Metoda Cromatografiei Gaz Lichide Si Aplicarea Ei In Analiza Chimico Toxicologica

Introducere

În ultimele decenii în arsenalul preparatelor medicamentoase sau inclus un șir de preparate noi ca: sulfanilamidele, antibiotice, vitamine, antituberculoase, psihotrope, hormonale, cardiace ș.a. Creșterea arsenalului de forme medicamentoase este însoțit de apariția noilor metode de analiză calitativă și cantitativă. Aici nu este lipsită de mister metoda cromatografiei gaz-lichide.

Aceasta este, o metodă sensibilă, universală și specifică, care oferă posibilități de identificare, dozare a substanțelor medicamentoase în preparate, lichide biologice, cât și pentru separarea ingredientelor în amestec.

În prezent cromatografia gaz-lichide se aplică în lucrul practico-științific în laboratoarele biochimice, chimice, clinice ș.a. Pentru aplicarea acestei metode în practica chimico-farmaceutică nu sunt în de-ajuns surse în literatură.

Prin această indicație metodică oferim studenților un ghid de orientare în vederea analizei chimico-toxicologice a toxicilor volatili. Totodată sunt incluse metodele de îndeplinire a lucrărilor individuale, care ridică amplituda cunoștințelor studenților în vederea determinarii substanțelor toxice din materialul biologic: sunt formulate scopurile, planul expus, materialul informativ, subiectele ce stau la baza studierii temei, indicații pentru lucrul practic al studenților în laborator.

Tema: Analiza toxicilor “volatili” prin metoda cromatografiei gaz-lichide

Scopul studierii temei: Ai învăța pe studenți să efectueze analiza chimico-toxicologica asupra toxicilor volatili din materialul biologic în urma izolării.

Planul studierei temei

Introducere în analiza cromatografiei gaz-lichide a toxicilor volatili. Cercetarea materialului biologic asupra toxicilor volatili, care se izolează prin metoda antrenării cu vapori de apă.

Determinarea cantitativă a toxicilor volatili aplicând metoda cromatografiei gaz-lichide.

Determinarea alcoolului etilic în sânge și urină prin metoda cromatografiei gaz-lichide.

Material informativ

Efectele cromatografice au fost cunoscute din cele mai vechi timpuri. Încă pe timpul lui Aristotel oamenii dedurizau apa de mare, filtrând-o prin anumite pământuri.

Metoda cromatografică, ca metodă științifică de separare și analiză a substanțelor, a fost elaborată de savantul rus M.S.Țvet, în anul 1903. Cu ajutorul acestor metode Țvet a stabilit, că pigmentul verde al plantelor clorofila, care se consideră omogen, este într-adevăr alcătuit din câteva substanțe. Trecând extractul frunzei verzi printr-o coloană umplută cu praf de cretă și spălându-l cu solvenți organici Țvet a obținut câteva zone colorate, fapt care mărturisea incontestabil despre prezența în extract a câtorva substanțe. Ulterior acest fapt a fost confirmat și de alți cercetători. Această metodă a fost numită cromatografie (grec ”chromatos” – culoare) deși însuși autorul a demonstrat posibilitatea separării și a substanțelor incolore.

În 1941 Martin și Synge bazându-se pe fenomenul deja cunoscut ei încearcă separarea aminoacizilor, folosind o coloană umplută cu silicagel saturat cu apă, iar fază mobilă folosesc cloroform amestecat cu adausuri din ce în ce mai mari de alcool n-butilic. Astfel apare cromatografia de separare pe coloană.

În 1944 Gordon și Martin pun bazele cromatografiei pe hârtie. Tehnica de lucru simplă face, ca cromatografia pe hârtie să se dezvolte și să se aplice la separarea amestecurilor de substanțe organice și ulterior la cele anorganice.

Datorită rapidității această metodă oferă informații printr-un efort minim.

Cromatografia de gaze s-a dezvoltat datorită perfectării detectorilor, folosirii diferitelor faze staționare și mobile noi.

Clasificarea metodelor cromatografice

Metodele cromatografice de separare fac parte din metodele de separare, bazate pe echilibrul între faze. În aceste metode este valorificată diferența între proprietățile de separare a componenților amestecului între două faze de contact și nemescibile. Clasificarea generală a metodei cromatografice este în funcție de natura fazelor (I), procesele, care au loc la separare (II) și modul de efectuare (III)(fig.1).

Metodele de separare și analiză cromatografică nu sunt specifice. În procesul de analiză cromatografică se ia în considerație natura fazelor, ce urmează a fi folosite, prezența compușilor care interferă cu compușii analizați. În alte cazuri este necesară izolarea unor compuși necunoscuți în vederea caracterizării lor ulterioare, sau analiza completă a unui amestec complex, necunoscut, prin separarea componenților, urmată de analiză de structură și determinării cantitative.

Tehnicile de separare au fost create în funcție de proprietățile amestecurilor în limite extrem de mari), volatilitate și alte proprietăți.

Complexitatea tehnicilor de separare este corelată cu proprietățile componenților de separat. În cazul izomerilor optici separarea lor poate fi realizată cu tehnici speciale. În alte cazuri proprietățile sunt atât de diferite încât separarea poate fi realizată printr-o tehnică simplă (distilare).

După ce componenții din amestec au fost separați se poate alege metoda adecvată de determinare.

Clasificarea metodelor cromatografice

Fig. 1. Schema clasificării metodelor cromatografice

Dinamica proceselor cromatografice

Determinarea parametrilor de retenție

Separarea cromatografică se bazează pe distribuția diferită a componenților unui amestec între două faze nemescibile, dintre care una este staționară și poate fi lichidă, solidă sau în forma de gel, iar altă este mobilă și poate fi în stare gazoasă sau lichidă. Distribuția componenților amestecului de analizat între cele două faze se realizează, în general, prin diverse procese fizice (sorbție-desorbție, excluziune sterică), fizico-chimice (repartiție, dizolvare-eliminare), chimice (schimb ionic, precipitare, complexare, oxido-reducere etc.). Cantitativ repartiția componenților amestecului analizat, între cele două faze e determinată de raportul dintre cantitatea de component în faza staționară și mobilă și se numește constantă de distribuție a componentului în sistemul dat:

CS

K = (1)

Cm

unde: K – constanta de distribuție:

CS și Cm – concentrația (sau cantitatea) totală a tuturor formelor unui component analizat, prezent la echilibru în faza staționară și mobilă respectiv.

În funcție de procesul predominant la separare, când componentul analizat e prezent numai într-o anumită formă în ambele faze deosebim constantă de repartiție constanta de adsorbție etc. În acest caz procesele secundare sunt neglijabile. Aceste constante se notează și se calculează analogic constantei de distribuție, iar CS și Cm reprezintă concentrația (sau cantitatea) de component într-o anumită formă în ambele faze.

K – depinde de natura fazelor, t0 , pH, forța ionică a soluției (dacă faza mobilă este lichidă) etc.

Substanța este introdusă pe coloană cu faza mobilă. Ea se transportă (se reține) în faza staționară total sau parțial, fie prin adsorbție, repartiție, excluziune, reacție chimică etc. Tot odată substanța reținută deja în faza staționară contactează încontinuu cu noi porții de fază mobilă și total sau parțial se transferă din nou în faza mobilă. Faza mobilă deplasează încontinuu substanțele analizate pe un sector nou unde iarăși din nou se realizează același act elementar de echilibru.

Fie că urmează să separăm, pe o coloană cromatografică, un amestec din doi componenți A și B. Cantitatea de substanță în faza mobilă și stașionară va fi corespunzător: [A]m, [B]m și [A]S, [B]S. Din momentul introducerii amestecului pe coloană, la interfața dintre cele două faze nemescibile în conformitate cu legea echilibrului chimic, se stabilesc echilibre dinamice pentru fiecare component. Pentru fiecare component A și B vom avea coeficientul de distribuție KA și KB, respectiv (fig.2).

Fig.2. Coloana cromatografică. Schema de formare a zonei de component în metoda de eluție și repartiyarea sub stanței în zona de component

Cu cât componentul se reține mai mult într-o fază cu atât și concentrația lui va fi mai mare în această fază și mai mică în cealaltă fază, și invers. De exemplu, dacă componentul A se reține mai mult în faza staționară decât componentul B, atunci, coeficientul respectiv de distribuție vor îndeplini relația: KA > KB.

Orice separare cromatografică se caracterizează prin factorul de retenție (sau retenția) – R, care este raportul dintre viteza de migrare a componentului (VZ) și viteza de migrare a fazei mobile (eluentului) – (V) în faza staționară dată:

VZ

R = (2)

V

Valoarea numerică a lui R este subunitară (0 < R < 1). În condiții extreme, dacă VZ = 0, atunci R = 0 și substanța este totalmente reținută pe coloana dată. Dacă VZ = V, atunci R = 1 și substanța este purtată de faza mobilă fără a interacționa cu faza staționară.

Retenția depinde de coeficientul de distribuție a substanței date. Dacă R reprezintă fracția moleculelor componentului ce se află în faza mobilă, atunci 1-R va reprezenta fracția moleculelor aflate în faza staționară la echilibru. Prin urmare se poate scrie:

CS 1 – R 1

K = = → R = (3)

Cm R K + 1

Din expresiile (2) și (3) obținem:

V

VZ = (4)

K + 1

De aici rezultă, că factorul de retenție și viteza de migrare a substanței prin coloană sunt invers proporționale cu constanta de distribuție a ei.

Viteza de migrare a substanței prin coloană poate fi definită ca raportul dintre lungimea coloanei parcursă de substanța dată (L) și timpul de reținere a substanței (tR) pe coloana dată:

L

VZ = (5)

tR

Luând în considerație expresia (4) obținem:

L (K+1)

tR = (6)

V

Deoarece lungimea coloanei și viteza fazei mobile în condițiile date sunt mărimi constante, timpul de reținere este direct proporțional cu constanta de distribuție și fiind ușor măsurabil, servește ca parametru de retenție în analiza calitativă cromatografică și se numește timp de retenție.

Timpul de retenție poate fi definit ca timpul în care substanța dată a eluat (s-a deplasat) prin coloana de la momentul introducerii și până la detecția concentrației maxime la ieșirea ei din coloană.

Alt parametru de retenție utilizat în cromatografie este volumul de retenție (reținere) total (V2), care poate fi definit ca volumul de eluent măsurat de la introducerea probei pe coloană și până la ieșirea concentrației maxime a componentului de pe coloană.

Volumul de retenție (VR) e proporțional cu timpul de retenție (tR):

VR = tR F (7)

unde F este viteza volumetrică a gazului purtător.

Parametrii de retenții (tR, VR) depind de natura fazelor, de presiunea fazei mobile, masa fazei staționare, pH, t0, parametrii geometrici ai coloanei etc. Dar asupra acestor mărimi pot influența și diferiți factori ocazionali.

Pentru componenții A și B parametrii de retenție se vor afla în următoarele relații:

KA > KB

VA < VB

tR (A) > tR (B) (8)

VR (A) > VR (B)

Prin urmare, componenții amestecului analizat, având coeficienți de distribuție diferiți se vor deplasa în procesul eluției cu diferite viteze și vor avea un timp de reținere diferit, în condițiile date. În rezultat se va realiza separarea componenților pe coloana dată.

Constanta de distribuție este factorul principal, care determină separarea substanțelor pe coloana cromatografică. Cu cât mai mare va fi diferența dintre valorile constantelor de distribuție, cu atât mai efectivă va fi separarea cromatografică în condițiile date.

Cromatografia poate fi definită ca un proces dinamic bazat pe realizarea multiplă a actelor de echilibru la distribuția componenților amestecului în cele două faze nemescibile ce vin în contact.

În cromatografia de gaze separarea componentelor dintr-un amestec complex se realizează între o fază mobilă gazoasă și o fază staționară solidă (CGS) sau lichidă (CGL). Mecanismul separării poate fi un proces de adsorbție (CGS) sau de repartiție (CGL).

CG permite atât separarea substanțelor volatile (stabile la temperatura lor de volatilizare) cât și a celor care în urma unor reacții chimice (derivatizare) pot fi transformate în derivați volatili și stabili.

Faza mobilă este constituită dintr-un gaz inert: He, Ar, Ne, H2, numit și gazul vector (purtător), care antrenează substanțele de determinat.

Faza fixă (staționară) este formată dintr-un adsorbent (CGS) sau dintr-un suport inert granulos (0,15-0,18 mm) impregnat cu un lichid de impregnare – puțin volatil sau lichid selectiv (CGL). Faza fixă se găsește tasată în coloană sau depusă pe pereții unor coloane capilare.

Aparatul și principiile de lucru

În figura 3 este prezentată schema de princiăpiu a unui cromatograf de gaze de tipul „Crom-5”. Componentele esențiale ale cromatografului cu gaz purtător, care are rolul de fază mobilă (1); reductor de presiune (2); uscător purificator (3); blocul de control fin (4); debitmetru (5); dispozitiv de injectare pentru introducerea probei (6); două coloane montate paralel (7); detectorul (8) și imprimanta (11). Dispozitivul de injectare, coloanele și detectorul sunt amplasate în cuptoare cu reglare și control automatizat al temperaturii.

Fig. 3. Schema de principii a cromatografului de gaze

Într-un cromatograf gazul vector care provine de la “sursa de gaz” reglat la un anumit debit de reglatorul de debit traversează camera de injectare a probei și antrenează substanțele volatile spre coloana cromatografică. Volumul cuprins între capul de injectare și capătul coloanei trebuie să fie cât mai mic posibil. O metodă mai nouă constă în injectarea direct în coloană, la 1-2 cm umplutură. Din coloană curentul de gaz este introdus în detector. Detectorul transformă diferența unei proprietăți fizice dintre componentele probei și gazul purtător într-un semnal electric, proporțional cu concentrația componenților din faza gazoasă și se produce un semnal, care se înregistrează cu ajutorul unui integrator, ordinator . Înregistratorul trasează o curbă în formă de clopot. Reprezentarea grafică a semnalelor detectorului în funcție de timp, poartă denumire de cromatogramă (fig.4).

Picul cromatografic.Parametrii de bază și mărimile derivate

Picul este secțiunea cromatogramei semnalizată de detector la apariția componentului în gazul purtător; în cazul separării incomplete, în același pic pot apărea mai multe componente. În gaz-cromatogramă se definește linia de bază a cromatogramei – secțiunea de cromatogramă, care se înregistrează când din coloană iese numai gazul purtător.

Baza picului este distanța BD dintre limitele sale extreme. Aria (S) a picului reprezintă suprafața mărginită de curbă și de bază. Înălțimea (h) a picului este distanța dintre maximul picului și bază, măsurată paralel cu axa pe care se înregistrează semnalul detectorului. Lățimea B1D1 a picului este distanța dintre intersecțiile tangentelor duse în punctele de inflexiune cu baza. ω0,5 – reprezintă lărgimea curbei la jumătatea înălțimii piculu.

Componentele probei se separă din coloană și o părăsesc una după alta într-o anumită ordine, după intervale de timp determina

Fig.5. Parametrii de bază ai picului și mărimile derivate

Timpul de retenție (tR) – timpul aflării substanței analizate în sistemul cromatografic. În practică se determină ca interval de timp din momentul introducerii probei în coloană și momentul înregistrării amplitudinii maxime a picului cromatografic. Fiecare substanță în unele și aceleași condiții își are timpul său de retenție parametru ce stă la baza identificării componenților amestecului de analizat.

Timpul „mort” (to) – timpul de trecere a eluentului prin sistemul cromatografic prezintă mărimea, ce caracterizează un sistem cromatografic concret cu o viteză dată a fluxului de eluent. El se determină ca timp de eluare al componentului nereținut.În practică determinarea timpului mort e dificilă, ce-i legată de inexistența substanțelor absolut nereținute, din care cauză pînă în prezent nu-i elaborată o abordare unică de determinare. Astfel la determinarea to prin metoda HPLC cu fază inversă se utilizează nitrații, mai rar bromurile sau nitrometanul.

Timp de retenție corectat sau net (recalculat) (tR) – timpul mediu, în decursul căruia moleculele substanței se găsesc în faza staționară. Se determină ca diferință:

tR = tR – to.

Factor de capacitate (coeficient de capacitate):K= tR/to=(tR- to)/to = tR/to– 1.

Mărime proporțională coeficientului de distribuție a sorbatului între faza mobilă și staționară. Este parametru mai universal, decât timpul de retenție. Întrucât valoare lui nu depinde de demensiunile geometrice a coloanei și de viteza de eluare. Cu mult mai rar se utilizează valoarea necorectată a factorului de capacitate: K = tR/to.

Înălțimea picului cromatografic (h) – distanța dintre vârful picului și linia de bază. Practic ea se determină ca lungimea perpendicularei, coborât din punctul de vârf al picului la linia de bază interpolară între capetele picului. Mărimea dată se utilizează la calcularea limitei de detecție de asemenea în analiza cantitativă deopotrivă cu aria picului.

Lățimea la jumătatea înălțimii picului (1/2) – distanța orizontală dintre liniile, ce limitează profilul de pic la jumătatea înălțimii lui. Pentru picul gaussian 1/2 = 2,345 . Se utilizează la calcularea eficienței coloanei și altor mărimi.

Lățimea la baza picului () se determină ca segment retezat la linia de bază de tangentele trasate în punctele de inflexiune pe pantele picului, sau ca distanță orizontală dintre punctele situate la nivelul 0,044 h. Pentru picul gaussian = 4 . În practică este complicat de măsurat exact această valoare, de aceea mai des se utilizează mărimea 1/2.

Factor de asimetrie (As) – mărimea ce caracterizează gradul de asimetrie orizontală a picului. Pentru picurile simetrice, printre care și gaussiene As=1; mărimea As 1 corespunde frontului ascendent mai întins a picului „fronting”, iar când As 1 este mai întins frontul descendent „tailing”. Există diverse procedee de determinare a factorului de asimetrie; cel mai des se aplică egalitatea: As = (a0,05 + b0,05) / 2a = 0,05/2a, unde a0,05 și b0,05 – lățimea corespunzător porțiunii anterioare și posterioare a picului la nivelul 0,05 h.

Eficiența coloanei (N) se exprimă prin numărul de talere teoretice și este legată de parametrii funcției Gauss: N = tR/2.

Selectivitatea (factorul de separare) (a) capacitatea sistemului cromatografic de a separa doi analiți.

a = tR2/tR1=(tR2- to)/tR1 – to = K2/ K1.

Ea reflectă doar gradul de separare a maximelor de pic fără a lua în considerație lățimile lor.

Factorii care condiționează separarea gaz-cromatografică sunt:

natura izotermei de repartiție;

volumul și principiile de injectare în coloană a probei de analizat;

natura gazului vector;

programarea temperaturii și a debitului de eluant;

natura fazelor;

tipul de detector.

Forma picului cromatografic depinde de tipul izotermei de adsorbție. La temperatură constantă adsorbția se mărește la creșterea presiunii gazului ori concentrației soluției.

Izoterma de adsorbție este dependența cantității substanței adsorbite de presiunea gazului purtărrtător sau concentrația soluției la temperatură constantă. (fig.6)

Fig.6.Diferite tipuri de iz oterme

Aceste izoterme sunt descrise de o ecuație de tip L angmuir de forma:

b c (9)

ai = am

1 + b c

unde ai este cantitatea de substanță reținută (adsorbită) pe faza staționară în timpul echilibrului; am – cantitatea maximă de substanță care poate fi reținută (adsorbită) pe faza staționară dată, pentru acoperirea ei cu un strat monomolecular; b – constanta caracteristică puterii de adsorbție; c – concentrația componentului în faza mobilă.

După Langmuir la suprafața corpului solid există un număr de locuri cu energie minimă, așezate la anumite intervale pe toată suprafața.

Numărul lor este egal dm. Pe aceste locuri se pot adsorbi molecule de gaz ori din soluție. În domeniul concentrațiilor mici izoterma e liniară (fig.6a). Pentru bc 1 numitorul din ecuația (9) devine egal cu 1 și ecuația dată poate fi scrisă astfel:

ai = am bc = KHC (10)

Această este ecuația adsorbției liniară. Corespunde ecuației lui Henry (KH – constanta lui Henry). Intervalul adsorbției liniare uneori se mai numește intervalul Henry. În cazul adsorbției liniare (fig. 6a) forma picului cromatografic este simetrică de tip goussian (fig.7a). În practică deseori dependența cantității substanției adsorbite de concentrația soluției sau de presiunea gazului nu este liniară. Izoterma adsorbției poate fi de exemplu, curbată, de formă convexă (fig. 6b) și atunci forma picului este asimetrică, cu coadă (fig.7b) sau de formă concavă (fig. 6c) și atunci se obțin picuri „frontale” (fig. 7c).

Izoterma de repartiție trebuie să fie liniară pentru a obține picuri cromatografice simetrice. În cazul izotermelor neliniare de adsorbție se recomandă blocarea parțială a centrilor activi de adsorbție prin depunerea unui lichid greu volatil sau să se lucreze la diluții mari.

Dispozitivul pentru introducerea probei (fig.8) este amplasat, astfel, încât proba să fie introdusă direct în gazul de transport. El constă din corpul propriu-zis (1), elementul termic (2),radiato rmetalic(3), septum pliabil(4), prin care estinjectată proba.

Fig.8 .Schema simplificată a blocului de injectare.

Blocul de injectare este menținut la o temperatură mai ridicată decât temperatura coloanei pentru transferarea completă a substanței la coloană.

Probele solide lichide sau gazoase sunt injectate cu ajutorul unei seringi calibrate. Pentru gaze se poate utiliza o seringă de 0,5-10,0 l.

Lichidele se introduc sub formă de soluții cu ajutorul microseringilor Hamilton.

Pot fi injectate cantități de 0-50, 0-10 sau 0-1,0 l, cu o reproductibilitate satisfăcătoare. Proba este trasă de câteva ori în seringă pentru a se asigura absența bulelor de gaz și apoi este injectată rapid în curentul de gaz purtător.

Substanțele solide sunt tratate în două moduri. În primul caz materialul este dizolvat într-un solvent adecvat și apoi injectat sub formă de soluție. În al doilea caz substanța solidă poate fi injectată direct utilizând o seringă specială. Aceasta este concepută astfel ca substanța să fie încărcată la capătul seringei printr-o „crestatură”. Proba este injectată, apoi printr-un septum, cu ajutorul unui plunger, direct în instalație. Dezavantajul acestui procedeu constă în lipsa de reproductibilitate, deoarece cantitatea de substanță luată în seringă nu poate fi măsurată cu exactitate.

Probele care au presiuni de vapori scăzute sunt transformate pe cale chimică în derivați volatili, apoi injectați în instalație. Acesta este un procedeu util, care să crească numărul compușilor, care pot fi separați prin cromatografic de gaze. Ca urmare multe categorii de compuși ca: aminoacizii, lipidele și polimerii cu masa moleculară mare, care în mod normal nu sunt volatili pot fi separați după transformarea lor în derivați volatili. De exemplu acizii organici cu presiuni de vapori scăzute pot fi convertiți în cloruri acide cu punctul de fierbere scăzut, steroizii pot fi silanizați sau ionii metalici pot fi complexați cu hexafluoroacetilacetonă. În toate cazurile presiunea de vapori a derivaților este mult mai ridicată decât presiunea de vapori a moleculei originale.

Mărimea probei trebuie să corespundă concentrațiilor, care se încadrează în domeniul liniar al izotermei de repartiție. Se pot determina probe gazoase, lichide și solide. Gazele se introduc în injector prin prelucrarea lor de către eluant din dispozitivele speciale; substanțele lichide și solide (după dizolvarea lor în solvenți sau după topire) se introduc cu ajutorul unor microseringi sau capilare în volum de 0,1-10 ěl (concentrația componentelor în probe fiind de ordinul mcg, mg ). Introducerea probei în injector se face rapid; temperatura injectorului trebuie să fie superioară p.f. al componenților, pentru a se realiza evaporarea instantanee a acestora.

Faza mobilă – gazul purtător. În mod obișnuit în cromatografia de gaze drept fază mobilă se folosește heliu sau azot. Aceste gaze sunt folosite în majoritatea cazurilor, deoarece îndeplinesc următoarele condiții:

faza mobilă trebuie să fie inertă

faza mobilă trebuie să aibă un preț de cost redus, deoarece se folosesc cantități mari.

faza mobilă trebuie să permită ca detectorul să răspundă într-un mod adevărat.

În calitate de rezervor pentru faza mobilă se folosește o butelia pentru gaze rezistentă la presiune înaltă. La ea se atașază un regulator de presiune pentru a reduce și controla curgerea gazului prin coloană și un debitmetru, pentru a controla debitul de gaz.

Natura gazului vector are un rol însemnat, ea poate influența timpii retenției a componentelor sau, prin adsorbția acestuia pe suprafața fazei staționare, îi modifică proprietățile. Alegerea eluantului se face în funcție de sensibilitatea detectorului, de interacțiunea acestuia cu componentele de separat, cu faza staționară.

În cromatografia cu gradient de temperatură componentele se distribuie în coloană pe direcția gradientului în funcție de volatilitatea lor (cele mai puțin volatile – la intrare, cele mai volatile – la ieșire).

În cromatografia cu programare de temperatură o temperatură constantă pe toată lungimea coloanei variază în timp după o funcție liniară sau neliniară.

Alegerea fazelor și a suportului pentru un proces cromatografic se realizează în dependență de natura substanțelor care urmează a fi separate.

Dacă fazele sau suportul reacționează cu compușii injectați în coloană pot rezulta picurile de eluție eronate, derive de fond ale detectorului sau chiar distrugerea instalației.

Numărul de suporturi inerți și de faze lichide staționare disponibile pentru CGL este practic nelimitat. Pentru a realiza o separare satisfăcătoare, faza lichidă aleasă trebuie să satisfacă următoarele condiții.

să fie un solvent bun pentru componenții probei;

să posede o selectivitate sporită, pentru ca puterea sa de solvatare să fie diferită pentru fiecare component al probei;

să posede presiune de vapori cât mai scăzută;

să fie stabilă din punct de vedere termic;

să fie inertă din punct de vedere chimic, față de componenții probei analizate.

Criteriul cel mai important pentru alegerea fazei staționare lichide este polaritatea fazei și a amestecului, care trebuie separat. Cea mai bună separare este realizată atunci când faza lichidă este similară din punct de vedere structural cu componentele amestecului, deoarece eficiența separării depinde de presiunile de saturație a componentelor din amestec și de coeficienții de activitate a lor în raport cu faza dată. În cazul unor componente cu presiuni de saturație foarte apropiate, separarea va depinde în cea mai mare măsură de coeficienții lor de activitate.

Coeficientul de activitate () reprezintă interacțiunile dintre moleculele componentului dizolvat în faza staționară lichidă și moleculele fazei staționare. Aceste interacțiuni se manifestă prin forțe Kesson (între două molecule cu dipoli permanenți), forțe de inducție Debyl (între un dipol permanent și unul indus, fie a fazei staționare, fie a fazei mobile) și forțe de dispersie sau forțe London (între moleculele nepolare), care se datoresc câmpului electric ai dipolilor cu viața foarte scurtă, produși de mișcarea sistemului nucleu – electroni ai unei molecule.

Este avantajoasă folosirea umpluturilor, suprafața cărora este acoperită cu o peliculă subțire de fază staționară lichidă. Însă micșorarea grosimii peliculei este limitată atât de interacțiunea componentului cu suportul fazei lichide prin fenomenul de adsorbție, care se poate suprapune peste fenomenul de dizolvare, cât și de necesitatea reducerii corespunzătoare a cantității de probă.

Fazele lichide pot fi clasificate în:

faze lichide nepolare: hidrocarburi lichide, uleiuri siliconice (cauciuc siliconic, SE-30 etc.). Aceste faze separă componentele în ordinea creșterii temperaturii de fierbere.

faze lichide polare conțin o cantitate mare de grupe polare (polietilenglicolii dimetilsulfolan etc.) Aceste faze separă numai compuși polari.

faze lichide cu polaritate intermediară cuprind fazele lichide cu grupe polare sau polarizabile pe un schelet mare nepolar (SE-52, dizodecilftalat, difenilbenzil etc.). Pe ele se separă compuși cu polaritate intermediară.

fazele lichide cu punți de hidrogen sunt faze polare care conțin un număr mare de atomi de hidrogen capabili de a forma legături de hidrogen cu compușii de separat.

Caracterizarea fazelor lichide se poate face cu ajutorul constantelor lui Mc Reynolds. Acest sistem se bazează pe cel al lui Rohrschnelder și este mai potrivit pentru practica cromatografică.

Constantele Mc Reynolds (IR) sunt diferențele între indicii de retenție Kovacs (IR) pentru un component i pe faza lichidă de studiat și faza de referință (IRo).

IR1 = IRi – IRio

S-a stabilit, că din toate fazele cunoscute, preferate sunt 12- Ele acoperă întreg domeniul de polarități. Aranjarea într-o scară a polarităților se face prin distanța față de squalan, care se determină pe faza constantelor Mc Reynolds. În figura 9 este redată scara celor 12 faze preferate în cromatografia de gaze și distanțele respective față de squalan.

2000 D

1885 TCEF 1,2,3 – Tris (2 cianotoxi)propan

1612 DEGS Dimetilglicolsuccinat

1500

1259 DEGA Dimetilglicoladipinat

1052 PEG-20M Polietilenglicol

1000

821 XE-60 Cianoetilmetil-siloxan

709 GF-1 Trifluorpropilmetil-siloxan

500

488 OV-22 Fenilmetildifenil-siloxan

377 DC-610 Fenilmetil-siloxan

271 OV-3

100 SE-30 Dimetil-siloxan

0 0 Squalan

Fig. 9. Cele 12 faze staționare lichide frecvent utilizate în CGL și polaritatea lor în comporație cu squalanul

. Faza staționară solidă în CGS este constituită din adsorbenți de tipul: silicagel, cărbune activ, site moleculare. Separarea se bazează pe un proces de adsorbție. Eficacitatea separării crește prin impregnarea adsorbantului cu mici cantități de lichid nevolatili (siliconi) sau cu gaze care se adsorb ireversibil (CO2, H2O, H2S). Mai recent se utilizează coloane împlute cu polimeri organici cu porozitate mare, sub formă de perle, de exemplu din seria “Porapak” (etilvinilbenzen-divinilbenzen). Aceștia servesc în special la analiza apei, alcoolilor, gazelor cu masa moleculară mică și amestecurilor lichide.

În scop analitic se utilizează coloane de 1-1,5 m lungime și 3-6 mm diametru, care pot fi confecționate din metal, sticlă sau material plastic și au formă de U sau de spirală.

Dintre suporții utilizați amintim cei de tip diatomit (Chromosorb P) Kieselgur (Chromosorb G,W, Sterchamol) polifluoretilena (Fluoropak-80, perle de sticlă). În cazul coloanelor capilare, rolul suportului îl joacă pereții capilarelor, pe care se depune un strat subțire de suport solid, care ulterior va fi impregnat cu faza lichidă.

Capacitatea de separare a fazei staționare lichide, în cazul amestecurilor depinde de raportul tensiunilor de vapori a componenților cât și de tăria legăturilor ce apar între moleculele componentelor și cele ale fazei staționare. Deosebim legături ionice, Van der Waals, legături de hidrogen sau cu transfer de sarcină.

Pentru separarea componentelor cu puncte de fierbere foarte diferite, se pot utiliza combinații de două sau mai multe coloane în serie sau în paralel, cu un singur, respectiv cu doi detectori (ex. Coloana cu fază lichidă nepolară – Squalan și una polară – Carbowax).

Detectori. În cromatografia de gaze, pentru depistarea componentelor, care ies de pe coloană se folosesc detectorii. În funcție de proprietatea măsurată deosebim:

detectori de ionizare (detectori de ionizare în flacără, detectori cu captură de electroni);

detectori care măsoară o proprietate fizică de volum (detector de conductibilitate termică);

detectori optici (flamfotometru, spectrofotometru);

detectori electrochimici. Clasificați în alt mod, detectorii pot fi: universali, selectiv, specifici.

Condițiile generale pentru detectori sunt: sensibilitatea, stabilitatea, fiabilitatea și emiterea unui semnal liniar pentru anumit domeniu de concentrație a probei.

Detectorul de conductibilitate termică (DCT) sau catarometrul are cel mai răspândit domeniu de utilizare (fig10). El face parte din categoria detectorilor universali. Este un detector nedestructiv și poate fi utilizat și în cromatografia preparativă.

Fig. 10. Schema de principiu a unui detector cu conductibilitate termică (DCT)

Principiul de funcționare se bazează pe măsurarea diferenței de conductibilitate termică între component și eluent. În acest scop se folosește un montaj electronic, cu două sau patru celule de conductibilitate termică. În figura 12 este redată schema unui montaj cu patru celule. Două din celule sunt spălate continuu cu gaz purtător (R1 și R4 – celule de referință), celelalte două sunt spălate de amestecul binar care iese din coloană (R2 și R3 – celule de măsură). Constructiv celulele nu pot fi realizate identice. Pentru echilibrarea inițială a punții se folosește potențiometrul 4. Filamentele detectorului sunt confecționate dintr-un material a cărui rezistență electrică variază foarte mult în funcție de temperatură. În timpul funcționării, filamentele sunt încălzite de trecerea unui curent continuu stabilizat, de la o sursă de curent 1. Stabilirea curentului de lucru se face cu un potențiometru 2 și se măsoară cu miliampermetrul 3.

Temperatura detectorului, în procesul de lucru trebuie să fie mai înaltă decât temperatura coloanei. Atât timp cât la ieșirea din coloana cromatografică va apărea numai gazul purtător, rezistențele celulelor vor fi aceleași, puntea va fi echilibrat și instrumentul de măsură montat va indica 0.

În registrătorul 5 va fi trasată linia zero. Prezența unui component în eluentul, care circulă prin celula de măsură modifică conductibilitatea termică a mediului gazos din această celulă. În rezultat se modifică rezistența electrică a filamentelor R2 și R3, care provoacă dezichilibrul punții. Intensitatea curentului înregistrat la dezichilibrarea punții este proporțională cu concentrația componentului care iese din coloană.

Mărimea semnalului detectorului depinde de diferința dintre conductibilitatea termică a componentului și eluentului. Conductibilitatea termică a substanțelor depinde de masa moleculară ei. Hidrogenul, heliul și azotul, având mase moleculare mici posedă conductibilități termice ridicate. Aceste gaze sunt ideale pentru a fi folosite ca gaze purtătoare în cromatografia de gaze.

Sensibilitatea detectorului depinde de factorul geometric al celulelor (dimensiunile, raza, lungimea filamentului) și de valoarea curentului de alimentare a punții. Sensibilitatea crește la mărirea curentului în punte.

Creșterea curentului peste o anumită valoare poate duce la distrugerea filamentelor și de aceea valoarea lui este limitată de natura gazului purtător și de temperatura de lucru a detectorului.

Linia zero este sensibilă la variațiile debitului de gaz purtător și al temperaturii Ppentru ca variațiile temperaturii să fie cât mai mici blocul metalic al detectorului trebuie să aibă o masă cât mai mare, iar celulele să fie dispuse simetric în detectori.

Detectorul de ionizare în flacără (DIF) este un detector universal, stabil și simplu în construcție. Principiul de funcționare a detectorului cu ionizare în flacără de hidrogen constă în măsurarea conductibilității electrice a unei flăcări de hidrogen în prezența unui compus organic (fig. 11).

Fig. 11. Schema detectorului cu ionizare în flacără de hidrogen

La ieșirea din coloană eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen și este aprins la capătul unei duze din platină sau oțel inoxidabil. Duza este montată într-o cameră de ardere alimentată cu un curent de aer sau oxigen. De asupra flăcării este montat un electrod colector (anod). Alimentarea electrozilor se face de la o sursă de tensiune continuă, de valoare mare (100-350 V). La arderea H2 în prezența numai a gazului purtător între duză și electrodul colector se stabilește un curent foarte slab (10-14 A).

Apariția în flacără a unui compus organic mărește intensitatea curentului (datorită ionizării acestuia) care poate să ajungă până la 10-5 – 10-8A. în funcție de natura și concentrația componentului respectiv. Acest curent va fi amplicat și înregistrat.

Sensibilitatea detectorului se definește ca fiind cantitatea de sarcină electronică, produsă de un gram de component prin ionizare în detectorul cu flacără. Sensibilitatea detectorului pe mol de substanță este proporțională cu numărul atomilor de carbon din moleculă legați numai de hidrogen sau alți atomi de carbon din moleculă plus contribuția atomilor de carbon legați de halogeni, amine sau grupe hidroxil. Atomii de carbon oxidați complet din moleculă (din grupa carboxil sau carbonil) nu au nici o contribuție la valoare sensibilității.

Detectorul de ionizare în flacără de hidrogen nu poate detecta gazele permanente (N2, H2, He, Xe), oxizii de azot, compușii, care conțin un atom de carbon singur legat de oxigen sau sulf (CO2, Cs2, COS) gaze anorganice (NH3, SO2), apă și acid formic. Limita de detecție constituie 10-13 g.

Determinări calitative

Aprecierea calitativă a unei gaz-cromatograme care prezintă un număr de picuri se face în mod obișnuit prin:

examinare vizuală, în comparație cu gaz-cromatograma unei probe etalon;

compararea timpului (tR) sau a volumului de reținere (VR) a probei de determinat cu a etalonului-pur, cromatografiat în condiții identice, sau cu datele menționate în literatură pentru compusul respectiv;

compararea cromatogramei amestecului de determinat cu cromatograma aceluiași amestec, la care s-a adăugat substanța etalon care se bănuiește a fi prezentă în probă. Dacă picul unui component apare mărit pe a doua cromatogramă, acesta este un indiciu al prezenței, în amestec, a substanței adăugate probei; în caz contrar, substanța adăugată dă un pic nou pe cromatograma a doua;

identificarea componentelor se mai poate realiza cu ajutorul detectorilor specifici; DCE se utilizează pentru identificarea compușilor cu afinități diferite pentru electroni (alcooli, eteri, esteri, derivați carbonici, derivați halogenați). Spectrometrul de masă înregistrează spectrul de masă (SM) al componentelor prezente în fracțiunea de eluant introdusă în sursa de ioni a spectrometrului, cu înregistrarea concomitentă a cromatogramelor obținute prin trecerea celeilalte fracțiuni printr-un detector universal (CT);

identificarea prin sorbție sau reacție selectivă se realizează prin intercalarea între injector și coloana de separare a GC a unei coloane umplute cu adsorbant, sau absorbant specific unei anumite clase de substanțe, sau a unui microreactor în care are loc transformarea sau reținerea prin reacție chimică a unui component.

Timpul de retenție (reținere) brut (tR), exprimat în secunde sau minute, este timpul care se scurge între momentul introducerii probei în injector și timpul când picul atinge maximul.

Timpul relativ (tR) este timpul de retenție al unui component (i) în raport cu al unui component etalon (e) : tRi / tRe.

Timpul de retenție corectat este dat de diferența dintre timpul de retenție brut (tR) și timpul la care se separă eluantul sau un component nereținut pe coloană (ideal) și al componentului respectiv: Rx= tR /tRx. Factorul de retenție are valori cuprinse între 0,01-0,9, în cazul unei separări optime, când valoarea se apropie de 1, înseamnă că acel component X, părăsește coloana odată cu eluantul.

De aici se definește și factorul de separare, pentru doi componenți A și B:

tR(A)

(AB) = ––– , care trebuie să aibă valori ≠ 1 (11)

tR(B)

Eficacitatea coloanei

O importanță deosebită în prezentarea teoretică a procesului cromatografic de separare o au două teorii. Teoria „Talerului teoretic” și teoria cinetică.

Teoria „talerului teoretic” a fost propusă de Martin și Synge. Conform acestei teorii coloana cromatografică se împarte imaginar într-un șir de segmente elementare – talere – și se presupune, că pe fiecare taler se realizează un act elimentar de echilibru la distribuția substanței în faza staționară și faza mobilă. Fiecare porție nouă de fază mobilă purtătoare (gaz sau lichid) provoacă o deplasare a acestui echilibru, în urma căruia o parte de substanță se deplasează pe următorul taler, pe care la rândul său, se stabilește un nou echilibru distributiv și are loc trecerea substanței pe următorul taler. În urma acestor procese substanța supusă cromatografiei se distribuie pe câteva talere. Concentrația substanței pe talere din mijloc este maximă în comparație cu talerele invecitate.

Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din coloana cromatografică în care se realizează un echilibru elementar complet de distribuție a componentului dintre cele două faze nemiscibile, care vin în contact în procesul separării cromatografice.

Talerul teoretic din coloana cromatografică este analogic talerului teoretic dintr-o coloană pentru distilare fracționată. Deosebirea constă în aceea, că componența amestecului, care ese de pe coloana cromatografică încontinuu se schimbă dar în procesul de extracție ori distilare se poate de obținut pe parcursul întregului proces una și aceeași substanță.

Numărul talerelor teoretice pentru componentul dat și pentru lungimea coloanei date diferă de numărul talerelor teoretice pentru alți componenți în aceleași condiții. Numărul talerelor teoretice este direct proporțional cu lungimea și diametrul coloanei.

Numărul de talere N este un număr adimensional și se numește eficiența coloanei cromatografice, H și n – parametrii teoretici, care caracterizează eficacitatea de separare a coloanei cromatografice și determină dispersia zonelor de component.

Cu cât coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de lungime și cu cât înălțimea echivalentă unui taler teoretic va fi mai mică, cu atât mai efectivă va fi coloana pentru separare în condițiile date. Așa dar, condițiile eficacității de separare pe coloana cromatografică sunt :

H să obțină valori cât mai mici și N – cât mai mari.

Dacă vom raporta lungimea stratului de fază staționară (L) în care s-a produs separarea amestecului de substanțe la înălțimea talerului teoretic, vom obține numărul de talere teoretice (N) necesare pentru separarea amestecului dat de coloana dată (formula 12).

L

N=

H

Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului cromatografic în trepte, dar în realitate procesul decurge incontinuu. Această teorie ne permite să se calculeze parametrului cantitativi importanți pentru caracterizarea procesului cromatografic de separare. Acești parametri își mențin importanța și în teoria cinetică a cromatografiei, care ține cont de viteza de migrare a substanței, difuzie și alți factori cinetici, care caracterizează cantitatea procesului.

Teoria cinetică a cromatografiei acordă o atenție fundamentală cineticii procesului, asociind înălțimea echivalentă talerului teoretic (H) cu procesele difuziei, stabilirea lentă a procesului.

Parametrul experimental care determină din punct de vedere dinamic eficacitatea separării unei coloane cromatografice este lățimea picului cromatografic, numită în literatură și lărgirea zonei. Zona îngustă și compactă a componentului de la începutul coloanei (la introducerea probei) se va lărgi, astfel încât concentrația pe unitate de volum de coloană se va micșora. (fig.2).

Lărgirea zonei acționează în sensul micșorării separării, ducând la o reamestecare a componenților, respectiv la o suprapunere a picurilor cromatografice. Pentru practica cromatografică este necesară cunoașterea tuturor factorilor, care influențează dispersia zonei în vederea acționării asupra lor în sensul obținerii unor picuri cât mai înguste.

Giddings a elaborat teoria privind lărgirea zonei (), moleculelor în coloană e considerată ca un proces haotic incontinuu. Principalii factori, care duc la lărgirea zonei unui component ce parcurge coloana sunt:

difuzia moleculară longitudinală;

cinetica sorbție-desorbție;

transferul de masă în faza mobilă (format din difuzia transversală și structurală sau turbulentă.

Prin însumarea acestor contribuții se obține înălțimea echivalentă talerului teoretic. În funcție de viteza fazei mobile, care într-o formă simplificată e cunoscută sub denumirea de ecuația lui Van Deemeter:

B

H = A + + C V (13)

V

unde: ABC – constante: V – viteza fazei mobile.

Această ecuație se aplică în cazul cromatografiei cu gaze. Contribuția fiecărui termen al ecuației (13) asupra înălțimii echivalente talerului teoretice (H) în funcție de viteza fazei mobile (V) e ilustrată în fig.12.

Fig.12. Reprezentarea grafică a ecuației Van Deemter

Constanta A e în legătură cu acțiunea difuziei de vârtej, care depinde de mărimea particulelor și de densitatea fazei staționare în coloana dată. Mărimea B e legată cu coeficientul de difuzie a moleculelor în fază mobilă și ia considerație acțiunea difuziei longitudinale. Mărimea C caracterizează cinetica procesului de sorbție-desorbție, transferul de masă și alte efecte. Primul termen difuzează un aport constant în H. Efectul celui de-al doilea termen e esențial pentru o viteză mică a fluxului. Cu mărirea vitezei fazei mobile crește influența celui de-al treilea termen, iar a celui de-al doilea se micșorează.

Curba rezultantă H = f(v) se caracterizează printr-o valoare minimă a înălțimii echivalente talerului teoretic (H min), care corespunde unei viteze optime a gazului purtător (v opt).

Pentru a determina acest punct, diferențiem ecuația (13) și egalăm cu derivata ei cu zero:

dH B

= – + C = 0 (14)

dV V2

obținem V opt = B/C. Înlocuind acestă mărime în ecuația (13) determinăm înălțimea echivalentă a talerului teoretic minimă (Hmin) la care separarea cromatografică va fi cel mai efectivă:

Hmin = A + 2 BC (15)

Astfel teoria cinetică oferă bază pentru optimizarea procesului cromatografic.

Factorii, care influențează eficacitatea de separare:

Viteza fazei mobile. Influența este redată prin ecuația lui Van Deemter.

Mărimea și suprafața specifică a particulelor fazei staționare.

Numărul de talere crește odată cu micșorarea dimensiunii particulelor suprafeței specifice. Dimensiunile particulelor nu pot fi prea mici, deoarece crește brusc rezistența opusă de coloană la trecerea fazei mobile.

În literatura de specialitate există tabele în care se specifică relațiile optime dintre diametrul coloanei și mărimra particulelor fazei staționare.

Natura fazelor. Alegerea fazelor în dependență de natura probei ce urmează a fi analizată. Cantitatea de fază staționară, luată pentru separare trebuie optimizată. În cazul cromatografiei gaz-lichid de exemplu, o cantitate prea mare de fază staționară lichidă face ca particulele de umplutută să devină lipicioase și să se aglomereze, afectând astfel, eficacitatea de separare a coloanei și condiționează apariția unor picuri cu cozi. Micșorarea cantității de fază staționară lichidă mărește eficacitatea coloanei dar o cantitate prea mică va spori interacțiunea fazei purtătoare cu particulele suportului.

Parametrii geometrici a coloanei (lungimea, diametrul, forma). Din acest punct de vedere coloanele capilare sunt cele mai eficiente. Creșterea lungimii și micșorarea diametrului coloanei conduce la creșterea numărului de talere. Dar totuș există o lungime și un diametru optim limitat de fenomenele de curgere, care provoacă dispepsia zonelor (tendința de reamestecare).

Temperatura. În cazul cromatografiei de repartiție (gaz-lichidă, mărirea temperaturii mărește separarea, dar în cromatografia de adsorbție mărirea temperaturii influențează negativ separarea.

Eficacitatea coloanei se măsoară cu numărul talerelor teoretice. Pentru compararea eficacității coloanelor trebuie de identificat faza staționară, substanța de analizat, temperatura, viteza gazului vector și mărimea probei.

Numărul talelor teoretice (N) se determină după formua:.

X 2

N = 16

y

în care:

X – este distanța din momentul introducerii probei până la maximul picului substanței de analizat, mm

y – Distanța formată de linia de bază a picului cu tangentele duse în punctele de inflexiune ale picului cu baza, mm.

2. Înălțimea echivalentă unui taler teoretic (H):

L

H =

N

unde:

L – lungimea coloanei cromatografice în cm;

N – numărul de talere teoretice.

3.De trasat curba dependenței H (pe ordonată) de viteza gazului purtător (pe abcisă).

De determinat condițiile optime.

De completat tabelul:

Calcularea reproductibilității experimentului prin metoda gaz-cromatografică.

Fiecare student primește 3 cromatograme a unei substanțe, descrie condițiile experimentului, măsoară înălțimea picurilor în mm.

Eroarea unei determinări:

hmediu – h1 = a1

hmediu – h2 = a2

hmediu – h3 = a3

Eroarea medie: a1 + a2 + a3

= b

3

Eroarea medie relativă : b

˙ 100

hmediu

Eroarea relativă medie: b / hmediu∙ 100. Eroarea relativă medie nu trebuie să fie mai mare de 3-4 %.

Derivatizarea sau transformarea prealabilă a componentelor polare (greu volatile sau care se descompun la temperatura lor de fierbere) în derivați mai puțin polari a permis separarea și identificarea omologilor aceleiași clase, a izomerilor etc. Astfel, substanțele cu grupe polare (OH, COOH, NH2) se pot transforma în compuși cu grupe mai puțin polare (OCOR și NHCOR).

Analiza cantitativă în cromatografie se bazează pe stabilirea unei relației dintre mărimea semnalului dat de detector și cantitatea de compus prezent în probă. Semnalul detectorului este măsurat prin înălțimea sau aria picului. Aria picurilor poate fi calculată conform relațiilor).

s = ½ h0 s = ½ h0

s = ½ h0,5 s = 2,507 h

Aria picului poate fi măsurată cu ajutorul planimetrului, poate fi apreciată după greutatea fâșiilor de hârtie tăiate după conturul picurilor. În prezent în acest scop se folosesc integratoare electronice și microcomputere, care înregistrează foarte rapid și exact orice mărime de pe cromatogramă.

Metodele principale în analiza cromatografică cantitativă sunt:

a) metoda standardului intern, În probă cu o compoziție cantitațivă necunoscută se introduce preventiv o cantitate exactă de substanță cunoscută, care nu se conține în amestecul dat, nu interacționează chimic cu componentele amestecului și este stabilă la temperatura la care se efectuează analiza. Proprietățile fizico-chimice ale substanței adăugate (standardului intern) trebuie să fie asemănătoare proprietăților componentelor amestecului cercetat. Partea de masă (XI) a fiecărui component (în %) se determină din relația:

Si r

Xi = 100

Sst

unde Si și Sst sunt ariile picurilor componentului analizat și standardului, corespunzător; r – raportul masei standardului intern către masa probei:

masa standardului

r =

masa amestecului de analizat fără standard

b) metoda normării ariilor. Această metodă presupune, că suma tuturor ariilor picurilor corespunzătoare componentelor amestecului cercetat constituie 100 %. Partea de masă (Xi) a componentului i (in %) se determină din următoarea relație:

Si

Xi = n=i 100 % (41)

Si

c) metoda etalonării absolute. Se prepară și se cercetează o serie de soluții standard. Se determină experimental dependența înălțimii sau suprafeței picului de concentrația substanței și se trasează curba de etalonare. Apoi se determină aceeași parametri ai picurilor ai amestecului de analizat și din curba de etalonare se determină concentrația substanței analizate. Această metodă simplă și exactă este principală metodă de determinare a microimpurităților. Metoda nu necesită o separare a tuturor componenților amestecului, dar se limitează la analiza componentului studiat în amestecul concret.

. La baza determinărilor cantitative stă relația de proporționalitate între aria de sub picul cromatografic și cantitatea componentului eluat. Cheia acestor metode constă în măsurarea ariei și stabilirea acestei proporționalități.

Măsurarea ariei se poate face pe mai multe căi:

Măsurarea ariilor este înlocuită uneori cu măsurarea integrală a înălțimii picului (h), sau a jumătății ei (h/2) (figf. 7).

În cazul picurilor simetrice aria se măsoară prin metoda produsului dintre lățimea picului (determinată la ˝ înălțimii picului) și înălțimea lui (perpendiculară coborâtă din vârf pe linia de bază) (fig.7) sau din aria triunghiului format de linia de bază cu tangentele duse în punctele de inflexiune ale picului:

h ∙ y

A = –––

2

Aria este proporțională cu masa picului decupat și cântărit, cu condiția ca grosimea hârtiei să fie uniformă.

Ariile se mai pot determina automat, utilizând în acest scop un integrator mecanic sau un computer.

Corelarea datelor obținute cu compoziția cantitativă a probei. Dintre metodele care stabilesc relațiile pentru transformarea și corelarea corectă a ariilor cu concentrația componentelor, amintim:

Metoda standardului extern: se realizează într-un mod asemănător curbei de etalonare din spectroscopie. Cantități cunoscute de probă-etalon se cromatografiază; se măsoară ariile corespunzătoare picurilor și se întocmește curba de etalonare, care are înregistrată în ordonată valoarea ariilor (mm2) și în abscisă concentrația.(g).

Metoda standardului intern constă în introducerea unui standard, (substanță de referință) în cantitate cunoscută, în proba de analizat. Drept standard intern se poate utiliza o substanță pură, care să se elueze cu o rezoluție bună, cu un timp de reținere apropiat de al componentelor de determinat și care să nu interacționeze cu acestea. Cunoscând concentrația standardului intern în probă (Cs) și măsurând ariile picurilor corespunzătoare componentei de determinat (Ax) și ale standardului (As) se poate calcula concentrația necunoscută (Cx). În acest scop se întocmește o curbă de etalonare sau se calculează factorul de corecție al ariilor pentru compusul de determinat (fx).

Curba de etalonare se realizează prin cromatografierea a trei soluții de concentrații exacte din componenta de determinat (C1, C2, C3), prin dizolvarea ei în soluția standardului intern (Cs). Se determină, în fiecare caz în parte, raportul ariilor: A1/As; A2/As; A3/As. Se înscriu aceste valori în ordonata și concentrațiile C1, C2, C3 în abscisa unui sistem de coordonate și se trasează curba de etalonare.

Factorul de corecție al ariilor (fx) se poate calcula astfel:

Se face media aritmetică (Vx) a valorilor rapoartelor obținute mai sus:

V1 + V2 + V3

A1/As = V1; A2/As = V2; A3/As = V3; –––––- = Vx

3

Pentru fiecare concentrație (C1, C2, C3) se calculează raportul: C1/Vx; C2/Vx; C3/Vx; Media aritmetică a valorilor obținute pentru aceste trei concentrații, reprezintă factorul de corecție mediu, fx, care intervine în formula de calcul.

Cx (mg/ml) = fx • Vx

c) Metoda normării ariilor. Această metodă se bazează pe faptul că raportul existent între aria corespunzătoare picului unui anumit component SA și suma ariilor tuturor componentelor prezente (∑ S) este egală cu procentul de component prezent în amestec. SA

A % = ––––––– ∙ 100.

SA + SB + SC + …

Relația de mai sus este valabilă numai în cazul în care sensibilitatea detectorului este aceeași pentru toate componentele probei, în caz contrar se recomandă ca etalonarea să se facă în prealabil cu ajutorul unor factori de corecție.

Concentrația se calculă după curba de etalonare ori după formula:

Setilnitrit

C = –––– ∙ F ∙ R ∙ 100,

Spropilnitrit

în care:

C – concentrația

S – ariile corespunzătoare a picurilor

F – factorul de corecție a ariilor ori a înălțimii picurilor, ce se determină în raport cu standardul în condițiile experimentului (faza staționară, to injectorului, to termostatului, detectorului; viteza gazului vector)

F – (factorul) se calculă după formula:

Sst

F = –– ∙ C %; 'în care:

Sx

Sst – aria picului standardului

Sx – aria picului substanței de analizat

ori hst

F = –– ∙ C %; în care

hx

Sst – înălțimea picului standardului

Sx – înălțimea picului substanței de analizat.

C % – concentrația substanței de analizat.

Se calculă F pentru câteva concentrații și apoi se i-a media:

masa standardului

R = ––––––––––––––––––

masa amestecului de analizat fără standard.

Identificarea alcoolului etilic prin metoda gaz-cromatografică

În băuturile alcoolice și soluții alcoolice. Metoda constă în aceea, că alcoolii sunt transformați în alchilnitriți, care se separă în coloana cromatografică.

Pentru aceasta într-un flacon de sub penicilină se introduce 0,5 ml soluție de acid tricloracetic 50% și 0,5 ml soluție de alcool etilic cu concentrație exactă în limitele 3-4% (soluție standard). Flaconul se închide cu dopul de gumă, care este fixat de un dispozitiv cu un orificiu în dop. Cu ajutorul seringii în flacon prin dop se introduce 0,25 ml soluție de nitrit de sodiu 30%. Conținutul flaconului timp de un minut se agită. Cu altă seringă uscată se i-a 3 ml din faza gazoasă ce conține etilnitrit și se injectează în cromatograf. După obținerea cromatogramei soluției standard se determină timpul de retenție corectat.

Apoi tot așa se cromatografiază soluția de analizat și se compară timpul de retenție brut, corectat cu a soluției standard. Coinciderea confirmă identitatea lor.

În sânge și urină e asemănător cu identificarea etanolului în băuturi alcoolice și soluții alcoolice. Mai întâi se cromatografiază și se determină timpul de retenție a soluției etanolice (standard). Apoi se determină etanolul în sânge și urină. În flacon de sub penicilină se introduce 0,5 ml sânge ori urină și 0,5 ml soluție 50% de acid tricloracetic, se închide cu dop și se fixează cu fixatorul.

Apoi se introduce prin dop 0,25 ml soluție de nitrit de sodiu 30%. Conținutul flaconului bine se agită timp de un minut. Apoi din flacon cu o seringă curată se i-a 3 ml fază gazoasă, se introduce în cromatograf și se cormatografiază. Dacă coincide timpul de retenție a soluției standard și a substanței ce se conține în sânge ori urină, atunci se confirmă identitatea lor.

Lucrarea N 1

Tema: Introducere în cromatografia gaz-lichidă a toxicilor volatili. Cercetarea substanțelor toxice care se izolează din materialul biologic prin metoda antrenării cu vapori de apă.

Scopul lucrării: Studierea metodelor de identificare a toxicilor volatili aplicând metoda cromatografiei gaz- lichide.

Planul

Controlul cunoștințelor practice.

Lucrul de sinestătător asupra identificării toxicilor volatili prin metoda CGL.

Concluziile lucrării și controlul deprinderilor practice.

Oformarea proceselor verbale.

Subiectele ce stau la baza pregătirii teoretice

Însușirea tehnicii de lucru cu cromatograful: a regula parametrii de bază – temperatura, viteza gazului vector, a controla lucrul principiilor de dozare.

Însușirea tehnicii de analiză a probelor lichide și gazoase cu conținut de substanțe toxice.

Prelucrarea cromatogramelor, calculând timpul de retenție corectat și relativ.

Identificarea toxicilor volatili prin metoda cromatografiei gaz-lichide.

Principiile de bază ale CGL.

Schema cromatografului gaz-lichid.

Camera de evaporare și funcțiile ei.

Coloanele cromatogafice și rolul lor în separarea substanțelor. Faza staționară și cerințele față de ea.

Tipurile de detectori și sensibilitatea lor.

Noțiune de cromatogramă și pic cromatografic.

Timpul de retenție în coloană.

Metodele de determinare calitativă în analiza cromatografiei gaz-lichide.

Factorii care acționează asupra separării substanțelor în coloana cromatografică eficacitatea coloanei, selectivitatea fazei staționare.

Etapele de bază în identificarea toxicilor volatili izolați din materialul biologic prin metoda CGL.

Ce factori acționează la separarea componentelor în coloana CGL?

Explicați noțiunea de eficacitate a coloanei cromatografice.

Care sunt parametrii ce caracterizează înălțimea echivalentă talerelor teoretice?

Cerințele, care se atribuie către fază lichidă stațională.

Definiția coeficientului de repartiție componentelor în cercetare prin metoda CGL.

Natura formelor de interacțiune între substanțele de cercetare și faza staționară.

Reciprocitatea dintre coeficientul de repartiție și forțele de interacțiune a componentului cu faza staționară lichidă.

Care sunt parametrii de care depinde timpul de reținere și corectat în coloana cromatografului?

Principiile de bază pentru identificarea toxicilor volatili în lichidul biologic prin metoda CGL.

.

Răspundeți argumentat la următoarele întrebări

În ce compartiment al cromatografului se efectuează separarea substanțelor.

Care este prioritatea metodei CGL față de metodele chimice pentru analiza toxicilor “volatili”.

Cum înțelegeți definiția “înălțime”, “talere teoretice echivalente”.

Ce dozatore se folosesc pentru transmiterea probelor gazoase și lichide în coloana cromatografului?

Cum se schimbă mărirea tipului de retenție a substanțelor în coloană în timpul analizei calitative?

De la momentul introducerii probei.

De la maximum picului de aer.

De la maximum picului vecin?

Ce este timpul de retenție corectat și timpul de retenție relativ și de ce parametrii ai cromatografului depind ei?

Cum se va petrece repartiția pe coloana cromatografică, care conține 20 % glicerină a următorilor amestecuri?

Metanol, etanol, propanol, butanol

Propanol, benzen

Octan, benzen

Argumentați răspunsurile la aceleași întrebări dacă în calitate de sorbent ar fi 20 % ulei de vaselină.

Dați explicație expresiilor:

timpul reținerii

distanța de reținere

volumul de reținere

Prin ce se determină selectarea fazei staționare lichide?

Cu ajutorul cărei faze staționare lichide ПЕG-1500 ori Triton X-100 este mai eficientă rfepartiția amestecurilor eterilor metilici ai acizilor grași? Argumentați răspunsul.

Ce proprietate a substanțelor de cercetat determină cantitatea necesară a bazei lichide staționare în coloana cromatografică? Arătați aproximativ cantitatea fazei lichide staționare pentru repartiția amestecurilor hidrocarburilor aromatice, alcoolilor alifatici, substanțe medicamentoase

Răspundeți în scris la următoarele întrebări

Problema 1. Pentru separarea substanțelor folosirea ca detector în caterometru se folosesc diferite gaze-vectori- azot, heliu, hidrogen, argon. Ce gaz-vector asigură o sensibilitate mai mare a catarometrului. Argumentați răspunsul alcătuind următoarea tabelă.

Problema 2. În secția chimico-judiciară e necesar de determinat cantitatea metanolului în urină prin metoda cromatografiei gaz-lichide. Ce detector trebuie să folosim, ca la determinarea metanolului să nu împiedice apa?

Problema 3. În secția chimico-judiciară trebuie de efectuat analiza-express a materialului biologic asupra microcantităților de cloroform în sânge. Ce tip de detector trebuie să folosim pentru soluționarea acestei probleme?

Problema 4. Cetățeanul A fost internat în centrul pentru tratarea intoxicațiilor acute cu presupunere de intoxicare cu fenol. A fost efectuată analiza gaz-cromatografică a urinei acidulate a pacientului. Pe coloana polară timpul relativ de reținere corespundea etilenglicolului și fenolului, iar pe cea nepolară fenolului și toluolului. Ce concluzii a făcut chimistul-expert?

Problema 5. Pentru identificarea picului cromatografic se folosesc următoarele caracteristici:

Punctul inițial al picului

Maximul picului

Lățimea picului

Înălțimea picului.

Suprafața picului.

Lucrul practic al studenților în cadrul lucrării de laborator

Studenții fac cunoștință cu tehnica de securitate.

Lucrul practic constă din 2 etape:

Determinarea timpului de reținere relativ a substanțelor pure pe coloane de polaritate diferită și completarea tabelei generale.

Identificarea toxicilor “volatili” în amestecul-model.

Fiecare student primește 1 substanță o cromatografiază pe coloane cu polaritate diferită. Se prelucrează cromatogramele obținute.

Fiecare student primește amestecul model, conținând 2 substanțe necunoscute și le cromatografiază pe ambele coloane cu polaritate diferită în aceleași condiții.Cromatogramele se prelucrează, calculând timpul de reținere corectat și relativ. Apoi identificarea se efectuază după schema aplicată în cercetarea cromatogramelor model.

.3 Determinarea timpului de retenție relativ a componentelor pure pe coloana cu fază staționară lichidă de polaritate diferită și alcătuirea tabelei generale. (Lucrarea I).

4. Identificarea toxicilor volatili în amestecul model (Lucrarea II).

Aparatura și detaliile aucziliare

Cromatograful gaz-lichid cu detector și termostat la t 100 și m.m.

Microsering pentru 1mcl și 10mcl.

Flaconul cu lichide pentru spălarea microseringelor: cu alcool, cu eter.

Linia de măsurare, triunghi, lupa.

Colba cu apă de săpun și periuța

Regulile pentru studenți la folosirea microseringilor

La sfârșitul lucrului seringa se spală cu alcool, eter, luând fiecare solvent în seringă de 2-3 ori și eliberând pe hârtie de filtru.

Seringa se aranjază în penal.

Se interzice de a injecta în coloană acul până a fi colectată proba.

Nu se admite colectarea rapidă a probei.

Pregătirea către analiza cromatografică

Înainte de a începe lucrul verificăm ermeticitatea camerei de evaporare. Pentru aceasta cu ajutorul periei și soluției de săpun se unge deschizătura evaporatorului, unde ar trebui să troducem acul siringei. Ermeticitatea se constată prin lipsa vaporilor de gaz în această regiune.

Controlul ermeticității se efectuază și în timpul lucrării.

Controlul eficacității siringii de 1 l se face prin colectarea 0,5 l acetonă și dozarea lui pe hârtia de filtru. În timpul dozării apare o micropicătură pe vârful acului, iar la atingerea ei pe hârtie de filtru – apare un spot umed. Dacă picătura lipsește atunci se întărește acul de siringă.

În procesul lucrului ermeticitatea microseringii se controlează de fiecare dată după 7-10 probe.

Îndeplinirea analizei cromatografice

Analiza gaz-cromatografică începe cu aranjarea bandei de autoânscriere. Apoi în microseringă se colectează 0,5l solvent organic și se introduce în camera de evaporare a cromatografului. se înseamnă cu creionul momentul introducerii probei. După aceasta se înregistrează picul aerului, care se înseamnă prin “Aer”, după care urmează să fie picul probei de analizat compusului standard ori amestecul standard propus de profesor. Analiza aerului și la toate celelalte probe se interpretează consecutiv nu mai puțin de 2 ori pe aceeași coloană. Astfel se controlează suprapunerea cromatogramelor paralele după timpul de reținere, adică după distanța de la momentul introducerii până la apariția maximului și după mărimea înălțimii lui. Dacă rezultatele obținute de pe ambele cromatograme nu se suprapun se repetă experiența până la suprapunerea rezultatelor. În cazuri contrare calitatea cromatogramelor paralele se analizează cu profesorul.

Analiza substanțelor lichide se îndeplinește cu ajutorul microseringei de 1l ori 10 l .Mărimea probei 1-0,5 l. Sensibilitatea pentru fiecare substanță se alege individual. După îndeplinirea analizelor paralele seringa se spală de câteva ori cu soluția de analizat și numai atunci este gata de colectat proba pentru îndeplinirea experienței următoare pentru aceeaș probă.

Analiza cromatogramelor

Inițial se măsoară cu ajutorul riglei distanța (mm) de la momentul introducerii probei până la maximul picului de aer (fig.1). Această distanță corespunde timpului de găsire a componentului în interiorul cromatografului în stare mobilă.

Mărimea T este distanța de reținere a gazului neabsorbit. Se măsoară ea cu ajutorul riglei în mm. Distanța obținută în mm raportată la viteza mișcării corespunde timpului de reținere a gazului neabsorbit în sec ori min.

Distanța de la maximul picului aerului până la maximul picului compușilor de analizat, raportat la viteza lentei corespunde timpului de retenție corectatat al amestecului de analizat (T). Dacă nu se menționează “ștrih” atunci este timpul de reținere a gazului neabsorbit, care nu e adecvat pentru calcule. Pentru calculele de identificare se folosește numai timpul corectat (T), așa cum numai el determină timpul, în care moleculele substanței de analizat a “toxicului volatil” se găsesc în stare de absorbție (dizolvare) în fază staționară.

Numai timpul staționării este diferit pentru fiecare toxic “volatil”, după cum numai el caracterizează solubilitatea diferită a toxicilor în una și aceeași fază staționară, ori absorbția diferită in unul și același absorbent.

Datele valorilor L și T a fiecărui component se înscriu în tabelă

Tabelul 1

Lx

TR = –––––––-

C (viteza lentei)

Valoarea Trel se calculează cu exactitate până la 0,01. După efectuarea calculelor și îndeplinirea tabelului în procesul verbal studentul înscrie o tabelă o singură pagină, care conține date despre condițiile cromatografice a tuturor substanțelor cercetate.

Fig.1. Determinarea distanței de reținere pe cromatogramă

a – momentul introducerii probei;

b – maximum picului de aer;

c – maximum picului substanței de cercetat;

Lx – distanța de reținere totală

Lx – distanța cercetată de reținere

L – distanța de reținere a gazului neabsorbit

Obiectele de cercetare

– amestec model din 2 toxici volatili din următoarele componente: cloroform, alcool – metilic, etilic, butilic, izobutilic, aceton, etilacetat, toluen, dioxan, benzen, tetraclorură de carbon, dicloretan, hexan.

Etapele de lucru:

I. Determinarea timpului de retenție relativ a componentelor pure pe coloana cu fază staționară lichidă de polaritate diferită și alcătuirea tabelei generale. (Lucrarea I).

II. Identificarea toxicilor volatili în amestecul model (Lucrarea II).

Fiecare student primește amestecul model conținând 2 substanțe necunoscute și efectuează cromatografierea pe două coloane de polaritate diferită în aceleași condiții ce se referă la substanțele pure. (Lucrarea I).

Cromatogramele se prelucrează, calculând timpul de retenție corectat și relativ. Apoi identificarea se efectuează după schema dată. Pe cromatogramă se arată parametrii, care se folosesc pentru identificare.

Indicații pentru efectuarea identității toxicelor “volatili”

Identificarea toxicilor “volatili” prin metoda cromatografiei gaz lichide se reduce la Trel pe 2 coloane cu polaritate diferită. Dacă componentul nu se separă pe o coloană sub formă de pic, numaidecât separarea are loc pe a II coloană. Deaceea analiza amestecurilor se efectuează pe două coloane cu sorbent de polaritate diferită. Pe cromatogramele obținute se calculează timpul de retenție relativ pentru fiecare pic cromatografic. Parametrii obținuți se aranjază în două tabele. În prima tabelă se includ parametrii de reținere pe coloana cu sorbentul polar, a doua – pe coloana cu sorbent nepolar. Aici se finisează I etapă de lucru.

În etapa II se folosesc datele individuale din tabelă obținute pentru toxicii “volatili” În tabelul 2 includ parametrii de reținere și denumirile corespunzătoare, la care timpul de retenție relativ nu se deosebește decât cu 0,05, determinat experimental prin analiza amestecurilor de toxici neconoscuți.

Exemplu de tabelă. Datele experimentale și tabelare despre parametrii de reținere a toxicilor “volatili” necunoscuți pe coloana cu sorbent polar. Calculele timpului relativ de reținere este îndeplinit în raport cu benzenul (ori alt solvent).

Tabelul 2

Datele despre parametrii de reținere a toxicilor “volatili” necunoscuți pe coloana cu sorbentul polar

Datele din tabele despre parametrii de reținere și determinarea toxicilor “volatili”, care pot asista în problema de control e necesar să se continuă în tabela completată după rezultatele determinării timpului de reținere relativ a toxicilor pure – substanțe de comparare – pe două coloane cu polaritate diferită. Aceste tabele sunt rezultatele lucrului practic a lucrării precedente.

Pentru etapa următoare lucrul constă în compararea tabelelor completate pentru coloanele cu diferită polaritate conținând date concrete timpul de reținere a toxicilor “volatili” necunoscuți din problema de control și denumirile propuse. De aici rezultată, că componentele care au pic comun pe o coloană să fie în aceeași măsură orientate și pe altă coloană.

Aceste condiții se respectă.

Dar cu toate acestea sunt abateri, când necătînd la polaritatea diferită, ambele coloane nu sunt selective pentru perechea dată de substanțe. În acest caz aceste substanțe urmează să fie excluse din ambele tabele și necesitatea identificării lor se rezolvă separat după cum în amestecul de analizat ar putea să existe în mod separat ori împreună. În rezultat ambele componente se înscriu în răspunsul problemei “convențional identificate”.

După excludere se funcționează compararea tabelelor. Aceste denumiri corespund toxicilor, care persistă în obiectul de cercetare. Pentru finalizarea acestei etape de lucru urmează să completăm tabela finală, forma căreia este dată mai jos.

Tabelul 3

Prima rubrică a tabelei se completează cu toate denumirile, găsite pe coloana polară, a II cu denumirile de pe coloana nepolară. Denumirile subliniate se înscriu în rubrica II. Acestea vor fi la rândul lor denumirea toxicilor cercetați.

Așa dar, în procesul identificării, efectuat pe coloane paralele, denumirea toxicului, care se conține în probă e necesar, ca să fie determinat după totalitatea parametrilor de repartiție obținuți pe fiecare coloană folosită. Dacă denumirea toxicului e găsită numai după datele unei coloane, acest toxic în probă de cercetat nu se conține. Unii și aceeași toxici pe diferite coloane pot fi repartizați în ordine diferită.

Dacă pe cromatograme se înregistrează numai un pic și nu este exclusă prezența lui în probă în calitate de toxic “volatil” apare necesitatea de a schimba benzenul cu un alt solvent de exemplu: butilacetat, alcool propilic.

Controlul total

Aprecierea rezultatelor obținute în urma efectuării lucrului practic.

Semnarea proceselor verbale.

Bibliografie

Materialul prelegerilor

Бабилев Ф.В., Тряпицына Т.П. Газожидкостная хроматография в фармацевтическом анализе. Кишинев, “Штиинца”, 1978, р. 4-10, 15-19. 20-25. 30-53.

В.Ф. Крамаренко « Токсикологическая химия», Киев, Выща школа, 1989

Г.Мак. Нейр, Э.Бопелли. Введение в газожидкостную хроматографию. М., Мир, 1970. Р. 29-39.

Вигдергаиз М.С. Качественный газохроматографический анализ, гл. 3, М., “Химия”, 1979, р. 356.

Н.Перцев. Н. Корцев. Справочник по газовой хроматографии. Москва, “Мир”, 1987, р.246.

Lucrarea N2

Tema: metoda cromatografiei gaz-lichide în analiza chimico-toxicologică. Determinarea cantitativă.

Scopul lucrării: A însuși metodele de determinare cantitativă a toxicilor “volatili” prin metoda CGL. A studia teoretic și a asimila practic metodica de analiză a CGL asupra alcoolul etilic în sânge și urină aplicată în laboratoarele Centrului de medicină legală, și laboratoarele chimice.

Planul

Controlul cunoștințelor teoretice.

Lucrul de sinestătător asupra metodei de determinare calitativă și cantitativă a alcoolului etilic în lichidele biologice.

Concluziile lucrării și controlul deprinderilor practice.

Oformarea proceselor verbale.

Subiectele ce stau la baza studierei temei:

Bazele teoretice ale CGL.

eficacitatea coloanei cromatografice și fazei staționare lichide

selectivitate fazei staționare

detectorii cromatografului

Determinarea cantitativă prin metoda cromatografiei gaz-lichide.

Metodele de calculare a suprafeței picurilor:

normării a ariilor

standardului intern

calibrării absolute

Ce reacție stă la bază identificării și dozării alcoolului etilic în lichidele biologice prin metoda CGL.

Condițiile de identificare a alcoolului în lichidele biologice prin CGL.

Obiectele de cercetare asupra alcoolului etilic în analizele chimico-juridiciare și chimice.

Cum se măsoară valoarea “timpului de reținere” pe cromatogramă – de la momentul introducerii probei, de la maximul picului de aer?

Ce numim timp de reținere corectat și relativ?

Ce detector se folosește la determinarea alcoolului etilic în sânge și urină prin metoda CGL?

Împiedică oare determinării alcoolului etilic în lichidele biologice prin metoda CGL alte componente “volatile”?

Explicați construirea curbei de calibrare pentru determinarea etanolului în sânge și urină.

Ce luăm în calitate de standard intern la determinarea alcoolului etilic?

De ce se calculează coeficienții de calibrare la determinarea etanolului în sânge și urină?

Răspundeți argumentat la următoarele întrebări:

Ce proprietăți ale componentelor separate acționează la timpul de reținere în baza staționară.

Explicați de ce compușii organici nesaturați posedă un timp de reținere mai mare în faza staționară polară decât în cea nepolară?

Cum are loc cromatografierea în faza staționară lichidă benzenul și fenolul? (TR)?

Explicați prioritatea metodei CGL față de celelalte metode.

De ce depinde eficacitatea repartiției componentelor în coloană?

Ce parametrii ai picului se folosesc în determinarea cantitativă?

Ce se soluționează efectuând analiza cantitativă prin metoda cromatografiei gaz-lichide.

Cum se construiește graficul de calibrare prin metoda standardului intern, calibrării absolute?

De ce prin aplicarea metodei de dozare a standardului intern se întroduce în cromatograf diferite volume de probă?

Cum determinați conținutul etanolului în urină, dacă după analiza cromatogramei înălțimea picului de etilnitrat hx=10 mm, înălțimea picului de propilnitrat 15 mm, R=1, Ku=1,03.

Determinați conținutul etanolului în sânge, dacă înălțimea picului etilnitrat 25 mm, propilnitrat 17 mm, R=1, Ks=1,90.

Determinați Cu=Cs (după problema 1,2) și trageți concluzie de gradul de alcoolizare.

Lucrul practic al studenților la lucrarea de laborator

Studenții primesc cromatograme pentru rezolvarea 4 situații. Cromatogramele se înscriu în caiete. Pe una din ele se demonstrează ce parametri pe cromatograme se determină.

Studentul e dator să cunoască diferite moduri de calcul a suprafeței picurilor:

B unde h – înălțimea picului

S = h ––– B – baza triunghiului sub pic.

2

S = h unde h – înălțimea picului

– lățimea picului la jumătatea înălțimii

Studenții îndeplinesc 4 însărcinări după cromatogramele expuse.

Metoda normării ariilor

Fiecare student determină componența procentuală a amestecului (o cromatogramă) prin metoda normării ariilor de dozare a cromatogramelor. Pentru acesta se calculează suprafețele tuturor picurilor.

Formula de calcul:

SA

A = –––– 100

S

Metoda standardului intern

Calculați conținutul în % a unui component din amestecul medicamentos prin metoda standardului intern (calculele se efectuează conform formulei):

Sx Kx

A% = –––– R 100

Sst Kst

În cazul dat Sst și Kst = 1, iar

m standardului

R = ––––––––––––––––-

m amestecului de analizat (fără standard)

Fiecare student calculează independent, reieșind din datele cromatogramei, formula având următorul aspect:

Sx

A% = –- R 100

Sst

Cromatograma se prelucrează calculativ. Toate datele se includ în tabelă.

Calcularea vitezei optime a gazului vector pentru repartiția componențelor.

Fiecare student primește cromatograme a substanței de analizat la diferite viteze a gazului vector-heliu.

pentru fiecare cromatogramă calculați numărul talerelor teoretice după ecuația:

x

N = 16 (–-)2

Y

Calculați ÎETT după formula următoare :

L cm

ÎETT= –––

N

unde ÎETT- înălțimea eficacității talerelor teoretice;

L – lungimea coloanei cromatografice (arătată pe cromatogramă);

N – numărul talerelor teoretice.

Construiți graficul dependenței ÎETT (axei ordinatelor) în raport cu viteza gazului vector (axei absciselor). Determinați viteza maximă a heliului după grafic, corespunzător ÎETT minime pe grafic.

Alcătuiți tabela.

Calcularea reproductibilității metodei CGL.

Fiecare student primește 3 cromatograme a unii component, scrie condițiile experimentului și măsoară înălțimea picului în mm, calculează înălțimea medie, greșala determinării separate, abaterea relativă medie.

Abaterea determinării separate:

hmed – h1 = a1

hmed – h2 = a2

hmed – h3 = a3

Abaterea medie

a1 + a2 + a3

––––––– = B

3

Abaterea relativă medie

B

–––– 100

hmed

Abaterea medie relativă nu trebuia să depășască 3-4 %.

Tema: Determinarea alcoolului etilic în sânge și urină prin metoda CGL Prelucrarea metodică

Lucrul practic al studenților în laborator

Condițiile de lucru: Aparat – Crom-4: coloană de oțel (sticlă) 2 m, faza staționară – PEG-1500, umplutura – cromaton cu argint N-AW-DMAS, T0coloanei – 680, T0 termostatului – 700, T catarometrului – 1000, intensitatea curentului în detector – 100 am, gazul vector – heliu 2,4 l/oră, sensibilitatea înscrierii 2, mărimea probei 2 ml. Cloralhidratul, formaldehida, acidul acetic, fenolul, dioxanul, acidul cianhidric, metilsalicilatul, metilmercaptofos, tiofos picuri nu formează.

Picurile metilnitrilului, hexanului, pentanului se înregistrează înaintea etilnitrilului, cloroformul, tetraclorura de carbon, dicloretanul, acetona, eterul, benzenul, toluenul, xilolul, octanul, propil-, izopropil-, butil-, izobutil, amil-, izoamilnitriții se înregistrează după etilnitrit și nu împedică identificării. Pentru a dovedi prezența alcoolului etilic ne folosim atît de timpul de reținere corectat cît și de timp de reținere relativ.

Identificarea alcoolului etilic în amestecul model (scrieți chimismul reacțiilor)

În flacon de penicilină se introduc 0,5 ml sol acid tricloracetic 50%, 5 ml sol n-alcoolpropilic (4 %) și 0,5 ml sânge ori urină (ori C2H5OH), flaconul se închide cu un dop de cauciuc și se fixează în cilindru metalic. Capacul cilindrului se închide în așa mod ca dopul de cauciuc să închidă ermetic flaconul. Conținutul flaconului se agită cu precauție.

Un flacon se întroduce cu seringa de 1 ml, 0,25 ml soluție nitrit de sodiu 30 %. Flaconul se agită și peste 1 minută cu o altă seringă se colectează 2 ml probă gazoasă și se introduce în injectorul cromatografului. Pe cromatograma înregistrată se determină timpul de reținere corectat și relativ. Timpul de reținere relativ se determină după n-alcool propilic.

Determinarea cantitativă prin metoda standardului intern. Metoda grafică. Construirea curbei de calibrare a soluției standard de alcool etilic în lichidele biologice ori soluție apoasă de etanol.

Fiecare student primește 4 cromatograme ale etilnitritului, corespunzător conținutului de etanol în lichidele biologice (sânge ori urină). Fiecare cromatogramă se prelucrează după calculele de determinare calitativă și cantitativă a alcoolului etilic în lichidele biologice. Pentru aceasta se calculează timpul de retenție relativ a etilnitrilului. Pentru determinarea cantitativă se determină înălțimea picurilor de etilnitrit (hx) și standard – n-propilnitrit (hst) și se calculează raportul hx / hst 100. Se construiește graficul – pe axa ordinatelor se înscrie raportul hx / hst 100, pe axa absciselor – concentrația etanolului în lichidele biologice în promile (o/oo).

Soluțiile standarde ale etanolului în sânge și urină nu sunt stabile și pe ele în practica de lucru e nevoie să le renovăm. Mai corect ar fi să folosim soluțiile standarde apoase ale alcoolului etilic pentru construirea curbei de calibrare. Prin folosirea datelor acestui grafic se folosesc numaidecât coeficienții de calibrare, care pentru determinarea etanolului în sânge este egal 0,95, în urină – 1,05.

Cs = C(H2O ) 0,95, Cur = C(H2O) 1,05 (CH2O – valoarea concentrației etanolului găsită după curba de calibrare a soluției apoase de etanol).

Metoda de calcul pentru determinarea cantitativă a etanolului în cazul aplicării standardului intern

Analiza cantitativă a etanolului după metoda standardului intern se efectuează și prin metoda de calcul fără a construi graficul de calibrare, conform următoarei formule:

Sx

С‰ = ––- K R ; R = 1

Sst

K – coeficientul de corecție relativ a suprafețelor picurilor (Sx, Sst), determinat pentru fiecare component în raport cu standardul în condițiile date. (FLS, temperatura de evaporare. Temperatura de termostatare, detectorul, viteza gazului, vector). De aici reiese calculul coeficientului de corecție care se exprimă după formula:

Sst

K = ––- С‰, ori suprafața lui se înlocuește cu înalțimea picului.

Sx

hst (înălțimea picului propilnitrit)

K = –––––––––––––– СC2H5OH

hx (înălțimea picului etilnitrit)

Pentru calcularea K folosim soluțiile apoase de etanol (1‰, 2‰, 3‰, 4‰) cu standardul intern – alcoolul propilic. Soluțiile apoase a etanolului se prelucrează după metodică pentru dozare și se cromatografiază. Pe cromatogramă se măsoară înălțimea picului etilnitrit și propilnitrit (în soluție apoasă de etanol) și se calculează K, apoi se înmulțește la 0,95 ori 1,05. În rezultat coeficientul final, care va fi folosit în formula de calcul pentru sânge Ks = Kmed 0,95, pentru urină Kur = Kmed 1,05.

Exemplu de prelucrare a rezultatelor obținute:

Exemplu de calcul:

Problema 1 – Calculați cantitatea de etanol în sânge, dacă:

hС2H5ONO = 60 mm

hC3H7ONO = 130 mm

60

С‰ С2H5OH = –– 2,11 = 0,97 %

130

Problema 2 – Calculați conținutul etanolului în urină, dacă :

hС2H5ONO = 175 mm

hC3H7ONO = 80 mm

175

С‰ С2H5OH = –– 2,41 = 5,27 %

80

K – coeficientul de corecție pentru fiecare concentrație

K- coeficientul mediu pentru determinarea conținutului alcoolului etilic în sânge și urină

Controlul total

Aprecierea rezultatelor obținute în urma efectuării lucrului practic.

Semnarea proceselor verbale.

Bibliografie

Materialul prelegerilor

Бабилев Ф.В., Тряпицына Т.П. Газожидкостная хроматография в фармацевтическом анализе. Кишинев, “Штиинца”, 1978, р. 4-10, 15-19. 20-25. 30-53.

В.Ф. Крамаренко « Токсикологическая химия», Киев, Выща школа, 1989

Г.Мак. Нейр, Э.Бопелли. Введение в газожидкостную хроматографию. М., Мир, 1970. Р. 29-39.

Вигдергаиз М.С. Качественный газохроматографический анализ, гл. 3, М., “Химия”, 1979, р. 356.

Н.Перцев. Н. Корцев. Справочник по газовой хроматографии. Москва, “Мир”, 1987, р.246.

Lucrarea N 3

Tema: Expertiza chimico- toxicologica a toxicilor volatili din materialul biologic. Determinarea alcoolului etilic în lichidele biologice prin metoda cromatografiei gaz-lichide. “Metoda cromatografiei gaz-lichide în identificarea și dozarea toxicilor “volatili”. Îndeplinirea buletinului de expertiză.

Scopul temei: Întărirea cunoștințelor teoretice și practice asupr analizei chimico- toxicologice a toxicilor volatili din materialul biologic. A studia metodica de dozare a etanolului în sânge și urină prin aplicare metodei cromatografiei de gaze.

Determinarea gradului de alcoolizare în organism.

Scopuri practice:

A deprinde efectuarea izolării toxicilor volatili din materialul biologic, aplicînd metoda antrenării cu vapori de apă.

A studia metodele de identificare a toxicilor volatili din distilatul obținut.

Determinarea cantitativă a toxicilor volatili.

A studia biotransformarea toxicilor volatili.

A studia metodica de dozare a etanolului în sânge și urină prin aplicare metodei cromatografiei de gaze.

Determinarea gradului de alcoolizare în organism.

Întrebările teoretice:

Care este principiul metodei de izolare a toxicilor volatili?

Explicați prepararea probelor preliminare în analiza chimico- toxicologica a toxicilor volatili.

Cum se izolează etilenglicolul și acidul acetic din materialul biologic?

Particularitățile izolării alcoolului izoamilic, etilic, metilic, fenolului, dicloretanului, aldehidei formice.

Analiza chimico- toxicologică a acidului cianhidric și a sărurilor lui în extrasele biologice.

Însemnătatea toxicologică, mecanismul acțiunii toxice și metabolismul acidului cianhidric și sărurilor lui.

Analiza chimico- toxicologică, identificarea și dozarea halogenderivaților(cloroform, dicloretan, cloralhidrat, tetraclorura de carbon) în materialul biologic.

Acțiunea toxicologică a derivaților halogenați ai hidrocarburilor.

Caracteristica alcoolului metilic, etilic, izoamilic și etilenglicolului. Particularitățile izolării, identificării și dozării alcoolilor în dependență de obiectul de cercetare.

Particularitățile acțiunii alcoolului etilic. Coma alcoolică.

Metodele chimice de confirmare a prezenței formaldehidei în organele cadaverice.

Acțiunea toxică și biotransformarea formaldehidei în organismul uman.

Acetona și acidul acetic. Toxicocinetica și toxicodinamica.

Analiza chimico- toxicologică a acidului acetic și acetonei.

Particularitățile cercetărilor chimico- toxicologice asupra fenolului și derivaților săi.

Biotransformarea fenolului și acțiunea toxică a lui.

Expertiza intoxicațiilor alcoolice în materialul cadaveric. Factorii ce influențează asupra determinării etanolului.

Tetraetilul de Pb și particularitățile cercetării produselor petroliere asupra acestui toxic. Mecanismul acțiunii toxice.

Analiza ch.- toxicologică a nitrobenzenului, anilinei.

Mecanismul acțiunii toxice a nitroderivaților.

Absorbția, repartiția și eliminarea cianurilor și acidului cianhidric, cloroformului, cloralhidratului, tetraclorurii de carbon, dicloretanului, formaldehidei, acetonei, ac. acetic, alcoolilor alifatici, etilenglicolului, fenolului, nitrobenzenului.

Biotransformarea ac. cianhidric, derivaților halogenați, ac. acetic, formaldehidei, etilenglicolului, hidrocarburilor saturate.

Absorbția, distribuția și eliminarea alcoolului etilic în organismul uman.

Biotransformarea alcoolului etilic.

Simptomatologia intoxicațiilor cu alcool etilic.

Expertiza intoxicațiilor cu alcool etilic.

Interpretarea rezultatelor expertizei în dependență de materialul biologic.

Intoxicațiile mixte de alcool etilic.

Caracteristica metodei gaz-cromatografice în vederea determinării toxicilor “volatili”. Părțile componente ale cromatografului.

Tipurile de detectori. Principii de lucru.

Explicați eficacitatea coloanei.

De ce depinde selectivitatea fazei staționare?

Dați definiția timpului corectat și timpului relativ în coloană.

Principiu de identificare a toxicilor volatili prin metoda cromatografiei de gaze.

Dozarea toxicilor volatili prin metoda cromatografiei de gaze. Principiu de lucru și metodele de calcul.

Dozarea etanolului în lichidele biologice – chimismul, metodica, calculele.

Îndeplinirea scopului practic

Condițiile experimentului: aparatul “Crom-4”, coloana de sticlă – 2 m, faza staționară PEG-1500 10 %, T0 colanei – 600C, T0 camerei de evaporare 700 C, T0 catarometrului – 1000C, intensitatea curentului – 100 am., gazul purtător – Heliu, viteza 2,4 l/oră, mărimea probei – 2 ml.

Problema 1

Determinarea coeficientului de corecție pentru analiza cromatografică a lichidelor biologice la prezența alcoolului etilic prin metoda de calcul.

Fiecare student primește soluție în apă (cu conc. 1-5 ‰) și prelucrează soluția după metodica [3], după aceea cromatografiază amestecul de gaze în aparatul “Crom-4”. Pe cromatograma obținută se măsoară înălțimea picului etilnitrit și propilnitrit. După datele obținute se efectuează calculele coeficientului de corecție relativ după formula:

hst (înălțimea picului propilnitrit)

1) K = –––––––––––––– СC2H5OH ‰

hx (înălțimea picului etilnitrit)

2) Se calculează Kmed

3) Se calculează coeficientul de corecție pentru determinarea etanolului în sânge în condițiile cromatografice date luând în vedere coeficientul de calibrare.

K sânge = Kmed · 0,95

4) Se calculează coeficientul de corecție pentru determinarea etanolului în urină în condițiile experimentului, luând în vedere coeficientul de calibrare.

K ur = Kmed · 1,05

Problema 2

Dozarea alcoolului etilic în sânge și urină prin metoda de calcul

Fiecare 2 studenți primesc problemă – două flacoane cu lichid biologic – urină și sânge cu conținut de alcool etilic.

Probele se prelucrează pentru dozarea alcoolului etilic (Problema 1) și se cromatografiază produsele gazoase ale reacției în aparatul “Crom-4”. Cromatograma obținută se prelucrează calitativ (distanța de reținere L); TR – corectat, Trel – timpul relativ. Se efectuează dozarea alcoolului etilic prin metoda de calcul, pentru care se măsoară înălțimea etilnitritului și propilnitritului și se efectuează calculele.

Înălțimea picului propilnitrit

С etanolului(sînge) ‰= ––––––––––––– Ksânge

Înălțimea picului etilnitrit

Înălțimea picului propilnitrit

С etanolului(urină) ‰= ––––––––––––– Kurină

Înălțimea picului etilnitrit

Problema 3

Determinarea etanolului prin metoda standardului intern după graficul de calibrare.

a) Pentru îndeplinirea acestei probleme studenții folosesc datele din I problemă, îndeplinesc tabela, după datele obținute construiesc graficul de calibrare.

b) Determinarea etanolului în lichidele biologice după graficul de calibrare. Se prelucrează sângele și urina după metodica soluției apoase de etanol. Se măsoară pe cromatogramă

h -C2H5ONO și h –C3H7ONO și se găsește pe grafic concentrația corespunzătoare a etanolului (CH2O). Deoarece graficul de calibrare e cunoscut după soluția apoasă de etanol, concentrația adevărată a etanolului în sânge Csânge = CH2O 0,95

în urină Curina = CH2O 1,05

În sfârșit se compară datele obținute după graficul de calibrare și metoda de calcul.

Se fac concluzii despre conținutul etanolului în sânge și urină și gradul de alcoolizare.

Bibliografie

Conspectul lecțiilor

T.Brodicico, V.Valica “Curs de Chimie toxicologică”, Chișinău, 2003

Крамаренко В.Г. Токсикологическая химия. – Киев: Выща школа, 1989, с.135-143.

Лужников Е.А. Клиническая токсикология. М. «Медицина», 1994, с. 552

Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. Москва: «медицина», 1976, с. 37-44.

Preparate și reactive necesare pentru identificarea alcoolului etilic ăn materialul biologic

Modele de solvenți și amestecuri de solvenți organici:

Alcool etilic

Alcool metilic

Alcool butilic

Alcool izobutilic

Alcool izoamilic

Cloroform

Tetraclorură de carbon

Etilacetat

Аcetonă

Dioxan

Soluție standard intern de alcool propilic

Preparate și reactive necesare pentru determinarea cantitativă a alcoolului etilic în materialul biologic

soluții etanol 1 %о, 2 %о, 3 %о, 4 %о, 5 %о.

soluție propanol 4 %о.

soluție acid tricloracetic 50 %

soluție de nitrit de sodiu30 %

Probe de sînge și urină cu conținut de alcool etilic1 %о, 2 %о, 3 %о, 4 %о, 5 %о.

Aparate și veselă chimică pentru determinarea cantitativă a alcoolului etilic în materialul biologic

Cromatograf, două coloane umplute cu fazelichide mobile de diferite polarități, siringi pentru introducerea probelor în coloană cu volumul de 1mkl și 10 mkl, flacoane de penicilină cu dopuri de cauciuc, cilindre de metal cu dop rodat pentru ficsarea flacoanelor cu conținut de probă, pipete chimice cu volumul 1, 2, 5 ml.

Buletin de expertiză

Actul analizei chimico- toxicologice a corpurilor delicte, conform dosarului cetățeanului X, transmise anchetatorului__________

Analiza se efectuează în laboratorul toxicologic al Universității de Stat de Medicină și Farmacie ”Nicolae Testemițanu” de chimistul- expert__________

Începutul___________ Sfîrșitul__________

Examenul exterior

Pentru cercetare se ia un borcan de sticlă albă, cu volumul de 500 ml, acoperit cu permanganat, cu inscripția „Borcanul Nr. 1- bucăți de ficat și rinichi”. Conținutul probei prezintă bucăți de organe indicate cu masa: ficat- 250 g, rinichi- 200 g. Reacția conținutului probei (turnesol- neutră). La miros- nimic deosebit.

Cercetatrea chimică

100 g material biologic din borcanul Nr. 1 se amestecă cu apă distilată pînă la o consistență densă, se acidulează cu acid oxalic pînă la pH slab acid (hîrtia indicator turnesol) și se supune antrenării cu vapori de apă: 1- a fracție a distilatului în volum de 3 ml s- a adunat într- un volum de 5 ml soluție NaOH1%. Fracția a 2- a (25 ml) și a 3- a (25 ml) se adună separat fără adaos de NaOH.

Cercetarea distilatului

La 1- a fracție de distilat se adaugă cîteva picături de sulfat de Fe și 1- 2 picături sol. clorură de Fe, apoi lichidul se acidulează cu HCl pînă la pH slab acid. Nici deodată, nici peste 48 ore precipitat albastru n- a apărut.

La a 2- a fracție se face proba cu sol. de rezorcină în NaOH, care se încălzește, dar nu se observă colorație.

La a 2- a fracție se efectuează proba cu sol. de Iod în NaOH. La încălzire pe baia de apă cade precipitat galben cu miros de cloroform.

La o parte din fracția a 2- a se adaugă volum egal de sol. ac. sulfuric 20% și cîteva cristale KMnO4. Peste un interval de timp se simte miros plăcut de fructe. Peste 20 min., lichidul se filtrează și cu filtratul incolor se efectuează reacțiile următoare:

a.la jumătate din filtrat se adaugă 1/5 volum ac. sulfuric conc., în care au fost solubilizate cîteva cristale de morfină. Culoare albastră- violetă nu s- a observat.

b.la a 2- a jumătate de volum a filtratului se adaugă același volum de ac. fuxin sulfuros și 1 ml ac. sulfuric conc.. Nu se observă nici o colorație.

5. Cîteva cristale de acetat de Na se dizolvă la 1 ml sol. din distilatul 2, care se amestecă cu un volum dublu de ac. sulfuric conc. La o ușoară încălzire se simte miros de etilacetat.

6. O parte din distilatul 2 se amestecă cu același volum sol. alcoolică 5% NaOH și se încălzește atent timp îndelungat, la răcire se adaugă ac. azotic și apoi se adaugă sol. nitrat de Ag 5%. Formarea opalescenței și precipitatului nu se observă. Reziduurile distilatului 2 se amestecă cu al 3- lea și se supun cercetărilor.

7. La o parte din distilat se adaugă cîteva picături apă de Br, unde imediat se formează opalescență gălbuie; o jumătate din distilat se supune deflegmației de 2 ori. După a 2- a deflegmație s- a colectat în 1- l distilat 5 ml lichid, în al 2- lea 10 ml lichid. Cu 1- l distilat s- au efectuat reacțiile descrise în p. 3, 4, 5 cu același rezultate, la efectuarea reacției descrise în p. 5 mirosul de etilacetat devine mai pronunțat. În urma reacției cu apa de Br, opalescența nu se observă.

8. A 2- a parte a mestecului distilat se unesc, se alcalinizează cu carbonat de Na și se repetă extracția cu eter. Extracțiile eterice se unesc, se filtrează, iar eterul se înlătură la temperatura camerei. Reziduul a fost neînsemnat. După solubilizarea lui în 2- 3 picături apă distilată se adaugă 2 picături clorură de Fe, proaspăt pregătită. Culoarea violetă nu se observă.

Concluzie

Din analiza efectuată și descrisă rezultă că în materialul biologic al cetățeanului X s- a identificat alcool etilic.

Nu s- au identificat: ac. cianhidric, alcoolul metilic, cloroformul, tetraclorura de carbon, cloralhidratul, formaldehida, fenolul, alcoolul izoamilic.

.