Master de Genetică Aplicată și Biotehnologie [600804]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
Facultatea de Biologie
Master de Genetică Aplicată și Biotehnologie

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coducător științific:
Lect or Dr. Daniela POJOGA
Îndrumător CSIII dr Bicheru Nicoleta Simona

Masterand: [anonimizat]
2020

Se depune în 2 exemplare : 1 exemplar se depune odată cu celelalte documente la secretariat și 1
exemplar se îndosariază în Lucrarea de licență Aviz final
Coordonator științific,
Lector Dr. Pojoga Maria Daniela
(Numele și prenumele)

(Semnătura)

D E C L A R A Ț I E

Subsemnatul/ subsemnata Brucher Ioana Irina candidat: [anonimizat] , Facultatea de Biologie, Domeniul Biologie , Programul de studi i
Genetică Aplicată și BIotehnologie , declar pe proprie răspundere că lucrarea de față este
rezultatul muncii mele, pe baza cercetărilor mele și pe baza informațiilorobținute din surse
care au fost citate și i ndicate, conform normelor etice, în note și în bibliografie.
Declar că nu au am folosit tacit sau ilegal munca altora și că nici o parte din teză nu
încalcă drepturile de proprietate intelectuală ale cuiva, persoană fizică sau juridică.
Declar că lucrare a nu a mai fost prezentată sub această formă vreunei instituții de
învățământ superior în vederea obținerii unui grad științific ori didactic.
Declar că în Lucrarea de Disertație am depus Raportul privind gradul de similitudine
(forma scurtă), așa cum a rezultat din verificarea cu soft specializat.

Data Semnătura
20.06.2020

REFERAT DE APRECIERE A LUCRĂRII DE DISERTAȚIE

Titlul lucrării de disertație:
Studiul reactivității genomului uman la acțiunea radiațiilor ionizante X

Nume și prenume student: [anonimizat] :
Genetică aplicată și Biotehnologie

Conținutul lucrării să NU fie plagiat

Indicatori de evaluare Punctaj Maxim Punctaj Acordat
Conținut științific
Gradul de noutate/actualitate a tematicii abordate
Citarea surselor bibliografice 40 40
Modul de redactare
Stil clar, concis
Respectarea capitolelor de structură 30 30
Concluziile lucrării
Gradul de originalitate
Complexitatea concluziilor 10 10
Modul de prezentare a figurilor (legende complete,
indicarea sursei bibliografice, unde este cazul, a
măririi și colorației folosite in cazul imaginilor
microscopice) 10 10
Redactarea bibliografiei 10 10
PUNCTAJ TOTAL 100 (nota 10) Punctaj: 100
Notă: 10

Data: 16.06 .2020 Conducător științific
Lector Dr. Pojoga Daniela

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
Facultatea de Biologie
Master de Genetică Aplicată și Biotehnologie

Studiul Reactivității Genomului Uman
la Acțiunea Radiațiilor Ionizante X

Coducător științific:
Lector Dr. Daniela POJOGA
Îndrumător CSIII dr Bicheru Nicoleta Simona

Masterand: [anonimizat]
2020

2
CUPRINS
INTRODUCERE ………………………………………………………… ……………………………………………….. 4
Cap.I RADIAȚIILE IONIZANTE ȘI EFECTUL LOR ASUPRA ORGANISMELOR …….10
I.1 Clasificare Radiațiilor…………………………………………………………. ………………………… ……….. 11
I.2 Efecte celulare ale radiațiilor ionizante…………………………………………………………………….. 19
Cap.II TELOMERE ȘI TELOMERAZĂ ………………………………………………………………………2 3
II.1 Telomere……………………………………………………………………………………………………. ………….2 3
II.2 Telomerază………………………………………………………………………………………. ……………………2 8
II.3 Analiza critică a datelor din literatură cu privire la efectul radiațiilor asupra
telomerelor si telomerazei……………………………………………………………………………………… ……..3 6
Cap.II I METODE DE ANALIZĂ A TELOMERELOR ȘI TELOMERAZEI …………………4 2
III.1 Tehnici citogenetice aplicate pentru analiza efectelor radiațiilor inozante asupra
genomului uman……………………………………………………………………… ……………………………………4 2
III. 1.1 Citogenetică clasică ……………………………………………………………………………….. 42
III. 1.2 Citogenetică moleculară …………………….. ……………………….. ………………………… 44
III.2 . Tehnici moleculare aplicate pentru analiza efectelor radiatiilor ionizante asupra
genomului uman ………………………………………………………………………………………………………… …52
III.2 .1 TRAPeze………………………………………………………………………………… ……………52
Cap. IV MATERIALE ȘI METODE UTILIZATE PENTRU STUDIUL REACTIVITĂȚII
GENOMULUI UMAN LA ACȚIUNEA RADIAȚIILOR IONIZANTE X ………………………5 4
IV. 1. Material biologic…………………………………………………………………………. …………………….. .54
IV.2. Metode de studiu citogenetice………………. ………………………….. ……… ………………………….5 4
IV.2.1 Testul micronucleilor ………………………………………….. ………………. ……………………… 54
IV.2.2 Cultivarea in vitro a limfocitelor din sânge periferic uman pentru evidențierea
cromozomilor dicentrici……………………………….. ………. ……………………………………………… .55
IV.2.3 Evidenție repetițiilor telomerice prin tehnica FISH ………….. …………………………. .57
IV.2.4.Evidențierea genelor care codifică pentru componentele telomerazei prin tehnica
FISH ………………… …………. ……………. …………………………………………………………………………. 58
IV.3. Metode de studiu moleculare…………………………………………………………………………………5 9
V. REZULTATE ȘI DISCUȚII …………………………………………… …………… .……..6 3
V.1 Testul micronucleilor ……………………………………………………………… ……………………………. ..63

3
V.2. Evaluarea nu mărului de cromozomi dicentrici…………………………….. …………………………66
V.3. Evidențierea telomerelor și a telomerazei prin tehnica FISH ………… ……………………. …..68
V.4. Cuantificarea activității telomerazeidin limfocitele umane neiradiate cât și din cele
expunese la radiații ionizante X ………………………………………………………….. …………………………71
V.5 Concluzii……….. …………………………………………………………………………………………… ………….7 4
Bibliografie ………….. ……………. ……………………………………………………………………………… ………..7 5

4

INTRODUCERE

Efectul primar al expunerii la radiații ionizante este producerea de rupturi uni – sau
dublu -catenare în ADN. Leziunile ADN -ului induc declanșarea unor mecanisme celulare de
răspuns la stres care conduc la recunoașterea leziunilor și blocarea ciclului celular. Mecanismele
respective permit repararea leziunilor sau declanșrea apoptozei celulare
Cu toate acestea, ȋn momentul ȋn care are loc o expunere la doze mici de radiații o fracție
diminuată de celule poate să repare ȋntr -un mod greșit rupturile din ADN și dacă aceste modi ficări
ale ADN – ului sunt compatibile cu viabilitatea celulară (aberații neletale), celulele cu aberații
cromozomiale stabile pot persista în populația celulară
(https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc -ramona/focea
-ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf).
Cuantificarea aberațiilor cromozomiale persistente, observate la interval mare de timp
după iradiere, poate fi folosită ca o estimare retrospec tivă a dozei de expunere
(https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/ sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc -ramona/focea
-ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf).
Aberațiile cromozomiale structurale reprezintă indicatori ai unei expuneri anterioare a
sistemului hematopoetic la radiații ionizante, iar cercetările citogenetice au devenit metode de
estimare a dozei absorbite și a efectelor radiobiologice în urma expuneril or ocupaționale sau
terapeutice .
A fost stabilit faptul că, există o corelație între alterările cromozomiale și incidența
cancerului, iar o frecvență ridicată a mo dificărilor submicroscopice la nivel ADN -ului poate fi
utilizată pentru a estima riscul asociat cu expunerea la diverși compuși radioactivi în radioterapie
sau în anumite investigații clinice. Ȋn ultimul timp, s -au dezvoltat metode moleculare de mare
acura tețe bazate pe tehnica microarray, care permit detectarea aberațiilor cromozomiale cu o
rezoluție din ce în ce mai mare
(https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc -ramona/focea
-ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf).
Radiobiologia modernă ȋmpletește metode ale fizicii radiațiilor, biologiei moleculare și
celulare, geneticii, citologiei, histologiei, imunologiei, oncologiei și patologiei. Printre cele mai

5
importante și totodată remarcabile sunt cercetările asupra leziun ilor de la nivelul ADN -ului și
proteinelor, aberațiilor cromozomiale și apoptozei celulare, asupra inducerii mutațiilor, a
modificărilor căilor de semnalizare, a efectelor la nivelul ciclului celular și răspunsului imun,
precum și pentru observarea modific ărilor asupra speranței de viață a organismelor iradiate
(https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc -ramona/focea
-ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf).
Este de asemenea, important să putem distinge între efectele ra diațiilor asupra celulelor
izolate in vitro , (asupra culturilor de celule) – caz în care celulele pot interacționa doar între ele, și
efectele asupra țesuturilor, efectele asupra întregului organism sau efectele asupra unei populații.
De asemenea, este pre zentat și un alt fenomen, mai general, care stă la baza relației neliniare între
doză și efect, și anume acela că la doze mici de radiații sunt activate mecanismele de apărare sau
așa numitul răspuns adaptativ, precum repararea ADN -ului, punctele de contro l de la nivelul
ciclului celular, reacțiile sistemului imun și chiar efecte de evoluție ale populațiilor expu se cronic
la radiații ionizante
(https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc -ramona/focea
-ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf).
Cunoașterea cu exactitate a parametrilor fizici ce caracterizează un fascicul de radiații
ionizante ce urmează a fi folosit în orice domeniu, fie el industrial, medical sau în cercetare, este
esențial pentru controlul și eficientizare a utilizării radiațiilor. Domeniul pentru care sunt realizate
măsurători dozimetrice, au inclus parametrii ce asigură calitatea fasciculelor și a fost verificată
concordanța acestora cu standardele existente ale radioterapiei, întrucât asigurarea calității este
extrem de importantă atât pentru tratamentul pacientului, cât și pentru personalul expus
(https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc -ramona/focea
-ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf).
Scopul tezei de disertaț ie este evidențierea efectelor radiațiilor ionizante X asupra
genomului uman și cu precădere asupra telomerelor și telomerazei, prin cercetări in vitro pe
sisteme model.
Obiective operaționale :
 analiza critică a literaturii de specialitate cu privire radi ațiile ionizante și efectele acestora
supra genomului uman

6
 evidențierea efectelor induse de radiațiile ionizante X asupra genomului uman, prin tehnici
de citogenetică clasică (testul micronucleilor și cuantificarea numărui de cromozomi
dicentrici);
 aplicar ea tehnicii de citogenetică moleculară FISH (fluorescence in situ hybridization)
pentru stabilirea efectului radiațiilor X asupra telomerelor și a genelor care codifică pentru
componentele telomerazei;
 cuantificarea prin intermediul tehnicii TRAPeze a expr esiei telomerazei în prezența sau
absența iradierii.

Lucrarea a fost redactată în 5 capitole.
În partea teoretică (primele 3 capitole) sunt prezentate informații cu privire la tipurile de
radiații ionizante (cu accent pe radiațiile X ce au fost utiliz ate în realizarea etapelor experimentele );
sunt evidențiate rolul și structura telomerelor ș i telomerazei și sunt enunțate și caracterizate pe
scurt principalele tehnici ce pot fi utilizate pentru studiul efectelor radiațiilor X asupra genomului
uman.
Partea de rezultate personale prezintă materialele și metodele utilizate, rezultatele și
discuțiile generate de aplicarea tehnicilor de citogenetică clasică și moleculară precum și
concluziile prezentului studiu.
Lucrarea a fost realizată în cadrul Centrului de Cercetări Științifice Medico -Militare de la
Cernica , în laboratorul de Radiologie experimentală .

7
LISTĂ ABREVIERI:
A = Adenină
ABL = Tyrosine protein kinase
ACM FISH = Multicolor Flourescent In Situ Hybridization Assay
AND = Acid deoxyribonucleic
ADN dc = Acid deoxiribonucleic dublucatenar
AND mc = Acid deoxiribonucleic momocatenar
ARN = Acid ribonucleic
ARN m= Acid ribonucleic mesager
ARN r= Acid ribonucleic ribosomal
Arm FISH = AcroM Fluorescent In Situ Hybridization
BCR = Breakpoint Cluster Region protein
BMN = Micronuclei din celulele bucale
C = Citozină
CEP = Sonde centromerice
Co FISH = Chromosome Orientation Fluorescent In Situ Hybridization
Cy = Cyanine
DAPI = 4’ 6 -diamidino -2-phenylindole d ihydrochloride
DBS = Double strand binding
D FISH = Fusion signal Flourescent In Situ Hybridization
DL 50= Doză limită 50
DMSO = Dimetilsulfoxină
EBR = Eficacitate Biologică Relativă
EMN = Micronuclei din eritrocite mamaliene
FISH = Flourescent In Situ Hibridization
FITC = Flourescent In Isothiocyanate
G = Guanină
Gy = Gray
HFFF2 = Human Fetal Foreskin F ibroblasts
hGAR1 = Hypercholesterolemia pedigree 1
hNHP2 = High noise high plasticity

8
hNOP10 = Nucleolar protein
hTERT = Human Telomerase Reverse Transcriptase
hTERC = Human Telomerase RNA component
hTR = Human Telomerase RNA
LET = Transfer Linear de Ene rgie
LSI = Locus specific
M FISH = Multicolor Flourescent In Situ Hibridization
MN = Micronuclei
NAP57 = Nopp associated protein of 57 kDa
NDI = Nuclear division index
NHEJ = Non -homologus end joining
NOR = Nucleolar Organizer Region
PBS = Phosphate Buffer ed Saline
PCR = Polymerase Chain Reaction
PET = Position Emision Tomography
PNA = Peptide Nucleic Acid
POT = Protector of Telomeres
RAP1 = Repressor/Activator protein 1
ROS = Specii Reactive de Oxigen
RT = Reverstranscriptază
Q FISH = Quantitative Flouresc ent In Situ Hibridization
SCE = Sister Chromatide Exchange
SSB = Single Strand Breaks
SV = Sievert
snoRNP = Small Nucleolar RNP
T = Timină
Tas = Telomer associated sequence
TBS = Tampon Tris Salin
TERC = Telomerase RNA component
TERT = Telomerase Revers Tr anscription factor
TIN 2= Interacting Nucleolar factor 2

9
TPP 1= Shelterin complex subunit and telomerase recruitment factor
TRAPeze = Telomeric repeat amplification protocol
TR = Telomerase RNA
TRF = Telomeric Repeat Binding factor
UV = Ultraviolete
WCP = Wh ole Chromosome paint

10
Cap. I RADIAȚIILE IONIZANTE ȘI EFECTUL LOR ASUPRA ORGANISMELOR

Utilizarea din ce în ce mai frecvent a radioizotopilor a dus la creșterea preocupărilor cu
privire la efectele acestora asupra sistemelor biologice.Toți nucleii emit particule încărca te electric
sau unde electromagnetice. Când radiația ionizantă întâlnește celule vii, poate provoca încălzire,
ruperea legăturilor chimice sau pot ioniza molecule. Dintre toate acestea, cele mai dăunătoare
efecte sunt cele reprezentate de apariția molecule lor ionizate. De exemplu, particulele α și β emise
de radiațiile nucleare descompuse au energii mult mai mari decât energiile legăturilor chimice
obișnuite. În momentul în care aceste particule lovesc și pătrund în materie, ele produc ioni și
fragmente mol eculare, care sunt extrem de reactive. Daunele provocate organismelor vii, constau
în perturbări grave ale proceselor celulare normale, ale mecanismelor de reparare, lucru ce duce la
apariția bolilor sau chiar la moarte
(figur a1)(https://opentextbc.ca/chemistry/chapter/21 -6-biological -effects -of-radiation/ ).

Figura 1 Efectul radiațiilor ionizante asupra sistemelor biologice

La ora actuală, radioterapia reprezi ntă una dintre metodele larg folosite în medicina
modernă. Modernizarea tehnicii radioterapiei a condus la o acumulare de cunoștințe în acest
domeniu (Christodouleas și colab., 2011).

11
Iradierea folosită în scopuri medicale ridică însă probleme extrem de com plexe în ceea ce
privește protecția sistemului imunitar, precum și a celulelor cu evoluție normală din organismul
pacientului (Christodouleas și colab., 2011).
În cazul de față, studiul proceselor de radiosensibilitate și radioprotecție reprezintă o
etapă o bligatorie în elaborarea strategiei de iradiere terapeutică (Christodouleas și colab., 2011).

I.1. CLASIFICAREA RADIAȚIILOR
Radiațiile reprezintă fenomenul fizic de emitere și propagare de unde, ( radiație
ondulatorie) sau de corpusculi, (radiați e corpusculară). Orice radiație necesită un transport
energetic. De regulă radiația se realizează sub forma unui fascicul de raze. Activitatea radioactivă
reprezintă numărul de particule α, β sau γ emise de o sursă radioactivă în timp de o secundă
(https://ro.wikipedia.org/wiki/Radia%C8%9Bie ).
Radiațiile se pot clasifica ȋn două categorii ȋn funcție de energia transportată, în radiații ionizante și
radiații neionizante (figura 2) .

Figura 2. Clasificarea radiațiilor
(https://opentextbc.ca/chemistry/chapter/21 -6-biological -effects -of-radiation/ ).

12
Radiațiile neionizante sunt reprezentate de acea categorie de radiații ce nu prezintă
suficientă energie pentru a declanșa procesul de ionizare a atomilor sau moleculelor unor substanțe
(https://www.cdc.gov/nceh/radiation/nonionizing_rad iation.html ).
Acestea la rȃndul lor se ȋmpart ȋn mai multe subcategorii, cum ar fi: radiațiile ultraviolete
(UV), lumina vizibilă, infraroșiile, microundele, undele radio scurte și lungi. Acestea au lungimea
de undă cuprinsă între 102 nm (radiațiile UV) ș i > 108 nm (undele radio lungi) (figura 2)
(https://www.cdc.gov/nceh/radiation/nonionizing_radiation.html ).
Subcategoria de radiații neionizante cea mai importantă din punct de v edere al efectelor
biologice este reprezentată de radiațiile UV cu lungimea de undă cuprinsă ȋntre 100 -400 nm
acestea fiind ȋncadrate ȋn spectrul solar invizibil. Radiațiile UV sunt clasificate în: UV -A (400 –
320 nm) UV -B (320 – 290 nm), UV -C (< 290 nm)
(https://www.cdc.gov/nceh/radiation/nonionizing_radiation.html ).
Radiațiile UV cu lungimea de undă mai mică de 290 nm posedă efecte mutagene foarte
puternice, această fracție UV f iind absorbită de stratul de ozon circumterestru. Radiațiile cu
lungimea de undă ȋntre 250 – 300 nm sunt absorbite de către bazele azotate din acizii nucleici, ceea
ce generează modificări însemnate la nivelul macromoleculei de ADN (Knowland și colab., 199 4).
Printre primele daune ale radiațiilor UV care au fost cercetate mai frecvent se numără cele
produse la nivel celular. Efectul cel mai comun al iradierii UV este formarea de legături chimice
între două molecule adiacente de timină, aflate pe aceeași cat enă ADN. Din cauza acestui fapt se
formează un dimer de timină, ceea ce face ca punțile de H cu adeninele opuse să fie slăbite sau
chiar anulate. Astfel, apare o regiune distorsionată în dublul helix ADN, care împiedică
funcționarea normală a genei care co nține în structura sa cele două timine adiacente (figura 3). Pe
lȃngă apariția dimerilor de timină mai pot să apară și dimeri timină – citozină, citozină – citozină,
precum și legături încrucișate între pirimidinele de pe catene opuse, care blochează separ area
catenelor, necesară atât în transcriere, cât și în traducere (Goodsell, 2001).

13

Figura 3 Radiatiile UV acționȃnd asupra bazelor azotate (Rajeshwar P. Sinhaa și Donat -P. Häder, 2002)

Radiațiile ionizante ȋncadrează toate acele categorii de radiații care produc reacții
radiochimice. Acestea pot fi de natură electrochimică – radiațiile Röentgen (X) și razele gamma (γ)
sau corpusculare – razele beta (β) , protonii, razele alfa (α) , neutronii, etc. (Kudryashov, 2008).
Radiațiile electromagnetice sunt repr ezentate mai ales de radiațile norului electronic, fiind
caracterizate prin viteza constantă, egală cu cea a luminii – 300000 km/secundă, fiind lipsite de
încărcătura electrică (Kudryashov, 2008; Gavrilă și col ab., 2005 a).
Radiațiile Röentgen (X) au lungi mea de undă cuprinsă ȋntre 0,01 -10 nm fiind de 10000 de
ori mai mică decât cele UV. Datorită lungimii mici a undei și frecvenței mari, razele Röentgen au o
putere de penetrare mult mai mare decât razele UV, după care urmează în spectrul oscilațiilor
electr omagnetice, posedând astfel o capacitate puternică de i onizare (Gavrilă și colab., 2005 a).
Radiațiile reprezintă fenomenele fizice prin care este transmisă energie dintr -o regiune a
spațiului în alta. Cuantele câmpului electromagnetic sunt fotonii, partic ule cu masa de repaus nulă,
fără sarcină electrică și care se propagă cu viteza luminii în vid
(https://ro.wikipedia.org/wiki/Radia%C8%9Bie ).
Radiațiile X și gamma sunt radiații electromagnetice p enetrante, ele fiind cuprinse la limita
superioară a spectrului de energie. Acestea au capacitatea de a produce prin interacție cu atomii
substanței străbătute (iradiate), fenomenul de ionizare. Radiațiile X cu o energie mai mică de 100
keV sunt puternic a bsorbite de substanță, în timp ce radiațiile X dure (energie mai mare de 200
keV) și radiațiile gamma pot să străbată grosimi considerabile din substanță, absorbția în cazul
acestora fiind mult mai mică ( https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray ).

14
Radiațiile ionizante sunt radiații electromagnetice penetrante care produc, prin interacțiune
cu atomii substanței iradiate, fenomenul de ionizare. RadiațiileRoentgen pot fi grupate în radiații
de frânare și ra diații caracteristice. Radiațiile de frȃnare iau naștere din interacția electronilor de
energie mare cu nucleele. Spectrul de energie al radiației de frânare este un spectru continuu, care
cuprinde fotoni de toate energiile până la o limită maximă egală cu energia fotonilor inițiali, în
timp ce radiațiile caracteristice au un spectru compus dintr -un număr finit de energii, tipice
configurației electronice a atomului sursă ( https://ro.wikipedia.org /wiki/Radia%C8%9Bie_X ).
Radiațiile gamma (γ) iau naștere din dezexcitarea nucleelor excitate și au o lungime de
undă cuprinsă ȋntre 0,05 -14 nm, fiind mai penetrante decât razele X și ocupând în spectrul
oscilațiilor electromagnetice extrema minimă a lungi mii de undă și extrema maximă a frecvenței.
Fiecare nuclid are un spectru de linii specific ( https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray ).
La obținerea de radiații gamma de lungă durată contribuie o sursă de Cobalt radioactiv
(Co60). Mărimea dozei de iradiere se stabilește prin calcularea distanței față de sursă și a vitezei de
dezintegrare a acesteia. Datorită capacității mari de ionizare, razele gama sunt folosite pe scară
largă în inducerea de mutații ( https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray ).
Sursele de radiații gamma reprezentate din elemente chimice sau substanțe care prezintă
nuclizi radioactivi. Aceste substanțe pot fi ȋmparțite ȋn substanțe pu r radioactive, fiind formate
doar din specii nucleare radioactive sau pot fi mixte(conțin amestecuri de specii nucleare active și
inactive din punct de vedere al radiațiilor ( https://en.wikipedia.org/w iki/Gamma_ray ).
Ambele radiații , gamma și cele X acționează asupra atomului, având proprietatea de a
dezorganiza sferele de electroni care înconjoară nucleul atomic. Radiațiileelectromagnetice ,
având o energie și o viteză mare, smulg unul sau mai mulți el ectroni de pe orbita exterioară a
atomului, care prin pierderea unui electron se transformă în ion pozitiv. Electronul eliberat nu
rămâne liber, ci se atașează unui alt atom care, primindu -l, devine ion negativ.
Acest proces poartă denumirea de ionizare. Acțiunea biologică asupra materiei vii este
identică pentru radiațiile X și γ (Gavrilă și colab., 2005 a).
Radiațiile corpusculare sunt reprezentate de radiațiile nucleului atomic, precedate de
transmutația obligatorie a nucleului datorită schimbării număr ului de ordine și a masei. Viteza
particulelor nucleare este mult mai mică comparativ cu cea a radiațiilor electromagnetice,
aproximativ 15000 -20000 km/secundă. Ȋncă o diferență fizică este lungimea de undă și energia
de ionizare ( https://en.wikipedia.org/wiki/Ionizing_radiation ).

15
Radiațiile corpusculare se grupează ȋn trei categorii și anume: particule elementare ușoare,
particule grele ȋncărcate electric și particule neutre. Din prima categ orie fac parte electronii și
pozitronii care sunt emiși din substanță ȋn momentul ȋn care asupra lor este exercitată o cantitate
suficientă de energie. Din clasa particulelor grele fac parte protonii, deutronii și alfa -particulele.
Emisia protonilor este realizată după ce au avut lor reacțiile nucleare. Deutronii sunt folosiți ȋn
reacții nucleare, avȃnd rol de particule de bombardare, pe cȃnd particulele alfa sunt emise ȋn urma
dezintegrării alfa nucleelor radioactive. Clasa particulelor neutre este reprez entată de neutroni
(particule lipsite de ȋncărcare electrică), acest lucru conferindu -le o penetrabilitate sporită ȋn toate
nucleele ( https://en.wikipedia.org/wiki/Ionizing_radiation ).
Radiaț iile alfa (α) sau particulele alfa sunt alcătuite din atomi de heliu (2He4). Particulele α
se formează din doi protoni și doi electroni. Importanța genetică a radiațiilor alfa este diminuată
din cauza masei mari și a puterii mici de penetrare, acesta fiind de numai 2 – 9 cm în aer și de 0,02
– 0,06 mm în țesuturile materiei vii (https://en.wikipedia.org/wiki/Alpha_particle).
Neutronii sunt particule neutere, de aici vine și denumirea acestora, care iau naștere din
dezintegrarea nucleelor de uranium și pluto niu. Sunt produși ȋn reactoare speciale ajungându -se
până la fluxuri ce depășesc 1013-1015 neutroni/cm2/s. Raportat la viteza exprimată de energia pe
care o dețin, neutronii se clasifică ȋn patru grupe: rapizi (> 0,5MeV), medii (0,5MeV – 1KeV), lenți
(1KeV – 1eV), termici (< 0,1eV). O deosebire prezentată ȋntre radiațiile electromagnetice și
radiațiile beta, neutronii au o putere de penetrare mare în substanța iradiată, străbătând și plumbul
(https://en.wikipedia.org/wiki/Neutron_radiation ).
Ca un exemplu classic de iradiere profesională și ȋn același timp naturală cu neutron, poate
fi ȋntȃlnit în cazul minerilor care muncesc în minele de uraniu (Hande și colab., 2005).
Cercetarea efectelor radi ațiilor emise de uraniu radioactiv asupra materialului genetic al
minerilor este foarte esențială pentru stabilirea lungimii perioadei de siguranță în care nu sunt
semne ale leziunilor cromozomiale, a perioadei inițiale de mutagenicitate, ca și a perioadei de
instalare ireversibilă a mutațiilor (Hande și colab., 2005).
Radiațiile beta (β) sunt eleminate ȋn decursul timpului din nucleul anumitor atomi instabili
(radioactivi) ȋn două feluri, fie ca particule cu sarcină pozitivă (pozitroni), fie ca particule c u
sarcină negativă (electroni). Pozitronii ȋn general sunt produși de către radioizotopii folosiți ȋn
tomografii – Positron Emission Tomography (PET scan)
(https://en.wikipedia.org/wiki/Beta_decay ).

16
Cel care a descoperit particulele beta a fost Henri Becquerel, ȋn anul 1899 acesta a
demonstrat că particulele beta sunt identice cu electronii (Becquerel, 1899). Radiațiile beta =
electronii accelerați diferă de electronii obișnuiți prin aceea că iau naște re din interiorul nucleului,
în timp ce electronii provin din învelișul atomului (Becquerel, 1899).
În acceleratorul de particule mecanismul de producere a electronilor constă ȋn accelerarea
acestora cu ajutorul componentei electrice a câmpului progresiv d e ultraînaltă frecvență, cu
simetrie axială, generat de un sistem de alimentare cu microunde (2.998MHz), într -o incintă de
accelerare permanent vidată. Electronii captează energia de -a lungul traseului de accelerare. .
Energia medie și energia de vârf a el ectronilor, sunt dependente de valoarea curentului de fascicul
accelerat și au valori uzuale de E m = 6,5MeV, respectiv E max = 9MeV la valori ale curentului de
fascicul de ordinul μA ( https://en.wikipedi a.org/wiki/Electron ).
Pot avea loc aplicații ȋn interiorul incintei de accelerare, electronii ajunși la capătul
traseului de accelerare sunt extrași prin penetrarea unei ferestre de foiță de Al (grosime 0.1 mm),
care asigură și etanșare la vid. În acest m od se dispune de un fascicul de electroni accelerați,
utilizabil în mediul de experiențe, exterior acceleratorului (Swanson, 1979).
Pot fi enumerate cȃteva caracteristici ale particulelor beta: -1, masa de 1/2000 din masa
protonilor sau neutronilor, viteza apropiată de viteza luminii (100000 – 300000 km/s)
(https://en.wikipedia.org/wiki/Radiation#:~:text=p article%20radiation%2C%20such%20as%20al
pha,on%20a%20physical%20transmission%20medium ).
Chiar dacă particulele beta sunt emise de atomi radioactivi, ele însele nu sunt radioactive.
Faptul care provoacă apariția efectelor dăunătoare este energia acestora, energie ce poate
determina ruperea de legături chimice și poate genera ioni
(https://en.wikipedia.org/wiki/Beta_decay ).
Emisiile de particule beta din nucleu au loc atunci cȃnd raportul dintre proton i și neutroni
este prea mare ȋn nucleu. Surplusul de neutroni se modifică ȋntr -un proton și un electron. . Protonul
rămâne în nucleu, iar electronul este eliminat. Acest proces reduce numărul de neutroni cu unu și
crește numărul de protoni cu unu. Ținȃnd c ont de faptul că, gruparea atomilor se realizează în
funcție de numărul protonilor din nucleul unui atom – conversia unui neutron într -un proton duce la
modificarea radionuclidului în alt element
(https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray#:~:text=A%20gamma%20ray%2C%20or%20gamma
,imparts%20the%20highest%20photon%20energy ).

17
De nenumărate ori emisiile de radiații gama ȋnso țesc emisiile de particule beta. Ȋn
momentul ȋn care o particulă beta nu determină eliminarea totală a surplusului de energie din
nucleu, acesta îndepărtează excesul rămas, sub forma unui foton gamma
(https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray#:~:text=A%20gamma%20ray%2C%20or%20gamma
,imparts%20the%20highest%20photon%20energy ).
Există la ora actuală numeroși radionuclizi, atât naturali cât și artificiali: Potasiu – 40,
Carbon – 14, Stronțiu – 90, Cesiu –137, Tritiu, Cobalt -60, Technetiu -99, Iod -129 și 131,
Fosfor -32.
Emițătorii de radiații beta ȋndeplinesc o serie de proprietăți, de regulă ȋn domeniul medical,
precum și ȋ n tratament:
 Iod-131 este utilizat pentru tratarea bolilor tiroidei,
 Fosfor -32 este utilizat în cercetările de genetică,
 Stronțiu -90 este utilizat ca marker radioactiv în studiile medicale și agricole,
 Tritiu este utilizat în biologie și în studiile privin d testarea anumitor substanțe
medicamentoase,
 Carbon -14 este foarte important în datarea materiei organice cu o vechime de până la
30000 ani.
Un risc destul de mare ȋl reprezintă expunerea la radiații beta deoarece radiațiile provenind
din surse puternice pot să provoace înroșiri sau chiar leziuni ale pielii. Alt risc ȋl reprezintă, de
asemenea, inhalarea sau ingestia de particule beta (Ryan, 2012).
Particulele beta eliberate direct la nivelul țesuturilor vii pot să inducă leziuni la nivel
molecular care s ă stopeze funcționarea celulară. Ținȃnd cont de faptul că, sunt mult mai mici ca
dimensiune decât particulele alfa, electronii pătrund de regulă mai adȃc în țesuturi și, ca urmare,
leziunile celulare sunt mai ample (Ryan, 2012).
Radiațiile beta determină e fecte nocive asupra sănătății, atȃt cronice cȃt și acute. Expunerea acută
la radiații este destul de rară și ea poate apărea în urma contactului cu o sursă de radiații beta
puternică. Comparativ cu expunerea acută, cea cronică determină efecte mai commune. Acestea
rezultă ȋn urma expunerii timp îndelungat la doze scăzute de radiații beta. Acestea se dezvoltă
relativ lent (5 – 30 ani) (Ryan, 2012).

18
Efectul cel mai comun care apare ȋn urma expunerii la doze scăzute de radiații beta este
apariția diferitelor forme de cancer, risc ce este mai ridicat odată cu creșterea dozei de expunere
(Ryan, 2012).
Unități de măsură pentru radiații:
Röentgen -ul este cantitatea de radiații capabile să producă 2,08×109 perechi de ioni într -un
centimetru cub de aer uscat la 00C și 760mm Hg ( https://en.wikipedia.org/wiki/Roentgen_(unit) ).
O altă unitate de măsură este rad-ul (radiation absorbed dose ). Unitatea rad evidențiază
energia absorbită efectiv de țesuturi. Doza egală cu 1 rad este evidențiată de cantitatea de radiații
absorbită de un gram de materie vie la impactul acesteia cu radiația
(https://ieer.org/resource/classroom/measuri ng-radiation -terminology/ ).
Studii efectuate ȋn domeniul radiobiologiei au demonstrat că efectul biologic al radiațiilor
nu depinde doar de cantitatea de energie cedată de către acestea și absorbită de către țesuturi. S -a
dovedit că efectul biologic difer ă și în funcție de natura radiațiilor. Modul diferit ȋn care acționează
radiațiile ȋn funcție de natura lor a fost denumită eficacitate biologică relativă (E.B.R.). Ȋn urma
experimentelor efectuate s -a stabilit că radiațiile produse de neutroni sunt de 5 ori mai eficace față
de radiațiile X, cele de protoni de 10 ori, iar cele α de 20 de ori
(https://ieer.org/resource/classroom/measuring -radiation -terminology/ ).
Un alt exe mplu de unitate de măsură este rem-ul. Rem-ul evidențiază doza biologică de
radiații. Calcularea dozei biologice a radiației în rem se face prin înmulțirea E.B.R. cu doza de
radiații ( https://ieer.org/resource/classroom/measuring -radiation -terminology/ ).
Ȋn momentul de față, unitățiile de măsură care sunt folosite pentru radiațiile ionizante sunt
prezentate astfel:
• pentru doza administrată – gray (Gy) (100 rad = 1Gy);
• pentru doza absorbită – sievert (Sv) (100 rad = 1Sv) (Oncescu și Panaitescu, 1992).
Rezistența organismelor la radiații este foarte diferită, având specificitate de specie.
Un exemplu pentru cel mai rezistent organism la radiații este reprezentat de bacteri a
Pseudomonas , acesta a fost observată ca fiind foarte bine dezvoltată în apa în care era imersionat
reactorul nuclear de la Los Alamos, New Mexico, apă în care doza de iradiere atingea valori de
până la 930 Gy (Anellis, 1961). O altă bacterie, Micrococcus radiodurans , este rezistentă la
iradieri mai intense decât cele emise de centurile de radiații ale Pământului (Hansen, 1978).

19
Alga Chlorella rezistă la iradieri cu doze de câteva milioane de razi. Scorpionul are o
rezistență neobișnuită la iradiere, prob abil datorită formei circulare a cromozomilor săi.
Organismele pigmentate ( Aspergillus niger ) sunt mai rezistente la iradiere decât cele nepigmentate
(A. nidulans). Ȋn domeniul iradierii este utilizat parametrul DL 50 (doza limită 50), acesta
reprezentȃnd d oza a care jumătate din organismele supuse iradierii mor, iar la cealaltă jumătate de
supraviețuitori apare un procent maxim de mutații (t abel 1) (Gavrilă și colab., 2005 a).

Tabel nr. 1 DL50 la diferite or ganisme (Gavrilă și colab., 2005 a)
Plante Animal e
Brad: 6 -9 Gy Câine: 3,25 Gy
Cânepă: 70 Gy Om: 4,50 Gy
Fasole: 80 Gy Soarece: 5,30 Gy
Secară: 100 -150 Gy Sobolan: 8,50 Gy
Napi: 300 Gy Broască țestoasă: 10 Gy
Tomate: 400 Gy Salamandră: 30 Gy
In: 500 Gy Drosofilă: 46 Gy
Parameci: 350 G y

I.2. EFECTE CELULARE ALE RADIAȚIILOR IONIZANTE
Datele experimentale au arătat că radiațiile ionizante generează mutații la toți reprezentanții
lumii vegetale și animale, la toate bacteriile și virusurile (Little, 1968).
Acțiunea toxică a radiațiilor asupra organismului este datorată interacțiunii dintre radiații și
acizii nucleici (Little, 1968).
S-a dovedit faptul că, sinteza ADN este mai radiosensibilă comparativ cu sinteza ARN și a
proteinelor, iar la nivelul moleculei de ADN -ul purinele s -au dove dit a fi de 2 ori mai puțin
sensibile decât pirimidinele (Little, 1970).
După ce s -a produs iradierea, au loc modificări complexe, care pot merge până la distrugerea
totală a funcțiilor celulare (Little, 1970).

20
Nici o celulă vie nu este ȋn ȋntregime rezis tentă la acțiunea radiațiilor ionizante și, în prezent,
a fost subliniat faptul că modificările produse de iradiere, sunt mai frecvente și mai bine exprimate
în cazul celulelor iradiate în tipul diviziunii sau la scurt timp după aceasta (Bernhard și colab. ,
1995, Gadbois și colab., 1996).
Efectele cele mai dăunătoare iau naștere ȋn urma urma administrării de radiații ionizante pe
parcursul diviziunii mitotice în etapele de profază și, respectiv, metafază. O doză crescută de
radiații administrate unei celule în profaza diviziunii mitotice induce oprirea asamblării fusului de
diviziune, aglomerarea cromozomilor și alipirea cromatidelor surori. Deasemenea, separarea
cromatidelor la trecerea de la metafază la anafază este întârziată (Little, 1970).
Iradierea în cursul metafazei poate distruge fusul de diviziune, celulele putând intra într -o
falsă anafază, în care are loc migrarea la poli a cromozomilor întregi, neclivați, aceștia fiind
repartizați randomic la nivelul celulelor fiice. Ȋn urma acestui proces apar a stfel celule fiice
aneuploide, cu un număr de cromozomi diferit de cel al celulei mamă (Little,1970).
Dacă modificarea apărută nu pune ȋn pericol viața celulei, atunci ea se reproduce și se
transmite, inducând mutații cromozomiale ce pot fi structurale sau numerice(Little, 1970).
Restructurările cromozomiale (figura 4) se pot grupa ȋn:
Micronucleii ce reprezintă nuclei mici, adiționali, iau naștere prin excluderea unor fragmente
acentrice de cromozomi sau chiar a unor cromozomi întregi în timpul diviziunii, ca urmare a
alterării structural -funcționale a centromerilor.
Deleții interstițiale sau terminale care reprezintă deletarea(pierderea) unui fragment din
interiorul cromozomului sau de la capătul acestuia, cu formarea de fragmente acentrice.
Inversii para și pericentrice ce sunt evidențiate prin desprinderea unui fragment para sau
pericentric și repunerea acestuia la cromozomul inițial, dar nu în poziția inițială ci inversat.
Translocații ce reprezintă translocarea unui fragment dintr -un cromozom pe altul o molog
sau neomolog.
Cromozomii dicentrici rezultată ȋn urma fuziunii telomerelor cu distrucții aparținând
cromozomilor omologi sau neomologi.
Cromozomii inelari apar atunci cȃnd fuzionează telomerele cu distrucții, aparținând
aceluiași cromozom.
Duplicați i care sunt reprezentate prin dublarea unor segmente de cromozomi prin atașarea
fragmentelor desprinse de la cromozomul pereche.

21
Interschimburi care sunt translocații telomeră -la-telomeră și sinapse somatice ale
cromatidelor cromozomilor omologi sau neomol ogi.
Double minutes ce sunt rezultate în urma amplificării genice în condiții a normale (Gavrilă și
colab., 2005 a).

Figura 4 Tipuri de rearanjări cromozomiale
(https://www.creeaza.com/referate/STRUCTURA -MOLECULARA -A-CROMOZO723.php ).

Markerii citogenetici care au fost folosiți pentru prima dată ca indicatori ai efectului
cancerigen și mutagen al radiațiilor ionizante au fost aberațiile cromozomiale, iar mai apoi au
apărut și alte tehnici mai puțin laborioase și anume: frecvența SCE -urilor (Sister Chromatide
Exchange) și testul micronucleilor. O frecvență mare de SCE -uri este considerată un semn al
alterării mediului celular, prin acțiunea unor agenți nocivi, inclusiv radiații ionizante, iar rata cu
care apar micronucleii reprezintă un indiciu indirect al rupturilor cromozomiale (Thierens și
colab., 2000; Littlefield și colab., 1979).
Este considerat faptul că, apariția cromozomilor dicentrici reprezintă un in dicator valid al
expunerii limfocitelor umane la iradiere, aceștia fiind ușor de urmărit, deoarece frecvența lor
balansate reciproc
fuziune ce ntrică
Robertsoniană
pierdut
Deleții
Izocromozomi
Translocații
Inversii
paracentrice
pericentrice
Fragmente
Fragmente
Cromozom inelar

22
spontană este foarte mică (1/4000 metafaze) și crește foarte mult în cazul iradierii experimentale
(Evans, 1962).
Mutațiile ce apar prin iradie ri succesive cu doze mici au o frecvență care poate fi echivalentă
cu aceea rezultată dintr -o iradiere singulară, cu adunarea dozelor parțiale, ceea ce a reprezentat o
concluzie deosebit de importantă pentru practica medicală, unde iradierea este utilizată în scop
terapeutic (radioterapie) sau de diagnosticare (Evans, 1962).
Studiile efectuate in vitro au subliniat existența unei relații de proporționalitate directă între
doza de radiații și efectele sale asupra cromozomilor, manifestată prin incidența abe rațiilor
cromozomiale. Aceasta este menținută de obicei, și în cazul iradierii in vivo , cu deosebirea că în
acest caz numărul aberațiilor cromozomiale scade progresiv, odată cu trecerea timpului. Pe de altă
parte, ȋn cazul iradierii in vivo o parte din rup turi sunt reparate (restituite), în timp ce altele conduc
la moartea rapidă și eliminarea celulelor purtătoare (Evans, 1962).
Apariția leziunilor celulare datorită radiațiilor poate provoca, în anumite condiții, procesele
celulare de refacere. Această refa cere nu ȋnseamnă neapărat revenirea completă la condițiile
existente înainte de iradiere, ȋntrucȃt există un efect radiobiologic rezidual, iar procesele celulare
normale pot fi modificate de mecanismele de refacere (Evans, 1962).
Excepția acestui proces o reprezintă celulele din seria limfocitară și ovocitele la care moartea
celulară poate apărea în timpul interfazei, ȋn timp ce celelalte celule nu mor imediat după iradiere,
ci atunci cȃnd ajung în mitoză (moarte mitotică). Sunt considerate moarte și celule le care și -au
pierdut, în urma iradierii, capacitatea proliferativă, fiind incapabile de diviziune (Gadbois și
colab., 1996).

23
Cap. II TELOMERE ȘI TELOMERAZĂ

Obiectivul principal al lucrării de dizertație a constat ȋn evidențierea consecințelor acțiunii
radiațiilor ionizante asupra genomului uman, punȃndu -se accent pe efectele la nivelul telomerelor
și a genelor care codifică enzima implicată în sinteza lor, respectiv telomeraza. Așadar, pentru
realizarea acestora este esențială prezentarea unor elemente n ecesare privind structura și funcțiile
telomerelor, precum și actualizarea informațiilor legate de telomerază (subunități, proteine
asociate, funcționalitate).

II. 1. TELOMERELE
Telomerele (de la cuvântul grecesc „telos” = capăt și „meros” = parte) au fos t descrise ȋn
jurul anilor 1940 de către Hermann J. Muller și Barbara McClintock care le -au prezentat ca fiind
o structură protectoare, situată la capătul cromozomului eucariot (Muller, 1938; McClintock,
1941).
Muller a observat telomerele cu ajutorul exp erimentelor de iradiere, care au condus la
multiple tipuri de aberații cromozomiale datorate rupturilor terminale induse de radiații. Diferența
de stabilitate observată între cromozomii intacți și cei cu capete rupte a fost cea care a sugerat
existența la nivel terminal a unei structuri înalt specializate, cu rol de protecție, pe care a denumit -o
telomeră (Muller și Herskowitz, 1954).
Ȋn timp au fost folosite numeroase tehnici ș metode de observare a terminațiilor
cromozomiale. Printre primele metode se num ără metoda Vosa, care utilizează colorația Giemsa și
permite observarea heterocromatinei asociate telomerelor sub forma benzilor T (Vosa, 1975). Ȋn
momentul de față, cea mai folosită este tehnica FISH, aceasta utilizează sonde ADN
complementare cu secvenț ele telomerice, marcate cu fluorocromi (Vosa, 1975).
Telomerele sunt reprezentate de secvențe repetitive hexanucleotidice conservate, acestea
fiind bogate ȋn G și T (T sau A) m(G) n, asociate cu proteine non -histonice. Raportȃndu -se la capătul
cromozomial ca tena ADN telomeric bogată în G, este orientată de la 5’ la 3’, capătul său 3’
depășind cu 12 -16 nucleotide catena complementară, bogată în C. Datorită asimetriei moleculare,
ADN -ul telomeric poate fi separat prin ultracentrifugare izopicnică ca ADN satelit (Blackburn,
1991; Makarov și colab., 1997) (figura 5).

24

Figura 5 Structura ADN -ului telomeric (Philip C. Haycock et al. Association Between Telomere Length and Risk of
Cancer and Non -Neoplastic Diseases, JAMA Oncology, 2017).

Stabilitatea telomeric ă este dată practic de numărul de repetiții telomerice, ce variază de la
câteva sute de perechi de nucleotide (drojdii și ciliate), la mii de perechi de nucleotide la
vertebrate. La majoritatea vertebratelor care au fost analizate, domeniul repetițiilor te lomerice este
de 2 -20 kpb, cu100 kpb, la șoarece. Structura telomerică redundantă este cea care permite
pierderea unei părți din aceasta până la un anumit nivel, fără a fi alterată funcția de bază. Dacă acel
nivel este depășit, atunci are loc perturbarea f uncției telomerelor și, implicit, integritatea
structurală și funcțională a cromozomului eucariot (https://en.wikipedia.org/wiki/Telomere).
Numeroase cercetări elaborate pȃnă ȋn momentul de față au determinat faptul că, secvența
de ADN telomeric este asemă nătoare la majoritatea speciilor de eucariote analizate, indiferent de
locul ocupat de acestea pe scara filogenetică (Blackburn și Szostak, 1984; Blackburn, 1991;
Zakian, 1996; Greider și Blackburn, 1987; Vermeesch și Price, 1994) (tabel 2).
Cercetările au demonstrat existența unui nivel ridicat de variație a numărului de repetiții
telomerice atât de la o specie la alta, cât și între indivizii aceleiași specii și chiar între cromozomi
diferiți ai aceluiași complement cromozomial. Astfel de variații intraspe cifice au fost observate

25
prin tehnicile FISH și Flow FISH atât la om, cât și la șoarece (Zijlmans și colab., 1997; Rufer și
colab., 1998).

Tabel nr. 2 Secvența repetiției telomerice la diferite grupe de organisme
(Telomerase Database -http://telomerase.asu.edu/sequences_telomere.html)

26

Asociat secvenței telomerice sunt dispuse secvențele Tas (telomere -associated
sequence) , acestea se deosebesc de repetiția telomerică înalt conservată, prin prezența unei mari
diversități în ceea ce privește succesiunea de nucleotide, lungimea și complexitatea lor la
speciilor studiate. Secvențe Tas nu sunt ȋnsă esențiale pentru funcționarea telomerelor (Brown și
colab., 1990).
La nivelul nucleului, ADN -ul telomeric este complexat cu proteine structurale, care
formează complexul shelterin . Complexul conferă protecție capetelor cromozomilor față de
repararea necorespunzătoare a ADN -ului atunci când telomerele nu sunt alungite și ajută la
alungirea telomerelor sub acțiunea telomerazei (https://en.wikipedia.org/wiki/Telomere).
Acest complex la mamifere este format din 6 proteine:
 TRF1 și TRF2 (TRF=Telomeric Repeat binding Factor) împiedică telomeraza să
alungească telomerele în condiții normale și răspunsul la D BS (Double Strand Break).
Atunci cȃnd repararea telomerelor este esențială, TRF -urile recrutează proteinele cu rol în
reparare pentru a facilita procesul. Cu toate că, se atașează independent la ADN, TRF -urile
acționează coordonat (Sfeir și colab., 2012; D iotti și Loayza, 2011).
 TIN2 (TIN2=TRF1 Interacting Nuclear factor 2) face legătura ȋntre TRF1 cu TRF2 și le
conectează pe ambele la POT1. TIN2 facilitează recrutarea la nivel telomeric a proteinelor
de legare la monocatene (Nandakumar și Cech, 2013; Kibe și colab., 2010).
 POT1 (POT1=Protector of Telomeres 1) se așează la nivelul capătului monocatenar 3' și
previne recunoașterea telomerelor ca DBS. În genomul uman există o singură genă POT1,
în timp ce șoarecii au 2 gene: POT1a și POT1b(Blasco și Martínez, 2010).
 RAP1 (RAP1=Repressor/Activator Protein 1) se lipesc de TRF2 și îi facilitează funcția,
protejează capetele cromozomale de repararea prin calea NHEJ (Non -homologous end
joining) (Martínez și Blasco, 2010). O deosebire față de celelalte proteine ale c omplexului
este aceea că, RAP1 are și funcții independente de cea din complexul shelterin și anume:
reglează transcripția și intervine în calea de semnalizare NF -κB (Sfeir și colab., 2012).
 TPP1 (TPP1= ACD shelterin complex subunit and telomerase recruitmen t factor ) este o
proteină cu rol organizator, care interacționează cu POT1 și reglează funcționarea acesteia

27
(O'Connor și colab., 2006; Kibe și colab., 2010). TPP1 este un factor necesar în recrutarea
telomerazei (Abreu și colab., 2010).
Datorită utilizăr ii tehnicilor de microscopie electronică a fost obsevat faptul că, capătul 3'
invadează șirul format din duplexul de ADN repetitiv telomeric, rezultȃnd in vitro o buclă D și o
buclă T cu rol în stabilizarea ADN -ului, la realizarea respectivei structuri par ticipând numeroase
alte proteine asociate (figura 6).

Figura 6 Formarea buclelor T și D și proteinele asociate acestora (modificat după: Neumann șiReddel, 2002)

Rolul repetiției telomerice, precum și al enzimelor implicate în menținerea integrității
structurale cromozomiale a fost elucidat atunci cȃnd s -a pus problema terminalizării replicării
(https://en.wikipedia.org/wiki/Telomere).
Replicarea capetelor cromozomului reprezintă o problemă aparte pentru celule. ADN -ul se
pierde treptat din capetele crom ozomilor, ȋn momentul ȋn care celula se divide, deoarece ADN
polimeraza convențională nu poate replica în totalitate capătul 3' al catenei lagging dintr -o
moleculă liniară (problema terminalizării replicării) (Vega și colab., 2003) (figura 6).
Mecanismul t erminalizării replicării cromozomului eucariot implică intervenția unei
enzime speciale, descoperită de către Elizabeth H. Blackburn și colaboratorii, în anul 1984, la
ciliatul Tetrahymena thermophila și denumită telomerază. Ulterior, ea a fost identific ată și la alte
specii, inclusiv la specia umană (Blackburn și Szostak, 1984).

28

Figura. 7 Scurtarea telomerelor în urma replicării(modificat după: Vega și colab., 2003)

II. 2. TELOMERAZA
Telomeraza a fost descoperită ȋn anul 1984, fiind obse rvată în formă activă în numeroase
celule canceroase și în celulele imortalizate in vitro , în timp ce în majoritatea celulelor somatice
normale la om nu se exprimă. Așadar, activarea telomerazei este implicată în imortalizarea
celulelor neoplazice, iar rep rimarea ei permite scurtarea consecutivă a telomerelor
(https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase).
Telomeraza aparține clasei ribonucleoproteinelor și este o polimerază ARN dependentă de
ADN, care extinde telomerele cromozomilor la eucariote (Greider și Bl ackburn, 1985). Enzima se
compune din două componente primordiale: prima este componenta ARN funcțională
(TR/TERC), care servește drept matriță pentru sinteza de ADN telomeric (Kilian și colab., 1997;
Lingner și colab., 1997).
Cea de -a doua componentă este o proteină catalitică (TERT), cu activitate de
revers -transcriptază (figura 7) (Kilian și colab., 1997; Lingner și colab., 1997).
Componenta TR este bine exprimată în toate țesuturile, indiferent de activitatea
telomerazei; dar celulele canceroase prezintă TR în cantități mult mai mari.

29
Expresia componentei catalitice, este aproximată ca fiind mai mică decât 1 -5 copii/celulă
fapt ce este strict corelat cu activitatea telomerazei în celule. TERT este, în general, represată în
celulele normale și supraexprima tă în celulele imortalizate, sugerând că TERT este esențială în
realizarea activității telomerazei (Yi și colab., 1999).
Rolul său în finalizarea replicării cromozomului la eucariote se bazează pe capacitatea
componentei ARN de a recunoaște și se atașează la capătul 3’ al catenei ADN telomeric.
Telomeraza are activitate discontinuă. Ea se asociază cu catena bogată în G și adaugă la aceasta
15-22 de nucleotide complementare cu matrița ARN, iar apoi suferă o translocare la capătul 3’ al
ultimului nucleotid at așat catenei bogate în G, reluând adăugarea de deoxiribonucleotide prin care
se realizează alungirea ș.a.m.d. Enzima prelungește doar catena bogată în G a ADN -ului telomeric
(figura 8). Sinteza catenei complementare, bogată în C+A, este asigurată printr -un mecanism de
sinteză discontinuă, mediat de primază -polimerază, tipic pentru sinteza semiconservativă
(https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase ).

Figura 8 Extinderea telomerelor cromozomilor la eu cariote sub acțiunea telomerazei (modificat după
http://www.uke.de/kliniken/medizinische -klinik -1/index_43074.php )

30
Subunitatea ARN (TR/TERC) a telomerazei
Matrița pentru sin teza repetițiilor telomerice este conferită de componenta ARN (TR/TERC)
a telomerazei
(https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase_RNA_component#:~:text=Telomerase%20RNA
%20component%2C%20also%20known,(reverse%20transcription)%20by%20telomerase ).
Subunitatea ARN a telomerazei umane (hTR/hTERC) are o lungime de 445 nucleotide, cu o
secvență de 11 nucleotide (59 -CUAACCCUAAC -39) codificatoare pentru repetițiile
telomerice(TTAGGG) n.
(https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase_RNA_component#:~:text=Telomerase%20RNA%20c
omponent%2C%20also%20known,(reverse%20transcription)%20by%20telomerase ).
Gena hTR/hTERC este poziționată pe cromozomul 3, pe brațul lung al acestuia (figura 9),
este transcrisă de ARN polimeraza II, iar transcriptul primar este prelucrat la capătul 3' pentru a
produce un transcript matur de 451 nucleotide
(https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase_RNA_component#:~:text=Telomerase%20RNA%20c
omponent%2C%20also%20known,(reverse%20transcription)%20by%20telomerase) .

Figura 9 Localizarea genei hTR (mod ificat după: Abreu E , 2011)

31
În structura primară a TR/TERC au fost observate 10 regiuni ARN universal conservate
precum și alte regiuni ce alte rnează semnificativ atât ca lungime cât și ca secvență între diferite
clase de vertebrate. Această organizare a sugerat faptul că regiunea înalt conservată este cea cu rol
esențial în realizarea funcției telomerazei (Chen și colab., 2000).
Gena care codifi că pentru subunitatea ARN a telomerazei la șoarece (mTR/mTERC) este prezentă
unicat pe cromozomul 3, asemănător celei umane (figura 10). Gena mTERC/mTR are o lungime
de 397 bp (de la nucleotida 96414437 la 96414833) ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/21748 )

Figura 10 Localizarea TERC (modificatdupă: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/21748 )

Ȋnlăturarea subunităților ARN duce la inhibarea telomeraz ei, degradarea telomerelor,
compromiterea capacitații de creștere a unor celule cu ritm accelerat de proliferare, precum
celulele embrionare și hematopoetice la șoarece, moartea celulelor de cultură HeLa și a celor
maligne umane (Kilian și colab., 1997).

Subunitatea catalitică (TERT) a telomerazei
În celulele diploide umane, gena hTERT este prezentă în copie unică la nivelul benzii
cromozomiale 5p15.33 (figura 11), cea mai distală bandă de pe brațul scurt al cromozomului 5.
Această genă este alcătuită din 16 exoni și 15 introni și are peste 40 kb (Bryce și colab., 2000).
Gena care este responsabilă de codificarea subunității catalitice a telomerazei la șoarece
(mTERT) este prezentă în copie unică pe cromozomul 13 (figura 11). Gena are o lungime de
23080 bp (73626764….73649843) și este alcătuită din 18 exoni și 17 introni
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/21752 ).

32

Figura 11 Organizarea genei hTERT. Gena hTERT conține 16 exoni și 15 introni localiza ți pe brațul scurt al
cromozomului 5 (5p15.33), la o distanță de aproximativ 2Mb de telomere și este transcrisă către centromer. În
proteină sunt evidențiate: domeniul specific telomerazei (domeniul T), domeniul de revers -transcripție (domeniul RT)
și reg iunea C -terminală. (modificat după: Cong și colab., 2002).

Mai multe cercetări au demostrat faptul că, la șoarece, independent de activitatea de
alungire a terminațiilor cromozomiale și de reglare a procesului apoptotic, mTERT mai
îndeplinește, în creier ul acestor animale, o serie de alte roluri esențiale pentru funcționarea
normală a acestuia, fiind bine exprimată în bulbii olfactivi și interacționând direct cu receptorii
olfactivi (Lee și colab., 2010).
Gena hTERT suferă splicing alternativ. Nu este cu noscut pe deplin rolul splicing -ului
alternativ ȋn acest caz, ȋnsă s -a determinat că celulele tumorale, liniile celulare, chiar și țesuturile
umane normale (criptele din colon sau cele de la nivel testicular) conțin diferențe considerabile
privind pattern -ul de splicing. Rezultatele acestea evidențiază faptul că splicing -ul nu este
întâmplător și că, aceste transcripte pot avea un anumit rol fiziologic în celulă (Kilian și colab.,
1997).
Splicing -ul alternativ al hTERT este prezentat ca o reglare adițională a expresiei TERT și a
activității telomerazei (Kilian și colab., 1997) (figura 12).
Subunitatea catalitică de la diferite organisme este conservată filogenetic (Nakamura și
colab., 1997) și prezintă numeroase caracteristici specifice, cum ar fi faptul că, toate motivele
pentru revers -transcriere sunt localizate în jumătatea C -terminală a proteinei; regiunea specifică

33
telomerazei, conservată în evoluție, numită motivul T, este localizată N -terminal față de motivele
de revers -transcriere; regiunea N -terminal ă de dimensiuni mari conține domenii cu importanță
funcțională înalt conservate (Moriarty și colab., 2002; Xia și colab., 2000; Friedman și Cech,
1999).

Figura 12 Variante ale spilcing -ului alternativ în cazul genei hTERT: comparativ cu tip ul sălbatic, varianta alpha
este reprezentată de deleția primelor 36 nucleotide din exon 6, varianta beta, de deleția integrală a exonilor 6 și 7 și
varianta DEL[e2], de

Elongarea telomerelor datorită telomerazei, poate să fie implicată ȋntr -un proces des fășurat
în mai multe etape, reglat cu exactitate, și care săcuprindă maturarea, procesarea și acumularea
TERT, asamblarea ribonucleoproteinelor, recunoașterea substratului și sinteza coordonată a
catenei C. Proteinele asociate telomerazei, implicate în toa te aceste procese, ar putea juca un rol
benefic pentru ca enzima să funcționeze la capacitate maximă (Aisner și colab., 2002).

Proteinele asociate telomerazei
Dovezi solide au atestat faptul că, activitatea telomerazei este, de asemenea, dirijată de
mecan isme post -transcripționale. După translație, reunirea, păstrarea sau dizolvarea holoenzimei
funcționale și active presupune interacțiuni cu alte proteine. Luȃnd ȋn considerare faptul că,
telomeraza este foarte lent metabolizată, și are durată de viață mai mare de 24 de ore, activitatea
ORF
1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 16
1 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16ORFTipuri ARNm hTERT
Tipul sălbatic; Varianta alpha, Varianta beta; DEL(e2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ORF
4022 nts
ORF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
ORF
1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 16ORFORF
1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 16
1 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16ORF
1 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16ORF
1 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16ORFTipuri ARNm hTERT
Tipul sălbatic; Varianta alpha, Varianta beta; DEL(e2)Tipuri ARNm hTERT
Tipul sălbatic; Varianta alpha, Varianta beta; DEL(e2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ORF
4022 nts
ORF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 161 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ORF
4022 nts 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ORFORF
4022 nts
ORF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16ORF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16ORFORF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

34
acesteia poate fi periclitată de modulațiile apărute în urma modificării holoenzimei prin
interacțiuni proteice(Lewis and Wuttke, 2012).

Proteine asociate cu TERT
TEP1 (proteina 1 asociată telomerazei), care are efect asupra integrității particulei și a
ARN -ului asociat, vs ARN (Liu și colab., 2000) (este responsabilă de activitatea telomerazei care
catalizează adăugarea de noi telomere la capetele cromozomului), a fost identificată la om, șoareci
și șobolani. TEP1 este expri mată în majoritatea țesuturilor, indiferent de activitatea telomerazei
(Nakayama și colab., 1997).
Chiar dacă este asociată atât cu componenta ARN, cât și cu cea catalitică a telomerazei,
(TEP1 funcționând ca subunitate reglatoare a telomerazei și servind ca potențial eșafodaj pentru
recrutarea și organizarea hTR, hTERT și a substraturilor telomerice), în extractele celulare
provenite din celule imortalizate de om, șoarece sau șobolan, distrugerea TEP1 nu a afectat
activitatea telomerazei sau lungimea telom erelor (Nakayama și colab., 1997).
TRF1 este descris ca un factor reglator telomerazic. Supraexpresia TRF1 de lungă durată
în celulele canceroase telomerazic -pozitive induce o scurtare telomerică treptată și consecutivă.
Subunitatea hTERT rămâne corelată c u subunitatea ARN matriță. hTERT recunoaște și alungește
telomerele prin asociere cu regiunea matriță din hTR și ulterior, prin translocare la următoarea
poziție disponibilă, pentru legare în hTR. Etapa translocării poate necesita o ajustare a
conformației telomerazei active asamblată, proces mediat prin asocierea stabilă cu proteinele
hsp90 și p23 (figura 13) (Holt și colab., 1999).

Proteine asociate cu TR
Domeniile conservate din molecula TR sunt presupuse ca fiind situsuri de recunoaștere
pentru protein ele care se leagă la TR. Ȋn paralel cu analizele structurale, au fost identificate mai
multe proteine care se leagă la ARN și interacționează cu TR. Aceste proteine se numără printre
componentele unui complex de ribonucleoproteine mici și ale unui complex de proteine nucleare
heterogene, implicate în stabilizarea ARN, procesarea pre -ARN, maturarea și localizarea sa
(https://www.intechopen.com/books/telomere -a-complex -end-of-a-chromosome/the -role-of-telo
meres -and-telomere -associated -proteins -as-components -of-interactome -in-cell-signalin ).

35
Toate cele patru proteine de legare a H/ACA snoARN (hGAR1, diskerina/NAP57,
hNOP10, și hNHP2 ) sunt întâlnite în corelare cu hTR și telomeraza umană (figura 13). Acestea
sugerează faptul că hTR este asociată cu complexele ribonucleoproteice nucleolare mici
(snoRNP), sprijinind afirmația că snoRNP sunt impli cate în stabilizarea, acumularea, maturarea și
localizarea hTR
(https://www.intechopen.com/books/telomere -a-complex -end-of-a-chromosome/the -role-
of-telomeres -and-telomere -associated -proteins -as-components -of-interactome -in-cell-signalin ).

Figura 13 Reprezentarea schematică a complexului telomerază – proteine asocia te implicate în semnalizarea
celulară și repararea telomerelor (mdificat după: Keith șicolab., 2002 )

Reglarea activității telomerazei
Reglarea activități telomerazei poate fi desfășurată pe mai multe niveluri și anume:
transcripție, splicingul ARNm, matu rare, transport, localizare subcelulară a fiecărui component,
asamblarea ribonucleoproteinei telomerazice active, accesibilitatea și acțiunea telomerazei asupra
telomerelor. Multiple cercetări au demonstrat că activitatea telomerazei este modulată în condi ții
fiziologice particulare în timpul dezvoltării țesutului și în timpul menținerii homeostaziei.
Activitatea telomerazei este subiectul reglării prin diferențiere și prin semnale extracelulare
(radiații UV) și intracelulare (alfa interferon, estrogen) (Co ng și colab., 2002).

36
Printre componentele miezului telomerazei, doar componenta catalitică TERT pare a fi
determinantul limitativ al activității telomerazei, în timp ce alte componente au o expresie
ubiquitară. De regulă, ȋn numeroase cazuri expresia TERT este asociată cu activitatea telomerazei
și cu inițierea și progresia cancerelor. Aceasta este supresată la nivelul transcrierii într -o mulțime
de celule normale și este reactivată și suprareglată în timpul procesului de imortalizare. Datele
experimentale demonstrează că reglarea transcrierii TERT reprezintă prima etapă și în același timp
etapa esențială pentru expresia activității telomerazice în majoritatea celulelor (Takakura și colab.,
1999).

II. 3. ANALIZA CRITICĂ A DATELOR DIN LITERATURĂ CU PRIVIRE L A
EFECTUL RADIAȚIILOR ASUPRA TELOMERELOR ȘI TELOMERAZEI

Au fost elaborate mai multe cercetări pentru a evalua efectul radiațiilor ionizante asupra
organismelor, acestea generȃnd, pȃna ȋn prezent, date care se contrazic evidențiind complexitatea
relaților dintre radiațiile ionizante, radiosensibilitate, lungimea telomerelor și activitatea
telomerazei.
Datorită faptului că telomerele reprezintă o mică parte din genomul eucariotelor (de ex.
0.02% din genomul uman) probabilitatea ca radiațiile să traverseze d irect secvența telomerică este
redusă. Astfel, o parte foarte mare a efectului radiațiilor ionizante asupra telomerelor este datorat
perturbărilor mecanismelor de menținere a integrității telomerelor post iradiere , perturbări care
pot să aibă continuitate și în descendența celulelor direct iradiate (Baird, 2018).
Așadar, lungimea telomerelor reprezintă unul dintre biomarkerii pentru
radiosensibilitate , acesta fiind cercetat ȋn prezent (Genesca și colab., 2006).
Lungimea telomerelor este variabilă, iar aces t fapt a fost demonstrat experimental și
anume, lungimea acestora influențȃd răspunsul organismelor la acțiunea radiațiilor: persoanele cu
telomere scurte prezintă o frecvență mai mare a micronucleilor induși sub acțiunea radiațiilor
ionizante comparativ c u persoanele cu telomere mai lungi (Castella și colab., 2007). Multiple
cercetări care au fost efectuate atât in vivo cât și in vitro au arătat faptul că, , lungimea telomerelor
a fost corelată experimental, în celulele umane și murine care au deficit de t elomerază, cu
radiosensibilitatea (Bouffler și colab., 2001). Cercetările acestea au demonstrat existența unei
relații de inversă proporționalitate între sensibilitatea la radiații și lungimea telomerelor și că, deși

37
scurtarea telomerelor sporește radiosen sibilitatea, telomerele lungi nu fac obligatoriu celulele
radiorezistente (Rubio și colab., 2002).
Alte experimente au afirmat că, radiosensibilitatea la radiații ionizante poate fi asociată cu
pierderea telomerelor indiferent de lungimea acestora, fără a fi modificate nivelele de expresie
ale genelor pentru telomerază (Berardinelli și colab., 2012). Creșterea radiosensibilității în celulele
cu telomere scurte ce posedă telomerază inactivă poate fi datorată fuziunilor cromozomiale care au
loc între telomer ele scurte și DSBs induse de radiațiile ionizante. Fuziunile acestea interferă cu
repararea DSB și induc apariția de rearanjamente cromozomiale (Latre și colab., 2003; Soler și
colab., 2009).
Complexul de proteine shelterin este direct implicat în menținer ea integrității telomerice,
iar datorită acestui fapt, una dintre modalitățile prin care se presupune că sunt induse modificările
lungimii telomerelor poate fi reprezentată de schimbările induse de radiațiile ionizante la nivelul
acestor proteine. Studiul condus de Li, în anul 2012, a afirmat că iradierea in vitro a celulelor
umane normale, cu doze folosite în practica clinică, a indus o scădere semnificativă a TPP1 și
POT1, o ușoară scădere a TRF1 și TRF2 și nu a generat modificări evidente în TIN2 și Rap1 .
Observarea acestui nivel general scăzut al proteinelor complexului shelterin după iradiere a fost
corelată de către acesta cu scurtarea telomerelor indusă de radiațiile ionizante (Li și colab., 2012).
Mai mult, expunerea directă sau indirectă la radiații le ionizante, generează disfuncții la
nivel mitocondrial și stres oxidativ , ce persistă mult timp după ce a avut loc iradierea și induc
scurtarea telomerelor. Telomerele s -au prezentat a fi destul de stabile la acțiunea directă a speciilor
reactive de oxig en (ROS), care se formează în exces ca urmare a acestui stres oxidativ.
La nivel telomeric, repetiția (5’ – GGG -3’) este ținta principală a stresului oxidativ (Henle
și colab., 1999).
Guanina oxidată, este prezentă ȋn urma acțiunii speciilor reactive de oxigen la nivelul
nucleotidelor telomerice, care perturbă activitatea telomerazei (Szalai și colab., 2002) și inhibă
atașarea proteinelor asociate repetiției telomerice (TRF1 și TRF2) (Opresko și colab., 2005).
Surplusul speciilor reactive de oxigen induc și rupturi monocatenare (SSB – single -strand breaks),
care au capătul 3’ modificat (Dianov și colab., 2007). Modificările respective interferă cu
replicarea ADN -ului și induc telomere scurtate în celulele supuse stresului oxidativ (Tchirkov și
Lansdorp, 20 03). Ȋn urma unor experimente s -a demonstrat că, supraexprimarea unor enzime ca de
exemplu superoxiddismutaza de mangan (proteină cu funcție antioxidantă) determină încetinirea

38
scurtării telomerelor în celulele direct afectate de radiațiile ionizante, capa citatea de apărare
antioxidantă fiind, astfel, foarte importantă în controlul lungimii telomerice (von Zglinicki, 2002;
Serra și colab., 2003).
Efectul imediat al acțiunii radiațiilor ionizante asupra telomerelor în celule normale este
dependent de doză și de transferul linear de energie (LET), existând la ora actuală o serie întreagă
de studii în domeniu.
Așadar, la doze mici radiații ionizante, de până la 1 Gy, indiferent de variațiile transferului
linear de energie, în fibroblastele liniei AG1522, după i radierea in vitro nu au apărut modificări la
nivel telomeric (Nieri și colab., 2013). La fel s -a observat și ȋn cazul unei doze mai ridicate de
radiații X, de 4 Gy aplicată fibroblastelor normale umane HFFF2 cu deosebirea că, iradierea cu
protoni cu LET ri dicat a indus elongarea telomerelor post iradiere (Berardinelli și colab., 2011;
2013). Radiațiile ionizante gamma utilizate in vitro la doze practicate în clinică (18 până la >40
Gy) generează scurtarea telomerelor în limfocitele și fibroblastele normale la 24 h post iradiere
(Li, 2012).
Ansamblul acestor rezultate sugerează faptul că modificări importante ale lungimii
telomerelor sunt vizibile numai după expunerea la doze ridicate de radiații ionizante.
De asemenea, au fost elaborate o serie de cercetări care vizeazăefectele pe termen lung ale
iradierii cu radiații ionizante asupra lungimii telomerelor . Telomerele pot fi expuse la radiațiile
ionizante, fapt ce contribuie la creșterea instabilității cromozomiale care este observată și în
descendența celulel or iradiate (Berardinelli și colab., 2011; 2013).
Cu toate că, efectele de lungă durată ale dozelor mici de radiații ionizante sunt în mare
parte necunoscute și necesită studii suplimentare pentru a înțelege mai bine mecanismele implicate
și pentru a obser va dacă efectul radiațiilor ionizante asupra lungimii telomerice conservă
heterogenitatea individuală sau face distribuția acesteia mai omogenă. Așadar, s -a observat că spre
deosebire de fibroblastele umane normale iradiate cu doze de 4 Gy de radiații X cu LET scăzut nu
exprimă modificări ale lungimii telomerelor la 24 h post iradiere, aceleași celule, la 4 zile de la
iradiere sunt caracterizate de un nivel ridicat de scurtare telomerică, urmat de o elongare
telomerică întârziată la 15 zile post iradiere. Ȋ n același mod s -a demonstrat că iradierea cu protoni
cu LET ridicat generează alungirea telomerică imediat după iradiere (Berardinelli și colab., 2011;
2013). Au apărut astfel contradicții pe baza acestor experimente care sugerează faptul că
telomerele rea cționează diferențiat în funcție de tipul și de puterea de penetrare a radiațiilor

39
aplicate și implicit de complexitatea leziunilor generate de acestea (Berardinelli și colab., 2011;
2013).
O deosebită importanță este creată datorită legăturii dintre telom ere ca element cheie în
inițierea procesului carcinogen și radiațiile ionizante. Carcinogeneza este prezentată ca un proces
complex, ce cuprinde multe stadii, care presupun obținerea de noi capacități biologice, care permit
celulelor canceroase să supravie țuiască, prolifereze și să difuzeze. Mutațiile reprezentate de
instabilitatea genomică, rearanjamentele cromozomiale, precum și alte tipuri de alterări genetice
reprezintă un factor important, care ajută la achiziționarea trăsăturilor distinctive ale cance rului.
Instabilitatea poate fi indusă prin: dereglări de lungime ale telomerelor, modificări ale proteinelor
complexului shelterin sau ale proteinelor implicate în repararea ADN. Din cauza expunerii directe
sau indirecte la radiații ionizante se generează o varietate de tipuri de leziuni celulare și la nivel de
ADN, care determină ,pe termen lung, instabilitate genomică. Ȋn urma expunerii directe sau
indirecte la radiații ionizante apar modificări de lungime ale telomerelor, precum și senescența
accelerată , aceasta reprezentȃnd pași importanți în generarea instabilității genetice post iradiere și
în intensificarea carcinogenezei (Aragona et al., 2000).
Ȋn urma efectuării unor experimente, ȋn anul 2012 Kaul și colaboratorii au elaborat o teorie
referitor la implicarea telomerelor în inducerea carcinogenezei. Această teorie afirmă că, scurtarea
continuă a telomerelor va conduce, în final, la telomere nefuncționale, iar existența unui număr de
5 telomere nefuncționale sau mai multe, declanșează senescența și bl ochează proliferarea
(Hayflick și Moorhead, 1961) (figura 14).
Dacă se diminuează numărul de telomere pierdute (<5) calea de semnalizare ce conduce
celula spre senescență este blocată, celulele se divid nelimitat și telomerele continuă să se scurteze
până când se ajunge la așa numita ''crizatelomerică''. Astfel, pot fi pierduți cromozomi întregi sau
brațe cromozomiale, ceea ce conduce la pierderea heterozigoției pentru numeroase gene recesive
(Pommier și colab., 1995). Prin urmare, din cauza dezechilibrelo r cromozomiale induse de
scurtarea telomerelor ,mutațiile recesive acumulate în genom încep să se manifeste. În concluzie,
disfuncția telomerelor (naturală și/sau indusă de radiațiile ionizante) poate provoca și propaga
instabilitatea genetică și pierderea heterozigoției, ceea ce reprezintă un prim pas în carcinogeneză
(Pommier și colab., 1995).
Ȋn ceea ce privește tumorigeneza, telomerele și radiațiile ionizante se poate discuta despre
un alt aspect important și anume acela că, folosirea intensivă a radiot erapiei în tratarea cancerului.

40
Este esențial ca ȋn radioterapie să se ia în considerare diferențele interindividuale privind
sensibilitatea la acțiunea radiațiilor ionizante. A fost stabilit faptul că, există o variație
considerabilă a sensibilității la r adiațiile ionizante dependentă de lungimea telomerică, atât în
rândul pacienților cu cancer, cât și la persoanele sănătoase și că, sensibilitatea la radiații poate
contribui în mod semnificativ la rezultatele clinice ale radioterapiei. Dacă nu se ține seam a de
variabilitatea interindividuală este posibil ca pacienții extrem de radiosensibili să dezvolte efecte
secundare datorate toxicității radiațiilor, și, în același timp, pacienții rezistenți la radioterapie să
primească o doză insuficientă de radiații di n cauza limitărilor de doza din protocoalele actuale de
radioterapie generală. Ca să putem identifica atât radiorezistența în celulele tumorale, cât și
radiosensibilitatea în celulele normale ale pacienților cu cancer (radioterapie personalizată) trebuie
să se elaboreze o metodă clinică rapidă și eficientă (Andreassen și colab., 2012; Fernet și Hall,
2004).
Cu toate acestea, este evidențiată o asociere clar stabilită ȋntre radiosensibilitate și
inhibarea activității telomerazei ȋn celulele canceroase umane . Ulterior după inhibarea activității
telomerazei și respectiv a reducerii lungimii telomerelor, viabilitatea celulelor tumorale este
compromisă prin inducerea senescenței și prin deteriorarea creșterii tumorale. Celulele de
carcinom radiorezistente, posed ă activitate telomerazică ridicată și telomere lungi (Zhou și colab.,
2010). Radiorezistența celulelor este dată de telomerază datorită abilității acesteia de a alungi
preferențial telomerele scurte, acestea fiind aproape nefuncționale, protejȃnd astfel ce lulele de
apoptoză indusă de radiațiile ionizante și de necroză (Gorbunova și colab., 2002; Pirzio și colab.,
2004).
Datorită acestor rezultate s -a putut concluziona astefel că, utilizarea inhibitorilor
telomerazei în timpul terapiei cancerului poate dete rmina sensibilizarea celulelor canceroase la
chimioterapie și radioterapie (Nakamura și colab., 2005; Wesbuer și colab., 2010; Kovalenko și
colab., 2010).
Luȃnd ȋn considerare faptul că, variabilitatea interindividuală a lungimii telomerice, rata cu
care a u loc procesele de carcinogeneză și senescență va varia funcție de aceasta. Astfel lungimea
telomerică poate fi considerată elementul de bază al predispoziției individuale la carcinogeneză
(Aragona et al., 2000).

41

Figura 14 Lungimea telomerică și proces ele de carcinogeneză (modificat după Kaul și colab., 2012)

Din cauza faptului că, oamenii sunt expuși aproape zilnic la radiațiile ionizante fie naturale,
fie artificiale este important să se elaboreze atât studiul consecințelor pe termen lung, cât și a c elor
imediate generate de expunerea la radiațiile ionizante asupra telomerelor și a mecanismelor de
menținerii a lungimii acestora (Aragona et al., 2000).
Ca o concluzie, ȋnțelegerea corectă a acestor mecanisme, poate avea implicații importante
în domeniul sănătății umane, radioterapiei, și a protocoal elor de protecție împotriva radiațiilor
(Aragona et al., 2000).

42
Cap. III METODE DE ANALIZĂ A TELOMERELOR ȘI TELOMERAZEI

III.1. TEHNICI CITOGENETICE APLICATE PENTRU ANALIZA
EFECTELOR RADIATIILOR IONIZANTE ASUPRA GENOMULUI UMAN

III. 1. 1 Citogenetică clasică
Testul micronucleilor
Testul micronucleilor este un test care este utilizat ȋn screening -ul toxicologic pentru a
evidenția potențialii compuși genotoxici. Testul este recunoscut ca fiind unul dintre cel e mai de
succes teste pentru detectarea carcinogenilor genotoxici; carcinogeni care acționează cauzând
deteriorări la nivelul genelor. Există două variante ale acestui test și anume: in vivo și in vitro .
Ȋn general testul in vivo se realizează utilizȃnd măduvă osoasă sau sȃnge periferic. Ȋn
momentul ȋn care un eritroblast din măduva osoasă se transformă ȋntr -un eritrocit policromatic,
nucleul principal este eliminate; ȋn timp ce orice micronucleu care a fost format poate rămȃne ȋn
citoplasma anucleată. Vi zualizarea micronucleilor este facilitată ȋn aceste celule deoarece ele nu
prezintă un nucleu principal. O frecvență crescută a micronucleilor eritrocitelor policromatice la
animalele tratate indică inducerea deteriorării cromozomilor
(https://en.wikipedia.org/wiki/Micronucleus_test ).
Micronucleii au fost descoperiți la sfȃrșitul secolului 19 de către Howell și Jolly, aceștia au
observant ȋn sȃngele provenit de la pisici și șobolani, niște mi ci incluziuni. Aceste mici incluziuni,
cum au fost numite de către Howell -Jolly, au fost observ ate și ȋn eritrocitele din sȃngele periferic al
paciențiilor care sufereau de anemie. Aceasta a fost prima descriere a micronucleilor (Hayashi
Genes and Environment, 2016).
Ȋn 1959, Evans și colaboratorii au utilizat radiații gamma pentru a cuantifica det eriorările
cromozomiale din varfurile rădăcinii de la broad bean ( Vicia faba ). În 1970, Boller și Schmid au
dezvoltat o metodă de testare pentru evaluarea frecvenței eritrocitelor micronucleate printre
eritrocitele normale. Eritrocotelor micronucleate le l ipsesc propriile nuclee în timpul
hematopoiezei (Hayashi Genes and Environment, 2016).
În 1976, Countryman și Heddle au evidențiat acesti micronuclei folosind o cultură de
limfocite umane. Modificările acestei metode au fost aduse de către au fost introdu se de Fenech și

43
Moley, care au utilizant citocharasin B, iar acum metoda este larg utilizată pentru monitorizare
(Hayashi Genes and Environment, 2016).
Un micronucleu este al treilea nucleu care se formează ȋn timpul anafazei mitozei sau
meiozei. Micronucl eii reprezintă corpuri citoplasmatice care includ o porțiune de cromozom
acentric sau cromozom întreg care nu a fost transportat la polii opuși în timpul anafazei
(https://en.wikipedia.org/wiki /Micronucleus_test ).
Formarea lor are ca rezultat o celula fiică lipsită de o parte sau integral de un cromozom.
Aceste fragmente de cromozomi sau cromozomii întregi dezvoltă în mod normal membrane
nucleare și se organizează ca micronuclei. După citokinez ă, în una dintre celulele fiice se formează
un nucleu, în timp ce în cealată se generează un nucleu mare și unul mic (micronucleu). Există
posibilitatea ca să se formeze mai mult de un micronucleu ȋn momentul ȋn care apar deteriorările
genetice ( https://en.wikipedia.org/wiki/Micronucleus_test ).
Testul micronucleilor este utilizat ca un instrument pentru evaluarea genotoxicității
diferitelor substanțe chimice.Este mai ușor de realizat decât test area aberațiilor cromozomiale în
ceea ce privește procedurile și evaluarea. Utilizȃnd metoda FISH cu sonde orientate către regiunea
centromerului, se poate determina dacă un cromozom întreg sau doar un fragment este pierdut
(https://en.wikipedia.org/wiki/Micronucleus_test ).

Figura 15 Formarea micronucleilor (MN) pe calea clastogenă (sus) și calea aneugenică (partea de jos) J. Nicolette,
in A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug Development (Second Edition), 2017

44
La ora actuală, omenii sunt adesea expuși la diferiți agenți genotoxici prezenți ȋn mediul
ȋnconjurător poluat. Așadar, este necesar să se efectueze teste pentru determinarea nivelului
expunerii ce conduce la pericli tarea sănătății. Dintre toate testele de biomonitorizare in
vivoexistente pe piață , testul micronucleilor (MN) este unul dintre cele mai populare. Cu toate
acestea, conceptul de MN acoperă multe tehnici diferite care ar putea fi folosite cu certitudine ȋn
situații diferite (Centre for Radiobiology and Biological Dosimetry, Institute of Nuclear Chemistry
and Technology, Dorodna 16, 03 -195 Warszawa, Poland).
Mulți factori fizici și chimici ceafectează stabilitatea genomului nostru contribuie la
dezvoltarea diferitelor boli (boli cardiovasculare, boli pulmonare sau boli neurodegenerative).
Testele de genotoxicitate permit evaluarea impactului acestor factori asupra populației și a biotei.
Studiile efectuate în această direcție nu sunt ușor de realizat deoarec e sunt implicați numeroși
factori și au uneori o putere statistică scăzută ce nu permite o atribuire directă factorilor examinați
cu o maladie anume (Centre for Radiobiology and Biological Dosimetry, Institute of Nuclear
Chemistry and Technology, Dorodna 1 6, 03 -195 Warszawa, Poland).
Aproape 20 de tipuri diferite de teste de genotoxicitate in vitro sunt utilizate ȋn
prezent.Testele in vitro sunt utilizate pentru investigarea posibilelor efecte genotoxice determinate
de către produse farmaceutice noi și alte tipuri de material/materii de folosință zilnică, de factori
fizici sau chimici. Cele mai importante teste in vivo cuprind,similar cu cele in vivo, trei metode
citogenetice și anume: testele comet assay, evidențierea aberaților cromozomiale și cuantificarea
de micronuclei, eritrocite mamaliene MN (EMN) sau celule bucale MN (BMN) (Centre for
Radiobiology and Biological Dosimetry, Institute of Nuclear Chemistry and Technology, Dorodna
16, 03 -195 Warszawa, Poland).
Colororarea clasica cu solutie Giemsa
Coloraț ia Giemsa este o tehnică clasică prin intermediul căreia cromozomii se colorează
uniform. Această tehnică ajută la evidențerea tipurilor morfologice de cromozomi și evidentierea
variațiilor structurale și numerice ale acestora. Dacă scopul experimentului c onstă ȋn realizarea
unei cariotipări este de preferat să se aplice tehnici mai exacte cum ar fi bandarea G. Dacă scopul
experimentului este numai de a caracteriza cromozomii în condiții normale și patologice aplicarea
colorației Giemsa este metoda cea mai rapidă și mai simplă de realizat.

45
Bandări cromozomale
Organizarea biochimică diferită a cromozomilor (distribuția regiunilor AT/GC) și
condensarea diferită a cromatinei, permite evidențierea diferitelor zone cromozomiale sub formă
de benzi (Estandarte, 2 012).
Astfel fost observat faptul că, heterocromatina, care posedă o condensare mai puternică,
apare mai intens colorată (benzi întunecate), pe când eucromatina, care este mai puțin condensată
apare mai slab colorată (benzi luminoase) (Estandarte, 2012).
Denumirea benzilor a fost dată ȋn funcție de colorantul utilizat sau după segmentul
cromozomial evidențiat. Metodele cele mai comune de bandare sunt:
 bandarea G (Giemsa);
 bandarea C (Centromer);
 bandarea R (Reverse);
 bandarea Q (Quinacrina);
 bandareaT (Tel omere).
Bandările sunt utilizate atât în identificarea cromozomilor și obținerea cariotipului, cât și
pentru identificarea anomaliilor cromozomiale (legate de numărul sau structura cromozomilor).
Bandarea G – presupune utilizarea colorantului Giemsa. Ca să poată fi evidențiată
bandarea, preparatele cromozomiale sunt tratate specific cu o enzimă proteolitică (ȋn general
tripsina) care are abilitatea de a produce digestia parțială a cromozomilor și îndepartarea
proteinelor asociate, iar ulterior lamele sunt c olorate cu soluție Giemsa. Zonele heterocromatinice,
care tind să fie bogate în adenină și timină vor produce benzi întunecate, iar zonele bogate în
guanină și citozină vor genera benzi clare (Estandarte, 2012).
Aceast tip de bandare poate fi aplicat pentr u a identifica anomaliile cromozomiale, ca de
exemplu translocațiile, pe baza modelului unic de benzi luminoase și întunecate specifice fiecărui
cromozom (Estandarte, 2012).
Bandarea C – presupune tratamente cu mai multe soluții: HCl pentru depurinarea ADN și
eliminarea proteinelor; Ba(OH) 2 pentru denaturarea ADN și SSC pentru spălarea și înlăturarea
ADN -ului denaturat. Bandarea C este folosită pentru evidențierea heterocromatinei constitutive
centromerice, a heterocromatinei din regiunile terminale, inters tițiale, dar și a heterocromatinei de

46
la nivelul constricțiilor secundare. ADN -ul din aceste zone este înalt repetitiv și condensat și ca
atare mult mai greu de degradat, făcȃnd posibil acest fapt.
Cu ajutorul acestei tehnici sunt evidențiate aberațiile cr omozomiale structurale de tip: translocație
robertsoniană, cromozomi inelari sau dicentrici, precum și fragmente acentrice (Coman și Dordea,
1991).
Bandarea R – reprezintă inversul bandarii G. Regiunile întunecate sunt eucromatinice
(regiuni bogate în guan ină-citozină), iar regiunile slab colorate sunt heterocromatinice (regiuni
bogate în adenină -timina) (Estandarte, 2012).
Obținerea bandăii R se face prin incubarea cromozomilor într -o soluție ionică la o
temperatură ridicată (~ 87°C) urmată de colorarea cu Giemsa. Procesul de incubare induce
denaturarea regiunilor AT ale cromozomilor datorită punctului de topire scăzut al acestor regiuni
(~ 65°C) comparativ cu regiunile GC (~ 105°C) (Estandarte, 2012).
Bandarea Q – a fost concepută prima dată de către Caspe rsson în 1970 și folosește
colorantul Quinacrina (fluorescent). Tehnica permite obținerea de benzi intens colorate în zonele
bogate în adenină -timină și benzi slab fluorescente în zonele bogate în guanină -citozină. Acest tip
de bandare este similar bandări i G. Pentru vizualizare este utilizat un microscop cu
fluorescență (Coman și Dordea, 1991).
Bandarea Q este o colorație utilă pentru identificarea unor polimorfisme centromerice
(aparținând cromozomilor 1, 16, 19) sau pentru diferite variații ale cromozomul ui Y (Coman și
Dordea, 1991).
Bandarea T – reprezintă denaturarea termică urmată de folosirea a două tampoane unul de
acid citric și unul fosfat. Are loc o denaturare a materialului genetic, ce afectează integral
cromozomul, mai puțin la capetele acestuia (zona telomerică). Lamele sunt ulterior colorate cu
soluție Giemsa sau cu acridine -orange. Rezultă astfel o colorare numai a telomerelor, restul
rămânând slab colorat (Coman și Dordea, 1991).
Bandarea Nucleolar Organizer Regions (NOR) – presupune tratarea preparatelor cu
azotat de argint, soluție cu mare afinitate pentru regiunile organizator nucleolare ale cromozomilor
acrocentrici ce conțin informația genetică pentru ARNr18S și ARNr28S (Coman și Dordea, 1991).

47
III. 1. 2 Citogenetică moleculară
Tehnica F ISH
FISH ( Fluorescent in situ hibridization – hibridizare fluorescentă in situ ) este o tehnică de
citogenetică moleculară utilizată pentru a detecta și localiza secvențele ADN specifice din
structura cromozomilor, pentru detectarea de anomalii cromozomiale precum duplicații, deleții,
translocații, ce pot fi utilizate ulterior pentru sfatul genetic sau în domeniul medical (Amann si
colab., 2008).
În anii 1960, cercetătorii Joseph Gall și Mary Lou Pardue au observat că hibridizarea
moleculară ar putea fi folos ită pentru a identifica poziția secvențelor ADN in situ. În 1969, aceștia
au pus în aplicare pentru prima dată tehnica FISH, utilizând sonde nucleotidice marcate cu agenți
radioactivi, iar vizualizarea s -a realizat prin autoradiografiere (O'Connor, 2008).
Ulterior, sondele marcate radioactiv au fost înlocuite cu cele fluorescente datorită
siguranței lor mai mari, stabilității și ușurinței de detecție (O'Connor, 2008).
Această tehnică operează cu sonde de ADN/ARN marcate fluorescent complementare cu
diferite regiuni cromozomiale individuale. Segmentele de ADN/ARN marcate hibridizează cu
țintele din probă și pot fi vizualizate utilizând microscopia de fluorescență în nucleii interfazici sau
pe cromozomi metafazici (Decordier, 2013).
Există trei tipuri de hibrid izări: ADN -ADN, ADN -ARN și ARN -ARN (Jensen, 2014).
Sondele FISH pot fi: ADNdc, ADNmc sau ARN și trebuie să fie suficient de mari pentru a
hibridiza specific cu secvența țintă, dar totodată nu foarte mari pentru a nu împiedica procesul de
hibridizare.
Sonde le cele mai folosite sunt cele de ADNdc, acestea fiind sintetizate și marcate prin mai
multe metode: PCR, Nick translation sau Random priming (Ratan și colab., 2017).
Există două modalității de marcare a sondelor și anume: directă și indirectă. În cazul
marcării directe, sondele sunt sintetizate din nucleotide ce au atașat un fluorocrom, în timp ce în
cea indirectă, sondele conțin nucleotide modificate care au incluse haptene, cum ar fi biotina și
digoxigenina (Ratan și colab., 2017, Beliveau și colab., 201 2).
Gruparea sondelor se realizează în funcție de regiunea cromozomală vizată:
 Sonde centromerice (CEP) – sunt reprezentate de secvențe repetitive de ADN α satelit, fiind
utilizate pentru a cuantifica numărul de cromozomi, în special în detecția aneuploidi ilor sau a
poliploidiilor.

48
 Sonde telomerice –au specificitate pentru un locus poziționat la aproximativ 300 kb de capătul
cromozomal (TTAGGG) și sunt folosite pentru a evidenția restructurările terminale ale
cromozomilor și pentru cuantificarea numărului r epetițiilor telomerice.
 Sonde WCP (whole chromosome paint) – permit colorarea individuală a întregului cromozom.
Aceste sonde sunt utilizate pentru identificarea și studierea aberațiilor greu de identificat din punct
de vedere citogenetic.
 Sonde LSI (Locus specifice) – hibridizează doar cu o anumită secvență unică în
genomul uman. Cu ajutorul acestor sonde sunt identificate diferite anomalii cromozomiale de tipul
delețiilor, translocațiilor, amplificare genică
etc(https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_situ_hybridization ).

Figura 16 Tipuri de sonde utilizate în tehnica FISH (modificat după:
https://www.researchgate.net/figure/Examples -of-different -types -of-fluorescence -in-situ-hybridisation -FISH -probes –
a_fig1_9035148 )

Clasica analiză FISH folosește maxim două tipuri de fluoroc romi: un tip pentru
evidențierea zonei de interes și un alt tip ce va fi folosit drept element de contrast, colorând
cromozomii în întregime (table nr. 3). Îmbunătățirile în imagistica fluorescentă și dezvoltarea
fluorocromilor au dat frȃu liber cercetător ilor să utilizeze mai multe sonde diferite de ADN într -un
singur experiment (Bayani și colab., 2004).

49
Tabel nr. 3 Tipuri de fluorocromi folosiți pentru marcarea sondelor FISH (original)
Fluorocrom de bază (1) Culoare
fluorocrom
de bază Fluorocrom de c ontrast (2) Culoare
fluorocrom de
contrast
Fluorescein
isothiocyanate – (FITC) verde PI (propidium iodide) roșu
DAPI (4' 6 -diamidino -2-phenylindole
dihydrochloride) albastru
Rhodamine Texas Red
roșu DAPI (4' 6 -diamidino -2-phenylindole
dihydrochloride) albastru CY3 (Cyanine3)
CY5 (Cyanine5)
Probe multicolore Diverse
culori DAPI (4' 6 -diamidino -2-phenylindole
dihydrochloride) albastru

Pașii care trebuiesc urmați în cadrul tehnicii FISH cuprind: pretratarea lamelor ce conțin
preparatul biologic urmată de denaturarea ADN -ului cromozomal de la forma dublu catenară la
cea monocatenară și de denaturarea sondei tot la forma monocatenară. Ulterior are loc hibridizarea
sondă – țintă, contramarcarea și examinarea lamelor la microscopul cu fluorescență.

Figura 17 Tehnica FISH (modificat după:
http://www.abnova.com/support/resources.asp?switchfunctionid={B4285500 -DB85 -435D -BE02 -2BF420D 5C70D}

Această tehnică conferă o multitudine de avantaje, cum ar fi: : este o tehnică rapidă care
permite marcarea unui număr mare de celule într -o perioadă scurtă de timp; eficiența hibridizării

50
este ridicată; prezintă senzitivitate și specificitate mar i, tehnica a fost adaptată pentru sisteme
automatizate iar informațiile citogenetice pot fi obținute și din probe care conțin prea puține celule
pentru analiza citogenetică de rutină (Gozzetti și Beau, 2006).
Pe de altă parte, tehnica FISH prezintă și o se rie de limitări, precum: sunt identificate acele
anomalii care pot fi detectate cu sonde disponibile în prezent pe piață; permite detectarea uneia sau
doar a câtorva anomalii în simultan, este sensibilă pentru detectarea trisomiilor, dar mai puțin
sensibil în cazul detectării delețiilor cromozomiale iar datele citogenetice pot fi obținute numai
pentru cromozomii țintă, ȋn concluzie FISH -ul nu este obligatoriu cel mai bun instrument de
screening pentru bolile heterogene (Gozzetti și Beau, 2006).
Quantitative -FISH (Q -FISH)
Cuantificarea efectivă a lungimii telomerelor este efectuată prin tehnica denumită Q -FISH
(quantitative FISH). Lansdorp și colab., în anul 1996 au implementat această tehnică, care
presupune hibridizarea unei sonde sintetice denumită PNA (pe ptide nucleic acid) la nivelul
secvenței telomerice. Sondele PNA nu conțin grupări fosfat încărcate electric, legătura dintre PNA
și ADN fiind astfel mai puternică decât cea ADN -ADN sau ADN -ARN (Jackson -Cook și colab.,
2015).
Tehnica Q -FISH poate utiliza a tât cromozomi metafazici cât și nuclei interfazici.
Q-FISH efectuată pe cromozomii metafazici conferă informații despre variația lungimii
telomerelor între diferiți cromozomi, precum și o perspectivă asupra frecvenței instabilității
cromozomiale. Un avanta j al acestei tehnici ȋl constituie faptul că permite estimarea dimensiunilor
tuturor celor 92 de repetiții telomerice aflate la capetele fiecărui braț cromatidic existent în
complementul uman. Cu toate acestea există și un dezavantaj al acestei metode și a nume, faptul că
nu poate fi folosită în celule ce nu sunt active din punct de vedere mitotic și este destul de limitată
pentru liniile celulare cu rată scazută de proliferare. Așadar, este o metodă costisitoare și
laborioasă astfel că nu poate fi folosită în cazul studiilor pe grupuri mari de indivizi (Jackson -Cook
și colab., 2015).
Q-FISH -ul desfășurat în interfază a fost ȋmbunătățit pentru a depăși anumite limitări ale
FISH -ului clasic, putând fi aplicat pe mai multe tipuri celulare, inclusiv pe cele cons ervate prin
înghețare, împarafinare, fixare chimică, etc. Un avantaj solid al folosirii metodologiei Q -FISH pe
nuclei interfazici ȋl reprezintă faptul că permite colectarea simultană a informațiilor privind
lungimea telomerelor și informațiile histologice, având abilitatea de a o combina cu diverse tehnici

51
de marcare imunologică (Vera și Blasco, 2012). Dezavantajul ȋl reprezintă faptul că datele sunt
doar orientative deoarece în interfază există riscul ca materialul genetic aflat în stare decondensată
să pr ezinte regiuni suprapuse, și astfel pot apărea erori în detectare (Canela și colab., 2007).
Tehnici derivate din FISH
Primele experimente de hibridizare in situ au fost efectuate ȋn anul 1969, fiind dezvoltate
numeroase variații ale procedurii FISH, iar se nsibilitatea sa a crescut enorm. Ȋn prezent cele mai
multe proceduri de hibridizare in situ folosesc sonde fluorescente pentru a detecta secvențele ADN
(O'Connor, 2008).
 ACM -FISH – este un tip particular de FISH multicolor folosit pentru detectarea simulta nă a
anomaliilor cromozomiale numerice și structurale în celulele spermatice (Volpi și Bridger, 2008).
 ArmFISH – constituie o variantă a M -FISH -ului, ce folosește 42 de culori, permițȃnd detectarea
anomaliilor cromozomiale la nivelul brațelor cromozomiale, exceptând brațele scurte ale
cromozomului Y și cromozomii acrocentrici. Tehnica ArmFISH a fost aplicată cu succes pentru a
descoperi instabilitatea cromozomilor pe scară largă în liniile celulare de gliom (Ratan și colab.,
2017).
 CO-FISH (Chromosome orien tation) – este o tehnică FISH care utilizează sonde ADNmc pentru a
produce hibridizarea specifică monocatenelor. Inițial, CO -FISH a fost destinat pentru a determina
orientarea repetițiilor în tandem la nivelul regiunilor centromerice ale cromozomilor, fiin d utilizată
pentru detectarea inversiilor și a translocațiilor în general, și a translocațiilor Robertsoniene în
particular (Volpi și Bridger, 2008).
 D-FISH – este folosită pentru detectarea fuziunii BCR / ABL în leucemia mieloidă cronică (Ratan
și colab., 2017).
 Flow -FISH – tehnică așa cum a fost descrisă de Lansdorp și colab., în 1998, constă ȋn folosirea
sondelor telomerice marcate cu PNA (peptide nucleic acid) pentru vizualizarea și măsurarea
lungimii repetițiilor telomerelor, dar analiza combină hibrid izarea in situ cu citometria în flux
pentru măsurarea semnalelor telomerice din celulele în suspensie (Volpi și Bridger, 2008).
 Immuno -FISH -ȋmbină două tehnici, una fiind FISH -ul standard, fie pe preparatele cromozomiale
aplatizate (FISH 2 -D), fie pe nucl eele conservate tridimensional (FISH 3 -D), iar cealaltă este
reprezentată de o tehnică de imunofluorescență indirectă sau directă. Ultima tehnică permite

52
vizualizarea antigenelor din eșantion, astfel încât atât ADN -ul cât și proteinele pot fi analizate pe
aceeași probă (Volpi și Bridger, 2008).
 Reverse -FISH este utilizat pentru evidențierea unor probe de ADN necunoscut, dar care pot să
posede o restructurare cromozomială sau o amplificare cromozomială specifică celulelor maligne
(Volpi și Bridger, 2008).
 M-FISH (Multi Color FISH) – permite obținerea de informații privind rearanjamentele
cromozomiale pe cromozomii metafazici la care bandările clasice nu au dat rezultate.
 ML-FISH – permite identificarea microdelețiilor cromozomiale (Ratan și colab., 2017).
 Single-molecule RNA FISH – este o metodă de detectare și cuantificare a ARNm și a altor
molecule lungi de ARN într -un strat subțire de țesut
(https://en.wikipedia.org/wiki/Fluore scence_in_situ_hybridization ).

III.2. TEHNICI MOLECULARE APLICATE PENTRU ANALIZA EFECTELOR
RADIATIILOR IONIZANTE ASUPRA GENOMULUI UMAN
Tehnica TRAPeze
Dezvoltarea testului TRAPeze ce permite cuantificarea telomerazei bazată pe PCR s -a
dovedit un instrume nt esențial în cunoașterea și ințelegerea rolului telomerazei în cancer. Testul
permite să se analizeze biopsii tisulare mici și să fie prelucrate un număr mare de probe tumorale
concomitent. Ȋn aproximativ 85% din cazurile analizate (peste 950 tumori prim are) s -a descoperit
faptul că, acestea exprimă telomeraza, făcând din aceasta un marker frecvent pentru celule
canceroase. (Woodring E. Wright și colab., 1995).
Metoda a fost ințial creată de Kim și colab. în 1994 și a revoluționat cercetările asupra
activ ității telomerazei în senescență și cancer (Kim și colab.,1994). Reacția poate fi folosită la o
gamă foarte variată de organisme, ca de exemplu: om, șoarece, șobolan, câine, pui, vacă, Xenopus .
La om reacția poate fi utilă în diagnosticul timpuriu al difer itelor tipuri de cancere, ca factor de
prognostic sau în identificarea inhibitorilor de telomerază (Kim și colab., 1994).
Reacția se bazează pe acțiunea telomerazei izolată din extract celular total la nivelul
repetiției telomerice într -o reacție PCR “in v itro” . Cuantificarea se realizează prin raportarea la un
control intern a reacției de către un sistem automatizat de captare și analiză a imaginii (Wright
W.E. și colab., 1995).

53

Figura 17
Test de PCR bazat pe activitatea telomerazei (Detection of telomer ase activity by the TRAP assay and its variants and
alternatives)

54
Cap. IV MATERIALE ȘI METODE UTILIZATE PENTRU STUDIUL REACTIVITĂȚII
GENOMULUI UMAN LA ACȚIUNEA RADIAȚIILOR IONIZANTE BETA

IV.1 MATERIAL BIOLOGIC
Material biologic uman : sânge periferic.
Prelevarea sȃngelui a fost realizată de la persoane sanătoase, nefumătoare, care nu au urmat
nici un fel de tratament care să producă modificări la nivelul cromozomilor și care să nu fi
consumat alcool. Voluntarii au fost informați cu privire l a scopul și etapele studiului și și -au dat
consimțământul în scris pentru a participa la acesta.
Iradierea a fost efectuată la Institutul de Cercetare de la Turnu Măgurele, sângele
fiind supus acțiunii agenților mutageni fizici ( radiații X) conform tabelulu i nr.4.
Tabel nr. 4 – Dozele de iradiere administrate culturii de limfocite
Probe Doze Raze X
Martor Neiradiat
1 0,5Gy
2 1Gy
3 2Gy
4 4Gy

IV.2 METODE DE STUDIU CITOGENETICE
IV.2.1 Testul micronucleilor
Pentru efectuarea testului micronucleilor, au f ost necesare probe de sânge total prelevate pe
anticoagulant (Lithum – heparin).
S-au iradiat probele prelevate cu doze între 50 mGy și 4 Gy.
Fiecare probă iradiată s -a repartizat în câte 2 tuburi în cantitate de 0,5 ml/tub.
Probele control negativ și poz itiv: concomitent cu probele de testat s -au lucrat și probe de
celule neiradiate pentru evaluarea variabilității testului, a nivelului de degradare endogenă a
celulelor, precum și a leziunilor care pot surveni în timpul pregătirii eșantioanelor.
 Inițierea culturii: Lucrând în hota cu flux laminar, în fiecare tub cu 4.5 ml mediu PBMax
s-au adaug at câte 0.5 ml de sânge. S -au incub at tuburile cu probe în incubatorul de 37°C si
5% CO2, pentru 44 ore.

55
 Oprirea diviziunii celulare: La finalul perioadei de incubar e (44 ore), s -au scos tuburile cu
amestecul de mediu PBMax si sânge și s -au agitat ușor. S -au adăug at Citocalasina B pân ă
la o concentrație de 6 µg/ ml în fiecare tub, respectiv 5 µl/tub. S-au incuba t tuburile la 37°C
în incubator cu CO2, după care s -au centrifug at 8 minute la 4°C si 1200 rpm. S -a îndepărt at
supernatantul și s-a resuspend at sedimentul.
 Hipotonia: S au adăug at 7 ml soluție KCl 0.075M stocată la frigider, în fiecare tub și s -a
efectua t o nou ă centrifugare timp de 8 minute la 4°C si 1000 rpm. S -a elimin at
supernatantul și s-a resuspend at sedimentul.
 Fixarea: Pentru a scoate apa din celule și pentru a distruge membrana celulară au fost
necesare 4 fix ări succesive. S -au adăug at picătură cu picătură, pe peretele tubului, 2 ml de
soluție de fixare, apoi s -a resuspend at sedimentul, după care s -a reada t, tot picătură cu
picătură, soluție de fixare pâna la 5 ml. S -a agitat conținutul și s -a incuba t peste noapte. S -a
agitat conținutul tubului și s -a incuba t peste noapte la 4°C. A 2 -a zi am centrifug at tuburile
timp de 8 minute, la 4°C si 1200 rpm, și am îndepărta t supernatantul și am resuspend at
sedimentul. Am adaug at până la 5 ml soluție de fixare, apoi am centrifuga t 8 minute, la 4°C
si 1200 rpm. Am efectua t încă 2 astfel de fixări. După ultima centrif ugare am îndepărta t o
parte din supernatant și am omogeniz at sedimentul în cei aproximativ 2 ml de supernatant
rămași în fiecare tub.
 Picurarea lamelor: Suspensia de celule obținută a fost picurat ă pe lamele de microscop reci.
 Colorarea: Am usucat lamele p este 1 – 2 ore la temperatura camerei. Dup ă uscare am
colora t cu colora ție Giemsa 10% dup ă cum urmează: În paharele Berzelius am așezat
lamele câte două, spate în spate și a m adăugat soluție Giemsa până ce s -au acoperit
preparatele complet. Am lăsat 10 mi nute la colorat, după care am spălat cu apă de robinet,
am uscat și am vizualizat la microscop.

IV.2.2 Cultivarea in vitro a limfocitelor din sânge periferic uman pentru evidențierea
cromozomilor dicentrici
Ca să putem evidenția complementul cromozomal, a m realizat cultivarea in vitro a
limfocitelor din sânge periferic. Pentru realizarea culturii din sânge total am folosit tot mediu
PB-MAX suplimentat (ser fetal bovin; L -glutamină, soluție N16, antibiotice, fitohemaglutamină).

56
Fitohemaglutina s -a adaugat p entru stimularea transformării blastice a limfocitelor, mai ales a
limfocitelor T.
 Mediul de cultură astfel pregătit, s -a repartizat în flacoane sterile de 15 ml, câte 4,5 ml/flacon.
Ulterior, am adăugat în fiecare flacon câte 0,5 ml sânge total. După agit area ușoară a flacoanelor
(pentru ca celulele sanguine să se disperseze în mediul de cultură), acestea au fost introduse în
termostat, la temperatura de 37°C. După 72 de ore de la cultivare (când am considerat că în cultură
se află numărul maxim de limfoci te în diviziune) cultura s -a “sacrificat”, procedându -se la
prelucrarea materialului obținut.
 Cu două ore înainte de sacrificarea culturii de sânge, s -a adăugat în fiecare flacon de cultură,
soluție de colchicină 0,02% (10 µl), pentru blocarea limfocitelor în metafază (etapă a mitozei în
care cromozomii sunt bine individualizați, cu gradul maxim de contractare a fibrei de cromatină,
prezentând morfologie și dimensiuni caracteristice și constante).
 După cele două ore de colchicinizare, cultura de sânge s -a centrifugat 10 min. la 1000 rpm pentru
separarea celulelor de mediul de cultură.
 S-a îndepărtat supernatantul (mediul de cultură), reținându -se sedimentul celular pe care l -am
resuspendat în 5ml soluție salină hipotonă de clorură de potasiu 0,075M. Hipotoni zarea s -a realizat
pentru mărirea volumului celular și dispersia mai bună a cromozomilor în acest volum.
Temperatura de hipotonizare a fost de 37°C, iar durata de 35 min. După scurgerea acestui interval
de timp, am centrifuge t 10 min. la 1000 rpm și am reținut sedimentul celular.
 A urmat o serie de 3 fixări ale materialului celular, folosind un amestec de 4 ml alcool metilic
absolut:acid acetic glacial în proporție de 3:1, realizată extemporaneu utilizată de la temperatura
de 4°C. Trecerea celulelor din sol uția fixatoare veche în cea proaspătă am realizat -o printr -o
centrifugare la 1000 rpm, timp de 10 min., îndepărtarea fixatorului vechi și adăugarea celui nou.
 După ultima fixare, am făcut o nouă centrifugare în aceleași condiții ca cele de mai sus, iar
sedimentul celular s -a resuspend at într-un volum mic de soluție fixatoare (3 ml). Din această
suspensie am realizat preparate microscopice, prin picurare pe o lamă cu o pipetă Pasteur, de la o
înălțime de câțiva centrimetri.
 Lamele cu preparatele microscopice au fost lăsate să se usuce la aer 24 ore și apoi colorate
convențional cu soluție Giemsa 10%.

57
IV.2.3 Evidenție repetițiilor telomerice prin tehnica FISH
Sonde:
Telomere PNA FISH/Cy3 (Cy3 -fluorescență roșie) – DakoCytomation;
Etapele tehnicii FISH:
1. Pretra tamentul preparatelor – eliminarea debriurilor de pe lamă:
 Lamele au fost supuse unui tratament de 2 minute cu TBS (Tampon Tris Salin);
 Apoi le -am introdus 2 minute în soluție TBS cu 3,7% formaldehidă;
 A urmat spălarea lamelor în TBS1 și în TBS2 – 2 x 5 mi nute;
 Am pretratat lamele timp de 10 minute cu proteinaza K diluată în TBS;
 Spălarea lamelor în TBS3 și TBS4 –2 x 5minute;
 Îndepărtarea tamponului TBS4 de pe lame am realizat -o prin introducerea acestora timp de 2
minute, în băi liminate de 70%, 85%, 95% e tanol rece;
 Am uscat lamele la aer.
2. Denaturarea și hibridizarea lamelor și a sondei:
 Am adăugat 10 µl Telomere PNA Probe/Cy3pe lamă și am acoperit -o cu lamelă ;
 Lamele au fost introduse în incubatorul de hibridizare 5 minute la 80°C;
 Au fost incubate la întu neric, timp de 2 h;
 Lamela a fost îndepărtată prin introducerea în soluția de clătire timp de 1minut.
3. Spălari post -hibridizare – îndepărtarea excesului de sondă:
 Lamele au fost liminate în soluția de spălare timp de 5 minute la 650C;
 Soluția de spălare de pe lame a fost îndepărtată prin introducereaacestora timp de 2 minute, în băi
de 70%, 85%, 95% etanol rece;
 Preparatele au fost uscate la aer.
4. Evidențierea cuplării sondă/probă:
 Pe lame am aplicat 20 µl DAPI și apoi am acoperit cu lamelă ;
 Prin presare am e liminat excesul de DAPI;
 Am lăsat lamele 15 minute la întuneric înainte de a le analiza.
5. Vizualizarea și fotografierea metafazelor: Analizarea preparatelor am efectuat -o la microscopul de
fluorescență Olympus BX 40 (obiective: 20x -100x), fotografierea fiin d realizată cu camera foto
Olympus E -330.

58
IV.2.4.Evidențierea genelor care codifică pentru componentele telomerazei prin
tehnica FISH
Sonde:
1. Sondă pentru evidențierea componentei ARN a telomerazei umane – sonda hTERC
(3q26) / 3q11 – KREATECH. Sonda duală c u regiunea (3q26) specifică genei hTR
marcată direct cu PlatinumBright550 (fluorescență roșie), iar regiunea control 3q11
pentru cromozomul 3 marcată direct cu PlatinumBright495 (fluorescență verde).
2. Sondă pentru evidențierea componentei hTERT a telomeraze i umane – sonda hTERT
(5p15) / EGR (5q31) – KREATECH. Sonda duală cu regiunea (5p15) specifică genei
hTERT marcată direct cu PlatinumBright550 (fluorescenta roșie), iar regiunea control
5q31pentru cromozomul 5 marcată direct cu PlatinumBright495 (fluoresce nța verde).
Etape:
1. Pretratamentul preparatelor microscopice – eliminarea rezidurilor de pe lamă
 Am incubat lamele la 370C pentru 30 min. în 2xSSC (SSC=Salt sodium citrate) (pH=
7.0) și 0,5% Igepal (detergent ce ajută la eliminarea rezidurilor de pe lamă);
 Deshidratarea succesivă a lamelor pentru 2 min. în 70%, 85%, 100% etanol, la
temperatura camerei.
2. Denaturarea probelor – separarea catenelor ADN cromozomial de pe lamă la formă
monocatenară
 Menținerea lamelor pe baia de apă pentru 2 min. la 720C în formami dă 70% în 2xSSC
(pH= 7.0);
 Deshidratarea succesivă a lamelor pentru 2 min. în 70%, 85%, 100% etanol rece
(-200C);
 Lamele au fost uscate la aer.
3. Denaturarea sondelor – separarea catenelor ADN sondă la ADN monocatenar
 Am introdus sonda în tuburi PCR de 0,2 l și s -a denaturat în termocicler la 750C
pentru 10 min. (câte 10 l sondă/lamă);
 Am plasat tuburile pe gheață pentru 30 secunde.
4. Hibridizarea
 Am adăugat uniform 10 l sondă/lamă;
 Am acoperit -o cu lamela (22x22mm);

59
 Am sigilat lama cu Fixogum Rubber Cement -Kreatech:
 Am incubat peste noapte în camera umedă de hibridizare la 370C (termostat).
5. Spalări post -hibridizare – pentru îndepartarea excesului de sondă
 Am îndepărtat lamela de lamă;
 Am spălat lama în tampon de spălare posthibridizare I (0,4xSSC/0,3% Igepal )
pentru 2 min la temperatura camerei:
 Am spălat lama în tampon de spălare posthibridizare I (0,4xSSC/0,3% Igepal)
pentru 2 min la 72o C fără agitare;
 Am spălat lama în tampon de spălare posthibridizare II (2xSSC/0,1% Igepal)
pentru 1 min la temperaturea c amerei fără agitare;
 Am deshidratat lamele în etanol 70%, 85% și 100% timp de 1 min în fiecare baie;
 Am uscat lamele la temperatura camerei.
6. Evidențierea legării sondă/probă
 Am aplicat 15 l DAPI (4',6 -diamidino -2-phenylindole se atașează la ADN și
relevă semnalul sondei)/Antifade (inhibă pierderea semnalului) și apoi am aplicat
lamela și am eliminat excesul de DAPI
7. Vizualizarea și fotografierea metafazelor: Analizarea preparatelor am efectuat -o la
microscopul cu fluorescență Olympus BX 40 (obiective: 20x -100x), fotografierea fiind
realizată cu camera foto Olympus E -330.

IV.3 METODE DE STUDIU MOLECULARE
Cuantificarea activității telomerazei folosind TRAPeze Kit RT Telomerase Detection Kit:
mod de lucru.
Pentru cuantificarea activității telomerazice, am uti lizat o variantă a metodei TRAP
(Telomeric Repeat Amplification Protocol) cu detecție prin real -time PCR cu kit -ul comercial
TRAPeze (Sigma Aldrich). Principiul metodei se bazează pe extracția enzimei telomerază dintr -un
lizat celular și utilizarea unui su bstrat pe care aceasta poate adaug a repetiții telomerice.
Cuantificarea acestor repetiții adăugate de telomerază se face prin real -time PCR cu primeri
specifici pentru substratul la care telomeraza a adăugat repetițiile.

60
Pentru a cuantifica absolut activi tatea telomerazică, în reacția RT -PCR se generează o
curbă standard cu un număr cunoscut de produși de amplificare generați de o cantitate cunoscută
de telomerază, respectiv 40, 4, 0.4 și 0.04 amoli.
Pentru acest test au fost obținute două probe de sânge p eriferic de la un voluntar; una dintre
probe a fost iradiată cu o doză unică de 2 Gy raze X, după care de la ambele probe au fost izolate
limfocitele care au fost lizate pentru extracția proteinelor totale.
1. Pregătirea probelor
Din sângele venos recoltat pe citrat, am izola t limfocitele în gradient de densitate folosind
Histopaque -1077 (Sigma -Aldrich).
În tuburi de centrifugă am distribui t Histopaque, iar peste acesta am adăugat ușor, pe
perete, sânge (volum la volum) și am centrifuga t. În urma centrifugă rii, a fost vizibil un inel
limfocitar albicios pe care l -am transferat într -un alt tub și l-am spălat cu PBS. Din suspensia de
limfocite în PBS am număr at celulele folosind Trypan Blue și o cameră Bürker -Türk.
2. Obținerea lizatului proteic
Din suspensia celulară, 200 µL (cu o densitate celulară de cel puțin 1,000,000 celule) am
amestec at cu tampon de liză CHAPS și am incuba t pe gheață timp de 30 minute.
3. Prepararea amestecului de reacție
În timpul în care amestecul de celule și tampon de liză a fost incubat, am prepar at
amestecul de reacție pe care l-am pipet at în plăcuța pentru PCR.
Componentele reacției sunt prezentate în tabelul 5 .
Tabel 5. Componentele reacției
Reactiv Volum (pentru o probă)
5X TRAPEZE® RT Reaction Mix 5.0 μL
Taq polimerază (5 unită ți/μL) 0.4 μL (2 unități)
apă pentru PCR 17.6 μL
Probă (probele de analizat, controlul pozitiv, controalele
negative și standardul TSR) 2.0 μL
TOTAL 25 μL

61
În afară de probele de testat, pentru cuantificarea activității telomerazei a fost nevoie de
generarea unei curbe standard, introducând în reacție o serie de 4 diluții zecimale din standardul
TSR existent în kit. Produșii de amplificare generați de cele 4 diluții au o concentrație cunoscută
care corespunde numărului de copii generate de o anumită ca ntitate de enzimă (anume: 40 amoli, 4
amoli, 0.4 amoli și 0.04 amoli). În afară de curba TSR, în reacția PCR am mai introdu s un control
negativ de extracție (proba a fost înlocuită de tampon de liză CHAPS), un control negativ al
reacției (proba a fost înlocuită de apă PCR) și un control pozitiv (un lizat celular cu o cantitate de
enzimă cunoscută, care generează copii echivalent cu 0,004 amoli telomerază). Toate probele
le-am testat în duplicat, iar schema încărcării plăcuței este prezentată în tabelul 6:
Tabel 6. Probe testate
1 2
A TRS 40 amoli Control pozitiv
B TRS 40 amoli Control pozitiv
C TRS 4 amoli Probă neiradiată
D TRS 4 amoli Probă neiradiată
E TRS 0.4 amoli Probă iradiată
F TRS 0.4 amoli Probă iradiată
G TRS 0.04 amoli control negativ ext racție (CHAPS)
H TRS 0.04 amoli control negativ PCR (apă)
4. Programarea aparatului PCR
Pentru experimentul real -time PCR, am configurat aparatul (BioRad CFX96) , experimentul
incluzând parametri i din tabelul 7 :
Tabel 7. Ciclurile reacției PCR
1 ciclu 30°C 30 min
1 ciclu 95°C 2.0 min
45 cicluri 94°C 15 sec
59°C 60 sec
*45°C 10 sec
* temperatura și etapa la care aparatul a făcut achiziția fluorescenței în timp real

62

5. Interpretarea rezultatelor
La încheierea ciclurilor de amplificare, software -ul aparatului a genera t o curbă standard pe
care a m plasa t probele testate.
Orice proba a cărei fluorescență a depășit pragul impus (Ct – cycle treshold) după ciclul 38
(Ct>38), a fost considerată negativă/neamplificată . În situația în care exista curba pe grafi c pentru
o proba, dar valoarea Ct a fost mai mare de 38, am observat că sunt artificii de amplificare (dimeri
de primeri).
În funcție de valoarea Ct a unei anumite probe comparativ cu valoarea Ct obținută pentru
punctele curbei standard și de formula regre siei liniare generate de această curbă, programul
aparatului a putut calcula numărul de copii generate de activitatea telomerazei. Rezultatele
generate de program au fost ajustate în funcție de numărul de celule introdus în reacție de la fiecare
probă.

63
CAPITOLUL V – REZULTATE ȘI DISCUȚII

Evidențierea efectelor radiațiilor ionizante asupra tuturor sistemelor vii la nivel
cromozomal și la nivel genic este deosebit de importantă dovedit fiind faptul că acestea produc
aberații cromozomiale și leziuni în ADN ce sunt corelate atât cu evoluția unor boli de tip benign
sau malign cât și cu îmbătrînirea și senescența (Das și colab., 2009).
Ȋn scopul dezvoltării și optimizării unor teste de dozimetrie biologică utile pentru evaluarea
riscurilor persoanelor exp use profesional la acțiunea radiațiilor ionizante (lucrători în centrale
atomo -electrice, tehnicieni radiologie, etc.), studiul de față și -a propus efectuarea unei baterii
complexe de teste de citogenetică clasică și moleculară combinată cu tehnici molecul are de inaltă
performanță – tehnica TRAPeze. Toate aceste tehnici vizează evidențierea efectelor radițiilor
ionizante X asupra genomului uman, având în vedere faptul ca instabilitatea cromozomială
moștenită sau cea indusă reprezintă o punte fragilă între m ecanismele de integritate genomică și
tumorigeneză (Wright, 1999), telomerele jucând un rol important în ambele procese.
Pentru realizarea testului micronucleilor și a evaluării numărului de cromozomi dicentrici,
s-a realizat iradierea cu doze crescătoare de radiații X a probelor de sânge total provenit de la
voluntari.

V.1 Testul micronucleilor
În urma analizei în triplicat a lamelor obținute pentru cele 4 doze de radiații (50 mGy, 1 Gy,
2 Gy și 4 Gy), s -au calculat următorii parametri:
 Frecvența micron ucleilor:număr total de micronuclei împărțit la număr total de celule
binucleate.
 Frecvența celulelor binucleate cu cel puțin un micronucleu: număr total de celule
binucleate cu cel puțin un micronucleu împărțit la numărul total de celule binucelate.
 NDI ( indexul de diviziune – Nuclear Division Index): suma dintre numărul de celule
mononucleate, numărul de celule binucelate, numărul de celule trinucleate și numărul de
celule tetranucleate, împărțită la numărul total de celule numărate.

64

Figura 19 Micronuclei rezultați în urma iradierii cu doza de 2 Gy (100x)

Rezultatele obținute pentru fiecare doză de iradiere sunt prezentate în tabelul 8.

Tabel 8. Frecvența micronucleilor, frecvența celulelor cu micronuclei și indexul de diviziune (NDI) obți nute pentru
probele testate după iradierea cu diferite doze de raze X
Doza
(Gy) Frecventa MN
(medie triplicate) Frecventacelulelor cu MN
(medie triplicate) NDI
(medie triplicate)
0.5 3.60% 3.30% 2.07
1 4.90% 4.60% 1.72
2 5.70% 5.00% 1.61
4 23.80% 17.00% 1.72

Analizele au stabilit faptul că a aparut o creștere exponențială a numărului și frecvenței
micronucleilor cu creșterea dozei de iradiere (figurile 20 și 21).

65

Figura 20 Reprezentarea grafică a frecvenței micronuceilorla diferite doze iradiere.

Figura 21 Reprezentarea grafică a frecvenței numărului de celule cu micronuclei la diferite doze iradiere.

Aceste observații pot fi utilizate pentru estimarea dozei de radiații la care a fost expus
profesional un individ. Spre exemplu, dacă în urma anal izei micronucleilor, la un individ expus
profesional la radiații ionizante X se identifică o frecvență de 7% a celulelor cu micronuclei, se
poate estima doza de radiații la care acesta a fost expus folosind ecuația curbei exponențiale din

66
figura 21. Astfel conform acestei ecuații (unde y=frecvența celulelor cu micronuclei, x=doza de
radiații) putem deduce că doza de iradiere este de 2,21 Gy.

V.2. Evaluarea numărului de cromozomi dicentrici:
Cromozomi dicentricirezultă prin fuziunea telomerelor cu distruc ții aparținând
cromozomilor omologi sau neomologi și sunt rezultatul clar al instabilității genomice datorată
sensibilității telomerice la acțiunea radiațiilor ionizante (Rudd și colab., 1983) (figura 22).

Figura 2 2 (a, b, c) Cromozomi d icentrici (săgeți) rezultați ȋn urma iradierii cu raze X cu o doză de 2 Gy (100x)

Cromozomii dicentrici reprezintă un bun indicator al gradului de iradiere, în principal când
analizele sunt realizate la scurt timp după expunere (Bauchinger și colab. 1989 ).
În urma analizei în triplicat a lamelor obținute pentru cele 4 doze de radiații (50mGy, 1 Gy,
2 Gy și 4 Gy), am calculat și frecvența cromozomilor dicentrici, ca număr de cromozomi
dicentriciîmpărțit la numărul metafazelor analizate. Rezultatele obținu te sunt prezentat e în tabelul
9.

a
b
c

67
Tabel nr. 9 Frecvența cromozomilor dicentrici obținută pentru probele testate după iradierea
cu diferite doze de raze X
Doza (Gy) Frecvența dicentricilor
(medie triplicate)
0.5 0.01%
1 0.02%
2 0.05%
4 0.2%

Figu ra 23 Reprezentarea grafică a numărului de cromozomi dicentrici la diferite doze iradiere

Similar testului micronucleilor, observațiile pot fi utilizate pentru estimarea dozei de
radiații la care a fost supus un potențial individ expus profesional folos ind ecuația curbei
exponențiale din figura 23.
De luat în calcul este și faptul că numărul de micronuclei, precum și cel de anomalii
cromozomiale (precum cromozomii dicentrici), este influențat de vârstă. Astfel, la estimarea dozei
biologice de radiații sa u a altor agenți mutageni trebuie aplicată o corecție în funcției de vârsta
individului testat.

68
V.3. Evidențierea telomerelor și a telomerazei prin tehnica FISH
Radiațiile ionizante produc leziuni ADN atât în mod direct, interacționând cu structura
moleculară a ADN (generând de cele mai multe ori leziuni dublucatenare), cât și în mod indirect –
prin generarea de specii reactive de oxigen, azot, etc. (generând mai adesea leziuni monocatenare).
Aceste leziuni pot afecta structura telomerelor (ex. ruperea t elomerelor cu formarea de cromozomi
inelari), însă pot afecta și reglajul și expresia unor gene, inclusiv a telomerazei.
Scopul acestei părți a studiului a fost de a evidenția prezența telomerelor și a telomerazei în
limfocite umane expuse la radiații ioni zante (doză unică de 2 Gy raze X) vs. limfocite umane
normale utilizand tehnica de hibridizare fluorescentă in situ (FISH).

Evidențierea telomerelor prin tehnica FISH
Preparatele FISH din limfocite umane normale și iradiate au fost realizate folosind o
sondă PNA pentru telomere marcată cu Cy3 (DAKO). Acestea au fost analizate prin microscopie
de fluorescență, iar metafazele (20 de metafaze / preparat) au fost prelucrate și analizate utilizând
programul MetaSystems Isis – modulul pentru telomere.
În urma a nalizei la microscopul cu fluorescență s -a identificat prezența semnalului
fluorescent în condiții normale la aproximativ 98% din metafaze (2 semnale/cromatidă – 4
semnale/cromozom).
La doza iradiere cu radiații X de 2 Gy , s -a observat, prin tehnica FISH faptul că în cazul
unor restructurări cromozomiale de tipul interschimburilor, cromozomilor inelari sau dicentrici
semnalul telomeric fluorescent este absent la nivelul capetelor cromozmale implicate în structurile
aberante respective (fig ura 24).
În af ară de modificări ale prezenței telomerelor, la celulele iradiate am observat
aneuploidii, cromozomi dicentrici și inelari precum și interschimburi complexe (figura 24).

69

Figura 24 Evidențierea telomerelor din cromozomi metafazici; s ondă marcată cu Cy3 și contracolorare cu
DAPI a. Metafază normală; b. Aneuploidie (<46 cromozomi); c. Cromozomi inelari și semnale slab pentru
telomere; d) Cromozomi dicentrici și semnale slabe pentru telomere , e) Interschimburi cromozomale (absența
semna lelor telomerice în zonele de fuziune cromozomală) (100x)

Rezultatele obținute pot fi corelate cu alte studii din literatura de specialitate în care, prin
FISH, a fost detectată variabilitatea semnalului de hidribizare la nivelul telomerelor ce nu aveau
secvențe detectabile la nivelul joncțiunilor cap la cap realizate în vederea asocierii (Sabatier și
colab., 1994). Cercetări similare, din anul 2000 au relevat prezența interschimburilor complexe
complete sau incomplete apărute între cromozomi în urma irad ierii limfocitelor cu raze X (doză de
4 Gy) concomitent cu perturbarea semnalului fluorescent la nivel telomeric (Fomina și colab.,
2000).
e)

70
În concluzie, tehnica FISH permite decelarea prezenței/absenței semnalului de tip telomeric.
Utilizand soft -uri spe cifice este posibilă totodată pe imaginle respective și cuantificarea efectivă a
numărului de repetiții telomerice.
Având în vedere că variația numărului de repetiții telomerice este esențială pentru estimarea
disfuncționalităților la nivel telomeric, se impune aplicarea unor tehnici moleculare de ultimă
generație (TRAPEZE), adecvate pentru estimarea acestui parametru.

Evidențierea componentelor telomerazei prin tehnica FISH
Telomeraza reprezintă una dintre enzimele de bază implicate în menținerea număru lui de
repetiții telomerice în condiții normale cât și în cadrul procesului de reparare ADN, enzimă ce s -a
dovedit frecvent supraexprimată în urma expunerii la radiații ionizante (Ayouaz și colab., 2008).
Acest studiu a urmărit evidențierea la nivel crom ozomial prin tehnica FISH a genelor pentru
componentele telomerazei în limfocitele normale și în cele iradiate. Atât pentru evidențierea
componenței ARN a telomerazei cât și a componentei polipeptidice s -au utilizat sonde duble
(figura 25).

a b
Figura 25 Evidențierea prin FISH a componentei a) hTERC (3q26) / 3q11, marcare Cy5 (sonda Kreatech), b)
hTERT (5p15)/ /5q31, marcare Cy5 (sonda Kreatech) (100x) b

71
Deși in literatura de specialitate amplificarea genelor componentelor telomerazei ev idențiată
prin tehnica FISH a fost corelată cu diferite tipuri de cancere (Zhu C -Q, 2006; Bièche I, 2000) și
există la ora actuală disponibile pe piață numeroase protocoale de detectare a numărului de copii
ale genelor componentelor hTERC și hTERT prin FIS H (https://www.questdiagnostics.com;
http://www. kreatech.com etc.), în cazul studiului de față ca reacție post iradiere în limfocitele
analizate nu a fost evidențiată prin FISH apariția de semnale suplimentare pentru nici una dintre
componente. Este posib il ca doza maximă de iradiere l -a care s -a lucrat să nu fie suficient de
puternică pentru a determina apariția amplificării genice, studiile din literatură mergand cu dozele
de iradiere pană spre 5Gy.
Totuși, în urma analizei imaginlor obținute prin FISH pe leucocitele normale, putem
concluziona că tehnica FISH se dovedește a fi fezabilă pentru a fi utilizată cu încredere în vederea
identificării și localizării cromozomale atât a hTERC cât și a hTERT. Ulterior analizele de
citogenetică moleculară vor fi c onfirmate/aprofundate prin tehnica TRAPeze de cuantificare a
expresiei telomerazei.

V. 4. Cuantificarea activității telomerazei din limfocitele umane neiradiate cât și din cele
expunese la radiații ionizante X
Pentru cuantificarea activității telomerazice , am utilizat o variantă a tehnicii TRAP
(TelomericRepeatAmplification Protocol) cu detecție prin real -time PCR (kit -ul comercial
TRAPezeTM, de la firma Sigma Aldrich).
Principiul metodei include extracția telomerazei dintr -un lizat celular și utilizarea unui
substrat pe care aceasta poate adaugă repetiții telomerice.
Cuantificarea acestor repetiții adăugate de telomerază se face prin real -time PCR cu
primeri specifici pentru substratul la care telomeraza a adăugat repetițiile. Pentru a cuantifica
absolut activitateatelomerazică, în reacția re RT -PCR se generează o curbă standard cu un număr
cunoscut de produși de amplificare generați de o cantitate cunoscută de telomerază, respectiv 40,
4, 0.4 și 0.04 nmoli (figura 26) .
Pentru acest test au fost obținute d ouă probe de sânge periferic de la un voluntar; una dintre
probe a fost iradiată cu o doză unică de 2 Gy raze X, după care din ambele probe au fost izolate
limfocitele care au fost lizate pentru extracția proteinelor totale.

72
În urma testării s -a determinat o creștere a activității telomerazei de la valoare de 159.7
(limfocite control) la 567.2 în urma iradierii cu o doză unică a 2 Gy (figura 26).

Figura 26 Cuantificarea activității telomerazei prin tehnica TRAPeze. a. Curba standard; b. Curbele obținute
pentru standarde și probele testate înduplicat; c. Rezultatele obținute – cuantificarea absolută a numărului de copii de
repetiții telomerice .

La ora actuală testarea activității telomerazei se realizază ca un tot unitar, necorelând -o
specific cu supraexp rimarea vreuneia dintre componente, testul de bază utilizat fiind TRAPeze.

73
În studiul de fată, tehnica TRAPeze a permis pe de o parte evidențierea unui nivel bazal al
exprimării telomerazei în celule limfocitare umane normale, dar mai ales, apariția unei reactivări
specifice a enzimei în urma iradierii cu radiații ionizante X cee ace constituie elemente de reflexie
pentru calcularea rapoartelor beneficiu/risc în cazul iradierii terapeutice și nu numai.
Rezultatele prezentei lucrări se corelează cu datele din literatura de specialitate ce sustin
pentru toate varintele de experimente o creștere a activității telomerazice post iradiere.
Astfel, un studiu realizat de echipa lui Neuhof D. în 2001 evidențiază faptul că la doză de 4
Gy celulele au o activitate t elomerazică crescută de 2,5 ori, activitate ce începe să se crească la
jumătate de oră după iradiere și atinge maximul la 24 h postiradiere. În acest caz activitatea
telomerazică crescută se corelază cu o creștere a lungimii telomerelor din celulele iradia te la 14
zile după expunere (Neuhof și colab., 2001).
Studii similare realizate de Leteurtre F., în 1997; Perez în anul 2002 au corelat creșterea
activității telomerazei dependent de doza de iradiere cu implicarea acesteia în procesele reparatorii
și ref acerea cromozomală în celulele hematopoetice în cazul iradierilor cu doze cuprinse între 0.5
și 5 Gy.
Echipa lui Hyeon a dovedit și ea, lucrând însă direct pe celule tumorale, că după iradierea cu
radiații X la doză de 4 Gy se observă o creștere a activită ții telomerazice la 24 h post iradiere de 3
până la 7 ori (Hyeon și colab., 1998).
Este esențial de urmărit, atât în cazul iradierii terapeutice cât și al expunerilor profesionale,
pana la ce nivel are loc această amplificare a activității telomerazice ș i de determinat dacă această
activare indusă generează o imortalizare a celulelor afectate, ce conduce la apariția de procese
cancerigene și de la ce nivel al amplificarii apar aceste efecte.

74
V.I CONCLUZII

 Analizele de citogenetică clasică au evidenț iat faptul că creșterea dozei de radiații X
administrate determină o creștere exponențială a numărului și frecvenței micronucleilor și
a cromozomilor dicentrici.
 Atât testul micronucleilor cât și cuantificarea cromozomilor dicentrici evidențiază efectul
clastogen al radiațiilor ionizante X și permint estimări ale dozei de radiații la care a fost
expus profesional un individ folosind ecuația curbei exponențiale.
 Tehnica FISH a permis evidențierea semnalului fluorescent atât la nivel telomeric cât și
pentru componentele telomerazei în toate metafazele analizate provenind din limfocite
neiradiate.
 Analiza telomerelor prin FISH a evidențiat, în cazul probelor irradiate, absența semnalului
repetitiv la nivel terminal în cromozomi, atât în cazul unor restructură ri cromozomiale de
tipul cromozomilor inelari sau dicentrici cât și în cazul interschimburilor complexe.
 Utilizarea sondelor marcate fluorescent a evidențiat și localizat pe cromozomi cele două
componente telomerazice după cum urmează: hTERC pe 3q și respe ctiv hTERT pe 5p atât
în cazul probelor control cât și în cele iradiate.
 Componentele telomerazei evidențiate prin FISH nu s -au dovedit a suferi amplificare
genică la doza maximă de iradiere de 2 Gy.
 Tehnica TRAPeze a evidențiat existența unui nivel baza l al exprimării telomerazei în
celule limfocitare umane normale, dar mai ales, apariția unei reactivări specifice a enzimei
în urma iradierii cu radiații ionizante X, date ce s -au dovedit conforme cu cele din literatura
de specialitate.

PERSPECTIVE

 Eviden țierea efect ulu radiații lor ionizante X cu doze mai marei decat 2 Gy asupra
genomului uman
 Cuantificarea a ctivității telomerazei prin reacții de RT-qPCR independente pentru fiecare
genă codificatoare a component elor sale (hTERC și hTERT ).

75

BIBLIOGRAFIE

1. Abreu E., Aritonvska E., Reichenbach P., Cristofori G., Culp B., Terns R. M., Lingner J.,
Terns M. P., 2010 TIN2 -tethered TPP1 recruits human telomerase to telomeres in vivo
Mol. Cell. Biol. 2971 -2982.
2. Aisner D. L., Wright W. E., Shay J. W., 2002 Telomerase regulation: not just flipping the
switch . Curr Opin Genet Dev 12: 80 -85.
3. Amann R., Fuchs B. M. and Behrens S., 2008 The Identification of Microorganisms by
Fluorescence in Situ Hybridisation Nat Rev Microbiol , 6(5):339 -48. doi:
10.1038/nrmi cro1888. PMID: 18414500
4. Andreassen C. N., Barnett G. C., Langendijk J. A. et al., 2012 Conducting Radiogenomic
Researc :Do Not Forget Careful Consideration of the Clinical Data , 105(3), 337 -340.
5. Anellis A., 1961 Radioresistance of Pseudomos species isolated from the Omega West
Reactor . Radiant. Res , 194:158 -60. doi: 10.1038/194158a0.
6. Aragona M., Maisano R., Panetta S., Guidice A., Morelli M., La Torre I. and la Torre F.,
2000 Telomere Length Maintenance in Aging and Carcinogenesis , International journal of
oncology, 17: 981 -989
7. Ayouaz A., Raynaud C., Heride C., Revoud D. and Sabatier L., 2008, Telomeres:
Hallmarks of Radiosensitivity, Biochimie , 90(1):60 -72.
8. Baird DM. Telomeres and genomic evolution. Philos Trans R Soc Lond B ,Biol Sci.
2018;373(1741):20160437. doi:10.1098/rstb.2016.0437
9. Baliveau B. J., Joyce E. F., Apostolopoulos N., Yilmaz F., Fonseka C. Y., McCole R. B.,
Chang Y., Li J. B., Senaratne T. N., Williams B. R., Rouillard J. M. and Wu C. T., 2012
Versatile Design and Synthesis Platform for Visualiz ing Genomes With Oligopaint FISH
Probes , 109(52):21301 -6. doi: 10.1073/pnas.1213818110.
10. Bauchinger M., Huber R., Schraube H., Nahrsted H and Braselmann H., Dose -response
relationships of micronuclei in human lymphocytes induced by fission neutrons and by l ow
LET radiations, Mutation research, 135-141.

76
11. Bayani J. and Squire J. A., 2004 Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) , Chapter
22:Unit 22.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2204s23.
12. H. Becquerel Influence d'un champ magnétique sur le rayonnement des corps radi o-actifs ,
C. R. hebd. Séanc. Acad. Sci. Paris , 129 (1899), pp. 996-1001
13. Bernhard E. J., Maity A., Muschel R. J., McKenna W. G., 1995 Effects of Ionizing
Radiation on Cell Cycle Progression. A Rev. Radiant Environ Biophys , PMID:
7652155 DOI: 10.1007/BF01275210
14. Berardinelli F., Nieri D., Sgura A., Tanzerella C and Antoccia A., 2012 Telomere Loss,
Not Average Telomere Length, Confers Radiosensitivity to TK6 -irradiated Cells ,Mutation
research, PMID: 23220250 DOI: 10.1016
15. Bièche I., Noguès C. , Paradis V. , Olivi M. , Bedossa P., Lidereau R., Vidaud M., 2000,
Quantitation of hTERT gene expression in sporadic breast tumors with a real -time reverse
transcription -polymerase chain reaction assay . Clin. Cancer Res. , 6(2): 452 -9.
16. Blackburn E. H. and Szostak J. W., 1984 The Molecular Structure of Centromeres And
Telomeres , Nature, 53:94 -163.
17. Blackburn E. H. , Structure and Function of Telomeres, Nature, 569-573,569–573(1991)
18. Blasco M. A. and Martinez P., 2010 Telomere -driven diseases and telomere -targeting
therapies in: The Journal of Cell Biology , PMCID: PMC5379954 DOI: 10.1083
19. Bouffler S. D., Blasco M. A., Cox R., and Smith P. J., 2001 Telomeric Sequences,
Radiation Sens itivity and Genomic Instability ,The international journal of radiation
biology, 77(10):995 -1005.
20. Brown et al., 1990 Advances in Genetics ,(Cambridge, Mass) , 63, 119 -132.
21. Bryce L. A., Morrison N., Hoare S. F., Muir S. and Keith W. N., 2000 Mapping of the gene
for the human reverse transcriptase, hTERT, to chromosome 5p15.3 by fluorescence in situ
hybridization , Neoplasia, 197–201.
22. Canela A., Vera E., Klatt P., Blasco M. A., 2007 High -throughput Telomere Length
Quantification by FISH and Its Application to Huma n Population Studies , Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA, 104 (13) 5300 -5305.
23. Castella M., Puerto S., Creus A., Marcos R. and Surralles J., 2007 Telomere Length
Modulates Human Radiation Sensitivity in Vitro ,Toxicology letters, 172(1-2):29 -36.

77
24. Centre for Radiobiology and Biological Dosimetry, Institute of Nuclear Chemistry and
Technology, Dorodna 16, 03 -195 Warszawa, Poland.
25. Chen et al., 2000 , Cloning and Characterization of a Novel Nuclear Bcl -2 Family Protein,
zfMcl -1a, in Zebrafis h Embryo, Biochemical and Biophysical Research Communications
279(2): 725 -731.
26. Coman, N., Dordea Manuela – Genetică, îndrumător de lucrări practice , Tip. Univ.
Babeș -Bolyai, Cluj -Napoca, 1991 .
27. Cong Y. S., Wright E. W. and Shay J. W., 2002 Human Telomerase a nd Its Regulation ,
Microbiology and molecular biology reviewers, 66(3):407 -25.
28. Das C. A., Lucia M. S., Hansen K. C. and Tyler J. K., 2009, CBP /p300-mediated
acetylation of histone H 3 on lysine 56 , Nature. 459, 113 -117.
29. Decordier I., Kirsch -Volders M., 2013 Fluorescence in Situ Hybridization (FISH)
Technique for the Micronucleus Test, Methods In Molecular Biology (Methods and
Protocols), vol 1044. Humana Press, Totowa, NJ.
30. Diotti R. & Loayza D., 2011. Shelterin complex associated factors at human telomeres .
Nucleus 119 -135.
31. Dianov G. L. and Parsons J. L., 2007 Co -ordination of DNA Single Strand Break Repair ,
Free Radic Biol Med , 107:228 -244.
32. Estandarte A. C. K., 2012 Staining Strategies for Imaging of Metaphase Chromosomes
Department of Chemistry University Co llege London University of London.
33. Fernet M. and Hall J., 2004 Genetic Biomarkers of Therapeutic Radiation Sensitivity ,DNA
repair, 3(8-9):1237 -43.
34. Fomina J., Darroudi F., Boie J. W. A. and Natarajan A. T., 2000, Discrimination between
complete and incomplet e chromosome exchanges in X irradiated human lymphocytes
using FISH with pan -centromeric and chromosome specific DNA probes in combination
with telomeric dna probe, Int. J Radiant Biol, 76:807 -813.
35. Friedman K. L. and Cech T. R., 1999 Telomerases: Chemistr y, Biology, and Clinical
Applications ,University of California at Berkeley, Berkeley, CA 94720 -3200, USA.
36. Gadbois M. D., Crissman H. A., Nastai A., Habbersett R. et al., 1996 Alterations in the
progression of cells through the cell cycle after exposure to alpha particles or gamma rays ,
The international journal of radiation biology, 94(11):1049 -1053.

78
37. Ganesca A., Martin M., Latre L., Soler D., Pampolona J. and Tusell L., 2006 Telomere
Dysfunction:A New Player in Radiation Sensitivity ,3(9): 889 –895.
38. Gavrilă L., Timus D., Radu I., Usurelu D., Manaila E., 2005, The reactivity of plant,
murine and human gonome to electron beam irradiation . Arab. J. Nucl. Sci. Appl.,
38:713 -722.
39. Gozzetti A, Le Beau MM (2000) Fluorescence in situ hybridization: uses and limitation s.
Semin Hematol 37:320 –333.
40. Goodshell D. S., 2001 The oncologist 6: 298 -299.
41. Gorbunova V., Seluanov A. and Pereira Smith O. M., 2003 Evidence That High
Telomerase Activity May Induce a Senescent -Like Growth Arrest in Human Fibroblasts ,J
Biol Chem , 28;278( 9):7692 -8.
42. Greider C. W., Blackburn E. H . Identification of a specific telomere terminal transferase
activity in Tetrahymean extracts , 198 7, Cell, 43(2 Pt 1):405 -13.
43. Hande M. P., Azizova T. V., Burat L. E., Khokhrykov V. F., Geard C. R. and Brenner D. J.,
2005 Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after
occupational exposure to densely ionizing radiation: An mFISH study , Genes
Chromosomes Cance , 44(1):1 -9.
44. Hansen M. T., 1978 Multiplicity of Genome Equivalents in the Radiation -Resis tant
Bacterium Micrococcus Radiodurans, J Bacteriol , 134(1):71 -5.
45. Hayashi M., 2016 The Micronucleus Test -Most Widely Used in vivo Genotoxicity Test,
1:38:18 .
46. Hayflick L. and Moorhead P. S., 1961 The Serial Cultivation of Human Diploid Cell
Strains , Experime ntal cell research, 25:585 -621.
47. Henle E. S., Han Z., Tang N., Rai P., Lou Y. and Linn S., 1999 Sequence -specific DNA
Cleavage by Fe2+ -mediated Fenton Reactions Has Possible Biological Implications , The
Journal of biological chemistry, 274(2):962 -71.
48. Hyeon J. O ., Hande M.P ., Lansdorp P.M ., Natarajan A.T ., 1998, Induction oftelomerase
activity and chromosome aberrations in human tumour cell lines following X -irradiation.
Mutat. Res. , 401(1 -2): 121 -31.
49. Holt SE, Aisner DL, Bau r J, et al. Functional requirement of p23 and hsp90 in telomerase
complexes. Genes Dev. 1999a;13:817 –26.

79
50. Jackson -Cook et al., 2015.
51. Jansen E., 2014 Technical Review: In Situ Hybridization , Anatomical record ,
297(8):1349 -53.
52. Kibe T., Kaori K. T., Donigian J . R., Frescos D. and De Lange T.,2010 Telomere
protection by TPP1/POT1 requires tethering to TIN2 , Molecular cell, 44(4):647 -59.
53. Kilian A., Bowtell D. D., Abud H. E., Hime G. R., Venter D. J., Keese P. K., Duncan E. L.,
Reddel R. R. and Jefferson R. A., 199 7 Hum. Mol. Genet . 6: 2011 -2019.
54. Kim S. et al., 1994 Cystosolic chaperonin subunits have a conserved ATPase domain but
diverged polypeptide -binding domains . Trends Biochem Sci 19(12):543 -8.
55. Kovalenko O., Kaplunov J., Herbig U., Detoledo S., Azzam E. and Sa ntos J. H.,
2010Expression of (NES -)hTERTin Cancer Cells Delays Cell Cycle Progression and
Increases Sensitivity to Genotoxic Stress , PloS one, 5(5):e10812.
56. Kudryaskov Y. B., 2008 Radiation Biophysics, Nova Science Publishers , Inc New York .
57. Latre L., Tusell L., Martin M., Miro R., Egozcure J., Blasco M. and Ganesca A., 2003
Shortened Telomeres Join to DNA Breaks Interfering With Their Correct Repair Exp. Cell.
Res.,287, 282 —288.
58. Leteurtre F ., Li X., Gluckman E ., Carosella E.D ., 1997, Telomerase activity during the cell
cycle and in gamma -irradiated hematopoietic cells. Leukemia , 11(10):1681 -1689.
59. Lewis K. A. and Wuttke D. S., 2012 Telomerase and telomere -associated proteins:
Structural insights into mechanism and evolution.
60. Li P., Hou M., Fe nglan L., Bjorkholm M. and Xu D., 2012 Telomere Dysfunction Induced
by Chemotherapeutic Agents and Radiation in Normal Human Cells ,The international
journal of biochemistry and cell biology, 44(9):1531 -40.
61. Liu X., Dakic A., Zhang Y., Dai Y., Chen R. and Sc hlegel R., 2000 HPV E6 protein
interacts physically and functionally with the cellular telomerase complex , Preceeding of
the National Academy of Sciences of the USA , 106(44):18780 -5.
62. Linger J., Hughes T. R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V. and Cech T. R., 1997
Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase Science , Science,
276(5312):561 -7.
63. Little J., 1968 Cellular Effects of Ionizing Radiation, The New England journal of
medicine, 278(7):369 -76 concl.

80
64. Little J., 1970 Irradiation of primary human amnion cell culture: Effect of DNA synthesis
and progression through the cell cycle , Radiant. Res earch, 44(3):674 -99.
65. Makarov V. L., Hirose Y. and Lanymore J. P., 1997 . Long G Tails at Both Ends of Human
Chromosomes Suggest a C Strand Degradat ion Mechanism for Telomere Shortening
66. Cell, 88, 657 -666.
67. McClentock B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mais . Genetics ,
26(2):234 -82.
68. Moriarty T. J., Ryan J. W., Taboski A. S. and Autexier C., 2002 An Anchor Site –Type
Defect in Human Telo merase That Disrupts Telomere Length Maintenance and Cellular
Immortalization , Molecular biology of the cell , 16(7):3152 -61.
69. Muller H. S. , 1938 The remaking of chromosomes , Collecting Net 8: 182 –198.
70. Muller H. S. , Herkowitz I. H. Concerning the healing of chromosomes ends produced by
breakeage in Drosophilla melanogaster . Amer Nat 88; 177 -208.
71. Nakamura, T.M., G.B. Morin, K.B. Chapman, S.L. Weinrich, W.H. Andrews, J. Lingner,
C.B. Harley, and T.R. Cech. 1997. Telomerase catalytic subunit homologs from fissio n
yeast and human . Science 277: 955 –959.
72. Nandakumar J. and Cech T. R., 2013 Finding the End: Recruitment of Telomerase to
Telomeres , Nature reviews. Molecular cell biology , 14(2):69 -82.
73. Nakayama J, Saito M, Nakamura H, Matsuura A, Ishikawa F. TLP1: A gene encoding a
protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family.
Cell. 1997;88:875 –884.
74. Neuhof D., Ruess A., Wenz F., Weber K.J., 2001, Induction of Telomerase Activity by
Irradiation in Human Lymphoblasts . Radiat. Res ., 155(5): 693-697.
75. Neumann and Reddel, 2002 , Telomere Maintenance and Cancer , Nature reviews. Cancer ,
2(11):879 -84.
76. Nicolette J., 2017 A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug
Development , International Journal of Toxicilogy , 36(5):410 -411.
77. Nieri D., Berardinelli F., Sgura A., Cherubini R., De Nadal V., Gerardi S., Tanzarella C.
and Antoccia A., 2013 Cyogenetics Effects in AG01522 Human Primary Fibroblasts
Exposed to Low Doses of Radiations With Different Quality , International journal of
radiation biology , 89(9):698 -707.

81
78. O’Connor M. S., Safori A. Xin H., Liu D. and Songyang Z., 2006 A critical role for TPP1
and TIN2 interaction in high order telomeric complex assembly , Proceedings of the
Nationa l Academy of Sciences of the USA , 103(32):11874 -9.
79. Oncescu și Panaitescu, 1992 , Dozimetria și ecranarea radiațiilor Roentgen și Gamma.
80. Opresko P. L., Fan J., Danzy S., Wilson D. M. and Bohr V. A., 2005 Oxidative Damage in
Telomeric DNA Disrupts Recognition by TRF1 and TRF2 , Nucleic a cids research ,
33(4):1230 -9.
81. 80.Perez M., Dubner D., Michelin S., Leteurtre F., 2002, Radiation -induced up -regulation
of telomerase in KG1a cells is influenced by dose -rate and radiation quality . Int. J. Radiat.
Biol., 78(12): 1175 -83.
82. Philip C. Haycock et al. , 2017 Association Between Telomere Length and Risk of Cancer
and Non -Neoplastic Dise ases, JAMA Oncology , 3(5):636 -651.
83. Pirzio L. M., Freulet -Marriere M. A., Bai Y., Fouladi B., Murnane J. P., Sabatier L. and
Desmaze C., 2004 Human Fibroblasts Expressing hTERT Show Remarkable Karyotype
Stability Even After Exposure to Ionizing Radiation , Cytogenetic and genome research,
104(1 -4):87 -94.
84. Pommier J. P., Lebeau J., Ducray C. and Sabatier L., 1995 Chromosomal Instability and
Alteration of Telomere Repeat Sequences , Biochimie, 77(10):817 -25.
85. Rajeshwar P. Sinhaa and Donat -P. Häder, 2002 , UV -induced DNA Damage and Repair,
Photochemical and photobiological sciences, 1(4):225 -36.
86. Ratan Z. A., Zaman S. B., Mehta V., Haidere M. F., Runa N. J. and Akter N., 2017
Application of Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Technique for the Detection of
Geneti c Aberration in Medical Science , Cucerus, 9(6):e1325.
87. Rubio M., Kim S. H. and Campisi J., 2002 Reversible Manipulation of Telomerase
Expression and Telomere Length. Implications for the Ionizing Radiation Response and
Replicative Senescence of Human Cells , The Journal of biochemistry, 277(32):28609 -17.
88. Rufer N. et al. Telomere lemgh dynamics in human lymphocyte subpopulation massurated
by flow cytometry , Nat. Biotehnol ., 1998 , Nature biotehnology, 16(8):743 -7.
89. Ryan, 2012 Ionizing radiation: The Good, the Ba d amd the Ugly, in: Journal of
Investigative Dermatology , The Journal of investigative dermatology, 132(3 Pt 2):985 -93.

82
90. Serra V., Zglinicki T., Lorenz M. and Saretzki G., 2003 Extracellular Superoxide
Dismutase Is a Major Antioxidant in Human Fibroblasts a nd Slows Telomere Shortening ,
The Journal of biological chemistry, 278(9):6824 -30.
91. Sfeir A., 2012 Telomeres at a glance. Journal of Cell Science , 125(Pt 18):4173 -8.
92. Swanson P., 1979 Improved calculation of photoneutron yields released by incident
electrons , Health physics, 37(3):347 -58.
93. Szalai V. A., Singer M. J. and Throp H. H., 2002 Site -Specific Probing of Oxidative
Reactivity and Telomerase Function Using 7,8 -Dihydro -8-oxoguanine in Telomeric DNA ,
Journal of the American Chemical Society, 124(8):1625 -31.
94. Takakura M, Kyo S, et al. Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene
promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for
transcriptional activation in immortalized and cancer cells . Cancer Res . 1999;59(3):551 -7.
95. Thierens H. M., Touli N., Elhajouji A. And Kirsch -Volders M., 2000 Analysis of
chromosome loss and chromosome segregation in cytokinesis -blocked human
lymphocytes: Non -disjunction is the prevalent mistake in chromosome segregation
produced by low dose expo sure to ionizing radiation , Mutagenesis, 15(1):1 -7.
96. Tchirkov A. and lansdrop P. M., 2003 , Role of Oxidative Stress in Telomere Shortening in
Cultured Fibroblasts From Normal Individuals and Patients With Ataxia -Telangiectasia,
Human molecular genetics, 12(3):227 -32.
97. Vega M., Salas M., Holguera I., 2003 DNA -Binding Proteins Essential for Protein -Primed
Bacteriophage φ 29 DNA replication , Frontines in molecular biosciences, 3:37.
98. Vera E., Bernardes de Jessus B., Foronda M., Flores J. M. and Blasco A. M., 2012 The
Rate of Increase of Short Telomeres Predicts Longevity in Mammals , Cell reports,
2(4):732 -7.
99. Vermeesch J. R. and Price C. M., 1994 Telomeric DNA sequence and structure following
de novo telomere synthesis in Euplates crassus , Mol. Cell. Biol . 14: 554 -566.
100. Volpi E. and Bridger J. M., 2008 FISH Glossary: An Overview of the Fluorescence in
Situ Hybridization Technique , Bio Techniques, 45(4):385 -6, 388, 390
101. Vosa C. G., 1995 The use of Giemsa and other staining techniques in karyotype analysis ,
Curr. Adv. P lant. Sci , 6:495 -510.

83
102. Xia, J., Peng, Y., Mian, S. & Lue, N.F. Identification of Functionally Important Domains in
the N -terminal Region of Telomerase Reverse Transcriptase Mol. Cell. Biol. 20, 5196 –5207
(2000).
103. Yi X., White D. M., Aisner D. L., Baur J. A., wright W. E. and Shay J. W., 1999 An Alternate
Splicing Variant of the Human Telomerase Catalytic Subunit Inhibits Telomerase
Activity ,Neoplasia , 2(5):433 -40.
104. Zakian, 1996 ,Cell, Aging and Human Disease , Science, 270(5242):1601 -7.
105. Zhou X., Xue Y., Zhu B. an d Sha J., 2010 Effects of Metformin on Proliferation of Human
Colon CarcinomaCell Line SW-480.
106. Zijlmans M., Martens V. M., Poon S. and Raap A. K., 1997 Telomeres in the mouse have
large inter -chromosomal variations in the number of T2AG3 repeats , Proceedi ngs of the
National Academy of Sciences of the USA, 94(14): 7423 –7428.
107. Zglinicki T., 2002 Oxidative Stress Shortens Telomeres , Trends in biochemical sciences,
27(7):339 -44.
108. Zhu C -Q., Cutz J -C., Liu N., Lau D., Shepherd F.A., Squire J.A., Tsao M -S., 2006,
Amplification of telomerase (hTERT) gene is a poor prognostic marker in non -small -cell lung
cancer. Br. J. Cancer ., 94(10): 1452 –1459.
109. Wesbuer S., Lanvers -Kaminsky C., Duran -Seuberth I., Bolling T., Ludwing -Schafer K.,
Braun Y., Wullich N. and Greve B., 20 10 Association of Telomerase Activity With Radio –
And Chemosensitivity of Neuroblastomas Radiation Oncology , Radiation oncology, 5:66.
110. Wooddring E. Wright, 1995 Telomerase activity in human germline and embryonic tissues
and cells , Developmental genetics, 18(2):173 -9.
111. https://en.wikipedia.org/wiki/Alpha_particle.
112. http://www.abnova.com/support/resources.asp?switchfunctionid={B4285500 -DB85 -435D –
BE02 -2BF420D5C70D.
113. https://opentextbc.ca/chemistry/chapter/21 -6-biological -effects -of-radiation.
114. https://en.wikipedi a.org/wiki/Neutron_radiation.
115. https://en.wikipedia.org/wiki/Beta_decay .
116. https://en.wikipedia.org/wiki/Electron .
117. https://www.questdiagnostics.com ;
118. http://www. kreatech.com

84
119. .https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray#:~:text=A%20gamma%20ray%2C%2
0or%20gamma,imparts%20the%20highest%20photon%20energy.
120. .https://en.wikipedia.org/wiki/Radiation#:~:text=particle%20radiation%2C%20su
ch%20as%20alpha,on%20a%20ph ysical%20transmission%20medium).
121. https://en.wikipedia.org/wiki/Roentgen_(unit).
122. https://ro.wikipedia.org/wiki/Radia%C8%9Bie.
123. https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_situ_hybridization.
124. https://www.researchgate.net/figure/Examples -of-different -types -of-fluorescence –
in-situ-hybridisation -FISH -probes -a_fig1_9035148.
125. https://www.intechopen.com/books/telomere -a-complex -end-of-a-chromosome/th
e-role-of-telomeres -and-telomere -associated -proteins -as-components -of-interactome -in-c
ell-signalin.
126. https://en.wikipe dia.org/wiki/Micronucleus_test.
127. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/21748.
128. https://www.cdc.gov/nceh/radiation/nonionizing_radiation.html.
129. https://ro.wikipedia.org/wiki/Radia%C8%9Bie.
130. https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma_ray.
131. https://en.wikipedia.org/wiki/Telom ere.
132. https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase.
133. https://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase_RNA_component#:~:text=Telomerase
%20RNA%20component%2C%20also%20known,(reverse%20transcription)%20by%20t
elomerase.
134. https://ro.wikipedia.org/wiki/Radia%C8%9Bie_X.
135. https:/ /en.wikipedia.org/wiki/Ionizing_radiation.
136. https://www.phys.uaic.ro/wp/scoala -doctorala/sustineri -teze-doctorat/focea -ghioc –
ramona/focea -ghioc -ramona -rezumat -teza-doctorat.pdf.