Master Biologie Medical ă [604600]

1

UNIVERSITATEA "BABEȘ -BOLYAI" CLUJ -NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Master Biologie Medical ă

Co-încapsularea curcuminei și doxorubicinei în lipozomi
cu timp de circulație prelungit ca strategie de țintire
pasiv ă a cancerului de colon

Coordonator : Student: [anonimizat],
Iulie 2017

Cuprins

2

Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 343
1. Introducere în patogeneza și terapia cancerului de colon ………………………….. ………………………. 674
1.1. Cancerul de colon. Generalită ți și cauze. ………………………….. ………………………….. ………………………. 684
1.2. Procese asociate dezvoltarii tumorale ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 785

3
Listă de abrevieri

A549 – linii celulare de cancer pulmonar uman
ACF – clustere de glande tubulare anormale de la joncțiunea dintre colon și rect(din engleză aberrant
crypt foci)
AP-1- proteina activatoare 1(din engleză – activator protein 1)
APC – o proteină supresoare tumorală codificată de gena APC (din engleză adenomatous polzposis
coli)
BcI2 – limfomul 2 al celulelor B(din engleză – B-cell lymphoma 2)
C26- celule canceroase de colon murin
C-myc- genă reglatoare care codifică un factor de transcri ere
CAC – colită asociată cancerului
COLO 205 – cellule canceroase de colon uman
COX -2- ciclooxigenaza 2
CRC – cancer colorectal
CURC – curcumină
CXCR4 – receptorul chemokinic C -X-C de tip 4(din engleză – C-X-C chemokine receptor type 4)
DEN -dietilnitrozamină
DL- limfomul Dalton
DOX – doxorubicină
EGFR – receptorul factorului de creștere epidermal
ErbB2 – receptorul factorului de creștere epidermal 2( HER2 ) codificat de gena ERBB2
EMT – tranziție epitelial -mezenchimală
EP2- receptorul pentru prostaglandina E2(din e ngleză prostaglandin E2 receptor 2)
EPR – efectul de permeabilitate și retentive îmbunătățit
Fas- receptorul de deces de pe suprafața celulelor

4
Flt-1- receptorul factorului de creștere al endoteliului vascular
Fzd7 – proteină codificată de gena FZD7 (din engl eză Frizzled -7)
5-Fu- 5-fluorouracil
GDNV – nanovectori obținuți prin reasamblarea lipidelor derivate din ghimbir
GPx – glutation peroxidaza
GSH – glutation tripeptidic
GSK -β- glicogen sintaza kinazei 3
GST -π- glutation transferaza π
HA- acid hialuronic
HAase – hialuronudază
HCC – carcinom hepatocellular
HCT116 – celule canceroase de colon uman
HCT15 – celule canceroase de colon uman
HepG2 – cellule hepatice umane
HIF- factorul indus de hipoxie (din engleză – hypoxia -inductible factors)
HIF-1α- factorul -1 indus de hipoxie
HT29 – celule canceroase de colon(Homo sapiens)
IBD- boala intestinului inflamator
IkBα – membru al familiei de proteine celulare care inhibă NF -kB(din engleză – nuclear factor of
kappa light gene enhancer in B -cells inhibitor, alpha)
IL – interleukina
K-ras- proto -oncogenă care corespunde oncogenei identificată în virusul sarcomului Krasten la
șobolan
KHOS – celule din măduva osoasă
LoVo – cellule canceroase de colon uman(prezentând metastază la nodulii limfatici)
LPN – nanoparticule polime rice acoperite cu lipide
MDR – rezistență multiplă la medicamente(din engleză – multidrug -resistant)

5
MMP – matrixmetaloproteinaze
MMR – proteinele de reparare a nepotrivirilor din AND
MPS – sistemul fagocitar mononuclear
MRP – proteina asociată rezistenței multiple la medicamente(din engleză – multidrug resistant
associated protein)
MSN – nanoparticule de siliciu mezoporoase
NF-kB- factorul nuclear de transcriere kB(din engleză – nuclear factor kappa -light-chain -enhancer of
activ ated B cells )
NP- nanoparticule
OS- osteosarcom
p53- proteină supresoare tumorală
P-gp- P-glicoproteina 1(din engleză – P-glycoprotein 1)
PEG – polietilenglicol
PGE2 – prostaglandina E2(dinoprostonă)
PI3K – fosfoinositidă 3 -kinază(din engleză – phosphoinositide 3 -kinase)
RNI- intermediari de azot reactivi
RNS – specii reactive de azot
ROS – specii reactive de oxigen ( din engleză – rereactive ox ygen species)
SSMPEG -PCL – micelle MPEG -PCL în formă de stea
STAT3 – factor de transcriere codificat de gena STAT3 (din engleză – signal transducer and activator
of transcription 3= traductorul de semnal și activatorul 3)
TGF -β- factorul de creștere transformat β
TNF -α- factorul α de necroză tumorală
TOPO II – topoizomeraza II
VEGF – factorul de creștere al endoteliului vascular
VEGFR – receptorul factorului de creștere al endoteliului vascular( receptorii tirozin – kinazici )
Wnt – cale de semnalizare

6
Introducere

Principalele cauze ale morbidită ții și mortalită ții la nivel mondial, cu aproximativ 15
milioane de cazuri noi și cu peste 8 milioane de decese, sunt reprezentate de variatele forme de
cancer. Organiza ția Mondială a Sănătă ții sus ține că în Africa, America Centrală și de Sud, Asia, apar
cazuri noi de cancer în prpor ție de peste 60% (Beets și colab., 2017 ).
Terapia cancerului are ca scop principal ac țiunea antiangiogenă și apoptotică asupra
celulelor tumorale, cu efecte secundare cât mai restrânse posibil ( Yallapu și colab., 2012).
Etapele urmărite în mod conven țional în terapia cancerului sunt rezec ția tum orii (în cazul tumorilor
solide), chimioterapia, imunoterapia și radioterapia (Akhter și colab., 2013).
În general pentru un efect cât mai consistent asupra celulelor canceroase și pentru o afectare
colaterală redusă în chimioterapie se utilizează sisteme de doi sau mai mul ți agen ți co-încapsula ți în
nanotransportori. De regulă agen ții co -încapsula ți își delimitează rolurile, unii prezentând un rol
antiangiogen, iar al ții un rol apoptotic.
Rolul nanotransportorilor este crucial într -un astfel de sistem, deoarece men țin încapsulate
medicamentele pe tot traseul sanguin până la tumoră, evitându -se astfel pierderii mari din doza
administrată și eventuale localizări nedorite care să producă efecte adverse asupra altor zone din
organism.

1. Introducere în patogeneza

1.1. Cancerul de colon. Generalită ți și cauze.

7
Cancerul de colon reprezintă a doua cauză de deces în Europa, survenită în urma unei forme
de cancer, e șantioanele pe țări prezentând mari varia ții (Beets și colab., 2017 ). La nivel mondial, în
rândul bărba ților cancerul de colon este al treilea cel mai frecvent tip de cancer, iar în rândul
femeilor acest tip de cancer ocupă locul doi ca frecven ță, având de cele mai multe ori ca definitivare
decesul, reprezentând a patra cea mai întâl nită cauză de deces din lume, în rândul tipurilor de cancer
(Ferlay și colab., 2015), ( Torre și colab., 2012).
Factorii de risc care duc la apari ția cancerului de colon includ (Lieberman, 2009) : fumatul;
obezitatea; inflama ția intestinală cronică; consumul mare de alcool, de carne ro șie, carne procesată
și de grăsimi; vârsta înaintată poate aduce de asemenea o predispozi ție pentru acest tip de cancer;
sedentarismul.
Pentru a preveni apari ția cancerului de colon sunt recomandate (Rennert, 2007):
 consumul mare de lichide (aproximativ 2.5 L de apă zilnic);
 consumul de alimente bogate în fibre;
 activită țile fizice;
 evitare consumului de alcool și tutun.
Persoanelor care prezintă un risc crescut de a dezvolta cancer de colon le este recomandată
ca medicam enta ție Aspirina și Celecoxibul, deoarece aceste medicamente au efecte care pot
contribui la o astfel de preven ție (Cooper și colab., 2010 ), (Emilsson și colab., 2017).
De asemenea, se poate detecta și evita orice formă precoce de cancer de colon prin investigții de
specialitate, astfel putând fi depistată cu u șurință prezen ța polipilor adenomato și, în mare parte
premergători instalării unei forme de cancer de colon(ace știa putând fi înlătura ți prin colonoscopie
sau sigmoidoscopie). Chiar și o simplă a naliză asupra probelor fecale poate semnala o inciden ță a
cancerului de colon, iar o investiga ție CT poate fi la fel de concludentă precum colonoscopia, doar
că această tehnică nu oferă posibilitatea eliminării polipilor adenomato și (Lieberman, 2009) .

1.2. Procese asociate dezvoltarii tumorale

1.2.1. Inflama ția

8
Unul dintre cei mai importan ți factori de risc al apari ției cancerului de colon, îl reprezintă
boala intestinului inflamator, acest factor fiind implicat atât în formele de cancer de colon sporadic
cât și în cele ereditare (Aggarwal și colab., 2014 ).
Chiar dacă încă nu se cunosc cu certitudine care ar fi mecani smele moleculare prin
intermediul cărora inflama ția degenerează spre o formă de cancer de colon, conform literaturii de
specialitate sunt presupuse a fi premergătoare în acest sens colita asociată cancerului(CAC) sau alte
forme de cancer colorectal (Aggarw al și colab., 2014 ).
În toate etapele tumorigenezei(ini țiere, dezvoltare, progresie și metastazare) este sesizată în
mod cert implicarea celulelor imunitare distincte, citokinelor și a altor mediatori imuni ( Atreya și
Neurath, 2008 ).
Un subtip al CRC care este asociat cu IBD îl reprezintă CAC, însă în unele cazuri CAC
poate prezenta asemănări cu diverse tipuri de CRC, fără a semnala vreo asociere cu boala
intestinului inflamator ( Feagins și colab., 2009). Mecanismul de dezvoltarea a CRC și a CAC constă
în acumularea de muta ții în oncogene și în genele supresoare tumorale, care pot produce activarea
semnalizării β-cateninei într-o manieră aberantă( Figura 1.) (Terzić și colab., 2010 ).
Tranzi ția celulelor preneoplazice singulare spre clusterele de glande tubulare anormale de la
jonc țiunea dintre colon și rect și apoi spre adenom și carcinom colorectal este mediată de calea de
semnalizare β-catenină sau de alte componente ale acestei căi și de muta țiile în APC. Produc ția de
citokine proinflamatorii care ind uc muta ții în oncogene și în genele supresoare tumorale (APC, p53,
K-ras), precum și diferitele mecanisme care generează o instabilitate genomică sunt trăsături
definitorii ale inflama ție cronice, în urma căreia survine CAC.
Dezvoltarea tumorii, progresia și metastazarea acesteia ob țin condi țiile propice datorită
inflama ției persistente, care activează proliferarea și facilitează proprită țile antiapoptotice ale
celulelor premaligne (Terzić și colab., 2010) .

9

Figura 1. Mecanismul de dezvoltarea a CRC și a CAC (Terzić și colab., 2010 )
GSK -β: kinaza glicogen sintazei -β; RNI: intermediari de azot reactivi; TGF: factorul de cre ștere transformant.

Atât în situa ția CRC sporadic cât și în CAC, căile de semnalizare și genetice care implică
(TGF) -β, β-catenina, Wnt, MMR, K -ras și p53 prezintă modificări, cu toate că sincronizarea p53 și a
APC și activarea K -Ras pot fi diferite între CRC și CAC ( Lakatos și Lakatos, 2008) , (Sheng și
colab., 1998) .
Degradarea proteolitică a APC, activarea β-cateninei și translocarea în nucleu reprezintă
rezultatul semnalizării dependente de Wnt, astfel celulele care con țin muta ții de activare a căii Wnt
sau a β-cateninei prezintă o susceptibilitate mai accentuată de a forma tumori decât muta țiile ini țiale
în celulele epiteliale sau în celulele stem normale ( Bienz și Clevers, 2000 ), (Korinek și colab.,
1997 ). Activarea KRAS ulterioară muta țiilor survenite în AP C și localizarea nucleară a β-cateninei
sunt precursoare dezvoltării CRC ( Phelps și colab., 2009 ).
Pe de altă parte, nu numai inactivarea APC poate fi cauza activării și translocării β-cateninei
în nucleu, ci și activarea receptorului EP2 de către prostagl andina E2 (PGE 2), produsă în timpul
inflama ției acute și cronice ( Castellone și colab., 2005).
Semnalizarea NF -kB activată în celulele inflamatorii și în celulele premaligne stimulează
exprimarea citokinelor care au rolul de a favoriza dezvoltarea tumorilo r (Terzić și colab., 2010) .
NF-kB este un heterodimer format din subunită țile p50, p65 și IkB α, care se găse ște în
citoplasmă, în timpul homeostaziei normale, sub o formă inactivată (Karin și Ben -Neriah, 2000) .
NF-kB reglează exprimarea diferitelor gene care joacă roluri critice în apoptoză, proliferare
și transformare, prin activarea sa datorată fosforilării și degradării IkB α în proteazom, urmată de

10
translocarea nucleară și de legarea la o secven ță consens spec ifică din promotorii acestor gene
(Karin și Ben -Neriah, 2000).
Rezisten ța celulelor canceroase la radioterapie și la chimioterapeutice survine în urma
activării lui NF -kB, totu și cre șterea sensibilită ții acestor celule la terapiile men ționate ar putea fi
realizată printr -o strategie terapeutică care să vizeze inhibarea activării lui NF -kB(Wang și colab.,
1996).
Pe de altă parte un alt factor cu puternică influen ță în dezvoltarea CAC și CRC este
reprezentat de STAT3.
O manifestare de interes în patogeneza CRC o reprezintă activarea STAT3 care declan șează
exprimarea genelor antiapoptotice(BcI2, BcI -xL), a lui VEGF( factor angiogenic ), a genel or
proliferative, putând induce și activarea prelungită a lui NF -kB (Terzić și colab., 2010) .

1.2.2. Stresul oxidativ

Echilibrul oxidativ al celulelor este men ținut prin mecanisme enzimatice endogene, însă
poate fi afectat de factorii exogeni (Goodman și colab., 2008). Dezechilibrul dintre radicalii
liberi( ROS ) și metaboli ții reactivi și eliminarea lor prin mecanisme de protec ție, ca antioxidan ți,
poartă numele de stres oxidativ (Durackova, 2009).
Speciile reactive de oxigen și azot(ROS/RNS) produc alterări asupra celulelor în timpul
metabolizării fiziologice a oxigenului. Datorită faptului că prezintă o consisten ță gene roasă de acizi
grași polinesatura ți, lipidele membranare și lipoproteinele sunt oxidate atât de ROS cât și de RNS,
speciile reactive de oxigen și azot, afectând de altfel toate macromoleculele(ADN, proteine).
(Mandal, 2017 ).
Un parametru biologic important care caracterizează starea redox celulară este reprezentat de
speciile reactive de oxigen, superoxidul( 𝑂2−), peoxidul de hidrogen( H2O2), radicalul
peroxinitrit (ONOO-) și radicalul hidroxil (𝑂𝐻 .), având rol esen țial în semnalizarea celulară, în
procese biologice și în procese patologice ( Chen și colab., 2016 ).
Conform literaturii de specialitate, echilibrul dintre oxidan ții și antioxidan ții celulari este
controlat de căile de semnalizare redox, iar produc ția ROS crescută din celulele canceroase duce la
răspunsuri redox nefire ști (Caraglia și colab., 2011).
Starea redox a celulelor este reglată în principal de glutationul tripeptidic(GSH), acesta
contribuind la adaptarea oxodativă a celulelor canceroase, conferind acestor celule rezisten ță la

11
medi camente prin interac țiunea lui cu ROS, prevenind deteriorarea ADN și a proteinelor ( Traverso
și colab., 2013 ).
Având în vedere cele men ționate mai sus și capabilitatea de a modula apoptoza, proliferarea
celulară și func ția imună, GSH poate fi considerat o țintă veritabilă în terapia anticancer ( Lu, 2013 ).
Factorii de transcriere redox(NF -kB, HIF , AP-1) pot afecta eficacitatea tratamentului
anticanceros prin inplica ții în angiogeneză, metastază, inflama ție, chemosensibilitate și apoptoză,
fiind asocia ți în mod direct cu manifestările ROS exercitate în celulele canceroase (Polimeni și
Gazzano, 2014) .
Condi țiile de stres oxidativ din micromediul canceros activează NF -kB, datorită eliberării
ROS(mesageri secundari în activarea NF -kB).
Inhibarea activită ții NF -kB poate fi relizată cu ajutorul antioxida ților sau prin supraexprimarea
enzimelor antioxidante, cum ar fi catalaza și Gpx (Das și Vinazak, 2011) .
Factorul de transcriere AP -1 este constitutiv exprimat în afec țiunile maligne, precum
cancerul de colon, care în urma activării prin intermediul kinazei c -Jun facilitează proliferarea și
transformarea celulelor tumorale, și reglează factorii de transcriere STAT3 și HIF -1α
(Kunnumakkara și colab., 2008).
Pe de altă par te atât sinteza c ât și activarea lui AP -1 poate fi indusă și de ROS, iar această
activare este implicată în carcinogeneza asociată cu inflama ția(cancerul de colon). Prevenirea
apoptozei este datorat ă produc ției de metaboli ți în timpul proliferării celulare și se realiz ează prin
inducerea căilor sensibile redox, cum ar fi calea de semnalizare controlat ă de AP-1 și NF-kB (Reuter
și colab., 2010).
Rezisten ța la terapie poate fi manifestată pe seama faptului că celulele canceroa se dezvoltă
mecanisme de adaptare în urma modificărilor care perturbă echilibrul celular redox ( Trachootham și
colab., 2009 ).
Supraproduc ția ROS are efecte antagoniste în celulele sănătoase și în celulele canceroase.
Dacă în cazul celulelor normale nivelul de ROS crescut, amplifică instabilitatea genomică și
produce stresul oxidativ și carcinogeneza, în celulele canceroase ROS contribuie la apoptoza lor
(Wang și Yi, 2008 ). Acest lucru este aso ciat cu faptul că celulele canceroase prezintă o cantitate mult
mai mare de ROS fa ță de celulele sănătoase, cantitate acumulată pe baza unei disfunc ții
mitocondriale, a unui metabolism aberant sau pe baza activării oncogenelor ( Pelicano și colab.,
2004 ). Având în vedere această diferen ță a nivelelor ROS din cele două tipuri de celule, este

12
explicabilă utilizare agen ților generatori de ROS singulari sau în terapie combinată, ace știa
exercitând un efect citotoxic, si induc ând apoptoza celulelor maligne ( Cabel lo și colab., 2007 ).

1.3.3. Angiogeneza

Una dintre manifestările cancerului care trebuie inhibată în mod sus ținut și rapid este
angiogeneza. Angiogeneza reprezintă fenomenul prin care pe parcursul dezvoltării tumorii este
antrenată neovascularizarea pe seama schimbărilor echilibrului dintre inductorii și inhibitorii de
angiogeneză (Folkman, 1971 ). Perturbarea acestui e chilibru survine în urma supraproduc ției
factorului de cre ștere al endoteliului vascular la nivelul țesutului pe seama transcrierii genei
modificate.
Creșterea permeabilită ții vasculare, stimularea proliferării și migrării celulelor endoteliale,
men ținându -se integritatea vasculară sunt efectele datorate legării VEGF la VEGFR ( Kim și colab.,
1993 ).
Având în vedere studiul realizat pe cancerul de colon, s -a constatat că atât ligandul cât și
receptorii factorului de cre ștere al endoteliului vascular sun t supraexprima ți, iar prin inhibarea
ligandului se pot ob ține efecte antitumorale directe ( George și colab., 2001 ).
În vederea combaterii angiogenezei se disting atât agen ți care țintesc smnalizarea
receptorului VEGF, cât și agen ți care țintesc ligandul VE GF (Fan și colab., 2005), (Lesslie și colab.,
2006) .
O altă abordare de suprimare a angiogenezei constă în inhibarea căii EGFR, care determin ă o
diminuare a factorilor proangiogenici, printre care VEGF și IL-8, având ca rezultat o scădere a
densită ții microvasculare tumorale ( Perrotte și colab., 1999 ). Factorul responsabil de activarea
angiogenezei face parte din familia factorilor de cre ștere deriva ți din plachete(VEGF -A, VEGF -B,
VEGF -C, VEGF -D, VEGF -E), dintre care VEGF -A este cel implicat în neovascu larizare ( Shinkaruk
și colab., 2003 ), (Ferrara, 2004 ). Receptorii tirozin -kinazici ai ligandului VEGF, implica ți direct în
formarea vaselor de sânge sunt Flt -1 din clasa VEGFR -1 și Flk -1 din clasa VEGFR -2 (Rmali și
colab., 2007 ).
Dacă Flk -1 este implicat în transducția semnalului de stimulare în celulă prin activarea
cascadei tirozin -kinazelor, Flt -1 are implicări în inducerea secre ției de citokine de către macrofage,
în inflama ție și în carcinogeneză ( Schwartz și colab., 2010 ).

13
Unul dintre cei mai puterni ci stimuli pentru exprimarea VEGF, surprins în cadrul tumorilor solide,
este HIF -1, considerat și ca reglator al angiogenezei în hipoxie ( Mizukami și colab., 2007 ).
Pe de altă parte supravie țuirea și proliferarea celulelor maligne este facilitată de transcrierea
constitutivă a chemokinelor tumorigene și angiogene modulate de NF -kB (Li și colab., 2005) .

1.3.4. Invazia și metastazarea celulelor tumorale

Metastazarea presupune diseminarea singulară sau a unor aglomerări mici de celule
canceroase prin vasele sanguine sau limfatice și extravazarea lor colateral în diferite organe ( Bui și
colab., 2015 ). Dezvoltarea metastazelor poate fi limitată de intrarea într-o stare latentă reversibilă a
celulelor canceroase care supravie țuiesc în urma diseminării, acestea fiind greu de eradicat ulterior
datorită rezisten ței lor la chimioterapie în compara ție cu celulele cancerigene primitive ( Luzzi și
colab., 1998 ).
În general, celulele imune și inflamatorii prezintă o distribu ție marginală în densitatea
tumorilor avansate și metastazate, unde are loc și invazia, iar etapele cheie ale metastazării sunt
influen țate de micromediul inflamator ( Laghi și colab., 2009), ( Wu și Zhou, 2009 ).
Tranzi ția epitelial -mezenchimală(EMT), reprezintă prima etapă a metastazării și este
caracterizată de invazia celulelor canceroase în membrana bazală, celule a căror motilitate a fost
crescută prin dobândirea unor caracteristici fibroblast ice, care reu șesc astfel să ajungă la vasele de
sânge eferente sau la cele limfatice ( Kalluri și Weinberg, 2009 ).
Pierderea expresiei E -caderinei de către celulele epiteliale maligne caracterizează EMT,
această etapă fiind reglată de TGF -β (Xu și Pasche, 2007 ).
Chiar dacă β-catenina din celulele canceroase de colon a fost activată, supraexprimarea
ligandului pentru receptorii Wnt, Fzd7, conferă motilitate ridicată și capacită ți metastatice acestor
celule în scopul tranzi ției epitelial -mezenchimale ( Ueno și colab., 2009 ).
Pe de altă parte EMT poate fi influen țat de activarea căii de semnalizare NF -kB și/sau
STAT3, dar și de citokinele proinflamatorii( IL -1, TNF -α, HIF-1α, IL-6), aceste citokine având
sarcina de a activa factorii de transcriere care reglează EMT ( Wang și colab., 2009 ), (Yang și
Weinberg, 2008 ).
Metastazarea celulelor cancerului de colon este favorizată de stabilizarea Snail(factorul de
transcriere care reglează EMT), prin intermediul semnalizării TNF -α (Wu și colab., 2009 ).

14
Acțiuni antitumorigene importante asupra celulelor metastatice singulare, dar și asupra unui
efect metastatic secundar slab sunt surprinse în cazul unor citokine produse de sistemul imunitar
(Lin și Karin, 2007 ).
Mecanismele prin care semnalizarea CXCR4 regle ază metastazarea sunt atrac ția
chemotactică a originilor metastatice și stimularea neoangiogenezei tumorale ( Schimanski și colab.,
2008 ).
Un actant important în stimularea motilită ții celulelor canceroase în vederea pregătirii ni șei
pre-metastatice este re ceptorul tirozin -kinazic din clasa VEGFR -1, Flt -1 (Lesslie și colab., 2006 ).
Procesul de formare a ni șei pre -metastatice constă în producerea fibronectinei de către fibroblaste,
aceasta reprezentând o țintă pentru migrarea celulelor progenitoare hematop oetice(monocite,
macrofage) care con țin Flt -1. Celulele tumorale vor fi mobilizate ulterior și li se va conferi
motilitatea necesară pentru metastazare (Kaplan și colab., 2005), (Kaplan și colab., 2006).

2.Strategii terapeutice in cancer

2.1. Chimioterapie, radioterapie, rezectie chirurgicala

În vederea tratării cancerului de colon prima etapă este rezec ția chirurgicală, urmată de
chimioterapie, imunoterapie și radioterapie (Ahmad și colab., 2015) . Deși rezec ția tumorală, urmată
de chimioterapie este cea mai utilizată strategie în terapia cancerului, această strategie are de cele
mai multe ori un efect terapeutic slab și efecte toxice asupra celulelor sănătoase, deoarece
majoritatea chimiterapeuticelor nu po t să distingă celulele canceroase de cele sănătoase (Zhang și
colab., 2016).
În terapia carcinomului de colon sunt utilizate căteva chimioterapeutice care prezintă atât
efecte anticancerigene dar care prezint ă și efecte toxice colaterale, printre acestea numărându -se
oxaliplatina, 5 -fluorouracilul, irinotecanul , doxorubicina .
Oxaliplatina este un medicament care are o activitate antitumorală puternică în cancerul de
colon, manifestată prin împiedicarea replicării și transcrierii ADN prin formarea legături lor crosslink
între două resturi de chinină adiacente sau o guanină și o adenină, însă prezintă efecte secundare
semnificative în cazul dozelor cumulative(disfunc ția rinichilor, ototoxicitate, neutropenie) (Li și
colab., 2007) .

15
Irinotecanul este un deriv at semisintetic al camptotecinei utilizat în cancerul de colon
metastatic, având efecte terapeutice bune, dar și câteva efecte secundare slabe, cum ar fi diareea
neutropenia (Fuchs și colab., 2006 ).
5-FU este un chimioterapeutic ce inhibă sinteza ADN și ARN, prezentând efecte secundare
precum stomatita, diareea, neutropenia și eritrodisestezia palmar -plantică(sindromul "mâna -picior")
(Parker și Cheng, 1990) .
Alte strategii terapeutice în cancerul de colon metastatic constau în utilizarea anticorpilor
monoclonali Cetuximab (Erbitux) și Panitumumab (Vectibix) care ac ționează asupra factorului de
creștere epidermal, însă aceste strategii prezintă și efecte secundare cum ar fi diareea, febra,
oboseala, acneea și presiune arterială scăzută (Carethers, 2008 ).
Radioterapia se bazează pe utilizarea radia țiilor X și poate fi aplicată atât înainte cât și după
rezec ția chirurgicală pentru a preveni recidiva acestei afec țiuni sau metastazarea, însă prezintă și
efecte secundare cum ar fi iritarea colonului, a pielii, grea ță, iritarea vezicii urinare (Tepper, 1983) .

2.2 Curcumina si doxorubicina , administrate in forme libere in terapia anti –
canceroasa
2.2.1. Doxorubicina – mecanism de actiune

Doxorubicina este un antibiotic antraciclinic eficient în terapia cancerului, însă aplicarea
clină a acesteia a fost restric ționată datorită posibilită ților sale terapeutice restrânse și a dezvoltării
MDR ( Deepa și colab., 2014 ). Din punct de vedere terapeutic , restric ționarea acesteia survine în
urma citotoxicită ții induse prin generarea speciilor reactive de oxigen. (Yuan și colab., 2013)
Clorhidratul de doxorubicină este un agent chimioterapeutic a cărui efect apoptotic se
datorează capacită ții de a interac ționa cu ADN nuclear prin intercalare și inhibarea biosi ntezei
macromoleculare (Friesen și colab., 2008), (Kim și colab., 2011).
DOX prezintă o tendin ță inerentă de a se transloca în nucleu, acumulându -se efectiv aici prin
formarea unui complex DOX -proteazom (Minotti și colab., 2004), (Kiyomiya și colab., 2001) .
Anterior translocării în nucleu și formării acestui complex, D OX liber penetrează membrana
plasmatică pe cale nespecifică, prin interac țiuni electrostatice și hidrofobe cu fosfolipidele
(Speelmans și colab., 1997).

16
Un studiu realizat in vitro pe celulel e Colon -26 și HT -29, în vederea determinării cantitative
a efectelor apoptotice rezultate în urma administrării DOX individual e, a demonstrat faptul că
procentul celulelor viabile a fost unul scăzut datorită capacității DOX individual e de a pătrunde
rapid în celule prin difuziune pasivă, exercitându -și efectele sale antitumorale direct în nucleu . Pe de
altă parte, acest studiu realizat și in vivo, pe șoarceii Balb/c injectați cu celule Colon -26, a arătat o
scădere a volumului tumoral comparativ cu controlul (șoarecii cărora li s -a administrat PBS) (Zhang
și colab., 2016) .
Referitor la efectele colaterale ale administrării DOX individuale, studiul realizat de Mosafer
și colab. a demonstrat că în urma administrării DOX individuale(5 mg/kg masă corporală) la șoarcii
Balb/c injectați cu celule C26 s -a sesizat o scădere semnificativă a greutății corporale a
subiecților(cu 18,3% față de greutatea inițială la 6 zile după administrare) (Mosafer și colab., 2017).
Evaluarea in vitro a nivelului de rezistență a liniei celulare HCT -15 expuse la o doză de
DOX individuală cuprinsă între 0,1µM și 30µM a demonstrat o rezistență ușoară la acest tratament,
cu un IC 50 de 4. 7(±0 ,3)µM (Argov și colab., 2009) .

2.2.2. Curcumina – mecanism de actiune
Curcumina este un constituent polifenolic alimentar al plantei Curcuma longa (Fan și colab.,
2013) și, deși este utilizată ca remediu natural încă din istorie, fără să -i fie cunoscute toate
proprietă țile farmacologice, în prezent se știe că aceasta prezint ă activită ți antimicrobiene,
antiinflamatorii, antiangiogene și anticarcinogene, func ții neuro -protectoare, func ții cardio -, nefro -,
miocardio -protectoare, și de suprimare a trombozei, activită ți anti -reumatice, hipoglicemice și
activitate ancancerigenă (A hmad și colab., 2014).
Curcumina sau diferuloilmetanul reprezintă un compus proapoptotic care atrage interesul în
terapia cancerului, fiind capabilă să țintească mai multe căi de semnalizări (Li și colab., 2007).
Acest compus polifenolic este format dintr -un amestec de diferuloilmetan (~77%), demetoxi
Curcumină (~17%) și bisdemetoxi Curcumină (~6%) (Ahmad și colab., 2015).
În formă liberă, CURC este slab absorbită în tractul gastrointestinal, și prin urmare
eficacitatea sa clinică poate fi limitată, însă încapsularea acesteia în nanoparticule, ar permite o
administrare sistemică (Li și colab., 2007).

17
În diferite celule canceroase s -a observat că CURC acționează ca un chemosensibilizator în
suprimarea supraexprimării P -gp, Bcl -2, NF-kB, HIF-1α pentru a anula MDR, inhibând proliferarea
celulară și inducând apoptoza într -o manieră dependentă de doză (Xu și colab., 2013).
Curcumina ac ționeză în prevenirea cancerului prin perturbarea ciclului vicios al produc ției
constante de ROS, responsabile de un micromediu puternic oxidativ care facilitează proliferarea
tumorilor (Das șiVinayak, 2011). Totodată, aceasta prin diversele ei proprietă ți biologice manifestă
și un efect de suprimare a factorului nuclear kB și unul inhibitor angiogenic (Aggarwal și colab.,
2003), însă totu și îi este limitată aplicarea clină, deoarece prezintă o biodisponibilitate scăzută (Li și
colab., 2007).
Pe lângă poten țialul Curcuminei de a modula factorul NF -kB, aceasta mai modulează și alte
căi de semnalizare în care sunt implica ți AP-1, P-gp, glutation, protein kinaza C, ATPazele, ErbB2,
alpha -1 acid glicoproteina, COX -2, MMP, Ciclin D1 , etc., conferindu -i acesteia activită ți multi –
terapeutice, mai ales atunci când este încapsulată în nanotransportori (Anand și colab., 2008).
Pe de altă parte CURC este capabilă și să suprime exprimarea receptorilor de estrogen și a
receptorului factorului de cre ștere epidermică, ace știa fiind factorii de ce ștere asocia ți cancerului
(Kunnumakkara și colab., 2008).

Figura 2. Mecanismele de acțiune ale Curcuminei în terapia cancerului (adaptată după Ahmad și colab., 2015)

18

Din punct de vedere molecular capacitatea Curcuminei de a inhiba cre șterea tumorilor se
datorează efectelor acesteia asupra genelor apoptotice, moleculelor de semnalizare celulară,
reglatorilor de angiogeneză și a factorilor de transcriere, factorul NF -kB fiind un mediator principal
prin intermediul căruia CURC afectează aceste căi (Li și colab., 2007).
Curcumina este capabilă să interac ționeze cu ADN, ARN, factorii de cre ștere, factorii de
transcriere și cu multiple proteine care sunt implicate în calea de transduc ție a semnalului celular
(Salem și colab., 2014) ,(Gupta și colab., 2013 ).
Curcumina poate să ac ționeze prin două tipuri de mecanisme (Shezad, Lee și colab., 2013) :
– intrinsec (mitocondrial);
– extrinsec (mediat prin Fas (receptorul de deces pe suprafa ța celulelor)).
Activarea supresorului p53 ini țiază mecanismul intrinsec de ac țiune al CURC . Favorizarea
apoptozei prin formarea de pori în membrana mitocondrială se datorează activării BcI -2 și proteinei
x asociate cu BcI -2, prin suprareglarea lui p53 ( Salem și colab., 2014).
Conform studiului realizat de Youns M. și Fathy G. M. proliferarea poate fi inhibată și
apoptoza poate fi indusă prin mecanismul extrinsec de ac țiune al CURC mediat prin activarea
receptorului TNF ( Youns și Fathy, 2013 ).
Conform studiului de cercetare rea lizat de Chuang și colab. s -a observat că prin tratarea
șoarecilor cu HCC (carcinom hepatocelular), indus de dietilnitrozamină (DEN), cu CURC , apare un
efect chemopreventiv ( Chuang și colab., 2000).
Pe de altă parte, asupra celulelor HCC umane CURC are cap acitatea de a suprima
proliferarea acestora, scăzând exprimarea β-cateninei (C -myc, VEGF) prin intermediul căii de
semnalizare Wnt ( Xu și colab., 2013).
Potrivit rezultatelor ob ținute de Das și Vinayak, în studiul realizat pe șoarecii purtători de
DL ( limfom Dalton), CURC inhibă stresul oxidativ prin inhibarea procesului de carbonilare proteica
în micro -mediul cancerului, în ficatul acestora (Das și Vinayak, 2011).

2.2.3. Terapia combinat ă cu curcumină și doxorubicină
Datorită eterogenită ții celulelor canceroase chimioterapia asociată a devenit un regim
standard pentru tratarea pacien țiilor cu diferite tipuri de cancere, însă acest tip de chimioterapie

19
combinat cu medicamente care au proprietă ți distincte, cum ar fi solubilitatea, necesită în general
utilizarea unor transportori multipli sau a unor solven ți, acest lucru limitând probabilitatea de
furnizare simultană ( Sun și colab., 2014 ). Combina țiile de doi sau mai mul ți agen ți terapeutici pot
depă și toxicitatea și suprima alte efecte secundare care lim itează utilitatea mai multor medicamente,
fie prin contracararea compensării biologice, fie prin accesarea mecanismelor multi -țintă specifice
contextului ( Kaelin , 2005), ( Lehár și colab., 2009).
Deși DOX și CURC sunt medicamente care ac ționează prin mecanisme diferite împotriva
cancerului ( Jagetia și Aggarwal, 2007 ), (Lown, 1993 ), studiile au arătat că terapiile care combină
DOX cu CURC cresc rata de regresie a tumorii comparativ cu aceste medicamente administrate
individual ( Duan și colab., 2012 ), (Goel și Aggarwal, 2010 ). Administrarea concomitentă a două sau
mai multe medicamente poate reduce dozajul fiecărui medicament și poate îmbunătă ți indicele
terapeutic al medicamentelor individuale, ducând la o activitate anticancerigenă îmbunătă țită (Eldar –
Boock și colab., 2013).
Astfel , administrarea simultată a CURC cu diver și agen ți chimioterapeutici, precum
Doxorubicină (cancer de plămâni), 5-flurouracil (cancer de colon) sau camptotecina(cancer de
colon+hepatic) , a rezultat într-un efect de poten țare al efectului citotoxic al acestor compuși
chimioterapeutici (Bava și colab., 2004) , (Wang, 2013), (Shakibaei, 2013).
2.3. Modalități de țintire a tumorilor cu curcumină și doxorubicin ă, în
nanoformulări

Trăsăturile fizice distincte ale tumorilor care permit acestora să reziste abordărilor terapiei
tradi ționale împreună cu complexitatea sistemului biologic reprezintă obstacole mari în vederea
aplicării unei strategii eficiente de tratament specifică unui situs (Sriraman și colab., 2014).
Datorită proprietă ților fizico -chimice ale chimioterapeuticelor, problemelor legate de toxicitatea lor,
dar și a capacită ții acestora de a ținti orice celulă care se divizează rapid în organism, administrarea
sistemică a acestora este limitată.
Pe de altă parte s -a constat că d oar o cantitate mică din doza administrată ajunge la locul
țintă, astfel survenind complica ții și anume dezvoltarea rezisten ței la medicamente, tocmai datorită
faptului că tumorile sunt expuse la cantită ți limitate de medicament. Limitările eliberării
medicamentelor au fost eludate, datorită progreselor din domeniul furnizării medicamentelor, și
anume prin dezvoltarea nanoparticulelor(NP) (Sriraman și colab., 2014).

20
Administrarea intravenoasă a nanoparticulelor reprezintă un traseu fiabil și rapid, care
permite distribuirea completă prin circulația sistemică, însă complexitatea sistemului in vivo care
provoacă multiple bariere biologice împiedică eliberarea medicamentelor din NP în tumorile solide
(Chrastina și colab., 2011 ).
Ajunse în circula ția sistemică, NP pot fi recunoscute de către celulele sistemului fagocitar
mononuclear și apoi eliminate din circula ție, acumulându -se în ficat, procese ce au loc după ce
acestea au fost opsonizate de proteinele din sânge ( Hume și colab., 2006 ).
A doua bar ieră biologică, ce trebuie depă șită de NP care au evitat eliminarea de către MPS,
este extravazarea lor eficientă din circula ție (Figura 3.), dincolo de înveli șul endotelial spre
micromediul tumoral ( Malik și colab., 1989 ).
Intersti țiul tumoral caracterizat prin presiune ridicată a fluidului intersti țial, pH scăzut, oxigenare
scăzută, prezen ța celulelor musculare netede, fibroblastele asociate cancerului, matricea
extracelulară, reprezintă pentru NP penultima barieră biologică ( Rabanel și colab., 2012 ).

Figura 3. Extravazarea nanoparticulelor din sistemul circulator în interstițiul tumoral (adaptată după Sriraman și colab.,
2014)

Pentru o eliberare intracelulară eficientă a agentului chimioterapeutic, NP extravazate din
circula ția sistemică, trebuie să fie capabile să depă șească ultima barieră biologică reprezentată de
celulele tumorale și de mecanismele intracelulare (Sriraman și colab., 2014).

21
Caracteristicile fizico -chimice ale NP(eterogenitatea suprafe ței, forma, dimensiunea și
sarcina) su nt importante în vederea evitării fagocitozei acestora survenite în urma formării
complexului proteine -NP prin opsonizare ( Aggarwal și colab., 2009 ).
În vederea ob ținerii NP cu un timp de circula ție în sânge prelungit, prin evitarea barierei
MPS, s -a aplicat o strategie de modificare a suprafe ței NP cu polimeri ( Storm și colab., 1995 ). În
acest sens au fost demonstrate avantajele abordărilor care implică acoperirirea NP cu
polietilenglicol(PEG) ( Zhu și colab., 2012 ).
Matrixmetaloproteinazele mediază pr oteoliza matricei extracelulare, în urma căreia este
stimulat procesul de angiogeneză, acestea fiind implicate în cancerele metastatice în stadii evoluate
(Stetler -Stevenson și colab., 1993 ).
Distribu ția în micromediul tumoral, a nanoparticulelor încărcate cu chimioterapeutice se
realizează prin intersti țiul tumoral, datorită fluxului sanguin prin convec ție bazată pe un gradient de
presiune sau prin difuzie pe baza unui gradient de concentra ție (Fukumura și Jain, 2017 ).
Presiunea crescută a fluidului intersti țial(IFP) se datorează lipsei de drenaj limfatic provocată de
distribu ția neuniformă a vaselor limfatice și eterogenită ții mari produse în fluxul sanguin vascular
(Junttila și de Sauvage, 2013 ).
Nanoparticulele dobândesc printr -o formulare corectă câteva caracteristici unice, cum ar fi o
dizolvare rapidă, o aderen ță sporită la suprafe țele biologice, o s olubilitate de satura ție crescută, cu
ajutorul cărora asigură o ac țiune rapidă și o bidisponibilitate îmbunătă țit medicamentului încapsulat
în inte riorul lor ( Riehemann și colab., 2009 ).
Pentru o direc ționare specifică, o eficacitate terapeutică crescută și efecte secundare reduse,
NP pot fi func ționalizate cu liganzi de țintire(anticorpi, aptameri) sau pot fi folosite NP magnetice,
astfel fiindu -le conferită capacitatea de a controla și de a sus ține eliberarea medicamentului la sau în
situsul localizat, modificând distribu ția și eliminarea ulterioară a medicamentului ( Raba nel și colab.,
2012 ).
Pentru a proteja medicamentele sau pentru a le fi mascate proprietățile farmaceutice
nefavorabile sau a le fi înlocuite cu cele ale nanotransportorilor, aceștia pot fi dezvoltați astfel încât
medicamentul să fie absorbit sau conjugat pe suprafața particulelor, să fie dizolvat în matricea
particulei sau să fie încapsulat în interiorul polimerului/lipidului. Pe de altă parte, EPR conferă
nanotransportorilor capacitatea de a se acumula preferențial în situsurile tumorale (Bamrungsap și
colab., 2017).

22
În vederea ob ținerii unei furnizării eficiente a medicamentelor, atunci când se dezvoltă
nanotransportorii se urmează două criterii importante (Cho și colab., 2008) :
 depă șirea barierelor biologice și direc ționarea specifică a medicamentelor la situsurile
tumorale după administrare, astfel încât să nu existe pierderi mari din volumul și activitatea
lor în circula ția sangvină;
 eliberarea controlată a formei active și diminuarea sau chiar anularea efectelor nocive asupra
țesuturilor sănătoase.
Îmbunătă țirea calită ții vie ții și cre șterea supravie țuirii pacien ților au fost ob ținute în urma
aplicării a două strategii de țintire în terapia cancerului (Sinha și colab., 2006) :
 Țintirea activă;
 Țintirea pasivă.

Figura 4. Țintirea activă vs. Țintirea pasivă (adaptată după Farokhzad și Langer, 2009)

2.3.1. Țintirea pasivă

O strategie care permite acumularea selectivă a nanomedicamentelor în țesuturile tumoarele
este reprezentată de țintirea pasivă, țintire ce se bazează pe caracteristicile patofiziologice ale
vaselor tumorale ( Cho și colab., 2008 ).
În vederea furnizării oxigenului și substan țelor nutritive pentru dezvoltarea masei tumorale,
sunt cruciale formarea de noi vase de sânge sau reorientarea celor existente în apropierea masei
tumorale, astfel sporind cre șterea celulele canceroase ( Carmeliet și Jain, 2000 ).

23
Efectul îmbunătă țit al permeabilită ții și reten ției se datorează unui dezechilibru produs de
reglatorii angiogeni(factorii de cre ștere și MMP ), determinând c a vasele de sânge să fie
dezorganizate și dilatate cu un număr mare de pori rezultați în urma joncțiunilor mărite dintre
celulele endoteliale și care compromite drenajul limfatic . Mai mult decât atât migrarea
macromoleculelor cu diametrul de până la 400 nm în micromediul tumoral este favorizată prin
efectul EPR (Sinha și colab., 2006).
Atât micromediul tumoral, care este diferit de cel al celulelor sănătoase cât și EPR facilitează
țintirea pasivă. Utilizarea lipozomilor acoperi ți cu un polimer sintetic pentru a proteja
medicamentele de distrugerea imună, în terapia cancerului reprezintă o strategie bună care se
încadrează în țintirea pasivă (Kubik și colab., 2005).
Datorită necesită ții unei cantită ți suplimentare de energie pentr u dezvoltarea celulelor
tumorale, este stimulat procesul de glicoliză, în urma căruia rezultă un pH acid în micromediul
tumoral, în acest sens au fost dezvolta ți lipozomi care să fie stabili la un pH fiziologic de 7.4, dar
care să se degradeze la pH acid p entru a elibera medicamentul în situsul țintă ( Pelicano și colab.,
2006 ).

2.3.2. Țintirea activă

Depă șirea limitărilor intrinseci a specificită ții țintirii pasive este realizată prin ata șarea
liganzilor de afinitate, cum ar fi molecule mici, aptameri, anticorpi și peptide la suprafa ța
conjugatelor polimer -medicament ( Allen și colab., 2002 ).
Datorită faptului că ace ști liganzi de afinitate prezintă capacitatea de a se lega numai la receptor ii
specifici exprima ți pe suprafa ța celulei tumorale, nanotransportorii recunosc și se leagă de celulele
țintă prin interac țiuni ligand -receptor (Cho și colab., 2008) .
Creșterea specificită ții țintirii tumorale se realizează numai dacă receptorii de pe sup rafața
celulelor îndeplinesc următoarelor criterii:
 să fie puternic exprima ți numai pe suprafa ța celulelor tumorale;
 să nu fie exprima ți pe suprafa ța celulelor normale;
 să se exprime omogen pe suprafa ța tuturor celulelor tumorale;
 să nu fie elimina ți în circula ția sanguină.
Facilitarea eliberării medicamentelor în interiorul celulelor survine în urma internalizării
nanotransportorilor func ționaliza ți cu liganzi prin endocitoza mediată de receptor, continuată de

24
incluziunea membranei plasmatice în jurul co mplexului ligand -receptor pentru a forma un endozom,
acesta fiind transferat la organitele specifice, astfel eliberarea fiind realizată datorită pH -ului acid
sau enzimelor (Cho și colab., 2008).

2.3.3 .Nanoformul ări cu curcumină și doxorubicină pentru țintirea pasivă a cancerului

Chiar dacă DOX și CURC se numără printre cei mai eficien ți agen ți anticancerigeni, ac țiunii
lor le sunt asociate efecte secundare sistemice, precum nefrotoxicitatea, grea ța și emeza (Wang și
colab., 2013).
Nanoformul ări cu curcumin ă
Deși are proprietă ți anticancerigene, aplicarea terapeutică a Curcuminei este împiedicată de
eliminarea sistemică rapidă, de absorb ția scăzută, de solubilitatea acesteia scăzută și de
biodisponibilitatea redusă (Ahmad și colab., 2015). Datorită h idrofobicită ții sale puternice, CURC
este imposibil să fie administrată intravenos, de aceea încapsularea acesteia în nanotransportori îi
conferă maleabilitatea necesară pentru a putea fi administrată intravenos, fără să -i fie atenuate
proprietă țile antitu morale (Li și colab., 2005). Amestecarea, dizolvarea, sau complexarea CURC cu
diferite tipuri de fosfolipide îi conferă o capacitate de absorb ție prelungită a acesteia ( Yallapu și
colab., 2012 ).
O modalitate simplă de distrugere a factorului restrictiv al CURC este aceea de a -i cre ște
solubilitatea în apă, de a -i îmbunătă ții biodisponibilitatea, de a o proteja de degradarea la pH alcalin
și de metabolismul puternic și de a -i poten ța capacitatea d e țintire a celulelor canceroase ( Ahmad și
colab., 2015).
Așa cum s -a prezentat anterior, biodisponibilitatea CURC față de terapia cancerului poate fi
îmbunătă țită semnificativ prin încapsularea acesteia în nanotransportori. Conform literaturii de
specialitate, s -au proiectat diferite tipuri de transportori terapeutici, cum ar fi nanosuspensii,
nanoemulsii, conjugate polimerice, micelii polimerice, nanoparticule lipidice solide (SLNP),
lipozomi, nanoparticule polimerice, tocmai pentru ob ținerea aces tei facilitări ( Lee și colab., 2014),
(Yallapu și colab., 2014 ).
Studiul de cercetare realizat de Li și colab. pe celulele de carcinom pancreatic a subliniat
faptul că CURC încapsulată în lipozomi suprimă legarea lui NF -kB și scade exprimarea produselor

25
genice reglate de NF -kB, incluzând ciclooxigenaza -2 și interleukina -8, acestea fiind implicate în
creșterea/ invazia tumorală ( Li și colab., 2005).
În urma unei analize famacologice s -a demonstrat că CURC are proprietă ți tarapeutice
naturale foarte bune pentru cancerul de colon, fiind foarte bine tolerată de organism, având o
toxicitate nesemnificativă chiar și în cazul unor doze mari administrate oral ( Mohanty și colab.,
2012 ).
Pentru o biodisponibilitate semnificativ m ai mare a CURC , o abordare care prezintă efecte
antitumorale atât in vitro cât și in vivo împotriva cancerului colorectal și acțiune antiangiogenă, cel
puțin similare sau chiar mai bune decât cele ale oxaliplatinei, o reprezintă încapsularea CURC în
lipoz omi. În studiul pe xenogrefele murine subcutanate de Colo 205 și de Lovo efectele supresive
ale CURC lipozomele asupra tumorii au fost egale cu sau mai mari decât cele ale oxaliplatinei ( Li și
colab., 2007).
Un studiu in vitro, realizat pe liniile celulare de cancer de colon uman HCT116 și HCT15
care exprimă fenotipul MDR, a arătat că formularea lipozomală a CURC prezintă efecte mai
puternice împotriva acestor linii celulare decât CURC individuală ( Pandelidou și colab., 2011).
Un efect sinergetic între CURC lipozomală și oxaliplatină în inhibarea dezvoltării cancerului
colorectal uman a fost demonstrat de transportorul lipozomal ce con ținea amestecul dintre cele două
medicamente ( Li și colab., 2007).
O altă abordare de încapsulare sunt micelele CURC /MPEG -PCL care eliberează lent CURC
in vitro, iar in vivo dimensiunea mică și înveli șul hidrofil PEG conferă micelelor CURC /MPEG –
PCL un timp de circula ție prelungit după administrarea sistemică și o eliberar e lentă a CURC , ceea
ce contribuie la îmbunătă țirea t 1/2 și AUC acesteia. In vitro, atât CURC liberă cât și micelele CURC
/MPEG -PCL prezintă o citotoxicitate clară în celulele C26 (carcinomului de colon), iar in vivo s -a
constatat că aplicarea sistemică a micelelor Cur/MPEG -PCL inhibă cre șterea carcinomului de colon
C26 subcutanat (Gou și colab., 2011).

Nanoformul ări cu doxorubicină
În vederea controlării citotoxicită ții DOX și evitării distribuirii ei în țesutul cardiac s -au
abordat diferite sisteme de nanotransportori care să contribuie facil în administrarea acesteia
(Augustin și colab., 2016).

26
Chiar dacă înveli șul nuclear prezintă pori care permit difuzia moleculelor mici, de la și
dinspre citosol, chimioterapeuticele trebuie să fie nucleotropice pentru o acumulare predominantă în
nucleu și nu în citosol (Tonini și colab., 1999).
Efluxul Doxorubicinei dependet de energia din celulele tumorale, eflux mediat de P -gp,
MRP1, Topo II și GST -π reprezintă cauza rezisten ței la medicamente a celulelor canceroase
manifestată vis -a-vis de mecanismul de ac țiune a DOX asupra acestora ( Li și colab., 2007).
Administrarea unei doze mari de DOX poate conduce la evitarea MDR, însă aduce cu sine o
manifestare toxică acută(mielosupresie și toxicitate gastro -intestinală), dar și o cardiotoxicitate
cumulativă (Pramanik și colab., 2012 ).
Pe de altă parte, conform studiului realizat de Cuvier și colab., nanosferele încărcate cu DOX
evită MDR manifestat de celulele tumorale și furnizează o concentra ție mare de DOX la citosol ul
celular și în nucleu ( Cuvier și colab., 1992).
Pentru terapia cancerului de sân secundar chemorezistent (Lee și colab., 2013 ), dar și
pentru a reduce cardiotoxicitatea prin acumularea preferen țială a medicamentului în situsul tumorii
la șoarecii cu carcinom hepatocelular H22 (Yuan și colab., 2013), s -a utilizat ca transportor
albumina serică umană.
Pentru înlesnirea trecerii DOX prin membrana nucleară î n compara ție cu medicamentul
neîncapsulat, s -a dezvoltat un sistem de nanoparticule pe bază de chitosan. Astfel, ac țiunea DOX
prin intermediul acestui sistem a manifestat o citotoxicitate de 300 de ori mai mare împotriva
celulelor canceroase umane și o efi cacitate in vivo crescută considerabil împotriva osteosarcomului
(Friedhuber și colab., 2014).
Pentru tratamentul cancerului de colon o solu ție veritabilă o reprezintă încapsularea DOX în
nanovectorii ob ținuți prin reasamblarea lipidelor derivate din ghimb ir, ace știa prezentând un profil
de eliberare a medicamentului dependent de pH. GDNV modificate prin conjugarea cu un ligand de
țintire, acidul folic, au îmbunătățit efectele DOX in vivo asupra tumorilor de colon C26, și anume
inhibarea proliferării tumorii, în comparație cu medicamentul administrat neîncapsulat ( Zhang și
colab., 2016).
Conform studiului realizat de Nowicka și colab., nanoparticulele magnetice nu au redus
capacitatea Doxorubicinei de a intercala ADN dublu catenar, câmpul magnetic gara ntând furnizarea
eficientă a acesteia, eliberarea ei având loc la o valoare a pH -ului apropiată de cea a celulelor
tumorale, și anume 5.8 (Nowicka și colab., 2009), (Nowicka și colab., 2013).

27
Potrivit rezultatelor ob ținute de Augustin și colab., în urma st udilui realizat pe celulele
HT29, sistemul compus din nanoparticule magnetice de oxid de fier(NP) care încapsulează DOX
(DOX -NP) adsoarbe proteinele din mediul de cultură al celulelor, astfel conferind o citotoxicitate
mai mare acesteia în compara ție cu DOX neîncapsulat. Pe de altă parte, complexul DOX -NP a
penetrat celulele canceroase prin endocitoză, cu ajutorul mecanismului numit „Trojan horse”, astfel
inducând efecte celulare similare cu cele ale DOX în monoterapie cum ar fi inhibarea ciclului
celular în faza G2/M urmată de apoptoză și necroză intârziata (Augustin și colab., 2016).
Citotoxicitatea DOX mai poate fi îmbunătă țită cu ajutorul unui tip de micele MPEG -PCL în
formă de stea (SSMPEG -PCL), dezvoltat astfel încât încapsularea DOX să se realizeze prin auto –
asamblare indusă de pH. Realizându -se un test al absorb ției celulare al acestui medicament prin
citometrie de flux, s -a observat că celule C26 prezintă un grad mai mare de absorbi ție a DOX atunci
când este încapsulată în micelele SSMPEG -PCL dec ât în cazul în care aceste celule au fost tratate
cu DOX liber, neîncapsulată. Concomitent, rezultatele studiului in vivo pe șoarecii BALB/c cu
aceea și abordare de DOX încapsulată în SSMPEG -PCL rezumă faptul că aplicarea sistemică a
acestei terapii a avut efecte mai accentuate de inhibare a cre șterii carcinomului de colon C26
comparativ cu terapia cu DOX neîncapsulat (Gao și colab., 2013).
Încă o manifestare a efectelor DOX poate fi surprinsă în situa ția încapsulării acesteia înntr –
un sistem de nanoparticu le de siliciu mezoporoase(MSN) funcționalizate cu acid hialuronic (HA)
modificat cu biotină, sistem de livrare țintită și receptiv la hialuronidază(HAase). Acțiunea Dox in
vitro este influențată în mod direct de prezența biotinei și a HAase, prin faptul că acestea îi
accelerează eliberarea din sistemul de livrare ( Zhang, Xu și colab., 2016).
Deși are o ac țiune covâr șitoare chimioterapeutică, DOX prezintă efecte secundare severe
printre care se numără trombocitopenie, leucopenie, toxicită ții gastrointestinale și anemie ( Zhang și
colab., 2016 ).

Nanoformul ări cu curcumin ă și doxorubicin ă

Pentru a evita astfel de efecte secundare sistemice, Wang și colab. au dezvoltat un sistem de
eficientizare a ac țiunii anticancerigene a DOX și CURC , asupra celulelor KHOS din linii celulare
OS umane și in vivo pe xenogrefe de celule KHOS murine, prin co -încapsularea lor în LPN, astfel
proliferarea tumorală fiind puternic întârziată. Atât in vitro cât și in vivo, în situa ția
osteosarcomului, ac țiunea antiangiogenă a CURC în sinergie cu efectul apoptotic al DOX , facilizate

28
de sistemul de co -încapsulare bazat pe LPN au demonstrat o eficien ță net superioară comparativ cu
tentativele de administrare a celor două medicamente neîncapsulate ( Wang și colab., 2 016).
Pe de altă parte, co -încapsularea DOX și CURC în micelele mPEG -PCL( DOX-CURC -M) a
dus la un progres remarcabil atât în activită țile citotoxice cât și în efectele apoptotice, comparativ cu
încapsularea individuală în micele a acestor medicamente la concentra ții echivalente, acest progres
fiind atribuit în special absorb ției celulare îmbunătă țite a DOX , prin intermediul CURC . Aceste
rezultate au fost observate atât in vitro pe celulele L929 cât si in vivo pe modelul subcutanat de
tumoră mamară 4T1 (Sun și colab., 2014). I n vitro, pe celulele L929 atât CURC cât și DOX au fost
eliberate din micelele DOX -CURC -M într -un mod controlat și sus ținut. Această caracteristică este
favorabilă și pentru DOX -CURC -M și în cazul administrării in vivo deoarece cei doi agenți
terapeutici ar fi mai puțin solubilizați în timpul circula ției înainte de a ajunge în tumoră, eliberarea
efectivă având loc în țesuturile tumorale (Sun și colab., 2014).
Conform studiului de cercetare realizat de Wang și colab., co -încapsularea DOX și a CURC
în lipozomi cu timp de circulație prelungit ( LCL -CURC -DOX ) in vitro , pe linii celulare A549 a
conferit un efect antitumoral mai accentuat DOX , în compara ție cu alte preparate bazate pe DOX
(Wang și colab., 2011).
Un profil de eliberare sus ținut și o eficacitate mare a încapsulării sunt trăsăturile definitorii
pentru nanoparticulele încărcate cu DOX și CURC (NP-CURC -DOX ), sistem de nanotransportori
utilizat în terapia cancerului ( Zhao și colab., 2015).
Avantajul co -încapsulării DOX și CURC în nanot ransportori(nanoparticulele lipozomale,
PLGA, micelii MPEG -PCL și nanoparticulele chitosan) a fost subliniat în mai multe studii cu privire
la tratarea celulelor canceroase. În aceste studii, în urma tratamentului cu un astfel de sistem
nanotransportor, s -au raportat efecte apoptotice crescute și anularea MDR ( Misra și Sahoo, 2011),
(Wang și colab., 2013 ).
Conlucrarea eficientă a CURC cu DOX a fost sesizată în studiul realizat de Qian și colab.,
care au raportat o cre ștere a apoptozei induse, în tratarea celulelor HepG2(celule hepatice umane)
(Qian și colab., 2011).
Conform unui alt studiu realizat de Misra și Sahoo, coformularea DOX și CURC în
nanoparticulele poli -(D, L -lactid -co-glicolidă) poate suprima dezvoltarea MDR în celulele leucemiei
cronice mieloide umane (Misra și Sahoo, 2011).

29
2.3.4. Lipozomi cu timp de circulație prelungit – avantejele utilizării în terapia
anticanceroasă

Lipozomii reprezintă vezicule sferice ob ținute artificial dintr -un miez apos prins de unul sau
mai multe bistraturi lipidice, dezvoltate din fosfolipide amfifilice. Structura sferică a acestor
vezicule se datorează presiunii osmotice, iar dimensiunea lor poate varia de la 50 nm până la câ țiva
micrometrii ( Immordino și colab., 2006 ).

Figura 5. Structura lipozomului (modificată conform Immordino și colab., 2006 )

Pe baza lamilarită ții acestora, lipozomii pot fi clasifica ți ca lipozomi unilamelari,
oligolamelari și multilamelari, iar în func ție de propor țiile lor ace știa pot fi de dimensiune mică,
intermediară sau mare (Amarnath și Sharma, 1997) . Bistraturile fosfolipidice pot fi realizate din
fosfatidilserine, fosfatidilcoline sau fosfatidiletanolamine, acestea prezentând regiuni nepolare care
sunt orientate spre interiorul bistratului, departe de miezul apos și de mediul apos exterior veziculei,
și regiuni polare care sunt orientate spre zona marginală a bistratului. Capul fosfat al acestor
fosfolipide are un caracter hidrofil și se distribuie în regiunea polară a bistratului, iar lan țul dublu
hidrocarbonat(saturat sau nesaturat, format din 12 -24 atomi de carbon) prezintă un caracter
hidrofob, fiind distribuit în regiunea nepolară a bistratului fosfolipidic (Chen și colab., 2013).

30
Datorită biocompatibilită ții generale, a biodegradabilită ții, având capacitatea de a izola și
încapsula atât medicamente hidrofile cât și hidrofobe, lipozomii prezintă un grad mare de interes în
elaborarea strategiilor pentru terapia cancerului. De aceea ei sunt utiliza ți ca nanotransportori pentru
o livrare faci lă, cu pierderi reduse de concentra ție și cu un grad ridicat de evitare a toxicită ții
colaterale, a agen ților chimioterapeutici(cu efecte apoptotite, antiangiogene, antiinflamatorii, etc.)
(Torchilin și colab., 2005 ).
În utilizarea acestor nanotransportori pentru terapia cancerului, agen ții chimioterapeutici pot
fi încapsula ți atât pasiv, adică în procesul de formare al lipozomilor, cât și activ ulterior realiză rii
acestui proces.
Administra ți intravenos, lipozomii sunt captura ți direct de către sistemul fa gocitar, urmând
apoi a fi elimina ți din circula ția sanguină (Scherphof, 1985). Stabilitatea lipozomilor și evitarea
legării proteinelor serice astfel încât să se depă șească bariera imunitară sunt direct controlate de
proprietă țile fizico -chimice ale lipoz omilor cum ar fi hidrofobicitatea, capacitatea netă de încărcare,
mărimea, împachetarea bistraturilor lipidice și fluiditatea (Chonn și colab., 1992).
Referitor la dimensiunile și sarcinile lipozomilor, s -a constatat că lipozomii mari sunt
elimina ți mai repede din circula ția sanguină, în timp ce lipozomii mici prezintă o stabilitate
superioară, iar cei încărca ți negativ prezintă un timp de înjumătă țire mai scurt decât cei neutri, în
timp ce lipozomii electropozitivi sunt toxici și astfel sunt elimina ți rapid din circula ție (Senior,
1982).
În vederea îmbunătă țirii fluidită ții bistratului fosfolipidic s -a demonstrat că încorporarea
colesterolului reduce transferul de fosfolipide în HDL(lipoproteină de densitate mare), datorită
creșteri împachetării fosfolipi delor în bistratul lipidic ( Damen, 2005 ).
Încorporarea colesterolului în bistratul lipidic al lipozomilor conferă într -adevăr o
îmbunătă țire a fluidită ții bistratului, însă chiar și așa nu se poate depă și pe deplin absorb ția crescută
de MPS, iar pentru ace st lucru s -au dezvoltat strategii de acoperire a suprafe ței lipozomilor cu
molecule inerte. O abordare în acest sens prezintă tentativa de a imita mebrana eritrocitelor,
preparându -se lipozomii prin modificarea suprafe ței lor cu gangliozide și deriva ți de acid sialic(de
exemplu, monosialotetrahexosilgangliozid(GM1)), iar cre șterea hidrofilită ții suprafe ței fiind
realizată prin utilizarea de polimeri hidrofilici (Allen și colab., 1989).
Stabilizarea sterică a lipozomilor și conferirea unui timp de circulație preluingit acestora pot
fi realizate prin utilizarea unui polimer hidrofil sau a unui glicolipid(de exemplu, PEG sau GM1),
utilizare care manifestă un comportament ce tinde să excludă macromoleculele incidente în

31
circula ția sanguină. Acest comporatment es te datorat faptului că glicolipidul posedă un lan ț flexibil
care ocupă stratul perilipozomal și astfel se evită interac țiunile MPS cu lipozomii, putându -se
realiza țintirea pasivă (Drummond și colab., 1999).
Datorită discotinuită ții căptu șelii endoteliale ale vasculaturii tumorale, este facilitată
extravazarea lipozomilor în spa țiul intersti țial și acumularea lor din cauza unui drenaj limfatic
deficitar al tumorii, astfel manifestându -se ca un sistem de eliberare sus ținută a agentului terapeutic
cu un efect de permeabilitate și reten ție îmbunăta țită (Maeda și colab., 2001).
În altă ordine de idei, PEG, un polimer diol liniar, solubil în mediul apos și organic, lipsit de
toxicitate și cu o biocompatibilitate mărită, imunogenicitate și antigenicitate foarte scăzute și cu o
bună cinetică a excre ției, poate fi ancorat la suprafa ța lipozomală prin intermediul unei lipide
reticulate (Allen și colab., 2002).
Durata parcursului lipozomilor în circuitul sanguin spre situsul țintă depinde în m od direct
de cantitatea de PEG grefat, dar și de lungimea și masa moleculară a acestuia (Allen și colab.,
1991). Ulterior acumulării lipozomilor pegila ți la situsul țintă datorită efectului de permeabilitate și
reten ție îmbunăta țită sub ac țiunea condi țiilor patologice(pH scăzut în micromediul tumoral),
înveli șul PEG se deta șează (Zalipsky și colab., 1999).
În consecin ță, augumentarea lipozomilor cu PEG conferă o absorb ție sus ținută ulterior
administrării intravenoase, combate bariera MPS, reduce clearance -ul renal și conferă un timp de
circulație prelungit a acestora ( Harris și colab., 2001 ).

32
Scopul lucrării
Scopul acestei cercetări a constat în investigarea efectului curcuminei și doxorubicinei, co-
încapsulate î n lipozomi cu timp de circula ție prelungit în circuitul sanguin , asupra tumorilor de
cancer de colon, induse subcutan la ș oareci Balb/c. S-au evaluat în acest sens efectele curcuminei și
doxorubicinei, administr ate individual sa u combinat, în forme libere sau încapsulate î n lipozomi
conjugați cu PEG, asupra dezvolt ării tumorale ( volumului tumoral ) greutății diferitelor organe,
parametrilor cheie implicați î n procesele inflamatorii/angiogenice intratumorale.
De menționat că, această cercetare este parte integrantă a unor studii, desfășurate în cadrul
proiectului PN -II-RU-TE-2014 -4-0220, finanț at de CNCS -UEFISCDI.
Titlul proiectului: „Doxorubicină și curcumină co -încapsulate în nanoformulări cu timp de
circulație prelungit pentru creșterea eficienței terapiei cancerului de colon”. Director de proiect Dr.
Alina Porfire, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin ă și Farmacie „Iuliu Hațieganu”,
Cluj-Napoca . Cultivarea și manipularea celulelor animale a fost efectuată la Centrul de Biologie
Moleculară, condus de domnul Academician Profesor Dr. Octavian Popescu, din cadrul Institutului
de Cercetări Interdisciplinare în Bionanoștiințe al Universității Babeș -Bolyai din Cluj-Napoca.
Tehnicile de anali ză a exprimării proteinelor au fost efectuate în cadrul laboratorului de Biochimie și
Biofizică (Departamentul de Biologie Moleculară și Biotehnologie al Facultății de Biologie și
Geologie din cadrul Universității Babeș -Bolyai).

33
Materiale și metode

Obținerea lipozomilor cu CURC și DOX
Materiale și reactivi utilizați:
 Curcumină, achizi ționată de la Sigma -Aldrich (Germania);
 Clorhidrat de doxorubicină, achizi ționat de la Sigma -Aldrich (Germania);
 Colesterol, achizi ționat de la Sigma -Aldrich (Germania);
 1,2-dipalmitoil -sn-glicero -3-fosforilcolină (DPPC), achizi ționat de la Lipoid GmbH
(Germania);
 sarea de sodiu a N -(Carbonil -metoxipolietilenglicol 5000) -1,2-distearoil -sn-glicero -3-
fosfoetanolamină(PEG -2000 -DSPE), achizi ționată de la Lipoid Gmb H (Germania);
 Fosfat monopotasic, achizi ționat de la Chemical Company (România);
 membrane de policarbonat (Whatman International Ltd, UK) cu porozită ți de 0.8, 0.6, 0.4 și
0.2 μ m;
 extruder LiposoFast LF -50 (Avestin Europe GmbH, Germania);
 casete de dializ ă Silde -A-Lyzer® (ThermoScientific, USA) cu 10k MWCO.
 Etanol, achizi ționat de la Chemical Company (România);
 Metanol, achizi ționat de la LGC Standards GmbH (Germania);
 Acetonitril, achizi ționat de la LGC Standards GmbH (Germania);
 reactivii suplimentari utiliza ți în realizarea acestei sinteze au fost de calitate analitică.

Modul de lucru

Obtinerea lipozomilor încărca ți cu curcumină (LCL -CURC)
Prepararea LCL -CURC s -a realizat prin metoda de hidratare a filmului lipidic, utilizând
fosfolipide 70mM (66,5 mM DPPC și 3,5 mM PEG -DSPE) și colesterol. Fofolipidele, colesterolul,
într-un raport molar fosfolipide:colesterol de 10:1, și CURC 1mM au fost dizolvate în etanol într -un
balon cu fundul rotund, urmând ca solventul organic să fie evaporat sub presi une scăzută, într -un
rotavapor, la 45 °C, timp de 30 minute. În timpul acestui proces se formează o peliculă lipidică pe
pere ții balonului, iar ulterior această peliculă este expusă unui flux de azot gazos. Ulterior, filmul

34
lipidic a fost hidratat la 45 °C , timp de 30 de minute, cu o solu ție tampon fosfat salin cu un pH de
4.5.
Printr -o centrifugare la 5000 rpm, timp de 30 de minute, CURC neîncapsulată este
îndepărtată, astfel purificându -se LCL -CURC. Sedimentul rămas în urma îndepărtării
supernatantului, a fost redispersat într -o solu ție tampon fosfat salin cu un pH de 4.5.
Extrudarea suspensiei lipozomale s -a realizat de câte trei ori, prin câte o membrană de policarbonat
cu o porozitate de 0.8, 0.6, 0.4 și apoi de 0.2 μm, urmând a fi depozitată la 4 °C p ână la efectuarea
analizei acesteia.

Obținerea lipozomilor încărca ți cu doxorubicină (LCL -DOX)
Având o compozi ție lipidică la fel ca și LCL -CURC (raport molar fosfolipide:colesterol de
10:1), LCL -DOX s -au preparat urmându -se aceea și rețetă ca în cazul lui LCL -CURC. După ce
lipidele s -au dizolvat în etanol, filmul lipidic s -a ob ținut prin evaporare la 60 °C timp de 20 minute.
Rehidratarea filmului lipidic s -a rezlizat la 45 °C, timp de 20 minute, utilizându -se o solu ție de DOX
1 mM ob ținută prin dizolvarea DOX în solu ție tampon fosfat salin cu un pH de 4.5.
Într-o solu ție tampon fosfat salin cu un pH de 4.5, LCL -DOX au fost supuse dializei timp de 24 de
ore, utilizându -se casete de dializă Silde -A-Lyzer® cu 10k MWCO. După înlăturarea DOX
neîncapsulat, LCL -DOX au fost extruda ți și depozita ți la fel ca și LCL -CURC.

Obținerea lipozomilor încărca ți cu curcumină și doxorubicină (LCL -CUR -DOX)
În vederea preparării LCL -CURC -DOX s -a luat în considerare aceea și compozi ție lipidică
precum în cazurile de mai sus. După dizolvarea compozi ției lipidice împreună cu CURC 1 mM în
etanol, evaporarea solventului și formarea filmului lipidic s -au realizat cu ajutorul rotavaporului la
45 °C timp de 30 de minute. Hidratarea filmului lipidic cu o solu ție de DOX 1 mM s -a realizat în
acelea și condi ții ca și în cazul LCL -DOX. De asemenea purificare, extrudarea și depozitarea LCL –
CURC -DOX s -au realizat la fel ca și în cazul LCL -DOX.
În urma etapei de extrudare, pentru determinarea dimensiunii particulelor lipozomale, a
distribu ției granulometrice și a poten țialului zeta, s -a utilizat analizorul Zetasizer Nano ZS (Malvern
Instruments, UK) care realizează aceste determinări pe baza dispersiei dinamice a luminii și a
electroforezei Doppler. Analiza propriu -zisă se face ulterior diz olvării lipozomilor în apă ultra -pură
la 25 °C.

35
Rezultatul final s -a ob ținut în urma realizării a trei citiri consecutive pentru fiecare parametru,
expimându -se o medie a valorilor ob ținute și ținându -se cont de divia ția standard.
În vederea determinării eficien ței de încapsulare a CURC și DOX în lipozomii cu timp de
eliberare prelungit, s -a realizat o analiză HPLC cu detec ție fluorescentă, utilizându -se un sistem
HPLC Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, USA).
Analiza HPLC s -a realizat utilizând o e luție gradient cu o fază mobilă caracterizată de o rată de
curgere de 1 ml/min și la o temperatură de 30 °C, pe o coloană Zorbax C18 (3.5 μm). Faza mobilă a
fost compusă din 0.2 % acid formic și acetonitril. În cazul măsurătorile cu privire la încapsularea
DOX lungimea de undă de emisie a fost setată la 560 nm, iar lungimea de undă de excita ție a fost
de 490 nm, iar în cazul CURC valorile au fost de 533 nm, respectiv 425 nm.
Rezultatul final s -a ob ținut în urma realizării a trei analizări consecutive, expr imându -se o medie a
valorilor ob ținute și ținându -se cont de divia ția standard.

Linia celulară și condi ții de cultură
Pentru realizarea acestui studiu s -au cultivat ca monostrat, celule murine C26 (CLS Cell
Lines Service GmbH, Eppelheim, Germania), într-un mediu RPMI -1640 (Lonza, Group AG, Basel,
Elveția), adăugându -se suplimentar 10% ser fetal bovin inactivat termic(FBS) (HyClone, GE
Healthcare Life Sciences, Logan, UT, USA), 100 U/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină.
Ulterior acestui pas, mono stratul de celule murine C26 a fost incubat într -o atmosferă umedă, în 5%
CO 2 și la 37°C până la sub -confluență, evitându -se cultivarea lor la o densitate crescută pentru a
preveni diferențierea și derivarea fenotipurilor celulare.

Înainte de inocularea în modelul animal:
– celulele au fost tripsinizate cu solu ție de tripsină -EDTA;
– tripsina s -a neutralizat cu mediu proaspăt;
– viabilitatea celulelor a fost verificată prin testul cu trypan blue, colorant care este exclus din
celulele vii;
– densitatea ce lulară a fost stabilită prin numărarea celulelor folosind camera de numărare Neubauer;
– celulele au fost resuspendate în mediu de cultură la densitatea finală necesară pentru realizarea
experimentului.

36
Inducerea modelului experimental de cancer de colon murin
Pentru testarea efectelor agen ților terapeutici (DOX și CURC) in vivo , s-au achizi ționat de la
Institutul Cantacuzino Bucure ști, șoareci masculi Balb/c (de 6 -8 săptămâni) crescu ți într -un sistem
de tip Liber de Germeni Patogeni Specifica ți (SPF).
Odată ce au fost primi ți, șoarecii au fost distribuiți în 9 loturi a câte 6 șoareci/lot, și găzdui ți în cu ști
conform standardelor, prevazute cu un dispozitiv ce le oferă apă și hrană ad libitum, la o
temperatură controlată de 21°C și un ciclu de lumină/în tuneric de 12h. Pentru adaptarea șoarecilor,
aceștia au fost ținuți timp de o săptămână, urmând ca apoi să înceapă experimentul propriu -zis.
Așa cum s -a spus mai sus șoarecii au fost împăr țiți în 9 loturi, cărora li s -au administrat următoarele
tratamente:
 Lot 1 – PBS(lotul control);
 Lot 2 – DMSO;
 Lot 3 – CURC;
 Lot 4 – DOX;
 Lot 5 – CURC+DOX;
 Lot 6 – LCL;
 Lot 7 – LCL -CURC;
 Lot 8 – LCL -DOX;
 Lot 9 – LCL -CURC -DOX.
Schema de tratament este prezentată mai jos:

37
– În ziua 0 s -a efectuat inocularea cu celulele de carcinom de colon murin, 106 celule
C26/100 μL au fost injectate subcutanat în flacul drept al șoarecilor Balb/c, în vederea
inducerii tumorilor;
– Ulterior inoculării celulelor C26, șoarecii au fost verifica ți în fiecare zi prin cântărire astfel
înregistrându -li-se greutatea corporală;
– La șapte zile de la inoculare, când tumora a fost palpabilă, s -au înregistrat și diametrele
tumorii, prin măsurarea acestora cu ajutorul unui șubler (se măsoară diametrul mic și
diametrul mare), aceste date fiind înregitrate pe tot parcusul planului de tratament, inclusiv în
ziua în care șoarecii au fost eutanasia ți; Calculul volumului tumoral pe baza măsurătorilor
realizate s -a ob ținut cu ajutorul fomulei V=0.52×a2×b, unde a reprezintă diametrul mic al
tumorii, iar b diametrul mare;
– În ziua a 8 -a, când tumora a fost palpabilă, după ce s -a realizat înregistrarea datelor pentru
volumul tumorii și pentru greutatea corporală, s -a administrat subiec țiilor prin vena caudală,
prima tranșă terapeutică după cum urmează:
 Lotul 1 – s-a administrat 200 μL PBS;
 Lotul 2 – s-a administrat 200 μL 5% DMSO;
 Lotul 3 – s-a administrat 5 mg/kg CURC(dizolvată în DMSO, final 5% DMSO);
 Lotul 4 – s-a administrat 2.5 mg/kg DOX(dizolvată în PBS);
 Lotul 5 – s-a administrat CURC + DOX((5mg + 2.5mg)/kg);
 Lotul 6 – s-a administrat LCL în același volum ca și LCL -CURC -DOX , ca lipidele
să fie la aceeași concentrație;
 Lotul 7 – s-a administrat LCL -CURC(5 mg/kg corp CURC);
 Lotul 8 – s-a administrat LCL -DOX(2.5 mg/kg corp DOX);
 Lotul 9 – s-a administrat LCL -CURC -DOX (5 mg/kg CURC + 2.5 mg/kg DOX).
– În ziua a 11 -a, adică după 72 de ore de la prima injectare cu tratame nt, se cântăresc din nou
șoarecii și li se măsoară diametrele tumorii, apoi li se admin istrează a doua doză de
tratament a șa cum s -a explicat mai sus;
– La 12 zile de la inocularea celulelor C26, timp în care au fost administrate cele două doze de
tratament, s -au înregistrat mai întâi datele legate de volumul tumorii și de greutatea
corporală;
– Ulterior animalele au fost eutanasiate pe rând în atmosferă saturată de CO 2.

38
Monitorizarea greutății corporale și a tumorilor
Prelevarea tumorilor și organelor
După sacrificarea animalelor s -au prelevat mai întâi tumorile care au fost cântărite individual,
urmând a fi păstrate în tuburi de centrifugă etichetate și înghe țate în azot lichid.
Ulterior acestei etape, s -a deschis cavitatea abdominală printr -o incizie sagitală, prelevându -se
pe rând ficatul, rinichii și splina. Etapa de prelevare a fiecărui organ a fost urmată de cântărirea
acestuia, depozitarea în falcone etichetate și înghe țarea în azot lichid.
Prelevarea inimii s -a realizat în urma disec ției cavită ții toracice, apoi s -a cântărit și s-a înghe țat în
azot lichid. Ttumorile și organele de la fiecare lot, au fost depozitate la -80°C.

Pregătirea lizatelor tumorale

Materiale utilizate:
 tampon fosfat salin (PBS – phosphate -buffered saline );
 Triton X -100 1%;
 inhibitori de proteaze (achizi ționa ți de la Roche Diagnostics);
 inhibitori de fosfataze (achizi ționa ți de la Roche Diagnostics).

Mod de lucru
– Se pregăte ște tamponul de liză din PBS, Triton X -100 1% și din inhibitori de proteaze și fosfataze,
amestec care va fi pus ulterior pe ghea ță;
– Se pregătesc lizatele tumorale. În vederea pregătirii lizatelor tumorale, mai întâi se dezghe ță
tumorile de la -80 °C lent, în tampon de liză, pe ghea ță. Raportul volum tampon de liză: masă
tumorală=1:1;
– ulterior , omogenatele obținute au fost centrifugate la 4 °C, la 15000xg, timp de 10 minute, iar
supernatantul obținut se alicotează în eppendorf -uri și se depozitează la -80 °C.

39
Dozarea proteinelor prin metoda Gornall

Materiale utilizate:
 reactiv Gornall(se ob ține prin dizolvarea în 500ml apă distilată a 1.5 g CuSO 4·5H 2O și 6 g
KNaC 4O6H4·4H 2O; apoi se adaugă 300 ml NaOH 10%(în raport de masă/volum) și se aduce
la 1000 ml cu apă distilată);
 solu ția de dezoxicolat de sodiu(5% în apă(masă/volum));
 solu ție etalon de albumină serică bovină 10mg/ml.

Mod de lucru
– Se pregătesc în eprubete de 10 ml etaloanele și blancul. Pentru pregătirea probei se pipetează 15
μL dintr -un alicot al probei de lizat tumoral, apoi 0.45 ml apă distilată și 2 ml reactiv Gornall și se
agită.
– Absorban ța probelor se va citi după 15 minute la 546 nm, ulterior citirii absorban țelor blancului și
a etaloanelor.
-După citirea absorban țelor, pe baza curbei de etalonare și a factorului de pantă F, ținându -se cont de
cantitatea de lizat t umoral luată în determinare se va calcula concentra ția de proteină, care se
exprimă în mg/ml.

Western blot
Materiale utilizate:
1. Reactivi necesari pentru pregătirea a 10 ml gel de migrare 10%(2 plăci):
 3.5 ml Aa + BisAa (29 %);
 3.85 ml apă ditilată;
 2.5 ml Tris pH = 8.8;
 100 μ L SDS 10 %;
 50 μL PA 10 %(agent de polimerizare);
 7.5 μ L TEMED(utilizat pentru declanșarea polimerizării gelului).
2. Reactivi necesari pentru pregătirea a 6 ml gel de concentrare (2 plăci):
 1 ml (29.2% Aa + 0.8 % BisAa) → 5 %;
 3.4 ml apă distilată;

40
 1.5 ml Tris HCl 0.5 M pH = 6.8;
 60 μL SDS 10 %;
 40 μL PA 10 %(agent de polimerizare);
 5 μL TEMED(utilizat pentru declanșarea polimerizării gelului).
3. Tampon pentru pregătirea probelor cu proteină (TP);
4. Tampon de migrare;
5. Marker de greutate moleculară (Thermo Fischer);
6. Lizate celulare;
7. 5% lapte praf degresat(Bio -Rad);
8. TBS -T (tampon Tris -salin cu Tween 20, 0.1%) (Sigma);
9. Anticorpi monoclonali IgG de șoarece față de subunitatea p65 (NF -kB) de șoarece; (Santa Cruz);
10. Anticorpi policlonali IgG de iepure față de β-actina de șoarece; (Sigma);
11. Anticorpi policlonali IgG de capra față IgG de șoarece conjugat cu HRP; (Santa Cruz);
12. Anticorpi policlonali IgG de capră fa ță de IgG de iepure conjugat cu HRP; (Santa Cru z);

Echipamente necesare:
– baie de apă pentru denaturarea probelor proteice;
– plăci de sticlă pentru solidificarea gelului;
– pieptene;
– Echipament pentru separarea proteinelor din lizate prin SDS -PAGE (Bio -Rad);
– membrană de nitoceluloză;
– Echipament pentru transferul proteinelor, de pe gel pe membrana de nitroceluloză(Bio -Rad);
– Kit de detecție Clarity™ Western ECL (Bio -Rad);
– Film AR Kodak (Sigma -Aldrich).

Modul de lucru
Separarea proteinelor din lizate în gel de poliacrilamidă
Având în vedere că proteinele vizate pentru separare au greutatea moleculară de 20000 –
100000 Da, porozitatea gelului de migrare s -a ales în consecin ță, iar concentra ția aleasă pentru Aa a
fost de 10%.
– Ulterior alegerii concentra ției de Aa, s -a preparat 10ml d e gel de migrare cu reactivii aminti ți mai
sus(la punctul 1 ) pentru 2 plăci;

41
– Gelul ob ținut se pipetează repede între plăci, urmând a se lăsa la polimerizat timp de 1h;
– După ce gelul de migrare a polimerizat, se pregăte ște gelul de concentrare cu reactivii aminti ți la
punctul 2 , apoi se toarnă între plăci și se pune pieptenele pentru godeuri, lasându -se la polimerizat
timp de 30 min; Rolul gelului de concentrare este acela de a alinia proteinele din godeuri,
premergător intrării lor în gelul de mig rare;
– Pregătirea probelor proteice pentru electroforeză constă în preparea unui volum final de proteină
de 100 μL prin amestecul volumului de probă diluată(astfel încât concentra ția finală de proteină să
fie de 2 mg/mL) cu 25 μL TP, diferen ța de volum pâ nă la 100 μL va consta din apă distilată; Ulterior
preparării probelor proteice, acestea se pun la denaturare 5 minute, la o temperatură de 95 ˚C;
– După polimerizarea gelului de concentrare, se fixează plăcile în camera de electroforeză, sco țându –
se piept enele și încărcându -se primul godeu de pe fiecare placă cu 3 μL de marker; Restul godeurilor
vor fi încărcate cu câte 2 μl de probă din lizate tumorale, fiecare în cantitate finală de 4 μg
proteină/godeu), iar apoi se va pune în compartimentul central și cel periferic tamponul de migrare;
– Pentru alinierea proteinele în gelul de concentrare, se setează redresorul la un voltaj constant de 50
V;
– După alinierea proteinelor redresorul va fi setat la 90 – 100 V pentru separarea proteinelor în
func ție de gre utatea molecură.

Transferul proteinelor de pe gelul de poliacrilamida pe membrana de nitroceluloză
În vederea detectării β-actinei și a factorului de transcriere total și fosforilat NF -kB, după
desăvâr șirea electroforezei, proteinele au fost transferate de pe gel pe membrana de nitroceluloză, pe
ghea ță, la 100 V timp de o oră.

Analiza gradului de exprimare a factorului NF -kB prin western blot
– blocarea centrilor (unde nu s -au transferat proteine) de pe membrană în 5% lapte praf degresat
dizolvat în TBS -T timp de 2h la temperatura camerei;
– spălarea de 4 x câte 10 minute în TBS -T;
– incubarea menbranelor cu anticorpii primari (IgG policlonal de iepure fa ță de β-actina de șoarece
diluat de 1000x în 5% lapte praf degresat dizolvat în TBS -T , IgG monoclona l de șoarece fa ță de
NF-kB p65 de șoarece diluat de 500x în 5% lapte praf degresat dizolvat în TBS -T) s-a realizat la 4
°C timp de 12 ore;
– β-actina a fost folosită ca și control intern;

42
– spălarea de 4 x în TBS -T câte 10 minute;
– incubare cu anticorpi secundari (IgG policlonal de capră fa ță de IgG de iepure -HRP diluat de
4000x și IgG policlonal de capră fa ță de IgG de șoarece -HRP diluat de 1000x) timp de 1h la
temperatura camerei;
– spălarea de 4 x în TBS -T câte 10 minute;
– folosindu -se kitul de dete cție Clarity™ Western ECL (Bio -Rad) și filmele de autoradiografie AR
Kodak (Kodak), prin chemiluminescen ță se realizează detectarea imunocomplexelor.

Analiza citokinelor în lizatele tumorale folosind tehnica ELISA
În vederea determinării gradului de exprimare a citokinelor în probele vizate în studiul
realizat s -a utilizat tehnica de analiză ELISA.

Materiale utilizate:
1. Kitul Multi -Analyte ELISArray (achizi ționat de la QIAGEN®) care conține:
 Wash Buffer 10x Concentrate(tampon de spălare);
 BSA 10%;
 Assay Buffer Stock(tampon de analiză stoc);
 Sample Dilution Buffer Stock(tampon de dilu ție a probelor);
 placa ELISArray;
 Avidin -HRP Conjugate;
 Detection Antibodies(anticorpi de detec ție);
 Stop Solution(solu ție de stopare a reacției enzimatice catalizate de peroxidaza din hrean
(HRP));
 Development Solution(solu ție de developare, care conține substratul peroxidazei);
 Antigen Standards.
 Cititor de plăci ELISA
2. Lizate celulare;
3. Apă bidistilată.

Mod de lucru

43
Pentru o desfă șurare corespunzătoare a experimentului este necesară pregătirea a 650 μL din
fiecare probă.
– Prima etapă din realizare a testului ELISA este diluția soluțiilor stoc din kit;
– Se diluează 50 ml de tampon de spălare în apă bidistilată până la u n volum final de 500 ml și se
păstrează la temperatura camerei;
– Utilizându -se Assay Buffer Stock, se diluează 0.6 ml BSA 10% într -un volum final de 30 ml;
– Pentru a se ob ține 1 ml de cocktail de Antigen Standards concentrat se pipetează câte 10 μL din
fiecare din cei 12 Antigen Standards ai kit -ului peste un volum de 880 μL Sample Dilution Buffer.
– Apoi se diluează în 800 μL de Sample Dilution Buffer 200 μL de cocktail de Antigen Standards
concentrat;
– În fiecare godeu al plăcii ELISArray, se pipeteaz ă 50 μL de Assay Buffer;
– Pentru a configura controlul negativ, în fiecare godeu al rândului A al plăcii ELISArray se va
pipeta 50 μL de Sample Dilution Buffer;
– Începând cu rândul B până la rândul G se va pipeta în fiecare godeu câte 50 μL din fiecare probă
de analizat(în fiecare godeu s -au încarcat 200 µg proteină);
– Pe de altă parte, pentru a configura controlul pozitiv, în fiecare godeu al rândului H se pipetează
câte 50 μL din cocktail de Antigen Standards preparat;
– se acoperă placa și se agită pentru amestecare timp de 10 s, iar apoi se va realiza o incubare la
temperatura camerei timp de 2 h;
-După dezghe țarea anticorpilor de detec ție, se adaugă pentru fiecare tub ce con ține astfel de
anticorpi câte 855 μL de Assay Buffer și se amestecă u șor;
– După ce au trecut cele 2 h de incubare se decantează con ținutul din godeuri și apoi se spală cu 350
μL Wash Buffer 1x, acest procedeu de spălare realizându -se de trei ori;
-Ulterior, se va transfera câte 100 μL de anticorpi de detec ție dilua ți în rânduril e corespunzătoare de
pe placa ELISArray(în ordinea indicată în protocolul din kit), se va agita placa 10 s și se va incuba
timp de 1 h la temperatura camerei;
– Cu 20 de minute înainte de a se utiliza Avidina conjugată cu peroxidază (HRP), aceasta se
dezgh eață pe ghea ță, apoi se vortexează. La 11 ml de Assay Buffer se adaugă 11 μL de Avidin -HRP;
– După încă un proces de spălare similar cu cel anterior, se pipetează câte 100 μL de Avidin -HRP
diluat în toate godeurile, se agită apoi se lasă placa la incubat t imp de 30 de minute la temperatura
camerei, în întuneric;

44
– Ulterior unui proces de spălare, dar de data aceasta în patru tran șe, se adugă în fiecare godeu câte
100 μ L de solu ție de developare și se incubează placa timp de 15 de minute la temperatura camer ei,
la întuneric.
– În aceea și ordine de adăugare ca în cazul solu ției de developare se vor adăuga câte 100 μL de
solu ție de stopare în fiecare godeu;
– În decurs de 30 de minute de la oprirea reac ției se va realiza o citire a absorban ței la 450 nm și
apoi se verifică și se realizează scădere a citirilor A450 cu citirile A570, pentru evitarea semnalelor
artificiale crescute datorate imperfec țiunilor plăcii.

45
Rezultate

Caracterizarea fizico -chimică a formulărilor lipozomale

Datorită caracterului de eliberare prelungită al lipozomilor, ace știa sunt capabili de a se
extravaza și de o acumulare ulterioară eficientă în situsul tumorii.
Formulările lipozomale ob ținute și utilizate în acest studiu au fost nanodimensionate, iar
dimensiunile, indicii de poli dispersie și potențialul ζ caracteristice acestor formulări lipozomale sunt
prezentate în Tabelul 1 .
Tipuri de LCL Dimensiune [nm] Indice de polidispersie Potențial ζ [mV]
LCL -CURC 168.8 ± 3.092 0.095 ± 0.023 -47.1 ± 0.624
LCL -DOX 162.2 ± 0.6658 0.067 ± 0.018 -50.1 ± 0.917
LCL -CURC -DOX 171.0 ± 1.400 0.033 ± 0.013 -48.7 ± 0.208
Tabelul 1. Carcteristicile lipozomilor

Valorile mici ale indicelui de polidespersie ce caracterizează lipozomii obținuți indică o
dispersie omogenă a agregatelor.
Timpul de eliberare prelungit al lipozomilor ob ținuți a fost demonstrat și de valoarea
poten țialului zeta ob ținut în urma electroforezei Doppler realizată cu ajutorul analizorul Zetasizer
Nano ZS. Valorile ob ținute ale potern țialului zeta mai mici de -30 mV au suge rat
electronegativitatea lipozomilor și în consecin ță o stabilitate mai bună, deci un timp de înjumătă țire
mai mic.

Efectul tratamentelor cu lipozomi cu CURC și DOX asupra dezvoltării
tumorilor de carcinom de colon murin.

În vederea analizării efectului anti -tumoral al tratamentului cu CURC și DOX administrate
în lipozomi cu timp de eliberare prelungit în circulație, s -a luat în calcul volumul tumoral(mm3) din
ziua a 11 -a, de la inocularea cu celulele de cancer de colon mur in, C26. În această zi, tumorile au
atins cel mai mare volum înregistrat pe durata experimentului. De asemenea, s -a realizat și o
reprezentare a AUTC (area under the tumor growth curve). În urma analizei, folosindu -se testul
One-way ANOVA, rezultatele au arătat că CURC și DOX, administrate individual în lipozomi, au
determinat un efect puternic inhibitor asupra dezvoltării tumorilor, volumul tumoral fiind

46
semnificativ mai mic (p<0.001) comparativ cu volumul tumorilor din grupul de control ( Figura 6A.
si Figura 7A. ). În cazul ambilor agenți anti -tumorali, efectul determinat prin administrarea în forma
lipozomală a fost mai puternic comparativ cu efectul produs de administrarea agentilor în forma
neîncapsulată (p<0.05). LCL nu a indicat o manifestare semnifi cativă în ceea ce prive ște inhibarea
dezvoltării tumorale (p>0.05).
În contextul determinării zonei de sub curba cre șterii tumorale (AUTC) până în ziua a 11 -a,
doar LCL -CURC a prezentat un efect semnificativ asupra inhibării cre șterii tumorale comparativ cu
controlul(P<0.01) ( Figura 6B. ). Datele AUTC pentru CURC în compara ție cu controlul și pentru
LCL comparativ cu controlul au demonstrat însă efecte nesemnificative în această privin ță.

Figura 6. Activitatea antitumorală a LCL -CURC în modelul de cancer de colon murin. (A) V olumele tumorale din
ziua a 11 -a a șoarecilor trata ți cu CURC, LCL și LCL -CURC au fost comparate cu volumele tumorale de la lotul control
tratat cu PBS. (B) AUTC după tratamentele cu CURC, LCL și LCL -CURC. În vederea prelucrării rezultatelor care stau
la baza acestor grafice s -a realizat testul One -way ANOVA, rezultatele fiind exprimate ca medie a măsurătorilor făcute la
6 șoareci, ținându -se cont de devia ția standard; ns(nesemnificativ) – P > 0.05, * -P < 0.05, ** -P < 0.01, *** -P < 0.001,
**** -P< 0.0001.

Potrivit datelor AUTC până în ziua a 11 -a, comparativ cu controlul, atât în cazul
tratamentului cu DOX cât și în cazul tratamentului cu LCL -DOX s -a sesizat re gresia tumorală
(P<0.05, respectiv P<0.01) ( Figura 7B. ). Pe de altă parte, la fel ca și în cazul anterior datele
statistice referitoare la efectul LCL denotă efecte nesemnificative asupra afectării volumului
tumoral, comparativ cu grupul de control.

47

Figura 7. Activitatea antitumorală LCL -DOX în modelul de cancer de colon murin. (A) V olumele tumorale din ziua a
11-a, a șoarecilor trata ți cu DOX, LCL și LCL -DOX au fost comparate cu volumele tumorale de la lotul control tratat cu
PBS. (B) AUTC după trata mentele cu DOX, LCL și LCL -DOX. În vederea prelucrării rezultatelor care stau la baza
acestor grafice s -a realizat testul One -way ANOVA, rezultatele fiind exprimate ca medie a măsurătorilor făcute la 6
șoareci, ținându -se cont de devia ția standard; ns(nese mnificativ) – P > 0.05, * -P < 0.05, ** -P < 0.01, *** -P < 0.001,
**** -P< 0.0001.

Rezultatele obținute în cazul administrării LCL -DOX și DOX individual au fost în
concordanță cu rezultatele studiate din literatura de specialitate, cum ar fi studiul realizat de Gao și
colab. Conform acestui studiu, a fost demonstrat că s -au obținut efecte mai accentuate de inhibare a
dezvoltării carcinomului de colon C26(in vivo la șoarecii Balb/c) prin administrarea DOX încapsulat
în SSMPEG -PCL comparativ cu DOX neîncapsulat (Gao și colab., 2013) .
Referitor la eficiența administrării CURC încapsulată sau individual, rezultatele obținute sunt
de asemenea în concordanță cu rezultatele studiate din literatura de specialitate. Potrivit rezultatelor
obținute de Gou și colab., administrarea in vivo a CURC încapsulată în nanotransportori(în cazul
studiului acestora CURC/MPEG -PCL) inhibă creșterea carcinomului de colon C26 mai puternic
decât administrarea individuală a agentului (Gou și colab., 2011).

48
Cele mai satisfăcătoare rez ultate ale acestui studiu, cum era și de a șteptat în urma
cercetărilor făcute sunt sesizate în cazul administrării CURC cu DOX, în forme libere sau
încapsulate.
În contextul analizei statistice referitoare la volumele tumorale măsurate în ziua a 11 -a
comparativ cu controlul atât administrarea combinată a CURC cu DOX cât și a LCL -CURC -DOX a
rezultat în efecte puternice asupra dezvoltării tumorale (în ambele cazuri, P<0.0001). Din nou, LCL
semnalează efecte nesemnificative în acest sens. Conform datelor AUTC, datorită caracteristicilor
versatile ale LCL de a men ține agregatul și de a depă și eficient bariera MPS spre situsul tumorii,
volumele tumorilor în cazul admini strării LCL -CURC -DOX au fost semnificativ mai mici
comparativ cu controlul(P<0.0001) sau cu volumul tumoral în cazul lotului trata cu CURC+DOX în
formă liberă .

Figura 8. Activitatea antitumorală a LCL -CURC -DOX în modelul de cancer de colon murin. (A) V ol umele tumorale
din ziua a 11 -a, a șoarecilor trata ți cu CURC -DOX, LCL și LCL -CURC -DOX au fost comparate cu volumele tumorale
de la lotul control tratat cu PBS. (B) AUTC după tratamentele cu CURC+DOX, LCL și LCL -CURC -DOX. În vederea
prelucrării rezultatelor care stau la baza acestor grafice s -a realizat testul One -way ANOVA, rezultatele fiind exprimate
ca medie a măsurătorilor făcute la 6 șoareci, ținându -se cont de devia ția standard; ns(nesemnificativ) – P > 0.05, * -P <
0.05, ** -P < 0.01, *** -P < 0.001, **** -P< 0.0001.

49
Determinarea efectelor adverse ale tratamentelor cu lipozomi cu CURC și DOX
în modelul de cancer de colon murin

Ținându -se cont de raportul exprimat procentual, dintre masa organului predispus
acumulărilor colaterale și masa corporală, conform analizei de varian ță One -way ANOVA, nu există
modificări semnificative în afectarea inimii, rinichilor, splinei și ficatului, în contextul administrării
CURC, DOX în forme individuale sau combinate, libere sau încapsulate. ( Figura 9. A si Figura 9.
B), La nivel hepatic, însa DMSO și LCL au detrminat creșterea în greutate a acestui organ
comparativ cu controlul (P<0.0001, respec tiv P<0.01).

Figura 9. Analiza efectelor adverse ale tratamentului cu CURC și DOX, administrate individual sau combinat, în formă
liberă(A) sau încapsulată(B) asupra inimii, rinichilor, splinei și ficatului.

50
Rezultatele cu privire la acumulările colaterale ale ale acestor tratamente au fost în
concordanță cu rezultatele studiate din literatura de specialitate, cum ar fi studiul realizat de Wang și
colab. Conform acestui studiu, distribuția DOX și CURC în țesut urile tumorale, în urma
administrării în formula DOX -CURC -LPN a fost mai mare, reduându -se efectele toxice colaterale
(Wang și colab., 2016) .

Efectele lipozomilor cu CURC și DOX asupra gradului de exprimare a factorului
de transcriere NF -kB (subunitatea p65)
În vederea detectării gradului de exprimare a factorului de transcriere NF -kB, cu rol critic în
inflamația asociată dezvoltării tumorale, proteinele din lizatele tumorale, au fost separate
electroforetic, transferate pe o membrană de nitroceluloză și ulterior testate cu anticorpi specifici
prin metoda Western blot.
În urma analizei lizatelor celulare prin Western blot ( Figura 10. ), s-a observat o exprimare
constitutivă a factorului NF -kB în lizatul tumoral de control. De menționat, că CURC și DOX,
admi nistrate individual sau combinat, în formă liberă sau încapsulată, au determinat reducerea
gradului de exprimare a factorului NF -kB p65, administrarea LCL -CURC -DOX, fiind cea mai
eficientă în inhibarea gradului de exprimare a acestui factor (p<0.001) în l izatele tumorale cu cca .
50% comparativ cu controlul. .

51
Figura 10. Efectul agenților anti -tumorali CURC și DOX, administrati la șoarecii Balb/c în forma individuală sau
combinată, liberi sau încapsulați, asupra inflamației asociate tumorii, prin prisma modificării gradului de exprimare al
factorului NF -kB.

Conform studiului realizat de Das și Vinayak, administrarea CURC în combinație cu alți
agenți chimioterapeutici are ca rezultat inhibarea activării ș i translocării factorului de transcriere
NF-kB (Das și Vinayak, 2012), rezultate obținute de altfel și în acest studiu.

Efectele lipozomilor cu CURC și DOX asupra gradului de exprimare al
citokinelor inflamatorii și angiogenice

Pentru determinarea calitativă a proteinelor implicate în procesele inflamatorii/angiogenice
din lizatele tumorale s -a folosit kit -ul Multi -Analyte ELISArray conform instrucțiunilor
producătorului.
Rezultatele obținute, exprimate în termeni de valori de absorbanță la 450 nm, corectate față
de absorbanța unei probe blanc, arată că, în cazul IL -1α cu ac țiune proinflamatorie, comparativ cu
controlul, administrarea individuală a CURC, DOX, dar și coadministrarea CURC+DOX,
stimulează foarte puternic exprimarea acestei citokine (P<0.0001). În cazul IL -1β, IL-17A ambele cu
acțiune proinflamatorie, precum și în cazul G -CSF cu ac țiune antinflamatorie, doar administrarea
CURC comparativ cu controlul are efecte de stimulare asupra exprimării acestrora(P<0.01). De
asemena, în cazul IL -10 cu ac țiune antiinflamatorie și în cazul GM -CSF cu ac țiune proinflamatorie,
CURC determină creșterea semnificativă a gradului de exprimare comparativ cu controlul
(P<0.0001). Pe de altă parte, asupra gradului de exprimare al IFN -γ (anti/proinflamator) CURC
exercită un efect moderat stimulator comparativ cu controlul (P<0.05).
Niciuna dintre cele trei variante de terapie împotriva cancerului de colon C26 murin
(administrarea CURC, DOX sau CURC+DOX), nu a exercitat efecte modulatoare a supra gradului
de exprimare al IL -2, IL -12 și TNF -α (citokine cu efect proinflamator)( Figura 11. ), comparativ cu
controlul.

52

Figura 1 1. Profilul de citokine intratumorale de la șoarecii injectați cu CURC și DOX în
forme libere, administrate individual sau combinat .

53
În contextul terapiei cu aceea și agen ți aminti ți mai sus, dar încapsula ți în LCL (Figura 1 2.),
LCL -CURC a prezentat un efect extrem stimulator (P<0.0001) asupra gradului de exprim are IL-1α,
IL-1β(ambele cu efect proinflamator), IL -6(cu efect antiinflamator) si a factorului GM -CSF,
comparativ cu controlul .

Figura 12. Profilul de citokine intratumorale de la șoarecii injectați cu CURC și DOX încapsulate
individual în lipozomi sau coî ncapsulate.

Pe de altă parte, LCL -CURC -DOX, comparativ cu controlul prezintă de asemenea un efect
extrem de pronun țat(P<0.0001) asupra exprimării IL -1α, IL-1β, GM-CSF(toate trei având efect
proinflamator), IL -6 și IL-10(ambele prezentând efect antiinflamator). Comparativ cu controlul,
LCL -DOX prezintă efecte puternice de stimulare a exprimării IL -1β și IL-10(P<0.001), dar și mai
accentuate în cazul IL -6 și GM -CSF. În cazul stimulării exprimării IL -1α, LCL -DOX nu prezintă
nicun efect semnificativ comparativ cu controlul.
Asupra stimulării exprimării IL -4, IL -12, IL -17A, IFN -γ, TNF -α și G-CSF, nu au fost
sesizate efecte semnificative a niciuneia dintre cele trei terapii, comparativ cu controlul.
Rezultatele obținu te în urma analzei calitative asupra proteinelor implicate în procesele
inflamatorii/angiogenice sunt în concordanță cu rezultatele din literatura de specialitate. Precum și în

54
studiile realizate de Barui, Zhao și Gou, s -a demonstra t potențialul antiangiogenic al CURC sau
DOX, încapsulate sau co -încapsulate în lipozomi sau nanoparticule lipidice . Rezultatele acestor
studii au sugerat faptul că abilitatea LCL -CURC -DOX de a bloca angiogeneza și inflamația este
corelată cu citotoxicitate a acestora (Barui, 2014), (Zhao, 2015), (Gou, 2011).

55
Concluzii

 Conform studiului asupra literaturii de specialitate și experimentului realizat, s -a constatat că
co-încapsularea CURC și DOX în lipozomi cu timp de eliberare prelungit(LCL) a condus la
efecte antitumorale mult mai puternice în terapia cancerului de colon, comparativ cu formele
cele induse de formele neîncapsulate;
 Eficacitatea terapeutică a LCL -CURC -DOX , LCL -DOX si LCL -CURC poate fi explicat ă
prin abilitatea nanoformulărilor de a reduce gradul de exprimare al factorului NF -kB, cu rol
cheie în angiogeneză și inflamația asociată tumorii ;
 Datorită faptului că s -au obținut rezultate satisfăcătoare pentru formularea LCL -CURC –
DOX, o perspectivă terapeutică promițătoare ar fi testare a și aplicarea acesteia în contextul
clinic.