Masteran d: Rusen Georgiana -Sorina [627797]

4 UNIVERSITATEA BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific: Conf. dr. Cimponeriu D ănuț
Îndrumător științific: Cerc. gr. III, dr . Consuel S. Ionică

Masterand: [anonimizat]
2017

UNIVERSITATEA B UCUREȘTI

2
FACULTATEA DE BIOLOGIE
GENETICĂ APLICATĂ ȘI BIOTEHNOLOGIE

Frecvența mutațiilor factorilor
trombofilici și implicarea lor în avortul
spontan

Coordonator științific: Conf. dr. Cimponeriu Dă nuț
Îndrumător științific: Cerc. gr. III, dr . Consuel S. Ionică

Masteran d: Rusen Georgiana -Sorina

BUCUREȘTI
2017
UNIVERSITATEA BUCURE ȘTI

3
CUPRINS
MULȚUMIRI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 4
ABREVIERI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 5
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 6
PARTEA I – PARTEA TEORETICĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 9
CAPITOLUL 1. AVORTUL SPONTAN . AVORTUL SPONTAN RECUR ENT ………………………….. ………………………….. . 9
1.1. Caracteristici generale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 9
1.2. CAUZE ale AS ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 10
CAPITOLUL 2. HEMOSTAZA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 15
2.1. Hemostaza fiziologică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 15
2.2. Hemostaza primară ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 16
2.3. Hemostaza secundară ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 17
2.4. Fibrinoliza ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 19
CAPITOLUL 3. PATOLOGIA HEMOSTAZEI ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 20
3.1. Tromboza ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 20
3.2. Sângerarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 21
CAPITOLUL 4. FACTORII TROMBOFILICI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 21
4.1. Factor V Leiden ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 21
4.2. Haplotipul HR2 FV (FVHR2) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 24
4.3. Factor II (Protrombina) ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 25
4.4. Metilentet rahidrofolat reductaza (MTHFR) ………………………….. ………………………….. …………………… 27
4.5. Cistation beta -sintetaza (CBS) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 29
4.6. Inhibitor al activatorului de plasminogen, tip 1 ( PAI-1) ………………………….. ………………………….. …… 30
4.7. Glicoproteina IIIa (GPIIIa) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 31
4.8. Enzima de conversie a angiotensinei (ACE) ………………………….. ………………………….. …………………… 32
4.9. Apopoliproteina E (ApoE) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 34
4.10. Angiotensinogenul (AGT) ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 36
4.11. Serin/Treonin kinaza ATR ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 38
4.12. Fibrinogen (FGB) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 39
4.13. Factor XIII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 41
PARTEA II – PARTEA PRACTICĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 43
CAPITOLUL 5 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 43
5.1. Ipoteza de lucru și obiective ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 43
5.2. Lotul de studiu și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 44
5.3. Prelucrarea statistică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 51
5.4. Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 52
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 66
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 67

4 MULȚUMIRI

În primul rând doresc să mulțumesc doamnei Dr. Cristiana Gug pentru permisiunea de a
analiza datele lotului clin ic de paciente. De asemenea mulț umesc domnului Dr. Lorand Savu,
director Genetic Lab SRL pentru permisiunea de a accesa datele clinice adiț ionale ale
pacientelor, fără de care nu aș fi putut efectua analizele din acest stud iu. Mulțumesc domnului
Dr. Consuel Ionică, CSIII pentru îndrumările și sugestiile referitoare la colectarea, analiza și
prezentarea datelor.

5
ABREVIERI

AS- Avort spontan
ASR – Avort spontan recur ent
FvW – Factorul von Willebrand
TF- Factor tisular
FX- Factor X
FXa- Factor X activat
FVII – Factor VII
FVIIa – Factor VII activat
FIX- Factor IX
FIXa – Factor IX activat
FV- Factor V
FVa- Factor V activat
PCA – Proteina C activă
tPA- Activatorul proteazic de tip tisular al
plasminogenului
uPA- Urokinaza activatoare de
plasminogen
COX – Ciclooxigenazei
ADP – Adenozin difosfatul
HNF – Heparină nefracționată
HGMM – Heparină cu greutate moleculară
scăzută FVL- Factorul V Leiden
TVP – Tromboza venoasă profundă
TV- Tromboza venoasă
FVHR2 – Haplotipul HR2 FV
FII- Factor II
MTHFR – Metilentetrahidrofolat reductaza
CBS – Cistation beta -sintetaza
PAI-1- Inhibitor al activatorului de
plasminogen, tip 1
GPIIIa – Glicoproteina IIIa
ACE – Enzima de conversie a angiotensinei
ApoE – Apopoliproteina E
LDLR – Lipoproteinele cu de nsitate mica
HLP III – Hiperlipoproteinemia de tip III
VLDL – Lipopoliproteine de densitate
foarte mic ă
AGT – Angiotensinogenul
ATR – Serin/Treonin kinaza ATR
FGB – Fibrinogen
FXIII – Factor XIII
FXIIIa – Factor XIII activat

6
INTRODUCERE

Avortul spon tan este definit ca o sarcină care se termină în mod spontan înainte ca
fătul să ajungă la o vârstă gest ațională viabilă. Această definiție este echivalentă din punct de
vedere clinic cu o sarcină care se încheie înainte de 24 de săptămâni de gestație (Regan și
Rai, 2000) .
Avortul spontan se clasifică în două mari categorii: avort spontan spo radic și avort
spontan recurent (Regan și Rai, 2000).
Avortul spontan sporadic (ASS) este cea mai frecventă complicație a sarcinii, una din
patru femei care rămân gravide, experimentând pierderea sarcinii. Marea majoritate a
avorturilor sporadice sunt precoce, și apar cu mult înainte de 12 săptămâni de gestație. ASS
după această perioadă, constituie nu mai mult de 1 – 2% din sarcini. Incidența avortului
recunoscut clinic în studiile populației generale a fost raportată în mod constant ca 12 – 15%,
dar această cifră este doar vârful aisbergului pierderii totale de produși de comcepție . S-au
dezvoltat teste extrem de sensibile, de beta gonadotropină corionică umană (b -hCG), pentru a
detecta prezența embrionului, iar aplicarea lor s -a realizat inițial ca un instrument de cerceta re
și, mai recent, pentru testul de sarcină, confirmând că amploarea pierderii sarcinii între
implantare și identificarea clinică a sarcinii este de 60%. Cel mai recent studiu realizat pe
pierderea sarcinii a demonstrat că, în sarcinile umane, cele mai de succes sunt cele în care
implantarea produsului de concepție în cavitatea uterină se realizează la 8 -10 zile după
ovulație, și că, atunci când implantarea are loc mai târziu, incidența de pierdere a sarcinii
foarte timpuriu este crescută (Regan și Rai, 200 0).
Spre deosebire de ASS, avortul spontan recurent (ASR) este relativ mai puțin
frecvent. Incidența ASR nu a fost niciodată determinată precis , în primul rând din cauza
opiniilor diferite cu privire la definiția acestuia. Atunci când este definit ca fiind pierderea a
trei sau mai multe sarcini consecutive, avortul spontan recurent afectează 1% din toate
cuplurile dar atunci sunt incluse femeile cu două sau mai multe pierderi de sarcină,
consecutive, amploarea problemei crește, incluzâ nd mai mult de 3% din toate cuplurile
(Regan și Rai, 2000). Dacă avortul spontan este întotdeauna un eveniment aleator, iar
incidența pierderii sarcinii clinice este de 15%, riscul teoretic de a experimenta trei avorturi
spontane succesive trebuie să fie 0,34%. Frecvența femeil or care duc la termen o sarcină, cu
trei avorturi spontane anterioare, a fost raportată ca fiind de 0,7%, și pentru că au fost incluse
în această cifră numai acele f emei care au o sarcină de succe s, este probabil ca această

7
frecvență să fie subestimată. Ac eastă cifră este semnificativ mai mare decât estimarea
teoretică de a pierde trei sau mai multe sarcini, și sugerează că pierderea sarcinii recurente nu
poate fi întotdeauna explicată prin ep isoade consecutive de ‘ghinion’ (Regan și Rai, 2000).
Există două dovezi clare care susțin punctul de vedere că, în plus față de cauzele
aleatorii, unele cupluri au un risc crescut de pierderi repetate. În primul rând sunt datele
anatomo -patologice , care demonstrează că riscul de avort spontan crește odată cu numărul de
avorturi spontane anterioare, sau cu caracteristicile pierderii de sarcină, cum ar fi indicele de
pierdere a sarcinii, cariotipul, sau morfologia. A doua dovadă vine din studii care au
demonstrat că femeile cu antecedente de pierderi repetate de sarcină a u caracteristici de
reproducere care sunt asociate cu o slabă prognoză pentru rezultatul sarcinii, distingându -se
de femeile care suferă avorturi spontane sporadice. Într -un studiu mare, realizat de Clifford și
colab., în 1994 , de 500 de cupluri, se face r eferire la o clinică de specialitate pentru avorturile
spontane, potrivit căreia s-a observat că în 6% din cupluri există antecedente de făt mort sau
de deces neonatal, la 2% din cupluri s-a realizat întreruperea sarcinii pentru anomalii fetale
iar 5% din cuplurile studiate au suferit anterior o sarcină ectopică. La 45% din cuplurile care
aveau un copil viu, au fost frecvente antecedentele de naștere prematură și greutatea mică a
sugarilor la naștere. Aproximativ o treime din această populație are o istori e de întârzieri de
concepție și investigații ginecologice anterioare pentru infertilitate. Cu toate acestea, în acest
studiu i mportanța relativă a anomaliilor genetice, anatomice, infecțioase, endocrine, anomalii
ale sistemului imunitar și idiopatice în et iologia avorturilor spontane recuren te s-a dovedit
greu de stabilit (Clifford și colab., 1994; Andersen și colab., 2001 ).
Cauzele medicale majore recunoscute pentru producerea de ASR sunt cele genetice
(anomalii genetice numerice și structurale), imune, en docrine, precum și anomaliile
trombofilice (Regan și Rai, 2000).
Antico rpii antifosfolipidici sunt strâns legaț i de anomaliile trombofilice . Sindromul
antifosfolipidic sau sindromul anticorpilor antif osfolipidici ( SAP sau SAAP ) este o stare
autoimună, hipe rcoagulabilă determinată de anticorpi antifosfolipidici. SAP provoacă
cheaguri de sânge (tromboză) în artere și vene, precum și complicații legate de sarc ină, cum
ar fi avortul spontan , livrarea prematură și preeclampsia severă (Tong și colab., 2014) .
Acce ptarea anticorpilor antifosfolipidici ca o cauză importantă și tratabil ă pentru ASR a
determinat cercetă torii să examineze rolul potențial pe care anomaliile trombofilice îl pot juca
în etiologia pierderii de sarcină. Acest lucru a condus la dezvoltarea ip otezei că unele cazuri

8
de ASR se datorează unui răspuns exagerat al hemostaticii față de sarcină, ceea ce duce la
tromboză placentară, infarct placent ar și ulterior la avort spontan (Regan și Rai, 2000).
Trombofilia moștenită este un ul din factor ii de risc pentru sarcină, ducând la tulburări
de reproducere și avort spontan recurent. Au fost raportate o serie de polimorfisme ale
genelor trombofilice, suspectate de asocierea cu ASR (Torabi și colab., 2012 ).
Pe baza acestor considerente ș i a datelor din litera tura referitoare la implicarea
factorilor de trombo ză cu baza ereditară î n avortul spontan și avortul spontan recurent, am
testat ipoteza de lucru conform că reia, î n lipsa unor factori de ordin citogenetic, prezenț a
alelelor de risc trombofilic se asociază cu pierderea de sarcină . Verificarea acestei ipoteze a
fost efectuată pe un lot de paciente care au efectuat un set de 15 teste genetice, inclusiv pentru
trobofilii ereditare în cadrul laboratorului Genetic Lab. Majoritatea probelor au provenit din
labora torul medical al Dr. Gug Cristina, Timiș oara, istoria perinatală ș i datele citogenetice ale
pacientelor fiind cunoscute.
În prezentul studiu, am comparat frecvențele alelelor pentru 6 factori de trombofilie :
Metilentetrahidrofolat reductaza ( MTHFR) polimor fismele C677T și A1298C ,
Angiotensinogenul ( AGT M235T ), Serin/Treonin kinaza (ATR -1 A1166C ), Fibrinogen
(FGB -455 G/A ), Factor XIII (FXIII V34L ) și combinații a le acestora la paciente cu ASR ș i
AS. Costurile ridicate ale kit -ului de 15 analize au î mpiedicat constituirea unui grup de
control, în acest scop utilizâ ndu-se frecvențele alelice ale populației generale raportate î n
baza de date 1000 genoame ( NCBI, 2017 ).

9
PARTEA I – PARTEA TEORETICĂ
Capitolul 1. Avortul spontan. Avortul spontan recuren t

1.1. Caracteristici generale
Avortul spontan este cunos cut și sub numele de boală abort ivă, și reprezintă moartea
naturală a unui embrion sau fetus înainte de a fi capabil să supraviețuiască ind ependent, în
mediul extrauterin (Williams și Wilkins , 2012) . Prin urmare, termenul include toate pierderile
de sarcină, din momentul conceperii până la 24 de săptămâni de gestație. Cu toate că doar
15% dintre sarcinile recunoscute clinic sufer ă avort spontan, pierderile totale de repr oducere
sunt mai aproape de 50 % (Kline , 1989; Wilcox și colab., 1988; Chard, 1991). În absența
criteriilor exacte de datare a sarcinii, avortul spontan poate fi definit ca eliminarea din uter a
unui produs de concepție cu o greutate mai mică de 500 g rame, (Jeve și Davies , 2014;
Bradley și colab., 2012), această situație putând fi interpretată ca un mecanism de salvare
pentru prevenirea evoluției unei sarcini anormale (Stirrat , 1990 ).
Există două tipuri de avort spontan: avort spontan sporadic și avort spontan recurent.
Avortul spontan r ecurent afectează aproximativ 1% din cupluri. În schimb, cel puțin 25%
dintre femei suferă una sau mai multe avorturi spontane sporadice, de obicei, din cauza
anomaliilor cromozomiale feta le aleatorii (Stirrat, 1990; Greenwold și Jauniaux , 2002) iar
riscul apariției l or crește odată cu vârsta mamei (Regan și Rai, 2000). Avortul spontan
recurent, este definit de trei sau mai multe pierderi de sarcină consecutive, și face parte dintr –
o serie de tulburări reproductive ca re au o bază comună (Stirrat, 1990; Gree nwold și
Jauniaux, 2002) . Dovezile anatomo -patologice sugerează că defectele în profunzimea și
calitatea de implantare a fătului duc la rezultate negative în toate cele trei trimestre de sarcină.
Cu toate acestea, mai multe caracteristici sugerează că pier derea recurent ă a sarcinii este o
entitate distinctă clinic, în sprijinul acestei ipoteze fiind aduse o serie de argumente statistice
și biologice: astfel, riscul de avort spontan este direct legat de re zultatele sarcinilor anterioare
(Risch și colab., 1988; Andersen și colab., 2000) .
În studiul realizat de Risch și colab., în 1988, pe un lot de 6,282 de paciente, s -a ajuns la
concluzia, în urma utilizării unor metode de regresie binomială cu risc relativ (similar
regresiei logistice) că riscul ca o pacient ă să sufere avort spontan crește direct proporțional cu
numărul de avorturi antecedente. De asemenea, incidența observată de avort spontan recurent

10
(1%) este mult mai mare decât cea așteptată din întâmplare în monoterapie (0,34%) .
Monoterapia se referă la tratamentul bazat pe un singur medicament sau o singură tehnică, de
exemplu monoterapia cu estrongeni, în care se administrează estrongen femeilor cu
insuficiență ovariană primară, o condiție de depreciere a funcției normale a ovarelor înainte
de vârsta de 40 de ani. În cazul în care are loc disfuncția ovarelor, acestea nu vor mai produce
cantități normale de estrogen și nici nu vor mai elibera ovule în mod regulat, infertilitatea
fiind cel mai frecvent rezultat al insu ficienței ovarie ne premature (Regan , 1991). Spre
deosebire de avortul spontan sporadic, avortul spontan recurent tinde să apară chiar dacă fătul
are un complement normal de cromozomi (Stirrat, 1990; Sullivan , 2004) ceea ce conduce la
ideea că recurența avortului are cauze adiționale.
Cinci car acteristici s -au dovedit a fi asociate cu avortul spontan recurent: cariotipu l
cromozomal normal al produsului de concepție , avorturile care au apărut după a 14 -a
săptămână de sarcină, întârzierea în concepere, și diagnos ticul incompetenței cervicale
(Strobino și colab., 1986; Jivraj și colab., 2001) .
Din punct de vedere istoric, avortului spontan recurent i -au fost atribuite fie cauze
genetice (structural sau numerice), infecțioase, endocrine, imune, fie cauze inexplicabile.
Un studiu de mare amploare, rea lizat pe 500 de cupluri a arătat că vârsta maternală, la
concepție, este un puternic factor de risc, independent, pentru avortul spontan. Riscul de avort
crește de la 9% la 20 -24 ani până la 75% la 45 de ani și mai în vârstă. Șansa unei sarcini de
succes l a femeile cu vârsta de peste 40 de ani sau mai mult este slabă, iar riscul de avort
spontan, și/sau sarcină ectopică, devenind mult mai mare decât la femeile de 30 ani
(Andersen și colab., 2001) .
Tulburările trombofilice sunt acum în atenția cercetătorilor pentru că, se pare că au un
rol important în vederea pierderii sarcinii recurente, iar acest lucru lărgește foarte mult
domeniul de aplicare al investigațiilor și opțiunilor de management pentru avortul spontan
recurent.
1.2. CAUZE ale AS
1.2.1. CAUZE GEN ETICE
1.2.1.1. Anomalii numerice cromozomale
Aneuploidia fetală este cea mai importantă cauză a avortului spontan înainte de zece
săptămâni de gestaț ie (Jacobs și Hassold , 1987 ). Între 50% și 60% din totalul avorturilor
spon tane sunt asociat e cu anomaliile citogenetice, c ele mai frecvente fiind trisomiile, urmate

11
de poliploidii și de monosomia X (Stirrat, 1990; Stephenson și colab., 2002; Kalousek și
colab., 1993; Fritz și colab., 2001) . Cele mai multe aneuploidii umane se dezvoltă în urma
erorilor ce apar în timpul diviziunii meiotice primare a ovocitului, care este inițiată prenatal și
nu este completată până la ovu lație. O rată crescută a spermatiilor cu anomalii cromozomiale
a fost de asemenea raportată la cuplurile cu avort recurent (Giorlandino și cola b., 1998), dar
numai 7% din anomaliile fetale s -au dovedit că prov in din erorile meiotice paterne (Robinson
și colab., 1999) . În ciuda asocierii recunoscute între avansarea vârstei mamei și a
aneuploidiilor fetale, sunt puțin cunoscu te mecanismele care sta u la baza acestei legături . O
ipoteză este faptul că femeile au un număr limitat de ovocite , și că odată cu creșterea vârstei,
numărul acestora scade (Warburton , 1989) . Astfel, femeile care au pierdut cel puțin un făt
trisomic au fost raportate cu o rezerv ă ovariană diminuată, intrând la menopauză la o vârstă
mult mai mai mică decât cele care nu a u un astfel de istoric (Freeman și colab., 2000; Kline și
colab., 2000) .
1.2.1.2. Anomalii structural cromozomale
Embrioscopia transcervicală a arătat că embrionii aneuploizi au o creștere
dezordonată și o dezvoltare anormală (precum anencefalia și displazia la nivelul membrelor),
și că anomalii similare se găsesc în până la 18% din sarcinile euploide, care se termină cu
avort spontan (Phillipp și colab., 2003) . Frecvența anomaliilor uterine congenitale, în general
nu este cunoscută, dar la femeile cu avort spontan recurent a fost rapor tată ca fiind între 1 -8%
și 37% (Grimbizis și colab., 2001; Salim și colab ,. 2003) .
Fibromul uterin este prezent la 30% dintre femei, iar efectul lui asupra rezultatelor de
reproducere este controvers at (Hart și colab., 2001) . Cele mai multe studii au raportat că
eșecul de implantare după fertilizarea in vitro este legat de fibroamele intr amurale sau
submucoase (Rackow și Taylor , 2006) .
Mecanismul sau mecanismele prin care fibromul uterin poate provoca pierderea unei
sarcini precoce sunt neclare. Tradițional, cercetătorii au postulat că fibromul uterin are un
efect mecanic, lucru ce împiedică implantarea embrionului. Expresia lui HOX10, o genă care
este implicată în implantare și controlează diferențierea celulelor , s-a dovedit că ar fi mai
mică la nivelul colului cu fib roame față de cel fără fibroame (Rackow și Taylor, 2006).

12
1.2.2. CAUZE IMUNOLOGICE

Cauzele recurente de avort infecț ios rămân speculative. Pentru ca orice agent infecțios
să fie implicat, acesta trebuie să fie capabil să persiste în tractul genital nedetectat și trebuie
să cauzeze puține simptome maternale. Din cauza faptului că toxoplasmoza, rubeola,
citomegalovirusul și herpesul, nu îndeplinesc aceste criterii, screening -ul de rutină pentru
aceste boli a fost acum abandonat (Regan și Jivraj , 2001) . Dovezile pentru vaginita bacteriană
ca o cauză de avort spontan pre coce secundar sunt puține (Camp și colab., 1996; Ralph și
colab., 1999) dar prezența vaginozei bacteriene în timpul primului trimestru de sarcină a fost
raportată în mod repetat, ca un factor de risc pentru avortu l târziu sau nașterea prematură
(Hay și colab., 1994) . Un studiu clinic randomizat, controlat, rea lizat pe un lot de 6120 de
femei, a arătat că riscul de naștere prematură și avortul spontan târziu este redus, prin
screening -ul feme ilor pentru vaginoza bacteria nă la începutul sarcinii și tratarea orală cu
clindamicină (Ugwumade și colab., 2003). Cu toa te acestea, opt studii clinice randomizate au
concluzionat că nu există nici un beneficiu în screening -ul și tratarea tuturor femeilor gravide
pentru vaginita bacteriană pentru a preveni nașterea prematură.
1.2.2.1. Disfuncția imună
Dintr -o perspectivă tra dițională imunologică, supraviețuirea fetusului semiallogenic
(fătul semiallogenic prezintă o parte din genele mamei, dar nu toate) depinde de supresia
răspunsului imun matern. Cu toate acestea, deși funcția limfocitelor se schimbă în t impul
sarcinii, nu s e realizează suprimarea generalizată a sistemului imun matern. Într -adevăr,
studiile terapeutice randomizate au respins utilitatea conceptului de imunizarea mamei,
pentru a preveni respingerea fătului dife rit din punct de vedere genetic (Scott, 2003; Ober și
colab., 1999) .
Înțelegerea contemporană a imunologie i reproductive postulează o interacțiune între
sistemul imunitar matern și antigenele fetale (Moffett și colab., 2002). Există centre de interes
cu privire la legătura dintre celulele killer naturale ș i eșecul reproducerii. Celulele killer
naturale sunt sunt un tip de limfocite citotoxice și fac parte din sistemul imunitar înnăscu t.
Atât sângele periferic cât și mucoasa uterină conțin celule naturale killer , dar celulele au
importante dife rențe fenotipice și funcționale (Koopman și colab., 2003 ).
Femeile cu avort spontan recurent au mai multe celule killer naturale în mucoasa
uterină față de c ele fără avort spontan recurent (Clifford și colab., 1999; Quenby și colab.,
1999; Lachapelle și colab., 1996) . Nu există nici o asociere între nivelul de celule killer
naturale din sângele periferic și cele de la nivelul mucoase i uterine, astf el încât nivelurile de

13
celule killer naturale din sângele periferic nu sunt predictive pentru rezultatul sarcinii la
femeile cu avort spontan recurent. Prin urmare, valoarea testării nivelului de celule killer a
femeilor cu avorturi recuren te, este interpr etabilă (Moffett și colab., 2004 ).
Celulele killer naturale din mucoasa uterină contribuie la răspunsul imun al
citokinelor, de la interfaț a materno -fetală. Acest răspuns este, în general, fie de tip T -helper -1
(Th-1) (cu producerea de interleukină 2, inte rferon și factor de necroză tumorală α [TNFa]),
fie de tip T -helper -2 (Th -2) (cu producerea de interleukine 4, 6 și 10).
O sarcină normală ar putea fi rezultatul unui răspuns al citokinelor de tip Th -2, în care
anticorpii de blocare fetali sunt mascați de antigenele trofoblastice pentru recunoașterea
imunologică, de către un răspun s celular citotoxic mediat Th -1 (Wegmann și colab., 1993) .
Prin contrast, femeile cu avort spontan recurent au tendința de a produce un răspuns
predominant de tip Th -1 atât în cadrul perioadei de implantare embri onară cât și în timpul
sarcinii (Reinhard și colab., 1998 ; Wolff 2000 ; Lim și colab., 2000; Raghupathy și colab.,
2000 ).

1.2.3. CAUZE ENDOCRINOLOGICE

Tulburările endocrine au fost postulate în a provoca pierderea recure ntă a sarcinii , dar
puțin e rapoarte există ca și control (Mills și colab., , 1988; Rosenn și colab., 1994). O meta –
analiză a raportat asocierea între prezența autoanticorpilor tiroidieni, antecedente de unul sau
două avorturi spontane, și rezultatul următ oarei sarcini (Prummel și Wiersinga, 2004;
Rushworth și colab., 2000) .
Prolactina are un rol atât în ovulație cât și în maturarea endometrială.
Hiperprolactinemia poate produce avort spontan recurent, iar tratamentul cu bromocriptene,
care suprimă secreția d e prolactină, reduce în mod semn ificativ rata de avort spontan
(Hirahara și colab., 1998) . Lipsa de exprimare a prolactine i în cursul fazei luteale a ciclului
menstrual a fost de asemenea asoci ată cu avortul spontan recurent (Garzia și colab., 2004) .
Legăt urile posibile între ovarele polichistice, diferitele endocrinopatii asociate cu
cancerul ovarian polichistic, și avorturile recurente au fost investigate în ultimele trei decenii.
Prevalența ovarelor polichistice este în mod semnificativ mai mare la femei le cu avort
recurent (40%) decât la femeile cu un istoric fără complicații de reproducere (22%). Cu toate
acestea, morfologia ovariană per se nu este un factor predictiv al rezultatului pentru sarcinile
viitoare (Ra și colab., 2000) . Un studiu clinic rando mizat controlat, realizat pe un lot de 68 de

14
femei, din diverse zone ale Londrei, a raportat că suprimarea hormonului luteinizant endogen
nu îmbunătățește rata de supraviețuire a fătului (Clifford și colab., 1996).
Atenția se concentrează acum asupra legăt urii dintre sindromul ovarelor polichistice,
rezistența la insulină, și pierderea sarcinii. Rezistența la insulină este frecvent întâlnită la
femei cu avorturi recurente, fiind astfel asociată cu o rată crescută de avort spontan (Craig și
colab., 2002) .

1.2.4. CAUZE HEMATOLOGICE

Sarcina este o stare de hipercoagulabilitate (Hellgren 1996; Stirling și colab., 1984 ).
Avantajul evolutiv al unei astfel de schimbări în hemostază este acela de a contracara
instabilitatea inerentă, asoc iată cu placentația hemoco rială. Primele studii ale prevalenței
anomaliilor de coagulare la femeile cu antecedente au apărut în mijlocul anilor 1990 ( Sanson
și colab., 1996; Preston și colab., 1996) .
Au fost identificate trei mutații trombofilice comune asociate cu patologii ale
coagulării : Factorul V (Leiden) G1691A; Factorul II (Protrombina) G20210A și
Metilentetrahidrofolat reductaza C677T. De atunci, multe publicații au raportat rezultate
contradictorii, conform că rora defectele de coagulare individuale sunt fie la fel de frecven te
fie mai frecvente la femeile cu avort spontan recurent față de femeile de tip control (fără
avorturi spontane recurente).
Datele privind frecvența trombofiliei genetice nu sunt concludente datorită
dimensiunii reduse a studiilor individuale, potrivirii slabe a cazurilor și controalelor precum
și heterogenității etice . Cu toate acestea, două meta -analize au confirmat o asociere între
avortul spontan recurent și mutațiile în genele pentru Factorul V Leiden și Protrombină
(Kovalevsky și colab., 2004 ), exis tând puține date cu privire la rezultatul sarcinilor netratate,
la femei cu defecte genetice trombofilice.

15
Capitolul 2. Hemostaza

2.1. Hemostaza fiziologică
Hemostaza este procesul fiziologic care determină oprirea sângerării la nivelul unei
leziuni, menținând în același timp un flux sanguin normal. Pierderea sângelui este oprită prin
formarea unui dop hemostatic. Endoteliul din vasele de sânge menține o suprafață
anticoagulantă, ce servește pentru a menține sângele în stare fluidă, dar dacă vasul san guin
este deteriorat, componentele matricei subendoteliale sunt expuse. Mai multe dintre aceste
componente activează cele două procese principale de hemostază pentru a iniția formarea
unui cheag de sânge, compus în principal din trombocite și fibrină. Aces t proces este strict
controlat astfel încât se activează în câteva secunde de la lezare, și este localizat la nivelul
leziunii (Gale , 2011) .
Există două procese principale ale hemostazei , primară și secundară : Hemostaza
primară se referă la agregarea tromb ocitelor și formarea dopului trombocitar. Trombocitele
sunt activate într -un proces cu multiple fațete, și ca urmare, acestea aderă la nivelul leziunii,
aderă unele de altele ș i se conectează cu leziunea. Hemostaza secundară se referă la
depunerea de fibri nă insolubilă la nivelul leziunii , generată în urma unei cascada proteolitice
de coagulare. Fibrina insolubilă formează o rețea c are este încorporată în interior ul și în jurul
dopului de trombocite. Aceste ‘’ochiuri de fibrină’’ servesc la consolida rea și stabiliza rea
cheagul ui de sânge. Cele două procese ale hemostazei, se întâmplă simultan și sunt
interconectate mecanic. Calea de fibrinoliză joacă, de asemenea, un rol important în
hemostază (Gale, 2011).
În situații patologice, atât procesele hemostatice cât și cel de fibrinoliză pot fi afectate,
efectele depinzând de modificări ale succesiunii în care se produc, ale vitezei de activare, a
intensității și frecvenței cu care se produc, și a locației unde apar. Dereglarea acestor procese
poate conduce la f ormarea trombusului patologic, numită tromboză, sau sângerări patologice .
Complexitatea acestor sisteme a fost din ce în ce mai aprofundată în ultimele câteva decenii
(Gale, 2011).

16
2.2. Hemostaza primară
Trombocitele (sau plachetele) sunt mici fragmente de celule anucleate care iau naștere
din megacariocite, celule sanguine specializate, mari, poliploide cu ori ginea î n măduva
osoasă (Schulze și colab., 2005). Trombocitele sunt preze nte în număr de 150 -400.000 pe
cm3 de sânge și pot circula liber timp de z ece zile. Într -un vas de sânge sănătos, și în fluxul
sanguin normal, plachetele nu aderă la suprafețe, și nu sunt agregate între ele. Cu toate
acestea, în cazul unei leziuni, plachetele sunt expuse la matricea subendotelială, și astfel se
declanșează adezi unea și activarea plachetelor (Zucker -Franklin, 2000) .
Receptorii multiplii de pe suprafața trombocitelor sunt implicați în aceste interacțiuni
adezive, și acești receptori sunt vizați de mai multe proteine adezive. Cheia pentru toți acești
receptori este faptul că interacțiunea adezivă are loc numai în caz de vătămare a vasului de
sânge. Această restricție este menținută în mai multe moduri (Jackson, 2007; Ruggeri și
Mendolicchio , 2007 )
Factorul von Willebrand (FvW) se leagă la receptorul GPIb -IX-V specifi c, printr -o
interacțiune între GPIbα și domeniul A1 al FvW. FvW este o proteină cu o masă moleculară
mare, multimerică, secretată de celulele endoteliale și de megacariocite; FvW este mereu
prezent în stare solubilă în plasmă și în stare imobilizată în mat ricea subendotelială (Ruggeri,
2007) . Cu toate acestea, FvW solubil în circulație, nu se leagă cu afinitate ridicată la GPIbα .
Interacțiunea cu afinitate ridicată poate fi dependentă de stresul exercitat de sânge le care
curge cu FvW imobilizat (Yago și colab., 2008; Siedlecki și colab., 1996).
Receptorul GPVI este constitutiv activ în sânge , dar este activat doar în prezența
ligandului său, colagenul, acesta din urmă fiind prezen t în matricea subendotelială. Numai
expunerea colagenului în caz de rănire cond uce î n mod normal la activarea receptorului
GPVI . GPVI și GPIb -IX-V sunt factori critici pentru adeziunea plachetelor la nivelul matricei
subendoteliale la locul leziunii și pentru activarea ulterioară (Kehrel și coab. 1998; Nieswandt
și colab., 2001).
Activarea trombocitelor este critică pentru agregare. În special integrinele, αIIbβ3,
α2β1 și avp3 sunt în mod normal prezente pe suprafața plachetelor într -o formă inactivă, dar
activarea plachetară induce o tranziție conformațională la acești receptori care expun
situsurile de legare a ligandului (Luo și colab., 2006; Xiao și colab., 2004) . αIIbβ3 este
probabil cel mai important dintre acești receptori, deoarece este prezent în cea mai mare
densitate, pe suprafața plachetelor. În plus, αIIbβ3 se leagă la mai mulți liganzi care
promovează agregarea trombocitelor, aceștia incluzând fibrinogenul, FvW, colagenul,

17
fibronectina și vitronectina (Emsley și colab., 2000; Lam și colab., 1989; Sonnenberg și
colab., 1988; Varga -Szabo și colab., 2008).
Activarea plachetel or din apropiere a leziunii, este esențială pentru agregarea
ulterioară și propagarea dopului de trombocite. Această activare este mediată în principal de
agoniștii eliberați de trombocitele activate, care acționează asupra receptorilor cuplați cu
proteina G. ADP este eliberat din granulele dense de trombocite și se leagă de receptorii
P2Y1 și P2Y12 (Mills, 1996). Tromboxanul A2 este sintetizat de novo de trombocitele
activate și se leagă de receptorul tromboxan în primul rând, și de alți receptori
prostagla ndinici într -o măsură mai mică, iar local serotonina este de asemenea secretată din
granule dense și contribuie la activarea trombocitelor (Hanasaki și colab., 1988).
Un alt mecanism critic al activării plachetare care face legăt ura dintre hemostaza
secund ară de funcția plachetară , este activarea trombinei. Trombina este terminalul serin
protează al cascadei de coagulare. Trombina scindează 2 proteaze, PAR1 și PAR4. Acestea
sunt, de asemenea, receptori cuplați cu proteina G, și clivajul cu trombină expune o nouă
catena N -terminală, ce servește ca un ligand priponit pentru a activa receptorul. Toți acești
receptori inițiază căi de semnalizare atunci când sunt ligați, și au ca rezultat secreția de
granulație plachetară, activarea integrinelor și remodelare a trombocitelor citoscheletului
(Kahn și colab., 1998; Vu și colab., 1991; Brass, 2000).
Astfel, în rezumat, adeziunea plachetelor este inițiată prin legarea GPIbα la factorul
FvW imobilizat și legarea GPVI la colagen, care este expus în urma unei accidentări
endoteliale. Aceste trombocite și alte trombocite locale sunt apoi activate, iar adeziunea și
agregarea este întărită și extinsă prin conexiuni plachetare trombocitare . Aceste conexiuni
sunt între αIIbβ3 legate la fibrinogen, FvW, fibronectină sau vitrone ctin precum și între avp3
legat la vitronectin sau trombo spondin, cu α5β1 -fibronectina. I nteracțiunile cu α6β1, pot, de
asemenea, juca un rol important. În plus, aderarea la colagenul subendotelial este întărită prin
interacțiunea α2β1, integrină și colage n. Acest dop de trombocite este, de asemenea, stabilizat
prin depunerea de fibrină insolubilă generată de cascada de coagulare (Gale, 2011).

2.3. Hemostaza secundară
Hemostaza secundară rezultă din cascada de coagulare serin protează care culminează
cu cl ivajul fibrinogenului solubil, de către trombină. Clivajul generează fibrina insolubilă
care formează o plasă de fibrină reticulată la locul leziunii. Generarea de fibrină apare

18
simultan cu agregarea plachetară. În vasele de sânge intacte și sănătoase acea stă cascadă nu
este activată, mai multe mecanisme de anticoagulare prevenind activarea acesteia.
Mecanismele includ prezența trombomodulinei și a proteoglicanilor heparan sulfat l a nivelul
endoteliului vascular (Falati și colab , 2002; Furie, 2009).
Trombom odulina este un cofactor pentru trombina care se transformă dintr -un
procoagulant într -un anticoagulant prin stimularea activării proteinei ant icoagulante serin
protează C (Esmon și colab , 1981) .
Când sistemul vascular este rănit, sângele este expus la țe suturile extravasculare, care
sunt bogate în factorul tisular (TF), un cofactor pentru factorul serin proteaza VIIa.
Complexul format din TF și factorul VIIa activează factorul X și factorul IX. Această cale de
activare este numită calea extrinsecă de coag ulare. Factorul IX activează, de asemenea,
factorul X, în prezența factorului VIIIa, cofactor pentru factorul X. Factorul Xa, de asemenea,
în prezența cofactorului său Va, activează protr ombina pentru a genera trombina (Kirchhofer
și colab.,1996; Dahlback, 2000).
Trombina este o serin protează centrală în cascada de coagulare, și execută mai multe
reacții critice. Trombina scindează fibrinogenul pentru a genera fibrina insolubilă. Trombina
activează trombocitele prin clivajul PAR1 și PAR4 și este de asemene a responsabilă pentru
activarea printr -un feedback pozitiv al coagulă rii, proces critic pentru propagarea cheagului
format. Trombina activează factorul XI, care mai apoi activează factorul IX, însa trombina
activează deasemenea cofactorii VIII și V. Aceast ă cale a fost numită calea intrinsecă de
coagulare, dar este mai potrivit să ne gândim la ea ca la o buclă de feedback pozitiv. Cele mai
multe modele s -au bazat pe celulele de bază ale hemostazei, concentrându -se asupra
importanței faptului că aceste reacț ii sunt controlate prin localizarea lor pe diferite suprafețe
celulare (Kahn și colab ,1998; Lane și colab, 2005; Bouma și colab , 1998).
Coagularea este inițiată de cofactorul TF (pe calea extrinsecă), care este o proteină
transmembranară prezentă pe fibrob laste și alte țesuturi extravasculare. Factorul Xa generat
aici, formează complexul protrombinază, pe aceste suprafețe, suficiente pentru a genera doar
o cantitate mică de trombină. Apoi, amplificarea și propagarea coagulării prin bucla de
feedback pozitiv apare pe suprafața trombocitelor, care sunt activate în apropierea locului de
leziune, pe urmele trombinei și prin ade rarea la matricea extracelulară. Ca urmare ,
complexele active de coagulare din această de buclă de feedback pozitiv de pe supraf ața
tromb ocitelor sunt activate (Hoffman și colab, 2001).

19
În cele din urmă, trombina joacă un rol important în reglarea coagulării prin legarea
de trombomodulina de pe celulele endoteliale și apoi act ivarea proteinei C activă (PCA)
(Esmon și colab , 1981). Sistemul a nticoagulant de proteină C activă este important în
reglementarea cascadei de coagulare. PCA scindează și inactivează cofac torii procoagulanț i
VIIIa și Va (Fulcher și colab. , 1984; Guinto și colab. , 1984) . Această reacție necesită, de
asemenea, un cofactor , proteina S; în p lus, factorul V asigură funcția anticoagulantă ca
cofactor pentru PCA / proteină S în inactivarea factorului Vllla și factorul Va. Aceste
complexe dintre proteaze și cofactori (procoagulant și anticoagulant) se formează pe
suprafețele de membrană încărcate negativ, care sunt furnizate de trombocitele activate.
Localizarea r eacțiilor în cascada coagulă rii este critică în limitarea coagulării la locul leziunii
(Gale, 2011).
Cascada de coagulare este de asemenea reglată prin inactivarea tutu ror serin
proteazelor de către inhibitorii de serin protează. Cei mai mulți dintre acești inhibitori sunt
din familia inhibitorilor serpin. Antitrombina este probabil cea mai importantă dintre aceștia.
Antitrombina inhibă trombina și factorul Xa, precum fa ctorul IXa și factorul XIa în prezența
heparinei sau heparan sulfatului. Alte serpine care joacă un rol important în coagulare sunt
cofactorul II al heparinei (inhibitor de trombina), proteina dependentă de proteaza Z
inhibitoare (inhibitor al factorului X a), inhibitor al proteinei C (inhibitor al PCA) și
inhibitorul C1 (inhibitor factor Xla). Doi inhibitori non -serpin, sunt inhibitorii căii factorului
tisular și alfa -2-macroglobulina, care de asemenea, joacă un rol important, în inhibarea
factorului Xa și a trombinei (Gale, 2011).
2.4. Fibrinoliza
Rolul sistemului fibrinolitic este acela de a dizolva cheagurile de sânge în timpul
procesului de vindecare a rănilor și pentru a preveni formarea cheagurilor de sânge în
interiorul vaselor sanguine sănătoase. Sis temul fibrinolitic este compus în principal din trei
serin proteaze, care sunt prezente ca zimogene (proenzime) în sânge. Plasmina scindează și
desco mpune filamentele de fibrin ă. Plasmina este generată din zimogena denumită
plasminogen, de activatorul prot eazic de tip tisular al plasminogenului (tPA) și de urokinaza
activatoare de plasminogen (uPA). tPA și plasminogenul converg și aderă împreună pe
suprafața unui cheag de fibrină . tPA apoi activează plasminogenul, care ulterior scindează
fibrina. uPA active ază plasminogenul în prezența receptorului UPA, care se găseș te pe

20
diferite tipuri de celule . Toate cele trei proteaze serice sunt reglate de serpinele prezente în
sânge (Rau și colab., 2007).

Capitolul 3. Patologia Hemostazei

Hemostaza este o funcție de echilibru între sistemele procoagulante (trombocite,
cascada de coagulare) și sistemele anticoagulante (PCA / proteină S, fibrinoliză, serpine). În
cazul în care hemostaza este în dezechilibru, din cauza unui defect într -unul dintre aceste
sisteme, atunci apare fie tromboza (prea multă coagulare) fie sângerarea (nu este suficientă
coagulare ) (Gale, 2011).
3.1. Tromboza
Trombii arteriali sunt compuși în mare parte din trombocite agregate, în timp ce
trombii venoși sunt compuși din mai multe filament e de fib rină prinse cu celulele roșii din
sânge. Compoziția acestor diferiți trombi este dictată de diferitele condiții ale circulației
arteriale și venoase. Un aspect important este fluxul sanguin, cu debite mai mari și, prin
urmare, forțe sup erioare în circulați a arterial ă (Tangelder și colab. , 1988). Clasic, tromboza
arterială și tromboza venoasă sunt considerate a avea diferiți factori de risc. În orice caz,
studiile recente au sugerat că unii dintre factorii de risc clasici pentru trombozele arteriale,
cum ar fi obezitatea și colesterolul ridicat, sunt de asemenea factori de risc pentru tromboza
venoasă (Franchini și colab. , 2008). Factorii de risc clasici pentru tromboza venoasă (cum ar
fi cancerul, o intervenție chirurgicală, imobilizarea, fracturi și sarcină ) dau o stare de
hipercoagulabilitate și au ca rezultat o tendință crescută pentru activarea cascadei de
coagulare (Bauer, 2000).
Tromboza arterială este tratată în general cu medicamente care inhibă agregarea
plachetară. Acidul acetilsalicilic (aspirina) este un inhibitor al ciclooxigena zei (COX) și
inhibă ireversibil COX -1 în calea de sinteză a tromboxan A2. Un alt inhibitor, ș i anume
clopidogrel ul, blochează ade nozin difosfatul (ADP), precum ș i activarea plachetelor p rin
inhibarea receptorului ADP (Gale, 2011).
Tromboza venoasă este tratată cu medicamente care inhibă cascada de coagulare.
Tratamentul aceasta a inclus heparina nefracționată (HNF), care stimulează inhibarea
coagulării de către antitrombină (Damus și colab. , 1973).

21
3.2. Sângerarea
Principale le tulburări hemoragice sunt moștenite genetic. Hemofilia rezultă din
defecte ce apar în hemostaza secundară. Hemofilia A se datorează deficitului de factor VIII,
iar hemofilia B apare ca urmare a deficitului de factor IX. Factorul VIII activat și factorul IX
activat, formează împreună complexul X intrisec pe suprafețe ale membr anei activate care
este critic î n bucla de feedback pozitiv de coagulare a sângelui. Prin urmare, deficiența
acestor proteine determină un fenotip caracterizat prin exces de vânătă i, sângerări spontane la
nivelul articulațiilor, mușchilor, organelor interne și creierului. Factorul VIII și factorul IX
sunt ambii codificați de gene X -likate (Dahlback, 2000). Astfel, hemofilia este exp rimată în
primul rând la bărbați , cu o prezență a h emofilie i A la aproximativ 1 din 5000 de indivizi și a
hemofilie i B la aproximativ 1 din 20.000. Cu toate acestea, mai multe mutații, fie ale
factorului VIII sau IX, au fost identificate, și nu toate dintre ele duc la pierderea completă a
proteinei sau a f uncției proteinei. În aproape jumătate din cazurile de hemofilie A pacienții au
suferit mutații de novo, nefiind moștenite de la părinții lor. În funcție de mutație, hemofilia
poate fi severă (<1% ), mode rată (1 -5%) sau ușoară (5 -20%) (Mannucci și colab. , 2001).
Hemofilia A și hemofilia B sunt tratate în principal, prin infuzie de factor VIII
recombinant sau factorul IX. Înainte ca acești 2 factori să fie disponibili pentru perfuzie,
hemofilicii au avut o speranță de viață mult mai mică și o calitate a vieț ii scăzută.
Hemostaza a fost și este studiată la scară largă. În acest moment avem o imagine
foarte detaliată a evenime ntelor moleculare și celulare care joaca roluri importante în
hemostaza normală și patologică (Mannucci, 2008).

Capitolul 4. Factorii tr ombofilici
4.1. Factor V Leiden
Factorul de coagulare V (FV), de asemenea, cunoscut sub numele de proaccelerin sau
factorul labil, este sintetizat în ficat și circulă sub forma unui lanț polipeptidic unic, într -o
formă inactivă procoagulantă. Deși majorita tea FV este prezent în plasmă, aproximativ 20%
din FV circulant se găsește în particulele alfa. Plachetar, FV este parțial proteolizat și este
stocat legat la multimerii proteici din interiorul acestor granule. F actorul V joacă un rol -cheie
sub form ă de cofactor al complexului protrombinază care scindează și activează protrombina
în trombină, ce ea ce conduce la formarea de cheaguri sanguine. Factorul V Leiden (FVL) este

22
numele unei mutații specifice a genei care duce la o stare de hipercoagulabilitate cu
consecințe clinice grave. La mai puțin de două decenii de la descoperirea sa, fiziopatologia,
consecințe le clinice, și managementul terapeutic al statului trombofilic asociat acestei condiții
rămâne un su biect de dezbatere . Coagularea excesivă, are loc în ac eastă tulburare, iar FV este
în mare parte limitat la teritoriul venos și este cunoscut a fi unul din ce i mai frecvenți
contribuabili în a provoca tromboza venoasă profundă (T VP) (Perez -Pujol și colab., 2012) .
4.1.1. Rolul FVL în hemostază
Factorul V circu lă în sânge sub formă inactivă până când sistemul de coagulare este
activat datorită unei deteriorări la nivelul vaselor de sânge. Într -o stare normală, FV activat
(FVa) acționează ca un cofactor, care interacționează cu factor ul activ X pentru a converti
enzima in activă, protrombina în trombină. Trombina, la rândul ei scindează fibrinogenul în
fibrină. Apoi, fibrina polimerizează, ceea ce duce la formarea cheagului sanguin. Participarea
proteinei C activată (PCA) ca anticoagulant natural, limitează gradul de coagulare prin
clivarea și degradarea FV. Proteina C activată (PCA) scindează FV la anumite situsuri (la
poziția 506 din proteină) și dereglează, prin urmare, funcția sa, împiedicând creșterea
excesivă a cheagului. Clivajul FV permite, de asemenea, inac tivarea factorul ui VIII, o altă
proteină esențială pentru procesul de coagulare a sângelui normal. PCA este în
imposibilitatea de a inactiva FV atunci când se produce mutația pe această proteină de
coagulare: schimbarea unică a unui aminoacid în poziția 50 6; o arginină (Arg) este înlocuită
cu o glutamină (Glu). Ca urmare a acestui fapt, mutația duce la pierdere funcției
anticoagulante a cofactorului FV iar mecanismele de coagulare rămân active pentru perioade
prelungite și determină creșterea ulterioară a f ormării cheagurilor de sânge (Perez -Pujol și
colab., 2012) .
4.1.2. Genetica FVL
Gena pentru factorul V este situată la nivelul cromozomului 1 (1q23). Din punct de
vedere genetic , aceasta este omoloagă cu gena factorului VIII de coagulare. Această genă se
întinde pe 70 kb, fiind formată din 25 de exoni, iar proteina rezultată are o masă moleculară
relativă de aproximativ 330kDa. Proteina FV este formată din șase domenii: A1 -A2-B-A3-
C1-C2.
Domeniile A sunt omoloage cu domeniile A ale ceruloplasminei, care est e proteina de
legare a cuprului, și formează un t rimer ca în proteine. Un ion de cupru este legat în interfața
A1-A3 și A3 interacționează cu plasma (Perez -Pujol și colab., 2012) .

23
Domeniile C aparțin familiei domeniului discoidin de legare a fosfolipidelor , iar
domeniul C2 mediază legarea membranei. Domeniul B -C-terminal acționează ca un cofactor
pentru activarea an ticoagulantă a proteinei C de că tre proteina S. Activarea FV se face prin
clivarea și eliberarea domeniului B, după care proteina nu mai ajută l a activarea proteinei C.
În această ultimă stare, proteina este împărțită într -un lanț greu, format din domeniile A1 -A2,
și într -un lanț ușor, format din domeniile A3 -C1-C2. Ambele formează necovalent un
complex dependent de calciu. Acest comple x este fact orul pro -coagulant V (Perez -Pujol și
colab., 2012) .
O mutație punctiformă în gena pentru factorul d e coagulare V îl face rezistent la
scindare , prin proteina C activată. Această mutație, numită Leiden, a fost descrisă pentru
prima d ată în 1994 de Bertina și colab., și este cauza principală a trombofiliei moștenite, fiind
găsită la 20 -60% dintre pacienții cu antecedente personale sau familiale de tromboză venoasă
profundă. Caracterul se transmite pe model de tip autosomal dominant . (Stephen Bare și
colab., 2000)
Mutația FVL este în prezent cel mai frecvent factor de risc cunoscut pentru tromboza
venoasa (TV). Factorul V Leiden este o condiție autozomal dominantă prezentă doar la
caucazieni, iar prevalența acesteia variază între 2% până la 15%. S -a demonstrat că mutația
este mai puțin frecventă în alte populații, cum ar fi hispanicii și afro -americanii, și este
extrem de rară la persoanele de origine asiatică. Polimorfismul a luat naștere de la o sursă
comună, în urmă cu aproximativ 30 000 de ani ( efect fondato r) și 3 -8% dintre persoanele cu
origine europeană și 5% din caucazieni din America de Nord transportă o copie a FVL
mutant, în timp ce aproximativ 1% ( circa 5.000 persoane ) au două copii ale mutației (Perez –
Pujol și colab., 2012) .
Prezența mutației FVL cre ște considerabil riscul de a dezvolta cheaguri de sânge
anormale. Cele mai frecvente manifestări clinice ale FVL sunt superficiale și /sau TVP. De
fapt, până la 30% dintre pacienții care prezintă TVP au fost diagnosticați cu această afecțiune.
Riscul de a d ezvolta episoade trombotice depinde de faptul dacă o persoană are una sau doua
copii ale mutație FVL. Moștenirea a două copii ale mutației, crește semnificativ riscul de a
dezvolta complicații trombotice. În general, cei care sunt homozigoți pentru alela m utantă
prezintă un risc ridicat de a dezvolta cheaguri anormale (50 -100 ori) față de cei care sunt
heterozigoți pentru mutație (5 -10 or i), având de fapt un risc foarte scăzut pentru TV. Este
important să se ia în considerare faptul că asocierea combinată a mutației cu alți factori de
risc pentru TV, cum ar fi vârsta, obezitatea , fumatul, utilizarea de pilule contraceptiv e

24
hormonale pe bază de estrogen , intervențiile chirurgicale recente, sau terapia de substituție
hormonală, pot spori riscul unei individual e TVP. În plus, asocierea mutației FVL cu o altă
mutație, a unei gene adiționale, implicată în sistemul de coagulare , conduce la un risc extrem
de ridicat de apariție de cheaguri anormale. Astfel , coexistența mutație FVL în stare
heterozigotă și a mutației G20210A în gena protrombinei este cea mai frecventă anomalie
asociată cu TVP. De asemenea, combinații de FVL, antitrombină , deficiențele și
hiperhomocist einemia de proteină C sau proteină S, s -au dovedit a avea ca rezultat o creștere
de 5 până la 10 ori a riscului relativ de tromboză (Perez -Pujol și colab., 2012) .
Cu toate că , anterior , s-a determinat că sinteza FV , are loc în megacariocite,
Christiella și colab., (2003 ) au fost în măsură să demonstreze că FV plachetar are originea în
plasmă . Cu toate aces tea, o mică proporție de FV se găsește în granulocitele alfa. Gould și
colab., (2004) au furnizat o dovadă puternică că, odată ce FV este stocat în granulocitele alfa,
el are un substrat diferit. Odată ce este endocit at de megacariocite și livrat plachete lor, FV
este scindat drept cofactor parțial activ, care pare a fi mai rezistent la inactivarea PCA.
Această constatare a s prijinit cercetarea Camire și colab., ( 1998) , care a u demonstrat că
inactivarea FV derivată din plachete nu este niciodată completă . Conform studiilor anterioare,
FVa care se exprimă pe plachetele activate, poate fi protejat de inactivare prin PCA. Mai
multe experimente au demonstrat, de asemenea, că plachetele derivate din microp articule au
condus la creșterea nivelurilor de inactivare a cofactorului, suprimând protecția aparent
dezvoltată de plachetele intacte. Acesta este un punct important a fi luat în considerare,
deoarece nivelurile crescute de plachete care circulă libere au fost raportate la pacienții
diagnosticați cu FVL.
Studiil e ulterioare au demonst rat că nivelurile de plachete pot corela cu concentrațiile
plasmatice ale FVL sugerând astfel că raportul FVL / FV ar putea fi un parametru pentru a
prezice riscul d e tromboză la purtătorii de FVL (Perez -Pujol și colab., 2012)

4.2. Haplotipul HR2 FV (FVHR2)
Recent, a fost raportat un haplotip complex al factorului V, care include 13
polimorfisme diferite de -a lungul genei. 7 din cele 13 modificări de bază conduc la o
schimbare a aminoacizilor, și conduc la modif icarea funcțională a p roteinei (Castaman , și
colab., 2003 ).

25
Acest haplotip este caracterizat printr -o singură substituție de bază numită R2
(A4070 G) în domeniul B al proteinei. Prezența unei mutații (A6755G; 2194Asp ->Gly), în
apropierea capă tului C terminal, a condus la emiterea unei ipoteze, că aceasta influențează
plierea proteinelor și a glicozilării , fiind posibil responsabil ă pentru trecerea dintr -o izoformă
în alta a factorului V (FV1/ FV2) (Pecheniuk , și colab., 2001 ).
FVHR2 scade activitatea de co -factor de degradare a PCA, mediată de FVIIIa , și
crește raportul factorului V1 la factorul V2, primul fiind o izoformă mai procoagulantă.
Rezistența crescută la PCA și reducerea antigenului pentru FV sau activitatea coagul antă, au
fost asociate cu FVHR2 (Castaman , și colab., 2003 ).
Mai multe studii au furnizat rezultate contradi ctorii cu privire la haplotipul în sine, și
anume dacă acesta induce un risc semnificativ de TVP. În orice caz , s-a presupus că FVHR2
sporește riscul de TVP conferit de FV Leiden, din moment ce acest efect a fost observat într –
un mecanism de control al cazurilor studiate. Mecanismele prin care HR2 ar putea crește
riscul conferit de FV sunt, probabil, mai multe. În primul rând, ambele polimorfisme reduc
activitatea PCA. Mai mult decât atât, și cel mai impo rtant, FV și HR2 nu au niciodată
aceleași alele și, pr in urmare, persoanele cu alele mutante pe ambele polimorfisme , nu au nici
un factor V normal (Castaman , și colab., 2003 ).

4.3. Factor II (Protrombina)
Trombina este o serin protează, enzima care, la om, este codificată de gena F2 (Royle,
și colab., 1987 ). Protrombina ( sau factorul de coagulare II) este clivată proteolitic pentru a
forma trombina în timpul procesului de coagulare. Trombina la rândul său, acționează ca o
serin protează transformând fibrinogenul solubil în fibre insolubile de fibrină, precum și în
multe alte reacții catalizatoare, legate de coagulare.
Trombina rezultă din scindarea enzimatică a două situsuri de protrombină prin
activarea factorului X (Xa). Activitatea factorului Xa este mult îmbunătățită prin legarea la
activarea factor ului V (Va), denumit complexul protrombinază. Protrombina este produsă în
ficat și este modificată co -translațional într -o reacție dependentă de vitamina K, care
convertește zece acizii glutamici în acid gama -carboxiglutamic (Gla). În prezența calciului,
rezidurile Gla determină legarea protrombinei la bistraturi fosfolipidice. Deficiența de
vitamină K sau administrarea de anticoagulant, inhibă producerea resturilor de acid gama –
carboxiglutamic, încetinin d activarea cascadei coagulării (Andrew , și colab., 1987).

26
4.3.1. Rolul FII în hemostază
În cascada de coagulare a sângelui, trombina convertește factorul XI la XIa, VIII la
VIIIa, V la Va, fibrinogenul în fibrină, și XIII la XIIIa.
Factorul XIIIa este o transglutaminază care catalizează formarea de legătur i covalente
între resturile de lizină și glutamină în fibrină. Legăturile covalente cresc stabilitatea rețelei
de fibrină. Trombina interacționează cu trombomodulina. Ca parte a activității sale în cascada
de coagulare, trombina promovează, de asemenea, ac tivarea și agregarea plachetară prin
activarea receptorilor activați de protează de pe membrana celulară a trombocitelor.
Trombina legată de trombomodulină activează proteina C, un inhibitor al cascadei de
coagulare. Activarea proteinei C este mult îmbunăt ățită în urma legării trombinei la
trombomodulină, o proteină de membrană integral ă, exprimată de celulele endoteliale.
Proteina C activată inactivează factorii Va și VIIIa. Legarea proteinei C activate la proteina S
conduce la o creștere modestă a activit ății sale. Trombina este de asemenea inactivată de
antitrombină, un inhibitor de serin protează (Bajzar , și colab., 1996 ).
4.3.2.Genetica FII
Gena trombinei (protrombinei) este loca lizată pe cromozomul 11 (11q12) (Royle, și
colab., 1987 ).
Există relativ puțini oameni care au fost diagnosticați cu forma congenitală de deficit
de factor II, ( Degen , și colab., 1987 ), care nu trebuie confundată cu mutația protrombinei
G20210A, care este, de asemenea , numită mutația factorului II (Varga și Moll , 2004 ).
Protromb ina G20210A nu este de obicei însoțită de alte mutații ale altor factori (cel
mai frecvent fiind însoțită de mutația factorul V Leiden). Gena poate fi moștenită heterozigot,
sau mult mai rar, homozigot. Mutațiile homozigote cresc riscul de tromboză. Alte r iscuri
potențiale pentru tromboză, cum ar fi contraceptive o rale, pot fi aditive (Davie și Kulman,
2006).
Greutatea moleculară a protrombinei este de aproximativ 72000 Da. Domeniul
catalitic este eliberat din fragmentul protrombină pentru a crea enzima de numită trombină
activă, care are o greutate moleculară de 36.000 Da. Structural, este o membră a familiei
proteazelor (Davie și Kulman, 2006).
Protrombina este compusă din patru domenii; un domeniu N -terminal Gla, două
domenii kringle și un domeniu serin p rotează, cum ar fi tripsina la nivelul C -terminal.
Factorul Xa cu factorul V ca un cofactor duce la scindarea Gla și a două domenii Kringle

27
(care formează împreună un complex numit fragmen t 1.2) și rezulta trombina, alcă tuită nu mai
din domeniul serin prote ază (Davie și Kulman , 2006) .

4.4. Metilentetrahidrofolat reductaza (MTHFR)
MTHFR este o enzimă care limitează viteza în ciclul de metil, și este codificată de
gena MTHFR ( Goyette și colab., 1994). MTHFR catalizează conversia 5, 10-
metilentetrahidrofolatul ui în 5-metiltetrahidrofolat, un co -substrat pentru reacția de remetilare
a homocisteinei la metionină. Variația naturală în această genă este frecvența sa la persoanele
sănătoase. U nele variante au fost raportate pentru a influenta susceptibilitatea la bo lile
vasculare, defectelor de tub neural, boala Alzheimer și alte forme de demență, cancerul de
colon , si leucemia acută. Unele mutaț ii ale acestei gene sunt asociate cu deficitul de
metilentetrahidrofolat reductază (Födinger și colab., 2000 ; Trimmer , 2013 ).
4.4.1. Genetica MTHFR
Enzima metilentetrahidrofolat reductaza este codificată de gena MTHFR, loc alizată
pe cromozomul 1(1p36.3) (Goyette și colab., 1994). Există multe variante de secvențe ADN
(polimorfisme ge netice) asociate cu această genă . În 2000, u n raport a adus num ărul
polimorfismelor până la 24 (Sibani și colab., 2000). Două dintre cele mai cercetate sunt
C677T (rs1801133 , codonul 222) ș i A1298C (rs1801131 , codonul 429), polimorfisme
uninucleotidice (SNPs).
Aceste două polimorfisme genetice comun e s-au dovedit a reduc e activitatea
MTHFR. Astfel, h iperhomocist einemia sanguină este o consecință a polimorfismului
uninucleotidic (SNP) în MTHFR 677 C> T, în care o mutație missense ce schimbă C cu T la
poziția codonului 222, unde alanina este substituit ă cu valina.
4.4.1.1 C677T SNP (Ala222Val)
Polimorfismul C677T are loc în exonul 4. Polimorfismul stă la baza site -ului de legare
pentru cofactorul MTHFR, fl avin adenin dinucleotidul (FAD) (Rabab și colab., 2014 ).
Nucleotida din poziția 667 din gena MTHFR poate fi o C (citozină) sau o T (timină). C la
poziția 667 (alanină la aminoacidul 222) este alela normală. Alela 667T (valină, la
aminoacidul 222) codifică o enzimă termolabilă cu activitate redusă și este alela anormală.
Indivizii cu două copii ale 667C (667CC – homozigoții n ormali) reprezintă cel mai
frecvent genotip. Indivizii 667TT (homozigoții mutanți) au o activitate mai scăzută a enzimei
MTHFR față de de cei CC sau CT (heterozigoți). Aproximativ zece la sută din populația din

28
America de Nord sunt T -homozigot pentru acest polimorfism. Există o variabilitate etnică în
frecvența alelei T . Frecvența populațiilor de lângă Marea Mediterană /hispanicii este mai
mare față de frecvența la caucazieni, care, la rândul său, este mai mare decât în Africa
/africani / afro -americani ( Schneider și colab., 1998) .
Gradul de enzimă MTHFR termolabilă (evaluată ca activitate reziduală după
inactivarea termică) este mult mai mare la persoanele 677CC (66 -67%) în comparație c u
677CT (56%) și 667TT (18 -22%) (Frosst și colab., 1995). Indivizii 677TT sunt predispuși la
hiperhomocistinemie ușoară (nivelul homocisteinei din sânge), deoarece aceștia au MTHFR
mai puțin activ disponibil pentru a produce 5 -methiltetrahidrofolat (care este utilizat pentru a
reduce homocisteina). Aportul al imentar scăzut de acid folic poate provoca, de asemenea,
hiperhomocistinemie ușoară.
Aportul scăzut de acid folic afectează persoanele cu genotipul 677TT într -o măsură
mai mare decât cele cu genotipurile 677CC / CT. Astfel 677TT (dar nu 677CC / CT), este
reprezentat de persoanele cu niveluri plasmatice mai mici de acid folic (Reilly și colab.,
2014) .
În studiile de MTHFR recombinant uman, proteina codificată de 677T pierde
cofactorul său de trei ori mai repede decât proteina normală (Yamada și colab., 2001) . 5-
metil -THF, încetinește vitez a de eliberare a cofactorului (Schwahn și Rozen , 2001) . Indivizii
677TT au un risc crescut de leucemie acută limfoblastică ( Ojha și Gurney, 2014) și a
cancerului de colon ( Bailey, 2003) . Genotipul C677T este asociat cu un ri sc crescut de
pierdere a sarcinii recurente la caucazieni. ( Wu X., și colab., 2012)
4.4.1.2. A1305C SNP (Glu429Ala) – MTHFR 1298A>C
Polimorfismul A1298C are loc în exonul 7, și are ca rezultat o substituție glutamat –
alanină la nivelul codonului 429 (Rabab și colab., 2014) . Nucleotida din poziția 1305 din
MTHFR, se poate substitui fie cu o A (ade nină) , fie cu o C (citozină). 1305A (sub stituția de
Glu în poziția 429) este ce a mai comună, în timp ce 1305C (substituția de Ala în poziț ia 429)
este mai puțin fre cventă. 1305AA este varianta normală (homozigoți), 1305AC este varianta
pentru heterozigoți, și 1298CC homozigot este varianta mutantă. În studiile de MTHFR
recombinant uman, proteina codificată de aminoacidul 1305C nu poate fi distinsă de proteina
codific ată de aminoacidul 1305A în ceea ce privește activitatea, termolabilitatea, eliberare a
de FAD sau e fectul protector al 5 -metil -THF (Yamada și colab., 2001) . Mutația C nu pare să
afecteze proteina MTHFR. Ea nu are ca rezultat MTHFR termolabil și nu pare să afecteze
nivelul homocisteinei. Însă, afectează conversia MTHF la BH4 (tetrahidrobiopterin), un

29
cofactor important în producerea neurotransmițătorilor, sinteza de oxid nit ric și detoxifierea
amoniacului (Rai și colab., 2017).
S-au înregistrat unele comenta rii pe baza "reacției inverse", în care
tetrahidrobiopterinul (BH4) este produs atunci când 5 -metiltetrahidrofolatul este convertit
înapoi în metilenetetrahidrofolat. Totuși, acest lucru nu este universal convenit. O opinie
alternativă este că 5 -MTHF proce sează peroxinitritul, menținând astfel BH4 existent, și astfel
nu se produce o "reacție inversă" (Rai și colab., 2017).
Privind importanța genei MTHFR în timpul sarcinii, s -a emis ipoteza că variațiile de
nucleotide în această genă poate afec ta rezultatul sarcinii , în special creșterea riscul ui de avort
spontan, dar Rohini și colab., în 2013 nu au evidențiat o asociere între genotip și riscul de
avort spontan. (Rohini și colab., 2013).

4.5. Cistation beta -sintetaza (CBS)
Cistationin -β-sintetaza, de asemene a, cunoscută și sub numele de CBS, este o enzimă,
codificată de gena CBS. Ea catalizează prima etapă a căii de trans -sulfurare, de la
homocisteină la cistationin (NCBI, 2016 ).
CBS este o enzimă cu mai multe domenii, compusă dintr -un domeniu enzimatic N –
terminal și două domenii CBS. Gena CBS este cel mai frecvent locus pentru mutaț iile
asociate cu homocistinuria (Janosík și colab., 2001 ).
Hiperhomocisteminemia ușoară este asociată cu mutații fie în gena CBS, fie în gena
MTHFR. În 1995, Sebastio și colab., au caracteriza t o inserție de 68 de perechi de baze în cis
cu mutația CBS (o substituție a timinei cu citozina la nucleotida 833, T833C), cel mai
frecvent detectată la pacienții cu homocistinuriei. Homocistinuria, este o boală autoz omal
recesivă cauzată de o deficiență a CBS, conducând la concentrații plasmatice ridicate de
homocisteină la pacienții homozigoți . Principalele caracteristici clinice ale celor homozigoț i
pentru mutație sunt retardul mental, ectopic lentis ( deplasare a sau o malpoziția lentilei
cristalinului din poziția sa normal) , anomalii scheletice, arteri oscleroza prematură și tromboza
(Young , 2001) .
4.5.1. Genetica CBS
Un studiu realizat pe hibrizi de celule somatice cu activitate enzimatică cistationin
beta-sintetază și celule de hamster normal e a demonstrat existența activității enzima tice la
nivelul cromozomului 21 (Skovby și colab., 1984) iar prin hibridizarea in situ , Munke și

30
colab., în 1985 au atribuit un locus genei CBS, pe cromozomul 21 și anume 21q22.3. Prin
analiza secvenței genomice s -a stabilit că această genă conține 23 de exoni, variind în mărime
de la 42 la 299 pb. Regiunea 5’ -UTR este formată din 1 -5 exoni utilizați în mod alternativ, iar
regiunea 3’ -UTR este codificată de exonii 16 și 17. Kraus și colab., în 1998 au descris 2
regiuni promotor, utilizate alternativ, bogate în GC.

4.6. Inhibitor al activatorului de plasminogen, tip 1 (PAI -1)
PAI-1, de asemenea, cunoscut și sub numele de inhibitor al activatorului
plasminogenului sau serpina E1, este o proteină care la om este codi ficată de gena
SERPINE1. Valorile crescute de PAI -1 sunt factor de risc pentru apariț ia trombozei și
aterosclerozei (Vaughan , 2005) .
Funcția principală pentru PAI -1 conduce adesea la inhibarea urokinazei activatorului
plasminogenului (uPA), o enzimă respon sabilă pentru clivarea plasminogenului pentru a
forma plasmina. Plasmina mediază degradarea matricei extracelulare, fie ca atare, fie în
combinație cu metalo -proteinaze matriceale. În acest scenariu, PAI -1 inhibă uPA prin
intermediul situsului de legare ac tiv, prevenind formarea plasminei. Inhibarea suplimentară
este mediată de PAI -1 legat la complexul receptor UPA / uPA, având ca rezultat degradarea
acestuia. Astfel, PAI inhibă serin proteazele tPA și uPA / urokinază, și deci este un inhibitor
al fibrinol izei, procesul fiziologic care degradează cheagurile de sânge. PAI -1 este produs în
principal de endoteliul (celulele mucoasei vaselor de sâ nge), dar, de asemenea, este secretat
de alte tipuri de țes uturi, cum ar fi țesutul adipos (Carter și Church , 2009).
4.6.1. Genetica PAI -1
Gena pentru PAI -1 se numește SERPINE1, și este localiza tă pe cromozomul 7
(7q21.3 -q22) (Ghosh și Vaughan , 2012 ).
Modificări ale nivelurilor plasmatice ale PAI -1 pot fi corelate cu variații genetice în
promotorul PAI -1. Mai multe poli morfisme în această regiune al e genei au fost descrise
incluzâ nd un polimorfism dinucleotidic repetat și anume citozină -adenină (CA), un
polimorfism Hindlll a fragmentelor de restricție, și o inserție/deleț ie de o singură nucleotidă
(4G / 5G). Polimorfism ul este situat la 675 pb în amonte de situsul start transcripțional, la
nivelul promotorului. Alela 4G în polimorfismul 4G / 5G pare să promoveze o rată de
transcripție crescută comparativ cu alela 5G, iar oamenii homozigoți pentru alela 4G prezintă
cu un nivel de aproximativ 25% mai mare de PAI -1 în plasmă, față de subiecții 5G / 5G.

31
Deși unele studii sugerează că alela 4G este legată de un risc crescut de infarct
miocardic, alte studii nu au putut confirma această corelație, iar două recente meta -analize au
indicat doar o asociere slabă. Rezultate contradictorii au fost raportate, de asemenea pentru o
posibilă legătură între polimorfismul PAI -1 și riscul de tromboembolism venos.
Polimorfismul 4G/4G a fost asociat, cu un rezultat slab, la pacienții răniți î n urma unui
traumatism sau la pacienții cu sepsis men ingococic, comparativ cu pacienț ii 4G/5G sau
5G/5G . În mod neașteptat, și în contrast cu aceste descoperiri, mai multe studii de PAI -1 și
riscul de evenimente cerebrovasculare, indică un rol protector p entru alela 4G în ciuda
nivelului înalt de PAI -1. Efectul protector al PAI -1 în sistemul vascular cerebral poate fi
datorat creșterii stabilității plă cii și neutralizarea neurotoxică TPA. În concluzie, dovezile
actuale care leagă variațiile genetice din pr omotorul PAI -1 pentru bolile umane sunt
contradictorii, posibil din cauza variațiilor factorilor necunoscuți sa u modelelor de studiu
diferite (Dellas și Loskutoff, 2005) .

4.7. Glicoproteina IIIa (GPIIIa)
Glicoproteina IIb / IIIa (GPIIb / IIIa, de asemenea , cunoscută și sub numele de
integrina αIIbβ3) este un complex de integrină, localizat în trombocite. GPIIIa este un
receptor pentru fibrinogen și factorul von Willebrand, ajutând activarea trombocitelor
(Vickers, 1999 ).
Glicoproteina plachetară a receptor ilor IIb / IIIa (GP IIb / IIIa), este o componentă
cheie în calea de agregare plachetară; în consecință, acest receptor a devenit țintă pentru
intervenția terapeutică. O paradigmă a acestei modalități de tratament antiplachetar se găsește
în mod natural în tulbura rea moștenită denumită trombasten ia Glanzmann. O caracteristică
esențială a acestei boli este faptul că pacienții prezintă sângerare cutaneo -mucoasă, dar numai
rareori au hemoragii spontane ale sistemului nervos central. Toate mutațiile care au fos t
identificate la pacienții cu rezultat de trombastenie Glanzmann, într -o deficiență funcțională a
receptorilor GP IIb / IIIa și un semn distinctiv al acestei boli este absența agregării plachetare
induse de agonist. Caracterizarea moleculară a mutațiilor care cauzează trombastenia
Glanzmann a furnizat o multitudine de informații cu privire la relațiile structură -funcț ie a
receptorului GPIIb / IIIa (French și colab., 1998 ).

32
4.7.1. Genetica GPIIIa
Rosa și colab., (1988) au localizat gena GP3A la niv elul cro mozomului 17 (17q21.32)
(Rosa și colab., 1988 ). În urma analizei secvenței genomice, s -a arătat că gena GP3A are 14
exoni iar regiunea 3’ este mai mare de 1700 de nucleotide, c onținând și o regiune netradusă
(Lanza și colab., 1990) .
4.8. Enzima de conversi e a angiotensinei (ACE)
Enzima de conversie a angiotensinei sau ACE, este o componenta centrală a
sistemului renină -angiotensină (RAS), care controlează tensiunea arterială prin reglarea
volumului de lichide din organism. Acesta convertește hormonul angiot ensină I la
angiotensina II activă, vasoconstrictoare. Prin urmare, ACE crește în mod indirect nivelul
tensiunii arteriale prin provocarea vaselor de sânge să se contracte. Inhibitorii ACE sunt
utilizați la scară largă ca medicamente farmaceutice pentru tr atamentul bolilor
cardio vasculare (Skeggs și colab., 1956) .
Enzima a fost descoperit de Leonard T. Skeggs Jr. în 1956. ( Skeggs LT., și colab.,
1956) și este situată în principal în capilarele pulmonare, dar poate fi găsită si în celulele
epiteliale, precum și celulele endoteli ale din rinichi (Kierszenbaum și Abraham , 2007) . Alte
funcții mai puțin cunoscute ale ACE sunt degradarea bradikininei ( Fillardi, 2015 ) și amiloid
beta-proteinei (Hemming și Selkoe , 2005 ).
ACE hidrolizează peptide prin îndepărtarea une i dipeptide de la capătul C -terminal.
La fel se convertește angioten sina I inactivă (dipeptida ), la angiotensina II activă
(octapeptidă), prin îndepărtarea dipeptidei His -Leu (Coates , 2003).
Angiotensina II este un vasoconstrictor puternic într -o manieră d ependentă de
concentrația substratului (Zhang și colab., 2000) . Angiotensina II se leagă de receptorul
angiotensinei II de tip 1 (AT1), care stabilește o serie de acțiuni care au ca rezultat
vasoconstricția și, prin urmare, creșterea tensiunii arteriale. A CE este, de asemenea, parte din
sistemul kinin -kalikreină unde degradează bradikinina, un vasodilatator puter nic, și alte
peptide vasoactive (Imig, 2004) .
Kininaza II se aseamă nă cu inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei. Astfel,
aceeași enzimă ( ACE), care generează un vasoconstrictor (ANG II), dispune și de un
vasodilatator (bradikinină) (Boulpaep și Boron , 2005) .

33
ACE este o metalo -enzimă, dependentă de zinc ( Wang și colab., 2016) , ionul de zinc
fiind esențial pentru activitatea sa, din moment ce participă direct la cataliza peptidelor. Prin
urmare, ACE poate fi inhibată d e agenții de chelatare metalici (Bünning și Riordan , 1985) .
Funcția ionilor de clor este foarte complexă și este extrem de dezbătută. Activarea
anionului de clorură este o trăsăt ură caracteristică a ACE (Bünning , 1983) . S-a determinat
experimental că activarea hidrolizei de către clorură este foarte dependentă de substrat. În
timp ce aceasta crește ratele de hidroliză pentru Hip -His-Leu (Zhang și colab., 2013) . În
condiții fiziolo gice, enzima ajunge la aproximativ 60% din activitatea maximă față de
angiotensina I, în timp ce ajunge la o activitatea deplină față de bradikinină. Prin urmare, se
presupune că funcția de activare anionului în ACE oferă specificitate d e substrat (Bünnin g,
1983) . Alte teorii susțin că clorura ar putea stabiliza doa r structura generală a enzimei (Zhang
și colab., 2013) .
4.8.1.Genetica ACE
Gena ACE se găsește la nivelul cromozomului 17 iar Mattei și colab., (1989) i -au
atribuit genei ACE prin hibridizarea in situ , locusul 17q23.
Cu toate că enzima de conversie a angiotensinei a fost studiată în primul rând, în
contextul rolului său în reglarea tensiunii arteriale, această enzimă , pe scară largă are multe
alte funcții fiziologice. Gena ACE codifică 2 izo -enzime. Somatic izoenzima ACE este
exprimată în multe țesuturi, inclusiv celulele vasculare endoteliale, celule epiteliale renale și
celule Leydig testiculare, în timp ce izoenzima ACE germinativ ă este exprimată numai în
spermatozoizi (Ramaraj și colab., 1998 ).
Prin RT-PCR, Harmer și colab., (2002) au analizat până la 72 de țesuturi diferite și au
găsit că ACE se exprimă în toate cele 72 de țesuturi examinate , iar nivelul de expresie a fost
ridicat în special în ileon, jejun, duoden, testicu le, plămâni, vasele sanguine pulmonare, și
prostată.
Howard și colab., (1990) au constatat că forma ACE testicular specifică are propriul
promotor în interiorul intronului 12, și este codificată de regiunea 3’ a genei, găsindu -se
numai în celulele din spermatogeneza pos tmeio tică și spermatozoizi.
4.8.2. Polimorfismul INSERȚIE/DELEȚIE
În afară de a fi prezentă ca o enzimă legată de membrană pe suprafața celulelor
endoteliale vasculare, ACE circulă și în plasmă. Enzima din plasmă poate fi sintetizată în
endoteliul vascular. La indivizii normali, concentrațiile plasmatice ale ACE pot arăta la fel de
mult ca și o variație inter -individuală de 5 ori mai mare; pe de altă parte, variațiile intra –

34
individuale sunt mici. Cambien și colab., (1988) au studiat asemănarea familială pentru
activitatea ACE plasmatică în 87 de familii sănătoase. Nivelurile medii au fost 34,1; 30,7, și
43,1 la tați, mame și urmași. ACE plasmatic ă a fost necorelată cu vârsta, înălțimea, greutatea,
sau tensiunea arterială la părinți, dar s -a observat o corelație negat ivă odată cu vârsta, la
urmași.
Rezultatele analizei genetice au sugerat că o genă majoră poate afecta variabilitatea
inter-individuală a ACE din plasmă. Okabe și colab., (1985) au descris o famile, în care o
creștere anormală a concentrațiilor plasma tice de ACE au fost transm ise aparent ca o
trăsătură autoz omal dominantă. Nivelurile ACE plasmatice la persoanele afectate din acest
studiu au fost mult mai mari decât valorile observate în cele 87 de familii studiate de
Cambien et al. (1988) iar Tiret și colab., (1992) au demonstrat că variabilitatea inter –
individuală a ACE plasmatică a fost asociată cu o inserție (I) / deleție (D) , polimorfism care
implică aproximativ 250 pb, situat în intronul 16 al genei ACE, așa -numitul polimorfismul
ACE I/D. Rigat și colab., (1990) au constatat că polimorfismul ACE I/D este puternic asociat
cu nivelul enzimei circulante. Rigat și colab., (1992) au stabilit că inserția ACE corespunde
unei secvențe repetitive de Ala și este 287 bp.

4.9. Apopoliproteina E (ApoE)
Apolip oproteina E (APOE) face parte dintr -o clasă de apolipoproteine găsite în
chilomicroni (ce sunt particule de lipoproteine care constau din trigliceride (85 -92%),
fosfolipide (6 -12%), coles terol (1 -3%) și proteine (1 -2%) (Hussain, 2000), și lipoproteine cu
densitate intermediară (IDLs), esențiale pentru catabolismul normal al elementelor
constitutive bogate în trigliceride. În țesuturile periferice, APOE este produsă în principal în
ficat și macrofage, și mediază metabolismul colesterolului într -o manieră dep endentă de
izoformă. În sistemul nervos central, APOE este produsă în principal de astrocite și transportă
colesterolul la neuroni prin intermediul receptorilor APOE, care sunt membri ai familiei de
gene pentru receptorii lipop roteinelor de densitate scăzu tă (Liu și colab., 2013) . APOE este
principalul p urtător de colesterol în creier (Puglielli și colab., 2003) . Această protein ă este
implicată în apariția bo lii Alzheim er și a bolilor cardiovasculare (Stolerman 2010).
APOE este o proteină lungă de 299 de am inoacizi și conține mai multe alfa -helixuri
amfipatice. Conform studiilor de cristalografie, o regiune balama leagă regiunile N – și C-
terminale ale proteinei. Regiunea N -terminală (resturile 1 -167) formează un pachet de patru

35
helixuri antiparalele astfel î ncât laturile nepolare se confruntă în interiorul proteinei. În
același timp, domeniul C -terminal (resturile 206 -299) conține trei alfa -helixuri care formează
o suprafață mare hidrofobă expusă și interacționează cu cei din regiunea N -terminală prin
legătur i de hidrogen. Regiunea C -terminală conține, de asemenea, un receptor de legare
pentru lipoproteinele cu densitate mică (LDL) ( Phillips, 2014).
APOE transportă lipoproteinele, vitaminele liposolubile și colesterolul în sistemul
limfatic și apoi în sânge. A cesta este sintetizat în principal în ficat, dar a fost, de asemenea,
găsit și în alte organe , cum ar fi creierul, rinichii și splina (Baars și colab., 2011). În sistemul
nervos, tipuri de celule non -neuronale, mai ales astroglia și microglia, sunt producă torii
primari de APOE, în timp ce neuronii exprimă pref erențial receptorii pentru APOE (Zhang și
colab., 2013). Există șapte receptori identificați în prezent, la mamifere, pentru APOE care
aparțin f amiliei LDL conservate evolutiv (Rogers și Weeber, 2008) .
APOE a fost inițial recunoscută pentru importanța sa în metabolismul lipoproteinelor
si a b olilor cardiovasculare. Defectele str ucturale ale APOE dau hiperlipoproteinemia de tip
III (HLP III), în care creșterea colesterolului plasmatic și a trigliceridelo r sunt consecința
clearance -ului defectuos al chilomicronilor, VLDL (lipopolip roteine de densitate foarte mică )
și LDL (lipopoliproteine de de nsitate mică ) (Entrez Gene , 2017 ). Mai recent, APOE a fost
studiat ă pentru rolul său în mai multe procese biologic e, care nu sunt direct legate de
transportul lipoproteinelor, inclusiv boala Alzheimer (AD), imunoreglarea și cogniția
(Stolerman , 2010).
4.9.1. Genetica APOE
Gena APOE este cartografiată la nivelul cromozomului 19 într -un cluster cu
apolipoproteina C1 și apolipoproteina C2. Gena APOE este formată din patru exoni și trei
introni, în lungim e totală de 3597 de perechi de baze. APOE este activată transcripțional de
receptorul hepatic X (un regulator important al colesterolului, acizilor grași și homeostaziei
glucozei) și receptorul γ activat de proliferatorul peroxizomului, receptor nuclear care
formează hetero dimeri cu receptorul retinoid X (Chawla și colab., 2001). În celulele
melanocitare expresia genei APOE poate fi reglată prin MITF (Hoek și colab., 2008) .
4.9.2. Polimorfisme APOE
Gena APOE este polimorfă, ( Singh și colab., 2006; Eisenberg și colab., 2010) , având
3 alele majore: ApoE2 (cys112, cys158), ApoE3 (cys112, arg158), și ApoE4 (arg112,
arg158) ( Stolerman, 2010; Baars și colab., 2011; Ghebranious și colab., 2005). Toate aceste
forme alelice diferă una de alta prin unul sau doi aminoacizi la pozițiile 112 și 158, ( OMIM

36
107741#0015; OMIM 107741#0001; Zuo și colab., 2006) iar aceste diferențe schimbă
structura și funcția AP OE și au consecințe fiziologice .
E2 (rs7412 -T, rs429358 -T) are o frecvență alelică de aproximativ 7 %. ( Alzforum ,
2017 ). Această variantă se leagă slab la receptorii de suprafață celulară, în timp ce variantele
E3 și E4 se leagă mai specific (Weisgraber și colab 1982). E2 este asociată atât cu creșterea
cât și cu scăderea riscului pentru ateroscleroză. Persoanele cu o combinație E2 / E2 pot
înlătura grăsimile încet și astfel prezintă un risc mai mare de a dezvolta boli vasculare
precoce și genetice, precum hiperlipoproteinemia de tip III -94,4% dintre acești pacienți fiind
E2 / E2 ( Breslow și colab., 1982; Feussner și colab., 1998; Civeira și colab., 1996) . E2 a fost,
de asemenea, implicat în boala Parkinson, ( Huang și colab., 2004) , dar această constatare nu
a fost r eplicată într -un studi u mai extins (Federoff și colab., 2012) .
E3 (rs7412 -C, rs429358 -T) are o frecvență alelică de aproximativ 79 % ( Alzforum ,
2017 ). Este considerat genotipul "neutru".
E4 (rs7412 -C, rs429358 -C) are o frecvență alelică de aproximativ 14 % (Alzforum ,
2017 ) E4 e ste impl icat în ateroscleroză (Mahley, 1988), boala Alzheimer (Corder și colab.,
1993; Strittmatter și colab., 1993), alterarea funcției cognitive ( Deary și colab., 2002; Farlow
și colab., 2004) , reducerea volumului hipocampusului ( Farlow și colab., 2004) , HIV, ( Burt și
colab., 2008) , progresia mai rapidă a bolii în scleroza multiplă ( Chapman și colab., 2001;
Schmidt și colab., 2002) , rezultatele nefavorabile după traumatismele cerebrale ( Friedman și
colab., 1999) , boala cerebrovasculară ischemică ( McCarron și colab., 1999) , apnee în somn
(Kadotani și colab., 2001 ; Gottlieb și colab 2004) , scurtarea telomerelor accelerată ( Jacobs și
colab., 2013) , și reducerea cr eșterii prelungirilor neuronale (Raber, 2008) . Un avantaj not abil
al alelei E4 (în raport cu E2 ș i E3), este asocierea pozitivă cu niveluri mai ridicate de
vitamină D, care ar putea ajuta la explicarea prevalenței sale în ciuda complicațiilor apărute
în diferite boli sau tulburări (Huebbe și colab., 2011) .
Cu toate acestea, există multe necunoscute despre aceste izoforme APOE, inclusiv
interacțiunea cu alte polimorfisme genetice, fiind recomandat ă precauția la avansarea unor
concluzii despre influența polimorfismelor APOE ( Mondadori și colab., 2007) .

4.10. Angiotensinogenul (AGT)
Angiotensinogenul es te o componentă a sistemului renină -angiotensină (RAS), un
sistem hormonal care reglează tensiunea arterială și echilibrul fluidelor. De asemenea, este

37
cunoscut ca substrat pentru renină, și este un membru fără inhibitor al familiei ser pin
inhibitorilor de proteinază (Ohkubo și colab., 1983) .
Angiotensinogenul, este scindat catalitic de renină pentru a produce angiotensina I ca
răspuns la presiunea arterială scăzută. Enzima de conversie a angiotensinei (ACE), elimină
ulterior o dipeptidă pentru a produce an giotensina II, peptida activă fiziologic, care
funcționează în reglarea volumului de minerale și echilibrul fluidelor corporale.
Angiotensinogenul este sintetizat în ficat și secretat în plasmă. Proteina aparține
superfamiliei inhibitorilor de serin protea ză (Ehlers , 1989 ; Fuchs și colab., 2004 ).
Angiotensina I și angiotensina II pot fi prelucrate în continuare pentru a genera angiotensina
III, care stimulează eliberarea de aldosteron, precum și generarea de angiotensină IV
(Goodfriend și Peach, 1975 ).
Polimorfismul obișnuit M235T al genei AGT pare să fie asociat cu o predispoziție
esențială la hipertensiune; este de asemenea asociat cu hipertensiunea indusă de sarcină (PIH)
(preeclampsie), o t ulburare heterogenă, care complică 5 -7% din toate sarcinile și rămâne o
cauză principal ă în morbiditate și mortalitate (Ohkubo și colab., 1983) .
Pe lângă rolul bine cunoscut al angiotensinogenului (Agt) în sistemul renină –
angiotensină (RAS) care reglează v asopresoru l, electroliți și homeostaz ia fluid ică, dovezile în
creștere au sugerat un rol pentru Agt în dezvoltarea embrionară. Receptorii angiotensinei
(AT) II și AT II (AT1 și AT2) sunt exprimați în embrioni umani în timpul sarcinii și sunt
implicați în d ezvoltarea organelor. AT este un inhibitor de serin -protează plasmatic care
inhibă permanent trombina prin legarea covalentă la situsul proteolitic și, în mod normal,
ajută la menținerea fluidității sângelui. Deficitul de antitrombină este o tulburare gene tică
autosomal -dominantă, caracterizată fie de absența, fie de forma disfuncțională a
antitrombinei. Are cel mai mare potențial trombogenic cunoscut pentr u tromboembolismul
venos, dar la o prevalență de <0,1% este rară, probabil datorită efectelor sale dău nătoare, care
duc la un dezavantaj selectiv puternic. Combinarea deficienței antitrombinei cu alte mutații
trombofile duce la un risc suplimentar crescut de ASR. Mai mult decât atât, în timpul sarcinii,
modificările hemostazei protejează femeile gravide de hemoragi e severă în timpul nașterii ,
dar, de asemenea, cresc riscu l de complicații tromboembolice. Astfel de modificări includ
concentrații crescute ale mai multor factori de coagulare, concentrații scăzute ale unor
anticoagulante și activitate fibrinolit ică redusă și au ca rezultat c reșterea potențialului
trom bogen ic. Prin urmare, sarcina este considerată un factor de risc suplimentar , dobândit.
Un efect dăunător similar pentru sarcina timpurie a fost observat la șoareci, unde a fost

38
descoperită letalitat ea embrionară de 100% pentru șoarecii homozigoți cu deficit de
antitrom bină (Baek si colab. 2007) .
4.10.1. Genetica AGT
Gaillard și colab., (1989) au descoperit că gena angiotensinogenului uman conține 5
exoni și are organizare identică cu cea a genei AAT, dar diferită de cea a genei AT3.
Prin hibridizarea in situ , Gaillard -Sanchez și alții în 1990 au atribuit genei
angiotensinogenului regiunea 1q4, aceeași regiune ca și pentru gena renina. Isa și colab.,
(1989, 1990) au folosit o sondă de ADNc plasmidic pe ntru a localiza gena non -isotopică prin
hibridizarea in situ ; locația a fost determinată la nivelul regiunii 1q42 -q43. Prin screening -ul
unui grup de hibrizi de celule somatice umane -șoarece, Abonia și colab., (1993) au confirmat
atribuirea locusului AGT l a cromozomul 1. Ei au arătat, de asemenea, că gena omoloagă la
șoarece se află la capătul distal al cromozomului 8; o regiune de omologie scurtă de legătură
între cromozomul conservat la șoarece 8 și cromozomul uman 1 a fost indicat de cartografiere
și a l ocusului alfa actină (102,610) pentru cromozomul 8 de șoarece și cromozomul 1 uman.

4.11. Serin/Treonin kinaza ATR
Serin/treonin -protein kinaza ATR, de asemenea, cunoscută și sub numele de ataxie
telangiectazică legată de proteina Rad3 (ATR), este o enzim ă care, la om, este codificată de
gena ATR. ATR aparține familiei pro tein kinazei fosfatidilinozitol (Cimprich și colab 1996 ;
Bentley și colab 1996) .
Proteina codificată de această genă aparține familiei PI3 / -PI4 kinază, și este cel mai
strâns legată de A TM, o protein kinază codificată de gen a mutantă în ataxia telangiectaz ică.
Această proteină și ATM prezintă similaritate cu Schizosaccharomyces pombe rad3, o genă
punct de control al ciclului celular necesar pentru oprirea ciclului celular și repararea
daunelor din ADN, ca răspuns la deteriorarea ADN -ului. Ac eastă kinază fosforilează, kinaza
punctului de control CHK1, proteinele punctului de control RAD17, și RAD9, precum
BRCA1 proteina supresor tumoral (Gagou și Meuth, 2010) .
4.11.1. Genetica ATR
Gena ATR se găsește l a nivelul cromozomului 3 (3q23) (NCBI, 2017).
Gena ATR este esențială pentru a menține integritatea genomului prin stabilizarea furcilor de
replicare și de regla rea progresiei ciclului celular , precum și repararea ADN -ului. ATR, într –
un complex cu partenerul său de reglementare cu ATRIP ( ATR care interacționează cu

39
proteine), localizează furcile de replicare care au stagnat ca răspuns la o varietate de tipuri de
stres și de deteriorarea a ADN -ului. ATR poate avea ca substrat o serie de proteine, cum ar fi:
proteine senzori pentru deteriorarea ADN, mediatori și efectori, proteine care repara ADN -ul,
proteine ale replisomului și modelatoare ale cromatinei, precum și proteine centrozomale .
Funcția ATR este esențială pentru viabilitatea celulară iar perturbări în semn alizarea ATR
cauzează instabilitate genomica. Mutațiile în gena ATR sunt rare și compatibile cu viața
numai atunci când se găsesc în stare hipermorfă sau heterozigotă. O legătură clară între boală
și mutația genei ATR este sindromul S eckel. Gena ATR a fost propusă pentru a servi ca un
supresor tumoral haploinsuficient, în anumite tipuri de deficiențe și activarea sa a fost
detectată în majoritatea chimioterapiilor de cancer ( Gagou și Meuth, 2010) .

4.12. Fibrinogen (FGB)
Fibrinogenul, este o glicoproteină prezentă la vertebrate, ce participă la formarea
cheagurilor de sânge. ( Hall Ph.D. și colab., 1958) Molecula de fibrinogen este mare și
complexă, având 340 kDa, fiind o glicoproteină plasmatică solubilă, alcătuită din 3 perechi de
lanțuri polipeptidice (alfa, beta, gamma), legate prin punți disulfidice. Lanțurile alfa și beta
conțin polipeptidele A și B. Această glicoproteină este transformată de trombină în fibrină în
timpul formării cheagurilor de sânge. Fibrinogenul este sintetiza t în f icat de către hepatoci te,
concentrația de fib rinogen din plasma sanguină fiind de 200 -400 mg / dl (Marucco și colab.,
2013) .
În timpul coagulării sângelui, o cascadă de coagulare activează zimogena denumită
protrombină ce se transformă în serin proteaza de numită trombină. Trombina convertește
apoi fibrinogenul solubil în fibre de fibrină insolubile. Aceste fibre sunt apoi legate prin
factorul XIII pentru a forma cheagul de sânge. FXIIIa stabilizează fibrină în continuare prin
încorporarea inhibitorilor alfa -2-antiplasmină și TAFI (trombina activă inhibitoare a
fibrinolizei, procarboxipeptidaza B), și legarea de mai multe proteine adezive. Atât activarea
factorului XIII prin trombină cât și activatorul plasminogen (t -PA) sunt catalizați de fibrină.
(Muszbe k L. și colab., 2008) Fibrina se leagă în mod specific de factorii activi de coagulare
ai factorului Xa și trombină și îi captează în rețeaua de fibre, funcționând astfel ca un
inhibitor temporar al acestor enzime, care rămân active și pot fi e liberate în timpul
fibrinolizei (Kaiser , 2003) .

40
Fibrina (ogenul) reprezintă o țintă pentru factorii fibrinolitici care dizolvă excesul de
fibrină pentru a menține permeabil itatea și integritatea vasculară . Fibrinogenul servește, de
asemenea, ca o moleculă primară de l egătură care leagă împreună plachetele activate prin
intermediul glicoproteinelor lor IIb și IIIa (Inbal și Muszbek, 2003).
Cele trei anomalii ereditare suprapuse ale fibrinogenului (afibrinogenemia,
disfibrinogenemia și hipofibrinogenemia ) au fost asociat e cu ASR (Inbal și Muszbek, 2003) .
Afibrinogenemia este un defect al secreției sau eli berării fibrinogenului hepatic ; ea
este moștenită ca o trăsătură autoz omală recesi vă și este asociată cu o diateză hemoragică,
afectarea reparației plăgii și pierderea re cidivantă a sarcinii. O formă asemănătoare a acestei
tulburări este hipofibrinogenemia (Inbal și Muszbek, 2003).
Disfibrinogenemiile ereditare sunt caracterizate prin biosinteza moleculelor
fibrinogene anormale din punct de vedere structural și funcț ional, ele fiind a sociate cu
trombofilia (Inbal și Muszbek, 2003).
O prezentare obișnuită, dar nu invariabilă a afibrinogenemiei / hipofibrinogenemiei
este prelungirea timpului de protrombina (PT) și timpul de tromboplastină parțială activată
(aPTT). Momentele d e trombină ș i timpii de coagulare sunt de asemenea prelungiți (Inbal și
Muszbek, 2003).
Șoarec ii experimentali afibrinogenemici/ hipofibrinogenici au prezentat caracteristici
similare ale tendinței de sângerare, avortului spontan și formării anormale a cic atricilor.
Pe baza modelului de șoarece, absența sau o scădere semnificativă a fibrinogenului matern
este suficientă pentru a provoca ruperea vascularizării materne care afectează infiltrarea de
tropofobie embrionară, ducând la avort spontan hemoragic (Inbal și Muszbek, 2003).
4.12.1. Genetica FGB
Simbolurile genelor care codifică cele 3 lanțuri ale fibrinogenului sunt, FGA , FGB și
FGG , genele fiind localizate la nivelul cromozomului 4, (4q31.3). Bolile asociate mutațiilor
la nivelul genelor FGA, FGB și FGG sunt: afibrinogenemie, hipofibrinogenemie,
disfibrinogenemie congenitală cu tendință la hemoragie excesivă sau tendința la evenimente
tromboembolice. Disfibrinogenemia congenitală este determinată de nivelul normal de
fibrinogen, dar cu funcție anormală, iar hipofibrinogenemia, presupune nivelul scăzut și
funcția anormală a fibrinogenului. (OMIM#616004)
Polimorfismul cel mai studiat și asociat cu trombofilia și avortul spontan este G455A
la nivelul genei FGB, asociată cu un nivel de 7 -10% mai crescut de fi brinogen, în urma căruia
crește depozitarea intravasculară de fibrină prin interacțiunea substratului enzimatic cu

41
trombină, fibrinogen și trombocite, ducând astf el la tromboză și avort spontan (Torabi și
colab., 2012 ).
4.13. Factor XIII
Factorul XIII sau factorul stabilizator al fibrinei este o enzimă a sistemului de
coagulare, determinând încrucișarea fibrinei. Deficiența acestui factor (FXIIID) afectează
stabilitatea cheagurilor. FXIIID, în general apare rar, dar în Iran incidența atinge un maxim
global , cu 473 de cazuri. Orașul Khash, situat în provinciile Sistan și Balochistan, are cea mai
mare incidență în Iran, cu o rată ridicată datorită căsătoriei consanguine (Dorgalaleh și colab.,
2015 ).
Factorul XIII este o transglutaminază plasmatică ce particip ă în etapa finală a cascadei
de coagulare. FXIII este activat de trombină, care scindează legătura peptidică dintre Arg37 –
și Gly38. FXIII activat de trombină catalizează formarea legăturilor încrucișate covalente
între c -glutamil și e -lizil pentru a se ob ține cheagul matur. Ionii de calciu sunt necesari pentru
activarea FXIII plasmatic după scindarea trombinei. În plus față de trombin ă, activarea prin
scindarea legă turii peptidice Arg37 -Gly38 poate avea loc prin intermediul altor serin
proteaze, cum ar fi proteaza plachetară. FXIII circulă în plasmă ca un heterotetramer compus
din două subunități A și două subunități B. Subunitatea A conține situsul activ al enzimei și
este sintetizată de hepatocite, monocite și megacariocite. Subunitatea B servește ca supo rt
catalitic pentru subunitatea A în plasmă , și este sintetizată de ficat (Dardik și colab., 2006) .
FXIII -A a fost identificat în macrofagele prezente în uter, în țesutul de implantare și
în placentă. În placentă, în săptămâna a cinc ea a săptămânii gestați onale apar mici celule
mononucleare cu formă rotundă care conțin FXIII -A și apoi se proliferează rapid și se
diferențiază în celule stelate mari, ajungând la aproximativ 30% din numărul total de celule.
Din cea de -a opta săptămână de sarcină , ele au tendin ța să se acumuleze în parte a periferică a
vilozităților coriale . Prezența celulelor care conțin FXIII -A atât în placentă, cât și în țesutul de
implantare și lipsa FXIIIA în monocitele / macrofagele pacienților cu deficit de FXIII
sugerează implicarea acest or macrofage care implică FXIII în dezvoltarea sarcinii normale.
Cu toate acestea, faptul că înlocuirea simplă a FXIII din plasmă este suficientă pentru a
transporta cu succes pacienții prin sarcină indică faptul că FXIII în sine este esențial pentru
impla ntare (Inbal și Muszbek, 2003) .
Cauza exactă a pierderilor de sarcină la femeile cu deficit de FXIII este necunoscută.
Procesul de implantare implică o interacțiune complexă între blastocist și uter și FXIII joacă

42
un rol esențial în acest proces. FXIIIa fa ce legătura între fibrină (ogen) și fibronectină,
ambele fiind importante pentru atașarea placentei la uter. Este posibil ca deficiența FXIII să
aibă ca rezultat hemoragie periplacentală și pierderea spontană a fătului. De obicei, în a
șaptea zi după impla ntarea ovulației este inițiată. În termen de o săptămână după acel timp,
atât citotrofoblastele cât și sincytirofoblastele invadează stroma deciduală și formează masa
trofoblastică. La două săptămâni după implantare, citotrofoblastele proliferează activ,
penetrează masa trofoblastică și invadează stroma deciduală, formând citotrofoblaste
extravilane. În săptămânile 6 până la 8, unele citotrofoblaste extravilioase fac carcasa
citotrofoblastică care formează suprafața interioară a interfeței mater ne-fetale (Inbal și
Muszbek, 2003). Trombocitele, dar nu și monocitele, sunt principala sursă a FXIII A
plasmatic așa cum s -a raportat la pacienții cu transplant de celule stem; surse extra –
hematopoietice ale sintezei FXIII pot contribui, de asemenea, la creș terea niv elului FXIII în
plasmă (Dardik și colab., 2006) .
4.13.1. Genetica FXIII
FXIII este o proteină codificată, la om, de gena F13A1. Factorul zimogen XIII este un
tetramer format din două subunități A și două subunități B, iar genele pentru aceste subunități
se găsesc pe cr omozomi diferiț i:
Subunitatea A se găsește pe cromozomul 6 (6p25 – p24). Partea transglutaminazică
adaugă o grupare alchil la atomul de azot pe un reziduu de glutamină, care se leagă la rândul
său, cu o lizină pe celălalt lanț. Greutatea molecu lară a lanțului A este de aproximativ 83kDa.
Subunitatea B se găsește pe crom ozomul 1, regiunea q31 – q32.1. Această regiune nu
are nici o activitate enzimatică clară, și poate servi ca purtător pentru subunitatea A.
Greutatea moleculară a lanțulu i B este de aproximativ 76.5kDa (Komáromi și colab., 2011 ).
Această genă codifică mai exact subunitatea A a factorului de coagulare XIII. Factorul de
coagulare XIII este ultimul care este activat în cascada de coagulare a sângelui. După
scindarea peptidei de activa re de către trombină și în prezența ionilor de calciu, factorul
plasmatic XIII disociază subunitățile sale B și produce aceeași enzimă activă, ca factorul
plachetar XIII. Această enzimă acționează ca o transglutaminază pentru a cataliza formarea
de legătur i gamma -glutamil -epsilon -lizină între moleculele de fibrină, stabilizând astfel
cheagul de fibrină. Deficiența factorului XIII se clasificată în două categorii: deficit de tip I,
caracterizat prin lipsa ambelor subunităților A și B și deficit tip II, cara cterizat prin lipsa
numai unei subunități. Aceste defecte pot duce la o tendință de sângerare pe tot parcursul
vieții, vindecarea rănilor fiind defect uoasă iar avortul este obișnuit (NCBI, 2017 ).

43
PARTEA II – PARTEA PRACTICĂ
Capitolul 5

5.1. Ipoteza de luc ru și obiective
5.1.1. Ipoteza de lucru
În realizarea acestui studiu s -a propus verificarea a două ipoteze ale asocierii dintre
prezenț a alelelor de risc trombofilic și pierderea spontană a sarcinii .
Ipoteza 1. Trombofilia ereditar ă cu genotip modificat, implicând diferiț i factori ai
coagulării, se asociază cu, și poate fi o cauză a avortului spon tan, prin predispoziția ereditară
la hipercoagulabilitate ( fenotip modificat ) și implicit modificarea circulației fetale și
placentare.
Ipoteza 2. Frecvența avor tului spontan poate fi corelată cu polimorfismele urmă torilor
factori trombofilici: MTHFR polimorfismul C677T și polimorfismul A1298C , AGT M235T ,
ATR -1 A1166C , FGB -455 G/A , Factor XIII V34L , aceștia întrunind un consens în literatură .
În conformitate cu a ceste ipoteze am construit două predicț ii, ambele referitoare la
frecvenț a alelelor mutante ale genelor factorilor de coagulare. Astfel, femeile cu avort
spontan ar trebui să prezinte frecvenț e mai mari ale alelelor de risc ale genelor față de femeile
din populația generală (după excluderea unor cauze citogenetice). Aces te diferenț e de
frecvenț e pot să se refere fie individual ș i independent la fiecare din polimorfismele genetice
cunoscut a fi asociate/cauzatoare ale trombofiliilor, fie la suma alelelor d e risc per persoană.
În fine, frecvenț ele alelelor de risc ar trebui să fie mai mari la femeile cu avort spontan
repetat, comparativ cu ce le cu un singur avort spontan, în măsura î n care efectul altor factori
poate fi controlat : vârsta femeilor, vârsta la care s -a încercat procreerea, malformații
congenitale, sarcină extrauterină , etc.). Alți factori posibil implicați sunt incompatibilitatea
Rh, factorii de toxicitate sau comportamentul de risc – consum de alcool, tutun.
Predicția ipotezei de nul – inexist ența unor asocieri î ntre alelele de risc trombofilic ș i
pierderea sarcinii – este că nu există diferențe ale frecvenței alelelor î ntre loturi clinice și
populația generală .

44
5.1.2. Obiective
Scopul lucrării a fost determinarea profilului genotipic pentru gena MTHFR
(polimorfismele 667 C>T și 1298 A>C), gena AGT , gena ATR, gena FGB și gena FXIII
precum și gradul de asociere al alelelor de risc ale acestor gene cu avortul spo ntan la un lot de
femei din Româ nia, cu avort spontan în antecedente.

5.2. Lotul d e studiu și metode
5.2.1. Lotul de studiu
Studiul este unul de tip clinic – observaț ional î n care paciente le ce au suferit avorturi
spontane au efectuat la recomandarea medicului sau au solicitat personal genotiparea unui s et
de 15 polimorfisme genetice î n cadrul laboratorului clinic Genetic Lab , Bucureș ti. Pacientele
au semnat un consimțămâ nt informat de solicitare a analizei, iar datele de istoric al sarcinii au
fost furnizate de că tre medic(i) în scopul analizelor statistice. O mare parte din analizele
genetice au fost efectuate de că tre autoarea lucră rii (R.G.). Accesul la datele medicale ale
pacientelor și aprobarea efectuării analizelor din această lucrare au fost permise de către
Genetic Lab și de că tre medicul solicitant al analizelor (dr. Cristina Gu g), cu condiția
respectării anonimităț ii pacientelor și a normelor etice ale cercetă rii medicale.
Lotul de studiu (LS) a fost format dintr -un număr de 175 de paciente cu un istoric a
cel puț in un avort spontan. Conform informațiilor clinice primi te de la D r. Cristina Gug
(comunicare personală) , medicul majorităț ii persoanelor investigate , pacienții din lotul clinic
investigat, nu au p rezentat anomalii cromozomiale.
Din totalul de potențiali pacienți investigaț i a fost selecț ionat un lot de studiu format
pe baza următoarelor criterii:
Criteriile de includere:
 paciente cu cel puțin 2 avorturi de cauză neprecizată în antecedente;
 paciente cu un singur avort spontan de cauză neprecizată, dar cu antecedente
 paciente diagnosticate aleatoriu cu trombofilie după un singur avort spontan
Criteriile de excludere:
 femei cu avorturi de alte cauze cunoscute (cromozomiale, morfologice, endocrine,
infecțioase, imunologice – sindrom antifosfolipidic, alte hemopatii, etc.);
 femei cu condiții de mediu favorizante pentru avort ( mediu profesional toxic,
consumatoare de tutun și alcool ).

45
5.2.2. Metode de lucru
Pacientelor li s -au efectuat aceleași proceduri de determinare a polimorfismelor 667
C>T și 1298 A>C a genei MTHFR , M235T al genei AGT , A1166C al genei ATR -1, 455 G/A
al gen ei FGB și V34L al genei Factor XIII .

5.2.2.1. Extracția de ADN
Fiecărei paciente i s -au recoltat cca. 2 -6 ml sânge venos periferic într -o eprubetă cu
conținut de EDTA (Vacutainer) , fie î n cabinetele teritoriale ale medicilor , fie în cadrul
Genetic Lab. Sângele a fost transportat î n maxim 3 zile (la rece ) și apoi la 4o C, după care a
fost efectuată extracția de AD N cu ajutorul kitului de extractive FAVORGEN Blood
Genomic DNA Extraction MiniKit
Etape extracției de ADN:
– Într-un tub steril de 1.5 ml s -a trans ferat 200 µl sânge venos periferic; s -a notat pe
capac numărul probei.
– S-a adă ugat 20µl QIAGEN Protease. S -a vortexat pentru omogenizare apoi s -a
efectuat o centrifugare ușoară pentru a îndepărta picăturile din interiorul capacului;
– S-a adă ugat 200µl Buffe r AL.
– S-a vortexat 15s și s -a incubat 10 min la 56oC. După incubare, s -a centrifugat ușor
pentru îndepărtarea picăturilor din interiorul capacului.
– S-a adă ugat 200µl etanol (96 -100%), s -a vortexat 15s, apoi s -a centrifugat ușor pentru
îndepărtarea picături lor din interiorul capacului.
– S-a plasat o minicoloană într -un tub de colecție de 2ml, s -a notat proba
corespunzătoare pe capac și s -a pipetat mixul obținut în minicoloană fără a atinge
inelul interior al minicoloanei cu vârful.
– Centrifugare la 8000rpm (60 00g), 1 min. S -a aruncat filtratul.
– S-a plasat minicoloana într -un nou tub de colecție de 2ml. S -a adă ugat în minicoloană
500µl Buffer AW1 și s -a centrifugat la 8000rpm (6000g), 1 min. S -a aruncat filtratul.
– S-a plasat minicoloana într -un nou tub de colecț ie de 2ml. S -a adaugat în minicoloană
500µl Buffer AW2 și s -a centrifugat la 14000rpm (20000g), 3 min. S -a aruncat
filtratul.
– S-a plasat minicoloana într -un tub Eppendorf de 1,5 ml. S -a centrifugat la 14000rpm
(20000g), 1 min, pentru a îndepărta eventualel e urme de Buffer AW2.

46
– S-a plasat minicoloana într -un tub Eppe ndorf steril de 1.5ml și s -a adă ugat 100µl
Buffer AE.
– S-a incubat 5min la temperatura camerei (15 -25oC).
– S-a centrifugat la 8000rpm (6000g), 1 min. S -a îndepărtat minicoloana și filtratul
(conțin e ADN) s -a transferat în tubul Eppendorf steril de 1.5 ml pe care s -a notat
numărul probei, tipul analizei, data extracției.

5.2.2.2. Genotiparea prin PCR și hibridizare pe strip cu streptavidină
Genotiparea s -a efectuat prin metoda amplificării ADN -lui ( prin reacția de
polimerizare în lanț, PCR) , urmată de hibridizare, utilizâ nd un kit specializat de detectare a
15 mutaț ii (NLM, Italia)
Prepararea mixului de PCR: pentr u fiecare probă s -au pregătit câ te 2 tuburi Eppendorf
sterile de 200 μl cu notația probe i corespunzătoare și a mixului utilizat pe capac, în care s -a
pipetat:

tub 1: 45, 75 μl PCR Mix 1
0, 25 μl ADN Polimerază (5U/ μl)
4 μl ADN cu concentrații cuprinse între 30 – 40 ng
tub 2: 45, 75 μl PCR Mix 2
0, 25 μl ADN Polimerază (5U/ μl)
4 μl ADN cu concentrații cuprinse între 30 -40 ng

Pentru amplificare s -a utilizat aparatul Veriti 96 Well Thermal Cycler și programul
PCR:

95oC 120 X1
95oC 30 x
60oC 30 35
72oC 45
72oC 300
10oC ∞ X1

47

Genoti parea s -a efectuat pentru următoarele polimorfisme: MTHFR 677 C>T;
MTHFR 1298 A>C; AGT M235T; ATR A1166C; Fibrinogen 455 G>A; Factor XIII
Val34Leu. Adițional, panelul trombofilic complet a inclus un set adiț ional , după cum
urmează: ACE I/D; ApoE4 (arg112); ApoE4 (arg115); CBS I278T/844ins68; Factor V
Leiden (1691 G>A); F II (Protrombina)(20210 G>A); Factor V HR2; GPIIIa Leu59Pro; PAI –
1 I-5G/D -4G.

5.2.2.3. Electroforeza capilară
Electroforeza capilară s -a realizat pe sistemul automat QIAxcel (Qiagen), pentr u a verifica
prezenț a ampliconilor specifici și eficienț a celor 2 reacț ii PCR necesare hibridiză rii.
Procedura de lucru s -a desfă șurat astfel :
– S-a pornit calculatorul
– S-a pornit aparatul QIAxcel de la buton
– S-a deschis programul BioCalculator
– S-a dat coman da Cart Latch dacă pe ecran este semnalat Unlatched
– S-a dat comanda Change Buffer pentru a aduce stativul aparatului în față
– S-a introdus stripul de tuburi conținând Alignment marker în poziția Marker1
– S-a dat comanda Park – placa se retrage în poziția ini țială (vârfurile capilarelor
trebuie să fie menținute în Buffer )
– Setarea programului de rulare: s -a ales metoda, s -a precizat poziția probelor pe
plăcuță (probele sunt așezate pe rânduri și nu pe coloane) și numărul de rulări
– S-au pregătit probele: s -au tă iat capacele tuburilor PCR și s -au poziționează tuburile
în godeurile plăcii aparatului
– S-au denumit probele în Sample info
– S-a bifat Autoscale time axis during aquisition pentru a vedea migrarea în timp real
– S-a notat numele utilizatorului în User ID
– S-a denumit run -ul în Plate ID
– S-a dat comanda Run
– La sfâ rșitul rulării s -au analizat probele
– S-a scos stripul de tuburi cu Alignment marker : Change Buffer→ s-a scos stripul →
Park
– S-a închis programul BioCalculator

48
– S-a închis aparatul QIAxcel de la buton
– S-a verificat poziția capilarelor: vârfurile capilarelor trebuie să fie imersate în Buffer
– S-a închis calculatorul

5.2.2.4. Hibridizarea pe strip de streptavidi nă
Hibridizarea s -a realizat cu kitul CVD 14 (NLM, Italia) într-un set de etape.
Hibridizare :
– S-a pipetat 40 μl de soluție DNAT în fiecare culoar al tăviței de plastic
– Pentru fiecare probă s -a adă ugat 20 μl produs de amplificare Mix 1 + 20 μl produs de
amplificare Mix 2
– După care amestecul s -a incubat 5 minute la temperatura camerei
– S-a adă ugat 1 ml de soluți e de hibridizare (pre -încălzită la 45oC) în fiecare probă ș i s-
a amestecat ușor: culoarea albastră dispare
– S-a scufundat câte un strip în fiecare culoar al tăviței de plastic cu liniile marcate în
sus
– S-a incubat 30 minute la 45oC în baia de apă ( l a aproximativ 50 rpm); s -a ținut baia
închisă pentru a evita orice variație de temperatură.

Soluția de spălare : după pasul de hibridizare s -a scos tăvița din baia de apă, s -a înclinat și s –
a aspirat toată soluția, din fiecare culoar folosindu -se o pipetă, fără să se atingă suprafața
stripului
– S-a adă ugat 1 ml d e soluție de spălare A (pre -încălzita la 45oC) în fiecare culoar și s -a
amestecat bine
– S-a îndepărtat soluția și s -a adă ugat, din nou, 1 ml de soluție de spălare A (pre –
încălzită la 45oC)
– S-a incuba t 10 minute la 45oC în baia de apă ( la aproximativ 50 rpm) (în timpul
incubării soluția de spălare A s -a pus în baia de apă, să se mențină la temperatura de
45oC)
– S-a îndepărtat soluția și s -a adă ugat 1 ml de soluție de spălare A (pre -încălzită la
45oC)
– S-a incubat 10 minute la 45oC în baia de apă ( la aproximativ 50 rpm)
– S-a îndepărtat soluția din fiecare culoar

49
Colorare : toți pașii următori s -au realizat la temperatura camerei cu agitare; deoarece ar dura
foarte mult ca apa să se răcească și să ajungă la temperatura camerei, tăvița de plastic s -a
așeza pe un suport mai înalt astfel încât tava să fie izolată de apa fierbinte, folosindu -se doar
funcția de agitare a băii:
– S-a adă ugat 1 ml Conjugat
– S-a incubat 20 minute la temperatura camerei, folosindu -se agitarea
– S-a îndepărtat soluția și s -a adă ugat 1 ml de soluție de spălare B, amestecându -se bine
– S-a îndepărtat soluția și s -a adă ugat, din nou, 1 ml de soluție de spălare B
– S-a incubat 5 minute la temperatura camerei, folosindu -se agitarea
– S-a îndepărtat soluția și s -a adă ugat 1 ml soluție de spălare B
– S-a incubat 5 minute la temperatura camerei, folosindu -se agitarea
– S-a îndepărtat soluția și s -a adă ugat 1 ml Color developer
– S-a incubat 20 minute la temperatura camerei, la întuneric, folosindu -se agitare a
– S-a îndepă rtat soluția și s -au spă lat stripurile cu apă distilată
– Stripurile s -au lasa t la uscat la întuneric, pe hârtie absorbantă înainte de interpretare

5.2.2.5. Interpr etarea rezultatelor PCR -hibridizare

Benzile de hibridizare au fost aliniate un ui model de bandare corespunzător
prezenței/absenț ei alelelor celor 15 polimorfisme. Schema stripului din figura (Figura 1. )
indică poziția diferitelor sonde (benzi). O linie este considerată pozitivă atunci când apare o
bandă pu rpurie (mov) la sfârșitul c oloră rii. Pentru a identifica genotipul unui eșantion trebuie
analizată fiecare bandă cu ajutorul cardului transparent de interpretare. Pentru a alinia corect
benzile cu cardul de interpretare, liniile extreme de sus și de jos se suprapun celor două
poziț ii colorate cu roșu, și respectiv albastru.
În urma cit irii benzilor și interpretă rii ace stora, profilul genetic al fiecă rei paciente a
fost î nregistrat pe hârtie, ș i transferat în Excel. Doi observatori cu experiență au efectuat
citirea ș i scorizarea profilului comparând rezultatele și efectuând ajustă ri și corectă ri în
funcț ie de intensitatea benzilor. Î n cazul probelor cu rezulta t echivoc (benzi slabe sau lipsă) a
fost efectuată repetarea analizei î ncepâ nd fie cu re -extragerea ADN din probă, fie cu PCR.

50

Strip Card de interpretare

Figura1. Schema stripului și cardul transparent de interpretare

51
5.3. Prelucrarea statistică
Prelucrarea statistică a datelor s -a efectuat în programul MS Excel și programul
Minitab, versiunea 16, precum și în utilitarul MedCalc (www.medcalc.com).
Pentru analiza datelor au fost aplicate testul Hardy -Weinberg pe lotul de lucru și testul
Odds Ratio de comparare a lotului clinic cu o populație generală, în acest caz aplicând un
nivel de încredere CI = 95%.
Pentru compararea efectului (cumulativ) al alelelor de risc asupra pierderilor de
sarcină (conform ipotezei 2 a acestui studiu) am utilizat testul T – Student (CI=95%, p<0.05,
bidirecțional), urmărind variația mediei numărului alelelor de risc la femei cu un singur avort
față de cele cu mai multe avorturi spontane. Această analiză a ignorat alți posibili factori de
influență precum vârsta femeii la momentul avortului.
În lipsa unui eșantion de comparație (dat fiind costul ridicat al genotipării), pentru
testul Odds Ratio au fost utilizate date derivate din procentajele ale lice ale populației
generale, conform baz elor de date NCBI, 1000 Genoms și ALFRED (alfred.med.yale.edu). În
acest scop au fost selectate loturi cât mai apropiate geografic și etnic de populațiile din
România (europeni, caucazieni) și numeric comparabile cu lotul clinic din această lucrare.
Frecve nțele alelice pentru fiecare din polimorfismele testate au fost derivate prin re -calculare
pe baza procentajelor raportate în baza de date. În cazul în care nu s -a putut selecta un lot
optim de comparație, au fost utilizate datele de populație generală din 1000 Genoms.
În cazul testului Odds Ratio, alela de risc (mutanta) a fost considerată condiția de
expunere (" exposure ") iar alela normală condiția de bază. Apartenența la grupul clinic a fost
considerată situația de rezultat clinic pozitiv (" bad outcome" ) adică apariția pierderii de
sarcină. Apartenența la grupul populației generale a fost considerată situația de rezultat clinic
negativ (" good outcome "), adică inexistența pierderii de sarcină.
LOT CLINIC POPULAȚIE GENERALĂ
Rezultat pozitiv Rezultat n egative
(pierdere de sarcină) (fără pierdere de sarcină)
Expunere Frecvență alela de risc Frecvență alela de risc
(alela de risc) (aM lot clinic) (aM pop gen)
Lipsa expunere Frecvență alela neutră Frecvență alela neutral
(alela neutra) (aW lot cl inic) (aW pop gen)
Tabel 1 . Modul de structurare al datelor pentru analiza Odds Ratio a riscului de avort
în funcție de frecvența unei alele de risc. aM = alela mutantă (de risc), aW = alela normală.

52
Este evident că acest mod de structurare al datelor pe ntru analiza Odds Ratio ignoră
pierderile de sarcină din populația generală și favorizează obținerea unor rezultate statistic
semnificative (eroare de tip I) pentru as ocierea dintre alelele de risc ș i avort. Prin urmare,
analiza Odds Ratio a fo st efectuată utilizâ nd un set de considerente care pot conduce la
supraestima rea efectului alelelor de risc î n lotul clinic. Cu toate acestea, dată fiind lipsa unui
eșantion de control, pe baza analizelor din acest studiu este posibilă evaluarea importanț ei
relative a mutaț iilor trombofilice în pierderea de sarcină (ordonarea valorilor OR ale
acestora). Formula utilizată pentru calcu lul Odds Ratio bazat pe frecvenț ele alelelor este
(www.Medcalc.org):

(aM lot clinic) / (aW lot clinic) (aM lot clinic) x (aW pop gen)
OR = ––––––––––––– = ––––––––––––-
(aM pop gen) / (aW pop gen) (aW lot clinic) x (aM pop gen)

Testele Hardy -Weinberg ș i Odds Ratio au util izat alela ca unitate de analiză . Testul T –
Student a ut ilizat subiectul ca unitate de anali ză. Având în vedere numă rul limi tat de cazuri
din acest studiu și lipsa unui eșantion veritabil de comparație, nivelul de semnificație
statistică (p< 0.05) a fost interpretat atât independent cât și î n conformitate cu pr ocedur a
introdusă de Bonferroni (Wh itlock si Schlutter, 2015).

5.4. Rezultate și discuții
Într-o primă etapă am efectuat analiza descriptivă a datelor pentru a determina distribuția
alelelor, preponderența avorturilor spontane și caracteristicile vâ rstelor din eșantionul de
femei. Un număr redus de subiecți au fost excluși din studiu deoarece datele clinice au indicat
posibilitatea existenței unor cauze citogenetice (trisomii) ale avortului. În această categorie
am inclus și situațiile de avort asist at medical cu sarcină oprită în evoluție (SOE) dacă acestea
nu erau însoțite de o istorie a avortului spontan.

53
5.4.1. Numărul avorturilor spontane

Figura 2. Frecvența avorturilor spontane

Majoritatea femeilor au avut unu l sau două avorturi spontane în antecedente (80%).
Este de remarcat însă că numărul femeilor care au avut mai mult de două avorturi în
antecedente consti tuie o proporție de 20%. Proporț ia ridicată a acestora, sugerează că
investigațiile efectuate pentru de pistarea cauzei avorturilor sunt subestimate (Figura 2 ).
5.4.2. Vârsta maternală
7 (3.97 %) 46 (26.13%) 58 (32.95%)
45 (25.56%)
18 (10.22%)
2 (1.13
%)
20-25 ani 25-30 ani 30-35 ani 35-40 ani 40-45 ani 45-50 anin=17 5

Figura 3. Distribuția vârstei maternale, în momentul testării

54
Cele mai multe dintre pacientele testate, au o vârstă cuprinsă între 30 și 35 de ani
(32.95%), cu un procent ap ropiat fiind pacientele cu vârsta cuprinsă între 35 și 40 de ani
(25.56%). Aceste date sunt în concordanță cu literatura (de. ex. studiul realizat de Risch HA.
și colab., 1988), care susține ipoteza conform căreia odată cu înaintarea în vârstă, crește risc ul
de avort spontan. Preponderența femeilor cu vârsta de peste 30 de ani, care au suferit unul sau
mai mule avorturi spontane, era de așteptat. Cu toate acestea, în lotul de studiu, cu un procent
ridicat (26.13%) sunt femeile cu vârsta cuprinsă între 25 și 30 de ani, iar acest fapt ne arată că
acest lot cuprinde un segment notabil pentru care vârsta mamei nu pare a fi principalul factor
în declanșarea avortului spontan, respectiv a avortului spontan recurent. Prin urmare, conform
cu una din ipotezele de luc ru, prezența vârstelor sub 30 ani în lot sugerează că factorii de
trombofilie ar putea avea un impact puternic asupra pi erderii de sarcină (Figura 3 ).

5.4.3. Frecvența genotipurilor polimorfismelor testate

MTHFR
677
ATR
A1166C
CC (homozigot normal) 63 (36%)
AA (homozigot normal) 103 (58%)
CT (heterozigot) 91 (51%)
AC (heterozigot) 62 (35%)
TT (homozigot mutant) 23 (13%)
CC (homozigot mutant) 12 (7%)

MTHFR
1298
FXIII
V39L
AA (homozigot normal) 93 (52%)
GG (homozigot normal) 102 (58%)
AC (heterozigot) 72 (40%)
GT (heterozigot) 64 (36%)
CC (homozigot mutant) 14 (8%)
TT (homozigot mutant) 11 (6%)

AGT
M235T
FGB
G455A
MM (homozigot normal) 43 (24%)
GG (homozigot normal) 92 (52%)
MT (heterozigot) 92 (52%)
GA (heterozigot) 75 (42%)
TT (homozigot mutant) 42 (24%)
AA (homozigot mutant) 10 (6%)

Tabel 2 . Distribuția genotipurilor polimorfismelor testate în lotul clinic.

În tabelul 2 se poate observa că pentru fiecare polimorfism, în lotul de studiu, se
întâlnesc toate cele trei variante alelice: homozigot normal, heterozigot și homozigot mutant.
În patru dintre cele 6 gene (MTHFR 1298, ATR, FXIII și FGB), forma homozigot normal se

55
întâlnește cu precădere, însă în cazul MTHFR 667 și AGT se observă 2 diferențe: forma
heterozig otă este cea predominantă, iar numărul cazurilor cu forma homozigot mutant este
mai mare comparativ cu celelalte, acest lucru indicând o frecvență mai mare a variantei
alelice mutante, a genelor respective.
Marea majoritate a polimorfismelor studiate se g ăsesc în echilibru Hardy -Weinberg,
cu excepția CBS, GPIIIa, APOE (ApoE4 -112), APOE (ApoE4 -115), ACE (Tabelul 3 ).

Pacienți HW
Lot clinic
SNP rs# Nr tot W H M Wf Hf Mf X2 p
MTHFR A1298C rs1801131 175 93 70 12 0.53 0.40 0.07 0.06 0.81
MTHFR C677T rs1801133 175 63 90 22 0.36 0.51 0.13 1.36 0.24
ATR A1166C rs5186 175 103 61 11 0.59 0.35 0.06 0.11 0.74
AGT M235T rs699 176 43 91 42 0.24 0.52 0.24 0.28 0.60
FGB G455A rs1800787 175 92 74 9 0.53 0.42 0.05 1.45 0.23
FXIII V39L rs1800790 175 102 63 10 0.58 0.36 0.06 0.00 0.95
FII G20210A rs1799963 175 168 7 0 0.96 0.04 0.00 0.07 0.79
FV A506G rs6025 175 164 10 1 0.94 0.06 0.01 3.29 0.07
HR2FV A4070G rs1800595 175 146 29 0 0.83 0.17 0.00 1.43 0.23
CBS I278T/844ins68  rs5742905 175 158 14 3 0.90 0.08 0.02 11.61 0.00
PAI-1 I-5G/D-4G rs1799889 175 39 89 47 0.22 0.51 0.27 0.07 0.80
GPIIIa Leu59Pro rs5918 175 58 76 41 0.33 0.43 0.23 2.65 0.10
APOE  ApoE4 (arg112) rs7412 175 137 33 5 0.78 0.19 0.03 2.74 0.10
ApoE4 (arg115) rs429358 175 143 32 0 0.82 0.18 0.00 1.88 0.17
ACE I/Drs4343 175 58 76 41 0.33 0.43 0.23 2.65 0.10

Tabelul 3 . Echilibrul Hardy -Weinberg în populația de studiu

56
5.4.3. Frecvența totală a alelelor mutante
MTHFR 667
20%
MTHFR 1298
14%
AGT
26% ATR
13% FGB
14% FXIII
13%
n=178 MTHFR 667
MTHFR 1298
AGT
ATR
FGB
FXIII

Figura 4. Frecvența totală a alelelor mutante.
După analiza rezultatelor, s -a putut observa faptul că, într lotul clinic de 178 de
paciente, alela mutantă cea mai frecventă este cea a genei AGT, cu o frecvență de 26 %.
Alela mutantă pentru gena MTHFR polimorfismul C667T prezintă o frecvență de 20%. Cele
mai puțin frecvente alele mutante sunt cele pentru: gena FXIII și gena ATR, ambele având o
frecvență de 13%, urmate de alte două alele mutante cu o frecvență de 14 %, și anume alelele
mutante pe ntru genele FGB și MTHFR polimorfismul A1298C. De asemenea se poate
observa o diferență clară, de 6%, între alelele mutante ale aceleiași gene: MTHFR
polimorfismul C667T și respectiv MTHFR polimorfismul A1298C.

57
5.4.5. Asocierea dintre numărul avort urilor spontane si numărul alelelor de risc

1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 av 3 9 11 16 11 9 1 1 1
2 av 6 8 13 16 14 4 1 0 0
3 av 1 1 2 8 4 1 1 0 0
4 av 0 1 1 3 0 0 0 0 0
>5 av 0 1 2 1 1 0 0 0 0024681012141618n=17 5
1 av
2 av
3 av
4 av
>5 av

Figura 5. Asocierea dintre numărul avorturilor spontane și numărul alelelor de risc
În cazul asocierii dintre numărul de avorturi spontane și numărul alelelor de risc,
numărul de avorturi spontane a crescut direct proporț ional cu numărul de alele de risc, însă
numai până la un anumit punct. Atunci când numărul de alele de risc este egal cu 4, avorturile
spontane înregistrează cel mai mare număr. O posibilă interpretare a acestui rezultat este că
numărul de a vorturi spontane crește odată cu numărul de alele de risc, până în momentul în
care numărul de alele de risc atinge numărul de 4 alele de risc, după care, deși numărul de
alele de risc crește, numărul de avorturi spontane scade. O problemă cu acest mod de
interpretare este că numărul de avorturi spontane depinde și de alți factori precum vârsta
femeii, vârsta deciziei de a procrea, calitatea serviciilor ginecologice disponibile pentru
subiecți, etc. Multe din aceste date nu sunt momentan disponibile pentru acest studiu.
Remarcăm că pe un lot redus de paciente ca în cazul de față, și pe acest tip de analiză, există

58
o limită atât a numărului de alele ce pot fi luate în considerare cât și o limită fizică și
temporală a numărului de avorturi spontane ce pot exis ta per subiect.
O analiză T -Student a infirmat existența unor diferențe ale numărului de alele de risc
între femeile cu avort spontan singular față de cele cu avort spontan repetat. Astfel, femeile
cu un singur avort spontan (N = 64) au în medie 3.94 alel e de risc, sd = 1.76, iar cele cu avort
spontan repetat (N = 90) au în medie 3.71 alele de risc, sd = 1.40 (t = 0.95, p=0.39, df = 115).

5.4.6. Distribuția frecvențelor alelice și Odds Ratio

Pentru f iecare genă î n parte, s -au calculat frecvențele alelice, pentru alela normal ă și
alela mutant ă, comparându -se astfel frecvenț ele alelice ale grupului de studiu cu frecvenț ele
alelice din populaț ia gen erală. Î n plus, s -a calculat Odds Ratio (OR) . OR este o comparație
între ș ansa de apariț ie a unui eveniment după expunerea la un factor de risc , cu șansa de
apariț ie a acelui eveniment într -o situație de control sau de referință.
În ca zul acestui studiu , evenimentul este reprezentat de avortul spontan, iar factorul de
risc este reprezentat de alela mutantă .
Bonferroni
Gena Variant rs# OR p 14 teste
Aw Am Dir Aw Am Minim Maxim 0.004
MTHFR A1298C rs1801131 256 94 < 250 100 0.918 0.659 1.278 0.612 –
MTHFR C677T rs1801133 216 134 > 242 108 1.390 1.017 1.901 0.039 –
ATR A1166C rs5186 267 83 > 275 75 1.136 0.799 1.625 0.470 –
AGT M235T rs699 177 175 < 154 198 0.773 0.572 1.035 0.083 –
FGB G455A rs1800787 258 92 > 286 64 1.603 1.111 2.286 0.011 –
FXIII V39L rs1800790 267 83 > 291 59 1.523 1.056 2.226 0.025 –
FII G20210A rs1799963 343 7 > 347 3 2.410 0.605 9.204 0.216 –
FV A506G rs6025 338 12 > 343 7 1.740 0.677 4.472 0.250 –
HR2FV H1299R rs1800595 321 29 > 330 20 1.520 0.826 2.689 0.185 –
CBS I278T/844ins68  rs5742905 330 20 > 350 1.0 0.0 0.006 0.353 0.003 da
PAI-1 I-5G/D-4G rs1799889 167 183 < n/a n/a n/a
GPIIIa Leu59Pro rs5918 192 158 > 307 43 5.900 4.009 8.611 0.0001 da
APOE  ApoE4 (arg112) rs7412 307 43 > 327 23 2.002 1.172 3.382 0.011 –
APOE ApoE4 (arg115) rs429358 318 32 < 300 50 0.606 0.377 0.967 0.036 –
ACE I/D rs4343 192 158 < 163 187 0.715 0.533 0.966 0.029 -CI 95%Odds Ratio
Pop generală Paciente Frecvențe alelice

Tabel 4 . Sinteza analizei fecvențelor alelice ș i a Odds Ratio pentru 15 polimorfisme ale unor
gene implicate direct sau indirect în mecanisme ale coagulă rii. Sunt incluse frecvenț ele
alelice a 175 paciente cu avort spontan în comparație cu frecvenț e alelice derivate din
procente ale populaț iei generale. Rezultatele statistic semnificative pen tru Odds Ratio sunt
prezentate î ngroș at, iar cele ce rămân semnificative după corecț ia Bonferroni sunt subliniate.

59
Tabelul 4 prezintă într -o formă sumarizată rezultatele obținute pentru distribuția
alelelor genelor testate în acest studiu. Rezultate statistic semnificative au fost obținute pentr u
polimorfismele MTHFR C677T (p=0.039), FGB G455A (p=0.011), FXIII V39L (p=0.025),
APOE arg112 (p =0.011), CBS I178T/844ins68 (p=0.003 ) si GPIIIa Leu59Pro (p=0.0001). În
aceste cazuri alelele mutante (de risc) sunt mai frecvent întâlnite în populația clini că decât în
populația generală, fapt simbolizat prin [>] în coloana Dir (directie) din tabel.
În cazul polimorfi smelor APOE arg115 (p=0.036) și ACE I/D (p=0.029) rezultatele
sunt de asemenea statistic semnificative, dar în direcția unui surplus d e alele m utante în
popula ția generală (simbolizat prin [<]).
În mod special sunt de reținut polimorfismele CBS I178T /844ins68 (p=0.003 ) și
GPIIIa Leu59Pro (p=0.0001) care rămân statistic semnificative și în urma unei corecții
Bonferroni. În cazul polimorfismului P AI 1 4G/5G nu am identificat o sursă potrivită pentru
a deriva frecvențe ale polimorfismului în populația ge nerală.

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 134 108
Alela normală 216 242216 242 134 108
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc

Figura 6. Frecvențe alelice MTHFR C667T în lotul clinic și în populația generală.

60

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 94 100
Alela normală 256 250256 250 94 100
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc
Figura 7. Frecvențe alelice MTHFR A1298C în lotul c linic și în populația generală .

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 175 198
Alela normală 177 154177 154 175 198
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc

Figura 8. Frecvențe alelice AGT T235C (M235T) în lotul clinic și în populația generală

61

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 83 75
Alela normală 267 275267 275 83 75
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc
Figura 9. Frecvențe alelice ATR -1 A1166C în lotul clinic și în populația generală.

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 92 64
Alela normală 258 286258 286 92 64
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc

Figura 10. Frecvențe alelice FGB -455 G/A în l otul clinic și în lotul de populație generală.

62

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 83 60
Alela normală 267 291267 291 83 60
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc
Figura 11. Frecvențe alelice al Factor XIII V34L în lotul clinic și în populația generală.
Genotipul C677T este asociat cu un risc crescut de pierdere a sarcinii recurente la caucazieni.
(Wu X., și colab., 2012) iar rezultatul frecvenței alelei de risc din acest studiu, pare să meargă
în aceeași direcție cu informațiile din literatură, acest polimorfism având o frecvență a alelei
de risc semnificativ mai mare, față de frecvența alelei de risc din populația generală.
AGT polimorfismul M235T a fost raportat (Ohkubo și colab., 1983) ca asociat cu
predispoziția esențială la hipertensiune, si cu hipertensiunea indusă de sarcină (PIH,
preeclampsie, o tulburare heterogenă, care complică 5 -7% din toate sarcinile și rămâne o
cauză principală în morbiditate și mortalitate). Deficiența de antitrombină crește riscul de
apariție al ASR. Cu toate aceste a, în studiul nostru frecvența alelei mutante din LS nu sprijină
această ipoteză .
Polimorfismul cel mai studiat, asociat cu trombofilia și avortul spontan este G455A la
nivelul genei FGB, asociat cu un nivel de 7 -10% mai crescut de fibrinogen, în urma căruia
crește depozitarea intravasculară de fibrină prin interacțiunea substratului enzimatic cu
trombină, fibrinogen și tro mbocite, ducând astfel la tromboză și avort spontan (Torabi și
colab., 2012 ). Luând in considerare acest studiu și ipoteza de lucru, frecvența alelei mutante
în cazul genei FGB, ar trebui sa fie considerabil mai mare față de cea din populația generală.
Iar în cazul acestui lot de studiu, datele susțin ipoteza de lucru, întrucât valoarea frecvenței

63
alelei mu tante din lotul de studiu este mai mare față de valoarea frecvenței alelei mutante, din
populația generală.
Un alt factor important și asociat adesea cu trobofilii și apariția avortului este factorul XIII.
FXIII -A fiind identificat în macrofagele prezente în uter, în țesutul de implantare și în
placenta. Cauza exactă a pierderilor de sarcină la femeile cu deficit de FXIII este
necunoscută. Proces ul de imp lantare implicâ nd o interacțiune complexă între blastocist și
uter, iar FXIII joacă un rol esențial în acest proces , el face legătura între fibrină (ogen) și
fibronectină, ambele fiind importante pentru atașarea placentei la uter (Inbal si Muszbek,
2003). Valoarea crescută a frecvenței alelice mutante precum și cea a OR, în cadrul lotului
de studiu, față de cea raportată în populația generală, susține ipoteza de lucru.
Fiecare pacientă a dispus de un panel trombofilic extins, realizându -se genotiparea
mai multor factori, precum FVL A506G, FII G20210A, FVHR2, CBS I278T/844ins68, PAI –
1, GPIIIa Leu59Pro, APOE ApoE4 (arg112) și ApoE4 (arg115), ACE I/D.
Dintre toți acești factori, cei care au avut rezult ate remarcabile sunt FII (protrombina)
G20210A, CBS I278 T/844ins68 si GPIIIa Leu59Pro .

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 7 3
Alela normală 343 347343 347 7 3
338340342344346348350352Alela normală Alela de risc

Figura 12. Frecvențe alelice FII G20210A în lotul clinic și în populația generală.

64

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 20 1
Alela normală 330 350330 350 20 1
315320325330335340345350355Alela normală Alela de risc
Figura 13. Frecvențe alelice CBS I278T/844ins68 în lotul clinic și în populația generală.

Lot clinic Pop. generală
Alela de risc 158 43
Alela normală 192 307192 307 158 43
050100150200250300350400Alela normală Alela de risc

Figura 14. Frecvențe alelice GPIIIa Leu 59Pro (T1565) în lotul clinic și în populația generală.

65
FII sau Protrombina, un factor foarte important în cascada de coagulare, raportat în
numeroase studii a fi frecvent și direct implicat în apariția avortului spontan, și în cazul de
față pare să susț ină ipoteza de lucru. Astfel, la nivelul acestui studiu, chiar dacă frecvența
alelei mutante este mică (7), aceasta este mult mai mare față de frecvența ale lei mutante din
populația generală (3).
Un alt rezultat remarcabil este dat de gena CBS, și anume a inserției de 68 de perechi
de baze în cis (o substituție a timinei cu citozina la nucleotida 833, T833C), cel mai frecvent
detectată la pacienții cu homocistinurie. Frecvența inserției, este foarte mare în lotul de studiu
(32) față de frecvența acesteia ra portată în populație (0.3). Valoarea OR este mult mai mare
în cazul lotului de studiu față de cea din populație, aceasta rămânând semnificativă și în urma
corecț iei Bonferroni.
Rezultatul genei GPIIIa, care este o componentă cheie în calea de agregare plac hetară
indica de asemenea un factor major asociat pierderii de sarcina in grupul clinic. Frecvența
alelică mutantă este semnificativ mai mare în cazul pacientelor care au suferit avorturi
spontane (158) față de frecvența alelică raportată în populația gene rală (43) .

66

CONCLUZII

1. Trombofilia ereditară este o afecțiune genetică, cu etiologie heterogenă, produsă prin mutații
descrise la aproape toți factorii coagulării.
2. Asocierea de polimorfisme ale genelor implicate î n procesul coagulării constituie un factor de
risc crescut pentru apariția avortului spontan (AS), respectiv a avortului spontan repetat
(ASR ).
3. Acest studiu este unul preliminar și limitat dato rită numărului redus de cazuri, și a lipsei unui
eșantion de co ntrol dedicat , datorită costurilor ridicate ale testelor.
4. Apreciem că sunt necesare în continuare cercetări în aceast ă direcți e pe loturi de paciente din
România ș i introducerea unui screening pentru cele mai frecvente polimorfisme asociate cu
AS ș i ASR. P entru FIV (Fertilizare in vitro ) este foarte important să se realizeze testul celor
15 mutații sau cel puțin a celor detectate a fi relevante succesului de implantare. Sugerăm
femeilor cu vârsta peste 30 de ani testele de trombofilie, pentru a detectat fre cvența alelelor de
risc și considerăm că în stadiul actual al cunoașterii și al practicii curente s -ar putea impune
testarea pentru trombofilie a tuturor femeilor cu cel puțin două avorturi în antecedente.
5. Pe viitor vom căuta frecvenț e ale unor loturi de c ontrol mai potrivite lotului nostru , și vom
extinde eș antionul de lucru . Vom adăuga date biografice mai amănunțite ș i vom efectua o
sortare a lotului clinic după crite rii mai stricte de vârstă, afecțiuni adiț ionale, etc. î n colaborare
cu medicii pacientelo r.
6. Polimorfismele GPIIIa și CBS par să fie cele mai impo rtante variante genetice asociate cu AS
și ASR, confirmate î n cazul lotului studiat, în urma aplică rii celor mai restrictive metode de
verificare a semnificaț iei statistice a datelor.
7. Este posibil ca și alte polimorfisme asociate trombofiliilor, de ex – MTHFR C677T, AGT
M235T, ATR A1166C, FGB G455A, FXIII V39L, FII G20210A să fie implicate în apariția
AS ș i/sau ASR, dar aceste date sunt în acest moment î n curs de verificare.
8. În măsura în care rezul tatele obținute î n cazul APOE arg115 ș i ACE I/D iți mențin nivelul de
semnificație statistică, este necesară o investigație suplimentară asupra mecanismelor prin
care aceste polimorfisme pot in fluența manifestă rile de tip patologic (trombofilii, AS ș i ASR) .
De a semenea sunt necesare investigaț ii asupra efectului combinat al mai multor polimorfisme
implicate î n procesele fiziologice care conduc la AS ș i ASR.

67

BIBLIOGRAFIE

1. Abonia, J. P., Abel, K. J., Eddy, R. L., Elliott, R. W., Chapman, V. M., Shows, T. B.,
Gross, K. W. (1993) "Linkage of Agt and Actsk -1 to distal mouse chromosome 8
loci: a new conserved linkage". Mammalian Genome 4: 25 -32.
2. Aida Inbal, Laszlo Muszbek (2003) "Coagulation Factor Deficiencies and Pregnancy
Loss ". SEMINARS IN THROMBOSIS AND HEMOSTASIS/VOLUME 29,
NUMBER 2 . 172 -173
3. Allen J. Wilcox, M.D., Ph.D., Clarice R. Weinberg, Ph.D., John F. O'Connor, Ph.D.,
Donna D. Baird, Ph.D., John P. Schlatterer, M.S., Robert E. Canfield, M.D., E. Glenn
Armstrong, Ph.D., and Bruce C. Nisula, M.D. N En gl J Med (1988). "Incidence of
early loss of pregnancy".; 319: 189 –94
4. Alzforum. (2010). ALZGENE – ‘’META -ANALYSIS OF ALL PUBLISHED AD
ASSOCIATION STUDIES (CASE -CONTROL ONLY) APOE_E2/3/4.’’
5. Andrew M, Paes B, Milner R, Johnston M, Mitchell L, Tollefsen DM, P owers P.
(1987). "Development of the human coagulation system in the full -term infant".
Blood. 70 (1): 165 –172.
6. Baars H, van der Smagt J, Doevandans P. (2011). "Clinical Cardiogenetics". London:
Springer.
7. Bailey LB (2003). "Folate, methyl -related nutrients , alcohol, and the MTHFR 677C –
>T polymorphism affect cancer risk: intake recommendations". The Journal of
Nutrition. 133 (11 Suppl 1): 3748S –3753S.
8. Bajzar L, Morser J, Nesheim M. (1996). "TAFI, or plasma procarboxypeptidase B,
couples the coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin –
thrombomodulin complex". The Journal of Biological Chemistry. 271 (28): 16603 8.
9. Bauer, KA. Hypercoagulable States. In: Hoffman, R.; Benz, EJ.; Shattil, SJ.; Furie,
B.; Silberstein, LE.; McGlave, P., editors. (200 0). "Hematology Basic Principles and
Practice". 3. Churchill Livingstone; New York: p. 2009 -2039.

68
10. Bare S.N., Pcika R., Balogh I., Ajzner E. (2000). " Factor V kiden as a risk factor for
miscarriage and reduced fertility" . N Z J Obstet Gynecol. 40: 2: 186 -190
11. Bentley NJ, Holtzman DA, Flaggs G, Keegan KS, DeMaggio A, Ford JC, Hoekstra
M, Carr AM (1996). "The Schizosaccharomyces pombe rad3 checkpoint gene". The
EMBO Journa l. 15 (23): 6641 –51.
12. Boulpaep EL, Boron WF (2005). "Integration of Salt and Water Balance ". Medical
Physiology: a Cellular and Molecular Approach. Philadelphia, Pa.: Elsevier Saunders.
pp. 866 –867.
13. Bouma BN, von dem Borne PA, Meijers JC. (1998) "Factor XI and protection of the
fibrin clot against lysis —a role for the intrinsic pathway of coagu lation in
fibrinolysis". Thromb Haemost.; 80:24 –27.
14. Brass, LF., Hoffman, R.; Benz, EJ.; Shattil, SJ.; Furie, B.; Cohen, HJ.; Silberstein,
LE.; McGlave, P., editors. (2000). " The molecular basis for platelet activation" .
Hematology Basic Principles and Prac tice. 3. Churchill Livingstone; New York:. p.
1753 -1770.
15. Breslow JL, Zannis VI, SanGiacomo TR, Third JL, Tracy T, Glueck CJ (1982).
"Studies of familial type III hyperlipoproteinemia using as a genetic marker the apoE
phenotype E2/2". Journal of Lipid Rese arch. 23 (8): 1224 –35.
16. Bünning P, Riordan JF. (1985). "The functional role of zinc in angiotensin converting
enzyme: implications for the enzyme mechanism". Journal of Inorganic Biochemistry.
24 (3): 183 –98.
17. Burt TD, Agan BK, Marconi VC, He W, Kulkarni H, Mold JE, Cavrois M, Huang Y,
Mahley RW, Dolan MJ, McCune JM, Ahuja SK (2008). "Apolipoprotein (apo) E4
enhances HIV -1 cell entry in vitro, and the APOE epsilon4/epsilon4 genotype
accelerates HIV disease progression". Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 105 (25): 8718 –23
18. Cambien, F., Alhenc -Gelas, F., Herbeth, B., Andre, J. L., Rakotovao, R., Gonzales,
M. F., Allegrini, J., Bloch, C. (1988). "Familial resemblance of plasma angiotensin –
converting enzyme level: the Nancy study". Am. J. Hum. Genet. 43: 774 -780.
19. Camp JM, Rai R, Ison C, Regan L, Taylor -Robinson D. (1996 )."Association of
bacterial vaginosis with a history of second trimester miscarriage". Hum Reprod; 11:
1575 –78.

69
20. Carter JC, Church FC (2009). "Obesity an d breast cancer: the roles of peroxisome
proliferator -activated receptor -γ and plasminogen activator inhibitor -1’’
21. Castaman G, Faioni EM, Tosetto A, Bernardi F. (2003)."The factor V HR2 haplotype
and the risk of venous thrombosis: a meta -analysis." Haemato logica. Oct;
88(10):1182 -9
22. Chapman J, Vinokurov S, Achiron A, Karussis DM, Mitosek -Szewczyk K, Birnbaum
M, Michaelson DM, Korczyn AD (2001). "APOE genotype is a major predictor of
long-term progression of disability in MS". Neurology. 56 (3): 312 –6
23. Chard T . (1991). "Frequency of implantation and early pregnancy loss in natural
cycles. Baillieres Clin Obstet Gynaecol"; 5: 179 –89
24. Chawla A, Boisvert WA, Lee CH, Laffitte BA, Barak Y, Joseph SB, Liao D, Nagy L,
Edwards PA, Curtiss LK, Evans RM, Tontonoz P (2001) . "A PPAR gamma -LXR –
ABCA1 pathway in macrophages is involved in cholesterol efflux and atherogenesis".
Molecular Cell. 7 (1): 161 –71.
25. Cimprich KA, Shin TB, Keith CT, Schreiber SL (1996). "cDNA cloning and gene
mapping of a candidate human cell cycle checkp oint protein". Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (7): 2850 –5.
26. Civeira F, Pocoví M, Cenarro A, Casao E, Vilella E, Joven J, González J, Garcia -Otín
AL, Ordovás JM (1996). "ApoE variants in patients with type III
hyperlipoproteinemia". Atherosclerosis. 127 (2): 273 –82.
27. Claudia Dellas, David J. Loskutoff (2005). "Historical analysis of PAI -1 from its
discovery to its potential ro le in cell motility and disease" . Thromb Haemost 2005;
93: 631 -40
28. Clifford K, Flana gan AM, Regan L. (1999). "Endometrial CD56+ natural killer cells
in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study". Hum Reprod; 14:
2727 –30.
29. Clifford K, Rai R, Watson H, Franks S, Regan L. (1996). "Does suppressing
luteinising hormone secreti on reduce the miscarriage rate? Results of a randomised
controlled trial".; 312: 1508 –11.
30. Coates D (2003). "The angiotensin converting enzyme (ACE)". The International
Journal of Biochemistry & Cell Biology. Renin -Angiotensin Systems: State of the
Art. 35 (6): 769 –73.

70
31. Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ, Schmechel DE, Gaskell PC, Small GW,
Roses AD, Haines JL, Pericak -Vance MA (1993). "Gene dose of apolipoprotein E
type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families". Science. 261
(5123): 921 –3.
32. Craig LB, Ke RW, Kutteh WH. (2002). "Increased prevalence of insulin resistance in
women with a history of recurrent pregnancy loss". Fertil Steril; 78: 487 –90.
33. Dahlback B. (2000). "Blood coagulation". Lancet.; 355:1627 –1632.
34. Damus PS, Hicks M, Rosenberg RD. (1973). "Anticoagulant action of heparin".
Nature.; 246:355 –357.
35. Dardik R, Loscalzo J, Inbal A. (2006). "Factor XIII (FXIII) and angiogenesis". J
Thromb Haemost; 4: 19 –25.
36. Davie EW, Kuhl man JD (2006). "An overview of the structure and func tion of
thrombin". Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32 Suppl 1: 3 –15.
37. Deary IJ, Whiteman MC, Pattie A, Starr JM, Hayward C, Wright AF, Carothers A,
Whalley LJ (2002). "Cognitive change and the APOE epsilon 4 allele". Nature. 418
(6901): 932.
38. Degen SJ , Davie EW (1987). "Nucleotide sequence of the gene for human
prothrombin". Biochemistry. 26 (19): 6165 –77.
39. Dorgalaleh A, Naderi M, Hosseini MS, Alizadeh S, Hosseini S, Tabibian S, et al.
(2015). "Factor XIII Deficiency in Iran: A Comprehensive Review of t he Literature.
Seminars in thrombosis and hemostasis;" 41 (3 (41)): 323 –329.
40. Eisenberg DT, Kuzawa CW, Hayes MG. (2010). "Worldwide allele frequencies of the
human apolipoprotein E gene: climate, local adaptations, and evolutionary history".
American Journa l of Physical Anthropology. 143 (1): 100 –11.
41. Emsley J, Knight CG, Farndale RW, Barn es MJ, Liddington RC. (2000). " Structural
basis of collagen recog nition by integrin alpha2beta1" . Cell.; 101:47 –56.
42. Esmon CT, Owen WG. (1981). "Identification of an endothel ial cell cofactor for
thrombin -catalyzed activation of protein C". Proc Natl Acad Sci USA.; 78:2249 –
2252.
43. Falati S, Gross P, Merrill -Skoloff G, Furie BC, Furie B. (2002); "Real -time in vivo
imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thr ombus formation in the
mouse". Nat Med. 8:1175 –1181.

71
44. Farlow MR, He Y, Tekin S, Xu J, Lane R, Charles HC (2004). "Impact of APOE in
mild cognitive impairment". Neurology. 63 (10): 1898 –901. .
45. Federoff M, Jimenez -Rolando B, Nalls MA, Singleton AB (2012). "A large study
reveals no association between APOE and Parkinson's disease". Neurobiology of
Disease. 46 (2): 389 –92.
46. Feussner G, Feussner V, Hoffmann MM, Lohrmann J, Wieland H, März W (1998).
"Molecular basis of type III hyperlipoproteinemia in Germany". Hum an Mutation. 11
(6): 417 –23.
47. Fillardi P (2015). "ACEi and ARBS in Hypertension and Heart Failure". Volume 5.
Switzerland: Springer International Publishing. pp. 10 –13.
48. Födinger M, Hörl WH, Sunder -Plassmann G (2000). "Molecular biology of 5, 10 –
methylenetet rahydrofolate reductase". Journal of Nephrology. 13 (1): 20 –33.
49. Franchini M, Mannucci PM. (2008). "Venous and arterial thrombosis: different sides
of the same coin?". Eur J Intern Med.; 19:476 –481
50. Freeman SB, Yang Q, Allran K, Taft LF, Sherman SL. (2000). "Women with a
reduced ovarian complement may have an increased risk for a child with Down
syndrome". Am J Hum Genet; 66: 1680 –83.
51. French DL, Coller BS, Usher S, Berkowitz R, Eng C, Seligsohn U, Peretz H. (1998).
"Prenatal diagnosis of Glanzmann thrombasthe nia using the polymorphic markers
BRCA1 and THRA1 on chromosome 17". Br J Haematol.;102:582 –587.
52. Friedman G, Froom P, Sazbon L, Grinblatt I, Shochina M, Tsenter J, Babaey S,
Yehuda B, Groswasser Z (1999). "Apolipoprotein E -epsilon4 genotype predicts a
poor outcome in survivors of traumatic brain injury". Neurology. 52 (2): 244 –8.
53. Fritz B, Hallermann C, Olert J, et al. (2001). "Cytogenetic analyses of culture failures
by comparati ve genomic hybridisation (CGH) –Re-evaluation of chromosome
aberration rates in early spontaneous abortions". Eur J Hum Genet; 9: 539 –47.
54. Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den
Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP (1995). "A candidate genetic risk factor
for vascular disease: a common muta tion in methylenetetrahydrofolate reductase".
Nature Genetics. 10 (1): 111 –3.
55. Fulcher CA, Gardiner JE, Griffin JH, Zimmerman TS. (1984). "Proteolytic
inactivation of activated human factor VIII procoagulant protein by activated protein
C and its analogy to factor V". Blood.; 63:486 –489

72
56. Furie B. (2009). "Pathogenesis of thrombosis". Hematology Am Soc Hematol Educ
Program.:255 –258.
57. Gaillard, I., Clauser, E., Corvol, P. (1989). "Structure of human angiotensinogen
gene". DNA 8: 87 -99.
58. Gaillard -Sanchez, I., Matt ei, M. G., Clauser, E., Corvol, P. (1990). "Assignment by in
situ hybridization of the angiotensinogen gene to chromosome band 1q4, the same
region as the human renin gene". Hum. Genet. 84: 341 -343.
59. Gale A. J. (2011). "Current Understanding of Hemostasis". Toxicologic Pathology,
39(1), 273 –280.
60. Garzia E, Borgato S, Cozzi V, et al. (2004). "Lack of expression of endometrial
prolactin in early pregnancy failure: pilot study". Hum Reprod; 19: 1911 –16.
61. Ghebranious N, Ivacic L, Mallum J, Dokken C (2005). "Detect ion of ApoE E2, E3
and E4 alleles using MALDI -TOF mass spectrometry and the homogeneous mass –
extend technology". Nucleic Acids Research. 33 (17): e149.
62. Ghosh, A. K., & Vaughan, D. E. (2012). PAI -1 in Tissue Fibrosis. Journal of Cellular
Physiology, 227(2), 493–507.
63. Giorlandino C, Calugi G, Iaconianni L, Santoro ML, Lippa A. (1998). "Spermatazoa
with chromosomal abnormalities may result in a higher rate of recurrent abortion".
Fertil Steril; 70: 576 –77.
64. Gottlieb DJ, DeStefano AL, Foley DJ, Mignot E, Redline S, Givelber RJ, Young T
(2004). "APOE ɛ4 is associated with obstructive sleep apnea/hypopnea: the Sleep
Heart Health Study". Neurology. 63 (4): 664 –8.
65. Goyette P, Sumner JS, Milos R, Duncan AM, Rosenblatt DS, Matthews RG, Rozen R
(1994). "Human methylenetet rahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping
and mutation identification". Nature Genetics. 7 (2): 195 –200.
66. Goyette P, Sumner JS, Milos R, Duncan AM, Rosenblatt DS, Matthews RG, Rozen
R. (1994). "Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA mapping
and mutation identification". Nature Genetics. 7 (4): 551.
67. Greenwold N, Jauniaux E. (2002). "Collection of villous tissue under ultrasound
guidance to improve the cytogenetic study of early pregnancy failure". Hum
Reprod;17:452 –56.

73
68. Grimbizi s GF, Camus M, Tarlatzis BC, Bontis JN, Devroey P. (2001). "Clinical
implications of uterine malformations and hysteroscopic treatment results". Hum
Reprod Update; 7: 161 –74.
69. Guinto ER, Esmon CT. (1984). "Loss of prothrombin and of factor Xa -factor Va
interactions upon inactivation of factor Va by activated protein C". J Biol Chem.;
259:13986 –13992.
70. Hall, Ph.D., Cecil E.; HENRY S. SLAYTER (1958). "The Fibrinogen Molecule: Its
Size, Shape, and Mode of Polymerization". The Journal of Biophysical and
Biochemic al Cytology. Plate 1. Cambridge, M: e Department of Biology,
Massachusetts Institute of Technology. 5 (1): 11 –6.
71. Hanasaki K, Arita H. (1988). ‘’Characterization of thromboxane A2/prostaglandin H2
(TXA2/PGH2) receptors of rat platelets and their interaction with TXA2/PGH2
receptor antagonists’’. Biochem Pharmacol.; 37:3923 –3929.
72. Harmer, D., Gilbert, M., Borman, R., Clark, K. L. (2002). "Quantitative mRNA
expression profiling of ACE 2, a novel homologue of angiotensin converting
enzyme". FEBS Lett. 532: 107 -110,.
73. Hart R, Khalaf Y, Yeong CT, Seed P, Taylor A, Braude P. (2001). "A prospective
controlled study of the effect of intramural uterine fibroids on the outcome of assisted
conception". Hum Reprod; 16: 2411 –17.
74. Hay PE, Lamont RF, Taylor -Robinson D, Morgan DJ, Ison C, Pearson J. (1994).
"Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery
and late miscarriage".; 308: 295 –98.
75. Hellgren M. (1996). "Hemostasis during pregnancy and puerperium". Haemostasis;
26 (suppl 4) : 244–47
76. Hemming ML, Selkoe DJ (2005). "Amyloid beta -protein is degraded by cellular
angiotensin -converting enzyme (ACE) and elevated by an ACE inhibitor". The
Journal of Biological Chemistry. 280 (45): 37644 –50.
77. Hirahara F, Andoh N, Sawai K, Hirabuki T, Uemura T, Mi naguchi H. (1998).
"Hyperprolactinemic recurrent miscarriage and results of randomized bromocriptine
treatment trials". Fertil Steril; 70: 246 –252.
78. Hoek KS, Schlegel NC, Eichhoff OM, Widmer DS, Praetorius C, Einarsson SO,
Valgeirsdottir S, Bergsteinsdottir K, Schepsky A, Dummer R, Steingrimsson E

74
(2008). "Novel MITF targets identified using a two -step DNA microarray strategy".
Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6): 665 –76.
79. Hoffman M, Monroe DM III. (2001). "A cell -based model of hemostasis". Thromb
Haemo st.; 85:958 –965.
80. Howard, T. E., Shai, S. Y., Langford, K. G., Martin, B. M., Bernstein, K. E. (1990).
"Transcription of testicular angiotensin -converting enzyme (ACE) is initiated within
the 12th intron of the somatic ACE gene". Molec. Cell. Biol. 10: 4294 -4302.
81. Hua Y, Zhao H, Kong Y, Ye M. (2011). "Association between the MTHFR gene and
Alzheimer's disease: a meta -analysis". The International Journal of Neuroscience. 121
(8): 462 –71.
82. Huang X, Chen PC, Poole C (2004). "APOE -ɛ2 allele associated with higher
prevalence of sporadic Parkinson disease". Neurology. 62 (12):
83. Huebbe P, Nebel A, Siegert S, Moehring J, Boesch -Saadatmandi C, Most E, Pallauf J,
Egert S, Müller MJ, Schreiber S, Nöthlings U, Rimbach G (2011). "APOE ε4 is
associated with higher vitamin D l evels in targeted replacement mice and humans".
FASEB Journal. 25 (9): 3262 –70.
84. Ian P. Stolerman (2010). "Encyclopedia of psychopharmacology "(Online -Ausg. ed.).
Berlin: Springer.
85. Imig JD (2004). "ACE Inhibition and Bradykinin -Mediated Renal Vascular
Respo nses: EDHF Involvement". Hypertension. 43 (3): 533 –5
86. Jackson SP. "The growing complexity of platelet aggregation ". Blood. 2007;
109:5087 –5095.
87. Jacobs EG, Kroenke C, Lin J, Epel ES, Kenna HA, Blackburn EH, Rasgon NL
(2013). "Accelerated cell aging in female APOE -ε4 carriers: implications for hormone
therapy use". PloS One. 8 (2): e54713.
88. Jacobs PA, Hassold TJ. (1987). "Chromosome abnormalities: origin and etiology in
abortions and live births". In: Vogal F and Sperling K, eds. Human genetics. Berlin:
Springe r-Verlag,: 233 –44.
89. Janosík M, Kery V, Gaustadnes M, Maclean KN, Kraus JP (2001). "Regulation of
human cystathionine beta -synthase by S -adenosyl -L-methionine: evidence for two
catalytically active conformations involving an autoinhibitory domain in the C –
terminal region". Biochemistry. 40 (35): 10625 –33.

75
90. Jeve YB, Davies W. (2014). ‘’Evidence -based management of recurrent
miscarriages’’. Journal of Human Reproductive Sciences.;7(3):159 -169.
91. Jivraj S, Anstie B, Cheong YC, Fairlie FM, Laird S, Li TC. (2001). "O bstetric and
neonatal outcome in women with a history of recurrent miscarriage: a cohort study".
Hum Reprod; 16: 102 –06
92. Kadotani H, Kadotani T, Young T, Peppard PE, Finn L, Colrain IM, Murphy GM,
Mignot E (2001). "Association between apolipoprotein E ɛ4 an d sleep -disordered
breathing in adults". Jama. 285 (22): 2888 –90.
93. Kahn ML, Zheng YW, Huang W, Bigornia V, Zeng D, Moff S, Farese RV Jr, Tam C,
Coughlin SR. (1998). ‘’A dual thrombin receptor system for platelet activation’’.
Nature.; 394:690 –694.
94. Kaiser B (2003). "DX -9065a, a direct inhibitor of factor Xa". Cardiovascular Drug
Reviews. 21 (2): 91 –104.
95. Kalousek DK, Pantzar T, Tsai M, Paradice B. (1993). "Early spontaneous abortion:
morphologic and karyotypic findings in 3912 cases". Birth Defects Orig Artic Ser; 29:
53–61.
96. Katy Clifford , Raj Rai, Hazel Watson, Lesley Regan (1994). ‘’ An informative
protocol for the investigation of recurrent miscarriage: preliminary experience of 500
consecutive cases ’’. Human Reproductio n vol.9 no.7 pp. 1328 -1332
97. Kehrel B, W ierwille S, Clemetson KJ, Anders O, Steiner M, K night CG, Farndale
RW, Okuma M, Barnes MJ. (1998) Glycoprotein VI is a major collagen receptor for
platele t activation: it recognizes the platelet -activating quaternary structure of
collagen, whereas CD36, glycoprotein IIb/IIIa, and von Willebrand factor do not.
Blood.
98. Kierszenbaum, Abraham L. (2007). "Histology and cell biology: an introduction to
pathology". Mosby Elsevier.
99. Kirchhofer D, Nemerson Y. (1996). "Initiation of blood coagulation: the tissue
factor /factor VIIa complex". Curr Opin Biotechnol.; 7:386 –391.
100. Kline J, Kinney A, Levin B, Warburton D. (2000). "Trisomic pregnancy and earlier
age at menopause". Am J Hum Genet; 67: 395 –404.
101. Kline J. (1989). "Conception to birth -epidemiology of prenatal devel opment".
Monographs in Epidemiology and Biostatistics. Oxford, Oxford University Press.

76
102. Komáromi I, Bagoly Z, Muszbek L (2011). "Factor XIII: novel structural and
functional aspects". Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (1): 9 –20
103. Koopman LA, Kopcow HD, Rybalov B, et al. (2003). "Human decidual natural killer
cells are a unique NK cell subset with immunomodulatory potential". J Exp Med 198:
1201 –12.
104. Kovalevsky G, Gracia CR, Berlin JA, Sammel MD, Barnhart KT. (2004).
"Evaluation of the association be tween hereditary thrombophilias and recurrent
pregnancy loss: a meta -analysis". Arch Intern Med; 164: 558 –63.
105. Kraus, J. P., Oliveriusova, J., Sokolova, J., Kraus, E., Vlcek, C., de Franchis, R.,
Maclean, K. N., Bao, L., Bukovska, G., Patterson, D., Paces, V., Ansorge, W.,
Kozich, V. (1998). "The human cystathionine beta -synthase (CBS) gene: complete
sequence, alternative splicing, and polymorphisms". Genomics 52: 312 -324
106. Kwang -Hyun Baek, Eung -Ji Lee and Yong -Soo Kim (2007). ‘’Recurrent pregnancy
loss: the key potential mechanisms’’. TRENDS in Molecular Medicine Vol.13 No.7:
313
107. Lachapelle MH, Miron P, Hemmings R, Roy DC. (1996). "Endometrial T, B, and NK
cells in patients with recurrent spontaneous abortion. Altered profile and pregnancy
outcome". J Immun ol.; 156: 4027 –34.
108. Lane DA, Philippou H, Huntington JA. (2005). "Directing thrombin". Blood.;
106:2605 –2612.
109. Lanza, F., Kieffer, N., Phillips, D. R., Fitzgerald, L. A. (1990). "Characterization of
the human platelet glycoprotein IIIa gene: comparison wit h the fibronectin receptor
beta-subunit gene". J. Biol. Chem.
110. Lam SC, Plow EF, D’Souza SE, Cheresh DA, Frelinger AL III, Ginsberg MH.
(1989). ‘’Isolation and characterization of a platelet membrane protein related to the
vitronectin receptor’’. J Biol Che m.; 64:3742 –3749.
111. Lim KJ, Odukoya OA, Ajjan RA, Li TC, Weetman AP, Cooke ID. (2000). "The role
of T-helper cytokines in human reproduction". Fertil Steril; 73: 136 –42.
112. Linda A. Bradley, Glenn E. Palomaki, Jessica Bienstock, Elizabeth Varga, Joan A.
Scott . (2012) "Can Factor V Leiden and prothrombin G20210A testing in women with
recurrent pregnancy loss result in improved pregnancy outcomes?": Results from a
targeted evidence -based review. Genetics in Medicine.; 14, 39 –50.

77
113. Lippincott Williams & Wilkins (2 012). " The Johns Hopkins Manual of Gynecology
and Obstetrics " (4 ed.) 438–439.
114. Liu CC, Liu CC, Kanekiyo T, Xu H, Bu G (2013). "Apolipoprotein E and Alzheimer
disease: risk, mechanisms and therapy". Nature Reviews. Neurology. 9 (2): 106 –18.
115. Luo BH, Springer TA. (2006). ‘’Integrin structures and conformational signaling’’.
Curr Opin Cell Biol.; 18:579 –586.
116. Mahley RW (1988). "Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding
role in cell biology". Science. 240 (4852): 622 –30.
117. Mahmood Hussain, M (2000). "A proposed model for the assembly of
chylomicrons". Atherosclerosis. 148 (1): 1 –15.
118. Mannucci PM. (2008). "Back to the future: a recent history of haemophilia
treatment". Hae mophilia.; 14(Suppl 3):10 –18.
119. Mario R. W. Ehlers, James F. Riordan (1989). "Angiotensin -converting enzyme: new
concepts concerning its biological role". Biochemistry, 28 (13), pp 5311 –5318
120. Marucco, Arianna; et al. (2013). "Interaction of fibrinogen and a lbumin with titanium
dioxide nanoparticles of different crystalline phases". Journal of Physics. Conference
Series. 429 (1)..
121. Mary E Gagou, Mark Meuth, May (2010). "ATR (ataxia telangiectasia and Rad3
related)". Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncol ogy and Haematology
122. Mattei, M. -G., Hubert, C., Alhenc -Gelas, F., Roeckel, N., Corvol, P., Soubrier, F.
(1989). "Angiotensin -I converting enzyme gene is on chromosome 17". (abstract)
Cytogenet. Cell Genet. 51: 1041.
123. McCarron MO, Delong D, Alberts MJ (1999 ). "APOE genotype as a risk factor for
ischemic cerebrovascular disease: a meta -analysis". Neurology. 53 (6): 1308 –11.
124. Mills DC. (1996). ‘’ADP receptors on platelets’’. Thromb Haemost.; 76:835 –856.
125. Mills JL, Simpson JL, Driscoll SG, et al. (1988). "Incid ence of spontaneous abortion
among normal women and insulin -dependent diabetic women whose pregnancies
were identified within 21 days of conception". N Engl J Med; 319: 1617 –23.
126. Mischoulon D, Raab MF (2007). "The role of folate in depression and dementia" .
The Journal of Clinical Psychiatry. 68 Suppl 10: 28 –33.
127. Moffett -King A. (2002). "Natural killer cells and pregnancy". Nat Rev Immunol; 2:
656–63.

78
128. Mondadori CR, Quervain DJ, Buchmann A, Mustovic H, Wollmer MA, Schmidt CF,
Boesiger P, Hock C, Nitsch RM, Papassotiropoulos A, Henke K (2007). "Better
memory and neural efficiency in young apolipoprotein E epsilon4 carriers". Cerebral
Cortex. 17 (8): 1934 –47.
129. Munke, M., Kraus, J., Watkins, P., Tanzi, R., Gusella, J., Millington Ward, A.,
Watson, M., Francke, U. (1985). " Homocystinuria gene on human chromosome 21
mapped with cloned cystathionine beta -synthase probe and in situ hybridization of other
chromosome 21 probes". (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 40: 706 -707
130. Muszbek L, Bagoly Z, Bereczky Z, Katona E ( 2008). "The involvement of blood
coagulation factor XIII in fibrinolysis and thrombosis". Cardiovascular &
Hematological Agents in Medicinal Chemistry. 6 (3): 190 –205.
131. National Center for Biotechnology Information Search database. (2016) ‘’CBS
cystathioni ne-beta-synthase’’ Homo sapiens (human) . (Abstract)
132. National Center for Biotechnology Information Search database. (2016). ‘’APOE
apolipoprotein E’’ Homo sapiens (human) .Abstract)
133. National Center for Biotechnology Information Search database MAP VIEWER.
(2017) ‘’ Homo sapiens (human) . Annotation Release 108 (Current) ’’
134. National Center for Biotechnology Information Search database. (2017) ‘’ABCA3
ATP binding cassette subfamily A member’’. Homo sapiens (human) .
135. National Center for Biotechnology Information Search database. (2017). ‘’F13A1
coagulation factor XIII A chain’’. Homo sapiens (human) .
136. Nieswandt B, Brakebusch C, Bergmeier W, Schulte V, Bouvard D, Mokhtari -Nejad
R, Lindhout T, Heemskerk JW, Zirngibl H, Fassler R. (2001). ‘’Glycoprotein VI but
not alpha2beta1 integrin is essential for platelet interaction with collagen’’. EMBO J.
20:2120 –2130
137. Nishiyama M, Kato Y, Hashimoto M, Yukawa S, Omori K (2000). "Apolipoprotein
E, methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) mutation and the risk of senile
dementia —an epidemiological study using the polymerase chain reaction (PCR)
method". Journal o f Epidemiology / Japan Epidemiological Association. 10 (3): 163 –
72.
138. Nybo Andersen AM, Wohlfahrt J, Christens P, Olsen J, Melbye M. (2000). "Maternal
age and fetal loss: population based register linkage study".; 320: 1708 –12.

79
139. Ober C, Karrison T, Odem RR, et al. (1999). "Mononuclear -cell immunisation in
prevention of recurrent miscarriages: a randomised trial". Lancet; 354: 365 –69.
140. Ohkubo H., Kageyama R., Ujihara M., Hirose T., Inayama S. And Nakanishi S.
(1983). "Cloning and sequence analysis of cdna for rat angiotensinogen".
PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A. 80(8) 2196 -2200.
141. Ojha RP, Gurney JG (2014). "Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and
overall survival in pediatric acute lymphoblastic leukemia: a systematic review".
Leukemia & Lymphoma. 55 (1): 67 –73.
142. Okabe, T., Fusisawa, M., Yotsumoto, M., Takaru, F., Lanzillo, J. J., Fanburg, B. L.
(1985). "Familial elevation of serum angiotensin -converting enzyme". Quart. J. Med.
216: 55 -61.
143. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (2017). "APOE3 isoform, APOE ,
CYS112 and ARG158" -107741#0001
144. Online Mend elian Inheritance in Man (OMIM) (2017). "APOE3 isoform,
hyperlipoproteinemia, type III, autosomal recessive" -107741#0015
145. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (2014). DYSFIBRINOGENEMIA,
CONGENITAL. https ://www.omim.org/entry/616004#title
146. Pecheniuk NM, Morris CP, Walsh TP, Marsh NA. (2001). "The factor V HR2
haplotype: prevalence and association of the A4070G and A6755G polymorphisms".
Blood Coagul Fibrinolysis;12(3):201 -6.
147. Phillipp T, Phillipp K, Reiner A, Beer F, Kalousek DK. (2003). "Embryoscopic and
cytogenetic analysis of 233 missed abortions: factors involved in the pathogenesis of
developmental defects of early failed pregnancies". Hum Reprod; 18: 1724 –32.
148. Phillips MC (2014). "Apolipoprotein E iso forms and lipoprotein metabolism".
IUBMB Life. 66 (9): 616 –23.
149. Preston FE, Rosendaal FR, Walker ID, et al. (1996). "Increased fetal loss in women
with heritable thrombophilia". Lancet; 348: 913 –16.
150. Prummel MF, Wiersinga WM. (2004). "Thyroid autoimmunity and miscarriage". Eur
J Endocrinol; 150: 751 –55.
151. Puglielli L, Tanzi RE, Kovacs DM (2003). "Alzheimer's disease: the cholesterol
connection". Nature Neuroscience. 6 (4): 345 –51.
152. Quenby S, Bates M, Doig T, et al. (1999). "Pre -implantation endometrial leuko cytes
in women with recurrent miscarriage". Hum Reprod; 14: 2386 –91.

80
153. Rabab M Aly, Mona M Taalab, Hayam F Ghazy (2014). "MTHFR A1298C and
C677T gene polymorphisms and susceptibility to chronic myeloid leukemia in
Egyp"t. Int J Clin Exp Pathol. 2014; 7(5): 2571 –2578..
154. Raber J (2008). "AR, apoE, and cognitive function". Hormones and 53 (5): 706 –15
155. Rackow BW, Taylor HS. (2006). "Uterine leiomyomas affect endometrial HOXA10
expression". J Soc Gynecol Investig; 13 (suppl 2): 654 (abstract).
156. Raghupathy R, Mak hseed M, Azizieh F, Omu A, Gupta M, Farhat R. (2000).
"Cytokine production by maternal lymphocytes during normal human pregnancy and
in unexplained recurrent spontaneous abortion". Hum Reprod; 15: 713 –18.
157. Raheleh Torabi, Saeed Zarei, Hojjat Zeraati, Amir Hassan Zarnani, Mohammad
Mehdi Akhondi, Reza Hadavi, Elham Savadi Shiraz, Mahmood Jeddi -Tehrani.
(2012). "Combination of Thrombophilic Gene Polymorphisms as a Cause of
Increased the Risk of Recurrent Pregnancy Loss". Mahmood Jeddi -Tehrani,
Department of Im munochemistry, Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna
Research Institute.
158. Rai R, Backos M, Rushworth F, Regan L. (2000). "Polycystic ovaries and recurrent
miscarriage —a reappraisal". Hum Reprod; 15: 612 –15.
159. Rai V, Yadav U, Kumar P (2017). "Null as sociation of maternal MTHFR A1298C
polymorphism with Down syndrome pregnancy: An updated meta -analysis". Egyptian
Journal of Medical Human Genetics. 18 (1): 9 –18.
160. Ralph SG, Rutherford AJ, Wilson JD. (1999). "Influence of bacterial vaginosis on
conception and miscarriage in the fi rst trimester: cohort study".; 319: 220 –23.
161. Ramaraj, P., Kessler, S. P., Colmenares, C., Sen, G. C. (1998). "Selective restoration
of male fertility in mice lacking angiotensin -converting enzymes by sperm -specific
expression of t he testicular isozyme". J. Clin. Invest. 102: 371 -378.
162. Rau JC, Beaulieu LM, Huntington JA, Church FC. (2007). "Serpins in thrombosis,
hemostasis and fibrinolysis". J Thromb Haemost.; 5(Suppl 1):102 –115.
163. Regan L, Jivraj S. (2001). "Infection and pregnancy loss". Infection and pregnancy.
London: RCOG Press,: 291 –304.
164. Regan L, Rai R. (2000) "Epidemiology and the medical causes of miscarriage".
Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol; 14: 839 –54
165. Regan L. (1991). "Recurrent miscarriage".; 302: 543 –44

81
166. Reilly R, McNulty H, Pentieva K, Strain JJ, Ward M (2014). "MTHFR 677TT
genotype and disease risk: is there a modulating role for B -vitamins?". The
Proceedings of the Nutrition Society. 73 (1): 47 –56.
167. Reinhard G, Noll A, Schlebusch H, Mallmann P, Ruecker AV. (1998). "Shifts in the
TH1/TH2 balance during human pregnancy correlate with apoptotic changes".
Biochem Biophys Res Commun; 245: 933 –38.
168. Rigat, B., Hubert, C., Alhenc -Gelas, F., Cambien, F., Corvol, P., Soubrier, F. (1990).
"An insertion/deletion po lymorphism in the angiotensin I -converting enzyme gene
accounting for half the variance of serum enzyme levels". J. Clin. Invest. 86: 1343 –
1346.
169. Risch HA, Weiss NS, Clarke EA, Miller AB. (1988). "Risk factors for spontaneous
abortion and its recurrence". Am J Epidemiol; 128: 420 –30.
170. Robinson WP, Bernasconi F, Lau A, McFadden DE (1999). "Frequency of meiotic
trisomy depends on involved chromosome and mode of ascertainment". Am J Med
Genet; 84: 34–42
171. Roffman JL, Weiss AP, Deckersbach T, Freudenreich O, Hen derson DC, Purcell S,
Wong DH, Halsted CH, Goff DC (2007). "Effects of the methylenetetrahydrofolate
reductase (MTHFR) C677T polymorphism on executive function in schizophrenia".
Schizophrenia Research. 92 (1 –3): 181 –8.
172. Rogers JT, Weeber EJ (2008). "Reeli n and apoE actions on signal transduction,
synaptic function and memory formation". Neuron Glia Biology. 4 (3): 259 –70.
173. Rosa, J. -P., Bray, P. F., Gayet, O., Johnston, G. I., Cook, R. G., Jackson, K. W.,
Shuman, M. A., McEver, R. P. (1988). "Cloning of gly coprotein IIIa cDNA from
human erythroleukemia cells and localization of the gene to chromosome 17". Blood
72: 593 -600.
174. Rosenn B, Miodovnik M, Combs CA, Khoury J, Siddiqi TA. (1994). "Glycemic
thresholds for spontaneous abortion and congenital malformatio ns in insulin –
dependent diabetes mellitus". Obstet Gynecol; 84: 515 –20.
175. Royle NJ, Irwin DM, Koschinsky ML, MacGillivray RT, Hamerton JL (1987).
"Human genes encoding prothrombin and ceruloplasmin map to 11p11 -q12 and 3q21 –
24, respectively". Somatic Cell a nd Molecular Genetics. 13 (3): 285 92.
176. Ruggeri ZM, Mendolicchio GL. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res.
2007; 100:1673 –1685.

82
177. Rushworth FH, Backos M, Rai R, Chilcott IT, Baxter N, Regan L. (2000).
"Prospective pregnancy outcome in untreat ed recurrent miscarries with thyroid
autoantibodies". Hum Reprod; 15: 1637 –39
178. Salim R, Regan L, Woelfer B, Backos M, Jurkovic D. (2003). "A comparative study
of the morphology of congenital uterine anomalies in women with and without a
history of recurren t first trimester miscarriage". Hum Reprod; 18: 162 –66.
179. Sanson BJ, Friederich PW, Simioni P, et al. (1996). "The risk of abortion and
stillbirth in antithrombin -, protein C -, and protein S -deficient women". Thromb
Haemost; 75: 387 –88.
180. Schmidt S, Barcello s LF, DeSombre K, Rimmler JB, Lincoln RR, Bucher P,
Saunders AM, Lai E, Martin ER, Vance JM, Oksenberg JR, Hauser SL, Pericak –
Vance MA, Haines JL. (2002). "Association of polymorphisms in the apolipoprotein
E region with susceptibility to and progression o f multiple sclerosis". American
Journal of Human Genetics. 70 (3): 708 –17.
181. Schneider JA, Rees DC, Liu YT, Clegg JB (1998). "Worldwide distribution of a
common methylenetetrahydrofolate reductase mutation". American Journal of Human
Genetics. 62 (5): 1258 –60.
182. Schwahn B, Rozen R (2001). "Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate
reductase gene: clinical consequences". American Journal of Pharmacogenomics. 1
(3): 189 –201
183. Schulze H, Shivdasani RA. Mechanisms of thrombopoiesis. J Thromb Haemost.
2005; 3: 1717 –1724.
184. Scott JR. (2003) . "Immunotherapy for recurrent miscarriage ". Cochrane Database
Syst Rev
185. Sebastien Fuchs,Kristen Frenzel,Hong D. Xiao,Jonathan W. Adams,Hui
Zhao,George Keshelava, Lu Teng Kenneth E. Bernstein (2004). "Newly recognized
physiolog ic and pathophysiologic actions of the angiotensin -converting enzyme".
Current Science Inc6: 124
186. Sibani S, Christensen B, O'Ferrall E, Saadi I, Hiou -Tim F, Rosenblatt DS, Rozen R
(2000). "Characterization of six novel mutations in the methylenetetrahydrof olate
reductase (MTHFR) gene in patients with homocystinuria". Human Mutation. 15 (3):
280–7.

83
187. Siedlecki CA, Lestini BJ, Kottke -Marchant KK, Eppell SJ, Wilson DL, Marchant
RE. (1996) "Sheardependent changes in the three -dimensional structure of human von
Willebrand factor ". Blood.; 88:2939 –2950.
188. Silvia Perez -Pujol, Omer Aras, and Gines Escolar. (2012). "Factor V Leiden and
Inflammation". Hindawi Publishing Corporation Thrombosis
189. Singh PP, Singh M, Mastana SS. (2006). "APOE distribution in world populatio ns
with new data from India and the UK". Annals of Human Biology. 33 (3): 279 –308.
190. Skeggs LT, Kahn JR, Shumway NP (1956). "The preparation and function of the
hypertensin -converting enzyme". The Journal of Experimental Medicine. 103 (3):
295–9.
191. Skovby, F ., Krassikoff, N., Francke, U. (1984). "Assignment of the gene for
cystathionine beta -synthase (CBS) to human chromosome 21 in somatic cell hybrids".
(Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 37: 585.
192. Sonnenberg A, Modderman PW, Hogervorst F. (1988). ‘’Laminin re ceptor on
platelets is the integrin VLA -6’’. Nature.; 336:487 –489.
193. Stephenson MD, Awartani KA, Robinson WP. (2002). "Cytogenetic analysis of
miscarriages from couples with recurrent miscarriage: a casecontrol study". Hum
Reprod; 17: 446 –51.
194. Stirling Y, W oolf L, North WR, Seghatchian MJ, Meade TW. (1984). "Haemostasis
in normal pregnancy". Thromb Haemost; 52: 176–82
195. Stirrat GM. (1990). "Recurrent miscarriage". Lancet; 336: 673 –75
196. Strittmatter WJ, Saunders AM, Schmechel D, Pericak -Vance M, Enghild J, Salv esen
GS, Roses AD. (1993). "Apolipoprotein E: high -avidity binding to beta -amyloid and
increased frequency of type 4 allele in late -onset familial Alzheimer disease".
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90
(5): 1977 –81.
197. Strobino B, Fox HE, Kline J, et al. (1986). "Characteristics of women with recurrent
spontaneous abortions and women with favourable reproductive histories". Am J
Public Health; 76: 986 –91
198. Sullivan AE, Silver RM, LaCoursiere DY, Porter TF, Branc h DW. (2004).
"Recurrent fetal aneuploidy and recurrent miscarriage". Obstet Gynecol; 104: 784 –88.

84
199. Tangelder GJ, Slaaf DW, Arts T, Reneman RS. (1988). "Wall shear rate in arterioles
in vivo: least estimates from platelet velocity profiles". Am J Physiol.; 254:H1059 –
H1064.
200. T L Goodfriend and M J Peach. (1975). "Angiotensin III: (DES -Aspartic Acid -1)-
Angiotensin II. Evidence and speculation for its role as an important agonist in the
renin – angiotensin system".Circulation Research. 1975;36:38 -48.
201. Tiret, L ., Rigat, B., Visvikis, S., Breda, C., Corvol, P., Cambien, F., Soubrier, F.
(1992). "Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of
the angiotensin I -converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels". Am.
J. Hum. Genet. 51: 197 -205.
202. Trimmer EE. (2013). "Methylenetetrahydrofolate reductase: biochemical
characterization and medical significance". Current Pharmaceutical Design. 19 (14):
2574 –93.
203. Tong M., Viall C.A., L.W. Chamley (2014). ‘’ Antiphospholipid antibodies and t he
placenta: a systematic review of their in vitro effects and modulation by treatment ’’.
Human Reproduction Upda te, Vol.0, No.0 pp. 16
204. Ugwumade A, Manyonda I, Reid F, Hay P. (2003). "Effect of early oral clindamycin
on late miscarriage and preterm delive ry in asymptomatic women with abnormal
vaginal flora and bacterial vaginosis". Lancet; 361: 983 –98.
205. Varga EA, Moll S (2004). "Cardiology patient pages. Prothrombin 20210 mutation
(factor II mutation)". Circulation. 110 (3): e15 –8
206. Varga -Szabo D, Pleines I , Nieswandt B. (2008). ‘’Cell adhesion mechanisms in
platelets’’. Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 28:403 –412.
207. Vaughan DE (2005). "PAI -1 and atherothrombosis". Journal of Thrombosis and
Haemostasis. 3 (8): 1879 –83.
208. Vickers JD. (1999). "Binding of polymeri zing fibrin to integrin alpha(IIb)beta(3) on
chymotrypsin -treated rabbit platelets decreases phosphatidylinositol 4,5 -bisphosphate
and increases cytoskeletal actin". Platelets. 10 (4): 228 –37
209. Von Wolff M, Thaler CJ, Strowitzki T, Broome J, Stolz W, Tabibz adeh S. (2000).
"Regulated expression of cytokines in human endometrium throughout the menstrual
cycle: dysregulation in habitual abortion". Mol Hum Reprod; 6: 627 –34.

85
210. Vu TK, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR. (1991). ‘’Molecular cloning of a
functional th rombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor
activation’’. Cell.; 64:1057 –1068.
211. Wang W, McKinnie SM, Farhan M, Paul M, McDonald T, McLean B, Llorens –
Cortes C, Hazra S, Murray AG, Vederas JC, Oudit GY. (2016). "Angiotensin
Converting E nzyme 2 Metabolizes and Partially Inactivates Pyrapelin -13 and Apelin –
17: Physiological Effects in the Cardiovascular System". Hypertension. 68: 365 –77.
212. Warburton D. (1989). "The effect of maternal age on the frequency of trisomy:
change in meiosis or in utero selection?". Prog Clin Biol Res; 311: 165 –81.
213. Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, Mosmann TR. (1993). "Bidirectional cytokine
interactions in the maternal -fetal relationship: is successful pregnancy a TH2
phenomenon?" Immunol Today; 14: 353 –56.
214. Weisgrab er KH, Innerarity TL, Mahley RW (1982). "Abnormal lipoprotein receptor –
binding activity of the human E apoprotein due to cysteine -arginine interchange at a
single site". The Journal of Biological Chemistry. 257 (5): 2518 –21.
215. Whitlock, M. C., & Schluter, D . (2014). The Analysis of Biological Data (2 edition).
Greenwood Village, Colorado: W. H. Freeman.
216. Wu X, Zhao L, Zhu H, He D, Tang W, Luo Y (2012). "Association between the
MTHFR C677T polymorphism and recurrent pregnancy loss: a meta -analysis".
Genetic T esting and Molecular Biomarkers. 16 (7): 806 –11.
217. Xiao T, Takagi J, Coller BS, Wang JH, Springer TA. (2004). ‘’Structural basis for
allostery in integrins and binding to fibrinogen -mimetic therapeutics’’. Nature.;
432:59 –67.
218. Yago T, Lou J, Wu T, Yang J, M iner JJ, Coburn L, Lopez JA, Cruz MA, Dong JF,
McIntire LV, McEver RP, Zhu C. (2008 ). Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch
bonds with human WT v WF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. J
Clin Invest.; 118:3195 –3207.
219. Yamada K, Chen Z, Rozen R, Matthews RG (2001). "Effects of common
polymorphisms on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate
reductase". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 98 (26): 14853 –8.
220. Yamada K, Chen Z, Roze n R, Matthews RG (2001). "Effects of common
polymorphisms on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate

86
reductase". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 98 (26): 14853 –8.
221. Young Ju Kim MD PhD, Roger A. Williams on MD, Jeffrey C. Murray MD, Janet
Andrews MD, Jorie J. Piets cher BS, Peter J. Peraud BS, and David C. Merrill MD
PhDc . (2001) ‘’ Genetic susceptibility to preeclampsia: Roles of cytosineto -thymine
substitution at nucleotide 677 of the gen e for methylenetetrahydrofolate reductase,
68–base pair insertion at nucleotide 844 of the gene for cystathionine β -synthase, and
factor V Leiden mutation ’’. Am J Obstet Gynecol . Volume 184, Number 6 . 1212
222. Zhang C, Wu S, Xu D. (2013). "Catalytic mechanism of angiotensin -converting
enzyme and effects of the chloride ion". The Journal of Physical Chemistry B. 117
(22): 6635 –45.
223. Zhang R, Xu X, Chen T, Li L, Rao P (2000). "An assay for angiotensin -converting
enzyme using capillary zone electrophoresis". Analy tical Biochemistry. 280 (2): 286 –
90.
224. Zhang Z, Mu J, Li J, Li W, Song J (2013). "Aberrant apolipoprotein E expression and
cognitive dysfunction in patients with poststroke depression". Genetic Testing and
Molecular Biomarkers. 17 (1): 47 –51
225. Zucker -Frankli n, D. Megakaryocyte and platelet structure. In: Hoffman, R.; Benz,
EJ.; Shattil, SJ.;Furie, B.; Silberstein, LE.; McGlave, P., editors. Hematology B asic
Principles and Practice. Churchill Livingstone; New York: 2000. p. 1730 -1740.
226. Zuo L, van Dyck CH, Luo X, Kranzler HR, Yang BZ, Gelernter J 2006. "Variation at
APOE and STH loci and Alzheimer's disease". Behavioral and Brain Functions. 2 (1):
13."Alzheimer Research Forum: Meta -Analyses of apolipoprotein E AD Association
Studies"

87