Lucrare de licenta [620250]

UNIVERSITATEA ”ALEXANDRU IOAN CUZA ” din IASI
FACULTATEA DE CHIMIE

Lucrare de licenta

Coordonator stiintific,
Lect. Dr. Brindusa -Alina Petre
Absolvent: [anonimizat]
2018

UNIVERSITATEA ”ALEXA NDRU IOAN CUZA” din IASI
FACULTATEA DE CHIMIE
SPECIALIZAREA CHIMIE MEDICALA

Lucrare de licenta
Identificarea si caracterizarea epitopilor
peptidici prin metode de afinitate si
spectrometria de masa

Coordonator stiintific,
Lect.dr. Brindusa -Alina Petre
Absolvent: [anonimizat]
2018

Cuprins
Cuprins ……………………………………………………………………………………………1
Abreviatii …………………………………………………………………………………………2
Lista de figuri ……………….. ………………………………………………………………….3
Lista de tabele ……………………………………………………………………………………4
1.Introducere ……………………………………………. …………….. ………………………….5
1.1 Introducere in chimia peptidelor si proteinelor
1.2 Mioglobina. Structura si functie.
1.3 Boli si tratament
1.4 Structura si biodiversitatea imunoglobulinelor
1.5 Introducere in spectrometria de masa
1.6 Biosenzori
1.7 Obiectivele acestei teze
2.Metode si software………..
2.1 SDS PAGE in conformitate cu Laemmli
2.2 SPR – bisenzor pentru determinarea rezonanei plasmonilor de la suprafata
2.3 Spectrometria de masa asistata de matrix prin desorbtie/ionizare cu laser si analizator
de masa timp de zbor(MALDI -TOF)
2.4 Analiza biomoleculelor utilizand ionizarea cu electrospray(ESI -MS)
2.5 Digestia proteolitica la presiune atmosferica si presiune inalta
2.6 Coloana de afinitate. Extractia epi topului
2.7 Software
3. Partea experimentala.Rezultate si discutii…..
3.1 Materiale si reactivi
3.2 Validarea proteinelor prin SDS PAGE
3.3 Determinatea constantei de afinitate a mioglobinei prin SPR
3.4 Analiza mioglobinei prin ESI MS
3.5 Analiza diges tiei proteolitice cu ajutorul MALDI -TOF
3.6 Analiza digestiei proteolitice cu presiune utilizand MALDI -TOF
3.7 Identificarea epitopilor utilizand MALDI -TOF
5.Concluzii
6.Bibliografie

Abreviatii
MS spectrometrie de masa
SPR rezonanta plasmonilor de suprafata
MALDI ionizarea/desorbtia cu laser asistata de matrix
TOF timp de zbor
UV ultraviolet
ESI ionizarea cu electrospray
SDS PAGE electroforeza gelului de poliacrilamida in prezenta sulfatului dodecil de sodiu
HCl acid clorhidric
PCT tehnologia cu presiune in cicluri
ADN acid dezoxiribonucleic
EDC 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carboimida
NHS N -hidroxisuccinimida
HPLC cromatografia lichida la presiune inalta
APS persulfat de amoniu
TEMED N,N,N,N – tetrametiletilendiamina
SAM monostrat auto -ansambat
PBS fosfat de sodiu dihidrat dibazic
TFA acid trifloracetic
ACN acetonitril
DHB acid 2,5 -dihidroxibenzoic
SDHB acid super 2,5 -dihidroxibenzoic
TWEEN polietilen gicol sorbitan monolaurat

Lista cu figuri
Figura 1.1 Structura chimica de baza a aminoaci zilor
Figura 1.2 Reprezentarea schematică a unei structuri de imunoglobulină G și a situsului de
legare a antigenului.
Figura 1.3 Formarea CDR în procesul de recombinare somatică

Lista de tabele
Tabelul 1. Lista cu aminoacizi esentiali naturali.
Tabel 2.Lista perechilor complementare care pot fi studiate folosind sistemele biosenzor

1.Introducere
1.1 Introducere in chimia proteinelor si peptidelor
Proportii mari din celulele noastre, musc hi si tesuturi sunt cuprinse din aminoacizi, peptide si
prote ine. Functii importante, cum sunt integritatea, comunicarea celulara si sarcina de transportor
de nutrient sunt executatae de aceste macromolecule. In special, aminoacizii influenteaza functia
organelor, glandelor, tendoanelor si arterelor. Un alt rol impo rtant este vindecarea ranilor si
repararea tesuturilor, la fel si eliminarea deseurilor produsilor metabolici din corp.
”Termenul ”aminoacid esential” se refera la un aminoacid care este necesar pentru indeplinirea
nevoilor fiziolgice si care trebuie sa fi e furnizat de catre organism. Sunt 20 de aminoacizi
naturali, listati in tabelul1 din care arginina este sintetizata de catre corpul uman, iar metionina
este necesara in cantitati mari pentru producerea de cisteina” asa cum este prezentat in (1).
Aminoaci zii se leaga intre ei atunci cand gruparea carboxil a unei molecule reationeaza cu
gruparea amino de la o alta molecula, creand legatura peptidica –C(=O)NH – si elimina o
molecula de apa(H 2O). Aminoacizii sunt blocul de baza de constructie a enzimelor, horm onilor,
proteinelor si tesuturilor.

Figura 1.1 Structura chimica de baza a aminoacizilor.
In toti cei 20 de aminoacizi, cu excepria glicinei, atomul de carbon cu gruparea amino este atasat
la 4 substituenti diferiti.”Unghiurile legaturii tetraedrice al e carbonului si asimetria atasamentelor
fac posibil pentru aminoacizi sa aiba 2 structuri non -superimpozabile, formele L si R , care sunt
imaginile in oglinda a amandurora” este descrisa in (2). Singuri aminoacizi prezenti in proteine
sunt L aminoacizii. S unt 20 de aminoacizi naturali, si ei sunt prezentati in Tabelul 1.
O peptida este un lant scurt de aminoacizi legati prin legaturi amidice. Atunci cand un lant lung
neramificat este format, acea structura este numita o polipeptida.In consecinta, exista o c lasa
larga de poimeri si oligomeri, cateva zaharide si chiar acizi nucleici pot fi descrisi ca strucuri
peptidice.

Tabelul 1. Lista cu aminoacizi esentiali naturali.

Peptidele sunt formate din 2 sau mai multi aminoacizi. Cand lantul de aminoacizi este mai mare
de 10 atunci aceste structuri sunt numite proteine sau polipeptide, discutate si in (3)” peptidele
care cuprind peste 50 de aminoacizi sunt clasificate ca proteine”. Toata informatia genetica
despre proteine poate fi gasita in ADN( acid dezoxiribonucleic) .”Descoperirea sa a fost facuta in
1960 de catre Marshal Nirenberg la Institutul National de Sanatate(NIH) cand a dedus cum este
intocmit ADN -ul.”, aceasta a fost aratata in (3).
Proteinele sunt formate din aminoacizi care sunt cara cterizati din urmatoarea substuctura: –
CH(NH2)COO -. Diferenta dintre proteine si peptide este bazata pe dimensiune, si ca numar
arbitrar, o peptida poate fi recunoscuta ca fiind o structura care contine cel mult de 50 de
aminoacizi(4)(5).Intrucat tehnicile de laborator aplicate sunt diferite pentru peptide, contrare
polipeptidelor sau proteinelor, acest numar 50 nu este absolut. Un exemplu este lantul lung β –
amloid care este format din 42 de aminoacizi si se considera a fi o proteina.
Proteinele si peptide le se gasesc intr -o varietate larga de structuri in corpul uman. Cheratina este
o proteina cunoscuta prezenta(15% -17%) in parul unam si unghii. O alta proteina cunoscuta este
colagenul, cuprins in aproximativ 20 -30% din toate proteinele.

Structura protein elor si rolul acestora in metabolism
Proteinele reprezintă unul dintre elementele de bază ale țesutului corporal. Le plac alte
macromolecule biologice (biomacromoleculele) sunt părți esențiale ale organismelor și participă
la toate procesele biologice din celule. Proteinele au multe roluri importante în toate organismele
vii, de la bacterii și viruși, prin ciuperci la plante și animale, inclusiv la oameni. Ele funcționează
ca catalizatori, transportatori și depozitarea altor molecule, precum și pentru a ofe ri răspuns
imun, a genera mișcări, a transmite impulsuri nervoase sau a controla creșterea și diferențierea.
[Berg 2002, Whitford 2005]. Proteinele sunt polimeri liniari care se formează din aminoacizi.
Reziduurile individuale de aminoacizi sunt legate cu resturile adiacente prin legătura peptidică în
lanțuri lungi (numite polipeptide). Deși toate proteinele sunt compuse din cei 20 (cu excepția
selenocisteinei și pirolizinei) L -a-aminoacizii, aceste molecule sunt foarte complexe și diferă în
funcție de mări me, de numărul de subunități, de funcții și de alte proprietăți. În plus, proteinele
pot fi modificate posttranslațional (fosforilare, glicozilare, legături disulfidice etc.) sau legate
covalent / necovalent la alte molecule (ioni de fier, moleculă organic ă, grup hemă etc.). Fiecare
dintre aceste modificări poate modifica proprietățile chimice și fizice, stabilitatea, activitatea și,
în cele d in urmă, plierea și funcția proteinelor.(Berg 2002, Tlier 2011)
După dezintegrarea secvenței genomului în multe orga nisme, numărul de proteine cunoscute a
crescut rapid. Cu toate acestea, majoritatea structurilor lor sunt încă necunoscute. Din păcate,
determinarea secvenței de aminoacizi nu este suficientă pentru elucidarea structurii
tridimensionale a proteinei. În c eea ce privește structura, secvența de aminoacizi menționată mai
sus (ordinea resturilor în lanțul polipeptidic) este denumită "structură primară". Plierea lanțului
de polipeptidă în structură obișnuită, cum ar fi helix alfa, foaie beta, întoarcere sau buc lă, este
denumită "structură secundară" și forma generală a moleculei unice este denumită "structură
terțiară". Dacă ansamblul de proteine constă din mai mult de o moleculă, atunci aranjamentul
spațial al tuturor subunităților este denumit "structura cua ternară" (Fig. 1 .2) [Berg 2002, Voet
2011].

Figura 1.2 Nivelele diferite ale structurii proteinelor.
Funcția fiziologică a proteinelor din organisme depinde în mod direct de structura lor
tridimensională și, prin urmare, elucidarea structurii proteinei poate descoperi, de asemenea,
funcția sa fiziologică. Acesta este motivul pentru care cercetarea structurilor proteice și
dezvoltarea metodelor de determinare a acestora este încă un domeniu științific atractiv .
Unul din motivele pentru cercetar ea scumpa a peptidelor este ca ele permit formarea a
anticorpilor in animale fara necesitatea purificarii proteinei de interes (6). Aceasta permite
sinteza a peptidelor antigenice a unei proteine specifice care pot eventual fi folosite la
dezvoltarea antic orpilor la animale impotriva proteinei stabilite. Folosind spectrometria de masa
pentru a cartografia secventele de proteine bazate pe masele peptidelor si structura aminoacizilor
a devenit un protocol obisnuit. Dar deoarece primele experimentele au permi s determinarea
structurii chimice de baza, in zilele noastre oamenii de stiinta sunt capabili sa foloseasca diferite
abordari ale structurilor aminoacizilor cu lant lungi pentru a descoperi mai multe informatii
despre rolul lor in corpul uman.

1.2 Mioglobi na. Stuctura si functie
Mioglobina este o proteină mică, monom erică, care servește ca depozit intracelular de oxigen . Se
găsește în abundență în mușchii scheletici ai vertebratelor și este responsabil pentru culoarea
roșie caracteristică a țesutului muscul ar. Mioglobina este strâns legată de hemoglobină, care
constă din patru su bunități asemănătoare cu mi oglobina care formează un tetramer și sunt
responsabile pentru transportul oxigenului în sânge. La om, mioglobina cardiacă transmisă în
sânge poat e servi ca a biomarker al atacului de cord, deoarece nivelurile de mioglobină din
sânge cresc în următoarele două până la trei ore leziuni musculare. Structura atomică a
mioglobinei a fost cunoscută încă din 1957, când John Kendrew a demonstrat că cristalografia c u
raze X poate dezvălui stru ctura proteinelor întregi . Mi oglobina se evidențiază ca prima
proteină determinată structural și a fost subiectul a numeroaselor studii detaliate realizate de un
număr mare de metode experimentale ș i computationale datorită capacității sale de a lega
reversibil oxigenul. Capacitatea de legare la oxigen a mioglobinei este conferită de un grup
protetic heme care, se află într -o cleftă a moleculei de mioglobină. Structura și dinamica gruparii
heme și mediul său înconjurător, joac ă un rol esențial în capa citatea mioglobinei de a lega
oxigenul și rezistă la legarea monoxidului de carbon (CO se leagă ireversibil la heme, făcându -l
inaccesibil pentru O2).
Tabel 2. Distribuia aminoacizilor in secventa mioglobinei.
MGLSDGEWQVLNVWGK VEA DIPGHGQEVLIRLXGHPETL EKFDKXHLKSEDE MKAS
EDLKKHGATVLTALGGILKK K GHHEAEIKPL AQSHATKHKIPVKYLEfiS CIIQVLQSKH
PGDFG ADAQGAMNKALELFRKDMAS NYKEL GFQG

Figura 1.3 Strucura 3D a mioglobinei de la sperma de balena. Mioglobina este alcatuita din 8 α
helixuri(albastru) si gruparea heme(verde).
Mioglobina este o hemepro teină monomerică care se găsește în principal în țesutul muscular în
care servește ca situs de stocare intracelulară pentru oxigen. În timpul perioadelor de deprivare a
oxigenului, oxiimo globina eliberează oxigenul legat, care este apoi utilizat în scopuri metabolice .
Structura terțiară a mi oglobinei este cea a unei proteine globulare solubile în apă tipică. Structura
sa secundară este neobișnuită prin aceea că conține o proporție foarte mare (75%) de structură
secundară a -helicală. O polipeptidă mioglobina este formată din 8 spirale a -a separate, denumite
A până la H, care sunt conectate prin regiuni scurte ne -elicoidale Grupările R ale aminoacidului
ambalate în interiorul moleculei sunt predominant hidrofobe, în timp ce cele expuse pe suprafața
moleculei sunt în general hidrofile, făcând astfel molecula relativ solubilă în apă .
Grupul h eme constă din componenta organică protoporfirină și un atom de fier situat în centrul
său. Grupul heme dă mușchi și sânge culoarea lor roșie distinctivă. Componenta organică este
formată din patru inele de pirol care sunt legate prin punți metinice. În plus, heme este
responsabil pentru culoarea roșie a sângelui și a mușchiului. Oxidarea atomului de fier ( Fe2+ ->
Fe3+) este responsabilă în principal de culoarea mușchiului și a sângelui. În centrul
protopirininei, atomul de fier este legat la atomii de azot din patru inele de pirol. Atomul de fier
poate forma două legături suplimentare, unul pe fiecare parte a planului heme. Aceste site -uri de
legare sunt denumite site -urile de coordonare a cincea și a șasea. În mioglobină, al cincilea situs

de coordonare este ocupat de inelul imidazol dintr -un rest de histidină pe proteină. Această
hisitidină este denumită h istidină proximală. Cel de -al șaselea sit de coordonare este disponibil
pentru legarea oxigenului. Atomul de fier din deoxiimoglobină se află la aproximativ patru
angstromi din planul planului protoporfirin, deoarece este prea mare în această formă pentru a se
încadra în gaura bine definită.

Figura 1.3 Reprezentarea gruparii heme din interiorul moleculei de mioglobina, cu rolul de a
lega liganzi precum, oxigenul, monoxidul de carbon, etc.
Afinitățile de legare pentru oxigen între mioglobină și hemoglobină sunt factori importanți
pentru funcția lor. Atât mioglobina cât și hemoglobina se leagă bine cu oxigenul atunci când
concentrația de oxigen este foarte ridicată (de exemplu la plămâni), cu toate acestea,
hemoglobina este mai probabil să elibereze oxigen în zone cu concentrație scăzută (de exemplu,
în țesuturi). Deoarece hemoglobina leagă oxigenul mai puțin bine decât mioglobina în țesuturile
musculare, acesta poate transporta efectiv oxigen ul în organism și îl poate livra celulelor. Pe de
altă parte, mioglobina nu ar fi la fel de eficientă în transferul de oxigen. Nu arată legătura de co –
operare a oxigenului deoarece ar lua oxigen și va fi eliberată numai în condiții extreme.
Myoglobina are o afinitate puternică pentru oxigen care îi permite să stocheze oxigenul în
mușchi în mod eficient. Acest lucru este important atunci când organismul este lipsit de foame
pentru oxigen, cum ar fi în timpul exercițiilor anaerobe. În acest timp, nivelul diox idului de
carbon din fluxurile de sânge este extrem de ridicat, iar concentrația de acid lactic crește în
mușchi. Ambii acești factori determină mioglobina (și hemoglobina) să elibereze oxigenul,
pentru a proteja țesuturile organismului de a fi deteriorate în condiții dure. Dacă concentrația de
myoglobină este ridicată în interiorul celulelor musculare, organismul este capabil să utilizeze
oxigenul în plămâni pentru o perioadă mult mai lungă de timp. Myoglobinul, o proteină care
conține fier în mușchi, prim ește oxigen din celulele roșii și îl transportă în mitocondriile celulelor
musculare, unde oxigenul este utilizat în respirația celulară pentru a produce energie. Fiecare

moleculă de mioglobină are un grup protetic heme situat în cleftul hidrofob al protei nei. Funcția
de mioglobină este notabilă din revizuirea lui Millikan (1) în care a pus la punct un studiu
realizat pentru a stabili că mioglobina se formează adaptiv în țesuturi ca răspuns la nevoile de
oxigen și că mioglobina contribuie la aprovizionarea cu oxigen a acestor țesuturi. Oximioglobina
reglează atât aprovizionarea, cât și utilizarea oxigenului, acționând ca agent de curățare a
moleculei bioactive de oxid nitric. Oxidul de azot este generat continuu în miocit. Oximoglobina
reacționează cu NO pen tru a forma nitrați inofensivi, cu formarea concomitentă de mioglobină
ferică, care este reciclat prin acțiunea enzimei intracelulare metmioglobin reductază. Flogel (2) a
efectuat un studiu care a arătat cum interacțiunea dintre NO și oxymyoglobin controle ază
utilizarea oxigenului cardiac.

Figura 1.4. Curba de legare a oxigenului in cazul mioglobinei.
1.3 Boli si tratament
Rabdomioliza este un sindrom grav datorită unei leziuni musculare directe sau indirecte. Ea
rezultă din moartea fibrelor musculare și eliberarea conținutului lor în sânge. Acest lucru poate
duce la complicații grave, cum ar fi insuficiența renală (rinichi). Aceasta înseamnă că rinichii nu
pot elimina deșeurile și urina concentrată. În cazuri rare, rabdomioliza poate provoca moartea.
Cu toate acestea, tratamentul prompt dă ades ea un rezultat bun.
Cauzele rabdomiolizei
Există multe cauze traumatice și netraumatice ale rabdomiolizei. În prima categorie, cauzele
includ:
• rănire la strivire, cum ar fi un accident auto, căderea sau efortul fiz ic extrem
• Compresia musculară de lungă durată, cum ar fi cea cauzată de imobilizarea prelungită după o
cădere

• Sarcina la șocuri electrice, lovituri de trăsnet sau arsuri de gradul trei
• Utilizarea alcoolului sau drogurilor ilegale, cum ar fi heroina, cocai na sau amfetaminele
• Tulpină musculară extremă, în special la cineva care este un atlet netratat; acest lucru se poate
întâmpla și în sportivii de elită și poate fi mai periculos dacă se va sparge masa musculară.
• Utilizarea medicamentelor, cum ar fi antip sihotice sau statine, în special când sunt administrate
în doze mari
• O temperatură foarte ridicată a corpului (hipertermie) sau accident vascular cerebral de căldură
Semne și simptome de rabdomioliză
Semnele și simptomele de rabdomioliză pot fi greu de identificat. Acest lucru este în mare parte
adevărat deoarece cursa rabdomiolizei variază în funcție de cauza sa. Și simptomele pot apărea
într-o zonă a corpului sau pot afecta întregul corp. De asemenea, pot apărea complicații în fazele
timpurii și ulteri oare. "Triada clasică" a simptomelor de rabdomioliză sunt: dureri musculare la
nivelul umerilor, coapselor sau spatelui inferior; slăbiciune musculară sau probleme în mișcarea
brațelor și a picioarelor; și urină roșie sau maro.
Testele de sânge pentru cr eatinkinaza, un produs de defalcare a mușchilor și teste de urină pentru
mioglobină, o rudă de hemoglobină eliberată de mușchii afectați, pot ajuta la diagnosticarea
rabdomiolizei (deși la jumătate dintre persoanele cu afecțiune, testul cu mioglobină poate apărea
negativ ). Alte teste pot exclude alte probleme, pot confirma cauza rabdomiolizei sau pot verifica
complicațiile. Comportamentele frecvente ale rabdomiolizei includ niveluri foarte ridicate de
potasiu în sânge, care pot duce la bătaia neregulată a inimii sau la stoparea cardiacă și la
afectarea rinichilor (care apare la jumătate dintre pacienți). Aproximativ unul din patru dezvoltă
și probleme cu ficatul. O afecțiune numită sindrom compartiment poate apărea, de asemenea,
după resuscitarea fluidă. Ac eastă comprimare gravă a nervilor, a vaselor de sânge și a mușchilor
poate provoca leziuni tisulare și probleme cu fluxul sanguin.

Tratamente pentru rabdomioliză
Diagnosticul precoce și tratamentul rabdomiolizei și cauzele sale sunt cheia succesului. Doct orii
pot chiar inversa leziuni renale. Cu toate acestea, dacă sindromul compartimentului nu este tratat
destul de devreme, acesta poate provoca da une de durată . Tratamentul cu fluide intravenoase
(IV) ajută la menținerea producției de urină și prevenirea i nsuficienței renale. Rar, poate fi
necesar un tratament dializat pentru a vă ajuta rinichii să filtreze reziduurile în timpul recuperării.
Administrarea anomaliilor electrolitice (potasiu, calciu și fosfor) vă ajută să vă pro tejați inima și
alte organe. In cazuri grave estev nevoie de o procedură chirurgicală (fasciotomie) pentru a ușura
tensiunea sau presiunea și pierderea circulației dacă sindromul compartimentului amenință
moartea musculară sau deteriorarea nervului. În unele cazuri, poate fi necesar să v ă aflați în

unitatea de terapie intensivă (UTI) pentru a permite o monitorizare atentă. Cele mai multe cauze
ale rabdomiolizei sunt reversibile.
Dacă rabdomioliza este legată de o afecțiune medicală, cum ar fi diabetul sau tulburarea
tiroidiană, este nece sar un tratament adecvat pentru afecțiunea medicală. Și dacă rabdomioliza
este legată de un medicament sau de un medicament, utilizarea lui va trebui oprită sau inlocuita
cu alta alternativa.
Mioglobinuria este de obicei rezultatul rabdomiolizei sau distru gerii musculare. Orice proces
care interferează cu stocarea sau utilizarea energiei de către celulele musculare poate duce la
mioglobinurie. Eliberarea mioglobinei din celulele musculare este adesea asociată cu o creștere a
nivelurilor de creatinkinază (CK ), aldolază, lactat dehidrogenază (LDH), transaminază glutamic –
piruviculară (SGPT) și alte enzime. Când se excretă în urină, mioglobina, un monomer care
conține o moleculă de hem, similar cu hemoglobina, poate precipita, provocând obstrucție
tubulară și le ziuni renale acute.
1.4 Structura si diversitatea imunoglobulinelor
Anticorpii formează o familie de proteine plasmatice, cu două funcții speciale: (i) recunoașterea
specifică a agentului patogen care inițiază un răspuns imun și funcția biologică (ii) de recrutare a
altor celule și molecule pentru a distruge agentul patogen după legarea anticorpului. Cele două
funcții sunt separate în structura moleculei de imunoglobulină. Relația dintre structura și funcția
imunoglobulinei este rezultatul evoluției molec ulare, prin dublarea și diversificarea unui
domeniu în structura moleculei; există o uniformitate a domeniilor omoloage și o diversitate a
domeniilor de recunoaștere. Anticorpii constau dintr -o regiune constantă și una variabilă.
Regiunile variabile sunt i dentice cu mai mult de 95% pentru o specie, însă specificitatea lor
antigenică poate fi diferită chiar dacă regiunile variabile au modificat doar un aminoacid [13].
Imunoglobulina protoxică G1 (IgG1) este formată din patru lanțuri polipeptidice asamblate î ntr-
un complex macromolecular prin punți disulfidice. Două lanțuri sunt mai mici și se numesc
lanțuri ușoare, iar cele două lanțuri mai mari se numesc lanțuri grele. Cele două lanțuri grele sunt
identice, datorită faptului că doar una dintre cele două gene este exprimată în celulele B formând
anticorpul (excluziunea alilică – numai o genă alele funcționează pentru lanțul greu și pentru
lanțul ușor) [22].
Digestia proteolitică cu papain conduce la formarea a 3 fragmente: două fragmente Fab identice
(cu o gre utate moleculară de 50 kDa) conținând activitatea de legare a antigenului (legarea
antigenului de fragment, formată dintr -un lanț ușor ușor și o parte din lanțul greu) ; cel de -al
treilea fragment (cu o greutate moleculară de 80 kDa) nu se leagă de antigen , dar poate fi ușor
cristalizat (fragmentul Fc cristalizabil, este format din cele două părți rămase ale lanțurilor grele

și responsabil pentru funcțiile biologice efectoare ale anticorpilor ). Există 5 tipuri de clase de
lanțuri grele (μ, δ, γ, α, ε) și d ouă clase de lanțuri ușoare (κ și λ). Izotopul de anticorp depinde de
tipul lanțului greu și de clasa lanțului ușor (de exemplu, μk). Considerând că funcțiile efectoare
ale anticorpului sunt consecința numai a lanțului greu, moleculele de imunoglobulină su nt
clasificate numai pe clasele de lanțuri grele (lanțul IgM -p, lanțul IgG -y) [23.].

Figura 1.2 Reprezentarea schematică a unei structuri de imunoglobulină G și a situsului de legare
a antigenului. Anticorpul constă din două lanțuri grele și două lanțuri ușoare legate împreună cu
punți disulfidice în regiunea balamalei. Fiecare lanț greu constă din trei regiuni constante (CH) și
o regiune variabilă (VH); fiecare lanț ușor constă dintr -o regiune constantă (CL) și una variabilă
(VL). Regiunile variabile con tribuie la formarea domeniului de legare la antigen.
Fiecare lanț greu și ușor poate fi împărțit în domenii, fiecare format din cca. 110 aminoacizi.
Lanțul ușor are 2 domenii: VL, pentru regiunea variabilă a lanțului ușor (L) și CL, regiunea
constantă (κ s au λ). Lanțul greu are 4 domenii: VH – regiunea variabilă și trei domenii ale
regiunii constante – CH1, CH2, CH3. Între regiunile CH1 și CH2, există o regiune de comutare,
care oferă părții Fab o mobilitate ridicată în comparație cu Fc. Regiunile constante și variabile
ale lanțurilor ușoare și grele sunt codificate prin gene separate. Prin urmare, fiecare tip de VH
sau VL se poate combina cu fiecare regiune CH sau CL. Fiecare domeniu V sau C prezintă o
secvență de omologie; care derivă dintr -o genă comună a ncestrală. Caracteristică a structurii
domeniului lor este prezența a două resturi Cys care formează o punte disulfidică intra -domeniu.

În general, lanțul ușor este conectat la lanțul greu printr -o punte disulfidică. Lanțurile grele sunt
legate de punți di sulfidice în regiunea de comutare. Fiecare pereche este formată dintr -un lanț
greu și dintr -un lanț ușor și este capabilă să recunoască același epitop. IgG este glicozilat la
regiunea de comutare și la domeniul CH2. Reziduurile de carbohidrați sunt necesar e pentru
pliarea corectă și transportul imunoglobulinelor în timpul sintezei și, de asemenea, par a avea un
rol în rata catabolismului (24-28).

Figura 1.3 Formarea CDR în procesul de recombinare somatică. Când celulele B nu produc nici
o imunoglobulină, s egmente de gene individuale care codifică regiunile V, (D) și J ale lanțului
greu și ușor al moleculei de imunoglobulină sunt asamblate aleatoriu într -o singură moleculă.
Procesul de recombinare nu este precis și se introduc nucleotide suplimentare; număru l de
posibilități de diversitate a regiunii V de anticorpi este mare.
Un domeniu de imunoglobulină are o structură compactă globulară tridimensională și constă din
lanțuri polipeptidice din foaie β. Fiecare domeniu conține două părți: una constând din 4 la nțuri
de foi p și cealaltă din cele trei lanțuri care formează împreună un sandwich hidrofob stabilizat
de o punte disulfidică intra -domeniu. Aceste lanțuri sunt conectate prin așa -numitele domenii
"buclă" nestructurate. Lanțurile grele leagă lanțurile ușo are de regiunea "comutator", iar legarea
lor are loc numai în regiunea constantă, dar nu în regiunea variabilă.
Regiunile constante CH -CL formează împreună un nucleu compact hidrofob care oferă un punct
stabil pentru domeniile variabile și regiunile VH -VL formează un nucleu mai puțin hidrofob care

delimitează un șanț mic în care moleculele de antigen vor fi legate. Acest șanț împreună cu
părțile finale ale regiunii variabile formează situsul de combinație al moleculei de anticorp cu
antigenul sau paratoful . În regiunea variabilă, variabilitatea nu este uniform distribuită, dar există
unele vârfuri de variabilitate numite regiuni hipervariabile (HVR) sau regiuni complementare
determinate (CDR). Există 3 regiuni hipervariabile pentru VH, împărțite la 4 regiun i cadru.
Regiunile de cadre sunt formate din lanțuri de foi beta, dar CDR -urile sunt, în general, "regiuni
de buclă" care formează o suprafață perfect compatibilă cu epitopul de pe suprafața moleculei de
antigen. În formarea regiunii de legare la antigen, regiunile hipervariabile nu sunt codificate
genetic în genomul general, dar ele sunt obținute prin recombinare somatică în procesul de
maturare a celulelor B [24 -29]. O reprezentare schematică a unei molecule de imunoglobulină G
este prezentată în figura 5 . în timpul răspunsului imun se formează o multitudine de linii de
celule B, specifice diferitelor fragmente ale antigenului, fiecare linie de celule B producând un
singur anticorp după maturare. Prin separarea unui anticorp specific pentru un fragment de
antigen dintr -un grup de donatori, nu se poate aștepta o singură clonă, ci o variabilitate a
clonelor, cu afinități diferite pentru același fragment. În analiza structurală a autoprotecțiilor Ap,
datorită numărului mare de donatori de la care s -au obținut preparatele IVIg, s -au așteptat mai
multe clone cu diferite regiuni CDR care recunosc același fragment de peptide Aβ.
1.5 Introducere in spectrometria de masa
Spectrometria de masa(MS) este o tehnica cu rezolutie inalta utilizata in analiza ratiei
masa/sar cina a oricarei particule care poate fi ionizata.Este utilizata intr -un numar mare de
domenii, cu o istorie care prezinta marea sa aplicabilitate.
Ca metoda de analiza, MS a aparut in 1897 cand J.J Thomson, un fizician britanic a propus ca
particulele inca rate negativ cu un diametru de 1000 de ori mai mic comparat cu un atom sunt
cele mai mici blocuri de constructie a materiei, astazi numiti electroni. Asistat de Francis W.
Aston, Thomson a utilizat campul magnetic si electric pentru studiu miscarii acestor particule
ionizate. Datorita reflectiei diferite, ei au ajuns la concluzia ca sunt izotopi diferiti, insemnand ca
ei aveau 2 mase diferite. Prin urmare, o noua metoda experimentala a luat forma. Inventia
primului instrument spectrometric de masa este dato rita lui Francis W. Aston in 1919, care a
continuat sa lucreze la imbunatatirea metodei la universitatea din Cambridge.
Folosul acestei metode in comunitatea stiintifica a fost cu adevarat demonstrata in timpul celui
de al doilea razboi mondial. Aplicand cunostiintele sale in spectrometria de masa, fizicianul
Alfred Nier a fost cel care a determinat izotopul corect al uraniului care putea fi divizat. El a fost

capabil sa construiasca un instrument nou, care l -a ajutat sa determine rapid ca U -235 ers un
izotop fusionabil.
Cercetarea in domeniul spectrometriei de masa a fost utilizat doar pentru fizica pana cand 3
chimisti, Fred McLafferty, Klaus Biemann si Carl Djerassi au inceput investigarea mecanismelor
de fragmentare pentru diferite molecule organice. Ac esta a fost primul pas care permitea
determinarea structuii moleculare a moleculelor organice(26).
In decursul anilor au fost dezvoltate mai multe metode de analiza MS. FTICR rezonanta ion
ciclotron cu transformata Fourier a fost introdusa prima datade cat re Alan Marshall si Melvin
Comisarrow in 1971. Ambii au lucrau la UBC, Marshal a avut expertiza NMR, pe cand
Comisarrow s -a focalizat pe ICR si au realizat ca FT poate fi aplicata la ICR care a condus la
dezvoltarea FTICR MS.
Apoi, in 1988, spectrometria d e masa cu ionizarea electrospray(ESI MS) si ionizarea/desorbtia
cu laser asistata de matrix(MALDI) au aparut in scena MS aproape simultan. Cele 2 metode au
revolutionat spectrometria de masa si sunt cele mai utilizate metode de astazi. Aceste tehnici de
ionizare au revolutionat MS biologica si sunt cele mai dominante forme de ionizare a
macromoleculelor.(28). MS e o unealta de baza puternica pentru o varietate de aplicatii, de la
caracterizarea proteinelor, lipidelor, modificarilor post translationale si in teractiilor proteina –
proteina.
Primul pas in analiza MS este producerea ionilor in faza gazoasa ai compusului. Cand in faza
gazoasa este format un ion, acesta este supus fragmentarii care conduce la formarea unui radical
sau ion(care are un numar par de el ectroni) sau o molecula cu un radical nou. Aceste fragmente
au proprietati diferite si fiecare ion nou format se poate transforma in fragment. Spectrometrul de
masa utilizeaza aceasta proprietate si separa fragmentele in functie de raportul masa/sarcina si de
abundenta.
Pentru definirea masei unui atom, pot fi utilizate diferite metode.Pentru MS masa nominala este
calculata utilizand cea mai predominanta masa a izotopului fiecarui element rotunjind valoarea
cea mai apropita si integrala care corespunde num arului de masa. Pentru ca fiecare izotop are un
defect de masa unic, spectrometria de masa foloseste masa monoizotopica pentru fiecare element
si ia in considerare si acel defect.
In Figura 4 sunt reprezentate cele mai comune componente intre spectrometrel e de masa: sursade
ioni, un analizator de masa, si un detector de ioni.

Figura 4. Reprezentarea schematica a componentelor principale unui spectrometru de masa.
Cand caracterizam un spectrometru de masa prin performanta sa, sunt 5 Caracateristici care
trebuie luate in considerare:
• Limita gamei de masa – maximul m/z, pe care analizatorul de masa il poate analiza
• Viteza analizei – viteza de masurare pentru un domeniu particular de masa
• Transmisia – numarul de ioni din detector raportat la numarul de ioni din analizatorul de
masa
• Acuratetea masei – precizia raportului m/z
• Rezolutia – acuratetea cu care spectrometrul de masa poate distinge diferenta dintre 2
semnale de la ioni cu o diferenta mica a raportului m/z

1.6 Biosenzori

Bisenzorii sunt cele mai utilizat e si recente unelte. In zilele noastre, tehnologia biosenzorilor
foloseste nanotuburi si nanoparticule si rezultatele sunt mai de incredere in monitorizarea
biomoleculelor(30).
Scopul biosenzorului este de a furniza informatii rapide, in timp real, precis e si de incredere
despre analitul de interes. Analitul interactioneaza cu o pereche complementara, traductorii
proceseaza informatia in semnal electric si datele sunt prezentate ca grafic.

Asa cum s -amentionat, partea de recunoastere este de obicei o biomo lecula imobilizata pe un
matrix solid. Imobilizarea poate fi fizica prin fortele van der Walls sau prin activarea chimica a
suprafetei. Eficienta cuplarii fizice depinde de puterea interactiunii dintre suprafata biosenzorului
si biomolecula. Studiile(31) a rata ca interactiunile covalente au absorbtie non -specifica mai mica
si de asemenea nu permit conformatiei 3D sa se desfaca. Aceasta este importanta in interactiile
proteice pentru ca interactia poate fi studiata in conditii native. Proteinele sunt foarte sensibile la
fiecare schimbare din mediu si poate fi denaturata usor. Prin urmare, dezvoltarii de biosenzori
trebuie sa ia in considerare acest fapt si orice instrument care este folosit la asemenea studii ar
trebui sa urmareasa cateva conditii:
• Interactie rapida intre gruparea activata de la matrix si biomolecula
• Suprafata senzorului nu ar trebui sa necesite modificari port -sintetice inaintea etapei de
imobilizare
• Moleculele ar trebui sa se lege de suprafata homogena si ar trebui sa fie orientate
• Un matrix trebuie sa aiba o densitate de suprafata optimizata. Daca densitatea de
acoperire a suprafetei este prea mica, interactia va rezulta cu o valoare a densitatii
scazuta. De asemenea, daca este prea inalta, aceasta poate conduce la impiedicarea
sterica in in teractie.
• Un biosenzor ar trebui sa aiba o interactiune non -specifica sau aproapiata a biomoleculei
cu suprafata senzorului.(30)
Un biosenzor poate fi utilizat la studiu interactiunii dintre perechi complementare diferite.
Tabelul 2 prezinta o lista compe ta a perechilor complementare care pot fi studiate utilizand un
sistem biosenzor. In timpul interactiunilor se pot observa diferite modificari fizice, chimice, sau
biologice. Pentru a examina aceste schimbari si a le studia in conditii native, un traductor este
utilizat pentru a transforma aceste informatii in semnale electrice.
Tabel 3.Lista perechilor complementare care pot fi studiate folosind sistemele biosenzor
Analit Complementar
Enzima Substrat
Anticorp Antigen
Carbohidrati Receptor
Droguri Receptor
Celule Receptor
ADN ADN complementar
Ioni metalici Aminoacizi

Un traductor poate masura si transmite informatia care apare la un nivel de pH, poate consumul
si formarea substantei electroactiva, si detecta diferenta in temperatura, lumina, masa si
vascozitate. Potrivit cu schimbarile pe care le poate detecta un traductor, ei se pot clasifica in
transduceri optici, electrochimici, termici si acustici.(32)
Biosenzorii care au un traductor optic sunt cei mai utilizati. Ei functioneza masurand
schimbarile luminii dupa interactiunea cu suprafata senzorului. Aceasta schimbare poate fi in
intensitate, polarizarea si lungimea de unda unghiulara.(33)
Un alt tip de traductori utilizati des sunt cei elelctrochimici. Acest tip are proprietatea
transforma schimbarile de potential, curent, conductanta in semnal electric. Acesti traductori
sunt utilizati datorita costurilor mici si modul simplu de utilizare.(34)
1.7 Obiectivele si scopurile acestei lucrari
Interacțiunile între proteine și ligand sunt extre m de importante pentru o gamă largă de procese
biologice, iar modificările patofiziologice pot conduce la condiții de boală. Argumentând că
stările de boală rezultă adesea din modificări genetice în căile de semnalizare importante din
punct de vedere fizio logic, variantele proteice derivate din boală au fost utilizate frecvent pentru
a studia interacțiunile protein -ligand. Prin urmare, este important să se delimiteze caracteristicile
structurale ale speciilor legate în interacțiunile biopolimer. Dezvoltarea unor noi metode de
elucidare a studiilor cinetice împreună cu caracterizarea spectrometrică de masă a fost un
obiectiv important în studiile de interacțiune cu proteinele ligand și în descoperirea de
medicamente.
Scopul major al acestei teze este identifi carea epitopilor si caracterizarea acestora utilizand
afinitate a-metode le de spectrometrie de masă ca instrument e de investigare a interacțiunilor
protein a-ligand.

2. Metode
2.1 SDS PAGE in conformitatecu Laemmli
In ultimii 50 de ani, tehnicil e de electroforeza au evoluat d atorita rafinamentelor care s -au
facut in sistemele tampon, instrumentatie si tehnicile folosite pentru vizualizarea probelor.
Electroforeza proteinelor are o varietate de aplicatii cum ar fi: purificarea proteinelor, evaluarea
proteinelor purificate(de exemplu: in diferite etape in timpul separarii cromatografice),
colectarea datelor despre regularea expresiilor proteice sau determinarea marimii proteinelor,
punctul izoelectric(pI) si activitatea enzimatica. De fapt, un numar semn ificat de tehnici,
includand electroforeza in gel, focusarea isoelectrica(IEF), transferul isoelectric(blotting) si
electroforeza di -dimensionala(2D) pot fi grupate sub un singur titlu: electroforeza
proteinelor(Rabilloud,2010).
Atunci cand electroforeza e ste efectuata in gelul de acrilamida, acesta seveste ca o sita de
selectare in functie de marime in timpul separarii.Cand proteinele se misca prin gel ca raspuns la
actiunea campului electric, structura porilor gelului permit proteinelor mai mici sa treaca mai
rapid decat proteinele mai mari. Pentru separarea proteinelor, se pot folosi geluri care cuprind o
masa moleculara intre 5 si 250 kDa. Pentru a depasi limitele impuse de sistemele native PAGE,
Laemmli(1970) a incorporat un detergent, dodecil sulfat de sodiu(SDS) intr -un sistem
discontinuu de denaturare, astfel creand cea mai populara forma de electroforeza proteica,SDS –
PAGE.

Figura 1 .Electroforeza in gel. Modul de implementare a metodei SDS -PAGE implica prepararea
necesita turnarea a doua straturi di ferite de acrilamida intre doua placi de sticla. Stratul de jos
este responsabil pentru separarea in functie de marime. Stratul superior contine esantioanele cu
proba.

Ca urmare a electroforezei, modele de benzi de proteine pot fi vizualizate si supuse
analizei cantitative si calitative. Cum majoritatea proteinelor nu pot fi identificate in gel cu
ochiul liber, vizualizarea acestora este realizata prin utilizarea de colorant. Odata ce gelul este
”patat”, poate fi descris si analizat utilizand instrumente imagistice insotite de software
specializat. O tehnica de colorare a proteinelor ar trebui sa ofere urmatoarele caracteristici:
sensibilitate inalta si reproductibilitate, domeniu larg liniar dinamic, compatibilitate cu
tehnologiile in aval ca extractia p roteinelor si teste, blotting sau spectrometrie de
masa.Protocolul de colorare include de obicei urmatorii 3 pasi: fixarea proteinelor in metanol
acidic sau etanol, expunerea la solutia de colorant si decolorarea prin spalarea vopselei in exces.
Cele mai c ompune tehnici de colorare sunt: Coomassie stain, flourescent stains, silver stains,
negative stains si tehnologia stain free. Electroforeza este o tehnica directa, dar pot aparea
probleme in timpul diferitelor etape ale fluxului de lucru prin electrofore za.
2.2 Biosenzor pentru de terminarea rezonantei plasmonilor de la suprafata
Biosenzorii optici, cum sunt senzorii de determinare a rez onantei plasmonice(SPR),
traduc toare optice bazate pe unda optica si senzori cu interferometrie cu biolayer(BLI),
reprez inta grupul cu cea mai mare cota pe piata de analiza a interactiunilor
biomoleculare(BIA).Acesti senzori de bazeaza pe interactia luminii cu moleculele absorbite la
suprafata, permitand cuantificarea si analiza biomoleculelor prin analiza in timp real,
monitorizand schimbarile(de exemplu: intensitatea,lungimea de unda, polarizarea si aspectul)
pentru studiul interactiunilor protein -proteina, protein -acid nucleic, receptor -medicament si
printer altele si interactiunea lipide -proteina.
Biosenzorii SPR cuantif ica proteinele , interactiile proteice masurand schimbarile in
compozitia superficial a a un ui cip metalic -cuart modificat chimic. In masuratorile BIA, un
partener care interactioneaza este imobilizat in timp ce un altul trece pe deasupra suprafetei ca si
solutie. In timpul primelor exterimente SPR de imunotestare, anticorpi umani IgG absorbiti pe un
film subtire de argint au fost utilizati la detectarea anticorpilor anti-umani IgG in mediul apos. In
present, un ligand covalent imobilizat pe suprafata da dete ctare este utilizat pentru a capta
proteina tinta sau peptide din solutie, modificand astfel compozitia suprafetei. In biosenzorii SPR
confectionati din prisma(aranjamentul Kretschmann), un fascicul de lumina polarizata care trece
printr -o reflexive intern a totala la o interfata solutie -metal -prisma provoaca excitatia optica a
electronilor metalici , provocand astfel propagarea acestor electroni paralel cu suprafata.Acesti
electroni miscatori numiti plasmoni(unde electromagnetice) pot determina rezonanta
plasmonului de suprafata(SPR). SPR apare atunci cand impulsul fotonilor se potriveste cu
impulsul plasmonului de suprafata la un unghi specific al luminii incidente, rezultand o

diferenta(gol) de electron intre atomii de metal si transferul de energie. Prin u rmare, printe
electronii oscilanti de pe suprafata genereaza un camp evanescent, de aproximativ 100 nm pe
fiecare parte a suprafetei metalice. Momentul plasmonilor, si prin asociere si campul electric este
foarte sensibil la compozitia mediului de deasupra suprafetei metalice. Modificarile in
configuratia biomoleculei pe suprafata de detectare, impusa de interactiunile de afinitate intre
moleculele din solutie si suprafata de metal modificata, prin urmare necesita o modificare a
unghiului de intrare a lumin ii pentru ca SPR sa aibe loc. Acest semnal optic este inregistrat de un
diode array detector(DAD) sau un dispozitiv de cuplu incarcat(CCD) care se gasesc in biosenzor.
In consecinta, spectrul de intensitate a unghiului se modifica cu compozitia fizico -chimica a
suprafetei cipului de aur -cuart.

Figura 2. .Kretschmann a confectionat biosenzorul de rezonanta plasmonica de suprafata.
Modificarea unghiului a unui fascicol de lumina polarizat si reflectat este detectata de un
detector optic, care este inregistat de biosenzor.

Principalul dezavantaj al analizei cu biosenzori este incapacitatea de a furniza informatii
structurale ale moleculelor care interactioneaza fara a se combina cu alte metode(de exemplu:
spectrometria de masa). Prin urmare, bi osenzorul cuplat cu spectrometria de masa este cea mai
recenta dezvolatare in abordarile pe mai multe planuri utilizate pentru studiul proteinelor si
interactiunilor proteice(BIA -MS) si poate depasi aceste limite. Cum SPR reprezinta o metoda
nedesctructiva de detectie, proteinele pot fi caracterizate din punct de vedere structural dupa
afinitate, cum ar fi prin on -chip MALDI -TOF -MS sau prin micro recuperarea de pe suprafata
SPR, cum s -a mentionat anterior.In orice caz, aceasta abordare este limitata de inte ractiile slabe
de afinitate, cum sunt interactiile carbohidrati -proteina deoarece acestea produc cantitati
insuficienta pentru analiza MS. Prin urmare, sistemele noi, ca SPR -MS online sunt necesare
pentru depasirea acestor dificultati proceduale.
2.3 Spectrometia de masa asista ta de martix prin desorbtie/ionizare cu laser si analizator de masa
de tipul timp de zbor(TOF)
Analiza de spectrometrie de masa MALDI este efectuata prin incorporarea moleculelor
de analit intr -un exces de marix specific unei l ungimi de unda de absorbtie, care este uscata
pentru a produce un amestec cocristalizat. Ionii sunt de obicei generati prin bombardarea probei
de impulsuri ai luminei UV pentru o scurta durata de timp(1 -10 ns) de la laserul de nitrogen.
Atunci cand laserul loveste cristalele matrixului, depunerea energiei se crede a fi cea care
cauzeaza incalzirea rapida a cristalelor produse de moleculele matrixului emitand energie
absorbita sub forma de caldura. Incalzirea rapida cauzeaza sublimarea cristalelor matrixului si
expansiunea matrixului si analitului in faza gazoasa. Ionii sunt posibili a fi formati prin reactiile
faza gazoasa -transfer de protoni in coloana de faza gazoasa extinsa cu molecule de matrix
fotoionizat. O ilutstratie a procesului MALDI est e aratat sc hematic in Figura 3 .

Figura 3 .Reprezentarea schematica a formarii ionilor in spectrometria de masa MALDI

Este necesar ca moleculele de matrix sa posede abdorbie UV la lungimea de unda a
laserului, sa aiba volatilitate scazuta si sa aiba capacitatea de a t ransfera protoni la moleculele de
analit.Matrixul tipic potrivit pentru MALDI -MS a peptidelor/proteinelor include o varietate de
acid cinamic si derivati de acid benzoic hidroxilat.
Pentru analiza MALDI -TOF MS a proteinelor si peptidelor, probele sunt mai intai
cocristalizate su un exces de matrix. Urmati de un implus laser scurt, analitii sunt absorbiti si
ionizati in faza gazoasa, si valoarea lor m/z sunt determinate de un analizator de masa TOF. In
analizatorii TOF, raportul masa/sarcina a unui ion este determinat prin masurarea timpului de
zbor. Dupa accelerarea ionilor in sursa la o energie cinetica fixa, ei trec printr -un camp de
derivatie cu o velocitate proportioanala cu (m i/zi)-1/2 (mi/zi este raportul masa/sarcina a unei specii
particulare de ion). Datorita velocitati dependente de masa a lor, ionii sunt separati in timpul
zborului. Un detector la capatul tubului de zbor produce un semnal pentru fiecare specie de ioni.
Timpul de zbor uzua l este intre cateva microsecunde si cateva 100 µs.
2.4 Analiza biomoleculelo r utilizand ionizarea cu electrospray(ESI -MS)
Dezvoltarea tehnicilor de ionizare soft(ESI si MALDI) la inceputul anilor 1990 reprezinta
o descoperire majora in analiza biopolimeril or cum sunt peptidele sau alte macromolecule.
Datorita acuratetei analtice inalte si necesitatea unei cantitati mici de proba atat pentru
indentificarea masei moleculare exacte dar si analiza structurala a plierii proteinelor,
interactiunilor proteina -proteina și proteina -ligand, metodele ESI si MALDI -MS sunt foarte
preferate. Ambele tehnici de ionizare sunt considerate a ioniza ”usor” analitul, asa cum o energie
mica este transferata in timpul etapei de ionizare rezultand in fragmentarea mica sau chiar del oc
a legaturii amidice a proteinelor. In combinatia cu diferite fragmentari sau metode proteolitice de
digestie partiala, acest lucru permite intelegerea secventei de aminoacizi, modificarile post –
translationare si chiar analiza complecsilor non -covalenti formati de proteine si gruparile
protetice.
ESI este o metoda de ionizare la presiune atmosferica, care produce molecule intacte
ionizate in faza gazoasa de la un analit dizolvat in solutie. Proba este de obicei intodusa in sursa
de ioni prin infuzia cu aj utorul unei seringi sau un sistem de cromatografie lichida asigurand
debite in rate de µL min-1 . Sursa ESI consta intr -o capilara in fata bornei de intrare a
spectrometrului de masa(Fig. 112). Intre capilara si borna de intrare, o diferenta de potential i n
interval kV redus este aplicata, care face ca solutia de analit injecatata sa formareza conul
Taylor. La varful acestui con, fluxul de lichid se transforma in picaturi mici atunci cand limita
Rayleigh este atinsa, insemnand ca repulsia electrostatica a particulelor a depasit tensiunea

superficiala a fluxului de lichid. Picaturile, cu dimensiuni in gama micrometrilor, sunt atasate la
intrarea in capilara a spectrometrului de masa.
Figura 4. Reprezentarea schematica a sursei de ionizare cu electrospray.
In timpul zborului, densitatea sarcinii pe suprafata micro -picaturilor creste mai mult pana
la limita Rayleigh este atinsa, determinand fiziunea Coulomb, scindandu -le in picaturi mai mici
si mai stabile. Formarea ionilor in faza gazoasa din ioni solvatati este inca discutata si au fost
propuse doua teorii principale: In conformitate cu modelul de evaporare a ionilor, ionii solvatati
desorb de la picaturile incarcate in camp electric si intru in spectrometrul de masa prin capilarul
de intrare. Modelul rezidu urilor de sarcina propune ca fiziunea Coulomb cauzeaza picaturile mici
cu un singur ion solvatat.Sarcina picaturii este ulterior transferata de la solvent la molecula si
solventul ramas se evapora.Prin incalzirea sursei de ioni si aditia unui flux de gaz u scat precum
si un gaz nebulizator, formarea picaturilor si evaporarea solventului poate fi accelerata. Ca si
rezultat, ESI produce in mare parte ioni [M+nH]+n sau [M-nH]-n cu sarcina multipla, care pot fi
analizati ulterior de spectrometrul de masa.
Anal iza biopolimerilor cu ESI -MS este foate sensibila, permitand detectia moleculelor
chiar in domeniul femtomolar a probelor complexe. Studiul complecsilor nativi non -covalenti,
care necesita aditia unui solvent tampon poate complica analiza datorita formarii ionilor aducti
cum ar fi in faza gazoasa. Acest fapt este, de asemenea, a fi luat in considerare cand se cupleaza
ESI-MS cu instrumente de separare ca si sisteme HPLC pentru separarea probei inainte de
analiza.
2.5. Digestie proteolitica
2.5.1 Digestia en zimatica a proteinelor in solutie la presiune atmosferica

Analiza aminoacizilor este una din cele mai bune metode de analiza de cuantificare a
peptidelor si proteinelor si serveste ca o metoda analitica valoroasa pentru evaluarea peptidelor
sintetice, puri tatea proteinelor recombinante, identificarea proteinelor bazata pe compozitie s.a.
Analiza secventei primare este utilizata pentru identificarea proteinelor si obtinerea unor
informatii care mai departe au o mare importanta in probele de oligonucleotide p entru a clona
genele care codifica proteina de interes.
Abordarea obisnuita pentru obtinerea secventei primare este incercarea de a secventia
terminalul N al proteinei intacte; totusi, dintr -un motiv sau altul, proteinele pot sa nu contina o
grupare libera amino N terminala(de ex. pot fi blocate) si sunt in consecinta refractare la
degradarea Edman. Daca este pura, proteina blocata nu poate fi deblocata, de aceea este necesar,
de obicei, fragmentarea proteinelor prin metode enzimatice sau/si chimice s i izolarea
fragmentelor proteice individuale prin cromatografia lichida cu presiune inalta in faza
reversibila (RP-HPLC ), prin urmare obtinerea unor date despre secventa primara. Chiar daca
terminalul N al unei proteine nu este blocat, o asemenea abordare c onstituie adesea cea mai
economica utilizare a proteinelor, in sensul ca se poate obtine de mai multe ori o secventa mai
mare dintr -o cantitate limitata de proteina, asta doar daca terminalele N nu au fost secventiate.

Figura 5. Reprezentarea schematica a digestiei proteolitice.
Analiza structurii covalente a proteinei este mai puțin complexă și mai precisă atunci
când este efectuată pe peptide derivate din proteina mai mare. Spre deosebire de hidroliza totală

favorizată de acid (de exemplu, în HCI 6 N), p eptidele sunt generate în mod tipic prin proteoliză
selectivă, adică prin scindarea specifică a legăturilor peptidice cu endoproteaze care au grade
diferite de specificitate. Un protocolul de bază poate fi utilizat pentru a genera fragmente de
peptide din proteine intacte, nedenaturate. Fragmentele pot fi analizate direct prin spectrometrie
de masă (MS) sau, mai des, sunt mai întâi separate prin HPLC în fază inversă (RP -HPLC) și apoi
analizate prin MS sau prin secvențierea automată. Este necesară experti za cu aceste tehnici
analitice și cromatografice, sau procedurile trebuie să fie efectuate în asociere cu un operator
calificat.
Cele mai multe proteine sunt rezistente la proteoliza enzimatică în condiții nefondante
sau nu sunt solubile în soluție apoasă. Deoarece multe proteine sunt rezistente la digestia
proteazei în starea lor nativă, majoritatea digestelor sunt efectuate în prezența ureei și guanidinei
HCI. Includerea chaotropelor în amestecul digest evită necesitatea de a denatura (sau reduce și
alchila) proteinele substratului înainte de digestie. Aceasta, la rândul său, elimină necesitatea
îndepărtării agenților de denaturare prin cromatografie sau dializă înainte de adăugarea proteazei,
o etapă care poate determina pierderi grele ale protei nelor de substrat prezente în cantități de
subnanomol. Proteinele sunt solubilizate și denaturate în concentrații mari de uree sau guanidină;
HCI, iar denaturantul este apoi diluat până la o concentrație suficient de mare pentru a împiedica
replantarea sub stratului, dar suficient de scăzută pentru a permite digestia proteazei.
Procedura are o rată ridicată de succes și este cea mai des utilizată ca metodă de alegere.

2.5.2 Digetia enzimatica a proteinelor in solutie cu presiune

Utilizarea tehnologiei cu presiune in cicluri(PCT) pentru cresterea activitatii enzimatice a
fost introdusa la inceputul anilor 1990. Totusi, dezvolatarea unor instrumente noi a condus la
metode mult mai usor de implementat, avand ca rezultat descoperirea unou noi aplicatii. Digest ia
proteinelor asistata de presiune, de asemenea cunoscuta ca tehnologia cu presiune in
cicluri(PCT) se alatura metodei conventionale de digestie a proteinelor la presiune atmosferica.
PCT ofera o digestie enzimatica a proteinelor mult mai controlata decat digestia prelungita la
presiune atmosferica cu timpul de desfasurare intre 18 si 24 de ore.PCT este optimizat pentru
presiune si t imp si s -a dovedit a fi mai e ficient a la 15 kpsi pentru 120 de minute de incubare in
cazul celulelor precum histona H4.

Figura 6. Dezvolat ea unui sistem rapid de digesti e sub presiune.
Caracteristicile standard care vin odata cu 2320EXT includ: introducerea de date și
opțiunile de ieșire pentru a permite validarea și controlul calității; comanda controlată de
calculator cu programare cu ecran tactil și înregistrare automată a datelor; și capacitatea de a
controla mai mulți parametri ai ciclului de presiune, cum ar fi viteza de creștere / scădere a
presiunii, atât nivelul de presiune ridicat, cât și nivelul scăzut al presiuni i, precum și forma
profilului de presiune (de exemplu, unde sinusoidale, unde pătrate și altele). În plus, modelul
2320EXT este disponibil cu două metode diferite de control al temperaturii (o baie de apă de
încălzire externă pentru încălzire și răcire sau un încălzitor electric încorporat).
Există peste 100 de lucrări științifice publicate cu privire la avantajele platformei PCT,
multe de către liderii de opinie cheie din întreaga lume. Astfel de avantaje includ:
• Extracția și recuperarea mai multor protein e din membrană
• Digestia proteica rapida
• Liza diferențială într -o bază de probă mixtă
• Inactivarea patogenului
• Creșterea detecției ADN
• Controlul procesului de pregătire a probelor

2.6. Coloana de afinitate. Extractia epitopului

Cromatografia cu afinitate este acceptată pe scară largă și folosită ca instrument în cercetarea
biomedicală și biotehnologia; totuși, originea sa cu doar 30 de ani în urmă pare a fi uneori
diminuată în istorie. Cu toate acestea, potențialul acestei tehnologii co ntinuă să stimuleze
dezvoltarea continua si noi aplicatii.
Cromatografia afinității așa cum este cunoscută astăzi a fost introdusă în 1968 de către
Pedro Cuatrecasas, Chris Anfinsen și Meir Wilchek, unul dintre autorii acestui capitol. Deși
câteva metode conexe au fost descr ise mai devreme, conceptul și puterea imensă a biorecogniției

ca mijloc de purificare au fost introduse mai întâi în lucrarea din 1968 intitulată "Cromatografia
afinității”.
Cromatografia afinității se bazează pe recunoașterea moleculară. Este o procedur ă relativ
simplă. Orice biomolecule dată, pe care cineva dorește să o purifice, are de obicei un sit inerent
de recunoaștere prin care poate recunoaște o moleculă naturală sau artificială. Dacă unul dintre
acești parteneri de recunoaștere este imobilizat p e un purtător polimeric, acesta poate fi utilizat
pentru capturarea selectivă a biomoleculei prin simpla trecere a unui extract celular adecvat
conținând acesta din urmă prin coloană. Biomolecul dorit poate fi apoi eluat prin schimbarea
condițiilor externe , de exemplu, pH, putere ionică, solvenți și temperatură, astfel încât complexul
dintre biomolecule și partenerul său nu va mai fi stabil și molecula dorită va fi eluată într -o
epurare purificată formă.

Figura 7. Figura 333.Reprezentarea schematică a proc edurilor de excizie și extragere a epitopilor
exemplificată pe un sistem de anticorpi -antigen. În extirparea epitopului antigenul este mai întâi
incubat cu anticorpul imobilizat și complexul este apoi digerat cu diferite proteaze. Fracțiile
nelegate sunt a poi îndepărtate prin spălare. În final, peptidele de epitop legate de afinitate sunt
disociate de anticorp. În extracția epitopului antigenul este mai întâi digerat în soluție și

fragmentele proteolitice rezultate sunt prezentate anticorpului imobilizat. T oate fracțiile
recuperate sunt analizate prin spectrometrie de masă și rezultatele obținute sunt comparate.

Printre cele mai populare dintre aceste tehnici derivate din afinitate se numără
cromatografia cu imunoafinitate, care utilizează coloane de antico rpi pentru a purifica antigeni
sau coloane de antigen pentru purificarea anticorpilor. Cromatografia cu imunoafinitate este, de
fapt, utilizată în majoritatea studiilor biologice. Alte metode, cum ar fi cromatografia de afinitate
cu chelat de metal, se apl ică mutagenezei direcționate pe situs pentru a introduce diferite etichete
sau cozi de afinitate la biomolecul care urmează să fie purificat .
Două metode chimice moleculare descrise și aplicate în primul rând ion sau laborator
pentru identificarea situsurilor de interacțiune proteină -proteină sunt excizia și extracția
epitopilor. Metoda de excizie a epitopilor se bazează pe proteoliza selectivă în combinație cu
spectrometria de masă de ex. un complex de antigen -anticorp. În primul rând, anticorpul e ste
imobilizat pe un suport solid (de exemplu, agaroză, bile de silice) și este incubat cu antigenul
într-o micro -coloană. Apoi se efectuează proteoliză enzimatică specifică. Fragmentele de epitop
recunoscute de anticorp sunt astfel protejate de aceasta îm potriva digestiei și vor rămâne legate
la anticorpul imobilizat. Celelalte fragmente sunt îndepărtate și colectate pentru analiza
spectrometrică în masă. În final, complexul epitop -anticorp este disociat și fragmentele eluate
sunt identificate prin spectro metrie de masă. Anticorpii în stare nativă sunt foarte rezistenți la
proteaze, prin urmare, în funcție de proteaza utilizată, de timpul de digestie și de duritatea
procedeului de eluare, coloana anticorpului este de obicei reutilizabilă.

Figura 8. Figura 8. Reprezentarea schematica a principilui coloanei de afinitate

În procedura de extracție a epitopilor, antigenul este mai întâi digerat proteolitic și
amestecul de peptide rezultat este aplicat pe coloana anticorpului. Datorită specificității ridicate a
recunoașterii anticorpului -antigen, numai peptidele care conțin secvențele de epitop
interacționează cu paratopele corespunzătoare și sunt reținute pe coloană. După îndepărtarea
fragmentelor nelegate prin spălare, epitopul este eluat și caracterizat prin spectrometrie de masă.
Structurile de paratopi pot fi elucidate printr -o abordare conexă care utilizează sistemul invers cu
peptide imobilizate sau peptide epitop. Cel mai important avantaj al spectrofotometriei de
masurare a exciziei proteolitice și extra gerii pe HDX -MS și CXMS constă în izolarea și
identificarea peptidelor care leagă ligand, care sunt relevante pentru afinitatea specifică a
liganzilor de proteine.
Peptidele corespunzătoare reprezintă structuri model utile care sunt ușor accesibile pentru
sinteza chimică și utilizare în aplicații biomedicale. Alte avantaje sunt consumul scăzut de probe,
capacitatea de a lucra cu amestecuri complexe de proteine, timpul de analiză scurt și analiza
directă a datelor.
2.7. Software
2.7.1 GPMAW
Pentru determinar ea masei moleculare a proteinelor si peptidelorsi a fragmentelor
proteolitice obtinute dupa digestia proteinelor, a fost folosit programul GPMAW 6.0(General
Protein/Mass Analysis for Windows)(Lighthouse Data, Denmark).Acest program permite
calcularea masel or monoizotopice si medii ale peptidelor sau proteinelor, urmata de cautarea
diferitelor fragmente care au masa cunoscuta. Folosind acest program este posibila indroducerea
diferitelor modificari a unor anumiti aminoacizi.Se pot obtine valorile medii si mo noizotopice
pentru ionii M+H+ si, de asemenea valorile ionilor fragmentati care au sarcini diferite. Programul
GPMAW 6.0 poate sa prezice structura secundara si hidrofobicitatea unui proteine sau a unei
secvente peptidice.
2.7.2 DataAnalysis
Analiza datelor Bruker Daltonics 3.3 a fost utilizată pentru prelucrarea datelor avansate
obținute pe spectrometrele de masă Bruker Daltonics. Analiza datelor a fost utilizată în mai
multe analize la un moment dat și a permis analiza peptidică, elucidarea structur ală și
identificarea compusului pe baza spectrelor MS și MS / MS.
2.7 3 OriginPro 7.5 cu pluginul FitMaster
Originropro 7.5 cu ajutorul plug -in-ului FitMaster a fost folosit pentru a se potrivi senzorilor din
biosenzor și pentru a calcula constanta de disociere a int eracțiunii anticorp -mioglobina .

Materiale si reactivi
Toți reactivii și solvenții au fost de grad analitic sau cu cea mai mare puritate disponibilă.
APS, TEMED, Acr -Bis(0.1% -29%), Tris -HCl(0.5 M -1.5 M), 10% SDS, glicina, 50% metanol,
10% a cid acetic si 70% etanol au fost achiziționate de la Sigma Aldrich (Hamburg, Germania).
PageRuler Unstained Protein Ladder (Fermentas, Canada).
100 mM bicarbonat de amoniu: Sigma, iar enzimele tripsina si chimotripsina: Promega
(Mannheim, Germany). Matrix -ul pentru analiza cu ajutorul MALDI -TOF: acid 2,5 –
dihidroxibenzoic(DHB), folosit la analiza digestiilor, si acid super 2,5 -dihidroxibenzoic(SDHB),
folosit la anliza proteinei intacte, au fost solubilizate in 70% ACN si 0.1% TFA au fost
achizitionate de la Fluka.
Sefaroza CNBr activata: Sigma (Taufkirchen, Germany). Microcoloanele montate cu
filtre cu marimea porilor de 35 µm au fost achizitionate de la MoBiTec (Goettingen,
Germany).Acid clorhidric (37%), hidroxid de sodiu (99%), acid acetic (100%) etanolam ină
(99%), monocarbonat de sodiu(NaHCO 3, 99,5%), acetat de sodiu(99,5%): Merck. Apa ultrapura
de tip 1(18,2 MΩ · cm -1 la 25 ° C): Millipore (Eschborn, Germania).
Pentru SPR am preparat PBST(50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, 0.05% TWEEN, pH
7.5), solutia Piranha( H2SO4:H2O2, 2:1), acid 16 -mercaptohexadecanoic(1 mg/mL), cloroform,
cipul de aur pe care s -a imobilizat anticorpul anti -mioglobina(Santa Cruz Biotehnology Inc.,
Heidelberg,Germania), reactivi achizitionati de la Sigma -Aldrich Chemie GmbH(Munchen,
Germania) . Activarea cipului se realizat utilizand EDC/NHS, anticorpul a fost dizolvat in acetat
de sodiu 0.1 M , urmata de solutia de blocare etanolanima obtinuta de la Roth.
.

3. Partea experimentala
3.1 Validarea proteinei prin SDS PAGE
SDS PAGE a fost utilizat pentru identificarea sursei de mioglobina corespunzatoare
experimentelor viitoare. Au fost utilizate un sistem Mini -PROTEAN 3 și o sursă de alimentare
Powerpac 1000 (Bio -Rad, München, Germania) pentru turnarea și rularea gelurilor. Gelurile au
fost preparate proaspăt înainte de fiecare rulare, în conformitate cu rețetele enumerate în Tabelul
1, în dimensiune de 10 x 10 x 0,1 cm . Probele au fost solubilizate în 50 mM TrisHCI, SDS 4%,
glicerol 25%, al bastru bromofenol 0,02%, pH 6,8 . Tamponul de rular e a fost compus din 25 0
mM Tris, 192 mM glicină și 1% SDS. Electroforeza pe gel a fost efectuată fo losind o tensiune
constantă de 5 0 V timp de ~ 30 minute, până când colorantul de urmărire (albastru de
bromofenol) a intr at în gelul de separare și la 10 0 V timp de ~ 2 ore, până când colorantul de
urmărire a ajuns la capătul separatorului gel.
Table 1. Solutiile utilizate pentru prepararea gelurilor de poliacrilamida .
După separare, benzile de proteine au fost vizualizate prin colorare coloidală Coomassie. Soluția
de colorare, suficientă pentru dou ă geluri de dimensiune de 10 x 10 x 0,1 cm, a fost preparată
prin amestecarea a 200 ml de sulfat de amoniu 10% cu acid fosforic 2% și 2 ml de soluție apoasă
5% Coomassie Brilliant Blue G250. Gelu l a fost incubat cu solutia de mai sus 15 minute la
agitare. Gelul a fost spalat cu 70% etanol si apa distilata. Urmatorul pas a fost decolorarea
gelului, utilizand o solutie formata din 50% metanol, 10% acid acetic. Solutia de decolorare a
fost adaugata peste gel si incubata la agitare până când benzile de proteine au avut un contrast
bun împotriva fondului membranei. In urma decolorarii, gelul a fost spalat cu apa distilata si
inserat intr -o folie de plastic pentru pastrare.
3.2 Determinatea constantei de afinitate a mioglobinei prin SPR
Pentru a cuantifica inter acțiunea fizică între mioglobină și anticorpul anti -miloblobin a
corespunzător, interacțiunea proteină -anticorp a fost investigată prin analiza directă a Substante chimice Gelul de separare 16% Gelul de stocare 4%
Apa distilata 2 mL 3 mL
TRIS -HCl 2,5 mL -1,5 M 1,25 mL – 0,5 M
Acr-Bis 29% -0,9% 5,3 mL 0,65 mL
SDS 10% 50 µL 25 µL
APS 25 µL 12,5 µL
TEMED 5 µL 5 µL

biosenzorului. Măsurarea biofafițității a fost efectuată utilizând un biosenzor SR7500DC SPR cu
două ca nale (Reichert Technologies Life Sciences, Buff alo, USA). Interacțiunile fizice au fost
determinate prin analiza în timp real cu un cip de aur activat.
Cipul de aur a fost spalat cu 70% etanol si apa distilata, apoi imersat in solutia
Piranha(H 2SO 4:H2O2) 2:1 pentru 15 secunde. Procesul prezentat se repeta de 4 ori, dupa care
cipul este incubat in acid 16 -mercapto -hexadodecanoic(1mg/mL) la agitare peste noapte.Cipul de
aur este spalat din nou cu apa distilata si uscat sub gaz(nitrogen).
Imobilizarea covalen ta a anticorpului
Înainte de utilizare, anticorpul anti -mioglobină (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg,
Germania) a fost imobilizat pe monostratul auto -asamblat (SAM) al suprafeței activate a cipului
prin cuplarea aminei. Cip urile SAM au fost prepa rate așa cum s -a descris mai î nainte pe cip -uri
hidrofobe plane alchilate achiziționate de la Reichert Technologies Life Sciences. Toate reacțiile
au fost efectuate în celula microfluidică a biosenzorului SPR, iar substanțele chimice au fost
injectate prin autosampler. Suprafața cip ului a fost spălată inițial cu 900 µl de PBST solutie
tampon (50 mM Na2HPO 4, 150 mM NaCI, 0,05% TWEEN , pH 7,5) pentru curățare. Activarea
ulterioară a grupărilor carboxilice ale SAM a fost r ealizată prin injectarea a 250 µ l dint r-o soluție
proaspăt preparată de EDC 0,2 M și NHS 0,1 M la o rată constantă de fl ux de 35 μl min-1. Pentru
a îndepărta substanțele chimice nereacționate, suprafața cipului și sistemul microfluidic al
biosenzorului au fost purificate din nou cu 900 µl PBST solutie tampon . Cuplarea anticor pului a
fost efectuată cu PBST la pH 5,2. Pentru aceasta, o soluție de anticorp anti-mioglobină a fost
diluată la o concentrație finală de 50,0 µg ml-1 în PBST. Din această soluție, 250 µ l au fost
injectate direct pe supraf ața cipu lui la o viteză constantă de fl ux de 35 μl min-1. După purific area
sistemului încă o dată cu 900 µ l PBST bufer (pH 7,5), esterii NHS nereacționați au fost blocați
prin injectarea a 250 µ l soluție de etanolamină (1 M etanolamină, pH 8,5).
Determinar ea valorilor k D între anticorpul anti -mioglobina și mioglobină
Experimentele de legare au fost realizate la 25° C cu PBST bu ffer (50 mM Na 2HPO 4, 150 mM
NaCI, 0,05% TWEEN, pH 7,5). O serie de diluții de mioglobină din mioglobina inimii de
cal(SigmaAldrich B iochemie GmbH, Hamburg, Germania) a fost proa spăt preparată, variind de
la 30 µM până la 0,23 µ M utilizând aceeași bufe r și măsurată prin injectare prin autosampler
peste suprafața cipului de aur la un debit constant rata de 35 μl min-1. Cinetica înregistr ată de
asociere și disociere a fost evaluată utilizând software -ul TraceDrawer (Ridgeview Instruments
AB, Vange, Suedi a). Valorile k D au fost calculate din constantele de asociere și de disociere (ka
și kd) obținute din măsurătorile fizice ale probelor la fiecare concentrație.

3.3. Digestia proteolitica
3.3.1 Digestia proteolitca cu tripsina
Tripsina este o serin protează care se descompune la partea carboxil a resturilor de lizină și
arginină, cu excepția cazului în care fie este urmată de prolină. Tripsi na achiziționată pentru
acest studiu a fost modificată prin metilarea reductivă (Promega, Mannheim, Germania). Reacția
convertește reziduurile de lizină la e -N, N -dimetillizină rezistentă la tripsină. Tripsina alchilată
are aceleași proprietăți catalitice ale enzimei nemodificate, dar este mai puțin susceptibilă la
autoliză. Acest lucru permite perioade mai lungi de digestie, fără a produce vârfuri nedorite în
spectrul de masă.
Mioglobina din inima de cal utilizata a fost solubilizata in apa distilata, conc entratie 1 mg/mL.
Pentru digestie am folosit 50 µL de mioglobina cu 75 µL bicarbonat de amoniu, pH 8. Am
incubat la 95oC pentru 15 minute solutia pentru a denatura proteina, apoi am racit la temperatura
camerei. Am adaugat tripsina in raport 1:50 si am i ncubat proba la 37oC pentru 16 ore.

3.3.2 Digestia proteolitica cu chimotripsina

Chimotripsina este o serin protează care se descompune la partea carboxil a a minoacizilor
hidrofobi mari (fenilalanina, tirozina și triptofan ), cu excepția c azului în care e ste urmat de
prolina . Este posibilă și scindarea dup ă alți aminoacizi, cum ar fi metionina, izoleucina, serina,
treonina, valina, histidina, glicina și alanina, dar cu rate mai scăzute.C himotripsina este activată
prin scindarea legăturii din tre arginină și izoleucină prin tripsină, provocând modificări
structurale și formarea situsului de legare a substratului. Chimotripsina diferă de tripsină prin
faptul că tripsina descompune peptidele la resturile de ar ginină și lizină, în timp ce chi motripsina
preferă r eziduuri hidrofobe mari. Chimotripsina catalizează în mod preferențial hidroliza
legăturilor peptidice care implică izomerii L ai tirozinei, fenilalaninei și triptofanului. De
asemenea, acționează rapid asupra amidelor și esterilor aminoacizilor sensibili.
Mioglobina din inima de cal utilizata a fost solubilizata in apa distilata, concentratie 1 mg/mL.
Pentru digestie am folosit 50 µL de mioglobina cu 75 µL bicarbonat de amoniu, pH 8. Am
incubat la 95oC pentru 15 minute solutia pentru a denatura protein a, apoi am racit la temperatura
camerei. Am adaugat chimotripsina in raport 1:50 si am lasat la incubat la 37oC pentru 16 ore.
3.3.3.Digestia proteolitica a mioglobinei din inima de cal cu tripsina la presiune

Mioglobina utilizata a fost solubilizata in a pa distilata, concentratie 1 mg/mL. Pentru digestie am
folosit 50 µL de mioglobina cu 75 µL bicarbonat de amoniu, pH 8. Am incubat la 95oC pentru

15 minute solutia pentru a denatura proteina, apoi am racit la temperatura camerei. Am adaugat
tripsina in r aport 1:50. Utilizand Barocycler -ul 2320EXT, am pus proba intr -un microtub PCT de
150 µL, si am adus la un volum final de 150 µL, adaugand bicarbonat de amoniu. Digestia s -a
realizat la 37oC, timp de o ora, 60 de cicluri, presiune de 35 kpsi.

3.3.4. Diges tia proteolitica a mioglobinei din inima de cal cu chimotripsina la presiune

Mioglobina utilizata a fost solubilizata in apa distilata, concentratie 1 mg/mL. Pentru digestie am
folosit 50 µL de mioglobina cu 75 µL bicarbonat de amoniu, pH 8. Am incubat l a 95oC pentru
15 minute solutia pentru a denatura proteina, apoi am racit la temperatura camerei. Am adaugat
chimotripsina in raport 1:50. Utilizand Barocycler -ul 2320EXT, am pus proba intr -un microtub
PCT de 150 µL, si am adus la un volum final de 150 µL , adaugand bicarbonat de amoniu.
Digestia s -a realizat la 37oC, timp de o ora, 60 de cicluri, presiune de 35 kpsi.

3.4. Extractia epitopului prin coloană de afi nitate

O izolare fizică și capturarea analitului în inter față a fost realizată printr -o microcoloană.
Microcoloana a fost preparat a conform următoarei proceduri.
Cuplarea covalenta a anticorpului pe Sepharose ™ 4B activat de CNBr
Anticorpul anti -mioglobină a fost imobilizat pe Sepharose ™ 4B activat de CNBr (GEHealthcare
Europe GmbH, Freiburg, Germ ania). Mediul liofilizat de sefaroză a fost suspendat în 3 ml de
HCI 1 mM și a fost setat să se umfle la temperatura camerei timp de 15 min ute la agitare .
Ulterior , matricea suspendată a fost spălată extensiv cu 10 ml de solutie de spalare(WB – 0.2 M
NaOAc, 0.5M NaCl, pH 4) și 10 ml de solutie de cuplare (0.2 M NaHCO 3, 0,2 M NaCl 0,5 M,
pH 8,3), în această ordine. Sef aroza a fost apoi resuspendată în 500 µl solutie de cuplare și
incubată cu 7.81 µ g de anticorp la 25 ° C sub agitare viguroasă tim p de 3 ore. După aceea,
matricea a fost spălată excesiv cu 10 mL WB și 10 mL solutie de blocare, dupa care
resuspendată în 500 µl de solutie de blocare (0.1 M etanolamină, 0.5 M NaCl, pH 8,0) pentru
acoperirea părților cianogene nereacționate timp de 3 or e la agitare . Matricea coloanei a fost
echilibrată prin spăla rea cu 10 mL apa distilata și utilizat a direct în etapa următoare. Coloana de
afinitate preparata a fost testata cu mioglobina de la inima de cal intacta, digestiile cu tripsina si
chimotripsina atat fara, cat si cu presiune.
Conform protocolului, 20 µg proba de mioglobina a fost pusa la incubat in coloana suspendata in
apa distilata peste noapte. Ulterior, s -a colectat prima picatura dupa incubare, s -a spalat matricea
cu 10 mL apa distilata si fi ltrata, dupa care s -a colectat ultima picatura. Cele 2 picaturi au fost

analizate la MALDI -TOF, in prima picatura gasind peptidele care nu s -au legat de anticorp,iar in
ultima picatura nu s -a identificat nici un semnal. Dupa aceea, s -a facut elutia cu 300 µL 0.1%
TFA si s -a spalat din nou cu 10 mL apa distilata. Analizand elutia cu ajutorul spectrometriei de
masa MALDI -TOF am identificat, sau nu, epitopul sau proteina intacta. De asemenea, ultima
spalare este de preferat a fi curata pentru a putea refolosi coloana de afinitate.
Pentru stocare, coloana a fost lasata în apă distilata la 0 ° C pentru utilizarea pe perioade mai
lungi de timp.

3.5 Spectrometria cu analizator timp de zbor

Un număr mare de analize spectrometrice de masă MALDI -TOF s -au efectuat cu un
spectrometru de masă Bruker Auto flex linear TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germania)
echipat cu un laser cu azot UV (337 nm), un detector de plăci dual microcanal , o sursă 26 de
probe SCOUT. Achiziția spectrelor a fost efectuată la o tensiune de acce lerație de 20 kV și o
tensiune de detector de 1,5 kV. Pentru instrument s-au preparat 2 soluții de matrice : o soluție
saturată de acid 2,5 -dihidroxibenzoic (DHB) în 70% ACN, 0,1% TFA utilizata pentru peptide; o
solutie saturata de acid super 2,5 -dihidroxib enzoic(SDHB) in 70% ACN, 0.1% TFA utilizata
pentru proteine. Alicote de 0.5 µ l de soluție de probă și soluție de matrice au fost amestecate
direct pe placa de oțel și lăsat e să cristalizeze, apoi analizate . Soluțiile de matrice a fost
depozitate in frigider la 4° C.

3.6 Validarea proteinei prin ionizarea cu electrospray

Pentru a testa metoda de detecție prin spectrometrie de masă pentru mioglobina inimii de cal , a
fost efectuată analiza MS prin infusia directă cu ESI -MS.
Măsurătorile MS s -au efect uat în mod pozitiv cu ioni. Parametrii sursei de ioni folosiți au fost:
Tensiunea capilară -4500 V, placa de capăt setată -500 V, tensiunea capilară de ieșire 278,5 V,
debitul gazului de nebulizator (He) 12 psi, debitul gazului uscat 9 L min-1 și temperatur a de
uscare 250° C. Spectrele au fost înregistrate în modul de scanare completă, cu o gamă de scanare
de la m/ z 200 -3000. Ținta țintei de ioni a fost setată la 170000. Ionizarea mioglobinei a fost
testată prin prepararea a unei serii de dilutii intre 0.5 mM si 0.4 µM de mioglobina cu următorul
solvent: (50% acetonitril, 50% H 20 și 0,1% TFA) . Probele a u fost introduse în sursa ESI prin
infuzia directă cu o seringă, operată cu un sistem de pompare care funcționează la o rată
constantă de curgere de 100 μl mi n-1 .Evaluarea spectrelor s -a facut utilizand GPMAW 7.0 asa
cum s -a descris anterior.

4. Rezultate si discutii
4.1 Validarea proteiniei prin SDS PAGE
5 surse de mioglobina au fost analizate prin SDS PAGE pentru a verifica care dintre acestea este
cea mai potrivita pentru experimentele viitoare. Spectrometria de masă este o tehnică rapidă
pentru analizarea fracțiunilor de afinitate, dar informații importante, cum ar fi cantitățile
recuperate față de cantitatea inițială de proteine, pot fi obținute mai precis prin electroforeză în
gel. Comparativ cu spectrometria de masă, electroforeza pe gel este de asemenea mai tolerantă la
concentrațiile mari de săruri .
În prima bandă de gel cat si in ultima , se aplică "markerul de greutate moleculară" sau "scara de
proteine", care desemnează un amestec de proteine cu compoziție cunoscută și un model de
migrare bine caracterizat. Marke rul servește ca referință pentru estimarea greutății moleculare
(MW) a probelor necunoscute care se desfășoară în același gel. Acesta a fost ales în funcție de
densitatea și compoziția gelului și de greutatea moleculară estimată a probei, care ar trebui să se
încadreze în domeniul MW al markerului. În funcție de condițiile experimentale, proteinele pot fi
supuse (de z-) oligomerizării, p roteolizei sau autolizei, pot forma sau pierde punți disulfidice sau
pot suferi alte modificări în structura și conformația care afectează migrarea lor în gel. Banda de
referință poate furniza informații valoroase despre astfel de modificări moleculare și indică
necesitatea
unor etape
suplimentare de
optimizare.

Figura 1.Gelul de poliacrilamida rezultat in urma electroforezei, 50 V pentru 30 de minute si 100
V pentru 1 ora si 30 de minute. Gelul a fost colorat cu Commassie Brilliant Blue pentru 15
minute la agitare si decolorat cu 50% metanol, 10% acid acetic 30 de minute la agitare.

In banda cu numarul 1 a fost incarcata o proba de mioglobina de la inima de cal I(10 µg) cu 10
µL solutie tampon Commassie de incarcare. Se observa o coloratie intensa intre 15 si 20 kDa,
ceea ce indica prezenta mioglobinei intacte. In banda cu numarul 2 a fost utilizata o proba de
mioglobina de la inima de cal II(10 µg) cu 10 µL de solutie tampon de incarcare, in care apare o
coloratie mai putin intensa fata de prima s ursa de mioglobina de la inima de cal. Banda cu
numarul 3 a fost incarcata cu apomioglobina(10 µg), mioglobina fara gruparea hem, cu 10 µL
solutie de incarcare in care se observa o vaga coloratie. In banda cu numarul 4 a fost utilizata
mioglobina de la mus chiul schelatal din oaie(10 µg) cu 10 µL de solutie de incarcare, dar in gel
avem prezenta o intensitate scazuta in jurul domeniului 100 kDa. Banda cu numarul 5 reprezinta
mioglobina de la inima de cal preparata ca marker pentru focusarea izoelectrica(10 µ g) cu 10 µL
solutie de incarcare, in care se observa o coloratie aproape neobservabila datorata prezentei
proteinei.
Un pas important, chiar și pentru probele cunoscute, până când condițiile experimentale au fost
optimizate, a fost de a confirma identitat ea exactă a proteinelor în benzile de gel. În lucrarea de
față acest lucru a fost făcut folosind o abordare spectrofotometrica , si anume evaluarea
rezultatelor prin analiza probelor la MALDI -TOF .
4.2 Validarea mioglobinei din inima de cal I cu ajutorul MA LDI TOF
Mioglobina din inima de cal I utilizata a fost analizata si cu ajutorul unei metode spectrometrice,
MALDI -TOF. Un volum de 0,5 µL din mioglobina solubilizata in apa distilata de concentratie 1
mg/mL si un volum de 0,5 µL matrix, SDHB, un amestec d e 90:10 de acid 2,5 -dihidroxibenzoic
si acid 2 -hidroxi -5-metoxibenzoic pus in 60% acetonitril, 0,1% acid trifloroacetic si apa distilata

a fost pus pe o placa, ground steel.

Figura 2. Spectru de masa MALDI TOF a
mioglobinei de la inima de cal I. Primul semnal
din spectru este corespondent ionului 2+ al
mioglobinei, urmat de cel mai intens
semnal dat de mioglobina de la inima de
cal. Ultimul semnal cu masa cuprinsa
intre 30 -35 kDa a fost identificat ca fiind
dimerul mioglobinei.
4.3 Validarea mioglobinei de la inima de
cal I utilizand ESI
Pentru a studia comportamentul de ionizare
al mioglobinei inimii de cal (HHM), aceasta
a fost dizolvata în 50% ACN si 0.1% TFA și
măsurata prin injectare directă în MS. S -a constatat că prin dizolvarea din ce în ce mai des a
solvenților, cum ar fi creșterea concentrației de solvent organic (acetonitril) sau a pH -ului scăzut,
mioglobina ionizează cu valori m/ z din ce în ce mai mici. Condițiile non -native conduc la o
desfășurare parțială până la completă a lanțului de amin oacizi a proteinei, expunând lanțurile

laterale de aminoacizi și permițând transferarea mai multor încărcări în timpul evaporării
solventului care are loc în timpul procesului de ionizare.

Figura 3. Valorile m/z calculate si experimentale pentru mioglobina inimii de cal. Valorile pentru
[M + 8H] 8+ și [M + 9H] 9+ au fost calculate din masa holo -proteinei (17558,132 Da), toate
celelalte valori au fost calculate din masa apoproteinei (16941, 955 Da).

Figura 4. Spectrul de masa ESI al mioglo binei inimii de cal obtinut prin injectarea probei in sursa
ESI cu ajutorul unei seringi cu un debit de 100 µL min-1. Mioglobina inmii de cal a fost
dizolvata in 50% ACN, 0.1% TFA(pH 2.0).
4.4 Analiza mioglobinei folosind biosenzori
Pentru analiza cantita tivă a interacțiunii fizice a mioglobinei inimii calului cu anticorpul anti –
mioglobină, a fost efectuată analiza biosenzorului de suprafață a plasmonului (SPR). Pentru
aceasta, anticorpul a fost inițial imobilizat pe suprafața cipului de aur sensibil utili zând cuplarea
EDC/NHS : Deși activarea grupărilor carboxil din stratul SAM a fost reușită și cantitativă , reacția
de cuplare a anticorpului a atins randamente reduse de reacție, necesitând două injecții succesive
de anticorpi, urmată de o etapă de blocare . Experimentele de legare au fost efectuate în solutia
tampon PBST . Schimbarea indicelui relativ al unităților de refracție (RIU) a fost evaluat ă și
constanta k D a fost de 5,17×10 -9 M.

Figura 5. Reactiile desfasurate pentru imobilizarea anticorpului monoc lonal anti -mioglobina.
Monostratul auto -asamblat (SAM) al suprafeței cipului a fost activat cu ajutorul chimiei de
cuplare amină standard utilizând EDC/ NHS; (b) Suprafața activată a fost acoperită cu o soluție
apoasă de anticorp pentru a forma o legătură î ntre gruparea amină de pe peptidă și gruparea
carboxilică de pe suprafața cipului ; (c) Grupurile de suprafață activate au fost blocate utilizând
etanolamină.

Figura 6. Imunizarea anticorpilor anti -mioglo bină: 25 μg de anticorp în 250 µ l PBST (50 mM
Na2HPO 4, 150 mM NaCI, 0,05% TWEEN, pH 7,5) s -a injectat peste suprafața unui cip activat
SAM de aur de EDC/ NHS pentru 10 min: (1) arată activarea monostratului monosamblat (SAM)
cu 250 μl de EDC (283 μM) și NHS (92 μM) injectat timp de 10 min la o rată consta ntă de flux.
(2.1) și (2.2) prezintă răspunsul SPR al etapei de cuplare a anticorpului. (3) Blocarea esterilor
NHS nereacționați s -a realizat prin injectarea a 250 µ l de etanolamină (1 M, pH 8,5) timp de 10
min.

Figura 7. Analiza SPR a mioglobinei inimii de cal : 25 μg de anticorp de mioglobină au fost
cuplat e la suprafața unui cip SAM de aur activat cu EDC/ NHS. Au fost injectate pe suprafață
250 μl dintr -o serie de diluții de mioglobina în PBST bufer (570,0 µM; 5,7 µM; 28,5 µM și
respectiv 57,0 µ M) la o r ată de flux constantă timp de 7 min.
4.5 Digestia proteolitica a mioglobinei de la inima de cal cu tripsina

Figura 8. Spectrul de masa MALDI -TOF a digestiei mioglobinei cu tripsina la presiune
atmosferica dupa 16 ore de incubare la 37oC. Toate peptidele identificate au fost de sarcina unica
pozitiva(1+). Maximul de scindari ratate: 4.Tripsina a scindat mioglobina in proportie de 92%.

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFK HLKTEAEMKAS
EDLKK HGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSK
H PG DFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG
Figura 9. Secventa de acoperire a digestiei in urma utilizarii tripsinei ca enzima de scindare. Din
digestia mioglobinei lipseste peptida [49-63] cu o masa de 1591.81 Da.
Secventa mioglobinei de mai sus arata acoperirea dat orata actiunii tripsinei, care dupa
aminoacizii: lizina, arginina si in unele cazuri prolina a scindat mioglobina, formand peptide, pe
care analizatorul de masa TOF le identifica si le trimite mai departe detectorului care va da un
semnal corespunzator fie caruia.
Folosind software -ul GPMAW am facut o digestie automata a mioglobinei cu tripsina.

Tabel 2. Digestia automata a mioglobinei cu tripsina, cu acoperirea a secventei de 100%.
Se observa ca in digestia automata cat si in cea facuta experimental gasim multe semnale
comune(cu mici diferente de masa sau scindari ratate) ceea ce demonstreaza o digestie
corespunzatoare, insa tripsina nu a scindat dupa fiecare lisina sau arginina, in unele cazuri si
dupa prolina, ceea ce a determinat semnale intense de dimensiuni mari(de ex. semnalul dat de
petida (1 -31) cu masa de 3403.7393, are la axproximativ jumatatea secventei aminoacidul
lisina(K), dupa care tripsina trebuia sa scindeze si sa fi e identificate 2 peptide).

4.6 Digestia proteolitica a mioglobinei inimii de cal cu tripsina sub presiune.

Figura 10. Spectrul de masa MALDI -TOF a digestiei mioglobinei cu tripsina la presiune inalta
dupa 1 ora de incubare la 37oC. Toate peptidele iden tificate au fost de sarcina unica pozitiva(1+).
Maximul de scindari ratate: 4.Tripsina a scindat mioglobina in proportie de 92%.

GLSDGEWQQVLNVWGK VEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKAS
EDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSK
H PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG
Figura 11. Secventa de acoperire a digestiei sub presiune in urma utilizarii tripsinei ca enzima de
scindare.Observam ca din secventa mioglobinei inimii de cal lipseste peptida [1-16] cu masa de
1817.01 Da.

4.7 Digestia proteolitica a mioglobinei de cal cu chimotripsina

Figura 12. Spectrul de masa MALDI -TOF a digestiei mioglobinei cu chimotripsina dupa 16 ore
de incubare la 37oC. Toate semnalele au sarcina 1+. Maximul de scindari ratate: 4. Chimotripsina
a scindat miogl obina in proportie de 95%.

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKAS
EDLKKHGTVVL TALGGIL KKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSK
HPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG
Figura 13. Secventa de acoperire a digestiei miglobinei inimii de cal cu chimotripsina la presiune
atmosferica.Se observa absenta peptidei [ 70-76] cu masa moleculara 664. 57 Da.
Folosind software -ul GPMAW am facut o digestie automata a mioglobinei cu chimo tripsina.
Se observa ca in digestia automata cat si in cea facuta experimental gasim multe semnale
comune(cu mici diferente de masa sau scindari ratate) ceea ce demonstreaza o digestie
corespunzatoare, insa chimotripsina nu a scindat dupa fiecare fenilalan ina, tirozina sau triptofan
(cu excepția c azului în care este urmat de prolina), ceea ce a determinat semnale intense de
dimensiuni mari.

Figura 14. Digestia automata a mioglobinei cu chimotripsina. Acoperirea secventei este de
100%.
4.8 Diges tia proteolitica a mioglobinei de la inima de cal cu chimotripsina sub presiune.

Figura 15. Spectrul de masa MALDI -TOF a digestiei mioglobinei cu chimotripsina la presiune
inalta dupa 1 ora de incubare la 37oC. Toate peptidele identificate au fost de sarcina unica
pozitiva(1+). Maximul de scindari ratate: 4.Chimotripsina a scindat mioglobina in proportie de
95%.
GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKAS
EDLKKHGTVVL TALGGIL KKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSK
HPGDFGADAQGAMTKALELFRNDI AAKYKELGFQG
Figura 16. Secventa de acoperire a digestiei miglobinei inimii de cal cu chimotripsina la
presiune.Se observa absenta peptidei [ 70-76] cu masa moleculara 664. 57 Da.

4.9. Verificarea digestiei complete utilizand SDS PAGE
Pentru validarea unei digestii complete, 10 µL din digestiile cu, cat si fara, presiune cu tripsina si
chimotripsina au fost incarcate pe un gel de poliacrilamida.

Figura 17. .Gelul de poliacrilamida rezultat in urma electroforezei, 50 V pentru 30 de minute si
100 V pentru 1 ora si 30 de minute. Gelul a fost colorat cu Commassie Brilliant Blue pentru 15
minute la agitare si decolorat cu 50% metanol, 10% acid acetic 30 de minute la agitare.
Dupa marker, in prima banda gasim proteina intacta(1), dupa care digestia cu tripsina( 2), digestia
cu tripsina sub presiune(3), digestia cu chimotripsina(4), digestia cu chimotripsina sub
presiune(5).

Dupa cum se observa, in urma colorarii si decolorarii gelului, doar markerul si proteina intacta
sunt prezente in gel si in benzile cu digest ii nu exista nici o coloratie, fapt care demonstreaza
digestia completa, gelurile indicand biomoleculele cu masa cuprinsa intre 3 si 250 kDa.

4.10. Identificarea epitopului din digestia proteolitica cu tripsina
Un volum de 20 µL din digestia proteolitica cu tripsina a fost adaugata pe o coloana de afinitate
in care s -a imobilizat anticorpul anti -mioglobina monoclonal. După perioada de incubare,
coloana a fost drenată și fracția supernatantă a fost ana lizată prin MALDI -MS. Coloana a fost
apoi spălată până când nu s -au observat semnale peptidice răm ase în spectrul de masa . În final,
peptidele rămase aflate în afinitate au fost el uate cu 0.1% TFA și analizate prin MALDI -MS.

Figura 18. Spectrul de masa MALDI TOF a elutiei din digestia cu tripsina. Au fost id entificate 2
semnale. Primul semnal si cel mai intens corespunde cu peptida [146-153], gasita si in digestia
cu tripsina prezentata anterior, deci acesta este epitopul. Al doilea semnal a corespuns cu o
peptida identificata ca fiind cheratina.
Dupa elutie, s-a spalat coloana cu apa distilata si s -a verificat ultima spalare pentru a putea
refolosi coloana pentru urmatoare determinare a epitopului din digestia cu presiune.

Figura 19. Ultima spalare a coloanei de afinitate cu 10 mL apa distilata.

4.11 Iden tificarea epitopului din digestia proteolitica cu tripsina sub presiune
Un volum de 20 µL din digestia proteolitica cu tripsina sub presiune a fost adaugata pe o
coloana de afinitate in care s -a imobilizat anticorpul anti -mioglobina monoclonal. După perio ada
de incubare, coloana a fost drenată și fracția supernatantă a fost ana lizată prin MALDI -MS.
Coloana a fost apoi spălată până când nu s -au observat semnale peptidice răm ase în spectrul de
masa . În final, peptidele rămase aflate în afinitate au fost el uate cu 0.1% TFA și analizate prin
MALDI -MS.

Figura 20. Spectrul de masa MALDI TOF a elutiei din digestia cu tripsina sub presiune.Singurul
semnal si foarte intens corespunde cu peptida [146-153], gasita si in digestia cu tripsina sub
presiune prezentata a nterior cat si cu semnalul gasit in elutia din digestia cu tripsina la presiune
atmosferica, deci acesta este epitopul.

Figura 21. Ultima spalare a coloanei de afinitate in urma elutiei din digestia proteolitica a
mioglobinei cu tripsina sub presiune.

4.12. Identificarea epitopului din digestia mioglobinei inimii de cal cu chimotripsina

Bibliografie
1. [Davies et al., 1990] Davies, D. R., Padlan, E. A., and Sheri ff, S. (1990). Antibody -antigen
complexes. Annual review of biochemistry, 59(1):439 –473.
2. [El-Aneed et al., 2009] El -Aneed, A., Cohen, A., and Banoub, J. (2009). Mass spectrometry,
review of the basics: electrospray, maldi, and commonly used mass analyzers. Applied
Spectroscopy Reviews, 44(3):210 –230.
3. [McLaurin et al., 2002] McLaurin, J., Cecal, R., Kierstead, M., Tian, X., Phinney, A. L., Manea,
M., French, J., Lambermon, M. H., Darabie, A. A., Brown, M. E., et al. (2002). Therapeutically
effective antibodies against amyloid -β peptide target amyloid -β residues 4 –10 and inhibit
cytotoxicity and fibrillogenesis. Nature medicine, 8(11):1263 –1269.
4. [Nedelkov and Nelson, 2003] Nedelkov, D. and Nelson, R. W. (2003). Surface plasmon
resonance mass spectrometry: recent progress and outlooks. TRENDS in Biotechnology,
21(7):301 –305.
5. [Krone et al., 1997] Krone, J. R., Nelson, R. W., Dogruel, D., Williams, P., and Granzow, R.
(1997). Bia/ms: interfacing biomolecular interaction analysis with mass spectrometry. Analytical
biochemistry, 244(1):124 –132.
6. [Nirschl et al., 2011] Nirschl, M., Reuter , F., and V¨or¨os, J. (2011). Review of transducer
principles for label -free biomolecular interaction analysis. Biosensors, 1(3):70 –92.
7. [Przybylski and Glocker, 1996] Przybylski, M. and Glocker, M. O. (1996). Electrospray
mass spectrometry of biomacromolec ular complexes with noncovalent interactions —new
analytical perspectives for supramolecular chemistry and molecular recognition processes.
Angewandte Chemie International Edition in English, 35(8):806 –826.
8. [Suckau et al., 1990] Suckau, D., Ko¨hl, J., Karwa th, G., Schneider, K., Casaretto, M.,
BitterSuermann, D., and Przybylski, M. (1990). Molecular epitope identification by limited
proteolysis of an immobilized antigen -antibody complex and mass spectrometric peptide
mapping. Proceedings of the National Acade my of Sciences, 87(24):9848 –9852.
9. http://www.bio -rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
10. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3761939/
11. http://www.worthington -biochem.com/chy/default.html
12. http://www.ionsource.com/Card/protein/myoglobin.htm
13. Margaret E. Smith PhD DSc, Dion G. Morton MD DSc, in The Digestive System (Second
Edition) , 2010 .
14. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S: Cellular and molecular immunology. 7th edition.
Philadelphia: Elsevier/Saunders; 2012.
15. Decker JM: Introduction to immunology. Malden, Mass.: Blackwell Science; 2000.

16. Warrington R, Watson W, Kim HL, Antonetti FR: An introduction to immunology and
immunopa thology. Allergy Asthma Clin Immunol 2011, 7 Suppl 1:S1.
17. Cunningham BA, Rutishauser U, Gall WE, Gottlieb PD, Waxdal MJ, Edelman GM: The
covalent structure of a human gamma Gimmunoglobulin. VII. Amino acid sequence of heavy –
chain cyanogen bromide fragments H1-H4. Biochemistry 1970, 9(16):3161 -3170.
18. Edelman GM: The covalent structure of a human gamma Gimmunoglobulin. XI. Functional
implications. Biochemistry 1970, 9(16):3197 -3205.
19. Gall WE, Edelman GM: The covalent structure of a human gamma G -immunoglobuli n. X.
Intrachain disulfide bonds. Biochemistry 1970, 9(16):3188 -3196.
20. Gottlieb PD, Cunningham BA, Rutishauser U, Edelman GM: The covalent structure of a human
gamma G -immunoglobulin. VI. Amino acid sequence of the light chain. Biochemistry 1970,
9(16):3155 -3161.
21. Hood LE, Potter M, McKean DJ: Immunoglobulin structure: amino terminal sequences of kappa
chains from genetically similar mice (BALB/c). Science 1970, 170(3963):1207 -1210.
22. Happell BM, Gaskin CJ, Hoey W, Nizette D, Veach K: The activities that nurs es working in
community mental health perform: a geographical comparison. Aust Health Rev 2013,
37(4):453 -457.
23. K. Pragya, ”Essentials of Genetics”, I.K. International Pvt Ltd, 2010.
24. A. Zamora,”Proteins,amino acids, peptides and polypeptides -chemical struct ure”, Zenitech,2005.
25. M.W. Nirenberg et al.,”Approximation of genetic code via cell -free protein synthesis directed by
template RNA”, Fed Proc., 1963 Jan -Feb.
26. D.McNaught si A. Wilkinson,”Blackwell Scientific Publications”, Compendium of Chemical
Terminology Oxford,1997.
27. Zealand Pharma, ”What are peptides”, Denmark,2012.
28. J.C. Bulinski, ”Peptide antibodies: new tools for cell biology”. International review of
Cytology,1986.
29. J. Griffiths, ”A brief History of Mass Spectrometry” Anal.Chem. 2008.
30. B.Garipcan, M.O.Caglayan,G. Demirel, ”New Generation Biosensors Based on Ellipsometry”,
New Perspectives in Biosensors Technology and Applications,2011.
31. J.W.S Rayleigh,”On waves propagated along the plane surface of an elastic solid”, Proceedings
of the London Mathema tical Society,1885.
32. R.M. White and F.W. Voltmer, ”Direct Piezoelectric Coupling to Surface Elastic Waves”,
Applied Physics Letters,1966.
33. Y.Yang and Y.Yu, ”Electromechanical impedance modeling of PZT transducers for health
monitoring of cylindrical shell st ructures”, Smart Materials and Structures,2007.

34. H. Wohltjen, R. Dessy, ”Surface acoustic wave probe for chemical analysis”, Introduction and
instrument description, Anal.Chem., 1979.
35. Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L.: Biochemistry (5th ed.), W.H. Fr eeman (2002).
36. Voet D.; Voet, D.J.: Biochemistry (4th ed.), John Wiley and Sons (2011).
37. Whitford, D.: Proteins – structure and function, John Wiley and Sons (2005).