Master de Microbiologie Aplicata si Imunologie [604087]

Universitatea Bucuresti
Facultatea de Biologie
Master de Microbiologie Aplicata si Imunologie

Procese epigenetic e implicate in
disfunctia vasculara in diabet

Conducator stintific :
Lector Dr. Alina Maria Holban

Indrumator ICBP “N. Simiones cu”:
Dr. Simona -Adriana Manea

Masterand: [anonimizat] 2018

2
Cuprins

Partea I – Cunostinte actuale

Introducere…………………………………………………………………….………………………….……..3
Diabetul, date generale.. …………………………………………………………………………………………………………………. …………4
Retinopatia diabetica…………. …………………………………………………………………… ……………………………………….. ………4
Nefropatia diabetica…………………………………………………………………………………………… ……………………………………..5
Neuropatia diabeti ca………………… ……………………………………………………… .………..……….…….6
Insulina ………………………………………………………………………….…………….…………………….….7

Procese epigenetice implicate in disfunctia vascula ra…………………………………………………… .7
Metilarea ADN ………………. ……… …………………………………………… ………………………………………………………………. ……7
Functiile metilarii ADN -ului……. …………………………………………………………………………….. ……………………………………… …………. …..8
Acetilarea histonelor……… ……………………………………………………………………….. ……………………………. …..9
Inhibitorii de histon -acetiltransferaze si histon -deacetilaze… …………………………… …………… .…….………………… ..12
Fosforilarea histonelor……… ………………………………………………………….…… ..………………….. …13
Sumoilarea histonelor……… …………………………………………………….………… ..………………….. ….14

Factori de transcriere implicati in procesele inflamatorii ………………………..… ..……. 17
NF-kB…………….. ………………………………………………………………………………… ……….. ………………………….. ……………….17
AP1………… ……………………………………………………………………………………..………… ..…… …18
STAT1……. …………………………… …………………………………………………………………………………………………….. ……………18
C/EBP……………. ……………………………………………………………………………………….. ……………….. ………………… …………..19
Molecule cu rol important in patofiziologia complicatiilor vasculare asociate diabetului
zaharat…… ………………………………………………………………………….………. ….19
Endotelina -1…… …………………………………. ……………………………………………………………………………………… …………. ….19
Sintaza oxidului nitric de origine endoteliala…………………………………………………………… ……..……21
Sintaza inductibila a oxidului nitric……………….. ………………………………………………………………………….. ………………21
Moleculele de adeziune celulara vasculara……………………………………………………………… …..………22
Molecule de adeziune intracelulara……………………………………………………………………. …………….22
E-selectina…………………………………………………………………………………………………….. ………………………….. ………………23
Matrix metaloproteinaza 9………… …………………………………………………………………… …………… .23
Receptori i Toll -like ……………… …………………………………………………………………………………………………….. ……………..24
Molecule utilizate pentru normalizarea interna in experimentele de transfectie si de anali za a
expresiei genice si proteice …………………………………………………………… ..……….25
β-Galactozidaza………. …………………………………………………………………………………………………………….. ……….. ………..25
Glyceraldehyde 3 -phosphate Dehydrogenase……… ………………………….. ……………………………………………………… ….26
β-Actina…………… …………………………………………………………………………………………………………….. ……….. …………. ……26

Partea II – Contributii originale
Obiective specific……… …………………………………………………………… ………..…27
Materiale si metode………… …………………………………………………………………………….. …….. …….27

Metode experimentale……… ………………… ……………………………………… ..….….27
Preparare mediu Luria Bertani (LB) …………………………………………………………………… ..….……. ..27
Multiplicare bacterii E.coli transformate cu ADN plasmidial… ……………………………………………………. …………….. 28
Izolarea ADN -ului plasmidial (testare colonii – Mini -prep)… ……………………………………………………….. …………….. .29
Purificarea plasmidelor (protocol QIAfilter – Midi Kit)… ……………………………………………………..….. 29
Transfectie tranzienta a celulelor eucar iote…. …………………………………………………………………………………………….. 31
Amplificarea ADN -ului genomic prin PCR… ……………………………………………………………………………………. ………. .33
Izolarea ARN -ului total din celule endoteliale umane si celule musculare netede umane ………… ..….……… ..35
Revers -Transcrierea…… ………………………………………………………………………………….….……… 36
Analiza expresiei proteice prin Western Blot… …………………………. ………………………………………………………………. ..37

Rezultate experimentale…… ………………………………………………………..…… ……40
Analiza morfologica a celulelor – microscopie in contrast de faza… …………………………………………..,,,, .40
Investigarea rolului histo n-acetiltransferazelor p300 si HAT1 in modularea activita tii promotor ului genei ET -1 umane
si a activarii unor factori de transcriere pro -inflamatori ………… …………………………….……………… ….…41
Expresia receptorilor pentru endotelina la nivelul celulelor endotel iale si musculare netede……………. …………..4 4
Concluzii …………………………………………………………………………………………………………….. ……… .52
Bibliografie …………………………………. …………………………………………………………………………………………………………5 3

3

Partea I – Cunostinte actuale
Introducere

Schimbarile epigenetice reprezinta modificari fenotipice ale activitatii si expresiei
genelor. Exista mai multe mecanisme ce pot produce aceste modificari , precum : acetilarea,
metil area, fosforilarea, s umoilare a precum si interventia ARN necodant.
Principala modificare epigenetica este a cetilarea/ dezacetilarea histonelor , ce reprezinta
adaug area unei grupari acetil la nivelul grupa rii N-terminal a a proteinelor histonice .
Metilarea reprezinta adaugarea une i gruparil metil la situsurile bogate in legaturi tip
citozina -guanina (CG) in secventele de A DN, unde citozina va deveni 5-metil citozina avand
si rolul de a silen tia (inhiba) expresia genelor .
Fosforilarea prin modificarea histonelor regleaza expres ia ADN codificator si
determina repararea acestuia in caz de er ori sau mutat ii.
SUMO ilarea este o modificare post -translationa la a lizine i ca raspuns la s tres sau in
cursul ciclului cel ular. Aceasta este asemanato are ubiquitinarii dar care folose ste proteine
SUMO ( Small Ubiquitin -like Modifier ).
In aceasta lucrare s-au studia t modificarile epigenetice care apar in vitro , intr-un mediu
cu o concen tratie crescuta de glucoza .

4
Diabetul , date generale

In pre zent Diabetul sau Diabetes mellitus este o maladie ce afecteaza 8,4% din
populatia adulta actuala a globului ( Yuankai & colab , 2014 ), caracterizat prin hiperglicemie
ca rezultat a disfunct iilor de producere a insulinei sau a faptul ca insulina produsa nu este
corespunzatoare . Hiperglicemia rezultata are efecte negative asupra multiplelor organe
precum si a vaselor de sange .
Sunt doua tipuri majore de diabet. Diabetul de tip I , cauzat de incapacitat ea
pancreasului de a produce sau de produce rea in cantitati insuficiente a insulin ei, numit
diabetul insulino -dependent. Din totalul populatiei diabetic, aproximativ 10% au diabet de tip
I.
Diabetul de tip II este cauzat de faptul ui ca insulina produsa nu este recunoscuta de
celulel e tinta, fenomen cunoscut ca rezistenta la insulina, sau diabetul non -insuli no dependent,
fiind pre zent la 80% din populatia afectata de diabet .
Sunt si forme temporare de diabet, in care glicemia nu are valori considerate norm ale,
cum ar fi:
 (IFG) glicemie necorespunzatoare ce poate sa apara in timpul postului , ce poate evolua
in diabet de timp II . Persoanele cu glicemia scazut datorita reginului alimentar strict au
un risc de 3 ori mai mare decat persoanele cu un regim aliment ar regulat (Nichols &
colab, 2007 ).
 Diabetul gestational, aparand cu prevalenta in a doua jumatate a sarcinii dar care nu
prezina mereu simptomele clasice de diabet.
Afectiunile majore ce apar in diabet includ: hipoglicemia sau hiperglicemia,
microangiopat ia, complicatii macrovasculare, disfunctii ale sistemului imun itar si afectiuni ale
organelor: vitale (inima, rinichii, ficatul, etc) precum si retinopatiile , nefropatii si neuropatiile .

Retinopatia diabet ica

Afectiunile diabetice vasculare pot fi micro vasculare s au macrovascularea. O
complicatie microvasculara este reprezentata de retinopatia, care poate duce la orbire daca nu
este tratata la timp . Caracteristic retinopatiei este ischemia retinei fiind descrisa prin
microaneurisme, hemoragi, puncte in fundul ochiului , pete albe la nivelul retinei, anomalii ale
venelor, neovascularizatia si cresterea premeabilitatii vascularizati ei retinei . Metoda cea mai

5
practicata pentru a determina severitatea retinopatiei este a testului ETDRS – early treatment
diabet ic retinopathy study .
Studiile realizate recent asociaza persoanele c are a u dimensiuni ale lumenului
venulelor retinale crescut si arteriole ingustate cu o mortalitate prin CHD (coronary heart
disease) de 20%-30% mai mare (Ikram & colab , 2013 ). Studiile ar ata ca in general ,
persoanele cu o dimensiune a arterei retinale reduse prezinta si un perete ventricular stang mai
ingrosat decat in mod normal (datorita cresterii presiunii di astolice si sistolic e) fiind un semn
pentru diferite disfunctii cardiovasculare (Ylitalo, 2011 ).
In ische mii se reduce volumul de sange ce perfuzeaza retina datorita constrictie i
arterelor si arteriolelor ce duce la unele reactii metabolice specifice . La perso anele cu
glicemia prost regulata , se poate ajunge la ingrosarea membranei bazale si la hipertensiune, ce
duce la o legatura slaba intre celulele endoteliale si pericite, rezultand in apoptoza pericitelor
(celule ce s e afla in contact cu celulele capilare) si la formarea de noi vase de sange, va se de
sange ce pot acoperi membrana corticala vitelina. Mitocondriile retinale, in conditii de
hiperglicemie, cres c nivelul de specii superoxid produse , ceea ce va duce la eliberarea de
citocrom c , la distrugerea ADN si la apoptoza celulelor capilare.
Se observa 4 cai de dezvoltare a retin opatiei in diabet : prin alt erari moleculare si
structurale, cresterea fluxului caii poliol de conver tire a glucozei in fructoza , cresterea
formarii de produsi finali de glication avansat (AGEs), activarea unei izoforme a protein
kinazei C (PKC) si crestere a fluxului caii hexosaminei .
In aceasta afectiune creste frecventa utilizarii caii poliol, sau a caii sorbitol -aldose
reductazei, reprezinta un proces de convertire a glucozei in fructoz a, unde glucoza este redusa
la sorbitol (glucitol), cu ajutorul enzim ei aldose reductazei (Nishikawa & colab , 2000), c are
prin oxidare devine fructoza. In cazul diabeticilor, datorita nivelului de glucoza crescut, se
acumul eaza o cantitate crescut a de sorbitol .

Nefropatia diabetica

Nefropatia este o afectiune progresiva a nefronilor de la nivelul rinichilor , care apare
la persoanele diabetice ce se manifesta prin insuficienta renala cronica, prin prezenta
proteinelor in urina datorita distrugerii glomerulului renal , insotita de pierderea albuminei
serice precum si edem in functie de cat de precis e ste controlul glicemiei pacientului si durata

6
de care acesta a suferit de diabet, in medie, avand manifestari clinice dupa aproximativ 5 -10
ani.
In nefropatie multe din tre problemel e aparute la nivelul glomerulului de sange sunt
datorate hipertensiunii, care duce la hiperperfuzie si hiperfiltrare datorita vasodilatarii arterei
aferente (un factor care induce vasodilatarea este oxidul nitric). Hiperfiltrarea renala
mentinuta un timp indelungat duce la ingrosarea membranei bazale g lomerulare ceea ce va
rezulta int r-o hipofiltrare mai tarziu.
La majoritatea pacientilor cu glicemia prost controlata se observa o accelerare a
instalarii nefropatiei datorita faptului ca hiperglicemia din sange poate provoca glicozilarea
proteinelor, ce duce la formarea reactiilor intre glucoza si protein e, non -enzimatice, ce
formeaza produsi de glicozilare avansata ce pot activa di feriti factori proinflamatori (NF -kB),
metabolizarea glucozei intracelular fie prin calea aldozo -reductazei sau a hexozamine lor ce
creste osmolaritatea celulara.
Asadar diabetul este unu din factorii majori de risc in cazul insuficientei renale cronice
ducand la nevoia de dializa si transplant, impactul asupra rinichilor fiind ireversibil (Lim,
2014) .

Neuropatia diabet ica

Multe persoa ne diabetic e ce au un control slab al glicemiei din sange risca sa sufere de
neuropati diabetic e datorita perioadelor indelungate de nivel glicemic crescut. Neuropat ile
sunt afectiuni ale ne uronilor de la orice nivel si pot fi dureroase sau ned ureroase. Si mptomele
neuropatiei depind de ne uroni i afectati, iar gradul in care sunt afectat i depinde de gravitate a
leziunii neuronului ceea ce poate duce la formarea unor leziuni ireversibile. Pot afecta
sistemul nervos periferic sau sistemul nervos cent ral, multe dintre simptomele neuropatiei
diabetic sunt la nivelul membrelor, ca amorteli, dureri, scaderea se nsibilitatii sau a fortei
musculare sau asupra sistemului digestiv, asupra sistemului cardio -vascular si cel respirator
precum si a functiilor sexu ale (Kassardjin and col ab, 2015) .
Neurop atiile periferice se poat clasifica in: mononeuroaptii, polineuropatiile,
neuropatie autonomica , neuritis sau i nflamarea nervilor, multiplex mononeuritis, toate pot
avea cau ze datorita diabetului.
Mononeuropatiile spre deosebire de polineuropatii sunt cauzate de traume locale sau
afectiunilor ischemice , mai rar direct datorita complicatiilor diabetic e, pe cand
polineuropatiile afecteaza multiple zone ale corpului si deseori mult mai extinse, in speciale

7
afectiuni al e axonilor neuronilor prin demielinizarea acestora afectand transmiterea
semnal ului nervos. Mai pot f i afectati si corpii neuronilor, mai ales a neuronilor motorii si
senzitivi. Afectarea axonilor si a corpilor celulari poate avea diferite sim ptome in func tie de
tipul de afectiune, probleme motorii precum slabiciunea, neindemanarea in miscari ca si
senzatii de durere, intapaturi, senzatii de arsura si pierderea sensibilitatii in diferite zone.
Multiplexul mononeuritis , cunoscut si ca neuropatie multifocala afecteaza nervii
periferici reprezinta inflamarea a doi sau a mai multor nervi, in patie diferite ale corpului, in
mod asimetric, ceea ce duce la pierderea sensibilitatii si a abilitatilor motorii a zonelor
afectat e.

Insulina

Este un hormon peptidic secretat de celulele beta pancrea tice, aflate in Insulele lui
Langerhans , care a u rol in absortia glucozei in celule , din sange si duce la conversia acesteia
in glicogen sau in tesut adipos prin glucogeneza sau lipogeneza .
Rezistenta la insulina se dezvolta cand nivelurile de insulina normale sau c rescute din
sange nu produc sau au o actiune atenuata, ceea ce poate duce la la o serie de simptomatologii
datorita hiperglicemeiei sau hipoglicemiei din sange. Cei afectati de acest sindrom metabolic
sunt predispus i la boli cardiovascular e (Gisela, 2005) .
Descoperirea insulinei a inceput cu Paul Langerhans, in 1869, Berlin, care a identificat
insulele Langerhans, banuind ca au un rol in secretie. In 1889, Oskar Minkowski si Joseph
von Mering au inteles faptul ca pa ncreasul are rol in diabet. In 1916, Nicolae Paulescu a
realizat un extract pancreatic care a readus la normal gl icemia din sangele unui caine diabetic.
Banting si Best a u realizat deasemenea un extract pancreatic in 1921, care a readus la normal
niveluril e de gliceime a unui caine fara pancreas .
Procese epigenetice im plicate in disfunctia vasculara

Metilare a ADN

Metilarea este un mecanism epigenetic crucial pentru reglarea transcriptei genelor.
Metilarea ADN reprezinta adaugarea unei grupari metil la re sturile de citozina cand aceasta
este localizata langa o gunaina, intr -o grupare CpG, dinucleotidica (Stefan & colab , 2013) .

8
Metilarea poate modifica expresia genelor, fara a le modifica genotipic prin silentierea lor in
mod reversibil.
Metilarea modifica interactiunile dintre proteine si regiunile de ADN metilate, prin
legarea la nucleotidele de citozina a domneiilor de legare metal -CpG, de care se pot lega si
alte proteine de locus, precum histon deacetilaze sau pot modifica histonele compactand
cromatina , trasformand -o in heterocromatina (Jason & colab , 2014).
Metilarea citozinei aduce un risc crescut de mutatii punctiforme, deoarece restul de
grupare metil din pozitia 5 ce se leaga de citozina se poate dezamina spontan transformand
gruparea intr -o timnin a sau urcil, ducand la trasnformarea secventei CG intr -una TA (Jason &
colab , 2014). Disfunctiile de metilare duc la transformari maligne ale celulelor. Citozina poate
suferi modificari ajungand sa se transforme spontan in uracil prin procesul de deaminare
hidroltica sau deaminare citozine. Aceste mutatii apar din inabilitatea ADN polimerazei sa
discrimineze timina de uracil, legand o adenine la uracil. Exista un sistem ce repara aceste
errori uracil -ADN gilcosilaza, dar daca aceste tipuri de errori sunt pr ea frecvente si apropiate
unele de celelalte lantul de ADN se poate fragmenta iar celula poate sa intre intr -o apoptoza
aparte numita “thymine -less cell death” ( Békési & colab , 2011).
ADN nuclear prin metilarea enizimatica formeaza reziduri de 5 -metilcit osina in
secventele CG si CnG. Metilare se poate clasifica ca replicativa si non -replicativa fiind
specifica anumitor situsuri si are diferite metiltransferaze.

Dupa John Wiley & Sons , 2015
Figura 1. Procesele de metilare si dezaminare

9
Functi ile metilarii ADN -ului

Schimbarile gradului de metilare duc la inductia diferitelor gene sau la supresia lor.
Metilarea are si un posibil rol in formarea de noi memorii, datorita schimbarilor gradului de
compactare din neuron in timpul proceselor de invat area (Gupta & col ab, 2010) .
Metilarea la un nivel mult crescut este prezenta in celulele canceroase, avand prezent
in celula inca doua metil trasferaze suplimentarea fata de celulele normale.
La eucariotele pluricelulare metilarea este puternic influienta ta de hormoni
(hidrocortizonul) si modulata de antioxidanti, precum hidroxitoluenul butilat (BHT). Efectul
antioxidantilor este inducerea de novo, a metiltransfrazelor precum si transcrierea genelor
pentru SAM -sintetaza si p53 (tumor suppressing protein). Influienta hormonilor consta in
existenta complexelor hormone -receptori legate specific de zonele bogate in CG. Aceste
complexe se leaga de fractiile omoloage ale ADN a carei transcriptie este stimulata de
cortisol, ceea ce determina transpozitia sitului d e legare HRC de la o fractie de ADN posibil
activate la o fractie de ADN trasncris (Romanov & colab,1984).

Acetilarea histonelor

Acetilarea este o modificare post -translationara asupra proteinelor ce poate fi de doua
tipuri. Prima este in proportie de 8 0-90% din fractiunile de proteinele umane solubile, prin
modificarea cozii amino -terminale (Nt) a lantului liber de polipeptide fiind este catalizata de
Nt-acetyltransferaze (NATs). Cea de -a doua reactie este grupului Ɛ -amino de lizine, unde
reactia de acetilarea are un rol important in histonele ce regleaza transcripta genica, din
aceasta cauza enizimele ce catalizeaza aceasta reactie se numesc histon acetiltransferaza
(HATs) dar se poate numi si lisin acetilransferaza deoarece acetilarea lizinei nu are loc
exclusiv in histone (KATs) (Zhao & col., 2010) .

10

Dupa Tom Brock, 2010
Figura 2. Acetilarea si d ezacetilarea proteinelor (schema).

Diferenta intre cele doua tipuri de acetilari consta in faptul ca Nt -acetilarea este
ireversibila pe cand aceti larea lizinei este reversibila. Sunt unele histon deacetilaze (HDAC)
care au rolul opus acetilazelor prin reglarea transcrierii genelor, unde acetilarea histonelor
relaxeaza cromatina ducand la transcrierea intr -o cantitatea mai mare a genelor, iar
deaceti larea are un efect opus unde cromatina se compacteaza, formand structuri impreuna cu
histonele numite nucleosomi.
In timpul procesului de acetilarea se foloseste Ac -CoA iar in timpul procesului de
deacetilarea se folosesc NAD+ . Defectele in procesele de acetilarea duc la diferite erorri in
replicarea si functionarea celulelor, cum ar fi procesul de cancerogeneza precum si defecte
neurodegenrative si probleme cardiovascularea (Drazic and col ab, 2016).
Acetilarea capatului aminoterminal de catre Nt -acetil transferaze (NATs) consta in
gruparea acetil a molecului Ac -CoA (acetil coenzima A) ce este transferata la un grup α-
amino intr -un lant de polipetpide nou sintetizate. Gruparile de acetil atasate blocheaza
gruparea amino -terminala fara a o mai lasa sa fie modificata de alte procese post –
translationarea, fiind dependente de NATs pentru a transfera gruparea acetil la un rezid de
metionina produs din lantul de polipeptide.
N-acetiltransferazele apartin GCN4 (factor non -derepresibl de control genenral), factor
de transcriptie activator pentru acetiltransferaze ce include unele HATs. HATs au
monoubunitati si multisubunitati enzimatice ce au rol in activarea substratului specific, avand
rol si in reactiile co -translationare in legarea ribozomilor precum si a lanturilor nou formate de
polipeptide.

11
Nt-acetiltransferazele in celulele umane formeaza trei complexe ce sunt responsa bile
de 80% de reactile de acetilare din celule (NatA, NatB si NatC). Unde NatA are mai multe
subunitati catalitice Naa10 (N -alfa-acetiltransferaza), ce pot realiza acetilarea independent de
alte subunitati si subunitati auxiliare Naa15 ce au propiile unit ati catalitice NatE pentru alte
subunitati. NatB prezinta subunitati catalitice Naa20 si unitatea auxiliara Naa25, iar
complexul NatC are ca subunitatea catalitica Naa30 ce are doua subunitati auxiliare Naa35 si
Naa38. Nt-acetiltransfraze ce se ocupade res tul proceselor de acetilare din corpul uman sunt
NatD cu unitatea catalitica propie Naa40, NatE cu Naa50 si NatF a carui unitate catalitica este
Naa60, sunt monosubunitati enzimatice (Dinh, 2015) .
Diferenta intre tipurile de acetil transferaze mai consta i n tipurile de substrat pe care
pot actiona, specificitatea de substrat este determinata, in general, de resturile primilor doi
amino -acizi. Acetilarea proteinelor poate duce la ancorarea unor protein, Arl3 si Grh1 care
sunt proteine ce nu se pot asocia apa ratului Golgi daca nu au grupul Nt -acetil (Behnia &
colab ,2004) precum si retinerea proteinelor in citosol si inhibarea migrarii translocationala si
post-translationa la in retic ulul endoplasmatic (Forte & colab , 2011) precum si modificarea
propietatile coz ilor N-terminale, moduland astfel interactiile dintre proteine. Unele proteine
crestere sc gradul de interactiune dintre diferite enzime in timpul acetilari , spre exemplu
enzimele de conjugarea ubiqitinice Ubc12 care prin acetila rea cu NatC cres c gradul de
afinitat e fata de E3 ubiquitin ligaza Dcn1. Asadar putem intelege ca Nt -acetilarea joaca un rol
major in impachetarea proteinelor prin stabilizarea structurii flexibile N -terminiale precum si
durata vietii (half -life) proteinele TSC2 (tuberous sclerosis co mplex 2) care sunt implicate in
procesele tumorigenice precum si complexele THO a subunitatii omoloage (THOC7)
(Myklebust, 2015) .
Unele roluri ale acetilarii sunt vitale in dez voltarea mentala si fizica a vertebratelor
cum s -a observat din studiile asupra N-alfa-acetiltransferaze (Naa10) avand ca rezultat defecte
fenotipice letale in organismele mutante pe cand la organismele inferioare s -a dovedit a fi o
gena neesentiale in dezvoltarea dar necesara in procesele de perpetuare a speciei si de
supravietuire. Dar genele de acetilare, HATs au un rol vital in dezvoltarea vaselor de sange si
a oaselor. Gena Naa10 are rol in diferentierea osteoblastelor si formarea oaselor prin
interactionea cu factorul de transcriptie reglator Runt -related 2 (Runx2) si prin aceti larea
domeniului K225, ce ii opreste interactiunea cu CBF β inhiband activitatea transcriptionala a
Runx2 si stabilizeaza Naa10 in osteoblaste pe durata diferentierii acestora inducand
diferentierea ca si consecinta a inhibarii Runx2. Naa15 are functia de r eglator transcriptional
nuclear in osteogeneza, prin legarea sa la promotorul osteocalcin activand expresia

12
osteocalcinei impreuna cu Runx2. ( Willis & colab 2002.), avand implicatii si in dezvoltarea
vaselor de sange a celulelor hematopoietice, precum si reglarea genelor cu rol in mielopoieza.
Naa15 are un rol important si in reglarea permeabilitatii albuminei, asadar avand un rol in
reglarea permeabilitatii vaselor de sange, cu o functie majora in gradul permeabilitatea
endoteliului retinal fata de album ina, ce creste nivelul de activitatea a familiei de kinaze Src,
Fyn si Lyn. Substraturile Src (selective catalituc reduction) sunt factori esentiali in medierea
permeabilitatii, convertind oxidul nitric in apa (H 2O) si azot diatomic (N2).
Cortactin , prote ina corticala de legare a actinei, scade permeabilitatea barierei
vasculaturii functionale, formand un complex cu Naa15 ca o modalitate de a regula acest
proces . Scaderea expresiei de Naa15 se asociaza cu retinopatia dobandita odata cu inaintarea
in varsta (Gendron & colab , 2010) Studiile recente descriu acetilarea phosducin -like 3
(PDCL3), ca proteina chaperon ce inhiba degradarea proteosomala a receptorului pentru
factorului de crestere vascular endoteliar 2 (VEGFR -2). Acetilarea de NatB reguleaza
stabili tatea PDCL3 asadar si expresiei VEGFR2.
Acetilarea are rol si in reglarea presiunii vascularea, prin medierea degradarii
regulatorilor ca si Rgs2, ce pot modifica valorile proteinei G si scade presiunea vasculara
printr -un proces de scadere a semnalului G αq, ce este implicata in producerea hormonilor de
stres prin tranzitia calciului (Ca2+0), controland ritmul cardiac precum si homeostazia
temporara.
Reactiile de acetilare au rol si in localizarea proteosomilor si prin degradarea
proteinelor anormale ce p rezinta defecte ca asimetria si greselile de impachetarea, aceste
reactii avand loc la nivelul citoplasmei si a nucleului, aceste sunt tinute in granulele de
depozit proteasomal (PSGs).
Mutatiile in genele pentru acetilarea (HAT) pot avea si efecte degener ative, ducand la
unele patologii specifice. Sindromul Ogden, prin mutatii in exonul 2 p.S37P, se manifesta
prin intarzierea dezvoltarii , anomalii craniofaciale ce produc aparenta unei inaintari in varsta
precoce, hipotonie, aritmie cardiaca si cardiomiopa tie, datorata unui deficit de
acetiltransferaza, cu o mutatie in NAA10, subunitate majora in N -terminalt acetiltransferaza
(NatA), este o afectiunea de tip X -linkata, manifestandu -se numai la barbatii, cunoscuta si ca
sindromul infantilitatii leatale (Rope , 2001) .

13
Inhibitorii de histon -acetil transferaze si histon -deacetilaze

Principalul inhibitor a histon deacetilaselor (HDAC) este Vorinostat sau SAHA
(suberanilohydroxamic acid). Acesta actioneaza prin legarea la situsul de activare a histon
deacetila zei inhiband producerea ei rezultand o crestere a transcriptului genetic la nivelul
ADN (Ines & cloab, 2014) ducand la reglarea structurii si functiei cromatinei. Acetilarea
proteinelor reglatorii, spre exemplu proteina de soc termic90 sau α tubulin pot pr oduce duce
la repararea unor celule canceroase prin blocarea ciclului celular, declansarea apopto zei, sau
inhibitia angiogenezei (Suresh & colab, 2010) .
Un alt inhibitor este CPTH2 (hydrochloride), un inhibitor al histon acetilselor, care
actioneaza asupra Gcn5 histone acet iltransfera za, care duce la relaxarea si elongarea
nucleosomilor, prin faptul ca acetileaza histonele H3 lisin K9 si K14. CPTH2 inhiba
activitatea de acetilarea histonelor a Gcn5, asadar ducant la oprirea rel axarii cromatinei in
nucleotid e (Chimenti & colab , 2009) .
Un alt inhibitor este C646, care se leaga la situsul protein -specifica, a inhibitorului de
histon acetila za, p300 (Zhao & colab, 2016) .

Fosforilarea histonelor

Fosforilarea este de importanta vitala in procesele de modificar e post -translational e, in
special la nivelul histonelor , pentru a modula transcriptia sau replicarea ADN la nivelul
nucleosomilor, formati din segmente de 146 baze de ADN rasucite in jurul unui octamer
histonic . Pentru a controla gradul de compactare a cro matinei, trebuie sa aiba loc modificarea
postranslationala a histonelor , ca si fosforilarea, ce are loc la nivelul cozilor histonice.
Fosforilarea reprezinta atasarea unei grupari fosforil (PO 32-) avnd rolul de a regula
activitatea majoritatii enzimelor precum si modificarea predominanta post translationala a
proteinlor in celulele eucariote. Fosforilarea are loc la nivelul serinei, treoninei, tirosinei,
histidinei, lizinei , argininei precum si acidul aspartic si acidul glutamic. Aceasta modificare
este r eversibila ducand la schimbari conformationale la nivelul proteinelor, enzimelor si a
histonelor.
Fosforilarea histonelor are un rol major in transcriptie, ducand la decondensarea
cromatinei. Fosforilarea la nivelul unui amino acid are loc cand gruparile fosfat reactioneaza
cu gruparile -OH ale amino acidului . S-au observant, cum ca fosforilarea histonelor are un rol
major in transcrierea genelor , spre exemplu fosforilarea serinei de la nivelul histonelor H3 si

14
H2B este asociat a cu reglarea factorului de c restere epidermal, precum si fosforilare serinei 10
a H3 este asociata cu acetilarea H3 ducand la transcrierea gen elor in vivo .
Compactarea cromatinei este controlata tot prin fosforilare , in special la nivelul
histonei H3 in treonina 3 si 11. Fosforilare a rezidurilor din H3 cu rol in condensarea
cormatinei are rol in mitoza si meioza.
Fosforilarea este re versibila datorita enzimelor ce hidrolizeaza gruparile fosfat de la
nivelul compusilor organici , enzima fiind fosfataza, ce hidrolizeaza acidul fosforic formand
un ion fosfat si o molecula cu o grupare hidroxil libera (Rossetto & colab, 2012).

Sumoi larea histonelor

Denumire a de s umoilarea vine de la proteinele SUMO (Small Ubiquitin -like
Modifire), aceast e protein e ubiquitn -like sunt molecule de conjuga re ce altereaza propietatile
proteinelor de care se leaga , avand un rol important in functiile celulelor eucariote. SUMO
care in proportie de 20% asemanatoare cu ubiquidina. Prezinta trei paralogi (gene duplicate in
genom care au functii diferite de ce le initial e), SUMO -1 (la om Smt3c, PIC1, GMP1, Ubl1 si
sentrin), SUMO -2 (Smt3a si Sentrin3) si SUMO -3 (Smt3b si Sentrin2). Unde SUMO -3 si
SUMO -2 fac parte din aceiasi familie si sunt asemanatoare ca structura in proportie de 50%
(Ronald & colab , 2005) .
Prin conjugarea proteinelor SUMO are un rol important in modificarea organizarii
cormatinei, trans criptie si in producerea de ARN (Bohren & colab , 2004) .
Pentru a avea loc SUMOilare a este necesara prezenta catalazelor SAE1/SAE2 ce duc
la formarea SUMO -adenilat , unde grupare C -carboxil terminala se leaga covalent de adenosil
monofosfat (AMP). Legatura SUMO -AMP este rup ta, ceea ce duce le formarea unui covalent
intermediar unde gruparea carboxi l terminala a SUMO formeaza o legatura tieosterica cu
gruparea sulfhidr il a unei molecule de cisteina in SAE2. Dupa SUMO este transesterificat din
SAE2 in cisteina 93 in enzima SUMO conjuganta Ubc9 (Desterro & colab , 1997 ). Tioesterul
SUMO -Ubc9 poate catazlia formarea legaturilor izopeptidice dintre gruparea carbon
terminala a SUMO si gruparea Ɛ -amino a lisinele de substrat (Rodrigue z & col ab, 2001) .
Proteinele SUMO -2/-3 prezinta alinierea de secventa ce poate fi utilizata pentru a forma
lanturi polimerice tip SUMO (Tatham &col ab, 2001) . Dar rata de legare a SUMO de li zinei
precum si viteza de reactie este influientata de mai multe proteine , cum are fi STAT(PIAS ),
homoloage cu proteinele Siz1 si Siz2 prezente la organismele eucariote inferioare. La oameni
familia de proteina PIAS (PIAS1, PIASx α, PIASx β, PIAS γ, si PIAS3) contin e domeniul

15
RING . PIAS au domeniile RING ce contin proteine cu rol de ligaze SUMO E3 , ce sun t
similare domeniilor RING ale ubiquitinei E3s. Ligazele SUMO specifice RanBP2 si
proteinele polycomb -grup (cu rol in silentierea genelor Hox epigenetic) Pc2. Protein a RanBP2
e localizata la complexele de pori -nuclear i acelereaza modificarea Sp100 si histon deacetilaza
4 (HDAC4) de catre SUMO -1 (Kirsh & col ab, 2002) Asada r RanBP2 accelereaza conjugarea
SUMO -1 si SUMO -2/-3 la substraturi specifice.

Dupa Ivan Psakhye, 2012
Figura 3. Repararea ADN prin procesul de SUMOilare

Modificarile de tip SUMOilare sunt reversibile, asadar proteinele pot fi deconjugate de
lizina de catre proteazele SUMO -specifice ce scot complexu l SUMO din substraturile
modificate . Omoloage ale genelor Ulp1, gasit e la S.cerevisiae, sunt prezente si la om, unde au
fost identificate opt astfel de proteine (SENP1, SENP2, SENP3, SENP4, SENP5, SENP6,
SENP7 si SENP8) , care desi sunt specifice pentru SUM O pot deconjuga la randul lor si alte
tipuri de proteine ubiquidin -like. Aceste proteine difera prin domeniile N -terminale
neconservate, asadar pozitia domeniilor va determina substrat ul la care se vor lega, permitand
specificitatea mai mare a tipurilor de proteine deconjugate.
Rolul proteinelor SUMO in celula se refera la participarea acestora la desfasurarea
ciclul celular, avand un rol critic in timpul mitoz ei. Prot eazele specifice SUMO, Ulp2

16
regleaza complexul de proteine ce au rol in separearea cromat inelor surori in timpul diviziunii
celularea sau coeziunea cromozomla. In acest caz substratul SUMO este ADN Topoisomara za
II (Top2) fiind necesara pentru segregarea cromosomului dupa replicare .
Aceste proteine au rol si in pastrarea integritatii genomulu i, mai ales in repararea
defectelor de la nivelul ADN. In repararea defectelor postreplicative a u un rol major
proteinele cu domeniul RING ca RAD18 si RAD5 ce recruteaza enzimele ubiquitin conjugate
pentru repararea ADN defect , realizat de RAD6 si RAD18 ce monoubiquideaza PCNA asupra
K164 formand lanturi poliubiquitale K63 -linked impreuna cu K164 si PCNA (proliferating
cell nuclear antigen). PCNA care se conjuga cu SUMO de catre Ubc9 iar K164 se leaga de
lizina (Hoege & colab , 2002 ).
SUMO ar e rol si in tra nsportul subcelular unde Ubc9 este asocia t cu filamentele
nucleare ale complexelor de pori nucleari de la nivelul nucleului precum si in citoplasma.
Lizina Lys526 modificata de catre SUMO -1 este transportata catre un por al
membranei nucleare unde SUMO va interactiona cu RanBP2. Datorita reversibilitatii
modifcarilor SUMO , aceste proteine au un rol esential in transportul nuclear de proteine.
Un alt rol important al SUMO este de antagonist al ubiquitinei. Datorita faptului ca
lizina poate fi modificata de proteine reglatoarea precum si faptul ca poate fi acetilata sau
metilata , conjugarea cu SUMO poate bloca , prin conjugarea , alte modificarii. Acest fapt este
realizat cu ajutorul factorul de transcriere NF -kB, ce este mentinut intr -o stare inactivare de
proteinele de inhibitoare I κB. Cand sunt prezente semnale de activare IκBα, are loc un proces
de conjugare cu lisina 21 prin poliubiquilare marcand proteina pentru degradare
proteo zimatica si eliberand proteina activata NF -kB dar este stabilizat a de prezent a IκBα care
se leaga de SUMO -1 pe lizina 21, asadar blocand ubiquitinarea si stabilizand proteina . In
acest mod IκBα va fi protejata de degradare (Desterro &col ab, 1998) .
Un exemplu de SUMOilare anormal este cel observat in boala Huntington, c e duce la
moartea neuroni lor prin acumularea de Huntingtin (HTT) , factor care are rolul de a co ntrola
moartea celulara programata , apoptoza, precum si producerea unui factor ce regleaza procesul
de neurogeneza. HTT poate fi modificat prin ubiquitinare sau SUMOilare cu aceiasi lizina
acceptoare. Utilizand ca model experimental Drosophila melanogaster s-a obser vat ca
ubiquitinarea li zinei duce l a scaderea gradului de neurodegenerare pe cand SUMOilarea
lizinei duce la agravarea maladieie si la neurodegenerar e (Walker, 2007).

17
Factori de transcriere implicati in procesele inflamatorii

NF-kB

Factorul nuclear kappa β (NF-kB) este o proteina este implicata in formarea factorul
de transcriere NF -kB (nuclear factor kappa -light-chain -enhancer of activated B cells), care
impr euna cu RelB si c -Rel cliveaza proteinele Nf -kB1 si Nf -kB2. Gena RelA se gaseste la
oameni in cromozomul 11, banda 11q13.1 (Lin & colab , 2004) .
Ca structura, p65 contine un domeniu N -terminal REL -omolog si un domeniu
transactivator C -terminal. Domeniul RE L-omolog este prezent la toti factori transcriptionali
pentru complexul proteic NF -kB, anume: p50, p52, p65, c -Rel si RelB. Acest domeniu are
rolul de a permit e formarea homodimerilor si heterodimerilor pentru de a se lega la promotori
si de a modula expre sia genelor (Moynagh , 2005) .
Proteinele din familia NF -kB sunt inhibate de proteinele citoplasmatice IkB, asadar o
cale de activarea a NF -kB este prezenta in plasma a IkB kinazele (IKK), IkB mascheaza
secventele de amino acizi ce duc la transportul NF -kB in nucleu, mentinandu -le sub o forma
inactivat a la nivelul citoplasmei. IkB kinazele pot sa disocieze IkB de NF -kb. (Ghosh &
colab , 2008).
p65 se gaseste in toate celulele, datorita faptului ca este implicata in formarea
factorului Nf -kB, factor de transc riere esential in celula, avand si rol important in modulrea
raspunsului imun. Fiind principal a gena implicata in raspunsul inflamator al organismului.
Calea de activare a acestui raspuns este declansata de diferiti factori ca si radiatiile UV,
radicali li beri, factorul de necroza tumorala α (TNF α), unii inhibitori tumorali (EGFR),
lipopolisaharidele bacteriene (LPS), care cresc rata de expresieie a RelA ducand la activarea
caii NF -kB (Clakely & co lab, 2015) .
Prin activare caii NF -kB organismal uman poate lupta impotriva numeroase infectii
dar sunt unele cazuri in care patogenii, cum ar fi, virusul imonodeficientei umane prezinta
situsuri de legar e pentru unitatile NF -kB cee a ce duce la cresterea expresiei genelor virale si la
propagarea virusului (Hiscott & colab , 2001) .
Pentru a putea fi a ctivat complexul NF -kB, p65 suferea acetilari si fosforilari , p65
poate fi fosfori lat diferit in reguinea N -terminala, depinzand de stimul activator , ca
lipopolisaharide in mediu sau substante mitogene cum ar fi kinasa 1 (MSK1). Fosforilarea
cauzata de mai multi stimuli duce la cresterea gradului de transcriere a genei .

18
Acetilarea are de asemenea un rol foarte important in cresterea gradului de transcriere
a genei RelA, situsurile de acetilare fiind lizinele din pozitiile: 218, 221 si 310 precum si in
reglarea negative a transcririi prin acetilarea la lizina 122 sau 123.
Asadar, heterodimerul p50/RelA functioneaza ca un factor de transcriere, legandu -se
la mai multe gene pentru a activa leucocitel e, metabolismul, multiplicarea celulara si
procesarea antige nelor. Multiplele cancere care apar ca urmare a mutatiilor acestor gene
indica faptul ca p65 are un rol foarte important in metabolismul, cresterea si diviziunea
celulelor (Li & colab , 2002) .
AP1

c-Jun este o proteina care impreuna cu proteinele din fam ilia Fos, duce la forma rea
factorul de transcriptie AP -1. Proteinele Jun sunt factori de transcriere care formeaza
complexe, impreuna cu proteinele Fos, ce se pot lega de ADN, la complexele 5’ -TGAGTCA –
3’, forma nd subunitati α-helix (Gu & colab , 2007 ).
c-Jun este regulat de cytokine si stimuli extracelulari , radiatiile UV precum si
autoinducti a, unde promotorul jun prezinta situsuri de legare cu afinitate crescuta pentru AP –
1, stimuland in continuare transcriere genei.
Acea sta proteina are un rol foarte important , fiind necesare p entru trecerea celulei in
faza G1 a ciclului celular, regland transcriptia ciclinei D1, precum si datorita propietatiei anti –
apoptotice in cazul iradierii celulei cu UV sau in prezenta TNF α.
c-Jun este si o proto -oncogena, fiind supraexprimat in proportie de 31% in cancerul
primar cat si cel metastatic, fiind necesar a in formare tumorii inca din primele stadi i, iar
supraexpresia genei creste agresivitatea mai multor forme de cancer ( Eferl , 2003 ).

STAT 1

STAT1 sau semnalul de transducere si activatorul de transcriptie 1, este o proteina ce
face parte din familia de proteine STAT. STAT1 poate fi activata de liganzi cum ar fi
Interferon gamma (IFN γ), factorul de crestere epidermala (EGF), Interleukina 6 (IL -6). Prin
legarea liganzilor de receptori celulari duce la activarea Jak kinasei (JAK1 si TYK2) si la
tirosin fosforilarea proteinelor STAT1 si STAT2 ce poate patrunde in nucleu ca factor de
transcriere , sau cascada JAK/STAT. STAT1 are rol in reglarea expresiei numeroaselor gene

19
cu rol in viabilitatea celulei si rezistenta acesteaia la diferite conditii de mediu, in special in
prezenta antigenelor in mediu.
STAT1 are un rol important in cresterea transcrierii factorilor proinflamatorii,
in special a NADPH oxidase, Nox5. Acest lucru poate avea efecte detrimentale in special,
datorita faptului ca familia de enzime Nox duce la formarea speciilor oxigen reactive (ROS)
la nivelul vasculaturii, ducand, datorita stresului oxidativ , si a i nflamatiei, la formarea
leziunilor arteroscleroti ce (Manea & colab, 2012).

C/EBP

C/EBP sau enhancerul (stimulatorul) de legare proteic a se poate atasa sub forma de
homodimer i sau heterodimeri de unele regiuni reglatoar e ale ADN care au rol in controlul
raspunsului imun si inflamator, printre care si NADPH oxidaza, careia ii creste expresia
precum si a multiplelor specii oxigen reactive.
Familia C/EBP are 6 membrii, (C/EBP -α, C/EBP -β, C/EBP -δ, C/EBP -γ, C/EBP -ε si
C/EBP -ξ) care se gasesc in diferite tipuri celulare, avand rol in reglarea functiilor biologice
celulare, putand forma heterodimeri intre diferiti membrii ai familiei C/EBP sau cu alti factori
transcriptionali. Proteina fiind capabila de autoregulare, dar putand fi activata sau represata si
prinfosforilare si acetilare.
In raspunsul inflamator si imun au rol in special C/EBP -α, C/EBP -β, C/EBP -δ, ce
duc la formarea diferitelor citokine, chemokine, imunoglobulin e si a proteinelor de faza acuta,
avand un rol agravant in cazul patologiilor vasculare inflamatorii (Manea & colab, 2014).
Aceste proteine au un rol important si la nivelul adipocitelor, fiind implicate in
adipogeneza precum si in hematopoeza si regenerar ea ficatului

Molecu le cu rol important in patofiziologia complicatiilor
vasculare asociate diabetului zaharat

Endotelina -1

Endotelina -1 (ET-1) este peptidul principal vasoconstric tor, av and multiple functii de
la ajustarea presiunii vasculatorii la formarea u rinii primare la nivel glomerular. Eliberarea de
substante vasoactive a celuelelor endoteliale este daotrita cum ar fi: norepinef rina, trombine

20
precum si in conditii patologice precum hipoxia hypoxi a precum si stress mecanic . Endotelina
are ef ect m itogen asupra celulelor musculare netede vasculare (Manea & colab , 2010 ).
Endotelina are ca precursori big endotelina si preproendotelina , cum se poate vedea in
imaginea alaturata.

Dupa Thomas Lüscher , 2010
Figura 4. Precursorii e ndotelinei -1

Endotelina are ca precursor molecula endotelina mare (big endotelin ), de 39 de amino
acizi, care este clivata in 21 de AAde catre enzima de conversie a endotelinei (ECE).
Endotelina mare are ca precursor la randul ei
pre-endotelina . Producerea de ET -1 este datorata stimularii celulelor endoteliale de hormonul
antidiuretic, ADH si angiotensina 2 , precum si multe cytokine si alte specii reactive la
oxygen. Producerea de ET -1 este inhibata de prostacicline si oxid nitric. Majoritatea
disfunctiilor vasculare ca uzate de crestere nivelului de glucoza din mediu este datorata
supraexpresiei de endotelina 1 (Manea & colab, 2013).
Oxidul nitric este un radical liber, fiind unu din principalii mesageri biologieci in
cadrul sistemului cardiovascular, mai este denumit s i endothelium -derived relaxing factor
(EDRF), ducand la relaxared musculaturii netede din vasele de sange, rezultand vasodilatatia.
(Michel & cob, 1997).

21
Endotelina se poate lega de receptorii din celulele musculare , ETA si ETB care prin
cuplarea lor cu proteina G duce la cresterea calciului in tracelula, ducand la contractia celulei
muscularea.
Asadar, datorita prop rietatilor vasoconstrictoarea ale ET -1, aceasta proteina este
implicata in mai multe afectiuni cardiovasculare , cum ar fi hipertensiunea, atac uri de cord,
pierderea vedereii si probleme la nivelul glomerulilor renali (Lackland & col ab, 2015 ).

Sintaza oxidului nitric de origine endoteliala

Sintaza oxidului nitric de origine endoteliala (eNOS, NOS3) este una din enzimele cu
rol in sintetizarea oxidului nitric . Este implicata in mai multe afectiuni neurodegenerative
datorita rolului oxidului nitric si ca neurotransmitaor la nivelul celulelor neuronale , afectiuni
neurodegenareative precum: Alzheimer , atacuri de cord si ischemie. Dintre enzimele d in
famil a de oxid nitric numai NOS2, iNOS si nNOS (neuronal nitric oxid synthetas) sunt
capabilie sa transforme L -arginia si oxigenul molecular in oxid nitric si L -citrullina, ca in
reactia Kegg:
2 L-arginine + 3 NADPH + 4 O 2 = 2 L -citrulline + 2 nitric ox ide + 3 NADP+ + 4 H 2O.
(Stuehr & colab , 2001)
NOS3 are rol, ca si iNOS, in modulare tonusului vascular prin vasodilatatie, unde
oxidul nitric activeaza guanilat ciclaza, ce opreste calciul sa mai intre in celula, prevenind
contractia, activarea canalelor de K+ de hyperpolarizeaza celula si duce la relaxarea fibrei
musculare si prin crestere nivelului de cGMP (Liu & colab , 2012 )

Sintaza inductibila a oxidului nitric

Sintaza inductibila a oxidului nitric (iNOS) este o izoforma inductibila de NOS ( nitric
oxid synthase ) a carei principala functie este de a media productia de oxid nitric (NO), prin
oxidarea L -argininei si producerea L -citrulinei si a NO.
iNOS este codificata de gena NOS2, localizata pe cromozomul 17.
iNOS se gaseste in macrofage, hepatocite , sinoviocite si celule muscularea netede,
productia acestui enzime poate fi crescuta de interferon gamma (IFN), factorul de necroza
tumorala α (TNF α), interleukine si lipopolizaharide (LPS) (Osterloh & colab, 2016).
S-a observant ca inducerea cantitatilor mari de NO, indusc de iNOS, este cauzata de
medii oxidative, caz in care NO reactioneaza cu superoxizi ducand la formarea peroxnitrite,

22
substanta toxica pentru celule. Acest lucru este foarte important in raspunsul imun a
macrofagelor (Mungrue & colab, 2002).

Moleculele de adeziune celulara vasculara

Moleculele de adeziune celulara vasculara (Vascular cell adhesion molecule -1,
VCAM -1) sau CD106 sunt exprimate de celulele endoteliale, in special dupa stimularea
acestora cu substante inflamatorii sau diferite cytokine. Se leaga de integrina α4β1b exprimata
pe suprafata leucocitelor.
Spre deosebire de restul moleculelor de adeziune VCAM -1 nu se exprima in mod
constant, dar se exprima in conditii proinflamatorii si pro -aterosclerotice foarte repede, chiar
si in cazul leziunilor de dimensiune redusa.
Studiile realizate pe soareci ApoE -/- deficienti in exprimarea integrinei α4β1b
recruteaza mult mai putine macrofage la nivelul placii aterosclerotice (Nageh & colab, 1997).

Molecule de adeziune intracelulara

Moleculele de adeziune intracelular a (Intercelular adhesion molecule -1, ICAM -1)
apartin unui cluster de diferentiere de tip CD54, glicoproteine care se exprima cel mai intens
pe suprafata celulelor endoteliale si intr -o masura mai redusa pe unele celulele ale sistemului
imun, fibroblasti, c elule epiteliare si tesuturi hematopoetice.
Este prezenta in membrana acestor celule in concentratii mici dar in urma stimularii cu
substante proinflamatorii, la fel ca si E -selectina, nivelul de ICAM -1 de pe suprafata celulei
creste considerabil. ICAM -1 se leaga de integrina, LFA -1 si antigenul Macrophage -1, gasite
pe suprafata celulelor sistemului imun, permitand diapedeza ( Gahmberg & colab, 1997) .
Are rol in adeziunea moleculara, ce duce la legarea celulelor sistemului imunitar de
peretii vasculari fiin d ligand pentru LFA -1, integrina, receptor ce permite limfocitelor sa
migreze in tesut dupa ce acestea se leaga de endoteliu.
Are 459 de amino acizi si o masa moleculara de 51 kDa.
ICAM -1 poate fi indus a si de interleukina -1 (IL -1) si factorul de necroza tumorala
(TNF) (Dustin, & colab, 1986) . ICAM -1 este upregulate pe celulele endoteliale in conditii de
inflamatie, cum ar fi in prezenta de IL -1, pentru a permite diapedeza leucocitelor (Jaen &
colab , 2012) .
ICAM -1 este un receptor transmembranar, ce real izeaza adeziunea intre diferite celule
sau intre matricea extracelulara a acestora, prezinta la nivelul extracelular mai multe domenii

23
Ig, stabilizate prin legaturi disulfidice ce pot reliza legare sau interactiunea in mai multe
moduri. Se poate lega in mo d homofilic, intre ele, unde doua molecule de adeziune de acelasi
fel se leaga intre ele sau heterofilica, unde se leaga intre ele doua CAM diferite sau se poate
forma o legatura intre celula si substrat.
CD54 este si un receptor pentru virusuri, cum ar fi virusul West Nile si majoritatea
rhinovirusurilr. HIV, prin legarea particulelor virale cu integrine duce la infectarea celulelor
nonsursceptibile prin intermediul ICAM -1 (Bhalla & colab , 2015) .
Factorii de adeziune moleculara au un rol foarte importan t si in neoplazii, permitand
diseminarea acestor, metastazarii lor, prin extravazare si relocarea lor in noi situsuri (Andreoli
& colab, 2013) .

E-selectina

E-selectina (E -SEL) numita si CD62E, este o glicoproteina de 115kDa si o molecula
de adeziune celu lara care se exprima numai in celulele endoteliale. Are rol in adeziunea
neutrofilelor, monocitelor si a celulelor T, iar transcriptia acesteia este upregulata de substante
proinflamatorii, IL -1, TNF α si LPS precum si infectiile cu anumiti virusuri.
Glicoproteina se leaga de carbohirati prezenti pe suprafata proteinelor leucocitelor,
carbohidrati din familiile Lewis X si Lewis A, asadar are un rol important in raspunsul imun
al organismului, permitan d celulelor sa fie recrutate pentru a ajunge la situsurile inflamatorii.
E-selectina se exprima si in intima vaselor cu placile arterosclerotice la persoanele cu
sindromul coronarian acut, ducand la cresterea raspunsului inflamator de la nivelul placii (
Fang & colab, 2011) .

Matrix metaloproteinaza 9

Matrix metaloproteinaza 9 ( MMP9) este o endopeptidaza zinc -dependenta, cu rol in
repararea tesutului distrus sau mort. Se mai numeste si 92 kDA colegenaza tip IV sau
gelatinaza B, putand degrada matrice ext racelulara si a unor molecule bioactive cu rol in
dezvoltarea embrionala, reproducere, osteogeneza si angiogeneza, memoria si repararea
ranilor.
MMP9 este secretat ca o proproteina de 707 amino acizi, in forma inactiv a ca pro –
MMP 9, care este activate pri n clivarea de catre proteinazale extracelulare. Are 5 domenii, din
care cel propeptidic terminal ce prezinta o cisteina pentru legare a la zincul catal itic cu rolul in

24
mentinerea enzimei in stare inactiva. Activarea acestei enz ime se realizeaza cu ajutorul MMP –
3, care cliveaza propeptina ducand la activarea enzimei.
Asadar aceasta enzima, prin degradarea matricei extracelulare duce la remodelarea
tesuturilor si vindecarea ranilor, spre exemplu prin degradarea matricii de fibrinogen din rani ,
dar are roluri importante si in diferite patologii. Datoritat rolului lui MMP -9 in procesul de
angiogeneza si degradarea matricei este implicat in neoplazii, putand duce la metastazarea
acestora prin degradarea colegenului IV din membrana bazala (Groblewska & colab , 2012 ).

Receptorii Toll -like

Receptorii toll -like (TLR) se numesc asa datorita asemanarii secventei de amino -acizi
cu receptorii Toll gasiti la Drosophila sp., avand functii asemanatoare la om. Sunt proteine de
pe suprafata celulelor cu rol in imunitatea inn ascuta fiind prezente pe celulele dendritice si
macrofage fiind modalitatea principala de recunoastere a patogenilor ca bacteriil e, fungi si
virusuri precum si a moleculelor ce apar in urma distrugerii celulelor in urma apoptozei sau a
necrozei.

25

Dupa Sukhbir Brar, 2015
Figura 5. Structura receptor ilor Toll -like
Dintre cei 10 receptorii Toll -like se remarca TLR4 cu un rol important in
recunoasterea LPS bacteriene si generarea raspunsului imun innascut, deasemenea si
receptorii T LR1, TLR2, TLR5, TLR 6 se pot lega la diferite componente ale peretelui celular
si membranal a bacteriilor pe cand receptorii TLR3, TLR7, TLR8, TLR 9 se pot lega de acizii
nucleici, atat ADN cat si ARN. La nivelul regiunilor citoplasmatice sunt prezenti receptori
pentru interleukina -1 (IL -1Rs) iar regiunile extracelulare contin secvente repetitive bogate in
leucina (LRR) si trei domenii immunoglobuline -like.
Structural TLR au o lungime de 700 -1100 animo -acizi, prezentand atat domenii
extracelulare ce prezin ta situsul de legare, transmembranare si citoplasmatice, TLR1, TLR2,
TLR4 si TLR 5 sunt prezenti in principal la nivelul membranei plasmatice, TLR3, TLR7,
TLR8 si TLR9 se gasesc pe membrana endosomilor si lisosomilor, avand situsurile de legare
in interior ul organitelor. Aceste molecule pot identifica o gama foarte variata de molecule
datorita formarii heterodimerilor intre receptorii toll -like, precum si alte proteine, spre
exemplu CD14 (Gill & colab , 2010).

Molecule utilizate pentru normalizarea interna in experimentele de
transfectie si de analiza a expresiei genice si proteice

26
β-Galactozidaza

β-Galactozidaza e ste o enzima ce hidrolizeaza lactoza in glucaoza si galactoza avand
rol in functionarea normala a celulei. Aceasta enzima se foloseste pentru a determina
cantitatea de lactosa in substantele biologice si fiind o gena “hou se-keeping” e folosita ca
enzima reporte in monitorizarea activitatilor genelor si a gradului acestora de transcriere
(Hermanson, 2013 ).

Dupa Paul Held , 2001
Figura 6. Hidroliza lactozei in glucoza si galactoza cu β-Galactosidazei
β-Gal este principala sursa de producere de energie si carbon din lactoza, putand fi
detectata in conditii de laborator folosing un substrat X -gal, 5-bromo -4-chloro -3-indolyl -β-d-
galactopyranoside. β –Gal va cliva legatura glicosidica din X-gal formand galactoza si 5 –
bromo -4-chloro -3-hydroxyindole, care se va oxida si forma 5' -dibromo -4,4'-dichloro -indigo
un produs colorat care poate fi cuantificat cu usurinta in experimentele biologic e (Gary &
colab , 2005).

Dehidrogenaza gliceraldehid 3 -fosfat
Dehidrogenaza gliceraldehid 3 -fosfat (GAPDH) este o enzima a l carei produs
catalizeaza reacti ile metabolismul ui carbohidratilor si productia de ATP si molecule de
carbon.
Studiile actuale arata faptul ca GAPDH este implicat si in procese de trans criptie si
apoptoza. Tarnscriptia este datorata fa ptului ca complexul coactivator OCA -S contine
GAPDH . Are si functia de a proteja celula de stresul oxidative, prin producerea unui cofactor
antioxidant NADPH, care este produsa cu ajutorul enzimelor din cal ea pentozo -fosfate.
Aceasta cale incepe odata cu incativarea GAPDH datorita oxidantilor din celula (Ralser,
2017) .

27
β-Actina

β-Actina este o izoforma a actinei de 42kDa. Se gaseste la nivelule citoscheletului si
se observa rolurile ace stei protein in motilitatea, structura si integritatea celulei precum si
semnalizarea intercelulara. Aceasta proteina este folosita in normalizarea datelor in Western
Blot (Tran, 2018).
Actinele sunt protein conservate in organism, mutatii in aceasta gena duce la diferite
simptomatologii, cum ar fi sindromul Baraitser -Winter, caracterizat prin dizabilitati
intelectuale si facis distincti ve (Cuvertino & colab, 2017), DYTJ (dystonia juvenile -onset),
caracterizat prin contractii involuntare ale muschilor, malformatii in dezvoltare si pierderea
auzului (Klein & c olab, 2017).

28
Partea II – Contributii originale

Scopul studiului

Scopul aceste i lucrari a vizat identificarea unor mecanisme de natura epigenetica (i.e.,
sistemele enzimat ice responsabile de acetilarea/dezacetilarea histonelor) implicate in
modularea unor procese pato fiziologice specifice disfunctiei vasculare in diabet.
Obiective specifice
1. Evaluarea expresi ei receptorilor pentru endotelina la nivelul celulelor endoteliale si
musculare netede
2. Investigarea rolului histon -acetiltransferazelor p300 si HAT1 in modularea activitatii
promotorului genei ET -1 umane si a activarii uno r factori de transcriere pro -inflamatori

Materiale si metode

In ace st studiu s -au folosit mai multe tipuri celulare : celule endoteliale umane (linia
EAhy926 ) si celule musculare netede umane . Aceste celule au fost cultivate in Dulbecco’s
Modified Ea gle’s Medium cu glucoza 1‰ (5.5 mM) si au fost stimulate cu Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium cu glucoza in concentratie de 4,5‰ (25 mM) glucoza. Celulele au
fost tratate cu diferiti inhibitor i: SAHA sau Vorinostat , 8-(hydroxyamino) -8-oxo-N-phenyl –
octana mide, concentratii de 1µM, 5µM si 10µM ; CPTH2 cunoscuta si ca Cyclopentylidene –
[4-(4-chlorophenyl)thiazol -2-yl)hydrazone, concentratii de 1µM, 5µM si 10µM ; C646 , 4-[4-
[[5-(4,5-Dimethyl -2-nitrophenyl) -2-furanyl]methylene] -4,5-dihydro -3-methyl -5-oxo-1H-
pyraz ol-1-yl]benzoic acid, cu concentratiile de 1µM, 5µM si 10µM in mediu.

I. Preparare mediu Luria Bertani (LB)

1. Pentru prepararea a 1 litru de mediu LB se dizolva in apa:

29
a. 5g Triptona
b. 5g Yeast Extract
c. 10g NaCl
2. Pentru prepararea a 2 litru de mediu LB se dizol va in apa:
a. 10g Triptona
b. 10g Yeast Extract
c. 20g NaCl
3. Mediul LB se distribuie cate 200ml in pahare Erlenmeyer. Se autoclaveaza imediat
dupa preparare folosind programul pentru lichide. Se lasa sa se raceasca, apoi se
poate adauga antibioticul corespunzator in functie de acela la care sunt rezistente
bacteriile transformate pe care vrem sa le multiplicam [ ampicilina (stoc: 50
mg/ml), kanamicina, etc.] (la 200 ml mediu LB se adauga 200 μl de antibiotic).
Mediul LB se pastreaza la temperatura camerei, iar daca am adaugat si antibiotic
se pastreaza la 4șC.

Pregatire placi cu agar
1. Se prepara mediu LB proaspat si se adau ga agar inainte de autoclavare (15g agar/L
mediu LB). De exemplu: la 200mL mediu LB se adauga 30 grame Agar.
2. Se autoclaveaza la programul pentru lichide. Se lasa sa se raceasca si se adauga
antibioticul corespunzator (ampicilina, kanamicina, etc).
3. Se toarn a cate ~20 -25mL mediu LB cu agar in placi mari pentru bacterii.
4. Se lasa sa se intareasca, apoi placile se intorc cu capacul in jos (pentru a nu se
scurge condensul in placa) si se utilizeaza sau se pastreaza la 4șC.

II. Multiplicare bacterii E.coli transf ormate cu ADN plasmidial
Mediul cu antibioticul corespunzator (de ex. ampicilina) se repartizeaza cate
25-30mL in tuburi sterile de 50mL.
In fiecare tub se adauga cate 20 μL de inocul bacterian transformat. Capacul se
strange bine si probele se duc in inc ubator la 37oC.
In interiorul incubatorului se desface capacul fiecarui tub pentru a permite
aerului sa patrunda si se seteaza incubatorul la 37șC cu agitatorul pornit, peste noapte
(ON).

30
Dupa aproximativ 18 ore, se recupereaza tuburile in care s -au multip licat
coloniile bacteriene.
1. Pentru a pregati un stoc de bacterii transformate cu ADN plasmidial, se
amesteca in tuburi de 2ml, mediu LB cu suspensia bacteriana si gl icerol
(100%) in proportie de 1:1 (500 μl mediu LB cu suspensia bacteriana + 500
μl glicerol). Se vortexeaza bine. Se lucreaza pe gheata. Bacteriile
transformate ce contin ADN plasmidial se pastreaza la -70șC.
2. Pentru culturile de bacterii al caror ADN plas midial urmeaza sa fie
purificat, se seteaza centrifuga la 4300 rpm, 4șC si se centrifugheaza timp
de 30 de minute. Se arunca supernatantul in zona desemnata si se pastreaza
bacteriile sedimentate la -20 șC.

III. Izolarea ADN -ului plasmidial (testare colon ii – Mini -prep)

1. 1.5ml cultura bacteriana se centrifugheaza timp de 5 min., 13.000 rpm, RT;
2. Se indeparteaza supernatantul si se pastreaza sedimentul bacterian;
3. Se adauga 240 μl tampon P1 (cu RNaza), se vortexeaza;
4. Se adauga 240μl tampon P2, se omogenizeaza;
5. Se incubeaza 5min., RT;
6. Se adauga 240μl tampon P3, se omogenizeaza;
7. Se incubeaza 10 min. pe gheata;
8. Se centrifugheaza 15 min., 13.000 rpm, RT;
9. Se transfera supernatantul in alte tuburi noi de 1.5ml peste care se adauga cate 720μl
izopropanol (volum 1:1) pentru precipitarea ADN -ului plasmidial;
10. Se vortexeaza usor;
11. Se incubeaza 20 min. pe gheata;
12. Se centrifugheaza 30 min., 13.000 rpm, 4°C;
13. Se indeparteaza supernatantul si se p astreaza peletul (ADN -ul sedimentat);
14. Se adauga 500 μl Etanol 75%;
15. Se centrifugheaza 5 min., 13.000 rpm, 4°C;
16. Se indeparteaza supernatantul si se pastreaza peletul;
17. Se adauga 20 -50μl apa biologie moleculara.

P1: 6.6g Tris baza + 3.72g EDTANa 2 x 2H 2O se di zolva in 800ml H 2O

31
Se ajusteaza la pH -ul la 8 cu HCl. Se aduce la 1 litru cu H 2O. Se adauga 100mg
RNazaA (pt 1 litru P1)
P2: 8g NaOH se dizolva in 950ml H 2O. Se adauga 50ml SDS 20%. (Se aduce la
volum final de 1 litru)
P3: Se dizolva 294.5g acetat de pota siu in 500ml H 2O. Se aduce la pH 5.5 cu acid
acetic glacial (~100ml). Se aduce la 1 litru cu H 2O.

IV. Purificarea plasmidelor (protocol QIAfilter – Midi Kit)
 Se prepara Buffer -ul P1 prin adaugare RNaza A (110 μl) si reactiv LyseBlue
(110μl). Se pasteaza la 2 -8șC.
 Se raceste Buffer -ul P3 la 4șC.
 Se verifica Buffer -ul P2 sa nu aiba SDS -ul precipitat.
1. Se recolteaza culturile bacteriene dupa aproximativ 16 -18 ore de crestere, prin
centrifugare la 4.300rpm, 30 min. , 4șC.
2. Sedimentul bacterian (peletul) se resuspenda in 4ml Buffer P1.
3. Se adauga 4ml Buffer P2 (pentru liza celulelor bacteriene). Se mixeaza cele doua
componente prin rotirea tubului de aproximativ 10 ori, dupa care se incubeaza la
temperatura camerei (RT) pentru aproximativ 5 min. Solutia va deveni albastra daca s –
a adaugat reactiv LyseBlue.
4. Se adauga 4ml Buffer P3 rece in lizat si se mixeaza imediat pentru neutralizarea
reactiei de liza, prin rotirea tubului de aproximativ 10 ori. Daca in solutie s -a adau gat
reactiv LyseBlue, aceasta dupa mixare va deveni incolora.
5. Se pregatesc QIAfilter Cartridge, se insurubeaza dopurile.
6. Se toarna lizatul in QIAfilter Cartridge si se incubeaza la RT, timp de aproximativ 10
min.
7. Se echilibreaza QIAGEN -tip prin adaugarea a 4ml Buffer QBT si se lasa coloanele sa
se goleasca in tuburi de 50ml cu ajutorul gravitatiei.
8. Se scoate dopul de la QIAfilter Cartridge, se introduce usor pistonul si se filtreaza
lizatul bacterian in coloanele QIAGEN -tip echilibrate in prealabil. Lizatul intra in
rasina coloanelor QIAGEN -tip datorita fortei gravitationale.
9. Se spala coloanele QIAGEN -tip cu cate 10ml de Buffer QC de 2 ori.
10. Se elueaza ADN -ul cu 5ml Buffer QF in tuburi de 50ml.
11. Se precipita ADN -ul prin adaugarea in fiecare tub a 5.5ml izop ropanol la RT, se
mixeaza prin rotirea tuburilor.

32
12. Se impart cei aproximativ 10,5ml in tuburi de cate 2ml si se centrifugheaza la
14.000rpm, timp de 30 min., 4șC. Se decanteaza supernatantul cu atentie sa nu se
arunce ADN -ul plasmidial.
13. Se spala peletul d e ADN cu cate 400μl etanol 75% /tubul de 2ml si se centrifugheaza
la 14.000rpm, timp de 10min., RT. Se decanteaza supernatantul cu multa atentie sau
daca avem o cantitate foarte mica de ADN, se foloseste pipeta de 200 μl pentru a
indeparta etanolul.
14. Tuburi le se lasa la uscat timp de aproximativ 1h -2h, intr -o hota sterila (culturi
celulare) cu fluxul de aer pornit pentru a indeparta etanolul.
15. Se resuspenda ADN -ul in 30 μl apa de biologie moleculara /tubul de 2ml si se
centrifugheaza pentru cateva secunde.
16. Probele de acelasi fel se amesteca intr -un singur tub, se determina concentratia ADN –
ului plasmidial la nanodrop si se pasteaza la -20șC.

V. Transfectie tranzienta a celule lor eucariote

Transfectia este procedura prin care se introduce in celule eucariot e ADN purificat,
plasmidial. Se pot transfecta diferite linii celulare (BAEC -uri, THP -1, CMN umane, HepG2,
EAhy926). In acest experiment folosit ca exemplu, s -au transfectat celule endoteliale umane
din linia EAhy926.
S-au folosit plasmide care contin sec vente de promotor si gena raportor a
luciferazei (Luc) (pET -1-Luc, pC/EBP -Luc), vector control fara insert (pcDNA 3.1), vector
control pentru normalizare (pSV β-Gal) si vectori de expresie pentru factori de transcriere
(p65/RELA, c -Jun/AP -1, CEBP β, CEBP δ, STAT1, STAT3) si pentru enzime implicate in
acetilarea/dezacetilarea histonelor (HAT -1, p300, HDAC2, HDAC4, HDAC6, HDAC11).
Celulele umane endoteliale au fost tripsinizate in prima zi de experiment folosind
mediu DMEM 1‰ cu supliment, ser 10%, antibiotic 2% . Celulele au avut o densitate de
aproximativ 130.000 celule/ml de mediu si au fost insamantate pe placi cu cate 12 godeuri,
cate un ml in fiecare godeu.
Celulele au fost amestecate continuu in timpul insamantarii si distribuite in mod egal
pe toata supra fata fiecarui godeu.
In a doua zi de experiment s -a decongelat ADN -ul plasmidial, s -a centrifugat si s-a
pipetat in tuburi de 1.5 ml, in 300 µl de DMEM 1‰ fara ser fetal sau antibiotic.
Cantitatile de ADN (1,3µg) necesare pentru transfectie/godeu sunt:

33
1. 0,9 µg vector care contine secvente de promotor si gena raportor a luciferazei (de
ex.: pET -1-Luc);
2. 0,1 µg vector control pentru normalizare (pSV β-Gal);
3. 0,3 µg vector de expresie sau control (fara insert).

Pentru a calcula necesarul de ADN se foloseste concentratia acestuia, de exemplu:
ADN plasmidial pET -1-Luc are o concentratie de 0,618 µg/ µl, pentru a obtine
0,9 µg de ADN pentru reactia i ntr-un singur godeu se face calculul: 0,9/0,618 µl = 1,456 µl.
Pentru a putea lucra in triplicat se inmulteste cu 3 si anume 1,456*3=4,368 µl. Se vortexeaza
usor si se microfugheaza.
Se realizeaza calculul pentru fiecare tip de ADN necesar.
Super Fect Tran sfection reagent nu se vortexeaza, ci se amesteca prin rotirea tubului
de cateva ori.
Formarea complexelor ADN – Superfect: In fiecare tub de 1.5 ml se gasesc 1,3 µg de
ADN si 300 µl de DMEM 1‰ peste care se adauga reactivul de transfetie (ex. SuperfectTM,
Qiagen) (in raport 1:2 fata de ADN) si anume 2,6 µl de Superfect. Se vortexeaza usor si se
microfugheaza. Mixurile se vor lasa minim 15 minute la temperatura camerei pentru a se
forma complexele ADN – SuperfectTM.
Complexele ADN – SuperfectTM se resusp enda in 3,2ml de mediu (DMEM 1‰, ser
fetal 10% si antibiotic 2%) si se vortexeaza foarte bine (se lucreaza in tuburi sterile de 15 ml).
Se indeparteaza mediul din godeurile cu celulele ce urmeaza a fi transfectate
tranzitoriu si se pipeteaza in fiecare g odeu cate 1 ml din amestecul de mai sus. Se lasa la
incubat timp de 24 de ore.
In a treia zi de experiment, inainte de a aduce celulele in laborator, se decongeleaza
substratul de luciferaza si tamponul de liza. Dupa ce se dezgheata, substratul de lucifera za se
alicoteaza cate 1 ml in tuburi de 1.5 ml, din care pentru fiecare godeu sunt necesari 40 µl. Se
pastreza la 4șC. Tamponul de liza se afla la o concentratie de x5, fiind necesara o concentratie
de x1, la care se aduce cu apa distilata. Nu se vortexeaz a tamponul de liza deoarece spumeaza
puternic (se amesteca prin inversia tubului de cateva ori).

Determinarea activitatii luciferazei probelor obtinute in urma transfectiei tranziente la
luminometrul Berthold

34
Celulele transfectate tranzitoriu se luc reaza in laborator. Se indeparteaza mediul. Se
adauga in fiecare godeu cate 120 µl tampon de liza si se lasa 1 -2 minute pe balansoar la 20
rpm.
Dupa ce s -au lizat celulele, se pipeteaza usor si se colecteaza in tuburi de 1.5 ml.
Daca nu se face citirea in aceeasi zi probele se pot congela.
Masurarea luminiscentei se realizeaza la aparatul Berthold. Substratul pentru
luciferaza si lizatul celular se vortexeaza bine si se centrifugheaza timp de 1 minut la turatia
maxima.
Se folosesc tuburi de 1.5 ml nesterile pentru citirea la aparatul Berthold, in care se
adauga 70 µl lizat celular si 40 µl substrat pentru luciferaza, care se amesteca usor.
Se citesc probele la luminometrul Berthold. Datele se exporta in Excel.

VI. Amplificarea ADN genomic prin PCR

Se lucre aza cu primeri umani pentru cDNA -ul izolat din celule umane si primeri
murini pentru cDNA -ul izolat din celule murine.
Se foloseste Bufferul X 10 care este colorat (contine tampon de solubilizare) pentru
PCR -ul calitativ (cand folosim reactivii de la Qiage n).
Se lucreaza pe gheata. Enzima (Taq Polimeraza) trebuie tinuta la -20șC pana in
momentul utilizarii.

Reactivi:
 Apa de biologie moleculara: 17,7 µl
 Buffer X10: 2,5 µl (contine si 15mM MgCl 2) (Qiagen)
 MgCl 2: 0,5 µl (din stoc 25mM)
 dNTP: 1 µl (din stoc 10 mM)
 Primerul forward F: 0,5 µl (din stoc 10μM)
 Primerul reverse R: 0,5 µl (din stoc 10μM)
 Taq Polimeraza: 0,3 µl (din stoc 5U/ μl)
 cDNA: 2 µl/reactie
Amestecul final de reactie: 25μl in tuburi speciale pentru PCR de 0,2ml.

Etape:

35
1. Etapa initiala de denatur are a cDNA -ului: 95ș, 5 minute, x1 ciclu
2. Denaturarea cDNA -ului: 95ș, 45 secunde, x35 cicluri
3. Atasarea primerilor: 60ș, 45 secunde, x35 cicluri
4. Elongarea catenei: 72ș, 45 secunde , x35 cicluri
5. Elongarea finala: 72ș, 10 minute, x1 ciclu
6. Etapa de racire: 4ș, 3 0 minute, x1 ciclu (optionala)

Prepararea gelului de migrare pentru PCR calitativ

Gelurile pentru migrarea probelor obtinute in urma PCR -ului se pregatesc in camera
dedicata. Se folosesc manusile speciale care sa ne protejeze de temperatura ridicata ( cand se
lucreaza la cuptorul cu microunde ).

– Gel de agaroza de 1,5% (100 ml):
1. 100 ml de solutie TAE x1
2. 50 µl solutie Midori x1
3. 1,5 g agaroza

– Gel de agaroza de 1,5% (cand se foloseste cuva de 200 ml):
1. 200 ml de solutie TAE x1
2. 100 µl solutie Midori x1
3. 3 g agaroza (agaroza se gaseste in camera de preparare a gelurile, unde este si un
cantar special).

Solutia de TAE x1 se prepara din solutia stoc de TAE x50 si anume pentru solutia
TAE x1 (1 litru) se amesteca 20 ml de solutie sto c TAE x50 si 980 ml de apa distilata. Se
pastreaza intr -o sticla de plastic curata la temperatura camerei.

Solutia Midori se gaseste la frigider intr -un tub o pac, fiind sensibila la lumina. Pentru
a realiza solutia de lucru de 100 µl, sunt necesari 10 µl de solutie stoc Midori si 90 µl de apa
de biologie moleculara. Amestecul se vortexeaza bine.

Se pregateste cuva (de exemplu: 200 ml) in care vom turna gelul, in care se fixeaza cei
doi separatori. Se alege din timp pieptenele corespunzator numarului de probe.

36
Se adauga intr -un pahar Erlenmeyer 200 ml de TAE x1 si 3 g de agaroza. Se agita
bine. Se incalzeste amestecul in cuptorul cu microunde, la temperatur a maxima, timp de
aproximativ 2 minute . Se scoate paharul din cand in cand si se amesteca in cont inuare. Se tine
sub supraveghere paharul pentru a nu iesi pe dinafara solutia. Se poate incal zi si mai mult de 2
minute daca mai este agaroza netopita . Se adauga 100 µl solutie Midori x1, si se amesteca
energic. Solutia se toarna in cuva si se pune piept enele. Se l asa la polimerizat aproximativ 30
minute .

VII. Izolare a ARN total din celule endoteliale umane si celule musculare
netede umane

Materiale necesare:
1. Tuburi cu coloana albastra (de filtrare)
2. Tuburi cu coloana rosie (de legare)
3. Tuburi fara colo ana in numar dublu (de colectare)
4. Kitul de extractie GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit de la
Sigma
* Se folosesc manusi care se spala regulat cu RNaza away (inhibitor de RNaze).
* Se noteaza tuburile inainte de a incepe izolarea ARN -ului total.

Etapele de lucru:

1. Se prepara tamponul de liza (TL) cu beta mercaptoetanol (500 µl TL/placa de 60 mm)
(de exemplu daca facem extractia de ARN total din 2 placi, avem nevoie de 1 ml TL si
acesta se obtine astfel: 1 ml solutie de liza cu 10 μL beta mercaptoetan ol).
2. Se spala celulele cu PBS x 1 steril la temperatura camerei (cu exceptia monocitelor
circulante THP1).
3. Se lizeaza celulele cu 500 µl TL/placa de 60 mm.
4. Se transfera lizatul in coloana albastra.
5. Se centrifugheaza la 1300 rpm, timp de 2 minute.
6. Se arunca coloana albastra.
7. Se adauga 500 µl etanol 75% si se vortexeaza sau se mixeaza.

37
8. Se transfera amestecul dintre lizat si etanol in coloana rosie.
9. Se centrifugheaza timp de 1 minut.
10. Se arunca din tub solutia rezultata.
11. Se adauga 500µl solutie Wash 1 peste col oana rosie.
12. Se centrifugheaza timp de 1 minut.
13. Se transfera coloana rosie intr -un tub nou de colectare.
14. Se face o spalare cu 500µl solutie Wash 2 (60 ml de etanol absolut – pentru kitul cu 70
de reactii – trebuie adaugat in solutia Wash 2 inainte de prima utilizare).
15. Se centrifugheaza timp de 1 minut.
16. Se mai face o spalare cu 500µl solutie Wash 2.
17. Se centrifugheaza timp de 5 minute pentru a indeparta etanolul.
18. Se transfera coloana intr -un tub nou de colectare
19. Se adauga 50µl solutie de elutie in coloana ros ie.
20. Se centrifugheaza timp de 2 minute.
21. Se pastreaza tubul de colectare cu ARN -ul total izolat din celule, la -70șC.

Dozarea ARN -ului total

Se realizeaza cu ajutorul instrumentului Nanodrop 1000 (ND 1000)
1. Se calibreaza aparatul cu 1.5µl apa ultrapura (p entru biologie moleculara).
2. Se face citirea utilizand programul RNA40 la 230nm.
3. Prima proba va fi blank -ul (apa pentru biologie moleculara).
4. Se introduc probele una dupa alta pentru citire.
– Print report –

ARN -ul total se va pastra la -70°C.

VIII . Revers -Transcrierea

Etapa 1

Se lucreaza pe gheata, steril.

38
Se calculeaza volumul de ARN total ce urmeaza a fi adaugat folosind dozarile efectuate la
nanodrop, unde se fac citirile la 260nm si 280nm.
Ex: Proba 1 de 1‰ are 320 ng/µl ARN total.
0,320 µg/µl………..1 µl
1µg/µl…………….x µl
x = 3.13 µl de ARN total
Se ajusteaza volumul probei cu apa de biologie moleculara pana la volumul de 31.5µl.

Se face amestecul pentru reactia de Revers -Transcriere (se calculeaza cu o proba in plus).
Amestecul pentru o proba este:
Tampon Revers Transcriere x 5 ……………..10 μl
DTT (0.1M)……..…………………………….…….5 μl
Primeri random (0.3 μg/ μl)……………..….……1 μl
dNTP (10mM)………..………………….…….……1 μl

Dupa ce au fost notate tuburile, se va adauga cantitatea co respunzatoare de apa de biologie
moleculara, amestecul pentru reactia de Revers -Transcriere (17µl de amestec/ proba) si apoi
ARN -ul total calculat pentru fiecare proba.
Probele se vortexeaza si se centrifugheaza inainte de a fi puse in aparatul pentru Reve rs-
Transcriere (Pharmacia).

Protocol Revers Transcriere (aparat Pharmacia)
– Calibre: YES
– Run: YES
– Number program: 36 -> Enter
– Del.exe: NO
Denaturarea dureaza 5 minute la temperatura de 65șC.

Etapa 2
Se lucreaza la temperatura camerei.
Se adauga inhibitoru l de RNAze (RNAase Out Inhibitor cate 0,5μl/ proba) si enzima
Revers -Transcriptaza cate 1μl/ proba.

Protocol Revers Transcriere (aparat Pharmacia)

39
– Run: YES
– Number program: 37 ->Enter
Programul dureaza 60 minute la 37șC si 15 minute la 70șC.
Probele de cDN A se pastreaza la -20șC.

IX. Analiza expresiei proteice prin Western Blot

Extractia proteinelor
1. Se indeparteaza mediul din placile de cultura .
2. Se adauga pe fiecare placa de cultura cate 1ml de PBSx1.
3. Se racleaza celulele si se colecteaza in tuburi de 1. 5 ml.
4. Se centrifug heaza timp de 1 minut, 13.000 rpm la temperatur a camerei.
5. Se indeparteaza PBSx1 din tuburi le de 1.5ml .
6. Se pregatest e tamponul de solubilizare Laemmli de 2 ori concentrat : 1ml tampon
Laemmli + 100µl β-mercaptoetanol .
7. Dupa adaugarea tamponului de solubilizare, probele se vortexeaza si se centrifugheaza
scurt.
8. Probele se vor fierbe la 95°C timp de 10 minute, se vortexeaza si se vor mai fierbe la
95°C pentru inca 10 minute. Extractul proteic se pastreaza la -20°C.

Dozarea proteinelor (Protocol Amido Black)
1. Probele s e aplic a in spoturi de cate 1 µl pe o hartie de nitroceluloza ( curba de
BSA se realizeaza in duplicat , iar probele fiecare in triplicat ).
2. Hartia de nitroceluloza se spala cu metanol 50% pentru indepartarea SDS,
albastru de bromfenol, glicerol.
3. Se coloreaza cu solutie Amido Black timp de cateva minute, dupa care se
recupereaza colorantul.
4. Se mai spala o data cu metanol 50% pentru indepartarea colorantului.
5. Se indeparteaza excesul de metanol si se pune hartia de nitroceluloza pe o folie
de scanare.
6. Se scaneaza hartia de nitroceluloza cu spoturile ce urmeaza a fi masurate.
7. Densitometria spoturilor proteice se va face cu programul TotalLabTM.

Gelul de migrare SDS -PAGE

40
Exemplu pentru 4 geluri de co ncentratie 10% :
25 ml solutie SDS -PAGE de 10% pentru 4 geluri de migrare;
5 ml solutie SDS -PAGE de 12%, pentru izolare;
10 ml solutie SDS -PAGE de 5% pentru concentrare.
Gelurile se vor turna i ncepand cu cel de izolare, aproximativ 300 µl pentru fiec are gel .
Se va turna pana la semn gel ul de migrare care se va tasa cu butanol 500 µl inainte ca gelul sa
polimerizeze, pentru a indeparta eventualele bule de aer. Apoi se adauga gelul de concentrare
in care se fixeaza un piept ene pentru a se forma godeuril e in care se pipeteaza probele ce
contin proteinele ce urmeaza a fi separate in functie de masa lor moleculara .
Gelurile se introduc in cuva pentru migrare, in care se toarna aproximativ 1L de
tampon de migrare si se incarca probele de interes in godeurile gelurilor.
Probele vor migra la un voltaj de 100V timp de aproximativ 60 de minute.
Se scot gelurile si se lasa la echilibrat cateva minute intr -o baie de tampon de transfer.

Transferul proteinelor pe membrana de nitroceluloza, blocarea, incubarea cu ant icorpii
pimari/secundari si developarea

Se pregateste hartia de filtru si membrana de nitroceluloza pentru transferul probelor
prin imbibarea lor timp de 30 minute in tampon de transfer.
In sistemul de transfer se pun in ordine: hartia de filtru; membran a de nitroceluloza;
gelul de migrare; hartia de filtru. Probele migreaza la un voltaj de 15V timp de 30 de minute.
Se verifica daca probele au migrat corect in membrana de nitroceluloza prin colorarea
reversibila cu solutie Ponceau. Se taie marginile membr anei in functie de marimea proteinei
de interes migrate.
Membranele de nitroceluloza se vor incuba cu tampon de blocare TBS Blotto A timp
de 1h. Se adauga anticorpii primari (de exemplu: in 5ml de TBS Blotto A se adauga cantitatea
corespunzatoare de antico rp primar). Fiecare anticorp are de la firma care il produce, o
concentratie recomandata, spre exemplu:
Anticorpii primari: 1µl Ac. la 200µl TBS Blotto A
Anticorpii secundari: 1µl Ac. la 2000 µl TBS Blotto A
Anticorpii pentru β -actina: 1µl Ac. la 1000 µl TBS Blotto A
Bloturile se incubeaza cu anticorpul primar, peste noapte, la 4șC (camera rece), cu
agitare usoara .

41
A doua zi, membranele de nitroceluloza se incubeaza cu anticorpul secundar, timp de
1h, la temperatura camerei. Se spala bloturile de 3 ori cat e 15 minute cu cate 5 ml de TBS cu
Tween20 (0.05%), iar la final cu PBS x 1, timp de 15 minute.
Pentru developarea membranelor la aparatul de chemiluminiscenta (LAS4000 –
Fujifilm) se pregateste cate 1 ml de amestec de ECL pentru fiecare membrana si se dis tribuie
uniform pe suprafata acest eia. Bloturile se pun in aparatul pentru developat si se introduc
setarile corespunzatoare (Precision si High Resolution), iar aparatul se lasa sa iti gaseasca
automat timpul de expunere sau se pot seta manual timpii de ex punere.
Analiza densitometrica a benzilor proteice se va face cu programul TotalLabTM.
Bloturile dupa developare se pot spala cu PBS si se pot pastra la -20°C intre bucati de
hartie de filtru.

42
Rezultate

Analiza morfologica a celulelor – microscopie in c ontrast de faza

S-au folosit celule musculare netede umane , crescute in DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle's medium) cu supliment de amino acizi, amestecat cu 10% ser fetal bovin si 2% ameste c
de penicilina, streptomicina si neomicina.

Figura 7. Celulel e musculare netede fotografiate la microsco pul optic (contrast de faza
– marire x5, x10, x20, respectiv x40)

43
S-au mai folosit si celule endoteliale umane imortaliza te din linia EAhy926, crescute in
mediul in aceleasi conditii ca si pentru celulele mu sculare netede umane .

Figura 8 . Celule EAhy926 fotografiate la microsco pul optic (contrast de faza – marire
x5, x10, x20 resp ectiv x40)

Investigarea rolului histon -acetiltransferazelor p300 si HAT1 in modularea
activita tii promotor ului genei ET -1 umane si a activarii unor factori de
transcriere pro -inflamatori

Celulele din lina EAhy 926 au fost utilizate in experimentele de transfectie tranzienta
cu mai multe tipuri de plasmide pentru a investiga implicarea histon -acetiltransferazelor p300

44
si HAT1 in modularea activitatii promotorului ET-1 si a unor factor i de transcriere pro –
inflamatori. Plasmide le utilizate au fost:
 Plasmida fara insert (“empty vector”, pcDNA );
 Vector de expresie plasmidial pentru beta -galacozidaza pentru normalizarea
interna (p SV-βGal);
 Vectori care contin gena raportor a luciferazei care contin: promoto rul proxilal
al genei ET -1 umane (pET1 -luc), 3 elemente de legare NF-kB (pNF -kB-luc), 3
elemente de legare C/EBP (pC/EBP -luc), 5 elemente de legare AP1 (pAP1 –
luc). Fiecare plasm ida prezinta gena pentru rezistenta la ampicilina ;
 Vectori de expresie plasmidiali pentu genele: p65/NF -kB, c -Jun/AP -1 C/EBPβ,
C/EBPδ, p300/CBP, HAT1. Plasmide le contin gena de rezistenta la ampicilina.

Figura 9 . Reprezentarea schematica a constructului pET1 -Luc care contine regiun ea
proximala a promotorului genei ET -1 clonata inaintea genei raportor a luciferazei

45

Figura 10. Histon -acetiltransferazele p300 si HAT1 induc activarea factorului de
transcriere pro-inflamator CCAAT/enha ncer -binding protein (C/EBP) in vitro .
*P<0.05 , **P<0.01. Valoarile statistice P stabilite in raport cu nivelulul vectorului fara
insert (“Empty vector”)

Se observa cresterea nivelului de activare a factorului de transcriere C/EBP in
conditiile supraexp rimarii histon acetil trans fereazelor p300 sau HAT1. Vectorul de expresie
pentru factorul de transcriere C/EBP δ a fost utilizat drept control pozitiv.

Figura 11. Histon -acetiltransferazele p300 si HAT1 induc activarea promotorului genei
ET-1 umane in vitro (EAhy926) . *P<0.05 , **P<0.01, ***P <0.001. Valoarile statistice P
stabilite in raport cu niv elulul vectorului fara insert ( “Empty vector”)

46

Figura 12. Reprezentarea schematica a strategiei experimentale (co -transfectia
tranzienta a vectorului pET1 -Luc in prezenta vectorului fara insert (“empty vector” –
control) sau a vectorilor de expresie pentru factori de transcriere (p65/NF -kB, cJun/AP –
1, C/EBP β, C/EBP δ – controale pozitive) sau histon -acetiltransferaze (p300, HAT1).

Expresia receptorilor pentru endotelina la nivelul celulelor endoteliale si
musculare netede

Pentru a vedea expresia receptorilor pentru endoteli na a celulelor endotelia le si
musculare netede la di ferite concentratii de glucoza , precum si in prezenta inhibitorile s -au
folosit celule din linia EAhy 926 si celule musculare netede din pasajul 12 in mediu cu 1‰
glucoza si in mediu cu 4,5‰ glucoza. Celulele au fost stimulate timp de 2 4 de ore in mediu cu
cantitatea de glucoza crescuta, urmat de inhiba rea cu diferite concentrtii de CPTH2, SAHA si
C646 timp de 24 de ore.
Dupa stimuarea celulelor s -a extras ARN total, urmand sa fie revers transcris care s -au
folosit in realizarea unui P CR. In acest experiment s -au folosit enzimele de la firma Q iagen,
iar primerii folositi au fost umani.
Primerii folositi au fost receptorii pentru endotelina: ETA1, ETA2, ETB si GAPDH.

47

Figura 1 3. Analiza calitativa a exprimarii receptorilor pentru ET -1, ETA si ETB in
celulele endotelia le si musculare netede vasculare umane

Din imagine a de mai sus se observa expresia receptorilor ETB la nivelul celulelor
endoteliale fata de cele musculare, care au exprimat mai bine ETA1 si ETA2.

48
Figura 14. Inhibarea farmacologica a HAT (C PTH2) reduce nivelele de exprimare
genica si proteica ale ET-1 in celulele endoteliale umane (EAhy926) . *P<0.05 , **P<0.01.
Valoarile statistice P au fost stabilite in raport cu nivelul 25 mM glucoza

Figura 15. Inhibarea farmacologica a p300 -HAT (C646) reduce nivelul de exprimare
genica al ET-1 in celulele endoteliale umane (EAhy926) . *P<0.05 , **P<0.01.
Valo rile statistice P au fost stabilite in raport cu nivelul 25 mM glucoza.

Figura 16. Determ inarea nivelelor de exprimare genica ale receptorului ETB prin
tehnica real -time PCR in culturi de celule endoteliale umane ( EAhy926 ) expuse

49
concentratiilor normale (5.5 mM) sau crescute (25 mM) de glucoza in absenta sau
prezenta inhibitor ului farmacologi c al histon acetiltransferazelor , CPTH2

Figura 17. Determinarea nivelelor de exprimare genica ale receptorului ETB prin
tehnica real -time PCR in culturi de celule endoteliale umane (EAhy926) expuse
concentratiilor normale (5.5 mM) sau cre scute (25 mM) de glucoza in absenta sau
prezenta inhibitorului farmacologic al histon acetiltransferazelor, C 646

50
Figura 18. Inhibarea farmacologica a HDAC (SAHA ) reduce nivelul de exprimare
genica al receptorului ETB in celulele endoteliale u mane (EAhy926) . **P<0.01. Valoarea
statistica P a fost stabilita in raport cu nivelulul 5.5 mM glucoza.
***P <0.001. Valoarea statistica P a fost stabilita in raport cu nivelul 25 mM glucoza.

Figura 19. Inhibarea farmacologica a HDAC (SAHA ) reduce nivelul de exprimare
genica al receptorului ET A in celulele musculare netede umane din pasajul 15.
*P<0.05. Valoarea statistica P a fost stabilita in raport cu nivelulul 25 mM glucoza.
**P<0.01. Valoarea statistica P a fost stabilita in raport cu n ivelul 25 mM glucoza.

Din figurile de mai sus se observa foarte clar expresia marita in conditii de concentrati
crescut e de glucoza a receptorilor pentru endotelina ETB, precum si efectele inhibitorilor de
histo n deacetilaza (SAHA ), care reduc nivelul de transcriere a receptorilor si inhibitorului de
histon acetiltransferazelor (CPTH2 si C646), aratand importanta folosirii acestor produsi
farmacologici pentru mentinerea sanatatii cardiovasculare .
Se mai observa cresterea expresiei receptorilor ETA in mediu cu concentratii de
glucoza de 25mM si efectul inhibitor a histon acetiltransferazei (SAHA) prin reducerea
expresiei acestor receptori.
Studiile actuale asupra efectelor diabetului se axeaza mai mult asupra efectelor genelor
proinflamatorii la nivelul cel ulelor din sistemul imunitar, spre exemplu monocitele circulante
(THP -1). In conditii asemanatoare de glucoza crescuta in mediu, s -au obtinut rezultate
similare (Yun & colab, 2011).

51
Cresterea expresiei genelor proinflamatorii, in special la nivel cardiovas cular duce la
cresterea riscului aparitiei bolilor inflamatorii, cum ar fi: arteroscleroza, rezistenta la insulina
sindrom metabolic , angina miocardica si ischemia precum si alte complicatii datorita
producerii de specii oxigen reactive .
Asadar, diabetul f iind una din cauzele cresterii expresiei genelor proinflamatorii iar
scopul acestui studiu a fost de a determina daca inhibitorii de histon acetiltransferaza si histon
deacetiltransferaza pot sa reduca expresia acesotor la un nivel normal

52

Concluzii
Persoanele diabetice, prezin ta alterari la nivelul expresiei genelor cauzate in special de
hiperglicemie, principala manifestare clinica a acestei maladii. Studiile recente demonstreaza
implicarea mecanismelor epigenetice (metilarea ADN, modificarea post -translationala a
histo nelor, ARN necodant) in patologia sistemului cardiov ascular care conduc la inflamatie,
stres oxidativ, modificarea structurala a vase lor de sange si a mecanismelor implicate in
reglarea relaxarii vasculare.
De asem enea, alterarea mecanismelor epigenetice in diabet au dat nastere unei noi
teorii, aceea de “memorie hiperglicemica” sau “memorie metabolica“ . Conform acestei teorii,
chiar in conditiile in care nivelul glicemei este controlat terapeutic, o serie de reac tii
inflamatorii si oxidative p ersista la nivelul diferitelor organe si tesu turi inclusiv la nivelul
sistemului cardiovascular.
Rezultatele acestui studiu efectuate pe modele experimentale in vitro (i.e. culturi de
celule endoteliale umane /celule musculare netede umane expuse concentratiilor normale sau
crescute de glucoza) au evidentiat faptul ca o serie de inhibitori farmacologici ai unor enzime
implicate in modularea nivelul ui de acetilare/dezacetilarea a histonelor cat si a unor proteine
non-histonice (e.g., factori de transcriere) reduc semnificativ nivelele de exprimare a l unor
molecule cu rol importnat in patofiziologia complicatiilor vasculare asociate diabetului
zaharat .
In acest context, m odularea farmacologica a mecanismelor epigenetice implicate in
acetilarea/dezacetilarea histonelor poate reprezenta o noua si import anta strategie terap eutica,
posibil in combinatie cu medic amente anti -hiperglicemiante pentru tratame ntul complica tiilor
cardiovasculare in diabet .

53

Bibliografie

Andreoli TE, Brown AM, Fambrough DM, Hoffman JF, Schultz SG, Welsh MJ, Cell
Adhesion, 2013, Molecular Biology of Membrane Transport Disorders, 1:11 -45.
Behnia R, Panic B, Whyte JR, Munro S, Targeting of the Arf -like GTPase Arl3p to
the Golgi requires N -terminal acetylation and the membrane protein Sys1p, 2004, Nat.Cell
Biol., 6:405 –413.
Békési A, Vértessy BG, Uracil in DNA: error or signal?, 2011, Science,
https://is.muni.cz/el/1431/jaro2015/ C2130/um/56180295/issue18_uracil.pdf
Bhalla K, Chugh M, Mehrotra S, Rathore S, Tousif S, Dwivedi VP, Prakash P, et al.,
Host ICAMs play a role in cell invasion by Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium
falciparum, 2015, Nature Communications, 6:6049.
Blakely C, Pazarentzos E, Olivas V, Asthana S, Yan J, Tan I, Hrustanovic G, et al.,
NF-κB activating complex engaged in response to EGFR oncogene inhibition drives tumor
cell survival and residual disease in lung cancer, 2015, Cell Rep. 11(1):98 -100.
Bohren KM, Nadkarni V, Song JH, Gabbay KH, Ower -bach DA, M55V
polymorphism in a novel SUMO gene(SUMO -4) differentially activates heat shock
transcription factors and is associated with susceptibility to type I diabetes mellitus, 2005, J.
Biol. Chem., 279:27233 –27238.
Chimenti F, Bizzarri B, Maccioni E, Secci D, Bolasco A, Chimenti P, Fioravanti R, et
al., A novel histone acetyltransferase inhibitor modulating Gcn 5 network: cyclopentylidene –
[4-(4’-chorophenyl)thiazol -2-yl)hydazone, J Med Chem, 2009, 52(2):530 -536.
Cuvertino S, Stuart HM, Chandler KE, Roberts NA, Armstrong R, Bernardini L et al.,
ACTB Loss -of-Function Mutations Result in a Pleiotropic Developmental Disorder, 2017,
Am J Hum Genet, 101(6):1021 -1033.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT, SUMO -1 modificat ion of IkappaBalpha inhibits
NF-kappaB activation, 1998, Mol. Cell., 2:233 –239.
Desterro JM, Thomson J, Hay RT, Ubch9 conju -gates SUMO but not ubiquitin, 1997,
417:297 –300.
Dinh TV, Bienvenut WV, Linster E, Feldman -Salit A, Jung VA, Meinnel T, Hell R,
Giglione C, Wirtz M. Molecular identification and functional characterization of the first Nα –

54
acetyltransferase in plastids by global acetylome profiling , 2015, Proteomics, 15(14):2426 –
2435.
Drazic A, Myklebust LM, Ree R, Arnesen T, The world of protein acetyl ation, 2016,
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics, 1864(10):1372 -1401.
Dustin ML, Rothlein R, Bhan AK, Dinarello CA, Springer TA, Induction by IL 1 and
interferon -gamma: tissue distribution, biochemistry, and function of a natural a dherence
molecule (ICAM -1), 1986, The Journal of Immunology, 137(1):245 -254.
Eferl R, Ricci R, Kenner L, Zenz R, David JP, Rath M, Wagner EF, Liver tumor
development. c -Jun antagonizes the proapoptotic activity of p53, 2003, Cell, 112(2):181 –92.
Fang F, Zh ang W, Yang L, Wang Z, Liu DG, PECAM -1 and E -selectin expression in
vulnerable plague and their relationships to myocardial Leu125Val polymorphism of
PECAM -1 and Ser128Arg polymorphism of E -selectin in patients with acute coronary
syndrome, 2011, Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 39(12):1110 –6.
Forte GM, Pool MR, Stirling CJ, N -terminal acetylation inhibits protein targeting to
the endoplasmic reticulum, 2011, PLoS Biol. 9:e1001073.
Gahmberg CG, Tolvanen M, Kotovuori P, Leukocyte adhesion –structure and fu nction
of human leukocyte beta2 -integrins and their cellular ligands, 1997, Eur. J. Biochem., 245
(2):215 –32.
Gary RK, Kindell SM , Quantitative assay of senescence -associated β -galactosidase
activity in mammalian cell extracts, 2005, Analytical Biochemist ry, 343(2):329 –334.
Gendron RL, Laver NV, Good WV, Grossniklaus HE, Miskiewicz E, Whelan MA,
Walker J, Paradis H, Loss of tubedown expression as a contributing factor in the development
of age -related retinopathy, 2010, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 51:52 67–5277.
Ghosh S, Hayden M, New regulators of NF -κB in inflammation, 2008, Nat. Rev.
Immunol., 8(11):837 –48.
Gill R, Tsung A, Billiar T, Linking oxidative stress to inflammation: Toll -like
receptors, 2010, Free Radical Biology and Medicine, 48:1121 –1132.
Gregory A , Nichols GA, Nichols TA, Progression from newly aquired impaired
fasting to type 2 diabetes, 2007, Diabetes Care, 30(2):228 –233.
Groblewska M, Siewko M, Mroczko B, Szmitkowski M, The role of matrix
metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs) in the development of esophageal
cancer, 2012, Folia Histochemica Et Cytobiologica, 50 ,(1):12 –9.

55
Gu Q , Tan M , Sun Y, SAG/ROC2/Rbx2 Is a Novel Activator Protein -1 Target that
Promotes c -Jun Degradation and Inhibits 12 -O-Tetradecanoylphorbol -13-Acetate –Induce d
Neoplastic Transformation , 2007, Cancer Research, 67(8):3 616-3625.
Gupta S, Kim SY, Artis S, Molfese D, Schumacher A, Sweatt JD, Paylor R, Lubin,
Histone methylation regulates memory formation, 2010, The Journal of Neuroscience, 30
(10):3589 –3599.
Herman son GT, Enzyme Modification and Conjugation, 2013, Bioconjugal
Techniques, 3:951 -957.
Hiscott J, Kwon H, Génin P, Hostile takeovers: viral appropriation of the NF -kappaB
pathway, 2001, J Clin Invest., 107(2):143 -51.
Hoege C, Pfander B, Moldovan GL, Pyrowol akis G, RAD6 -dependent DNA repair is
linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO, 2002, Nature, 419(6903):135 -141.
Huff JT, Zilberman D, Dnmt1 -Independent CG Methylation Contributes to
Nucleosome Positioning in Diverse Eukaryotes, Cell, 2014, 156( 6):1286 –1297.
Ikram M, Ong T, Cheung C, Retinal vascular caliber measurements: clinical
significance, current knowledge and future perspectives, 2013, Ophthalmologica, 229:125 -36.
Jaen JJ, Powers P, Sullivan T, Type -2 Diabetes and Associated Comorbidities as an
Inflammatory Syndrome, 2012, Annual Reports in Medicinal Chesmestry, 47:159 -175.
Kirsh O, Seeler JS, Pichler A, Gast A, Muller S, Miska E, Mathieu M, et al., The
SUMO E3 ligase RanBP2 promotes modification of the HDAC4 deacetylase, 2001, EMBO
J.21, 2 682–2691.
Klein C, Lohmann K, Marras C, Münchau A, Hereditary Dystonia Overview, 2017,
Gene Reviews.
Lackland DT, Weber MA, Global burden of cardiovascular disease and stroke:
hypertension at the core, 2015, The Canadian Journal of Cardiology, 31(5):569 –71.
Li Q, Verma IM, NF -kappaB regulation in the immune system, 2002, Nature Reviews.
Immunology, 2(10):725 –34.
Lim AK, Diabetic nephropathy – complications and treatment , 2014, Internationa l
Journal of Nephrology and Renovascular Disease, 7:361 –81.
Lin-FC, Greene WC, Shaping the nuclear action of NF -kB, 2004, Nature Reviews
Molecular Cell Biology, 5:392 –401.
Liu Y, Feng Q, NOing the heart: role of nitric oxide synthase -3 in heart developmen t,
2012, Differentiation, 84(1):54 –61.

56
Manea A, Manea SA, Florea IC, Luca CM, Raicu M, Positive regulation of NADPH
oxidase 5 by proinflammatory -related mechanisms in human aortic smooth muscle cells,
2012, Free Radic Biol Med, 52(9):1497 -1507.
Manea SA, M anea A, Heltianu C, Inhibition of JAK/STAT signaling pathway
prevents high -glucose -induced increase in endothelin -1 synthesis in human endothelial cells,
2010, Cell and Tissue Research, 340(1):71 -79.
Manea SA, Manea A, Fenyo MI, C-Src tyrosine kinase media tes high glucose -induced
endothelin -1 expression , 2016, The international journal of biochemistry & cell biology ,
75:123 -130.
Manea SA, Todirita A, Manea A, High Glucose -Induced Increased Expression of
Endothelin -1 in Human Endothelial Cells Is Mediated by Activated CCAAT/Enhancer –
Binding Proteins, 2013, PLoS One, 8(12):e84170.
Manea SA, Todirita A, Manea A, Raicu M, C/EBP transcription factors regulate
NADPH oxidase in human aortic smooth muscle cells, 2014, J Cell Mol Med, 18(7):1467 –
1477.
Michel T, Feron O, Perspective Series: Nitric Oxid and Nitric Oxide Synthases, 1997,
The American Society for Clinical Investigation, Inc, 100(9):2146 -2152.
Moynagh PN, The NFkB pathway, 2005, J Cell Sci ., 118:4389 –4392.
Mungrue IN, Husain M, Stewart DJ, The role of NOS in heart failure: lessons from
murine genetic models, 2002, Heart Fail Rev. 7(4):407 –22.
Myklebust LM, Van Damme P, Støve SI, Dörfel MJ, Abboud A, Kalvik TV, Grauffel
C, Jonckheere V, et al., Biochemical and cellular analysis of Ogden syndrome reveals
down stream Nt -acetylation defects, 2015, Hum. Mol. Genet., 24:1956 -1976.
Nageh MF, Sandberg ET, Marotti KR, Lin AH, Melchior EP, Bullard DC, Beaudet
AL, Deficiency of inflammatory cell adhesion molecules protects against atherosclerosis in
mice, 1997, Arterios cler Thromb Vasc Biol, 17(8):1517 -1520.
Nishikawa T, Edelstein D, Du XL, Yamagishi S, Matsumura T, Kaneda Y, Yorek
MA, Beebe D et al. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways
of hyperglycaemic damage, Nature, 2000, 404(6779):78 7–90.
Osterloh A, Papp S, Moderzynski K, Kuehl S, Richardt U, Fleischer B, Persisting
Rickettsia typhi Causes Fatal Central Nervous System Inflammation, 2016, Infect Immun,
84(5):1615 -1632.

57
Ralser M, Wamelink MM, Kowald A, Gerisch B, Heeren G, Struys EA, Klipp E,
Jakobs C, Breitenbach M, Lehrach H, Krobitsch S, Dynamic rerouting of the carbohydrate
flux is key to counteracting oxidative stress, 2017, Journal of Biology, 6(4): 10.
Ramalingam S, Maitland M, Belani C, Kassardjian CD, Dyck PJB, Davies JL, Rick ey
EC, Does Prediabetes Cause Small Fiber Sensory Polyneuropathy? Does it Matter? , J Neurol
Sci, 2015, 355(0):196 -198.
Rodriguez MS, Dargemont C, Hay RT, SUMO -1 conjugation in vivo requires both a
consensus modification motif and nuclear targeting, 2001, J. Biol. Chem., 276:12654 –12659.
Romanov GA, Kuzmenko AP, Dashkevich VS, et al., Purified Glucocorticoid –
Receptor Complexes from Rat Liver Cytosol Preferentially Bind to a HomologousDNA
Fraction Whose Transcription Is Activated by Cortisol, FEBS Lett., 198 4, 165:35 –38.
Ronald T, Hay RT, SUMO: A History of Modification, 2005, Molecular Cell., 18:1 –
12.
Rope AF, Wang K, Evjenth R, Xing J, Johnston JJ, Swensen JJ, et al., Using VAAST
to identify an X -linked disorder resulting in lethality in male infants due to N-terminal
acetyltransferase deficiency, Am J Hum Genet., 2011, 89(1):28 -43.
Rossetto D, Avvakumov N, Côté J, Histone phosphorylation: a chromatin
modification involved in diverse nuclear events, 2012, Epigenetics, 7(10):1098 -1108.
Stefan M, Zhang W, Conc epcion E, Yi Z, Tomer Y, DNA methylation profiles in type
1 diabetes twins point to string epigenetic effects on etiology, Journal Autoimmun., 2014,
50:33 -7.
Stuehr D, Pou S, Rosen GM, Oxygen reduction by nitric -oxide synthases, 2001, The
Journal of Biolog ical C hemistry, 276:14533 -14536.
Tatham MH, Jaffray E, Vaughan OA, Desterro JM, Botting CH, Naismith JH, Hay
RT, Polymeric chains of sumo -2 and sumo -3 are conjugated to protein substrates by sae1/sae2
and ubc9, 2001, J. Biol. Chem. , 276.
Tran KV, Distinct adipocyte progenitor cells are associated with regional phenotypes
of perivascular aort ic fat in mice, 2018, Mol Metab, 9:199 -206.
Walker FO, Huntington's disease, 2007, Semin Neurol, 27(2):143 -150.
Wilcox G, Insulin and Insulin Resistance, 2005, The Aust ralian Association of
Clinical Biochemists.
Willis DM, Loewy AP, Charlton -Kachigian N, Shao JS, Ornitz DM, Towler DA,
Regulation of osteocalcin gene expression by a novel Ku antigen transcription factor complex,
2002, J. Biol. Chem. 277:37280 –37291.

58
Wolf ML I, Fan Z, Rauh M, Seufert S, Hore N, Buchfelder M, Savaskan NE, Eyupoglu
IY, Histone deacetylases inhibition by SAHA/Vorinostat normalizes the glioma
microenvoiroment via xCT equilibration, Scientific Reports 4, 2014, Art 6226.
Ylitalo KR, Peripheral Vascu lar Disease and Peripheral Neuropathy in Individuals
With Cardiometabolic Clustering and Obesity, 2011, National Health and Nutrition
Examnination Sur vey 2001 -2004, Diabetes Care, 34(7): 1642 -1647.
Yuankai S, Frank B, The global implications of diabetes and cancer, The Lancet,
2014, 383(9933):1947 -1948.
Yun JM, Jialal I , Devaraj S, Epigenetic regulation of high glucose -induced
proinflammatory cytokine production in monocytes by curcumin, 2011, The Journal of
Nutritional Biochemistry, 22(5):450 -458.
Zhao D, F ukuyama S, Kawaoka Y, c646, a Novel p300/CREB -Binding Protein
Specific Inhibitor of Histone Acetyltransferase, Attenuates Influenza A Virus Infection,
Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(3):1902 -1906.
Zhao S, Xu W, Jiang W, Yu W, Lin Y, Zhang T, Yao J, et al, Regulation of Cellular
Metabolism by Protein Lysine Acetylation, Science, 2010, 327(5968):1000 –1004.