Mărchidanu Carolina -Antonia [609162]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE
STUDIUL ACTIVITĂȚII ANTIMICROBIENE,
TOXICITĂȚII ȘI GENOTOXICITĂȚII UNOR
NANOPARTICULE ANORGANICE CU APLICAȚII
BIOMEDICALE

Coordonator științific:
Conf. Dr. Liliana Burlibașa

Îndrumător științific:
Prof. Dr. Mariana Carmen Chifiriuc

Masterand: [anonimizat]
– 2017 –

CUPRINS
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 3
CAPITOLUL I ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 4
1.1 Caracterizarea generală a nanoparticulelor. ………………………….. ………………………… 4
1.1.1 Mecanismul de formare al nanoparticulelor ………………………….. ……………………… 4
1.1.2 Nanoparticule de argint ………………………….. ………………………….. …………………….. 6
1.1.2.1 Metode de obținere a nanoparticulelor de argint ………………………….. …………. 7
1.1.2.2 Aplicații practice ale nanoparticulelor de argint ………………………….. ………….. 9
1.1.2.3 Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor de argint ………………………….. 13
1.1.2.4 Toxicitatea nanoparticulelor de argint ………………………….. ………………………. 16
1.1.3 Aspecte importante ale interacțiunilor din tre nanoparticulele de argint și sistemul
celular ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 22
1.1.4 Nanoparticule de oxid de zinc. Proprietăți. ………………………….. ……………………… 24
1.1.4.1 Metode de obținere a nanoparticulelor de oxid de zinc ………………………….. … 26
1.1.4.2 Aplicații practice ale nanoparticulelor de oxid de zinc ………………………….. … 28
1.1.4.3 Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor de oxid de zinc …………………. 29
1.1.4.4 Toxicitatea nanoparticulelor de zinc ………………………….. …………………………. 31
1.1.5. Testul micronucleilor in vivo ………………………….. ………………………….. …………….. 36
CAPITOLUL II. TESTAR EA ACTIVITĂȚII ANTIM ICROBIENE ȘI A
GENOTOXICITĂȚII UNOR NANOPARTICULE ANORGA NICE ………………………….. …. 40
2.1 Scopul și obiectivele lucrării ………………………….. ………………………….. ……………………… 40
2.2 Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 40
2.3 Rezu ltate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 43
2.4 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 48
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 49

3
INTRODUCERE

Apariția rapidă a nanotehnologiei a permis obținerea unei game largi de diferite
nanoparticule (NP) pentru aplicații specifice în industria farmaceutică, cosmetică și alte produse
biomedicale, precum și pentru dezvoltarea tehnicilor de imagistică și a tera piei fototermice. Cu
toate acestea, apar multe întrebări privind siguranța și riscurile latente pentru sănătatea umană și
pentru mediu (Chifiriuc și colab. , 2016).
Recent, atenția a fost concentrată asupra nanoparticulelor de argint datorită proprietățilo r
lor fizico -chimice și biologice distincte. Acest interes a provenit din utilizarea de nanoparticule
de argint în multe produse diferite, datorită dimensiunilor lor excepțional de mici și a
potențialului lor efect antibacterian (Duran și colab. ,2015).
Diferite produse pe bază de argint au devenit alternative eficiente î n îngrijirea arsurilor în
comparație cu antibi oticele comerciale disponibile. N anoparticule de argint au fost raportate ca
având o eficiență îmbunătățită împotriva unei game largi de micr oorganisme ( Rădulescu și
colab. , 2016) .
Nanoparticulele de ZnO prezintă rezultate in vivo bune în aplicațiile dermatologice cum
ar fi produsele de protecți e solară și produsele cosmetice, unde a u o penetrare limitată în straturile
cutanate și a u un efect redus asupra activității celulelor pielii (de exemplu : morfologie,
metabolism sau oxidare) (Petrochenko și colab.,2013).
Scopul acestei lucrări este reprezentat de evaluarea activității antimicrobiene și a
genotoxicității unor nanoparticule anor ganice pe bază de argint ș i oxid de zinc .

4
Capitolul I
1.1 Caracterizarea general ă a nanoparticulelor
Având în vedere evoluția , forma , sinteza, și structura particulelor, cu dim ensiuni cuprinse
între 1 -100 nm, dezvoltarea nanotehnologiilor a deschis noi frontier e ale aplicabilității , incluzând
sinteza ma terialelor la scar ă nano -, explo atarea și utilizarea proprietăț ilor fizico -chimice ș i
optoelectron ice. Nanotehnologiile dev in din ce în ce mai importante î n diferite domenii, cum ar
fi: sănătate, protecția mediului, cosmetic ă, alimentație, electronic ă, energetică, medicamente etc.
(Popa și colab.,2015).
Potențialul imens al NP pentru aplicații diferite est e rezultatul faptului că acestea sunt mai
reactive decât particulele cu dimensiuni convenționale, este de asemenea posibil ca ele să
prezinte, o citotoxicitate mai mare (Chifiriuc și colab. , 2016).
Cele mai utilizate metode de caracterizare a nanoparticulelor pentru studiile de
toxicologie sunt microscopia electronică de transmisie (TEM) pentru : mărimea, morfologia și
aglomerare a, dispersia dinamică a luminii (DLS) pentru distribuția mărimii particulelor,
măsurarea potențialului zeta pentru înc ărcarea suprafeței nanoparticulelor și x – difracție de raze
(XRD) pentru structura cristalină a particulelor. În unele cazuri, cum ar fi nanoparticulele de aur
și argint, spectroscopia UV poate fi utilizată pentru a determina distribuția mărimii și dimens iunii
datorită unei activități optice dependente de mărime. Analiz a nanoparticulelor trebuie să se repete
după administrare, deoarece în ti mpul procesului de aplicare este posibil să apară diferite
modificări ale acestora. Nanoparticulele sunt aplicate de obicei prin amestecarea cu mediul de
cultură celular. Componentele dizolvate în mediu , în special ionii, conduc la aglomerarea și
precipitarea multor nanoparticule, provocând modificări semnificative ale proprietăților lor
fizico -chimice. Efecte similare sunt de așteptat atunci când nanoparticulele vin în contact cu
surfactantul sau alte fluide biologice. S -a demonstrat că unele nanoparticule tind să formeze
coroane proteice în sistemele biologice (Omlor și colab., 2015) .
1.1.1 Mecanismul de formare al nanoparticulelor
În general, sinteza de nanoparticule a fos t realizată folosind trei abordăr i diferite : fizice,
chimice și biologice (Zhang și colab. 2016) .
Unele dintre cele mai importante abordări fizice sunt ablația laser și procesele de
evaporare -condensare , folosind un cuptor tubula r, la presiune atmosferică . Avantajele metodelor

5
fizice față de cele chimice sunt: absența solventului din învelișurile de material, uniformitatea
distribuției nanoparticul elor și nu există produse chimice periculoase implicate. Ca și dezavantaje
ar fi: randamentul scăzut cu un consum mare de energie (Popa și colab. ,2015).
Abordarea chimica folosește apă sau solvent organic pentru prepar area nanoparticulelor
de argint . Acest procedeu utilizează de obicei trei componente principale : precursori metalici,
agenți reducători și stabilizatori . Practic, reducerea sărurilor de argint implică doua etape: etapa
nucleat ă și o creștere ulterioară . Metoda chimică presupune folosi rea mai multor tehnici: sinteza
criochimică , ablația laser, reducerea electrochimică, iradierea laser, descompunerea termică și
reducerea chimică. Aceast ă metodă prezintă un randament ridicat și un cost scăzut. Dezavantajul
ar fi că utilizarea agenților chimici este dăunătoare organismelor vii (Zhang și colab. , 2016) .
Abordarea biologică poate fi folosită pentru sintetizare a nanoparticulelor de argint fără a
folosi substanțe scumpe, dăună toare sau toxice. S -au efectuat multe studii referitoare la sinteza
nanoparticulelor de argint folosind cu succes microorganisme și sisteme biologice. De exemplu
s-a demonstrat sinteza bioreductiv ă a nanoparticulelor de ar gint folosind Fusarium o xysporus
(Popa și colab. , 2015).
În producerea nanoparticulelor se utilizează un extract intracelular și extrace lular de
organisme, care se amestecă cu o soluție de săruri de metal la temperatura camerei. Reacția este
finalizată în câteva minute. Natura extractului viu, concentrația acestuia, concentrația metalului,
sarea, pH -ul, temperatura și timpul de contact sunt cunoscute că afectează rata de producție a
nanoparticulelor, cantitatea lor și alte caracteristici (Popa și colab. ,2015).

6

Fig. 1. Diverse organism e utilizate pentru biosinteza nanoparticulelor (adaptat dup ă Velusamy și
colab ., 2016) .
1.1.2 Nanoparticule de argint

Nanoparticulele de argint sunt particule cu dimensiune cuprin să între 1 nm și 100 nm. Î n
prezent, nanopartic ulele de argint sunt utilizate î n calitate de agenți antibacter ieni/antifungici, î n
biotehnologie și bioinginerie ( Chappel și Greville , 2004) .
Recent, nanoparticulele de argint au primit o mare atenție datorită proprietăț ilor lor fizico –
chimice și biologice distincte. Acest interes a provenit din utilizarea de nanoparticule de argint în
multe produse diferite, datorită dimensiunilor lor excepțional de mici și a poten țialului lor efect
antibacterian (Duran și colab. , 2015 ).
Actualmente, nanoparticule de argint se află în centrul atenției cercetătorilor. Aplicarea
lor multidisciplinară este cunoscută în general, deși utilizarea lor ca agenți antibacterieni este
probabil cea mai studiată . Există diferite metode sintetice pentru a obține NP de argint , de
exemplu, ablația laser, iradierea gamma, iradierea electronică, reducerea chimică, metodele
fotochimice, prelucrarea cu microunde și metodele biologice de sinteză . În ceea ce privește
precursorii de argin t pentru sinteza a cestor nanoparticule , cel mai adesea se utilizează nitrat de

7
argint, deoarece este ieftin și accesibil. Trebuie aplicat un agent de reducere pentru a transforma
argintul d in forma ionică în element (Balaz și colab.,2017) .
1.1.2.1 Metode de obținere a nanoparticulelor de argint

Sinteza nanoparticulelor de argint din bacterii . Pot fi sintetizate nanoparticule de argint
foarte stabile (40 nm) prin bioreducerea ionilor cu ajutorul unei culturi de bacterii supernatante
nepatogene, Bacillus licheniformis . Câțiva cercetători , au descoperit o nouă metodă pentru
sinteza nanoparticulelor. Această abordare se realizează prin combinarea unor culturi
super natante ( Bacillus subtilis ) prin meto da iradierii cu microunde în apă (Popa și colab .,2015).
Sinteza nanoparticulelor de argint din fungi . Nanoparticulele de argint (5-50 nm) pot fi
sintetizate extracelular folosind Fusarium oxysporum, fără vreo evidență a floculării particulelor
chiar după o lună de la reacție . Stabilitatea pe termen lung a soluției pe care o dau nanoparticulele
se poate datora stabilizării nanoparticulelor de argint de către proteine. Morfologia
nanoparticulelor variază o dată cu forma, în general, sunt sferice ș i ocazional pot fi observate la
micrografie și forme triunghiulare. S -a descoperit că aceste nanoparticule interacționează puterni c
cu proteinele, incluzând citoc romul C. Această proteină ar putea să se formeze singură pe
suprafața coloidului de argint redus în prezență de citrat. Nanopa rticule le de argint stabile pot fi
obținute folosind Aspergillus flavus. Aceste n anoparticule sunt stabile în apă mai bine de 3 luni
fără nici o agregare semnificativă datorită ligantului de suprafață al materialelor stabilizate
secretate de fungi. Biosinteza extracelulară a nanoparticulelor de argint la care s -a folosit
Aspergillus fumigatus (ciuperci saprofite omniprezente) a fost investigată în anul 2006 de
Bhainsa și D’souza. Rezultatul dat de microscopul TEM (Tramsmission Electron Microscopes) a
expus nanoparticulele d e argint bine dispersate și cu mărimi variabile, majoritatea având form ă
sferică și doar câteva cu formă triunghiular ă. Compar ativ cu biosinteza intracelulară a
nanoparticulelor, sinteza extra celulară ar putea fi recunoscută ca fiind o metodă simplă dar și
profitabilă datorită etapei secundare a bioprocesului. Aceasta se referă la partea în care masa de
celule din etapa I ajunge să satisfacă cerințele de calitate și puritate ale biomasei (Popa și colab .,
2015).
Sinteza nanoparticulelor din plante . Extractul de Camellia sinensis (ceai verde) a fost
folosit ca un agent reducător și stabilizator pentru biosinteza nanoparticulelor de argint în soluții
apoase și în condițiile mediului ambiant. S -a observat că atunci când cantitatea de extract a

8
crescut, nanoparticulele rezultate erau relativ mai mari, late si mai sferice. Biomoleculele de tipul
acizilor fenolici (ex: cafeina, teofil ina) prezente în extractul de Camellia sinensis sunt
responsabile pentru formarea și stabilizarea nanoparticulelor d e argint. Extractele din frunzele
ceaiului negru sunt de asemenea folosite în producerea nanoparticulelor de argint , acestea sunt
stabile și au forme diferite (sferice , trapezoid ale, prisme, tije). Polifenolii și flavonoidele sunt
responsabile pentru bios intezele acestor nanoparticule (Popa și colab .,2015).
Sinteza mediată de fitom este o metodă biosintetică r apidă, potrivită fiind cea mai
acceptabilă pentru sinteza nanoparticulelor metalice. Diverse părți ale plantelor, cum ar fi
extractele de coajă, frunze, fructe, tulpini și semințe au fost utilizate cu succes pentru sinteza
nanoparticulelor metalice . Abordarea de sinteză verde oferă cele mai multe avantaje față de
metoda chimică și fizică, deoarece este eficientă din punct de vedere al costurilor, e cologică și
ușor de creat pentru o sinteză pe scară largă fără a aplica substanțe chimice , de înaltă presiune,
temperatură și toxice. Există mai multe rapoarte privind sinteza n anoparticulelor de argint
utilizând diferite produse vegetale. Cu toate acestea , este încă nevoie de o cale stabilă din punct
de vedere economic, viabilă din punct de vedere comercial și eco logic, pentru sintetizarea AgNP
utilizând noi surse de plante. În ultimii ani, utilizarea plantelor și a produselor pe bază de plante
în sinteza diferitelor nanoparticule metalice a fost în mare măsură investigată. O serie de plante
medicinale sunt utilizate în mod industrial pentru producerea de medica mente pe bază de plante ,
precum și a compușilor bioactivi pentru sănătate și produse nutritive . Printre acestea, Protium
serratum este utilizat pe scară largă în întreaga lume pentru compușii săi farmaceutici activi care
vindecă diferite afecțiuni gastro -intestinale fiind considerați și agenți antimicrobieni puternici.
Diferite părți ale plantei Protium serratum au fost utilizate efectiv ca fructe, alimente și ca agenți
terapeutici potențiali în medicamentele tradiționale. Un număr de substanțe fitochimice, cum ar fi
polifenoli, flavonoide, tanin, zaharuri, alcaloizi și triterpenoide / steroizi, au fo st raportate ca fiind
prezente în planta Protium serratum și în diferitele sale părți, inclusiv frunze, rădăcini, fructe,
semințe și altele . Astfel, s -au folosit frunzele de Protium serratum pentru sinteza nanoparticulelor
metalice care ar fi o abordare profitabilă, rentabilă și ecologică (Mohanta și colab.,2017)
În așa numita abordare ecologică, procedura de reducere este efectuată de un material
natural, cel mai frecvent un extract de plant e care conține substanțe cu proprietăți de reducere . Au
fost aplicate div erse plante pentru sinteza nanoparticulelor de argint , iar a cest subiect a fost în
centrul numeroase lor lucrări de revizuire din ultimii ani . De asem enea și Origanum vulgare a

9
fost utilizat pentru sinteza Ag NP. Această plantă este destul de comună și conține substanțe cu
proprietăți benefice pentru sănătate și are una dintre cele mai puternice activități antioxidante
cunoscute printre plantele culinare. În majoritatea cazurilor, nano particulele de argint trebuie să
fie activate de diferiți agenți de captare înainte de aplicarea lor. Agenții de acoperire pot fi și
substanțele responsabile de reducerea argintului sau a altor componente prezente în plante.
Principala lor funcție este de a spori stabilitatea NP într-o soluție, care este factorul -cheie atunci
când se analizează agentul de acoperire pentru nanosuspensie. Agenții de acoperire pot afecta și
forma nanoparticuleleor . Polivinilpirolidona (PVP) face parte dintre cei mai răspândiți agenți de
acoperire, deoarece este netoxică și poate servi la diferite scopuri benefice în timpul sau după
sinteza nanoparticulelor. Poate fi aplicat ca stabilizator de suprafață, modificator d e creștere,
dispersant sau agent de reducere. Mai mult, efectul său benefic asupra propr ietăților
antimicrobiene ale Ag NP în combinație cu antibiotice le a fost raportat în literatură (Balaz și
colab.,2017)
1.1.2.2 Aplicații practice ale nanoparticulelor de argint
În ultimul deceniu, s-a înregistrat o creștere exponențială în ceea ce privește aplicarea
nanoștiinț ei și nanotehnologiei, ceea ce a dus la progrese importante în dezvoltarea de noi
nanomateriale. Aceast ă creștere a inovării se datorează , în mare măsură , proprietăț ilor speciale pe
care a ceste materiale l e posedă la scară nanometrică , ceea ce duce la o creștere mecanică,
dimensională, electrică, fotochimică și catalitică ( Calderon -Jime nez și colab . , 2017) .
Toate aceste achiziț ii în cercetarea și dezvoltarea noilor aplicații ale nanoparticulelor vor
avea un impact direct asup ra comerțului și societăț ii . În ultimii ani au existat diferite estimări ale
producției mondiale ale nanoparticulelor de argint. Se preconizează că industria nanotehnologică
global ă va continua să crească semnificativ. În mod specific, este de așteptat ca producția de
nanoparticule de argint să ajungă la aproximativ 800 t pa nă în 2025 (Calderon -Jime nez și colab . ,
2017) .
Printre nanoparticulele metalice, nanoparticulele de argint au fost utilizate enorm datorită
potențialului anti -bacterian, anti -fungic și antiproliferativ. Nanoparticulele de argint s -au dovedit
a fi implementate pe scară largă în domeniul detecției bio -moleculare, diagnosticului , catalizei și
microelectronicii (Mohanta și colab., 2017 ). De asemenea, prezintă un interes sporit, includerea
nanoparticulelor de argint într -o gamă largă de dispozitive medicale, precum matrice osoasă,

10
instrumente chirurgicale, măști chirurgicale, pansa mente pentru plăgi, creme antibacteriene
(Chappel și Greville , 2004).
În prezent, nanoparticulele de argint sunt utilizate în principal pentru cataliză, transport,
senzorizare și multe alte aplicații biologice și medicale. Aceste aplicații au sporit posi bilitatea ca
organismele vii să fie expuse direct sau indirect la nanoparticule de argint, ceea ce ar putea
induce numeroase efecte dăună toare asupra sănătății umane și asupra mediului. Efectele adverse
(primare sau secundare) ale nanoparticulelor de argint pot să se extindă în sistemul cardiovascular
sau în sistemul nervos central, provocând astfel neur otoxicitate sau imunotoxicitate (Duran și
colab. , 2015) .
S-a observat că nanoparticulele de argint au o valoare de marketing mai mare decât
celelalte nanoparticule, iar pre zența lor în produsele de consum este mult mai populară . Aceast ă
popularitate remarcată poate fi atribuit ă proprietăț ilor antimicrobiene ale argintului ionic
(Calderon -Jime nez și colab ., 2017) .
Proprietăți le fizico -chimice distincte ale nanoparticulelor de argint, ar fi: cond uctivitatea
electrică și termică ridicată, activitate catalitică și proprietăți optice neliniare acestea conducâ nd
la o varietate de produse noi și aplicații științifice .Proprietățile fizico-chimice menționate oferă
nanoparticulelor de argint capacitatea de a fi utilizate î ntr-o multitudine de noi aplicații
comerciale și tehnologice, inclusiv ca agenți antiseptici în domeniul medical, cosmetic ă,
ambalarea produselor alimentare, bioindu strie, electrochim ie și industrii de cataliz ă (Calderon –
Jime nez și colab. , 2017) .
Activitatea antibacteriană și antimicrobiană a nanoparticulelor de argint se numără printre
principalel e motive pentru utilizarea lor î n formularea de detergenți de suprafață , jucării ,
dezinfecție de aer și apă, catetere antimicrobiene, îmbrăcăminte clinică și conservarea alimentelor
etc. Nanoparticulele de argint de diferite forme și mărimi au fost utilizate pentru a dezvolta un
dispozitiv de diagnosticare rapidă pentru depistarea afecțiunilor febrile sistemice acute, cum ar fi ,
febra galbenă și virusul Ebola. O altă utilizare principală a nanoparticulelor de argint este
încorporarea lor în produsele din domeniul textilelor . Wu și colaboratorii (2016) a u raportat o
fabricare simplă și adecvată a țesă turilor de bumbac, cu capacită ți antibacteriene și proprietăț i
superhi drofobe care se pot folosi ca îmbrăcă minte de protecție pentru a lucra în domenii umede și
mai puțin sănătoase (Calderon -Jime nez și colab ., 2017).

11

Datorit ă proprietăț ilor lor unice antibacteriene, antifungice, anti -canceroase și
antiangiogene , AgNP au fost utilizate pe scară largă în ustensilele de uz casnic, în industria de
îngrijire a sănătăț ii și în aplicați ile de depozitare a alimentelor, de mediu și biomedical (figura 2)
(Zhang și colab ., 2016).

Fig. 2 Aplicații ale nanoparticulelor de argint : antibacteriene, antivirale, antiinflamatoare,
antiangiogenice, antitumorale, antioxidanti (adaptat după Zhang și colab ., 2016).
Având în vedere activitatea lor biocidă intrinsecă, materialele pe bază de argint au fost
folosite de ani de zile ca antimicrobiene pentru tratamentul arsurilor, traum elor și ulcerelor
diabetice . Diferite produse pe bază de argint au devenit alternative eficiente în comparație cu
antibioticele comerciale disponibile. Nanoparticule le de argint au fost raportate ca având o
eficiență îmbunătățiță împotriva unei game largi de microorganisme (Rădulescu și colab ., 2016) .
Pansamentele care conțin argint pot fi utilizate cu succes pentru tratarea rănilor acute,
cum ar fi chirurgicale sau traumatice (inclusiv arsuri) și pentru tratarea rănilor cronice inclusiv
leziuni deschise sau închise localizate, prevenind astfel răspândirea microbiană și infecția
sistemică ulterioară . Este bine cunoscut faptul că nanoparticulele metalice și de oxid de metal de
dimensiuni mai mici induc un potențial toxic crescut față de celule, d atorită tendinței lor de a
elibera ionii metalici în mediul fiziologic. Prin urmare, soluția de acoperire a nanoparticulelor de
argint a fost testată in vivo și in vitro ( Rădulescu și colab ., 2016) .

12
Exist ă o mare varietate de pansamente pentru răni, disponibile pe piață care conțin argint
și care acționează ca o barieră de protecție temporară și oferă condiții ideale de reparare ef ectivă
(Fox și colab., 1974) .
Nanoparticulele de argint prezintă interes deoarece dețin o combinație rară de proprietăț i
(mărimea și forma depinzând de proprietățile optice, electrice și magnetice) care se regăsesc în
aplicabilitățile antimicrobiene: materiale cu biosenzor , fibre compozite, materiale criogenice
superconductoare, produse cosmetice și comp onente electronice (Popa și colab ., 2015).
Efectele citotoxice ale nanoparticulelor de argint sintetizate au fost investigate pe
microorganisme și pe kerationocite umane bazându -se pe permeabilitatea pielii sub iradiere UV .
Nanoparticulele de argint s-au dovedit a fi foarte stabile, de monstrând eficacitate suficientă
împotriva bacteriilor și a ciupercilor mixte, acestea nepenetrând pielea uman ă . Nanoparticulele
de argint sunt adecvate pentru utilizarea lor drept cons ervant în produsele cosmetice (Popa și
colab ., 2015).
Microorganismele ce dau naștere infecțiilor bucale de tipul candidozei ar putea fi distruși
de nanoparticulele de argint produse în labora tor. Cercetătorii au studiat acțiunea nanoparticulelor
de argint prezent e în ap a de gură și pe fațetele de ceramică , acestea având un potențial preventiv
asupra infecțiilor cauzate de Candida sp. Aceasta apare atat la persoanele tine re cât și la cele în
vârstă , dar mai ales la persoanele cu un sistem imunitar slăbit . Cercetătorii implicați în acest
studiu au adăugat nanoparticule de diferite d imensiuni și în diferite cantităț i în biofilme
artificiale orale. Aceștia au constatat că au eficiență indiferent de dimensiunea partic ulelor.
Având în vedere incidenț a infecțiilor date de Candida a lbicans , nanoparticulele de argint sunt o
noua metod ă de tratament cu potențial crescut, deoarece ele sunt relativ stabile în mediul lichid.
Nanoparticulele de argint vor putea fi utilizate în componenț a apelor de gur ă (Popa și colab. ,
2015).
Utilizarea nanoparticuleleor de argint pe suprafețele implantului manifestă un interes
consi derabil , în special datorită proprietăț ilor antimicrobiene și a potențialului puternic anti –
biofilm, împreună cu citotoxicitate a relativ scăzută la celulele de mamifere. Nanoparticulele de
argint inhib ă în mod eficient creșterea bacteriilor inclusiv tulpin ile foarte rezistente, la
concentrații foarte scăzute în unităț i de mg/l, în timp ce astfel de concent rații nu prezintă efect
citotoxic acut, fapt dovedit la concent rații mai mari de 20 mg/l (Markowska și colab ., 2013) .

13
Datorită proprietăților lor antimicrobiene unice, nanopartic ulele de argint (AgNP) se
numără printre nanoparticulele cele mai utilizate pe scară largă într -o varietate de produse de
consum . Prin spălare, ploaie și prin alte căi, aceste nanoparticule pot fi eliberate în mediul
înconju rător, în special în mediul acvatic . Acest lucru îngrijorează cu privire la potențialele efecte
adverse asupra organismelor acvatice. În acest context, toxicitatea AgNP la organismele acvatice
a fost testată pe o varietate de organisme, de la bacterii la p lante, fungi, alge, nevertebrate și pești
(Yue și colab., 2017) .

1.1.2.3 Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor de argint
Printre nanoparticulele metalice cu activitate antimicrobiană deosebit ă, cele realizate din
argint sunt agenți bactericizi deosebit de eficienți . Proprietățile antibacteriene ale argintului sunt
cunoscute de mult și se consider ă că nanoparticulele acestui metal sunt mai puțin toxice decât
ionii de argint. Nanoparticule le de argint au probabil mecanisme multiple de acțiune
antibacteriană , din cauza lipsei curente a cunoștințelor despre acest subiect, baz a exactă pentru
activitatea nanoparticulelor de argint este încă necunoscută . Unele studii au arătat că
nanoparticulele de argint eliberează ioni Ag + în prezenț a apei (Markowska și colab ., 2013) .
În plus, în cazul nanopa rticulelor de argint , rezistenț a bacterian ă nu a fost raportată până
acum, în ciuda faptului că a fost observată rezistenț a la argint ionic. Având un risc foarte scăzut
de dezvoltar e a rezistenț ei bacteriene, este, relevantă cunoașterea efectelor antibacteriene ale
nanoparticulelor de argint. Acesta este un efect extrem de valoros , mai ales astăzi , când ne
confruntă m cu o rezi stență antibacteriană crescu tă observată la antibiotice și alte substanțe
antibac teriene. Prin urmare, o acțiune comun ă multidisciplinar ă, inclusiv înlocuirea antibioticelor
cu abordări non-antibiotice, ar putea reduce gama și rata rezistenț ei bacteriene (Gallo și colab .,
2016) .
Mecanismul activității antibacteriene a argintului a f ost studiat pe larg, pentru a înțelege
procesul său de bază . Înainte , se știa deja c ă modul de acțiune bactericid al argintului implic ă
numeroase că i. Atomii de argint se atașează la grupele tiol ale enzimelor implicate în procesele
biologice vitale, incluzând transportul de ioni și gene rarea de energie transmembranară . Argintul
catalizează reacțiile de oxidare dintre atomii de oxigen și hidrogen al tiolului, producând
legăturile disulfidice și inhibând creșterea bacteriilor ( Nam și colab., 2015) .

14
Modificările de la nivelul moleculelor biologice vitale ale celulelor conduc la modificări
ale structurii celulare, care pot duce la moartea acestora . Un alt mecanism al activității
antimicrobiene a argintului este întreruperea respirației celulare bacteriene. Ionii de argint sunt
capabili să dezactiveze subunitățile ribozomale 30S. Dezactivarea complexului de r ibozomi
conduce la o interferență în translația proteinelor, o parte important ă a reproducerii bacteriene
(Yamanaka și colab., 2005) .
Lipsa unei bariere normale de protecție , în cazul unei plăgi , poate conduce la o creștere a
șanselor de infecție și la alte complicații ( Nam și colab., 2015) .
Activitatea antibacteriană a ionilor de argint este frecvent testat ă pe bacterii Gram
pozitive ( Staphylococcus aureus ) și Gram negative ( E-coli) ( Nam și colab., 2015) .
Dezvoltarea de noi tulpini patogene de bacterii rezistente la antibioticele disponibil e în
prezent a devenit o amenințare la adresa sănătății publice, care declanșează dezvoltarea imediată
a bactericidelor de nouă generație. Există multe influențe pozitive ale AgNP, aceste nanoparticule
urmând să fie utilizate ca agenți antimicrobieni efici enți. Ele sunt foarte competente împotriva
unei game largi de bacterii și paraziți patogeni, având toxicitate sistemică scăzută față de om. În
plus, AgNP au fost proclamate a fi utilizate și testate pentru numeroase aplicații biomedicale și
industriale, in clusiv evitarea colonizării bacteriene și eradicarea microorganismelor de pe diferite
dispozitive medicale metalice și nemetalice, agent dezinfectant în stațiile de tratare a apelor
reziduale și în garnituri din cauciuc siliconic pentru conservarea și tra nsportul materialelor de
hârtie și materiale textile. Dat fiind faptul că argintul este cunoscut de mult timp că prezintă o
toxicitate puternică pentru o gamă largă de microorganisme, este un mare avantaj să se utilizeze
compuși pe bază de argint pentru aplicații antimicrobiene împotriva agenților patogeni proveniți
din alimente, precum și antioxidanți pentru a menține calitatea alimentelor (Mohanta și colab.,
2017)
Apariția bacteriilor MDR nece sită noi antibiotice cu activități antibacteriene
îmbunătăț ite. În majoritatea privințelor , nanoparticulele de argint au apărut ca alternativ e pentru
problemele de rezistență la antibiotice, deoarece nanoparticulele de argint utilizează mecanisme
multivalente sau polivalente pentru a -și exercita activități antibact eriene . În plus, raportul mare
suprafață – volum și caracteristicile fizice și chimice specifice ale nanoparticulelor de argint le
fac agenți antibacterieni eficienți împotriva bacteriilor MDR, care includ Staphylococcus aureus
rezistent la meticilin ă (MRSA), Staphylococcus aureus sensibil la meticilină (MRSE),

15
Escherichia coli rezistent la ampicilin ă, Staphylococcus aureus rezistent la vancomicina
(VRSA), Staphylococcus pyogenes rezistent la eritromicina, Pseudomona s aeruginosa
multirezistent (Park, 2 014).
Mecanismele antibacteriene ale nanoparticulelor de argint nu sunt încă pe deplin înț elese.
Cu toate acestea, comunitatea de cercet are a prezentat câteva ipoteze:
1. Nanoparticulele de argint penetrează peretele celular al bacteriilor Gram negative,
conducând la creșterea permeabilității celulare, urmat ă de moartea celulei.
2. Formarea radicalilor liberi de către nanoparticulele de argint este atribuit ă deterioră rii
membranei .
3. Capacitatea puternic ă de legare a Ag+ cu grupările tiol și baze care conțin fosfor,
cum ar fi enzime vitale și baze ADN, determin ă inhibarea creșterii bacteriene și
moartea celulelor (Park, 2014) .
Factorii cheie, cum ar fi dimensiunea și forma, afectează activitatea antibacterian ă a
nanoparticulelor de argint. Cu c ât mărimea particulelor antimicrobiene este mai mic ă cu atât
raportul suprafaț ă-volum crește. Suprafața mare oferă multe oportunităț i de interacțiune cu
bacteriile. Astfel, mărimea mică a particulelor este efic ientă ca agent antibacterian . Pal și
colab oratorii au ra portat că nanoparticulele de argint triunghiulare sunt mai active decât
nanoparticulele de argint în formă sferic ă și în form ă de tija împotriva Escherichia coli, sugerând
că forma nanoparticulelor de argint este un factor cheie în determinarea activit ății antimicrobiene
(Park, 2014) .
Posibilele mecanisme ale activității lor antimicrobiene sunt modificarea structurii
permeabilității selective a membranei celulare, interacțiunea cu sulf ul și fosfor ul multor enzime
vitale, generarea speciilor de oxigen re activ (Rădulescu și colab., 2016) .
Chiar și cu eficacitatea testată clinic a ionilor de argint, dezvoltarea și aplicarea unei
astfel de chimioterapii ar trebui să se desfășoare cu pruden ță, deoarece efectele secundare
neprevăzute anterior s -ar putea p rezenta î n anumite condiții ( Nam și colab., 2015) .
Activitatea anti -biofilm a nanoparticulelor de argint a fost demonstrată într-o serie de
studii. Aplicarea nanoparticulelor de argint ca agent antimicrobian eficient nu trebuie să
provoace rezistență microbiană chiar și după utilizare pe termen lung . Mecanismul de rezistență
implică o proteină care leagă metal ul plasmic , o pompă de eflux chemiosmotică și o pom pă de

16
eflux de ATPază codificată de un singur grup de gene de rezistență la ca tioni metalici t oxici.
Rezistenț a este co nferită de acțiunea pompelor codificate cu plasmă care promovează efluxul
activității de ioni de Ag+ din celulă (Markowska și colab. , 2013) .
Biofilmele bacteriene reprezintă o problem ă gravă datorit ă ineficienț ei crescânde a
antibioticelor convenționale , astfel s unt luate în considerare numeroase metode alternative de
combatere a biofilmelor bacteriene. Nanoparticulele de argint au primit recent o atenție sporit ă
pentru efectele lor antimicrobiene și posibilele aplicații clinice. În ciuda numeroaselor studii
efectuate în ultimul deceniu, există încă lacune semnificative î n cunoștințele despre proprietăț ile
antimicrobiene ale nanoparticulelor de argint. În plus, baza exactă a activității lor antibacteriene
nu a fost încă defin ită (Markowska și colab. , 2013) .
Argintul are proprietăț i antibacteriene, antifungice și antivirale. Mecanismul
antimicrobian al ionilor de argint face să inactiveze enzimele vitale ale bacteriilor, determinând
ADN bacterian sa-și piardă capacitatea de replicare, ducând la moartea celulelor.
Nanoparticulele de argint au demonstrant o eficiență bacterian ă ridicată în materialele dentare .
Conceptul de tratament al cariilor dentare s -a schimbat odată cu dezvoltarea de noi c ompoz ite și
agen ți de legare . Aplicarea nanotehnologiei pentru combaterea cariilor dentare, incluzând
inhibarea formarii biofilmelor și reglarea echilibrului demineralizării și remineralizăr ii, este o
direcție promițătoare pentru prevenirea și tr atamentul cariilor dentare (Cheng și colab. , 2015) .
1.1.2.4 Toxicitatea nanoparticulelor de argint

Studiile anterioare au susținut afirmația că particulele de dimensiuni mai mici pot provoca
o toxicitate mai mare decât cele de dimensiuni mai mari, deoarece au o suprafață mai mare.
Forma este la fel de important ă, ca și dimensiunea particulelor, pentru determinarea toxicității
(Zhang și colab. , 2016).
Pentru toxicitatea asociată nano, mecanismele multiple sunt importante. Pentru a corela
efectele toxice cu proprietățile n anoparticulelor, este necesar să se caracterizeze bine
nanoparticulele se lectate înainte de administrare (Omlor și colab. , 2015) .
Toxicitatea nano particulelor de argint depinde î n principal de disponibilitatea acoperirilor
chimice și biologice pe suprafaț a nanoparticulelor. Acțiunile de suprafață ale nanoparticulelor de
argint ar putea determina efectul de toxicitate în celule. De exemplu încărcarea de suprafață
pozitiv ă a acestor nanoparticule le face mai potrivite, permițându -le să rămână pentru o lung ă

17

perioad ă de timp în fluxul sanguin în comparație cu nanoparticulele încărcate negativ, care
reprezintă o cale majoră pentru administrar ea agenților anticanceroși (Zhang și colab ., 2016) .
Toxicitatea nanoparticulelor de argint este strâns legat ă de transformarea acestora în
mediu biologic, incluzând oxidarea suprafeței , eliberarea ionilor de argint și interacțiunea cu
macromoleculele biologice. Nanoparticulele de argint pot interacționa cu proteinele membranare
și pot activa căile de semnalizare , conducând la inhibarea proliferării celulelor (figura 3)
(McShan și colab. ,2014) .

Fig. 3 Toxicitatea nanoparticulelor de argint in mediul biologic (adaptat după McShan și colab. ,
2014).
Nanopart iculele de argint pot pătrunde , de asemenea , în celulă prin difuzie sau
endocitoz ă pentru a provoca disfuncții mitocondriale, generarea de specii reactive de oxigen
(ROS), care duc la deteriorarea proteinelor și acizilor nucleici și în final, inhib area proliferării
celulelor (figura 4) ( McShan și colab., 2014) .

18

Fig. 4 Mecanismul toxicității nanoparticulelor de argint (adaptat după McShan și co lab., 2014) .
Stresul oxidativ apare atunci când generarea ROS depășeș te capacitatea sistemului de
apărare antioxidantă celulară ( McShan și colab., 2014) .
Un mecanism important de toxicitate pentru nanoparticulele de argint este interacțiunea
atât a formei ionice câ t și a nanoparticulelor de argint cu macromoleculele care conțin sulf, cum
ar fi proteinele, datorit ă afinității puternice a a rgintului pentru sulf (McShan și colab., 2014) .
Proprietățile fizice și chimice ale nanoparticulelor de argint includ: chimia suprafeței ,
dimensiunea, forma, morfologia particulelor, compoziția particulelor, viteza de dezvolta re,
reactivitatea particulelor î n soluție , eficiența eliberă rii ionilor, tipul celulei și î n final tipul de
agenți reducători utilizați pentru sinteză – factori esențiali pentru determinarea citotoxicității . De
exemplu, folosind agenți de reducere biologici, cum ar fi super natantele de cultur ă ale diferitelor
specii de Bacillus , nanoparticule de argint pot fi sintetizate în diferite forme: sferice, tije,
octogonale, hex agonale, triunghiuri, flori etc (Zhang și colab. , 2016) .
Evaluările de risc ale nanoparticulelor de argint sunt concepute pentru a testa efectele
biologice, mecanisme posibile și abordări eficiente pentru a di minua efectele lor ne gative .

19
Nanotoxicitatea se concentrează în mare măsură pe testarea efectelor biologice și est e esențială
pentru înțelegerea mecanismelor și pentru precizarea efectelor potențiale negative ale
nanoparticulelor de argint pentru dezvoltarea du rabilă a acestora în viitor (Zhang și colab., 2014 ).
Cea mai importantă întrebare este cu privire la impactul real al NP asupra sănătății umane
și a animalelor . Mai multe organisme model au fost analizate pentru a înțelege mecanismul
diferitelor boli umane, împreună cu tulburările lor genetice. Organismele frecvent utilizate sunt
drojdia ( Saccharomyces sp.), Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , peștele zebră ,
șoarece le, maimuța și multe altele. Drosophila melanogaster sau Caenorhabditis elegans sunt
modele remarcabile pentru studierea funcții lor genetice având activități moleculare comune .
Aceste modele ne ajută să înțelegem mecanismele moleculare de reglementare, cum ar fi un
complex de proteine care comunică sau o cale de transducție a semnalului (Chakraborty și colab. ,
2016) .
În cazul Drosophyla melanogaster toxicitatea acută a fost observată la 20 mg / l, la care
50% din muștele testate nu au putut să iasă din puști și să termine ciclul de dezvoltare. Expunerea
pe termen lung la Ag a influențat fertilitatea numai în primele trei generații, urmată de expunere a
pe termen lung la concentrații scăzute (0,1 și 1 μg / ml) de AgNP, dar nu și de ioni Ag, s -a redus
semnificativ durata de viață a muștelor prin apariția adaptabilității muștelor la expunerea la
concentrația scăzută a Ag NP. Expresia GAL4 este reglată ca răspuns la ingerarea concentrațiilor
scăzute de AgNP, iar linia mutantă respectivă a prezentat o toleranță semnificativ crescută la
AgNP. Efectele AgNP la concentrații non -letale până la 50 mg / l pe tip sălbatic Drosophyla
melanogaster hrănite cu aliment e suplimentate cu AgNP au arătat că AgNP nu au influențat rata
de supraviețuire. În schimb, muștele au dezvoltat o culoare mai ușoară a corpului datorită
pierderii pigmenților de melanină din cuticulă, în timp ce capacitatea de fertilitate și de mișcare
verticală a fost compromisă. Aceste efecte biologice nu pot fi atribuite prezenței ionilor de Ag
(Chifiriuc și colab., 2016).
Există mai multe studii in vivo privind citoto xicitatea și genotoxicitatea Ag NP. S -a
investigat toxicitatea prin inhalare a Ag NP pe șobolani Sprague -Dawley pe o perioadă de 28 de
zile. Șobolanii au fost expuși Ag NP timp de 6 ore pe zi, 5 zile pe săptămână, pentru un total de 4
săptămâni. Rezultatele au arătat că șobolanii masculi și femele nu au prezentat modificări
semnificative ale g reutății co rporale față de concentrația Ag NP în timpul experimentului de 28
de zile. Nu au existat, de asemenea, schimbări semnificative în hematologie la șobolani masculi

20
sau femele. În timp ce unii cercetatori au raportat că plămânii sunt țesuturi țintă majore afectate
de expunerea prelungită p rin inhalare la Ag NP într-o altă publicație, Lee și colaborato rii au
raportat că expunerea Ag NP a modulat exprimarea mai multor gene asociate cu tulburările
neuronului motor, boala neurodegenerativă și funcția celu lelor imunitare, indicând
neurotoxicitatea potențială și imunoto xicitatea asociată expunerii Ag NP. Inflamația pulmonară
minimă sau citotoxicitatea șoarecilor au fost găsit e după 10 zile de expunere a Ag NP (Tran și
colab., 2013).
Pentru toxicologia gastro -intestinală cauzată de expunerea Ag NP prin ingestie, Kim și
colaboratorii a u testat toxicitatea orală a Ag NP (60 nm) pe o perioadă de 28 de zile la șobolanii
Sprague -Dawley. Rezultatele au arătat că șobolanii masculi și femele nu au prezentat modificări
semnificative ale greutății corporale față de dozele de Ag NP în timpul experimentului de 28 de
zile. Dar, s -au constatat modificări semnificative dependente de doză în valorile alcaline ale
fosfatazei și colesterolului la șobolanii masculi sau femele, ceea ce pare să indice că expunerea la
mai mult de 300 mg Ag NP poate duce la ușoare leziuni hepatice. S -a sugerat că Ag -NP nu induc
toxicitatea genetică la măduva osoasă masculină și feminină de șobolan in vivo . Există câteva
publicații despre studiile privind to xicologia Ag NP la organism prin expunerea sau injectarea
pielii. În general, s -au găsit foarte puține lucrări privind toxicologia in vivo a Ag NP, fiind
necesare investigații suplimentare în acest domeniu pentru a evalua exact impactul real al Ag -NP
în prod usele comerciale asupra oamenilor și animalelor. Cauzele frecvente ale toxicității induse
de Ag -NP includ stresul oxidati v, deteriorarea ADN și apoptoză (Tran și colab., 2013).
Pestele zebră este un model animal experimental popular. Acceptarea globală a p estelui
zebră ca model experimental modern de animale crește treptat. Acest model animal devine
popular în domeniile toxicologiei și cercetării biomedicale pe parcursul etapelor adulte și
embrionare. Motivul pentru această recunoaștere largă a pestelui zeb ră ca model animal popular
se datorează unui set excepțional de caracteristici pe care le posedă. Unele dintre acestea sunt
mărimea lor mică, reproductibilitatea foarte ridicată, dezvoltarea rapidă, transparența embrionului
și înclinarea la ecrane genetice și chimice. În plus, putem găsi o literatură extensivă despre
experimentele pe pestele zebră. S -a observat că pestele zebră este un animal de dimensiuni mici
și, prin urmare, poate fi manipulat fără dificultate. Ouăle se taie rapid și larvele pot începe s ă se
hrănească după 120 de ore de fertilizare, ceea ce indică debutul experimentelor pe larvele de
peste zebră din acel punct. Un alt avantaj este că embrionii sunt transparenți și toate celulele sunt

21
observabile din stadiile larvare timpurii. În plus, org anele și țesuturile pot fi vizualizate ușor in
vivo și pot fi examinate instantaneu. În plus, se știe că pestelui zebră posedă o rată de fecunditate
ridicată, generând un număr mare de embrioni. De exemplu, femelele produc în jur de 300 ouă pe
săptămână în condiții finale. Acest lucru poate duce la o fecunditate de> 300.000 ouă pe kg de
femelă. În plus, se poate reproduce în acvariul de laborator adăugând floră și pietriș în rezervor.
De asemenea, s -a observat că ouăle se desprind rapid și organogeneza are loc rapid. Ca urmare,
organele majore se dezvoltă în 5 -6 zile după fertilizare în larve. Femelele pot atinge dimensiunea
de 38 mm, în timp ce masculii pot atinge o dimensiune medie maximă de 35 mm, cu o greutate
de 0,9, respectiv 0,6 g. Un alt avantaj majo r al pestelui zebră este că sistemele cardiovasculare,
nervoase și digestive ale acestui model de animal sunt similare cu mamiferele. În plus, căile de
semnalizare foarte conservate se găsesc atât în peste zebră, cât și în cazul oamenilor cu un nivel
ridicat de omologie genomică. Recent, Institutul Național de Sănătate (NIH), SUA, a început să
încurajeze organismul modelului pestelui zebră pentru analiza diferitelor boli cu un program
genetic. Harta de gene a pestelui zebră a fost de asemenea dezvoltată, pr ezentând > 2000 markeri
microsatelit și 400 de gene distincte. După cum s -a observat, există un nivel ridicat de asemănare
între genomul uman și peste zebră (mai mult sau mai puțin 75% similaritate), ceea ce îl face un
model animal fezabil pentru studii an alitice (Chakraborty și colab., 2016).
A fost observată toxicitatea dependentă de mărimea AgNP, care indică faptul că mărimea
NP este unul dintre factorii importanți pentru profilul lor de toxicitate. S -a efectuat un studiu
cantitativ in vivo și s-a demons trat transportul cu dimensiuni reduse și toxicitatea Ag -NP la
pestele zebră . În acest studiu cercetatorii au arătat că nanoparticulele Ag cu diametre de 30 -72
nm au fost capabile să difuzeze în embrionii pestelui zebră prin porii corionici prin mișcare
aleatorie browniană și astfel pot preze nta un efect toxic mai puternic . Un studiu recent a
concluzionat că NP Ag sunt mult mai biocompatibile decât NP de citrat. S -a evaluat stresul
oxidativ și apoptoza în ficatul pestelui zebră și s -a concluzionat comportam entul hepatotoxic al
AgNPs (Chakraborty și colab., 2016).
Toxicitatea reproductivă este, de asemenea, printre parametrii importanți ai măsurării
toxicității nanoparticulelor. Modelul pestelui zebră este unul dintre cele mai bune modele pentru
evaluarea tox icității reproductive datorită ratei ridicate de reproducere. S -a observat că
nanoparticulele afectează reproductivitatea masculină și feminină și dezvoltarea embrionului.

22
1.1.3 Aspecte importante ale interacțiunilor dintre nanoparticulele de argint și sistemul
celular

Citotoxicitatea și genotoxic itatea nanoparticulelor de argint depind de mulți factori , ca de
exemplu concentrația , dispersia, mărimea și funcționalitatea suprafeței . Rapoartele au arătat că
dimensiunea nanoparticulelor de argint este un factor important pentru citotoxicitate si
genotoxicitate, probabil acționând prin mecan isme de apoptoz ă si necroză (Duran și colab., 2016) .
Citotoxicitatea nanoparticulelor de argint este strâns legată de absorbț ia celulară ,
producția de ROS și declanșarea mecanis melor celulare antioxidante (McShan și colab., 2014) .
Expunerea corpului uman la nanoparticulele de argint poate avea loc prin diferite cai:
inhalare , ingerare, injectare, sau contact fizic prin tăieturi sau răni. Prudenț a este necesară , deoarece
unele date in vitro au ară tat că în unele cazuri concentraț ii scăzute de nanoparticule de argint pot fi
toxice (Duran și colab., 2016) .
Principiile de lucru și mecanismul de acțiune al nanoparticulelor de argint sunt diferite în
fiecare tip d e celulă . Inducerea citotoxicităț ii și genotoxicităț ii depinde de mulți factori cum ar fi
mărimea , forma, încărcarea de suprafață, acoperirea de supra față, solubilitatea, concentrația , mediul,
funcționalitatea suprafeței , modul de intrare în celule , distribuția în celule, tipul celulei ( Zhang și
colab. , 2016).
Activitățile biologice ale nanoparticulelor de argint depind de proteinele prezente în
mediul de cultur ă. Prezenț a unei proteine contribuie la toxicitate și facilitează interacțiunile dintre
nanoparticulele de argint și celule pentru a indu ce sau a reduce toxicitatea ( Zhang și colab ., 2016) .
Asharani și colaboratori i au arătat prin microscopie electronic ă de transmisie (TEM) c ă
nanoparticulele de argint pot pătrunde în comparti mentele celulare cum ar fi endoz omii, lizozomii și
mitocondriile (Duran și colab., 2016)
După introducerea nanoparticulelor de argint în celule prima etapă este reprezentată de
distribuția în celulă , un eveniment critic pentru determinarea toxicității . Mecanismele de absorbție a
nanoparticulelor includ endocitoza mediat ă de pinocitoză și fagocit oză ( Zhang și colab. , 2016) .
Odată ce nanopart iculele de argint pătrund în celul ă, soarta acesteia este determinat ă de
mulți factori, incluzând eficacitatea apărării antioxidante, eficienț a sistemului de reparare a ADN ,
tendința apoptotic ă și mecanis mule celulare de semnalizare . Deteriorarea oxidativă a ADN este

23
evenimentul celular final al apoptozei , evidențiat în multe boli, incluzând cancerul, tulburările
neurodegenerative și boli cardiovasculare (Zhang și colab. , 2016) .
Nanoparticulele de argint induc afectarea ADN la diferite tipuri de celule de mamifere
prin aberații cromozomale, rupturi ADN și mutații ( Zhang și colab. , 2016) .
Genotoxi citatea este descrisă ca leziuni cauzate informațiilor genetice din interiorul unei
celule datorită agenților chimici , avâ nd ca rezultat mutația genetică, modificarea cromozomilor și
deteriorarea ADN . Genotoxicitatea este un factor principal de risc pentru efectele toxice pe termen
lung, cum ar fi carcinogeneza (Chakraborty și colab. , 2016) .
Au fost cultivate și studiate multe tipuri de ce lule care interacționează cu nanoparticulele
de argint, incluzând celulele roșii din sânge , celulele hepatice BRL3A de șobolan , celu lele
neuroendocrine PC -12, celulele st em din linia de germeni GSC, ce lule de ade nocarcinom mamar
uman MCF -7, celule HepG2 de ficat uman, cel ule epiteliale bronș ice BEAS -2B, ce lule epiteliale
alveolare pulmonare A4549 și celule s tem mezenchimale umane hMSC (Duran și colab .,2015) .
Până în prezent, datele colectate in vitro și in vivo indică faptul că producția de specii
reactive de oxigen (ROS) joacă un rol important în efectele toxice ale nanoparticulelor de argint și
este responsabilă pentru numeroase modificări , de exemplu, molecular e și biochimice legate de
genotoxicitate în cultur i celulare (sparg erea A DN). De asemenea, se menționează , în literatur ă că
dizolvarea nanoparticulelor de argint poate avea un rol cheie în toxicitatea lor. Când se
investighează activitățile biologice ale nanoparticul elor de argint este important să se recunoască
faptul ca nanoparticulele vor interacționa întotdeauna cu mediu l proteic, cum ar fi un mediu de
cultură celulară sau o cultură bacteriană , înainte de acțiunile lor biologice (Duran și colab. , 2015) .
Argintul ionic (Ag+) este mai eficient decât antibioticele tradițion ale, deoarece
interacționează / interferează cu mai multe componente ale celul elor bacteriene. Datorită interacțiunii
electrostatice puternice dintre ionii de argint și grupele interne de electroni, cum ar fi tioli, io nii de
argint sunt capabili să interfereze sau să inactiveze proteinele bacteriene cheie. În mod similar,
lucrările din trecut indică faptul că ionii de argint se leagă în mod competitiv de locurile de chelare
ale metalului în enzimele lor, deplasând astfe l cationul inerent de metal necesar funcționării corecte.
O astfel de interferență / inactivare a enzimelor influențează în mod direct diferitele funcții celulare
critice, incluzând respirația și oxidarea celulară, integritatea peretelui celular și transpo rtul /
permeabilitatea celulară. Mai mult, s -a demonstrat că ionii de argint inhibă replicarea celulară prin
inducerea condensării ADN și direct interacționează cu bazele diferi ților acizi nucleici bacterieni.

24
Ionii de argint au fost, de asemenea, implicați în generarea și acumularea de specii reactive de
oxigen la bacterii, ceea ce poate duce la deteriorarea componentelor celulare, inclusiv a cromatinei,
pertur bând astfel funcțiile celulare . Deși argintul ionic a demonstrat proprietăți antimicrobiene, el
prezintă , de asemenea, și o toxicitate pentru animale și oameni. Toxicitatea depinde de starea
argintului : metalic, solubil sau insolubil. S-a demonstrat că expunerea repetată la argint ul ionic
produce anemie, m ărire cardiacă, întârzierea creșterii și modificările degenerative ale ficatului la
animale . Expunerea cronică la om con duce cel mai frecvent la argyrie , este o pigmentare ireversibilă
de albastru -cenușiu a pielii și / sau a ochilor (Kimberly și colab ., 2015) .
Două domenii de interes în cazul AgNP ar fi citotoxicitatea și genotoxicitatea.
Concentrațiile ridicate de AgNP au demonstrat că induc genotoxicitatea și că reduc viabilitatea
diferitelor tipuri de celule. Studiile anterioare au arătat că atât efectele citotoxice și genotoxice ale
AgNP , precum și interacțiunea lor cu celulele, depind atât de dimensiunea cât și de acoperirea
chimică. Expunerea AgNP poate apărea prin contact dermic, administrare orală, inhalare, contact cu
membranele mucoasei și / s au circulația sângelui. De asemenea, s -a demonstrat că răspunsul la
toxicitate variază în funcție de tipul sau țesutul celular. Mai mult, mecanismul de toxicitate sau
deteriorarea celulelor poate fi diferit în diferitele tipuri de celule, sugerând că celula selectată poate
avea un impact profund asupra rezultatului unui anumit studiu (Kimberly și colab ., 2015) .
1.1.4 Nanoparticu le de oxid de zinc. Proprietăți.

Nanoparticulele de oxid de zinc au următoarele proprietăți distinctive.
Proprietățile fizice ale nanoparticulelor de oxid de zinc : Nanoparticulele de oxid de zinc
au proprietăți fizice extraordinare. Este important de remarcat faptul că dimensiunile materialelor
semiconductoare se reduc în mod continuu la scară nanometrică sau chiar mai mică. U nele
proprietăți fizice suferă modificări cunoscute sub numele d e "efe ctele dimensiunii cuantice"
(Sabir și colab ., 2014) .

25

Fig. 5 Modelul structurii hexagonale a structurii wurtzite a ZnO. Este prezentată
organizarea tetraedric ă a Zn-O. Atomii de O sunt reprezentați ca sfere albe mai mari, în timp ce
atomii de Zn sunt sfere gri mai mici ( adaptat după Sabir și colab ., 2014) .
Proprietățile optice ale nanoparticulelor de ZnO. Proprietățile optice intrinseci ale
nanostructurilor de ZnO sunt studiate intens pentru implementarea dispozitivelor fotonice.
Spectrele fotolumini scente (PL) ale nanostructurilor de ZnO au fost raportate pe larg. Din
măsurătorile fotoconductivității nanofirelor de ZnO, se constată că prezența O 2 are un efect
important asupra răspunsului foto. S-a constatat că procesul de desorbție -adsorbție a O 2 afectează
răspunsul foto al nanofirelor ZnO. La iluminare, galer iile fotogenerate evacue ază suprafața
chimică sorbită prin recombinarea suprafețelor electronice, în timp ce electronii fotogenerați
măresc în mod semnificativ conductivitatea. Atunci când iluminarea este oprită, moleculele de O 2
se reabsorb pe suprafața nanofirelor ș i se reduce conductivitatea (Sabir și colab., 2014)
Oxidul de zinc este un mate rial comercial utilizat pe scară largă , care a câștigat recent
interesul cer cetătorilor și nanotehnologiilor datorită proprietăț ilor sale considerabile de protecție
antimicrobiană . Un număr mare de materiale comerciale au utilizat oxidul de zinc ca o
componen tă activă , cum ar fi bandaje, ciorapi, pansamente (Petrochenko și colab., 2013).
Oxidul de zinc este un compus anorganic. Apare ca o pulbere albă și este aproape
insolubil în apă. Semiconductorul de ZnO are câteva proprietăți unice, cum ar fi o bună
transparență, o mobilitate ridicată a electronilor, un decalaj de bandă largă și o lumi niscență
puternică (Sabir și colab ., 2014) .

26
1.1.4.1 Metode de obținere a nanoparticulelor de oxid de zinc

Nanomaterialele sau nanostructurile pot fi sintetizate printr -o varietat e de tehnici, cum ar
fi piroliz a pulverizată, descompunerea termică, beamepitaxia moleculară, depunerea chimică a
vaporilor și ablația laser (Sabir și colab ., 2014)
Sinteza chimică este una dintre cele mai importante tehnici care poate fi realizată utilizând
o gamă de precursori și diferite condiții cum ar fi : temperatura, timpul, concentrația reactanților și
așa mai departe. Variația acestor parametri duce la diferen țe morfologice în dimensiunea și
geometria nanoparticulelor rezultate (S abir și colab ., 2014)
Reacția chimică a metalului de zinc cu alcoolul. Majoritatea mediilor alcoolice, cum ar fi
etanol, metanol sau propanol, sunt utilizate pentru sinteza chimică a nanoparticulelor ZnO. În
mod obișnuit, în această sinteză se adaugă 5 mg de pulbere de metal zinc în 10 ml de etanol. În
continuare, acest amestec de reacție este sonicat timp de 20 de minute și transferat într -o
autoclavă din oțel inoxidabil și sigilat în condiții inerte. Amestecul de reacție este încălzit încet
(de la 2 ° C la 200 ° C pe minut) și menținut la această temperatu ră timp de 24 până la 48 ore.
Suspensia rezultată va fi apoi centrifugată pentru a prelua produsul, spălată și apoi în final uscată
în vid. În mediile alcoolice, creșterea particulelor de oxid este lentă și controlabilă (Sabir și
colab ., 2014)
Sinteza transportului de vapori. Procesul de transport al vaporilor este cea mai obișnuită
metodă pentru sinteza ZnO. În acest proces, vaporii de zinc și oxigen sunt transportați și
reacționează unul cu celălalt conducând la formarea de nanostructuri de ZnO. Exist ă numeroase
moduri de a genera zinc și vapori de oxigen. Descompunerea de ZnO este o metodă mai ușoară,
mai directă și mai simplă; Totuși, este limitat ă la temperaturi foarte ridicate, cum ar fi ~ 1400˚C.
O altă metodă directă implică încălzirea pulberii d e zinc în fluxul de oxigen. Aceasta implică o
temperatură relativ scăzută de creștere (500 – 700 ° C), dar raportul dintre presiunea de vapori de
zinc și presiunea de oxigen trebuie să fie atent controlat pentru a obține nanostructurile dorite. S-a
observa t că schimbarea în acest raport are ca rezultat o variație mare în morfologia (mărimea și
geometria) nanostructurilor ( Sabir și colab ., 2014)
Tehnica hidrotermală. Tehnica hidrotermală este o metodă sintetică alternativă eficientă
din cauza scăderii temp eraturii procesului; Este mult mai ușor de controlat dimensiunea
particulelor. Acest proces are mai multe avantaje, cum ar fi utilizarea echipamentelor simple,

27
creșterea fără catalizatori, cos tul scăzut, producția uniform ă și fiind mai puțin periculoase față de
alte procese de creștere. În această metodă se pot utiliza materiale plastice datorită temperaturilor
reduse de reacție. Această tehnică a fost utilizată cu succes pentru prepararea nanoparticulelor de
ZnO și a altor materiale lumini scente. Morfolo gia și mărimea particulelor pot fi controlate prin
procesul hidrotermic prin reglarea temperaturii de reacție, a timpului și a concentrației
precursorilor (Sabir și colab ., 2014) .
Pentru sintetizarea nanoparticulelor de ZnO, se prepară soluții stoc de Zn (CH3COO) 2 ∙
2H2O (0,1M) și apoi la această soluție stoc, se adaugă 25 ml soluție NaOH (de la 0,2 M la 0,5 M)
preparată în metan ol sub agitare pentru a obține v aloarea pH a reactanților între 8 și 11. Aceste
soluții sunt transferate în autoclave din oțel i noxidabil etanșate cu teflon și menținute la diferite
temperaturi în intervalul 100 -200 ° C timp de 6 până la 12 ore sub presiune autogenă. Produsul
solid de culoare albă rezultată va fi spălat cu metanol, filtrat și uscat în aer într -un cuptor de
laborato r la 60 ° C. Apoi, caracterizarea probelor sintetizate va fi făcută pentru a determina
structurile lor prin teh nica de difracție cu raze X ( Sabir și colab ., 2014) .
Metoda de precipitare. În acest procedeu, ZnO poate fi sintetizat prin utilizarea azotatului
de zinc și a ureei ca precursori. Într-o sinteză tipică, azotatul de zinc 0,5M (4,735 mg) (Zn (N03)
2 * 6H20) este dizolvat în 50 ml de apă distilată și este menținut sub agitare constantă timp de 30
de minute pentru dizolvarea completă. Se prepară, de as emenea, 1M (3,002 g) uree în 50 ml apă
distilată sub agitare constantă timp de 30 minute; Această soluție de uree acționează ca agent de
precipitare. Această soluție de uree se adaugă prin picurare în soluție de azotat de zi nc cu agitare
viguroasă la 70 °C timp de 2 ore pentru a permite formarea completă a nanoparticulelor. În final,
soluția de precipitare devine tulbure. Acest produs precursor alb este centrifugat la 8000 rpm timp
de 10 minute și spălat cu apă distilată pentru îndepărtarea oricăror impurități sau ioni absorbiți
dacă sunt prezenți . Calcinarea produsului obținut se va face la o temperatură de 500° C în
atmosf eră de aer timp de 3 ore . Toate reacțiile chimice sunt sigure. Dar sinteza nanoparticulelor
prin utilizarea microorganismelor este oarecum dificilă deoarece implică un proces elaborat de
menținere a culturilor celulare, sinteza intracelulară și e tape multi ple de purificare (figura 6)
(Sabir și colab ., 2014) .

28

Fig.6 Metoda de precipitare (adaptat după Sabir și colab ., 2014) .
1.1.4.2 Aplicaț ii practice ale nanoparticulelor de oxid de z inc

Pudrele de nanoparticule de oxid de zinc (ZnO NP) sunt utilizate pe scară largă în
produsele cosmetice (protecții solide, îngrijire pentru picior, unguente și produse topice de tip
"over -the-counter"), pigmenți și acoperiri (protecție ultravioletă, fungicid în vopsele) catalizatori.
În ciuda utilizăr ii pe scară largă a nanoparticulelor de ZnO, siguranța acestui compus pentru om
este încă neclară (Vandebriel și colab., 2012) .
Nanoparticulele de oxid de zinc au atras eforturi intense de cercetare pentru proprietățile
lor unice și aplicații vers atile în electronică , emițătoare de lumină ultravioletă (UV), dispozitive
piezoelectrice , senzori chimici și electronice de centrifugare. ZnO pare a fi netoxi c; Poate fi
folosit ca material de degradare fotoca talitică a poluanților de mediu (Sabir și colab ., 2014) .
ZnO este prezentat ca material "general recunoscut ca sigur (GRAS)" de către
Administrația pentru Alimentație și Medicamente și utilizat, de asemenea, ca aditiv alimentar.
ZnO prezintă o eficiență catalitică ridicată, precum și o abilitate puternică de ad sorbție și sunt
utilizate mai frecvent în fabricarea de protecție solară. De asemenea, se sugerează că expunerea la
nanoparticulele de ZnO a condus la un potențial genotoxic mediat de peroxidarea lipidelor și de
stresul oxidativ. Datorită potențialulu i lor de țintire, nanoparticulele de ZnO ar putea fi utilizate
în tratamentul canceru lui și/sau autoimunității (Sabir și colab ., 2014) .
Nanoparticulele de ZnO au proprietăți antimicrobiene (atât antibacteriene cât și
antifungice). Capacitatea lor bactericidă este utilă pentru aplicațiile biomedicale și pentru Solu ție de sare Zn / agent de precipitare
Adăugarea precursorului de precipitare
Filtrarea și spălarea
Nanoparticule de oxid de zinc
Caracterizare

29
ambalarea produselor alimentare. Mai mult decât atât, utilizarea nanoparticulelor de ZnO și -a
extins domeniul de aplicare în rândul consumatorilor sub formă de produse cosmetice și textile,
precum și în industrie sub formă de produse electronice (Ng și colab., 2017) .
Nanoparticulele de ZnO prezintă rezultate in vivo bune în aplicațiile dermatologice cum
ar fi produsele de protecție solară și produsele cosmetice, unde are o penetrare limitată în
straturile cutanate și are un efect redus asupra activității celulelor pielii (de exemplu, morfologie,
metabolism sau oxidar e) (Petrochenko și colab., 2013).
Activitatea catalitică ridicată a nanoparticulelor de ZnO face ca substanța să fie un aditiv
industrial important pentru multe produse, inclusiv materiale plastice, ciment, sticlă, cauciuc,
lubrifianți și produse alimentare iar absorbția excelentă a acestora și reflexia UV le -au făcut de
asemenea o componentă comună în produsele cosmetice ș i produsele de protecție solară ( Hsueh
și colab., 2015).
Nanoparticulele de ZnO sunt deosebit de utile în produsele de protecț ie solară deoarece au
capacitatea intrinsecă de a filtra UVA, precum și radiațiile UVB. Datorită acestei proprietăți
remarcabile, acestea oferă protecție mai largă decât orice alt agent de protecție a l soarelui. Dar
aceste nanoparticule au capacitatea de a pătrunde în piele și de a ajunge la celule viabile, având
astfel un potențial toxic . O analiză comparativă a penetrării dermice între diferite specii de
animale a fost efectuat la mai multe specii fiind evaluați în ordinea iepure> șobolan> porc>
maimuță> om. S -a observat că pielea porcului și șobolanului este de până la 4 și de 9 -11 ori mai
permeabilă decât pielea umană (Sabir și colab., 2014).
1.1.4.3 Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor de oxid de zinc

Nanoparticulele de oxid de zinc sunt cunoscute a fi eficiente împotriva multor tipuri de
bacterii și ciuperci, atât sub iluminare ambientală, cât și în absența luminii ultraviolete (UV).
Vopselele antifouling au înlocuit din ce în ce mai mult ZnO cu nanoparticulele de ZnO, datorită
proprietă ților lo r antibacteriene superioare ( Hsueh și colab., 2015) .
În 2010, au fost produse 550 de tone de nanoparticule de ZnO, devenind al treilea agent
fotocatalitic și antimicrobia n cel mai frecvent utilizat ( Hsueh și colab., 2015) .
Au fost stud iate diferite morfologii ale NP ZnO pentru a elucida mecanismele care stau la
baza efectelor lor antimicrobiene și, deși mecanismul precis rămâne neclar, au fost propuse mai

30
multe teorii, inclusiv generarea de specii reactive de oxigen (ROS) sau e liberarea memb ranei
celulare – dăunând ionilor de Zn2 +. Studiile au arătat, de asemenea, că activitatea antibacteriană a
ZnO NP împotriva Escherichia coli și Candida albicans poate fi datorată radicalilor hidroxilici
generați prin interacțiunile dint re nanoparticulele de ZnO și apă . Bacteriile Gram-pozitive, cum ar
fi Staphylococcus aureus , sunt mai sensibile la nanoparticulele de ZnO decât bacteriile G ram-
negative cum ar fi Escherichia coli ( Hsueh și colab., 2015) .
Cu toate că nanoparticulele de ZnO pot juca un rol benefic atunci când sunt utilizate
împotriva microorganismelor patogene, ele pot afecta în mod negativ bacteriile de mediu și sunt
pe deplin capabile să modifice echilibrul ecologic în mediile solului ( Hsueh și colab., 2015) .
Activită ți antimicrobiene ale pudrelor de oxid metalic (ZnO NPs) împotriva
Staphylococcus aureus , Escherichia coli sau fungi au fost evaluate cantitativ în mediile de
cultură. S-a observat că inhibarea creș terii nu a fost mai mare în ZnO sintetizat biologic decât
nanoparticulel e ZnO chimice . Bioactivitatea sporită a acestor particule mai mici este atribuită
raportului mare suprafață / volum . Nanoparticulele de ZnO constituie un agent antimicrobian
eficient împotriva microo rganismelor patogene. Practic, sp eciile de oxigen activ generate de
aceste particule de oxid metalic ar putea fi mecanismul activității lor antibacteriene (Sabir și
colab ., 2014) .
Mecanismul a ntibacterian al NP ZnO implică interacțiunea directă între nanoparticulele
ZnO și suprafețele celulare care afectează permeabilitatea membranei celulare; După aceea,
aceste nanoparticule pătrund în celule bacteriene și induc stresul oxidativ, ceea ce conduce la
inhibarea cr eșterii celulare și, în cele din urmă, la moartea celulară; Activitatea antibacteriană
demonstrată a acestor nanoparticule recomandă aplicarea acestora în domeniul conservării
alimentelor. Acest ea pot fi aplicat e ca un agent sanitar puternic pentru dezinfectarea și sterilizarea
echipamentelor și containerelor din industria alimentară împotriva atacului și a contaminării cu
bacterii patogene provenite din alimente. Nanoparticulele de ZnO au arătat atât toxicitatea asupra
bacteriilor patogene (de exemplu, Escherichia coli și Staphylococcus aureus ), cât și efectele
benefice asupra bacteriilor , cum ar fi Pseudomonas putida , care are potențial de bioremediere și
este un colon izator puternic de rădăcini (Sabir și colab ., 2014) .

31
1.1.4.4 Toxicitatea nanoparticulelor de zinc

Cea mai mare parte a cercetării nanotoxicologice actuale utilizează modele in vitro care
nu oferă informații despre activitatea NP în organismele gazdă (biodistribuție, acumulare,
metabolism, persistență, eliminare etc.) (Chifiriuc și colab. , 2016) .
Studiile in vivo utilizează în principal organisme acvatice, cum ar fi păstrăvul curcubeu
(Oncorhynchus mykiss ), peștele zebră ( Danio rerio), nematodul ( Caenorhabditis elegans), algele
și dafniții. În plus, protocoalele utilizate în diferite studii pentru evaluarea nanotoxicității nu sunt
standardizate în ceea ce privește numeroasele variabile care apar în acest domeniu de cercetar e
(variații în mărime, proceduri de fabricare, agregare, solubilitate, absorbție intracelulară și
modele celulare și animale ). Aceste aspecte împiedică orice comparație sau reproductibilitate a
rezultatelor obținute, ridicând necesitatea standardizării și stabilirea de modele experimentale in
vitro / in vivo pentru caracterizarea citotoxicității și a biocompatibilității NP. Se impune stabilirea
unor parametri farmacologici standard, cum ar fi doza, calea de administrare, metabolismul etc.
(Chifiriuc și cola b., 2016) .
Puține studii au investigat neurotoxicitatea și efectele nanoparticulelor de ZnO. Învățarea
și capacitatea de memorare au fost atenuate prin modificarea plasticității sinaptice la șobolani
după administrarea intraperitoneală a nanoparticulelor de ZnO de 20 -80 nm (4 mg / kg corp) de
două ori pe să ptămână tim p de 8 săptămâni (Vandebriel și colab ., 2012) .
Atunci când se utilizează administrarea intravenoasă, absorbția nu are loc , astfel alte
aspecte ale toxicocineticii cum ar fi : distribuția și eliminarea țesuturilor, pot fi studiate cu mai
multă precizie. Datorită abundenței zincului din organism, NP radioactive de ZnO au fost
utilizate pentru studii de biodistribuție la șoareci (Vandebriel și colab ., 2012) .
Injectarea intravenoasă a determinat retenția primară în plămân (43,6% din doza injectată
pe g greutate umedă, 1 oră după administrare) și translocarea ulterioară la tractul gastrointestina l
pentru e xcreția fecalelor (Vandebriel și colab ., 2012) .
Administ rarea intraperitoneală unică a nanop articulelor ZnO de 100 nm (2,5 g / kg corp) a
dus la acumularea în ficat, splină, plămân, rinichi și inimă. Concentrația de zinc în ficat, splină și
plămân a fost m ai mare după administrarea de nanoparticule decât după administrarea de cantități
similare d e particule de Zn de 1 μm (Vandebriel și colab ., 2012) .

32
Administrarea orală a nanoparticulelor de ZnO de 100 nm (2,5 g / kg corp) a dus la
acumularea în ficat, splină, plămân și rinichi. Spre deosebire de administrarea intraperitoneală,
nanoparticulele d e ZnO nu s -au acumulat în inimă. Distribuția sistemică ZnO la nano – și micro –
dimensiuni arată, de asemenea, după absorbția orală, o absorbție mai mare și un efect toxic mai
puternic al particulelor de dimensiuni nano. Ficatul, splina, plămânul și rinichii și, în unele cazu ri,
inima sunt organe țintă (Vandebriel și colab ., 2012) .
Deși nanoparticule de oxid de zinc (60-200 nm) au prezentat o activitate clastogenică in
vitro în celulele de mamifere, nu a existat nici o indicație a potențialului clastogen sau a act ivității
aneugenice in vivo (Vandebriel și colab ., 2012) .
Deși nanoparticule de ZnO au o mare importanță comercială și sunt prezente în diferite
produse, există în mod clar o preocupare crescândă a cosumatorului de a cunoaste efectele
toxicologice ale nanoparticulelor de oxid de zinc. Din păcate, studiile toxicologice efectuate pe
nanoparticule de oxid de zinc în ultimii zece ani arată că prezintă riscuri potențiale pentru
sănătate, precum și pentru mediul înconjurător. Aceste nanoparticule pot prezenta toxicitate
asupra bacteriilor, șo areci lor și chiar celule umane (Sabir și colab ., 2014) .
Printre nanoparticule concepute intenționat, nanoparticulel e de oxid de metal sunt
nanomaterialele cele mai utilizate. S-a demonstrat că expunerea la metale poate duce deseori la
toxicitate, la modificarea expresiei genei, la modificarea semnelor epigenetice și la carcinogenez ă
indusă de metal (Pati l și colab.,2016) .
Dovezile acumula te arată clar că expunerea la nanoparticule poate fi toxică pentru
sistemul biologic, de la procariote la eucariote superioare, inclusiv la oameni. Mai multe studii au
arătat că expune rea la nanoparticule conduce la un răspuns inflamator, la deteri orarea ADN, la
stresul oxidativ, la peroxidarea lipidelor, apoptoză , formarea micronucleilor, modificarea
expresiei genei, genotoxicitate, citotoxicitate, toxicitate reprod uctivă, imunotoxicitate și
carcinogenitate non-genotoxică. Au fost propuse mecanisme diferite pentru carcinogenitatea non –
genotoxică, una dintre acestea fiind modificările epigenetice ale modelului de metilare a ADN
care pot e determina o expresie genetică modificată. Variația epigenet ică a câștigat puțină atenție
(figura 8) (Pati l și colab.,2016) .

33

Fig. 8 Calea prooxidantă pentru toxicitatea ind usă de nanoparticule : diferite NP prezintă
toxicitate dependentă de stresul oxidativ. La expunerea de NP, generarea ROS este capabilă să
inducă leziuni oxidative ale ADN, rupturi de catenă, denaturare proteică și peroxidare lipidică,
demonstrând astfel caracteri sticile mutageni ce și carcinog ene asociate cu nanoparticulele .
Excesul de producție a radicalilor liberi conduce la deteriorarea membran ei mitocondriale
cauzând necr oză și moartea celulelor. Fagocitele incluzând neutrofilele și ma crofagele gen erează
ROS masiv prin fagocitoza incompletă a NP și prin sistemul enzimatic NADPH -oxidază, în timp
ce ROS indus de NP declanșează o cascadă inflamatorie a expresiei chemokinei și citokinei prin
activarea căilor de semnalizare celulare, cum ar fi MAPK, NF -κB, Akt, Și RTK. Mai mult,
stimularea oxidativă a acestor mecanisme celulare are ca rezultat transcripția genelor responsabile
de fibroză, EMT și car cinogeneza (adaptat după Manke și colab., 2013) .
Epigenetica implică modificări stabile și ereditare în exprimarea genelor fără a schimba
secvența ADN. Mecanismele epigenetice includ în principa l modele de metilare a ADN,

34
modificări posttranslaționale ale cozilor histone lor, remodelarea cromatinei și micro ARN
(miRNAs) (Pati l și colab., 2016 ).
Studiul similar pe nanoparticule de argint (AgNPs) arată că, l a niveluri subletale, AgNP
pot modifica metilarea histonelor , determinând astfel expresia genei globinei în celulele roșii d in
sânge. NP pot duce la creșterea producerii de specii reactive de oxigen și la deteriorarea ADN
oxidativ, ceea ce poate afecta capacitatea activității metiltransferazelor care conduce la
hipometilarea ADN și la alterarea expresiei genelor reglate prin metilare. Cu toate acestea, nu
există cercetari privind influența nanoparticulelor de dioxid de titan (TiO2) și a nanoparticulelor
de oxid de zinc (ZnO) asupra integrității epigenetice la concentrația subletală. TiO2 și ZnO NP
sunt considerate fotocataliza toare și sunt utilizate pe scară largă în produsele cosmetice ș i
produsele de protecție solară (Pati l și colab., 2016) .
Altele decât proprietățile inerente ale nanoparticulelor de ZnO, proprietățile fizico –
chimice, cum ar fi dimensiunile și încărcăturile d e suprafață, contribuie la toxicitatea
nanoparticulelor de oxid de zinc. Încărcarea de suprafață a NP este, de asemenea, un factor
important în evaluare a toxicității, deoarece NP în cărcate pozitiv s -au dovedit a avea o toxicitate
mai mare, iar sarcina dife rențială de suprafață este atribuită absorbției celulare și localizării
intracelulare (Ng și colab., 2017) .
Apariția de produse pe bază de nanoparticule de ZnO a produs îngrijorări cu privire la
toxicitatea și siguranța lor potențială datorită expunerii cr escute. Mai multe studii au demonstrat
efectele toxice nedorite ale nanoparticulelor de ZnO, cum ar fi inducerea stresului oxidativ,
moartea celulară autofagică, răspunsurile inflamatorii, deteriorarea celulară și genotoxicitatea (Ng
și colab., 2017).
S-a demonstrat că toxicitatea NP ZnO este atribuită oxidarii Zn la ionii Zn2+ liberi și
generarea de radicali liberi de pe suprafața ZnO, rezultând dezechilibrul ionic celular și metabolic
care este asociat cu un defect în homeostazia ionică și inhibarea tra nsportului ionic. Studiile de
toxicitate au arătat că generarea de specii reactive de oxigen (ROS), urmată de stresul oxidativ
indus de ROS, este mecanismul care conduce la toxicitatea mediată de ZnO Np. Mecanismul de
protecție antioxidant insuficient, ca urmare a producției excesive de ROS, a demonstrat că
provoacă moartea celulelor și genotoxicitate (Ng și colab., 2017).
Efectele toxice ale expunerii in vivo au fost raportate la vertebrate precum rozătoarele și
peștele zebră, precum și la nevertebrate ,de exemplu Drosophila melanogaster . Alte studii au

35
arătat, de asemenea, riscul potențial al NPn ZnO în inducerea genotoxicității. Deși a fost propus
stresul oxidativ ca principal mecanism responsabil pentru toxicitatea NP, rolul direct al genei
ROS asociate în toxicitate rămâne de explorat. În ciuda acestor studii de toxicitate, efectele
periculoase ale nanoparticulelor de ZnO rămân discutabile. Studiile au arătat că nanoparticulele
de ZnO nu provoacă nici o toxicitate pentru celulele umane și doar toxicitate subcronică scăzută
la rozătoare. În plus, un studiu anterior care a utilizat Drosophila melanogaster nu a raportat nici
o toxicitate observată la ingestia nanoparticulelor de ZnO. Pe de altă parte, un alt studiu anterior
care a evaluat genotoxicitatea și stresul oxidativ indus de nanoparticulele de ZnO în Drosophila
melanogaster a arătat o genotoxicitate slabă a nanoparticulelor de oxid de zinc (Ng și colab.,
2017).
Expunerea la nanoparticulelor de TiO 2 și ZnO este cunoscută ca afectând în principal
plămânii, prin urmare, linia celulară de fibroblaste pulmonare (MRC5) fiind utilizată ca model
pentru a determina modulați ile potențiale în metilarea ADN . Se poate raporta că, concentrația
subletală de NP TiO 2 și ZnO poate induce modificări epigenetice, ceea ce poate duce la
reprogramarea unui spectru larg de exprimare a genelor (Pati l și colab., 2016) .
S-a mai demonstrat că nanoparticulele de oxid de zinc prezintă o activitate antimicrobiană
puternică împotri va bacteriilor Gram pozitive , precum și o anumită toxicitate preferențială față
de celulele canceroase de leucemie mieleoblastică umană (HL60) în comparație cu celulele
mononucleate de sânge periferic. Pot exista mai multe motive pentru toxicitatea celul ară
preferențială. Un mecanism potențial pentru acest comportament poate implica generarea de
specii reactive de oxigen (ROS). Generarea de specii reactive de oxigen ,în general , se presupune
că apare după absorbția celulară a ionilor de zinc (Petrochenko și colab., 2013).
Nanoparticulele de oxid de zinc produc mici ROS, dar generează ioni de Zn2+, care apoi
intră în celulă și provoacă producerea ROS intracelulară (Petrochenko și colab.,2013).
Diferite celule ale sistemului imunitar răspund diferit la nanomaterialele de ZnO. De
exemplu celulele dendritice derivate din monocite prezintă un răspuns citotoxic dependent de
doză și o creștere a activității caspazelor, enzim e implicat e în moartea celulelor apoptotice. În
general, modul de toxicitate al nanoma terialelor ZnO se presupune că implică ioni Zn liberi, o
doză clasică și un răspuns dependent de timp pentru producerea ROS intracelulară și
citotoxicitatea (Petrochenko și colab., 2013).

36
ZnO s -a dovedit a fi toxic in vivo prin anumite căi de expunere. De exemplu,
nanoparticulele de ZnO au fost observate a fi mai toxice pentru plămâni decât doza echivalentă în
forma ionică (ZnCl 2) după instalarea intratraheală. Se crede că particulele sunt prinse în plămâni
și eliberează continuu ionii de zinc care prov oacă toxicitate (Petrochenko și colab., 2013).
1.1.5. Testul micronucleilor in vivo

În 1970, Balle r și Schmid au elaborat o metodă de testare pentru a evalua frecvența
eritrocitelor micronucleate între eritrocitele normale, care nu dispun de nuclee proprii în timpul
hematopoiezei, folosind măduvă osoasă și celule sanguine periferice de hamster tratați cu un
agent puternic de alchil are trenimon (Hayashi, 2016).
În 1980, MacGregor și colab oratorii au raportat metoda micronucleilor în eritrocitele
periferice de șoarece (Hayashi, 2016).
Datorită faptului că metoda micronucleilor presupune utilizarea unor substanțe chimice,
încă de la începutul anilor 1980, unele țări, precum și organizații internaționale, au început sa -și
facă propriile ghiduri de testare pentru evaluarea siguranței împotriva substanțelor chimice
(Hayashi, 2016).
Testul micronucleilor este inclus în categoria de testa re a genotoxicității (Hayashi, 2016).
Din 1984 pană în prezent, grupul de studiu colaborativ pentru testul de micronuclei din
cadru grupului de studiu privind mutagenitatea la mamifere, care este o suborganizare a societății
mutagene de mediu din Japonia (CSGMT/JEMSMMS) a început să studieze diferiți factori care
ar putea afecta rezultatul testului (Hayashi, 2016).
Până în prezent au fost studiate și raportate următoarele: diferența de sex, diferența de
tulpină, diferența dintre injecția intrape ritoneală ș i administrarea orală prin gavaj, efectul
numărului de tratamente, testul micro nucleilor cu sânge periferic utilizând metoda de colorare
acridică portocalie supravitală și îmbătrânirea șoriceilor (Hayashi, 2016).
Testul micronucl eilor nu are observație dir ectă a cromozomilor în metafaza celulară. Cu
toate acestea, testul micronucleilor nu este sugerat a fi o metodă pur alternativă pentru analiza
metafazei , se consideră că testul micronucleilor este o metodă independentă de testare a
aberațiilor cromozomale cu propriile caracteristici (Hayashi, 2016).

37
Caracteristicile testului micronucleilor comparativ cu analiza metafazei:
1. Orice populație de celule divizate poate fi utilizată indiferent de cariotipul său
2. Pot fi obținute date exacte deoarece punctul final al acestora este simplu și ușor de
identificat
3. Răspunsul poate fi de tectat pentru o durată mai lungă
4. Pot fi detectate otrăvuri ale arborilor
5. Frecvențele de fundal ale celulelor micronucleate sunt de obicei stabile
6. Nu este necesar un trat ament suplimentar al substanțelor chimice, altele decât cele
de testat, colamid sau BrdU
7. Tipurile de aberații cromozomale nu pot fi clasificate prin testul micronucleilor
8. Posibilitate de apariție a pseudonucleilor
Toate acestea sunt avantaje importa nte, dar î n același timp tes tul micronucleilor este
limitat (Hayashi, 2016).
În eritrocitele micronucleate, micronucleul este considerat component ADN în celulă,
deoarece nucleul principal al celulei este expulzat în timpul eritropoiezei ș i structura este simplă .
O astfel de caracteristică este adecvată pentru identificarea în mod automat al aberațiilor
cromozomale cu ajutorul dispozitivelor, de exemplu: analiza imaginii cu citometria de flux
(Hayashi, 2016).
Analiza in vivo a micronucleilor rozătoarelor are limitări ca și alte teste de genotoxicitate
și anume: nici un test nu poate detecta toate substanțele chimice genotoxice cu diferite moduri de
acțiune. Cu toate acestea, tes tul micronucleilor a fost utilizat pe scară largă ca test in vivo fiind cel
mai fiabil test pentru a evalua prezenta aberațiilor cromozomale, unul dintre cele două obiective
principale ale mutagenității, precum și identificarea pericolelor și evaluarea riscurilor (Hayashi,
2016).
Analiza micronucle ilor este un biomarker excelent, deo arece este capabil să detecteze
leziuni ale materialului genetic sau funcționarea defectuoasă a fluxului mitotic cauzată de
mecanisme aneugenice (Torres -Bugarin și colab., 2015).
MN se formează în timpul mitozei atunci când cromozomii întârziați sunt lăsaț i în a fara
plăcii metafizice datorită defectelor mitotice (efect aneuploid) sau atunci când fragmentele

38

cromozomale care nu au centromere nu sunt atașate la microtubul ii fusului de diviziune (efect
clastogenic). În ambele cazuri, materialul genetic nu a p utut fi încorporat în nucleul celulelor fiice
(Torres -Bugarin și colab., 2015).
Cuantificarea frecvenței micronucleilor este efectuată cu ușurință în orice țesut care este
supus proliferării constante, cum ar fi: epiteliile mucoa sei orale sau în limfocite prin două teste
diferite. În ceea ce priveș te mucoasa orală, s -a descris că micronucleii se observă în s tratul bazal
al țesutului epitel ial, iar prezența lor poate reflecta deteriorarea genotoxică produsă la 14 zile
înainte de colectarea probei. Din toate aceste motive frecvența micronucleilor poate fi considerată
biomarker pentru leziuni mutagene și genoto xice (Torres -Bugarin și colab., 2015).
Micronucleii (MN) pot fi în general formați din fragmente cromozomale acentrice
întârziate, fragmente cromatidice acentrice sau cromozom întreg care nu au putut fi incluse în
nucleul celulei fiice în timpul mitozei ( Kang și colab., 2013).
Aceste fragmente cromozomale înconjurate de membrana nucleară sunt cunoscute sub
numele de micronuclei , care sunt similari morfologic cu nucleul normal, dar sunt mult mai mici
în dimensiune. Comparativ cu alte teste de genotoxicitate, testul micronucleilor este u n test rapid
și ușor de realizat (figura 9 ) ( Kang și colab., 2013).

Fig.9 Schema care arată pr ocedura principală a testului micronucl eilor in vivo . (adaptat după
Kang și colab., 2013).

39
Testul micronucleilor in vivo a fost stabilit prin reglementarile OCDE și a fost optimizat
și actualizat continuu prin numeroase studii ( Kang și colab., 2013).
Testele de genotoxicitate sunt utilizate pentru detectarea leziunilor g enetice prin diverse
mecanisme î n sistemele in vitro și in vivo (Rim și colab., 2015).
Până în prezent, majoritatea autorităților internaționale recomandă o schemă de testare
constând î n metode in vitro și in vivo pentru a detecta genotoxicitatea/ mutagenitatea indusă de
diferite substanțe (Rim K.T și colab., 2015).
În plus, este o metodă predictivă pentru cancer, care poate fi automatizată și permit e o
bună extrapolare pentru limi tele potențiale ale expunerii sau pragurilor genotoxicității (Rim și
colab., 2015).
Abordări in vivo . Există necesitatea validării modelelor pe animale pentru studii privind
toxicitatea NM. Dificultățile constau în elaborarea unei abordări corecte în inter pretarea studiilor
și în luarea deciziilor privind parametrii care trebuie luați în considerare în examinarea toxicității
în sisteme in vivo . Mulți cercetător i au administrat nanoparticule prin expunere , prin inhalare sau
pe cale orală, prin ingestie (prin alimente sau alimentare cu apă ) sau injecție directă în organism.
De obicei, se evaluează biodisponibilitatea și translocarea ulterioară a Np, inclusiv organul țintă,
precum și alte organe în care acumularea este mai semnificativă. Testele utilizate pentr u
evaluarea genotoxicității sunt similare cu cele utilizate în studiile in vitro (Ng și colab., 2010).
Este de menționat faptul că î n lite ratura de specialitate nu există informații referitoare la
genotoxixitatea Ag -ZnO Np. Au existat studii efectuate sepa rat pe ZnO Np și AgNp.

40
Capitolul II. Testarea activității antimicrobiene și a genotoxicității unor
nanoparticule anorganice

2.1 Scopul și obiectivele lucrării

Scopul acestei lucrări este reprezentat de evaluarea activității antimicrobiene și a
genotoxicității unor nanoparticule anorganice pe bază de argint ș i oxid de zinc.
Pentru realizarea scopului lucrării, formulat mai sus, s -au stabilit urmatoarele obiective :
 Testarea activității antimicrobiene .
 Testarea genotoxicității in vivo prin testul micronucleilor la nivelul maduvei
osoase de șoarece .
2.2 Materiale și metode

Modelul animal experimental mam alian a fost șoarecele . Au fost utilizate exemplare
adulte de șoarece (cu greutate 20 -25 g). Indivizii au fost ținuți în condiții de mediu cons tant
(12:12 ciclul lumina: întuneric , temperatura 22 ± 3°C, 30% umiditate). Animalele au fost hrănite
cu granule standard și au avut acces la ap ă potabilă .
Experimentul a inclus dou ă grupuri de șoareci : grupul de șoareci testați (n = 3 pentru
fiecare probă ) și un grup control (n =2), hrănit doar cu granule standard, ținuți în aceleași condiții
de mediu și injectați asemenea grupului experimental, însă doar cu TFS (Tampon Fosfat Salin
steril)
Probele au fost notate astfel:
Grup Control – Animale din grupul injectat cu TFS
Grup P3.1 – animale injectate cu Ag -ZnONp dizolvat in TFS
Grup P3.4 – animale injectate cu Ag -ZnONp dizolvat in TFS
Grup P3.9 – animale injectate cu Ag -ZnONp dizolvat in TFS
Șoarecii au fost sacrificați la 24h după admi nistrarea cele i de-a treia doze.

41
Celulele aparținând măduvei osoase au fost prelevate de la nivelul femurului și preparate
conform metodelor standard:
a) Se spală canalul medular cu soluție citrat de potasiu 0,05%. Se realizează hipotonie cu
citrat de potasiu 0,05 M timp de 40 min;
b) Centrifugare 1000 rpm timp de10 min.
c) Fixare metanol: acid acetic 3:1, peste noapte.
d) Colorare cu reactiv Giemsa
e) Analiza preparatelor microscopice la Microscopul Olympus BX40
Testul de micronucleaț ie in vivo pe model mamalian (474 OECD Guideline – Mamm alian
Erythrocyte MN Test) este un test standardizat utilizat pentru detectarea le ziunilor cromozomale,
precum și a perturbărilor în desfășurarea ciclului celular, în special a fazei mitotice, produse de
un compus chimic (care este testat). Aceste modificări sunt studiate prin analiza celulelor
hematopoetice prelevate din măduva osoas ă și/sau sânge periferic prelevat de la animale, în
special rozătoare (Kwon si colab., 2014).
Scopul lucrării a mai fost și acela de a evalua eficacitatea Ag ZnO -NP asupra creșterii
planctonice a agenților patogeni relevanți din punct de vedere medical și de a determina efectele
sale asupra biofil melor formate de diferite specii microbiene.
În cazul concentraț iei minime inhibitorii t oate tulpinile s -au depozitat la -80 ° C și s -au
subcult ivat de două ori pe plăci cu agar sanguin înainte de experimente. O singură colonie a
fiecărui tip de tulpină microbiană a fost inoculată în 10 ml mediu de bulion Mul ler-Hinton
autoclavat (Sigma) respectiv și incubat la 37 ° C peste noapte cu agitare. Culturile lichide
rezultate s -au diluat pentru a obține un inocul cu 108 cfu / ml utilizat pentru experimentele
descrise mai jos. MIC (concentrația minimă inhibitorie) a fost utilizată pentru a determina
concentrația care a inhibat orice creștere vizibilă a organismului în decurs de 24 de ore. Valorile
MIC au fost determinate prin metoda diluțiilor seriale în medii lichide, în conformitate cu
metodele de referință ale Institutului de Standarde Clinice și de Laborator (CLSI) pentru
determinarea MIC a bacteriilor aerobe prin microdiluție în bulion.
Concentrația minimă de eradicare a biofilmului (MEBC) a fost determinată prin metoda
microtitră rii. Suspensiile micro biene corespunzătoare densității 0,5 Mac Farland au fost
însămânțate în bulion Muller Hinton, distribuite în 96 de plăci cu mai multe godeuri, apoi
incubate în condiții aerobe la 37 ° C timp de 24 de ore. Biofilmele microbiene vizibile, formate

42
pe fundul g odeurilor, au fost spălate de trei ori cu apă de la robinet, fixate cu metanol rece timp
de 5 minute, colorate cu cristal violet 1% timp de 15 minute, spălate din nou cu apă de la robinet
și resuspendate în acid acetic 33%. Mediul Muller Hinton a fost folo sit ca un control negativ.
Formarea biofilmului a fost evaluată calitativ prin măsurarea absorbției suspensiei colorate
obținute la 490 nm. Toate testele au fost efectuate în două exemplare .
S-au utilizat trei tipuri de nanoparticule selectate pe baza ac tivităț ii microbicide și anti-
biofilm .
Tabel 1. Proprietățile nanoparticulelor utilizate în acest studiu.

ZnO pulbere NPs (min 99,5%, wurtzite, dimensiunea primară medie de 60 nm), azotat de
argint (AgNO3, pa, cristalizat, min 99,9%, Mw de 169,87 g / mol), sare de sodiu acid poli
(acrilic) PAS (Mw de 5,100), sare de sodiu a acidului poli (4 -stirensulfonic -co-maleic), PSSA -co-
MA (C12H10Na2O7S cu acidul 4 -stirensulfonic: raportul molar al acidului maleic 1: 1, Mw de ~
20.000); Carboximetil celuloză d e sodiu, CMC (C28H30Na8O27, medie Mw de 700000, grad de
substituție de 0,8 -0,95), acid citric (C6H8O7.H20, min 99,5%, Mw de 210,14 g / mol), D (+) – ,
Min. 99,5%, Mw de 180,16 g / mol) și borohidrură de sodiu (NaBH4, minimum 96%, Mw de
37,83). Toate materi alele au fost utilizate fără altă purificare. Apa bi -distilată (conductivitate
electrică de 5 μ s la 25 ° C, pH de 5,5) a fost utilizată pentru prepararea soluțiilor apoase de agenți
de reducere și de stabilizare. Suspensie coloidala
(CS) de Ag (1%) –
ZnO 915%)
Agent de stabilizare si
reducere
parțială a Ag+
Agent de
reducere
finala a Ag+
Cod pulbere
compozita
de Ag -ZnO

CS1 (P -A)
PAS
C6H8O7.H2O
P1
CS4 (S -A)
PSSA -co-MA
C6H8O7.H2O
P4
CS8 (C -G)
CMC
C6H12O6
P8

43
Ag-ZnO Np s-au obținut din suspensii coloid ale de Ag -ZnO conținând NP ZnO 15% (g /
v) și Ag NPs 0,1% (g / v). Sinteza chimică in situ a NP Ag pe suprafața ZnO NP a fost efectuată
în condiții fierbinți prin reducerea parțială a ionilor Ag (Ag +) din soluții apoase de AgN03 cu un
agent slab reducător de tip polielectrolit anionic (PAS), PSSA – MA și CMC) care are și rolul
agentului de stab ilizare electrostatică, în care sunt NP ZnO dispersate. După o agitare de 24 h a
nanocristalelor Ag, reducerea finală a ionilor Ag + rămași a fost efectuată cu acid citric sau
glucoză în stare fierbinte sau NaBH4 în stare rece. Am folosit o metodă chimică modificată
pentru doparea ZnO NPs cu Ag NPs în care pentru reducerea finală a ionilor Ag + cu acid citric
sau glucoză este raportată pentru prima dată sau a fost raportată anterior în cazul utilizării NaBH4
(Lungu și colab., 2016, Lungu et Al., 2014; Lungu și colab., 2012). Raportul greutate / greutate
între primul agent reducător (PE) și Ag a fost 3: 1, iar raportul molar dintre agentul reducător
final și AgN03 a fost 4: 1.

2.3 Rezultate și discuții

Au fost testate diferite tipuri de NP Ag pentru a eval ua toxicitatea acuta ( 10-100 mg / L)
și toxicita tea cronică (5 mg / l) (Tabel 2, fig.11)
Pentru toate cele trei probe se constată o incidență a micronucleilor asemănătoare
controlului. Expunerea animalelor la NP a fost de durată scurtă spre medie, astfel că se poate
concluziona că în cazul tratamentelor in vivo datorită capacității organismul ui de a reacționa la
acțiunea factorilor exogeni și datorită capacității intrinseci a ADN de a realiza repararea
leziunilor, capacitatea genotoxică a NP este foarte scăzută spre nulă

44
Tabel 2. Evaluarea frecvenț ei micronucleilor in vivo (Analiza s -a realizat prin evaluarea
prezenț ei micronucleilor la 1000 nuclei numărați – MN‰) (fig.11 ).
CONTROL P3.1 P3.4 P3.8
Frecvenț a MN/1000nuclei 2.5 4.0 4 4
Frecvenț a MN/1000nuclei 3.1 4.0 4 2.2
Frecvenț a MN/1000nuclei – 4.5 5 –
MEDIA(‰) 2.8 4.2 4.3 3.1
Valori SD 0.424 0.289 0.577 1.273

Fig.10 Evaluarea frecvenț ei micronucleilor in vivo (Analiza s -a realizat prin evaluarea
prezenț ei micronucleilor la 1000 nuclei numărați – MN‰)
S-au folosit trei tipuri de nanoparticule la o concentrați maximă de 5 mg/ml. Diferenț ierea
nanoparticule lor s-a facut prin utilizarea diferiților agenți de stabilizare și reducere parțială a
argintului. Se constată o incidență a micronucleilor aproximativ asemanatoare controlul ui 0123456
Control P 3.1 P 3.4 P 3.8Frecvența MN/1000 nuclei

45

deoarece expunerea la nanoparticule a fost de durată scurtă spre medie, astfel capacita tea
genotoxică a nanoparticule lor a fost sc ăzută spre nulă (figura 11 ).

Fig. 11 Imagini de microscopie optica ale limfocitelor tratate cu nanoparticule (coloraț ie Giemsa)
Următoarele tulpini microbiene din colecția de culturi de tip americane au fost utilizate în
studiu: Enterococcus faecalis ATCC 6221 Staphylococcus aureus ATCC 6538 (bacterii G ram-
pozitive), Escherichia coli ATCC 11229 (bacterii G ram-negative), Pseudomonas aeruginosa
ATCC 4352 ) și Candida albicans ATCC 3333 (tulpin ă fungică).
Control (x 80) P 3.1 (x 80)
P3.4 (x80) P3.8 (x80)

46
Tabel 3. Concentrația minimă inhibitorie (CMI)
AgZnONPs
P. aeruginosa
ATCC
E. coli ATCC
S. aureus
ATCC
E. faecalis
ATCC
C. albicans
ATCC

P1 2.5
2.5
2.5
3.75
3.75

P4 2.5
2.5
5
5
1.875

P8 2.5
2.5
7.5
5
1.875

P1 a prezentat cea mai bună activitate microbicidă împotriva tuturor tulpinilor
microbiene testate, cu valori ale CMI de la 3,75 mg / ml la 2,5 mg / ml. (Tabelul 3).
Tabel 4 . Concentrația minimă de eradicare a biofilmului (CMEB )
AgZnONPs
P. aeruginosa
ATCC
E. coli ATCC
S. aureus
ATCC
E. faecalis
ATCC
C. albicans
ATCC

P1 2.5
3.75
1.875
7.5
1.875

P4 1.875
5
2.5
5
1.875

P8 2.5
3.75
2.5
5
2.5

NP au prezentat eficiență antibiofilm față de microorganismele testate, biofilmele de
Pseudomonas aeruginosa ATCC, Staphylococcus aureus ATCC și Candida albicans ATCC fiind
cele mai sensibile la P1 și P4 cu valoarea MBEC de 1,875 mg / ml. ( Tabelul 4)

47
Discuții
Una dintre problemele actuale cu care se confruntă oamenii de știință și personalul din
domeniul biomedical în lupta împotriva bolilor infecțioase este dezvoltarea rezistenței bacteriene .
Nanotehnologia oferă un potențial enorm în medicină, inclusiv utilizarea Np ca biocide. Multe
dintre aceste a sunt compuse din metale grele sau oxizi metalici, cum ar fi argintul, aurul, zincul,
dioxidul de titan și oxidul de zinc .
Alte metale NP și oxid de metal au fost testate și împotriva microorganismelor patogene,
inclusiv oxid de titan, oxid de magneziu, cupru, oxid de cupru, oxid de zinc, seleniu ,cadmiu și
telură de cadmiu (Graves, 2015).
S-a dovedit că oxizii nanometalici pot fi utilizați ca agenți antibacterieni c um ar fi oxizii de
titan (TiO2), siliciu (SiO2), nanoparticulele de oxid de zinc (ZnO) pot fi utilizate ca finisare
antibacteriană pent ru textile (Ribeiro și colab ., 2016 ).
Ibănescu și colaboratorii (2014) a u dezvoltat nanoparticule compozite Ag / ZnO prin
reducerea argintului pe suprafața nanoparticulelor ZnO. Rezultatele studiului au arătat că
activitatea antibacteriană a nanoparticulelor Ag / ZnO crește la o concentrație mai mare de argint.
Această creștere a activității antimicrobiene pentru argintul superior poate fi legată de scăderea
mărimii cristalitei cu creșterea corespunzătoare a suprafeței active, ceea ce face posibilă o
creștere a efectului biocid.
În studiul de față, Np de AgZnO recent d ezvoltate au demo nstrat un bun efect microbicid
atât împotriva bacteriilor Gram -negative cât și G ram-pozitive și împotriva tulpinii fungice de
Candida albicans .
În general, aceste rezultate indică faptul că Np de AgZnO dezvoltate au prezentat o
activitate microbicidă p uternică împotriva bacteriilor G ram pozitive, a bacteriilor G ram negative
și Candida albicans și au potențialul de a fi utilizate pentru diferite aplicații antimicrobiene în
domeniile biotehnologiei și biomedicale.

48
2.4 Concluzii

Nanoparticulele de AgZnO nou sintetizate manifestă un puternic efect antibacterian și
antifungic față de mi croorganisme patogene, demonstrând astfel potențialul aplicativ î n
domeniul biotehnologiei și al domeniilor biomedicale .
Analiza genotoxicității in vivo , prin testul micronucleilor pe model murin a evidențiat un
potențial genotoxic scăzut al Ag -ZnONp, rez ultat pozitiv cu implicații benefice î n utili zarea
acestor nanoparticulelor î n domeniul biomedical, pentru obținerea de noi biomateriale cu
proprietăț i antimicrobiene.

49
Bibliografie

1. Albert Joachim Omlor, Juliane Nguyen, Robert Bals and Quoc Thai Din1, 2015,
Nanotechnology in respiratory medicine , Omlor et al. Respiratory Research (2015) 16:64
doi 10.1186/s12931 -015-0223 -5.
2. Amruta Manke, Liying Wang, and Yon Rojanasakul1, 2013, Mechanisms of
Nanoparticle -Induced Oxidative Stress and Toxicity , BioMed Research International
http://dx.doi.org/10.1155/2013/942916 .
3. Bryan Calderón -Jiménez , Monique E. Johns on1, Antonio R. Montoro Bustos , Karen E.
Murphy, Michael R. Winchester and José R. Vega Baudrit , 2017, Silver Nanoparticles:
Technological Advances, Societal Impacts, and Metrological Challenges , Frontiers in
Chemistry, doi: 10.3389/fchem.2017.00006.
4. Chappel J.B., Greville G.D , 2004 , Effect of silver ions on mitochondrial
adenosinetriphospha tes. Nature (London) . v. 174, p. 930 –931.
5. Cheng Teng Ng, Liang Qing Yong ,Manoor Prakash Hand e ,Choon Nam Ong, Liya E Yu ,
Boon Huat Bay, Gyeong Hun Baeg ,2017 , Zinc oxide nanoparticles exhibit cytotoxicity
and genotoxicity through oxidative stress respons es in human lung fibroblasts and
Drosophila melanogaste r, International Journal of Nanomedicine 2017:12 1621 –1637.
6. Cheng -Teng Ng, Jasmine J. Li, Boon -Huat Bay,1 and Lin -Yue Lanry Yung, 2010,
Current Studies into the Genotoxic Effects of Nanomaterials , Journal of Nucleic Acids,
doi:10.4061/2010/947859
7. Chiranjib Chakraborty, Ashish Ranjan Sharma, Garima Sharma and Sang ‑Soo Lee, 2016,
Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity , Chakraborty
et al. J Nanobiotechnol (2016) 14:65 DOI 10.1186/s12951 -016-0217 -6
8. Danielle McShan, Paresh C. Ray, Hongtao Yu, 2014, Molecular toxicity mechanism of
nanosilver, Food and Drug Administration, Taiwan. Published by Elsevier Taiwan LLC,
Administration, Taiwan. Published by Elsevier Taiwan LLC.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jfda.2014.01.010 .
9. Fox C L, Modak S M , 1974 , Mechanism of Silver Sulfadiazine Action on Burn Wound
Infections .Antimicrob. Agents Chemother. 5:582 –588.

50
10. Geewoo Nam, Sabarina than Rangasamy, Baskaran Purushothaman and Joon Myong
Song, 2015 , The Application of Bactericidal Silver Nanoparticles in Wound Treatment ,
Nanomater Nanotechnol, 2015, 5:23 | doi: 10.5772/60918.
11. Graves, J. L., Tajkarimi, M., Cunningham, Q., Campbell, A., N onga, H., Harrison, S. H.,
& Barrick, J. E. (2015 ). Rapid evolution of silver nanoparticle resistance in Escherichia
coli. Frontiers in Genetics, 6, 42. http://doi.org/10.3389/fgene.2015.00042
12. Ibanescu M, Musat V, Textor T, Badilita V, Mahltig B, 2014 ,.Photocatalytic and
antimicrobial Ag/ZnO nanocomposites for functionalization of textile fabrics . J Alloys
Compounds 2014. 610:244 –249.
13. Ionel POPA, Ioana -Maria NICOLA, Victoria CEARA, Cristian BOBOC, Cristi ana
Alexandra DANEC, 2015, Obtinerea si utilizarea nanoparticulelor de argint , ICPE,
Bucureti, România; IMT, Bucureti, România.
14. Jiri Gallo, Ales Panacek , Robert Prucek , Eva Kriegova , Sarka Hradilova , Martin Hobza
and Martin Holinka , 2016, Silver Nanocoating Technology in the Prevention of
Prosthetic Joint Infection , Materials 2016, 9, 337; doi:10.3390/ma9050337.
15. Katarzyna Markowska, Anna M. Grudniak and Krystyna I. Wolska, 2013 , Silver
nanoparticles as an alternative strategy against bacterial bio films , Mikrobiot Vol. 60, No
4/2013 523 –530.
16. Kimberly S. Butler, David J. Peeler, Brendan J. Casey, Benita J. Dair and Rosalie K.
Elespuru, 2015, Silver nanoparticles: correlating nanoparticle size and cellular uptake
with genotoxicity Mutagenesis, 2015, 3 0, 577 –591 doi:10.1093/mutage/gev020.
17. Korshed P, Li L, Liu Z, Wang T, 2016 The Molecular Mechanisms of the Antibacterial
Effect of Picosecond Laser Generated Silver Nanoparticles and Their Toxicity to Human
Cells . PLoS One. 2016 Aug 30;11(8):e0160078. doi: 10.1371/journal.pone.0160078.
18. Kwon J Y, Koedrith P., Seo Y.R, 2014, Current investigations into the genotoxicity of
zinc oxide and silica nanoparticles in mammalian models in vitro and in vivo:
carcinogenic/genotoxic potential, relevant mechanisms and bi omarkers, artifacts, and
limitations , International Journal of Nanomedicine 2014, 9 (Suppl 2) 271 –286
19. Kyung -Taek Rim, Soo -Jin Kim, 2015, A Review on Mutagenicity Testing for Hazard
Classification of Chemicals at Work: Focusing on in vivo Micronucleus Test for Allyl

51
Chloride, Safety and Health Research Institute. Published by Elsevier Ltd.
http://dx.doi.org/10.1016/j.shaw.2015.05.005 .
20. Lei Cheng, Ke Zhang, Michael D Weir1, Mary Anne S Melo1, Xuedong Zhou, and
Hockin HK Xu,2015 , Nanotechnology strategies for antibacterial and remineralizing
composites and adhesives to tackle dental caries , Nanomedicine (Lond). 2015 March ;
10(4): 627 –641. doi:10.2217/nnm.14.191.
21. Makoto Hayashi, 2016, The micronucleus t est—most widely used in vivo genotoxicity
test, Hayashi Genes and Environment (2016) 38:18 DOI 10.1186/s41021 -016-0044 -x.
22. Mariana Carmen Chifiriuc, Attila Cristian Ratiu, Marcela Popa and Alexandru Al.
Ecovoiu, 2016 , Drosophotoxicology: An Emerging Resear ch Area for Assessing
Nanoparticles Interaction with Living Organisms , Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 36;
doi:10.3390/ijms17020036.
23. Marius Rădulescu , Ecaterina Andronescu , Georgiana Dolete , Roxana Cristina Popescu
,Oana Fufa, Mariana Carmen Chifiriuc , Lau rentiu Mogoanta , Tudor -Adrian Balseanu ,
George Dan Mogosanu , Alexandru Mihai Grumezescu ,and Alina Maria Holban , 2016,
Silver Nanocoatings for Reducing the Exogenous Microbial Colonization of Wound
Dressin gs, Materials 2016, 9, 345; doi:10.3390/ma90503 45.
24. Matej Balaz, Ľudmila Balazova, Nina Daneu, Erika Dutkova, Miriama Balazova, Zdenka
Bujnakova and Yaroslav Shpotyuk, 2017, Plant -Mediated Synthesis of Silver
Nanoparticles and Their Stabilization by Wet Stirred Media Milling , Baláž et al.
Nanoscale Rese arch Letters (2017) 12:83 DOI 10.1186/s11671 -017-1860 -z.
25. Nayana A Patil, WN Gade, Deepti D Deobagkar,2016, Epigenetic modulation upon
exposure of lung fibroblasts to TiO2 and ZnO nanoparticles: alterations in DNA
methylation , International Journal of Nanom edicine 2016:11 4509 –4519.
26. Nelson Duran, Camila P. Silveira, Marcela Durán and Diego Stéfani T. Martinez, 2015,
Silver nanoparticle protein corona and toxicity: a mini review , Durán et al. J
Nanobiotechnol (2015) 13:55.
27. OECD (2014), Test No. 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, OECD
Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris
28. Olivia Torres -Bugarín, Nicole Macriz Romero, María Luisa Ramos Ibarra, Aurelio
Flores -García, Penélope Valdez Aburto, and María Guadalupe Zavala -Cerna1, 2015,

52
Genotoxic Effect in Autoimmune Diseases Evaluated by the Micronucleus Test Assay:
Our Experience and Literature Review, BioMed Research International,
http://dx.doi.org/10.1155/2015/194031 .
29. Palaniyandi Velusamy, Govindarajan Venkat Kumar, Venkadapathi Jeyanthi, Jayabrata
Das and Raman Pachaiappan, 20 16, Bio-Inspired Green Nanoparticles: Synthesis,
Mechanism, and Antibacterial Application , http://dx.doi.org/10.5487/TR.2016.32.2.095 .
30. Peter E. Petrochenko, Shelby A. Skoog, Qin Zhang,1 David J. Coms tock, Jeffrey W.
Elam,Peter L. Goering1 and Roger J. Narayan, 2013, , Cytotoxicity of cultured
macrophages exposed to antimicrobial zinc oxide (ZnO) coatings on nanoporous
aluminum oxide membranes Biomatter 25528; http://dx.doi.org/10.4161/biomatter.25528 .
31. Quang Huy Tran, Van Quy Nguyen and Anh -Tuan Le, 2013, Silver nanoparticles:
synthesis, properties, toxicology, applications and perspectives , Adv. Nat. Sci.: N anosci.
Nanotechnol. 4 033001 (20pp) .
32. Ribeiro M, Ferraz MP, Monteiro FJ, Fernandes MH, Beppu MM, Mantione D, Sardon
H.,2026, Antibacterial silk fibroin/nanohydroxyapatite hydrogels with silver and gold
nanoparticles for bone regeneration . Nanomedicine. 201 6 Aug 31. pii: S1549 –
9634(16)30142 -3. doi: 10.1016/j.nano.2016.08.026.
33. Rob J Vandebriel, Wim H De Jong, 2012, A review of mammalian toxicity of ZnO
nanoparticles , Nanotechnology , Science and Applications , 5 61–71.
34. Seung Hun Kang, Jee Young Kwon1, Jong Kwon Lee, Young Rok Seo, 2013 , Recent
Advances in In Vivo Genotoxicity Testing: Prediction of Carcinogenic Potential Using
Comet and Micronucleus Assay in Animal Models, Journal of C ancer Prevention Vol. 18,
No. 4 .
35. Sidra Sabir, Muhammad Arshad, and Sunbal Khal il Chaudhari, 2014, Zinc Oxide
Nanoparticles for Revolutionizing Agriculture: Synthesis and Applications , The Scientific
World Journal http://dx.doi.org/10.1155/2014/925494 .
36. Tianlu Zhang, Liming Wang, Qia ng Chen,1 and Chunying Chen, 2014, Cytotoxic
Potential of Silver Nanoparticl es, Yonsei Med J 55(2):283 -291,
http://dx.doi.org/10.3349/ymj.2014.55.2.283 .

53
37. Xi-Feng Zhang , Wei Shen and Sangiliyandi Gur unathan, 2016, Silver Nanoparticle –
Mediated Cellular Responses in Various Cell Lines: An in Vitro Model , Int. J. Mol. Sci.
2016, 17, 1603; doi:10.3390/ijms17101603.
38. Xi-Feng Zhang , Zhi -Guo Liu , Wei Shen and Sangiliyandi Gurunathan , 2016 , Silver
Nanoparticles: Synthesis, Characterization, Properties, Applications, and Therapeutic
Approaches, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1534; doi:10.3390/ijms17091534.
39. Yamanaka M, Hara K, Kudo J (2005) Bactericidal Actions of a Silver Ion Solution on
Escherichia col i, Studied by Energy -Filtering Transmission Electron Microscopy and
Proteomic Analysis. Applied and Environmental Microbiology 71:7589 –7593.
40. Yang Yu e, Xiaomei Li, Laura Sigg, Marc J .F Suter, Smitha Pillai, Renata Behra and
Kristin Schirmer, 2017, Interacti on of silver nanoparticles with algae and fish cells: a
side by side comparison, Yue et al. J Nanobiotechnol 15:16 DOI 10.1186/s12951 -017-
0254 -9.
41. Yi-Huang Hsueh, Wan -Ju Ke, Chien -Te Hsieh, Kuen -Song Lin, Dong -Ying Tzou, Chao –
Lung Chiang, 2015, ZnO Nanopart icles Affect Bacillus subtilis Cell Growth and Biofilm
Formation , PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0128457.
42. Youmie Park, 2014, A New Paradigm Shift for the Green Synthesis of Antibacterial Silver
Nanoparticles Utilizing Plant Extracts , Toxicol. Res. Vol . 30, No. 3, pp. 169 -178
http://dx.doi.org/10.5487/TR.2014.30.3.169 .
43. Yugal K. Mohanta, Sujogya K. Panda, Akshaya K. Bastia and Tapan K. Mohanta, 2017,
Biosynthesis of Silver Nanoparticles from Protiu m serratum and Investigation of their
Potential Impacts on Food Safety and Control , Frontiers in Microbiology, doi:
10.3389/fmicb.2017.00626.