculară, vasodilatația, migrarea leucocitelor polimorfonucleare, eliberarea histaminei și serotoninei și moderează sinteza eicosanoidelor pro-inflamatorii prin ciclooxigenază și 5-lipoxigenază. În acest model de inflamație topică indusă de uleiul crotonic, inhibitorii COX și 5-LOX, leucotrienele B4 și corticosteroizii au demonstrat eficiență locală. (Mitul Patel et al., 2012)

Agentul inflamator aplicat în doză unică pe pielea urechii animalului duce la apariția unui edem doză dependent. Efectul maxim proinflamator a fost determinat în urma utilizării unei concentrații de 4%, dar reacția inflamatorie apare și la concentrații de 0,25% . Cu toate acestea, indiferent de concentrația utilizată, efectul maxim apare la 6-7 ore de la administrare. În cazul în care acidul crotonic 0,25% este aplicat topic, în doză unică, pe spatele animalului ras în prealabil, are loc o reacție inflamatorie caracterizată de hiperplazia celulelor epidermale și infiltrația leucocitelor polimorfonucleare. Modificările histologice apărute după aplicarea topică au atins un nivel maxim la 20-27 ore de la administrare și au scăzut substanțial după 72 ore. Rezultatele au demonstrat că acidul crotonic induce o inflamație doză și timp depententă.

Inducerea edemului urechii la șoareci cu oxazolonă

Modelul prezent reprezintă un model de hipersenzitivitate de contact întârziată care permite determinarea cantitativă a procesului inflamator local și, implicit, a acțiunii antiinflamatoare topice.

Administrarea topică oxazolonei crește nivelul citokinelor Th2 și scade nivelul citokinelor Th1 în țesutul lezat. Citokinele Th2, în special IL-4, joacă un rol important în dezvoltarea dermatitei în cazul de față. Un grup de șoareci a primit topic oxazolonă în acetonă administrată de 3 ori pe săptămână și a fost comparat cu grupul care a primit doar acetonă topic. (Mitul Patel et al., 2012)

După ce animalele au fost sacrificate, urechile au fost excizate și cântărite și determinat astfel volumul edemului.

Inflamatia acută indusă de dextran

Dextranul este o polizaharidă cu o moleculă mare, un agent osmotic clasic. Injectat subcutanat in extremitățile animalului duce la apariția unei reacții anafilactice, caracterizată de extravazarea și formarea edemului.

Inflamația indusă la nivelul labei sobolanului este caracterizată de o permeabilitate vasculară crescută, activarea kininelor și eliberarea histaminei și serotoninei din celulele mastocite. Aceste evenimente conduc la formarea edemului osmotic, cu niveluri scăzute de proteine si neutrofile. (Chistiane Oliveira Coura et al., 2015)

Dextranul produce o inflamație intensă cu un efect maxim la jumătate de oră de la administrare, cu diminuare in următoarele ore. În funcție de doza administrată, formarea edemului are cauze diferite. În cazul unei doze mari are loc perturbarea celulelor mastocitare cu eliberarea histaminei și serotoninei, vasodilatație, hipotermie, hipotensiune, hemoconcentrare și apariția edemului. Administratea unei doze mici de agent osmotic are ca rezultat doar producerea edemului și a vasodilatației, acest răspuns putând fi considerat o reacție anafilactică tipică. În primul caz simptomele sunt o consecință mai degrabă a prezenței fizice a cantității mari de dextran în sânge decât a unei reacții anafilactice. Astfel, în cel de-al doilea caz, o concentrație mică de dextran induce edemul fară perturbarea celulelor mastocitare, hipotermie, hipotensiune sau hemoconcentrare ceea ce demonstrează că răspunsul agentului osmotic este mediat de alți factori decât histamina și serotonina din celulele mastocitare. (B. Gözsy et al., 1963)

Serotonină

Serotonina este un important mediator inflamator care își exercită efectul prin vasodilatație inițială și creșterea permeabilității vasculare.

Injectarea sublantară a serotoninei de concentrație 0,005-0.2mg/mL în apă distilată a dus la dezvoltarea unei inflamații acute. Aceasta induce o creștere liniară a greutății labei animalului de experiență după o oră de la administrare

Edemul a fost măsurat cu pletismometru la momentul 0, înainte de administrarea serotoninei, și la diferite intervale de timp după. Volumul labei șobolanului a început să crească progresiv imediat după injectarea 5-HT până la 1 oră de la administrare, după care a avut loc scăderea treptată. (Yoke Keong Yong et al., 2013)

Studiile au demonstrat că serotonina crește nivelul oxidului nitric (NO) în țesut, acesta fiind corelat cu apariția edemului prin creștere permeabilității vasculare. Receptorii 5-HT2 stimulează eliberarea endoteliu dependentă a NO cât și a NO din macrofage prin intermediul activării iNOS. În endoteliu, creșterea nivelului de calciu endotelial duce la producerea oxidului nitric pe calea eNOS urmată de un mecanism eGMP dependent implicat în creșterea permeabilității vasculare. (Yoke Keong Yong et al., 2013)

S-a realizat evaluarea inflamației și prin determinarea NO măsurat prin metoda Moshage et al. 2012 folosind kitul colorimetric Nitrit/Nitrat. Suma nitritului (NO2-) și a nitratului (NO3-) a fost evaluată ca indicator al nivelului de NO. Astfel, o porțiune de țesut din laba inflamată a fost prelevată după 60 minute de la injectarea serotoninei. Țesutul prelevat a fost deproteinizat cu acid sulfosalicilic 35% după o prealabilă spălare cu apă distilată rece. După omogenizare, supernatantul a fost amestecat cu reactiv Griess și determinat spectrofotometric la 540 nm. Determinarea s-a realizat folosind o scară etalon realizată cu nitrit de sodiu (NaNO2) și nitrat de potasiu (KNO3). (Yoke Keong Yong et al., 2013)

Antagoniștii serotoninei cum ar fi LY53857 s-au dovedit a fi cei mai eficienți în inflamația indusă de aceasta la nivelul labei animalului ducând la o antagonizare aproape completă a edemului și o DE50 de 0,1 mg/kg. (Cole HW et al., 1995)

În cazul în care s-a utilizat un amestec 5-HT/antagonist serotoninergic, cicloheptadiena, s-a observat de asemenea o inhibiție aproape completă a edemului cu o DE50 de 1,3mg/kg. (Cole HW et al., 1995)

Datele experimentale au demonstrat că agoniștii dopaminergici(pergolină,chinpirol), yohimbină, dexametazonă și nifedipină au produs un antagonism semnificativ în ceea ce privește răspunsul serotoninergic. În schimb, substanțe ca clonidina, prazocin, clorfeniramina, cimetidina, antagoniști dopaminegici, imipramina, ciclosporina A, peroxicamul și superoxid dismutza s-au dovedit ineficienți în antagonizarea edemului. (Cole HW et al., 1995)

Evaluarea inflamației s-a realizat de asemenea prin măsurarea factorului de creștere a endoteliului vascular folosind kitul Murine VEGF Elisa (BioVision, USA). După 5 ore de la injectarea subplantară a serotoninei șobolanii au fost eutanasiați prin dislocare cervicală. O porțiune de țesut din laba animalelor a fost prelevată și menținută în tampon liza (lysis buffer). Împreuna cu un inhibitor de proteză, urmată den omogenizare și centrifugare. Supernatantul obținut urmând protocolul kitului folosit. După 35 minute de incubare , dezvoltarea culorii a fost monitorizată cu un cititor de plăci ELISA ( SpectraMax ) la 405 nm cu corecția lungimii de undă stabilită la 650 nm. (Yoke Keong Yong et al., 2013)

FCEV a fost responsabil de creșterea permeabilității vasculare. Aceasta poate fi definită ca mișcarea fluidelor, solutului și a moleculelor între spațiul vascular și cel extravascular. Factorul de creștere a endoteliului vascular poate induce scurgerea de soluți pe mai multe căi prin endoteliul , inclusiv difuzie , racorduri interendoteliale , fenestre , caveole și organelle – vezicular vacuolar ( VVO ) . În ceea ce privește studiul Kroll și Waltenberger , VEGF -A mediază stimularea endotelială a eNOS și expresia iNOS inductibil care conduc la producerea de NO prin receptorul-2 FCEV(VEGFR-2 ). (Yoke Keong Yong et al., 2013)

O altă modalitate de inducere a inflamației prin intermediul serotoninei este prin modelul săculețului de aer. Acest model ilustrează atât faza acută cât și faza subacută a inflamației, unde, în afară de extravazarea fluidului, se poate analiza și infiltrația leucocitelor și granulocitelor polimorfonucleare.

Săculețul de aer a fost realizat prin injectarea subcutanată a aerului filtrat pe spatele șobolanului. În zilele 3 și 6 s-a adiționat un volum suplimentar de aer filtrat pentru a menține săculețul format. Ulterior s-a administrat în interiorul săculețului serotonină 1% în apă distilată și menținută 48 ore. Animalele au fost sacrificate, iar săculețul spălat cu soluție salină, Fluidul din interiorul acestuia a fost extras și s-a realizat numărarea leucocitelor și colorația Wright printr-un analizator automatic hematologic. (Yoke Keong Yong et al., 2013)

Emigrarea leucocitelor provenite din microcirculație și acumularea lor în țesutul inflamat reprezintă semnul distinctiv al evenimentelor celulare ce au loc în timpul procesului de inflamație acută. Serotonina induce o activitate chemotactică utilă pentru migrarea granulocitelor polimorfonucleare prin creșterea concentrației intracelulare a GMP ciclic. Pentru determinarea inflamației induse de serotonină s-a luat in calcul numărul leucocitelor prezente în exudatul format în săculețul de aer. (Yoke Keong Yong et al., 2013)

Cap. 1.2.2 Modele de inflamație subacută

Metoda inducerii edemului prin injectarea formolului

Formolul este soluția de concentrție 37% de formaldehidă.

Formolul cu o concentrație de 0,75- 2.5% a fost injectat subcutanat în suprafața plantară a label șobolanului după 30 minute de la injectarea intraperitoneala a vehiculului, apă distilată 0,1 mL/100 g.

Evoluția inflamației în modelul indus de formol cuprinde doua etape. Prima etapă începe imediat după injectarea substanței iritante și durează 3-5 minute. Această fază este caracterizată de stimularea directă a nociceptorilor, iar date experimentale au arătat că formolul activează în fibrele C și nu în Aδ aferente. Drept urmare există o perioadă de 10-15 minute timp în care animalele arată un gesturi minime sugestive pentru nocicepție. .(Arne Tjǿlsel et al., 1992)

A doua etapă începe după aproximativ 15-20 minute de la injectarea formolului și durează în general 20-40 minute. La administrarea antiinflamatoarelor non-steroidiene ca și indometacin, se produce reducerea nocicepției în cea de-a doua fază, în timp ce prima faza rămâne neschimbată chiar și când este folosită o concentrație scăzută de formol. Studiile experimentale au demonstrat prezența substanței P și a bradikininei în prima fază în timp ce în a doua fază s-a detectat prezența histaminei, serotoninei, prostaglandinelor și a bradikininei (Shibata et al., 1989b). Cu toate acestea, indometacinul nu s-a dovedit eficient pentru a diminua inflamația indusă de formol, care apare la 4 ore de la injectare(Brown et al., 1967).

Spre deosebire de modelul inflamației acute indusă de Carragenan sau de drojdia de bere care determină un comportament ce arată o durere de intensitate scăzută, prezentul model determină apariția unei dureri semnificative, neutralizată doar prin injectarea locală a unui anestezic, atât în prima fază, cât și în a doua.(Arne Tjǿlsel et al., 1992)

Determinarea inflamației s-a realizat cu un pletismometru la momentul zero după injectarea subplantară, și la diverse intervale de timp după. Studiile au arătat că inflamația s-a menținut și 7 zile de la inducerea edemului.

Modelul inflamației induse prin formol se aseamănă artritei umane și este cea mai potrivită metodă pentru testarea agenților anti-artritici și antiinflamatori deoarece implică infiltrația neutrofilelor macrofagelor și proliferarea fibroblaștilor. (Shivani Ghildiyal et al., 2013)

Inducerea inflamației cu caolin

Injectarea subplantară caolinului (silicat de aluminiu hidratat) produce o inflamație doză dependentă, prezentă până ls 48 ore de la administrare. Studii preliminare folosind mediatori și depletori au demonstrat că, în cazul kaolinului, atât histamina cât și serotonina nu sunt implicate în formarea edemului. În schimb, inflamația indusă prin injectarea kaolinului are o componentă prostaglandinică întrucât au fost descoperite cantități semnificative de prostaglandine în țesutul inflamat. (Alan J. Lewis et al., 1976).

În cazul șobolanilor, kaolinul nu activează cascada complementului (Noordhoek et al., 1977) ci mai degrabă declanșează eliberarea kininelor și prostaglandinelor (Lewis, 1978). Când este administrat în afara articulației, se elimină prin formarea unor abcese sterile, ceea ce garantează lipsa efectelor secundare.(E. C. Jeunesse et al.)

Determinarea volumului edemului se realizează cu ajutorul pletismometrului, determinănd volumul inițial (la momentul de timp zero înainte de administrarea caolinului) și la diferite intervale de timp după acesta. Diferența dintre volumul labei inflamate și volumul inițial reprezintă volumul edemului.

Cap. 1.2.3 Modele de inflamație cronică

Inflamația cronică indusă prin bumbac

Există mai multe metode de măsurare a inflamației care întâmpină dificultăți și rețineri, spre exemplu inflamația indusă prin folosirea bumbacului. Peleți de bumbac sterilizat sunt de obicei implantați bilateral sub pielea animalului, iar după câteva zile sunt scoși și înregistrată greutatea peleților. Diferența dintre greutatea initială și cea finală a peleților reprezintă întinderea țesutului granulomatos, și poate fi exprimat ca miligrame țesut granulomatous format la 100g greutate corporală. Această metodă se limitează determinării inflamației cornice și subacute.

Prin această metodă, granuloame cu corp străin au fost provocate la șobolani prin implantarea subcutanată de pelete de bumbac comprimat . După câteva zile, pe lângă infiltrația lichidului,, au fost observate celule gigante și țesut conjuctiv nediferențiat. Cantitatea de țesut conjuctiv nou format poate fi măsurat prin cântărirea peletelor uscate după îndepărtare. În cazul în care peletele de bumbac au fost impregnate cu Carragenan, s-a observat un granulom de intensitate crescută. (Mitul Patel et al., 2012)

De asemenea, se iau în considerare si greutatea splinei, ficatului, glandelor suprarenale, dar și greutatea animalului per ansamblu. Se pot monitoriza și parametri biochimici cum ar fi alanin-transaminază(ALT), aspartat-transaminază(AST) și fosfatază. (M. Fereidonia et al., 2010). S-au folosit ca animale de experiență șobolani cărora li s-au implantat subcutanat câte 2 pelete de bumbac pe ambele părți ale abdomenului, folosind tehnici sterile și anestezie ușoară cu eter. Timp de 7 zile le-au fost administrate substanțe antiinflamatoare, o dată pe zi, în timp la grupul martor a fost administrat vehicul. În a 8a zi șobolanii au fost sacificați, iar peletele implantate au fost extrase și cântărite. De asemenea, timusul a fost extras. (Mitul Patel et al., 2012)

După extracție, atât timusul cât și bumbacul au fost uscate la 60 ◦C pentru 18 ore și au fost cântărite din nou pentru a determinat greutatea în stare uscată. Astfel au fost calculate greutatea granulomului și a țesutului transudat, dar și a procentajului de inhibare a formării acestora de către substanțele antiinflamatoare. A fost înregistrată și creșterea în greutate per ansamblu. (Mitul Patel et al., 2012)

Inducerea granulomului prin intermediul unei tije de sticlă

Acest model reflectă o inflamație cronică proliferativă. Spre deosebire de modelul peletelor din bumbac, pe țesutul conjuctiv nou format nu se măsoară doar greutatea în stare umedă și uscată, dar și compoziția chimică și proprietățile mecanice. (Mitul Patel et al., 2012)

Tije de sticlă cu diametrul de 6 mm sunt tăiate, ajungând la o lungime de 40 mm, iar terminațiile sunt rotunjite prin topire in flacără. Se folosesc ca animale de experiență șobolani, anesteziați cu eter. Blana de pe spatele lor este rasă și dezinfectată, Se realizează o incizie în regiunea caudală și se formează un tunel subcutanat în direcția craniană,cu un forceps cu capete teșite. O baghetă de sticlă este introdusă în acest tunel. Injcizia este închisă cu suturi . Animalele sunt ținute în cuști separate . Tijele rămân in situ timp de 20 sau 40 de zile. (Mitul Patel et al., 2012)

Tratamentul medicamentos se administrează fie pe tot parcursul testului, fie în ultimele 10 sau 2 zile. La sfâșit animalele sunt sacrificate prin anestezie cu CO2. Tijele de sticlă sunt pregătite împreună cu țesutul conjunctiv, care formează un tub în jurul lor. Prin incizie realizată la un capăt, tija de sticlă este îndepărtată, iar granulomul umed este cântărit, uscat, iar apoi cântărit din nou. Pot fi efectuate determinări biochimice cum ar fi determinarea colagenului și a glicozaminoglicanilor din țesutul conjuctiv nou format. (Mitul Patel et al., 2012)

Inflamație articulară indusă de adjuvantul Freund

Artrita reumatoidă(AR) este o afecțiune inflamatorie sistemică care afectează aproximativ 1% din populația generală a globului. Este caracterizată prin inflamația articulațiilor, membranei sinoviale și distrugerea cartilajului. Severitatea afecțiunii depinde de factori multiplu printre care se numără factorii genetici, imunologici și de mediu. Evoluția bolii este influențată de componente ale sistemului imun și ale inflamației cum ar fi limfocite T și B, neutrofile, monocite și endoteliul vascular. (Yan-li LIU et al., 2009)

Studii recente au demonstrate importanța citokinelor proinflamatorii (TNF-α, IL-1) în patogeneza artritei reumatoide deoarece au un nivel crescut în țesutul synovial, fluidul sinovial și in ser. IL-1și TNF-α contribuie la auto- proliferarea sinocitelor și creșterea producției de enzime tisulare, cum ar fi matrice metal-proteinaze prin condrocite și celule sinoviale, rezultând în degenerarea cartilajului . În procesul de eroziune osoasă , TNF-α declanșează producerea altor cytokine și molecule de adeziune moleculară , stimulează colagenaza și induce diferențierea osteoclastelor [ 6 ] . În plus, TNF-α exercită eficacitatea artritogenică prin inducerea IL–1. Astfel, IL-1, IL-2 și TNF-α s-au dovedit a fi elementele dominante ale inducerii inflamației și distrucției osoase. (Yan-li LIU et al., 2009)

Adjuvantul complet Freund (CFA sau FCA) este compus din micobacterii inactivate și uscate (de obicei M. Tuberculosis), în timp ce forma incompletă(IFA sau FIA) este lipsită de componenta micobacteriană(spre urmare conține doar emulsie de apa în ulei). Este denumit după imunologistul american Jules T. Freund.

Artrita a fost indusă prin injectarea adjuvantului complet Freund în laba sobolanilor. Inflamația și hiperalgezia ulterior apărute au fost determinate la anumite intervale de timp după administrarea CFA. S-au determinat de asemenea și valorile factorului tumoral necrotic-α (TNF- α), interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2) și interleukina-10 (IL-10) în ser prin intermediul ELISA. Modificările histopatologice în sinoviocite au fost evaluate cu ajutorul microscopului. Prin aceste determinări s-a observant o inflamație marcată la nivelul labei animalului și o scădere a pragului de retragere a membrului la aplicarea unor stimuli mecanici și termici. Nivelul markerilor TNF- α, IL-1 și IL-2 au crescut în timp ce nivelul IL-10 a scăzut. Determinările histopatologice au evidențiat inflamație profundă și acumularea de colagen în țesut. (Yan-li LIU et al., 2009)

Șobolanii masculi au fost injectați intra-articular cu adjuvantul complet Freund și comparați cu un lot martor care a primit același volum de soluție salină, după o prealabilă anesteziere cu fenobarbital sodic. Circumferința articulației a fost măsurată folosind o bandă flexibilă. (Yan-li LIU et al., 2009)

Teste mecanice de retragere a labei

Șobolanii au fost plasați sub o cușca de plastic pe o podea cu perforații și au fost lăsați pentru aclimatizare 15 minute înainte de testare. Monofilamente etalonate de tip von Frey (North Coast Medical Co , SUA) au fost folosite pentru a genera stimuli mecanici punctați de diferite intensități pe suprafața plantară a ambelor labe posterioare. Pragurile răspunsului de retragere pentru fiecare labă au fost determinate folosind metoda descrisă de Chaplan et al, 1994. Fiecare stimul a fost aplicat pe o perioadă de 1-2 s, cu un interval de 5 s între stimuli. Stimulii au fost aplicați aleator pe suprafața plantară. Răspunsurile immediate de retragere au fost numerate, iar forța mecanică (în grame) aplicată de monofilamente care a produs un răspuns de retragere de 50 % a fost înregistrată ca prag. (Yan-li LIU et al., 2009)

Testul platformei reci

Pentru evaluarea hiperalgeziei ca răspuns la stimuli reci s-au folosit platforme reci menținute la o temperature de 2 °C. S-a măsurat lantența de la momentul plasării animalelor pânâ la răspunsul corespunzător. Testul a arătat o latență scăzută după administrarea CFA. (Yan-li LIU et al., 2009)

Graficele au arătat existența a două faze din punct de vedere al evoluției edemului. În prima fază edemul a crescut și a ajuns la un maxim în ziua a 3-a după administrarea adjuvanutlui complet Freund. După acest moment, s-a observant o scădere a inflamației până în ziua a 9-a, moment în care laba a început din nou să se inflameze și a atins un nou pic al concentrației în ziua 11. Artrita indusă la șobolani a fost asociată cu un comportament care a demonstrat hiperalgezia prezentă prin protejarea labei afectate și evitarea greutății corpului pe aceasta. Hiperalgezia este prezentă în special în faza acută a inflamației. Deși animalele au suferit o inflamație profundă la nivelul articulației și au arătat modificări considerabile nociceptive, mobilitatea acestora a rămas în general nemodifică. (Naomi L Cillingworth et al., 2003)

După eutanasierea animalelor s-a analizat patologia membranei sinoviale. Specimenele au fost fixate 6h în soluție 4% glutaraldehidă în PBS, decalcifiate și apoi plasate în soluție 30% sucroză submitted to routine paraffin embedding. Secțiunile tisulare au fost colorate cu hematoxilină șă eozină sau cu colorantul Gieson. (Yan-li LIU et al., 2009)

Bibliografie

Gen Pharmacol. 1995 Mar;26(2):431-6.

Serotonin-induced paw edema in the rat: pharmacological profile.

Cole HW1, Brown CE, Magee DE, Magee C, Roudebush RE, Bryant HU.

S. W. Martin, A. J. Stevens, B. S. Brennan, D. Davies, M. Rowland, and J. B. Houston, “The six-day-old rat air pouch model of inflammation: characterizatiora of the inflammatory response to carrageenan,” Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, vol. 32, no. 3, pp. 139–147, 1994.

H. Moshage, B. Kok, J. R. Huizenga, and P. L. M. Jansen, “Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation,” Clinical Chemistry, vol. 41, no. 6, pp. 892–896, 1995.

J. Kroll and J. Waltenberger, “VEGF-A induces expression of eNOS and iNOS in endothelial cells via VEGF receptor-2 (KDR),” Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 252, no. 3, pp. 743–746, 1998.

 Noordhoek J, Nagy MR, Bonta LL (1977) Involvement of complement and kinins in some non-immunogenic paw inflammations in rats. Agents Actions Suppl2:109–121

Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL.

Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J

Neurosci Methods 1994; 53: 55–63.