Master de Genetica Aplicata si Biotehnologie [306989]

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

Facultatea de Biologie

Master de Genetica Aplicata si Biotehnologie

DIZERTATIE DE MASTER

Coordonator stiintific                                              Masterand: [anonimizat] 2016

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

Facultatea de Biologie

Master de Genetica Aplicata si Biotehnologie

Polimorfisme genetice utile in managementul sarcinii.

Mutatia factorului V Leiden,[anonimizat] (C677T si A1890C), PAI-1, Factorul XIII.

DIZERTATIE DE MASTER

Coordonator stiintific                                              Masterand: [anonimizat] 2016

CUPRINS

Introducere (importanța și actualitatea temei abordate)

Stadiul actual al cunoașterii ([anonimizat], metodologie, analiza și compararea datelor din literatura de specialitate); acest capitol trebuie să se termine cu precizarea aspectelor mai puțin cunoscute până în prezent

Scopul și obiectivele lucrării

Materiale și Metode (utilizate în studiu; NU le prezentați în exprimări de tip manual “[anonimizat]”, ci “a fost centrifugat, a fost transferat etc”)

Rezultate și Discuții (prezentarea rezultatelor și compararea lor cu alte studii din literatura de specialitate)

Concluzii

Bibliografie (minimum 25 de titluri bibliografice)

[anonimizat].

II Principalele polimorfisme asociate trombofiliei:

II.1 Mutatia factorului V Leiden

Este generata tot de o mutatie punctiforma prin substitutia guaninei (G) cu adenina (A) în poziția 1691. Gena se afla pe cromozomul 1q23, iar mutatia acesteia este transmisa in descendenta pe modelul autozomal codominant si are o incidenta de 3-7% in populatia caucaziana si astfel este considerata a fii cea mai frecventa forma de trombofilie ereditara. [anonimizat] 506 [anonimizat] (mutația R506Q). Astfel factorul V [anonimizat] V Leiden si devine rezistent la acțiunea proteinei C activate (APC) persistand mult mai mult timp in circulati un nivel crescut de trombina care duce astfel la o hipercoagulabilitate.

Asocierea factorului V Leiden și mutația G20210A a protrombinei apare la mai mult de jumatate dintre indivizii diagnosticati cu trombofilie ereditara.

Factorului V Leiden este considerat a fi responsabil pentru urmatoarele afectiuni:

[anonimizat],

evenimente trombotice la pacienți tineri (<50 ani)

[anonimizat] a retinei,

[anonimizat].

Statusul heterozigot sau homozigot decide nivelul de risc de tromboză sau de alte afectiuni asociate acestei mutații. Indivizii cu status heterozigot au un risc de tromboză de 4-8 ori mai crescut decât persoanele cu factor V normal, în timp ce homozigoții prezintă un risc de 80-100 ori mai mare (synevo.ro).

Se considere ca in cazul asocierii factorului V Leiden cu alte polimorfisme (in special cu mutatia protrombinica), riscul de aparitie a hipercoagularii creste exponential.

Administrarea anticonceptionalelor orale la persoanele cu factor V Leiden pozitiv este asociata un cu risc crescut de tromboza venoasă profundă.

Alti factori considerati de risc in cazul indivizilor cu factorul V Leiden pozitiv sunt sarcina, obezitatea, hipercolesterolemia etc. Factorul V Leiden conduce la o predispozitie pentru infarctul miocardic, in schimb riscul de boala coronariană este mai scazut. (Middendorf si colab., 2004).

II.2 Mutația factorului II (protrombina)

Poort și colaboratorii săi au descoperit in 1996 mutația genei protrombinei. Aceasta apare prin substituția unei nucleotide, guanina (G) fiind înlocuită cu adenina (A) in pozitia perechii de baze 20210.

Mutatia protrombinei este foarte importanta si reprezinta a doua cauza de trombofilie ereditara după mutația factorului V Leiden.

Principalele afectiuni asociate ca fiind o consecinta a acestei mutatii sunt:

tromboză venoasă profundă, in special asociata cu anumite conditii (la indivizii si pentru alte defecte genetice, terapie hormonală, administrarea contraceptivelor orale, perioada sarcinii și post-partum),

tromboză idiopatică a venei porte,

tromboză idiopatică a sinusurilor cerebrale,

complicații ale sarcinii (retard de creștere intrauterină, apoplexie utero-placentară).

Mutația protrombinică este foarte des asociata cu mutatia factorului V Leiden. S-a dovedit că în aceste cazuri riscul de tromboză venoasă recurentă crește. De aceea, se recomanda testarea ambelor mutatii la pacienții cu suspiciune de trombofilie ereditara.

Precum mutatiile factorului V Leiden și MTHFR, si mutatia in gena protrombinica este asociata cu un risc crescut de avorturi spontane recurente.

Prezenta acestei mutatii asociate cu fumatul si cu hipertensiunea arteriala duce la cresterea riscului de evenimente trombotice.

II.3 MTHFR (Metilentetrahidrofolat reductaza) – polimorfisme (C677T, A1298C)

MTHFR (metilentetrahidrofolat reductaza) este o enzima care intervine in catalizarea 5,10-metilenetetrahidrofolatului la 5-metilenetetrahidrofolat, acesta fiind un cofactor care remetileaza homocisteina la metionina.

Mutatia punctiforma la nivelul genei MTHFR (C677T) este considerata ca fiind o varianta enzimatica termolabila si a fost descrisa ca fiind responsabila de aparitia hiperhomocisteinemiei, mai ales in asociere cu un deficit de folati (Ivy Altomare si colab.,2007).

In populatia caucaziana, statusul homozigot are o incidenta de 11% si este asociat cu afectiuni ale sarcinii ce includ anomalii cromozomiale, malformatii congenitale, pierderi recurente de sarcina, afectiuni ale placentei si preeclampsie.

Hiperhomocisteinemia si statusul homozigot pentru mutatia C677T sunt implicate in fenomenele tromboembolice survenite tardiv in sarcina si chiar in perioada post-partum si un risc de 2-3 ori mai mare pentru defecte de tub neural cum ar fi spina bifida si anencefalie in comparatie cu persoanele care nu prezinta aceasta mutatie, iar statusul heterozigot combinat pentru C677T si A1298C constituie de asemenea un factor de risc pentru defectele de tub neural (Willianne L.D.M. Nelen and Henk J. Blom,2005).

Pacientii heterozigoti pentru aceasta mutatie nu prezinta hiperhomocisteinemie si nici un risc crescut de evenimente trombotice, in absenta corelarii acesteia cu alte polimorfisme genetice implicate in patologia trombofiliei.

O a doua mutatie descrisa frecvent in cadrul genei MTHFR, este A1298C. Caracteristica principala este aceea ca nu se asociaza cu hiperhomocisteinemei indiferent de statusul heterozigot sau homozigot, insa genotipul heterozigot combinat cu polimorfismul C677T (heterozigot sau homozigot), poate genera manifestari clinice similare cu cele induse de statusul homozigot pentru mutatia C677T.

Homocisteina este un aminoacid care apare prin demetilarea metioninei si este considerat un biomarker de risc asociat trombozelor si complicatiilor sarcinii.

Nivelul homocisteinei este influientat de cele 2 cai de metabolizare:

Prima ar fi trans-sulfurarea la cisteina, cu ajutorul enzimei cistationin beta-sintetaza (CBS) si vitamina B6 servind drept cofactor.

A doua cale ar fi remetilarea la metionina cu ajutorul MTHFR (metilentetrahidrofolat reductaza) si metionin-sintetaza, avand ca substrat folatii si co-enzima vitamina B12. Nivelul homocisteinei in sange este invers proportional cu nivelul plasmatic al folatilor, vitaminei B12, vitamina B6.

Hiperhomocisteinemia (un nivel plasmatic >12-15 μmol/L) apare atunci cand este blocata una din cele 2 cai de metabolizare. Statusul homozigot al genei MTHFR C677T codifica o varianta enzimatica termolabila si este asociata cu hiperhomocisteinemia severa. In schimb, statusul heterozigot pentru acest polimorfism nu este asociat cu valori crescute ale homocisteinei.

Hiperhomocisteinemia prezinta un factor de risc major in sarcina, fiind puternic asociat cu defecte de tub neural, spina bifida, tromboze venoase precum si avorturi spontane recurente.

S-a demonstrat ca terapia cu folati si cu alte vitamine din grupul B, reduc rapid nivelurile

de homocisteina si astfel se reduc si riscurile asociate unui nivel crescut al acestul aminoacid.

Folatul este o vitamina cruciala in metabolismul homocisteinei. Folatul seric intra in tesutul celulelor prin receptori de acid folic, și apoi dihidrofolat reductază (DHFR) îl convertește în tetrahidrofolat care se transforma in 5, 10-metilentetrahidrofolat, cu ajutorul vitaminei B6 ca si un cofactor. Apoi, metilentetrahidrofolat reductaza (MTHFR) convertește 5, 10-metilentetrahidrofolat în 5-metiltetrahidrofolat, oferind astfel o grupare metil pentru conversia homocisteinei în metionină într-o reacție catalizată de metionin-sintetaza (MTR). Aceasta MTR necesita vitamina B12 (cobalamina) ca si coenzimă. De-a lungul timpului, cobalamina (I) cofactor al MTR este oxidat pentru a forma cobalamina (II), ceea ce duce la inactivarea MTR. Astfel, este necesară reductaza metionin-sintetazei (MTRR) pentru reversia cobalaminei oxidate (II) la ch3-cobalamina (III) pentru a menține activitatea MTR.

II.4 PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor-1)

PAI-1 este un inhibitor serin-proteazic, inhibitorul principal al activatorului tisular al plasminogenenului și a urokinazei intervenind în reglarea fibrinolizei.

Mutatia genei PAI-1 conduce la aparitia unei activitati fibrinolitice anormale ce are ca rezultat riscul dezvoltarii trombozelor arteriale sau venoase.

Genotipurile 4G/4G și 4G/5G asociate cu alte defecte trombofilice (cum ar fi factorul V Leiden, mutatia protrombinica II, mutatia genei MTHFR (C677T si A1298C), hiperhomocisteinemia, deficienta proteinelor C sau S) sunt asociate cu:

risc crescut de tromboembolism pulmonar,

infarct miocardic,

pierderile de sarcina din trimestrul I, prin afectarea formarii placentei,

infarctul miocardic la pacienti tineri (≤ 45 ani),

hipertensiunea arteriala,

istoricul familial de afectiuni cardiovasculare.

Homozigotii 4G/4G  au o incidenta de 11% in populatia europeana si prezinta niveluri mai mari cu 25% al inhibitorul principal al activatorului plasminogenenului fata de homozigotii 5G/5G.

II.5 Mutația factorului XIII

Factorul XIII are rolul de a intervenii in formarea complexelor de fibrina si le confera acestora rezistenta la fibrinoliza datorita legaturilor incrucisate dintre filamente si intervine vindecarea endoteliilor prin sinteza colagenului fiind esential in mentinerea sarcinii. Mutatia de la nivelul subunitatii A a genei este cea mai frecventa, fiind mostenita pe modelul autozomal recesiv si are o incidenta redusa in populatie.

Mutația aparuta prin substitutia a Valinei in pozitia 34 cu Leucina a FXIII este corelata cu diverse forme de hemoragie. Asocierea dintre mutatia Val34Leu a factorului XIII cu mutatia PAI1 conduce la anomalii placentare si astfel la avorturi spontane recurente la femei si infertilitate la barbati. Indivizii heterozigoti sunt de obicei asimptomatici, in schimb ce homozigotii vor prezenta simptomatologie specifica hemoragica.

Deficitul de proteină C

Este o afecțiune congenitală sau dobândită, care duce la un risc crescut de tromboză. Deficitul congenital de proteină C este un grup eterogen de tulburări genetice asociate cu un risc crescut de tromboembolism venos. Proteina C are o greutate moleculara de 62-kD, este o glicoproteina sintetizată în ficat dependentă de vitamina K. (Dahlback B, 2008)

Proteina C activată (APC) își exercită activitatea anticoagulantă în primul rând prin inactivarea factorilor de coagulare Va si VIIIa, care sunt necesare pentru activarea factorului X și generarea de trombină. Activitatea catalitică a proteinei C activate (APC) este mult îmbunătățită de proteina cofactor dependentă de vitamina K.

Pe lângă rolul său în coagulare, APC are si funcții antiinflamatorii și citoprotective, care sunt mediate prin receptorul proteinei C endoteliale și activat de proteaza receptor-1 (RAP-1). (Mosnier LO si colab.,2007).

O deficiență de proteină C activată (APC) perturbă echilibrul delicat dintre procoagulant și proteine ​​anticoagulant și dă naștere unui mediu protrombotic. APC asociata cu alte proteine ​​anticoagulante au un rol deosebit de important în circulația venoasă, prin expunerea prelungită a proteinelor procoagulante și fosfolipidele plachetare la peretele vasului. Acest lucru se poate explica, în parte, de ce deficitul de proteină C pare a fi asociată în principal cu tromboză venoasă.

Deficit de proteină C heterozigot este moștenită într-un mod autozomal dominant. Gena pentru proteina C este localizata pe brațul lung al cromozomului 2 și au fost asociate aproape 200 de mutații patogene ale acestei gene.

Aceste mutații sunt împărțite în 2 tipuri:

tipul I – o deficiență cantitativă a concentrației de proteină plasmatică C

tipul II – deficiență funcțională, este mai putin comuna decat tipul I, si este asociat cu scăderea activității funcționale și niveluri normale de proteină C.

Deficitul de proteină C este asociat cu un risc ușor mai crescut de preeclampsie, de a da naștere unor feți cu greutate mică ca urmare a disfuncțiilor placentare survenite în urma fenomenelor trombotice. Ca atare, se impune o atentă monitorizare a acestora de către obstetrician. Severitatea manifestărilor clinice este dependentă de statusul homo/heterozigot.

Deficitul de antitrombină

Se transmite autozomal dominant. Este destul de rar in populatia generala, avand o incidenta de 0,02%. Indivizii cu deficit de antitrombina prezinta un risc crescut de episoade trombotice. Gena antitrombinei, localizată pe cromozomul 1, codifică o glicoproteină cu greutatea moleculară de 58 kDa ce este sintetizată în ficat.

Este o anomalie multifactoriala fiind determinata de peste 250 de mutații diferite. Aproape toate tipurile sunt heterozigote, tipul homozigot nefiind compatibil cu viața sau determinând un fenotip trombotic sever.

Complicațiile obstetricale la gravidele cu deficit de antitrombină, pierderi recurente de sarcină au fost observate in numeroase studii.

Există 3 subtipuri de deficit de AT:

Antitrombina I este fibrina care inactivează trombina impiedicand coagularea progresivă și extensia cheagului. Acest tip in stare homozigota este incopatibil cu viata.

Antitrombina II (ATII) sau alfa 2 macroglobulina (α2M), este o proteină plachetară (granule lizozomale) și plasmatică cu acțiune de 20 de ori mai lentă decat a ATIII. In prezenta fibrinogenului, AT II inhiba trombina faromand cu aceasta un complex ireversibil.

Antitrombina III (cofactorul heparinei). Este o proteină plasmatică care produce o inactivare lentă și progresivă a trombinei, rămasă in exces după ce acesta și-a realizat acțiunea asupra fibrinogenului. Inhibă și Xa, enzima cheie a celor două căi de coagulare, extrinsecă și intrinsecă. In plus, inactivează și alți factori ai coagulării: VIIa, IXa, XIa, XIIa. Efectul inhibitor al ATIII nu pertrubă reacția trombină – fibrinogen; formarea fibrinei se efectuează numai unde este necesară. Reacția dintre ATIII și trombină este accelerată de heparina. Acțiunea anticoagulantă a heparinei depinde de nivelul de ATIII plasmatic. Din intreaga capacitate a plasmei de inhibare a trombinei, acțiunea ATIII este de 75%, fiind astfel proteina principală a mecanismului de inactivare a trombinei.

Antitrombina VI. Corespunde produșilor de degradare ai fibrinei sau/și fibrinogenului (PDF), sunt patru peptide: două cu moleculă mare (X, Y) și două cu moleculă mică (D, E). PDF-urile X,Y impiedică polimerizarea monomerilor de fibrină, iar PDF-urile D, E inhibă aderarea și agregarea plachetară.(Rusu Iosefina si colab, 2006)

Deficitul de proteină S

Deficitul de proteina S are o incidenta mai mica (0.026-0.13%), comparativ cu cel al proteinei C, si se transmite tot pe modelul autozomal dominant. Proteina S este un cofactor ce se asociaza cu proteina C activată si intervin in inactivarea factorilor Va si VIIIa.

Au fost identificate 3 subtipuri de deficit de proteină S:

tipul I – deficiență cantitativă – nivel scăzut de proteină S totală si libera. Proteina S este normal funcționala, dar se găsește într-o cantitate insuficientă pentru a controla cascada coagulării;

tipul II – extrem de rar întâlnit în populație și se caracterizează prin nivel normal de proteina S libera și nivel scăzut de proteina S totală. Prezinta cantitate normală de proteină S, care este însă incapabilă să-și exercite funcția (activitate redusă) ca urmare a unor defecte moleculare;

tipul III – nivel scazut de proteina S libera și nivel normal de proteina S asociată cu o activitate scăzută, în prezența unei cantități normale de proteină S totală.

Se inregistreaza o scadere a activității proteinei S in cursul sarcinii sau atunci cand se administreaza contraceptivele orale.

PARTEA a II-a

CONTRIBUȚIE PERSONALĂ

III SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Scopul principal al lucrării este acela de a prezenta polimorfismele genetice asociate trombofiliilor, gravitatea acestora si aparitia complicatiilor in sarcina.

Acesta lucrare se va concentra pe incidenta trombofiliei, gravitatea manifestărilor clinice, diagnosticul si tratamentul acestei afectiuni.

In realizarea acestor obiective am intervievat un lot compus din 59 de femei deja diagnosticate cu diferite mutatii asociate trombofiliei (factor V Leiden, mutatia protrombinica II, MTHFR, PAI1, factor XIII). Chestionarul a fost aplicat in mediul online, pe un grup dedicat suportului reciproc pentru persoanele afectate de aceasta anomalie, cu ajutorul aplicatiei google survey forms. Acest studiu retrospectiv a furnizat date importante pentru o mai buna intelegere a mecanismelor acestei afectiuni, corelarea stilului de viata cu ameliorarea sau din contra, agravarea simptomatologiei, incidenta sarcilinor pierdute in lipsa unui tratament adecvat, precum si alte aspecte importante care au fost pe larg preventate in lucrare.

Ulterior au fost selectate acele persoane care prezentau unul din polimorfismele genei MTHFR in vederea identificarii si altor polimorfisme asociate genei MTHFR (MTRR, MS, DNMT3) pentru a identifica daca exista o corelatie intre aceste polimorfisme si pierderile recurente de sarcina.

IV MATERIALE ȘI METODE

Studiul a fost realizat în Departamentul de Genetica din cadrul Facultatii de Biologie, pe un lot de 59 de paciente ce au facut obiectul unei evaluări complete intr-un studiu retrospectiv in care s-a aplicat un algoritm de markeri genetici asociati procesului de coagulare.

Criteriile de selectie în lotul de studiu au tinut cont de istoricul medical (numarul sarcinilor pierdute în antecedente,varsta, antecedente individuale de tromboză, mutatia MTHFR, stil de viata).

Pentru fiecare pacientă s-a aplicat un chestionar tip, în care s-au consemnat toate datele legate de antecedentele obstetricale, analize genetice ale unor markeri cunoscuti pentru trombofilie, evoluția sarcinii, date privind evenimente negative și posibile complicații apărute pe parcursul sarcinii etc),

IV.1. MATERIAL BIOLOGIC

Materialul biologic a fost reprezentat de sânge venos periferic colectat pe anticoagulant și saliva umana, care au fost procesate pentru extracția ADN, amplificare și analiza prin metoda de genotipare PCR-RFLP si inversblotting. Ca anticoagulant a fost folosit EDTA-ul deoarece heparina împiedică prelucările specifice ulterioare.

IV.2. METODE DE LUCRU

IV.2.1. Izolarea ADN din sânge

Pentru extracție ADN din sânge integral a fost utilizat kitul Kitul DNeasy Blood and Tissue de la Quiagen. Etapele de prelucrare prevad urmatoarele operatiuni:

s-au transferat 20 μl proteinază K într-un tub de centrifugă de 1,5 sau 2 ml. S-au adaugat 50-100 μl sânge recoltat pe anticoagulant si s-a adus volumul la 220 μl adăugând PBS.

s-a adăugat 200 μl Tampon AL, s-a amestecat prin vortexare si s-a incubat la 56 șC timp de 10 minute

s-au adăugat 200 μl etanol (96-100%), și în probă și s-a amestecat prin vortexare până s-a obținut o soluție omogenă

s-a pipetat amestecul obținut într-o coloniță livrată cu kitul, și s-a inserat în tubul de colectare de 2 ml din kit. S-a centrifugat la 6000 x g (8000 rpm) si s-a aruncat filtratul și tubul de colectare.

S-a plasat colonița într-un tub nou de colectare (2 mL, livrat cu kitul), s-a adăugat 500 μl Tampon AW1, și s-a centrifugat timp de 1 minut la 6000 x g (8000 rpm). Se aruncă filtratul și tubul de colectare.

s-a mutat colonița într-un tub nou de colectare, s-a adăugat 500 μl Tampon AW2, și centrifugăm 3 minute la 20,000 x g (14,000 rpm) pentru a se usca membrana din coloniță. Se aruncă filtratul și tubul de colectare.

S-a plasat colonița într-un tub nou de 2 ml, și s-a pipetat 60 μl Tampon AE direct pe membrana din coloniță. Incubăm la temperatura camerei timp de 1 minut și apoi centrifugăm la 6000 x g (8000 rpm) 1 min pentru a elua ADN-ul.

s-a pastrat soluția eluată ce conține fragmentele de ADN la 4șC sau – 20șC;

Tuburile s-au stocat la -20°C.

IV.3.2. Izolarea ADN din saliva

Etapa A – Stabilizarea ADN

1. S-a adaugat 500 μl soluție LS în tubul ce conține celulele recoltate din cavitatea bucală;

2. S-a pus 20μl soluție PK în tubul ce conține celulele și soluție LS și s-a vortexat;

ADN-ul stabilizat astfel a fost procesat in vederea izolarii.

Etapa B – Izolarea ADN

3. S-a incubat tubul cu celulele și soluțiile LS și PK la 600C la baia de apă timp de 1 oră si s-a vortexat;

4. Baia de apă s-a setat la 800C pentru pasul 13;

5. Am transferat supernatantul din tub (aprox. 400 μl ) într-un tub de centrifugă de 1,5ml;

6. A fost adaugat 400 μl soluție CT peste supernantantul introdus într-un tub de 1,5 ml si s-a vortexat;

7. S-a centrifugat la 13000 rpm timp de 7 minute pentru a obține peletul ADN;

8. S-a îndepărtat supernatantul cu atenție pentru a nu deranja peletul ADN;

9. S-a centrifugat 1 minut la 13000 rpm și am îndepărtat lichidul ce a mai ramas;

10. S-a pus 50 μl soluție TE peste peletul ADN;

11. S-a pastrat la temperatura camerei cel puțin 5 minute ca pentru hidratarea ADN, ulterior a fost vortexat;

12. Pas opțional (poate să îmbunătățească A260/280 și A260/230). A fost centrifugat tubul la 13000 rpm pentru îndepărtarea particulelor nedizolvate și se introduce supernatantul într-un tub nou;

13. S-a incubat tubul la 800C timp de 5 minute si am vortexat;

Verificarea puritatii si a concentratiei ADN s-a realizat spectrofotometric la lungimea de 260nm si 280nm, in functie de valorile A260 si A280 se stabileste gradul de contaminare astfel:

Raportul A260/280 optim este cuprins intre 1.8-2.0

Daca acesta este <1.7, contaminarea proteica a extractului este semnificativa

Daca acesta este > 2.0 atunci avem contaminare a extractului cu ARN.

Determinarea concentratiei ADN dintr-un extract se bazeaza pe citirea absorbantei la 260nm. A260=1 corespunde la 50ug ADNd.c./mL.

IV.3.3. Verificarea eletroforetica a integritatii ADN

Pentru verificarea integritatii ADN genomic, extractul a fost supus unei electroforeze in gel de agaroza in sistem submers in placa orizontala. La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcina electrica globala negativa. Drept urmare, daca sunt plasate intr-un camp electric, moleculele de acizi nucleici migreaza la anod (+). Migrarea probelor ADN s-a realizat in gel de agaroza de 0.8%, iar vizualizarea moleculelor de ADN din gel s-a facut prin asezarea gelului pe transiluminator UV (λ=302).

IV.4 Tehnica PCR- RFLP pentru studiul polimorfismului genei MTHFR

Pentru genotiparea a doua dintre cele mai cunoscute mutatii ale genei MTHFR (5,10- metilen tetrahidrofolat reductaza) (C677T si A1298C) a fost utilizata metoda lui Frosst et al. (1995) si Wisberg et al. (2001). MTHFR este o enzima ce joaca un rol important in sinteza ADN si in metilarea ADN. Catalizeaza reducerea 5,10 metilen tetrahidrofolatului la 5- metilen hidrofolat, ce este folosit de metionin sintaza pentru metilarea homocisteinei pentru a forma metionina. Metionina este precursorul S- adenozil- metioninei (SAM), ce are rol de donor de grupari metil pentru ADN metiltransferaze si penru cele e metileaza histonele. Polimorfismul 677C>T in gena MTHFR conduce la o forma termolabila a proteinei cu o activitate enzimatica scazuta. Modificarile in activitatea MTHFR schimba nivelele de SAM, iar aceste nivele scazute de SAM in celulele germinale materne, ofera un risc crescut ce implica un imprinting prin metilare realizat partial sau nerealizat.

MTHFR C677T si MTHFR A1298C sunt asociate cu reducerea activitatii enzimatice, cresterea nivelului plasmatic al homocisteinei in conjunctie cu deficitul de folati.

IV.4.1 REACTIA PCR

Primerii pentru analiza polimorfismului C667T au fost 5’- TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’ (exonic) si 5’- AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’ (intronic). Primerii pentru analiza polimorfismului A1298C au fost 5’- GGGAGGAGCTGACCAGTGCAG-3’ si 5’- GGGGTCAGGCCAGGGGCAG-3’.

Reactia PCR a avut loc pe un thermocycler Corbett. Volumul in care s-a lucrat a fost de 20 µl de mix pentru PCR ce continea 1× tampon PCR [50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0)], 1.5 mM, MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0,5 mM din fiecare primer, și 1 unitate polimerază ADN Taq.

Programul PCR pentru C677T: denaturare inițială la 94 °C, 3 minute, 30 cicluri – 94°C timp de 45 sec, 65°C timp de 45 sec, și 72°C timp de 45 sec. Elongare finală 72°C timp de 7 min. Programul PCR pentru analiza polimorfismului A1298C: denaturare inițială la 94 °C, 3 minute, 35 cicluri – 94°C timp de 45 sec, 65°C timp de 45 sec și 72°C timp de 45 sec. Elongare finală 72°C for 7 min.

IV.4.2. Digestia enzimatică

Pentru analiza polimorfismului C677T, 10 µl de produs PCR a fost digerat cu 10 unitati de enzima de restricție Hinf I, la 37 °C timp de 3 ore. Pentru analiza polimorfismului A1298C, 10 µl de produs PCR a fost digerat cu 5 unitati de enzima de restricție Fnu4H I, la 37 °C timp de 3 ore.

IV.4.3. Electroforeza în gel de agaroză a ampliconilor

Etapele de preparare ale unui gel de agaroză de 3% de dimensiunea 15x20cm:

am amestecat 3g agaroză și 100mL tampon TBE într-un tub Erlenmeyer de 500 mL

s-a acoperit vasul cu o folie de aluminiu și s-a topit agaroza pe o plită agitând ocazional

S-a pregatit cuva gelului și s-a turnat agaroza răcită în prealabil la 50-60°C, căreia i

s-a adăugat 1-2 μL bromură de etidiu 10 mg/mL;

S-a inserat pieptenele, și am lasat gelul să se răcească timp de 30-60 min;

S-a îndepărtat pieptenele și banda adezivă de pe cuvă, plasându-se cuva în tancul de electroforeză cu 1X TBE (astfel încât tamponul să acopere complet gelul); Se introduc probele în godeuri;

s-a conectat aparatul de electroforeză la o sursă de curent continuu, 100 V, timp de 40-60 min;

S-a scos gelul din tancul de electroforeza, și am vizualizat la transiluminator UV si s-a fotografiat gelul.

IV.4.4. Analiza ampliconilor

Substituția C→T la nucleotida 667 produce un sit de digestie Hinf I, astfel produsul PCR (198pb) este digerat în doua fragmente (175 pb și 23 pb), în timp ce alela C nu poate fi digerată de enzima de restricție Hinf I. Heterozigoții prezintă ampliconul de 198 pb și ampliconii de 175 pb și 23 pb, homozigoții CC prezintă doar ampliconul de 198 pb în gelul de agaroză și homozigoții TT prezintă ampliconii de 175 pb și 23 pb.

Substituția A→C la nucleotida 1298, produce un situs pentru enzima de restricție Fnu4H I, astfel produsul PCR (138 pb) este digerat în doua fragmente (119 pb și 19 pb), în timp ce alela A1298C nu poate fi digerată de enzima de restricție Fnu4H I. Heterozigoții prezintă ampliconul de 138 pb și ampliconii de 119 pb și 19 pb, homozigoții AA prezintă doar ampliconul de 138 pb, iar homozigotii CC prezintă în gelul de agaroză ampliconii de 119 pb și 19 pb.

IV.5.1. Genotiparea prin tehnica de hibridizare inversă

S-au analizat cinci polimorfisme diferite:

MTHFR (5,10 metilentetrahidrofolat reductaza) – MTHFR C677T, MTHFR A1298C;

MS (metionin sintaza) – MS A2756G;

MTRR (reductaza 5-metiltetrahidrofolat-homocistein metiltransferazei)- MTRR A66G;

DNMT3B (ADN metiltransferaza) – DNMT3B C-149T, folosind kitul de

hibridizare inversă RhyMA Test OMO de la Euroclone.

IV.5.2. Principiul metodei

Testul se bazează pe tehnologia de hibridizare inversă și implică șase pași:

a) extracția ADN

b) Amplificare PCR (multiplex-PCR) a secvențelor de interes cu primeri biotinilați.

c) Produsii de amplificare biotinilați sunt hibridizați pe membrane (stripuri) unde se află

sonde specifice alelelor de interes

d) Spălări stringente

e) Reacția de developare a culorii cu biotină-streptavidină

f) Interpretarea rezultatelor cu DecodoruL

IV.5.3. Amplificarea PCR

Prepararea mixului pentru PCR:

Pentru fiecare experiment s-a realizat un master mix , conform datelor din tabel:

Tabel 1. Cantitatea reactivilor introdusi in reactia de amplificare PCR

Dupa pregatirea mixului de adauga 45µL Master Mix in fiecare tub pentru PCR si se adauga 5 µL ADN (200-500 ng). S-au introdus tuburile in thermocycler, cand acesta a atins temperatura de +94șC si s-a rulat programul din tabelul de mai jos:

Tabel 2. Programul pentru amplificarea PCR

Dupa finalizare, tuburile s-au pastrat la +4 șC pana la folosire.

IV.5.4. Hibridizarea și spălarea

a) Hibridizare

1. S-a setat temperatura la 45°C la baia de apă cu agitator și se încalzesc la 45°C soluția de

hibridizare și soluția de spălare A.

2. DNAT, soluția de conjugare, soluția de spălare B și soluția cromogenică trebuie să ajungă

la temperatura camerei (20-25°C).

3. S-au transferat 20 μl din DNAT în fiecare spațiu al rezervorului și adăugam peste 20 μl de produs

de amplificare (soluția ar trebui să aibă culoarea albastră), incubam 5 min la temp. camerei.

4. Adaugăm 1ml soluție de hibridizare la fiecare probă și incubăm la baia de apă cu agitator

30 min la 45°C, aproximativ 100 rpm.

b) Spalare stringentă

1. Scoatem rezervorul din baia de apă și indepărtăm lichidul folosind o pipetă.

2. Adăugăm 1ml de soluție de spălare A (incalzită la 45°C), incubăm 10 sec și îndepărtăm

soluția.

3. Adaugam 1ml de soluție de spălare A (incalzită la 45°C), incubăm 15 minute la 45°C la

baia de apă cu agitator (aprox. 100 rpm) și apoi îndepărtăm soluția.

4. Se repetă etapa 3.

IV.5.5. Developarea culorii

Se lucrează la temperatura camerei în condiții de agitare.

1. Adăugăm 1ml soluție conjugat, și incubăm 15 min la temperatura camerei, agitând

rezervorul. Apoi aruncăm soluția.

2. Adaugam 1ml soluție de spălare B. Incubăm 10 sec. Apoi aruncăm soluția.

3. S-a adaugat 1ml soluție de spălare B, incubăm 5 min la temperatura camerei agitând

rezervorul. Apoi aruncam soluția

4. Repetăm etapa 3.

5. Adăugăm 1ml soluție cromogenă, s-a incubat 15 minute agitând rezervorul la intuneric.

6. Se spală membranele (stripurile) cu apă distilată sau EDTA, și se usucă.

IV.5.6. Interpretarea rezultatelor

Genotipul unei probe este determinat folosind hârtia cu harta benzilor de pe membrană. S-a plasat membrana în câmpul destinat ei, s-au potrivit liniile marker (superior-roșu, inferior-verde) și s-au fixat cu bandă adezivă.

Pentru fiecare poziție polimorfică, a aparut un pattern specific pentru homozigot normal,heterozigot sau homozigot pentru mutație. Intensitatea liniilor poate varia. Acest lucru nu este semnificativ pentru citirea rezultatului.

V. Rezultate si discutii

. Concentrația și puritatea ADN extras din sânge și salivă

În urma extracției cu un kit Qiagen (DNeasy Blood and Tissue), cantitatea și puritatea ADN s-a estimat prin intermediul absorbanței citite la un spectrofotometru. În Tabelul 13 sunt reprezentate valorile concentrației ADN și a raportului A260/A280, indicativ al calitatii ADN. Se observă faptul că, în majoritatea probelor analizate, provenite de la pacienții suspectați clinic și de la părinții acestora, cantitatea ADN a fost suficientă (valoarea concentrației a fost cuprinsă între 29,8 ng/μl și 201,2 ng/μl), iar puritatea (raportul A260/A280 nu a fost mai mic de 1,745 și nici mai mare decat 1,996).

V.1. Concentrația și puritatea ADN extras din sânge

Analiza PCR-RFLP s-a realizat pe ADN extras din sange cu ajutorul kitului DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) de la paciente suspecte de trombofilie.

Tabel 3. Concentratia si puritatea ADN extras din sange:

V.2. Concentrația și puritatea ADN extras din salivă

Analiza de hibridizare inversă s-a realizat folosind ADN extras din salivă. Aceasta metodă până în acest moment nu a fost raportată în publicațiile românești de specialitate. Pentru a fi adaptată și optimizată metoda de analiză a polimorfismelor, ADN extras din salivă a fost comparat cu ADN extras din sângele de la părinți (sânge păstrat în stocul utilizat drept control la adaptarea și validarea metodelor moleculare de diagnostic).

Tabel 4. Concentratia si puritatea ADN extras din saliva:

Tabel 5. Concentratia si puritatea ADN grup control:

În Tabelul 3,4 si 5, sunt prezentate concentrația și puritatea ADN extras pentru analiza polimorfismelor genelor implicate în metabolismul grupei metil. ADN extras din salivă a avut în medie o concentrație mai mare decât cel extras din sânge, însa a avut o puritate ușor scazută.

V.3. Analiza polimorfismului MTHFR C677T și A1298C prin tehnica PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Analiza polimorfismului C667T si A1298C a genei MTHFR s-a realizat prin tehnica PCR-RFLP pentru a identifica dacă forma termosensibilă a enzimei este un factor de risc pentru apariția sindromului Prader-Willi. S-au analizat 10 indivizi, părinții a cinci pacienți confirmați SPW, dintre care 3 cazuri cu deleția tipică și 2 non-deleționale.

Metoda PCR-RFLP se bazează pe digestia diferențiată a ampliconilor în funcție de punctele polimorfice care conduc la schimbarea secvenței țintă recunoscută de enzima de restricție. Se pot obține astfel fragmente diferite ADN, ce diferă prin greutatea moleculara în funcție de prezența mutației punctiforme sau a secvenței normale în situl de recunoaștere al enzimei.

În Figurile 1 si 2, se observă prezența ampliconilor ce trebuie supuși digestiei enzimatice dupa ce s-a efectuat electroforeza în gel de agaroză 2%. Ampliconii obtinuți de 198 pb (polimorfismul C677T) și 138 bp (polimorfismul A1298C) au fost supuși restricției enzimatice cu endonucleazele Hinf I și respectiv Fnu4HI, conform instrucțiunilor producătorului (New England Biolabs).

Figura 1. Ampliconii obtinuți pentru identificarea polimorfismului A1298T înainte de a fi supuși digestiei enzimatice.

Figura 2. Ampliconii obtinuți pentru identificarea polimorfismului C677T înainte de a fi supuși digestiei enzimatice

Figura 3. Patternul electoforetic efectuat în urma MTHFR RFLP (restriction fragment length polymorphism)

pentru polimorfismul C677T. L-Ladder, 1,3,5,6,7,8,9 sunt pacienti homozigoți CC; 2,4,11 sunt homozigoți

pentru polimorfismul TT; 10 este heterozigot CT.

Figura 4. Patternul electoforetic efectuat în urma MTHFR PCR-RFLP (restriction fragment length

polymorphism) pentru polimorfismul A1298C. L-Ladder; 1,3, sunt pacienți homozigoți CC; 2,4,5,7,8,10 sunt

homozigoți pentru polimorfismul AA; 6, 9 este heterozigot AC.

După digestie probele au fost migrate în gel de agaroză 3%. Heterozigotii (CT) au prezentat 2 fragmente de 198pb și 175 pb; fragmentul de 23 pb nu se observă deoarece la migrare a ieșit din gelul de agaroză. În cazul polimorfismului A1298C heterozigoții au prezentat două fragmente de 138 și 119 pb fragmentul de 19 pb nu se observă deoarece la migrare a ieșit din gelul de agaroză. Rezultatele analizei prin PCR-RFLP pentru polimorfismele C677T și A1298C ale genei MTHFR implicată în metabolismul grupei metil sunt reprezentate în Tabelul 6.

Tabel 6. Polimorfismele genei mthfr MTHFR C677T Polimorfism MTHFR A1298C

Din cei zece indivizi la care s-a studiat polimorfismul C677T, 4 au fost homozigoți pentru polimorfismul CC (normal), 5 au prezentat polimorfismul în forma heterozigotă CT, și 1 a prezentat polimorfismul TT (mutant).

La analiza polimorfismului A1298C, 3 indivizi au prezentat forma homozigotă AA, 6 au fost heterozigoți AC și unul a prezentat polimorfismul în forma mutantă homozigot CC. 3 indivizi au fost identificați ca fiind dublu heterozigoți (677CT/1298AC).

V.4. Analiza prin hibridizare inversă a polimorfismelor genelor MTHFR,

MTRR, MS și DNMT3B

Genele studiate prin tehnica de hibridizare inversă MTHFR, MTRR, MS și DNMT3B sunt implicate in metabolismul grupei metil. Mutatii în aceste gene au fost corelate cu hipometilarea și instabilitatea genomică.

În cazul hibridizării inverse se utilizează în locul digestiei enzimatice pentru diferențierea secvenței polimorfice, hibridizarea ampliconilor obtinuți din reacția de amplificare PCR cu oligonucleotide specfice formelor mutante și sălbatice imobilizate pe membrane comercializate sub forma de fâșii (stripuri).

Pentru a efectua aceasta metodă este necesară amplificarea fiecărei probe ADN într-o reacție de amplificare multiplex.

S-a urmărit prezența ampliconilor obținuți în reacția de amplificare prin electroforeza acestora în gel de agaroză 2%. Cele 8 probe au fost supuse amplificării în reacția PCR, și s-a observat lipsa unor ampliconi din cei 5 ce trebuiau să rezulte în urma acestei reacții, la probele 3 și 6. Acest lucru s-a datorat unui ADN cu o puritate scazută. Pentru probele 3-6 s-a repetat reacția de amplificare.

Figura 5. Patternul electroforetic al ampliconilor ce urmează să fie folosiți în procesul de hibridizare inversă.

MTRR A66G – 126 pb, MTHFR C677T – 142 pb, MS A2756G – 205 pb, MTHFR A1298C – 232 pb, DNMT3B

C-149T – 259 pb. L-Ladder, 1,2,3,4,5,6,7,8 – PACIENTI

Pentru probele 3, 4, 5, 6 s-a efectuat prelevarea de salivă pentru o nouă extracție ADN.

Figura 6. Patternul electroforetic al ampliconilor ce urmează să fie folosiți în procesul de hibridizare

inversă. MTRR A66G – 126 pb, MTHFR C677T – 142 pb, MS A2756G – 205 pb, MTHFR A1298C – 232 pb,

DNMT3B C-149T – 259 pb. L-Ladder, 1,2,3,4 – PACIENTI

Ampliconii obtinuți prin reacția de amplificare PCR s-au folosit în urmatoarele etape ale tehnicii de hibridizare inversă, pentru a hibridiza cu oligonucleotidele specifice fiecărei alele ce sunt așezate în benzi paralele pe membrană (strip). Hibridizările de acizi nucleici constau din unirea a două fragmente monocatenare în structuri bicatenare stabile în condiții adecvate de temperatură, concentrație ionică și pH.

Reacția este condiționată de complementaritatea secvențelor de baze azotate, aflate în componența celor două catene. Când există complementaritate rezultă în mod automat omologia de împerechere a bazelor. În urma acestei hibridizari, și datorită faptului că primerii erau marcați cu biotină, hibridul ADN biotinilat – ADN de pe membrana, este pus în evidență cu ajutorul conjugatului fosfataza alcalină – streptavidină care se colorează în brun-roșcat (Figura 7).

Figura 7. Rezultatul hibridizarii inverse la părinții pacienților SPW, pentru polimorfismele MTHFR C677T, MTHFR A1298T, MS A2756G, MTRR A66G, DNMT3B -149. a-linie marker roșie, b-control pozitiv, c-MTHFR C677T MUT(mutant), d- MTHFR A1298C MUT, e-MS A2756G MUT, f-MTRR A66G MUT, g- DNMT3B C-149T MUT, h- MTHFR C677T WT (wild type), i- MTHFR A1298C WT, j- MS A2756G WT, k-MTRR A66G WT, l- DNMT3B C-149T WT.

Figura 8. Structura membranei pentru hibridizare inversă.

Prin utilizare unui decodor se poate estima prezența sau absența mutațiilor pentru fiecare probă ADN.

Rezultatele analizei prin hibridizare inversă a genelor implicate în metabolismul grupei metil la paciente suspectate de evenimente trombofilice, sunt reprezentate în Tabelul 7.

Tabel 7. Polimorfismele MTHFR C677T, MTHFR A1298T, MS A2756G, MTRR A66G,

DNMT3B -149 ale pacientelor, analizate prin metoda hibridizării inverse

WW- tipul sălbatic (wild type)

MM – homozigot mutant

WM – heterozigot

Controlul normal a fost reprezentat de 6 indivizi, parinții unor copii normali. S-a urmărit prezența ampliconilor obținuți în reacția de amplificare, prin electroforeza acestora în gel de agaroză 2%. Cele 6 probe supuse amplificării în reacția PCR, au prezentat toți ampliconii (5) ce trebuiau să rezulte în urma acestei reacții (Figura 9).

Figura 9. Patternul electroforetic al ampliconilor ce urmează să fie folosiți în procesul de hibridizare

inversă. MTRR A66G – 126 pb, MTHFR C677T – 142 pb, MS A2756G – 205 pb, MTHFR A1298C – 232 pb,

DNMT3B C-149T – 259 pb. L-Ladder, 1,2,3,4,5,6 – PACIENTI CONTROL NORMAL

Figura 10. Rezultatul hibridizarii inverse pentru indivizii control normal,

pentru polimorfismele MTHFR C677T, MTHFR A1298T, MS A2756G, MTRR A66G, DNMT3B -149. a-linie

marker roșie, b-control pozitiv, c-MTHFR C677T MUT(mutant), d- MTHFR A1298C MUT, e-MS A2756G

MUT, f-MTRR A66G MUT, g-DNMT3B C-149T MUT, h-MTHFR C677T WT (wild type), i-MTHFR A1298C

WT, j- MS A2756G WT, k- MTRR A66G WT, l-DNMT3B C-149T WT.

Ampliconii obtinuți prin reacția de amplificare PCR s-au folosit în urmatoarele etape ale tehnicii de hibridizare inversă, pentru a hibridiza la oligonucleotidele specifice fiecărei alele, ce sunt așezate în benzi paralele pe membrană (strip). În urma acestei hibridizari, și datorită faptului că primerii erau marcați cu biotină, complexul ADN biotinilat – ADN de pe membrană este pus în evidență cu ajutorul conjugatului fosfataza alcalină – streptavidină care se colorează în brun-roșcat (Figura 10).

Tabel 8. Polimorfismele MTHFR C677T, MTHFR A1298T, MS A2756G, MTRR A66G,

DNMT3B -149, ale indivizilor control normal analizate prin

metoda hibridizarii inverse.

WW- tipul sălbatic (wild type)

MM – homozigot mutant

WM – heterozigot

Controlul normal a fost reprezentat de 6 indivizi considerati normali. Cu toate acestea au fost identificate 2 cazuri cu polimorfismul C677T status heterozigot, 2 cazuri cu mutația A1298C forma heterozigotă si un caz prezenta forma homozigota pentru A1298C. Celalalte 2 cazuri au fost negative pentru aceste polimorfisme.

În ceea ce privește ambele mutații, niciunul dintre indivizii control nu au prezentat forma dublu heterozigotă. În ceea ce privește gena MTHFR, au fost posibile analizele polimorfismelor doar la 3 indivizi. 1:3 (~33,33 %) au prezentat forma heterozigotă pentru mutația C677T și 2:3 (~66,66 %) dețineau forma normală. Pentru mutația A1298C au prezentat forma heterozigotă 3:3 (100%). 1:3 a prezentat forma dublu heterozigotă pentru mutațiile C677T și A1298C. Polimorfismul , MS A2756G a fost prezent în formă heterozigotă doar la 1 caz, restul indivizilor analizați prezentând forma normală a genei. Polimorfismul MTRR A66G, s-a prezentat în formă heterozigotă 2:6 (~33,33 %), normală 3:6 (~50 %) și homozigot mutant 1:6 (~16.66 %).

Repartizarea polimorfismului DNMT3B -149 C>T, a fost reprezentată 4:6 heterozigot (~66,66 %) și 2:6 normal (~33,33 %). Un singură persoană de sex feminin a prezentat mutația homozigotă la două dintre polimorfismele studiate (MTHFR A1298C și MTRR A66G).

Interpretarile si concluziile obtinute in urma studiului propriu:

S-au analizat in baza unui chestionar, 59 de femei deja diagnosticate cu unul sau mai multe polimorfisme asociate trombofiliei.

Acestea au raspuns la 21 de intrebari formulate special pentru a avea relevanta pentru studiu.

Pe baza istoricului lor medical, am tras propriile concluzii.

Scopul a fost acela de a identicica si corela anumiti parametri asociati trombofiliei.

Chestionarul a fost aplicat in mediul online, cu ajutorul aplicatiei google survey forms.

Varsta persoanelor:

Figura 11. Varsta persoanelor din grupul de studiu

Se poate observa ca varsta nu este un factor ….

Mutatiile asociate trombofiliei ereditare:

Figura 12. Graficul realizat cu incidenta polimorfismelor associate trombofiliei

Se poate observa ca

Figura 13.

Persoane care au sarcini pierdute

Figura 14. Incidenta pierderii sarcinilor in grupul de studiu

Nr sarcinilor pierdute/espondent

Figura 15. Numarul sarcinilor pierdute per respundent

Figura 16. Grupele de varsta la momentul pierderii sarcinilor

Figura 17. Varsta gestationala in momentul pierderii sarcinilor.

Acestea au fost grupate in intervale relevante. Primele doua grupe fiind asociate in special cu avorturile menstruale si cu incetarea in evolutie a embrionilor. Urmatoarele doua grupe de interes sunt asociate in special cu anomalii placentare, de coagulare, nasteri premature sau cu moartea fetala intrauterina.

Figura 18. Metoda obtinerii sarcinii

Cu relevanta in acest studiu deoarece incidenta avorturilor si complicatiilor in sarcina este mai mare in cazul sarcinilor obtinute prin tehnici de reprodcere umana asistata comparativ cu sarcinile obtinute in mod natural. Asadar, am vrut sa evidentiez ca procentul atat de mic asociat pierderilor de sarcina obtinute prin FIV se datoreaza si faptului ca in protocolul de pregatire al femeii in vederea demararii procedurilor de reproducere asistata sunt incluse analize de screening genetic pentru depistarea anomaliilor de coagulare. Acest lucru este pozitiv, putandu-se intervenii prompt cu medicatie specifica si preventiva.

Un procent foarte mare (80,4%) in cadrul grupului de studiu il reprezinta sarcinile pierdute in lipsa unui tratament adecvat.

Figura 19. Incidenta sarcinilor pierdute in cadrul grupului de studiu in timpul carora nu au fost administrate medicamente.

Figura 20. Incidenta administrarii medicamentelor in timpul sarcinilor care ulterior au fost pierdute si tipul terapiei medicamentoase.

In 60,9% din cazuri se observa ca nu a fost administrat niciun tip de medicament in timpul sarcinilor pierdute. Totusi, in restul cazurilor, 39,1% s-au aplicat terapii medicamentoase dar totusi sarcinile nu au fost finalizate cu succes, de unde putem deduce urmatoarele aspecte posibile:

au existat alte cauze care au condus la pierderea acestor sarcini,

medicatia nu a fost adecvata,

In imaginea 21 se poate observa modul prin care s-a produs pierderea sarcinilor. Un procent ridicat il constituie incetarea in evolutie a embrionului (56%). Acest lucru este des asociat cu trombofilia si complicatiile acesteia.

Figura 21. Modul prin care s-a produs pierderea sarcinilor.

In continuare am evidentiat si aspecte pozitive, si anume, incidenta sarcinilor finalizate cu feti vii la persoanele afectate de trombofilie. Se poate observa un procent ridicat asociat reusitei, 72,5% dintre femeile din grupul de studiu au reusit sa duca cu succes pana la final cel putin o sarcina (69% dintre cazuri), sau chiar mai multe.

Figura 22. Incidenta sarcinilor finalizate cu success in cadrul grupului de studiu.

Figura 23. Numarul sarcinilor finalizate cu feti vii.

Nasterea prematura a fost prezenta la 32,5% dintre cazuri, restul de 79,1% soldandu-se cu nasteri la termen.

Figura 24. Incidenta nasterilor premature si a celor la termen.

Un procent relativ mic, de doar 24% din sarcinile finalizate cu succes in timpul carora nu s-au administrat medicamente. In restul de 76% din cazuri, reusita a fost asociata cu terapia medicamentoasa specifica prevenirii complicatiilor trombofilice.Figura 25.

Terapia medicamentoasa a constat in anticoagulante, folati, hormoni (de genul progesteronului, care ajuta la fixarea in endometru uterin a sarcinii, precum si la mentinea viabilitatii acesteia). Figura 26.

Figura 25. Incidenta sarcinilor finalizate cu ajutorul terapiei medicamentoase.

Figura 26. Principalele medicamente administrate si procentul acestora.

Un alt aspect deosebit de important in acest studiu, il constituie stilul de viata al respondentelor. Un stil de viata nesanatos duce la agravarea simptomatologiei bolii, in schimb, un stil de viata sanatos poate ameliora pana la anulare a simptomatologiei si a complicatiilor trombofiliei.

De exemplu, in cazul polimorfismului genei MTHFR C677T statusul homozigot este deseori asociat cu hiperhomocisteinemia. Dar nu la toti indivizii cu aceasta mutatie este prezent un nivel crescut de homocisteina, ci in special la cei cu un stil de viata nesanatos asociat in principal cu lipsa folatilor si a altor vitamine din grupul B.

Figura 27. Stilul de viata al femeilor din grupul de studiu.

Un procent de 22,7% dintre respondente au declarat ca de-a lungul vietii au avut tromboze venoase. In acest grup de studiu, nu s-au regasit complicatii mai grave asociate trombofiliei, si anume tromboembolismelor pulmonare, accidentelor vasculare. Figura 28.

22,7% au declarat ca, in afara sarcinilor, administreaza anticoagelante. Acest grup de medicamente este asociat cu agravarea simptomatologiei asociate trombofiliei. Figura 29.

Figura 28. Alte complicatii aparute inafara sarcinilor

Figura 29. Administrarea unor medicamente considerate ca au interactie negativa cu trombofilia.

VII Concluzii:

Bibliografie:

Astrid Dossenbach-Glaninger, Michael van Trotsenburg et al. Plasminogen Activator Inhibitor 1 4G/5G Polymorphism and Coagulation Factor XIII Val34Leu Polymorphism: Impaired Fibrinolysis and Early Pregnancy Loss. In Clinical Chemistry. 2003; 49:1081-1086.