Lucrarea practica nr 3 [311746]

Lucrarea practica nr 3

Mitoza. Indicele mitotic

3.1. Diviziunea mitotică

Creșterea organismelor și transmiterea caracterelor ereditare de-a [anonimizat] o caracteristică fundamentală a [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat].

Mitoza este doar ultima etapă a unui proces mai amplu care este reproducerea celulară. [anonimizat], ioni și alte substanțe necesare pentru sinteza micromoleculelor (cele cu greutate moleculară mică) din diferite clase de substanțe. [anonimizat] ([anonimizat]), iar în final se produce replicarea (dublarea) ADN-ului, [anonimizat] (Benga ).

Reproducerea celulară implică evenimente multiple și complexe ce se succed ciclic alcătuind ciclul celular.

Ciclul celular mitotic este format din două etape distincte. [anonimizat]:

[anonimizat] 2 [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat] (sau nucleolii) [anonimizat]. Interfaza ocupă cea mai mare parte a ciclului celular (aprox 90%) și este formată din trei etapă distincte:

– perioada G1 (gap=discontinuitate, referitor la discontinuitate în sinteza ADN. Din engleză), [anonimizat], prin intensificarea transcripției și a [anonimizat], care au rol important în creșterea celulară (Lodish, 2000). [anonimizat] (NOR), [anonimizat], [anonimizat] (intra și inter), [anonimizat] a celulei. [anonimizat]: [anonimizat], reprezentați la plante de fitohormoni (G1a), faza de intrare în etapa G1 (G1b), [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] (G1c) [anonimizat] a secvenței de AND pe baza numeroaselor fragmente rezultate în urma sintezelor specifice (G1d).

Duratele diferite ale ciclului celular la diferite tipuri de celule se datorează perioadelor G1 diferite, astfel că există cicluri celulare foarte scurte de 14-16 ore sau foarte lungi, de până la câțiva ani. Există și posibilitatea ca celulele să părăsească ciclul celular din G1 și să treacă în stadiul G0, care este un stadiu de latență celulară, caracteristic speciilor care vernalizează, dar și majorității celulelor mamiferelor, unde pot rămâne timp nedefinit și de unde se pot întoarce în ciclul celular, direct în perioada S, dacă sunt îndeplinite anumite condiții necesare (Benga, 2005).

ADN-ul în perioada G1 într-o celulă diploidă eucariotă este 2n, ceea ce înseamnă că există câte două seturi de cromosomi prezenți în celulă. În această etapă, materialul genetic se prezintă sub formă de cromatină, dar dacă ar fi condensat, fiecare cromosom este monocromatidic.

– perioada S de sinteză și dublare a cantității de ADN (Nelson și colab, 2002) este caracterizată prin replicarea ADN-ului nuclear, astfel încât la sfârșitul acesteia cantitatea de ADN se dublează. Cromosomii devin bicromatidici, prezentând două cromatide surori identice. Celula previne apatiția a mai mult de o replicare prin activarea, în perioada G1, a unor complexe pre-replicare la nivelul ADN-ului, care sunt dezactivate în perioada S, când începe replicarea (Bell and Dutta, 2002). Viteza de sinteză a ADN-ului este de până la 100 nucleotide/secundă și trebuie realizată cu o acuratețe de cel mult o mutație punctiformă (o bază azotată) la 109 nucleotide. Simultan cu replicarea ADN-ului are loc și sinteza proteinelor histone și non-histone.

– perioada G2, este perioada numită postsintetică, în care transcripția și sinteza proteică au aceeași intensitate ca în G1, asigurându-se condițiile intrării celulei în mitoza propriu-zisă. Cromosomii bicromatidici prezintă un grad redus de condensare, nucleolul are mărimea maximă, iar volumul nuclear și celular se dublează. Este o fază, ce lipsește în unele cicluri celulare, cum e cazul embrionilor de Xenopus (Sha, 2002) sau al celulelor cancerigene (Taylor and Stark, 2001), celulele intrând direct din faza S în profaza mitozei.

Profaza.  Cromosomii se delimitează tot mai clar. Cromatidele devin (spre sfârșit) vizibile. Centromerul apare în poziția caracteristică fiecărui cromosom divizând-ul transversal în doua brațe (egale sau inegale). Condensarea cromosomilor continuă, paralel cu îngroșarea lor. Spre sfârșitul profazei, nucleolii dispar. La plante, formarea fusului de diviziune începe de la polii celulei, de la centrii de organizare a microtubulilor în sens centripet, prin asamblarea de microtubuli

Prometafaza se caracterizează prin pătrunderea fibrelor fusului de diviziune prin învelișul nuclear pe care-l fragmentează. Cromosomii bicromatidici oscilează în planuri diferite printre fibrele fusului de diviziune. La nivelul fiecărei cromatide, în zona centromerului, se formează complexe proteice specializate, numite kinetochori, ce permit atașarea acestora la fibrele kinetochorale ale fusului de diviziune.

Metafaza. Cromatina atinge gradul de condensare maxim și se colorează intens. Cromosomii sunt cel mai bine evidențiați, fiind îngroșați și scurți cu cromatidele surori situate alăturat într-o dispoziție paralelă. Cromosomii bicromatidici se atașează cu ajutorul centromerilor la fibrele fusului de diviziune, în placa ecuatorială a celulei. La sfârșitul metafazei începe reduplicarea centromerilor.

Anafaza. La începutul acestei faze se desăvârșește reduplicarea centromerilor. Are loc clivarea longitudinală a centromerilor însoțită de inițierea separării cromatidelor surori. Cromosomii monocromatidici migrează spre polii opuși ai celulei, cu ajutorul mișcărilor contractile ale fibrelor fusului de diviziune, cu o viteză de aproximativ 1μm pe minut.

Anatelofaza – cromosomii monocromatidici ajunși în zona polilor celulei apar înconjurați individual de o membrană dublă la formarea căreia participă veziculele golgiene, profiluri ale reticulului endoplasmatic și resturi ale vechiului înveliș nuclear

Telofaza. Cromosomii ajunși la polii fusului de diviziune se ating în unul sau mai multe puncte. Membranele cromosomilor se unesc formând noul înveliș nuclear. Cromosomii se decondensează. La începutul telofazei au aspectul unor fibre subțiri, alungite și încolăcite. La sfârșitul acestei faze cromatina își reia aspectul caracteristic interfazei (eucromatină și heterocromatină). La nivel nuclear reîncepe sinteza ARN. Fibrele fusului de diviziune se dezorganizează. Se reface nucleolul.

Citochineza sau citodiereza

Semnifica diviziunea citoplasmei si se realizează prin clivare.

La plante, încă de la sfârșitul anafazei, în placa metafazică începe formarea fragmoplastului, alcătuit din micro și macro vezicule, ribosomi, dictiosomi și resturi ale vechiului înveliș nuclear. La sfârșitul telofazei, prin unirea veziculelor fragmoplastului rezultă spații lacunare mari, care se unesc formând membrana despărțitoare dintre cele două celule fiice. Procesul are loc în sens centrifug.

La animale, diviziunea citoplasmei se realizează prin clivare. Locul de clivare devine vizibil încă din anatelofază sub forma unei adâncituri pe suprafața membranei plasmatice. Aceasta este situată în planul plăcii ecuatoriale, perpendicular pe fusul de diviziune.

Reglarea ciclului celular se realizează prin existența unor puncte de control, adică puncte ce trebuie depășite pentru ca celula să continue ciclul celular. Un prim punct de control este în perioada G1, punctul în care se decide dacă celula continuă ciclul celular sau îl părăsește trecând în stadiul G0. Al doilea punct de control este spre sfârșitul perioadei G1, când „trebuie decis” dacă celula poate începe replicarea ADN-ului. Dacă au fost depistate greșeli rămase de la replicarea ADN-ului din ciclul celular anterior, celula este oprită până se termină corectarea, pentru a nu se amplifica greșeala într-o nouă replicare (Benga, 2005).

Există apoi un punct de control la sfârșitul perioadei S, unde celula „controlează” dacă nu există greșeli în replicarea ADN-ului, „decizându-se” dacă se continuă replicarea sau se oprește, până la corectarea greșelii (Morgan, 2007 ).

Fig.1 Diviziunea mitotică – reprezentare schematică

Fig.2 Diviziunea mitotica la ceapa (Allium cepa)(original Corneanu M.)

O populație de celule crește doar în cazul în care acestea parcurg întregul ciclu celular, și anume trec prin interfază și de divid în mitoză. Multe celule își pierd capacitatea de a se divide sau se divid mult mai rar, odată cu maturizarea lor sau în funcție de tipul de țesut din care fac parte. Alte celule sunt capabile de a parcurge continuu și succesiv mitoze, în special celulele nediferențiate din zonele meristemale ale plantelor (meristeme apicale, caulinare sau radiculare) sau celulele cancerigene (în cazul mamiferelor).

Indicele mitotic este un indice important, utilizat în indicarea procentului de celule aflate în diviziune față de numărul total de celule analizate, dintr-o probă, indicând capacitatea celulelor dintr-un țesut de a se divide.

IM% = Nm x 100/ Nt,

în care:

Nm- numărul total de celule în diviziune

Nt-numărul total de celule observate

De asemenea, indicele mitotic este un factor de pronostic medical foarte important, fiind necesar în predicția supraviețuirii și răspunsului celulelor cancerigene la chimioterapie. Acest parametru își pierde însă mult din valoarea sa predictivă, în cazul populației înaintate în vârstă, la care indicele mitotic este scăzut și în cazul prezenței unei tumori maligne, dacă individul are peste 70 de ani (Baak și colab., 2008).

Pe aceleași considerente se pot calcula:

IP= indicele profazic- numărul de celule în profază, din numărul total de celule;

IP% = NP x 100/ Nt,

unde NP este numărul de celule în profază

IMet= indicele metafazic- numărul de celule în metafază, din numărul total de celule; IMet% = NMet x 100/ Nt,

unde NMet numărul de celule în metafază

IA= indicele anafazic- numărul de celule în anafază, din numărul total de celule;

IA% = NA x 100/ Nt,

unde NA este numărul de celule în anafază

IT= indicele telofazic- numărul de celule în telofază, din numărul total de celule;

IT% = NTel x 100/ Nt,

unde NTel este numărul de celule în telofază

II= indicele interfazic- numărul de celule în interfază, din numărul total de celule;

II% = NI x 100/ Nt,

unde NI este numărul de celule în interfază, rezultat din diferența dintre numărul total de celule și suma numărului de celule aflate în diviziune.

Experimental, se pot schimba proprietățile mediului celular și cuantifica efectul acestora asupra diviziunii celulare (adiția în mediu a unui factor mutagen, simulator sau inhibitor al diviziunilor celulare va schimba procentul de celule în diviziune). Se presupune că alungirea rădăcinilor, respectiv viteza de multiplicare a celulelor meristemale radiculare, depinde, pe lângă necesitățile nutritive ale plantei, de forța, astfel încât într-un spațiu microgravitațional indicele mitotic a crescut față de martorul crescut în laborator (g ≈ 9,78–9,82 m/s²), dar în spațiu vid (g=0) indicele mitotic al meristemelor radiculare din rădăcina principală a fost zero, amplificându-se multiplicarea celulelor meristemale ale rădăcinilor secundare gravitațională (Darbelley și colab., 1989). De asemenea, numărul de celule într-o anumită fază de diviziune este un indicator asupra stării de sănătate sau normalitate a unui țesut. Indicele mitotic al plantelor atinge un prag maxim între orele 7-9 dimineața, de aceea, se recomandă, prelevarea probelor de analizat și fixarea lor în acest interval de timp.

Metoda de lucru:

Se pun la înrădăcinat, în recipiente cu apă de robinet, bulbili de usturoi (Allium sativum L.) sau bulbi de ceapă (Allium cepa L.), iar când rădăcinuțele ating 0,8-1 cm lungime, se prelevează probele care se introduc imediat în fixator Carnoy (acid acetic glacial-alcool etilic absolut 1:3) incubându-se pentru 24 h la 4oC. Experimental, se pot preleva rădăcinuțe la alte ore din zi pentru a determina indicele mitotic diurn.

După 24h probele se trec în alcool etilic 70% și se pot păstra la 4oC până la colorare.

Pentru colorare se poate folosi reactiv Carr () sau reactiv Schiff (), realizându-se, ulterior colorării, preparate squash ce sunt observate la microscopul optic cu obiectivul 40x.

Se examinează 20-25 câmpuri microscopice numărându-se celulele în diviziune (pe faze de diviziune), iar datele obținute se trec într-un tabel conform modelului (tabel 1). Se calculează numărul total de celule din fiecare fază de diviziune (pentru totalul de câmpuri examinate) și se calculează indicele mitotic și indicele per fiecare fază de diviziune, după formulele de mai sus.

Tabel 1

Numărul celulelor aflate în diviziune din numărul total de celule dintr-un preparat microscopic

*Σ Număr total celule în diviziune = Σ NP + Σ NMet + Σ NA + Σ NTel

La final, se poate realiza o histogramă a indicelui mitotic diurn.