MAROSV ÁSÁRHELYI ORVOSI ÉS GYÓGYSZERÉSZETI [624909]

MAROSV ÁSÁRHELYI ORVOSI ÉS GYÓGYSZERÉSZETI
EGYETEM
GYÓGYSZERÉSZETI KAR
MESTERKÉPZÉS: ORVOSI BIOTECHNOLÓGIA

Western blotting: immunológiában alkalmas
diagnos ztikai eljárások és azok biotechnológiai
jellemz ői

Irányító tanár: Mesterképzős hallgató:
Nagy Előd -Ernő Burulea(Pavelea) Oana

2018

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
TÎRGU MUREȘ
FACULTATEA DE FARMACIE
MASTERAT: BIOTEHNOLOGIE MEDICALĂ

Western blotting: aplicații în diagnosticul
imunologic și aspecte biotehnologice

Îndru mător: Masterand: [anonimizat]őd -Ernő Burulea(Pavelea) Oana

2018

UNIVERSITY OF MEDICINE AND PHARMACY OF TIRGU
MURES
FACULTY OF PHARMACY
MASTER: MEDICAL BIOTECHNOLOGY

Western blotting: biotehnological issues and
applications in imuno diagnostics

Academic supervisor: Master student: [anonimizat]őd -Ernő Burulea(Pavelea) Oana

2018

1
Magyar nyelvű össz efoglaló

A West ern blot vagy immunoblot tehnikát először 1979 – ben írták le
Harry Towbin és munkatársai a bázeli Friedrich Miescher Intézet ben. Kezdetben
az eljárást az egerek és a kecskék tisztított riboszomális fehérjéinek
tanulmányozására használták fel.
Attól az évtől kezdve a technikát széles körben alkalmazzák különböző
területeken, többek között az immunológia, az idegtudomány és a
gyógyszerészet területein. Az első tanulmányokban olyan fehérjéket vizsgáltak,
amelyek gyógyszerrezisz tenciát okoznak, alkalmazták még az Alzheimer – kór és
legfőképpen az AIDS – et okozó humán retrovírus tanulmányozásában.
A Western blot technika magában foglalja a proteinek specifikus
kimutatását az antigén – antitest válasz alapján. Ez a módszer két lépést
tartalmaz: fehérj ék elválasztását és azonosítását. A fehérje elválasztása
elektroforézissel történik. A fehérje azonosítása olyan specifikus antitestekkel
történik, amelyek radioaktív an jelöltek vagy fluoreszcens jelöléssel vannak
ellátva.
Az elektroforézis magában foglalja a részecskék vándorlását a gélben az
elektromos tér hatása alatt. Ezt a migrációt számos tényező befolyásolja: a
molekula feltöltése, annak mérete és a fehérje sz erkezete.
Számos típúsu elektroforézis létezik: zónaelektroforézis, PAGE
elektroforézis, izoelektromos fókuszelektroforézis, kétdimenziós
elektroforézis, kapilláris elektroforézis. A Western blot technikában alkalmazott
legelterjedtebb elektroforézis a pol iakrilamid gélelektroforézis. Ebben a
tanulmányban részletesen ismertetem az elektroforézis szakaszait, hogy mitől
függ a fehérjék migrációs sebessége, ezen kívül szó lesz még a gél
összetételéről.
A Western blot szakasz magában foglalja a membránfehérjék
átvitelétét, blokkolását és mosását, az elsődleges antitesttel való inkubálást, a
mosást, a szekunder antitesttel (konjugá tummal ) történő inkubálást, a mosást
és a szubsztrát hozzáadását a kemilumineszcenciás vagy színreakció előhívása
végett . A szakaszok at részletesen fogjuk ismertetni.

2
Az antigén egy összetett molekula, amelyet az antitesteknek nevezett
fehérjeszerkezetek azonosítanak és inaktiválnak. Az antigén és az antitest
együtt immunkomplexet alkot. Az antigének kimutatásához először szükséges
ezek nek a próbákból való kinyerése. A minták származhatnak:
sejttenyészetekből, sejtszuszpenziókból, szövetekből.
A mintákból származó fehérjék mennyisége gyakran elégtelen, ezért
gyakran táptalajon tenyésztik, hogy elegendő mennyiséget kapjanak a
vizsgálatho z. A táptalajok a mikroorganizmusok függvényében különböznek.
Az antigén táptalajból való kinyerése különböző módszerekkel történik:
szűrés, centrifugálás, dekantálás, folyadékfázis -koncentráció, sejtbontás,
extrakció, szárítás, porlasztás, ultraszűrési ko ncentráció. A megfelelő táptalaj
kiválasztása és az antigén kivonásának módja számos tényezőtől függ,
amelyekről a dolgozatban tárgyalunk.
A Western blot technikához szükséges antigén egy biotechnológiai
módszer által nyert rekombináns antigén. A leggyako ribb rekombináns
fehérjéket Escherichia coli, élesztő és emlős sejtkultúrákból nyerjük ki. A
táptalaj kiválasztása számos tényezőtől függ: a célfehérje tulajdonságaitól, a
felhasználás céljától és a költségektől. A sejtkultúrák kinyerésének és
kivonásának módszereit részletesen tárgyaljuk a dolgozatban.
A célfehérje kimutatására antitesteket használnak. Az immunoblot
technikában használt antitestek lehetnek másodlagos antitestek (konjugált) és
ezek általában poliklonálisak. A monoklonális antitestek egyetlen antigénhez
kötődnek, mivel egyetlen epitóppal reagálnak. Ezzel szemben a poliklonális
antitestek, immunglobulinok gyűjteményéből állnak, amelyek egy specifikus
antigénnel reagálnak, de több epitópot ismernek fel. A monoklonális és
poliklonális antitesteket és azok különbségeit részletesen tárgyalja a dolgozat.
Az eredmények vizualizálására különböző módszerek alkalmazhatók:
kemilumineszcencia, fluoreszcencia, kromogén vagy radioizotóp. A
leggyakrabban használt vizuális módszerek manapság a kemilumineszcencia és
fluoreszcencia. A kemilumineszcencia egy enzimatikus módszer, amely
magában foglalja a fénykibocsátó reagens hozzáadását a másodlagos
antitesthez történő kötődéskor. A reakció eredménye változatlan marad az idő

3
múlásával, és ez lehetővé teszi az adatok reprodukálhatóságát. A fluoreszcencia
egy d irekt módszer, fluorofort használ, amely a másodlagos antitestet
konjugálja. A fluorofor stimulálás hatására egy fényjelzést bocsát ki, amely
rögzíthető. A vizualizálási módszer különbözik a fehérje típusától és a felismert
fehérje típusok számától is.
Bem utatjuk a Mikrogen Diagnostik Rec omLine Borrelia készletét, a ki t
alapelvét, annak tartalmát, a megoldások elkészítésének módját, a szükséges
mennyiség kiszámítását, a munkaprotokolt, az eredmények értelmezését a
sávokon való megfestődés intenzitás alapján , valamint a kimutatott fehérjék
alapján kapott pontszámokat és azok értelmezését. Az eredmények
értelmezésének jobb megértése érdekében néhány példát mutatunk be:

 1. Eset :

1.1. ábra. Mivel sem az IgM detektáló LBB09 – en, sem az IgG detektáló
LBB02 – n nem színeződik más sáv a kontrollsávokon kívül, ezért az értékelő
skálán 0 pontot kap, vagyis az eredmény negatív.

4
 2. Eset:

p41
1.2. Ábra. Az LBB 04 – es számú tesztcsíkot az IgM szpecifikus Borrelia
kimutatására használtuk fel. A sáv mel y megfelel a p41 – es fehérjének és
valamive l intenzívebb, mint a kontroll cut -off sáv, ezért 1 pontot kap. Ezeken
kívül más sáv nem színeződött el, így a végeredmény 1 pont, mely negatívként
értelmezhető.
Az LBB10 csík esetében az IgG sáv elszíneződött. Mivel a p41 fehérjének
megfelelő sáv kevésbé intenzívebben színeződött el, mint a cut off kontroll
sáv, ezért 0 pontok kap, így az eredmény negatív.

 3. Eset :

Fig.1. 3. Az IgM detektáló LBB20 tesztcsík az été kelésen 1 pontot kap a p41
fehérje jelenléte miatt , tehát az eredmény negatív. Az IgG dete ktáló LBB01 5

5
pontot kap a VisE – sáv megjelenésére és 1 pontot a p41 sáv megjelenésére, így
az összpontszám 6, vagyis az eredmény határérétékű (gray -scale) .

Abstract in English

Western blotting or immunoblotting was first described in 1979 at the
Friedrich Mies cher Institute in Basel by Harry Towbin and his colleagues.
Initially the method was used to study purified ribosomal proteins from mice
and goats.
Since that year, the technique has been widely used in various areas of
study rang: from immunology to neuroscience and drug discovery. The first
studies were about proteins that offer drug resistance, Alzheimer's disease, and
especially about the study of th e human retrovirus that causes AIDS.
The principle of Western blotting is the specific detection of proteins
based on the antigen -antibody response. This method involves two steps:
protein separation and identification. Electrophoresis is used for protein
separation. For protein identification are used specific antibodies that are
radiolabeled or fluorescently labeled.
Electrophoresis involves the migration of particles in the gel under the
influence of an electric field. This migration is influenced by s everal factors such
as: the charge of the molecule, the molecule size, the protein structure. There
are several types of electrophoresis, namely: zone electrophoresis,
polyacrylamide electrophoresis -PAGE, isoelectric focusing electrophoresis,
two-dimension al electrophoresis, capillary electrophoresis. The most common
type of electrophoresis used in the Western blot technique is polyacrylamide
gel electrophoresis. In this paper I will detail the stages of electrophoresis, on
what the migration speed of the p roteins depends on the support and the
composition of the gel.
The Western blotting itself involves transferring the proteins from the
membrane, blocking, washing, incubating with the primary antibody, washing
and incubating with the secondary antibody (co njugated), washing and adding

6
the substrate to detect the prote ins by chemiluminescent or chromogenic
reaction . Stages will be described more broadly in the paper.
The antigen is a complex molecule, recognized and inactivated by
specific binding to protein structures called antibodies, together forming the
immune complex. For the detection of antigens, they must first be purified from
the samples. Samples may differ from: cell cultures, cell suspensions to tissues.
Due to the fact that the proteins from the samples are often insufficient, they
are often cultivated on culture medium in order to obtain sufficient quantities
for the study. Culture mediums differ depending on the micro -organism for
which it is intended. Obtaining the antigen from cult ure medium involves their
processing by various methods: filtration, centrifugation, decantation, liquid
phase concentration, cell disaggregation, extraction, drying, atomization,
ultrafiltration concentrations. Choosing the right culture medium and method
of extract ing the antigen from it, depends on several factors and will be detailed
more extensively in the paper.
The required antigen in the Western blot technique, is a recombinant
antigen by biotechnological measures. The most common recombinant
proteins are obta ined in Escherichia coli, yeast and mammalian cell cultures.
The choice of the culture medium depends on several factors: the properties of
the target protein, the purpose of the use and the costs. The obtaining and
extracting methods from the cell culture s can be found more widely in the
paper.
Antibodies are used in detecting the target protein. In antibody
immunoblotting techniques, these may be secondary (conjugated) antibodies
and usually polyclonal. Monoclonal antibodies bind to a single antigen becau se
they react with a single epitope. Compared to the polyclonal antibody that is
made up of a collection of immunoglobulins that react with a specific antigen
but recognize more epitopes. Obtaining monoclonal and polyclonal antibodies
and their differences will be treated in detail in the paper.
Various methods can be used to visualize the results:
chemiluminescence, fluorescence, chromogenic reaction with enzymes or
radioisotopic labeling . The most commonly used viewing methods nowadays

7
are the chemilumine scent and fluorescent reactions . Chemiluminescence is an
enzymatic method, which involves the addition of a light -emitting reagent at
the time of binding to the secondary antibody. The reaction is stable over time,
allowing reproducibility of the data. The fluorescence determination method is
a direct method, using a fluorophore that will conjugate the secondary
antibody. By exciting the fluorophore, it will emit a luminous signal that can be
captured. This determination is not as stable as chemiluniscence. The viewing
method also differs depending on the type of protein and the number of
protein types detected at the same time.
I will present the RecomLine Borrelia kit from Mikrogen Diagnostik, the
principle on which the kit is based, its content, the metho d of preparation of
the solutions and calculation of the necessary quantities, the work ing protocol
and, last but not least, the interpretation of results according to the intensity
of the reaction developed on strips, assignment of the scores based on
detected protein and interpretation of scores. In order to better understand
the interpretation of the results, I will present some examples along with their
description.

 Case 1:

Fig.1.1. On both strips: LBB09, IgM detection and LBB02 detecting Ig G,
besides the control bands, no other bandwidth colored,
will be scored by 0 points. The result is negative.

8
 Case 2:

p41
Fig.1.2. The LBB 04 series strip was used to detect IgM specific for
Borrelia. Since the band corresponding to the p41 protein is slightly more
intense than the cut off off band, it will be given 1 point. On the strip, other
colored bands are not sketched. Thus, the final sc ore is 1, the result is
negative. On LBB10 series the IgG control was stained. Since the color of the
band corresponding to the p41 protein has a lower intensity than the cut off
control band, no points will be given, so it is negative.

 Case 3:

Fig.1.3. The LBB20 strip for IgM detection receives 1 point for the presence of
the p41 protein, so the result is negative. The LBB01 strip for IgG receives 5
points for VisE and 1 point for p41 protein, a total of 6 points, so the result is
equivocal.

9
Tartalomjegyzék

Mag yar nyelvű öss zefoglaló 1
Angol nyelvű össz efoglaló 5
Tartalomjegyzék 9
1. Beve zeték 12
10.Következtetések 52
11.Felhasznált irodalom 53

10
Table of contents

Resume in hungarian 1
Resume in english 5
Table of contents 10
1. Introduction 12
10. Conclusion 52
11. Bibliography 53

11
Cuprins

Rezumat în limba maghiară 1
Rezumat în limba engleză 5
Cuprins 11
1. Introducere 13
2. Principiul testului 18
3. Electroforeza proteinelor celulare și din lichide biologice 19
4. Western blot 22
3.1. Transferul 22
3.2. Blocarea și spălarea 23
3.3. Incubarea cu anticorpul primar 24
3.4. Spălarea și incubarea cu anticorpul secundar 24
3.5. Spălarea și detectarea proteinelor 24
5. Obținerea antigenului din cul turi celulare și lizat celular -antigen nativ
26
6. Aplicarea antigenului recombinat prin masuri biotehnologice: cum se obțin
proteinele recombinate în: culturile celulare de e.coli, drojdie și mamifere
29
5.1. Obținerea proteinelor recombinate în culturile de e.coli 30
5.2. Obținerea proteinelor recombinate în culturile de drojdie 32
5.3. Obținerea proteinelor recombinate în culturile de celule mamifere
33
7. Anticorpi în tehnica western blotting: obținerea anticorpilor monoc lonali la
animale 35
8. Anticorpi în tehnica western blotting: obținerea serului policlonal la
animale 38
9. Marcaj fluorescent și luminescent pentru vizualizare 40
9.1. Chemiluminiscența 40
9.2. Fluorescența 41
10. Protocol de lucru 43
9.1. Princiupiul testului 44

12
9.2. Prepararea soluțiilor 45
9.3. Protocol de lucru 46
10.4.Prezentare de cazuri – exempl e și interpretare 48
10. Concluzii 52
11.Bibliografie 53

13
1. INTRODUCERE

Tehnica Western blot sau immunoblotting, a fost descri să pen tru prima
dată în anul 1979, in cadrul I nstitutul ui Friedrich Miescher din Basel, de Harrz
Towbin și colegii săi. Inițial metoda a fost folosită pentru studiul proteinelor
ribosomale purificate din șoareci și capre.
Începând cu acel an tehnica a fost utilizată larg, în diferite arii de studiu
începând de la imunologie până la cel al neuroștiinței și în descoperirea
medicamentelor. Primele studii au fost despre proteinele care oferă reziste nță
la medicamente, despre boala Alzheimer și mai ales despre studiul
retrovirusului uman ce determină SIDA.
Principiu tehnicii Western blot presupune detectarea specifică a
proteinelor pe baza reacției antigen -anticorp. Această metodă presupune 2
etape: separarea proteinelor și identificarea acestora. Separarea proteinelor se
face cu ajutorul electroforezei. Identificarea proteinelor are loc cu ajutorul
unor anticorpi specifici, care sunt marcați radioactiv sau fluorescent.
Electroforeza presupune migrarea particulelor în gel, sub influența unui
câmp electric. Această migrare este influențată de mai mulți factori:
încărcătura moleculei, marimea acesteia, structura proteine. Există mai multe
tipuri de electroforeză, și anume: electroforeză zonală, electroforeză în
ploacrilamidă PAGE, electroforeză cu focalizare izoelectrică, el ectroforeză
bidimensională, electroforeză capilară. Tipul cel mai frecvent de electroforeză
folosit în tehnica Western blot este electroforeza pe gel de poliacrilamidă . În
cadrul acestei lucrăr i voi detalia pe larg etapele e lectroforezei, de ce depinde
viteza de migrare a proteinelor pe suport și componența gelului .
Etapa Western blot propriu zisă presupune transferul proteinelor de pe
membrană, blocarea și spălarea, incubarea cu anticorpul primar, spălarea și
incubarea cu anticorpul secundar/conjugat, s pălarea și adăugarea substratului
pentru detectarea proteinelor prin chemiluminiscență sau cromogenic. Etapele
vor fi descrise mai pe larg în cadrul lucrarii.

14
Antigenul este o moleculă complexă, recunoscută și inactivată prin
legarea specifică la structuri proteice numite anticorpi, împreună formând
complexul imun. Pentru detectarea antigenilor, acestea mai întâi trebuie
purificate din probe. Probele pot diferi de la culturi de celule, suspensii celulare,
țesuturi. Datorită faptului că proteinele provenite din probe sunt în cantități
insuficiente de multe ori, acestea sunt cultivate frecvent pe medii de cultură în
vederea obținerii de cantități suficiente pentru studiu. Mediile de cultură diferă
în funcție de microorganismul pentru care este destinat. Obțin erea antigenului
din medii de cultură presupune prelucrarea acestora prin diferite metode:
filtrare, centrifugare, decantare, concentrare a fazei lichide, dezagregare
celulară, extracție, uscare, atomizare, concentrări prin ultrafiltrare. Alegerea
mediului de cultură propice și a metodei de extracție a antigenului din acesta
depinde de mai mulți factori și vor fi tratate mai pe larg în cadrul lucrării.
Antigenul, necesar în tehnica Western blot, este un antigen recombinat
prin măsuri biotehnologice. Cele ma i frecvente proteine recombinate sunt
obținute în culturi de Escherichia coli, drojdie și celule de mamifere. Alegerea
mediului de cultură depinde de mai mulți factori: proprietățile proteinei țintă,
scopul utilizării și costurile. Metodele de obținere și de extragere din culturile
celulare se vor putea re găsi mai pe larg în cadrul lucră rii.
În detectarea proteinei țintă se folosesc anticorpi. În tehnicile imunoblot
cu detectare de anticorpi, aceștia pot fi anticorpi secundari(conjugat) și de
obicei policlo nali. Anticorpii monoclonali se leagă de un singur antigen,
deoarece aceștia reacționează cu un singur epitop. În comparație cu anticorpul
policlonal care este format dintr -o colecție de imunoglobuline ce reacționează
cu un antigen specific, dar recunoște mai mulți epitopi. Obținearea anticorpilor
monoclonali și policlonali și diferențele dintre acestea vor fi tratate în detaliu în
cadrul lucrării.
Pentru vizualizarea rezultatelor se pot folisi diverse metode:
chemiluminiscență, fluorecență, cromogenic sau radioisotopic. Cele mai
folosite metode de vizualizare în zilele noastre sunt prin chemilumiscență și
fluorescență. Chemiluminiscența este o metodă enzimatică, ce presupune
adiția unui reagent ce emite lumină în momentul legării de anticorpul secundar.

15
Reacția este stabilă în timp, permite reproductibilitatea datelor. Metoda de
determinare prin fluorescență este o metodă directă, în care se folosește
fluorofor ce va conjuga anticorpul secundar. Prin excitarea fluoroforului acesta
va emite un semnal luminos, ce poate fi captat. Această determ inare nu este la
fel de stabilă ca cea prin chemiluniscență. Metoda de vizualizare diferă și în
funcție de tipul proteinei și de numărul de tipuri de proteine detectate în acelaș
timp.
Voi prezenta Ki tul RecomLine Borreli a de la Mikrogen Diagnostik,
principiul pe care se bazează kitt -ul, conținutul acestuia, metoda de preparare
a soluțiilor și calcularea cantităților necesare, protocolul de lucru și nu în ultimul
rând interpretarea rezultatelor în funcție de intensitatea c ulorilor dezvoltate pe
benzi, acordarea punctajelor în funcție de proteina detectată și interpretarea
puntajelor. Pentru a întelege mai bine interpretarea rezultatelor voi prezenta
câteva exemple împreună cu descrierea lor.

 Exemplul numărul 1:

Fig.1.1 .Deoarece pe ambele stripuri LBB09, ce detectează IgM, și LBB02
ce detectează IgG, în afară de benzile de control nu se schițează nici o altă
bandă vor fi notate cu 0 puncte. Deci rezultatul este negativ.

16
 Exemplul numărul 2

p41
Fig.1.2 . Stripul cu seria LBB 04 a fost folosit pentru detectarea IgM specific
pentru Borrelia. Deoarece banda ce corespunde proteinei p41 este puțin mai
intensă decât banda controlului cut off se va acorda 1 punct. Pe strip alte
benzi colorate nu se schițează. Astfel punctajul final este 1, deci rezultatul este
negativ.
Pe stripul cu seria LBB10 controlul pentru IgG sa colorat. Deoarece culoarea
benzii ce corespunde proteinei p41 are o intensitate mai mică decât banda
controlului cut off se vor acorda o puncte, deci rezultat negativ.

 Exemplul numărul 3 :

Fig.1.3 .Stripul cu numarul LBB 20 pentru detectarea IgM -ului, primește 1
punct petru prezența proteinei p41, deci rezultatul este negativ. Stripul LBB01

17
pentru IgG primește 5 puncte pentru VisE și 1 punct pentru proteina p41, în
total 6 puncte , deci rezultatul este echivoc.

18
2. PRINCIPIUL TESTULUI

Western blot este o tehnică de laborator bazată pe principiul
reacției antigen -anticorp , utilizată pentru detectarea specifică a proteinelor –
antigenilor. Un prim pas pentru aceasta este separarea prin electroforeză a
proteinelor , transferarea acestora prin adsorbție p e un suport și apoi
identificarea lor cu ajutorul unor anticorpi specifici , marcați radioactiv sau
fluorescent. [1]
Western blot cunoscut și sub numele de imunoblott ing, este o tehnică
folosită pentru detectarea și analiza proteinelor pe principiul formării unui
complex antigen -anticorp. [2]

19
3. ELECTROFOREZA PROTEINELOR CELULARE
ȘI DIN LICHIDE BIOLOGICE

Electroforeza este un procedeu prin care particulele încărcate migrează
spre electrodul opus sub influeța unui câmp electric.
Mobilitatea electroforetică este reprezentată de viteza de migrare a
moleculelor sub influența câmpului electric. Mobilitatea electroforetică este
influețată de:
 Încărc atura,
 Mărimea moleculei,
 Structura proteinei.
Migrarea pe gel are loc în prezența unei soluții tampon , care este important
în transportul curentului electric și menținerea unui pH constant. În funcție de
pH-ul soluției tampon, aceasta poate influența migr area proteinelor, astfel la
un pH mare, migrarea v -a fi încetinită.
Suportul electroforetic trebuie să îndeplinească anumite condiții:
 să fie stabil,
 netoxic,
 rezistent la umezeală și uscare,
 uniform poros.
Acest suport poate fi: hârtie, acetat de ce luloză, amidon, agaroză,
poliacrilamidă, etc.
Există mai multe tipuri de elect roforeză:
 electroforeză zonală,
 electroforeză în ploacrilamidă PAGE,
 electroforeză cu focalizare izoelectrică,
 electroforeză bidimensională ,
 electroforeză capilară.

20
Sistemul PAGE -SDS se poate folosi atât pentru separarea componenților
unui lizat celular cât și pentru separarea proteinelor din diferite lichide
biologice.
Electroforeza PAGE este folosită pentru es timarea purității unei
proteine și permite stabilirea aproximativ ă a masei moleculre. Gelul este
sintetic, stabil termic, transparent, relativ inert chimic, ce poate fi preparat cu
pori de dimensiuni variate. Se folosește pentru separarea proteinelor între 5 –
2000kDa. Mărimea porilor este controlată prin concentrațiile g elulu i care
variază între 5% – 15%. În cazul proteinelor mici sunt recomandate gelurile cu
concentrațiile mari .
Adăugarea de SDS( sodiu -dodecilsulfat) la soluția tampon favorizează
separarea proteinelor strict pe baza masei moleculare. Sodiu -dodecilsulfatul
este un detergent anionic, a cărui moleculă înconjoară proteinele, astfel
moleculele de SDS maschează sarcinile, formând agregate anionice. Astfel
separarea are loc pe baza mărimii moleculare și poate fi determinată și masa
moleculară .[3]
Electroforeza proteinelor în laboratorul clinic de rutină se folosește
pentru separarea unor fracțiuni proteice din diferite lichide biologice (ser,
urină, LCR).
Electroforeza presupune urmă toarele etape:
 introducerea probelor pe suport,
 aplicarea unu i curent electric cu voltaj și amper stabilit, ce determină
migrarea probelor,
 fixarea fracțiunilor pe suport după migrare,
 colorare,
 indepărtarea surplusului de colorant,
 interpretarea rezultatelor. [3]
Vitez a de migrare a proteinelor se calcul ează pe baza următoarei formule:
𝑣=𝐸×𝑞2
𝑚, unde:
 m reprezintă coeficientul de fricțiune,
 E intensitatea câmpului electric,

21
 q încărcarea electrică,
 și v viteza de migrare.
Astfel în gel de agaroză fracțiunile proteice sunt separate pe baza
raportului 𝑞2
𝑚 asemănător (de ex. 1 globulinele și 2 globulinele sunt fracțiuni
heterogene conținând mai multe globuline).
Pe baza electroforez ei proteinele sunt fracționate.(Fig.2.1.) Fracționarea
se poate realiza pe gel de agaroză, acrilamidă, agar, amidon, etc. Ace st proces
are loc într -un mediu cu pH alcalin.
Proteinele sunt separate pe urmatoarele fracțiuni: albumină
Globulină α1 α2
β2 β1
γ
Albumina migrează cel mai repede, iar γ globulinele cele mai încet. [4]
Gelul de agaroză este format din 2 polizaharide. Ac este polizaharide sunt
obținute din galactoză. Gelul poate conține urme de sulfați, care prin legăturile
de hidrogen se gelifică. Gelul de agaroză are o structură macroreticulară.

Albumină α 1 α2 β γ
Fig.3 .1. Electroforeză pe gel de agaroză

22
4. WESTERN BLOT

Etapele procesului western blot sunt: transferul proteinelor pe
membrană, blocarea și spălarea, incubarea cu anticorpul primar, spălarea și
incubarea cu anticorpul secundar/conjugat, spălarea și adăugarea s ubstratului
pentru detectarea proteinelor prin chemiluminiscență sau cromogenic. [5]

4.1. Transferul

Proteinele din gel sunt transfe rate pe o membrană de nitrocelul oză sau
PVDF. Membranele de nitroceluloză sunt ieftine, fragile, ușor de folosit, prin
spălare pot fi ușor șterse moleculele mici. Membranele în funcție de mărimea
porilor pot fi de: 45µm – folosite pentru moleculele mai mari de 20kDa și de
0,2µm folosite pentru moleculele mai mici de 20kDa.
Metoda de transfer poate fi: semiuscată sau umedă. Metoda de transfer
umedă funcționează pe principiul unui sandwich: gel -mem brană -filtru, care
este suspendat vertical în soluția tampon, iar transferul are loc sub influența
curentului electric ce se va aplica. Este o metodă mai eficientă decât transferul
semi-uscat (Fig.3.1.) , unde transferul are loc fără a fi aplicat curentul electric,
doar pe baza gradientului datorat soluției tampon. [2]

23

Fig. 4 .1. Metoda de transfer semi uscată. Primul strat de hârtie de filtru
și ultimul trebuie să conțină cel puțin 3 bucăți fiecare. Membrana
trebuie să fie cât mai aproape de anod. La așezarea straturilor trebuie
avut grijă să fie uniforme.

4.2. Blocarea și spălarea

Este o etapă importantă prin care se dorește scăderea formărilor de
legături nespecifice din timpul pro cesului. Pentru acest lucru se folosesc
proteine inerte sau detergenți. Frecvent sunt folosite și soluții tampon în acest
scop. Aceștia trebuie să îndeplinească următoarele criterii: să blocheze
situsurile nereactive, să nu înlocuia scă proteinele de pe memb rană, să nu se
lege de epitopul prot einei țintă ș i să nu reacționeze încrucișat cu anticorpii sau
substratul folosit.
Tipuri de soluții ce pot fi folosite : BSA/TBS, lapte, lapte praf, cazeină,
Tween 20, gelatină de pește, ser de cal. Laptele este ieftin, însă trebuie evitat
dacă în proces se folosește biotină sau detecția are loc prin defosforilare,
datorită faptului ca laptele are proprietăți de defosforilare asupra proteinelor.
Tween20 scade frecvența ruperilor de proteine în timpul emulsificării.

24
4.3. Incubarea cu anticorpul primar

După spălarea probelor se va adăuga anticorpul primar, care va fi incubat
împreună cu membrana. În acest timp anticorpul se va lega de proteina țintă.
Anticorpii pot fi monoclonali sau policlonali. Anticorpii monoclonali au o
specificitate crescută, vizează un singur antigen specific al epitopului, iar
rezultatul este influențat dacă în proces au fost distruși epitopi. Anticorpii
policlonali au o afinitate crescută , recunosc mai multi epitopi și rezultatul nu
este influența t de distrugerea epitopilor.

4.4. Spălarea și incubarea cu anticorp ul secundar

După incubare, probele sunt spălate și se adaugă cel de -al doilea anticorp,
așa zisul conjugat. Anticorpii frecvent utilizați provin de la: șoareci, iepuri,
capre. Alegerea an ticorpului secundar se face în funcție de anticorpul primar
folosit.

4.5. Spălarea și detectarea proteinelor

Spălarea este u rmată de adăugarea substratului. Acesta se va lega de
anticorpul secundar, astfel se va dezvolta o reacție de culoare, în urma căre ia
proteina țintă va fi vizibilă.
Substraturile frecvent folosite sunt: HRP( peroxidază de cal) și AP(fosfatul
alcalin), ambele dezvoltând culoarea albastră.
Pentru a verifica metoda de lucru se folosesc controale. Controlul pozitiv
conține o celulă li zată, cunoscută , ce conține proteina țină. Se folosește pentru
verificarea eficienței anticoripilor utilizați. Controlul negativ nu conține
proteina țintă și verifică specificitatea anticorpilor utilizați. Controlul
anticorpului secundar se face prin omit erea anticorpului primar și verifică
specificitatea anticorpului secundar. Controlul neutru omite ambii anticorpi,
primar și secundar, și verifică natura membranei și efectul de blocare. Controlul

25
de încărcare este folosit pentru verificarea calitații prob elor și performa nțele
anticorpului secundar. [2]

26
5. Obținerea antigenului din culturi celulare
și lizat celular -antigen nativ

Antigenul este o moleculă complexă, recunoscută și inactivată prin
legarea specifică la structuri proteice numite anticorpi, î mpreuna formând
complexul imun. Epitopul reprezintă o structură specifică antigenului.
Antigenul nativ este antigenul care nu a fost procesat încă de APC
(celulele prezentatoare de antigen).
Culturile celulare reprezintă o metod ă prin care celulele izolate sau
celulele dintr -un fragment de țesut/suspensii celulare naturale sau artificiale,
obținute prin tehnici de laborator, sunt transferate î ntr-un mediu artificial,
controlat, în care aceștia își pastrează viabilitatea și funcț iile specifice în scopul
multiplicării celulare.
Mediile de cultură asigură suportul nutritiv ideal pentru multiplicarea
celulară. Aceștia sunt de diferite tipuri, în funcție de consistență pot fi: medii
lichide, solide sau semisolide, după compoziție: nat urale sau sintetice, după
tipul de microorganisme cultivate: aerobe sau anaerobe.
Un mediu de cultură destinat microorganismelor trebuie să conțină: sursă
de carbon, azot, fosfor, oligoelemente și factori de creștere.
Creșterea pe mediile de cultură este i nfluențată de concentrația
substratului, calitatea și cantitatea inoculului, temperatură, pH, agitatre și de
concentrația oxigenului dizolvat.
Prelucrarea primară a mediilor de cultură poate fi realizată prin: filtrare,
centrifugare, decantare, concentrarea fazei lichide, dezagregarea celulelor,
extracție, uscare, atomizare sau concentrări prin ultrafiltrare.
Trebuie avut în vedere faptul că prod ușii sunt termolabili, astfel este
obligatorie cunoașterea proprietăților fizico -chimice:
 Solubilitatea:
 în apă sau diluț ii de săruri,
 solvenți polari(metanol, etanol, acetona),

27
 solvenți slabi polari( cloroform, hidrocarburi).
 Stabilitatea în soluție:
 în funcție de pH,
 efectul temperaturii,
 în soluții tampon,
 efectul solvenților organici.
 Stabilitatea în forma solidă în funcție de temperatură și efectul umidității.
 Proprietăți fizice:
 dializabilitate prin membrane,
 adsorbția pe suprafețe solide,
 migrarea în câmp electric,
 sedimentarea în ultracentrifugă.
 Proprietăți chimice:
 stabilitate față de enzime,
 stabilitate față de agenți chimici.
Pentru separarea produsului de mediile de cultură sunt folo site
urmă toarele metode: extracția cu solvenți organici, separarea prin schimbarea
de ioni, cromatografia și adsorbția.
Dezagregarea celulară poate fi realizată prin procedee: mecanice, fizice
nemecanice, chimice și enzimatice. În timpul procedeelor mecanice trebuie
avut în vedere că are loc o creștere a tempera turii, pentru a evita acest lucru se
aduc probele la temperaturi mai joase. Exemple de procedee fizice
nemecanice: decomprimare rapidă, înghețare lentă sau șoc osmotic, vibrații
ultrasonice aplicate asupra suspensiei celulare (20 000Hz determină
dezintegra rea celulelor , aceste sunete produc o regiune de presiune joasă unde
membranele celulare se rup, pentru evitarea supraîncălzirii ciclurile sunt
scrurte iar între ele, probele sunt răcite, ideal pentru cantități și numă r mic de
probe ).
Procedeele chimice presupun distrugerea componentelor lipoproteice
ale membranei celulare. Pentru acest lucru se folosesc detergenți cationici s au
anionici, solvenți organici. Tratările enzimatice atacă legaturile.

28
Separarea prin ultracentrifugare are loc datorită diferențel or de volum
celular. Se poate efectua la temperaturi joase, astfel șansele de denaturare
termică sunt reduse. [2]

29
6. Aplicarea antigenului recombinat prin mă suri
biotehnologice: cum se obțin p roteinele recombinate în
culturile celulare de E.coli, drojdie și mamifere

Proteinele sunt una din cele mai importante molecule biologice din viață.
Au o gama largă de funcții în cadrul organismelor: catalizează reacțiile
metabolice, intervin în replicarea ADN -ului, prin ră spunsul lor la stimuli
transportă molecule dintr -o locație în alta. Pentru analiza lor sunt necesare
cantități mari de proteine pure, de preferat în cel mai scurt timp și cu cost
redus. În vederea acestui fapt se folosesc proteine recombinate.
Proteinele recombinate sunt forme de proteine manipulate, obținute prin
diverse moduri pentru a produce cantități mari de proteine, pentru a modifica
secvențele genice și a produce produse comerciale utile. Aceasta este c odificată
prin ADN recombinant. ADN -ul recomb inant, frecvent secvența ADNc a
proteinei țintă, este conceput să fie sub controlul unui promotor bine cunoscut
și să exprime proteina țintă în interiorul celulei gazdă ale asă pentru a realiza
expresia proteinei la nivel înalt. Modificarea genei prin tehno logia ADN
recombinant poate duce la exprimarea unei proteine mutante sau a unei
cantități mari de proteine.
Cheia succesului este a legerea unui sistem adecvat de expresie a proteinei .
Factori ce trebuie luați în considerare sunt: proprietățile proteinei țintă,
aplicarea dorită, randamentul proteinelor și costul.
Una din utilizările antigenului recombinant prin măsuri biotehnologice
este confirmarea diagnosticului de boală Lyme prin tehnica Western blot. [6]
Boala Lyme este cauzată de Borrelia burgdoferi. Ea este transmisă prin
căpușe. [6]
Borreliile sunt spirochete, groase, mobile, cu capetele drepte. Mobilitatea
acestora este conferită de fibrele axiale periplasmatice, care sunt în număr de
7-20 la fiecare extremitate a spirochetei. [6]
Borreliile pot fi împărțite în următoarele specii :
 Borrelia sensu stricto,

30
 Borrelia afzelii,
 Borrelia garinii,
 Borrelia spielmanii,
 Borrelia bavariensis,
 Borrelia burgdorferi.
Pentru cultivarea in vivo a borreliilor, în vederea obținerii de antigeni, sunt
utilizate: șobolani, șoareci, colonii de căpușe sau ou de găină embrionat.
Cele mai importante structuri antigenice ale tulpinii Borrelia Burgdorferi
sunt:
 OspA,
 OspC care are un rol important în declanșarea răspunsului imun,
 Proteina p39 ce determină formarea de ant icorpi,
 Proteina p41 sau flagelina, care deși nu este specifică specie, determină
mobilitatea bacteriei și apariția precoce a anticorpilor anti Borrelia,
 Proteina p100 este implicată în raspunsul imun tardiv, [6]
Diagnosticul se face pe coroborarea simptom elor clinice și a
rezultatelor de laborator.
Diagnosticul de laborator al bolii Lyme se face în următoarea ordine:
 Se fac culturi din sângele sau LCR -ul sau din lichidu articular al bolnavului
pentru a exclude alți patogeni
 Urmează testarea imunoenzimatic ă prin ELISA
 Testele pozitive trebuie confirmate prin tehnica Western Blot. [7]
Primii anticorpi ce ating un vârf la 6 săptămâni de la debutul bolii sunt
IgM-ul, a căror loc va fi ușor preluat în timp de IgM .[6]

6.1. Obținerea proteinelor recombinate în culturile de E. Coli

În vederea obținerii de proteine recombinate, E. Coli este cel mai frecvent
utilizat. Acest lucru este datorat și faptului că: are un fundal genetic bine
cunoscut, se reproduce rapid, are un cost redus, expresie este înaltă, este ușor
de purificat, stabil și are o gamă largă de aplicații.

31
În urma plierii unele proteine se pot forma incorect în citoplasmă. Acestea
formează agregate insolubile ce poartă numele de corpuri de incluziune.
Corpurile de incluziune îngreunează procesul de p urificare. [8]
Teoretic obținerea une i proteine recombinante este foarte simplu. Se alege
gena de interes , se clonează într-un vector de e xpresie, se transferă în gazda
aleasă , se induce expresia și apoi proteina este gata pentru purificare și
caracterizare. În realitate există multipli factori care pot influența negativ
procesul: c reșterea slabă a gazdei, form area corpului de incluziune ,
inactivitatea pro teinelor și chiar lipsa obținerii oricărei proteine. [9]
Cele mai frecvente plasmide utiliz ate în prezent sunt rezultatul multiplelor
combinații de: repliconi, promotori, markeri de selecție, multiplelor situsuri de
clonare și proteine de fuziune sau de eliminare a fuziunii. Vectorii de expresie
disponibili sunt disponibili în bază de date disponibil publicului ce pot fi
accesate electronic , în vederea alegerii celui mai potrivit sistemului utilizat.
Escherichia coli este un bacil gram negativ. Acesta face parte din genul
Escherichia -Shigella. Frecvent prezintă cili peritrichi și nu are ca psulă. Rar
prezintă forme filamentoase, iar unele tulpinic care sunt imobile pot prezenta
capsulă. Acesta nu este pretențios, creste pe medii sim ple, în care singurul
constituent organic este glucoza. Este aerob, facultativ anaerob. Metabolismul
poate fi fermentativ sau respirator. Pe medii solide coloniile sunt de tip S, iar în
mediile lichide apar ca o tulburare uniformă și un inel aderent pe peretele
tubului. [10]
Repliconul este cromozomul bacteriilor. Acesta este format din: secvență
de nucleotidice c e m archează începerea replicării, secvențe semnal pentru
terminarea replicării și gene ce codifică sinteza unor proteine specifice. [11]
În transcrierea genelor sunt implicate: promoterul, terminatorul
transcripțional, secvențe de reglare și ARN polimeraza. Componentele ARN
polimerazei sunt: α, β, β ', ω și σ. Nucleul enzima este dat de α2ββω. Dacă se
adaugă σ la nucleul emzimă, atunci se oferă specificitate promoterului formând
holoenzima . Se presupune că ω joacă a rol în asamblarea ARN polimerazei. E.
Coli posedă 6 factori suplimentari σ , dintre care s70 este folosit în producția
proteinelor recombinate. [12]

32

6.2. Obținerea proteinelor recombinate în culturile de drojdie

Celulele de drojdie sunt recunoscute ca organisme sigure, și datorită
acestui fapt sunt deosebit de avantajoase gazde p entru producția
biofarmaceutică. D rojdia Saccharomyces cerevisiae este una dintre cele mai
bine caracterizate eucariote și cel mai utiliz at sistem gazdă pe scară largă pentru
produsele biofarmaceutice de la începuturile inginerie i genetice și producția de
protein e recombinante . În ultima perioada pentru sinteza de proteine
recombinate au fost folosite specii de dr ojdii neconvenționale de exemplu:
Hansenula polimorfă, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces
pombe și Kluyveromyces lactis.
Drojdiile sunt un sistem ideal datorită faptului ca sunt rezistente pe
mediile simple și totodata pot fi crescut e pe scară largă în bioreactoare, cu
modificări postranslaționale dorite și frezabilitate în manipularea genetică.
Secvența genomică completă a S. Cerevisiae a fost publicată ca primul
genom al unui eucariot în anul 1996. Totodată în prezent pentru m ai multe
specii de drojdie neconvenționale secvența geno mului este cunoscută și
prezentă în baze de date publice.
Cu ajutorul H. Polimorpha a fost produs vaccinul recombinant împotriva
virusului he patic B. Acesta a fost ansamblat în membranele lipidice de rivate
din drojdie. Structura particulară a lipoproteinelor este importan tă pentru
antigenitatea AgHBs. Inducția prin metanol este importantă pentru că
favorizează formarea membra nei lipidice. Tot inducția cu metanol se folosește
și în cazu l drojdiei P. P astoris.
Drojdiile secretă puține proteine endogene, datorită acestui fapt este
ușor de purificat proteina recombinată secretată. Conversia secvenței ADN
codificatoare de proteină matură este mai complexă. În vederea acestui lu cru
se parcurg multiple etap e de : procesare, transcripția, translația, translocația,
modificări posttranslaționale, împachetarea proteinei, clivarea peptidelor,
glicozilare suplimentară, sortare și secretare.
Vectorii folosiți sunt:

33
 YIp- plasmid de integrare în locul genomic,
 Ycp- plasmid centromeric, face o singura copie
 Yep-plasmid episomal, mai multe copii, folosit pentru producerea de
proteine recombinate.
Fungii de tip glicani sunt formați în totalitate din manoză. S cerevisiae este
perfect în manozilar e, dar nu în toate proteinele. Glicozilarea din drojdii poate
afecta proteina produsă.
Proteinele cărăuș diferă în funcție de gazdă. Dacă E. Coli este folo sit ca
mediu de cultură atunci introducerea proteinei se face cu ajutorul: proteinei
A a staphylococcu lui , tioredoxin -DsbA sau MBP. În cazul Aspergillus niger se
utilizează glucoamilază –GA și la Trichoderma reesei CBHI.
Proteinele secretoare intră în reticulul endoplasmic (ER). Acumularea de
proteine incorect pliate determină inducerea răspunsului p roteinei
nepliate (UPR) și degradare asociată reticulului endoplasmatic. (ERAD).
Răspunsul la șocul de căldură (HSR) determină, d e asemenea, o expresie înaltă
a numeroaselor gene care codifică proteine secretoare de pliere chaperoni și
din citoplasma . Prot einele pliate corect sunt transportate la aparatul Golgi
pentru prelucrare ulterioară, inclusiv glicozilare suplimentară. Proteinele care
ies din Golgi pot fi secretați extracelular sau direcționați către vacuole pentru
depozitare sau degradare. Alternativ , produsele recombinante sunt supuse
degradării proteolitice prin mai multe proteaze localizate în compartimentele
celulare, cum ar fi aparatul Golgi, citos ol, mitocondriile și peretele celular. [13]

6.3. Obținerea proteinelor recombinate în culturile de celul e
mamifere

Obținerea de culturi celulare ale mamiferelor este mult mai costisitoare
decât cea a drojdiei sau a bacteriilor. Datorită faptului ca există diferite modele
de pliere a protein elor sau modificări de proteine, glicozilarea la cele obținute
în cu lturile de bacte rii sau drojdie , se preferă culturile umane. Un alt factor
poate fi și posibilitatea de urme de cantități de drojdie sau componente

34
bacterine în preparatele proteice ce nu sunt acceptabile în producerea
produselor de uz terapeutic.
Culturile de celule folosite pentru obținea de proteine recombinate pot fi:
 Celulele din ovarul hamsterului chinezesc -CHO a fost prima dată izolată în
anul 1950 de Theodore Puck. Aceste celule cresc în cantități mari în
suspensii le de cultură și se adaptea ză uș or în condițiile de mediu fără ser.
Optimizarea culturilor celulare s -a obținut prin diferite strategii de hrană.
 HEK 23 este prima linie celulară de origine umană folosit prin
transformare cu ajutoru unui ADN adenovirus striat al serotipului Ad5.
Celule folosite sunt celule renale embrionare.
 PER.C6 sau Crucell a fost obținută din celule umane de retinoblast prin
transinfecția cu minigena E1 în vederea unei producții mai eficiente.
 CAP/CAP -T linie celulară de amniocite umane.
Pentru obținerea unei p roteine recombinate se urmează acești pasi:
 Gena recombinată cu elementele reglatoare de transcripție este
transferat în celulă.
 Se transferă și o genă secundară pentru a conferi un avataj de selectivitate
celulelor receptoare.
 La câteva zile după transfer ul de gene, în prezența agentului de selecție,
de exemplu DHFR -dihidrofolat reductaza, doar genele care exprimă
selectorul vor supraviețui.
 După selecție, celulele care au supraviețuit vor fi transferate una câte una,
în diferite medii de cultivare unde s ă formeze populații clonale.
 Fiecare clonă dintr -un mediu este evaluat individual pentru expresia
proteinei recombinate, și în funcție de care produce nivele cele mai mari
va fi cultivat în continuare. [14]

35
7. Anticorpi în t ehnica Western Blotting : Obținerea anticorpului
monoclonal la animale

Anticorpul monoclonal se obține prin izolarea unei celule B care produce
anticorpul respectiv și pe urmă se cultivă pe o perioadă nedeterminată.
Fuziunea dintre celu la B ce produce anticorpul și celulele canceroase, de ex.
mielomul, generează hibrizi, cu termen de viața nelimitat, ce conțin genele ce
codifică anticorpii specifici. Selectarea clonelor de hibrizi se face în funcție de
afinitate și specifitate. Producere a de anticorpi monoclonali durează între 4 -6
luni (Fig.7 .2.).[15]
Deși anticorpii monoclonali (Fig.7 .1.) sunt produși împotriva aceluiași
antigen, clonele reacționează diferit, datorită faptului că epitopii de pe acelaș
antigen pot fi diferiți. De asemenea clonele au și diferite aplicații. La alegerea
anticorpului monoclonal trebuie avut în vedere numele an tigenului și a clonei.

Fig.7 .1. Anticorp monoclonal, reacționează doar
cu un singur antigen specific

O altă opțiune de a produce anticorpi monoclonali este utilizarea de
fagi. Fagul sau altfel zis bacteriofagul este un virus care parazitează bacteriile .
Are o structură complexă, și este formată din: capul și coada fagului. La nivelul
capului se găsește acidul nuclei format din ADN dublu catenar sau ARN. Coada
fagului prezintă următoarele elemente: cilindru axial, teaca cozii, placă bazală,
croșete de fi xare și fibrele cozii. Această coadă este de natură proteică și joacă
rol în adsobția și penetrarea celulelor bacteriene.
Anticorpul fag este un fag în care genetic au fost integrate gene
codificatoare de parți ale anticorpului. Astfel ele produc la supra față
fragmentele de anticorpi , cum ar fi formele de Fab sau scFv. Fagii care pot fi

36
utilizați pot fi selecționate din bazele de date, în funcție de afinitatea
moleculară a anticorpului și molecula țintă.
Pentru producerea de anticorpi monoclonali pot fi utilizați: șoareci,
găini, iepuri, om, etc. Acești anticorpi reacționează cu un singur epitop. Dacă
calitatea anticorpului selecționat este bun atunci și specifitatea este înaltă.
Reproductibilitatea este posibilă, în schimb abilitatea de a se lega se poa te
pierde în cazul în care epitopul a fost pierdut prin fixare sau denaturarea
antigenului.
Deoarece anticorpul mooclonal reacționează la un singur epitop,
legarea se face între un singur anticorp și un singur antigen, pe de a ltă parte
anticorpul policlon al este format dintr -o colecție de imunoglobuline ce
reacționează unui antigen specific, dar cu recunoașterea a diferiților
epitopi. [16]

37

Fig.7 .2. Obținerea anticorpului monoclonal

38
8. Anticorpi în t ehnica Western Blotting : Obținerea serului policlonal la
animale

Injectarea unui antigen în animal induce producerea de niveluri ridicate de
anticorpi în sânge. Pe parcursul a mai multor luni imunizarea este repetată, iar
din sânge le, în special din plasmă și ser , colectat anticorpii vor f i purificați.
Anticorpii astfel obținuți sunt anticorpi policlonali (Fig.8 .1.) deoare sunt
produse de diferite clone ale celulelor B, iar antiserul rezultat conține diferiți
anticorpi ce reacționează cu imunogenul injectat.

Fig.8 .1 Anticorp policlonal – varietate de specii care
se leagă de epitopi diferiți

Pentru acest procedeu sunt fo losite diferite animale, ca de exempl u:
șoareci, iepuri, mamifere, păsă ri, inclusiv hamsteri, porci de guinea, găini, oi,
capre, mă gari. Genele ce codifică imunoglobu linele, mecanismul de
diversificare, diversitatea anticorpilor obținuță diferă în funcție de animalul
vertebrat folosit.
După imunizarea anima lului (Fig.8 .2.), în sângele a cestuia IgM î ncepe să
crescă primul, după multiple imunizări nivelul de IgG începe să crească și el.
Abilitatea de a se lega IgM de antigen nu crește direct cu numarul de imunizări,
pe de altă parte abilitatea de legare de antigen a IgG -ului crește proporț ional
cu numărul de imunizări. Trebuie avut în vedere că numarul excesiv de
imunizări în vederea creșterii afinității de legare a IgG -ului de antigen, poate să
inducă o hiperimunizare prin formarea de anticorpi nespecifici, inclusiv
autoanticorpi ce pot d eteriora sănătatea animalului. Pentru a obține anticorpi
de calitate este important ca periodic să se recolteze cantități mici de sânge din
care să fie evaluat afinitatea anticorpului pentru antigen și reacțiile nespecifice.

39
Pentru a purifica anticorpii se respectă pașii urmatori:
 Se îndepărtează materialele solide și proteinele exceptând anticorpii, se
centrifugează sau filtrează.
 Se izolează anticorpii prin cromatografie de afinitate
 Se îndepărtează elementele contaminatoare ce au rămas după pasul 2,
după care se efectuează cromatografie prin gel filtrare pentru purificarea
în continuare a anticorpilor cu schimbarea soluției tampon. [16]

Fig.8 .2. Obținerea anticorpilor policlonali cu ajutorul mamiferelor

40
9. Marcaj fluorescent și luminiscent pentru vizualizare

Rezultatele obținute în urma tehnicii Western blot pot fi detectate în
diferite moduri. Aceste metode de detectare pof fi:
 chemiluminiscență,
 fluorescență,
 cromogenic
 radioisotopic.
În cele ce urmează voi trata pe larg metodele de vizualizare prin
chemiluminscență și fluorescență. [2]

9.1.Chemiluminiscența

Chemiluminiscența este o metodă de determinare enzimatică. Această
metodă necesită adiția unui reagent ce emite lumină atunci când se leagă de
enzima legată de anticorpul secundar. Este una din cele mai frecvente meto de
de detecție enzimatică.(Fig.9 .1.)

Fig.9 .1. Detectare enzimatică

Proteina țintă și anticorpul primar formează un complex de care se
leagă anticorpul secundar ce este conjugat cu HRP. La adiția de peroxidază și
luminol, HRP catalizează reacția de oxidare a luminolului printr -un lanț de
reacții. Datorită reacției are loc o emisie de o lumină de intensitate slabă, ce
poate fi detectată la 428n m(Fig.9 .2.). Intensitatea emisiei poate fi multiplicată
prin adiția unor substanțe, de exemplu fenoli. Intensitatea semalului de lumină

41
este egal cu numarul de molecule de enzime ce au reacționat. Acesta este direct
proporțional cu numarul de anticorpi, ce este în strânsă legătură cu numărul de
proteine.
În timp reacția este stabilă ce ușurează procesul de colectare a
datelor. [2]

Fig.9 .2. Detectarea prin chemiluminiscență

9.2.Fluorescența

Fluorescența este o metodă de detectare directă, în care anticorpul
secundar este conjugat cu un fluorofor. Fenomenul de fluorescență apare
atunci când molec ulele de fluorofor ab sorb lumină (Fig.9 .3.) În starea lor
naturală fluor oforii nu emit lumină, însă când sunt excitate, de exemplu de
lumină, nivelul lor en ergetic crește până la un prag instabil. Acestea emit
semnale de fluorescență ce sunt captate cu ajutorul unor camere sau scanere.
Semanulul fluores cent al unei probe diferă dacă citirea acesteia se face
în doua zile diferite.
Această metodă de detectare este preferată în cazul în care se dorește
detectarea mai multor proteine în acelaș timp. Pentru aceasta anticorpii

42
primari folosiți trebuie să provină din surse diferite pentru fiecare proteină
cautată, iar anticorpii secundari să fie marcași cu culori di ferite. [2]

Fig.9 .3. Metoda fluorescentă

43
10. Protocol de lucru pentru determinarea unor seturi
de anticorpi specifici pentru speciile Borrelia
din ser uman

Testul poate fi util în confirmarea rezultatelor sau proces elor de screening,
care de obicei se efectuează prin reacție ELISA sau imunofluorescență indirectă.
Pachetul conține urmatoarele:
 Dilbuf: 100ml soluție tampon gata de folosit. Acesta conține: tris buffer,
NaCl, detergent, MIT 0,01%, oxiprion 0,1%, conservanți și proteină.
 Washbuf A : concentrat de 10%
 Substrat TMB 40ml, tetrametilbenzină, gata de folosit.
 Conjugat 500µl (anticorpi anti IgM și anti IgG marcați cu peroxidază de cal)
 Lapte praf 5g.
 Instrucțiuni,
 Formular de evaluare.
În afară de cele menționate mai sus, fiecare kit mai conține și : 2 tubur i a
câte 10 stripuri numerotate.
Kitul de reactivi RecomLine Borrelia de la Mikrogen Diagnostik se bazeaz ă
pe o reacție in vitro, ce are la bază principiul detectării anticorpilor IgG și IgM
împotriva Borreliei, din ser, plasmă și CS F.
Tipurile de Borrelii care se pot detecta sunt următoarele:
 Borrelia burgdorferi sersu strictu,
 Borrelia garinii,
 Borrelia afzelii,
 Borrelia bavariensis,
 Borrelia spielmanii.
Materiale necesare în afara kitului:
 Plăci de incubare,
 Apă distilată,
 Pensă de plastic,
 Shaker orizontal,

44
 Vortex,
 Pompă vacum,
 Cilindrii volumetrici de 50ml și 1000ml,
 Micropipete cu vârfuri de unică folosință de 20µl și 1000µl,
 Pipete de 10ml,
 Hârtie absorbantă,
 Mănuși,
 Container pentru produse toxice.
Reactanții se stochează la temperaturi între +2 și+8 oC. Nu se congelează.
Înainte de a fi folosiți se lasă cel puțin 30 de minute afară până ajung la
temperatura camerei. În timpul procedurii kitul trebuie ferit de expunerea la
lumină deoarece, mai ales substratul, TMB, este foarte sensibil.
Probele utiliz ate frecvent sunt ser sau plasmă. Acestea se recoltează în
eprubete cu EDTA, citrat, heparină sau CPD. Se evită utilizarea de probe icterice,
hemolitice, lipemice sau tulbure. Dacă probele nu sunt analizate imediat după
recoltare, acestea pot fi stocate pâ nă la 2 saptamâni la temperaturi cuprinse
între +2 și +8 oC. Pentru perioade mai lungi de stocare, se recomandă
temperatura de -20oC. Stocări repetate a probelor nu se recomandă , deoarece
rezultatele pot fi alterate după decongelări și recongelări repetat e.

10.1. Principiul testului

Kitul conține teste strip. Stripurile sunt formate din membrane de
nitroceluloză pe care sunt fixați antigeni recombinați, purificați, de Borrelia
burgdorferi. Antigenii prezenți pe acest strip sunt:
 Osp A,
 Osp C,
 p100,
 VIsE,
 p39,

45
 p58,
 p18,
 p41.
Stripurile se vor incuba cu serul sau plasma diluată. În această etapă
anticorpii se vor lega specific de antigenii patogeni prezenți în probe. Etapa
următoare constă în spălarea anticorpilor nelegați, urmat de incubarea cu
conjug atul ce conține și peroxidază de cal, după care se spală, iar anticorpii care
s-au legat se vor vizualiza prin reacții de culoare, catalizate de peroxidază.
Dacă reacțiile antigen -anticorp au avut loc, la nivelul stripurilor vor apărea
benzi colorate, spe cific locurilor unde au avut reacțiile.
La nivelul capătului de strip există niște benzi de control și anume:
 banda pentru reacția control – aceasta se colorează în prezența serului sau
plasmei,
 banda control pentru conjugat – diferit pentru IgM și IgG, pent ru difențierea
anticorpului detectat,
 banda control pentru cut off – în funcție de intensitatea acestei benzi se
evaluează rezultatele.

10.2. Prepararea soluțiilor :

 Soluția de diluat probe este gata de folosit,
 Prepararea soluției de spălat A:
Soluția de spălat A se folosește pentru: diluarea conjugatului, pentru spălat,
pentru diluarea laptelui praf, care ulterior trebuie amestecat cu apă distilată în
proporție de 1/9.
Cantitatea necesară se calculează pe baza următoarelor formule:
 Pentru lapte
𝑁𝑟.𝑠𝑡𝑟𝑖𝑝𝑢𝑟𝑖 𝑓𝑜𝑙𝑜𝑠𝑖𝑡𝑒 ×0,1
Ex. Dacă sunt 5 stripuri atunci e nevoie de 0,5g
 Concentrat de soluție de spălare A
𝑁𝑟.𝑠𝑡𝑟𝑖𝑝𝑢𝑟𝑖 ×2
Ex. Dacă sunt 5 stripuri atunci e nevoie de 10ml

46
 Apă distilată
𝑁𝑟.𝑠𝑡𝑟𝑖𝑝𝑢𝑟𝑖 ×18
Ex. Dacă sunt 5 str ipuri atunci e nevoie de 90ml
 Soluție de spălare A gata de folosit
𝑁𝑟.𝑠𝑡𝑟𝑖𝑝𝑢𝑟𝑖 ×20
Ex. Dacă sunt 5 stripuri atunci e nevoie de 100ml
Soluția poate fi stocată la temperaturi între +2 și +8 oC.
 Soluția de conjugat trebuie preparată chiar înainte de a fi utilizată. Acesta
nu poate fi stocată. Diluția se face 1parte conjugat concentrat și 100 de părți de
soluție de spălare gata de folosit. Necesarul este calculat dupa următoarele
formule:
 Pentru concentratul de conjugat:
𝑁𝑟.𝑠𝑡𝑟𝑖𝑝𝑢𝑟𝑖 ×20
Ex. Dacă sunt 5 stripuri atunci e nevoie de 100µl
 Pentru soluția de spălare A gata de folosit
𝑁𝑟.𝑠𝑡𝑟𝑖𝑝𝑢𝑟𝑖 ×2
Ex. Dacă sunt 5 stripuri atunci e nevoie de 10ml.

10.3. Protocol de lucru

1. Probele și reagenții se aduc la temperatura cemarei în cel puțin 30 de
minute.
2. Fiecare strip se așează în 2ml soluție tampon gata de folosit. Stripurile nu
se ating cu mâna, doar cu pensa de plastic. Numărul stripului trebuie să fie
cu fața în sus.
3. La fiecare strip se adaugă 20µl de probă pentru IgG sau 40µl de p robă
pentru IgM. Se incubează timp de 1 oră, timp în care sunt plasați pe un
agitator și acoperiți.
4. Se îndepărtează capacul, din fiecare casetă individual de îndepărtează
soluțiile, apoi se adaugă 2ml soluție de spălare A, și se spală timp de 5
minute prin agitare apoi se îndepărtează soluția de spălare. Spălarea se
repetă de 3 ori.

47
5. Se adaugă 2ml soluție conjugat gata de folosit și se incubează timp de 45 de
minute, pe agitator și acoperit.
6. Se spală de 3 ori probele.
7. Se adaugă 1,5ml substrat, apoi se incu bează timp de 8 minute pe agitator.
8. Reacția de stopare constă în spălarea de 3 ori a probelor cu apă distilată.
9. Uscarea și citirea stripurilor. Uscarea stripurilor se face între hartii
absorbante timp de 2 ore. Citirea stripurilor are loc cu ajutorul sche mei de
strip din dotarea kitului.

Stripurile conțin benzi de control. Banda 1 corespunde reacției de control și
apare ca o bandă clară, închisă la culoare. Benzile 2 și 3 corespund lui IgM și
IgG, în funcție de care anticorp este detectat se colorează ban da
corespunzătoare. A patra bandă reprezintă cut off -ul. Aceasta apare slab
colorat.
După determinare, stripurile uscate se așează lângă schema de citire din
dotarea kittului, întrucât benzile de control să fie aliniate cu cele de pe schema
de citire, și s e citesc rezultatele.
Interpretarea reacțiilor de culoare dezvoltate se face în următorul fel:
Tabel.10 .1.

Bandă Notă
Fără reacție –
Intensitate mult mai mică decât cut -off +/-
Intens itate joasă asemănătoare cu cut -off +
Intensitate mai mare decât cut-off ++
Foarte intens +++
Tabel.10 .1. Notarea intensităților de culoare dezvoltate

Interpretarea rezulatelor se face în funcție de prezența antigenului și
reacțiilor de culoare prezente pe baza următoarei scheme: Tabel.10. 2.

48
Antigen IgG IgM
p100 5 5
VisE 5 5
p58 4 4
p41 1 1
p39 5 4
Osp A 5 5
Osp C 5 8
p18 5 5
Tabel.10 .2. Acordarea punctajelor în funție de proteina detectată

Punctajele obținute se adună. Pentru un punctaj sub sau egal cu 5
rezultatul este negativ. Pentru un punctaj de 6 rezultatul este neconcludent.
Pentru punctaj de cel puțin 7 rezultatul este consideret pozitiv.
Rezultatele obținute trebuie interpretate în context clinic. Un rezultat
negativ nu exclude infecția, mai ales în fazele incipiente a bolii, când anticorpii
încă nu sunt prezenți sau sunt în cantități foarte mici. Repetarea testării la 3
săptămâni după suspiciunea clinică de boală Lyme, în cazul rezultatelor
negative sau echivoc este de preferat. Rezultatele pozitive înseamnă că boala
este activă.
Prezența Osp C -ului la determinarea IgM -ului arată un răspuns imun rapid.
Prezența p100, VisE, p58, p39, p18, rar Osp A pe banda de IgG corespunde cu o
infecție mai veche. VisE este un marker timpuriu al IgG -ului. [17]

10.4.Prezentare de cazuri – exempl e și interpretare

Acordarea punctajelor se face pe baza stripului de cont rol care este
prezentat în Fig.10 .1.

Fig.10 .1. Strip de control

În cele ce urmează voi arata câteva exemple de stripuri pe care le voi
interpreta în funcție de stripul control.

49

Fig.10 .2. Stripul cu numărul LBB02 corespunde pentru detectarea
IgM-ului. Deoarece nu s -a colorat nici o altă bandă în afară de cele de
control se acordă 0 puncte, deci negativ. Stripul LBB20 corespunde cu IgG.
Banda din dreptul proteinei p41 are o intensitate asemănătoare cu cea a
cut-offului, deci se acordă un punct. Trei dintre benzile ce corespund cu
OspC au intesitate mai mare, astfel se acordă 5 puncte. Un total de 6 puncte
ce corespunde cu un rezultat echivoc.

Fig.10 .3. Stripul LBB09 coresp unde pentru IgM. Banda ce corespunde lui
p41 are o intesitate mai mare decât cea a cut -offului, deci se acordă 1 punct,
și banda pentru OspC are o intesitate similară cu cea a cut -offului, astfel se
acordă 8 puncte, un total de 9puncte, deci rezultat pozitiv. Stripul LBB03 este
pozitiv pentru VisE – se acordă 5 puncte, p41 -1 punct, p39 -5puncte și OspC -5
puncte, obținând un total de 16 puncte, deci rezultat pozitiv.

50

Fig.10 .4. Stripul LBB08 prezintă benzi de intensitate mai mare decât
a cut -offului în d reptul la p41 și p39, pentru care primește 5puncte.
Stripul LBB04 pentru IgG primește doar un punct pentru p41.

Fig.10 .5. Stripul cu numărul LBB12 pentru detectarea de IgM primește
1 punct pent ru p41, 4 puncte pentru p39 și 8 puncte pentru Ospc, cu un total
de 13 puncte, se consideră test pozitiv. Pentru stripul LBB 15 se acordă: 5
puncte pentru VisE, 1punct pentru p41, 5 puncte pentru p39, 5puncte pentru
OspC, iar pentru p100 și Borrelia garinii 0 puncte deoarece intensitatea
acestor benzi este mai mică decât cea a cut -offului. A stfel s-a obținut un total
de 16 puncte, deci rezltatul este pozitiv.

51

Fig.10 .6. Stripul cu numărul LBB19, corespunde cu detectarea IgM -ului,
primește 1 punct pent ru p41, deci rezultatul este negativ. Stripul LBB16
pentru IgG primește 5puncte pentru p100, 5puncte pentru VisE, 4 puncte
pentrup58, 1punct pentru p41 și 5 puncte pentru Borrelia afzelli, un total de
20 de puncte, deci rezultatul este pozitiv.

Fig.10 .7 Stripul LBB11 spcific pentru IgM a primit următoarele puncte: 1
pentru p41, 8 pentru OspC și 5 pentru Borrelia afzelli, un total de 14 puncte –
pozitiv.
Stripul LBB20 nu a primit nici un punct pentru că doar benzile de control s -au
colorat, astfel rezultat ul este negativ.

52
11.Concluzii

Western blotul este o tehnică care la nivelul unor reactivi se bazează pe
proceduri biotehnologice. Aplicațiile pot fi în domeneniul cercetării ( unde se
pot determina atât antigeni cât și anticorpi) cât și în domeniul diagnosticului
clinic.
Dacă se determină anticorpi, antigenii folosiți se pot obține atât din lizat
celular cât și prin tehnica recombinării genetice.
Dacă se determină antigeni, anticorpii folosiți se pot obține atât prin
tehnica clasică a imuniz ării de animale (ser policlonal) cât și prin tehnica
hibridoamelor din care se obțin anticorpi monoclonali.
În detectarea anticorpilor în tehnica Western blot se folosesc acticorpi
secundari care de obicei sunt seruri sau anticorpi policlonali anti om.
În ceea ce privește detectarea semnalului imunoblotul se bazează pe
formarea unui complex imun care se poate marca fluorescent, radioizotopic sau
enzimatic (de unde se poate obține un semnal luminescent sau colorimetric).
Western blotul in diagnosticul clinic se co nsideră o tehnică de confirmare
(de exemplu în HIV, hepatite sau boala Lyme).

53
Bibliografie

1. Tahrin Mahmood, Ping -Chang Yang , Western Blot: Technique,
Theory, and Trouble Shooting , North Amerocan Journal of
Medical Sciences, 4, 2012 : 429-434
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/?rep
2. Western Blotting Principles and Methods, Handbooks from GE
Healthcare 28 -9998 -97 AB 10/2011:9 -190
3. Western Blotting Fundamental Principle, How Western Blots
Work -https://www.bosterbio.com/protocol -and-
troubleshooting/western -blot-principle
4. Ileana Funduc, Metode de separare și caracterizare a
proteinelor, Minodora Dobreanu, Biochimie clinică -Implicații
practice Ed. a -3-a revizuită, Târgu Mureș: University Press, 2015:
1-457
5. J. J. Bass, D.J.Wilkinson, D. Rankin, D.E. Philips et al., An overview
of technical considerations for We stern blotting aplications to
physiological research, Scandinavian Journal of Medicine&
Science in Sports, 2017:27:4 -25
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/sms.12702
6. Felicia To ma Săcărea, Genul Borrelia , Bacteriologie medicală,
Târgu Mureș: University Press, 2006:2 -463
7. Mark H. Beer, Boli infec țioase, Robert S. Porter, Thomas V. Jones,
et al., Manualul Merck ediția a XVIII a, ALL, 2006:1 -2976
8. Creative BioMart, Recombinant Protein and Its Expression
Systems https://www.creativebiomart.net/resource/article –
recombinant -protein -and-its-expression -systems-365.htm
9. Germ án L. Rosano, Eduardo A. Ceccarelli, Recombinant protein
expression in Escherichia coli: advances and challenges,
Frontiers in microbiologz,2014,5: Article 172:1 -17
10. Felicia Toma Săcărea, Bacili gram negativi, Bacteriologie
medicală, Târg u Mureș: University Press, 2006:2 -463

54
11. Felicia Toma Săcărea, Genetica bacteriană, Universitatea de
Medicină și Farmacie Târgu Mureș, 2005:2 -70
12. Wolgang Schumann, Luis Carlos S. Ferreira, Production of
recombinant proteins in Escherichia coli, Genetics and
Molecular Biology, 2004, 27:442 -453
13. Hyunah Kim, Su Jin Yoo, Hyuan Ah Kang, Yeast synthetic biology
for the production of recombinant therapeutic protei ns, FEMS
Yeast Research, 2015, 15:1 -16
14. Ashok D. Bandaranayake, Steven C. Almo, Recent advances in
mammalian protein production, NIH -PA Author Manuscript,
2014, 588:253 -260
15. What are antibodies? Medical and Biological Life science
http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/support/method/antibody.html
16. How to generate antibodies, Medical and Biological Life science
http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/support/method/antibody –
production.html#mono
17. recomLine Borrelia IgG -IgM, Mikrogen diagnostik, 2013