Metode Eco Economice de Conservare Si Multiplicare In Vitro la Drosera Rotundifolia

Economie

Metode Eco Economice de Conservare Si Multiplicare In Vitro la Drosera Rotundifolia

Byadmin ianuarie 1, 2024

METODE ECO-ECONOMICE DE CONSERVARE ȘI MULTIPLICARE IN VITRO LA DROSERA ROTUNDIFOLIA

Cuprins

1. INTRODUCERE

Globalizarea este un proces continuu, care nu poate fi negat, dar poate fi astfel dirijat încât să conducă la o mai bună gospodărire a biodiversității vegetale. Altfel, globalizarea poate fi unul dintre factorii care afectează integritatea planetei (Antofie, 2010).

Biodiversitatea reprezintă varietatea de expresie a lumii vii, specii de plante (floră), animale (faună), microorganisme. Valorile biodiversității fac parte integrantă din patrimoniul natural care trebuie folosit de generațiile actuale fără a mai periclita șansa viitoarelor generații. Biodiversitatea reprezintă o particularitate specifică a planetei noastre, care asigură funcționalitatea optimă și echilibrată a tuturor ecosistemelor, existența și dezvoltarea biosferei în general. De aceea, biodiversitatea este „o poliță de asigurare a mediului” ce favorizează capacitatea de adaptare a acestuia la schimbările cauzate de orice activitate umană distructivă.

Convenția privind diversitatea biologică, semnată la Rio de Janeiro în 5 iunie 1992, la care România a aderat prin Legea nr. 58/1994, pune accent pe valoarea diversității biologice și a componentelor acestora: ecologice, genetice, sociale și economice, științifice, educativ – culturale, recreative și estetice.

Conservarea ex situ este o metodă folosită pentru numeroase specii vegetale utile în domenii precum: cercetare, comerț, industrie, medicină, cosmetică, biotehnologie, farmacie și agricultură. Numai prin armonizarea la nivel juridic, bazat pe cercetări științifice, toate aceste domenii specifice, extrem de sensibile, care se ocupă cu conservarea ex situ, vor putea asigura hrana și sănătatea umană în viitor, să asigure statutul corespunzător de conservarea in situ a biodiversitatii, ca un întreg. Deoarece este imposibil să se aplice măsuri de conservare, fie in situ, fie ex situ, fie ambele, pentru toate speciile vegetale, este necesar să se dezvolte în continuare instrumente strategice pentru prioritizarea eforturilor într-un mod rentabil (Antofie, 2011).

Culturile in vitro vegetale se constituie nu numai într-o alternativă în propagarea speciilor vegetale, dar și o procedură eficientă, cu risc minor în stocarea germoplasmei (Cachiță, 1987). Micropropagarea in vitro la plante prin culturile de țesuturi și celule vegetale a devenit deja o rutină pentru specialiștii din domeniul biologiei, acestea făcând parte din biotehnologiile moderne, cu un impact deosebit în domeniile economice, în agricultură, silvicultură, medicină și farmacie, alimentație etc., fiind nu numai o metodă rapidă și economică de înmulțire a plantelor, dar jucând un important rol în ameliorarea acestora (Cachiță și Ardelean, 2009), ea pornind de la celebra teorie celulară a lui Schwann și Schleiden din anii 1835 și 1839, aceea a totipotențialității celulare, potrivit căreia la baza structurii organismelor fiecare celulă posedă toate informațiile genetice de care aceasta are nevoie pentru formarea unui nou organism. Schaeffer (1990) definea micropropagarea ca fiind o înmulțire clonală operată plantelor in vitro, pentru aceasta folosind diferite tipuri de fitoinoculi, culturile primare fiind inițiate din variate explante, proceduri care să asigure o proliferare accelerată de lăstari (Petruș – Vancea, 2007).

Prezenta lucrare răspunde cerințelor actuale privind nevoia identificării unor metode moderne, economice și ecologice de conservare a biodiversității vegetale. Am ales conservare in vitro pentru că această metodă biotehnologică prin simpla utilizare, se constituie ca un instrument de conservare în bănci de gene a genofondului. Mai mult decât atât, utilizând diferite tehnici de temporizare a creșterii în vitrocultură, reușim să prelungim cultura in vitro cu repicări mai rare, așadar cu economie de resurse materiale și umane.

Mulțumesc pe această cale Universității din Oradea și d-nei șef lucr.dr. Adriana Petruș, pentru sprijinul acordat în elaborarea prezentei lucrări.

2. DESCRIEREA SPECIEI ȘI A AREALULUI

2.1. Încadrarea sistemică

Drosera rotundifolia L. este o plantă carnivoră, care a fost ,,răsfățată" de către poporul român cu denumirea ,,roua cerului".

Roua cerului face parte din:

Încrengătura Magnoliophyta (Angiospermatophyta, Angiospermae)

Clasa Magnoliopsida (Dicotyledonatae)

Ordinul Caryophyllales

Familia Droseraceae

Genul Drosera

(după Chifu și colab., 2002)

Genul cuprinde aproximativ 200 de specii. Specie ocrotită, această plantă este una din puținele plante carnivore întâlnite și în România: în turbăriile muntoase, astăzi fiind rezervații naturale. Peste 535 de specii, aceste plante deosebit de interesante și neobișnuite, aparțin dicotiledonatelor, și doar un număr mic de specii se găsesc în categoria monocotiledonatelor (Stănescu și colab.,, 2005). Plantele carnivore, un grup biologic ciudat, au adaptări neobișnuite și metamorfoze (transformări ale frunzelor), consecință a tipului lor de nutriție mixtă, atipică genurilor și speciilor din lumea vegetală.

Plantele carnivore sunt organisme preponderent autotrofe, fotosintetizante, dar, carența in azot mineral a substratului în care ele își au fixat sistemul radicular le-a orientat metabolismul înspre ,,carnivorie". Nutriția de tip mixotrof, le servește plantelor carnivore la completarea necesarului de azot, acesta fiind un element indispensabil sintezei compușilor organici azotați, în principal a proteinelor, moleculele care se află la temelia ,,clădirii" biostructurilor celulare, a enzimelor, a fitohormonilor, a unor produși secundari de metabolism etc. (Toma și Stănescu, 2008).

Poate fi numit carnivor, mai degrabă insectivor, un organism vegetal cu caractere anatomice, fiziologice, morfologice, etologice și ecologice care să permită atragerea, capturarea, omorârea și digerarea unor viețuitoare, animale mici, artropode sau insecte. După hidrolizarea produșilor proteici aceștia sunt absorbiți și integrați în metabolismul propriu și astfel planta își îmbunătățește nutriția, își susține creșterea sporind producția de polen și semințe, calitatea lor, capacitatea de germinație.

2.2. Descoperirea speciei

Primul care a descris genul Drosera – încă din anul 1875 – a fost Darwin în cartea „Insectivorous plant”, începând cercetările asupra plantelor carnivore, încă din anul 1860. Darwin efectuează studii asupra speciei de roua cerului (Drosera rotundifolia L.) în mediul natural (Holodnîi, 1966), deoarece observase numeroase insecte prinse pe frunzulițele plantei, încercând să și explice particularitățile metabolice ale nutriției. Aceste plante insectivore cu frunze metamorfozate în capcane, au adaptări metabolice și morfofiziologice ciudate, formațiuni capabile să prindă și să imobilizeze animalele mici pe care le digeră, iar ulterior, le absorb. Din aceste reacții metabolice, în special aminoacizii, rezultați în urma hidrolizării proteinelor din micile viețuitoare (altele decât ciupercile sau plantele) sunt absorbiți compușii chimici.

Încă din perioada lui Darwin (1975), acesta menționa că Drosera are pe partea centrală a discului foliar al frunzelor peri tentaculari mai scurți cu orientare verticală și cu pedicelele verzi. În schimb, pedicelele perilor tentaculari, glandulari, situați spre marginile limbului foliar, sunt tot mai lungi și înclinate înafara frunzei. Pedicelele acestea au o culoare purpurie; în vârful lor (puțin turtite și subțiate înspre zona apicală) se află o glandă secretoare alcătuită din câteva rânduri de celule alungite și pline cu un lichid purpuriu sau cu o substanță granulară. În locul de inserție a pedicelelor tentaculare pe frunză există o zonă mai lată, de culoare verde, iar în lungul pedicelului sunt vizibile vase spiralate, lemnoase, cu un țesut vascular care urcă de-a lungul tuturor tentaculelor, până în glandele digestive secretoare.

Potrivit părerii lui Darwin, că tentaculele au fost inițial simple formațiuni epidermale ca parte superioară, în timp ce partea inferioară ar fi o prelungire a frunzei. Nitschke (1861) susține că formațiunile epidermale au elemente specifice limbului foliar, iar perii tentaculari au țesut vascular. Deci, acești peri tentaculari provin din frunză.

Tot Darwin, semnala în anul 1865 faptul că, cu excepția tentaculelor foliare marginale, partea glandulară a tentaculelor are o dimensiune aproximativ uniformă, este de formă ovală cu o lungime de circa 2,5 mm și cu funcții complexe ce secretă enzime proteolitice și absorb produșii rămași din digestie. Activitatea acestor peri este influențată de factori externi care au efect excitant.

Pe glob, plantele carnivore sunt întâlnite de la tropice, până în zona temperată, majoritatea speciilor fiind terestre și numai câteva sunt epifite, iar acvatice și mai puține; exemplu elocvent este otrățelul de baltă – Utricularia – întâlnit chiar în bălțile Dunării.

Încă din epoca medievală a fost remarcată bizareria speciilor de Drosera, fiind observată suprafața frunzelor cu mii de picături chiar și în soare, magicienii considerând acest lucru un semn al unei „alianțe magice între plantă și astre”. Aceste plante sunt considerate de alchimiști că au în compoziția lor unul dintre componenții pietrei „filosofale”, compus chimic care este posibil să transforme plumbul în aur (Toma și Toma, 2002).

2.3. Morfo-anatomia plantei

Din punct de vedere morfologic (Fig. 1), în anul 1990, Crowder și colaboratorii săi au descris Drosera rotundifolia ca o axă verticală (rizom), ce poate atinge 3-5 cm cu frunze așezate spiralat pe această axă și alcătuind o rozetă. La frunze pețiolul este verde, cu o lungime de 3 cm, cu perișori, iar la baza lui sunt stipelele împărțite în 7 dințișori lungi până la o lungime de 5 mm.

Drosera are rădăcini destul de slab dezvoltate, cu o lungime de circa 12-25 mm și prezintă, pe suprafața lor, perișori lipicioși, absorbanți, care aprovizionează planta cu apă, zonele fiind sărace în elemente minerale. Perișorii absorbanți au culoare neagră, doar în vitroculturi, iar în zonele temperate, specia dezvoltă rădăcini în prima parte a anului.

Rădăcinile plantei mor toamna, dar rămân în sol, iar iarna ancorează planta în substrat. Din primordiile foliare, primăvara, cresc frunze și rădăcini care au supraviețuit climatului rece și formează un sistem nou radicular, rizo- și filogeneza, având loc în același timp (Slack, 2000).

A B

C D

Fig. 1. Aspecte ale speciei Drosera rotundifolia (A), rădăcină adventivă (B), limb foliar (C), peri foliari glandulari (D – 10X) (bara reprezintă 1 cm) (original).

Roua cerului prezintă, la suprafața solului o rozetă de frunze, formată din câte 5-6 frunze, pețiolate mai scurt sau mai lung având limburi etalate într-o poziție aproximativ orizontală, iar altele au chiar o poziție oblică. Limbul foliar este acoperit cu peri pedicelați, tentacule (purtători de glande digestive), care secretă substanțe lipicioase care se adună sub forma unor picături strălucitoare de rouă, de unde vine și denumirea plantei. Epiderma inferioară a pețiolurilor și a frunzelor este prevăzută cu peri secretori, mici, sesili. Frunzele plantei au pețiolul lung, până la 4 cm și în zona apicală, pe epiderma superioară, sunt perișori glandulari, tentaculari.

În anul 1875, Darwin susținea că numărul mediu de „glande”, adică perii tentaculari de pe limbul foliar, ar fi de 192. Fiecare glandă la rândul ei, în partea inferioară ar fi înconjurată de o picătură mare de secreție incoloră vâscoasă, transparentă, având rolul de a trage și imobiliza insectele.

În mijlocul rozetei de frunze apare tulpina florală, înaltă până la 25 cm. Vara, la maturitate, cresc 3-4 tije sau axe florifere de aproximativ 15 flori mici fiecare formate pe tipul 5, cu petale de culoare albă.

Drosera are flori erecte care se deschid spre vârf de la baza ina baza inflorescenței, doar două simultan, constituite pe tipul 5 și are cinci sepale unite, verzi ce devin negre după formare fructului. Petalele, în număr de cinci, sunt libere, albe, ascuțite și au circa 5-6 mm (la florile cleistogame sunt persistente); 5 stamine libere, cu filamente roșii reprezintă androceul. Gineceul este format dintr-un ovar cu trei carpele unite, doar uneori având peri tentaculari, iar ovarul prezintă în continuarea sa 3-5 stile drepte și bifurcate. Bobița de polen are dimensiunea de 35 µm, exina având spini lungi, de circa 3-5 µm.

Fructul Droserei este de tip capsulă, împărțită în trei valve. El rămâne întreg până când rădăcinile mor. Semințele sunt netede, fusiforme, de culoare brună, cu dimensiuni de 1-5 mm fiind situate în partea superioară a fiecărei valve.

Din punct de vedere anatomic, Drosera rotundifolia are structura rădăcinii tipic primară, la exterior găsim rizoderma, care prezintă în zona piliferă peri absorbanți numeroși, denși și foarte lungi. Scoarța rădăcinii slab dezvoltate, este groasă, având un parenchim cortical din 5-6 straturi de celule tip meatic, la exterior și o endodermă de tip secundar. Majoritatea celulelor au pereții uniform îngroșați. La exterior un periciclu cu un singur strat delimitează cilindrul central, destul de gros, cu patru fascicule de lemn și tot atâtea fascicule de liber, care au vase cu dezvoltare centripetă, pereții slab îngroșați și lignificați, precum și tuburi ciuruite și celule anexe. Tot în cilindrul central se afla un parenchim fundamental normal.

Tulpina subterană (rizomul) are o epidermă cu celule tangențial alungite și cu pereți subțiri, pe care din loc în loc, apar peri secretori sesili. Rizomul are o scoarță formată din circa șase straturi de celule parenchimatice, cu mici meaturi și spere frunze se observă fascicule conducătoare. Edoderma, ultimul strat al scoarței, este de tip secundar și este alcătuită din celule cu pereții îngroșați uniform și suberificați, cu celule de pasaj din loc în loc. Un număr mare de fascicule conducătoare libero-lemnoase, colateral închise, definesc cilindrul central care reprezintă la exterior un periciclu unistratificat; vase lemnoase cu pereți slab îngroșați și lignificați, cu puține celule de parenchim lemnos, iar liberul este alcătuit din celule anexe și tuburi ciuruite. Razele medulare, înguste, parenchimice, cu pereți celulozici apar între fascicule.

Din față, tulpina aeriană are celule poligonale, alungite, cu pereți drepți, cu stomate dese și peri secretori, sesili. Văzută transversal, tulpina are un contur circular cu celule alungite tangențial, mari și cu peri secretori. În ce privește scoarța aceasta este parenchimică, unistratificată, cu celue mici față de celulele epidermale; între ele apar meaturi. La exterior, cilindrul central prezintă 3-5 straturi de elemente sclerenchimatice, care formeză un inel; diametrul acestor elemente crește de la periferie spre centrul tulpinii. Acest cilindru nu are periciclu, dar în parenchimul său meatic găsim șase fascicule conducătoare libero-lemnoase separate între ele de raze medulare, înguste și așezate pe două arcuri opuse. Între aceste două arcuri se găsește patea centrală a tulpinii, reprezentată de o măduvă cu celule celulozice de tip meatic.

Frunza prezintă un pețiol cu un contur semicliptic, din cauza prezenței pe lateral a două aripioare scurte, mici, latero-adoxiale. Acest pețiol este acoperit de epiderma cu celule izodiametrice, pereți subțiri, din loc în loc apar stomate și peri secretori sesili; un parenchim fundamental de tip meatic și cu celule mari, apare în interiorul pețiolului. Parenchimul este format din fascicule conducătoare libero-lemnoase, mai mici, așezate pe un arc central, având multe elemente liberiene și puține vase lemnoase. Lamina frunzei are în ambele epiderme celule poligonale – alungite cu pereți laterali drepți, stomate și limbul amfistomatic cu numeroși peri tentaculari, senzitivi, secretori și lung-pedicelați. Omogen se prezintă mezofilul foliarformat din celule cu meaturi și lacune mici. În funcție de grosimea nervurii fasciculele conducătoare libero-lemnoase sunt diferite ca mărime și au vase lemnoase înguste, puține și cu pereți slab lignificați și slab îngroșați (Turcuș, 2009).

2.4. Cerințe eco-fiziologice. Mod de nutriție.

Plantele de Drosera sunt plante cu o consistență ierboasă, de talie mică, printre puținele plante carnivore. Drosera este un gen ubicvist. Poate fi admirată în turbăriile muntoase cu Sphagnum, care pot forma lacuri turboase mici, în pajiști alpine, în păduri de cedru sau pe terenuri nisipoase. Majoritatea plantelor se află în rezervații naturale unde planta supraviețuiește în aceste ecosisteme sărace, mai ales în azot (Stănescu și colab., 2008).

Formațiuni glandulare cu funcții complexe s-au dezvoltat în plantele carnivore. Aceste funcții sunt următoarele: glande aromatice sau nectarifere, atrag prada; glande mucilagene, secretă un mucus adeziv, bogat în polizaharide acide; glande digestive ce produc enzime proteolitice, resorbind produșii de digestie.

Când Drosera trăiește într-un mediu cu săruri nutritive îndestulătoare, planta funcționează într-un regim metabolic autotrof, complet, fără aportul de compuși nutritivi animali; în schimb în mediile sărace în materii nutritive(azot în special) plantele carnivore trebuie să găsească resursele necesare de la animalele digerate, colonizând în acest mod și zonele sărace în săruri nutritive îndestulătoare.

Microorganismele împreună cu enzimele secretate de Drosera sunt doar împreună suficiente pentru digestia completă a prăzii. Fenomenul este de tip simbiont.

Potrivit cercetărilor lui Toma și Stănescu (2008), histologic, pedicelul glandelor are epiderma, parenchim, țesut vascular și capul părului tentacular are celule secretoare sesile, a căror activitate este stimulată de mucusul existent pe epiderma frunzelor din glandele pedicelate.

Perii glandulari, tentaculari reprezintă formațiunea morfo-anatomică pe care se bazează nutriția carnivoră a plantei, capcane eficiente pentru prinderea insectelor, dar planta are și formațeuni morfofiziologice specializate în realizarea celor patru funcțiuni principale. Acestea sunt: atragerea olfactivă sau vizuală a insectei către capcană (foliară), capturarea activă (cu mișcare) sau pasivă a prăzii; digerarea prăzii de către bacteriile aflate în zona de captură sau de către enzimele secretate de plantă și absorbția și asimilarea substanțelor nutritive (hidrolizatele proteice) – rezultat al digerării prăzii.

O insectă care se așează pe o frunză de Drosera se lipește de sucul lipicios al perilor maciucați. Încercând să se elibereze, ea se lipește și de mai mulți peri care se încolăcesc în jurul insectei, secretând un suc lipicios, mucilaginos, incolor și abundent care sufocă insecta. Apoi este digerată de anumite enzime proteolitice timp de mai multe zile, rămânând doar scheletul chitinos. Planta consumă în jur de 50 de insecte pe an.

Perii glandulari, tentaculari, sunt sensibili și prehensivi la excitații fizice și chimice de natură externă, care la atingerea de către insecte mici se curbează și cu zona apicală „imobilizează” victima. La sfârșitul procesului de digerare a insectei, intervine absorbirea compușilor de degradare rezultați, iar tentaculele revin la statutul de normalitate și își reiau poziția verticală. Limbul revine plan, iar o frunză adultă poate funcționa, după tipicul respectiv, de circa 3-4 ori (Toma și Stănescu, 2008).

Plantele de Drosera, atât cele crescute în natură, cât și cele regenerate și crescute în regim de vitrocultură, conțin un lichid granular purpuriu în celulele poligonale.

2.5. Importanța pentru biodiversitate

În folclor, se crede că această specie ar avea puterea de a desface orice lacăt, fiind numită, „iarba fierului” (Toma și Stănescu, 2008).

Cu toate că este cunoscută drept o plantă toxică, chiar „malefică”, oamenii au folosit-o în scopuri terapeutice, în arsuri provocate de soare, afecțiuni pulmonare (Grigorescu și colab., 1986), având efecte expectorante, antibiotice sau diuretice. Drosera are și rol în cicatrizarea rănilor (Pietropaolo și Pietropaolo, 1997) și prezintă interes fitofarmaceutic. Plantele de roua cerului sunt folosite la extragerea unor produși secundari de metabolism, masă vegetativă, supraterestră, adunată din natură și valorificată în obținerea Droserei herba (Stănescu, 2008). Acest preparat conține produși secundari de metabolism cu structură naftochinonică, precum: rosalizida, ramentoma, plumbagina, ramentacetona, carboxioxinaftochinona, vitamina C, flavone, acizi organici și enzime proteolitice (Hook, 2001; Toma și Stănescu, 2008).

Datorită efectelor ei benfice asupra sănătății, această specie a fost pereclitată, devenind specie ocrotită de lege.

O metodă ecologică, dar și economică (adică eco-economică) a cultivării a acestei specii, fără a afecta flora spontană este aceea a culturilor in vitro, prin biotehnologie vegetală. Astfel, este motivat interesul biotehnologiilor vegetale de a realiza vitroculturi de Drosera; prin acesta practică există posibilitatea obținerii constante a unei cantități fixe de biomasă, folosită ca materie primă în extragerea de produși secundari de metabolism (specifici acestei specii vegetale), eliminând dependența fabricanților de astfel de produse.

2.6. Arii naturale protejate de interes național și internațional, în care se întâlnește roua cerului

Protecția mediului în țara noastră, ca de altfel în întreaga Europă, are ca obiective protejarea peisajelor geografice în general, dar și a florei și faunei, care au suferit schimbări din cauza factorilor antropici. În acest sens, există mai multe tipuri de arii protejate, unele fiind restrânse, altele mai extinse, dar ambele tipuri prezintă componente ale mediului natural, care au reușit să se păstreze, într-o bună măsură, reușind să asigure supraviețuirea plantelor, a asociațiilor vegetale și a animalelor (http://www.mmediu.ro/beta/domenii/protectia-naturii-2/arii-naturale-protejate/).

Odată cu trecerea timpului, unii cercetători au fost preocupați de conservarea și ocrotirea naturii, precum și a speciilor de animale și plante existente.

Pe lângă Academia Română, există Comisia pentru Ocrotirea Monumentelor Naturii, care a obținut delimitarea și legiferarea numeroaselor monumente ale naturii, rezervații naturale și un parc național în care există plante ocrotite în mod deosebit, printre care si specia Drosera rotundifolia(http://www.edusoft.ro/rol/Protectia%20mediului%20si%20rezervatii%20naturale.php).

Drosera rotundifolia este o plantă insectivoră care se dezvoltă și se întâlnește în mlaștinile oligotrofe răspândite în regiuni umede cu climat temperat rece, pe interfluvii și sărace în substanțe minerale, alimentate doar de precipitațiile atmosferice. Ecobiomul acestor mlaștini este format din mai multe ecosisteme acvatice care sunt generatoare de turbă.

Ariile naturale de interes botanic și dendrologic aflate pe teritoriul județului Bihor sunt reprezentate de 24 de arii naturale protejate pentru o vegetație deosebită, precum și cele zece parcuri dendrologice (http://www.ecotoporadea.ro/images/brosuri/cartea_verde.pdf).

Pe suprafața viitorului Parc Național al Munților Apuseni se afla 11 arii protejate în zona montană, care au ca interes protejarea vegetației speciale pe care o dețin.

Turbăriile din Padiș „molhașurile” din cadrul rezervațiilor botanice din județul Bihor, sunt practic mlaștini oligotrofe, care datează din perioada glaciațiunilor, având rol ecologic în întregul areal. În aceste turbării, pe lângă sfagnumuri, se găsesc specii de plante care se dezvoltă pe mușuroaie mai înalte, nu în apă. Una dintre plantele întâlnite în această zonă este Drosera rotundifolia.

O altă rezervație unde întâlnim roua cerului este Crovul de la Larion, o rezervație naturală de tip botanic, situată în județul Bistrița-Năsăud, în estul comunei Lunca Ilvei.

Rezervație naturală, care prin Legea Nr. 5 din 6 martie 2000, publicată în Monitorul Oficial al României Nr. 152 din 12 aprilie 2000, a fost declarată arie protejată și se întinde pe o suprafață de 250 de hectare. Se suprapune sitului Natura 2000 – Larion (http://enciclopediaromaniei.ro/wiki/Crovul_de_la_Larion).

Această arie naturală reprezintă o turbărie oligotrofă cu o vegetație compusă din specii arboricole și plante ierboase crescute în soluri sărace în nutrienți. Aceste soluri sărace protejează planta insectofagă Drosera rotundifolia. Rezervația naturală, Crovul de la Larion, se află în Categoria a IV-a IUCN.

De asemenea, Parcul Național Retezat, situat în sud-estul țării, în județul Hunedoara, înființat în anul 1935, în prezent cu statut de arie naturală protejată de interes național și internațional, deține indivizi de roua cerului. În anul 1979 acest parc a fost recunoscut ca Rezervație a Biosferei, iar ca arie protejată de interes național corespunde categoriei a II-a IUCN. Prin construirea acestei arii se urmărește protecția unor eșantioane care reprezintă acest spațiu biogeografic național. Ele cuprind elemente naturale cu o deosebită valoare cu aspect fizico-geografic, geologic, paleontologic, speologic, pedologic, peisagistic, faunistic și floristic.

Parcul Național Retezat este situat în vestul Carpaților Meridionali, se întinde pe o suprafață de 38.138 hectare din Masivul Retezat- Godeanu și are o administrație proprie. În anul 2007 a fost propus ca sit pentru rețeaua ecologică europeană Natura 2000.

Drosera rotundifolia – apare planta carnivoră, relict glaciară se întâlnește în Mlaștina de la Peșteana – din Parcul Retezat – care este o rezervație naturală de tip botanic.

Mlaștinile oligotrofe sau turbăriile sunt reprezentative pentru Parcul Natural Munții Maramureșului, evidențiate aici prin existența speciei relicte glaciare Drosera rotundifolia.

Ariile protejate de interes național aflate în cadrul rezervației naturale botanice cuprinde mai multe mlaștini.

Mlaștina Tăul lui Dumitru cu o suprafață de trei hectare este specială datorită formațiunilor de turbărie bombată care au în centru „un mic ochi de apă”, unde sunt protejate o serie de plante foarte rare printre care se află specia studiată, roua cerului, Drosera rotundifolia.

O altă mlaștină, situată în apropierea stațiunii Izvoare, Mlaștina Vlasinescu, prezintă un strat de turbă cu o grosime de aproximativ 3, 5 m și se întinde pe o suprafață de trei hectare. Stratul de turbă oferă o bună dezvoltare câtorva specii de plante rare cum ar fi Drosera rotundifolia, Scheuchzeria palustris și Lycopodium inundatum etc.

Poiana Brazilor este tot o mlaștină din cadrul Parcului Natural Munții Maramureșului amplasată într-o depresiune craterială cu diametrul de circa 2 km. Aici este prezentă umplutura vulcanică formată din andezite piroxenice cu o grosime, cu mult peste 800 de m. Această rezervație este un mic fragment localizat la bifurcația altor două mlaștini: mlaștina împădurită Valea Brazilor Stângă, cu o lungime de 1 km și o lățime de 100 – 150 m și mlaștina cu turbă, Valea Brazilor Dreaptă, cu o lățime de 150 – 200 m și o lungime de 1 km.

Cele două mlaștini sunt situate pe lângă cursul apelor, fiind într-o stațiune mai joasă, relictă de circa 80 de km spre est.

Lacul Sfânta Ana din Munții Harghita, este singurul lac din Europa de Est de origine vulcanică cu formă și integritate originală. A apărut în documente în anul 1349, nu are izvor și nici drenaj. În caldera Ciomatului, în craterul geamăn al lacului Sfânta Ana, există cea mai vestită arie naturală de interes național numită Tinovul Mohoș. Acesta corespunde categoriei a IV-a IUCN (rezervație naturală de tip floristic și faunistic) din județul Harghita. Cu o formă rotundă și o suprafață de 80 hectare Tinovul Mohoș se află la o altitudine de 1050 m.

Apele tinovului sunt drenate de pârâul Roșu, din vechiul lac al craterului rămânând doar 20 de oglinzi de apă, mici și întunecoase, de culoare bordo, unde trăiesc din abundență plante glaciare, relicte de tundră, ca Drosera rotundifolia.

La munte, mlaștinile oligotrofe sunt formate de al doilea grup de rezervații. Aceste tinovuri de munte au o populație de plante endemice, relicte, care ne aduc aminte de tundrele zonei boreale ale Terrei, populația fiind alcătuită din plante insectivore ca roua cerului în trei varietăți.

3. CONSERVAREA ECO-ECONOMICĂ A SPECIILOR VEGETALE DE INTERES

Culturile in vitro se pot constitui într-un instrument de conservarea a biodiversității florii, utilizând metode ecologice, dar și economice, cu păstrarea fondului genetic. Fiind practicate în flacoane de mici dimensiuni, cu costuri restrânse, acestea pot fi păstrate în spații mici, în diferite condiții ecologice care induc temporizarea creșterii biomasei vegetale, cum ar fi: temperaturi coborâte, întuneric continuu ori semiîntuneric, utilizarea de medii de cultură care să încetinească creșterea fitoinoculilor, producând acestora o creștere lentă, mărind intervalul de repicare, de la 1 – 2 luni, până la 1-2 ani (Cachiță, 1987).

Principiile de bază ale eco-economiei pot fi aplicate cu succes în domeniul biotehnologiilor vegetale. Culturile in vitro la sfecla reprezintă o direcție importantă în producerea de biomasă, în special în bioreactoare. Impactul antropic asupra biodiversității vegetale a fost dur în ultimele decenii. Metodele de dezvoltare economică ale societății nu pot fi oprite, dar este vital de a găsi soluții care să nu afecteze mediul înconjurător. O astfel de dezvoltare ar fi aceea bazată pe ecoeconomie (economie bazată pe principii ecologice), concept care a fost propus de Brown (2008, 2009) și care se referă la o economie ce se poate dezvolta pe termen lung, fără să afecteze mediul înconjurător.

Brown (2011) a citat un studiu din anul 2002, al unui colectiv de savanți de la Academia Națională de Științe a SUA, care a introdus conceptul de „amprentă ecologică”, exprimând sintetic efectele însumate ale tuturor proceselor care conduc la uzura bogățiilor naturale ale pământului, inclusiv suprasarcina de bioxid de carbon acumulat atmosferă. Acești autori au ajuns la concluzia că, solicitările colective ale omenirii au depășit – pentru prima oară – capacitatea de regenerare a pământului, în jurul anului 1980. În anul 1999, solicitările globale au depășit productivitatea sustenabilă a sistemelor naturale cu 20%; calculele vorbesc de faptul că, în 2007, acest indicator a ajuns la valoarea de 50%, altfel spus, actualmente, ne aflăm într-o situația de avarie.

Stabilirea unor protocoale eficiente de micropropagare, la speciile vegetale, presupune rezolvarea a numeroase probleme teoretice, în vederea stabilirii principalilor factori care pot influența favorabil acest proces. Astfel, tehnicile de culturi in vitro sunt utilizate atât în scopul efectuării de cercetări fundamentale, cât și experimental, sau ca mijloc de conservare a genotipurilor valoroase (Atanasov, 1986) sau de optimizare a procedurilor deja existente, în sensul creșterii calității și cantității biomasei vegetale, obținute prin practici moderne de biotehnologie.

Această activitate poate fi realizată prin cultivarea în condiții heterotrofe a suspensiilor de celule vegetale, provenite din organele verzi ale plantelor. În acest caz, agentul biologic poate consta din celule individualizate, care se mențin prin operarea de subculturi, practicate repetat, la interval de trei săptămâni, ce constă în recoltarea unei părți din cultura veche și inocularea ei pe mediu de cultură proaspăt; restul biomasei celulare se colectează prin centrifugarea suspensiei și depozitul obținut după îndepărtarea supernatantului se constituie în materie primă utilizată în industria farmaceutică, sau în prepararea de enzime, ori pentru extragerea de pigmenți vegetali (de exemplu, din struguri se extrag antocianii, folosiți pentru colorarea preparatelor alimentare sau a medicamentelor), de alcaloizi, de glicozizi, de flavone, de taninuri, de uleiuri eterice etc. Tot prin intermediul suspensiilor celulare, schimbând echilibrul fitohormonal, unele componente minerale și unele condiții de mediu se poate induce declanșarea proceselor de embriogeneză somatică. Astfel de embrioni pot fi utilizați ca biomasă, ce poate fi valorificată în industria farmaceutică, întrucât embrionul somatic – generat în bioreactoare – are în cotiledoane aceiași compuși organici care se găsesc sintetizați în embrionul zigotic, din ei putând fi extrase diferite uleiuri eterice, sau agenți aromatizanți, ori ei pot fi încapsulați în sferule de alginat de sodiu, care – trecute fiind printr-o baie de clorură de calciu, facilitează formarea la periferia acestor sferule a unui strat de alginat de calciu – deține consistența unui „tegument”, realizându-se așa-numitele semințe artificiale (Petruș – Vancea, 2011).

Dacă se dorește păstrarea culturilor in vitro pe o durată lungă de timp, a resurselor genetice recalcitrante la înmulțirea vegetativă, a produselor biotehnologice, cum ar fi genotipuri de elită, a unor plante rare și specii aflate pe cale de dispariție, din Lista Roșie, se pot efectua modificări în regimul eco-fizilogic de creștere a inoculilor, utilizând diferite metode de reducere a intensității proceselor vitale, fie prin hipoxie (reducând concentrația de oxigen în vasele de creștere), fie prin coborârea presiunii atmosferice, ori prin creșterea presiunii osmotice a mediului de cultură, deshidratând controlat celulele, fie prin menținerea culturilor la temperaturi mici, de 4 – 7 °C, în condiții de iluminare scăzută, fie chiar prin conservarea acestora în azot lichid, la – 196 °C (criostocare) (Cachiță și Ardelean, 2009).

Pe termen mediu, se poate realiza o temporizare a creșterii in vitro, ceea ce conduce la creșterea intervalelor între repicări.

În literatura din domeniu, există numeroase metode de conservare in vitro a germoplasmei constând din vitroplantule, minibutași, propaguli, muguri axilari, bulbi florali, calusuri, suspensii celulare, embrioni somatici, a diferitelor specii vegetale, având ca principal obiectiv reducerea costului de producție (Williams și Taji, 1989; Petruș și colab., 2003, 2006; Baciu și colab., 2007; Cachiță și Ardelean, 2009; Crișan și Petrus-Vancea, 2013; Hevele și colab., 2013; Ilieș și Petruș-Vancea, 2013 etc).

Sagawa (1990) (după Petruș – Vancea, 2007) a menținut protocormi de Cymbidium la o temperatură mică, de 1ºC, într-un mediu MS de bază, cu 117-175 mM (4-6%) zaharoză, protocormii rămânând verzi timp de 4 luni, după care și-au reluat creșterea, în momentul trecerii lor la temperatura de 24ºC. Autorul menționat mai sus a constatat că protocormii depozitați la 1ºC, pe o durată mai mare de 4 luni s-au depigmentat sau s-au necrozat. Aceștia, trecuți la o temperatură optimă de creștere, au necesitat cca. 4 – 5 luni ca să-și revină și să-și reia ciclul normal de dezvoltare. Protocormii de Cymbidium au supraviețuit și la temperaturi de – 40ºC, dar după decongelare s-au necrozat complet, în timp scurt. Același autor a stocat protocormi de Cattleytonia Rosy Jewel, pe o perioadă de 15 săptămâni, la 4 – 5ºC, într-un mediu lichid, cu adaos de 292 mM (100g/l) zaharoză. El a concluzionat faptul că o rezervă de material înmulțitor, în vitrocolecții, poate fi menținută la temperaturi negative, dar metoda implică costuri mai ridicate și poate să scadă capacitatea regenerativă a vitroculturilor.

Sharma și colaboratorii (2002) au descoperit, că adiția de acid salicilic 104 M la culturile de Zingiber officinale (ghimbir), a condus la creșterea rezistenței acestora față de atacul ciupercii Fusarium oxysporum. Aplicarea externă a acidului salicilic a provocat o creștere a activității peroxidazei și a – 1,3 glucanazei, fenomene prin care autorii au justificat mărirea rezistenței plantelor față de atacul acestor fungi patogeni. Introducerea acidului acetilsalicilic (aspirina), în compoziția mediului de cultură, a fost studiată și de către Pătru și colaboratorii (2000), în scopul temporizării ratei de creștere la protocormii de Cymbidium. Obiectivele experimentului respectiv au fost atinse prin utilizarea concentrației de 1 mg/l acid acetilsalicilic.

Inhibarea creșterii protocormilor de Cattleya și Dendrobium, prin adăugarea în mediul de cultură a acidului salicilic și a acidului acetilsalicilic, administrat în concentrații diferite (0,1 și 0,5 mg/l) a fost studiată de către Petruș-Vancea și colaboratorii (2003). Autorii au constatat că adaosurile de acid salicilic, în concentrații de 0,1 și 0,5 mg/l și de acid acetilsalicilic, în concentrație de 0,5 mg/l au condus la temporizarea creșterii protocormilor de Cattleya, în schimb utilizarea celor două principii active, în concentrațiile testate în acel experiment, s-a dovedit a nu fi o soluție pentru conservarea vitroculturilor de protocormi de Dendrobium.

Petruș și colaboratorii (2004) la culturi de protocormi de Cymbidium inoculați direct într-un mediu MB-MS (1962) fie lichid, fie solid, dar într-un singur strat, lipsit de regulatori de creștere, în care apa distilată a fost înlocuită cu apă sărăcită în deuteriu, în concentrații de deuteriu de: 25 ppm D și 87,5 ppm D. Autorii au concluzionat faptul că: la culturile de Cymbidium în mediile de cultură lichide, prezența apei sărăcite în deuteriu (cu 25 ppm D) a indus diminuarea ratei de multiplicare și de creștere a protocormilor, iar culturile pe mediile solidificate, preparate cu apă sărăcită în deuteriu, fie în concentrație de 25 ppm D, fie de 87,5 ppm D, s-au necrozat în procent de 100%. Aceeași autori au menționat că, la vitroplantule de Petunia, formarea de rădăcini și de tulpini au fost evident inhibate de prezența în compoziția mediilor de cultură MB-MS agarizate a apei sărăcită în deuteriu, atât la concentrația de 25 ppm D, cât și la cea de 87,5 ppm D, ca înlocuitoare a apei distilate.

Metoda de temporizare a creșterii vitroculturilor prin acoperirea acestora cu un strat de ulei de parafină, imaginată pentru mărirea intervalului de subcultură la microorganisme, a fost utilizată în mică măsură în conservarea materialului vegetal cultivat in vitro (Cachiță și colab., 1999; Cachiță și Halmágyi, 2000).

Petruș – Vancea și colaboratorii (2006) au realizat un experiment referitor la analizarea evoluției vitroculturilor de protocormi de Dendrobium și de Cattleya, în regim de hipoxie – în culturi în dublu strat – diminuarea accesibilității oxigenului la nivelul cormofitoinoculilor fiind provocat prin submersarea acestora sub un strat de ulei, de proveniență variată, respectiv sub ulei de parafină, ori sub ulei de natură vegetală, respectiv de ricin, de in sau amestec de 1:1 ulei de ricin cu ulei de in. Încetinirea creșterii protocormilor de Dendrobium în urma acoperirii acestora sub un strat de ulei de parafină, în special sub un strat cu înălțimea de 1 cm (2 ml), s-a dovedit a fi o bună modalitate (dintre cele testate de noi) de realizare măririi intervalului de subcultură. Utilizarea apei distilate, la protocormii de Dendrobium cultivați pe MB – MS agarizate, ca strat acoperitor (supernatant), a determinat o necrozare intensă a acestora, fenomen absent la protocormii lotului martor, neacoperiți cu apă sau cu uleiuri. Supernatantul constituit din ulei de in sau din ulei de ricin, ori a amestecului realizat din combinarea acestor două uleiuri, în raport de 1:1, a exercitat efecte nocive asupra protocormilor de Dendrobium, din această cauză aceste proceduri nu pot fi o metodă de temporizarea creșterii vitroculturilor. În ceea ce privește conservarea protocormilor de Cattleya, variantele cu submersarea în ulei de parafină 1 ml și de 2 ml, reprezentând un strat cu grosimea de 0,5 cm, respectiv 1 cm, se pot constitui ca metode eficiente de mărire a intervalelor de subcultură. Cea mai optimă variantă, cu referire la grosimea stratului de ulei de parafină, de deasupra protocormilor, sub care au fost submersați protocormii de Cattleya (temporizând multiplicarea și creșterea acestora), a fost cel de 1 cm grosime (de 2 ml), în special în ceea ce privește încetinirea procesului de caulogeneză. Protocormii de Cattleya submersați în 2 ml apă distilată au prezentat rată mică de creștere și un procent de supraviețuire a acestora foarte scăzut. Submersarea protocormilor de Cattleya sub ulei de ricin, de in sau amestec dintre ele, în raport de 1:1, a dus, în final, la necrozarea culturilor. Protocormii proveniți din submersie în ulei de parafină, în straturi de profundități diferite (submersați sub 1, 2, sau 4 ml) au prezentat o viabilitate de 100%. În momentul subcultivării și creșterii protocormilor pe medii proaspete, ei au prezentat o dezvoltare inferioară martorului, cu excepția procesului de caulogeneză, care a prezentat sporuri față de martor, la nivelul variantei ale cărei protocormi au provenit din submersie în 1 ml ulei de parafină.

Tot pentru temporizarea creșterii fitoinoculilor, Petruș și colaboratorii (2011 b) au înlocuit apa distilată din compoziția mediului de cultură, cu apă sărăcită în deuteriu (cu 25 ppm D). Autorii au subliniat că același efect inhibitor al creșterii masei vegetale în vitrocultură îl prezintă și mierea de albine, ca înlocuitoare a zaharozei din mediile de cultură.

4. IMPORTANȚA RECIPIENTULUI DE CULTURĂ ÎN MICROPROPAGARE

Condițiile naturale în care se dezvoltă normal, plantele permit descompunerea produselor secundare de metabolism în sol sau în atmosferă. Sistemele de cultură in vitro sunt lipsite de acest avantaj, deoarece presupun folosirea unor recipiente închise pentru prevenirea contaminării microbiene, care nu permit scurgerea produselor secundare departe de vitroplantulă. Tipul recipientelor de vitrocultură variază, în funcție de procesele de morfogeneză specifice fiecărei specii și de natura fitoinoculilor. În decursul perioadei de vitrocultură, în atmosfera recipientelor sunt eliberați diferiți compuși volatili, precum: dioxidul de carbon, etilena, acetaldehida și etanolul (Thomas și Murashige, 1979; Cachiță și colab., 2004)). Cantitatea de etilenă este mult mai ridicată la culturile de calus, în timp ce culturile de lăstari au un nivel scăzut de dioxid de carbon, marcând o scădere mai accentuată a acestuia în prezența luminii.

În urma unor experimente efectuate de noi anterior (Petruș – Vancea și colab., 2004) privind evoluția exvitroplantulelor de Petunia, în procesul aclimatizării lor la mediul septic de viață, în funcție de utilizarea în vitrocultură a unor recipiente cilindrice mai mici (2/7 cm) și a unor vase Erlenmeyer, mai mari (5/10 cm) am observat că rizogeneza la baza vitroplantulelor a fost superioară în recipientele de dimensiuni și volum mai mic, față de aceea manifestată de vitroculturile executate în vasele Erlenmeyer, a căror dimensiuni și volum au fost mai mari; totodată, suprafața foliară a acestor vitroplantule a fost mult mai mică, ceea ce a împiedicat – în etapa de aclimatizare – producerea unei evapotranspirații excesive. Așadar, la Petunia, dacă se dorește realizarea de subcultură este recomandabilă utilizarea pentru vitrocultură a vaselor Erlenmeyer, cu diametrul bazei mare, de 5 cm, iar dacă se urmărește aclimatizarea acestor vitroplantule, este bine ca vitroculturile să fie practicate în recipiente mai mici, ca dimensiuni, respectiv ca volum (Petruș – Vancea și colab., 2004).

Influența dimensiunilor vaselor de cultură, a volumului mediului de cultură, a densității culturii și a concentrațiilor în CO2 a fost studiată la vitroculturile de salată verde (Lactuca sativa L) și de iarbă creață (Mentha spicata) de către Tisserat (2000). Autorul a semnalat că, cu toate că un mediu bogat în CO2 poate stimula foarte mult creșterea vitroplantulelor, există și alți factori de cultură, cum ar fi capacitatea vaselor de cultură, volumul de mediu și densitatea culturii, care influențează creșterea vitroplantulelor.

Radoveț – Salinschi și Cachiță (2003 și 2004), studiind morfogeneza vitroplantulelor la mai mult specii de Coleus cultivate în recipiente de sticlă, de diferite mărimi, respectiv în eprubete cu capacitatea de 25 cm3 (cu 5 ml mediu de cultură) și în flacoane cilindrice cu capacitatea de 176 cm3 (cu 10 ml mediu de cultură) au constatat faptul că, vitroplantulele cultivate în eprubete au prezentat o talia mai mare, noduri mai multe și internoduri mai lungi, comparativ cu vitroplantulele cultivate în flacoane cilindrice, care au dispus de ramificații mai multe, atât caulinare, cât și radiculare.

Petruș-Vancea și Cachiță (2007) au identificat faptul că utilizarea de recipiente mici, cu diametrul de 2 cm și înălțimea de 7 cm, cu un conținut de mediu de cultură de 5 ml, în defavoarea celor cu diametrul de 5 cm și înălțime de 10 cm, cu un conținut de 15 ml de mediu de cultură se constituie într-o metodă ieftină și la îndemâna oricărui producător de plantule prin culturi de țesuturi, de stimulare a adaptării exvitroplantulelor de crizanteme la condițiile mediului septic de viață, încă din perioada de vitrocultură. Pe de altă parte, utilizarea unor recipiente mai mari (de 5/10 cm), cu un conținut de 15 ml de mediu de cultură, conduce la diminuarea, în medie cu 30% a procesului de rizogeneză, ceea ce este de nedorit în momentul transferării în mediul septic de viață, dar mai mult decât atât presupune o ridicare nejustificată a costului de producție. Aceeași autori afirmă că spre deosebire de crizanteme, în cazul violetelor africane, situația a fost inversă, în recipientele mari (de 5/10 cm) dezvoltându-se tufe mari, cu mai mulți propaguli în alcătuirea lor, propaguli care prezentau, atât rizogeneză, cât și caulogeneză superioare celor desprinși din vitrotufele formate în recipiente mici (2/7 cm), diferențe accentuate pe parcursul perioadei de aclimatizare (Petruș –Vancea și Cachiță, 2007).

5. MULTIPLICAREA ȘI CONSERVAREA IN VITRO LA DROSERA ROTUNDIFOLIA

Cercetările vizând multiplicare in vitro a speciilor de Drosera, în scop fitofarmaceutic, s-au extins foarte mult. Există studii orientate în direcția utilizării fitoinoculilor de Drosera ca modele experimentale, în efectuarea de studii de biologie moleculară sau de investigare a căilor de sinteză a unor produși secundari de metabolism.

Micropropagarea la roua cerului (Drosera rotundifolia) se practică în diferite scopuri, fie ca material didactic, pentru a ilustra și demonstra caracteristicile morfo-anatomice, ultrastructurale, eco-fiziologice sau biochimice ale acestei plante carnivore, sau ca instrument de cercetare în biotehnologiile vegetale, precum și ca model experimental într-o serie de experimente de biotestare a reacției acestui tip de material vegetal la diferite condiții din mediul lor de cultură in vitro și ex vitro, ori pentru inițierea unor vitroculturi pe medii lichide, executate în scopul obținerii de vitamină K (Cachiță și colab., 1989; 1991).

In vitro, capacitatea regenerativă a speciei este foarte mare. Ea poate fi subcultivată pe medii solide sau lichide, lipsite – sau nu – de regulatori de creștere. Din acest punct de vedere, vitroculturile de Drosera se pretează foarte bine pentru efectuarea de variate experimente valoroase. Deși Drosera este o plantă carnivoră, în mediul de cultură nu se introduc proteine sau aminoacizi.

În scopul inițierii de vitroculturi de Drosera au fost utilizate variate tipuri de explante, în cazul speciei D. rotundifolia, cercetătorul van Waes (1985) a reușit multiplicarea in vitro, prin utilizarea de explante prelevate din frunze, iar Cachiță și colaboratorii (1991) au utilizat explante de tip boboc, cultivate pe medii cu acid beta indolil acetic (AIA), plus chinetină (K) în concentrație de 10 mg/l. De asemenea, explante de natură variată: fragmente de pețiol, de limb foliar, de tijă florală, în vitrocultură regenerează mici rozete de frunzulițe, lung pețiolate, din porțiunea lor bazală formându-se o prelungire, ca un stolon, ce poate genera – la o oarecare distanță de planta mamă – o nouă rozetă de frunzulițe, formațiune morfo-anatomică care dobândește un statut de autonomie (ca la căpșuni sau fraga), la baza ei generându-se nenumărate rădăcinițe, în acest mod, luând naștere o nouă plantă.

Unele specii au rol important în medicină (Paper și colab., 2005; Fukushima și colab., 2009). Au fost identificate componente ale metabolismului secundar al speciilor acestui gen, în special flavonoide, cu rol important în obținerea de medicamente (Hook, 2001; Marczak și colab., 2005; Putalun și colab., 2010; Milella și colab., 2011; Padula și colab., 2013; Biteau și colab., 2012),

Alte metode de optimizare a micropropagării la specii din genul Drosera au fost realizate în ultimii ani (Jayaram și Prasat, 2007; Grevenstuk și colab., 2010; Jiménez și colab., 2011; Kawiak și Lojkowska, 2011).

Optimizarea micropropagării și conservării la Drosera a fost realizată de către Rejthar și colaboratorii săi (2014) prin testarea diferitelor concentrații ale mediului de vitrocultură MS 1/2, 1/4, 1/8 nivele diferite de pH (3,7-7,7), cu concentrații diferite de zaharoză (10-40 g/l) și citochinine (0,1 – 3 mg/l) și anume: benzinadenină, zeatină și kinetină. La 60 de zile de vitrocultură nu s-au identificat diferențe la loturile cultivate pe medii cu pH diferit sau concentrații diferite de zaharoză, în timp ce pe mediile cu concentrații ridicate de nutrimente au fost identificate inhibiții ale indicilor de creștere. Astfel, mediile cu 1/8 MS au prezentat o creștere intensă comparativ cu cele martor (MS 1/1). Multiplicarea și creșterea au fost supresate de adăugarea în mediile de cultură a BA și Kinetinei, dar zeatina în concetrații mici (0,1 mg/l) a condus la stimularea creșterii și proliferării (Rejthar și colab., 2014).

6. CERCETĂRI PROPRII

6.1. SCOPUL CERCETĂRILOR

Obiectivul cercetării experimentale a constat în identificarea unor metode ecologice și economice (eco-economice) de multiplicare și conservare in vitro a speciei Drosera rotundifolia L. (roua cerului).

6.2. IPOTEZELE CERCETĂRII

Amestecul de uleiuri naturale, preparat natural după rețetă proprie, conduce la temporizarea creșterii in vitro la nivelul propagulilor de roua cerului, prin culturi în dublu strat.

Dimensiunile vasului de cultură influențează morfogeneza fitoinoculilor și creșterea propagulilor de roua cerului, precum și aclimatizare acestora la mediul septic de viață.

Motivația alegerii temei

Deoarece în conservarea ex situ – în bănci de gene – există un tot mai mare interes în direcția identificării de noi tehnici de cultură eco-economice (Petruș- Vancea, 2011) care să permită menținerea in vitro a biomasei vegetale, pe o perioadă cât mai lungă de timp, cu scopul realizării așa-numitelor living collections, am încercat identificarea unor metode de temporizare a creșterii, implicit de prelungire a intervalelor de subcultură la specia roua cerului.

Potrivit literaturii de specialitate – deosebit de bogată în acest domeniu – metodele semnalate în acest sens, sunt diverse. Ele fac referire la fiecare dintre etapele unei micropropagări, startând de la alegerea tipului de fitoinocul, a momentului recoltării acestuia, la îmbunătățiri ale tehnicilor de inoculare, la identificarea condițiilor optime de vitrocultură și până la optimizarea mediilor de cultură, sau la adăugarea unor retardanți ai creșterii, la alegerea tipului de recipiente de cultură, ultimele două categorii fiind în atenția noastră în prezentele cercetări.

6.3. MATERIAL ȘI METODE

Materialul vegetal utilizat a constat din propaguli obținuți prin separare de tufe de roua cerului (Drosera rotundifolia), din vitrocoloniile existente în laboratorul de biotehnologie al Universității din Oradea, Facultatea de Științe, Departamentul de Biologie, subcultivate pe un mediu de cultură de bază steril Murashige-Skoog (1962), modificat de noi având vitaminele tiamină HCl, piridoxină HCl și acid nicotinic, câte 1 mg/l din fiecare, mezo-inozitol 100 mg/l, zaharoză 20 g/l și agar-agar 7 g/l, lipsit de regulatori de creștere. Mediul de cultură a fost sterilizat prin autoclavare la 121 ᵒC (1 atm).

Inocularea s-a realizat respectând regulile de asepsie și asepsizare specifice acestei proceduri (Cachiță, 1987).

Incubarea și creșterea vitroculturilor a fost făcută timp de 90 de zile în camera de creștere în care s-au asigurat condiții de iluminare cu lumină fluorescentă, albă, cu o intensitate de 1700 lucși și o fotoperioadă de 16 ore/zi și o temperatură de 23 ± 2 ᵒC.

6.4. EXPERIMENT PRIVIND TEMPORIZAREA CREȘTERII IN VITRO LA NIVELUL PROPAGULILOR DE ROUA CERULUI PRIN CULTURI ÎN DUBLU STRAT

6.4.1. Protocol experimental

Prezentul experiment a fost realizat conform particularităților de cultură prezentate în tabelul 1.

Recipientele de cultură au constat din flacoane cu diametrul de 2 cm și înălțimea de 7 cm, având fiecare câte 5 ml mediu de cultură. La 30 de zile de la inocularea propagulilor pe stratul solid, în condiții sterile, adică la hotă cu flux laminar orizontal de aer steril, a fost adăugat supernatantul, câte 2 ml/recipient, acoperind 2/4 din înălțimea tufei de roua cerului. După operațiunea de adăugare a celui de al doilea strat, vitroculturile au fost trecute din nou în camera de creștere, în condiții similare celor din prima etapă.

Tabelul 1. Protocol experimental.

Prepararea amestecului de uleiuri naturale (a supernatantului):

Amestecul de uleiuri s-a preparat din: ulei de măsline, vin alb vechi de cel puțin cinci ani, din plante – piper, vâsc, cuișoare, scorțișoara, nucșoara, maghiran – și din esențe – scorțișoară, untdelemn, smirna, tămâie solidă, nard. Vinul, plantele, uleiul și esențele s-au fiert în vase speciale timp de trei zile și s-a amestecat continuu pentru a nu se arde uleiul și pentru a evita ca plantele să rămână pe marginea vaselor, ceea ce ar duce la schimbare culorii.

Tămâia este o substanța rășinoasa obținuta prin crestarea scoarței unor arbuști exotici, solidificată sub forma unor boabe neregulate, de culoare gălbuie-roșiatica, care prin ardere, produce un fum cu miros aromat pătrunzător. Este folosită în ceremoniile religioase, medicină și parfumerie. Aceasta rășina aromată, care arde ușor si repede la flacăra, se scurge din trunchiul arborilor din speciile Boswellia carteri, Boswellia serata, aparținând familiei Burseraceae, care cresc în: India, China, Somalia, Etiopia, Egipt. Scoarță acestor arbori, prin incizare produce o oleorezina numita esența de Oliban sau tămâie, ce conține rezine (în care predomina acidul boswelic), ulei volatil (în care predomina hidrocarburile monoterpenice), gume, substanțe amare. Are acțiune antialergica, antidepresiva, expectoranta, antiinflamatoare, imunostimulatoare, cicatrizanta, fiind utilizata în afecțiuni respiratorii astmatiforme, depresii.

Smirna este tot o substanța rășinoasa, obținută prin crestarea unor arbuști exotici: Styrax benzoin- Sumatra, Styrax macrothyrsus – Vietnam, Styrax paralleloneurus – Indonezia, Styrax tokinozis – China din Familia Stryacceae, care arde răspândind un miros plăcut aromatic si care se folosește in ceremoniile religioase, îmbălsămare, în medicina și parfumerie. Styrax benzoin este un arbust, dar poate avea si forma unui copac cu o înălțime de 4-5m. Din scoarța lui, prin incizii, curge rășina, denumita smirna, un suc alburiu, foarte compact, care se solidifica in contact cu aerul devenind untoasa. Treptat, culoarea devine aurie, pentru ca atunci când rășina este întărita, să fie roșiatica. Smirna are un gust balsamic și arde răspândind un miros plăcut si mulți vapori de acid benzoic cu acțiune farmaceutica. Se dizolva in alcool de 90° sau in eter. Impostorii pot falsifica smirna cu diferite rășini obținute din diferite specii de brad, molid etc. Smirna este antiinflamatoare a căilor respiratorii. Ea este întrebuințata si ca antioxidant, sau cu acțiune antiseptica, astringenta, carminativa, deodoranta, sedativa si expectoranta.

Scorțișoara reprezintă scoarța aromatica a unor arbori, precum Cinnamomum zeylanicum Ness, din familia Lauraceae, care se dezvolta in zonele calde, folosită drept condiment, dar și in medicină, datorita compoziției chimice a uleiului de scorțișoara, bogat in eugenol si benzoat de benzil. Uleiul se obține prin distilarea cu vapori de apa a scoarțelor ramurilor tinere, a florilor si a frunzelor. Acesta are efect antidiareic, antimicrobian, astringent, imunostimulator, afecțiuni respiratorii, genito-urinare, in tratamentele stomatologice, vermifug.

Nardul reprezintă un grup de specii de plante erbacee, din familia Valerianaceae, originare din regiunea munților Himalaya, iar uleiul de nard, extras din rădăcinile acestora. Uleiul din rădăcină de nard, obținut prin distilare, este un lichid uleios, pal gălbui, foarte plăcut mirositor, iute la gust, care are acțiune antiinflamatorie, antipiretica, bactericida, fungicida, laxativa si purgativa.

Uleiul de măslin sau untdelemnul nu se extrage din sâmburi de măslin, ci din pulpa sau carnea fructului (cu cât fructul este mai cărnos, cu atât uleiul este mai puțin si
inferior calitativ).

6.4.2. Rezultate și discuții

La 30 de zile de la inocularea pe simplu strat constând din mediu de cultură solid MS, lipsit de regulatori de creștere a propagulilor uniformi de roua cerului, peste vitroplantule a fost aplicat un supernatant, preparat din numeroase uleiuri și esențe naturale, descris mai sus.

La 30 și 60 de zile de la adăugarea celui de al doilea strat, a supernatantului, au fost făcute biometrizări ale indicilor de creștere pentru a identifica rata de creștere a fitoinoculilor amplasați în condiții de conservare in vitro în stratul de amestec de uleiuri (varianta testată), comparativ cu un lot de plantule martor, cărora nu le-a fost aplicat stratul de supernatant (varianta control) (Fig. 2).

Fig. 2. Valori procentuale ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 30, respectiv 60 de zile de la startarea culturii în dublu strat, provenite de la lotul amplasat sub supernatant, comparativ cu cei biometrizați la lotul martor, a cărui valori medii au fost considerate ca fiind 100%.

A B

C D

Fig. 3. Aspecte ale temporizării creșterii la roua cerului (Drosera rotundifolia L.), cultivată în regim de dublu strat (Fig. B și D), la 30 (Fig. A și B) și 60 (Fig. C și D) de zile de la startarea experimentului, comparativ cu lotul martor (Fig. A și C) (culturi în simplu strat) (barele reprezintă 1 cm).

După cum se poate observa în figura 2, indicii de creștere privind procesul de caulogeneză (în special diametrul limbului foliar), ai vitroplantulelor cultivate în regim de dublu strat au fost inhibați de acțiunea amestecului de ulei, comparativ cu cei omologi ai lotului martor. (Fig. 3). Rizogeneza nu a avut de suferit din cauza imersiei în supernatant, ceea ce înseamnă că acesta a avut o acțiune directă, posibil chiar fizică, asupra organelor vegetative ale plantulelor. Ipoteza de la care am pornit în realizarea acestui experiment s-a dovedit a fi adevărată.

6.5. EXPERIMENT PRIVIND STUDIEREA IMPACTULUI DIMENSIUNII VASULUI DE CULTURĂ ASUPRA MORFOGENEZEI IN VITRO A PLANTULELOR DE DROSERA ROTUNDIFOLIA L.

6.5.1. Protocol experimental

Metodologia de lucru este prezentată în tabelul de mai jos.

Tabelul 2. Protocol experimental.

6.5.2. Rezultate și discuții

La 30 de zile de la inoculare, în urma prelucrării matematice (media, abaterea standard, eroarea standard) și statistice (testul t) a datelor am constatat o diferență foarte semnificativă statistic în ceea ce privește lungimea limbului foliar al plantulelor de roua cerului aparținând lotului V0 (amplasate în vase de dimensiuni mari), comparativ cu valorile biometrizate la lotul provenit din recipiente de dimensiuni mici (V1) (Fig. 4).

Tot creșteri dar doar semnificative din punct de vedere statistic, au fost semnalate în cazul lățimii limbului foliar, și a înfloririi in vitro, marcată prin indici precum lungimea tijei florale, respectiv numărul de tije florale (Fig. 5).

Din perspectiva rizogenezei, nu sunt diferențe semnificative între vitroplantulele celor doua loturi (Fig. 4).

Fig. 4. Valori medii ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 30 de zile de la inocularea în diferite recipiente de cultură mai mari (V0) și mai mici (V1) (barele reprezintă eroarea standard) (* – semnificativ p<0.1; *** – foarte semnificativ p<0.01).

V0 V1

Fig. 5. Aspecte ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 30 de zile de la inocularea în diferite recipiente de cultură mai mari (V0) și mai mici (V1) (bara reprezintă 1 cm).

La 60 de zile de la inoculare

În cest moment al biometrizărilor se menține tendi0nța din prima lună de la inoculare (Fig. 6). Astfel că, dacă la nivelul rizogenezei nu sunt observate diferențe semnificative între cele două loturi de vitroplantule, caulogeneza este mai intensă, mai ales din perspectiva suprafeței foliare, la nivelul lotului cultivat pe varianta V1 (Fig.7).

Fig. 6. Valori medii ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 60 de zile de la inocularea în diferite recipiente de cultură mai mari (V0) și mai mici (V1) (barele reprezintă eroarea standard; *** – foarte semnificativ p<0.01).

V0 V1

Fig. 7. Aspecte ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 60 de zile de la inocularea în diferite recipiente de cultură mai mari (V0) și mai mici (V1) (bara reprezintă 1 cm).

La 90 de zile de la inoculare

La finele experimentului, după 90 de zile de vitrocultură, s-a identificat o regenerare ridicată de propaguli în recipientele de dimensiuni mai mari, comparativ cu cele de dimensiuni mai mici, în schimb la lotul din urmă, dimensiunea propagulilor era mai mare, implicit a suprafeței foliare și a diametrului rozetei (Fig. 8 și Fig. 9).

În recipientele mari, numărul de propaguli, numărul și lungimea tijei florale, precum și numărul de rădăcinițe au înregistrat valori semnificativ mai ridicate, comparativ cu cele semnalate la lotul cultivat în recipiente de dimensiuni mai mici, în schimb vigurozitatea vitroplantulelor, a limburilor foliare, mai ales a lungimii acestora, a fost semnificativ mai mare la plantulele cultivate în recipiente mai mici (Fig. 8). Cu alte cuvinte în recipiente mare s-au regenerat mai multi propaguli de dimensiuni mici, în timp ce în recipiente mai mici propagulii neoformați au fost mai puțini, dar erau mai viguroși. Rezultate similare au fost obținute de Petruș –Vancea (2007) la violetele africane, care prezintă o creștere sub formă de tufă. Și la crizanteme cultivate in vitro recipiente mici s-a observat o tendință de stimulare a indicilor de creștere a plantulele cultivate în recipiente mici, doar cu 5 ml mediu de cultură, coparativ cu cele cultivate în recipiente mari, care au dispus de 20 ml mediu de cultură (Petruș – Vancea, 2007).

Fig. 8. Valori medii ale indicilor de creștere ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 90 de zile de la inocularea în diferite recipiente de cultură mai mari (V0) și mai mici (V1) (barele reprezintă eroarea standard; *** – foarte semnificativ p<0.01).

Fig. 9. Aspecte ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 90 de zile de la inocularea în diferite recipiente de cultură mai mari (V0 – stg.) și mai mici (V1- dr.) (bara reprezintă 1 cm).

6.6. CONCLUZII

Amestecul de uleiuri naturale a condus la temporizarea creșterii vitroplantulelor de roua cerului (Drosera rotundifolia L.), în ceea ce privește caulogeneza, cu păstrarea viabilității fitoinoculilor, putând fi recomandată ca metodă ecologică și economică de conservare in vitro a acestei specii cu scopul realizării de așa numitele living collection.

Utilizarea de recipiente de dimensiuni mari a condus la diminuarea semnificativă a procesului de caulogeneză, fără afectarea rizogenezei, comparativ cu recipientele de dimensiuni mici.

Dacă scopul culturii in vitro constă în aclimatizarea vitroplantulelor de roua cerului, recomandăm utilizarea recipientelor de mici dimensiuni, deoarece caulogeneza este inhibată (protejând astfel planta de evapotranspirație excesivă), fără ca rizogeneza să fie afectată.

Dacă scopul culturii in vitro este repicarea in vitro, recomandăm utilizarea recipientelor de mari dimensiuni, deoarece numărul de propaguli care se pot constitui în viitori fitoinoculi, într-o subcultură, este foarte ridicat, comparativ cu cel regenerat în recipiente de dimensiuni mai mici.

7. BIBLIOGRAFIE

Antofie, M.M., 2010, Convenția privind diversitatea biologică și agrobiodiversitatea. Revista ULBS 'Studia Securitatis', vol. IV, nr. 3, pp.72-106.

Antofie, M.M., 2011, Current political commitments. Challenges for ex situ conservation of plant genetic resources for food and agriculture. Analele Universitatii din Oradea Fascicula Biologie, Tom. XVIII, Issue: 2, pp. 157-163.

Atanassov, A., 1986, Sugar beet (Beta vulgaris L.). Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 2: Crops I, Bajaj, Y.P.S. (ed.), Springer – Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 462 – 470.

Baciu, A., Petruș-Vancea, A., Zehan, R., Mike, L., Prodan, M., 2007, The results in the field of the in vitro conservation of the cultivars when using classic and modern conservation methods. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, Tom. XIV, pp. 23-26.

Brown, L., 2008, Plan B 3.0. Mobilizing to save civilization. W. W. Norton & Company, Inc.

Brown, L., 2009, Plan B 4.0. Mobilizing to save civilization. W. W. Norton & Company, Inc.

Brown, L., 2011, World on the Edge: How to Prevent Environmental and Economic Collapse. W. W. Norton & Company, Inc.

Cachiță, C.D., 1987, Metode in vitro la plantele de cultură, Editura Ceres, București.

Cachiță, C.D., Ardelean, A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetală. Vol 2. Editura Dacia, Cluj – Napoca.

Cachiță, C. D., Halmágyi, A., 2000, Studii biochimice privind efectele conservării protocormilor de Cymbidium sub un strat de ulei de parafină. În: Actualități și perspective în biotehnologie vegatală. Lucrările celui de al IX – lea Simpozion de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale. Cachiță, C.D., Bavaru, A., Brezeanu, A. (eds). „Ovidius” Univ. Press, Constanța, pp. 102 – 114.

Cachiță, C.D., Zăpârțan, M., Grigoraș, S., 1989, In vitro cultured Drosera rotundifolia a new biotest. The IV th Nat. Symp. On Plant Cell and Tissue Culture, Cluj-Napoca, Editura West Side Computers Brașov, pp. 42-43.

Cachiță, C.D., Zăpârțan, M., Grigoraș, S., 1991, In vitro cultured Drosera rotundifolia ‐ a new biotest. În „In vitro” Explant Culture – Present and Perspective. The IV – th National Symposium on Plant Cell and Tissue Culture, Cluj – Napoca. Cachiță C.D (ed).

Cachiță, C.D., Deliu, C., Rakosy T.L., Ardelean, A., 2004, Tratat de biotehnologie vegetală. Vol. 1. Editura Dacia, Cluj – Napoca.

Cachiță, C. D., Halmágyi, A., Deliu, C., 1999, Reacția diferitelor cormofitoinoculi la conservare prin stocarea culturilor sub un strat de ulei de parafină, pe durată scurtă de timp. În: Culturi “in vitro” la cormofite. Lucrările reunite ale celui de al VII-lea și al VIII-lea Simpozion de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale. Cachiță, C.D., Ardelean, A., Crăciun, C. (eds., Risoprint, Cluj- Napoca, pp. 261 – 267.

Chifu, T., Mânzu, C., Zamfirescu, O., Șuruban, B., 2002, Botanică sistematică. Cormobionta. Editura Univ. “AL. I. Cuza” Iași.

Crisan, A., Petrus-Vancea, A., 2013, Studii preliminare de conservarea protocormilor de dendrobium si cattleya cu ajutorul apei sărăcite în deuteriu. Științe exacte și științe ale naturii (Oradea), Vol. V, pp. 9-15.

Crower, A. A., Pearson, M.C., Grubb, P. J., Langlois, P. H., 1990, Drosera L.. Biological flora of the British Isles. Jaurnal of Ecology, vol. 78, pp. 233- 267.

Darwin, Ch., 1875, Insectivorus plants. Editura John Murray, London, p. 462.

Holodnîi, N.G., 1966, Charles Darwin și cunoștințele actuale despre plantele insectivore(I,II). Natura, nr. 18, pp. 38-53.

Grevenstuk, T., N. Coelho, S. Gonçalves, Romano, A., 2010. In vitro propagation of Drosera intermedia in a single step. Biol. Plant. 54, pp. 391-394.

Grigorescu, E.M., Ciulei, I., Stănescu, U., 1986, Index fitoterapeuti. Editura Medicală, București

Hevele, E., Tripon, C., Petrus-Vancea, A., 2013, Conservarea biodiversității prin micropropagare in vitro. Științe exacte și științe ale naturii (Oradea), Vol. V, pp. 67 – 71.

Hook, I.L.I., 2001, Naphthoquinone contents of in vitro cultured plants and cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67, Kluwer Academic Publishers, pp. 281-285.

Ilies, C., Petrus-Vancea, A., 2013, Micropropagarea la Drosera rotundifolia L.. Științe exacte și științe ale naturii (Oradea), Vol. V, pp. 21-25.

Rejthar, J., Viehmannova, I., Cepkova, P.H., Fernández, E., Milella, L., 2014, In vitro propagation of Drosera intermedia as influenced by cytokinins, pH, sucrose, and nutrient concentration. Emir. J. Food Agric., 26 (6), pp. 558-564.

Jayaram, K., Prasad, M.N.V., 2007, Rapid in vitro multiplication of Drosera indica L.: a vulnerable, medicinally important insectivorous plant. Plant Biotechnol. Rep. 1, pp. 79–84.

Jimenez, V.M., Guevara, E., Masis, E., 2011, Effect of macronutrients and sucrose concentration on in vitro grow of Drosera capensis L. (Droseraceae) plants, and evaluation of six substrates for aclimatization. Propag. Ornam. Plants 5, pp. 47–68.

Kawiak, A., Lojkowska, E., 2011, In vitro cultures of Drosera aliciae as a source of a cytotoxic naphthoquinone: ramentaceone. Biotechnol. Lett. 33, pp. 2309-2316.

Murashige, T., Skoog, F., 1962, A revised medium for rapid growth bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, pp. 473–497.

Nitschke, Th., 1861, Anatomie des Sonnentaublattes (Drosera rotundifolia L.). Bot. Ztg, 19, 33, pp. 233- 235.

Pătru, D.M., Cachiță, C.D., Floriș, C., 2000, Cercetări privind evoluția culturilor de protocormi de Cymbidium hybridum în condițiile substituirii zaharozei cu miere de albine. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, Tom. VII, pp. 271 – 282.

Petruș – Vancea, A., 2007, Cercetări privind procesele morfofiziologice și biochimice care au loc în decursul aclimatizării plantulelor generate in vitro, la viața în mediul septic. Teză de doctorat. Universitatea din Oradea.

Petruș – Vancea, A., 2011 a, Cercetări privind optimizarea micropropagarii ți conservarii in vitro a biodiversitatii vegetale de interes alimentar si economic. Teza de postdoctorat. Academia Română.

Petrus-Vancea, A., 2011 b, New methods to improve the bioeconomic and ecoeconomic impact by plant biotechnology. Studia Univ. Vasile Goldiș, Seria Șt. Vieții, Vol. 21 (3), pp. 613-618.

Petruș – Vancea, A., Cachiță, C.D., 2007, The study of the influence that the size and the shape of the vitroculture vessel has upon the organogenesis at the level of Chrysanthemum and Saintpaulia inoculs, as well as of the exvitroplantlets acclimatization to the septic life medium. Analele Universității din Craiova, Vol XII (XLVIII), Secțiunea Biologie, pp. 203-208.

Petruș, C.M., Cachiță, C.D., Petruș – Vancea, A., 2004 a, Micropropagarea la Cymbidium și Petunia pe medii de cultură preparate cu apă sărăcită în deuteriu. În: Fiziopatologia celulei vegetale în regim de vitrocultură – Lucrările celui de al XII -lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale. Cachiță, C.D., Ardelean, A., Fati, V. (eds.). Editura Dacia Satu – Mare, pp. 185 – 192.

Petruș – Vancea, A., Cachiță, C.D., Blidar, C.F., Filip, C., 2004 b, Influența tipului de vas de vitrocultură și a cărbunelui activ asupra organogenezei “in vitro” la minibutașii de Petunia. În: Fiziopatologia celulei vegetale în regim de vitrocultură – Lucrările celui de al XII -lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale. Cachiță, C.D., Ardelean, A. (eds.). Editura Daya, Satu – Mare, pp. 178 – 184.

Petruș – Vancea, A., Cachiță, C.D., C.F. Blidar, Gergely, I., 2006, Încercări de temporizare a creșterii protocormilor prin acoperirea acestora cu ulei. În: Conservarea vitroculturilor vegetale – Lucrările celui de al XIV -lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale. Cachiță C.D. și Sand, C. (eds). Editura Alma Mater, Sibiu, pp. 65 – 76.

Petruș – Vancea, A., Cachiță, C.D., Pătru Diana, Duna, Tunde, 2003, Metode de temporizare a creșterii protocormilor de Catthleya și Dendrobium prin adaos de acid salicilic și acid acetil salicilic. Studia Univ. Vasile Goldiș, Seria Șt. Vieții, Vol. 13, pp. 97 – 103.

Pietropaolo, J., Pietropaolo, P., 1997, Carnivorus plants of the world. Timber Press, Inc.

Radoveț-Salinschi, D., Cachiță, C.D., 2003, Influența tipului de recipient de cultură asupra morfogenezei „in vitro” la nivelul minibutașilor apicali de diferite specii de Coleus. Analele Universității din Oradea, Fascicula Biologie, Tom. X., pp. 269 – 274.

Radoveț-Salinschi, D., Cachiță, C.D., 2004, Evoluția minibutașilor subapicali de Coleus cultivați „in vitro”în recipiente de calibru diferit. În: Fiziopatologia celulei vegetale în regim de vitrocultură – Lucrările celui de al XII-lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale. Cachiță, C.D., Ardelean, A. (eds.). Edituta Daya 2004, pp. 193 – 202.

Thomas, D., Murashige, T., 1979, Volatile emission of plant tissue cultures: I Identification of major component. In vitro, 15 (9), pp. 654 – 658.

Toma, C., Stănescu, I.E., 2008, Fascinanta lume a plantelor carnivore. Editura Graphys, Iași.

Toma, C., Toma, I., 2002, Plante carnivore – un caz particular de adaptare la mediul de viață. Prelegeri academice nr. 1. Editura Apollonia, Iași, pp. 103-130.

Turcuș, V., 2009, Studii morfologice, anatomice și citologice efectuate la nivelul vitroplantulelor de Drosera potundifolia. Teza de doctorat, Universitatea din Oradea.

Slack, A., 2000, Carnivorous Plants. MIT Press, Yeovil, p . 240

Stănescu, I., Gostin, I., Toma, C., 2008, Leaf structure considerations of some Drosera L. species. Acta Horti Botanici Bucurestiensis, 33, pp. 77 – 82.

Stănescu, I., Toma, I., Toma, C., 2005, Considerations of the stem structure of some Drosera L. species. Contribuții botanice ale Universității “Babeș-Bolyai”, Cluj-Napoca, nr. 40, pp. 215-220.

Tisserat, B., 2000, CO2 – ultrasonic fogging system enhances survival & growth. Agricell Report, 8, p. 12.

Williams, R.R., Taji, A.M., 1989, Auxin type, gel concentration, rooting, and survival of Cheiranthera volubilis in vitro. HortScience, 24, pp. 305 – 307.

Pagini web:

http://www.edusoft.ro/rol/Protectia%20mediului%20si%20rezervatii%20naturale.php, disponibil în iunie 2014.

http://www.ecotoporadea.ro/images/brosuri/cartea_verde.pdf – raport Ecotop Oradea, disponibil în iunie 2014.

http://www.mmediu.ro/beta/domenii/protectia-naturii-2/arii-naturale-protejate/, disponibil în iunie 2014.

http://enciclopediaromaniei.ro/wiki/Crovul_de_la_Larion, disponibil în iunie 2014.

BIBLIOGRAFIE