Marcarea de Proteine In Vivo cu Gfp (proteina cu Fluorescență Verde)

Coordonator științific,

Conf. Dr. Fărcășanu Ileana

Absolvent,

Bărbieru Otilia

Coordonator științific,

Conf. Dr. Fărcășanu Ileana

Absolvent,

Bărbieru Otilia

Cuprins

Partea I

Partea I

1.GFP – Structură și proprietăți

GFP sau Green Fluorescent Protein (proteina cu fluorescență verde) este o proteină care se găsește în organele luminescente ale unei meduze care trăiește în apele calde de coastă ale Americii, Aequorea victoria. În momentul de față, această specie este destul de rară.

GFP a fost descoperită accidental în decursul izolării unei alte proteine (aequorină) din extractul celular obținut din aceste meduze. Aequorina prezintă chemiluminescență în prezența ionilor de Ca2+ , fapt pentru care este și utilizată ca marker al acestor ioni.

Dar ceea ce face GFP atât de specială este faptul că poate fi utilizată ca marker pentru absolut orice proces spațio-temporal, dar mai mult de atât, poate fi utilizată în celule vii, fără a le dăuna în vreun fel. Este, deci extreme de utilă în realizarea de studii asupra căilor metabolice și biochimice din celule. Datorită acestui fapt a devenit unul dintre cele mai importante și versatile instrumente în biologia moleculară.

1.1.Compoziție, structură, fluorofor

GFP este o proteină compusă din 238 resturi de aminoacizi, cu o masă de 26,9 kDa. Deși structura terțiară a proteinei nu a fost elucidată până în anul 1966, acest fapt nu i-a oprit pe cercetători să o utilizeze.

Structura terțiară GFP este formată dintr-un număr de 11 fragmente β-sheet care se înfășoară în jurul unei axe, sub forma unei structuri cilindroide, β-barrel sau β-can. De asemenea, mai există un număr de fragmente în forma de α-helix care funcționează ca ancore pentru fluoroforul care se găsește în interiorul acestui cilindru.[1]

Figura 2: Structura terțiară a GFP[3]

Cea mai mare parte din aminoacizii prezenți în acestă proteină sunt utilizați pentru formarea structurii β-barrel și a structurii de α-helix care ancorează fluoroforul într-o poziție centrală în interiorul cilindrului, ceea ce face deleția unor fragmente imposibilă, deci și micșorarea proteinei este de asemenea imposibilă.

Este important de remarcat că în absența structurii de β-barrel, fluoroforul nu se formează și proteina nu prezintă fluorescență, cum nici gruparea fluorofoară nu poate funcționa izolat.

GFP în forma sa nativă poate cristaliza atât ca dimer dar și ca monomer, fapt indicat de modificarea aspectului spectrului de excitare. Însă, s-a observat că dimerizarea este dependentă de factorii care influențează creșterea cristalului și nu este o caracteristică definitorie a proteinei.[1]

Figura 3: Formarea fluoroforului GFP[4]

În GFP, floroforul este format între aminoacizii din pozițiile 65-67, care în cazul proteinei native sunt serină, tirozină și glicină. În prezența oxigenului, acești aminoacizi se asamblează într-o structură de tip p-hidroxibenzilideneimidazolinonă.

GFP prezintă două maxime de excitare, unul foarte mare la 400 nm și unul mai mic la 470 nm. De asemenea, în spectrul GFP mai există un maxim de emisie de la 505 nm și unul ceva mai mic la 570 nm. [6]

Pentru formare fluoroforul este necesar ca mai întâi să se formeze conformația nativă a proteinei, structura de β-barrel. Astfel, cei trei aminoacizi sunt aduși într-o poziție favorabilă pentru a avea loc atacul nucleofil al amidei aparținând glicinei asupra grupării carbonil a serinei din poziția 65, urmată de deshidratare (Fig. 3). În urma expunerii acestei grupări nou create la oxigenul molecular, legătura α-β a restului 66 este dehidrogenată și este inițiată conjugarea între imidazolină și gruparea aromatică (ciclul benzenic al tirozinei). În urma acestor reacții se obține fluoroforul matur care are proprietăți absorbante și fluorescente semnificative.[5]

În urma studiillor efectuate asupra structurii și mecanismului de formare a floroforului s-a observat că GFP nu prezintă fluorescență în absența oxigenului, ceea ce îl face imposibil de utilizat în cazul organismelor anaerobe, însă acesta nu necesită prezența unul cofactor sau a ionilor metalici pentru a-și realiza funcția, ceea ce îl face un marker excelent pentru toate organismele aerobe.

La nivel molecular s-a observat că glicina din poziția 67 este conservată la toate organismele care prezintă fluorescență, probabil datorită faptului că este un nucleofil foarte bun și că prezintă împiedicări sterice minime, având ca substituenți la carbonul β doi hidrogeni. [10]

1.2. Clasificare și spectre

Variantele de GFP, atât cele naturale cât și cele obținute prin mutații se pot clasifica în 7 categorii, în funcție de ionii și de aminoacizii pe care îi au în componența fluoroforului.

Amestec de fenoxid și fenol neutru

Anioni fenoxid

Fenol neutru

Anioni fenoxid cu sisteme stacked π-elecrons

Indol

Imidazol

Fenil

Clasele de la 1-4 sunt derivați ai peptidelor care în poziția 66 conțin tirozină, iar cele din grupele 5, 6 și 7 conțin în aceiași poziție triptofan, histidină, respectiv fenilalanină. Fiecare clasă are spectre de absorbție și de emisie diferite.[1]

Din punctul de vedere al spectrelor de emisie și absorbție, cel mai complex corespunde GFP din prima categorie, prezentând două maxime de excitare, unul mult mai mare la 395 nm care corespunde picului de emisie de la 508 nm și un pic mai mic la 475 nm care corespunde unui pic de emisie la 503 nm. Acest comportament se explică datorită existenței a două forme distincte din punct de vedere chimic care există însă în proporții diferite.

A doua clasă de GFP conține, în gruparea care formează fluoroforul, anioni fenolat. Acest grup este cel mai des utilizat în practică, deoarece îmbină atât o luminozitate bună cât și un spectru mult mai simplu, format doar dintr-un maxim de excitare, la 480-490 nm și un maxim de emisie la 503 nm.

Acest fapt se datorează unei mutații, transformarea serinei din poziția 65 în treonină (S65T). Un efect asemănător îl are și înlocuirea serinei cu alți aminoacizi alifatici precum glicina, alanina, cisteina sau leucina.

Prin acestă mutație se induce ionizarea fenolului și astfel se suprimă picul de excitare corespunzător fenolului în formă neutră și se evidențiază creșterea în amplitudine a picului datorat anionului fenoxid.

În urma studiilor comparative făcute asupra formei native a proteinei cât și asupra formei astfel modificate s-a observat că ambele prezintă capacitate de pliere bună a proteinei la temperatura camerei sau la temperaturi mai joase, dar odată cu creșterea acestora se produce un număr mare de proteine pliate incorect sau agregate non-fluorescente.[5]

Datorită interesului existent pentru exprimarea GFP în organisme care trăiesc la temperaturi mai ridicate, s-a urmărit obținerea de forme ale GFP care să își păstreze luminozitatea bună chiar și la 37oC. Astfel s-a observat că modificarea F64L (fenilalanina din poziția 64 este înlocuită cu leucină) îmbunătășește plierea proteinei astfel încât un număr mult mai mare de molecule de proteine se maturează și prezintă fluorescență. Mai există un număr de mutații care conduc la rezultate asemănătoare dintre care cele mai utilizate sunt V163A (valina din poziția 163 este înlocuită cu alanină), S72A (serina 172 este înlocuită cu alanină), N149K (asparagina 149 înlocuită cu lizină), M153T (metionina 153 înlocuită cu treonină) și I167T (izoleucina 167 înlocuită cu treonină). Toate aceste modificări pot fi utilizate singure sau în combinație.[1]

În cazul introducerii acestor modificări în proteina wild type (nativă), ele nu influențează luminozitatea obținută, doar capacitatea de pliere a proteinei în forma corectă, pentru obținerea unui număr mai mare de proteine mature care pot prezenta fluorescență. Însă numai procesul de pliere a proteinei este dependent de temperatură, astfel încât, o proteină maturată corect la temperatură scăzută va fi activă până la o temperatură de 65˚C.

A treia clasă de GFP, cea care conține fenolul în forma sa neutră este obținut prin transformarea unui aminoacid hidroxilat din apropierea fluoroforului într-o formă nehidroxilată ceea ce duce la imposibilitatea de solvatare a fenolului și implicit la suprimarea picului corespunzător ionului fenoxid de la 490 nm. Singurul pic de emisie din spectru corespunde stării excitate în care fenolul este încă destul de acid pentru a expulza un proton.

Datorită lipsei picului de excitare din zona 480-490 nm această formă poate fi utilizată în combinație cu GFP din a doua clasă pentru o dublă marcare a țesuturilor.

A patra clasă a proteinelor fluorescente, cea a GFP care prezintă atât anioni fenoxid cât și un sistem stacked π-electrons, se realizează printr-o modificare în lanțul lateral, adiacent grupării fluorofoare, prin înlocuirea aminoacizilor din poziția 203 cu un rest care conține sisteme aromatice ( histidină, triptofan, fenilalanină sau tirozină) în timp ce restul din poziția 65 poate fi glicină sau treonină pentru a induce ionizarea. Datorită introducerii acestor amonoacizi, crește atât lungimea de undă necesară pentru excitare, cât și cea de emisie, ceea ce face culoarea acestor proteine să aibă o nuanță galbenă. Din acest motiv acestea se mai numesc și YFP (Yellow Fluorescent Proteins).[1]

Cea de-a cincea clasă de GFP conține în molecula de cromofor, substituit în poziția 66, un rest de triptofan în locul celui de tirozină, ceea ce introduce un ciclu indolic în cromofor. Acest fluorofor nou format are două picuri de excitare la 436 și 476 nm, dar datorită mărimii mult mai mari a indolului sunt necesare mai multe modificări pentru a obține o luminozitate bună. Aceste proteine sunt denumite CFP (Cyan Florescent Proteins), datorită fluorescenței verzi-albăstrui pe care o prezintă[6]

A șasea clasă conține un imidazol introdus în gruparea cromoforă, prin înlocuirea restului de tirozină din poziția 66 cu un rest de histidină, ceea ce modifică maximele de excitare și de emisie la valori și mai mici (383 nm pentru excitare și 477 pentru emisie). Din această cauză culoarea pe care aceste proteine o au este albastră, ele fiind denumite și BFP(Blue Fluorescent Proteins).

Deși studiate foarte puțin, datorită lungimilor de undă foarte mici necesare pentru excitare, proteinele florescente din a șaptea clasă (conțin un rest de fenilalanină în poziția 66) merită menționate datorită potențialului pe care îl prezintă în posibilitatea de a crea alte tipuri de proteine fluorescente. Pe acestea s-a demonstrat necesitatea existenței unui rest aromatic pentru formarea floroforului.[10]

Deși s-au încercat un număr mare de mutații și modificări, în final nu a fost posibilă obținerea florescenței roșii. Totuși, în anumite specii de anemone și corali, există o proteină foarte asemănătoare atât ca structură cât și ca secvență cu GFP. În urma unor mutații minore s-a reușit inducerea florescenței și astfel s-a obținut o paletă impresionantă de culori.

În speciile de Anthozoa există un set de proteine asemănătoare ca structură cu proteinele omoloage din Aequorea victoria. Aceste proteine au fost izolate din specii de corali nonluminescenți, ceea ce demonstrează că nu toate proteinele cu structură de GFP prezintă fluorescență. Se consideră ca fluorescența este o caracteristică evolutivă relativ recentă a anumitor filogenii sau o adaptare la mediul în care acestea trăiesc.

În cazul acestor proteine se poate observa înalta conservare atât a proceselor și a structurii primare. În urma studiilor efectuate s-a descoperit faptul că glicina din poziția 67 este perfect conservată, alături de tirozina din poziția 66. Modificarea apare la aminoacidul din poziția 65 (serină în GFP), care în acest caz este înlocuită cu glutamină, asparagină sau lizină.[11]

Proteinele fluorescente roșii(RFP) prezintă un singur maxim de absorbție, la 475 nm și un singur pic de emisie în zona roșie a spectrului.

1.3.Toxicitate

Deși marcarea celulelor cu proteine fluorescente reprezintă o metodă mai puțin dăunătoare decât colorarea cu pigmenți flourescenți sintetici, și acestea prezintă un anumit grad de toxicitate, dat în special de reacțiile pe care proteinele flourescente le au cu oxigenul molecular, din care rezultă specii reactive ale oxigenului și radicali liberi.

Este recomandat ca în studiile în care se utilizează proteine fluorecente, să fie utilizate în special proteinele care sunt excitate de lungimi de undă mai mari (GFP, YFP, RFP) față de cele excitate de lungimi de undă mai mici (CFP și BFP), datorită riscului scăzut de a distruge celula prin efectul energiei radiației de excitare.

De asemenea, trebuie ținut cont și de durata de iluminare a probelor. S-a observat că celulele care au fost supuse iluminării o perioadă mai lungă de timp (experimente care necesită iluminarea pe o perioada de minim 12 ore) au suferit diverse modificări fiziologice care în timp au dus la moarte celulară.[6]

1.4.Utilizări

GFP este o moleculă extrem de versatilă, ceea ce a condus la obținerea unui număr mare de utilizări pentru aceasta. Aplicațiile ei nu se rezumă doar la studierea proceselor vitale în celulă, ajungând până la studierea interacțiilor între celula gazdă și patogen. Totuși, aplicațiile GFP nu se limitează numai în laborator, prin procesele de fluorescență fiind posibilă monitorizarea proceselor de fermentație sau a descompunerii combustibililor fosili sub acțiunea bacteriilor din sol.[9]

GFP poate fi utilizat ca marker pentru o genă (fusion tag). În acest caz, gena GFP este fuzionată în fază de gena responsabilă pentru sinteza unei anumite proteine și se pot studia procese celulare dinamice și localizarea sau domeniile proteinei respective.

Datorită formării cromoforului, fără a fi necesari cofactori, utilizarea GFP este ideala pentru observarea in vivo a proceselor biologice, iar faptul că introducerea GFP în celule nu reprezintă un factor care duce la moartea iminentă a celulei prezintă un avantaj notabil.

De asemenea, trebuie menționat faptul că legarea proteinei de interes de marker se poate face atât prin capătul N-terminal cât și prin capătul C-terminal. S-a observat că în urma fuzionării proteinei de interes cu GFP pot apărea împiedicări sterice, dar în cea mai mare parte a timpului cele două proteine funcționeză independent una de cealaltă.

Un alt mod de a utiliza GFP este ca genă raportor. Aceasta este legată de un promotor de interes și se măsoară fluorescența pentru a se determina nivelul de exprimare a genei respective.

Deoarece GFP s-a dovedit a fi un instrument extrem de util și versatil, oferind cercetătorilor o nouă viziune asupra complexității proceselor celulare și a incredibilelor transformări ce pot avea loc într-un spațiu atât de mic precum o celulă, această descoperire a primit premiul Nobel în anul 2008.

Premiul a fost acordat celor trei cercetători care au avut cea mai mare contribuție în desoperirea acestei proteine. Osamu Shimomura pentru extracția, purificarea și cristalizarea GFP, Martin Chalfie pentru exprimarea GFP în alte organisme, și Roger Tsien pentru dezvoltarea unei întregi palete de culori în care există în momentul de față proteinele fluorescente .

2.ADN – Structură, proprietăți

Ereditatea celulară reprezintă capacitatea organismelor vii de a perpetua specia prin reproducerea cu înaltă fidelitate a unui set de caractere care sunt transmise mai departe generațiilor următoare.

Acizii nucleici reprezintă mediul de stocare a informației genetice și legătura între ereditate și caracterele pe care le prezintă celula.

În ADN există toată informația necesară sintezei oricărei proteine existente în celulă de aceea trebuie să înțelegem structura ADN-ului. ADN sau acidul deoxiribonucleic este un polimer de mari dimensiuni format din nucleotide.

Monomerii din care este constituit ADN sau nucleotidele sunt formate din 3 componente majore; o bază azotată care poate avea nucleu purinic sau pirimidinică și o unitate zaharidică de tip pentoză care este esterificată cu unul, două sau trei resturi de acid fosforic.

Bazele azotate sunt compuși heterociclici și prezintă un anumit număr de legături duble, ceea ce le conferă o anumită stabilitate. [12]

Cele 5 baze azotate nu au o distribuție uniformă în ADN și ARN. Timina este prezentă doar în ADN, în timp ce uracilul este prezent numai în ARN.

Unitățile zaharidice pot fi de două feluri. În cazul ADN acestea sunt de tip deoxi-riboză, iar în cazul ARN sunt de tip riboză. Această diferență stă la baza stabilității diferite a celor două tipuri de acizi nucleici.

Pentru a se forma polimerul, din nucleozid trifosfați, este necesar să aibă loc atacul nucleofil între gruparea –OH a unui 3’ nucleozid-fosfat asupra poziției 5‘ a următorului nucleozid fosfat. Astfel se formează legăturile fosfo-diesterice.

Structura secundară a ADN a fost propusă de Watson și Crick în anul 1953 în urma studiilor asupra acizilor nucleici, prin difracție de raze X și prin metode de modelare a structurilor.

Descoperirea lor a fost răsplătită cu un Premiu Nobel.[13]

ADN-ul este format din două catene cu sens antiparalel care sunt legate între ele prin legaturi de hidrogen și se răsucesc într-o structura de dublu helix în care bazele azotate sunt în interiorul helixului și grupările fosfat și unitatea zaharidică sunt la exterior.

Între cele două catene de ADN cuplarea este specifică, după cum a observat și Chargraff, astfel încât concentrația nucleotidelor conținând adenină este întotdeauna egală cu concentrația celor care conțin timină și cea a deoxi-citidin nucleotidelor este egală cu cea a deoxi-guanozin nucleotidelor.

Astfel s-a realizat faptul că o adenină se va lega de o timină (A=T) și o citozină se va lega de o guanină (CG). [13]

De asemenea, trebuie luate în considerare distanțele între cele două baze azotate. În cuplarea unei baze azotate purinice cu o baza azotată pirimidinică se formează un număr de legături de hidrogen, două pentru cuplul T-A și trei pentru C-G, dar distanța între cele două fragmente rămâne constantă.

Se poate spune că cele două catene sunt complementare, astfel încât, dacă pe o catenă există adenină, pe cealaltă catenă, în poziția corespunzătoare va exista o timină. În cazul cuplării unei purine cu o altă purină sau a unei pirimidine cu o alta pirimidină, lanțul de ADN va prezenta deformări. [13]

ADN-ul este un helix de dreapta cu distanța între două baze azotate de 0.36 nm și pasul de spiră (numărul de baze la care ADN-ul efectuează o rotație completă) de 10.5 baze.

Figura 7. Structura ADN

Acestea sunt caracteristicile structurii de tip B, cea mai răspândită în celule în condițiile uzuale (tărie ionică mică, hidratare puternică). De asemenea, se delimitează în acest sens două particularități structurale, cele două cavități, fose sau șanțuri. Aceste spații permit interacții între proteinele reglatoare și anumite secvențe de ADN cu care interacționează prin legături de hidrogen.

Principalele proprietăți ale ADN-ului sunt replicarea și transcripția.

2.1.Transcripția ADN

Transcripția este procesul prin care o genă este citită, copiată în ARN ca apoi ARN-ul să fie utilizat în sinteza proteică.

Se consideră că transcripția este primul pas în exprimarea unei proteine într-o celulă și aceasta urmează anumiți pași bine determinați pentru a citi o genă și a o transforma în ARN.

O genă este un fragment de ADN cu o anumită lungime, care prezintă un set de caracteristici, ca de exemplu, existența unei zone de inițiere a transcrierii ( TATA-box), de obicei cu 30 de perechi de baze înainte de zona de începere a transcripției, dar și situsuri de legare a speciilor cu caracter activator sau represor al transcripției. [17]

Transcripția are loc în 3 etape.

Inițiere

Elongare

Terminare

În cazul eucariotelor, există secvențe promotoare care semnalează existența unei gene și ajută la transcripția acesteia prin legarea de factori de transcripție.

Factorii de transcripție se leagă specific de zonele reglatoare ale acizilor nucleici, prin recunoaștrea unui fragment de 6-12 baze. Astfel, aceștia joacă rol de activatori sau represori ai genelor. De asemenea, factorii de transcripție au un rol extrem de important în legarea ARN-polimerazei de situsul de începere a transcrierii.

Etapa de inițiere începe odată cu legarea ARN-polimerazei de promotor.

ARN-polimeraza este o enzimă multi-funcțională, a cărui principal scop este de a citi secvența de nucleotide a catenei matriță și de a sintetiza, prin complementaritate un fragment de ARN care să conțină aceeași informație prezentă pe catena codificantă.

Pentru a putea citi informația existentă doar pe una dintre catene, ARN-polimeraza trebuie să dezorganizeze duplexul de ADN. Astfel, aceasta denaturează ADN, aproximativ 14 perechi de baze în apropiere de situsul de inițiere a sintezei cu formarea unei bule (transcription bubble). [10]

ARN-polimeraza începe activitatea de transcriere a ADN-ului în ARN prin legarea provizorie a primei ribonucleotide de ADN ca apoi să se adauge următoarea ribonucleotidă, complementară cu cea de pe catena matriță.

Între cele două nucleotide se formează o legătură fosfodiesterică prin atacul nucleofil al grupării –OH din poziția 3‘ a restului de pentoză asupra fosfatului din pozitia α a următoarei nucleotide.

Odată cu formarea primei legături fosfodiesterice se încheie etapa de inițiere și începe etapa de elongare a ARN.

După polimerizarea unui număr de aproximativ 10 nucleotide, ARN-polimeraza eliberează factorii de transcripție și promotorii și se mișca de-a lungul catenei de ADN, continuând reacția de polimerizare, până când întâlnește o secvență specifică de terminare. [17]

În zona în care ADN-ul este denaturat pentru a se permite citirea, acesta există ca un duplex hibrid ADN-ARN. Pe parcursul reacției de polimerizare, ADN-ul se renatureză în urma ieșirii din bula de transcripție, ceea ce face ca fragmentul de ARN sa fie eliberat, totuși, acesta rămâne ancorat de ADN pe o lungime de 8 perechi de baze, în interiorul ARN-polimerazei.

În etapa de încheiere, odată cu întâlnirea secvenței de terminarea transcripției, ARN-polimeraza se disociază de duplexul de ADN și eliberează și fragmentul de ARN obținut.

În general, genele existente în ADN conțin o serie de fragmente non-codificante numite introni și fragmente codificante, exoni. Molecula de ARN obținută conține atât introni, cât și exoni. Este denumit pre-ARNm (ARN mesager precursor) și pentru a ajunge la maturitate trebuie să treacă printr-un număr de modificări.[13]

Aceste modificări încep odată cu terminarea sintezei, când un set de enzime sintetizează o grupare 7-metilguanilat, legată de capătul 5‘ al pre-ARNm, printr-o legătură 5‘-5‘trifosfoesterică. Rolul acestei modificări este de a proteja pre-ARNm de acțiunea RNA-zelor, ajută la transportul lor către citoplasmă și la legarea factorilor de translație.

De asemenea, la capătul 3‘ al pre-ARNm este legată, de gruparea –OH liberă, o codiță poli-adenilată.

Ultima modificare și cea mai importantă care are loc la nivelul pre-ARNm este fenomenul de splicing. Acesta reprezintă excizarea intronilor din secvența de acizi nucleici și legarea fragmentelor codificante. În urma acestui proces se obține ARNm matur care este transportat prin membrana nucleară, în citoplasma, unde este preluat de ribosomi, pentru a continua procesul de sinteză proteică, prin translația ARNm în secvența primară a unei singure proteine. [17]

Toate celulele funcționeză pe baza dogmei centrale a geneticii:

Din acest motiv a doua funcție importantă a ADN-ului este stocarea informației și transmiterea ei mai departe descendenților prin reproducere.

2.2.Replicarea ADN

Replicarea este procesul de sinteză a unui nou set de molecule de ADN printr-un proces semi-conservativ. Acesta are loc în urma despiralizării și desfacerii catenelor de ADN, astfel încât fiecare catenă provenită din ADN-ul original servește ca și catena matriță pentru catena nou sintetizată. Astfel se obține o copie identică a ADN-ului din celula inițială.

Replicarea necesită un set special de condiții pentru a avea loc. De obicei, aceasta are loc în faza S a ciclului celular, când celula a înglobat deja o cantitate mare de nutrienți și substanțe necesare sintezei proteice.

Echipamentul enzimatic necesar replicării ADN-ului este unul destul de complex, cuprinzând un număr mare de enzime și primeri.

Pentru a putea utiliza ADN-ul ca matriță pentru sinteza, acesta trebuie să existe în forma sa lineară. În acest caz ADN-ul trebuie să sufere anumite procese de denaturare. Astfel, în urma despiralizării ADN cu ajutorul helicazelor (formarea unei bifurcații de replicare), acesta expune anumite situsuri de legare pentru fragmente scurte de ARN, complementare cu catena matriță, denumite primeri.[12]

Însă cele două catene de ADN nu se sintetizează identic, deoarece sinteza ADN nu poate avea loc decât în direcția 5’- 3’. Astfel, una dintre catene se va sintetiza continuu (catena leading) și celalată discontinuu (catenă lagging).[13]

Catena leading se va sintetiza continuu deoarece există întotdeauna o grupare –OH liberă la capătul 3‘ și astfel nucleotidele se pot adăuga în mod continuu.

Pentru a menține fragmentele de ADN monocatenare în această stare este necesară existența altor proteine, SSBP (single strand binding proteins) care au ca rol principal împiedicarea respiralizării catenei de ADN, dar și protejarea acesteia față de acțiunea nucleazelor.

Cea mai importantă enzimă necesară replicării este ADN-polimeraza. Astfel, acesta citește secvența de pe catena matriță și adaugă nucleotide care se potrivesc prin complementaritate cu cele de pe catena matriță și apoi formează legătura fosfodiesterică între cele două nucleotide. [10]

De asemenea, unele ADN-polimeraze prezintă și funcție de editare, astfel încât, dacă se inserează o nucleotidă necomplementară, ADN-polimeraza se poate întoarce la punctul respectiv, excizează nucleotida incorectă și o introduce pe cea corectă.

În general, rata erorilor introduse de ADN-polimerază este destul de mică, o greșeală la apoximativ  107 nucleotide, ceea ce înseamnă că nu este necesar ca toate polimerazele să prezinte funcție de editare.

Pentru sinteza catenei lagging, este necesar un ansamblu proteic mai complex, din cauza faptului că elongarea fragmentului de ADN are loc în sens invers înaintării bifurcației de diviziune, de aceea este necesar ca sinteza să se desfașoare pe bucăți.

O ARN-primază se leagă de matriță și citește secvența de nucleotide ca apoi să sintetizeze un set de primeri din ARN, care apoi sunt elongați de către o ADN-polimerază, formând un fragment Okazaki.

Fragmentele Okazaki sunt serii de câteva sute de baze, separate de fragmente de primeri ARN. Acești primeri sunt apoi dizolvați și cu ajutorul unei ADN-ligaze, se formează legăturile între fragmentele Okazaki pentru a obține o catenă continuă de ADN nou sintetizată.[13]

Modelul Replicării ADN-ului stă la baza uneia dintre cele mai puternice tehnici utilizate în prezent în studiile de biologie moleculară și anume tehnica PCR.

3.Tehnica PCR (Polymerase chain reaction)

În prezent este una din tehnicile de bază utilizate în laboratoarele de biologie moleculară, dar care datorită eficienței crescute și a simplității de realizare și-a dovedit utilitatea în nenumărate domenii. Cele mai importante aplicații sunt în clonarea genelor și ingineria genetică, diagnosticarea bolilor ereditare, teste de amprentare genetică (teste de paternitate), precum și în detectarea și diagnosticarea bolilor infecțioase. [17]

Tehnica PCR se bazează pe o reacție enzimatică care permite obținerea unui număr mare de copii identice ale aceluiași fragment de ADN. Ca matriță pot fi utilizate fragmente de ADN celular, țesuturi sau chiar sânge, salivă și alte tipuri de probe biologice. Pentru o astfel de reacție este nevoie de o cantitate foarte mică de probă pentru a se obține un număr de copii destul de mare încât să permită analiza prin metode clasice de laborator.

Dezvoltarea acestei tehnici a fost răsplătită cu un Premiu Nobel în anul 1993, acordat lui Kary Mullis și Michael Smith.[19]

Pentru a realiza un PCR în condiții optime sunt necesare un set de componente de bază.

Termocycler, un aparat care permite atât încălzirea cât și răcirea amestecului de reacție

O matriță ADN

Oligo-nucleotide complementare cu secveța de nucleotide care flanchează fragmentul de interes, denumite primeri (amorse)

ADN-polimerază termostabilă, de obicei Taq-polimerază obținută dintr-o bacterie care trăiește la temperaturi foarte ridicate

Deoxi-nucleozid-trifosfați (dNTP)

Soluție tampon pentru a menține activitatea polimerazei.

Reacția are loc în tuburi cu volum mic, cu pereții subțiri pentru a permite transferul de căldură între aparat și amestecul de reacție. Pentru a preveni evaporarea solvenților, incinta în care se plasează tuburile de reacție este închisă cu un capac termoizolat.

Reacția PCR este realizată în 25-30 de cicluri. Aceste cicluri constau într-o serie de 3 etape.

1. Denaturarea ADN

În prima etapă, fragmentul de ADN care conține gena de interes ce va servi drept matriță pentru procesul de polimerizare este denaturată, cu ajutorul temperaturii (90-95˚C), transformând duplexul de ADN în două catene separate. Denaturarea are loc datorită ruperii legăturilor de hidrogen între două baze azotate complementare, ceea ce face ca cele două catene să se separe.

2.Hibridizarea

Temperatura amestecului de reacție este scăzută până la 50-55˚C pentru a permite hibridizarea primerilor pe fragmentele de ADN monocatenar. Aceștia se leagă specific, prin complementaritate, pe fiecare catenă. De asemenea, pentru a stabili temperatura de hibridizare a primerilor trebuie ținut cont de temperatura de topire a acestora.

3. Elongarea

Temperatura este crescută la 70-72˚C, temperatură optimă pentru funcționarea polimerazei termostabile. Taq-polimeraza detecteză primerii hibridizați corespunzător și începe elongarea fragmentelor de ADN, prin adăugarea de nucleozid-trifosfați la fragmentele deja hibridizate. Elongarea fragmentului de ADN are loc la temperatură ridicată astfel încât, dacă primerii nu sunt corect legați, acestia se vor denatura.[20]

Timpul de elongare a fragmentului se stabilește în funcție de lungimea sa, luându-se în calcul faptul că o ADN-polimerază poate procesa în medie aproximativ 1000 de perechi de baze într-un minut.

După terminarea fazei de elongare, se obține ADN dublu-catenar. Temperatura de reacție este din nou ridicată, pentru a scădea activitatea Taq-polimerazei și fragmentele de ADN sunt denaturate pentru a începe un nou ciclu de reacție.

Acești pași se repetă de 25-30 de ori, pentru a obține un număr suficient de mare de copii ale ADN-ului țintă.

În cazul în care reacția se continuă într-un număr mai mare de cicluri se delimitează 3 stadii ale reacției.

Amplificare exponențială – în fiecare ciclu amplificarea este considerată 100% eficientă, deci la sfârșitul fiecărui ciclu vom avea o cantitate dublă de ADN.

Faza de încetinire a reacției – Taq-polimeraza își pierde activitatea și cantitatea de nucleozid-trifosfați scade, ceea ce limitează reacția.

Faza stagnantă – nu se mai acumulează produs de reacție datorită pierderii complete a activității Taq-polimerazei.[17]

Este de reținut că multe dintre polimerazele termostabile prezintă funcții de editare, însă Taq polimeraza nu prezintă această proprietate, adăugând la capătul 3‘ o nucleotidă singulară, o adenină (3‘Adenine-overhang) care este extrem de utilă în clonarea de tip TA.[21]

4.Clonarea genelor

Clonarea este procesul de a crea un număr mare de copii identice ale aceluiași fragment de ADN recombinant. Acest proces se realizează cu ajutorul unor vectori virali sau celule-gazdă, care sunt ușor de crescut și de manipulat.

Pentru a putea introduce fragmente de ADN ale altor specii în celule-gazdă este necesară ligarea lor într-un plasmid.

Plasmidele sunt fragmente de ADN circular care se replică independent de ADN-ul gazdei. Acestea au un număr de caracteristici, printre care faptul că de obicei conțin o singură genă, un fragment de ADN specific denumit originea replicării.

Plasmidele artificiale conțin, în general, o origine a replicării, un marker de selecție și un multiple cloning site(MCS). Acesta reprezintă punctul în care se poate insera gena de interes.

MCS conține un set de secvențe de nucleotide care reprezintă situsurile de clivare pentru diverse enzime de restricție.

Enzimele de restricție sunt endonucleaze care se găsesc de obicei în specii de bacterii, având rolul de a le proteja de virusuri. Aceste enzime taie selectiv ADN-ul atunci când întâlnesc o anumită secvență de nucleotide, denumită situs de restricție. [22]

Această secvență este specifică pentru fiecare enzimă și este formată din 6 nucleotide. De obicei, acestea sunt așezate palindromic prin complementaritate. Enzimele de restricție pot tăia simetric, la jumătatea situsului și astfel se obțin fragmente cu capete boante (blunt ends). Dar unele enzime taie asimetric fragmentele de ADN, obținându-se fragment cu capete coezive (sticky ends).

Cea mai importantă aplicație a enzimelor de restricție în biologia moleculară este de a ajuta introducerea unui construct de interes într-un plasmid, în vederea obținerii unui număr mare de copii sau de a-l exprima într-un organism cu organizare simplă.

Este posibilă utilizarea enzimelor de restricție și a plasmidelor pentru a crea un construct format din două proteine, prin fuzionare în fază.

Fuzionarea în fază (sau in frame) reprezintă unirea a două secvențe codificante, astfel încît secvența de codoni să nu fie perturbată și să rezulte o secvență codificantă continuă.

Pentru a păstra intactă funcționalitatea ambelor proteine se utilizeză în special fuzionarea în fază, deoarece schimbările la nivelul structurii proteice sunt minime și șansele de a distruge situsurile sunt de asemenea scăzute.

Pentru a realiza o fuzionare în fază este necesar ca în secvențele codificante ale celor două proteine să nu existe un codon STOP care să întrerupă sinteza proteică, astfel proteina obținută este un construct între cele două proteine inițiale.

Partea a II-a

1.Considerații teoretice

Saccharomyces cerevisiae sau drojdia de bere este unul dintre cele mai des întâlnite modele moleculare utilizate în cercetarea moleculară. Există un număr mare de motive pentru care acestea sunt utilizate, cel mai important fiind faptul că sunt celule cu organizare eucariotă și care pot trece foarte ușor de la structură diploidă la structură haploidă. Acest fapt s-a dovedit extrem de util în studiile de genetică și genomică, precum și în studiul mecanismelor biologice și biochimice celulare, datorită marii versatilități de care dau dovadă.

Informația genetică existentă în celule este codificată de ADN, iar genele sunt parte integrantă a acestuia, fiind responsabile de sinteza proteinelor, prin procesul de transcripție-translație. Pentru a izola o anumită genă și pentru a-i urmări traseul biologic și biochimic este necesară separarea acesteia din genom. Acest proces se realizează prin izolarea și purificarea ADN-ului genomic.

2.Materiale și Metode

2.1Linii celulare și condiții de creștere

În experimentele noastre au fost utilizată liniile celulară de Saccharomyces cerevisiae omologată BY4741 (MATa; his3 ∆1; leu2∆0; met15 ∆0; ura3 ∆0) achiziționată de la EUROSCARF (www.euroscarf.de). Stocarea și manipularea celulelor s-a făcut pe mediu complet YPD (2% polipeptonă, 1% extract de drojdie, 2% glucoză), cu 2% agar pentru medii solide. Pentru selecția liniilor transformate cu plasmidul care conține gena CUP1 fuzionată cu GFP s-a utilizat un mediu sintetic fără uracil (SD-Ura) care conține 0,17% sursă de azot fără aminoacizi și (NH4)2SO4, 0,5% (NH4)2SO4, 2% glucoză, amestec de aminoacizi esențiali și 2% agar. Toate mediile au fost preparate conform standardelor de creștere pentru celulele de drojdie (Sherman et al., 1986).

Reactivii de biologie moleculară au fost achiziționați de la Promega (SUA) și Invitrogen (SUA).

3.Izolarea ADN-ului genomic

Este unul din procesele de bază în biologia moleculară și constă în spargerea membranei celulare și izolarea din extractul celular total a ADN-ului genomic, pentru a fi purificat prin electroforeză preparative și în final amplificat prin tehnica PCR.

Reactivi și materiale

-Mediu de cultură lichid YPD

-Tampon de liză celulară STET

-Nisip de cuarț

-Acetat de sodiu ( CH3COONa)

-Alcool etilic (CH3CH2OH)

-Tampon TE

-Tuburi de centrifugă

-Micropipete

-Tuburi Eppendorf

-Centrifugă

-Baie de apă

Mediu YPD

-1% Extract de drojdie

-2% Peptonă

-2% Glucoză

Tampon STET

-8% sucroză în 50mM Tris-HCl, pH 8.0

-5% Triton X-100(v/v)

-50mM EDTA

Tampon TE

-10mM Tris-HCl, pH 8.0

-1mM EDTA, pH 8.0

Mod de lucru

1. Se cultivă celulele de S. cerevisiae peste noapte în 5mL mediu de cultură lichid YPD, la 28oC și sub agitare.

2. Se colectează celulele prin centrifugare.

3. Se arunca supernatantul și se adaugă peste celule 200µL Tampon STET.

4. Se vortexează până la obținerea unei suspensii celulare omogene.

5.Se adaugă 100µL nisip de cuarț sterilizat prin autoclavare.

6. Se vortexează timp de 5 minute la temperatura camerei.

7. Se mai adaugă 100µL tampon STET și se vortexează scurt.

8. Se încălzește extractul celular la 95oC pentru 3 minute.

9. Se centrifughează extractul celular pentru 10 minute la 4oC.

10. Se răcesc pe gheață tuburile timp de 2 minute.

11. Se transferă supernatantul în tuburi Eppendorf curate și se aruncă nisipul de cuarț.

12. Se adaugă AcONa 3M (1/10 din volumul total)

13. Se adaugă 2 volume de EtOH 99% egale cu volumul de probă.

14. Se incubează 5-10 minute la temperatura camerei.

15. Se centrifughează la temperatura camerei la 10000 rpm, timp de 5 minute (Se va observa un precipitat albicios care reprezintă ADN-ul izolat).

16. Se aruncă supernatantul și se spală precipitatul cu 200µL EtOH 70% rece.

17. Se centrifughează 5 minute la temperatura camerei.

18. Se aruncă supernatantul.

19. Se resuspendă ADN-ul în 20µL Tampon TE.

20. Se păstrează la 4oC sau la congelator la -20oC, în cazul în care este necesară o păstrare pe o durată mai îndelungată de timp.

ADN-ul obținut astfel se va purifica prin electroforeză preparativă în gel de agaroză.

4.Purificarea fragmentelor de ADN în scopul clonării

Electroforeza în gel de agaroză, în cele două forme ale sale, analitică și preparativă, reprezintă modul standard de separare, purificare și identificare a fragmentelor de ADN obținute.

Materiale și echipamente

-Agaroză

-Tampon de electroforeză TAE (Tris-acetat-EDTA)

-Tampon de incarcare

-Bromură de etidiu

-Tanc electroforetic și sursă de curent

-Suport de turnare a gelului

-Pieptene pentru godeuri mari

-Transiluminator

Soluție stoc TAE 10X

-48.5g Tris base

-11.5 mL Acid acetic glacial

-20 mL EDTA 0.5M, pH 8.0

-H2O până la 1 L

Soluția stoc se va dilua de 10 ori înainte de utilizare.

Tampon de încărcare

-25mg albastru de bromfenol

-4g sucroză

– H2O până la 10mL

4.1.Prepararea gelului și electroforeza ADN-ului

1. Se amestecă pulbere de agaroză cu tampon de electroforeză TAE(2% agaroză).

2. Se încălzește la microunde sau pe baie de apă până la dizolvare completă.

3. Se toarnă în formă specială pentru gel.

4. Se fixează pieptenele pentru godeuri, având grijă să nu se formeze bule de aer.

5. Se lasă sa se solidifice gelul la temperatura camerei.

6. După solidificarea gelului se îndepărtează cu grijă pieptenele, fără a rupe gelul.

7. Se plasează gelul împreună cu tăvița de turnare în tancul electroforetic și se adaugă tampon de migrare TAE până când acesta acoperă gelul.

8. Se pregătesc probele care vor conține 2µL ADN, 2µL tampon de încărcare și tampon TE până la 20µL.

9. Se aplică probele în godeuri, fără a înțepa sau a mișca gelul.

10. Se aplică markerul de masă λSty.

11. Se pune capacul tancului electroforetic și se aplică curentul electric.

12. Se urmărește migrarea probelor.

După terminarea migrării, gelul de agaroză se supune colorării cu bromură de etidiu pentru 10-15 minute, apoi se introduce în transiluminator.

Purificarea fragmentelor de ADN din gelul de agaroză se face prin excizarea lor din gel.

1. Se introduce fragmentul de gel într-un tub Eppendorf pre-cântărit.

2. Se determină masa de gel.

3. Se introduce un volum egal cu masa de gel obținută din soluția de dizolvare pentru gel.

4. Se încălzește amestecul pe baie termostatată la 45-55oC până la dizolvarea completă a gelului.

5. Se plasează amestecul într-o coloniță filtrantă și se incubează 1 minut la temperatura camerei.

6. Se pleasează colonița într-un tub de colectare și se centrifughează 1 minut la 10000 rpm. ADN-ul obținut se va lega de membrana filtrantă.

7. Se aruncă lichidul colectat și se adaugă în coloană 700µL soluție de spălare ce conține EtOH.

8. Se centrifughează 1 minut la 10000 rpm și se aruncă lichidul.

9. Se repetă operația de spălare cu 700µL soluție de spălare ce conține EtOH.

10. Se centrifughează 5 minute la 10000 rpm și se aruncă lichidul.

11. Se centrifughează 1 minut la 10000 rpm pentru a se îndepărta urmele de lichid de pe filtrul coloniței.

12. Se adaugă cu grijă 30-50µL apă fără nucleaze în centrul filtrului coloanei.

13. Se eluează ADN-ul prin centrifugare timp de 1 minut la 10000 rpm.

Fragmentul de ADN astfel obținut se va amplifica prin tehnica PCR.

5.Izolarea și amplificarea genei prin tehnica PCR

Tehnica PCR a ușurat mult munca cercetătorilor deoarece permite atât izolarea genei din genomul unei anumite specii, cât și obținerea unui număr mare de copii identice ale genei în vederea carcterizării acesteia. De asemeanea, un mare avantaj al acestei tehnici este că dintr-o cantitate foarte mică de ADN se pot obține un număr mare de gene identice copiate cu înaltă fidelitate.

De asemenea, tehnica PCR este foarte des utilizată în studiul mutagenezei și a efectelor acesteia.

Pentru a selecta o anumită genă este necesară cunoașterea secvenței de nucleotide, necesară pentru proiectarea de primeri (amorse) care se vor lega specific de catena de nucleotide.

Gena de interes în acest caz este CUP1, care în S. cerevisiae codifică o metalotioneină. Aceste proteine conferă celulelor în care există o rezistență mărită la concentrații crescute ale ionilor de cupru și cadmiu. De asemenea, are rol în legarea ionilor de cupru și prezintă și un oarecare efect antioxidant.

Secvența în ADN este:

1 ATGTTCAGCG AATTAATTAA CTTCCAAAAT GAAGGTCATG AGTGCCAATG CCAATGTGGT
61 AGCTGCAAAA ATAATGAACA ATGCCAAAAA TCATGTAGCT GCCCAACGGG GTGTAACAGC
121 GACGACAAAT GCCCCTGCGG TAACAAGTCT GAAGAAACCA AGAAGTCATG CTGCTCTGGG
181 AAATGA

Structura primară a metalotioneinei este următoarea:

1 MFSELINFQN EGHECQCQCG SCKNNEQCQK SCSCPTGCNS DDKCPCGNKS EETKKSCCSG
61 K*

Materiale și echipamente

-PCR termocycler

-Tuburi pentru PCR

-Micropipete

-ADN genomic

-Taq polimerază, termostabilă

-Mix de Nucleotid-trifosfați

-Primeri

-Ioni de Mg2+

-Tampon cu pH optim pentru funcționarea enzimei

1. Amestecarea volumelor se va face pe gheață pentru a evita începerea reacției de polimerizare.

2. Pentru o reacție PCR se amestecă într-un tub pentru PCR:

-Tampon de amplificare 5X – 4µL

-Soluție de nucleozid-trifosfați 20mM, pH 8 – 1µL

-Primer direct (forward) 20µM – 1µL

-Primer invers (reverse) 20µM – 1µL

-Taq polimerază 0,5 µL

-Apă fără nucleaze 12,5 μL

3. Se introduc tuburile de PCR în termocycler și se alege programul de lucru. Acesta depinde de mărimea fragmentului care trebuie amplificat și de temperatura de topire a primerilor.

4. Se denaturează ADN-ul la 94-95oC pentru a transforma duplexul de ADN în monocatene.

5. Se scade temperatura la 50-55oC pentru a permite primerilor să se lege specific de monocatenele complementare.

6. Polimeraza identifică fragmentele annelate și le utilizează ca primeri pentru a transforma fragmentele monocatenare în duplexuri.

7. Prin creșterea temperaturii la 70-72oC se activează Taq-polimeraza și începe secvența de elongare a ADN-ului. Timpul de elongare este stabilit în funcție de lungimea fragmentului, luându-se ca reper valoarea de 1000bps/1minut.

8. Odată format duplexul de ADN, temperatura este din nou crescută și reacția de polimerizare este stopată.

9. Se repetă denaturarea ADN-ului și pașii următori de 25-30 de ori, pentru a obține un număr suficient de mare de copii, dar și pentru a păstra fidelitatea secvenței inițiale. Un număr mai mare de cicluri poate duce la apariția de erori.

10. ADN-ul astfel obținut se păstrează la -20oC.

Din proba de ADN obținută se utilizează 2µL pentru a verifica existența fragmentului de ADN amplificat prin electroforeză analitică în gel de agaroză.

6.Ligarea fragmentului de ADN într-un plasmid

Pentru a putea exprima gena într-un organism aceasta trebuie introdusă într-un plasmid care se replică independent de ADN-ul genomic. De obicei, pentru acest proces se folosesc celule competente care au proprietatea de a îngloba ADN străin din alte surse, mai ales dacă îi aduce un beneficiu, ajutând celula respectivă să reziste anumitor condiții impuse de mediu.

În cazul de față s-a utilizat un plasmid TOPO care conține pe lângă gena de rezistență la ampicilină necesară selectării culturilor pozitive de E.coli, o genă necesară selectării culturilor pozitive de S.cerevisiae (gena necesară creșterii pe medii fără uracil) și secvența necesară legării GFP de proteina CUP1.

Ligarea fragmentului de vector se va face datorită Adenine-overhangs, lăsate de polimerază în urmă procesării acestuia prin PCR.

Ligarea ADN-ului se face prin adăugarea într-un tub steril de centrifugă a următoarelor volume de substanțe:

-Vector TOPO 2µL

-Fragment de ADN 7µL

-Tampon de ligare rapidă X2 10 µL

-Ligază ADN T4 1µL

Amestecul de reacție se incubează la temperatura camerei timp de 5 minute pentru ligarea capetelor coezive sau 15 minute pentru ligarea fragmentelor cu capete drepte.

7.Prepararea celulelor competente de Escherichia coli

E.coli este un vector bacterian extrem de versatil și de aceea este foarte mult utilizat în experimentele de biologie moleculară.

Abilitatea bacteriilor de a îngloba ADN străin se numește competență și este de multe ori reglată de prezența sau absența unor nutrienți din mediul pe care cresc aceste bacterii.

Materiale și echipamente

-Mediu LB lichid

-Mediu LB/Agar

-Soluție Tfb1

-Soluție Tfb2

-Plăci Petri

-Tuburi mari

-tuburi de centrifugă

-celule de E. coli (DH5α)

Mediu LB (Luria Bertani) 100 mL

-Extract de drojdie 0.5 g

-NaCl 0.5 g

-Peptonă 1 g

-Pentru mediile solide se adaugă 1.5 g agar

Se ajustează pH-ul la 7-7.2 cu NaOH 1M și se aduce la 100mL cu apă deionizată.

Mod de lucru

1. Se inoculează o placă Petri cu mediu LB/agar cu celule E. Coli și se incubează peste noapte la 37oC.

2. Se prepară și se sterilizează mediu LB lichid.

3. Se inoculează mediul LB lichid cu celule de E. coli proaspete și se incubează cu agitare peste noapte.

4. Se țin celulele pe gheață timp de 5 minute.

5. Se centrifughează tuburile cu celule la 4oC la 3000 rpm timp de 5 minute.

6. Se resuspendă celulele în 100 µL Tfb1.

7. Se centrifughează tuburile cu celule la 4oC la 3000 rpm timp de 5 minute.

8. Se resuspendă celulele în 40µL Tfb2.

9. Se porționează celulele în tuburi, câte 50µl în fiecare tub.

10. Se păstrează tuburile la -80OC.

8.Transformarea celulelor competente de E.coli

Transformarea este procesul de porare a membranei celulare, astfel încât celula de E.coli să absoarbă ADN străin, în acest caz, ADN-ul plasmidial.

1. Din celulele competente obținute anterior se utilizează 20µL peste care se adaugă 2µL amestec de ligare.

2. Tuburile cu celule se țin 30 de minute pe gheață la 0oC.

3. Celulele se introduc pentru 1 minut în baia de apă la 42oC ( suferă șoc termic)

4. Se adaugă 100µL mediu S.O.C.( mediu LB îmbogățit cu vitamine)

5. Celulele se distribuie uniform pe plăci Petri ce conțin mediu solid LB-Agar și 20µg/mL ampicilină.

6. Se incubează peste noapte la 37oC.

7. Se selectează coloniile pozitive.

9.Tăierea cu enzime de restricție

Acest procedeu este utilizat pentru a cliva un fragment de ADN dintr-un plasmid, cu scopul de a-l introduce în alt plasmid sau de a-l purifica.

Materiale și metode

-Tuburi Eppendorf

-Micropipete automate

-Incubator

-Apă fără nucleaze

-Tampon enzimă (10X)

– Enzimă de restricție

Mod de lucru

1. Într-un tub Eppendorf se amestecă:

– 12L H2O fără nucleaze

-5 μL tampon de lucru

– 2 μL ADN plasmidial

– 0,5μL enzimă de restricție (EcoRI)

– 0,5μL enzimă de restricție (SalI)

2. Se incubează 2 ore la 37º

3. Se verifică clivarea prin electroforeză în gel de agaroză.

10.Transformarea celulelor de S. cerevisiae

Materiale și metode

-celule de S.cerevisiae

-Amestec de transformare

-Tuburi Eppendorf

-pipete automate

Se pregatesc celule proaspete din liniile care trebuie transformate. Se inoculează pe mediul solid YPD celule din liniile BY4741 și se incubează la 280C timp de 2 zile.

Se prepară 500μL amestec de transformare:

100L Acetat de Litiu 2M (proaspat preparat sau păstrat la 40C)

400 L PEG 50% (polietilen glicol M=3350)

3.85 L 2-mercaptoetanol (>98%)

1. În 100L amestec de transformare se introduc 5L ADN plasmidial.

2. Amestecul obținut se vortexează ușor.

3. În acesta se suspendă cu bețișorul o colonie de celule din celulele proaspăt crescute pe mediu solid.

4. Se vortexează apoi se incubează 60 min la 370C pe baie de apă.

5. După expirarea timpului se centrifughează 5min la 3000 rpm, la temperatura camerei. Se aruncă supernatantul.

6. Precipitatul se resuspendă în 100L apă sterilă și se etalează pe mediu SD-Ura îmbunătățit cu adenină și vitamine cu ajutorul unei spatule Drigalski.

7. Se incubează la 280C timp de 2 zile.[24]

Rezultate

În acest studiu am efectuat marcarea la capătul N-terminal al proteinei fungice Cup1 cu myrGFP. myrGFP prezintă la capătul N-terminal o secvență de miristoilare, care permite acilarea cu o grupare miristoil, proces care determină ancorarea myrGFP de fața internă a membranei plasmatice.[25]

Acest lucru este posibil utilizând plasmidul pGREG596 (achiziționat de la EUROSCARF, www.euroscarf.de) a cărei hartă este prezentă mai jos.

Figura 9: Plasmidul pGREG596[26]

Secvența genei recombinante myrGFP este prezentată mai jos (Fig. 10) alături de secvența aminoacizilor codificați. Se observă că în acest plasmid, gena GFP are intodusă o secvență artificială ce conține 4 situduri de restricție, utilizate în clonarea in farme a genei CUP1

myrGFP

10 20 30 40 50 60 70 80 90

| | | | | | | | |

ATGGGGTGTACAGTGAGTACGCAAACAATAAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGC 100

M G C T V S T Q T I S K G E E L F T G V V P I L V E L D G D V N G H

ACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCC 200

K F S V S G E G E G D A T Y G K L T L K F I C T T G K L P V P W P

AACACTTGTCACTACTTTCACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGT 300

T L V T T F T Y G V Q C F S R Y P D H M K Q H D F F K S A M P E G

TATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGT 400

Y V Q E R T I F F K D D G N Y K T R A E V K F E G D T L V N R I E L

TAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAA 500

K G I D F K E D G N I L G H K L E Y N Y N S H N V Y I M A D K Q K

GAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGC

N G I K V N F K I R H N I E D G S V Q L A D H Y Q Q N T P I G D G

CCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAA

P V L L P D N H Y L S T Q S A L S K D P N E K R D H M V L L E F V T

CAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGTCATATGGATCCGCTGCACGGTCCTG

A A G I T H G M D E L Y K N S I S S L S I P S T S Y G S A A R S C

TTCCCTAGCATGTACGTGAGCGTATTTCCTT

S L A C T * A Y F L

MGCTVSTQTI: Myristoylation sequence

GAATTC: EcoRI site; AAGCTT: HindIII site; GTCGAC: SalI site; GGATCC: BamHI site

Figura 10: Secvența genei myrGFP din plasmidul pGREG 596.

Pentru fuzionarea genei myrGFP cu gena CUP1 s-au urmat următoarele etape

Izolarea ADN genomic

Amplificarea genei CUP1 prin PCR

Ligarea genei CUP1 în vectorul pGREG596 și obținerea plasmidului pGREG596-CUP1

Amplificarea, izolarea și verificarea plasmidului pGREG596-CUP1.

Transformarea celulelor de S. creveisiae cu plasmidul pGREG596-CUP1.

Observarea microscopică a celulelor transformate. Dacă plasmidul este corect, proteina recombinantă myrGFP-Cup1 va apărea ca un halou fluorescent la nivelul membranei plasmatice.

Izolarea ADN din celule de S. cerevisiae

Din 5 mL cultură de celule (linia BY4741) aflate în faza exponențială de creștere (107 celule/mL) am obținut 30 L soluție ADN genomic cu o concentrație de 8 g/mL (A260 = 0.1518, determinată cu un spectrometru UV-vis Shimadzu, model 240Mini).

Amplificarea CUP1 prin PCR

Primerii folosiți pentru amplificarea genei CUP1 au fost:

CUP1_F1: CGGAATTCGTTCAGCGAATTAATTAACTTC (primer direct)

CUP1_R1: ATGTCGACTCATTTCCCAGAGCAGCATGAC (primer invers)

Primerul direct introduce situsul de restricție pentru EcoRI (galben) și primele baze ale genei CUP1 după codonul START. Primerul invers introduce situsul SalI (albastru) și codonul STOP plus ultimii codoni ai genei CUP1.

În Fig. 11 este prezentată electroforegrama ampliconului CUP1. Fragmentul ADN este foarte mic (aproximativ 300pb) motiv pentru care se suprapune cu colorantul folosit la încărcarea probelor în godeuri (albastru de brom fenol).

Figura 11: Analiza ampliconilor obținuți în urma reacției PCR s-a efectuat pe un gel de agaroză 2%. Fragmentele de ADN au fost colorate cu bromură de etidiu și evidențiate cu ajutorul unui trans-iluminator prin expunere la radiații UV ( = 325 nm). Imaginea a fost preluată cu un sistem de documentare a gelurilor Vilber Lourmat. Godeurile 1-2: amplificare pozitivă; godeurile 3-4: amplificare ratată.

Ligarea genei CUP1 în vectorul pGREG596 și obținerea plasmidului pGREG-myrGFP::CUP1

Vectorul pGREG596 și ampliconul CUP1 purificat au fost supuși clivării cu enzimele de restricție EcoRI și SalI. Fragmentele au fost purificate prin metoda exciziei în gel și, amestecate și ligate cu ajutorul enzimei ADN-ligaza (izolată din bacteriofagul T4, promega). Amestecul de ligare a fost utilizat pentru transformarea celulelor competente de Escherichia coli. Celulele transformate cu plasmid devin rezistente la ampicilină.

Amplificarea, izolarea și verificarea plasmidului pGREG-myrGFP::CUP1

În urma transformării Escherichia coli cu amestecul de ligare au fost obținute 34 colonii rezistente la ampicilină. Din acestea au fost selectate aleatoriu 16 colonii care au fost însămânțate în mediu cu ampicilină și crescute cu agitare (200 rpm) la 37°C până la densitatea de 109 celule/mL. Au fost izolate plasmidele din fiecare tip de colonie. Numai 9 plasmide au fost vizibile în gel de agaroză. Acestea au fost tăiate cu EcoRI și SalI și supuse electroforezei în gel de agaroză 2%. În urma analizei gelului s-a constatat că numai unul din plasmidele izolate a generat fragmente la dimensiunile corecte (Fig. 4). Acest plasmid a fost re-amplificat, purificat și utilizat pentru transformarea celulelor de S. cerevisiae.

Figura 12: Analiza plasmidelor izolate din coloniile de E. coli ampicillin positive. Plasmidele au fost tăiate cu enzimele de restricție EcoRI și SalI și supuse electroforezei în gel de agaroză (2%). Fragmentele de ADN au fost colorate cu bromură de etidiu și evidențiate cu ajutorul unui trans-iluminator prin expunere la radiații UV ( = 325 nm). Imaginea a fost preluată cu un sistem de documentare a gelurilor Vilber Lourmat. Numai plasmidul din extremitatea dreaptă a gelului a generat fragmentele de dimensiunile corecte.

Transformarea celulelor de S. creveisiae cu plasmidul pGREG596-myrGFP::CUP1.

S-au obținut colonii numeroase pentru liniile BY4741 transformate cu plasmidul pGREG596-myGFP-CUP1 (Fig. 5)

Figura 13: Colonii de celule de S. cerevisiae transformate cu pGREG-myrGFP-CUP1. Celulele transformate pot crește pe mediu sintetic fără uracil (mediu de selecție).

Observarea microscopică a celulelor transformate.

Celulele transformate cu plasmidul pGREG-myrGFP::CUP1 au gena recombinantă myrGFP::CUP1 sub controlul promotorului GAL1 ceea ce permite ca gena recombinantă să fie exprimată numai când celulele sunt crescute pe mediu cu galactoză. Celulele au fost inițial crescute pe mediu selectiv cu glucoză, după care au fost transferate pe mediu cu galactoză pentru inducerea genei myrGFP::CUP1. Exprimarea genei sub formă de proteină activă (myrGFP-Cup1) a fost verificată prin analiza celulelor prin microscopie de fluorescență (Fig. 14)

S-a constatat că celulele de S. cerevisiae transformate cu pGREG-myr::CUP1 încep să exprime myrGFP::CUP1 foarte repede după ce celulele sunt transferate în mediu cu galactoză Astfel, după un ciclu de diviziune (aprox. 2 h) proteina recombinantă este produsă masiv, ea putând fi vizualizată prin microscopie de fluorescență. Se observă localizarea myrGFP-Cup1p la nivelul membrane plasmatice, dar și pe fața citosolică a vacuolelor. De asemenea, se observă apariție endozomilor (Figura 14).

Figura 14: Imagini microscopice ale celulelor de S. cerevisiae care supraexprimă myrGFP::CUP1. Celulele au fost vizualizate cu un microscop de fluorescență Leica DM 1000 (Wetzlar, Germany) dotat cu lampă de mercur HBO-100 și o cameră Leica DFC 295. Pentru înregistrarea semnalelor GFP s-a utilizat un set de filtre pentru GFP (filtru de excitare BP 470/40, oglindă dicromatică 500 și filtru de supresie BP 525/50).

Bibliografie

1.Tsien R.Y., The Green Fluorescent Protein, 1998, Annual Review of Biochemistry

2.https://mcdb-webarchive.mcdb.ucsb.edu/sears/biochemistry/presentations/f07-student-presentations/Tom-Dutra/frames1.htm

3. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/jellyfishfps.html

4.http://www.intechopen.com/books/biosensors-for-health-environment-and-biosecurity/mammalian-based-bioreporter-targets-protein-expression-for-bioluminescent-and-fluorescent-detection-

5. The Nobel Prize in Chemistry 2008 – Advanced Information",  2014, Nobelprize.org. Nobel Media AB

6. Remington J.S., Green fluorescent protein: A perspective, 2011, The Protein Society

7. Tsien R.Y., Constructing and Exploiting The Fluorescent Protein Paintbox – Nobel Lecture, 2009, The Nobel Prizes 2008, [Nobel Foundation]

8. Zimmer M., Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related

Photophysical Behavior, 2002, Chemical Reviews

9. Olenych S. G., Claxton N. S., Ottenberg G. K. and Davidson M. W., The Fluorescent Protein Color Palette, 2007, Current Protocols in Cell Biology

10. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y., Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein, 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

11. Matz M. V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A., Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species, 1999, Nature Biotechnology

12. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P.,Kaiser C.A., Krieger M., Scott M.P., Darnell J.,Molecular Cell Biology 5th edition, 2003 New York, W. H. Freeman

13. Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry 4th edition, 2004, W. H. Freeman

14.http://www.scienceinschool.org/sites/default/files/articleContentImages/18/uracil/issue18uracil8_l.jpg

15. http://csls-text3.c.u-tokyo.ac.jp/large_fig/fig06_13.html

16.Garrett R.H., Grisham C.M., Biochemistry 5th edition, 2012, Cengage Learning

17. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M.,  Roberts K., Walter P., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, 2002, Garland Science

18. Brown T.A., Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th Edition, 2012, Wiley-Blackwell

19. Bartlett, J.M.S., Stirling D., A Short History of the Polymerase Chain Reaction, 2003, PCR Protocols

20. Garibyan L., Avashia N.,Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction(PCR), 2013, The journal of investigative dermatology

21. Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Chang S.Y., Landre P.A., Abramson R.D., Gelfand D.H., High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase, 1993, PCR methods and applications

22. Pingoud A., Alves J., Geiger R., Enzymes of Molecular Biology, Methods of Molecular Biology, 1993, Humana Press

23. https://en.wikipedia.org/wiki/File:EcoRV_Restriction_Site.rsh.svg

24, David C.B., Jeffrey N. S., Cold S, Methods in yeast genetics, 2005,Harbour Laboratory Press

25.Gillen K.M., Pausch M., Dohlman H.G. N-terminal domain of Gpa1 (G protein alpha) subunit) is sufficient for plasma membrane targeting in yeast Saccharomyces cerevisiae, 1998, Journal of Cell Science

26. http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/pGREG.html