Lucrare de licență [624050]

Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” Iași
Facultatea de Fizică

Lucrare de licență

Coordonator științific:
Lect. Dr. Aurelia Apetrei
Absolvent: [anonimizat], 2018

Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” Ia și
Facultatea de Fizică
Specializarea Biofizică

Lucrare de licență
Propriet ăți conductive ale unor membrane lipidice
artificiale dopate cu pori apoși formați de peptide
antimicrobiene model

Coordonator științific:
Lect. Dr. Aurelia Apetrei
Absolve nt:
Nicoleta Iordache

Iași, 2018

1

Cuprins
Motivația alegerii temei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 3
I. Introducere. Fenomene de transport prin canale ionice formate de peptide membranar active .. 5
I. 1. Fenomene de transport ionic la nivelul membranelor cel ulare ………………………….. ………………….. 5
I. 1. a. Transportul pasiv prin membrane biologice ………………………….. ………………………….. ………… 5
I. 1. b. Transportul activ prin membrane biologice ………………………….. ………………………….. ………… 9
I. 1. c. Comportamentul electric al membranelor semipermeabile. Ecuația lui Nernst. ………………. 11
I. 1. d. Comportamentul electric al membranelor permeabile pentru mai multe specii ionice. Ecuația
Goldman. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 15
I. 1. e. Proprietăți structurale și funcționale ale canalelor ionice membranare ………………………….. . 20
I. 2. Activitatea membranară a peptidelor antimicrobiene ………………………….. ………………………….. … 26
I. 2. a. Proprietăți fizico -chimice ale peptidelor membranar active ………………………….. ……………… 27
I. 2. b. Mecanisme de acțiune ale peptidelor antimicrobiene la nivelul membranelor biologice ….. 31
I. 2. c. Proprietăți structurale și funcționale ale peptidei antibiotice alameticina ……………………….. 32
II. MATERIALE, METODE ȘI TEHNICI DE INVESTIGAȚIE ………………………….. ………………… 37
II. 1. Materiale utilizate în cadrul studiului ………………………….. ………………………….. …………………….. 37
II. 2. Tehnica Montal și Müeller de realizare a bistraturilor lipidice planare ………………………….. ……. 37
II. 3. Dispozitivul experimental utilizat pentru înregistrarea curenților ionic i mediați de canalele de
alameticină ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 40
II. 4. Investigarea fluctuațiilor de curent electric mediat de nanopori proteici inserați în biomembrane
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 41
II. 5. Metoda noise analysis de analiză a proprietăților cinetice și de transport ale canalelor ionice … 42
III. REZULTATE EXPERIMENTALE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ……. 49

2

III. 1. Înregistrarea și analiza microscopică a fluctuațiilor de curent ionic mediat de canalele de
alameticină. Determinarea conductanței porilor de alameticină la nivel unimolecular. ………………………….. …. 49
III. 2. Analiza macroscopică a fluctuațiilor de curent ionic prin oligomerii transmembranari de
alameticină. Determinarea proprietăților cinetice și de transport ale canalelor de alameticină folosind metoda
”noise analysis ” ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 55
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 57
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 59

3
Motivația alegerii temei

De-a lungul timpului membrana cel ulară a dovedit o adaptare impecabilă în natură și a
contribuit la dezvoltarea funcțiilor celulare. Rolul membranei celulare în cadrul transportului de
substanță este indispensabil vieții umane iar modul în care celulele funcționează a revoluționat mai
mereu știința .
Transportul de substanță este o caracteristică esențială iar modul în care acesta are loc, cu
ajutorul canalelor ionice, al pompelor sau nu , face să devină mai special și cu atât mai diversificat.
Canalele ionice sau porii sunt la bază proteine specializate în transportul de substanță, acestea prezintă
structuri și funcții diferite, una dintre ele fiind cea de închidere și deschidere stochastică a canalului
ionic în procesul de difuzie.
Canalele ionice joacă un rol fundamental în modul în care c elulele comunică. Ele generează
semnale electrice care fac ca inima să bată, mușchii să se contracte și permit creierului să primească și
să proceseze informații. Această comunicare între celule permite orchestrarea activităților fizice și
mentale la om. M ulte boli rezultă din funcționalitatea incorectă a canalelor ionice.
Canalele ionice formate din peptide antimicrobiene sunt subiect de dezbatere de mulți ani
încoace. Primele indicii ale prezenței peptidelor antimicrobiene au fost în bacterii și ciuperci, fiind
considerate molecule de apărare unice în organismele unicelulare. Peptidele antimicrobiene sunt
peptide scurte cu greutate moleculară mică, majoritatea cationice, conțin reziduuri hidrofobe multiple,
sunt amfipatice și prezintă activitate antimicrob iană cu spectru larg.
Alameticina este o peptidă antimicrobiană ce formează canale voltaj -dependente în membranele
celulare. Peptidele antimicrobiene sunt mici proteine care apar în mod natural și care prezintă o gamă
largă de activități împotriva bacterii lor și a altor agenți patogeni. Deși au fost raportate unele rezistențe
bacteriene la peptidele antimicrobiene, ele au rămas eficiente în tratarea agenților bacterieni, în ciuda
faptului că acestea se desfășoară pe scară largă în mod natural.
Observațiile făcute de Mueller și Rudin cum că alameticina induce excitabilitatea în
membranele lipidice artificiale au creat un interes major în studierea interacțiunilor alameticină – lipide.
Structura sa, determinată acum 20 de ani de către Fox și Richards prin cris talografie de radiații X, este
de alfa -helix. Spre deosebire de alte peptide antimicrobiene, alameticina conține foarte multe reziduuri

4
hidrofobe . Canalele de alameticină sunt formate dintr -un pachet de monomeri elicoidali ce formează un
por transmembranar apos prin care ionii vor difuza.
Experimentele în care alameticina este introdusă drept mijloc de realizare a difuziei prin
canalele ionice sunt din ce în ce mai diversificate iar modul în care acestea se realizează poate fi din ce
în ce mai co mplicat .
Sunt multe lucruri pe care am dori să le cunoaștem în general despre canalele ionice,
selectivitatea lor, probabilitatea relativă de deschidere, forma relației curent -tensiune, și care pot fi
găsite fără a considera analiza single -channel. Dacă includem an aliza fluctuațiilor de curent electric am
putea spune că înregistrarea canalelor individuale este inutilă. Printre primele experimente era
interesant să observăm evenimente cu un singur canal ionic pentru a ne asigura că curenții erau de fapt
impulsuri rec tangulare de curent, cu o amplitudine bine definită și durate aleatorii. Acum știm asta și ne
așteptăm la un astfel de comportament general al oricărui curent ionic mediat de canalele ionice.
De-a lungul timpului au fost studiate proprietățile de conductiv itate ale membranelor lipidice
artificiale inserate cu canale ionice de alameticină . Cea mai interesantă caracteristică, privind
conductanța membranelor lipidice ce conțin alameticină, fiind puternica dependență față de tensiune.
Studiile privind fluctuați ile unui singur canal ionic au identificat că această dependență de tensiune este
asemănată cu probabilitatea de a părăsi starea închis, pe când probabilitățile de tranziție între diversele
stări conductive sunt relativ puțin afectate de tensiune. ( Eisenbe rg et al. 1973; Boheim, 1974; Gordon
& Haydon, 1975)

5
I. Introducere. Fenomene de transport prin canale ionice formate de peptide membranar
active
I. 1. Fenomene de transport ionic la nivelul membranelor celulare

Fenomenul de transport este esențial pent ru lumea vie deoarece fiecare celulă trebuie să
schimbe materie cu mediul înconjurător. Celulele trebuie să prezinte modalități de introducere a
nutrienților și de evacuare a produșilor toxici. Toate celule mențin un gradient de concentrație pentru
particu lele care străbat membranele celulare, astfel încât celule prin natura lor dețin o cantitate mare de
energie potențială sub forma acestor gradienți de concentrație.
Cu toate că natura a fost cea care a găsit în cele din urmă o metodă prin care celulele să posede
abilități favorabile ale transferului transmembranar, din punct de vedere energetic sunt câteva dificultăți
de care trebuie totuși ținut cont. Diferența mare de permeabilitate electrică relativă, energia proprie a
ionilor și a moleculelor polare fi ind mult mai mare în miezul hidrofob al membranelor decât în mediul
apos, extracelular sau intracelular, duc la implicarea unui consum extern de energie pentru transportul
unui asemenea sistem de ioni sau molecule.
Prezența interacțiunilor electrostatice î ntre moleculele dipolare și ioni sau moleculele polare de
apă conduce la formarea unei sfere de hidratare în jurul acestora, în soluții apoase. Difuzia sistemelor
ionice hidratate prin miezul hidrofob al membranelor va presupune dehidratarea lor, acest ti p de proces
nu este favorabil energetic din cauza lipsei de interacțiuni electrostatice compensatoare energetic între
ioni sau moleculele polare și regiunile hidrocarbonate ale lipidelor în procesul de transport
transmembranar.

I. 1. a. Transportul pasiv prin membrane biologice

În cazul particulelor mici, cum sunt ionii, atomii, moleculele de apă, etc, transportul de
substanță are loc cu păstrarea integrității biomembranei prin transport pasiv si transport activ.
Transportul pasiv care se realizează dator ită gradientului electrochimic, fără consum de
energie.În cadrul acestui tip de transport întâlnim doua clase de proteine distincte implicate în
desfășurarea sa:

6
a) cărăuși: care interacționează stereospecific cu molecula transportată, iar
proprietățile cinet ice sunt asemănătoare cu ale unui proces enzimatic;
b) canale ionice: sunt formate din structuri de tip “α helix” sau “β sheet”, facilitând
transportul ionic cu rate foarte mari, apropiate de cele ale difuziei libere în apă, nu prezintă
caracter de stereospec ificitate și, în general, fluxul mediat nu este saturabil de concentrații mari
de ioni transportați.

Difuzia simplă este cel mai simplu proces de transport. În cadrul difuziei simple specia
moleculară care este transportată prin membrană este dizolvată și aceasta va fi transportată din regiunea
cu concentrație mai mică către regiunea cu concentrație mai ridicată, până când compartimentele au
concentrațiile egale.
Solubilitatea unei substanțe fiind diferită în mediul apos și în membrană, rezultă că difuzi a
simplă depinde de coeficientul de permeabilitate al membranei dar și de caracteristicile particulei, adică
de coeficientul de partiție.
Coeficientul de partiție măsoară afinitatea relativă a moleculei pentru mediul lipidic în raport cu
apa sau ilustreaz ă gradul de hidrofobicitate al moleculei. Dacă valoarea acestui coeficient este mai
mare , atunci molecula va pătrunde mai repede în membrană. Trebuie menționat faptul că dacă
molecula nu este încărcată electric, prezența unui gradient de concentrație trans membranar determină
un flux net diferit de zero prin membrana lipidică.
Difuzia simplă se desfășoară conform primei legi ale lui Fick atunci când există un gradient de
concentrație pe cele doua fețe ale membranei:

(1)
Relația de mai sus exprimă viteza de difuzie ce este direct proporțională cu diferența de
concentrație, suprafața S și coeficientul de permeabilitate al membranei.
Dacă specia moleculară transportată are sarcina netă, mișcarea ei va fi influienț ată atât de
gradientul de concentrație cât și de potențialul de membrană. Potențialul de membrană produce o forță
) (1 2C CSPdtdn

7
ce se va opune mișcării ionilor iar acesta va scădea pe măsură ce ionii traversează membrana până când
se vor egala concentrațiile din cele do uă compartimente.
Gradientul de concentr ație și potențialul de membrană formează gradient ul electrochimic sau
potențial ul electrochimic.

Figura I. 1. Mișcarea particulelor printr -o membrană permeabilă. a) Mișcarea unor particule fără sarcină electrică
de la concentrație ridicată (C1) către concentrație mai mică (C2) în virtutea gradientului de concentrație până la stabilirea
echilibrului. b) Mișcarea ionilor sau a particulelor cu sarcină electrică dictată de potențialul electric (Vm) și de diferența de
concentrație de -a lungul membranei. Mișcarea va avea loc până la atingerea valorii zero a potențialului electric. (adaptat din
D.L.Nelson,M.M.Cox,Lehninger Principles of Biochemistry,Fourth Edition,W.H.Freeman,2004).

Difuzia facilitată prin canale permite un transport extrem de rapid prin membrană. Canalele
membranare joacă de aceea un rol extrem de important în procesele de semnalizare celulară, în care
viteza de transmitere a informației este un element critic.
Un canal membranar este o proteină integral ă complexă care formează o cale de trecere pentru
ioni sau molecule mici, insolubile în matricea lipidică a membranei. Canalele pot fi ionice (transportă
ioni) sau moleculare (transportă molecule mici, precum apa).
În general, canalele membranare su nt sel ective: ele prezintă o mare specificitate pentru anumiți
ioni sau molecule, nepermițând altor tipuri de ioni sau molecule să le traverseze. Aminoac izii hidrofobi
ai unei proteine canal se orientează spre regiunea lipidică hidrofobă a membranei, în timp ce
aminoacizii hidrofili ai proteinei se orientează spre interiorul canalului, pentru a putea interacționa cu

8
molecula hidrofilă care traversează membrana prin canal. Există deci în structura canalului o anumită
regiune, numită filtru, care determină propriet ățile selective ale canalului.
Difuzia prin canale și pori presupune existența în membrană a unor canale ionice specializate și
selective , ce permit trecerea ionilor în ambele sensuri, sau a unor pori . Noțiunea de por este folosită
pentru structurile nesel ective. Transportul prin canale are loc în sensul gradientului electrochimic.
Eficacitatea transportului prin canale este foarte mare, astfel încât printr -un canal pot trece 106-
108ioni/s, ceea ce va da naștere la curenți ionici individuali (mediați de un singur canal ionic) de
ordinul 10-12-10-10 amperi.

Figura I. 2. Clasificarea grafică generală a tipurilor de
transport ionic pasiv facilitate de porii apoși transmembranari:
difuzia simplă (A), difuzia facilitată de proteine cărău și (B),
difuzia prin canale ionice (C) și difuzia prin pori (D). (adaptat din
D.L.Nelson,M.M.Cox,Lehninger Principles of
Biochemistry,Fourth Edition,W.H.Freeman,2004).

În concluzie, membrana celulară poate fi traversată prin transport pasiv de molecul ele mici
hidrofobe prin difuzie simplă, de ioni prin canale și difuzie facilitată și de molecule hidrofile mari prin
difuzie facilitată.

9
I. 1. b. Transportul activ prin membrane biologice

În procesele de transport activ primar sunt implicate proteine me mbranare integrale cu
proprietăți enzimatice, care transportă ioni sau molecule împotriva gradientului lor de concentrație, de
potențial ele ctric sau de presiune osmotică . Astfel de proteine se numesc pompe membranare .
Transportul activ primar este posibi l numai prin cuplarea sa energetică cu reacții care furnizează
energie liberă (reacții exergonice); este de aceea un proces consumator de energie. Reacțiile exergonice
care furnizează energia necesară funcționării pompelor membranare sun t în general reacți i metabolice.
Există însă și pompe care utilizează energia luminii. Astfel, se poate face o primă clasificare a
pompelor : pompe ionice activate de lumină și ATP -aze.
Majoritatea pompelor ionice funcționează pe principiul utilizării energiei moleculei de AT P
pentru a transporta anumiți ioni împotriva gradientului electrochimic între cele două fețe ale
membranei; molecula de ATP se leagă la molecula pompei ionice și este hidrolizată la ADP, proces în
care este eliberată o parte din energia chimică a ATP -ului.

Figura I. 3. Reacția de hidroliză a ATP.
Proteina care constituie pompa ionică absoarbe parțial energia furnizată prin hidroliza ATP și
își schimbă conformația. Prin această modificare conformațională, pompa efectuează trecerea
moleculei hidrofile de pe o parte pe alta a membranei.
Energia absorbită de proteină este în final cedată prin relaxarea structurii pompei, care revine la
conformația inițială și ciclul poate fi reluat. Energia care nu este absorbită de pompă este disipată prin
încălzirea locală a mediului apos în care se produce hidroliza ATP.
Procesul de transport activ primar este mecanismul principal prin care sunt menținute
diferențele de concentrații ionice între diferitele co mpartimente celulare, precum între citosol și mediul

10
extracelular . În organism, cel mai important rol în menținerea potențialului de repaus la valoare
constantă îl au pompele de Na+ – K+ care extrag trei ioni de sodiu din celulă și introduc doi ioni de
potasiu din mediul extracelular în celulă pentru fiecare moleculă d e ATP hidrolizată .

Figura I. 4. Figură simplificată a proteinei Na+ -K+ -ATP -aza ce facilitează transportul activ primar împotriva
gradientului electrochimic,al ionilor de potasiu spre mediul intracelular,respectiv a ionilor de sodiu în mediul
extracelu lar.Hidroliza exoenergetică a moleculelor de ATP are loc în mediul intracelular,iar o parte din energia eliberată
este utilizată pentru transferul a 3 ioni de sodiu și a 2 ioni de potasiu pentru fiecare moleculă de ATP hidrolizată.Inhibito rii
specifici int eracționează cu partea extracelulară a acestei proteine inducând diminuarea dramatică a fenomenelor de
transport enunțate.(adaptat din D.L.Nelson,M.M.Cox,Lehninger Principles of Biochemistry,Fourth
Edition,W.H.Freeman,2004).

În procesele de transport acti v secundar sunt implicați transportori complecși, care cuplează doi
gradienți electrochimici diferiți, astfel încât energia eliberată prin mișcarea unor molecule de un anumit
tip în sensul gradientului lor electrochimic este folosită pentru a transporta mo lecule de alt tip
împotriva gradientului lor electrochimic. Astfel de transportori se numesc cotransportori, iar procesul
se numește cotransport sau transport cuplat. Transportul cuplat este de două feluri: simport, în care
ambele tipuri de molecule sunt t ransportate în acel ași sens, și antiport, unde cele două tipuri de
molecule sunt transportate în sensuri opuse.

11

Figura I. 5. Transportorii tip simport și antiport care transportă o moleculă împotriva gradientului de concentrație și
un ion în virtutea gra dientului de concentrație. (adaptat din D.L.Nelson,M.M.Cox,Lehninger Principles of
Biochemistry,Fourth Edition,W.H.Freeman,2004).

I. 1. c. Comportamentul electric al membrane lor semipermeabile. Ecuația lui Nernst .

O membrană semipermeabilă reprezintă un bistrat lipidic care lasă doar anumite particule să
treacă.
Se consideră un recipient ce are în interiorul acestuia o soluție apoasă. El va fi compartimentat
cu ajutorul unei membrane semip ermeabile, rezultând astfel două compartimente de volume egale. În
primul compartiment se va adăuga KCl (clorură de potasiu) . Putem spune că la momentul de timp
inițial ionii de potasiu sunt egali cu ionii de clor. Dacă membrana semipermeabilă prezintă
permeabilitate selectivă doar pentru ionii de potasiu, aceștia vor în cepe să difuzeze de -a lungul
membranei potrivit unui gradient de concentrație.
Acest lucru va conduce la acumularea de sarcină pozitivă în compartimentul din dreapta sau
compartimentul II și de sarcină negativă în compartimentul I.

12

Figura I. 6. Figura si mplificat ă a unui recipient compartimentat de o membrană semipermeabilă pentru ionii de
potasiu în două compartimente de volume egale și concentrații diferite. În primul compartiment se află sarea de K+Cl- , ionii
de potasiu vor difuza prin membrana semipe rmeabilă în virtutea gradientului de concentrație.
După acumularea de sarcini diferite de o parte și alta a membranei, se va stabili o diferență de
potențial de o parte și alta a membranei.
Intensitatea câmpului electric ce apare în membrana semipermeabilă are expresia:
xdxxdVE ˆ)(
(2)
V(x) -funcția care exprimă cantitativ potențialul electric prin membrana semipermeabilă.
Se consideră că potențialul V(x) are componenta nenul ă doar pe axa x.
O forță electrică este cea care va acționa asupra ionilor de -a lungul difuziei lor prin membrana
semipermeabilă la interacțiunea cu câmpul electric pe care l -am scris mai sus. Această forță se opune
fenomenului de difuzie, ionii pozitivi v or difuza însă până când se va atinge o valoare a potențialului
destul de mare pentru ca forța electrică să poată suprima mișcarea ionilor pozitivi între cele două
compartimente, în mod ordonat , în virtutea gradientului de concentrație.
xdxxdVqz EqzFe e ˆ)( 
, (3)

13
unde:
z+-valența ionilor pozitivi difuzanți;
qe-sarcina electrică elementară.
Cunoscând prima lege a lui Fick, vom scrie expresia fluxului de difuzie prin membrana
semipermeabilă:
xcD Jdifuzie
, (4)
unde:
J-fluxul de difuzie;
1 2 s mol JSI
D-coeficient de difuzie;
sm DSI /2
c-concentrația;
3/m mol cSI
(5)

Fluxul total al ionilor prin membrana semipermeabilă va căpăta următoarea formă:
Indicele + din expresia de mai sus ne ajută să ne dăm seama că este vorba de ionii pozitivi din
cadrul difuziei.
C+ este o mărime variabilă cu distanța în zo na de difuzie (C+ = C+(x) în int eriorul membranei
semipermeabile).
După cum știm din cadrul proceselor de difuzie, dacă nu apare o difere nță de potențial între cele
două compartimente înseamnă că s -a atins starea de echilibru a sistemului. În acest caz fluxul total de
difuzie va fi nul.
Vom nota mobilitatea electrica a ionilor difuzanți cu
 Bqz ue și vom folosi relația lui Einstein
pentru valoarea coeficientului de difuzie,
 kTB D . În continuarea vom scrie:
dxdVCBqzdxdCD Je
 

14

(6)

Se va multiplica primul termen din dreapta cu raportul
AA
NN , unde NA este numărul lui Avogadro.
Utilizăm următoarele egalități:
eAA
qNFkNR
 , iar expresia de mai sus va deveni egală cu:

dxdVCudxdC
FzRTu J
  , sau:

 
 
dxdV
dxCd
FzRTCu Jln
(7)
Starea de echilibru în cadrul procesului de difuzie de care discutam mai sus va presupune
anularea valorii fluxului J+, sub acțiunea gradientului de concentrație și a forței de tip electric.

0ln
dxdV
dxCd
FzRT (8)
Vom integra această ultimă relație între cele două compartimente:


II
III
IC
CV
VdV CdFzRTln
, (9)
sau:





. lneq
III
II I V
CC
FzRTVV
(10)
R reprezintă constanta universală a gazului ideal (8,31JKmol-1);
T este temperatura absolută exprimată în Kelvin.
F este constanta lui Faraday exprimată în C/mol.
Expresia de mai sus repre zintă bine cunoscuta ecuație a lui Nernst, ea exprimând diferența de
potențial care apare între compartimentele I și II, în acel moment când starea de echilibru a ionilor
difuzanți a fost atinsă.
dxdVCudxdC
qzkTu J
e
  

15
Diferența de potențial Nernst dedusă pentru o specie ionică difuzantă se mai nu mește
potențialul de echilibru (V eq.+) al ionului difuzant respectiv.
Ion Concentrația intracelular ă (mM) Concentrația extracelular ă(mM)
Na+ 12 145
K+ 155 4
Cl- 4.2 123
Ca2+ 10-4 1-2
Tabel I. 1. Exemple de ioni cu concentrațiile în mediul intracelular și extracelular.

I. 1. d. Comportamentul electric al membranelor permeabile pentru mai multe specii
ionice. Ecuația Goldman.

După cum am observat mai sus, în cazul ecuației lui Nernst, puteam calcula potențialul de
echilibru doar pentru un ion ce străbatea membrana . În mod normal, membrana poate fi traversată la
orice moment de timp nu doar de un singur ion, ci de mai mulți ioni, asta conferind membranei o
proprietate de permeabilitate pentru mai multe specii de particule.
Selectivita tea pentru specii le ionice face ca ionii să aibă o mișcare în virtutea gradientului lor
electrochimic. Mișcarea oricărui ion în virtutea gradientului electrochimic conduce potențialul de
membrană spre potențialul de echilibru al respectivului ion. În acest caz, mișcarea transmembranară
colectivă contribuie în determinarea potențialului de membrană.
La mijlocul secolului 20, Goldman a dedus o ecuație care descrie potențialul de membrană în
funcție de gradienții de concentrație și de proprietățile de permeabi litate ale membranei pentru mai
multi ioni permeanți. Pentru a putea înțelege formalismul în care a lucrat Goldman , vom începe prin a
reduce analiza ecuațiilor de difuzie ionică la o membrană biologică cu proprietăți de
semipermeabilitate. Această membran ă este reprezentată mai jos:

16

Figura I. 7. Reprezentarea simplificată a unei biomembrane semipermeabile de grosime h, ce delimitează mediul
intracelular , de potențial V, de mediul extracelular , de potențial V(h) . În cadrul mediului intracelular specia ion ică n
prezintă o concentrație ionică, notată cu C n(I) iar în mediul extracelular o concentrație C n(E). Potențialul biomembranei,
V(x ), variază liniar.
În reprezentarea grafică de mai sus am notat cu V(x), ca fiind valoarea potențialului electric prin
memb rană și se presupune că acesta variază liniar. V reprezintă potențialul electric pe partea
intracelulară a membranei, iar pe partea extracelulară am ales să notăm potențialul cu V(h), unde h este
grosimea membranei celulare.
Cu Cn(I) și Cn(E) am notat conc entrațiile unei specii ionice n, în domeniul intra și extracelular.
Cn(0) și Cn(h) sunt valorile concentrațiilor speciei ionice n, în imediata vecinătate a suprafețelor de
separație a membranei de mediile externe, respectiv interne. Datorită interacțiunilo r specifice ion –
membrană, aceste concentrații nu sunt riguros identice cu Cn(I) și Cn(E).
Pentru a deduce ecuația lui Goldman, vom începe prin a folosi forma echivalentă a legii a II -a a
lui Fick ce descrie mișcarea colectivă a particulelor difuzante sub a cțiunea unui gradient de
concentrație și a unei forțe externe ce provine dintr -un potențial de forma V(x), care se exercită asupra
tuturor particulelor difuzante. În condițiile în care se observă pentru procesul studiat atinsă starea de
staționaritate privind variația în timp a concentrației ionilor difuzanți , putem integra u rmătoarea relație
ce este o formă echivalentă a ecuației lui K ramer pentru a determina valoarea fluxului de sarcină prin
membrană:

17

h
xvzEvz
nIvz
n
n n
dx eehC e CD J
nn n
0)()( )()( )0(, (11)
unde:
– z reprezintă valența speciei ionice ce difuzează prin membrană;
– D reprezintă coeficientul de difuzie;
– v(I) și v(E) reprezintă valoarea potențialului electric pe partea internă și externă a membranei
celulare.
În această ecuație fo losim potențialul normalizat, v(x):
RTxVFxv)()(
(12)
Putem face acum schimbarea de variabilă la numitorul relației de mai sus și avem:
) 1(
0)(
0)(in n n vz
Inh
xvzh
xvzevzhdvdvdxe dx e  
(13)
În acest caz, vi reprezintă valoarea normalizată a potențialului electric pe partea internă a
membranei.
Putem scrie acum ecuația lui Kramer astfel:
vizvz
n n n
in nnin
ee ChC
hDvz J

1)0( )(
(14)
Valorile concentrațiilor speciei ionice în imediata vecinătate a suprafețelor de separație sunt
date de formulele:

(15)
(16)

αk se numește coeficient de distri buție între faza apoasă și lipidică a specie i ionice n.
)( )()( )0(
EC hCIC C
nk nnk n



18
Introducem aces te ultime egalități în relația (14) :
 in
invz
n n vzi
nn n eECIC
evPz J )( )(
1

(17)
Pn este coeficientul de permeabilitate al speciei ionice n și are următoarea formă:
hDPn n
n
(18)
Permeabilitatea se referă la ușurința cu care fiecare ion traversează membrana și este direct
proporțională cu numărul total de canale deschise pentru o anumită specie ionică.
Raportul permeabilităților ionilor este următorul:
45.0:04.0:1 : :   Cl Na Kp p p

În cazul în care diferența de potențial aplicată din exterior este nulă, rezultă:
))( )(( )(lim1
1lim0
00
ECICP Jevzv
n n n nvvzin
vi
iini
 





După toate aceste schimbări de variabilă, precum și în urma condițiilor impuse, ecuația capătă
forma le gii I a lui Fick.
Dacă gradientul de concentrație este nul, ecuația are forma:
i nn n CvPz J
(19)
Se observă că valoarea fluxului de purtători de sarcină care difuzează prin memb rană va
depinde în mărime absolută nu doar de valoarea diferenței de potențial aplicate din exterior, dar și de
semnul acesteia. Dacă presupunem un caz particular pentru care membrana biologică este permeabilă
pentru ionii de K+, Na+, Cl-, putem scrie urmă toarele ecuații pentru acești ioni ce difuzează prin
membrană:

19

iiiiii
vv
Cl Cl
i Cl Clvv
Na Na
i Na Navv
K K
i K K
eeI C E CvP JeeI C E CvP JeeI C E CvP J

 
  
  
 
1)( )(1)( )(1)( )( (20)
Dacă valorile concentrațiilor din ecuațiile de mai sus sunt exprimate în valori molare, putem
aprecia prin definiție că , acestor fluxuri ionice le corespund următoarele densități de curenți ionici
membranari:
   

Cl ClNa NaK K
FJ IFJ IFJ I
(21)
Iar densitatea de curent electric total mediat prin membrană se poate scrie:
  Cl Na K total I I I I
(22)
În momentul în care densitatea de curent electric atinge o valoare nulă, putem spune că sistemul
analizat a atins starea de staționaritate. Ecuația va avea următoarea formă:

ext Cl Na KCl ext Na ext K
mClp Na p KpClp Na p Kp
zFRTV    
    
  
int intintln
(23)
Desigur că există mai multi ioni în mediul intra sau extracelular, dar ei fie sunt prea slab
permeanți prin membrană fie sunt în concentrații mici. Din acest motiv ne -am limitat a scrie ecuația lui
Goldman doar pentru aceste trei specii de ioni.
R,T,F au aceleași semnificații ca în cazul ecuației lui Nernst.
Expresia de mai sus a fost dedusă de Hodgkin și Katz iar astăzi poartă denumirea de ecuația lui
Goldman -Hodgkin -Katz.

20
I. 1. e. Proprietăți structural e și funcționale ale canalelor ionice membranare

Canalele ionice sunt pori proteici transmembranari care traversează membrana celulară și
permit fluxul ionilor în virtutea gradientului electrochimic. Ele sunt variate și se găsesc în diverse
conformații.
Anterior, am afirmat faptul că prin canalele care transportă ioni apar curenți electrici individuali
ce pot produce schimbări ale diferenței de potențial transmembranar și totodată pot constitui substratul
fizic al comunicării electrice celulare, prin inte rmediul potențialelor de acțiune propagabile.
Canalele ionice sunt prezente în membrana tuturor celulelor și prezintă o serie de proprietăți,
una dintre acestea este proprietatea de selectivitate a canalelor ionice pentru diferiți ioni ce este de
altfel si o condiție apărută din cauza dispunerii asimetrice de ioni de o parte și de alta a membranei.
Canalele ionice trebuie să distingă speciile ionice în cursul proceselor de transfer de substanță
pe care le mediază. Apar astfel câteva caracteristici determina te de această proprietate de
permeabilitate ionică selectivă ce constau în forma topologică a porului apos a proteinei respective dar
și în distribuția sarcinii electrice fixe din interiorul porului. În porul permeant, regiunea unde are loc
selectivitatea energetică a ionilor difuzanți este mai îngustă, comparabilă cu diametrul ionilor
dehidratați, iar restul porului este suficient de voluminos pentru a permite influxul de ioni hidratați.
Să considerăm ca exemplu, canalele de K+ , acestea permițând fluxul i onilor de K+ și excluzând
fluxul de Na+, deși din punct de vedere geometric, ionii de sodiu sunt mai mici decât cei de potasiu.
Un astfel de canal avem reprezentat mai jos:

21

Figura I. 8. Reprezentarea grafică a unui canal de potasiu, în vedere longitudin ală (A) și transversală (B) . Ionii de
potasiu sunt reprezentați de sferele verzi. Cele patru subunități care alcătuiesc porul prezintă un filtru de selectivitate f ormat
de buclele P ale fiecărei subunități.

Mai jos avem reprezentat într -un model mai simpl ist un canal de potasiu . Canalul prezintă
vederea longitudinală a canalului de potasiu, adițional sunt afișa te grupele carbonil care au principalul
rol de a înlătura sfera de hidratare a ionului de potasiu. Oxigenii din grupările carbonil sunt puternic
electronegativi și atrag cationii. Filtrul poate găzdui ionii de potasiu în patru situsuri.

22
Figura I. 9. Reprezentarea detaliată a filtrului unui canal de potasiu împ reună cu grupările carbonil, oxigenii fiind
marcați cu roșu în cadrul filtrului de selecti vitate. În dreapta observăm catenele ce formează filtrul și modul de dispunere a
atomilor de oxigen.

Distribuția de sarcină electrică fixă în interiorul porului reprezintă un parametru important
pentru modularea fluxurilor ionice prin canalele ionice. Ne referim la faptul că prin interacțiuni
favorabile energetic, anumite specii ionice vor conduce la mărirea concentrației lor în interiorul porului
și la suprafețele porului extra sau intracelular. Rezultă în acest caz o mărire a conductanței electrice a
canalului ionic pentru respectiva specie ionică. Acest lucru prezintă și situația opusă pentru interacțiuni
nefavorabile energetic pentru care conductanța electrica a canalului va scădea.
Se poate adăuga în cadrul acestei caracteristici selectivitatea ionică între anioni și cationi.
Există două paradigme prin care se poate explica selecția unor ioni difuzanți în raport cu alții:
1. Selecție sterică, bazată pe considerente geometrice . Cum raza de hidratare a ionului de potasiu
este mai mare decât cea a ionului de sodiu, ionul de potasiu va fi exclus de la difuzia prin canale
de sodiu.
2. Selecție energetică, bazată pe interacțiuni electrostatice de tip ion -dipol, ce are loc în zona
filtrului de selectivitate. Raza de hidratare a ionului de sodiu este mai mică decât a ionul de
potasiu, dar ei sunt excluși de la difuzia prin canalele de potasiu deoarece energia lor de
hidratare este mai mare decât energia de interacțiune cu aminoacizii din filtrul de selectivitate.
Se folosește metoda de trasare a diagramelor curent -tensiune pentru a se putea aprecia cantitativ
această proprietate de selectivitate a canalelor ionice, care caracterizează procesele de transport prin
membrană în cazul în care avem în cele două medii concentrații diferite.
Mai sus am con siderat ca exemplu un canal de potasiu ce prezintă conformație de alfa -helix, în
natură din punct de vedere structural putem găsi canale și sub formă de pături beta, dupa cum urmează:

23

Figura I. 10. Reprezentarea alfa -hemolizinei în vedere transversală (s tânga sus) și vedere longitudinală (dreapta
sus), fiind primul membru identificat din familia porilor toxici în formă de pături beta și este format din 7 unități de
monomeri , fiecare fiind reprezentat aici printr -o culoare diferită .

O altă proprietate imp ortantă a canalelor ionice o reprezintă procesul cinetic de închidere și
deschidere stochastică a porului apos, proprietate care se mai numește gating (deschidere) și se
realizează fizic prin tranzițiile stochastice între conformații conductive și neconduc tive ale canalelor
ionice pentru transportul ionic.
Proprietatea de deschidere a canalelor ionice, ce sunt implicate în conducerea potențialelor de
acțiune, poate fi influiențată în special de diferența de potențial trasmembranar însă poate fi afectată și
de interacțiunea canalului cu molecule extracelulare, mesageri secundari intracelulari, metaboliți,
temperatura, valoarea pH -ului, etc.

24

Figura I. 11. Reprezentarea unui canal de potasiu în stare închisă (A) și în stare deschisă (B), inserat într -o
biomem brană lipidică.

Această proprietate de deschidere este extrem de importantă și trebuie înțeleasă pentru
parcurgerea ulterioară a subiectului. Dacă vom considera o serie de canale ionice de potasiu, activate în
urma depolarizării membranei celulare, a căro r reprezentare experimentală a curentului electric
macroscopic este dată mai jos, vom observa cum variația în timp a acestui curent ionic se supune unei
legi deterministe.
În schimb, dacă se va înregistra curentul ionic mediat doar de un canal ionic din to ată populația
ce se găsește în membrană, se va observa cum proprietățile cinetice ale curenților ionici individuali
sunt cu mult diferite față de cele ale curentului electric macroscopic. Aceste proprietăți cinetice sunt
caracterizate doar în termeni proba bilistici.

25

Figura I. 12. Înregistrare „ patch -clamp’ a curentului ionic de potasiu mediat de canalele ionice de potasiu din
axonul de calmar, după cum rezultă în urma depolarizării mem branare de la –100 la +50 mV.
În panelul (A) sunt pre zentate nouă înregistrări succe sive ale curentului electric de po tasiu de tip „ patch -clamp’ . În
panelul (B) este prezentat re zultatul medierii statistice a înre gistrărilor experimentale din pane lul precedent, ce expri mă
depende nța temporală a curentului electr ic de potasiu așa cum ar fi înregis trată în urma măsurătorilor macro scopice a
curentului ionic de potasiu [Ionic Chan nels of Excitable Membra nes, 1992. Hille, B.]

Se observă cum curentul electric mediat de un singur canal ionic variază abrupt iar dur ata
temporală este o mărime stochastică pentru starea conductoare sau neconductoare a canalului ionic .
Tranzițiile bruște observate în cadrul stării de con ductivitate a unui canal ionic refl ectă proprietatea sa
de deschidere și au cores pondent fizic în o rientările specifice ale unui domeniu proteic definit . Acest
domeniu de aminoacizi își schimbă orientarea conformațională în mod stochastic pentru a putea
permite difuzia aleatoare a ionilor prin canalul ionic.
O diagramă cinetică foarte simplă a unui sing ur canal ionic ce realizează tranziții aleatorii, între
două stări, este reprezentată mai jos:
' '' ' deschis închis


26
Din punct de vedere funcțional există două clase fundamentale de canale ionice:
1. Canale ionice specializate în codarea informației în poten țiale de acțiune și medierea propagării
lor;
2. Canale ionice specializate în detecția și convertirea diferiților stimuli exogeni (lumina,
temperatura, stimuli chimici, etc).
Canalele ionice care sunt implicate în generarea semnalelor electrice propagabile în
membranele excitabile se împart în doua categorii:
a) Canale ionice care sunt cunoscute sub denumirea de ligant -dependente datorită interacțiunilor
lor cu moleculele specifice;
b) Canale ionice cunoscute sub denumirea de voltaj -dependente datorită interacțiunii lor cu un
câmp electric transmembranar.
Canalele voltaj -dependente reprezintă o clasă importantă de proteine membranare integrale ce
pot controla concentrația intra – și extracelulară de ioni în funcție de valoarea potențialului
transmembranar. Cele mai im portante clase de canale ionice voltaj -dependente sunt cele de sodiu,
potasiu și calciu cu un deosebit rol în modularea excitabilității nervilor și mușchilor.
Dacă se modifică diferența de potențial transmembranar, în cazul canalelor voltaj -dependente,
va rezulta o modificare a ratelor de tranziție între stările închis și deschis ale canalelor ionice
individuale. Astfel, curentul ionic va crește după o lege temporală cu caracter determinist,drept rezultat
macroscopic. Altfel zis, modificarea diferenței de potențial conduce la alterarea proprietății de gating.

I. 2. Activitatea membranară a peptidelor antimicrobiene

Petidele antimicrobiene sunt segmente proteice produse de organism pentru a lupta cu patogenii
biologici, cum sunt bacteriile, fungii, virusur ile. Acestea încearcă prin nenumărate căi să invadeze
patogenii, una dintre aceste căi fiind inserarea lor în membrana celulară a patogenului și compromiterea
integrității structurale, ducând la distrugerea celulei străine.

27
Peptidele antimicrobiene au demo nstrat că pot distruge bacteria Gram negativ și Gram pozitiv,
înfășurând virusurile, fungii și chiar transformând sau cancerizând celulele. Tot ele pot avea abilitatea
de a dezvolta imunitatea prin funcționarea lor ca imunomodulatori.
Ca structură, peptide le antimicrobiene sunt unice și sunt grupuri formate din diverse molecule.
Acestea au o structură cuprinsă între 12 -50 de aminoacizi și cuprind două sau mai multe reziduuri
încărcate electric pozitiv. Aceste sarcini pozitive provin de la arginină, lisină s au în mediile acide,
histidină. Peste 50% cuprind reziduri hidrofobe.
Structura lor secundară poate fi de α -helix, pături β, buclă , etc. Multe dintre ele nu au structură
în soluție liberă, ajungând la configurația finală prin divizarea în membranele biolog ice.
Abilitatea de a se asocia cu membranele este o caracteristică a peptidelor antimicrobiene, deși
permeabilitatea membranei nu este necesară. Aceste peptide cuprind o varietate de activități
antimicrobiene variind de la permeabilitatea membranei până la acțiunea asupra unei game de ținte
citoplasmatice.
Modurile de acțiune ale peptidelor antimicrobiene împotriva microbilor sunt variate și diferă de
la specie la specie. Unele peptide antimicrobiene distrug atât bacterii cât și fungi. Membrana fiind ținta
frecventă, dar peptidele antimicrobiene pot interfera și cu ADN -ul, sinteza proteinelor, împachetarea
proteinelor și sinteza peretelui celular.
Un aspect important este efectul rapid de a distruge. Unele peptide antimicrobiene pot distruge
în câteva secund e dupa contactul inițial cu membrana.

I. 2. a. Proprietăți fizico -chimice ale peptidelor membranar active

Un număr de caracteristici fizico -chimice referitoare la sarcină, hidrofobicitate și amfipaticitate
par să fie comune pentru majoritatea peptidelor antimicrobiene. Modificând acești parametrii pentru o
anumită peptidă se va modifica selectivitatea și activitatea antimicrobiană.
Lungimea peptidelor antimicrobiene este importantă pentru activitatea pe care acestea o
desfășoară deoarece cel puțin 7 -8 ami noacizi formează structuri amfipatice cu fețe hidrofobe și
hidrofile pe fețele opuse ale unei peptide.

28
Mărimea unei peptide antimicrobiene care traversează membrana unei bacterii în modelul
barrel -stave trebuie să aibă cel puțin 22 de aminoacizi pentru pep tidele antimicrobiene ce au structura
de α-helix, în timp ce pentru păturile β sunt necesari doar 8 aminoacizi.
Pe lângă efectele lungimii care intră în structura peptidelor antimicrobiene și a modului de
acțiune, lungimea poate afecta citotoxicitatea ei. De exemplu, melitina scurtată cu 15 reziduuri la
capătul C -terminal a prezentat o toxicitate de 300 de ori mai scăzută la eritrocitele șobolanilor,
eritrocitele umane față de formele lor originale.
Astfel, lungimea unei peptide antimicrobiene trebuie luată în considerare atunci când se
încearcă proiectarea unor noi peptide cu toxicitate redusă.
Sarcina netă a peptidelor antimicrobiene, care este suma tuturor grupurilor ionizabile cu sarcină
a peptidei, variază de la negativ spre pozitiv și este factorul pri ncipal în interacțiunea lor cu
membranele celulelor încărcate negativ.
Schimbând sarcina netă a unei peptide antimicrobiene, activitatea antimicrobiană și hemolitică
poate fi alterată pentru a realiza distrugerea selectivă a microbilor fără efecte minime a supra celulei
gazdă.
Hidrofobicitatea a demonstrat că poate influiența activitatea și selectivitatea peptidelor
antimicrobiene. Aproape 50% din aminoacizii din secvența primară a peptidelor antimicrobiene au
reziduuri hidrofobe. În cele mai multe cazuri, creșterea în hidrofobicitate pe partea încărcată pozitiv a
unei peptide antimicrobiene sub un anumit prag, poate duce la creșterea activității antimicrobiene, pe
când descreșterea hidrofobicității conduce la diminuarea activității.
Unele studii au arătat c ă hidrofobicitatea este critică în determinarea unei game de celule țintă
pentru o peptidă antimicrobiană. Creșterea hidrofobicității unei peptide antimicrobiene poate schimba
gama de ținte. De exemplu, magainina este o peptidă antimicrobiană eficientă împ otriva bacteriilor
Gram negative. Cu toate acestea, pot exista și analogi sintetici cu hidrofobicitate mai mare care pot
distruge câteva bacterii Gram pozitive și celule eucariote.

29

Figura I. 13. Reprezentarea magaininei ca structură secundară de alfa -helix. Cu albastru se prezintă radicalii
încărcați electric iar cu verde radicalii hidrofobi.

Amfipaticitatea este o altă proprietate importantă a peptidelor antimicrobiene pentru a -și asigura
activitatea și interacțiunea cu membranele microbiene.
Fernandes -Vidal și colaboratorii săi au arătat că amfipaticitatea este mai importantă decât
hidrofobicitatea pentru legarea la membranele microbiene. Amfipaticitatea fiind necesară pentru
puternica partiție în interfaț a cu membrana. A r trebui să se acorde prioritate structurii amfipatice atunci
când se proiectează peptide antimicrobiene sintetice pentru celule țintă specifice.
O măsură cantitativă a amfipaticității este momentul hidrofob, calculat ca suma vectorială a
hidrofobicităților individuale ale aminoacizilor, normalizat la un helix ideal. Creșterea momentului
hidrofobic are ca rezultat o creștere semnificativă a activităților permeabilizante și hemolitice ale
peptidelor model față de membranele țintă.

Figura I. 14. Proiectarea momentului hidrofob pe o
peptidă cu structură de alfa helix PGL (peptidil -glicin –
leucină -carboxiamidă) în secțiunea sa transversală.

30
Deoarece peptidele antimicrobiene trebuie să acționeze sau să intre prin membranele lipidice,
acestea trebuie să fie solubile în mediile apoase. Dacă moleculele peptidelor antimicrobiene se agregă,
își vor pierde abilitatea de a interacționa cu membrana celulară.
De exemplu, o peptidă antimicrobiană hibrid sintetică compusă din cecropină și melitină are
tendința să formeze dimeri. Substituind un rez iduu de lisină pe fața nepolară a acestui hibrid se va
preveni dimerizarea și activitatea hemolitică va fi redusă. Pierderea capacității de dimerizare face ca
peptida antimicrobiană să fie mai eficientă în incorporarea ei în membranele microbiene.
Unghiul polar reprezintă o măsură a proporției relative a părții polare a unei structuri α -helix,
față de partea hidrofobă.

Figura I. 15 . Reprezentarea schematică a unei peptide amfipatice sub formă de alfa helix. Unghiul polar este notat
cu ϕ. Radicalii încărc ați pozitiv sunt reprezentați prin forma de pentagon, cei polari prin cercuri iar cei nepolari prin mici
diamante. (William Porto, Octavio L. Franco, Osmar Nascimento Silva, Prediction and Rational Design of Antimicrobial
Peptides, Protein structure, Editi on 1, Chapter 17 )
Helicitatea reprezintă abilitatea peptidei antimicrobiene de a forma protecția spinului pe direcția
impulsului . Este o proprietate mai puțin importantă pentru activitatea unei peptide antimicrobiene în
comparație cu factorii de mai sus, î nsă este importantă pentru determinarea toxicității asupra celulelor
eucariote.

31
Reducerea helicității prin încorporarea aminoacizilor dextrogiri în structura primară a
demonstrat un efect hemolitic scăzut în timp ce efectul antimicrobian a fost reținut.
Un alt factor asociat cu helicitatea peptidelor antimicrobiene este tendința aminoacizilor de a
forma α helix din secvența primară. În plus, peptidele trebuie să fie suficient de flexibile pentru a -și
schimba conformația în timpul procesului de inserție a me mbranei.

I. 2. b. Mecanisme de acțiune ale peptidelor antimicrobiene la nivelul membranelor
biologice

Activitatea biologică a peptidelor ant imicrobiene este puternic influ ențată de interacțiunea
peptidă -membrană. Nenumărate modele au fost formulate pentr u a pune în evidență aceste interacțiuni.
Peptidele antimicrobiene există în soluții în diverse structuri secundare, principala fiind de random coil ,
având diferențiate suprafețele hidrofobe și hidrofile. Când sunt în contact cu membrana, peptidele
cationi ce interacționează cu membranele încărcate negativ (membrane bacteriene) prin interacțiuni
electrostatice de rază lungă.
Peptidele se acumulează la suprafața membranei și un prim pas este de adsorbție la suprafața
membranei , peptidele încorporându -se în re giunea capetelor polare ale lipidelor prin interacțiuni
electrostatice între capetele polare ale lipidelor și resturile încărcate ale peptidei . Inserția ulterioară este
împiedicată de interacțiunile nefavorabile dintre reziduurile polare și cozile hidrocar bonate, conducând
la o barieră energetică. Cu toate acestea, o astfel de barieră energetică finită este redusă de
interacțiunile hidrofobe dintre reziduurile nepolare ale peptidei și cozile hidrocarbonate. Atâta timp cât
peptida ajunge la grupările opuse d e lipide, interacțiunile hidrofobe cooperează cu interacțiunile
electrostatice pentru a finaliza procesul de inserție a peptidei în membrană.
Un prim model este modelul barrel -stave în care un por sau un canal ionic este format în
membrană fără a perturba semnificativ lipidele din structura membranei.
Mecanismul barrel stave descrie formarea porilor transmembranari prin legături peptidice.
Recrutarea progresivă a altor monomeri peptidici conduc la o dimensiune crescândă constantă a
porilor. Scurgerile intra celulare prin acești pori determină ulterior distrugerea celulelor. Pentru a

32
permite formarea porilor, moleculele inserate ar trebui să aiba structuri distincte, cum ar fi amfipatice
sau hidrofobice , α helix, pături β, etc.
Un pas esențial în cadrul acestu i mecanism este ca peptidele să se recunoască între ele în starea
legată de membrană. Ansamblul de peptide poate apărea pe suprafața membranei sau în interiorul
acesteia, deoarece peptidele hidrofobe pot intra în membrane ca monomeri.
În modelul alternativ , carpet -pore sau toroidal -pore, peptidele se acumulează la suprafața
membranei lipidice. Pentru unele lipide, această acumulare duce la liza celulară (carpet -pore), iar
pentru alte peptide, acestea ajung să atingă o concentrație critică și provoacă o curb ură membranară,
urmată de formarea porilor toroidali căptușiți atât cu peptide cât și cu lipide.
Potrivit modelului carpet -model , peptidele se leagă mai întâi de suprafața membranei celulare
microbiene țintă și ulterior membrana este acoperită de un grup d e peptide tip carpet .

Figura I. 16 . Mecanismele de acțiune ale peptidelor antimicrobiene cu membrana lipidică reprezentate sub formă
elicoidală. Peptidele se adsorb la suprafața membranei în (A) și în (B) acestea se inseră sub formă de barrel -stave. În (C)
acestea apar sub formă carpet iar în (D) peptidele iau formă toroidală o dată inserate în membrană.

I. 2. c. Proprietăți structurale și funcționale ale peptidei antibiotice alameticina

Alameticina este o peptidă antibiotică produsă de ciuperca Trich oderma Viride . Asupra
structurii ei s -au creat mai multe confuzii, inițial se credea că aceasta este compusă din 18 aminoacizi
cu structură circulară. Martin și Williams au demonstrat în 1976 că molecula este liniară și constă în 20

33
aminoacizi. Ea conține la capătul C -terminal o grupare α -aminoalcool și la capătul N -terminal o
grupare acetilată. Capătul N -terminal este rigid pe când celălalt capăt este flexibil. Secve nța sa primară
este următoarea: Ac-Aib-Pro-Aib-Ala-Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib-Gly-Leu-Aib-Pro-Val-AibAib –
Glu-Gln-Phl-OH (Ac-acetil N -terminal).

Figura I. 17 . Structura primară a alameticinei.
Investigațiile pentru un singur canal ionic au demonstrat că alameticina induce formarea de pori
transmembranari atunci când un potențial electric est e apl icat de -a lungul membranei, alameticina fiind
un canal voltaj -dependent.
Alfa-helixul are un exces de sarcină negativă la capătul C -terminal și de sarcină pozitivă la
capătul N –terminal, fapt cauzat de aranjamentul momentelor dipolare.
Astfel, întreag ă peptidă prezintă în conformația alfa -elicoidală un moment dipolar ce poate
interacționa cu câmpul electric aplicat membranei. Monomerii de alameticină adoptă o orientare
transmembranară, capătul N -terminal îngropat în miezul hidrofob al cozilor hidrocar bonate, pe când
capătul C -terminal realizează legături de hidrogen cu moleculele de apă de la interfață sau cu capetele
polare ale lipidelor.

34
Alameticina a prezentat a avea momentul dipolar de 63 D (debye), însă într -o soluție de 25%
etanol prezenta moment ul dipolar de 67 D și 75 D în octan ol, prin măsurători dielectrice, corespunzător
unei distribuții de sarcină +1/2 la capătul N -terminal și -1/2 la capătul C -terminal al helixului.

Figura I. 18 . Conformația α -elicoidă a alameticinei cu părțile hidrofile (albastru) și hidrofobe (roșu) ale helixului
cât și prezentarea prolinei din poziția 14 împreună cu reprezentarea unui cilindru amfifil;lungimea moleculei este de
aproximativ 30 Å.

Deși s -au scris sute de publicații despre alameticină, proprietățile de f ormare a canalelor în
membranele celulare, nu au fost elucidate complet. Diferite mecanisme au fost și mai sunt propuse.
Unul dintre ele susține că alameticina formează n hexameri de tip canal gramicidin, cu o cavitate
centrală pentru trecerea ionilor.
Cele mai multe investigații moleculare despre mecanismul de formare a canalelor de
alameticină se concentrau pe inserția unor molecule polipetidice în centrul hidrofob al membranei sub
influiența unui potențial electric aplicat. Inițial, în absența unui câmp electric, moleculele de
alameticină ar fi fost localizate la suprafața membranei. Dar când se aplica un potențial
transmembranar ele penetrau bistratul lipidic hidrofob. Alameticina inserându -se doar cu capătul N –
terminal în interiorul bistratului iar capă tul C -terminal rămânând ancorat la suprafața de inserție.
Procesul este reversibil, iar moleculele de alameticină s -ar întoarce pe suprafața membranei după
înlăturarea potențialului. Dat fiind acest fapt, alameticina se inseră în biomembrane doar la valori ale
potențialului electric negative față de partea unde adaug ăm alameticina.
Într-un model mai recent se presupune că peptida tinde să fie adsorbită la suprafața capetelor
polare ale membranei celulare într -o stare inactivă din punct de vedere funcțional. La atingerea unei
concentrații prag a peptidei se formează o stare cu pori multipli. Acest lucru duce la creșterea notabilă a

35
conductivității și a permeabilității membranei. Formarea porilor este un proces extrem de cooperant
confirmat de alameticină. Atunci când minim 4 monomeri formează în interiorul unei biomembrane un
nanopor cu ajutorul legăturilor de hidrogen, prin care ionii vor difuza liber în virtutea unui gradient
electrochimic, canalul prezintă o stare conductivă. În urma reacțiilor de asociere -disociere a
moleculelor de alameticină, în funcție de numărul monomerilor ce formează nanoporul, canalul
prezintă diferite stări conductive.

Figura I. 19 . Reprezentarea schematică porilor de alameticină în diverse stări conductive , în vedere transversa lă.
Primul por format este constituit din 4 peptide, raza acestuia fiind notată cu d 1, prin oligomerizare s -a format o nouă stare
conductivă II a cărui por este alcătuit din 5 peptide. Starea III este formată dintr -un por cu 6 peptide a cărui rază este not ată
cu d 3. Pe măsură ce numărul de peptide care alcătuiesc porul crește, crește și raza porului respectiv, d 1<d2<d3. Procesul este
și reversibil, așa cum prin adăugarea unei peptide se formează noi stări conductive cu rază mai mare, peptidele se pot
disoci a formând noi stări conductive ale porului de rază mai mică.
Cel mai acceptat model de formare a canalelor este cel barrel -stave , după c um prezintă și figura
de mai jos , în care agregatele intramembranare sunt f ormate din grupuri paralele de 4 -12 monomeri de
alameticină, unde exteriorul lor este în contact cu acizii grași din bistratul lipidic și înconjoară un por
umplut cu apă. Între acești monomeri se realizează legături de hidrogen mediate de aminoacizii Gln7,
Gln18, Gln 19.

36
Figura I. 20 . Modelul barrel-stave ca mecanism
funcțional de interacțiune cu membrana celulară. Într-un
prim pas, monomerii de alameticină sunt adsorbiți la
suprafața membranei celulare urmând ca mai apoi să se
orienteze într -o structura tip canal ionic ca cea de mai
sus, cu părțil e hidrofobe orientate spre cozile
hidrocarbonate și cele polare spre zona interioară a
porului.

Figura I. 21 . Reprezentarea unui canal ionic de alameticină cu structură de alfa helix format din 6 structuri de
monomeri, ce prezintă stabilitate prin legăturile de hidrogen realizate între Gln 7, Gln 18 și Gln 19.

În cadrul acestui model, prolina din poziția 14 este cheia inserției în membrană, formând o
curbură între două segmente elicoidale. Din analiza oscilațiilor chimice, unghiurile de înclinare ale
capetelor N și C -terminale au fost determinate a fi 17o, respectiv 32o. Terminalele N și C au fost
identificate ca alfa și respectiv, 3 10 helix. Unghiul de îndoire al celor două elice a fost determinat a fi
165o. Toate aceste măsurători s -au făcut în raport cu axa normală a membranei.

37
Figura I. 22. Structura secundară a alameticinei
și topologia ac esteia la inserarea în membrană cu ajutorul
rezonanței magnetice nucleare. Capătul N -terminal, alfa –
helix, prezintă o înclinare de 17 o față de normală, iar
capătul C -terminal, 3 10 helix, o înclinare de 32o față de
normală. Unghiul de înclinare dintre cele două elice fiind
de 165o. (adaptat din Structure and orientation of
antibiotic peptide alamethicin in phospholipid bilayers as
revealed by chemical shif t oscillation analysis of solid
state nuclear magnetic resonance and molecular dynamics
simulation , BBA -Biomembranes,2015 )

II. MATERIALE, METODE ȘI TEHNICI DE INVESTIGAȚIE

II. 1. Materiale utilizate în cadrul studiului

În cadrul studiului s -a folosit inițial un preparat de hexadecan -pentan, soluție extrem de
hidrofobă care ajută la aderarea cozilor hidrofobe către apertura din teflon din cadrul experimentului.
Ulterior, am folosit o sare, KCl, în acest caz 0.5 M. Totodată, am adăugat 10 mM HEPES, soluț ie
tampon, care ajută la menținerea pH -ului constant, egal cu 7.
După realizarea condițiilor necesare pe care le vom descrie mai jos se adaugă lipida noastră, L-
α-fosfatidilcolină dizolvată în pentan. După evaporarea completă a pentanului se adaugă peptida
alameticină ce se va insera în bistratul format având diverse stări conductive.

II. 2. Tehnica Montal și Müeller de realizare a bistraturilor lipidice planare

Metoda Montal -Muller are la bază caracterul amfipatic al moleculelor fosfolipidice care intră în
compoziția acestora. Condiția de energie minimă necesară în realizarea unui bistrat lipidic stabil este de

38
organizare a moleculelor lipidice în cadrul monostraturilor, în așa manieră încât capetele polare să
interacționeze cu mediul apos, iar cozile hi drofobe să evite contactul cu moleculele de apă. Această
stabilitate se realizează prin intermediul interacțiunilor de tip van -der-Waals.
Tehnica de formare a unei membrane artificiale, într -o descriere exhaustivă, este inițiată în
modul următor: o bucată dintr -o fol ie de teflon, cu diametrul de ordinul micrometrilor , este așezată
între două celule componente, realizate din teflon, ale dispozitivului celula BLM (black lipid
membrane) . Acest nume,membrană lipidică neagră, rezultă în urma comportamentului opt ic al
membranei când se formează. Termenul negru se referă la faptul că bistraturile sunt întunecate în
lumina reflectată, deoarece grosimea membranei este de numai câțiva nanometri.
Bistratul lipidic se va forma la nivelul aperturii aflată în filmul de te flon. Stabilitatea mecanică a
bistratului lipidic se va realiza pretratând apertura foliei de teflon cu o soluție hidrofo bă de hexadecan –
pentan .
Stabilitatea bistratului lipidic este dependentă de calitatea orificiului din filmul de teflon, astfel
pretratâ nd orificiul pentru a mări coeficientul de hidrofobicitate al filmului și pentru a compensa
deformările de pe marginea orificiului este total necesar.
Apertura trebuie lăsată la uscat pentru ca mai apoi să realizăm o soluție de KCl. Soluția
fiziologică de KCl trebuie să prezinte concentrația specifică tipului de experiment realizat și pH ajustat
și măsurat cu ajutorul unui pH -metru. În fiecare dintre cele două cuve se va introduce o anumită
cantitate de soluție, astfel încât suprafața de separație apă -aer s ă fie situată sub apertura din folia de
teflon.
În fiecare dintre cele două cuve se va adăuga soluție de lipidă, L -α-fosfatidilcolină, dizolvată în
pentan. Acest solvent este extrem de volatil și va permite imediata organizare a moleculelor lipidice în
monostraturi la interfețele lichid -aer din cele două cuve, conform caracterului amfipatic al acestora.
După aproximativ 2 minute, necesare pentru evaporarea completă a pentanului, nivelul soluției
electrofiziologice din cele două compartimente este ridicat su ccesiv, astfel încât interfața aer -mediu
apos să fie deasupra aperturii din filmul de teflon. Datorită interacțiunilor de tip van -der- Waals între
capetele hidrofobe ale moleculelor lipidice, în partiția din filmul de teflon se va forma o structură de
bistrat lipidic artificial.

39

Figura II. 1. Formarea bistraturilor lipidice artificiale folosind metoda Montal -Muller. A) Cele două compartimente
separate de filmul de teflon cu apertură și soluția apoasă. B) Organizarea monostraturilor la interfața aer -soluț ie apoasă.
C) Nivelul soluției începe să crească în unul din compartimente. D) Cozile hidrocarbonate aderă prin intermediul
interacțiunilor van -der-Waals. (Thomas Gutsmann, Thomas Heimburg, Ulrich Keyser, Kozhinjampara R. Mahendran,
Mathias Winterhalte r, Protein reconstitution into freestanding planar lipid membranes for electrophysiological
characterization, Nature Protocols 10, 2015)
Inserția ulterioară a peptidelor în membrană precum și formarea nanoporilor, este monitorizată
prin înregistrarea ampli tudinii curentului electric prin bistrat în prezența unui câmp electric extern.
Pentru a facilita izolarea electrică între cele doua celule, suprafața de contact dintre acestea și partiția
de teflon se acoperă cu o peliculă subțire de vaselină silicon.
Formarea bistraturilor lipidice poate fi observată prin mărirea rezistenței electrice între cele
două compartimente despărțite de ansamblul folie de teflon -biomembrană lipidică, precum și prin
creșterea capacității electrice a acestui sistem.

40
II. 3. Dispozit ivul experimental utilizat pentru înregistrarea curenților ionici mediați de
canalele de alameticină

Figura II. 2. Reprezentarea schematizată a componentelor dispozitivului experimental utilizat pentru realizarea
biomembranelor artificiale. Bistratul lip idic se realizează la nivelul aperturii de diametru de 100 µm din filmul de teflon de
grosime 25 µm, vedere detaliată a biomembranei formate la nivelul partiției de teflon ce separa cele două cuve de teflon, în
care, se inseră un canal ionic de alameticină . Curentul electric a fost detectat și amplificat cu un amplificator integrat setat
pe modul de voltaj fixat, prin intermediul a doi electrozi de Ag/AgCl. Achiziția datelor s -a realizat cu o placă de achiziție NI
PCI 6014 pe 16 biți, cu o frecvență de 30 k Hz în mediul grafic LabView 8.20.

Peptidele antimicrobiene se vor adăuga în sistem în compartimentul legat la masă, în diverse
concentrații relevante experimentului. Atunci când peptidele se adsorb la interfața bistrat/mediu apos,
se inseră în mediul hidr ofob al bistratului formând pori apoși transmembranari ce pot fi monotorizați
înregistrând modificările de curent electric ce apar în sistem în urma aplicării unei diferențe de
potențial de o parte și cealaltă a membranei lipidice.
Pentru a înregistra cure nții mediați de nanoporii inserați în membrana biologică vom folosi un
amplificator Axopatch 200 B și un filtru trece jos (frecveța de tăiere 10 kHz, filtru Bessel) în condițiile
de tensiune fixată. Conexiunile electrice dintre bistratul lipidic și restul dispozitivelor analogice se
realizează cu ajutorul unor sisteme fizice cu rol de interfață între sistemul studiat și instrumentul de
măsură al mărimii studiate. Astfel, vom folosi doi electrozi de Ag/AgCl, concepuți prin depunerea
electrolitică a clorului pe fire de argint (cu diametrul de aproximativ 0 .3 mm), într -o soluție de KCl.

41
Achiziția datelor a fost optimizată prin digitizarea semnalului de curent analogic cu ajutorul
unei cartele de conversie A/D cu rezoluție de 16 biți cu o frecvență de eșantionar e de 30 kHz. Ulterior,
semnalul a fost înregistrat în memoria unui calculator compatibil IBM. Pentru a implementa
protocoalele de analiză specifice fiecărui set de experimente, am utilizat mediul grafic LabView.

II. 4. Investigarea fluctuațiilor de cure nt electric mediat de nanopori proteici inserați în
biomembrane

Fundamentul structural principal în determinarea funcțiilor biomembranelor îl repre zintă
canalele ionice care fluc tuează stochastic între diferite stări microscopice, asociate macroscopic cu
diferite valori ale conductivității electrice. Tehnicile macroscopice de măsurare a curenților electrici
prin biomembrane reflectă valori medii ale mărimilor măsurate, unde cantitățile mediate sunt parametri
electrici ai canalelor ionice individuale. Pentr u a deduce informații utile despre proprietățile
microscopice ale canalelor ionice, cum este conductanța electrică, proprietatea de deschidere a
canalului, etc., folosim metoda analizei fluctuațiilor de curent electric prin biomembrane având ca
subiect de analiză cantități măsurabile macroscopice, curenții electrici medii, diferențe de potențial
transmembranare medii, etc.
Proprietățile fizico -chimice de transport și cinetice caracterizate de conductanța electrică, G, se
pot modifica iar curentul electric m ăsurat devine unul fluctuant și nu staționar, în conformitate cu legea
lui Ohm, mărimea și variația în timp a fluctuațiilor se scrie:
)( )( )()( )( tUtGtUtG tI   
(24)
Relația de mai sus ne oferă infomații despre prov eniența acestor fluctuații, o parte din fluctuații
provenind din fluctuațiile de conductanță electrică a sistemului iar o parte din fluctuațiile de diferență
de potențial la capetele sistemului. Dacă am menține diferența de potențial nulă, relația de mai s us va
fi:
)()( )( tUtG tI 
(25)
Observăm că folosind această tehnică, voltage -clamp, analiza fluctuațiilor de curent electric ne
oferă informații directe despre fluctuațiile de conductanță electri că.

42

II. 5. Metoda noise analysis de analiză a proprietăților cinetice și de transport ale
canalelor ionice

Vom considera un sistem molecular format din N canale ionice identice și independente, cu
valoarea N învariabilă în timp. Sistemul molecular cuprin de o serie de proprietăți:
– Se presupune că fiecare din cele N canale realizează tranziții stochastice între cele două stări,
închis și deschis de tip Markov, astfel încât valorile probabilităților de tranziție între cele două
stări în intervalul de timp t și t+τ, nu depind de timpul t;
– Valoarea conductanței electrice a stării deschis nu se modifică în timp și va fi notată cu γ;
– Valoarea potențialului lui Nernst pentru transportul ionilor prin fiecare canal ionic este cunoscut
și notat cu V Nernst.
Făcând ac este precizări, valoarea curentului electric instantaneu mediat de acest sistem are
forma:
) )(( )(Nernst d VVtNtI  
, (26)
unde:
– Nd(t) reprezintă numărul de canale ionice care se găsesc în starea deschis la un moment de timp
t;
– V este valoarea tensiunii electrice aplicate în sistem.
Luând în considerare caracterul fluctuant al curentului electric, relația de mai sus devine:
  ) )(( )(Nernst d VVtN tI  
(27)
Această relație ne ajută să observăm caracterul fluctuant al curentului electric măsurat ce
conduce la fluctuații ale numărului de canale ionice care se găsesc în starea deschis la oricare moment
de timp t. O precizare ce trebuie făcută în aceste condiții este aceea că tranziția făcută de canale între
cele două stări este una stochatică, ceea ce duce la o imposibilitate de a determina numărul de canale
care se găsesc în starea deschis la un moment de timp t.

43

)…( )( )(3 2 1 tN tN tNd d d  (28)
Mai departe vom înce rca să verificăm dacă putem determina probabilitatea de a găsi un canal
ionic în starea deschis și valoarea medie a canalelor din starea deschis.
)( )( t NptNd d
, (29)
unde:
–
)(tNd reprezintă valoarea medie a numărului de canale ionice aflate în starea deschis;
– pd(t) reprezintă probabilitatea de a găsi un canal ionic aflat în starea deschis la un moment de
timp t.
) ()( )(Nernst d VVtNtI  
(30)
–
)(tI reprezintă valoarea medie a curentului electric prin canalele ionice atunci când urmărim
activitatea a N canale ionice.
Folosind ecuația Master care prezintă probabilitatea de tranziție înt re cele două stări a unui
canal ionic, notăm starea deschis cu 1 și starea închis cu 2:


22 2112 11)()(
q qq qtPdttdP
(31)
Toate aceste tranziții au loc sub acțiunea unor constante de reacție, k 12=α și k 21=β.
O Ck
k12
21
(32)
Am notat cu C starea închisă (close) a canalului ionic, iar cu O starea deschis (open) a canalului
ionic.




22 2112 11
q qq qQ
(33)
Soluția ecuației Master se scrie în formă matricială astfel:

44

QtetP)( (34)
Valorile probabilităților de tranziție între cele două stări într -un interval de timp (0,t) au
următoarele expresii:
tttt
e tPe tPe tPe tP
) (
22) (
21) (
12) (
11
)()()()(








(35)
La orice interval de timp valorile probabilităților între cele două tranziții sunt date de:
1)( )(1)( )(
22 2112 11

tPtPtPtP
(36)
Proteina noastră se poate afla în una din cele două stări posibile, astfel încât dacă considerăm că
la momentul inițial proteina se afla în starea deschis, avem:


n
iik i k tP p tp
1)()0( )(
(37)
tt
e tP tPtpe tP tPtp
) (
22 12 2) (
21 11 1
)( 0)( )()( 0)( )(






(38)
Constatăm, în acest caz că canalele ionice aflate inițial într -o stare de echilibru, în urma unei
perturbații, tind să evolueze spre o stare de echilibru, cinetica probabilității de ocupare a unei stări p k(t)
urmând o lege temporală exponențială.
Astfel, putem constata că valoarea curentului electric mediu mediat de activitatea celor N
proteine sau canale ionice poate lua următoarea formă:

45


) ( )( ) )(( )() (
1 Nernstt
Nernst VV e NtI VVtNptI 



  (39)
Cunoscând faptul că proteina noastră realizează tranziții de tip Markov, faptul ca ea chiar să se
găsească în starea deschis este o funcție exponențială de tipul celei de mai sus. Valoarea mediată a
curentului electric în schimb, se obține doar prin realizarea experimentelor prin care se măsoară
curenții înregistrați prin unul sau mai multe canale. Doar atunci când numărul de experimente tinde
spre infinit, putem spune că valoarea mediată a curentului electric se apropie de cea din re lația de mai
sus.
În schimb, sistemul nostru de analizat prezintă un semnal stochastic și staționar a cărui valoare
medie a curentului electric este dată de următoarea relație:
) )(( )(Nernst d VVtNtI  
(40)
Vom nota cu i(t) valoarea curentului electric mediată de un singur canal ionic care urmărește
tranziția stochastică a canalului între cele doua stări și are expresia:
) ()(NernstVV ti
(41)
Anal iza semnalului stochastic se realizează considerând că toate cele N canale ionice contribuie
la valoarea fluctuațiilor de curent electric Putem scrie așadar funcția de autocorelație a curentului
electric total:
   ) ( ) ( )( ) ()( )(2
t t t Nernst I I deschisP deschis deschisP VVN R titiN R    
(42)
Funcția de autocorelație reprezintă gradul mediu de asemănare a unui semnal măsurat la un
timp t și ulterior la t+τ.
Funcția prezintă următoarele proprietăți:
R(-τ)=R(τ)
R(0)≥R(τ),
),0( (43)
σ2=R(0)

46
σ2 reprezintă varianța semnalului considerat.
    
ki kik i a tiP iara tiP titi
, ,)) (( ))(( ) ()(  
(44)
Probabilitatea descrisă în funcția de autocorelație este probabilitate condiționată iar indicii
reprezintă starea deschis (i) și starea închis (k).Probabilitatea condiționată se referă la probabilitatea ca
unul din cele N canale să fie în starea deschis la momentul t+τ, el fiind deschis la momentul t.
Pentru înțelegerea ecuației de mai sus facem precizarea că valoarea medie a unor valori
discrete , xi, ce pot apărea cu probabilitățile, p i, în timpul unor evaluări cantitative este descrisă de

iiipx
.
Suma de mai sus poate conține 4 termeni dacă avem t și τ fixați:
– ii când canalul este deschis atât la momentul t cât și la t+τ;
– ik când canalul este deschis doar la momentul de timp t și închis la momentul t+τ;
– ki atunci când canalul este închis la momentul t dar deschis la t+τ;
– kk, canalul este închis la ambele momente de timp.
După cum se poate observa singurul termen nenul din cadrul s umelor este atunci când canalul
este deschis la momentul t și la momentul de timp t+τ. Coeficientul a i este cel care definește curentul
electric mediat de acel canal fiind finit și egal cu
) (NernstVV .
  ) ; ( ) () ()(2
t t Nernst deschis deschisP VV titi   
(45)
Termenul probabilistic în această formulă reprezintă o probabilitate comună (joint probability),
acesta putând fi scris ca:
 t t t t t deschisP deschis deschisP deschis deschisP ( ) ; (    
(46)
Rezultă:
  t t t Nernst deschisP deschis deschisP VV titi ( ) () ()(2
   
(47)
Acestea fiind spuse, sistemul nostru este un sistem de semnale stochastice de tip Markov și
staționare.

47
Valoarea medie a fluctuațiilor de curent electric va avea forma:
) (NernstVV NI 
(48)
Relația de mai sus exprimă un criteriu după care sistemul de canale ionice atinge staționaritatea.
Revenind la sistemul de semnale de tip Markov și staționare vom presupune că acestea sunt și
ergotice. Un sistem se consideră a fi ergotic, stoc hastic și staționar dacă media pe ansamble este
identică cu media temporală efectuată pentru o singură efectuare a procesului. Datorită proprietății de
proces Markov probabilitatea condiționată se consideră a fi dependentă numai de τ și independentă de t
(condiția de staționaritate). Probabilitatea în acest caz este dată de:

) (t deschisP
(49)
Dacă ne referim la probabilitatea comună, aceasta sugerează că dacă un canal este deschis la
momentul de timp t, atunci va fi regăsit în această stare și dupa timpul t+τ.
 

) (
11)(
 e P deschis deschisPt t
(50)
Funcția de autocorelație poate fi scrisă acum astfel:
 






 ) ( 2) ( )( e VVN RNernst I
(51)
Funcția de autocorel ație de mai sus descrie un proces cinetic staționar al canalelor ionice, iar
aceasta nu depinde de momentul inițial ales drept origine, astfel se poate scrie:
(52)
Pentru sistemul nostru care se găsește în starea de staționaritate, probabilitatea să gă sim N d
canale deschise din cele N deja cunoscute, se determină din cadrul unei legi de distribuție binomială:
d d NN N
d ddNN NNNP








 

)! (!!)(
(53)
) ()( …) ()( ) ()( )(2 2 1 1        k k I titiN titiN titiN R

48
Varianța acestei distribuții se scrie:









 N
dN2
(54)
Varianța fluctuațiilor de curent electric, ce depinde de fluctuațiile în numărul de canale ionice
aflate deschise este:
 2 2 2) (  Nernst N I VV
d
(55)
Atât varianța fluctua țiilor curentului electric, cât și valoarea medie a curentului electric, sunt
mărimi ușor accesibile experimental, putându -se realiza caracterizarea proceselor de transport ionic
printr -un canal ionic.
Pentru a caracteriza cinetica și procesele de transpor t care au loc într -o serie de canale ionice s –
au impus câteva condiții:
– Canalele ionice sunt omogene din punct de vedere al speciilor de canale ionice existente în
membrană. În membrana celulară există însă densități de canale ionice distincte funcțional, iar
fluctuațiile care intervin aici vor conține contribuții de la fiecare canal ionic cu funcționalitate
diferită;
– Am presupus că aceste canale ionice sunt independente, ceea ce înseamnă că proprietatea
cinetică de deschidere a unui canal ionic era indepen dentă față de canalele care se găseau în
imediata vecinătate a sa. Și totuși s -a demonstrat că această condiție impusă este falsă iar
procesul poartă numele de cooperativitate. Acest lucru face ca funcția de autocorelație să capete
altă formă decât cea det erminată mai sus.
– În situația prezentată am considerat că tranzițiile posibile sunt doar două, ce prezintă
conductanță nulă în starea închis și conductanță finită în starea deschis, însă lucrurile în natură
tind să fie mai complicate, existând mai multe st ări moleculare închis și deschis . Putem aprecia
acum că fluctuațiile de curent electric cauzate de cinetica canalelor ionice studiate nu sunt
singurele care intervin în studiul acestei metode, pe lângă acestea apar fluctuații ale zgomotului
electric termal indus de elementele pasive ale sistemului de măsurare.

49
III. REZULTATE EXPERIMENTALE ȘI DISCUȚII

III. 1. Înregistrarea și analiza microscopică a fluctuațiilor de curent ionic mediat de
canalele de alameticină. Determinarea conductanței porilor de alamet icină la nivel unimolecular.

În cadrul acestui experiment ne -am propus să determinăm conductanța porilor de alameticină la
nivel unimolecular prin înregistrarea microscopică a fluctuațiilor de curent ionic mediate de canalele de
alameticină inserate în bi straturile lipidice planare reconstituite. Alameticina formează canale ionice
voltaj -dependente în membrane, care permit trecerea ionilor prin bistratul lipidic.
În cadrul laboratorului am format membrane lipidice atificiale, folosind tehnica Montal -Muller ,
formate din fosfatidilcolină. Ulterior, după realizarea stabilității membranei formate, se adaugă în
sistem, în partea cuvei legate la masă, un volum de alameticină. Prin soluția noastră electrofiziologică,
caracterizată de un pH egal cu 7 , peptidele vo r difuza și începe procesul de adsorbție la suprafața
bistratului lipidic. Cunoscând proprietățile de amfipaticitate a peptidelor, acestea adoptă o structură
secundară de alfa -helix cu aminoacizii hidrofobi pe o parte și hidrofili pe cealaltă parte, atunci când se
găsesc la suprafața de separație bistrat -mediu apos. Această structură ajută la inserarea peptidelor în
interiorul bistratului lipidic și la asocierea lor formând oligomeri transmembranari foarte favorabili din
punct de vedere energetic. Structur ile oligomerilor variază de la un număr minim de monomeri, în
cazul alameticinei fiind vorba de 4 monomeri, până la un număr de 12 monomeri. Canalele formate de
monomeri au structuri bine definite, în sensul că în interiorul canalelor ionice se găsesc acei aminoacizi
hidrofili care intră în contact cu apa, pe când în exteriorul canalului, acesta este căptușit cu aminoacizii
hidrofobi care interacționează cu cozile hidrocarbonate ale lipidelor.
În următoarea figură se observă că numărul minim de monomeri car e formează un por este 4.
Prin oligomerizare numărul monomerilor crește rezultând pori cu un diametru din ce în ce mai mare,
reacție care poate fi reversibilă, iar atunci diametrul o să scadă.

50

Figura III.1. Reprezentarea schematică porilor de alameticină în diverse stări conductive, în vedere transversală.
Primul por format este constituit din 4 peptide, raza acestuia fiind notată cu d 1, prin oligomerizare s -a format o nouă stare
conductivă II a cărui por este alcătuit din 5 peptide. Starea III este forma tă dintr -un por cu 6 peptide a cărui rază este notată
cu d 3. Pe măsură ce numărul de peptide care alcătuiesc porul crește, crește și raza porului respectiv, d 1<d2<d3. Procesul este
și reversibil, așa cum prin adăugarea unei peptide se formează noi stări co nductive cu rază mai mare, peptidele se pot
disocia formând noi stări conductive ale porului de rază mai mică.

Dacă aplicăm o diferență de potențial de o parte și alta a unei membrane lipidice pure, curentul
ionic înregistrat va fi foarte mic, însă nu zer o. Atunci când 4 monomeri se asociază și formează un por
în membrana respectivă, prin aplicarea unei diferențe de potențial se va înregistra un curent ionic ce o
să aibă o anumită amplitudine. Acest proces a căpătat numele de prima stare conductivă a pepti dei
alameticina. După cum menționam și mai sus, monomerii pot disocia iar atunci curentul ionic ajunge la
valoarea inițială apropiată de zero deoarece porul dispare. Dacă la cei 4 monomeri care formează deja
un por, se atașează un al cincilea monomer, rezu ltă o a doua stare conductivă a peptidei alameticina,
care are o amplitudine mult mai mare decât cea din prima stare conductivă. Acest lucru poate continua
până la un număr de 12 monomeri dar este de menționat faptul că, cu cât porul este mai mare, va fi m ai
instabil.

51
Inserarea precum și formarea porilor de către monomeri va fi monotorizată prin înregistrarea în
timp a curentului ionic ce străbate bistratul în urma aplicării unor valori ale diferenței de potențial.
Așa cum am văzut în primul capitol, alam eticina este puternic hidrofobă iar caracterul dipolar
precum și modul în care această se inseră în membrană, cu capătul N -terminal, îi dictează modul de
formare a porilor doar la diferențe de potențial negative. Peptida este adăugată în compartimentul leg at
la masă, aceasta se va insera în membrană atunci când un potențial negativ străbate electrodul din
compartimentul opus. La diferențe de potențial pozitive o să observăm că nu apar fluctuații ale
curentului ionic înregistrat.

Figura III.2. Înregistrare a curentului ionic macroscopic prin canalele de alameticină în funcție de timp, atunci când
din exterior aplicăm o diferență de potențial de -80 mV (c), respectiv -100 mV (d). Se observă cum activitatea alameticinei
crește pe măsură ce crește diferența de potențial electric. În a) avem înregistrat curentul ionic atunci când diferența de
potențial este nulă, iar în b) am înregistrat curentul ionic la aplicarea unei diferențe de potențial pozitive, +100 mV,
activitatea alameticinei este nulă în acest caz.

Observăm din înregistrările de mai sus faptul că activitatea peptidei se intensifică pe măsură ce
creștem valorile diferenței de potențial. Din cadrul acestor măsurători rezultă foarte clar că alameticina
formează canale ionice voltaj -dependente. După cum o să observăm și din cadrul diagramelor curent –
tensiune, amplitudinea unei stări conductive va crește pe măsură ce crește diferența de potențial.

52
Diagramele curent -tensiune au fost realizate prin determinări succesive ale amplitudinii curentului
ionic prin por, 10 determinări mai exact, la diferite valori ale diferenței de potențial ( -80 mV, -85 mV și
-90 mV), calculând pentru acestea valoarea medie și eroarea standard, la aplicarea unor diferențe de
potențial diferite. Mai jos am determinat deviația standa rd a determinărilor amplitudinilor de curent
ionic mediate de canalele ionice de alameticină pentru valori diferite ale dif erenței de potențial electric.
ΔV(mV) σ (pA)
-80 32.81
-85 35.72
-90 38.61

Tabel III. 1. Valorile deviației standard ale canale lor ionice de alameticină aflate în diferite stări de conductanță
supuse unor diferențe de potențial diferite.

Figura III. 3. Reprezentarea grafică a deviației standard, notată cu σ, în funcție de diferența de potențial aplicată.

Mai jos am atașat o ved ere detaliată a amplitudinilor stărilor conductive corespunzătoare unui
singur canal de alameticină ce se găsește în prima stare conductivă, a doua și a treia stare conductivă la
aplicarea unei diferențe de potențial negative.
2930313233343536373839
-80 -85 -90 σ (pA)
ΔV (mV)

53

Figura III. 4. Fluctuațiil e curentului electric mediate de către canalele ionice de alameticină, supuse unei diferențe
de potențial de -80 mV, unde C (close) reprezintă starea închis. În această stare nu există nici un canal ionic inserat în
membrană. Cu O I (open), am notat starea conductivă I a canalului ionic inserat în membrana lipidică, cu O II starea
conductivă II a canalului ionic, respectiv cu O III, starea conductivă III a canalului ionic de alameticină.

Pentru citirea amplitudinilor respectivelor stări conductive am folosit softul de prelucrare
dedicat Clampfit, prelucrarea statistică cât și reprezentarea grafică a diagramelor s -a făcut cu ajutorul
softului Origin.

54

Figura III. 5. Diagrame curent -tensiune ce arată dependența amplitudinii curentului corespunzător stării condu ctive
I (a), II (b) și III (c), față de diferența de potențial aplicată. Liniile punctate reprezintă fitarea liniară a datelor prin origine.

Prin fitarea liniară a acestor date obținute în urma măsurătorilor vom obține o dreaptă ce trece
prin origine iar panta descrisă de aceasta este chiar valoarea conductanței pentru fiecare stare
conductivă descrisă de canalul ionic de alametiicină. Valorile conductanței precum si eroarea standard
sunt prezentate în tabelul de mai jos.
Stare conductivă G (pS)
I 64 +/ -0.56
II 397 +/ -1
III 1068 +/ -0.99
Tabel III. 2. Valorile conductanței electrice pentru canalele ionice de alameticină, determinate din fitarea liniară a
datelor, aflate în stările conductive I, II, respectiv III, împreună cu erorile standard.

55
III. 2. Analiza macroscopică a fluctuațiilor de curent ionic prin oligomerii
transmembranari de alameticină. Determinarea proprietăților cinetice și de transport ale
canalelor de alameticină folosind metoda ”noise analysis”

Cu ajutorul softului dedicat Clampfit, am preluat porțiunile macroscopice pentru respectivele
diferențe de potențial, -80 mV, -85 mV, -90 mV, -95 mV, prelucrându -le ulterior în softul dedicat
Origin și reprezentându -le grafic. Dupa o fitare de tipul multi -peacks am obținut o reprezentare a
stăril or conductive deschise și a celor închise mult mai evidențiată a canalelor ionice de alameticină .

56
Figura III. 6. Reprezentări grafice care arată stările cinetice ale canalelor de alameticină inserate în biomembrane
artificiale, în funcție de curentul el ectric mediat de aceste canale ionice. Starea închis a canalelor ionice este reprezentată cu
albastru iar stările deschis, cu roșu , unde pentru fiecare diferență de potențial am atașat și o reprezentare pe scară
logaritmică. Starea închis a canalelor am no tat-o cu C (close), prima stare conductivă cu O 1(open) iar a doua stare
conductivă cu O2. În cadrul panelului a) am reprezentat stările de conductanță ale canalelor de alameticină pentru o
diferență de potențial de -80 mV, în panelul b) pentru diferența de potențial de -85 mV, în c) avem o diferență de potențial
de -90 mV iar în panelul d) am reprezentat stările conductive pentru diferența de potențial de -95 mV. După cum se observă
pentru diferența de potențial de -95 mV a fost dificil să indicăm stările de conductanță deschis deoarece activitatea
alameticinei la diferențe de potențial mari devine din ce în ce mai mare iar în membrană apar stări conductive care abundă.
După cum se poate observa , și la nivel macroscopic putem analiza activitatea conductivă a
canalelor ionice de alameticină, în special pe scară logaritmică putem determina și stările de
conductanță respective. Totodată, comparând graficele putem observa ușoara creștere a stărilor
conductive din starea deschis precum și apariția lor cu creștere a diferenței de potențial.
Cu ajutorul fitului multi -peaks am putut determina ariile respective stării deschis cât și a stării
închis, contribuind în cele din urmă la calcularea ariei totale . Cu ajutorul acestor arii , corespunzătoare
stărilor închise și de schise , am putut calcula probabilitățile, pentru fiecare diferență de potențial a
canalelor ce se găsesc în starea desc his, respectiv în starea închis.

Figura III. 7. Histograma probabilităților stărilor închis (close) și deschis (open) a canalelor ioni ce de alameticină
în funcție de diferența de potențial aplicată sistemului nostru biofizic. Cu roșu deschis am reprezentat stările deschise ale

57
canalelor iar cu albastru deschis stările închis ale canalelor ionice. P entru fiecare creștere a diferenței de potențial aplicată ,
probabilitatea de a găsi canalele ionice închise scade iar probabilitatea de a găsi canalele în starea deschis crește.
Histograma probabilităților ne întărește punctul de vedere avut până în prezent, după cum se
poate bine observa, prob abilitatea de găsi canale deschise crește în timp cu aplicarea unor diferențe de
potențial din ce în ce mai mari.

58
Concluzii
1. La diferențe de potențial nule, alameticina este orientată longitudinal pe suprafața
membranei celulare. La aplicarea une i diferențe de potențial, datorită momentului dipolar,
capătul N -terminal este forțat să se insere în membran a încărcată negati v.
2. Canalele de alameticină adoptă modelul barrel -stave în momentul în care monomerii se
inseră în membrană. Suprafața hidrofobă a monomerilor de alameticină interacționează cu
cozile lipidice hidrocarbonate iar suprafața hidrofilă este orientată spre interiorul porului
apos creat.
3. Curentul macroscopic al membranelor dopate cu pori apoși, creați de monomerii de
alameticină, a pus în evidență o creștere a activității conductive și a permeabilității la
diferențe de potențial negative din ce în ce mai mari.
4. La nivel de single channel , canalele au prezentat diverse stări conductive a căror
amplitudine crește cu creșterea diferenței de po tențial aplicate.
5. Alameticina formează canale tip elicoidale inserând capătul N -terminal în membranele
lipidice sub acțiunea unei diferențe de potențial prag.
6. În ceea ce privește probabilitatea de a găsi canalele în starea deschis, se observă o ușoară
creștere a probabilității odată ce creștem diferența de potențial, pe când probabilitatea de a
găsi canale în starea închis scade.
7. Alameticina formează stări conductive plecând de la un minim de 4 monomeri, cu cât crește
numărul de monomeri, porul este mai ins tabil.
8. Activitatea alameticinei devine greu de analizat la aplicarea unor diferențe foarte mari de
potențial deoarece se formează multiple canale care prezintă activități diferite, cu stări
conductive diferite.

59
Bibliografie

1. Tudor Luchian, Introducer e în biofizica moleculară și celulară, Editura Universității “ Al. I.
Cuza” Iași -2001 .
2. Tudor Luchian, Electrofiziologie moleculara. Teorie si aplicatii, Editura „ Sedcom Libris', 2006 .
3. Lehninger_Biochemistry_4e_2005 .
4. Robert E. W. Hancock, Annett Rozek, Rol e of membranes in the activities of antimicrobial
cationic peptides, FEMS Microbiology Letters 206: 143 -149, 2002 .
5. Kathleen F. Wang, Ramanathan Nagarajan, Terri A. Camesano. Antimicrobial peptide
alamethicin insertion into lipid bilayer: A QCM -D exploratio n, Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces 116: 472 -481, 2014 .
6. Yong Jeong, Introduction to Bioelectricity .
7. Takashi Nagao, Daisuke Mishima, Namsrai Javklantugs, Jun Wang, Daisuke Ishioka, Kiyonobu
Yokota, Kazushi Norisada, Izuru Kawamura, Kazuyoshi Ueda, Aki ra Naito, Structure and
orientation of antibiotic peptide alamethicin in phospholipid bilayers as revealed by chemical
shift oscillation analysis of solid state nuclear magnetic resonance and molecular dynamics
simulation, Biochimica et Biophysica Acta (BB A) Biomembranes , Volume 1848, Issue 11, Part
A, 2789 -2798, 2015 .
8. Nick B. Standen, Noel W. Davies, Philip D. Langton, Separation and analysis of macroscopic
currents, 1999 .
9. Ebooks – Chemistry – Biochemistry Garett And Grisham 2Nd Ed .
10. D. P. Tieleman, H. J. C. Berendsen, M. S. P. Sansom, Voltage -Dependent Insertion of
Alamethicin ar Phospholipid/Water and Octane/Water Interfaces, Biophysical Journal, Volume
80, Issue 1, 331 -346, 2001 .
11. Christina G. Siontorou, Georgia -Paraskevi Nikoleli, Dimitrios. P. Nikolelis, S tefanos K.
Karapetis, Artificial Lipid Membranes: Past, Present and Future, Membranes, 2017 .
12. Frederick J. Sigworth, Interpreting Power Spectra from Nonstationary Membrane Current
Fluctuations, Biophysical Society, Volume 35, 289 -300, 1981.
13. Ali Adem Bahar, Dacheng Ren, Antimicrobial Peptides, Pharmaceuticals, 1543 -1575, 2013.

60
14. L.J. DeFelice, Introduction to membrane noise, Plenum Press, New York, 1981 .
15. Michael A. Wilson, Andrew Pohorille, Calculating Conductance of Ion Channels – Linking
Molecular Dynamics and Electrophysiology, Journal of Physics: Conference Series 574, 2015
16. F. Conti, E. Wanke, Channel noise in nerve membranes and lipid bilayers, Quarterly Reviews
of Biophysics 8, 1975
17. D. Colquhoun, A. G. Hawkes, The principles of the stochastic interpretation of ion -channel
mechanisms, 1983
18. Ramakrishnan Nagaraj, Padmanabhan Balaram, Alamethicin, a Transmembrane Channel, Acc.
Chem. Res. , 356 -362, 1981
19. Michael R. Yeaman, Nannette Y. Yount, Mechanism of Antimicrobial Peptide Action and
Resistance, Pharmacologica l Review, 2003
20. William Porto, Octavio L. Franco, Osmar Nascimento Silva, Prediction and Rational Design of
Antimicrobial Peptides, Protein structure, Edition 1, Chapter 17
C. Li, T. Salditt, Structure of Magainin and Alamethicin in Model Membranes Studied by X –
Ray Reflectivity, Biophysical Journal, Volume 91, 3285 -3300, 2006