Masterul de Biologie Medicală [310371]

[anonimizat] a funcției de transport a albuminei serice datorată fenomenului de glicozilare neenzimatică prin analize electroforetice și spectrofotometrie la frecvențe înalte

București, 2016

Cuprins

I. Obiectivele Studiului

II. Introducere

Glicozilarea neenzimatică a proteinelor.

[anonimizat] (THz)

1.4.1. Noțiuni generale

1.4.2. Aplicații ale Spectroscopiei THz

Electroforeza

III. Materiale și metode

IV. Rezultatea și discuții

V. Concluzii

VI. Anexe

VII. Bibliografie

Obiectivele studiului

Nutritia si Diabetul………1-2 fraze

Diabetul este un grup de afecțiuni metabolice caracterizate prin valori ridicate ale glicemiei. Acestea sunt datorate secreției insuficiente de insulină, a unei rezistențe la insulină sau a ambelor. Hiperglicemia cronică întâlnită în diabet este o [anonimizat], nervi, inimiă și vase de sânge.

[anonimizat] (spectroscopie de THz) [anonimizat].

Aici scriem si după analiza rezultatelor.

In partea teoretica toate paragrafele trebuie sa se termine cu o trimitere bibliografică!

Ne trebuie să schematizezi conținutul cu puncte și linii!!! Lucrarea este o poveste…..

Cap. 1 ar trbuie sa fie despre nutritie și diabet.

Efectele conc crescute de zaharide se reflecta in glicozilare.

Legenda figurilor se pune sub aceasta iar a tabelelor, sus!

In text trebuie sa apara trimiterea la figură!

I. Introducere

1.1. Glicozilarea neenzimatică a proteinelor.

[anonimizat], [anonimizat]. Reacția a [anonimizat] 1911, care a observat îngălbenirea caracteristică a unei soluții de glicină (Gly) atunci când aceasta este incubată cu D-glucoză . Mai târziu s-a determinat, [anonimizat] a [anonimizat] ([anonimizat]) si melanoide ([anonimizat]-o etapă târzie a glicării). [anonimizat], a fost apoi organizată in etape diferite de John E. Hodge in 1953.

Zaharidele care prezintă proprietăți reducătoare (de ex: glucoza) au capacitatea de a reacționa neenzimatic cu grupările NH2 [anonimizat]. Acest proces este cunoscut sub denumirea de reacție Maillard [5,20].

Etapele procelui de glicare cuprind două faze: (figura 1).

Prima fază (reversibilă). [anonimizat] a produșilor Amadori (PA). Viteza cu care se desfășoară această fază este condiționată de (a) concentrația și structura glucidului; (b) [anonimizat]; (c) pH-ul mediului în care se desfășoară reacția.

Baza Schiff atinge concentrația de echilibru în câteva ore (în funcție de variațiile glicemice acute), iar produșii Amadori ating această conecntrație în zile până la săptămâni și de cele mai multe ori nu o [anonimizat]teinelor sau datorită degradării glucidului (în cazul în care acesta reacționează cu o proteină cu viață lungă).

Printre efectele formării produșilor Amadori se numără:

modificarea conformației, funcției și duratei de viață a proteinei;

transformarea proteinei în antigen.

2. Faza doi (ireversibilă). În această fază se formează produșii finali de glicozilare avansată (advanced glycation end products, AGEs) care se leagă ireversibil de proteină și se acumulează de-a lungul întregii perioade de viață a acesteia. Procesul de acumulare a AGEs la nivel intracelular (în special) dar și la nivel extracelular este cunoscut sub denumirea de stres carbonilic. Acumularea AGEs este mult mai rapidă în spațiul intracelular deoarece rata de glicozilare a zaharidelor intracelulare (fructoză, glucozo-6-fosfat sau gliceraldehid-3-fosfat) este mai mare decât a glucozei.

Figura 1: Etapele formarii AGEs (Barnaby, Cerny et al. 2011)

În general formarea AGEs este endogenă, dar poate proveni și din surse exogene (fumul de țigară sau din alimetele tratate termic). AGEs proveniți din fumul de țigară au fost identificați la nivelul cristalinului și peretelui coronarian iar până în prezent structura și rolul lor sunt insuficient cunoscute. AGEs proveniți din alimentele tratate termic se formează prin reacție Maillard. Acestea au structuri variabile, prezintă o absorbție intestinală scăzută și colorează alimentele. Acumularea acestora în urină determină fenomene de glucotoxicitate cum ar fi producția de citokine și leziuni glomerulare.

3 deoxiglucoza (3DG), metilglioxalul (MO) și glioxalul constiruie o grupă de produși intermediari reactivi de glicozilare denumiți α oxaldehide. Aceștia se formează din degradarea glucozei, a bazelor Schiff și produșilor Amadori.

Glioxalul se formează prin autooxidarea glucozei și a lipidelor/acizilor grași polinesaturați catalizată de metale.

Metilglioxalul provine din:

fragmentarea triozofosfaților căii glicolitice și căii poliol,

catabolismul corpilor cetonici sau al treoninei;

oxidarea acizilor grași polinesaturați.

Acesta este catabolizat de glioxlaza I în lactat.

3DG se formează din rearanjarea produșilor Amadori și din fructozo 3 fosfatul căii poliol. Acesta se degradează sub acțiunea 2 oxaldehid reductazei la 3 deoxi-fructoză. Din toti acești intermediari rezultă AGEs endogeni în prezența oxigenului (carboxilmetillizina, pentozidina) sau în absența oxigenului (piralina, methilglicoxalul, MOLD, DOLD).

AGEs produc efecte nocive prin trei mecanisme:

acumularea rapidă (predominant intracelulară), cu distrucție celulară progresivă;

alterarea funcțiilor proteinelor matriceale, în special ale colagenului și lamininei, fapt care determină nu numai dereglarea cooperării intramatriceale dar și a interacțiunii cu celulele vecine;

interacțiunea cu vecinii specifici.

Există două categorii de receptori AGEs:

receptori exprimați pe celule cu rol imunitar (limfocite T, monocite, macrofage). Stimularea acestora produce eliberare de interferon și citokine, precum și funcție fagocitară pentru macromoleculele circulante;

receptori exprimați pe un număr mare de celule, incluzând: endoteliul, celulele musculare netede,podocitele, fibroblaștii, celulele mezangiale, microgliile și astrocitul.

În tabelul de mai jos sunt redate implicațiile AGEs în complicațiile cronice diabetice:

Tabel 1. AGEs și complicații cronice diabetice (după [5] modificat)

Studierea AGEs este importantă datorită pierderii funcției proteice și deteriorarea tisulară, procese ce au loc in vivo, direct relaționate cu formarea AGEs. Formarea AGEs a fost studiată, de-a lungul timpului, pentru proteine precum colagenul sau hemoglobina. Cu toate acestea, informațiile privind proteina majoră de transport din serul uman, HSA, informațiile sunt limitate. (O.S.Barnaby, 2011).

1.2. Glicozilarea non-enzimatică în diabet:

Diabetul este o boală ce se caracterizează prin concentrații ridicate de glucide în sânge. La indivizii sănătoși concentrația de glucoză din sânge este reglată de insulină. După ce mâncarea este ingerată, glucoza este transportată la celulele β ale pancreasului, declanșând o cascadă de reacții ce determină secreția de insulină și eliberarea sa în sânge. Insulina este capabilă, ca ulterior secreției, să interacționeze cu lipidele, țesuturile musculare, ficatul pentru a facilita depozitarea glucozei în sânge, sub formă de glicogen și triacilgliceride, în vederea utilizării posterioare. Concentrația ridicată de zahăr din sânge, ce se întâlnește la diabetici este corelată, fie cu o producție insuficientă de insulină (diabetul de tip 1), fie de o rezistență la insulină (diabetul de tip 2).

Deficitul de insulină rezultă din secreția inadecvată de insulină sau din diminuarea răspunsului tisular la insulină. Acesta este factorul principal producător de hiperglicemie. Simptomele datorate hiperglicemiei includ poliurie, polidipsie, scăderea în greutate și în unele cazuri polifagie. Complicațiile pe termen lung ale diabetului includ: retinopatie (caracterizată prin pierderea acuității vizuale), nefropatie (care în final poate conduce la blocaj renal), neuropatie periferică (caracterizat prin picior diabetic, amputare, articulații Charcot), dereglări gastrointestinale, genitourinare și cardiovasculare.

Pacienții care suferă de diabet au o incidență crescută la afecțiuni cardiovasculare aterosclerotice, boli arteriale periferice și boli cerebrovasculare. La uni pacienții apare frecvent hipertensiune și dereglări ale metabolismului lipidic. La pacienții care prezintă riscul de a dezvolta un diabet de tip 1 pot fi identificate la nivelul pancreasului procese patologice autoimune, prin markeri genetici. În cazul diabetului de tip 2, gradul de hiperglicemie este suficient pentru a cauza schimbări funcționale și patologice la nivelul variatelor țesuturi țintă. Dar în absența unor simptome clinice poate să dureze până când diabetul este detectat.

În timpul perioadei asimptomatice este posibil de demonstrat dereglările metabolismului glucidic prin măsurarea glucozei din plasmă.

În tabelul 1. sunt prezentate caracteristicile celor două tipuri de diabet:

Tabelul 1. Prezentarea comparativă a caracteristicilor celor două tipuri de diabet

Concentrația elevată de glucoză din sânge are diverse efecte în corp, printre care enumerăm: risc crescut pentru boli ale inimii, infarct, disfuncții renale, pierderea vederii, sau amputări. Multe dintre aceste complicații sunt datorate glicării proteinelor și formării de AGEs. Complicațiile relaționate cu formarea AGEs pot fi împărțite în 2 categorii. În prima categorie, interacția AGEs cu RAGE este responsabilă pentru o gamă largă de răspunsuri inflamatorii, ce ulterior conduc la deteriorare tisulară. În a doua categorie, intră modificările directe ale proteinei, modificări induse de AGEs, ce conduc la pierderea funcției proteinei sau la deteriorarea țesutului, determinată de crosslink proteic.

Deși un nivel ridicat de glucoză se presupune a avea un rol important în reacțiile Maillard, din punct de vedere molecular, glucoza este una din cele mai puțin reactive glucide din sistemele biologice. (vezi Figura 1).

Formarea AGEs este direct relaționată cu acțiunea altor metaboliți, în afară de glucoză, ce sunt în principal localizați intracelular și ce participă în reacția de glicare cu o viteză mai ridicată.

Unul dintre acești metaboliți este fructoza. Cele două surse de fructoză sunt, pe de o parte o sursă exogenă din dietă, și o sursă endogenă, formarea din glucoză , prin intermediul căii poliol. Deoarece aportul alimentar de fructoză a crescut sistematic în ultimile două decenii, glicozilarea non-enzimatică cu fructoză a fost subiectul multor studii de specialitate. Un aport de fructoză ridicat conduce la modificări ale concentrației tisulare ale fructozei și ai metaboliților acesteia. În diferite organe, fructoza este formată din glucoză de calea poliol. Concentrația sa este ridicată în acele 14 țesuturi, la pacienții diabetici, în care calea poliol este activă, în special în rinichi și nervii periferici. (Barnaby, Wa et al. 2010)

Boli adiacente ale Diabetului

Nefropatia diabetică

Diabetul zaharat este cea mai frecventă cauză a blocajului renal în țările dezvoltate și în dezvoltare. Nefropatia diabetică, cunoscută și sub numele sindromului Kimmelstiel-Wilson sau glomeruloscleroză diabetică nodulară sau glomerulonefrită intercapilară, este un sindrom clinic caracterizat prin albuminurie (>300 mg/zi sau >200 mcg/min) confirmată la cel puțin 2 ocazii la distanță de 3-6 luni, descreșterea ireversibilă a ratei filtrării glomerulare (GFR) (Tabelul 1) și hipertensiune arterială. Sindromul a fost descris pentru prima oară de un fizician britanic, Clifford Wilson (1906-1997) și de fizicianul american Paul Kimmelstiel (1900-1970) în 1936.

Tabelul 1. Scăderea în rata filtrării glomerulare în diferite stadii are diabetului de tip 1 si 2 (http://emedicine.medscape.com/article/238946-overview).

Tabelul 1. Scăderea în rata filtrării glomerulare în diferite stadii are diabetului de tip 1 si 2 (disponibil pe http://emedicine.medscape.com/article/238946-overview accesat la 14 mai 2012).

Nefropatia diabetică este o complicație cronică a diabetului zaharat de tip 1 (distrugerea celulelor beta și lipsa totală a insulinei) și 2 (rezistență la insulină și/sau secreție scăzută a insulinei). Există cinci stadii de dezvoltare în nefropatia diabetică.

Stadiul I: Hiperfiltrarea hipertrofică.

În acest stadiu GFR este fie normal fie crescut. Stadiul I durează aproximativ cinci ani de la declanșarea bolii. Mărimea rinichilor este crescută cu aproximativ 20% și fluxul sangvin renal este crescut cu 10%-15%, în timp ce albuminuria și presiunea sangvină rămân în limite normale.

Stadiul II: Stadiul de stagnare începe cu aproximativ doi ani după declnașarea bolii și este caracterizat prin leziuni renale cu îngroșarea membranei bazale și proliferarea mezangială. Încă nu sunt semne clinice ale bolii. Nu există încă nici un semn clinic al bolii . GFR revine la valorile normale. Mulți pacienți rămân în acest stadiu până la sfârșitul vieții lor.

Stadiul III: Stadiul microalbuminuriei (albumina- 30-300 mg/dU) sau nefropatie inițială. Acesta este primul semn clinic detectabil al leziunii glomerulare. Apare de obicei de la cinci până la zece ani de la declanșarea bolii. Presiunea sângelui poate fi crescută sau normală. Aproximativ 40% din pacienți ajung la acest stadiu.

Stadiul IV: Insuficiență renală cronică (CKF) este un stadiu ireversibil. Se dezvoltă proteinuria (albumina este mai mare de 300 mg/dU), GFR scade sub 60 mL/min/1.73m2 iar presiunea crește peste valorile normale.

Stadiul V : insuficiență renală terminală (TKF ) (GFR < 15 ml / min / 1,73 m2 ) . Aproximativ 50 % din pacienții cu TKF necesită terapia de înlocuire de rinichi (dializă peritoneală, hemodializă , transplant de rinichi). În stadiile inițiale ale nefropatiei diabetice cei mai buni indicatori ai gradului de leziune sunt creșterea dimensiunilor rinichilor și Doppler schimbat.

2. Epidemiologia

Valoarea de prognostic a unei cantități mici de albumină în urină pentru dezvoltarea de leziuni renale la pacientii cu diabet zaharat de tip 1 sau 2 a fost confirmată la începutul anilor 1980 . Această etapă de leziuni renale a fost numită etapa microalbuminurie sau nefropatia inițială.

Aproximativ 20-30% din pacienți dezvoltă microalbuminuria după 15 ani de boală și mai puțin de jumătate dezvoltă nefropatie. EURODIAB (The European Diabetes Prospective Complications Study Group și un studiu danez de 18 ani au arătat că în general, apariția microalbuminuriei la pacienții cu diabet zaharat de tip 1 și 2 este de 12,6% (după 7,3 ani) și respectiv de 33%. În conformitate cu studiul britanic UKPDS (the United Kingdom Prospective Diabetes Study), incidența anuală a microalbuminuriei la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 în Marea Britanie este de 2% iar prevalența este de 25% la zece ani după diagnostic.

Proteinuria se dezvoltă la aproximativ 15-40% din pacienții cu diabet zaharat de tip 1, de obicei dupa 15-20 de ani de durată a bolii. La pacienții cu diabet zaharat de tip 2, prevalența variază în medie între 5% și 20%. Nefropatia diabetică este mai frecvenntă la afro-americani, asiatici, și americani nativi. La caucazieni, leziunea renală progresivă este mai frecventă la pacienții cu tip 1, deși prevalența generală la populația diabetică este mai mare la pacienții cu tip 2 deoarece acesta este mai prevalent. Apariția nefropatiei diabetice la indienii Pima cu diabet zaharat de tip 2 au dezvoltat nefropatie după doi ani de boală, iar 15% din ei erau deja în stadiul terminal cu insuficiență renală.

În SUA, apariția nefropatiei diabetice la pacienții care încep terapia de substituție renală s-a dublat în perioada 1991-2001. Din fericire, tendința a scăzut, cel mai probabil datorită unei mai bune preveniri și unui diagnostic și tratament prezumtiv al diabetului zaharat.

3. Patologia

Bariera de filtrare glomerulară funcționează ca o sită biologică complexă. Spre deosebire de alte capilare din corp, capilarele glomerulare au o permeabilitate ridicată la apă (conductivitate hidraulică) și sunt relativ impermeabile la moleculele mari. O astfel de permeabilitate este posibilă datorită structurii unice trilaminare a membranei de filtrare glomerulară care constă în glicocalix endotelial, membrană bazală glomerulară și podocite ( celule epiteliale viscerale glomerulare). Schimbările patologice se dezvoltă în glomerulii pacienților cu diabet zaharat de lungă durată înainte de apariția microalbuminuriei. Severitatea leziunii glomerulare este proporțională cu valoarea GFR, durata diabetului zaharat și reglarea glucidică. Principalele schimbări patohistologice în nefropatia diabetică includ îngroșarea membranei bazale glomerulare (GBM), expansiunea mezangială, scleroză nodulară- schimbare Kimmelstiel-Wilson, scleroză glomerulară difuză, fibroză interstițială tubulară, arteroscleroză și hialinoză a vaselor de sânge (figurile 1-3).

Figura 1. În firgură este prezentată structura unui glomerul normal. Colorație HE X 400.după cine??????

Figura 2. Clasa Iib, nefropatie diabetică. Expansiunea difuză a mezangiului (stea) și înroșarea difuză a membranei bazale glomerulare (săgeată). Pata PAS, X 400.

Figura 3. Nefropatie diabetică de clasă III. Nodul sclerotic (Kimmelstiel-Wilson) în nefropatie diabetică nodulară (săgeată). Hialinoza arteriolară aferentă și eferentă este caracteristică pentru nefropatia diabetică (stea). Săgeata din colțul de jos din partea dreaptă indică îngroșarea membranei bazale tubulare. Pata Mallory, X 100.

Printre alte leziuni patologice, ar trebui să menționăm hialinoza, așa numita capsulă de fibrină care constă în materialul hialin acumulat între celulele endoteliale și membrana bazală glomerulară (Fig 4). Capsula de fibrină este prezentă în aproximativ 60% din cazuri și se crede că este asociată cu ischemie cronică.

Figura 4. Capsula de fibrină (săgeată) este caracteristică pentru nefropatia diabetică. Este cauzată de însudarea și acumularea de proteine plasmatice glicozilate între endoteliul glomerular și membrana bazală glomerulară. Expansiunea difuză a mezangiului este proiectată prin steaua cu 4 puncte. Pata PAS, X 200.

Există o suprapunere semnificativă între schimbările descrise la pacienții în diferite stadii de albuminurie, indiferent de tipul de diabet zaharat. Toate modelele histologice au o semnificație prognostică identică (Figurile 5,6). Oricum, faptul că expansiunea mezangiului și scleroza glomerulară nu apar simultan indică diferite patogeneze la nefropatia diabetică. La microscopia optică reducerea numărului de podocite este ușor observată la pacienții cu diabet zaharat tip 1 și 2.

Având în vedere că schimbările din ambele tipuri de diabet se suprapun în mare măsură, Comitetul Științific al Societății de Anatomie Patologică a stabilit Clasificarea Patologică a Nefropatiei Diabetice, unde nefropatia diabetică este împărțită histologic în 4 stadii ale leziunii glomerulare (Tabelul 2).

Tabelul 2. Patru clase de leziuni glomerulare în nefropatia diabetică. Adaptat din [22]. LM, microscopie optică, GBM, membrană bazală glomerulară. Pe baza unei măsurători directe a lungimii GBM prin EM aceste valori extreme pot fi considerate indicative atunci când alte măsurători GBM sunt utilizate.

În plus față de nefropatie diabetica, scleroza glomerulară se poate dezvolta de asemenea, în alte condiții patologice la pacienții cu diabet zaharat. Acestea sunt:

a. disproteinemie (amiloidoza si a alte boli de depozit)

b. condiții cu ischemie cronică (boli cardiace congenitale cianotice)

c. glomerulonefrita cronică membranoproliferativă

d. Boli idiopatice, în cea mai mare parte asociate cu fumatul și creșterea tensiunii arteriale [23]. Aceasta înseamnă că descoperirile patologice în urina de pacienti cu diabet zaharat (proteinurie și eritociturie) nu sunt neapărat rezultatul nefropatiei diabetice și nu ar trebui să fie considerate ca atare. Această constatare este o provocare de diagnostic pentru un clinician, precum și pentru un patolog. Prin urmare, în cazul de hematurie, sindrom nefrotic mai sever, și / sau progrese rapide de deteriorare a funcției renale, fără diabet zaharat concomitent nefropatia la pacientii cu DZ, ar trebui să se ia în considerare un rinichi non-diabetic care stă la baza bolii. Biopsia rinichiului cu o analiză completă a probei (lumina, imunofluorescentă, și microscopie electronică) reprezintă standardul de aur în stabilirea diagnosticului la pacienții cu boală renală non-diabetică. Concluziile biopsiei și istoricul clinic trebuie să fie corelate întotdeauna. În cazul în care pacientul nu este diabetic, se ia în considerare diagnosticul de glomeruloscleroză nodulară idiopatică.

Reglarea glicemică

Nefropatia diabetică de multe ori se dezvoltă la pacienții care nu au realizat controlul glicemic. Gradul de control glicemic este un predictor important de insuficientă renală terminală. În studiul Krolewski et al. , prevalența de insuficiență renală terminală a fost de 36% la pacienții cu cel mai slab control glicemic , în comparație cu 9% în grupul glicemiei bine controlate . Este general acceptat faptul că gradul de control glicemic este un factor de risc foarte important pentru dezvoltarea nefropatiei diabetice.

Complicații oculare în patologia diabetică

Cataracta diabetică

Aceasta poate survenii la tineri și evoluează rapid către maturitate. Cataracta diabetică este bilaterală și se întâlnește la diabeticii cu toleranță foarte scăzută pentru glucoză. Debutul are loc în regiunea subcapsulară a cristalinului sub formă de opacifieri. Se înregistrează modificări în refracția cristalinului, cu tendințe la miopie și defecte de acomodare. Instituirea tratamentului în această fază duce la regresia opacifierii cristalinului.

Cataracta senilă. Nu există diferențe de frecvență și aspect clinic între aceasta și cea survenită la vârste înaintate la pacienții care nu suferă de diabet. Însă, evoluția spre maturare poate fi mai rapidă în diabetul decompensat.

Tulburări de refracție

Cea mai frecventă este miopia. Aceasta se întâlnește în caz de apariție acută sau rapidă a diabetului înainte ca pacientul să începă tratamentul. Dezvoltarea rapidă a diabetului, fără cauză locală, sugerează originea ei diabetică. În momentul instituirii tratamentului cu insulină, poate să apară o hipermetropie care să necesite întrebuințarea temporară a ochelarilor cu lentile convexe. Aceste tulburări sunt datorate schimbării indicelui de refracție a cristalinului apărute din cauza modificărilor de osmolaritate locală.

Anomalii pupilare

Apar rar la diabetici, ca o consecință a neuropatiei periferice autonome a fibrelor pupilare.

Lipemia retinalis

Apare uneori în acidoze grave. Se caracterizează prin aspectul lactescent al vaselor retiniene, în special la periferia fundului de ochi. Aceasta poate apărea pe fundul de ochi fără alte modificări. Acuitatea vizuală scade din cauza creșterii concentrației lipidelor în plasmă. Fracțiunile cele mai apte să modifice aspectul fundului de ochi sunt chilomicronii și unele lipoproteine. Ambele sunt foarte bogate în trigliceride și sunt deplasabile spre periferia vaselor retiniene, dându-le aspectul lactescent. Reechilibrarea diabetului reușește să corecteze aceste modificări.

Asociere între nefropatia diabetică și retinopatie

Pacienții cu DZ tip 1 și nefropatie au aproape întotdeauna alte complicații legate de boala de bază , cum ar fi retinopatia și neuropatia. Retinopatia are manifestări clinice ușor de recunoscut și precede întotdeauna semnele vădite clinic de nefropatie la același pacient.Viceversa nu este cazul . Un număr mic de pacienți cu retinopatie avansată are modificări histologice glomerulare si microalbuminuriei ,dar de cele mai multe ori, nu au nici o dovada de biopsie a bolii renale. Asocierea între nefropatia diabetică și retinopatie este mai slabă la pacienții cu DZ tip 2. Într-un studiu efectuat de Parving et al. pe 35 de pacienți cu DZ tip 3 și proteinurie (mai mare de 300 mg/zi), 27 din acești pacienți au avut o probă de biopsie care releva nefropatia. Retinopatia diabetică a fost prezentă la 15 dintre acești 27 de pacienți. Analiza ulterioară a arătat că aproximativ o treime dintre pacienții fără retinopatie nu aveau vreo probă de biopsie a nefropatiei diabetice.

Astfel, pacienții cu DZ tip 2 și proteinurie semnificativă și retinopatie au fost predispusți la dezvoltarea nefropatiei diabetice, întru-cât aceia cu proteinurie, dar fără retinopatie au avut o predispoziție mai mare la boli de rinichi care nu au diabet zaharat la bază. În studiul efectuat de Schwartz et al, biopsia a fost performată pe 36 de pacienți cu DZ de tip 2 și nefropatie. La 17 dintre ei, biopsia a arătat glomeruloscleroză cu noduli Kimmelstiel-Wilson, iar la ceilalți 15 pacienți biopsia a expus schimbări caracteristice ale nefropatiei diabetice (scleroză mezangială), dar fără prezența nodulilor. Nu era nici o diferență în durata bolii și reglarea glicemică între pacienții cu noduli și cei fără. O asociere strânsă a fost descoperită între retinopatia severă și prezența nodulilor Kimmelstiel-Wilson. Încă nu se cunoaște motivul.

Etilogia bolii renale la majoritatea pacienților cu DZ ar trebui atribuită diabetului zaharat dacă sunt prezente patologia proteinuriei și retinopatiei. În cazul în care retinopatia nu este prezentă, ar trebui investigate cauzele non-diabetice.

Albumina Serică Umană (Human Serum Albumin – HSA)

Albumina Serică Umană este cea mai abundentă proteina plasmatică, reprezentând 50-60% din proteinemia totală. Aproximativ aceeași cantitate întâlnită în plasmă, poate fi găsită și în spațiul extracelular. În sânge aceasta se găsește în concentrație de aproximativ 50g/L (Evans, 2002). HSA are o masă moleculară de 69 kDa și se prezintă sub forma unui lanț polipeptidic cu 585 de resturi de aminoacizi. La pH 7.4, albumina are pI de aproximativ 5, fapt care face ca pe suprafața sa să se gasească un număr mare de sarcini negative (Dinu, 1996, Figge, 1991, Mohora, 2006).

Datorită concentrației sale moleculare mari, albumina serică răspunde în proporție de 75-80% de presiunea osmotică a plasmei, având rolul de a menține apa în compartimentul intra vascular (Dinu . et al. 1996, Curry, 2009, Yang et al, 2014). Aceasta îndeplinește funcții importante în legarea și transportul diferiților componenți plasmatici. HSA leagă diferiți compuși ca bilirubina, acizii grași liberi, vitamine liposolubile. De asemenea tranportă hormoni, cationi (Ca2+, Cu2+) și multe medicamente (Yang, 2014, Peters, 1996, Yamasaki, 2013, Otagiri, 2005, Ascenzi, 2006 ).

Albumina Serică Umană este sintetizată de celulele parenchimului hepatic (la o rata de 12g/zi) și în plasmă, având un timp de înjumătățire de 15-19 zile (Dinu, 1996). HSA este o proteină sintetizată ca o formă precursoare de 609 aminoacizi, numită preproalbumina. Preproalbumina conține 24 de resturi aminoacidice adiționale la capătul N-terminal care formează peptida semnal.

HSA este alcătuită dintr-un singur lanț polipeptidic de 585 de aminoacizi, ce conține 17 perechi de punți disulfurice (Sugio, 1999). Aceasta este formată din trei domenii: domeniul I (reziduurile 1-195), domeniul II (196-383), și domeniul III (384-585). Fiecare domeniu este divizat în câte două subdomenii, A și B. Cele șase subdomenii se ansamblează pentru a forma o moleculă în forma de inimă (Figura 2) ( Sugio, 1999).

Figura 2. Structura 3D a HSA (cod PDB 1AO6 ). Subdomeniile sunt evidențiate prin diferite culori (IA – albastru închis; IIB – bleu; IIA – verde închis; IIB – verde deschis; IIIA – galben; IIIB – roșu). Superior se observă schematic secvența de aminoacizi corespunzători fiecărui domeniu (Sugio et al., 1999, Fanali G. et al., 2012).

Domeniul I este orientat aproape perpendicular pe domeniul II. Domeniul III, care are legătură doar cu subdomeniul IIB, pornește din acesta la un unghi de 45°, fapt care crează aspectul literei Y la nivelul domeniilor II și III (He X.M, 1992).

Deși domeniile au o structură asemănătoare, studiile au arătat că acestea au situri de legare specifice pentru diverși compuși. Două dintre cele mai importante situs-uri de legare sunt Sudlow I și II (figura 2) (Sudlow, 1975). Situs- ul Sudlow I este localizat la nivelul subdomeniului IIA, iar situs-ul Sudlow II este localizat în subdomeniul IIIA. Situs-ul Sudlow I are o afinitate de legare pentru compușii heterociclici, așa cum sunt azapropazona, fenilbutazona și warfarina, iar situs-ul Sudlow II prezintă afinitate pentru compușii aromatici, precum ibuprofenul (Lee, 2015, Vallner, 1977, Aime , 1996).

Situsul Sudlow I este mai larg, fapt care permite legarea liganzilor de dimensiuni mai mari, în timp ce situsul Sudlow II este mai îngust și mai rigid, favorizând astfel legarea liganzilor stereospecifici (Sudlow G, 1975).

Figura 3. Structura 3D a HSA (cod PDB 1H9Z și 1O9X) (Ascoli GA. et al., 2006, Shaklai N. et al., 1994). Cele șase subdomenii ale HSA apar colorate diferit. Gruparea Hem (colorat în roșu) se leagă la nivelul subdomeniului IB. Situs-ul Sudlow I ( subdomeniul IIA) este ocupat de warfarină (maro) iar situs-ul Sudlow II (subdomeniului IIIA) este ocupat de doi asizi grași (fat acids), FA4 și FA3. Sunt localizate și siturile de legare ale altor acizi grași (Fasano, 2005)

Funcția de transport a albuminei

HSA are o mare capăcitate de a lega o mare varietate de liganzi hidrofobi și joacă un rol cheie în transportul acizilor grași, aminoacizilor, metalelor ( Cu2+și Zn2+), al tiroxinei (hormon tiroidian), al metaboliților ( bilirubina), și compuși farmaceutici medicamentoși.

Liganzii naturali ai HSA sunt acizii grași neesterificati cu lanțuri lungi, substanțele nutritive și cele care contribuie la construcția lipidelor complexe. HSA este un receptor important pentru substanțele farmaceutice care au caracteristici fizico-chimice similare cu liganzii naturali ai acesteia. Prin legarea de HSA se facilitează astfel transportul medicamentelor deoarece aceasta ajută la solubilizarea lor și prin aceasta îmbunătățește capăcitatea de transport în sânge (Sugio , 1999).

A) Transportul acizilor grași. În figurile 2 și 3 se poate observa că fiecare moleculă HSA poate transporta până la șapte molecule de acizi grași (Fasano, 2005, Yang, 2014).

Figura 4. Structura 3D a HSA și localizarea situs-urilor de legare ale acizilor grași (fatty acids – FA). Moleculele acizilor grași sunt evidențiate prin galben. Subdomeniul IA este colorat în roșu, subdomeniul IB în verde, subdomeniul IIA în albastru, subdomeniul IIB în magenta, subdomeniul IIIA în azur, iar subdomeniul IIIB în gri (preluat din Yang F. et al., 2014).

În situsurile de legare FA 1-5, gruparea carboxilat a acizilor grași este legată prin interacții electrostatice sau polare. FA1 realizează o punte de sare cu Arginina din poziția 117 localizată în bucla IB-IIA. FA2 stabilește legături de hidrogen cu tirozina din poziția 150 localizat în subdomeniul IB și cu arginina din poziția 257 și serina din poziția 287 din subdomeniul IIA. Situsul FA2 este diferit de celelalte prin faptul că se localizează la interfața a trei subdomenii: IA, IB și IIA. FA3 și FA4 sunt localizate la nivelul subdomeniului IIIA într-o zonă care formează situsul Sudlow II (care este și situsul pentru ibuprofen). FA3 formează punți de sare cu arginina din poziția 348 și arginina din poziția 485 și o legătură de hidrogen cu serina din poziția 342. FA4 se leagă de arginina din poziția 410, formând o punte de sare și de tirozina din poziția 411 și serina din poziția 489 prin legături de hidrogen. FA5 este localizat la nivelul subdomeniului IIIB iar capul polar este orientat spre subdomeniu IIIA. În felul acesta, stabileste punți de sare și legături de hidrogen cu tirozina din poziția 401 și lizina din poziția 525.

Deoarece situs-urile FA6 și FA7 nu realizează niște interacții polare cu capul carboxilat al acizilor grași suficient de puternice încât să il imobilizeze, acestea sunt situsuri cu afinitate scazută. FA7 este localizat la nivelul situsului Sudlow I (care reprezintă și situsul principal de legare al warfarinei (Fasano, 2005).

B) Transportul ionilor metalici. Ionii precum Cu2+, Co2+ sau Ni2+ se leagă de căpătul N-terminal al HSA (Curry,2009). Legarea Cu2+ și a Ni2+ se realizează în forme care nu dau naștere la specii reactive. Acest mecanism de legare a fost demonstrat că are un efect protectiv împotriva oxidării LDL de către Cu2+ (Schnitzer, 1997). Mutații care apar la nivelul capătului N-terminal scad afinitatea pentru Cu2+ . Astfel de modele experimentale se folosesc pentru studiul efectului protectiv al HSA împotriva oxidării LDL de către Cu2+ în primele stadii ale dezvoltării unei plagi atherosclerotice (Fasano, 2005).

C) Transportul hormonilor. Hormonul tiroidian Tiroxina, se leagă (în absența acizilor grași) în primul rând de situsul Sudlow I. Apoi mai sunt trei situsuri la nivelul domeniului III, unul la nivelul situsului Sudlow II și două la nivelul FA5. În prezența acizilor grași Tiroxina se leagă în spațiul cuprins de domeniul I și III (Fasano, 2005).

D) Transportul medicamentelor. Datorită concentrației sale în sânge HSA prezintă un rol important în comportamentul farmacocinetic al multor compuși farmaceutici: reglează eficacitatea medicamentului, scade toxicitatea acestuia și înbunătățeste capacitatea acestuia de a acționa în locul specific (Sleep, 2013, Lee , 2015).În momentul de față se urmărește marirea capacității HSA de a interacționa cu cât mai mulți compuși farmaceutici cu scopul de a înbunătății modul de administrare al diferitelor medicamente (Lee et al., 2015).

De asemenea HSA protejează medicamentele împotriva oxidării și joacă un rol important în influențarea administrării medicamentului in vivo și totodată diminuează proprietățile farmacocinetice și farmacodinamice ale acestuia (Kawakami, et al., 2006, Sleep et al., 2013, Yang et al., 2014, Bertucci,et al., 2002, Colmenarejo, et al., 2003).

Warfarina, care este un anti-coagulant se leagă de situsul Sudlow I, iar ibuprofenul (agent anti-inflamator nesteroidian) se leagă de situsul Sudlow II (figura 2). În afară de aceste două situsuri principale, pentru warfarină și ibuprofen au mai fost identificate și altele la nivelul domeniilor II și I (Fasano et al., 2005).

Modificări induse de procesul de glicare

Chiar dacă albumina serică provine dintr-o familie de natură glicozilată, aceasta nu este o glicoproteină fiind una dintre puținele proteine plasmatice care nu conține grupuri de carbohidrați. HSA nu conține secvența Asn-X-Ser/Thr care este necesară pentru glicosilarea-N. În trei variante de HSA, mutația a creat situl Asn-X-Ser/Thr și varianta alele este glicosilată normal fără vreun efect asupra funcției sale (Nakajou et al, 2003).

HSA poate suferi în anumite condiții o glicare post-translațională. Prin glicare se înțelege interacțiunea dintre o proteină și o moleculă glucidică fără intervenția asistată a unei enzime (Spiro, 2002). Glicarea schimbă conformația HSA (Nakajou et al., 2003), afectând legarea anumitor medicamente, dar nu a tuturora. Situs-urile HSA afectate de glicare sunt argininele din pozițiiele 114, 218 și 428 precum și lizina din poziția 186 (Ahmed et al., 2005). Inițial unele studii susținut ideea potrivit căreia glicarea afectează capacitatea de legarea a anumitor substanțe farmaceutice, precum warfarina, însă în studiile ulterioare nu s-a identificat schimbări majore (Baraka-Vidot et al. 2012, Okabe et al., 1994, Jackson et al., 2013, Chiou et al., 1999, Fanali et al., 2012).

La unii compuși farmaceutici precum tolazamide, acetohexamide, glibenclamide și tolbutamide s-a observat o scădere a afinității de legare de HSA glicată față de HSA neglicată (Tsuchiya et al., 1984, Ascoli et al., 2006).

Studiile realizate de Joseph et co. (2010) au arătat că la HSA glicată există o creștere de cinci ori mai mare a activității de legare a L-triptofanului fața de proteina neglicată. Glicarea HSA este corelată cu creșterea nivelului de glucoză din sânge, fenomen întâlnit de obicei la pacienții cu diabet. Într-un studiu recent realizat in vitro s-a constatat că conentrația de Zinc din organism ar juca un rol important în glicarea HSA(Seneviratne et al, 2011, Lee et al., 2015).

Glicarea HSA are loc prin reacția de bază Schiff la grupul carbonil glucid cu grupurile amino ale HSA într-o manieră reversibilă. Arginina din poziția 410 și lizina din poziția 525 sunt principalele situri ale glicării HSA. Alte situri cu modificări minore sunt Arginina 114, Lizina 186, Arginina 218, Lizina 281, Arginina 428 și Lizina 439 (Ahmed et al., 2005). Baza Schiff trece prin rearanjarea Amadori cu o formare ireversibilă a unei amine secundare (adică fructozamina) și cu introducerea grupului carbonil pe suprafața proteinei (contribuind la formarea HSA carbonilată) (Baynes et al., 1989).

Glicarea albuminei serice umane este asociată cu oxidarea reziduurilor de histidină și triptofan, cu fragmentarea lanțului principal și cu pierderea structurilor secundară și terțiară (Coussons et al., 1997; Iwao et al., 2006b). Glicarea scade fluorescența intrinsecă a HSA inducând o schimbare conformațională care alterează proprietățile fizico-chimice ale mediului Trp 214 (Ahmed și Thornalley, 2002; Mendez et al., 2005b). Nivelurile de glicare avansată a HSA sunt reduse de diclofenac, un medicament antiinflamator fără steroizi care interacționează non-covalent cu proteina. Același comportament este observat în prezența aspirinei (Van Boekel et al., 1992).

Glicarea HSA alterează conexiunea liganzilor endogeni și exogeni la siturile Sudlow I și II, dar și interacțiunea cu acizii grași. În plus, glicarea lizinei din poziția 525 poate afecta conformația proteinei, modificând astfel legarea ligandului de siturile Sudlow I și II. Mai mult, glicarea lizinei din poziția 199 îmbunătățește legarea warfarinei, dar scade afinitatea bilirubinei (Oettl și Stauber, 2007).

Schimbările structurale induse de legarea acizilor grași previn abilitatea grupurilor Lys e-N de a experimenta rearanjarea Amadori pentru formarea aductului stabil de fructozamină. Acestea nu implică faptul că nivelurile crescute de acizi grași sunt avantajoase din punct de vedere clinic, deși concentrația crescută de acizi grași în sânge este recomandată pentru o scădere a nivelului de HSA glicată (Lautenslager et al., 2011). În final, glicarea scade activitatea HSA (Gerasimova et al., 2008a).

Nivelul de HSA glicată la o persoană normală este de aproximativ 10%, în orice caz, această proporție crește de obicei cu 20-30% la pacienții cu hiperglicemie (Rondeau și Bourdon, 2011). Glicarea HSA la pacienții cu diabet zaharat afectează și legarea ligandului și proprietățile antioxidante (Bourdon et al., 1999; Sakata et al., 2002; Cohen, 2003; Van Campenhout et al., 2006; Barzegar et al., 2007; Faure et al., 2008a). În mod notabil, capacitatea de legare Cu2+ a HSA glicată este mai scăzută decât cea a unei proteine non-glicate (Sakata et al., 2002). Astfel, HSA glicată intensifică oxidarea LDL indusă prin Cu2+, probabil prin generarea de superoxid (Bourdon et al., 1999; Sakata et al., 2002). În plus, capacitatea antioxidantă de legare Fe3+ a HSA este redusă semnificativ la pacienții cu diabet zaharat (Van Campenhout et al., 2006). În final, legarea și transportul triptofanului prin HSA glicată este redus (Barzegar et al., 2007).

Modificarea structurală a HSA indusă de glucoză sau radicali liberi deteriorează proprietățile sale antioxidante(Sakata et al., 2002, Fanali G. et al., 2012).

HSA a pacienților care suferă de diabet zaharat de tip 1 este alterată conformațional cu o expunere mai mare a regiunilor sale hidrofobe. În plus, HSA modificată prin radical hidroxil este extrem de imunogenică la iepuri prin comparație cu HSA nativă. HSA a pacienților cu vârste înaintate care suferă de diabet zaharat de tip 1 și care au fost fumători expun o legătură mult mai puternică la HSA modificată cu radical hidroxul față de cea normală. Aceste observații sugerează faptul că oxidarea proteinelor din sânge, în special a albuminei serice umane poate îmbunătăți stresul oxidativ la pacienții care suferă de diabet zaharat de tip 1 (Rasheed and Ali, 2006, Fanali et al., 2012). HSA la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 scade proprietățile antioxidate care pot agrava stresul oxidativ (Faure et al., 2008a).

O parte din pacienții care suferă de diabet (30-40%) dezvoltă neuropatii care cer tratament cu hemodializă. Conținuturile de di-Tyr și carbonil au fost găsite la un nivel ridicat în HSA izolată la pacienții care fac hemodializă. Astfel de HSA deteriorată afectează capacitatea de legare a liganzilor și proprietățile antioxidante (Lim et al., 2007, Fanali et al., 2012).

Foarte recent, alterarea proprietăților antioxidante ale HSA s-a observat la pacienții afectați de sindromul apneic. Acesta reflectă o activitate insuficientă antioxidantă a HSA care este asociată cu un nivel îmbunătățit de glicare (Faure et al., 2008b). În final, HSA glicată expune un efect toxic asupra celulelor microgliale asociat cu deficiențe ale sistemelor proteolitice celulare, fapt care poate reflecta rolul produselor finite de glicare avansată în neurodegenerare (Vitek et al., 1994; Cohen, 2003; Fanali et al., 2012)

Figura 5. Structura 3D a HSA (cod PDB: 1AO6). Sunt evidențiate localizările principalelor sistus- uri de legare ale substanțelor farmaceutice (ex: situs-urile Sudlow I și II). Sunt prezentate și locațiile câtorva lizine despre care se știe că au un rol în procesul de glicare (Anguizola et al., 2013).

Deoarece glicarea poate modifica structura HSA, s-a manifestat un interes deosebit privind felul în care aceste schimbări pot influența capacitatea HSA de a lega diverse substanțe chimice (Anguizola, et al., 2013).

Studiul HSA glicate a evidențiat că modificări în structura proteinei pot apărea în jurul unor reziduri la nivelul sau în apropierea situs-urilor Sudlow I și II. Diverse metode experimentale au fost utilizate pentru a studia interacțiunii dintre HSA glicată și diverși compuși chimici cu scopul de a vedea dacă acestea coincid cu cele observate la HSA normală. Printre acestea se numără: spectroscopia de fluorescență, dicroismul circular, ultrafiltrarea și tehnici cromatografice precum metoda Hummel–Dreyer (Anguizola, et al., 2013).

Albumina Serică Bovină (Bovin Serum Albumin – BSA)

Albumina Serică Bovină (Bovin Serum Albumin – BSA) reprezintă un model accesibil în studiul modificărilor structurale ale albuminei serice pe parcursul glicozilării neenzimatice.

Albumina serică bovină are o formă globulară și este principala proteină din plasma bovinelor, unde îndeplinește aceleași funcții ca și la om. Proteina precursoare BSA are o lungime de 607 aminoacizi. Dintre aceștia, 18 aminoacizi constituie peptida-semnal, iar încă patru aminoacizi reprezintă propeptida. Aceștia sunt înlăturați în urma secreției. Proteina matură este formată din 585 aminoacizi și are o masă moleculară de aproximativ 67 kDa. Deoarece BSA și HSA sunt omoloage în proporție de 76%, s-a preconizat că au structuri asemănătoare. Molecula de BSA este α- helicală și este structurată în trei domenii (I, II si III), alcatuite la râdul lor din două subdomenii (A și B). Modelul tridimensional al moleculei de BSA a fost construit pe baza omologiei cu structura cunoscută a albuminei serice umane (Majorek, et al. 2012).

Studiile au demonstrat că glicarea HSA, in vivo, din diabet poate afecta proprietățile sale de legare a medicamentelor (Barnaby, Wa et al. 2010; Barnaby, Cerny et al. 2011; Barnaby, Cerny et al. 2011).

Glicozilarea non-enzimatică a HSA are loc la nivelul mai multor situsuri. Glucoza se poate atașa la resturile de Lys 199, Lys 281, Lys 439 și Lys 525, dar și la alte resturi de lizină și arginină, sau la capătul N-terminal al polipeptidului. Căile de glicare includ o serie de reacții complexe ce au loc în mai multe etape, ce duc la formarea AGEs, ce au următoarele caracteristici: autoflorescentă, culoare maro și legături inter- si intramoleculare încrucișate. biblio

Deși reacțiile inițiale sunt reversibile, reacțiile ce urmează conduc la produși rearanjați formați prin legături încrucișate ireversibile intre proteină si glucoză. Aceste reacții determină modificări structurale și funcționale ale proprietătilor proteinei. biblio

Glicarea are potentialul de a induce deplierea si replierea proteinelor globulare în structuri cross-β. biblio

S-a observat că odată cu legarea covalentă a glucozei la HSA, are loc și formarea unor agregate cu greutate moleculară mai mare, și din punct de vedere termodinamic, mai stabile. Deasemenea are loc și o creștere a conformațiilor β-sheet. (Khan, Rasheed et al. 2007)

Spectroscopia de Terahertzi (THz)

În spectrul electromagnetic, radiația Terahertz (THz) este localizată între infraroșu și microunde, in domeniul de frecvență cuprins între 100GHz și 10THz. În ultimul timp, spectroscopia de THz a devenit interesantă pentru industria medicală, fizică, chimie, biologie securitate datorită modului în care interacționează cu substanța. Astfel s-au dezvoltat sisteme de spectroscopie și imagistică cu radiație THz, care au aplicații în domenii biologice și militare. biblio

Printre principalele avantajele folosirii radiației THz în biologie și medicină se număra: a) radiația THz nu produce distrugeri deoarece este nonionizantă,

b) substanțele investigate cu radiație THz prezintă spectre moleculare unice.

Radiația terahertz (THz, 1 THz = 1012 Hz), se situează în spectrul electromagnetic între regiunile infraroșu și microunde, având domeniul de fregvență între 100 GHz și 10 THz.

Regiunea spectrală cuprinsă între 0.1 – 10 THz este folosită în cercetare în domenii precum fizică, chimie, biologie și medicină. Acest fapt este confirmat de zecile de conferințe și work-shopuri dedicate studiului THz care au avut loc în ultimii ani (Orlando A.R. 2009).

Cercetătorii au realizat o multitudine de studii privind aplicțiile spectrocscopiei THz în biologie și medicină. Astfel, spectroscopia THz este folosită în aceste domenii începând de la studiul diverselor molecule biologice (ex.: proteine, medicamente, ADN) și până la studiul diferitelor tipuri de țesuturi (ex.: țesutul canceros). Una dintre aplicațiile importante ale spectroscopiei THz o reprezintă identificarea moleculelor biologice. Folosind radiația THz putem obține informații cu privire la vibrațiile intermoleculare ale moleculelor chimice, care apar în regiunea infraroșu. Prin aceste studii se urmarește să se elucideze dinamica moleculelor mari (Jin 2010).

O caracteristică importantă a radiației THz este aceea că este neionizantă. Undele THz au energii fotonice joase (1 THz = 4.1 meV), de un milion de ori mai slabe decât razele X, fapt care face ca aceastea să nu cauzeze distrugeri în țesuturile biologice (Orlando. 2009).

Radiația THz oferă acces la scala de timp din domeniul sub-picosecundelor, care este dificil de atins prin alte metode. Posibilitățile de studiu al THz-lor în chimie și biologie sunt, prin urmare foarte numeroase (Orlando. 2009).

Studiul biomoleculelor prin spectroscopie

Spectrele THz ale biomoleculelor cristalizate au fost raportate pentru o varietate de oligopeptide, simple zaharuri, specii farmaceutice și alte biomolecule mici.

Spre deosebire de macromolecule, o trăsătură comună a acestor studii este observarea unui număr relativ mic de caracteristici vibraționale ascuțite atribuite la un număr discret de moduri de intramoleculare. Observarea caracteristicilor vibraționale depinde în primul rând de spațiul de grup, astfel, de obicei, doar una sau două conformații ale subunităților monomere sunt dominante în cristal și, prin urmare, numărul mic de atomi per unitatea celulară rezultă într-un număr mic de moduri vibraționale care sunt iractive sub 3 THz. (Plusquellic , 2007)

Aplicații ale spectroscopiei în biocataliză și fotobiologie

Știința THz-lor oferă posibilitatea de a analiza vibrațiile interne ale proteinelor. Identificarea experimentală a scalelor mici foarte rapide, sub-picosecunde, generează vibrații și mișcări cuplate care anticipează înțelegerea bazelor fizice a catalizei enzimelor (Orlando, 2009).

Studiul radiației THz, oferă oportunități pentru studierea fotoizomerizarii cromoforului retinei. Senzația vizuală este obținută prin transformarea biologică a unui foton într-un semnal electric de la nivelul retinei. Acest proces are loc prin intermediul receptorilor cuplați cu proteine G numiți opsine, care conțin cromoforul: 11-cis retinal. Aceasta este partea în care are loc absorbția luminii și este legat covalent de opsină. Cromoforii retinei apar în forme izomere diferite în funcție de funcția fizică a proteinelor. Atunci când este lovit de un foton, 11-cis retinalul suferă procesul de fotoizomerizare la toate capetele trans-retinal (to all-trans retinal) care schimbă conformația opsinei, fapt care conduce la transmiterea semnalului de transducție în cascade. Izomerizare cis-trans este cea mai rapidă reacție fotochimica cunoscută (cca. 200 f/s) (Orlando, 2009).

Coerența vibrațională a izomerizării poate fi responsabilă pentru această viteză de reacție. Walther M. (2000) împreună cu colaboratorii săi au folosit spectroscopia THz-Time Domain (TDS) pentru a măsura spectrul infraroșu a trei izomeri ai retinalului: all-trans, 13-cis și 9-cis. Retinalul sa dovedit ca absoarbe în regiunea 0.3-3 THz, fapt care arată diferențe semnificative între spectrele de vibrație cu frecventa joasă a celor trei izomeri (Orlando, 2009).

THz-TDS este sensibilă în discriminarea diferitelor stări conformaționale ale proteinelor cu structură similară. În studiul realizat de Qu Y. G. în 2007, deși structurile secundare și terțiare ale proteinelor CP43 și CP47 (care sunt proteinele membranare de fotosinteză) sunt foarte asemănătoare, a fost posibil să se diferențieze stările conformaționale prin spectrele de absorbție THz. Această diferențiere sa menținut, și după ce s-a încercat denaturarea proteinelor prin tratarea probelor cu guanidină hidroclorhidrată, indicând faptul că proteinele denaturate se află în stări conformaționale diferite (Orlando, 2009).

În plus, Balu R. (2008) a constatat că natura mișcărilor vibraționale activate de radiații terahertz este surprinzătoare de asemănătoare între două proteine cu structura similară, și anume între rodopsină și bacteriorhodopsină, fapt care confirmă importanța studiilor de spectroscopie THz (Orlando, 2009).

Această metodă a fost aplicată cu succes la probe biologice permițând obținerea de informații directe despre mecanismul de translocație primară în proteinele retiniene, precum și în sistemele fotosintetice. Echipa cu care a lucrat Groma G.I. (2008) au analizat prin radiație THz probe de bateriorodopsină. Semnalul THz detectat a fost analizat prin simulare numerică de diferite modele pentru procesele de polarizare elementare, dezvăluind secvențe corelate ale transferului de electroni primar în interiorul retinei cromofore, și transferul de protoni, adică redistribuirea unei legături de H în apropierea proteinei retinieine (Orlando AR, 2009).

Studiul aminoacizilor prin spectroscopie THz

Aminoacizii reprezintă unitatea de bază a proteinelor. Aceștia sunt foarte sensibili la undele radiatiei THz, creând spectre specifice. În figura 6 se pot observa spectrele produse de cei 20 de aminoacizi esențiali care compun moleculele proteice umane. În această figură putem obseva că vârfurile de absorbție caracteristice aminoacizilor sunt între 0,2 și 0,3 THz. Printr-un studiu comparativ de molecule s-a putut stabilii pentru prima dată corelații între vârfurile spectrale THz și structurile moleculare ale aminoacizilor și a putut fi realizată clasificarea aminoacizilor bazată atât pe structurile moleculare cât și pe spectrele THz (Jin,2010).

Radiația THz poate fi utilizată și în identificarea structurii izomerice a aminoacizilor. Astfel, pentru α- alanina și β- alanina s-au obținut spectre THz diferite (Jin B. 2010).

Plusquellic D.F. et al. au realizat o serie de experimente în care au masurat spectrele THz de absorbție în infraroșu atât pentru cei 20 de aminoacizi esențiali cât și pentru alți aminoacizi.

Aceștia au constatat că aceste spectre conțin un set de caracteristici de absorbție în domeniul spectral 1-22 THz. Într-un alt experiment s-a dorit să se afle dacă o grupare atomică (OH pentru serină și SH pentru cisteină) poate fi identificată în spectrul THz. În urma analizei L-serinei și L-cisteinei aceștia au obținut spectre diferite pentru cele două structuri. Diferențe semnificative s-au observat în special în regiunea fotonică de frecvență joasă (<100cm-1), fapt care a indicat că interacțiunile acestor aminoacizi sunt puternic influențate de grupările atomice pe care le dețin în structuraă (Plusquellic, 2007).

Figura 6. Spectrele THz a celor 20 de aminoacizi (Jin B., 2010).

Spectroscopia THz este de asemenea extrem de sensibilă la structura cristalină enantiomerică a biomoleculelor. Stereochimia multor specii biologice și farmaceutice joacă un rol important în funcționalitatea și toxicitatea acestora (Plusquellic, 2007).

Peptidele

Peptidele sunt polimeri de aminoacizi. Spectroscopia THz poate fi folosită de asemenea pentru identificarea peptidelor. Wang W. și Yan H. au folosit spectroscopia THz pentru a studia vârfurile de absorbție și caracteristicile optice ale glutationului redus și ale carnosinei (β-alanil-histidina). Pentru a prezice cauza vârfului de absorbție s-a folosit Teoria Densitatii Funcționale (TDF), diferitele vârfuri de absorbție corespunzând diferitelor moduri vibraționale ale moleculelor. Prezicerile teoretice s-au dovedit a fi în concordanță cu rezultatele experimentale (Jin,2010).

Proteinele

Proteinele au structuri și funcții diferite care variază în funcție de organismul în care se află. Spectroscopia THz poate fi folosită atât pentru identificarea proteinelor cât și pentru identificarea structurii și dinamicii acesteia (Jin, 2010).

Spectroscopia THz este o tehnică folosită pentru a se obține informații despre dinamica configurațională și conformațională a proteinelor. Chen H. și colaboratorii săi folosesc spectroscopia THz pentru a studia procesul de denaturare a proteinelor CP43 si CP47. Aceștia au obținut spectre de absorbție diferite, fapt care dovedește atât că în procesul de denaturare al proteinelor au loc niște schimbări conformaționale, cât și capacitatea tehnologiei THz de detectare a acestor modificări (Jin, 2010, Chen, 2007).

Studiul Biomoleculelor prin spectroscopie THz in medii apoase

Grupul condus de Martina Havenith (2006) au studiat comportamentul biomoleculelor în medii apoase. Aceștia au folosit spectroscopia THz și au constat ca regiunea 1-4 THz este sensibilă la cele mai mici schimbări care au loc la între moleculele de apă și biomoleculă (Huegen, 2006).

Imagistica THz

Deoarece radiațiile THz sunt non-ionizante acestea, nu produc daune la nivelul țesuturilor. Unele frecvențe ale radiației THz pot penetra câțiva milimetri de țesut care conține o concentrație scăzută de apă și poate detecta diferențele în apa conținută și densitatea țesuturilor. Imagistica THz este o metodă sigură și lipsită de durere folosită pentru detectarea cancerului.

Zhang și colaboratorii săi au utilizat imagistica THz pentru a studia diferențele de absorbție dintre diferite tumori (tumori subcutanate și ficat inflamat) și țesuturile normale corespunzătoare, la mai multe frecvențe. Sa constatat că, la un anumit interval de frecvență, cele mai multe tumori au un grad de absorbție mai mic decât țesuturile normale. Astfel au ajuns la concluzia că imagistica THz poate fi folosită pentru a distinge țesuturile cancerigene de țesuturile normale (B.Jin, 2010).

Figura 7. Imagistica THz folosită pentru a diferenția între țesutul bolnav (stânga) și țesutul sănătos (dreapta) la diferite fregvențe (Preluat din B.Jin, 2010).

Ca o concluzie spectroscopia THz este o metodă utilă pentru identificarea moleculelor biologice, studiul structurii moleculare și poate fi folosită pentru diferențierea țesuturilor bolnave de cele sănătoase, având aplicații în medicină și biologie (B.Jin 2010).

Electroforeza

Electroforeza este o metodă de analiză ce permite separarea componenților unui amestec pe baza diferențelor dintre vitezele de deplasare în câmp elecric. Moleculele încărcate electric, aflate în soluție și supuse unui câmp electric, vor migra către electrodul de polaritate opusă.

Viteza de deplasare a fiecărui component al probei depinde de raportul dintre forța electrică și de forțele de frecare:

V= Fe/f

Forța electrică se exprimă astfel:

Fe = q • E (E=U/d)

unde:

q = sarcina electrică a particulei (C);

E = intensitatea câmpului electric (Vm-1)

U = diferența de potențial între electrozi (V)

d = distanța dintre electrozi

Pentru o moleculă sferică de rază r ce se deplasează într-un mediu de viscozitate η, forțele de frecare sunt legate de legea lui Stokes:

f = 6 π • η • r

Viteza de migrare a unei particule în câmp electric este direct proporțională cu sarcina și intensitatea câmpului electric și invers proporțională cu raza particulei și vâscozitatea mediului. Separarea electroforetică a macromoleculelor care compun un amestec se realizează cand vitezele de migrare ale acestora diferă. Astfel, se pot influența: sarcina electrică a moleculei (prin ajustarea pH-ului soluției tampon în care se află dizolvată proba), intensitatea câmpului electric sau vâscozitatea mediului de migrare, cu scopul de a influența separarea. În cazul în care vitezele de migrare ale particulelor sunt totuși asemănătoare, separarea electroforetică se poate realiza prin creșterea intervalului de timp de migrare.

Electroforeza este o formă incompletă de electroliză. Conducția într-un sistem elecroforetic se realizează mai ales pe seama ionilor soluției tampon, care au o mobilitate superioară macromoleculelor amestecului de separat.

Soluția tampon

Există mai multe tipuri de soluții tampon. Printre acestea se numără: formiat, acetat, citrat, fosfat, Tris, EDTA etc. Compoziția chimică a soluției tampon nu trebuie să permită interacții chimice cu compușii probei. pH-ul trebuie să țină cont de natura probei astfel încât să nu o modifice chimic sau să o denatureze. Ionizare unor grupe acide sau bazice slabe este dependentă de pH-ul tamponului folosit: creșterea ionizării grupelor acide este cu atât mai mare cu cât creșterea pH-ului mediului este mai mare; pentru grupele bazice ionizarea crește cu scăderea pH-ului. Cu cât pH-ul tamponului va fi mai depărtat de pI al unui component al probei, cu atât încărcarea acelui component va fi mai exprimată. La un pH<pI, componentul va fi cation și se va deplasa către catod. La pH=pI, componentul nu va migra deoarece încărcarea sa electrică va fi nulă. La pH>pI componentul anionic va migra spre anod. Astfel, putem trage concluzia că direcția și gradul migrării unui amfolit sunt dependente de pH.

Forța ionică a tamponului este deseori cuprinsă între 0.05 și 0.15. Aceasta este rezultatul unui compromis: (a) la forță ionică mare, cantitatea de curent transportată prin ionii tamponului va crește și cea transportată prin probă va scade. Aceasta va scade viteza de migrare a probei și va permite o separare foarte bună; difuzia probei va fi neglijabilă, dar temperatura dezvoltată în aparat va fi ridicată și va necesita sisteme adiționale de răcire. Creșterea temperaturii ar putea provoca denaturarea unor compuși; (b) la forță ionică mică, migrarea se realizează rapid. Temperatura este neglijabilă iar difuzia este considerabilă.

Câmpul elecric

Electroforeza necesită un generator de curent continuu, la voltaj sau la curent constant. Dacă curentul aplicat este prea mare, se produce creșterea temperaturii, fapt care determină pierderea apei din sistem prin evaporare și denaturarea probei.

Suportul pentru electroforeză

Electroforeza poate fi condusă prin soluție liberă, fără să necesite un mediu suport; în acest caz, rezistența la fricțiune între ionii probei și soluție este minimă și are loc o migrare rapidă; acest tip de electroforeză se numește electroforeză în flux continuu (liberă) și este folosită pentru o scară largă de separări preparative. Deoarece încărcarea unor molecule similare e asemănătoare, ele tind să migreze împreună ca o bandă; apar „granițe” între substanțe care au mobilități ușor diferite. Această tehnică (moving boundary electrophoresis) a fost descoperită de Tiselius (Suedia) și este o metodă analitică ce necesită aparate optice care să detecteze schimbările în indicii de refracție la interfețele granițelor.

Folosirea unui mediu suport, inert și relativ omogen, în locul unei soluții libere, a dat naștere la versatilitatea electroforezei în separarea substanțelor încărcate, de la ionii anorganici la macromolecule.

Separarea unei probe pe un mediu suport, face ca migrarea componenților să realizeze zone distincte, ce pot fi ulterior detectate prin tehnici analitice. Termenul de electroforeză „zonală” este aplicat acestei metode ce are largi aplicații preparative și analitice.

Există multe tipuri de medii suport, de la foi de hârtie absorbantă sau acetat de celuloză la diverse geluri; fiecare poate oferi avantaje față de altul pentru o separare particulară.

Unele suporturi pot cauza adsorbție, adică retenția moleculelor probei pe suport; proba va migra în formă de cometă în loc de bandă compactă distinctă, aceasta reducând atât viteza cât și rezoluția amestecului. Unele geluri în care lanțurile moleculare se răsucesc la întâmplare prin gel pot genera o structură gen sită. Apare un fenomen de „cernere moleculară”, modificarea mărimii porilor conducând la modificarea deplasării moleculelor cu mărimi diferite.

Printre suporturile mai folosite se numără:

-Hârtia de filtru- este ieftină și ușor de utilizat; principalul inconvenient este că absoarbe moleculele ce urmează să fie separate, ceea ce poate antrena o proastă separare. Acest suport servește pentru separări de aminoacizi, peptide, proteine, etc.

-Acetatul de celuloză- oferă o absorbție mai redusă și deci o separare și o eluție mai bună.

-Gelurile (coloizi semisolizi), insolubile în apă, se prepară înainte de utilizare, din diverse pudre solide. Proprietatea de „sită moleculară” a acestor geluri permite separări de molecule cu încărcări similare, dar cu forme și mărimi diferite.

-Gelul de agaroză, polimer pe bază de galactoză, este transparent și perfect adaptat pentru o evaluare spectrofotometrică a compușilor după separare. Agarul depus pe lamele de microscop este un suport de ales în separări de acizi nucleici și în imunoelectroforeză.

-Gelul de amidon se prepară prin fierbere și răcire a unui amestec de amidon parțial hidrolizat, într-un tampon potrivit. Aceasta face ca lanțurile ramificate de amilopectină să se răsucească și să formeze pori în gelul semigrid.

-Gelul de poliacrilamidă este cel mai recent suport pentru electroforeză. El posedă avantajul de a fi transparent și de a putea fi utilizat în spectrofotometria în vizibil și ultraviolet. Este obținută o rezoluție foarte fină a amestecului de analizat. Deoarece mărimea porilor poate fi controlată, separarea depinde atât de sarcina cât și de mărimea și de forma moleculei. Gelul se prepară prin polimerizarea acril amidei (CH2=CH-CO-NH2).

Polimerizarea se efectuează în prezența unor mici cantități de agent de reticulare (de formare de rețea, de legături covalente „încrucișate” între lanțuri). Agentul de reticulare este metilen-bis-acrilamidă (CH2=CH-CO-NH)2CH2. Acesta, la copolimerizare, leagă între ele covalent lanțuri diferite de polimeri de poliacrilamidă căci o moleculă de agent de rețea se include în două lanțuri polimerice. Se folosește un catalizator-inițiator de polimerizare (persulfatul de amoniu) și un agent ce induce o polimerizare (persulfatul de amoniu) și un agent ce induce o polimerizare regulată.

Gelul pomierizează în tuburi mici ce au la partea inferioară un robinet. Un film de apă este depozitat pe suprafața gelului pentru a obține o suprafață plană și pentru a evita contactul gelului cu oxigenul din aer, care inhibă polimerizarea. Mărimea porilor gelului poate fi modificată, variind raportul de concentrație între monomerii de acrilamidă și agentul de reticulare. Gelurile cu conținut de 3% acril amidă au diametrul porilor mai mare (0,5 nm), iar cele cu 30% acrilamidă au diametrul mai mic (0,2 nm), ultimele oferind mai multă rezistență la pasajul moleculelor. În general se folosesc geluri de 5-15% acrilamidă; ele pot fi preparate cu mare reproductibilitate, nu absorb în ultraviolet, deci sunt potrivite pentru separări cantitative „in situ” și pentru tehnici histologice.

Aparatul de electroforeză

Aparatul de electroforeză constă dintr-o cuvă închisă etanș și saturată cu vapori de apă; aparatul este prevăzut cu două rezervoare de tampon, în care se introduc electrozii și cu un cadru în (sau pe) care se aplică suportul de separare; capetele suportului sunt în legătură cu soluția tampon, deci conectate la curent. Rezervoarele de tampon conțin câte două compartimente, conectate între ele prin meșe de bumbac sau hârtie de filtru; un compartiment conține electrodul corespunzător, celălalt este în contact cu capătul suportului de electroforeză. Variațiile de pH, de temperatură sau de concentrație, ce pot surveni în timpul lucrului la electrozi sunt minimalizate în vecinătatea imediată a suportului, prin existența a două compartimente.

Cu privire la aplicarea probei, aceasta se aplică cu o micropipetă, dacă proba conține componenți individuali cu sarcini opuse este de așteptat ca ei să migreze spre ambii electrozi. Proba se aplică pe suportul îmbibat iar volumul aplicărilor este de ordinul μl. După aplicarea probei aparatul se conectează la curentul necesar.

Câteva dintre tehnicile electroforetice sunt electroforeza în gel cu dodecil-sulfat de sodiu (SDS-gel-electroforeza), izotachoforeza, focalizarea izoelectrică sau gel-electroforeza în câmp izolatoriu.

Electroforeza în gel cu duodecil-sulfat de sodiu se folosește pentru separarea amestecurilor de proteine și pentru determinarea maselor lor moleculare. SDS [CH3-(CH2)11-OSO3-Na+] este un detergent anionic a cărui catenă hidrocarbonată poate interacționa cu regiuni hidrofobe ale proteinelor, provocând denaturarea lor, grupul –SO3- ionizat proemină în mediul înconjurător. În prezența unui exces de SDS, fiecare gram de proteină leagă circa 1,4 g de detergent obținând o încărcare negativă constantă pe unitatea de masă.

Izotachoforeza este folosită în industrie, de exemplu în controlul poluării, depistării ionilor anorganici sau detergenților în apa de băut sau în controlul alimentelor, medicamentelor. Această tehnică se poate efectua într-un tub de sticlă, într-un mediu apos tamponat sau pe coloane umplute cu gel.

Focalizarea izoelectrică este bazată pe ”moving boundary”. În această tehnică componenții amestecului de analizat se separă cu rezoluție foarte mare. Astfel, metoda este potrivită pentru separarea și identificarea proteinelor serice, pentru cercetări imunologice, pentru cercetări în biochimia membranelor sau pentru separări de izoenzime.

Gel-electroforeza în câmp pulsatoriu se aplică în special separării moleculelor mari de acizi nucleici cum ar fi cromozomii compleți. În tehnicile convenționale gel-electroforetice, toate moleculele ADN peste o anumită mărime migrează cu aceeași viteză deoarece există o conformație și orientare prin care pot traversa prin gel. Sub un câmp pulsatil, moleculele sunt forțate să-și schimbe direcția de migrare prin schimbări perioadice în direcția câmpului aplicat.

III. MATERIALE ȘI METODE

Protocolul pentru prepararea bufferilor este prezentat în tabelul 3. Soluțiile obținute au fost 10X și vor fi diluate de 10 ori (1 parte soluție + 9 părți apă distilată) înainte de folosire. Soluțiile diluate 1X de folosit vor avea o concentrație de tampon 10-20 mM și o tărie ionică finală de 150 mM.

Tabelul 3. Protocol pentru prepararea bufferilor

* Se aduce la volumul final prin pipetare în corning până la semn (10 ml).

Pregătirea probelor

Materiale necesare: 18 eppendorfuri, pipete, balanță analitică

Substanțe necesare: albumină serică bovină, glucoză, fructoză, azidă de sodiu

Soluții tampon ( pH = 4, pH = 5, pH = 6, pH =7, pH = 7.4, pH = 8 )

S-au numerotat și împarțit cele 18 eppendorfuri în trei și s-au pus câte 6 pe rând.

Primul rand de eppendorfuri ( 1-6 ) conține :

Tabel numarul… substanțele și cantitățile necesare pentru alcătuirea soluțiilor de BSA glicate cu fructoza.

Al doilea rând de eppendorfuri ( 7 – 12 ) conține:

Tabel numarul… substanțele și cantitățile necesare pentru alcătuirea soluțiilor de BSA glicate cu glucoză.

Al treilea rând de eppendorfuri ( 13 – 18 ) conține :

Tabel numarul… substanțele și cantitățile necesare pentru alcătuirea soluțiilor de BSA neglicate.

Toate cele 18 eppendorfuri s-au vortexat după care s-au luat din fiecare câte 100 µl și s-a congelat. Iar restul probelor s-au păstrat în termostat la o temperatură de 37 șC.

Protocol electroforeză

Materiale necesare: aparat de electroforeză , pahare Berzelius, corninguri, balanță analitică, baloane cotate, cilindru, hârtie de filtru, pipete, eppendorfuri.

Prepararea gelului și a tamponului de încărcare pentru probe

Tabelul numarul… Compoziția gelului:

Tabelul numarul… Compoziția tamponului de încărcare:

Tabelul numarul… Compoziția buffer-ului TBE 5 X.

Într-un balon cotat de 500 ml s-au cântărit:

Prepararea solutiei de EDTA 0.5 M

S-au cânărit 14,62 g EDTA ( pentru 100 ml) obținuți după formula de calcul, după care s-au transferat într-un pahar Berzelius și s-au adăugat aproximativ 80 ml apă distilată.

S-a pus paharul pe un vortex până când soluția s-a dizolva. Pentru ajustarea Ph –ului s-a preparat o soluție de Na OH 5 M ( s-a cântărit 20 g de Na OH și s-au adăugat 80 ml apă distilată agitandu-se până la dizolvare după care s-a transferat soluția într-un balon cotat de 100 ml și s-a adăugat apă distilată până la semn).

Din soluția de NaOH s-a luat aproximativ 50 ml și s-a adaugat picătură cu picatură în soluția de EDTA 0,5 M în care s-a introdus ulterior un pH-metru până cand s-a ajuns la un pH de 8.

Calcule:

EDTA 0,5 M

0,5 M = 0,5 moli/ 1000 ml

0,05 moli/ 100 ml

1 mol………………….292,4 g ( M)

0,05moli……………..X g

X= 0.05 x 292,4 / 1

X = 14,62 g EDTA

NaOH 5 M

5 M = 5 moli / 1000ml

0,5moli /1000ml

1mol………………………..40g ( M Na OH )

0,5moli…………………….Xg Na OH

X= 0,5 x 40 /1

X = 20 g Na OH

Prepararea soluției persulfat de amoniu, (Amoniumperoxodisulfat, APS) 10 %

S-a cântărit 0,1 g APS într-un eppendorf la balanța analitică după care s-au adăugat 900 µl apă distilată și s-a agitat pe un vortex.

10g APS………………..100ml

X g APS…………………1 ml

X= 10 x 1 / 100

X= 0,1 g APS

Prepararea soluției de Bromfenol 0,1 %

S-a cântărit 0,01 g bromfenol la balanța analitică și s-a pus într-un corning peste care s-a adăugat apă distilată până la un volum de 10 ml.

0,1g……………………….100 ml

Xg………………………….10 ml

X = 0,1 x 10 / 100

X = 0,01 g bromfenol

Modul de lucru

S-au așezat cele două plăcuțe de geamuri pe suporturi după care într-un corning de 15 mL s-a preparat gelul de poliacrilamidă conform compoziției menționate mai sus ( tabelul …),apoi gelul gata preparat s-a turnat între cele două placuțe de geamuri fixate ulterior.Godeurile s-au format cu ajutorul unui piepten din plastic de 1 mm care s-a fixat între geamuri după turnarea gelului.

După polimerizarea gelului s-a scos pieptănul și s-a pus în ficare godeu cate o bucațică de hartie de filtru,având rolul de a sustrage surplusul de gel din godeuri apoi s-au fixat cele două placuțe în suportul aparatului de electroforeză peste care s-a adaugat Buffer TBE 1 X ( într-un balon cotat de 1 L s-a adăugat 200 mL de Buffer TBE 5X peste care s-a pus apă distilată până la semn),s-a așezat capacul și s-a conectat la sursa de curent.

După încărcarea probelor s-a pornit migrarea la temperatura camerei, la 110V, etapă care s-a desfășurat până în momentul în care frontul de migrare a atins limita inferioară a gelului, apoi gelurile au fost colorate cu o soluție de azotat de argint și fotografiate.

Colorația cu azotat de argint

După cine e protocolul?????

S-au lasat gelurile într-o soluție de fixare ( 25 ml methanol + 5 ml acid acetic + 100 µl formaldehidă ( 4.5 %) + apă distilată până la un volum de 50 ml) timp de o ora după care s-au spalat gelurile într-o soluție de ethanol 50 % ( 50 ml ethanol + 50 ml apă distiltă) de 3 ori, nu mai mult de 20 de minute. După ce s-a realizat etapa de fixare și spalare cu ethanol s-a tratat gelul timp de un minut cu hiposoluție de tiosulfat de sodiu ( 0.2 g tiosulfat de sodiu / 100 ml ).

În continuare gelul s-a spălat în trei reprize cu apă distilată ( 20 de secunde fiecare) iar apoi acesta, s-a tratat cu o soluție de azotat de argint ( 20 mg azotat de argint într-o sută ml de apă distilată ) timp de 30 de minute.

Următoarea etapă a presupus spălarea gelurilor cu apa distilată de trei ori. Apoi gelul s-a pus într-o soluție de developare ( 6 g carbonat de sodiu + 2 ml tiosulfat de sodiu + 100 µl formaldehidă + apă distilată până la un volum de 100 ml) și s-a lasat până cand s-a obținut imaginea dorită.

La final gelul s-a pus intr-o soluție de stopare (acid acetic 5 % ).

Protocol de obținere a spectrelor THz.

Protocolul de obținere a spectrelor este preluat din Mernea M. et al. 2015. Spectrele THz au fost obținute utilizând spectrometrul TPS Spectra 3000 (al firmei TeraView Limited, Cambridge), în modul ATR (attenuated total reflection – reflexie totală atenuată) sub un unghi de incidență de 35°. Proba (25 μl soluției) au fost așezată direct pe cristalul ATR. Măsurătorile au fost realizate sub purjare constantă cu azot, la o rezoluție de 1.2 cm-1. Pentru fiecare spectru s-au realizat 1800 de scan-uri, la o rată de 30 de scan-uri/ secundă. Spectrul rezultat a fost procesat prin aplicarea funcției de apodizare Blackman-Harris. Apodizarea și calculul absorbanței a fost realizat cu ajutorul softului TPS Spectra 3000.

IV. Rezultate și discuții

V. Concluzii

Bibliografie

Ahmed, N., Thornalley, P.J., 2002. Chromatographic assay of glycation adducts in human serum albumin glycated in vitro by derivatization with 6-aminoquinolyl-N hydroxysuccinimidyl-carbamate and intrinsic fluorescence. Biochem. J. 364, 15–24.

Ahmed N, Dobler D, Dean M, Thornalley PJ. Peptide mapping identifies hotspot site of modification in human serum albumin by methylglyoxal involved in ligand binding and esterase activity. J Biol Chem. Feb 18; 2005 280(7):5724–32.

Aime, S., Botta, M., Fasano, M., Geninatti Crich, S., and Terreno, E. (1996) Gd(III) complexes as contrast agents for magnetic resonance imaging: a proton relaxation enhancement study of the interaction with human serum albumin. J. Biol. Inorg. Chem. 1, 312 – 319.

Annunziata Lapolla, LauraMolin, and Pietro Traldi, Protein Glycation in Diabetes as Determined by Mass Spectrometry, International Journal of Endocrinology, Volume 2013, Article ID 412103, 11 pages;

Ascenzi, P.; Bocedi, A.; Notari, S.; Fanali, G.; Fesce, R.; Fasano, M. Allosteric modulation of drug binding to human serum albumin. Mini Rev. Med. Chem. 2006, 6, 483–489.

Ascoli GA, Domenici E, Bertucci C. Drug binding to human serum albumin: abridged review of results obtained with high-performance liquid chromatography and circular dichroism. Chirality 2006;18:667–79.

Baraka-Vidot J, Guerin-Dubourg A, Bourdon E, Rondeau P. Impaired drug-binding capacities of in vitro and in vivo glycated albumin. Biochimie. Sep; 2012 94(9):1960–7.

Barnaby, O. S., R. L. Cerny, et al. (2011). "Comparison of modification sites formed on human serum albumin at various stages of glycation." Clin Chim Acta 412(3-4): 277-285.

Baynes JW, Thorpe SR, Murtiashaw MH. Nonenzymatic glucosylation of lysine residues in albumin. Methods Enzymol 1984;106:88–98.

Bertucci, C.; Domenici, E. Reversible and covalent binding of drugs to human serum albumin: Methodological approaches and physiological relevance. Curr. Med. Chem. 2002, 9, 1463–1481.

Božidar Vujičić, Tamara Turk, Željka Crnčević-Orlić, Gordana Đorđević and Sanjin Rački (2012). Diabetic Nephropathy, Pathophysiology and Complications of Diabetes Mellitus, Prof. Oluwafemi Oguntibeju (Ed.), ISBN: 978-953-51-0833-7, InTech, DOI: 10.5772/50115. Available from: http://www.intechopen.com/books/pathophysiology-and-complications-of-diabetes-mellitus/diabetic-nephropathy.

Chiou YJ, Tomer KB, C. Smith P. Effect of nonenzymatic glycation of albumin and superoxide dismutase by glucuronic acid and suprofen acyl glucuronide on their functions in vitro. Chem Biol Interact. 1999; 121:141–59.

Colmenarejo, G. In silico prediction of drug-binding strengths to human serum albumin. Med. Res. Rev. 2003, 23, 275–301.

Coussons, P.J., Jacoby, J., McKay, A., Kelly, S.M., Price, N.C., Hunt, J.V., 1997. Glucose modification of human serum albumin: a structural study. Free Radic. Biol. Med. 22, 1217–1227.

Curry, S. (2009) Lessons from the crystallographic analysis of small molecule binding to human serum albumin, Drug Metab Pharmacokinet 24, 342-357.

Dinu V., Truția E., Cristea P. E., Popescu A., 1996, Biochimie Medicală, mic tratat, Editura Medicală, București.

Evans, T. W. (2002) Review article: albumin as a drug–biological effects of albumin unrelated to oncotic pressure, Aliment Pharmacol Ther 16 Suppl 5, 6-11.

Fanali G, Masi di A., Trezza V., Marino M., Fasano M, Ascenzi P., Human serum albumin: From bench to bedside, Molecular Aspects of Medicine 33 (2012) 209–290.

Fasano M. , Stephen Curry, Enzo Terreno, Monica Galliano, Gabriella Fanali, Pasquale Narciso, Stefania Notari and Paolo Ascenzi, The Extraordinary Ligand Binding Properties of Human Serum Albumin, IUBMB Life, 57(12): 787 – 796, December 2005.

Figge, J., Rossing, T. H., and Fencl, V. (1991) The role of serum proteins in acid-base equilibria, J Lab Clin Med 117, 453-467.

Gerasimova, Y.V., Knorre, D.D., Shakirov, M.M., Godovikova, T.S., 2008a. Human serum albumin as a catalyst of RNA cleavage: N-homocysteinylation and Nphosphorylation by oligonucleotide affinity reagent alter the reactivity of the protein. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 5396–5398

Hawkins JW, Dugaiczyk a. The human serum albumin gene: structure of a unique locus. gene. 1982; 19(1):55–8.

He XM, Carter DC. Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature 1992; 358: 209-215.

Iwao, Y., Anraku, M., Hiraike, M., Kawai, K., Nakajou, K., Kai, T., Suenaga, A., Otagiri, M., 2006b. The structural and pharmacokinetic properties of oxidized human serum albumin, advanced oxidation protein products (AOPP). Drug Metab. Pharmacokinet. 21, 140–146.

Jackson AJ, Anguizola J, Pfaunmiller EL, Hage DS. Use of entrapment and high-performance affinity chromatography to compare the binding of drugs and site-specific probes with normal and glycated human serum albumin. Anal Bioanal Chem. Jul; 2013 405(17):5833–41.

Joseph KS, Hage DS. The effects of glycation on the binding of human serum albumin to warfarin and L-tryptophan. J Pharm Biomed Anal. Elsevier B.V. Nov 2; 2010 53(3):811–8.

Kawakami, A.; Kubota, K.; Yamada, N.; Tagami, U.; Takehana, K.; Sonaka, I.; Suzuki, E.; Hirayama, K. Identification and characterization of oxidized human serum albumin. FEBS J. 2006, 273, 3346–3357.

Lautenslager, G.T., Shearman, C.W., Hud, E., Cohen, M.P., 2011. Effects of nonenzymatic glycation and fatty acids on functional properties of human albumin. Metabolism 60, 1683–1691.

Lee P. and Wu X. , Modifications of Human Serum Albumin and Their Binding Effect, Curr Pharm Des. 2015 ; 21(14): 1862–1865.

Majorek, K. A., Porebski, P. J., Dayal, A., Zimmerman, M. D., Jablonska, K., Stewart, A. J., Chruszcz, M., and Minor, W. (2012) Structural and immunologic characterization of bovine, horse, and rabbit serum albumins, Molecular Immunology.

Mernea Maria, Alina Ionescu, Ionut Vasile, Cristina Nica, Gheorghe Stoian,Traian Dascalu, Dan Florin Mihailescu, In vitro human serum albumin glycation monitored by Terahertz spectroscopy, Optical and Quantum Electronics, April 2015.

Mendez, D.L., Jensen, R.A., McElroy, L.A., Pena, J.M., Esquerra, R.M., 2005b. The effect of non-enzymatic glycation on the unfolding of human serum albumin. Arch. Biochem. Biophys. 444, 92–99.

Mohora M., 2006, Biochimie Medicală, Editura Niculescu, București.

Nakajou K, Watanabe H, Kragh-Hansen U, Maruyama T, Otagiri M. The effect of glycation on the structure, function and biological fate of human serum albumin as revealed by recombinant mutants. Biochim Biophys Acta – Gen Subj. Oct; 2003 1623(2-3):88–97.

Okabe N, Hashizume N. Drug binding properties of glycosylated human serum albumin as measured by fluorescence and circular dichroism. Biol Pharm Bull. 1994; 17:16–21.

Oettl, K., Stauber, R.E., 2007. Physiological and pathological changes in the redox state of human serum albumin critically influence its binding properties. Br. J. Pharmacol. 151, 580–590.

Otagiri, M. A molecular functional study on the interactions of drugs with plasma proteins. Drug Metab. Pharmacokinet. 2005, 20, 309–323. Int. J. Mol. Sci. 2014.

Peters, T. All about Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications; Academic Press: San Diego, CA, USA, 1996.

Rondeau, P., Bourdon, E., 2011. The glycation of albumin: structural and functional impacts. Biochimie 93, 645–658.

Schnitzer, E., Pinchuk, I., Bor, A., Fairanu, M. and Lichtenberg, D. (1997) The effect of albumin on copper-induced LDL oxidation. Biochim. Biophys. Acta 1344, 300 – 311.

Shaklai N, Garlick RL, Bunn HF. Nonenzymatic glycosylation of human serum albumin alters its conformation and function. J Biol Chem 1984;259:3812–7.

Sleep D, Cameron J, Evans LR. Albumin as a versatile platform for drug half-life extension. Biochim Biophys Acta. Elsevier B.V. Dec; 2013 1830(12):5526–34.

Seneviratne C, Dombi GW, Liu W, Dain J a. The in vitro glycation of human serum albumin in the presence of Zn(II). J Inorg Biochem. Elsevier B.V. Dec; 2011 105(12):1548–54.

Spiro RG. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 2002; 12(4):43R–56R.

Sudlow, G., Birkett, D. J., and Wade, D. N. (1975) The characterization of two specific drug binding sites on human serum albumin. Mol. Pharmacol. 11, 824 – 832.

Sugio, S., Kashima, A., Mochizuki, S., Noda, M., and Kobayashi, K. (1999) Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution, Protein Eng 12, 439-446.

Tom L. Van Belle, Ken T. Coppieters, and Matthias G. Von Herrath, Type 1 Diabetes: Etiology, Immunology, and Therapeutic Strategies, Physiol Rev 91: 79–118, 2011;

Tsuchiya S, Sakurai T, Sekiguchi S. Nonenzymatic glucosylation of human serum albumin and its influence on binding capacity of sulfonylureas. Biochem Pharmacol. 1984; 33(19):2967–71.

Vallner, J. J. (1977) Binding of drugs by albumin and plasma protein. J. Pharm. Sci. 66, 447 – 465.

Vitek, M.P., Bhattacharya, K., Glendening, J.M., Stopa, E., Vlassara, H., Bucala, R., Manogue, K., Cerami, A., 1994. Advanced glycation end products contribute to amyloidosis in Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4766–4770.

van Boekel, M.A., van den Bergh, P.J., Hoenders, H.J., 1992. Glycation of human serum albumin: inhibition by Diclofenac. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 201–204.

Yamasaki, K.; Chuang, V.T.; Maruyama, T.; Otagiri, M. Albumin–drug interaction and its clinical implication. Biochim. Biophys. Acta 2013, 1830, 5435–5443.

Yang F., Yao Zhang and Hong Liang, Interactive Association of Drugs Binding to Human Serum Albumin, Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 3580-3595.